JP2003189848A - Bead for culturing animal cell - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide beads which are used for culturing animal cells, have a high animal cell-adhering property and a high animal cell-proliferating property, and can efficiently culture the animal cells even in a serum-free culture medium. <P>SOLUTION: The beads for culturing the animal cells are characterized by disposing a polypeptide (P) having at least one minimum amino acid sequence exhibiting a cell adhesion signal in one molecule on the surfaces of fine particles (B), wherein the content of (P) is 0.1 to 100 μg per cm<SP>2</SP>of the surfaces of (B). The volume-average particle diameter of (B) is preferably 50 to 250 μm. The true specific gravity (density) of (B) is preferably 1.01 to 1.05 (g/cm<SP>3</SP>). (B) preferably comprises at least styrene units and multifunctional monomer units as constitutional units. The polypeptide (P) preferably has three to fifty minimum cell adhesion signal-exhibiting amino acid sequences in the molecule. <P>COPYRIGHT: (C)2003,JPO

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、動物細胞培養用ビ
ーズに関する。さらに詳しくは、細胞の接着・増殖性が
高く、特に、無血清培地を用いても、血清含有培地と同
等以上の接着・増殖性を与える動物細胞培養用ビーズに
関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to beads for culturing animal cells. More specifically, the present invention relates to a bead for animal cell culture, which has high cell adhesion / proliferation property, and in particular, which gives the same or higher adhesion / proliferation property as a serum-containing medium even when a serum-free medium is used.

【０００２】[0002]

【従来の技術】アミノ酸３文字表記で現されるArg Gly
Asp配列を有する遺伝子組換えペプチドであるプロネク
チンＦ（以下、ＰｎＦと略する。）やポリ−Ｌ−リジン
をコートした樹脂ビーズに対する細胞接着性を、０．５
％の血清を含有した培地を使用して研究発表されている
（非特許文献１）。2. Description of the Related Art Arg Gly expressed by three-letter code for amino acids
Cell adhesion to resin beads coated with Pronectin F (hereinafter abbreviated as PnF), which is a gene recombinant peptide having an Asp sequence, and poly-L-lysine was 0.5.
Studies have been published using a medium containing% serum (Non-Patent Document 1).

【０００３】[0003]

【非特許文献1】バラニ（J.Varani），インマン（D.R.I
nman），フリギール（S.E.G.Fligiel），ヒリガス（W.
J.Hillegas）、サイトテクノロジー（Cytotechnology）
13,1993年、89-98頁[Non-Patent Document 1] J. Varani, Inman (DRI
nman), Frigir (SEGFligiel), Hirigasu (W.
J.Hillegas), Site Technology (Cytotechnology)
13, 1993, pages 89-98

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】この研究発表におい
て、ＰｎＦを０.００５μｇ／ｃｍ²あるいは０．０２５
μｇ／ｃｍ²コートした場合、コートしない場合のそれ
ぞれ３倍又は５倍の細胞接着性を示すが、接着・増殖性
がさらに高いものが強く要望されている。一方、同研究
発表で、ポリ−Ｌ−リジンを０.５μｇ／ｃｍ²コートし
た場合に、コートしない場合の約４１倍の細胞接着性を
示すが、この場合、細胞の伸展が遅いという問題と、ポ
リ−Ｌ−リジンには毒性があるという問題がある。 す
なわち、本発明の目的は、動物細胞の接着性及び増殖性
が高く、特に無血清培地でも効率的に培養できる動物細
胞培養用ビーズを提供することにある。In this research presentation, PnF was added to 0.005 μg / cm ² or 0.025
When coated with μg / cm ^2, the cell adhesion is 3 times or 5 times that of the case without coating, but a cell having higher adhesion / proliferation is strongly desired. On the other hand, in the same publication, when poly-L-lysine was coated at 0.5 μg / cm ² , the cell adhesion was about 41 times that of the uncoated poly-L-lysine, but in this case, there was a problem that cell spreading was slow. However, there is a problem that poly-L-lysine is toxic. That is, an object of the present invention is to provide beads for culturing animal cells, which have high adhesiveness and proliferative property of animal cells and can be efficiently cultivated particularly in a serum-free medium.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究を
重ね、特定のポリペプチドを０．１μｇ／ｃｍ²以上で
コートした樹脂ビーズを用いることにより劇的に細胞接
着性及び増殖性が高くなることを見いだし本発明に到達
した。すなわち、本発明の動物細胞培養用ビーズの特徴
は、微粒子（Ｂ）の表面に、細胞接着シグナルを現す最
小アミノ酸配列を１分子中に少なくとも１個有するポリ
ペプチド（Ｐ）を配してなり、（Ｐ）の含有量が（Ｂ）
の表面積１ｃｍ²当り０．１〜１００μｇである点にあ
る。Means for Solving the Problems The present inventor has conducted extensive studies and found that by using resin beads coated with a specific polypeptide in an amount of 0.1 μg / cm ² or more, the cell adhesion and proliferation properties can be dramatically improved. The inventors have found that the cost is high and have reached the present invention. That is, the characteristic feature of the animal cell culture beads of the present invention is that the polypeptide (P) having at least one minimal amino acid sequence expressing a cell adhesion signal in one molecule is arranged on the surface of the fine particle (B), The content of (P) is (B)
The surface area is 0.1 to 100 μg per cm ² .

【０００６】[0006]

【発明の実施の形態】まず、微粒子（Ｂ）について説明
する。微粒子（Ｂ）は、水不溶性であればいかなる材質
も使用可能であるが、成型性や細胞毒性が低いという点
で好ましいものを列記すると、ビニル樹脂｛ポリスチレ
ン、ポリアクリルアミド架橋体（アクリルアミドとエチ
レングリコールジアクリレートとの共重合体等）、ポリ
メチル（メタ）アクリレート及びポリ（メタ）アクリロ
ニトリル等｝、ポリエステル、ポリウレタン、エポキシ
樹脂、ナイロン及びポリカーボネート等の合成高分子を
主成分とするもの、セルロース、セルロース誘導体（セ
ルロースジアセテート及びセルローストリアセテート
等）、架橋コラーゲン、架橋ゼラチン、架橋キチン及び
デキストラン等の天然高分子を主成分とするもの、並び
に酸化アルミニウム、ハイドロキシアパタイト、酸化チ
タン、シリカ及びガラス等の無機物を主成分とするもの
等が挙げられる。なお、水不溶性とは、３７℃の水（電
気伝導度１ジーメンス未満のイオン交換水）に対する溶
解度が１ｇ／１００ｇ未満のものをいう。イオン交換水
に対する溶解度は、次のようにして求められる。１００
ｇのイオン交換水（電気伝導度１ジーメンス未満）に、
過剰の（Ｂ）を加え、３７℃で２４時間攪拌し完全に飽
和させる。次に孔径１０μｍのメンブランフィルターで
ろ過して得られるろ液を１００℃で蒸発させてその残渣
を測定することにより求められる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION First, the fine particles (B) will be described. As the fine particles (B), any material can be used as long as it is insoluble in water, but when listed as preferable ones in terms of low moldability and low cytotoxicity, vinyl resin {polystyrene, polyacrylamide crosslinked product (acrylamide and ethylene glycol) Copolymers with diacrylates, etc.), polymethyl (meth) acrylates and poly (meth) acrylonitriles, etc.}, polyesters, polyurethanes, epoxy resins, those having synthetic polymers such as nylon and polycarbonate as main components, cellulose, cellulose derivatives (Cellulose diacetate and cellulose triacetate, etc.), crosslinked collagen, crosslinked gelatin, crosslinked chitin, dextran and other natural polymers as main components, as well as aluminum oxide, hydroxyapatite, titanium oxide, silica and glass, etc. And those mainly composed of inorganic material and the like. The term “water-insoluble” means that the solubility in water at 37 ° C. (ion-exchanged water having an electric conductivity of less than 1 Siemens) is less than 1 g / 100 g. The solubility in ion-exchanged water is determined as follows. 100
g ion-exchanged water (electrical conductivity less than 1 Siemens),
Add excess (B) and stir at 37 ° C. for 24 hours to fully saturate. Then, the filtrate obtained by filtering with a membrane filter having a pore size of 10 μm is evaporated at 100 ° C., and the residue thereof is measured to obtain the value.

【０００７】これらの中で、細胞との親和性が良いとい
う点で、合成高分子を主成分とするもの、天然高分子を
主成分とするもの及びハイドロキシアパタイトが好まし
く、さらに好ましくは合成高分子を主成分とするもの及
び天然高分子を主成分とするもの、特に好ましくは合成
高分子を主成分とするもの、最も好ましくはビニル樹脂
を主成分とするものである。ビニル樹脂としては、スチ
レン及び多官能性モノマーを構成単位としてなるポリス
チレン、メチル（メタ）アクリレート及び多官能性モノ
マーを構成単位としてなるポリメチル（メタ）アクリレ
ート、並びに（メタ）アクリルアミド及び多官能性モノ
マーを構成単位としてなるポリ（メタ）アクリルアミド
等が挙げられ、これらの中で、スチレン及び多官能性モ
ノマーを構成単位としてなるポリスチレンが望ましい。
多官能性モノマーとしては、細胞毒性が低くスチレンと
共重合しうるモノマーであれば制限なく使用でき、２〜
４官能のビニル化合物及び（メタ）アクリロイル化合物
等が用いられ、例えば、ジビニルベンゼン、エチレング
リコールジ（メタ）アクリレート、トリビニルベンゼン
及びトリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート
等が挙げられる。[0007] Among them, those having a synthetic polymer as a main component, those having a natural polymer as a main component and hydroxyapatite are preferable in terms of good affinity with cells, and more preferably synthetic polymers. And a natural polymer as a main component, particularly preferably a synthetic polymer as a main component, and most preferably a vinyl resin as a main component. As the vinyl resin, polystyrene having styrene and a polyfunctional monomer as a constitutional unit, polymethyl (meth) acrylate having a methyl (meth) acrylate and a polyfunctional monomer as a constitutional unit, and (meth) acrylamide and a polyfunctional monomer are used. Examples thereof include poly (meth) acrylamide as a constituent unit, and among these, styrene and polystyrene having a polyfunctional monomer as a constituent unit are preferable.
As the polyfunctional monomer, any monomer having low cytotoxicity and copolymerizable with styrene can be used without limitation.
A tetrafunctional vinyl compound and a (meth) acryloyl compound are used, and examples thereof include divinylbenzene, ethylene glycol di (meth) acrylate, trivinylbenzene, and trimethylolpropane tri (meth) acrylate.

