JP2003247980A - Method of separating component constituting reversal complex by free flow electrophoresis, and method and device for determining interaction between components constituting reversal complex by free flow electrophoresis - Google Patents
Method of separating component constituting reversal complex by free flow electrophoresis, and method and device for determining interaction between components constituting reversal complex by free flow electrophoresisInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、フリーフロー電気
泳動法により可逆的複合体を構成する構成成分の分離す
る方法、フリーフロー電気泳動法により可逆的複合体を
構成する構成成分の相互作用を決定する方法および装置
に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for separating components constituting a reversible complex by a free flow electrophoresis method, and an interaction of components constituting a reversible complex by a free flow electrophoresis method. A method and apparatus for determining.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、マイクロマシン技術は着目されつ
つあり、電気泳動を利用した試料の前処理システムにも
その応用が試みられるようになってきている。例えば、
Anal．Chem.Vol.６６，２８５８-２８６５（１９９４）
及び米国特許No.5,180,480には、フリーフロー電気泳動
を応用した試料の前処理システムが記載されている。こ
のフリーフロー電気泳動装置は、導入口と排出口とを備
えた密封流床と、流床中の流れ方向と平行でかつ流床の
両側に配置された一対の電極とからなる。本装置では、
流床中に電気泳動を行なうための緩衝液を流すととも
に、試料を上流位置で滴下し、電極間に電圧を印加し流
れと直角方向に電場を印加することによって、該試料を
緩衝液によって下流に運ぶとともに、電気泳動を行な
い、試料の構成成分を分離する。2. Description of the Related Art In recent years, attention has been paid to micromachine technology, and its application has been attempted in a sample pretreatment system using electrophoresis. For example,
Anal. Chem. Vol.66, 2858-2865 (1994)
And US Pat. No. 5,180,480 describes a sample pretreatment system to which free flow electrophoresis is applied. This free-flow electrophoresis apparatus comprises a sealed fluidized bed having an inlet and an outlet, and a pair of electrodes arranged in parallel to the flow direction in the fluidized bed and on both sides of the fluidized bed. With this device,
While flowing a buffer solution for electrophoresis in the flow bed, by dropping the sample at the upstream position, applying a voltage between the electrodes and applying an electric field in the direction perpendicular to the flow, the sample is moved downstream by the buffer solution. And carry out electrophoresis to separate the constituent components of the sample.
【０００３】このような装置においては、電気泳動の終
了する時点の流床をさらに細分化することによって、分
離した成分のうち目的の成分を取り出し連続的に試料の
前処理を行なうことが可能となる。上記のように連続的
前処理を行なうことが可能なため、マイクロマシン技術
を用いた微小なシステムでも、ｍｌのレベルの試料であ
れば１つのモジュールでシステムのサイズを変えること
なく必要な試料量に応じて処理を行なうことが可能とな
る。In such an apparatus, by further subdividing the flow bed at the end of electrophoresis, the target component among the separated components can be taken out and the sample can be continuously pretreated. Become. Since it is possible to perform continuous pretreatment as described above, even with a micro system using micromachine technology, if a sample of ml level is used, one module can achieve the required sample amount without changing the system size. Processing can be performed accordingly.
【０００４】また、特開２００１−９１４９７号の「フ
リーフロー電気泳動装置」においては安定化した流れを
確保するために試料排出口の流床の圧力損失を均一にす
る構造、及び両側の電極で発生する気泡が分離部へ流れ
込まないように電極部と分離部にバリヤーを形成する構
造が提案されている。Further, in the "free flow electrophoresis apparatus" of Japanese Patent Laid-Open No. 2001-91497, in order to ensure a stable flow, a structure for uniform pressure loss in the bed of the sample discharge port and electrodes on both sides are used. A structure has been proposed in which a barrier is formed in the electrode portion and the separation portion so that the generated bubbles do not flow into the separation portion.
【０００５】一方、バイオ分子間の相互作用を測定する
システムとして表面プラズモンを利用したシステムが商
品化されている。このシステムは、基板表面に対象とな
る分子を固定し、その分子と他の分子間の結合を光学的
な変化として捉えるものである。例えば、基板表面に固
定した分子が他の分子と結合すると表面の屈折率、膜厚
等が変化し、表面プラズモン共鳴が変化する。その現象
を利用して蛋白の抗原抗体反応やＤＮＡ等のハイブリダ
イゼイション反応を測定できる。On the other hand, a system utilizing surface plasmons has been commercialized as a system for measuring the interaction between biomolecules. This system immobilizes a target molecule on the surface of a substrate and captures the bond between the molecule and another molecule as an optical change. For example, when a molecule fixed to the surface of a substrate binds to another molecule, the refractive index of the surface, the film thickness, etc. change, and the surface plasmon resonance changes. The phenomenon can be used to measure the antigen-antibody reaction of proteins and the hybridization reaction of DNA and the like.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】従来、フリーフロー電
気泳動装置は複数の構成成分からなる試料を分離するた
めに用いていたが、該装置を可逆的な相互作用で結合し
た複数の構成成分からなる試料可逆的複合体について、
該複数成分間の相互作用を調べるために使用することに
ついては何ら研究されてもいなかったし、そのような課
題は存在していなかった。Conventionally, a free-flow electrophoresis apparatus has been used to separate a sample composed of a plurality of constituent components, but the apparatus is composed of a plurality of constituent components which are bound by reversible interaction. For the sample reversible complex
There has been no research into using it to investigate the interaction between the multiple components, and such a problem did not exist.
【０００７】また、上記の表面プラズモンを利用した分
子間相互作用を測定するシステムは優れた方法である
が、片方の分子が基板に固定されているため、反応部位
が限られている等の、反応に制約があるため反応速度が
遅く、また相互作用の強さを測定するためには解離液を
流して測定をする必要がある等の問題がある。この場
合、解離液によって物質を変性させる可能性があり、ま
た測定に時間がかかるという問題もある。そこで、変性
されること無くより自然な状態でかつ短い時間で物質相
互間の相互作用を測定できる方法が望まれる。The system for measuring intermolecular interaction utilizing surface plasmons is an excellent method, but one molecule is immobilized on the substrate, so that the reaction site is limited. There are problems that the reaction rate is slow because the reaction is limited, and that the dissociation solution must be flowed to measure the strength of the interaction. In this case, the substance may be denatured by the dissociation solution, and there is also a problem that the measurement takes time. Therefore, a method that can measure the interaction between substances in a more natural state in a short time without being denatured is desired.
