JP4593581B2 - Cell culture carrier - Google Patents
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Description
本発明は細胞培養用担体に関する。さらに詳しくは、無血清培養の細胞増殖性に特に効果的な細胞培養用担体に関する。 The present invention relates to a cell culture carrier. More specifically, the present invention relates to a cell culture carrier that is particularly effective for cell growth in serum-free culture.
細胞培養用担体としては、動物由来のコラーゲンを有するデキストランビーズ(非特許文献1)、細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列を有するポリペプチドを配したポリスチレンビーズ(特許文献1)等が知られている。 Known carriers for cell culture include dextran beads having animal-derived collagen (Non-patent Document 1), polystyrene beads having a polypeptide having a minimum amino acid sequence expressing a cell adhesion signal (Patent Document 1), and the like. .
しかし、上記のビーズでは、無血清培養での細胞増殖性が不十分である。また、上記のデキストランビーズでは、動物由来成分を有するためウイルス等の感染因子の混入の危険性があるという問題がある。すなわち、本発明の目的は、無血清培養での細胞増殖性を向上させると共に、感染因子混入の危険性のない細胞培養用担体を提供することである。 However, the above beads are insufficient in cell proliferation in serum-free culture. Moreover, since the above dextran beads have animal-derived components, there is a problem that there is a risk of mixing infectious agents such as viruses. That is, an object of the present invention is to provide a cell culture carrier that improves cell proliferation in serum-free culture and does not risk infectious agents.
本発明の細胞培養担体の特徴は、架橋ポリ(メタ)アクリル酸(塩)粒子(A){以下、粒子(A)と略する場合がある。}と、細胞接着性最小アミノ酸配列(X)を1分子中に少なくとも1個有する人工ポリペプチド(P)とからなり、該(P)の含有量が、細胞培養用担体の乾燥重量を基準として、500ng/g〜50mg/gであり、保水量が10〜30g/gである点を要旨とする。
また、本発明の細胞培養用担体の製造方法の特徴は、粒子(A)と、細胞接着性最小アミノ酸配列(X)を1分子中に少なくとも1個有する人工ポリペプチド(P)とを溶媒中で混合して細胞培養用担体を得る工程を含み、該(P)の含有量が、細胞培養用担体の乾燥重量を基準として、500ng/g〜50mg/gであり、
細胞培養用担体の保水量が10〜30g/gである点を要旨とする。
また、本発明の有用物質の生産方法は、上記の細胞培養用担体及び無血清培地を用いて、細胞を培養する工程を含む点を要旨とする。
また、本発明の組織又は臓器の生産方法は、上記の細胞培養用担体及び無血清培地を用いて、細胞を培養する工程を含む点を要旨とする。
The cell culture carrier of the present invention is characterized by crosslinked poly (meth) acrylic acid (salt) particles (A) {hereinafter abbreviated as particles (A). And an artificial polypeptide (P) having at least one cell adhesion minimal amino acid sequence (X) per molecule, the content of (P) being based on the dry weight of the cell culture carrier 500 ng / g to 50 mg / g, and the gist is that the water retention amount is 10 to 30 g / g.
The method for producing the cell culture carrier of the present invention is characterized in that particles (A) and an artificial polypeptide (P) having at least one cell-adhesive amino acid sequence (X) in one molecule are contained in a solvent. In which the content of (P) is from 500 ng / g to 50 mg / g based on the dry weight of the cell culture carrier,
The gist is that the water retention amount of the cell culture carrier is 10 to 30 g / g.
Moreover, the gist of the method for producing a useful substance of the present invention includes a step of culturing cells using the carrier for cell culture and a serum-free medium.
The gist of the method for producing a tissue or organ of the present invention includes a step of culturing cells using the above cell culture carrier and serum-free medium.
本発明の細胞培養担体は、優れた細胞増殖性を発揮する。また、動物由来成分を含まないため、ウイルス等の感染因子混入の危険性がない。
本発明の細胞培養用担体の製造方法によると、上記の細胞培養用担体を容易に得ることができる。
本発明の有用物質の生産方法によると、優れた細胞増殖性を発揮するため、有用物質を大量に得ることができる。また、ウイルス等の感染因子の混入されていない有用物質を容易に得ることができる。
本発明の組織又は臓器の生産方法によると、優れた細胞増殖性を発揮するため、目的の組織や臓器を容易に得ることができる。また、ウイルス等の感染因子の混入されていない組織や臓器を容易に得ることができる。
The cell culture carrier of the present invention exhibits excellent cell growth properties. Moreover, since it does not contain animal-derived components, there is no risk of contamination with infectious agents such as viruses.
According to the method for producing a cell culture carrier of the present invention, the above cell culture carrier can be easily obtained.
According to the method for producing a useful substance of the present invention, a large amount of a useful substance can be obtained because it exhibits excellent cell growth properties. In addition, useful substances not contaminated with infectious agents such as viruses can be easily obtained.
According to the method for producing a tissue or organ of the present invention, the target tissue or organ can be easily obtained because it exhibits excellent cell proliferation. In addition, it is possible to easily obtain tissues and organs not contaminated with infectious agents such as viruses.
<架橋ポリ(メタ)アクリル酸(塩)粒子(A)>
(メタ)アクリル酸(塩)としては、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸塩及びメタクリル酸塩を意味する。
アクリル酸塩及びメタクリル酸塩としては、アクリル酸又はメタクリル酸のアルカリ金属(リチウム、カリウム及びナトリウム等)塩、アルカリ土類金属(マグネシウム及びカルシウム等)塩及びアンモニウム塩等が用いられる。これらのうち、アルカリ金属塩が好ましく、さらに好ましくはナトリウム塩、リチウム塩及びカリウム塩、特に好ましくはナトリウム塩及びリチウム塩、最も好ましくはナトリウム塩である。
<Crosslinked poly (meth) acrylic acid (salt) particles (A)>
(Meth) acrylic acid (salt) means acrylic acid, methacrylic acid, acrylate and methacrylate.
As the acrylate and methacrylate, alkali metal (such as lithium, potassium and sodium) salts, alkaline earth metal (such as magnesium and calcium) salts and ammonium salts of acrylic acid or methacrylic acid are used. Of these, alkali metal salts are preferable, sodium salts, lithium salts and potassium salts are more preferable, sodium salts and lithium salts are particularly preferable, and sodium salts are most preferable.
架橋ポリ(メタ)アクリル酸(塩)粒子(A)は、(メタ)アクリル酸(塩)を主構成単位としてなるものであれば、(メタ)アクリル酸(塩)と共重合可能なその他のビニルモノマーとを共重合することができる。共重合可能なその他のビニルモノマーとしては、共重合性単量体(親水性ビニルモノマー及び疎水性ビニルモノマー)及び架橋性単量体等が含まれる。
共重合性単量体及び架橋性単量体としては、公知のもの(特開平11−5808号公報、特開2001−2935号公報、特開2003−165883号公報、特開2005−247931号公報、特開2005−186015号公報等)が使用できる。
The crosslinked poly (meth) acrylic acid (salt) particles (A) can be copolymerized with (meth) acrylic acid (salt) as long as (meth) acrylic acid (salt) is the main constituent unit. Vinyl monomers can be copolymerized. Examples of other copolymerizable vinyl monomers include copolymerizable monomers (hydrophilic vinyl monomers and hydrophobic vinyl monomers) and crosslinkable monomers.
As the copolymerizable monomer and the crosslinkable monomer, known ones (Japanese Patent Laid-Open Nos. 11-5808, 2001-2935, 2003-165883, and 2005-247931) are known. JP, 2005-186015, A, etc.) can be used.
共重合性単量体を使用する場合、共重合性単量体単位の含有量(重量%)は、(メタ)アクリル酸(塩)単位の重量に基づいて、0.001〜10が好ましく、さらに好ましくは0.01〜7、特に好ましくは0.03〜5、最も好ましくは0.05〜3である。
細胞増殖性の観点等から、共重合性単量体単位を含まないことが好ましい。
When a copolymerizable monomer is used, the content (% by weight) of the copolymerizable monomer unit is preferably 0.001 to 10, based on the weight of the (meth) acrylic acid (salt) unit, More preferably, it is 0.01-7, Most preferably, it is 0.03-5, Most preferably, it is 0.05-3.
From the viewpoint of cell proliferation, it is preferable not to contain a copolymerizable monomer unit.
架橋性単量体のうち、細胞増殖性の観点等から、エチレン性不飽和基を2個以上有する架橋性単量体及び反応性官能基を2個以上有する架橋性単量体が好ましく、さらに好ましくは反応性官能基を2個以上有する架橋性単量体であり、特に好ましくはポリエチレンイミン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、グリセリン(ジ又はトリ)グリシジルエーテル、最も好ましくはエチレングリコールジグリシジルエーテルである。 Among the crosslinkable monomers, from the viewpoint of cell proliferation, a crosslinkable monomer having two or more ethylenically unsaturated groups and a crosslinkable monomer having two or more reactive functional groups are preferable. Preferably it is a crosslinkable monomer having two or more reactive functional groups, particularly preferably polyethyleneimine, ethylene glycol diglycidyl ether, diethylene glycol diglycidyl ether, propylene glycol diglycidyl ether, glycerin (di or tri) glycidyl ether. Most preferred is ethylene glycol diglycidyl ether.
架橋性単量体を使用する場合、架橋性単量体単位の含有量(重量%)は、(メタ)アクリル酸(塩)単位の重量に基づいて、0.001〜50が好ましく、さらに好ましくは0.005〜15、特に好ましくは0.02〜5、最も好ましくは0.1〜2である。この範囲であると、細胞増殖性がさらに向上する。 When the crosslinkable monomer is used, the content (% by weight) of the crosslinkable monomer unit is preferably 0.001 to 50, more preferably based on the weight of the (meth) acrylic acid (salt) unit. Is 0.005-15, particularly preferably 0.02-5, most preferably 0.1-2. Within this range, cell proliferation is further improved.
粒子(A)は、疎水性有機溶媒に、撹拌下、(メタ)アクリル酸(塩)、並びに必要により、共重合可能なその他のビニルモノマー、重合開始剤、連鎖移動剤及び/又はグラフト基材を連続的に供給して、公知の逆相懸濁重合させる方法(特開平11−5808号公報、特開2001−2935号公報、2003−165883号公報、特開2005−247931号公報及び特開2005−186015号公報等)、(メタ)アクリル酸(塩)、並びに必要により、共重合可能なその他のビニルモノマー、重合開始剤、連鎖移動剤及び/又はグラフト基材を、公知の水溶液重合させる方法(特開2005−075982号公報、特開2005−095759号公報、特開2005−097569号公報、特開2005−186015号公報及び特開2005−186016号公報等)等により製造することができる。 The particles (A) are prepared by mixing (meth) acrylic acid (salt) with a hydrophobic organic solvent under stirring, and, if necessary, other vinyl monomers that can be copolymerized, a polymerization initiator, a chain transfer agent, and / or a graft substrate. Are continuously fed and subjected to known reverse phase suspension polymerization (Japanese Patent Laid-Open Nos. 11-5808, 2001-2935, 2003-165883, 2005-247931 and JP-A-2005-247931). 2005-186015, etc.), (meth) acrylic acid (salt), and, if necessary, other copolymerizable vinyl monomers, polymerization initiators, chain transfer agents and / or graft base materials are polymerized in a known aqueous solution. Method (JP 2005-075982 A, JP 2005-095759 A, JP 2005-097569 A, JP 2005-186015 A It may be prepared by finely JP 2005-186016 Publication), and the like.