【０００８】ビニル樹脂を主成分とする場合、ビニル樹
脂（ポリスチレンが好ましい）中のビニルモノマー｛ス
チレン、メチル（メタ）アクリレート及び（メタ）アク
リルアミド等｝単位の含有量は、微粒子（Ｂ）の重量に
基づいて、６０〜９９．９重量％が好ましく、さらに好
ましくは８０〜９９．５重量％、特に好ましくは９０〜
９９重量％である。すなわち、この場合、ビニル樹脂中
のビニルモノマー単位の含有量（重量％）は、微粒子
（Ｂ）の重量に基づいて、６０以上が好ましく、さらに
好ましくは８０以上、特に好ましくは９０以上であり、
また９９．９以下が好ましく、さらに好ましくは９９．
５以下、特に好ましくは９９以下である。ビニル樹脂
（ポリスチレンが好ましい）中の多官能性モノマー単位
の含有量は、微粒子（Ｂ）の重量に基づいて、０．１〜
４０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜２０
重量％、特に好ましくは１〜１０重量％である。すなわ
ち、多官能モノマー単位の含有量（重量％）は、微粒子
（Ｂ）の重量に基づいて、０．１以上が好ましく、さら
に好ましくは０．５以上、特に好ましくは１以上であ
り、また４０以下が好ましく、さらに好ましくは２０以
下、特に好ましくは１０以下である。When the vinyl resin is the main component, the content of vinyl monomer {styrene, methyl (meth) acrylate, (meth) acrylamide, etc.} units in the vinyl resin (preferably polystyrene) is the weight of the fine particles (B). Based on the above, 60 to 99.9% by weight is preferable, 80 to 99.5% by weight is more preferable, and 90 to 9% is particularly preferable.
It is 99% by weight. That is, in this case, the content (% by weight) of the vinyl monomer unit in the vinyl resin is preferably 60 or more, more preferably 80 or more, particularly preferably 90 or more, based on the weight of the fine particles (B).
Further, it is preferably 99.9 or less, more preferably 99.
It is 5 or less, particularly preferably 99 or less. The content of the polyfunctional monomer unit in the vinyl resin (preferably polystyrene) is 0.1 to 10 based on the weight of the fine particles (B).
40% by weight is preferable, and more preferably 0.5 to 20.
%, Particularly preferably 1 to 10% by weight. That is, the content (% by weight) of the polyfunctional monomer unit is preferably 0.1 or more, more preferably 0.5 or more, particularly preferably 1 or more, based on the weight of the fine particles (B), and 40 The following is preferred, 20 or less is more preferred, and 10 or less is particularly preferred.

【０００９】微粒子（Ｂ）の形態には中実型と多孔質型
があるが、本発明においては特に制限はなく、中実型で
も多孔質型でも使用できる。これらのうち、通常の培養
方法でも細胞に対する栄養や酸素の供給が効率よく行
え、細胞の回収率が高くできるという点において、中実
型が好ましい。また、微粒子（Ｂ）の形状としては、細
胞が接着できる表面積が大きくなるという点で、針状、
板状又は直方体状等は好ましくなく、すなわち球状が好
ましく、特に真球状に近い方が好ましい。The form of the fine particles (B) includes solid type and porous type, but there is no particular limitation in the present invention, and both solid type and porous type can be used. Among these, the solid type is preferable in that nutrients and oxygen can be efficiently supplied to the cells and the recovery rate of the cells can be increased even by an ordinary culture method. The shape of the fine particles (B) is needle-like in that the surface area to which cells can adhere is large.
A plate shape or a rectangular parallelepiped shape is not preferable, that is, a spherical shape is preferable, and a spherical shape is particularly preferable.

【００１０】微粒子（Ｂ）の形態が中実型の場合、
（Ｂ）の体積平均粒子径は、２０〜１０００μｍが好ま
しく、さらに好ましくは４０〜５００μｍ、特に好まし
くは５０〜２５０μｍである。すなわち、この場合、
（Ｂ）の体積平均粒子径（μｍ）は、２０以上が好まし
く、さらに好ましくは４０以上、特に好ましくは５０以
上であり、また１０００以下が好ましく、さらに好まし
くは５００以下、特に好ましくは２５０以下である。体
積平均粒子径がこの範囲内であると、細胞の接着のしや
すさと単位体積当りの有効表面積のバランスが取れてお
り、特に５０〜２５０μｍの範囲であると、その傾向が
顕著である。また、粒子径（μｍ）は、１５〜１５００
が好ましく、さらに好ましくは３０〜６００、特に好ま
しくは４０〜３００である。すなわち、粒子径（μｍ）
は、１５以上が好ましく、さらに好ましくは３０以上、
特に好ましくは４０以上であり、また１５００μｍ以下
が好ましく、さらに好ましくは６００μｍ以下、特に好
ましくは３００μｍ以下である。微粒子（Ｂ）の形態が
多孔質型の場合、体積平均粒子径は、５０〜２００００
μｍが好ましく、さらに好ましくは１００〜１００００
μｍ、特に好ましくは２００〜５０００μｍである。す
なわち、この場合、体積平均粒子径（μｍ）は、５０以
上が好ましく、さらに好ましくは１００以上、特に好ま
しくは２００以上であり、また２００００以下が好まし
く、さらに好ましくは１００００以下、特に好ましくは
５０００以下である。また、粒子径（μｍ）は、３０〜
２５０００が好ましく、さらに好ましくは５０〜１２０
００、特に好ましくは７５〜６０００である。すなわ
ち、粒子径（μｍ）は、３０以上が好ましく、さらに好
ましくは５０以上、特に好ましくは７５以上であり、ま
た２５０００以下が好ましく、さらに好ましくは１２０
００以下、特に好ましくは６０００以下である。When the form of the fine particles (B) is solid,
The volume average particle diameter of (B) is preferably 20 to 1000 μm, more preferably 40 to 500 μm, and particularly preferably 50 to 250 μm. That is, in this case
The volume average particle diameter (μm) of (B) is preferably 20 or more, more preferably 40 or more, particularly preferably 50 or more, and preferably 1000 or less, more preferably 500 or less, particularly preferably 250 or less. is there. When the volume average particle diameter is within this range, the ease of cell adhesion and the effective surface area per unit volume are balanced, and particularly in the range of 50 to 250 μm, this tendency is remarkable. The particle size (μm) is 15 to 1500.
Is more preferable, 30 to 600 is more preferable, and 40 to 300 is particularly preferable. That is, particle size (μm)
Is preferably 15 or more, more preferably 30 or more,
It is particularly preferably 40 or more, preferably 1500 μm or less, more preferably 600 μm or less, and particularly preferably 300 μm or less. When the form of the fine particles (B) is porous, the volume average particle size is 50 to 20,000.
μm is preferable, and more preferably 100 to 10,000
μm, particularly preferably 200 to 5000 μm. That is, in this case, the volume average particle diameter (μm) is preferably 50 or more, more preferably 100 or more, particularly preferably 200 or more, and preferably 20000 or less, more preferably 10000 or less, particularly preferably 5000 or less. Is. The particle size (μm) is 30 to
25,000 is preferable, and more preferably 50 to 120.
00, particularly preferably 75 to 6000. That is, the particle diameter (μm) is preferably 30 or more, more preferably 50 or more, particularly preferably 75 or more, and preferably 25,000 or less, more preferably 120.
00 or less, particularly preferably 6000 or less.

【００１１】形態が多孔質型の場合、気孔径は５〜５０
０μｍが好ましく、さらに好ましくは７〜１００μｍ、
特に好ましくは１０〜５０μｍである。すなわち、この
場合、気孔径（μｍ）は５以上が好ましく、さらに好ま
しくは７以上、特に好ましくは１０以上であり、また５
００以下が好ましく、さらに好ましくは１００以下、特
に好ましくは５０以下である。なお、体積平均粒径は、
レーザー式粒度分布測定装置（例えば、商品名ＬＡ−９
２０：堀場製作所製、商品名マルチタイザーIII：コー
ルター社製等）で、水等を分散媒として用いて測定でき
る。また、気孔径は、電子顕微鏡で観察することで測定
できる。When the form is a porous type, the pore size is 5 to 50.
0 μm is preferable, more preferably 7 to 100 μm,
It is particularly preferably 10 to 50 μm. That is, in this case, the pore diameter (μm) is preferably 5 or more, more preferably 7 or more, particularly preferably 10 or more, and 5
It is preferably 00 or less, more preferably 100 or less, and particularly preferably 50 or less. The volume average particle size is
Laser type particle size distribution measuring device (for example, trade name LA-9
20: manufactured by Horiba, Ltd., trade name: Multitizer III: manufactured by Coulter, Inc.), and can be measured using water or the like as a dispersion medium. The pore size can be measured by observing with an electron microscope.

【００１２】微粒子（Ｂ）の真比重は特に制限はない
が、本発明のビーズの使用方法によって好ましい範囲が
異なる。すなわち、ビーズを培地とともに撹拌しながら
細胞培養するいわゆる懸濁培養法等においては、撹拌中
はビーズは浮遊し、撹拌を止めると沈降することが好ま
しく、微粒子（Ｂ）の真比重としては１.００〜１.１０
ｇ／ｃｍ³が好ましく、さらに好ましくは１.０１〜１.
０８ｇ／ｃｍ³、特に好ましくは１．０１〜１．０５ｇ
／ｃｍ³である。すなわち、微粒子（Ｂ）の真比重（ｇ
／ｃｍ²）としては、１.００以上が好ましく、さらに好
ましくは１.０１以上であり、また１.１０以下が好まし
く、さらに好ましくは１.０８以下、特に好ましくは
１．０５以下である。The true specific gravity of the fine particles (B) is not particularly limited, but the preferred range differs depending on the method of using the beads of the present invention. That is, in a so-called suspension culture method in which cells are cultured while stirring the beads with a medium, it is preferable that the beads float during the stirring and settle when the stirring is stopped, and the true specific gravity of the fine particles (B) is 1. 00-1.10
g / cm ³ is preferable, and more preferably 1.01 to 1.
08 g / cm ³ , particularly preferably 1.01 to 1.05 g
/ Cm ³ . That is, the true specific gravity (g) of the fine particles (B)
/ Cm ² ) is preferably 1.00 or more, more preferably 1.01 or more, and preferably 1.10 or less, more preferably 1.08 or less, and particularly preferably 1.05 or less.

