JP2003259888A - 微生物によるカルボン酸類の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】微生物によりニトリル化合物から対応するカル
ボン酸類を得る反応において、１）副原料である誘導基
質の使用が少なく、誘導基質由来の副生物を殆ど伴わな
い高純度なカルボン酸類の製法、２）主原料のポリニト
リル化合物の特定のシアノ基のみを副反応をほとんど伴
わず選択的に加水分解しカルボキシル基に変換し誘導基
質の使用が少い高純度シアノカルボン酸類の製法、３）
上記反応を触媒する微生物を提供すること。 【解決手段】ニトリル化合物を誘導基質としてシアノ基
の加水分解酵素活性を発現または向上しうる微生物、ま
たは該微生物処理物を主原料のニトリル化合物に作用さ
せカルボン酸類を得る製法において、該微生物の改変さ
れた変異微生物を用い誘導基質の使用量を低減すること
を特徴とするカルボン酸類の製法及び変異微生物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の作用によ
りニトリル化合物のシアノ基を加水分解し対応するカル
ボン酸類を製造する方法に関し、さらにはより低濃度の
ニトリル化合物を誘導基質としてシアノ基の加水分解酵
素活性を発現または向上するよう改変された変異微生物
を用い、誘導基質の使用量を低減するカルボン酸類の製
法及び変異微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】ニトリル化合物のシアノ基を加水分解し
対応するカルボン酸類を得る反応は、簡便にカルボン酸
類を得る方法として種々検討がなされている。これらの
うち、微生物の反応の特異性を生かした反応が多数知ら
れている。

【０００３】特に、ポリニトリル化合物の、一部のシア
ノ基のみを生物的に加水分解し、対応するシアノカルボ
ン酸を得る反応、特に芳香族ポリニトリル化合物の特定
のシアノ基のみを選択的に加水分解することにより、芳
香族シアノカルボン酸類を得る方法については、多数報
告がある。

【０００４】例えば米国特許第４，６２９，７００号公
報では、ロドコッカス（Rhodococcus）属の微生物を用
いた、フタロニトリル類からシアノ安息香酸類の製法が
開示されている。また例えば欧州特許第１７８，１０６
号公報では、ロドコッカス（Rhodococcus）属を含む４
属のグラム陽性細菌を用いた、ポリニトリル化合物から
の選択的シアノ基加水分解によるシアノカルボン酸類、
及びシアノカルボン酸アミド類の製法が開示されてい
る。

【０００５】有機合成的には、ポリニトリル化合物の等
価なシアノ基の一部を選択的に加水分解することは困難
であり、このように微生物・酵素反応の特徴である位置
選択性を生かした種々の方法が検討されてきた。

【０００６】しかしながら、これら微生物を用いる製法
においては、目的とする化合物によっては、目的化合物
の原料となるニトリル化合物以外に、酵素誘導基質とし
て別途異なるニトリル化合物を加え、酵素活性を誘導す
る必要がある。

【０００７】米国特許第４，６２９，７００号公報で
は、微生物反応液中にベンゾニトリルを添加することに
より、微生物のニトリル加水分解活性を誘導し、種々の
ニトリル化合物のカルボン酸への変換を実施している。

【０００８】このような方法においては、目的産物以外
に、反応液中に誘導基質の加水分解産物が生成し、目的
産物とともに反応液中に蓄積・残留する場合がある。微
生物のもつニトリル変換活性を十分に高め、効率よく反
応を達成するためには、微生物のレスポンスに十分な誘
導基質を添加することが不可欠であるが、その結果得ら
れる反応物は、目的産物とともに、著量の誘導基質由来
の副生物を含む。

【０００９】例えば、芳香族ジニトリルからシアノ安息
香酸を得ようとする場合、ベンゾニトリルはニトリル加
水分解活性の誘導基質として好適であるが、主原料およ
び誘導基質それぞれから生成する加水分解物、すなわち
シアノ安息香酸と安息香酸は相互に沸点、疎水度などの
物性値が酷似しており、ひとたび混合物となると通常用
いられる蒸留や抽出、塩析といった精製方法では完全に
は分離され難い。