架橋ポリ(メタ)アクリル酸(塩)粒子(A)は、必要に応じて、表面架橋剤により表面架橋処理を行うことができる。架橋ポリ(メタ)アクリル酸(塩)粒子の表面近傍を表面架橋剤で架橋処理することは、細胞増殖性の観点等で好適である。 The crosslinked poly (meth) acrylic acid (salt) particles (A) can be subjected to a surface crosslinking treatment with a surface crosslinking agent, if necessary. Cross-linking treatment of the vicinity of the surface of the cross-linked poly (meth) acrylic acid (salt) particles with a surface cross-linking agent is preferable from the viewpoint of cell proliferation.
表面架橋剤としては、例えば、特開昭59−189103号公報等に記載の多価グリシジル(エチレングリコールジグリシジルエーテル及びグリセリンジグリシジルエーテル等が好ましい。)、特開昭58−180233号公報及び特開昭61−16903号公報等に記載の多価アルコール、多価アミン、多価アジリジン及び多価イソシアネート、特開昭61−211305号公報及び特開昭61−252212号公報等に記載のシランカップリング剤、並びに特開昭51−136588号公報及び特開昭61−257235号公報等に記載の多価金属等が挙げられる。これらの表面架橋剤のうち、カルボキシル(塩)基と強い共有結合を形成して耐熱性に優れるという観点から、多価グリシジル、多価アミン及びシランカップリング剤が好ましく、さらに好ましくは多価グリシジル及びシランカップリング剤、特に好ましくは多価グリシジルである。 Examples of the surface cross-linking agent include polyvalent glycidyl (ethylene glycol diglycidyl ether and glycerin diglycidyl ether, etc.) described in JP-A-59-189103, JP-A-58-180233, and the like. Polyhydric alcohols, polyhydric amines, polyhydric aziridines and polyhydric isocyanates described in Japanese Utility Model Laid-Open No. 61-16903, etc., and silane cups described in Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 61-21305 and 61-252212, etc. Examples thereof include ring agents, and polyvalent metals described in JP-A Nos. 51-136588 and 61-257235. Of these surface cross-linking agents, polyvalent glycidyl, polyvalent amine and silane coupling agent are preferred from the viewpoint of forming a strong covalent bond with a carboxyl (salt) group and being excellent in heat resistance, more preferably polyvalent glycidyl. And a silane coupling agent, particularly preferably polyvalent glycidyl.
表面架橋処理をする場合、表面架橋剤の量(重量%)は、表面架橋剤の種類、架橋させる条件等により種々変化するが、表面架橋処理前の架橋ポリ(メタ)アクリル酸(塩)の重量に基づいて、0.002〜8が好ましく、さらに好ましくは0.01〜4、特に好ましくは0.05〜2、最も好ましくは0.05〜1である。 In the case of surface cross-linking treatment, the amount (% by weight) of the surface cross-linking agent varies depending on the type of surface cross-linking agent, conditions for cross-linking, etc., but the cross-linked poly (meth) acrylic acid (salt) before surface cross-linking treatment Based on the weight, 0.002 to 8 is preferable, more preferably 0.01 to 4, particularly preferably 0.05 to 2, and most preferably 0.05 to 1.
表面架橋処理を行う方法としては、従来公知の方法が適用できる(たとえば、特開平11−5808号公報、特開2001−2935号公報、特開2003−165883号公報、特開2005−247931号公報及び特開2005−186015号公報)。 As a method for performing the surface crosslinking treatment, conventionally known methods can be applied (for example, JP-A-11-5808, JP-A-2001-2935, JP-A-2003-165883, JP-A-2005-247931). And JP-A-2005-186015).
粒子(A)は、必要により乾燥処理、粉砕処理及び/又は分級処理される。乾燥処理する方法は特に限定されず、50〜230℃の温度の熱風で乾燥する方法、50〜230℃に加熱されたドラムドライヤー等の使用による薄膜乾燥法、(加熱)減圧乾燥法、凍結乾燥法及び赤外線による乾燥法等が使用できる。粉砕処理する方法は特に限定されず、通常の装置(ハンマー式粉砕機、衝撃式粉砕機、ロール式粉砕機及びジェット気流式粉砕機等)を用いて粉砕できる。また分級処理する方法も特に限定されず、通常の装置(乾式振動篩い機、湿式振動篩い機及び風力分球機等)を用いて分級できる。 The particles (A) are dried, pulverized and / or classified as necessary. The method of drying is not particularly limited, and is a method of drying with hot air at a temperature of 50 to 230 ° C., a thin film drying method using a drum dryer or the like heated to 50 to 230 ° C., a (heating) vacuum drying method, and freeze drying. And drying methods using infrared rays can be used. The method for pulverization is not particularly limited, and the pulverization can be performed using a normal apparatus (hammer-type pulverizer, impact-type pulverizer, roll-type pulverizer, jet airflow-type pulverizer, etc.). Further, the classification method is not particularly limited, and classification can be performed using a normal apparatus (a dry vibration sieve, a wet vibration sieve, a wind classifier, etc.).
粒子(A)の外形状は、球状、針状、扁平(楕円)状(紡錘状)、薄片状、ブドウ房状、不定形破砕状及び繊維状のいずれでもよいが、細胞増殖性の観点等から、球状及び扁平(楕円)状(紡錘状)が好ましく、さらに好ましくは球状である。すなわち、粒子(A)の好ましい形態は、ビーズである。 The outer shape of the particles (A) may be any of spherical, needle-like, flat (elliptical) (spindle-like), flake-like, grape tuft-like, irregularly crushed, and fibrous. Therefore, a spherical shape and a flat (elliptical) shape (spindle shape) are preferable, and a spherical shape is more preferable. That is, a preferred form of the particles (A) is beads.
粒子(A)を生理食塩水で膨潤させて得た膨潤粒子の体積平均粒子径(μm)は、細胞増殖性の観点等から、10〜2000が好ましく、さらに好ましくは25〜1000、特に好ましくは50〜500、最も好ましくは100〜300である。
なお、膨潤粒子の体積平均粒子径は、粒子(A)1重量部を生理食塩水(0.9重量%)100重量部中に、25℃で60分間浸漬させることにより調製される膨潤粒子を、JIS Z8825−1:2001に準拠して、レーザー式粒度分布測定装置(例えば、堀場製作所製LA−920、分散媒:生理食塩水、測定温度:25℃)により測定できる。
The volume average particle diameter (μm) of the swollen particles obtained by swelling the particles (A) with physiological saline is preferably 10 to 2000, more preferably 25 to 1000, particularly preferably from the viewpoint of cell proliferation. 50-500, most preferably 100-300.
The volume average particle diameter of the swollen particles is determined by immersing 1 part by weight of the particles (A) in 100 parts by weight of physiological saline (0.9% by weight) at 25 ° C. for 60 minutes. According to JIS Z8825-1: 2001, it can be measured with a laser particle size distribution measuring apparatus (for example, LA-920 manufactured by Horiba, dispersion medium: physiological saline, measurement temperature: 25 ° C.).
粒子(A)の生理食塩水に対する保水量(g/g)(以下、保水量)は、細胞増殖性の観点等から、2〜50が好ましく、さらに好ましくは5〜40、特に好ましくは10〜30であり、最も好ましくは10〜25である。
なお、保水量は、次の方法により測定される。生理食塩水約100mLを入れたビーカーに、攪拌しながら乾燥した架橋ポリ(メタ)アクリル酸(塩)粒子1.0gを投入してあらかじめ膨潤させて膨潤粒子を得た後、目開き53μmのナイロン網で作製したティーバッグ(縦20cm、横10cm)に移し、過剰の生理食塩水中に60分間浸漬する。次いで、膨潤粒子をティーバッグごと遠心脱水機に入れて、150Gで90秒間遠心脱水を行い、余剰水を取り除く。遠心脱水後の重量(g2)を測定し、次式から算出した値を保水量とする(参考:JIS K7223−1996)。
(保水量)=(g2)−1.0
The water retention amount (g / g) (hereinafter referred to as water retention amount) of the particles (A) with respect to physiological saline is preferably 2 to 50, more preferably 5 to 40, and particularly preferably 10 to 10 from the viewpoint of cell proliferation. 30 and most preferably 10-25.
In addition, the amount of water retention is measured by the following method. In a beaker containing about 100 mL of physiological saline, 1.0 g of crosslinked poly (meth) acrylic acid (salt) particles dried with stirring was added and swollen in advance to obtain swollen particles, and then nylon having an opening of 53 μm. Transfer to a tea bag (20 cm long, 10 cm wide) made with a net and immerse in excess saline for 60 minutes. Next, the swollen particles are put together with the tea bag into a centrifugal dehydrator, and centrifugal dehydration is performed at 150 G for 90 seconds to remove excess water. The weight (g2) after centrifugal dehydration is measured, and the value calculated from the following formula is used as the water retention amount (reference: JIS K7223-1996).
(Water retention amount) = (g2) −1.0
粒子(A)としては、市場から容易に入手でき、アクアパール(登録商標)シリーズ{サンダイヤポリマー(株)}、サンフレッシュ(登録商標)シリーズ{三洋化成工業(株)}、アクアキープ(登録商標)シリーズ{住友精化(株)}、アロンザップ(登録商標)シリーズ(東亜合成(株))及びアクアリック(登録商標)シリーズ((株)日本触媒製)等が挙げられる。これらのうち、アクアパールシリーズ及びアクアキープシリーズが好ましく、さらに好ましくはアクアパールシリーズである。 The particles (A) can be easily obtained from the market. Aqua Pearl (registered trademark) series {Sundia Polymer Co., Ltd.}, Sun Fresh (registered trademark) series {Sanyo Chemical Industries, Ltd.}, Aqua Keep (registered trademark) ) Series {Sumitomo Seika Co., Ltd.}, Alonzap (registered trademark) series (Toa Gosei Co., Ltd.), Aquaric (registered trademark) series (manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd.), and the like. Of these, the Aqua Pearl series and Aqua Keep series are preferred, and the Aqua Pearl series is more preferred.
<人工ポリペプチド(P)>
「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する(大阪府立母子医療センター雑誌、第8巻 第1号、58〜66頁、1992年)。
細胞接着性最小アミノ酸配列(X)としては、「病態生理、第9巻 第7号、527〜535頁、1990年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第8巻 第1号、58〜66頁、1992年」に記載されているもの等が用いられる。
<Artificial polypeptide (P)>
“Cell adhesion” means a property in which a specific minimum amino acid sequence is recognized by a cell integrin receptor, and the cell easily adheres to a substrate (Osaka Prefectural Maternal and Child Medical Center, Vol. 8, No. 1, 58-66, 1992).
Examples of the cell adhesion minimal amino acid sequence (X) include “Pathophysiology, Vol. 9, No. 7, pp. 527-535, 1990” and “Osaka Prefectural Maternal and Child Medical Center, Vol. 8, No. 1, 58-66”. Page, 1992 ", etc. are used.