【００１３】また、ビーズを流動層型バイオリアクター
等の中に流動層として固定して培地を循環しながら細胞
培養するいわゆる灌流培養等においては、ビーズが液流
によって舞い上がらないことが好ましく、微粒子（Ｂ）
の真比重としては１.１〜１０.０ｇ／ｃｍ³が好まし
く、さらに好ましくは１.３〜８.０ｇ／ｃｍ³、特に好
ましくは１．５〜３．０ｇ／ｃｍ³である。すなわち、
微粒子（Ｂ）の真比重（ｇ／ｃｍ²）としては１.１以上
が好ましく、さらに好ましくは１.３以上、特に好まし
くは１．５以上であり、また１０.０以下が好ましく、
さらに好ましくは８.０以下、特に好ましくは３．０以
下である。なお、灌流培養においても、ビーズをホロー
ファイバー等に充填された状態で固定して培地を循環し
ながら培養する場合には、微粒子（Ｂ）の真比重は特に
規定されない。Further, in so-called perfusion culture in which beads are fixed as a fluidized bed in a fluidized bed type bioreactor or the like while circulating a medium, it is preferable that the beads do not rise due to a liquid flow, and fine particles ( B)
The true specific gravity is preferably 1.1 to 10.0 g / cm ³ , more preferably 1.3 to 8.0 g / cm ³ , and particularly preferably 1.5 to 3.0 g / cm ³ . That is,
The true specific gravity (g / cm ² ) of the fine particles (B) is preferably 1.1 or more, more preferably 1.3 or more, particularly preferably 1.5 or more, and preferably 10.0 or less,
It is more preferably 8.0 or less, and particularly preferably 3.0 or less. Even in perfusion culture, the true specific gravity of the fine particles (B) is not particularly specified when the beads are fixed in a state of being filled with hollow fibers and the like and the culture is performed while circulating the medium.

【００１４】微粒子（Ｂ）の製造方法については特に制
限はなく、従来から公知の方法等が適用できる。合成高
分子を主成分とする場合、微粒子（Ｂ）の水性分散液
を、例えば、懸濁重合法又は乳化重合法で直接得る
か、バルク重合又は溶液重合後に転相乳化法又は貧溶
媒添加法で得るかした後、（Ｂ）の水性分散液を遠心分
離又はろ過により（Ｂ）を製造する方法や、バルク重
合又は溶液重合で得られた重合体(溶液)をスプレードラ
イすることによって（Ｂ）を製造する方法（大津隆行，
木下雅悦著「高分子化学合成の実験法」化学同人，１９
７２年）等が挙げられる。なお、溶液重合品をスプレー
ドライすることによって、多孔質型のビーズが得られ
る。The method for producing the fine particles (B) is not particularly limited, and conventionally known methods and the like can be applied. When the main component is a synthetic polymer, an aqueous dispersion of the fine particles (B) is directly obtained by, for example, a suspension polymerization method or an emulsion polymerization method, or a phase inversion emulsification method or a poor solvent addition method after bulk polymerization or solution polymerization. Or by a method of producing (B) by centrifuging or filtering the aqueous dispersion of (B), or by spray-drying the polymer (solution) obtained by bulk polymerization or solution polymerization (B). ) Manufacturing method (Takayuki Otsu,
Masayoshi Kinoshita "Experimental Method for Polymer Chemistry" Kagaku Dojin, 19
1972) and the like. By spray-drying the solution-polymerized product, porous beads can be obtained.

【００１５】ビニル樹脂を主成分とする場合はいずれの
方法も適用できるが、特にポリスチレンを効率良く合成
できるという点で懸濁重合による方法が好ましい。例え
ば、ビニル樹脂であるスチレンと多官能モノマーからな
るビーズは、ポリビニルアルコール［例えば、（株）ク
ラレ製、商品名：ＰＶＡ３５Ｐ］を分散剤として用い
（例えばモノマー全量に対して０．４重量％）、例えば
スチレンとジビニルベンゼンの混合モノマー（例えばス
チレン／ジビニルベンゼン＝９８／２重量比）を、例え
ばモノマー３０重量部に対して７０重量部の水に分散さ
せ、重合開始剤［例えば、日本化薬（株）製ベンゾイル
パーオキシド）を例えばモノマー全量に対して３重量％
加えた後、窒素雰囲気下で撹拌しながら８０℃で７時間
反応後、ろ過，乾燥（例えば８０℃で１０時間），篩い
分け｛例えば、目開き１０６μｍ金属製網篩（ＪＩＳ
Ｚ８８０１−１９８７）を通り、目開き７５μｍ金属製
網篩（ＪＩＳ Ｚ８８０１−１９８７）に残るもの選
別｝することによって、得られる。When the vinyl resin is the main component, any method can be applied, but the method by suspension polymerization is preferable from the viewpoint that polystyrene can be efficiently synthesized. For example, beads made of styrene which is a vinyl resin and a polyfunctional monomer use polyvinyl alcohol [for example, Kuraray Co., Ltd., trade name: PVA35P] as a dispersant (for example, 0.4% by weight based on the total amount of the monomers). For example, a mixed monomer of styrene and divinylbenzene (for example, styrene / divinylbenzene = 98/2 weight ratio) is dispersed in 70 parts by weight of water with respect to 30 parts by weight of the monomer, and a polymerization initiator [eg Nippon Kayaku (Benzoyl peroxide, manufactured by Co., Ltd.)
After the addition, the mixture is reacted at 80 ° C. for 7 hours while stirring in a nitrogen atmosphere, then filtered, dried (for example, 80 ° C. for 10 hours), and sieved {for example, opening 106 μm metal mesh sieve (JIS
Z8801-1987), and a sieve having a mesh of 75 μm and remaining on a metal mesh sieve (JIS Z8801-1987) is selected}.

【００１６】ポリエステル、ポリウレタン、エポキシ樹
脂、ナイロン及びポリカーボネートを主成分とする場合
は、乳化重合による方法以外の方法が適用できるが、懸
濁重合による方法および転相乳化による方法が好まし
い。天然高分子を主成分とするものは、その溶液を用
いて転相乳化法又は貧溶媒添加法で水性分散体を得た
後、これを遠心分離又はろ過により微粒子（Ｂ）を製造
する方法や、その溶液をスプレードライすることによ
って製造することができる。なお、スプレードライする
ことによって多孔質型のビーズが得られる。When polyester, polyurethane, epoxy resin, nylon and polycarbonate are the main components, methods other than emulsion polymerization can be applied, but suspension polymerization and phase inversion emulsification are preferred. For those containing a natural polymer as a main component, a method of producing fine particles (B) by centrifuging or filtering after obtaining an aqueous dispersion by a phase inversion emulsification method or a poor solvent addition method using the solution, Can be produced by spray-drying the solution. In addition, porous beads can be obtained by spray drying.

【００１７】無機化合物を主成分とするものは、市販品
をそのまま又は篩い分けを行った後に使用できる。市販
品としては、例えば、酸化アルミナとして昭和電工(株)
製又は住友化学(株)製の活性アルミナ、ハイドロキシア
パタイトとして富山製薬(株)製又は京セラ(株)製のハイ
ドロキシアパタイト粉末、酸化チタンとして石原産業
(株)製又はチタン工業(株)製の酸化チタン粉末、シリカ
として東海化学(株)製のシリカ粉末、及びガラスとして
日本板硝子(株)製のガラス粉末がそれぞれ挙げられる。As the material containing an inorganic compound as a main component, a commercially available product can be used as it is or after sieving. Commercially available products include, for example, Showa Denko K.K.
Alumina manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd., hydroxyapatite powder manufactured by Toyama Pharmaceutical Co., Ltd. or Kyocera Co., Ltd. as hydroxyapatite, and Ishihara Sangyo as titanium oxide.
Examples thereof include titanium oxide powder manufactured by Titanium Industry Co., Ltd., silica powder manufactured by Tokai Chemical Co., Ltd. as silica, and glass powder manufactured by Nippon Sheet Glass Co., Ltd. as glass.

【００１８】また、細胞培養用ビーズとして市販されて
いるビーズも使用可能である。市販品としては、例え
ば、ポリスチレン製として、ナルジェヌンク社製の商品
名バイオシロン（Biosilon）、ソロヒル社製の商品名プ
ラスチックビーズ（Plastic beads）及びラックス社製
の商品名サイトスフェア(Cytosphere)；ポリアクリルア
ミド製としてバイオラッド(株)製の商品名バイオキャリ
ア(Biocarrier)；ポリウレタン製としてイノアック(株)
製の商品名ＰＵＦ；セルロース製としてバイオマテリア
ル(株)製の商品名セルスノウ(Cellsnow)；コラーゲン製
としてべラックス社製の商品名べラックス（Verax）；
ゼラチン製として東洋紡績(株)製の商品名カルチスフェ
アー（Cultispher）；デキストラン製としてアムシャム
ファルマシア社製の商品名サイトデックス（Cytode
x）；並びにガラス製としてスコット社製の商品名シラ
ン（SIRAN）等が挙げられる。Also, beads commercially available as cell culture beads can be used. Examples of commercially available products include polystyrene, which is a trade name of Biosilon manufactured by Nalgenunc, and plastic beads (Plastic beads) manufactured by Solo Hill Co., Ltd., and Cytosphere, a trade name of manufactured by Lux Co .; polyacrylamide. Product name: Bio-Rad Co., Ltd .; Biocarrier; Polyurethane: Inoac Co., Ltd.
Trade name PUF manufactured by Biomaterials Co., Ltd. manufactured by Biomaterials Co., Ltd .; Cellsnow manufactured by Biomaterials Co., Ltd .;
Product name: Cultispher manufactured by Toyobo Co., Ltd. as a product made of gelatin; Cytode, a product name made by Amsham Pharmacia as a product of dextran
x); and as the glass, a trade name silane (SIRAN) manufactured by Scott and the like can be mentioned.