【００１０】このような状況を避けるため、酵素誘導工
程と、反応工程を分離する方法が考えられる。すなわ
ち、微生物培養液に、誘導基質のみを添加しニトリル加
水分解活性を発現させ、しかるのちに微生物菌体のみを
回収し、残留する誘導基質由来の副生成物を除いたのち
に、反応原料を含む溶液に回収菌体を添加し、目的反応
を実施する。しかしながらこのような方法は煩雑であ
り、特に大スケールの製造工程では、簡便に菌体のみを
回収することは困難であり、長時間の煩雑な菌体回収操
作においては酵素の失活が生産性に大きな影響を与え
る。

【００１１】さらに、本来の目的反応には無関係な誘導
基質を副原料として要することによるコストアップ、微
生物に対する細胞毒性の問題等、解決すべき課題は多
い。

【００１２】また、特開平９−２８３８２号公報では、
ニトリル分解酵素を構成化し、誘導基質を不要にした微
生物に関する技術が開示されている。

【００１３】しかしながら、微生物の調節遺伝子を構成
発現化することは通常、微生物本来の生理機能の負担と
なり、菌の増殖も含めたトータルの能力では、調節下で
の発現に及ばないことが多い。

【００１４】菌の良好な増殖と、効果的な酵素発現を両
立するには、酵素の発現が不必要な前培養段階等ではそ
の発現が抑えられ、十分な菌の増殖が得られたのち、酵
素が発現されるよう、何らかの調節機構下に置き制御で
きることがより好ましい。

【００１５】このように、微生物を用いてカルボン酸類
を得る方法は、目的物に対する反応性は優れているもの
の、誘導基質として類縁のニトリル化合物を必要とする
ことが、簡便・低コストで純度よく生成物を得ることを
困難にしていた。

【００１６】微生物本来の酵素誘導機構を活かしつつ、
実用的な純度の生成物を効率よく得るため、誘導基質と
するニトリル化合物の使用量を低減する方法が求められ
ていた。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のよう
な背景から、主原料のニトリル化合物のシアノ基を、微
生物を用いて加水分解し対応するカルボン酸類を得る反
応において、１）副原料である誘導基質の使用が少な
く、また誘導基質由来の副生物をほとんど伴わない高純
度なカルボン酸類の製法を提供すること、２）ポリニト
リル化合物の特定のシアノ基のみを副反応をほとんど伴
わず選択的に加水分解しカルボキシル基に変換する、副
原料である誘導基質の使用が少なく、また誘導基質由来
の副生物をほとんど伴わない高純度シアノカルボン酸類
の製法を提供すること、さらに３）上記反応を触媒する
微生物を提供することを課題とする。

【００１８】

【課題を解決するための手段】発明者らは、従来の微生
物によるシアノ基の加水分解反応において誘導基質由来
の副生物の本質的な低減、すなわち誘導基質の低減を目
指し鋭意検討を重ねた。そして、より少ない誘導基質に
対しても高い酵素活性を発現する改変微生物が得られる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１９】すなわち本発明は、以下の事項に関する。 ［１］ニトリル化合物を誘導基質としてシアノ基の加水
分解酵素活性を発現または向上しうる微生物、または該
微生物処理物を主原料のニトリル化合物に作用させカル
ボン酸類を得る製法において、該微生物の改変された変
異微生物を用い誘導基質の使用量を低減することを特徴
とするカルボン酸類の製法。 ［２］主原料のニトリル化合物がポリニトリル化合物で
ある上記［１］に記載のシアノカルボン酸類の製法。

【００２０】［３］ポリニトリル化合物がオルトフタロ
ニトリル、イソフタロニトリルまたはテレフタロニトリ
ルのいずれかであり、得られる化合物がそれぞれ２−シ
アノ安息香酸、３−シアノ安息香酸、４−シアノ安息香
酸であることを特徴とする上記［２］に記載のカルボン
酸類の製法。 ［４］誘導基質が、ベンゾニトリル、３−シアノピリジ
ン、４−シアノピリジン、イソブチロニトリル、イソバ
レロニトリル、オルトフタロニトリル、イソフタロニト
リルまたはテレフタロニトリルのいずれかであることを
特徴とする上記［１］ないし［３］のいずれかに記載の
カルボン酸類の製法。 ［５］変異微生物が、ロドコッカス属由来微生物である
ことを特徴とする上記［１］ないし［４］のいずれかに
記載のカルボン酸類の製法。