【０００８】本発明は、上記従来技術に鑑み、フリーフ
ロー電気泳動装置を、可逆的複合体を構成する複数構成
成分間の相互作用を調べるために使用することを試み、
解離液等不要な物質を使用することがなく、かつ物質の
変性を伴わず短い時間で構成成分間の相互作用を調べる
ことを可能とする技術を提供することを目的とするもの
である。「可逆的複合体」については、後述する。In view of the above-mentioned prior art, the present invention attempts to use a free-flow electrophoresis apparatus to investigate the interaction between a plurality of components constituting a reversible complex,
It is an object of the present invention to provide a technique capable of examining an interaction between constituent components in a short time without denaturing a substance without using an unnecessary substance such as a dissociation solution. The “reversible complex” will be described later.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】本願の第１の発明は、試
料及び緩衝液を上流から下流へ流しながら、流れと垂直
に電圧を印加し電気泳動を行なうフリーフロー電気泳動
法により試料を分離する方法において、試料として可逆
的複合体を流し、電場によって可逆的複合体をその構成
成分に分離する方法に関する。According to a first aspect of the present invention, a sample is separated by a free-flow electrophoresis method in which a sample and a buffer solution are caused to flow from upstream to downstream and a voltage is applied perpendicularly to the flow to perform electrophoresis. In the above method, a reversible complex is flown as a sample, and the reversible complex is separated into its constituent components by an electric field.
【００１０】また、本願の第２の発明は、試料及び緩衝
液を上流から下流へ流しながら、流れと垂直に電圧を印
加し電気泳動を行なうフリーフロー電気泳動法により試
料を分離するに当たり、試料として可逆的複合体を流
し、電場によって可逆的複合体をその構成成分に分離
し、該構成成分の相互作用の強さを決定する、可逆的複
合体の構成成分の相互作用の決定方法に関する。The second invention of the present application is to separate a sample by a free-flow electrophoresis method in which a sample and a buffer solution are allowed to flow from an upstream side to a downstream side and a voltage is applied perpendicularly to the flow to perform electrophoresis. And a method for determining the interaction of the constituents of the reversible complex, in which the reversible complex is allowed to flow, the reversible complex is separated into its constituents by an electric field, and the strength of the interaction between the constituents is determined.
【００１１】さらに、本願の第３の発明は、試料及び緩
衝液を上流から下流へ流しながら、流れと垂直に電圧を
印加し電気泳動を行なうフリーフロー電気泳動法により
試料を分離するに当たり、試料としての可逆的複合体を
構成する少なくとも２種類の構成成分を別々に供給し、
電場により電気泳動させることにより該少なくとも２種
類の構成成分を合流させて可逆的複合体を形成させ、試
料として形成された可逆的複合体をさらに流し、電場に
よって可逆的複合体をその構成成分に分離し、該構成成
分の相互作用を決定する、可逆的複合体の構成成分の相
互作用の決定方法に関する。Further, according to the third invention of the present application, when the sample and the buffer solution are flowed from the upstream side to the downstream side, the sample is separated by a free-flow electrophoresis method in which a voltage is applied perpendicularly to the flow to perform electrophoresis. At least two kinds of constituent components constituting the reversible complex as
The at least two kinds of constituent components are merged by electrophoresing by an electric field to form a reversible complex, the reversible complex formed as a sample is further flowed, and the reversible complex is converted into its constituent components by the electric field. The present invention relates to a method for determining an interaction between components of a reversible complex, which is separated and determines an interaction between the components.
【００１２】試料及び緩衝液を上流から下流へ流しなが
ら、流れと垂直に電圧を印加し電気泳動を行ない試料を
分離するためのフリーフロー電気泳動装置において、試
料としての可逆的複合体を流すための流床と、流床中の
流れ方向と直角方向に電場をかけるための流床の両側に
配置された一対の電極と、該構成成分の相互作用を決定
する相互作用決定手段とからなる、可逆的複合体の構成
成分の相互作用の強さの決定するためのフリーフロー電
気泳動装置。In order to flow a reversible complex as a sample in a free-flow electrophoresis apparatus for separating a sample by applying a voltage perpendicular to the flow while flowing the sample and the buffer solution from the upstream to the electrophoresis. Of the bed, a pair of electrodes arranged on both sides of the bed for applying an electric field in a direction perpendicular to the flow direction in the bed, and an interaction determining means for determining the interaction of the constituents. Free-flow electrophoresis apparatus for determining the strength of interaction of components of a reversible complex.
【００１３】[0013]
【発明の実施の形態】以下に、本発明について詳細に説
明する。
（１）電気泳動装置
まず、図１（ａ）と図1（ｂ）とに本発明で用いるフリ
ーフロー電気泳動装置を示す。フリーフロー電気泳動装
置は、緩衝液を一定の方向に流すための扁平な空隙を流
床とする電気泳動用流床１と、この流床の上流に設けた
緩衝液導入口２と、流床に試料を注入するための試料導
入口３と、流床の流床方向下流に設けた試料の分離成分
を取り出すための分離成分分取口４，５，６と、流床の
両側に流れと平行に設け緩衝液の流れに電界を印加する
ための第１、第２の電極７，８とからなり、流床は一対
の互いに隔てたガラス板９，１０により形成されてい
る。電気泳動装置はそれ自体は既知であるので、詳細な
説明は省く。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention is described in detail below. (1) Electrophoresis Device First, FIGS. 1A and 1B show a free-flow electrophoresis device used in the present invention. The free-flow electrophoresis apparatus comprises an electrophoresis flow bed 1 having a flat void as a flow bed for flowing a buffer solution in a certain direction, a buffer solution inlet 2 provided upstream of the flow bed, and a flow bed. A sample inlet 3 for injecting a sample into the chamber, separated component collecting ports 4, 5 and 6 provided downstream of the flow bed in the flow bed direction for taking out a separated component of the sample, and a flow on both sides of the flow bed. The first and second electrodes 7 and 8 are provided in parallel to apply an electric field to the flow of the buffer solution, and the flow bed is formed by a pair of glass plates 9 and 10 separated from each other. Since the electrophoretic device is known per se, a detailed description will be omitted.
【００１４】（２）可逆的複合体
本発明の対象とする可逆的複合体とは、複数の構成成分
で構成され、相互に静電的結合、分子間引力等によって
結合され、電場を印加の下、電気泳動により可逆的に解
離する複数の構成成分で構成される可逆的結合・解離可
能な複合体を意味し、該複数の構成成分は電気泳動によ
る移動度(例えば、等電点の相違による)が異なるため、
電場印加下で電気泳動させることによって解離・分離可
能となっている。可逆的複合体には、陰イオン−陽イオ
ンの組合わせ、抗原−抗体等の蛋白−蛋白の組合わせ、
蛋白−ＤＮＡの組合わせ、蛋白−ＲＮＡの組合わせ、ド
ナー−レセプターなどの様々な組合わせが挙げられる。
例えば、陰イオン−陽イオンとの例としては、キシレン
シアノ−ル(アニオン性色素)とサフラニンＴ(カチオン
性色素)の組合わせ、オレンジＧ（アニオン性色素）と
サフラニンＴとの組み合わせ等がある。可逆的複合体を
形成すると両者が混合した色を呈し、長時間経過すると
沈殿を生じる。また、ターゲットとなる抗原に対して、
種々の抗体を混合して可逆的複合体を形成して試料とし
て用いると、抗原とそれらの各種の抗体との間の相対的
結合強さを比較することが可能となる。(2) Reversible Complex The reversible complex, which is the object of the present invention, is composed of a plurality of constituent components, which are mutually coupled by electrostatic coupling, intermolecular attractive force or the like, and are subjected to an electric field. In the following, a reversible bond-dissociable complex composed of a plurality of components that reversibly dissociate by electrophoresis is referred to, and the plurality of components are mobilities due to electrophoresis (for example, differences in isoelectric point). Due to different)
It can be dissociated and separated by electrophoresis under an electric field. The reversible complex includes an anion-cation combination, an antigen-antibody etc. protein-protein combination,
Various combinations of protein-DNA combinations, protein-RNA combinations, donor-receptors and the like can be mentioned.