【００１９】細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配
列を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド
（Ｐ）について説明する。細胞接着シグナルを現わす最
小アミノ酸配列としては、接着シグナルとして働くもの
であればいずれも使用でき、例えば、株式会社永井出版
発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０）５
２７頁に記載されているもの等が使用できる。The polypeptide (P) having at least one minimal amino acid sequence showing a cell adhesion signal in one molecule will be described. As the minimum amino acid sequence that expresses a cell adhesion signal, any amino acid sequence that functions as an adhesion signal can be used. For example, see “Pathophysiology” Vol. 9, No. 7 (1990) 5
Those described on page 27 can be used.

【００２０】これらのうち、接着する細胞の種類が多い
という点で、Arg Gly Asp配列、LeuAsp Val配列、Arg G
lu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列
（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val
Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gl
y配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp I
le配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Leu A
rg Glu配列、Asp Gly GluAla配列（８）及びHis Ala Va
l配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列が
好ましく、さらに好ましくはArg Gly Asp配列、Ile Lys
Val Ala Val配列（７）及びHis Ala Val配列からなる
群から選ばれる少なくとも１種の配列である。なお、ア
ミノ酸配列はアミノ酸３文字表記で現わし、（ ）内に
アミノ酸配列表に対応する配列番号を付記した。Among these, Arg Gly Asp sequence, LeuAsp Val sequence and Arg G are available in that many types of cells adhere to them.
lu Asp Val sequence (1), Tyr Ile Gly Ser Arg sequence (2), Pro Asp Ser Gly Arg sequence (3), Arg Tyr Val
Val Leu Pro Arg Sequence (4), Leu Gly Thr Ile Pro Gl
y sequence (5), Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp I
le sequence (6), Ile Lys Val Ala Val sequence (7), Leu A
rg Glu sequence, Asp Gly Glu Ala sequence (8) and His Ala Va
At least one kind of sequence selected from the group consisting of l sequences is preferable, and Arg Gly Asp sequence and Ile Lys are more preferable.
It is at least one kind of sequence selected from the group consisting of Val Ala Val sequence (7) and His Ala Val sequence. The amino acid sequence is represented by the three-letter amino acid code, and the sequence number corresponding to the amino acid sequence listing is added in parentheses.

【００２１】ポリペプチド（Ｐ）中には前記最小アミノ
酸配列が１分子中に少なくとも１個含有される必要があ
る。前記最小アミノ酸配列があると、細胞接着活性が高
まり、本来の機能を維持した状態で動物細胞の増殖を促
進することが可能となる。一方、前記最小アミノ酸配列
が含有されない場合、細胞接着性が低下する結果、特に
無血清培地を用いる場合に細胞の増殖が不十分になる。At least one of the above-mentioned minimum amino acid sequences must be contained in one molecule in the polypeptide (P). When the minimum amino acid sequence is present, cell adhesion activity is enhanced, and it becomes possible to promote the growth of animal cells while maintaining the original function. On the other hand, when the above-mentioned minimum amino acid sequence is not contained, cell adhesion is reduced, resulting in insufficient cell growth, especially when a serum-free medium is used.

【００２２】この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接
着・増殖性の観点から、１分子中３〜５０個が好まし
く、さらに好ましくは５〜４０個、特に好ましくは１０
〜３０個である。含有量がこの範囲であると、細胞接着
活性がさらに高まり、本来の機能を維持した状態で動物
細胞の増殖を促進することが容易となりやすい傾向にあ
る。The content of the minimum amino acid sequence is preferably 3 to 50, more preferably 5 to 40, and particularly preferably 10 per molecule from the viewpoint of cell adhesion and proliferation.
~ 30. When the content is in this range, the cell adhesion activity is further increased, and it tends to be easy to promote the growth of animal cells while maintaining the original function.

【００２３】ポリペプチド（Ｐ）の数平均分子量（Ｍ
ｎ）は、細胞に対する毒性が低く、接着性能が高いとい
う点で、５，０００〜５，０００，０００が好ましく、
さらに好ましくは１０，０００〜１，０００，０００、
特に好ましくは５０，０００〜５００，０００である。
なお、ポリペプチド（Ｐ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（Ｎａドデシルスルフェイト−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法）で、（Ｐ）を水中で展
開し、泳動距離を標準物質と比較することによって求め
られる。Number average molecular weight of polypeptide (P) (M
n) is preferably 5,000 to 5,000,000 in terms of low toxicity to cells and high adhesiveness,
More preferably 10,000 to 1,000,000,
Particularly preferably, it is 50,000 to 500,000.
The number average molecular weight (Mn) of the polypeptide (P) is
It is determined by SDS-PAGE method (Na dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis method) by developing (P) in water and comparing the migration distance with a standard substance.

【００２４】ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着シグナル
を現わす最小アミノ酸配列以外に、（Ｐ）の熱安定性が
高まるアミノ酸配列、例えばシルクフィブロイン由来の
GlyAla Gly Ala Gly Ser配列（９）を少なくとも２個有
することが好ましく、このアミノ酸配列を３個以上有す
ることがさらに好ましく、５〜３０個有することが特に
好ましい。The polypeptide (P) is an amino acid sequence that enhances the thermal stability of (P), such as a silk fibroin-derived amino acid sequence, in addition to the minimum amino acid sequence that exhibits a cell adhesion signal.
It is preferable to have at least two GlyAla Gly Ala Gly Ser sequences (9), more preferable to have three or more amino acid sequences, and particularly preferable to have 5 to 30 amino acid sequences.

【００２５】ポリペプチド（Ｐ）としては、例えば、
（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配列（１０）とArg Gly
Asp配列とを有するポリペプチド、（Gly Ala Gly Ala G
ly Ser）₉配列（１０）とTyr Ile Gly Ser Arg配列
（２）とを有するポリペプチド、（Gly Ala Pro (Gly P
ro Pro)₄）₂配列（１１）とArg Gly Asp配列とを有する
ポリペプチド、（Gly Ala Pro (Gly Pro Pro)₄）₂配列
（１１）とTyr Ile Gly Ser Arg配列（２）とを有する
ポリペプチド、及び（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配列
（１０）とIle Lys Val Ala Val配列（７）とを有する
ポリペプチド（特表平３−５０２９３５号公報）等が挙
げられる。The polypeptide (P) is, for example,
(Gly Ala Gly Ala Gly Ser) ₉ sequences (10) and Arg Gly
A polypeptide having an Asp sequence, (Gly Ala Gly Ala G
ly Ser) ₉ sequence (10) and Tyr Ile Gly Ser Arg sequence (2), (Gly Ala Pro (Gly P
a polypeptide having ro Pro) ₄ ) ₂ sequence (11) and Arg Gly Asp sequence, (Gly Ala Pro (Gly Pro Pro) ₄ ) ₂ sequence (11) and Tyr Ile Gly Ser Arg sequence (2) Examples thereof include a polypeptide and a polypeptide having the (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) ₉ sequence (10) and the Ile Lys Val Ala Val sequence (7) (JP-A-3-502935).

【００２６】ポリペプチド（Ｐ）として市場から入手で
きるものとしては、例えば、三洋化成工業（株）製プロ
ネクチンＦ（遺伝子組替大腸菌により製造され、１分子
中にArg Gly Asp配列と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉
配列（１０）とを各々約１３個有する数平均分子量約１
１万のポリペプチド）、同プロネクチンＦプラス（プロ
ネクチンＦをジメチルアミノエチルクロライドと反応さ
せて水溶性にしたもの）、同プロネクチンＬ（遺伝子組
替大腸菌により製造され、１分子中にIle LysVal Ala V
al配列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配列（１
０）とを各々約７個有する数平均分子量約９万のポリペ
プチド）等が挙げられる。As the polypeptide (P) commercially available, for example, Pronectin F (manufactured by recombinant Escherichia coli, manufactured by Sanyo Kasei Co., Ltd., which is produced by recombinant Escherichia coli) and contains Arg Gly Asp sequence and (Gly Ala Gly in one molecule Ala Gly Ser) ₉
Number average molecular weight of about 1 each having sequence (10) and about 13
10,000 polypeptides), Pronectin F plus (pronectin F was made water-soluble by reacting with dimethylaminoethyl chloride), Pronectin L (manufactured by genetically modified E. coli, and Ile LysVal Ala V in one molecule)
al sequence (7) and (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) ₉ sequence (1
0) and a number average molecular weight of about 90,000 each having about 7) and the like.

【００２７】また、宝酒造（株）製ＲｅｔｒｏＮｅｃｔ
ｉｎ（リコンビナントヒトフィブロネクチンＣＨ−２９
６）｛ヒトフィブロネクチン細胞接着シグナルであるＣ
Ｓ１シグナルと細胞接着ドメインＴｙｐｅＩＩＩ及びヘ
パリン結合ドメインＩＩを１つずつ有する数平均分子量
約6万のポリペプチド｝（Leu Asp Val配列を約１個含
有）、同ＲＧＤＳ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ｛Arg Gly Asp
配列をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＩｇＧ結合ドメイン）に挿
入した数平均分子量約３万のポリペプチド｝（ArgGly A
sp配列を約１個含有）もポリペプチド（Ｐ）として使用
可能である。Also, RetroNect manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
in (recombinant human fibronectin CH-29
6) {C which is a human fibronectin cell adhesion signal
A polypeptide having an S1 signal, a cell adhesion domain Type III and a heparin binding domain II, each having a number average molecular weight of about 60,000} (containing about one Leu Asp Val sequence), and RGDS-Protein A {Arg Gly Asp
A polypeptide having a number average molecular weight of about 30,000, in which the sequence is inserted into Protein A (IgG binding domain)} (ArgGly A
(containing about 1 sp sequence) can also be used as the polypeptide (P).

【００２８】ポリペプチド（Ｐ）の製造方法は特に制限
されず、ペプチドを合成する従来既知の方法と同様にし
て製造することができ、例えば、有機合成法（固相合成
法、液相合成法等）及び生化学的合成法［遺伝子組換微
生物（酵母、細菌、大腸菌等）］等によって合成するこ
とができる。有機合成法に関しては、例えば、日本生化
学学会編「続生化学実験講座２、タンパク質の化学
（下）」第６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；
株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が
用いられる。The method for producing the polypeptide (P) is not particularly limited, and it can be produced in the same manner as a conventionally known method for synthesizing a peptide. For example, an organic synthesis method (solid phase synthesis method, liquid phase synthesis method). Etc.) and biochemical synthesis methods [genetically modified microorganisms (yeast, bacteria, E. coli, etc.)] and the like. Regarding the organic synthesis method, for example, edited by The Society of Biochemistry of Japan, "Lecture on Biochemistry Experiment 2, Protein Chemistry (2)", pages 641 to 694 (May 20, 1987;
The method described in Tokyo Kagaku Doujin Co., Ltd.) is used.