これらの最小アミノ酸配列(X)の中で、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Leu Arg Glu配列、His Ala Val配列、Arg Glu Asp Val配列(1)、Tyr Ile Gly Ser Arg配列(2)、Pro Asp Ser Gly Arg配列(3)、Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列(4)、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列(5)、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列(6)、Ile Lys Val Ala Val配列(7)、Asp Gly Glu Ala 配列(8)、Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列(9)、Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列(10)、Tyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列(11)、Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys配列(12)、Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly配列(13)、Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys配列(14)、Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr(15)及びPro His Ser Arg Asn(16)からなる群より選ばれる少なくとも1種が好ましく、細胞接着性の観点等から、さらに好ましくはArg Gly Asp配列、Tyr Ile Gly Ser Arg配列(2)、Ile Lys Val Ala Val配列(7)、Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr(15)及びPro His Ser Arg Asn(16)からなる群より選ばれる少なくとも1種、特に好ましくはArg Gly Asp配列である。
これらの最小アミノ酸配列(X)の両端には、他のアミノ酸{アラニン(Ala)、グリシン(Gly)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、システイン(Cys)、メチオニン(Met)、フェニルアラニン(Phe)、チロシン(Tyr)、プロリン(Pro)、トリプトファン(Trp)、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、アルギニン(Arg)、リジン(Lys)及びヒスチジン(His)等}を含んでいてもよい。
Among these minimum amino acid sequences (X), Arg Gly Asp sequence, Leu Asp Val sequence, Leu Arg Glu sequence, His Ala Val sequence, Arg Glu Asp Val sequence (1), Tyr Ile Gly Ser Arg sequence (2) Pro Asp Ser Gly Arg sequence (3), Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg sequence (4), Leu Gly Thr Ile Pro Gly sequence (5), Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile sequence (6), Ile Lys Val Ala Val sequence (7), Asp Gly Glu Ala sequence (8), Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro sequence (9), Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys sequence (10), Tyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser sequence (11), Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys sequence (12), Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly sequence (13) , Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys sequence (14), Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr (15) and Pro His Ser Arg Asn (16) Species are preferable, and from the viewpoint of cell adhesion, Arg Gly Asp sequence, Tyr Ile Gly Ser Arg sequence (2), Ile Lys Val Ala Val sequence (7), Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile At least one selected from the group consisting of Arg Thr (15) and Pro His Ser Arg Asn (16), particularly preferably Arg Gly Asp sequence.
At the both ends of these minimum amino acid sequences (X), other amino acids {alanine (Ala), glycine (Gly), serine (Ser), threonine (Thr), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile) ), Cysteine (Cys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), tyrosine (Tyr), proline (Pro), tryptophan (Trp), asparagine (Asn), glutamine (Gln), aspartic acid (Asp), glutamic acid ( Glu), arginine (Arg), lysine (Lys), histidine (His), etc.}.
人工ポリペプチド(P)は、最小アミノ酸配列(X)を1分子中に少なくとも1個有すればよいが、細胞接着性の観点等から、1分子中に1〜50個有するものが好ましく、さらに好ましくは2〜50個、つぎに好ましくは3〜30個、特に好ましくは4〜20個有するもの、最も好ましくは5〜15個有するものである。なお、2種以上の最小アミノ酸配列(X)が一分子中に含まれてもよい。 The artificial polypeptide (P) may have at least one minimum amino acid sequence (X) in one molecule, but from the viewpoint of cell adhesion, one having 1 to 50 in one molecule is preferable. Preferably those having 2-50, then preferably 3-30, particularly preferably 4-20, most preferably 5-15. Two or more kinds of minimum amino acid sequences (X) may be included in one molecule.
人工ポリペプチド(P)は、最小アミノ酸配列(X)以外に、人工ポリペプチド(P)の熱安定性向上の観点等から、補助アミノ酸配列(Y)を有することが好ましい。 In addition to the minimum amino acid sequence (X), the artificial polypeptide (P) preferably has an auxiliary amino acid sequence (Y) from the viewpoint of improving the thermal stability of the artificial polypeptide (P).
補助アミノ酸配列(Y)としては、最小アミノ酸配列(X)以外のアミノ酸配列が使用でき、人工ポリペプチド(P)の熱安定性の観点等から、Gly 及び/又はAlaを有する配列が好ましい。
補助アミノ酸配列(Y)としては、(Gly Ala)a 配列、(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)b配列、(Gly Ala Gly Ala Gly Tyr)c配列、(Gly Ala Gly Val Gly Tyr)d配列、(Gly Ala Gly Tyr Gly Val)e配列、{Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala}g配列、(Gly Val Pro Gly Val)h配列、(Gly)i配列、(Ala)j配列、(Gly Gly Ala)k配列、(Gly Val Gly Val Pro)m配列、(Gly Pro Pro)n配列、(Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly)o配列、(Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln)p配列及び/又は(Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro)q配列を有する配列等が含まれる。これらのうち、(Gly Ala)a配列、(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)b配列、(Gly Ala Gly Ala Gly Tyr)c配列、(Gly Ala Gly Val Gly Tyr)d配列、(Gly Ala Gly Tyr Gly Val)e、{Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala}g配列、(Gly Val Pro Gly Val)h配列、(Gly Val Gly Val Pro)m配列及び/又は(Gly Pro Pro)n配列を有するものが好ましく、さらに好ましくは(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)b配列、(Gly Val Pro Gly Val)h配列、(Gly Val Gly Val Pro)m配列及び/又は(Gly Pro Pro)n配列を有するもの、特に好ましくは(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)b配列を有するものである。
なお、aは5〜100の整数、bは1〜33の整数、c、d及びeは2〜33の整数、fは1〜194の整数、gは{1}〜{200/(6+f)}の小数点以下を切り捨てした整数、hは2〜40の整数、i及びjは10〜200の整数、kは3〜66の整数、mは2〜40の整数、nは3〜66の整数、oは1〜22の整数、p及びqは1〜13の整数である。
As the auxiliary amino acid sequence (Y), an amino acid sequence other than the minimum amino acid sequence (X) can be used. From the viewpoint of thermal stability of the artificial polypeptide (P), a sequence having Gly and / or Ala is preferable.
The auxiliary amino acid sequence (Y) includes (Gly Ala) a sequence, (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b sequence, (Gly Ala Gly Ala Gly Tyr) c sequence, (Gly Ala Gly Val Gly Tyr) d sequence, ( Gly Ala Gly Tyr Gly Val) e sequence, {Asp Gly Gly (Ala) f Gly Gly Ala} g sequence, (Gly Val Pro Gly Val) h sequence, (Gly) i sequence, (Ala) j sequence, (Gly Gly Ala) k sequence, (Gly Val Gly Val Pro) m sequence, (Gly Pro Pro) n sequence, (Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly) o sequence, (Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln) p sequence and / or (Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro) sequence having q sequence and the like are included. Among these, (Gly Ala) a sequence, (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b sequence, (Gly Ala Gly Ala Gly Tyr) c sequence, (Gly Ala Gly Val Gly Tyr) d sequence, (Gly Ala Gly Tyr Gly Val) e, {Asp Gly Gly (Ala) f Gly Gly Ala} g sequence, (Gly Val Pro Gly Val) h sequence, (Gly Val Gly Val Pro) m sequence and / or (Gly Pro Pro) n sequence Those having a (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b sequence, (Gly Val Pro Gly Val) h sequence, (Gly Val Gly Val Pro) m sequence and / or (Gly Pro Pro) n sequence are preferred. Particularly preferred are those having the (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b sequence.
A is an integer of 5 to 100, b is an integer of 1 to 33, c, d and e are integers of 2 to 33, f is an integer of 1 to 194, and g is {1} to {200 / (6 + f). } An integer obtained by rounding down the decimal point, h is an integer of 2 to 40, i and j are integers of 10 to 200, k is an integer of 3 to 66, m is an integer of 2 to 40, and n is an integer of 3 to 66. , O is an integer from 1 to 22, and p and q are integers from 1 to 13.
補助アミノ酸配列(Y)は、グリシン(Gly)及び/又はアラニン(Ala)を含むことが好ましい。グリシン(Gly)及びアラニン(Ala)を含む場合、これらの合計含有割合(%)は、補助アミノ酸配列(Y)の全アミノ酸個数に基づいて、10〜100が好ましく、さらに好ましくは20〜95、特に好ましくは30〜90、最も好ましくは40〜85である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
グリシン(Gly)及びアラニン(Ala)の両方を含む場合、これらの含有個数割合(Gly/Ala)は、0.03〜40が好ましく、さらに好ましくは0.08〜13、特に好ましくは0.2〜5である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
The auxiliary amino acid sequence (Y) preferably contains glycine (Gly) and / or alanine (Ala). When glycine (Gly) and alanine (Ala) are contained, the total content (%) thereof is preferably 10 to 100, more preferably 20 to 95, based on the total number of amino acids in the auxiliary amino acid sequence (Y). Especially preferably, it is 30-90, Most preferably, it is 40-85. Within this range, the thermal stability is further improved.
When both glycine (Gly) and alanine (Ala) are included, the content ratio (Gly / Ala) is preferably 0.03 to 40, more preferably 0.08 to 13, particularly preferably 0.2. ~ 5. Within this range, the thermal stability is further improved.
補助アミノ酸配列(Y)には、以上の例示の他に、他のアミノ酸{アラニン(Ala)、グリシン(Gly)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、システイン(Cys)、メチオニン(Met)、フェニルアラニン(Phe)、チロシン(Tyr)、プロリン(Pro)、トリプトファン(Trp)、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、アルギニン(Arg)、リジン(Lys)及びヒスチジン(His)等}を含んでいてもよい。 In addition to the above examples, the auxiliary amino acid sequence (Y) includes other amino acids {alanine (Ala), glycine (Gly), serine (Ser), threonine (Thr), valine (Val), leucine (Leu), Isoleucine (Ile), Cysteine (Cys), Methionine (Met), Phenylalanine (Phe), Tyrosine (Tyr), Proline (Pro), Tryptophan (Trp), Asparagine (Asn), Glutamine (Gln), Aspartic acid (Asp) , Glutamic acid (Glu), arginine (Arg), lysine (Lys), histidine (His), etc.}.
(Gly Ala)a配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(17)〜(19)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)b配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(20)〜(22)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Ala Gly Ala Gly Tyr)c配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(23)〜(25)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Ala Gly Val Gly Tyr)d配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(26)〜(28)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Ala Gly Tyr Gly Val)e配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(29)〜(31)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
{Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala}g配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(32)〜(34)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Val Pro Gly Val)h配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(35)〜(38)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly)i配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(39)〜(41)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Ala)j配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(42)〜(44)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Gly Ala)k配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(45)〜(47)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Val Gly Val Pro)m配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(48)〜(50)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Pro Pro)n配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(51)〜(53)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly)o配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(54)〜(56)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln)p配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(57)〜(59)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro)q配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(60)〜(62)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (Gly Ala) a sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (17) to (19).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (20) to (22).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having (Gly Ala Gly Ala Gly Tyr) c sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (23) to (25).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having (Gly Ala Gly Val Gly Tyr) d sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (26) to (28).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (Gly Ala Gly Tyr Gly Val) e sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (29) to (31).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the {Asp Gly Gly (Ala) f Gly Gly Ala} g sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (32) to (34).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having (Gly Val Pro Gly Val) h sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (35) to (38).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (Gly) i sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (39) to (41).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (Ala) j sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (42) to (44).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (Gly Gly Ala) k sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (45) to (47).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having (Gly Val Gly Val Pro) m sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (48) to (50).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having (Gly Pro Pro) n sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (51) to (53).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly) o sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (54) to (56).
(Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln) Examples of the auxiliary amino acid sequence having the p sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (57) to (59).
(Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro) Examples of the auxiliary amino acid sequence having the q sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (60) to (62).