For example, examples of the anion-cation include a combination of xylene cyano-l (anionic dye) and safranin T (cationic dye), a combination of orange G (anionic dye) and safranin T, and the like. . When a reversible complex is formed, the two show a mixed color and precipitate after a long time. Also, for the target antigen,
When various antibodies are mixed to form a reversible complex and used as a sample, it becomes possible to compare the relative binding strength between an antigen and these various antibodies.
【００１５】試料としての可逆的複合体には、可逆的
複合体として既に存在しているものを使用する場合、
予め、可逆的複合体を形成して被分離試料として用いる
場合、また可逆的複合体の複数の構成成分を別々に流
床中に供給し、流床中で電場を印加し電気泳動させるこ
とにより相互結合させ可逆的複合体を形成する場合等の
いずれの可逆的複合体が含まれる。When a reversible complex already existing is used as the reversible complex as a sample,
When a reversible complex is formed in advance and used as a sample to be separated, by supplying a plurality of constituent components of the reversible complex separately to a fluidized bed and applying an electric field in the fluidized bed to perform electrophoresis. Any reversible complex is included, such as when they are linked together to form a reversible complex.
【００１６】（３）緩衝液、緩衝液の流速、電場の強さ
等の電気泳動分離条件
緩衝液、緩衝液の流速、電場の強さ等の電気泳動分離条
件は、当業者であれば、対象とする可逆的複合体の種
類、用いるフリーフロー電気泳動装置等を考慮して適宜
決めることができる。例えば、緩衝液としては、トリス
・グリシン緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液が利用でき、
それらの緩衝液のイオン強度、ｐＨ等は種々調整でき
る。また、緩衝液のpHを変えることにより構成成分の電
荷を変え、分離をより良好に行なうこともできる。電場
の強さは、例えば、構成成分の分離能をあげるため、分
離初期の電場を強くする等の調整を行なうこともでき
る。(3) Electrophoretic separation conditions such as buffer solution, flow rate of buffer solution, and strength of electric field Electrophoretic separation conditions such as buffer solution, flow rate of buffer solution, and strength of electric field can be determined by those skilled in the art. It can be appropriately determined in consideration of the type of the reversible complex to be targeted, the free-flow electrophoresis apparatus used, and the like. For example, as the buffer solution, a buffer solution such as Tris-glycine buffer solution or acetate buffer solution can be used,
The ionic strength, pH, etc. of these buffers can be adjusted in various ways. Further, by changing the pH of the buffer solution, the charges of the constituents can be changed, and the separation can be performed better. The strength of the electric field can be adjusted by, for example, increasing the electric field at the initial stage of separation in order to increase the separation ability of the constituent components.
【００１７】（４）可逆的複合体が電気泳動時点から分
離開始をするまでの時間、距離の測定
可逆的複合体は、電場の中に置かれてフリーフロー電気
泳動にかけられた場合、すぐにその構成成分への分離は
始まらず、少し電場の中を流れてから分離が始まる。微
視的には分離しても、目視現象あるいは測定可能な現象
として現れるまでは一定の時間が必要であるからであ
る。この分離が始まるまでの時間、距離は可逆的複合体
の強さを反映すると考えることができ、このような分離
現象を利用することによって、単なる結合現象のみでな
く、結合の相対的強さを測定することが可能である。従
って、当該時間及び／または距離を測定することによっ
て、可逆的複合体を構成する構成成分間の相互作用の強
さを評価、測定することができる。(4) Measurement of the time and distance from the point of electrophoresis of the reversible complex to the start of separation When the reversible complex is placed in an electric field and subjected to free-flow electrophoresis, it is immediately measured. Separation into its constituents does not begin, but the separation begins after flowing through the electric field for a while. This is because, even if they are microscopically separated, a certain amount of time is required until they appear as a visual phenomenon or a measurable phenomenon. It can be considered that the time until the separation starts and the distance reflect the strength of the reversible complex, and by utilizing such a separation phenomenon, not only the binding phenomenon but also the relative strength of the binding can be determined. It is possible to measure. Therefore, by measuring the time and / or the distance, it is possible to evaluate and measure the strength of the interaction between the constituent components of the reversible complex.
【００１８】可逆的複合体が電気泳動時点から分離開始
をするまでの時間、距離は、例えば色の変化を分光器で
モニターしたり、あるいは吸光度の変化をモニターした
り、・・・することによって測定することができる。当
該時間および距離を予め決定しておいた換算方法によっ
て、可逆的複合体を構成する構成成分間の相互作用の強
さに容易に換算・決定できる。または、可逆的複合体形
成前の単一成分をそれぞれ単独で試料として泳動分離後
の試料回収位置と複合体形成による相互作用により変化
した試料回収位置を比較することによって換算・決定で
きる。The time and distance from the point of electrophoresis of the reversible complex to the start of separation can be determined by, for example, monitoring the change in color with a spectroscope or the change in absorbance. Can be measured. The time and distance can be easily converted and determined to the strength of interaction between the constituent components of the reversible complex by a conversion method that has been determined in advance. Alternatively, it can be converted and determined by comparing the sample collection position after electrophoretic separation with the single component before reversible complex formation alone as a sample and the sample collection position changed by the interaction due to complex formation.
【００１９】（５）電気泳動パターン
図２は、可逆的複合体を注入し、電気泳動開始時点
から分離開始をするまでの時間及び／または距離を測定
するモニター装置を備えたフリーフロー電気泳動装置の
模式的説明図である。(5) Electrophoresis pattern FIG. 2 is a free-flow electrophoresis apparatus equipped with a monitor device for injecting a reversible complex and measuring the time and / or distance from the start of electrophoresis to the start of separation. It is a schematic explanatory view of.
【００２０】図中、２１は、緩衝液を一定の方向に流す
ための扁平な空隙を流床とする電気泳動用流床であり、
この流床の上流にはそれぞれ緩衝液導入口２と流床に試
料を注入するための試料導入口３とが設けられ、試料の
分離成分を取り出すための分離成分分取口５，６とが設
けられている（緩衝液排出口４、分離成分分取口５，６
の配列は図１参照）。図示しないが、流床の両側に流れ
と平行に設け緩衝液の流れに電界を印加するための第
１、第２の電極が設けられ、また流床は一対の互いに隔
てたガラス板により形成されている。緩衝液導入口２と
試料導入口３とには、それぞれペリスタポンプ２２，２
３を備えた緩衝液導入チューブ２４と試料導入チューブ
２５とが接続されている。In the figure, reference numeral 21 is a electrophoresis bed having a flat void for flowing the buffer solution in a certain direction as a bed.