【００２９】生化学的合成法に関しては、例えば、特表
平３−５０２９３５号公報に記載されている方法等が用
いられる。高分子量の（Ｐ）を容易に合成できる点で、
遺伝子組換微生物による生化学的合成法が好ましく、特
に好ましくは遺伝子組換大腸菌を用いて合成する方法で
ある。Regarding the biochemical synthesis method, for example, the method described in JP-A-3-502935 can be used. In that high molecular weight (P) can be easily synthesized,
A biochemical synthesis method using a genetically modified microorganism is preferable, and a method in which genetically modified Escherichia coli is used is particularly preferable.

【００３０】本発明のビーズは、細胞接着シグナルを現
す最小アミノ酸配列を１分子中に少なくとも１個有する
ポリペプチド（Ｐ）を、微粒子（Ｂ）の表面に、（Ｂ）
の平均表面積１ｃｍ²当り、０．1〜１００μｇ含有して
おり、好ましくは０．２〜５０μｇ、さらに好ましくは
０．３〜１０μｇの範囲で含有している。すなわち、ポ
リペプチド（Ｐ）の含有量（μｇ）は、微粒子（Ｂ）の
平均表面積１ｃｍ²当り、０．1以上であり、好ましくは
０．２以上、さらに好ましくは０．３以上であり、ま
た、１００以下であり、好ましくは５０以下、さらに好
ましくは１０以下である。ポリペプチド（Ｐ）の含有量
が、０．１μｇ／ｃｍ²未満である場合、（Ｐ）を含ま
ない場合よりも細胞の接着・増殖性は高くなるものの、
その効果は不十分であり、（Ｐ）の含有量が１００μｇ
／ｃｍ²を超える場合、効果は低下しないものの非経済
的である。なお、（Ｐ）の含有量は、通常のタンパク量
測定試薬（例えば、ピアスケミカル社製ＢＣＡ蛋白試薬
等）で測定することができる。微粒子（Ｂ）の平均表面
積は、次のようにして求める。レーザー式粒度分布測定
装置（例えば、商品名：ＬＡ−９２０（堀場製作所製）
及びマルチタイザーＩＩＩ（コールター社製）等）で、
水を分散媒として（Ｂ）の体積平均粒子径［φ（μ
ｍ）］を測定する。一方、比重の異なる液体（食塩水
等）に、それぞれ微粒子（Ｂ）を加えて、（Ｂ）の浮遊
する液を見いだすことにより、その液体の比重を（Ｂ）
の比重（ｄ）とする。そして、微粒子（Ｂ）の平均表面
積は、（Ｂ）を真球状と擬制することにより、これらの
体積平均粒子径（φ）及び比重（ｄ）から、式｛表面積
（ｃｍ²／ｇ）＝［４×π×（φ／２／１００００）²］
／［４／３×π×（φ／２／１００００）³×ｄ］｝か
ら算出される。なお、鱗片状、棒状、直方体及び板状等
の球状でないもの、表面に凹凸を有するもの（例えば凹
凸の差が０．１ｍｍを超えるもの）及び多孔質のもの
（上記の方法ででは計算できないもの）は、比表面積計
（例えば、ＱＵＡＮＴＡＳＯＲＢ（ユアサアイオニクス
製）を用いて測定（測定ガス；Ｈｅ／Ｋｒ＝９９．９／
０．１体積比、検出ガス；窒素）することができる。な
お、以上のすべての測定温度は２５℃である。The beads of the present invention comprise a polypeptide (P) having at least one minimal amino acid sequence which expresses a cell adhesion signal in one molecule on the surface of fine particles (B) (B).
Per 1 cm ² of the average surface area of 0.1 to 100 μg, preferably 0.2 to 50 μg, and more preferably 0.3 to 10 μg. That is, the content (μg) of the polypeptide (P) is 0.1 or more, preferably 0.2 or more, more preferably 0.3 or more, per 1 cm ² of the average surface area of the fine particles (B), Further, it is 100 or less, preferably 50 or less, and more preferably 10 or less. When the content of the polypeptide (P) is less than 0.1 μg / cm ² , the cell adhesion / proliferation property is higher than that of the case where (P) is not contained,
The effect is insufficient, and the content of (P) is 100 μg
If it exceeds / cm ² , the effect is not reduced but it is uneconomical. The content of (P) can be measured with an ordinary protein amount measuring reagent (for example, BCA protein reagent manufactured by Pierce Chemical Co., etc.). The average surface area of the fine particles (B) is determined as follows. Laser type particle size distribution measuring device (for example, trade name: LA-920 (manufactured by Horiba Ltd.)
And Multitizer III (manufactured by Coulter, Inc.),
The volume average particle diameter of (B) [φ (μ
m)] is measured. On the other hand, by adding the fine particles (B) to liquids having different specific gravities (such as saline solution) and finding the liquid in which (B) floats, the specific gravity of the liquids becomes (B).
Specific gravity (d) of Then, the average surface area of the fine particles (B) can be calculated from the formula {surface area (cm ² / g) = [from the volume average particle diameter (φ) and specific gravity (d) by simulating (B) as a true sphere. 4 × π × (φ / 2/10000) ² ]
/ [4/3 × π × (φ / 2/10000) ³ × d]}. It should be noted that non-spherical ones such as scales, rods, rectangular parallelepipeds and plates, those having irregularities on the surface (for example, those having a difference of irregularities exceeding 0.1 mm) and porous ones (those that cannot be calculated by the above method) ) Is measured using a specific surface area meter (for example, QUANTASORB (manufactured by Yuasa Ionics) (measurement gas; He / Kr = 99.9 /).
0.1 volume ratio, detection gas; nitrogen). All of the above measurement temperatures are 25 ° C.

【００３１】本発明のビーズを得る方法としては、例え
ば、ポリペプチド（Ｐ）を溶媒に溶かした溶液を予め作
製し、その中に微粒子（Ｂ）を加え、所定のコーティン
グ時間必要に応じて攪拌した後に余分の溶液を捨て乾燥
させるか、余分の溶液を捨てずに乾燥させる方法等が挙
げられる。As a method for obtaining the beads of the present invention, for example, a solution in which the polypeptide (P) is dissolved in a solvent is prepared in advance, the fine particles (B) are added thereto, and a predetermined coating time is agitated if necessary. After that, the excess solution may be discarded and dried, or the excess solution may be dried without being discarded.

【００３２】ポリペプチド（Ｐ）の溶液を作製するため
に用いられる溶媒としては特に制限はないが、無機塩、
有機酸塩、アミノ酸、ビタミン、アルコール、脂質・
糖、酸及び／又は塩基を０．１〜５０重量％（好ましく
は１〜３０重量％）含有する水溶液及び水等が使用でき
る。無機塩としては、ハロゲン化金属塩、硫酸金属塩、
リン酸金属塩、硝酸金属塩、炭酸金属塩及び過ハロゲン
酸金属等が使用でき、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナ
トリウム、リン酸ナトリウム、塩化カルシウム、硝酸
鉄、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸ナトリウ
ム、リン酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水
素カリウム、硫酸銅、硫酸鉄、塩化リチウム、臭化ナト
リウム、臭化リチウム過塩素酸ナトリウム及び過塩素酸
リチウム等が挙げられる。The solvent used for preparing the solution of the polypeptide (P) is not particularly limited, but an inorganic salt,
Organic acid salts, amino acids, vitamins, alcohols, lipids
An aqueous solution containing 0.1 to 50% by weight (preferably 1 to 30% by weight) of sugar, acid and / or base, water and the like can be used. As the inorganic salt, a metal halide salt, a metal sulfate salt,
Metal phosphate, metal nitrate, metal carbonate, metal perhalogenate and the like can be used, and examples thereof include sodium chloride, sodium sulfate, sodium phosphate, calcium chloride, iron nitrate, potassium chloride, magnesium sulfate, sodium carbonate and phosphorus. Examples thereof include sodium hydrogen phosphate, potassium phosphate, potassium hydrogen phosphate, copper sulfate, iron sulfate, lithium chloride, sodium bromide, lithium bromide sodium perchlorate and lithium perchlorate.

【００３３】有機酸塩としては、例えば、蟻酸ナトリウ
ム、酢酸ナトリウム、酢酸リチウム及び酒石酸ナトリウ
ム等が挙げられる。アミノ酸としては、例えば、アルギ
ニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニ
ン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、
チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラ
ギン酸、グルタミン酸、プロリン、セリン及びグリシン
等が挙げられる。ビタミンとしては、例えば、コリン、
イノシトール、ニコチンアミド、グルタミン、ビタミン
Ａ及びビタミンＢ₁₂等が挙げられる。アルコールとして
は、炭素数１〜４のアルコール等が使用でき、例えば、
メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール及び
ブタノール等が挙げられる。Examples of the organic acid salts include sodium formate, sodium acetate, lithium acetate and sodium tartrate. Examples of amino acids include arginine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan,
Examples thereof include tyrosine, valine, alanine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, proline, serine and glycine. Examples of vitamins include choline,
Examples include inositol, nicotinamide, glutamine, vitamin A and vitamin B ₁₂ . As the alcohol, an alcohol having 1 to 4 carbon atoms can be used, for example,
Methanol, ethanol, isopropyl alcohol, butanol and the like can be mentioned.