これらの補助アミノ酸配列のうち、配列番号(17)、(18)、(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(26)、(27)、(29)、(30)、(32)、(33)、(34)、(35)、(36)、(38)、(39)、(40)、(42)、(43)、(45)、(46)、(48)、(49)、(51)、(52)、(54)、(55)、(57)、(58)、(60)又は(61)で表されるアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは配列番号(18)、(20)、(21)、(22)、(24)、(27)、(30)、(34)、(35)、(36)、(37)、(38)、(40)、(43)、(46)、(49)、(52)、(55)、(58)又は(61)で表されるアミノ酸配列、特に好ましくは配列番号(20)、(21)又は(38)で表されるアミノ酸配列である。 Among these auxiliary amino acid sequences, SEQ ID NOs: (17), (18), (20), (21), (22), (23), (24), (26), (27), (29), (30), (32), (33), (34), (35), (36), (38), (39), (40), (42), (43), (45), (46 ), (48), (49), (51), (52), (54), (55), (57), (58), (60) or (61) is preferred, More preferably, SEQ ID NOs: (18), (20), (21), (22), (24), (27), (30), (34), (35), (36), (37), ( 38), (40), (43), (46), (49), (52), (55), (58) or (61), particularly preferably Column number (20), the amino acid sequence represented by (21) or (38).
補助アミノ酸配列(Y)を含む場合、(Y)の含有個数は、熱安定性の観点等から、人工ポリペプチド(P)1分子中に、2〜50が好ましく、さらに好ましくは3〜30、特に好ましくは4〜20、最も好ましくは5〜15である。また、人工ポリペプチド(P)は、2種以上の補助アミノ酸配列(Y)を含んでもよい。 When the auxiliary amino acid sequence (Y) is included, the content of (Y) is preferably 2 to 50, more preferably 3 to 30, in 1 molecule of the artificial polypeptide (P) from the viewpoint of thermal stability. Especially preferably, it is 4-20, Most preferably, it is 5-15. Further, the artificial polypeptide (P) may contain two or more auxiliary amino acid sequences (Y).
人工ポリペプチド(P)は、分岐鎖を含んでいてもよく、一部が架橋されていてもよく、環状構造を含んでいてもよい。しかし、人工ポリペプチド(P)は、架橋されていないことが好ましく、さらに好ましくは架橋されていない直鎖構造、特に好ましくは環状構造を持たず架橋されていない直鎖構造である。なお、直鎖構造には、β構造(直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造)も含まれる。 The artificial polypeptide (P) may contain a branched chain, may be partially crosslinked, and may contain a cyclic structure. However, the artificial polypeptide (P) is preferably not cross-linked, more preferably a non-cross-linked linear structure, particularly preferably a non-cross-linked linear structure having no cyclic structure. The linear structure also includes a β structure (secondary structure in which linear peptides are bent and the portions are arranged in parallel and a hydrogen bond is formed therebetween).
人工ポリペプチド(P)は、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、最小アミノ酸配列(X)と補助アミノ酸配列(Y)とが交互に化学結合してなる構造であることが好ましい。この場合、最小アミノ酸配列(X)と補助アミノ酸配列(Y)との繰り返し単位(X−Y)の数(個)は、細胞接着性の観点等から、1〜50が好ましく、さらに好ましくは2〜40、特に好ましくは3〜30、最も好ましくは4〜20である。
また、最小アミノ酸配列(X)と補助アミノ酸配列(Y)との含有個数は同じでも異なっていてもよい。異なっている場合は、いずれかの含有個数が他方の含有個数より1個少ないことが好ましい{この場合、補助アミノ酸配列(Y)が少ないことが好ましい}。人工ポリペプチド(P)中の最小アミノ酸配列(X)と補助アミノ酸配列(Y)との含有個数割合(X/Y)は、0.5〜2が好ましく、さらに好ましくは0.9〜1.4、特に好ましくは1〜1.3である。
また、人工ポリペプチド(P)の末端部分(最小アミノ酸配列(X)又は補助アミノ酸配列(Y)からペプチド末端まで)に他のアミノ酸を含んでもよい。他のアミノ酸を含む場合、その含有個数は、人工ポリペプチド(P)1個当たり、1〜1000個が好ましく、さらに好ましくは3〜300、特に好ましくは10〜100である。
The artificial polypeptide (P) preferably has a structure in which the minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y) are alternately chemically bonded from the viewpoints of cell adhesion and thermal stability. In this case, the number (units) of repeating units (XY) of the minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y) is preferably 1 to 50, more preferably 2 from the viewpoint of cell adhesiveness. -40, particularly preferably 3-30, most preferably 4-20.
Further, the number of the minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y) may be the same or different. When they are different from each other, it is preferable that one of the contained numbers is smaller than the other contained number {in this case, the auxiliary amino acid sequence (Y) is preferably small}. The content ratio (X / Y) between the minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y) in the artificial polypeptide (P) is preferably 0.5 to 2, and more preferably 0.9 to 1. 4, particularly preferably 1-1.3.
Further, other amino acids may be included in the terminal portion of the artificial polypeptide (P) (from the minimum amino acid sequence (X) or auxiliary amino acid sequence (Y) to the end of the peptide). When other amino acids are included, the number thereof is preferably 1 to 1000, more preferably 3 to 300, and particularly preferably 10 to 100 per artificial polypeptide (P).
人工ポリペプチド(P)の重量平均分子量(以下、Mw)は、1,000〜1,000,000が好ましく、さらに好ましくは2,000〜700,000、特に好ましくは3,000〜400,000、最も好ましくは4,000〜200,000である。
なお、人工ポリペプチド(P)のMwは、SDS−PAGE(SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動)法により、測定サンプル{ポリペプチド等}を分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法等の公知の方法によって求められる(以下、同じ)。
The weight average molecular weight (hereinafter referred to as Mw) of the artificial polypeptide (P) is preferably 1,000 to 1,000,000, more preferably 2,000 to 700,000, particularly preferably 3,000 to 400,000. Most preferably, it is 4,000 to 200,000.
In addition, Mw of artificial polypeptide (P) is well-known, such as the method of isolate | separating a measurement sample {polypeptide etc.} by SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis), and comparing a migration distance with a reference material. It is determined by the method (hereinafter the same).
好ましい人工ポリペプチド(P)の一部を以下に例示する。
(1)最小アミノ酸配列(X)がArg Gly Asp配列(x1)の場合
Arg Gly Asp配列(x1)の13個と(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)9配列(21)(y1)の12個とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約11万のポリペプチド{「プロネクチンF」、プロネクチンは三洋化成工業(株)の登録商標(日本及び米国)である。三洋化成工業(株)製<以下同じ>};(x1)の5個と(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3配列(20)(y2)の5個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約2万のポリペプチド(「プロネクチンF2」);(x1)の3個と(Gly Val Pro Gly Val)2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3配列(38)(y3)の3個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約1万のポリペプチド(「プロネクチンF3」)等。
A part of preferable artificial polypeptide (P) is illustrated below.
(1) When the minimum amino acid sequence (X) is Arg Gly Asp sequence (x1)
It has 13 Arg Gly Asp sequences (x1) and 12 (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 9 sequences (21) (y1), and has an Mw of about 11 having a structure in which these are alternately chemically bonded. Ten thousand polypeptides {"Pronectin F", Pronectin is a registered trademark (Japan and USA) of Sanyo Chemical Industries, Ltd. Sanyo Chemical Industries Co., Ltd. (hereinafter the same)}; (x1) and (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 3 sequence (20) (y2) 5 A polypeptide having a structure of about 20,000 (“pronectin F2”); three of (x1) and (Gly Val Pro Gly Val) 2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 3 sequence (38) ( a polypeptide having a structure in which three of y3) and these are alternately chemically bonded to each other and having an Mw of about 10,000 (“pronectin F3”) and the like.
(2)最小アミノ酸配列(X)がIle Lys Val Ala Val配列(x2)の場合
プロネクチンF、プロネクチンF2又はプロネクチンF3のArg Gly Asp配列(x1)をIle Lys Val Ala Val配列(7)(x2)に変更した「プロネクチンL」、「プロネクチンL2」、又は「プロネクチンL3」等。
(2) When the minimum amino acid sequence (X) is the Ile Lys Val Ala Val sequence (x2) The Arg Gly Asp sequence (x1) of pronectin F, pronectin F2 or pronectin F3 is converted into the Ile Lys Val Ala Val sequence (7) (x2) “Pronectin L”, “pronectin L2”, “pronectin L3”, etc.
(3)最小アミノ酸配列(X)がTyr Ile Gly Ser Arg配列(x3)の場合
プロネクチンF、プロネクチンF2又はプロネクチンF3のArg Gly Asp配列(x1)をTyr Ile Gly Ser Arg配列(x3)に変更した「プロネクチンY」、「プロネクチンY2」、又は「プロネクチンY3」等。
(3) When the minimum amino acid sequence (X) is the Tyr Ile Gly Ser Arg sequence (x3) The Arg Gly Asp sequence (x1) of pronectin F, pronectin F2 or pronectin F3 was changed to the Tyr Ile Gly Ser Arg sequence (x3) “Pronectin Y”, “Pronectin Y2”, “Pronectin Y3” and the like.
また、(1)〜(3)のポリペプチドの他、宝酒造(株)製RetroNectin(リコンビナントヒトフィブロネクチンCH−296){最小アミノ酸配列(X)としてArg Gly Asp配列(x1)及びLeu Asp Val配列を含有するMw約6万のポリペプチド}、同RGDS−Protein A{最小アミノ酸配列(X)としてArg Gly Asp配列(x1)を含有するMw約3万のポリペプチド}も好ましく使用できる{ただし、これらのポリペプチドは天然に由来し、補助アミノ酸配列(Y)が含まれていない。よって、熱安定性等が上記の(1)〜(3)よりも劣る。また、これらのポリペプチドのアミノ酸配列は特開平2−311498号に開示されている。}。 In addition to the polypeptides (1) to (3), RetroNectin (recombinant human fibronectin CH-296) manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. {Arg Gly Asp sequence (x1) and Leu Asp Val sequence as the minimum amino acid sequence (X) Mw containing about 60,000 polypeptide}, RGDS-Protein A {Mw about 30,000 polypeptide containing Arg Gly Asp sequence (x1) as the minimum amino acid sequence (X)} can be preferably used {however, These polypeptides are naturally derived and do not contain any auxiliary amino acid sequence (Y). Therefore, thermal stability etc. are inferior to said (1)-(3). The amino acid sequences of these polypeptides are disclosed in JP-A-2-31498. }.
人工ポリペプチド(P)は、人工的に合成されるものであり、例えば、有機合成法(固相合成法、液相合成法等)及び生化学的合成法[遺伝子組換え微生物(酵母、細菌、大腸菌等)]等によって製造する。すなわち、人工ポリペプチド(P)は、動物由来のコラーゲンやフィブロネクチン等の細胞接着性蛋白質を含まない。 Artificial polypeptide (P) is artificially synthesized, for example, organic synthesis methods (solid phase synthesis method, liquid phase synthesis method, etc.) and biochemical synthesis methods [genetically modified microorganisms (yeast, bacteria) , E. coli, etc.)] and the like. That is, the artificial polypeptide (P) does not contain cell-adhesive proteins such as animal-derived collagen and fibronectin.