A buffer introduction port 2 and a sample introduction port 3 for injecting a sample into the flow bed are provided upstream of this flow bed, and separated component collection ports 5 and 6 for taking out separated components of the sample are provided. Provided (buffer solution discharge port 4, separated component collection ports 5 and 6)
(See Figure 1 for the sequence). Although not shown, first and second electrodes are provided on both sides of the flow bed in parallel with the flow for applying an electric field to the flow of the buffer solution, and the flow bed is formed by a pair of glass plates separated from each other. ing. The buffer solution inlet port 2 and the sample inlet port 3 are provided with peristaltic pumps 22, 2 respectively.
The buffer solution introducing tube 24 provided with 3 and the sample introducing tube 25 are connected.
【００２１】流床の上下にはそれぞれ照明３０とミラー
３１とが設けられ、ミラーの反射面にフィルター３２を
介してＴＶカメラ３３が対向している。ＴＶカメラには
ディスプレイ３４と記録再生装置３５とが接続されてい
る。図中、４０は制御部であり、図示しない切り換え弁
の動作、ペリスタポンプ２２，２３の動作を制御し、電
気泳動用流床に対して緩衝液と試料の供給、流床表面処
理液、バッファー液、アルカリ性液、酸性洗浄液等の供
給を所定のタイミングで切り換え制御することができる
ようにするとともに、照明３０、ＴＶカメラ、ディスプ
レイ装置３４、記録再生装置３５を制御し電気泳動の適
切なモニターを可能とする。（なお、制御部は図２のよ
うに四角で囲うのではなく、制御すべきパーツと線でつ
なぎました）。An illumination 30 and a mirror 31 are provided above and below the bed, and a TV camera 33 faces the reflecting surface of the mirror via a filter 32. A display 34 and a recording / reproducing device 35 are connected to the TV camera. In the figure, reference numeral 40 denotes a control unit which controls the operation of a switching valve (not shown) and the operations of the peristaltic pumps 22 and 23 to supply a buffer solution and a sample to the electrophoresis bed, a bed surface treatment solution, and a buffer solution. The supply of alkaline liquid, acidic cleaning liquid, etc. can be switched and controlled at a predetermined timing, and the illumination 30, TV camera, display device 34, and recording / reproducing device 35 can be controlled to appropriately monitor electrophoresis. And (The control part is not surrounded by a square as shown in Fig. 2, but is connected to the parts to be controlled by a line).
【００２２】図３に、電気泳動用流床に対する送液、試
料分離・分取、洗浄を行なうに用いられる電気泳動装置
の一実施態様を示し、図４に電気泳動用流床に対する送
液、試料分離・分取、洗浄の制御例を示す。上記ディス
プレイ装置に、上記照明、ＴＶカメラ系の制御内容も含
めて、図４の内容あるいはそれに対応する「試料送
液」、「試料分離・分取」、「洗浄」のそれぞれの段階
についての処理内容等が表示される。FIG. 3 shows an embodiment of an electrophoretic apparatus used for carrying out solution feeding, sample separation / separation, and washing for the electrophoresis bed, and FIG. 4 shows solution feeding for the electrophoresis bed. An example of control of sample separation / preparation and washing is shown below. The above-mentioned display device, including the control contents of the above-mentioned illumination and TV camera system, or the contents of FIG. 4 or processing corresponding to each stage of “sample feeding”, “sample separation / preparation”, and “washing” Contents etc. are displayed.
【００２３】図をみると、同図に示されるごとくに、第
１のぺリスタポンプ（１）２１１および第２のぺリスタ
ポンプ（２）２１２に関しては、それぞれ、「試料送
液」、「試料分離・分取」、「洗浄」の各段階におい
て、バッファー、バッファー、アルカリ、酸、バッファ
ーのため、第３のぺリスタポンプ（３）２１３に関して
は、「試料送液」の段階の後半部、「試料分離・分
取」、「洗浄」の各段階において、表面処理液、サンプ
ル、アルカリ、酸、バッファーのため、そして、第４の
ぺリスタポンプ（４）２１４については、「試料送
液」、「試料分離・分取」の各段階において、バッファ
ーおよび分離サンプルのため、それぞれ、そのポンプ作
動のための動作タイミングが図示のように設定されるも
のであることがわかる。As shown in the figure, regarding the first peristaltic pump (1) 211 and the second peristaltic pump (2) 212, as shown in FIG. Since the third peristaltic pump (3) 213 is a buffer, a buffer, an alkali, an acid, and a buffer in each of the steps of “preparation” and “washing”, the latter half of the “sample delivery” step, “sample separation” is performed. -In each stage of "preparation" and "washing", for the surface treatment liquid, sample, alkali, acid, buffer, and for the fourth peristaltic pump (4) 214, "sample feeding", "sample separation" It can be seen that in each stage of "preparation", the operation timing for pump operation is set as shown because of the buffer and the separated sample.
【００２４】また、同図に示されるごとくに、電源２０
１については、「試料分離・分取」の段階において、電
極１０５，１０５への電圧印加のため、その動作タイミ
ングが図示のように設定されるものであることがわか
り、さらに、照明、ＴＶカメラ系からなるモータ装置
（３０、３１、３２，３３，３４，３５）は、「試料送
液」、「試料分離・分取」、「洗浄」の各段階におい
て、「試料送液」ではサンプル導入前の気泡の有無の監
視のため、「試料分離・分取」では分離状況の監視のた
めにモニタリングするため、「洗浄」では洗浄状況の監
視のためのモニタリングのため、それぞれ用いられるこ
とがわかる。Also, as shown in FIG.
Regarding No. 1, it was found that the operation timing was set as shown in the figure due to the voltage application to the electrodes 105, 105 in the "sample separation / preparation" stage. The motor device (30, 31, 32, 33, 34, 35) consisting of a system introduces the sample in the "sample delivery" at each stage of "sample delivery", "sample separation / preparation", and "cleaning". It can be seen that they are used to monitor the presence or absence of bubbles in the previous step, to monitor the separation status in "Sample separation / preparation", and to monitor the cleaning status in "Washing". .
【００２５】とくに、ＴＶカメラ３３によりビデオ撮像
されたビデオ画像は、記録・再生装置３５に記録され、
リアルタイムでもしくは適宜の時機にディスプレイ装置
３４上に表示することができる。従って、流床上を流れ
る試料及び緩衝液の流動状態を時間経過とともにそれぞ
れ画像化し、記録して、画像解析に必要な１以上の画像
をディスプレイ装置３４によって表示したり、制御部４
０の演算回路によって解析することができる。In particular, the video image captured by the TV camera 33 is recorded in the recording / reproducing device 35.