【００３４】脂質・糖としては、例えば、脂質、単糖、
２糖、オリゴ糖、アミノ糖及び酸性糖等が挙げられる。
酸としては、無機酸及び炭素数１〜６の有機酸等が使用
でき、例えば、塩酸、硝酸、塩酸、硫酸、燐酸、酢酸、
蟻酸、酒石酸、リンゴ酸、フェノール及びカテコール等
が挙げられる。塩基としては、無機塩基及び炭素数２〜
６の有機塩基等が使用でき、例えば、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、アンモニア、モノエタノールアミ
ン、トリエタノールアミン及びトリエチルアミン等が挙
げられる。水としては、蒸留水、イオン交換水、水道水
及びイオン交換蒸留水等が挙げられる。これらの溶媒の
中で、無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液及び
水が好ましく、さらに好ましくは無機塩を含有する水溶
液及び水、特に好ましくは無機塩を含有する水溶液であ
る。無機塩のうち、ｐＨ緩衝効果のある無機塩（炭酸ナ
トリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、
リン酸カリウム及びリン酸水素カリウム等）を含有する
ものが最も好ましい。Examples of lipids / sugars include lipids, monosaccharides,
Disaccharides, oligosaccharides, amino sugars, acidic sugars and the like can be mentioned.
As the acid, inorganic acids and organic acids having 1 to 6 carbon atoms can be used, and examples thereof include hydrochloric acid, nitric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid,
Examples thereof include formic acid, tartaric acid, malic acid, phenol and catechol. As the base, an inorganic base and a carbon number of 2
The organic bases of 6 and the like can be used, and examples thereof include sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, monoethanolamine, triethanolamine and triethylamine. Examples of water include distilled water, ion-exchanged water, tap water, and ion-exchanged distilled water. Among these solvents, an aqueous solution containing an inorganic salt, an acid and / or a base and water are preferable, an aqueous solution containing an inorganic salt and water are more preferable, and an aqueous solution containing an inorganic salt is particularly preferable. Among the inorganic salts, those having a pH buffering effect (sodium carbonate, sodium phosphate, sodium hydrogen phosphate,
Those containing potassium phosphate and potassium hydrogen phosphate) are most preferable.

【００３５】なお、好ましいｐＨ範囲は、２〜１１．５
であり、さらに好ましくは４〜９．５、特に好ましくは
６〜８．５、最も好ましくは７〜７．５である。すなわ
ち、ｐＨは、２以上が好ましく、さらに好ましくは４以
上、特に好ましくは６以上、最も好ましくは７以上であ
り、また１１．５以下が好ましく、さらに好ましくは
９．５以下、特に好ましくは８．５以下、最も好ましく
は７．５以下である。好ましい無機塩水溶液としては、
ｐＨ７．２に調整されたリン酸水素ナトリウムとリン酸
水素カリウムとの生理食塩水溶液［ＰＢＳ（−）］等が
挙げられる。ポリペプチド（Ｐ）がシルクフィブロイン
由来のGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（９）を含有する
場合、その溶媒溶液の好ましい作成方法としては、該ポ
リペプチドを過塩素酸リチウムあるいは臭化リチウムに
例えば１ｍｇ／ｍＬの濃度にまず溶解し、ＰＢＳ（−）
で２０〜２００倍に希釈する方法等が挙げられる。The preferred pH range is 2-11.5.
And more preferably 4 to 9.5, particularly preferably 6 to 8.5, and most preferably 7 to 7.5. That is, the pH is preferably 2 or more, more preferably 4 or more, particularly preferably 6 or more, most preferably 7 or more, and preferably 11.5 or less, more preferably 9.5 or less, particularly preferably 8 or less. It is 0.5 or less, most preferably 7.5 or less. As a preferred inorganic salt aqueous solution,
Examples include a physiological saline solution [PBS (−)] of sodium hydrogenphosphate and potassium hydrogenphosphate adjusted to pH 7.2. When the polypeptide (P) contains a silk fibroin-derived Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequence (9), a preferable method for preparing a solvent solution thereof is to add the polypeptide to lithium perchlorate or lithium bromide, for example, 1 mg. Dissolve at a concentration of / mL first and then add PBS (-)
And a method of diluting with 20 to 200 times.

【００３６】ポリペプチド（Ｐ）の溶液の濃度は、溶媒
１ｍｌ当り、０．０１μｇ〜１００ｍｇが好ましく、さ
らに好ましくは０．１μｇ〜１０ｍｇ、特に好ましくは
１μｇ〜１ｍｇである。すなわち、ポリペプチド（Ｐ）
の溶液の濃度は、溶媒１ｍｌ当り、０．０１μｇ以上が
好ましく、さらに好ましくは０．１μｇ以上、特に好ま
しくは１μｇ以上であり、また１００ｍｇ以下が好まし
く、さらに好ましくは１０ｍｇ以下、特に好ましくは１
ｍｇ以下である。コーティング時間としては、用いる培
養基材によっても異なるが、通常３０秒〜４８時間、好
ましくは１分〜２４時間、されに好ましくは３分〜１２
時間である。必要に応じて行われる乾燥の条件について
も特に制限はなく、通常の方法が適用でき、例えば、必
要に応じて順風乾燥機や減圧乾燥機などを用いて、０〜
２００℃、０．００１Ｐa〜大気圧の圧力下で、１〜１
００時間乾燥することで行える。The concentration of the solution of the polypeptide (P) is preferably 0.01 μg to 100 mg, more preferably 0.1 μg to 10 mg, and particularly preferably 1 μg to 1 mg per 1 ml of the solvent. That is, the polypeptide (P)
The concentration of the solution is preferably 0.01 μg or more, more preferably 0.1 μg or more, particularly preferably 1 μg or more, and 100 mg or less, more preferably 10 mg or less, particularly preferably 1 per 1 ml of the solvent.
It is less than or equal to mg. The coating time varies depending on the culture substrate used, but is usually 30 seconds to 48 hours, preferably 1 minute to 24 hours, and more preferably 3 minutes to 12 hours.
It's time. There are no particular restrictions on the drying conditions performed as necessary, and ordinary methods can be applied. For example, if necessary, a normal air dryer or a reduced pressure dryer can be used to
At a temperature of 200 ° C. and 0.001 Pa to atmospheric pressure, 1 to 1
It can be done by drying for 00 hours.

【００３７】また、必要に応じて行われる乾燥の前又は
後で、無機塩を含有する水溶液又は水で通常の方法で洗
浄することもできる。また、コーティングの後で、必要
に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限
は無く、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス
滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられ
る。Further, before or after the drying, which is carried out if necessary, it is also possible to wash with an aqueous solution containing an inorganic salt or water by a usual method. Moreover, you may sterilize after coating as needed. The sterilization method is not particularly limited, and examples thereof include radiation sterilization, ethylene oxide gas sterilization, autoclave sterilization, and dry heat sterilization.

【００３８】本発明のビーズを用いて、培養される動物
細胞の種類としては特に制限がなく、ヒト、サル、マウ
ス、ハムスター、ラット及び昆虫等の初代培養細胞や株
化細胞、並びに細胞培養実験、医薬品又はワクチン生産
等に用いられる公知の細胞等が使用できる。具体的には
例えば、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎）細胞、ＣＨ
Ｏ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＷＩ３８（ヒ
ト胎児肺）細胞、ヒト由来の幹細胞、内皮細胞、上皮細
胞、実質細胞、線維芽細胞及び角質細胞等が挙げられ
る。これら細胞の中では、無血清培養のニーズが高く、
本発明のビーズの特長が最大限活用される医薬品やワク
チン生産用に用いられる細胞（Ｖｅｒｏ細胞及びＣＨＯ
細胞等）に最適である。There are no particular restrictions on the type of animal cells that can be cultured using the beads of the present invention. Primary cultured cells or cell lines of humans, monkeys, mice, hamsters, rats, insects, etc., as well as cell culture experiments. Known cells used for the production of pharmaceuticals, vaccines, etc. can be used. Specifically, for example, Vero (African green monkey kidney) cells, CH
Examples thereof include O (Chinese hamster ovary) cells, WI38 (human fetal lung) cells, human-derived stem cells, endothelial cells, epithelial cells, parenchymal cells, fibroblasts and keratinocytes. Among these cells, the need for serum-free culture is high,
Cells (Vero cells and CHO cells) used for the production of pharmaceuticals and vaccines in which the features of the beads of the present invention are fully utilized.
Suitable for cells etc.)

【００３９】本発明のビーズを用いて動物細胞を培養す
る方法としては特に制限はなく、通常の方法、例えば、
ビーズを培地とともに撹拌しながら細胞培養するいわゆ
る懸濁培養法、ビーズを流動層型バイオリアクター等の
中に流動層として固定するかあるいはホローファイバー
等の中に固定層として固定して培地を循環しながら細胞
培養するいわゆる灌流培養灌流培養法等を用いることが
できる。本発明のビーズの使用量は、細胞の種類等によ
って異なるが、通常、培地１Ｌ当り、０．５〜１０００
ｇ、好ましくは１〜１００ｇ、さらに好ましくは５〜５
０ｇである。すなわち、本発明のビーズの使用量（ｇ）
は、培地１Ｌ当り、通常０．５以上、好ましくは１以
上、さらに好ましくは５以上であり、また１０００以
下、好ましくは１００以下、さらに好ましくは５０以下
である。The method of culturing animal cells using the beads of the present invention is not particularly limited, and a conventional method such as, for example,
The so-called suspension culture method, in which the beads are cultivated while stirring the medium together with the medium, the beads are fixed in a fluidized bed bioreactor or the like as a fluidized bed, or fixed in a hollow fiber or the like as a fixed bed and the medium is circulated. While so-called perfusion culture in which cells are cultured can be used. The amount of the beads of the present invention used varies depending on the type of cells and the like, but is usually 0.5 to 1000 per 1 L of the medium.
g, preferably 1 to 100 g, more preferably 5 to 5
It is 0 g. That is, the amount of the beads of the present invention used (g)
Is usually 0.5 or more, preferably 1 or more, more preferably 5 or more, and 1000 or less, preferably 100 or less, more preferably 50 or less per 1 L of the medium.

【００４０】培地としては、用いる動物細胞の種類に応
じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ
培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆ
ｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ培
地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の
技術第三版」５８１頁に記載の基礎培地、これらの培地
に血清成分（ウシ胎児血清等）等を添加したもの、並び
に市販の無血清培地［味の素（株）製無血清培地ＡＳＦ
１０３，同ＡＳＦ１０４，同ＡＳＦ３０１、ギブコ社製
無血清培地ＣＨＯ−ＳＦＭ，同ＶＰ−ＳＦＭ等］等が用
いられる。The medium may be MEM medium, BME medium, DME medium, αMEM depending on the type of animal cells used.
Medium, IMEM medium, ES medium, DM-160 medium, F
Basal medium, such as isher medium, F12 medium, WE medium, RPMI medium, etc., published by Asakura Shoten, “Technology of Tissue Culture, 3rd Edition”, edited by The Tissue Culture Society of Japan, page 581, serum components (fetal bovine serum, etc.) Etc., and commercially available serum-free medium [serum-free medium ASF manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
103, ASF 104, ASF 301, Gibco serum-free medium CHO-SFM, VP-SFM, etc.] and the like are used.