有機合成法に関しては、例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座2、タンパク質の化学(下)」第641〜694頁(昭和62年5月20日;株式会社東京化学同人発行)に記載されている方法等が用いられる。生化学的合成法に関しては、例えば、特表平3−502935号公報に記載されている方法等が用いられる。人工ポリペプチド(P)を容易に合成できる点で、遺伝子組換え微生物による生化学的合成法が好ましく、特に好ましくは遺伝子組換え大腸菌を用いて合成する方法である。 The organic synthesis method is described in, for example, “Sequel Biochemistry Experiment Course 2, Protein Chemistry (Part 2)” pages 641-694 (May 20, 1987; published by Tokyo Chemical Co., Ltd.) edited by the Japanese Biochemical Society. The method etc. currently used are used. As for the biochemical synthesis method, for example, the method described in JP-T-3-502935 is used. A biochemical synthesis method using a genetically modified microorganism is preferable in that an artificial polypeptide (P) can be easily synthesized, and a method using a genetically modified Escherichia coli is particularly preferable.
本発明の細胞培養用担体において、粒子(A)と人工ポリペプチド(P)とは、通常、化学結合(イオン結合、水素結合及び/又は共有結合等)及び/又は物理吸着(ファンデルワールス力による吸着)によって結合される。粒子(A)と人工ポリペプチド(P)とが強固に結合される点で、化学結合が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。 In the carrier for cell culture of the present invention, the particles (A) and the artificial polypeptide (P) usually have chemical bonds (ionic bonds, hydrogen bonds and / or covalent bonds, etc.) and / or physical adsorption (Van der Waals force). By adsorption). A chemical bond is preferable and a covalent bond is more preferable in that the particles (A) and the artificial polypeptide (P) are firmly bonded.
粒子(A)に人工ポリペプチド(P)を共有結合させる方法としては、例えば、「ペプチド合成の基礎と実験、平成9年10月5日、丸善株式会社発行」に記載の方法等が挙げられ、具体的には、以下の(1)〜(3)の通りである。
(1)人工ポリペプチド(P)のうち1級アミノ基又は2級アミノ基を有するものと粒子(A)のカルボキシル基とを反応させる場合、カルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素{R’−N=C(OCOR)−NH−R’(−OCORが細胞培養用担体に由来する部分)}を得た後、人工ポリペプチド(P)のうち1級アミノ基又は2級アミノ基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、粒子(A)と人工ポリペプチド(P)とをアミド結合できる。
カルボジイミド化合物としては、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩等が挙げられる。
Examples of the method for covalently bonding the artificial polypeptide (P) to the particles (A) include the method described in “Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Published on Mar. 5, 1997, Maruzen Co., Ltd.”. Specifically, it is as the following (1) to (3).
(1) When the artificial polypeptide (P) having a primary amino group or secondary amino group is reacted with the carboxyl group of the particle (A), the carboxyl group is reacted with a carbodiimide compound in advance, and acylisourea { R′—N═C (OCOR) —NH—R ′ (the portion where —OCOR is derived from the cell culture carrier)}, and then the primary amino group or secondary amino group of the artificial polypeptide (P) The particles (A) and the artificial polypeptide (P) can be amide-bonded by adding the compound having the above to the acylisourea.
Examples of the carbodiimide compound include N, N′-dicyclohexylcarbodiimide and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride.
(2)人工ポリペプチド(P)のうち1級アミノ基又は2級アミノ基を有するものと粒子(A)のうちヒドロキシル基を有するもの{共重合単量体として、ヒドロキシル基含有モノマーを用いたもの}とを反応させる場合、粒子(A)のヒドロキシル基を予めカルボニルジイミダゾール化合物と反応させ、イミダゾール誘導体{R−Im、Imはイミダゾリン環、Rが粒子(A)に由来}を得た後、人工ポリペプチド(P)のうち1級アミノ基又は2級アミノ基を有するものをこのイミダゾール誘導体に加えることによって、粒子(A)と人工ポリペプチド(P)とをN−C結合できる。
カルボニルジイミダゾール化合物としては、N,N’−カルボニルジイミダゾール等が挙げられる。
(2) Artificial polypeptide (P) having a primary amino group or secondary amino group and particle (A) having a hydroxyl group {using a hydroxyl group-containing monomer as a copolymerization monomer After reacting the hydroxyl group of the particle (A) with a carbonyldiimidazole compound in advance, an imidazole derivative {R-Im, Im is an imidazoline ring, and R is derived from the particle (A)} is obtained. The particles (A) and the artificial polypeptide (P) can be bonded to each other by adding an artificial polypeptide (P) having a primary amino group or a secondary amino group to the imidazole derivative.
Examples of the carbonyldiimidazole compound include N, N′-carbonyldiimidazole.
(3)人工ポリペプチド(P)のうちヒドロキシル基を有するものと粒子(A)のカルボキシル基とを反応させる場合、粒子(A)のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素を得た後、人工ポリペプチド(P)のうちヒドロキシル基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、粒子(A)とポリペプチドとをエステル結合できる。 (3) When the artificial polypeptide (P) having a hydroxyl group and the carboxyl group of the particle (A) are reacted, the carboxyl group of the particle (A) is previously reacted with a carbodiimide compound to obtain acylisourea. Thereafter, by adding an artificial polypeptide (P) having a hydroxyl group to the acylisourea, the particles (A) and the polypeptide can be ester-bonded.
人工ポリペプチド(P)を粒子(A)に、物理吸着、イオン結合及び/又は水素結合させる方法としては、溶媒等に人工ポリペプチド(P)と粒子(A)とを投入し、混合して作製する方法等が挙げられる。溶媒としては特に制限はないが、無機塩、有機酸塩、酸及び/又は塩基を0.001〜50重量%(好ましくは0.005〜30重量%、さらに好ましくは0.01〜10重量%)含有する水溶液等(特開2003−189848等に記載)が使用できる。
これらの溶媒の中で、無機塩、酸及び/又は塩基を含有する水溶液、並びに水が好ましく、さらに好ましくは無機塩、酸及び/又は塩基を含有する水溶液、並びにイオン交換蒸留水、特に好ましくは無機塩、酸及び/又は塩基を含有する水溶液である。
As a method of physically adsorbing, ionic bonding and / or hydrogen bonding the artificial polypeptide (P) to the particles (A), the artificial polypeptide (P) and the particles (A) are put into a solvent and mixed. Examples of the method include a manufacturing method. Although there is no restriction | limiting in particular as a solvent, An inorganic salt, organic acid salt, an acid, and / or a base are 0.001 to 50 weight% (preferably 0.005 to 30 weight%, More preferably, 0.01 to 10 weight% ) Containing aqueous solution (described in JP-A No. 2003-189848, etc.) can be used.
Among these solvents, an aqueous solution containing an inorganic salt, an acid and / or a base, and water are preferred, an aqueous solution containing an inorganic salt, an acid and / or a base, and ion-exchanged distilled water, particularly preferably. An aqueous solution containing an inorganic salt, acid and / or base.
人工ポリペプチド(P)の含有量は、細胞接着性を向上させる観点等より、細胞培養用担体の乾燥重量あたり、5ng/g〜500mg/gが好ましく、さらに好ましくは50ng/g〜50mg/g、次に好ましくは500ng/g〜50mg/g、次に好ましくは500ng/g〜20mg/g、特に好ましくは500ng/g〜5mg/g、最も好ましくは5μg〜5mg/gである。 The content of the artificial polypeptide (P) is preferably 5 ng / g to 500 mg / g, more preferably 50 ng / g to 50 mg / g, based on the dry weight of the cell culture carrier, from the viewpoint of improving cell adhesion. Then, preferably 500 ng / g to 50 mg / g, then preferably 500 ng / g to 20 mg / g, particularly preferably 500 ng / g to 5 mg / g, most preferably 5 μg to 5 mg / g.
なお、細胞培養用担体の乾燥単位重量あたりの人工ポリペプチド(P)の含有量は、人工ポリペプチド(P)の含有量が500μg/gを超える場合、例えば、Biuret法(日本生化学会編「生化学実験講座1、タンパク質の化学I」第45〜55頁(1979
年12月11日;株式会社東京化学同人発行)等により求められる。
一方、人工ポリペプチド(P)の含有量が500μg/g以下の場合、例えば、Kjeldahl法(日本生化学会編「生化学実験講座1、タンパク質の化学I」第45〜55
頁(1979年12月11日;株式会社東京化学同人発行)等により求められる。
また、免疫学的測定法(特開2004−049921号公報等に記載)を利用して測定することもできる。具体的には、(1)人工ポリペプチド(P)の含有量が既知である細胞培養用担体{Biuret法やKjeldahl法等で人工ポリペプチド(P)の含有量が既知になった細胞培養担体}を生理食塩水に浸漬し、人工ポリプチド(P)と結合する抗体に酵素を標識したもの(以下、酵素標識抗体)とを反応させ、この反応した酵素標識抗体の酵素量を吸光度測定し、検量線(人工ポリペプチド(P)の含有量とそれに対する吸光度)を作成する。(2)同様に検体(人工ポリペプチド(P)の含有量が未知である細胞培養用担体)の吸光度を測定する。(1)で得られた検量線と(2)で得られた吸光度から、検体の人工ポリペプチド(P)の含有量を求めることができる。
乾燥重量は、測定試料1gを減圧乾燥機の中に入れ、120℃、0.1kPa以下の条件で1時間乾燥して、計量することにより得られる。
The content of the artificial polypeptide (P) per unit dry weight of the cell culture carrier is, for example, Biuret method (edited by the Biochemical Society of Japan “ Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry I ”pages 45-55 (1979)
December 11th; issued by Tokyo Chemical Co., Ltd.)
On the other hand, when the content of the artificial polypeptide (P) is 500 μg / g or less, for example, the Kjeldahl method (Japan Biochemical Society edited by “Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry I” 45-55
Page (December 11, 1979; issued by Tokyo Chemical Co., Ltd.).
Moreover, it can also measure using the immunoassay (it describes in Unexamined-Japanese-Patent No. 2004-049921 etc.). Specifically, (1) Cell culture carrier whose content of artificial polypeptide (P) is known {Cell culture carrier whose content of artificial polypeptide (P) is known by Biuret method, Kjeldahl method, etc. } Is immersed in physiological saline, and an antibody that binds to an artificial polypeptide (P) is reacted with an enzyme labeled (hereinafter referred to as an enzyme-labeled antibody). A calibration curve (content of artificial polypeptide (P) and absorbance relative thereto) is prepared. (2) Similarly, the absorbance of the specimen (cell culture carrier whose content of artificial polypeptide (P) is unknown) is measured. The content of the artificial polypeptide (P) in the sample can be determined from the calibration curve obtained in (1) and the absorbance obtained in (2).
The dry weight can be obtained by placing 1 g of a measurement sample in a vacuum dryer, drying it for 1 hour under the conditions of 120 ° C. and 0.1 kPa or less, and weighing it.