It can be displayed on the display device 34 in real time or at an appropriate time. Therefore, the flow states of the sample and the buffer solution flowing on the bed are imaged and recorded over time, and one or more images required for image analysis are displayed on the display device 34, or the control unit 4 is used.
It can be analyzed by an arithmetic circuit of 0.
【００２６】ここに、サンプラー２２１は、サンプルス
トック用容器２２２に収容されている次のサンプルをサ
ンプルカップ２２４（供給用サンプルカップ）に分注
し、分注後、洗浄槽２２３にてノズル内外壁を洗浄され
るものとすることができる。また、表面処理液は、サン
プルカップからチャンバーまでの、サンプルと接触する
領域を表面に膜を張ることで、コンタミネーションを防
止するためのものである。Here, the sampler 221 dispenses the next sample stored in the sample stock container 222 into the sample cup 224 (supplying sample cup), and after dispensing, the washing tank 223 uses inner and outer walls of the nozzle. Can be washed. Further, the surface treatment liquid is for preventing contamination by forming a film on the surface of a region in contact with the sample from the sample cup to the chamber.
【００２７】 また、図５（ａ）は、試料及び緩衝液
を上流から下流へ流しながら、流れと垂直に電圧を印加
し電気泳動を行なうフリーフロー電気泳動法により試料
を分離するに当たり、試料として可逆的複合体を流し、
電場によって可逆的複合体をその構成成分１１，１２に
分離する方法を模式的に示し、図５（ｂ）は可逆的複合
体を注入した個所から可逆的複合体の構成成分が分離し
始める位置までの距離１３を測定することにより、可逆
的複合体の構成成分の相互作用の強さを決定する方法を
模式的に示す。図５ａのパターンとなるか、あるいは図
５ｂのパターンとなるかは、電場の強さ、緩衝液、試料
の流速等により決まる。本測定では、可視化するために
色素分子を用い、またはそのままでは観察が不可能なタ
ンパク質などの分子は色素をラベルする必要があるが、
それが不可能な場合には各々の分取口から試料を回収の
後、その成分を測定することにより、分布により相互作
用の程度を見積もることができる。Further, FIG. 5 (a) shows that a sample and a buffer solution are flowed from the upstream side to the downstream side, and when the sample is separated by a free-flow electrophoresis method in which a voltage is applied perpendicularly to the flow to perform electrophoresis, Flush the reversible complex,
A method for separating the reversible complex into its constituent components 11 and 12 by an electric field is schematically shown, and FIG. 5 (b) shows the position where the constituent components of the reversible complex start to separate from the site where the reversible complex is injected. A method for determining the strength of interaction of the constituent components of the reversible complex by measuring the distance 13 to is schematically shown. Whether the pattern shown in FIG. 5a or the pattern shown in FIG. 5b is obtained depends on the strength of the electric field, the buffer solution, the flow rate of the sample, and the like. In this measurement, it is necessary to use dye molecules for visualization, or to label dyes for molecules such as proteins that cannot be observed as they are.
If that is not possible, the degree of interaction can be estimated from the distribution by collecting the sample from each collection port and then measuring its components.
【００２８】（６） 可逆的複合体の少なくとも２種類
の構成成分を別々に供給し、合流させて可逆的複合体を
形成させ、再分離し、該構成成分の相互作用を決定する
場合についてさらに説明する。以下に、陰イオンと陽イ
オンとの場合について説明するが、複数の構成成分が電
気泳動により同方向に移動する場合であっても、移動度
(例えば、等電点の相違による)が異なれば、交差可能に
構成成分の供給位置を調整すれば別々に供給した構成成
分は同様に可逆的複合体を形成し、再分離、構成成分の
相互作用の決定を行なえる。また、以下の場合、可逆的
複合体として２種類の構成成分からなる場合について言
及しているが、２種類以上であっても以下の方法が適用
となることは容易に理解されよう。(6) Further, in the case where at least two kinds of constituent components of the reversible complex are separately supplied and merged to form a reversible complex, re-separated and the interaction of the constituent components is determined. explain. The case of anions and cations will be described below. However, even when a plurality of constituent components move in the same direction by electrophoresis, the mobility
If the component positions are adjusted so that they can cross each other (for example, due to the difference in isoelectric point), the separately supplied components similarly form a reversible complex, and the reseparation and mutual mutual separation of the components are performed. The action can be decided. Further, in the following cases, the case where the reversible complex is composed of two kinds of constituent components is mentioned, but it will be easily understood that the following method is applicable even when two or more kinds of constituents are used.
【００２９】本実施の形態では、フリーフロー電気泳動
装置の流床内で構成成分を反応させ可逆的複合体を形成
し、形成された可逆的複合体を構成する構成成分を再度
分離するという工程を１回の操作で行なうことができ、
また反応前の試料を用いることが出来るので、複数の他
の分子との相互作用を比較するのに便利である。例え
ば、試料導入口から注入する分子に対する相互作用を調
べるためには、試料導入口から注入する分子を固定し、
別の試料導入口から注入する試料を順次変えればよい。
また、電極に対して同方向に電気泳動する分子を用いる
場合でも、その電気泳動による移動度の違いを利用して
合流させることは可能である。その場合、さらに多くの
試料導入口を形成することは容易であるので、泳動距離
を稼ぐように泳動方法の電極の反対側の電極に近い位置
から試料を導入することも可能である。In the present embodiment, the steps of reacting the constituents in the flow bed of the free-flow electrophoresis apparatus to form a reversible complex, and separating the constituents constituting the formed reversible complex again. Can be done in one operation,
Moreover, since the sample before the reaction can be used, it is convenient to compare the interaction with a plurality of other molecules. For example, in order to investigate the interaction with the molecule to be injected from the sample inlet, the molecule to be injected from the sample inlet should be fixed,
The sample injected from another sample introduction port may be sequentially changed.
Further, even when molecules that electrophorese in the same direction with respect to the electrodes are used, it is possible to join them by utilizing the difference in mobility due to the electrophoresis. In that case, since it is easy to form a larger number of sample introduction ports, it is possible to introduce the sample from a position near the electrode on the opposite side of the electrode of the electrophoresis method so as to increase the migration distance.
【００３０】この方法では可逆的複合体が経時的に変性
したり、あるいは不純物で汚染される可能性があり、予
め存在する可逆的複合体あるいは予め用意した可逆的複
合体を使用したのでは、構成成分間の相互作用を評価、
測定するのに何らかの悪影響が考えられる場合に好適で
ある。即ち、本方法では、電気泳動中に、純粋な構成成
分から可逆的複合体が形成されるからである。In this method, the reversible complex may be denatured with time or may be contaminated with impurities. Therefore, if a reversible complex existing in advance or a reversible complex prepared in advance is used, Evaluate interactions between components,
It is suitable when there is some adverse effect on the measurement. That is, in this method, a reversible complex is formed from pure constituents during electrophoresis.