【００２１】［６］変異微生物が、ロドコッカスｓｐ．
ＳＤ８２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０５）株の変異株で
あることを特徴とする上記［５］に記載のカルボン酸類
の製法。 ［７］変異微生物が、ロドコッカスｓｐ．ＳＤ８３０
（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７１４）株であることを特徴とす
る上記［５］に記載のカルボン酸類の製法。 ［８］ニトリル化合物を誘導基質としてシアノ基の加水
分解酵素活性を発現または向上しうる微生物を親株とし
て、より低濃度のニトリル化合物を誘導基質としてシア
ノ基の加水分解酵素活性を発現または向上するよう改変
された変異微生物。

【００２２】［９］改変前の８０％濃度以下のニトリル
化合物によりシアノ基の加水分解酵素活性を発現するよ
う改変された上記［８］に記載の変異微生物。 ［１０］親株が、ロドコッカス属微生物由来であること
を特徴とする上記［８］または［９］に記載の変異微生
物。 ［１１］親株が、ロドコッカスｓｐ．ＳＤ８２６（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１８７１４）株であることを特徴とする上
記［１０］に記載の変異微生物。 ［１２］ロドコッカスｓｐ．ＳＤ８３０（ＦＥＲＭ Ｐ
−１８７１４）株。

【００２３】

【発明の実施の形態】以下本発明について詳細に説明す
る。本発明において適用されるシアノ基を加水分解しカ
ルボン酸基に変換する能力を有し、なおかつ該活性を得
るための誘導基質の所要量が低減された変異微生物を創
製するための親株としては、一般に知られる、ニトリル
化合物のシアノ基を加水分解する能力を持つ種々の微生
物、特に、ニトリラーゼ活性を有し、なおかつニトリル
化合物の存在によりニトリラーゼ活性が誘導的に向上す
るような微生物を用いることができる。

【００２４】ニトリル加水分解能を有することが知られ
る微生物の例としては、ロドコッカス(Rhodococcus)、
ロドトルラ(Rhodotorulla)、フザリウム(Fusarium)、シ
ュードモナス(Pseudomonas)、アシネトバクター(Acinet
obacter)、バチルス(Bacillus)、ブレビバクテリウム(B
revibacterium) 、クレブシエラ(Klebsiella)、ミクロ
コッカス(Micrococcus)、バークホルデリア(Burkholder
ia)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、ノカルデ
ィア(Nocardia)、アエロモナス(Aeromonas)、アグロバ
クテリウム(Agrobacterium)、アクロモバクター(Achrom
obacter)、アスペルギルス(Aspergillus)、リゾビウム
(Rhizobium)等の各属に属する微生物が挙げられる。

【００２５】例えば、このような微生物を通常知られる
ような培養方法にて培養し、得られた菌体にＮＴＧ（Ｎ
−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、
ＥＭＳ（エチルメタンスルホン酸）等のアルキル化剤；
５−ブロモウラシル等の塩基アナログ；アザセリンやア
クリジンオレンジ等のインターカレーション剤など、一
般に知られる変異誘起化合物、または紫外線を作用さ
せ、変異微生物集団を調製する。

【００２６】この変異微生物集団を、たとえば、目的と
する反応の主原料となるニトリル化合物、ならびに所望
の低減レベル相当の誘導基質を懸濁した寒天培地に塗抹
し、親株よりも大きいまたは明瞭なニトリル化合物分解
円を提示するコロニーを分離することにより、目的の改
良株を選抜することができる。

【００２７】このようにして創出された変異株の一例と
して、ロドコッカスｓｐ．ＳＤ８３０株を挙げることが
できる。ロドコッカスｓｐ．ＳＤ８３０株は、既知の微
生物であるロドコッカスｓｐ．ＳＤ８２６（独立行政法
人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに ＢＰ
−７３０５号として寄託）から発明者らにより創出され
た株であり、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生
物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１８７１４号として寄
託されているものである。本発明にかかるロドコッカス
ｓｐ．ＳＤ８３０株の微生物学的性質について以下に示
す。