本発明の細胞培養用担体は、細胞増殖性を高めるため、細胞増殖因子を含有させてもよい。細胞増殖因子としては、細胞の増殖を促進する物質、例えば、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インシュリン様増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、神経成長因子、幹細胞因子、白血病阻害因子、骨形成因子、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、神経栄養因子、結合組織成長因子、アンジオポエチン、コンドロモジュリン、テノモジュリン、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、アドレナモジュリン及びナトリウム利尿ペプチド等の生理活性ポリペプチド等が挙げられる(例えば、財団法人名古屋大学出版会発行「上田実編ティッシュエンジニアリング」(1999年)に記載)。これらの細胞増殖因子の中で、適用できる組織細胞の範囲が広く、細胞増殖性がより高くなるという観点等から、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インシュリン様増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、骨形成因子、インターロイキン及び腫瘍壊死因子が好ましく、さらに好ましくは線維芽細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、インターロイキン及び腫瘍壊死因子である。 The cell culture carrier of the present invention may contain a cell growth factor in order to enhance cell proliferation. Cell growth factors include substances that promote cell growth, such as fibroblast growth factor, transforming growth factor, epidermal growth factor, hepatocyte growth factor, platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial cell Growth factor, nerve growth factor, stem cell factor, leukemia inhibitory factor, bone morphogenetic factor, heparin-binding epidermal growth factor, neurotrophic factor, connective tissue growth factor, angiopoietin, chondromodulin, tenomodulin, interferon, interleukin, tumor necrosis factor And bioactive polypeptides such as colony-stimulating factor, adrenamodulin and natriuretic peptide (for example, described in “Ueda Minoru Tissue Engineering” (1999) published by Nagoya University Press). Among these cell growth factors, the range of tissue cells that can be applied is wide, and from the viewpoint of higher cell proliferation, fibroblast growth factor, transforming growth factor, epidermal growth factor, hepatocyte growth factor Platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor, bone morphogenetic factor, interleukin and tumor necrosis factor, more preferably fibroblast growth factor, epithelial cell growth factor, insulin-like growth factor, blood vessel Endothelial cell growth factor, interleukin and tumor necrosis factor.
細胞増殖因子は、粒子(A)に結合していることが好ましい。この結合は、粒子(A)と人工ポリペプチド(P)との結合と同様に、化学結合及び/又は物理吸着が使用でき、好ましい化学結合及び/又は物理吸着も同様である。 The cell growth factor is preferably bound to the particles (A). For this bond, chemical bond and / or physical adsorption can be used as well as the bond between the particle (A) and the artificial polypeptide (P), and the preferred chemical bond and / or physical adsorption are also the same.
細胞増殖因子を含む場合、この含有量は、細胞増殖性を向上させる観点等より、細胞培養用担体の乾燥重量あたり、10pg/g〜1000μg/gが好ましく、さらに好ましくは100pg/g〜100μg/g、特に好ましくは1000pg/g〜10μg/gである。 When a cell growth factor is included, the content is preferably 10 pg / g to 1000 μg / g, more preferably 100 pg / g to 100 μg / g, based on the dry weight of the cell culture carrier, from the viewpoint of improving cell growth. g, particularly preferably 1000 pg / g to 10 μg / g.
本発明の細胞培養用担体の外形状、体積平均粒子径及び保水量の好ましい範囲は、粒子(A)の好ましい範囲と一致する。 The preferable ranges of the outer shape, volume average particle diameter, and water retention amount of the cell culture carrier of the present invention coincide with the preferable ranges of the particles (A).
本発明の細胞培養用担体は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法としては、放射線、エチレンオキサイドガス、プラズマ、γ線、アルコール、オートクレーブ、乾熱等を用いた滅菌方法が適用できる。これらは、1種の方法のみで行ってもよいし、2種以上を組み合わせてもよい。 The cell culture carrier of the present invention may be sterilized as necessary. As a sterilization method, a sterilization method using radiation, ethylene oxide gas, plasma, γ rays, alcohol, autoclave, dry heat, or the like can be applied. These may be performed only by one type of method, or two or more types may be combined.
本発明の細胞培養用担体に接着できる細胞(CE)としては細胞であれば制限がないが、本発明の細胞培養用担体を用いると細胞増殖性が高いため、医薬品等の有用物質生産や治療等に用いられる哺乳動物由来の正常細胞、哺乳動物由来の株化細胞及び昆虫細胞が適している。
哺乳動物由来の正常細胞としては、皮膚に関与する細胞(上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等)、血管に関与する細胞(血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等)、筋肉に関与する細胞(筋肉細胞等)、脂肪に関与する細胞(脂肪細胞等)、神経に関与する細胞(神経細胞等)、肝臓に関与する細胞(肝細胞等)、膵臓に関与する細胞(膵ラ島細胞等)、腎臓に関与する細胞(腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等)、肺・気管支に関与する細胞(上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等)、目に関与する細胞(視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等)、前立腺に関与する細胞(上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞等)、骨に関与する細胞(骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等)、軟骨に関与する細胞(軟骨芽細胞及び軟骨細胞等)、歯に関与する細胞(歯根膜細胞及び骨芽細胞等)、血液に関与する細胞(白血球及び赤血球等)、及び幹細胞{例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞(oval cell、small hepatocyte等)、脂肪組織幹細胞、胚性幹(ES)細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、***幹細胞、胚生殖幹(EG)細胞、膵臓幹細胞(膵管上皮幹細胞等)、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、角膜系幹細胞、前駆細胞(脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、NK前駆細胞等)等}等が挙げられる。
The cell (CE) that can adhere to the cell culture carrier of the present invention is not limited as long as it is a cell. However, when the cell culture carrier of the present invention is used, cell proliferation is high, so that useful substances such as pharmaceuticals can be produced and treated. For example, normal cells derived from mammals, established cell lines derived from mammals, and insect cells are suitable.
Normal cells derived from mammals include cells involved in the skin (epithelial cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, etc.), cells involved in blood vessels (vascular endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, etc.) ), Cells involved in muscle (muscle cells, etc.), cells involved in fat (fat cells, etc.), cells involved in nerves (nerve cells, etc.), cells involved in liver (hepatocytes, etc.), involved in pancreas Cells (pancreatic islet cells, etc.), kidney-related cells (renal epithelial cells, proximal tubular epithelial cells, mesangial cells, etc.), lung-bronchial cells (epithelial cells, fibroblasts, vascular endothelial cells and Smooth muscle cells, etc.), cells involved in the eyes (visual cells, corneal epithelial cells and corneal endothelial cells, etc.), cells involved in prostate (epithelial cells, stromal cells, smooth muscle cells, etc.), cells involved in bone ( Osteoblasts, bone cells and osteoclasts) Cells involved in cartilage (such as chondroblasts and chondrocytes), cells involved in teeth (such as periodontal ligament cells and osteoblasts), cells involved in blood (such as leukocytes and erythrocytes), and stem cells {eg, bone marrow Differentiated mesenchymal stem cells, skeletal muscle stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, hepatic stem cells (oval cells, small hepatocytes, etc.), adipose tissue stem cells, embryonic stem (ES) cells, epidermal stem cells, intestinal stem cells, sperm stem cells, embryos Reproductive stem (EG) cells, pancreatic stem cells (pancreatic ductal epithelial stem cells, etc.), leukocyte stem cells, lymphocyte stem cells, corneal stem cells, progenitor cells (adipose precursor cells, vascular endothelial precursor cells, cartilage precursor cells, lymphoid precursor cells) , NK progenitor cells, etc.)} and the like.
哺乳動物由来の株化細胞としては、3T3細胞、A549細胞、AH130細胞、B95−8細胞、BHK細胞、BOSC23細胞、BS−C−1細胞、C3H10T1/2細胞、C−6細胞、CHO細胞、COS細胞、CV−1細胞、F9細胞、FL細胞、FL5−1細胞、FM3A細胞、G−361細胞、GP+E−86細胞、GP+envAm12細胞、H4−II−E細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、HEp−2細胞、HL−60細胞、HTC細胞、HUVEC細胞、IMR−32細胞、IMR−90細胞、K562細胞、KB細胞、L細胞、L5178Y細胞、L−929細胞、MA104細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、MIA PaCa−2細胞、N18細胞、Namalwa細胞、NG108−15細胞、NRK細胞、OC10細胞、OTT6050細胞、P388細胞、PA12細胞、PA317細胞、PC−12細胞、PER.C6細胞、PG13細胞、QGH細胞、Raji細胞、RPMI−1788細胞、SGE1細胞、Sp2/O−Ag14細胞、ST2細胞、THP−1細胞、U−937細胞、V79細胞、VERO細胞、WI−38細胞、ψ2細胞、及びψCRE細胞等が挙げられる{細胞培養の技術(日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、1999年)}。 Cell lines derived from mammals include 3T3 cells, A549 cells, AH130 cells, B95-8 cells, BHK cells, BOSC23 cells, BS-C-1 cells, C3H10T1 / 2 cells, C-6 cells, CHO cells, COS cells, CV-1 cells, F9 cells, FL cells, FL5-1 cells, FM3A cells, G-361 cells, GP + E-86 cells, GP + envAm12 cells, H4-II-E cells, HEK293 cells, HeLa cells, HEp− 2 cells, HL-60 cells, HTC cells, HUVEC cells, IMR-32 cells, IMR-90 cells, K562 cells, KB cells, L cells, L5178Y cells, L-929 cells, MA104 cells, MDBK cells, MDCK cells, MIA PaCa-2 cells, N18 cells, Namalwa cells, NG108-15 cells, NRK cells , OC10 cells, OTT6050 cells, P388 cells, PA12 cells, PA317 cells, PC-12 cells, PER. C6 cell, PG13 cell, QGH cell, Raji cell, RPMI-1788 cell, SGE1 cell, Sp2 / O-Ag14 cell, ST2 cell, THP-1 cell, U-937 cell, V79 cell, VERO cell, WI-38 cell , Ψ2 cells, ψCRE cells, etc. {Cell culture technology (edited by the Japanese Society for Tissue Culture, published by Asakura Shoten Co., Ltd., 1999)}.
昆虫細胞としては、カイコ細胞(BmN細胞及びBoMo細胞等)、クワコ細胞、サクサン細胞、シンジュサン細胞、ヨトウガ細胞(Sf9細胞及びSf21細胞等)、クワゴマダラヒトリ細胞、ハマキムシ細胞、ショウジョウバエ細胞、センチニクバエ細胞、ヒトスジシマカ細胞、アゲハチョウ細胞、ワモンゴキブリ細胞及びイラクサキンウワバ細胞(Tn−5細胞、HIGH FIVE細胞及びMG1細胞等)等が挙げられる{昆虫バイオ工場(木村滋 編著、株式会社工業調査会 発行、2000年)。
これらの細胞のうち、医薬品等の有用物質生産や治療等の観点から、哺乳動物由来の正常細胞及び哺乳動物由来の株化細胞が好ましい。そして、治療に有用な点で、さらに好ましくは平滑筋細胞、肝細胞、骨芽細胞、上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び幹細胞、特に好ましくは上皮細胞である。また、医薬品等の有用物質生産に有用な点で、さらに好ましくは3T3細胞、BHK細胞、CHO細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、L−929細胞、MDCK細胞、PER.C6細胞、VERO細胞及びWI−38細胞、特に好ましくはMDCK細胞及びVERO細胞である。
Insect cells include silkworm cells (BmN cells, BoMo cells, etc.), mulberry cells, sakusan cells, synjusan cells, mushroom cells (Sf9 cells, Sf21 cells, etc.), stag beetle hitori cells, caterpillar cells, Drosophila cells, sentinic fly, Cell, human striped cell, swallowtail butterfly cell, American cockroach cell, and nettle cottonweed cell (Tn-5 cell, HIGH FIVE cell, MG1 cell, etc.) etc. {Insect Bio Factory (edited by Shigeru Kimura, published by Industrial Research Institute, Inc., 2000) Year).