【００３１】図６は、上記方法を説明する模式図であ
り、フリーフロー電気泳動の試料注入口を上流の２箇所
３−１、３−２に設け、陽極に近い方の注入口３−１か
ら陽イオン１５を含む試料を流床中に導入し、陰極に近
い方の注入口３−２から陰イオン１６を含む試料を導入
すると、陽イオンは陰極に向かって流れ、一方陰イオン
は陽極に向かって流れ、流床の中央部で合流し、陽イオ
ンと陰イオンとの間で可逆的複合体（イオンコンプレッ
クス）が形成される。該可逆的複合体はしばらくそのま
まの状態で距離１３だけ下流に流れる。そして、解離に
必要な電場を印加されることによって可逆的複合体は再
び解離する。即ち、フリーフロー電気泳動において、当
該２つの試料導入口から相互作用を生じる試料を導入
し、試料が交差し可逆的複合体を形成し、さらに解離反
応と分離とを一度に行なわせることができる。FIG. 6 is a schematic diagram for explaining the above method. Sample inlets for free flow electrophoresis are provided at two upstream locations 3-1 and 3-2, and the inlet 3-1 nearer to the anode is provided. When a sample containing cations 15 is introduced into the flow bed and a sample containing anions 16 is introduced from the injection port 3-2 closer to the cathode, the cations flow toward the cathode, while the anions are anodic. Flow toward and toward the middle of the bed to form a reversible complex (ion complex) between positive and negative ions. The reversible complex remains downstream for a distance of 13 and flows downstream. Then, the reversible complex is dissociated again by applying an electric field necessary for dissociation. That is, in free-flow electrophoresis, it is possible to introduce a sample that causes an interaction from the two sample introduction ports, cross the samples to form a reversible complex, and further perform the dissociation reaction and the separation at the same time. .
【００３２】（７）本発明の応用面
本発明は、可逆的複合体の相互作用を調べることが可能
となると共に、結合の相対的強さを測定することがで
き、また可逆的複合体の前処理（粗分離）を行なうため
に用いることができる。また、対象物質と複数種類の構
成成分との間の複数の可逆的複合体の混合物について、
対象物質と該複数の構成成分の相互作用の強さを同時に
比較し決定することが可能となる。例えば、当該対象物
質に対して、IgE,IgG等モノクロナール抗体との相互作
用を調べることが可能となる。従って、本発明は複数の
測定項目（多項目測定）にも応用することすることが可
能となる。可逆的複合体の相互作用およびその強さを調
べることによって、創薬や、薬効等の研究に対して応用
することができる。(7) Application of the present invention The present invention makes it possible to investigate the interaction of a reversible complex and to measure the relative strength of the bond. It can be used to perform pretreatment (coarse separation). Further, for a mixture of a plurality of reversible complexes between the target substance and a plurality of types of constituents,
It is possible to simultaneously compare and determine the strength of interaction between the target substance and the plurality of constituent components. For example, it is possible to investigate the interaction of the target substance with a monoclonal antibody such as IgE or IgG. Therefore, the present invention can be applied to a plurality of measurement items (multi-item measurement). By investigating the interaction of the reversible complex and its strength, it can be applied to drug discovery and research such as drug efficacy.
【００３３】[0033]
【実施例】（実施例１）実施例１は、フリーフロー電気
泳動装置において、イオンコンプレックス試料を導入し
た場合のイオンコンプレックスの分離を調べるものであ
る。本実施例では、緩衝液としてトリス・酢酸緩衝液を
用い、イオンコンプレックスとしてキシレンシアノ−
ル、サフランＴを用い、電圧３ｋＶを印加した。始め、
イオンコンプレックスは、流下するに従って解離し、成
分と成分とに分離する。この場合、キシレンシアノ−ル
は陽極側に、サフラニンＴは陰極側に偏泳動する。結果
を図７に示す。EXAMPLES Example 1 Example 1 is to investigate the separation of ion complexes when an ion complex sample is introduced in a free-flow electrophoresis apparatus. In this example, a tris / acetate buffer was used as the buffer, and xylene cyano- was used as the ion complex.
A voltage of 3 kV was applied using Le and Saffron T. start,
The ion complex dissociates as it flows down, and separates into components. In this case, xylene cyanolate to the anode side and safranin T to the cathode side. The results are shown in Fig. 7.
【００３４】試験条件
試料：キシレンシアノール ＦＦ（アニオン染料）とサ
フランＴ（カチオン染料）の混合物（上記化合物の構造
は既知でしょうから、構造式は不要ですね）
緩衝液： ２０ｍＭトリス−９ｍＭホウ酸溶液／１０％
エタノールｐＨ８．６
試料流速：３０μｌ／ｍｉｎ．ｘ ７流出口
印加電圧：３ｋＶ（＝Ｉ．２ｍＡ）
図８において、両分離流が陰極側に流れる現象につい
て、打ち合わせの際お聞きし説明を受けたのですが、お
ぼろげです。すいませんが、ここで、アニオン染料であ
るキシレンシアノールの分離流が陽極側ではなく、陰極
側に多少偏泳動しているのは電気的浸透流が作用してい
る為の現象に基づく。Test conditions Sample: Mixture of xylene cyanol FF (anionic dye) and saffron T (cationic dye) (the structure of the above compound is known, so the structural formula is unnecessary) Buffer: 20 mM Tris-9 mM boro Acid solution / 10%
Ethanol pH 8.6 Sample flow rate: 30 μl / min. x 7 Outlet applied voltage: 3kV (= I.2mA) In Figure 8, I heard about the phenomenon that both separated flows flow to the cathode side when I heard it at the meeting, but it was faint. Excuse me, but the reason why the separated flow of xylene cyanol, which is an anionic dye, is slightly migrating toward the cathode side rather than the anode side is due to the phenomenon due to the action of electroosmotic flow.
【００３５】この分離過程において、印加電圧、緩衝液
のイオン濃度、ｐＨ等の条件を固定すると、イオンコン
プレックスの結合強さに依存して、結合状態維持長さが
変化する。本実施例から分かるように、本方法において
は、対象となる分子を例えばバイオチップ等の基板に固
定する必要も無く、また構成成分が結合している可逆的
複合体を解離するのに解離液を別個用いる必要が無いの
で、各構成成分は変性を受けることが無く、そのものが
本来有する性質を保ったままで評価することが可能とな
る。In this separation process, if the conditions such as the applied voltage, the ion concentration of the buffer solution, the pH, etc. are fixed, the binding state maintaining length changes depending on the binding strength of the ion complex. As can be seen from this example, in this method, it is not necessary to fix the target molecule to the substrate such as a biochip, and the dissociation solution is used to dissociate the reversible complex in which the constituent components are bound. Since it is not necessary to separately use, each constituent component does not undergo denaturation, and evaluation can be performed while maintaining its original properties.