【００２８】

【表１】

【００２９】本発明はニトリル化合物を誘導基質として
シアノ基の加水分解酵素活性を発現または向上しうる微
生物のみならず、該微生物の処理物、例えば、当該微生
物を難溶性の担体に固定化し、この固定化物を誘導基質
に接触させる方法においても適用できる。このような固
定化担体としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルア
ルコール、ポリ−Ｎ−ビニルホルムアミド、ポリアリル
アミン、ポリエチレンイミン、メチルセルロース、グル
コマンナン、アルギン酸塩、カラギーナン、キトサン、
ポリウレタン類、ポリエステル類、さらにこれらの重
合、架橋化物など、微生物包合した水難溶性の固形分を
形成するような化合物を単独、もしくは混合して用いる
ことができる。

【００３０】また、活性炭、多孔質セラミックス、多孔
質ポリマー成型体、ニトロセルロース膜など、あらかじ
め固形物として形成された物体上に微生物を保持させた
もの、あるいは該物体上に微生物を成育させた、固形物
／微生物菌体の複合体を用いることもできる。

【００３１】本発明において、「より低濃度のニトリル
化合物を誘導基質としてシアノ基の加水分解酵素活性を
発現または向上するよう改変された変異微生物」とは、
微生物とその酵素誘導基質の組み合わせに対して一義的
に求められる、酵素活性を十分発現するに必要な最小限
の誘導基質量に対し、より少ない誘導基質量で酵素活性
が誘導されるよう改変された変異微生物を表す。

【００３２】このような変異微生物を用い、より少ない
誘導基質を用いて酵素誘導を実施することにより、最終
産物に残留する、誘導基質由来の不純物が低減される。

【００３３】本発明において、変異微生物は改変前の８
０％濃度以下のニトリル化合物によりシアノ基の加水分
解酵素活性を発現することが好ましい。

【００３４】本明細書において、誘導基質の低減とは、
相対的に目的反応物の総量に対する誘導基質の使用量が
低減されることを意味する。目的反応物に対して相対的
に必要な誘導基質が低減される範囲において、目的反応
物の総生産性は変動してもよいが、当然ながら総生産性
は絶対的に親株より大きく低下しないことが好ましい。

【００３５】よって、目的とする不純物レベルを得るに
十分な量まで誘導基質を低減できるような変異微生物で
あれば、その改変の程度、すなわち低減の程度は問わな
い。例えば、ロドコッカスｓｐ． ＳＤ８２６株を通常
の懸濁反応に供するにあたり、ベンゾニトリルで酵素誘
導する場合、液中濃度として０．０５〜０．１％程度の
ベンゾニトリル添加で最大の活性を与える。一方、改変
微生物であるロドコッカスｓｐ． ＳＤ８３０株では、
同等の活性をその１／１０〜１／１００のベンゾニトリ
ル量で得ることが出来る。

【００３６】ベンゾニトリルの全量が、そのニトリル加
水分解産物である安息香酸に変換されるとすれば、改変
微生物では誘導基質由来の副生物を１桁以上低減するこ
とが可能である。通常、少なくとも酵素誘導に必要な誘
導基質が親株に対し２０％以上低減されており、これに
従い用いる誘導基質を低減すれば、その低減効果は生産
物中の誘導基質由来不純物の有意な低下として顕現す
る。

【００３７】本発明の反応は、前記のごとく創出された
変異微生物を用い、酵素誘導に要するニトリル化合物濃
度が削減できること以外において、通常のニトリル加水
分解活性を持つ微生物によるカルボン酸生成反応と同様
の変換反応として実施することができる。

【００３８】例えば、ＳＤ８３０株を１ｗ／ｖ％ペプト
ンなどの栄養培地で、２０℃〜４０℃、望ましくは２５
℃〜３０℃の温度で２４時間程度培養し、得られた培養
液に、誘導基質としてニトリル化合物、たとえばベンゾ
ニトリルを０．１ｐｐｍ〜１ｗ／ｖ％、望ましくは１ｐ
ｐｍ〜０．１ｗ／ｖ％添加、さらに目的反応の原料とな
るニトリル化合物を添加し、引き続き同様の温度で１時
間〜２００時間程度撹拌し続けることにより達せられ
る。なお添加される原料ニトリル化合物は必ずしも全量
が溶解していなくてもよいが、反応液中での溶解性や分
散性を改善するような溶媒、界面活性剤等を添加するこ
ともできる。また反応の進行による原料ニトリル化合物
の消費に応じて、連続的あるいは間欠的にニトリル化合
物を添加してもよく、この場合のニトリル化合物の反応
液中濃度は前記の限りではない。