Among these cells, normal cells derived from mammals and established cell lines derived from mammals are preferable from the viewpoint of production of useful substances such as pharmaceuticals and treatment. In terms of usefulness in treatment, smooth muscle cells, hepatocytes, osteoblasts, epithelial cells, fibroblasts, vascular endothelial cells and stem cells, particularly preferably epithelial cells are preferred. Moreover, 3T3 cells, BHK cells, CHO cells, HEK293 cells, HeLa cells, L-929 cells, MDCK cells, PER. C6 cells, VERO cells and WI-38 cells, particularly preferably MDCK cells and VERO cells.
本発明の細胞培養用担体を用いる細胞培養方法に用いる培地(ME)としては、無血清培地(Grace培地、IPL−41培地、Schneider’s培地、Opti−PROTMSFM培地、Opti−MEMTMI培地、VP−SFM培地、CD293培地、2
93SFMII培地、CD−CHO培地、CHO−S−SFMII培地、FreeStyleTM293培地、CD−CHO ATGTM培地及びこれらの混合培地等);一般の培地(RPMI培地、MEM培地、Eagle’sMEM培地、BME培地、DME培地、αMEM培地、IMEM培地、ES培地、DM−160培地、Fisher培地、F12培地、WE培地、ASF103培地、ASF104培地、ASF301培地、TC−100培地、Sf−900II培地、Ex−cell405培地、Express−Five培地、Drosophila培地及びこれらの混合培地);及びこれらの混合培地が挙げられる。
これらのうち、ヒトへの感染の可能性がある物質(血清に由来するウイルス等)の混入防止の観点等から、無血清培地が好ましく、さらに好ましくはOpti−PROTMSFM培地、Opti−MEMTMI培地、VP−SFM培地、CD293培地、293SFMI
I培地、CD−CHO培地、CHO−S−SFMII培地、FreeStyleTM293培地、CD−CHO ATGTM培地及びこれらの混合培地、特に好ましくはOpti−PROTMSFM培地、VP−SFM培地、CD293培地、293SFMII培地、FreeStyleTM293培地及びこれらの混合培地である。
As a medium (ME) used in the cell culture method using the cell culture carrier of the present invention, a serum-free medium (Grace medium, IPL-41 medium, Schneider's medium, Opti-PRO ™ SFM medium, Opti-MEM ™ I). Medium, VP-SFM medium, CD293 medium, 2
93 SFMII medium, CD-CHO medium, CHO-S-SFMII medium, FreeStyle ™ 293 medium, CD-CHO ATG ™ medium, and mixed media thereof; general media (RPMI medium, MEM medium, Eagle's MEM medium, BME) Medium, DME medium, αMEM medium, IMEM medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, ASF103 medium, ASF104 medium, ASF301 medium, TC-100 medium, Sf-900II medium, Ex-cell405 Medium, Express-Five medium, Drosophila medium and mixed medium thereof); and mixed medium thereof.
Of these, a serum-free medium is preferable from the viewpoint of preventing contamination with substances (such as serum-derived viruses) that may infect humans, and more preferably Opti-PRO ™ SFM medium, Opti-MEM ™. I medium, VP-SFM medium, CD293 medium, 293SFMI
I medium, CD-CHO medium, CHO-S-SFMII medium, FreeStyle ™ 293 medium, CD-CHO ATG ™ medium and mixed media thereof, particularly preferably Opti-PRO ™ SFM medium, VP-SFM medium, CD293 medium, 293SFMII medium, FreeStyle ™ 293 medium, and mixed media thereof.
また、これらの培地には、血清を添加することができるが、ヒトへの感染の可能性がある物質(血清に由来するウイルス等)の混入防止の観点等から、血清を添加しないことが好ましい。
血清としては、ヒト血清、及び動物血清(ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等)が含まれる。
血清を添加する場合、これらのうち、ヒト血清、ウシ血清、及びウマ血清が好ましい。また、動物血清の由来は、成体由来の血清、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清等が挙げられる。血清を添加する場合、これらのうち、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清が好ましく、さらに好ましくは新生由来の血清、及び胎児由来の血清、特に好ましくは胎児由来の血清である。血清を添加する場合、さらに血清は、非働化処理や、抗体の除去処理等を行ってもよい。
血清を使用する場合、血清の使用量(重量%)は、培地の重量に基づいて、0.1〜50が好ましく、さらに好ましくは0.3〜30、特に好ましくは1〜20である。
In addition, serum can be added to these media, but it is preferable not to add serum from the viewpoint of preventing contamination with substances (such as viruses derived from serum) that may infect humans. .
Serum includes human serum and animal serum (bovine serum, horse serum, goat serum, sheep serum, pig serum, rabbit serum, chicken serum, rat serum, mouse serum, etc.).
Of these, human serum, bovine serum, and horse serum are preferred when serum is added. The origin of animal serum includes adult-derived serum, offspring-derived serum, newborn-derived serum, fetal-derived serum, and the like. When adding serum, among these, serum derived from offspring, serum derived from newborn, and serum derived from fetus are more preferable, serum derived from newborn, and serum derived from fetus, particularly preferably serum derived from fetus. is there. When serum is added, the serum may be further subjected to inactivation treatment, antibody removal treatment, or the like.
When using serum, the amount of serum used (% by weight) is preferably 0.1 to 50, more preferably 0.3 to 30, and particularly preferably 1 to 20, based on the weight of the medium.
培地中には、必要に応じて、細胞増殖因子を含有させることができる。細胞増殖因子を含有させることにより、細胞の増殖速度を高めたり、細胞活性を高めたりすることができる。
細胞増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インシュリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、神経成長因子、幹細胞因子、白血病阻害因子、骨形成因子、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、神経栄養因子、結合組織成長因子、アンジオポエチン、サイトカイン、インターロイキン、アドレナモジュリン及びナトリウム利尿ペプチド等の生理活性ペプチドが含まれる。これらのうち、適用できる細胞の範囲が広く、治癒期間がより短縮できるという観点から、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インシュリン様増殖因子及び骨形成因子が好ましく、さらに好ましくは線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子及びインシュリン様増殖因子である。
細胞増殖因子を使用する場合、細胞増殖因子の含有量(重量%)は細胞増殖因子の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、10-16〜10-3が好ましく、さらに好ましくは10-14〜10-5、特に好ましくは10-12〜10-7である。
A cell growth factor can be contained in the culture medium as necessary. By containing a cell growth factor, the cell growth rate can be increased and the cell activity can be increased.
Cell growth factors include fibroblast growth factor, transforming growth factor, epithelial growth factor, hepatocyte growth factor, platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor, nerve growth factor, stem cell factor, leukemia Inhibitory factors, osteogenic factors, heparin-binding epithelial cell growth factor, neurotrophic factor, connective tissue growth factor, angiopoietin, cytokines, interleukins, adrenamodulin and natriuretic peptides are included. Of these, fibroblast growth factor, transforming growth factor, insulin-like growth factor and osteogenic factor are preferable, and more preferably fibroblasts, from the viewpoint that the range of applicable cells is wide and the healing period can be further shortened. Growth factors, transforming growth factors and insulin-like growth factors.
When a cell growth factor is used, the content (% by weight) of the cell growth factor varies depending on the type of the cell growth factor, but is preferably 10 −16 to 10 −3 , more preferably 10 − based on the weight of the medium. 14 to 10 −5 , particularly preferably 10 −12 to 10 −7 .
これらの培地には、さらに抗菌剤(アンホテリシンB、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシン等)を含有させることができる。抗菌剤を含有させる場合、この含有量(重量%)は抗菌剤の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、10-6〜10が好ましく、さらに好ましくは10-5〜1、特に好ましくは10-4〜0.1である。 These media can further contain an antibacterial agent (amphotericin B, gentamicin, penicillin, streptomycin, etc.). When the antibacterial agent is contained, the content (% by weight) varies depending on the type of the antibacterial agent, but is preferably 10 −6 to 10, more preferably 10 −5 to 1, particularly preferably based on the weight of the medium. 10 −4 to 0.1.
培地に分散させる細胞の濃度(個/mL)としては特に制限はないが、培地1mL当たり、100〜1億が好ましく、さらに好ましくは1000〜1千万、特に好ましくは1万〜100万である。
細胞の個数の計数方法は公知の方法が使用でき、例えば、クリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法で測定することができる{細胞培養の技術(日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、1999年)}。
また、培地に投入する細胞培養用担体の乾燥重量(g)は、培養する細胞の種類等によって適宜決定できるが、培地1L当たり、0.005〜800が好ましく、さらに好ましくは0.02〜200、特に好ましくは0.1〜40である。
Although there is no restriction | limiting in particular as a density | concentration (cell / mL) of the cell disperse | distributed to a culture medium, 100-100 million per 1 mL of culture media are preferable, More preferably, it is 1000-10 million, Most preferably, it is 10,000-1 million. .
A known method can be used as a method for counting the number of cells. For example, it can be measured by a cell nucleus counting method using crystal violet {Cell culture technology (edited by the Japanese Society for Tissue Culture, published by Asakura Shoten Co., Ltd., 1999). )}.
Further, the dry weight (g) of the cell culture carrier to be introduced into the medium can be appropriately determined depending on the type of cells to be cultured, etc., but is preferably 0.005 to 800, more preferably 0.02 to 200 per liter of the medium. Especially preferably, it is 0.1-40.
培養条件としては、特に制限は無く、二酸化炭素(CO2)濃度1〜20体積%、5〜45℃で1時間〜100日間、必要に応じて1〜10日毎に培地交換しなら培養する条件等が適用できる。好ましい条件としては、CO2濃度3〜10体積%、30〜40℃、1〜20日間、1〜3日毎に培地交換しながら培養する条件である。 There are no particular limitations on the culture conditions, and carbon dioxide (CO 2 ) concentration of 1 to 20% by volume, 5 to 45 ° C. for 1 hour to 100 days, and if necessary, culture conditions are changed every 1 to 10 days. Etc. are applicable. Preferable conditions are conditions in which the culture is performed while changing the medium every 1 to 3 days, at a CO 2 concentration of 3 to 10% by volume, 30 to 40 ° C., for 1 to 20 days.
細胞培養用担体から、細胞を剥離する方法は、公知の方法が使用でき、例えば、キレート剤(EDTA等)、非動物由来の蛋白質分解酵素{植物由来の蛋白質分解酵素(パパイン等)}、遺伝子組換えによる合成酵素(商品名:TrypLETM Select、インビトロジェン(株)製等)及び/又は動物由来の蛋白質分解酵素(トリプシンやコラゲナーゼ等)によって剥離させる方法が利用できる。 Known methods can be used to detach cells from the cell culture carrier, such as chelating agents (EDTA, etc.), non-animal derived proteolytic enzymes {plant-derived proteolytic enzymes (papain, etc.)}, genes A method of peeling with a recombinant synthetic enzyme (trade name: TrypLE ™ Select, manufactured by Invitrogen Co., Ltd.) and / or an animal-derived proteolytic enzyme (trypsin, collagenase, etc.) can be used.