【００３６】（実施例２）実施例２は、図２に示すフロ
ーフロー電気泳動装置を用いて、可逆的複合体の少なく
とも２種類の構成成分を別々に供給し、合流させて可逆
的複合体を形成させ、再分離し、該構成成分の相互作用
を決定する場合についての実施例である。本実施例で
は、試料としてキシレンシアノール、およびサフラニン
Ｔを用い、緩衝液として２０ｍＭトリス−９ｍＭホウ酸
バッファを用いた。バッファ流速２１０μｌ／ｍｉｎ、
２つの試料流速をそれぞれ１０μｌ／ｍｉｎとし、３ｋ
Ｖの電圧印加条件で行った。キシレンシアノール試料は
電気泳動により陽極に向かって泳動し、サフラニンＴは
陰極に向かって泳動した。この２つの流れが合流し、イ
オンコンプレックスを形成したが、強電場により再び解
離して単独成分となって分取口に向かって流れた。(Example 2) In Example 2, at least two kinds of constituent components of the reversible complex were separately supplied and merged by using the flow-flow electrophoresis apparatus shown in Fig. 2. Are formed, re-separated, and the interaction of the constituents is determined. In this example, xylene cyanol and Safranin T were used as samples, and 20 mM Tris-9 mM borate buffer was used as a buffer. Buffer flow rate 210 μl / min,
Two sample flow rates of 10 μl / min each and 3 k
It was performed under the condition that a voltage of V was applied. The xylene cyanol sample was electrophoresed towards the anode and Safranin T towards the cathode. These two flows merged to form an ion complex, but they were dissociated again by the strong electric field to become a single component and flowed toward the separation port.
【００３７】実施例１ではコンプレックス形成試料を用
いたのに対し、本実施例２ではコンプレックスの形成反
応もフリーフロー電気泳動装置内で行った。従って、一
方の試料を固定し、他方の試料を変えることにより、結
合の程度を種々の試料に対して連続的に測定できるとい
うメリットもある。In Example 1, a complex-forming sample was used, whereas in Example 2, the complex-forming reaction was also carried out in a free-flow electrophoresis apparatus. Therefore, by fixing one sample and changing the other sample, there is also an advantage that the degree of binding can be continuously measured for various samples.
【００３８】[0038]
【発明の効果】以上、上記の説明から分かるように、電
気泳動の際に移動度の異なる構成成分であれば、それら
の構成成分間の結合の強さの程度をフリーな溶液状態
で、かつ解離液等を必要とせずに比較的簡単に測定する
ことが可能となる。As can be seen from the above description, if the constituents have different mobilities during electrophoresis, the degree of bond strength between the constituents can be determined in a free solution state and It is possible to perform the measurement relatively easily without the need for a dissociation solution or the like.
【図１】 （ａ）と（ｂ）は、本発明で用いるフリーフ
ロー電気泳動装置を示す。1A and 1B show a free-flow electrophoresis apparatus used in the present invention.
【図２】 可逆的複合体を注入し、電気泳動開始時点か
ら分離開始をするまでの時間及び／または距離を測定す
るモニターを備えたフリーフロー電気泳動装置の模式的
説明図である。FIG. 2 is a schematic explanatory view of a free-flow electrophoresis apparatus equipped with a monitor for injecting a reversible complex and measuring the time and / or distance from the start of electrophoresis to the start of separation.
【図３】 電気泳動用流床に対する送液、試料分離・分
取、洗浄を行なうに用いられる電気泳動装置の一実施態
様を示す。FIG. 3 shows an embodiment of an electrophoretic apparatus used for liquid feeding, sample separation / separation, and washing for an electrophoretic flow bed.
【図４】 電気泳動用流床に対する送液、試料分離・分
取、洗浄の制御例を示す。FIG. 4 shows an example of control of liquid feeding, sample separation / separation, and washing for an electrophoresis bed.
【図５】 （ａ）は、試料及び緩衝液を上流から下流へ
流しながら、流れと垂直に電圧を印加し電気泳動を行な
うフリーフロー電気泳動法により試料を分離する方法に
おいて、試料として可逆的複合体を流し、電場によって
可逆的複合体をその構成成分に分離する方法を模式的に
示し、（ｂ）は可逆的複合体を注入した個所から可逆的
複合体の構成成分が分離し始める位置までの距離を測定
することにより、可逆的複合体の構成成分の相互作用の
強さを決定する方法を模式的に示す。FIG. 5 (a) is a reversible sample as a sample in a method of separating a sample by a free-flow electrophoresis method in which a voltage is applied perpendicularly to the flow while a sample and a buffer solution are made to flow from upstream to downstream and electrophoresis is performed. A method of flowing the complex and separating the reversible complex into its constituent components by an electric field is schematically shown. (B) is a position where the constituent components of the reversible complex start to separate from the place where the reversible complex is injected. A method for determining the strength of interaction between the components of the reversible complex by measuring the distance to is schematically shown.
【図６】 可逆的複合体の少なくとも２種類の構成成分
を別々に供給し、合流させて可逆的複合体を形成させ、
再分離し、該構成成分の相互作用を決定する方法を説明
する模式図である。FIG. 6: At least two components of a reversible complex are fed separately and combined to form a reversible complex,
It is a schematic diagram explaining the method of re-separating and determining the interaction of this component.
【図７】 実施例１の結果を示す。FIG. 7 shows the results of Example 1.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 船崎 純 東京都渋谷区幡ヶ谷２丁目43番２号 オリ ンパス光学工業株式会社内 Ｆターム(参考） 4D054 FA10 FB05 FB11 FB18 FB20 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (72) Inventor Jun Funasaki 2-43 Hatagaya, Shibuya-ku, Tokyo Ori Inside Npus Optical Industry Co., Ltd. F term (reference) 4D054 FA10 FB05 FB11 FB18 FB20
Claims (13)
がら、流れと垂直に電圧を印加し電気泳動を行なうフリ
ーフロー電気泳動法により試料を分離する方法におい
て、試料として可逆的複合体を流し、電場によって可逆
的複合体をその構成成分に分離する方法。1. A method for separating a sample by a free-flow electrophoresis method in which a sample and a buffer solution are allowed to flow from upstream to downstream and a voltage is applied perpendicularly to the flow to perform electrophoresis, and a reversible complex is flown as a sample. , A method of separating a reversible complex into its constituent components by an electric field.
される可逆的複合体、抗原と抗体で構成される可逆的複
合体、蛋白とDNAで構成される可逆的複合体およびドナ
ー分子とレセプター分子によって構成される可逆的複合
体からなる群から選ばれた可逆的複合体である、請求項
１に記載の分離方法。2. A reversible complex composed of cations and anions, a reversible complex composed of antigens and antibodies, a reversible complex composed of proteins and DNA, and a donor molecule. The separation method according to claim 1, which is a reversible complex selected from the group consisting of reversible complexes composed of receptor molecules.
複合体の構成成分が分離し始める位置までの距離及び／
または時間を測定することにより、可逆的複合体の構成
成分の相互作用の強さを決定する、請求項１または２の
分離方法。3. The distance from the injection site of the reversible complex to the position where the constituents of the reversible complex start to separate and / or
Alternatively, the strength of interaction of the components of the reversible complex is determined by measuring time, and the separation method according to claim 1 or 2.