【００３９】微生物を培養するための培地炭素源として
は、グルコースやシュークロース、フルクトース、廃糖
蜜等の糖類、エタノールや酢酸、クエン酸、コハク酸、
乳酸、安息香酸、脂肪酸などの有機物又はこれらのアル
カリ金属塩、ｎ−パラフィンなどの脂肪族炭化水素類、
芳香族炭化水素類、また例えばペプトン、肉エキス、魚
エキス、大豆粉、ふすま等の天然有機物を、単独、ある
いはこれらの組み合わせにより、通常０．０１ｗ／ｖ％
〜３０ｗ／ｖ％、望ましくは０．１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／
ｖ％程度の濃度で用いることができる。

【００４０】微生物を培養するための培地窒素源として
は、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝
酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素化合物、ま
た尿素、尿酸などの含窒素有機物、ペプトン、肉エキ
ス、魚エキス、大豆粉、等の天然有機物を単独、あるい
はこれらの組み合わせにより、通常０．０１ｗ／ｖ％〜
３０ｗ／ｖ％、望ましくは０．１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ
％程度の濃度で用いることができる。

【００４１】さらに必要に応じて、リン酸２水素カリウ
ム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、酢酸
カルシウム、塩化マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸コ
バルト、硫酸ニッケルなどの金属塩が菌の生育改善のた
めに添加される。添加濃度は培養条件により異なるが、
通常、リン酸塩に関しては０．０１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ
％、マグネシウム塩においては１０ｐｐｍ〜１ｗ／ｖ
％、他の化合物では０．１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ程度
である。

【００４２】また選択する培地により、ビタミン類、ア
ミノ酸、核酸などの供給源として例えば酵母エキス、カ
ザミノ酸、酵母核酸を１ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ程度添加
することにより、菌の生育を改善することができる。い
ずれの成分を用いた場合も培地のｐＨは、５〜９、望ま
しくは６〜８に調整されることが望ましい。

【００４３】反応中のｐＨは、十分な濃度の緩衝液を用
いる場合においては通常維持されうるが、反応の進行に
より上記ｐＨを逸脱する場合においては、水酸化ナトリ
ウム、アンモニアなどを用い適宜調整することが望まし
い。

【００４４】反応液中に生成したシアノカルボン酸は、
その反応液中での性状により、遠心分離、膜ろ過、減圧
乾燥、蒸留、溶媒抽出、塩析、イオン交換、各種クロマ
トグラフィーなど通常用いられる方法で分取される。最
も簡便には、反応液を酸性に調整することによりシアノ
カルボン酸を析出させ、沈殿を遠心分離またはろ過する
ことにより回収することができる。

【００４５】本発明によれば、主産物以外の、誘導基質
由来のニトリル加水分解物はあらかじめ低減されてお
り、こうした簡便な方法によっても高い純度のカルボン
酸類が取得でき、精製工程の負担も低減される。なお反
応生成物が水溶液として得られる場合は、生成物が溶解
した条件下で、遠心分離、膜ろ過などの方法により、微
生物菌体を除去しておくことが好適である。

【００４６】また反応生成物が固形物として得られる場
合は、結晶が十分に大きい場合はステンレス、ナイロン
等のメッシュを用いて生成物を分取することができる。
結晶が微生物との分別が困難な程度に微少な場合は、そ
れらが溶解するような条件、例えばアルカリ条件下など
により一度水溶液として、遠心分離、膜ろ過等の方法に
より菌体を除去し、しかる後に条件を回復し再度沈殿さ
せ分取する方法は好適である。ただし反応液の直接蒸留
など、微生物が除かれることが自明な手法をとることが
できる場合においてはこの限りではない。

【００４７】反応生成物の性質によっては、反応液中に
生成物が蓄積することにより、反応速度が低下する場合
がある。このような場合は、生成物の濃度に応じて反応
液中に、水、生理食塩水、反応緩衝液を追加し連続的に
希釈していく方法は好適である。

【００４８】また反応速度が低下した時点で菌を分取
し、上清を生産物溶液として回収し、分取した菌は再度
反応原料を含む溶液あるいは懸濁液に戻すことにより、
反応速度を回復することができる。これらの方法は、微
生物のニトリル加水分解活性が維持される範囲におい
て、何回でも繰り返すことができる。