【００４１】血清培地を使用した場合、血清中に成分未
知の蛋白質等が含まれ再現性が得られにくいこと、細胞
を用いる医薬品生産の場合には精製工程が複雑となりコ
ストがかかること、さらにウィルス感染の危険性がある
こと等の理由から、血清を含まないいわゆる無血清培地
が好ましく、特に、本発明のビーズは、無血清培地でも
細胞の接着・増殖性に優れているため、本発明のビーズ
とともに用いる培地としては無血清培地が特に好まし
い。When a serum medium is used, it is difficult to obtain reproducibility due to the inclusion of proteins or the like of unknown components in the serum, and in the case of drug production using cells, the purification process is complicated and costly. For reasons such as the risk of infection, so-called serum-free medium that does not contain serum is preferable, and in particular, the beads of the present invention have excellent cell adhesion / proliferation properties even in serum-free medium. A serum-free medium is particularly preferable as the medium used together with the beads.

【００４２】さらに必要に応じて、細胞増殖因子（Ｓ）
を培地中に含有させることにより、動物細胞の増殖速度
をさらに高めたり、細胞活性を高めたり、細胞が本来有
する機能を発現させたりすることができる。細胞増殖因
子（Ｓ）は細胞を増殖させる活性のある物質であり、例
えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、
ＩＧＦ及びＢＭＰ等が挙げられ、この他に、例えば財団
法人名古屋大学出版会発行「上田実編ティッシュエンジ
ニアリング（１９９９年）」４３〜５１頁及び同文献に
付記されている参考文献に記載されているもの等も用い
られる。細胞増殖因子（Ｓ）を含有させる場合、この使
用量（ｍｇ）としては、培地１Ｌ当たり、０．００００
１〜１００が好ましく、さらに好ましくは０．０００１
〜１０、特に好ましくは０．００１〜１である。すなわ
ち、この場合、（Ｓ）の使用量（ｍｇ）は、培地１Ｌ当
たり、０．００００１以上が好ましく、さらに好ましく
は０．０００１以上、特に好ましくは０．００１以上で
あり、また、１００以下が好ましく、さらに好ましくは
１０以下、特に好ましくは１以下である。Further, if necessary, cell growth factor (S)
By including the above in the medium, the growth rate of animal cells can be further increased, the cell activity can be enhanced, and the function originally possessed by the cells can be expressed. The cell growth factor (S) is a substance having an activity of growing cells, and includes, for example, FGF, VEGF, HGF, EGF, PDGF,
IGF, BMP, etc. are mentioned, and in addition to these, for example, they are described in "Minami Ueda Tissue Engineering (1999)", pages 43 to 51, published by the Foundation of Nagoya University Press, and the references attached thereto. Things etc. are also used. When the cell growth factor (S) is contained, the amount (mg) to be used is 0.0000 per 1 L of the medium.
1 to 100 is preferable, and 0.0001 is more preferable.
-10, and particularly preferably 0.001-1. That is, in this case, the usage amount (mg) of (S) is preferably 0.00001 or more, more preferably 0.0001 or more, particularly preferably 0.001 or more, and 100 or less per 1 L of the medium. It is preferably 10 or less, more preferably 1 or less.

【００４３】培養条件としては、特に制限はなく、二酸
化炭素（ＣＯ₂）濃度１〜２０体積％、５〜４５℃で１
時間〜１００日間、必要に応じて１〜７日毎に培地交換
しなら培養すること等が挙げられる。特に好ましい例と
しては、例えば、ＣＯ₂濃度５体積％、３７℃の条件
で、２〜４日毎に培地交換しながら１〜３６日間培養す
ることである。The culture conditions are not particularly limited, and the carbon dioxide (CO ₂ ) concentration is 1 to 20% by volume, and the culture condition is 5 to 45 ° C.
Culturing may be carried out for a period of time to 100 days, and if necessary, the medium is replaced every 1 to 7 days. A particularly preferable example is, for example, culturing under conditions of CO ₂ concentration of 5% by volume and 37 ° C. for 1 to 36 days while changing the medium every 2 to 4 days.

【００４４】本発明のビーズは、動物細胞を効率的に接
着・増殖させることができ、無血清培地を好適に使用で
きるため、細胞を用いる医薬品やワクチンの生産用に特
に好適に使用できる。Since the beads of the present invention can efficiently adhere and grow animal cells and can preferably use serum-free medium, they can be particularly preferably used for the production of pharmaceuticals and vaccines using cells.

【００４５】[0045]

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。 ＜実施例１＞スチレン９９重量％、ジビニルベンゼン1
重量％を懸濁重合して得られたポリスチレンビーズを金
属製網篩（ＪＩＳ Ｚ８８０１−１９８７）で篩い分
け、７５〜１０６μｍの間の粒子径を有するビーズを得
た。レーザー式粒度分布測定装置ＬＡ−９２０（堀場製
作所製）で測定した体積平均粒径は９６μｍ、比重は
１．０５であった。このビーズの平均表面積は、上記の
計算式によって５９５ｃｍ ²／ｇと計算された。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples.
As will be apparent, the present invention is not limited to these examples.
is not. <Example 1> 99% by weight of styrene and 1 of divinylbenzene
The polystyrene beads obtained by suspension polymerization of
Sieving with a genus net sieve (JIS Z8801-1987)
To obtain beads having a particle size of between 75 and 106 μm.
It was Laser type particle size distribution measuring device LA-920 (manufactured by Horiba
Manufactured by Seisakusho) has a volume average particle diameter of 96 μm and a specific gravity of
It was 1.05. The average surface area of this bead is
595cm according to the calculation formula ²/ G.

【００４６】特表平３−５０２９３５号公報中の実施例
記載の方法に準じて、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配
列（１０）とArg Gly Asp配列とを１２個含むＭｎ約１
１万の遺伝子組換え大腸菌の産生蛋白質"ＳＬＰＦ"を作
製した。次いで、ＳＬＰＦの４．５規定の過塩素酸リチ
ウム水溶液（ＳＬＰＦの濃度；１ｍｇ／ｍｌ）をリン酸
バッファー液（ＰＢＳ）でＳＬＰＦの濃度が１５μｇ／
ｍｌとなるように希釈し、ＳＬＰＦ溶液１を作製した。According to the method described in the example of JP-A-3-502935, Mn about 1 containing 12 (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) ₉ sequences (10) and Arg Gly Asp sequences was prepared.
Ten thousand recombinant E. coli produced protein "SLPF" was prepared. Then, a 4.5 N lithium perchlorate aqueous solution of SLPF (concentration of SLPF; 1 mg / ml) was added to a phosphate buffer solution (PBS) so that the concentration of SLPF was 15 μg /
It was diluted to have a volume of ml to prepare SLPF solution 1.

【００４７】ＳＬＰＦ溶液１の２５ｍｌに上記で得られ
たビーズを５ｇ加え、ポリフッ化エチレン樹脂（テフロ
ン（登録商標））製撹拌子で１２時間撹拌した。得られ
たビーズスラリーを振盪器上にセットしたステンレス製
バットに移し、１００℃の熱風を吹きつけながら、２４
時間振盪乾燥した。得られた乾燥ビーズをＰＢＳ５０ｍ
ｌで２回洗浄し、ＰＢＳ中で１２１℃で２０分間オート
クレーブ滅菌後、ＵＶ照射下に乾燥することで、本発明
のビーズ１を得た。ビーズ１のＳＬＰＦ含有量を、ビー
ズ１を４．５規定の過塩素酸リチウム溶液５０ｍＬ中で
２４時間撹拌後、過塩素酸リチウム溶液上清中に溶出し
たＳＬＰＦの含有量をピアスケミカル社製ＢＣＡ蛋白試
薬で測定することによって求めた結果、０．１μｇ／ｃ
ｍ²であった。5 g of the beads obtained above was added to 25 ml of the SLPF solution 1, and the mixture was stirred for 12 hours with a stir bar made of polyfluorinated ethylene resin (Teflon (registered trademark)). The resulting bead slurry was transferred to a stainless steel vat set on a shaker, and while being blown with hot air at 100 ° C., 24
Shake dried for hours. The obtained dried beads are PBS 50m
The beads 1 of the present invention were obtained by washing twice with 1 times, autoclave sterilization in PBS at 121 ° C. for 20 minutes, and then drying under UV irradiation. After the beads 1 were stirred in 50 mL of 4.5 N lithium perchlorate solution for 24 hours, the SLPF content of the beads 1 was determined by adjusting the content of SLPF eluted in the supernatant of the lithium perchlorate solution to BCA manufactured by Pierce Chemical Company. The result obtained by measuring with a protein reagent was 0.1 μg / c
It was m ² .

【００４８】＜実施例２＞ＳＬＰＦ溶液１の代わりに、
ＳＬＰＦの濃度が４５μｇ／ｍｌのＳＬＰＦ溶液２を用
いる以外は実施例１と同様にして、本発明のビーズ２を
得た。ビーズ２のＳＬＰＦ含有量は０．３μｇ／ｃｍ²
であった。<Example 2> Instead of the SLPF solution 1,
The beads 2 of the present invention were obtained in the same manner as in Example 1 except that the SLPF solution 2 having an SLPF concentration of 45 μg / ml was used. The SLPF content of the beads 2 is 0.3 μg / cm ²
Met.

【００４９】＜実施例３＞ＳＬＰＦ溶液１の代わりに、
ＳＬＰＦの濃度が９０μｇ／ｍｌのＳＬＰＦ溶液３を用
いる以外は実施例１と同様にして、本発明のビーズ３を
得た。ビーズ３のＳＬＰＦ含有量は０．７μｇ／ｃｍ²
であった。Example 3 Instead of the SLPF solution 1,
The beads 3 of the present invention were obtained in the same manner as in Example 1 except that the SLPF solution 3 having an SLPF concentration of 90 μg / ml was used. The SLPF content of the beads 3 is 0.7 μg / cm ²
Met.

【００５０】＜比較例１＞ＳＬＰＦ溶液での処理を行わ
ず、ポリスチレンビーズをそのまま用いて、比較用のビ
ーズ４を得た。<Comparative Example 1> Beads for comparison 4 were obtained using polystyrene beads as they were without treatment with the SLPF solution.