がら、流れと垂直に電圧を印加し電気泳動を行なうフリ
ーフロー電気泳動法により試料を分離するに当たり、試
料として可逆的複合体を流し、電場によって可逆的複合
体をその構成成分に分離し、該構成成分の相互作用の強
さを決定する、可逆的複合体の構成成分の相互作用の強
さの決定方法。4. A reversible complex is flown as a sample when separating the sample by a free-flow electrophoresis method in which a voltage is applied perpendicularly to the flow and electrophoresis is performed while flowing the sample and the buffer solution from the upstream side to the downstream side, A method for determining the strength of interaction between constituent components of a reversible complex, in which the reversible complex is separated into its constituent components by an electric field and the strength of interaction between the constituent components is determined.
される可逆的複合体、抗原と抗体で構成される可逆的複
合体、蛋白とＤＮＡ構成される可逆的複合体およびドナ
ー分子とレセプター分子によって構成される可逆的複合
体からなる群から選ばれた可逆的複合体である、請求項
４に記載の可逆的複合体の構成成分の相互作用の強さの
決定方法。5. The sample is a reversible complex composed of a cation and an anion, a reversible complex composed of an antigen and an antibody, a reversible complex composed of a protein and a DNA, and a donor molecule and a receptor. The method for determining the interaction strength of the components of the reversible complex according to claim 4, which is a reversible complex selected from the group consisting of reversible complexes composed of molecules.
複合体の構成成分が分離し始める位置までの距離及び／
または時間を測定することにより、可逆的複合体の構成
成分の相互作用の強さを決定する、請求項４または５の
可逆的複合体の構成成分の相互作用の強さの決定方法。6. The distance from the injection site of the reversible complex to the position where the constituents of the reversible complex start to separate and / or
Alternatively, the method for determining the strength of interaction between the components of the reversible complex according to claim 4 or 5, wherein the strength of interaction between the components of the reversible complex is determined by measuring time.
がら、流れと垂直に電圧を印加し電気泳動を行なうフリ
ーフロー電気泳動法により試料を分離するに当たり、試
料としての可逆的複合体を構成する少なくとも２種類の
構成成分を別々に供給し、電場により電気泳動させるこ
とにより該少なくとも２種類の構成成分を合流させて可
逆的複合体を形成させ、試料として形成された可逆的複
合体をさらに流し、電場によって可逆的複合体をその構
成成分に分離し、該構成成分の相互作用の強さを決定す
る、可逆的複合体の構成成分の相互作用の強さの決定方
法。7. A reversible complex as a sample is constituted when separating a sample by a free-flow electrophoresis method in which a sample and a buffer solution are allowed to flow and a voltage is applied in a direction perpendicular to the flow while the sample and the buffer solution are allowed to flow. At least two kinds of constituent components are separately supplied and electrophoresed by an electric field to combine the at least two kinds of constituent components to form a reversible complex, and the reversible complex formed as a sample is further A method for determining the strength of interaction between constituents of a reversible complex, wherein the strength of interaction between the constituents of the reversible complex is determined by separating the reversible complex into its constituents by flowing an electric field.
陽イオンと陰イオンの組合わせ、抗原と抗体との組合わ
せ、蛋白とDNAとの組合わせおよびドナー分子とレセプ
ター分子との組合わせからなる群から選ばれた組合わせ
からなる、請求項７に記載の可逆的複合体の構成成分の
相互作用の強さの決定方法。8. The component of the reversible complex of the sample comprises:
8. A combination selected from the group consisting of a combination of cations and anions, a combination of antigens and antibodies, a combination of proteins and DNA and a combination of donor molecules and receptor molecules. A method for determining the strength of interaction of the components of the reversible complex described.
的複合体の構成成分が分離し始める位置までの距離及び
／または時間を測定することにより、可逆的複合体の構
成成分の相互作用の強さを決定する、請求項７または８
の可逆的複合体の構成成分の相互作用の強さの決定方
法。9. The interaction of the components of the reversible complex by measuring the distance and / or the time from the position where the reversible complex is formed to the position where the components of the reversible complex start to separate. 7 or 8 for determining the strength of
Method for Determining the Strength of Interactions between Components of the Reversible Complex of.
ながら、流れと垂直に電圧を印加し電気泳動を行ない試
料を分離するためのフリーフロー電気泳動装置におい
て、試料としての可逆的複合体を流すための流床と、流
床中の流れ方向と直角方向に電場をかけるための流床の
両側に配置された一対の電極と、該構成成分の相互作用
を決定する相互作用決定手段とからなる、可逆的複合体
の構成成分の相互作用の強さの決定するためのフリーフ
ロー電気泳動装置。10. A reversible complex as a sample in a free-flow electrophoresis apparatus for separating a sample by applying a voltage perpendicular to the flow and performing electrophoresis while flowing the sample and the buffer solution from the upstream side to the downstream side. From a fluidized bed for flowing, a pair of electrodes arranged on both sides of the fluidized bed for applying an electric field in a direction perpendicular to the flow direction in the fluidized bed, and an interaction determining means for determining interaction of the constituents A free-flow electrophoresis apparatus for determining the strength of interaction of components of a reversible complex.
成される可逆的複合体、抗原と抗体で構成される可逆的
複合体、蛋白とＤＮＡ構成される可逆的複合体およびド
ナー分子とレセプター分子によって構成される可逆的複
合体からなる群から選ばれた可逆的複合体である、請求
項１０に記載の構成成分の相互作用の強さの決定するた
めのフリーフロー電気泳動装置。11. The sample is a reversible complex composed of cations and anions, a reversible complex composed of antigens and antibodies, a reversible complex composed of proteins and DNA, and a donor molecule and a receptor. The free-flow electrophoresis apparatus for determining the strength of interaction of components according to claim 10, which is a reversible complex selected from the group consisting of reversible complexes composed of molecules.
体を注入した個所から可逆的複合体の構成成分が分離し
始める位置までの距離及び／または時間を測定すること
により、可逆的複合体の構成成分の相互作用の強さを決
定する、請求項１０または１１の可逆的複合体の構成成
分の相互作用の強さの決定するためのフリーフロー電気
泳動装置。12. The reversible complex by measuring the distance and / or the time from the injection site of the reversible complex to the position where the components of the reversible complex start to separate by the interaction determining means. Free flow electrophoresis apparatus for determining the strength of interaction of the components of the reversible complex of claim 10 or 11, which determines the strength of interaction of the components of.
ラを備え、流床上を流れる試料及び緩衝液の流動を画像
化する、請求項１０乃至１２のいずれかに記載の可逆的
複合体の構成成分の可逆的複合体の相互作用の強さの決
定するためのフリーフロー電気泳動装置。13. The component of the reversible complex according to claim 10, wherein the interaction determining means comprises a video camera, and images the flow of the sample and the buffer solution flowing on the bed. Free Flow Electrophoresis Device for Determining the Strength of Reversible Complex Interactions in
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|---|---|---|---|
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