【００４９】本発明の方法によれば、通常知られる種々
のニトリル化合物を主原料として、例えば脂肪族ニトリ
ル、芳香族ニトリル、複素環式ニトリル等を対象とし、
高い選択率で対応するカルボン酸を得ることができる。

【００５０】脂肪族ニトリルとしては、例えばアセトニ
トリル、プロピオニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソ
ブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、イソバレロニト
リル、カプロニトリル、マロノニトリル、サクシノニト
リル、アジポニトリル、グルコノニトリル、アクリロニ
トリル、メタクリロニトリル等が挙げられる。

【００５１】また芳香族ニトリルとしてはベンゾニトリ
ル、トルニトリル、オルトフタロニトリル、テレフタロ
ニトリル、イソフタロニトリル及びこれら芳香族ニトリ
ル化合物の置換体、例えば塩素化物、フッ素化物、ニト
ロ化物、アミノ化物等が挙げられる。

【００５２】また複素環式ニトリルとしては、３−シア
ノピリジン、４−シアノピリジン、シアノインドール類
等が挙げられる。

【００５３】また本発明によれば、上記の主原料の二ト
リル化合物のうち、特に１分子中に複数のシアノ基を有
するポリニトリル化合物を対象とし、高い選択率で対応
するシアノカルボン酸を得ることができる。

【００５４】このようなポリニトリル化合物としては、
例えば脂肪族ニトリルとしては、マロノニトリル、サク
シノニトリル、アジポニトリル、グルコノニトリル等；
また芳香族ニトリルとしてはオルトフタロニトリル、テ
レフタロニトリル、イソフタロニトリル；及びこれら芳
香族ニトリル化合物の置換体、例えば塩素化物、フッ素
化物、ニトロ化物、アミノ化物等を挙げることができ
る。

【００５５】本発明によれば、上記のごとき種々のニト
リル化合物から、より少ない酵素誘導基質を用いて、効
率よく、なおかつ純度よく、対応するカルボン酸類を得
ることができる。

【００５６】本発明に適用される酵素誘導基質として
は、ベンゾニトリル、３−シアノピリジン、４−シアノ
ピリジン、イソブチロニトリル、イソバレロニトリル、
オルトフタロニトリル、イソフタロニトリル、テレフタ
ロニトリル等が挙げられる。

【００５７】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。なお、これら実施例は単なる例示であって本発明の
範囲をなんら限定するものではない。

【００５８】［実施例１］ 変異株の作成 ロドコッカス ｓｐ． ＳＤ８２６ ＦＥＲＭ ＢＰ−
７３０５を、ＬＢ寒天培地に画線し、３０℃恒温槽中で
２４時間培養した。生じたコロニーより１白金耳掻き取
り、ＬＢ液体培地５ｍｌに接種、３０℃の振盪培養器に
て６時間振盪培養した。菌体を１０，０００ｇの遠心に
より回収し、等容の５０ｍＭ リン酸カリウム／ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄した後、等容の同
緩衝液に再度懸濁した。菌懸濁液に、２０００ｐｐｍ
ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン）溶液を、終濃度にして１００ｐｐｍとなるよう
添加しよく撹拌後、室温で３０分間放置した。菌体を１
０，０００ｇの遠心により回収し、同緩衝液で１回洗浄
後、菌体を少量の同緩衝液に再度懸濁し、全量をＬＢ液
体培地５ｍｌに接種し３０℃、１２時間振盪培養した。
得られた培養液を５００倍に希釈し、希釈液を、下記組
成の固体培地Ａ（直径９０ｍｍシャーレ上）に各０．１
ｍｌずつ、３００枚に塗布した。

【００５９】 （固体培地Ａ） テレフタロニトリル １ｇ（よく撹拌し結晶を分散） ベンゾニトリル ０．０１ｇ グルコース ５ｇ 尿素 ２ｇ リン酸１カリウム １．５ｇ リン酸２ナトリウム １．５ｇ 硫酸マグネシウム７水和物 ０．２ｇ 硫酸カルシウム２水和物 １０ｍｇ 硫酸鉄７水和物 ５ｍｇ 酵母エキス ２０ｍｇ 寒天 １５ｇ／Ｌ

【００６０】３０℃、７２時間培養し、テレフタロニト
リルの分解円を認めたコロニーについてそれぞれ下記液
体培地Ｂ ５ｍｌに接種し、さらにテレフタロニトリル
１ｗ／ｖ％、ベンゾニトリル０．１ｗ／ｖ％〜０．００
１ｗ／ｖ％を添加し３０℃、４８時間反応した。