【００５１】＜比較例２＞ＳＬＰＦ溶液１の代わりに、
ＳＬＰＦの濃度が５．０μｇ／ｍｌのＳＬＰＦ溶液４を
用いる以外は実施例１と同様にして、比較用のビーズ５
を得た。ビーズ５のＳＬＰＦ含有量は０．０３μｇ／ｃ
ｍ²であった。<Comparative Example 2> Instead of the SLPF solution 1,
Beads 5 for comparison were prepared in the same manner as in Example 1 except that the SLPF solution 4 having an SLPF concentration of 5.0 μg / ml was used.
Got The SLPF content of beads 5 is 0.03 μg / c
It was m ² .

【００５２】＜比較例３＞ＳＬＰＦ溶液１の代わりに、
ＳＬＰＦの濃度が１０．０μｇ／ｍｌのＳＬＰＦ溶液５
を用いる以外は実施例１と同様にして、比較用のビーズ
６を得た。ビーズ６のＳＬＰＦ含有量は０．０６μｇ／
ｃｍ²であった。<Comparative Example 3> Instead of the SLPF solution 1,
SLPF solution with an SLPF concentration of 10.0 μg / ml 5
Comparative beads 6 were obtained in the same manner as in Example 1 except that was used. The SLPF content of the beads 6 is 0.06 μg /
It was cm ² .

【００５３】＜細胞培養＞得られたビーズ１〜６を用い
て無血清細胞培養実験を行った。６個の１Ｌスピナーフ
ラスコに、６ｇのビーズ１〜６をそれぞれ加え、２５０
ｍｌの味の素（株）製無血清培地ＡＳＦ１０４を加え、
３７℃で２０分間撹拌下温調後、Ｖｅｒｏ細胞［大日本
製薬（株）から購入］を細胞濃度：５．０×１０ ⁶個／
ｍＬに分散したもの５ｍｌを加え、２５ｒｐｍで撹拌し
ながら、二酸化炭素と空気の混合物（二酸化炭素／空気
＝５／９５体積比）中、３７℃で３日間培養を行なっ
た。撹拌下ビーズ懸濁液をサンプリングし、細胞核数を
ウィーゼル（Wezel）によるクリスタルバイオレットを
用いた細胞核計数法（nuclei-counting method）で計数
することで、細胞数を測定した。結果を表１に示す。<Cell culture> Using the obtained beads 1 to 6
A serum-free cell culture experiment was performed. 6 1L spinnerfs
Add 6g of beads 1 to 6 to the Rasco, 250
ml Ajinomoto Co., Inc. serum-free medium ASF104 was added,
After controlling the temperature at 37 ° C for 20 minutes with stirring, Vero cells [Dainippon
Purchased from Pharmaceutical Co., Ltd.] cell concentration: 5.0 × 10 ⁶Individual/
Add 5 ml dispersed in mL and stir at 25 rpm
While a mixture of carbon dioxide and air (carbon dioxide / air
= 5/95 volume ratio) at 37 ° C for 3 days
It was Sampling the bead suspension under stirring and counting the number of cell nuclei
Crystal Violet by Wezel
Count by the used nucleus counting method (nuclei-counting method)
By doing so, the cell number was measured. The results are shown in Table 1.

【００５４】[0054]

【表１】 なお、ビーズ１を用いて同様に、味の素（株）製無血清
培地ＡＳＦ１０４の代わりに、血清培地（ＦＢＳ５％含
有ＤＭＥＭ）を用いた場合の細胞数は、７０×１０⁶個
であった。[Table 1] The number of cells was 70 × 10 ⁶ when a serum medium (FMEM containing 5% FBS) was used instead of the serum-free medium ASF104 manufactured by Ajinomoto Co., Inc. using beads 1.

【００５５】この結果をＳＬＰＦの含有量を横軸にグラ
フ化すると、図１のようになる。図１から、ＳＬＰＦ含
有量が０．１μｇ／ｃｍ²以上で、得られる細胞数が明
らかに激増し、血清培地を用いた場合と同等以上の細胞
数が得られることが判る。以上の実施例及び比較例か
ら、本発明のビーズを用いた場合、無血清培養において
も血清培地を使用した場合と同様に、細胞の増殖が促進
されることが判る。FIG. 1 is a graph showing the SLPF content on the horizontal axis. From FIG. 1, it can be seen that when the SLPF content is 0.1 μg / cm ² or more, the number of cells obtained is remarkably increased, and the number of cells is equal to or more than that when the serum medium is used. From the above Examples and Comparative Examples, it is understood that when the beads of the present invention are used, cell growth is promoted even in serum-free culture as in the case of using a serum medium.

【００５６】[0056]

【発明の効果】本発明のビーズを用いると、無血清でも
細胞を効率的に培養が可能であり、動物細胞を用いる医
薬品やワクチンの生産の完全無血清化が実現できるもの
である。EFFECTS OF THE INVENTION By using the beads of the present invention, cells can be efficiently cultured even in the absence of serum, and the production of pharmaceuticals and vaccines using animal cells can be completely rendered serum-free.

【００５７】[0057]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】ＳＬＰＦ量と細胞数との関係を表したグラフで
ある。FIG. 1 is a graph showing the relationship between the amount of SLPF and the number of cells.

【００５８】[0058]

【配列表】 <110>三洋化成工業株式会社；SANYO CHEMICAL INDUSTRIES,LTD. <120>動物細胞培養用ビーズ <150>特願2001-322356 <151>2001-10-19 <160>11 <210>1 <211>4 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>1 Arg Glu Asp Val 1 <210>2 <211>5 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>2 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210>3 <211>5 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>3 Pro Asp Ser Gly Arg 1 5 <210>4 <211>7 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>4 Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg 1 5 <210>5 <211>6 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>5 Leu Gly Thr Ile Pro Gly 1 5 <210>6 <211>10 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>6 Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile 1 5 10 <210>7 <211>5 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>7 Ile Lys Val Ala Val 1 5 <210>8 <211>4 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>8 Asp Gly Glu Ala 1 <210>9 <211>6 <212>PRT <213>Bombyx mori <400>9 Gly Ala Gly Ala Gly Ser 1 5 <210>10 <211>54 <212>PRT <213>Bombyx mori <400>10 Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala 20 25 30 Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser 35 40 45 Gly Ala Gly Ala Gly Ser 50 <210>11 <211>30 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>11 Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 20 25 30 [Sequence list] <110> SANYO CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. <120> Animal cell culture beads <150> Japanese Patent Application 2001-322356 <151> 2001-10-19 <160> 11 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Glu Asp Val   1 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Ile Gly Ser Arg   1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Pro Asp Ser Gly Arg   1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg   1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Gly Thr Ile Pro Gly   1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile   1 5 10 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ile Lys Val Ala Val   1 5 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Gly Glu Ala   1 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 9 Gly Ala Gly Ala Gly Ser   1 5 <210> 10 <211> 54 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 10 Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala   1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala              20 25 30 Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser          35 40 45 Gly Ala Gly Ala Gly Ser      50 <210> 11 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly   1 5 10 15 Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro              20 25 30

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 微粒子（Ｂ）の表面に、細胞接着シグナ
ルを現す最小アミノ酸配列を１分子中に少なくとも１個
有するポリペプチド（Ｐ）を配してなり、（Ｐ）の含有
量が（Ｂ）の表面積１ｃｍ²当り０．１〜１００μｇで
あることを特徴とする動物細胞培養用ビーズ。1. A polypeptide (P) having at least one minimal amino acid sequence expressing a cell adhesion signal in one molecule is arranged on the surface of the fine particle (B), and the content of (P) is (B). ^{2. The} beads for animal cell culture, characterized in that the surface area per 1 cm ² is 0.1 to 100 μg. 【請求項２】 体積平均粒子径が５０〜２５０μｍであ
る請求項１記載のビーズ。2. The beads according to claim 1, which have a volume average particle diameter of 50 to 250 μm. 【請求項３】 真比重が１．０１〜１．０５ｇ／ｃｍ³
である請求項１又は２記載のビーズ。3. A true specific gravity of 1.01 to 1.05 g / cm ³
The bead according to claim 1 or 2, which is 【請求項４】 微粒子（Ｂ）が少なくともスチレン及び
多官能性モノマーを構成単位としてなる請求項１〜３の
いずれか記載のビーズ。4. The beads according to claim 1, wherein the fine particles (B) have at least styrene and a polyfunctional monomer as constituent units. 【請求項５】 ポリペプチド（Ｐ）の細胞接着シグナル
を現す最小アミノ酸配列の数が、（Ｐ）１分子中に３〜
５０個である請求項１〜４のいずれか記載のビーズ。5. The number of the minimum amino acid sequences which express the cell adhesion signal of the polypeptide (P) is 3 to 1 in one molecule of (P).
The number of beads is 50, which is 50 beads. 【請求項６】 ポリペプチド（Ｐ）の細胞接着シグナル
を現す最小アミノ酸配列が、アミノ酸３文字表記で現わ
される、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Arg Glu
Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、
Pro Asp SerGly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu
Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列
（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配
列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Leu Arg G
lu配列、Asp Gly Glu Ala配列（８）及びHis Ala Val配
列からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列である
請求項１〜５のいずれか記載のビーズ。6. The Arg Gly Asp sequence, Leu Asp Val sequence, Arg Glu in which the minimum amino acid sequence expressing the cell adhesion signal of the polypeptide (P) is represented by the three-letter amino acid code.
Asp Val sequence (1), Tyr Ile Gly Ser Arg sequence (2),
Pro Asp SerGly Arg Sequence (3), Arg Tyr Val Val Leu
Pro Arg sequence (4), Leu Gly Thr Ile Pro Gly sequence (5), Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile sequence (6), Ile Lys Val Ala Val sequence (7), Leu Arg G
The bead according to any one of claims 1 to 5, which is at least one kind of sequence selected from the group consisting of lu sequence, Asp Gly Glu Ala sequence (8) and His Ala Val sequence. 【請求項７】 ポリペプチド（Ｐ）が、さらにアミノ酸
３文字表記で現されるGly Ala Gly Ala Gly Ser配列
（９）を少なくとも２個有してなる請求項１〜６のいず
れか記載のビーズ。7. The bead according to any one of claims 1 to 6, wherein the polypeptide (P) further has at least two Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequences (9) represented by a three-letter amino acid code. . 【請求項８】 無血清培地を用いて、請求項１〜７のい
ずれか記載のビーズ上で動物細胞を培養することを特徴
とする動物細胞の生産方法。8. A method for producing animal cells, which comprises culturing the animal cells on the beads according to claim 1 using a serum-free medium.