【００６１】それぞれの株について得られた反応液の上
清を１００倍に希釈し、逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｈｏ
ｄｅｘ（昭和電工株式会社登録商標） ＤＳ−６１３、
溶離液：５０％アセトニトリル／５ｍＭリン酸カリウム
緩衝液ｐＨ３．０、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ
２１０ｎｍ）に供した。うち１株（ＳＤ８３０株）につ
いて、得られた反応液中の、ニトリル由来カルボン酸の
組成を図１に示す。

【００６２】 （液体培地Ｂ） グルコース ５ｇ 尿素 ２ｇ リン酸１カリウム １．５ｇ リン酸２ナトリウム １．５ｇ 硫酸マグネシウム７水和物 ０．２ｇ 硫酸カルシウム２水和物 １０ｍｇ 硫酸鉄７水和物 ５ｍｇ 酵母エキス ２０ｍｇ／Ｌ

【００６３】［比較例１］親株ＳＤ−８２６株について
実施例１と同様に液体培地Ｂ ５ｍｌに接種し、さらに
テレフタロニトリル１ｗ／ｖ％、ベンゾニトリル０．１
ｗ／ｖ％〜０．００１ｗ／ｖ％を添加し３０℃、４８時
間反応した。ＨＰＬＣに供し得られたニトリル由来カル
ボン酸の組成を図２に示す。

【００６４】変異株は、テレフタロニトリルより４−シ
アノ安息香酸の生産性を低減することなく、誘導基質で
あるベンゾニトリルを低減できること、またベンゾニト
リルを低減することにより、４−シアノ安息香酸に対す
るベンゾニトリル由来の安息香酸量を低減できることが
判明した。

【００６５】［実施例２］生成物の取得 実施例１で得られたＳＤ８３０株を、フラスコ中ＬＢ培
地１００ｍＬで３０℃２０時間培養したのち、培養液を
全量、下記液体培地Ｃ ２リットルに接種し、さらに３
０℃、２４時間培養した。得られた培養液に、テレフタ
ロニトリル６０ｇ、ベンゾニトリル４０ｍｇを添加し、
３０℃、２４時間反応した。実施例１と同様のＨＰＬＣ
分析により、反応液中に３．２０％の４−シアノ安息香
酸の蓄積を確認した。

【００６６】 （液体培地Ｃ） グルコース ２０ｇ 尿素 １０ｇ リン酸１カリウム １．５ｇ リン酸２ナトリウム １．５ｇ 硫酸マグネシウム７水和物 ０．４ｇ 硫酸カルシウム２水和物 ２０ｍｇ 硫酸鉄７水和物 １０ｍｇ 酵母エキス ４０ｍｇ／Ｌ

【００６７】培養液を遠心分離し菌体を除去、上清を分
取した。２Ｎ硝酸をｐＨ２．５まで添加し、４−シアノ
安息香酸を析出させ、Ｎｏ．５Ａ濾紙にて吸引ろ過し
た。さらに濾紙上で２Ｌの蒸留水を通じて洗浄したの
ち、沈澱を掻き取り、６０℃にて３日間減圧乾燥した。
得られた固形物を全量粉砕し一部サンプリング・再溶解
し、実施例１と同様ＨＰＬＣにより分析した。全乾物重
量は６０．２ｇ、うち４−シアノ安息香酸含量は９９．
４０％、安息香酸含量は０．０４％であった。

【００６８】［比較例２］生成物の取得 変異株ＳＤ８３０の親株ＳＤ８２６株を、実施例２と同
様に培養し、得られた培養液に、テレフタロニトリル６
０ｇ、ベンゾニトリル２ｇを添加し、３０℃、２４時間
反応した。同様の分析により、反応液中３．１７％の４
−シアノ安息香酸の蓄積を確認した。

【００６９】培養液を遠心分離し菌体を除去、上清を分
取し、実施例２と同様に酸性下沈澱を分取、乾燥した。
得られた固形物を全量粉砕し一部サンプリング・再溶解
し、実施例２と同様ＨＰＬＣにより分析した。全乾物重
量は５９．２ｇ、うち４−シアノ安息香酸含量は９８．
１０％、安息香酸含量は１．５４％であった。

【００７０】［比較例３］生成物の取得 変異株ＳＤ８３０の親株ＳＤ８２６株を用い、ベンゾニ
トリルを４０ｍｇとした以外は比較例２と同様にして、
反応液を得た。同様の分析により、反応液中０．２７％
の４−シアノ安息香酸の蓄積を確認した。

【００７１】培養液を遠心分離し菌体を除去、上清を分
取し、実施例２と同様に酸性下沈澱を分取、乾燥した。
得られた固形物を全量粉砕し一部サンプリング・再溶解
し、実施例２と同様ＨＰＬＣにより分析した。全乾物重
量は２．４ｇ、うち４−シアノ安息香酸含量は９７．６
５％、安息香酸含量は１．８４％であった。

【００７２】

【発明の効果】本発明により得られる高純度カルボン酸
類、特に高純度シアノカルボン酸類は、医薬、農薬、染
料・香料、その他ファインケミカルズの合成原料として
有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の微生物SD830を用いた、誘導基質ベン
ゾニトリルの添加量と、そのときの４−シアノ安息香酸
の生産性、および生成する誘導基質由来の副生物である
安息香酸量の関係の一例を示すグラフである。

【図２】本発明の微生物SD830の改変前微生物（親株）
であるSD826を用いた、誘導基質ベンゾニトリルの添加
量と、そのときの４−シアノ安息香酸の生産性、および
生成する誘導基質由来の副生物である安息香酸量の関係
の一例を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 13/00 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ニトリル化合物を誘導基質としてシアノ基
   の加水分解酵素活性を発現または向上しうる微生物、ま
   たは該微生物処理物を主原料のニトリル化合物に作用さ
   せ、カルボン酸類を得る製法において、該微生物の変異
   微生物を用い誘導基質の使用量を低減することを特徴と
   するカルボン酸類の製法。
2. 【請求項２】主原料のニトリル化合物がポリニトリル化
   合物であることを特徴とする請求項１に記載のシアノカ
   ルボン酸類の製法。
3. 【請求項３】ポリニトリル化合物がオルトフタロニトリ
   ル、イソフタロニトリルまたはテレフタロニトリルのい
   ずれかであり、得られる化合物がそれぞれ２−シアノ安
   息香酸、３−シアノ安息香酸、４−シアノ安息香酸であ
   ることを特徴とする請求項２に記載のカルボン酸類の製
   法。
4. 【請求項４】誘導基質が、ベンゾニトリル、３−シアノ
   ピリジン、４−シアノピリジン、イソブチロニトリル、
   イソバレロニトリル、オルトフタロニトリル、イソフタ
   ロニトリルまたはテレフタロニトリルのいずれかである
   ことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の
   カルボン酸類の製法。
5. 【請求項５】変異微生物が、ロドコッカス属由来微生物
   であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに
   記載のカルボン酸類の製法。
6. 【請求項６】変異微生物が、ロドコッカスｓｐ．ＳＤ８
   ２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０５）株の変異株であるこ
   とを特徴とする請求項５に記載のカルボン酸類の製法。
7. 【請求項７】変異微生物が、ロドコッカスｓｐ．ＳＤ８
   ３０（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７１４）株であることを特徴
   とする請求項５に記載のカルボン酸類の製法。
8. 【請求項８】ニトリル化合物を誘導基質としてシアノ基
   の加水分解酵素活性を発現または向上しうる微生物を親
   株として、より低濃度のニトリル化合物を誘導基質とし
   てシアノ基の加水分解酵素活性を発現または向上するよ
   う改変された変異微生物。
9. 【請求項９】改変前の８０％濃度以下のニトリル化合物
   によりシアノ基の加水分解酵素活性を発現するよう改変
   された請求項８に記載の変異微生物。
10. 【請求項１０】親株が、ロドコッカス属微生物由来であ
    ることを特徴とする請求項８または９に記載の変異微生
    物。
11. 【請求項１１】親株が、ロドコッカスｓｐ．ＳＤ８２６
    （ＦＥＲＭ ＢＰ−１８７１４）株であることを特徴と
    する、請求項１０に記載の変異微生物。
12. 【請求項１２】ロドコッカスｓｐ．ＳＤ８３０（ＦＥＲ
    Ｍ Ｐ−１８７１４）株。