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、特記しない限り、部は重量部、%は重量%を意味する。また、以下の記載において、実施例19、20、22、23、49、50及び53はそれぞれ参考例1〜7であり、実施例43、44、46及び47はそれぞれ参考例8〜11である。
<実施例1>
<架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の準備>
攪拌機、モノマー供給管、窒素ガス導入管、温度計、還流冷却器を備えた反応容器にシクロヘキサン624部、重合分散剤としてソルビタンモノステアレート3.1部を仕込み、窒素バブリングを30分以上行って、溶存空気を追い出し75℃まで昇温した。
別の反応器に80%アクリル酸水溶液173部を仕込み、冷却しながら28%水酸化ナトリウム水溶液207部を加えて中和した。この水溶液に架橋性単量体{エチレングリコールジグリシジルエーテル}4.52部及び重合開始剤{過硫酸カリウム}0.278部、連鎖移動剤{次亜リン酸ナトリウム}0.053部を添加した後、窒素バブリングを行い、溶存空気を追い出しモノマー水溶液を得た。
得られたモノマー水溶液を上記の重合反応器のモノマー供給管より6.5ml/分の割合で連続的に重合反応器内の撹拌中(撹拌速度は500rpm)のシクロヘキサン液中に約1時間かけて供給してシクロヘキサン還流下で重合を行った。
次に共沸脱水によって160部の水を抜き出した後、含水ゲルポリマーを取り出し、更に120℃で2時間乾燥して、乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を得た。
乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を、目開きが63μmのふるい及び53μmのふるい(JIS Z8801−1:2000)により分級して、粒子径53〜63μmの粒子{架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩粒子}を得た。
次に、得られた粒子に対して、エチレングリコールジグリシジルエーテルを溶液濃度として2%含むメタノール/イオン交換水(体積比70/30)溶液7.5部を添加し均一混合した。次いで、メタノールを風乾した後に密閉容器に入れ、80℃で1時間保持し、表面架橋を行った。その後、順風乾燥機中で120℃で30分間乾燥させて、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)を得た。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples. Unless otherwise specified, “part” means “part by weight” and “%” means “% by weight”. In the following description, Examples 19, 20, 22, 23, 49, 50 and 53 are Reference Examples 1 to 7, respectively, and Examples 43, 44, 46 and 47 are Reference Examples 8 to 11, respectively. .
<Example 1>
<Preparation of crosslinked polyacrylate particles (A1)>
A reaction vessel equipped with a stirrer, a monomer supply pipe, a nitrogen gas introduction pipe, a thermometer, and a reflux condenser was charged with 624 parts of cyclohexane and 3.1 parts of sorbitan monostearate as a polymerization dispersant, and nitrogen bubbling was performed for 30 minutes or more. The dissolved air was driven out and the temperature was raised to 75 ° C.
A separate reactor was charged with 173 parts of an 80% aqueous acrylic acid solution, and neutralized by adding 207 parts of a 28% aqueous sodium hydroxide solution while cooling. To this aqueous solution was added 4.52 parts of a crosslinkable monomer {ethylene glycol diglycidyl ether}, 0.278 parts of a polymerization initiator {potassium persulfate}, and 0.053 parts of a chain transfer agent {sodium hypophosphite}. Thereafter, nitrogen bubbling was performed to drive out dissolved air to obtain an aqueous monomer solution.
The obtained monomer aqueous solution was continuously fed at a rate of 6.5 ml / min from the monomer supply pipe of the above polymerization reactor into a cyclohexane solution being stirred in the polymerization reactor (stirring speed was 500 rpm) for about 1 hour. The polymerization was carried out under reflux of cyclohexane.
Next, 160 parts of water was extracted by azeotropic dehydration, and then the hydrogel polymer was taken out and further dried at 120 ° C. for 2 hours to obtain a dried crosslinked polyacrylic acid sodium salt.
The dried crosslinked polyacrylic acid sodium salt is classified by a sieve having an aperture of 63 μm and a sieve having a mesh size of 53 μm (JIS Z8801-1: 2000) to obtain particles having a particle size of 53 to 63 μm {crosslinked polyacrylate sodium salt particles}. It was.
Next, 7.5 parts of a methanol / ion-exchanged water (volume ratio 70/30) solution containing 2% ethylene glycol diglycidyl ether as a solution concentration was added to the obtained particles and mixed uniformly. Subsequently, the methanol was air-dried and then put into a sealed container and kept at 80 ° C. for 1 hour to perform surface crosslinking. Then, it was made to dry at 120 degreeC for 30 minute (s) in a normal wind dryer, and crosslinked polyacrylate particle | grains (A1) were obtained.
<人工ポリペプチド(P1)の準備>
特表平3−502935号公報中の実施例記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列の13個と(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)9配列(21)の12個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約11万のペプチド「プロネクチンF」を製造し、人工ポリペプチド(P1)とした。
<Preparation of artificial polypeptide (P1)>
According to the method described in the examples in JP-T-3-502935, it has 13 Arg Gly Asp sequences and 12 (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 9 sequences (21), which are alternately A peptide “pronectin F” having a structure of chemically bonding to about 110,000 Mw was produced and used as an artificial polypeptide (P1).
<細胞培養用担体(C1)の調製>
架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の1gに、塩化ナトリウムを0.85%で含有する0.02M,pH7.2のリン酸緩衝液(以下、PBS)の50mLを加え、30分間放置して、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)を膨潤させた後、アスピレーターで余分なPBSを吸引除去した。水溶性カルボジイミド(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド ハイドロクロライド、(株)同仁化学研究所製)を60mMの濃度で含むPBS溶液の40mLを加え、ポリフッ化エチレン樹脂製攪拌羽で攪拌し、2時間反応させた。反応溶液を吸引除去した後、PBSの40mLを添加、吸引除去する洗浄操作を5回行った。
次に、人工ポリペプチド(P1)を600μg/mLの濃度で含むPBS溶液の40mLを加え、ポリフッ化エチレン樹脂製攪拌羽で攪拌し、2時間反応させた。反応溶液を吸引除去した後、PBSの40mLを添加、吸引除去する洗浄操作を5回行い、さらにイオン交換水の40mLを添加、吸引除去する洗浄操作を2回行った。
最後に、減圧乾燥機の中に入れ、120℃、0.1kPa以下の条件での乾燥を4時間行い、本発明の細胞培養用担体(C1)を得た。この担体(C1)の保水量は13g/gであった。また、この担体(C1)には、2mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。なお、人工ポリペプチドの含有量は、Biuret法により作成した検量線を用いて、免疫学的測定法によって測定した。ただし、含有量が500μg以下となることが予測される場合、Kjeldahl法により作成した検量線を用いた{以下、同様である。}。
<Preparation of cell culture carrier (C1)>
To 1 g of the cross-linked polyacrylate particles (A1), 50 mL of 0.02M, pH 7.2 phosphate buffer (hereinafter referred to as PBS) containing 0.85% sodium chloride was added and left for 30 minutes. After the crosslinked polyacrylate particles (A1) were swollen, excess PBS was removed by suction with an aspirator. 40 mL of a PBS solution containing water-soluble carbodiimide (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, manufactured by Dojindo Laboratories Co., Ltd.) at a concentration of 60 mM is added, and a stirring blade made of polyfluorinated ethylene resin And stirred for 2 hours. After the reaction solution was removed by suction, 40 mL of PBS was added, and the washing operation for removing by suction was performed 5 times.
Next, 40 mL of a PBS solution containing the artificial polypeptide (P1) at a concentration of 600 μg / mL was added, and the mixture was stirred with a polyfluoroethylene resin stirring blade and allowed to react for 2 hours. After removing the reaction solution by suction, 40 ml of PBS was added and washed by suction 5 times. Further, 40 mL of ion exchange water was added and washed by suction and removed twice.
Finally, it was put in a vacuum dryer and dried under the conditions of 120 ° C. and 0.1 kPa or less for 4 hours to obtain the cell culture carrier (C1) of the present invention. This carrier (C1) had a water retention amount of 13 g / g. Further, this carrier (C1) contained 2 mg / g of the artificial polypeptide (P1). The content of the artificial polypeptide was measured by an immunological measurement method using a calibration curve prepared by the Biuret method. However, when the content is predicted to be 500 μg or less, a calibration curve created by the Kjeldahl method was used {the same applies hereinafter. }.
<実施例2>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から1.81部に変更すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A2)及び細胞培養用担体(C2)を得た。この担体(C2)の保水量は18g/gであった。また、この担体(C2)には、4mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 2>
The crosslinked polyacrylate particles ( A2) and a cell culture carrier (C2) were obtained. This carrier (C2) had a water retention amount of 18 g / g. Further, this carrier (C2) contained 4 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<実施例3>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C3)を得た。この担体(C3)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C3)には、5mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 3>
In the same manner as in Example 1 except that “the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used during polymerization is changed from 4.52 parts to 0.90 parts”, crosslinked polyacrylate particles ( A3) and a cell culture carrier (C3) were obtained. The carrier (C3) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C3) contained 5 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<実施例4>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.09部に変更すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A4)及び細胞培養用担体(C4)を得た。この担体(C4)の保水量は23g/gであった。また、この担体(C4)には、6mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 4>
In the same manner as in Example 1 except that “the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used during polymerization is changed from 4.52 parts to 0.09 parts”, crosslinked polyacrylate particles ( A4) and a cell culture carrier (C4) were obtained. This carrier (C4) had a water retention amount of 23 g / g. Further, this carrier (C4) contained 6 mg / g of artificial polypeptide (P1).
<実施例5>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P2){特表平3−502935号公報中の実施例記載の方法に準じて製造した、Arg Gly Asp配列(x1)の5個と(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3配列(20)(y2)の5個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約2万のポリペプチド(「プロネクチンF2」)}を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C5)を得た。この担体(C5)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C5)には、2mg/gの人工ポリペプチド(P2)が含まれていた。
<Example 5>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P2) instead of artificial polypeptide (P1)” ) {5 Arg Gly Asp sequences (x1) and (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 3 sequences (20) (y2), produced according to the method described in the examples in JP-T-3-502935 In the same manner as in Example 1, except that a polypeptide having a structure of Mw of about 20,000 (“pronectin F2”)} having a structure in which these are alternately chemically bonded to each other is used. Acrylate particles (A3) and a cell culture carrier (C5) were obtained. The carrier (C5) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C5) contained 2 mg / g of artificial polypeptide (P2).
<実施例6>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P3){特表平3−502935号公報中の実施例記載の方法に準じて製造した、Arg Gly Asp配列(x1)の3個と(Gly Val Pro Gly Val)2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3配列(38)(y3)の3個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約1万のポリペプチド(「プロネクチンF3」)}を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C6)を得た。この担体(C6)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C6)には、1mg/gの人工ポリペプチド(P3)が含まれていた。
<Example 6>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P3) instead of artificial polypeptide (P1)” {Three Arg Gly Asp sequences (x1) and (Gly Val Pro Gly Val) 2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 3 sequence (38) (y3) and having a structure in which these are alternately chemically bonded to each other and having a Mw of about 10,000 (“pronectin F3”)} ”, In the same manner as in Example 1, crosslinked polyacrylate particles (A3) and a cell culture carrier (C6) were obtained. The carrier (C6) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C6) contained 1 mg / g of artificial polypeptide (P3).
<実施例7>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P4){Arg Gly Asp配列(x1)を有するMw490のポリペプチド;Gly Arg Gly Asp Ser配列(63)、株式会社ペプチド研究所製}を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C7)を得た。この担体(C7)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C7)には、0.1mg/gの人工ポリペプチド(P4)が含まれていた。
<Example 7>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P4) instead of artificial polypeptide (P1)” ) {Use Mw490 polypeptide having Arg Gly Asp sequence (x1); Gly Arg Gly Asp Ser sequence (63), manufactured by Peptide Laboratories, Inc.} in the same manner as in Example 1 except that the cross-linked poly Acrylate particles (A3) and a cell culture carrier (C7) were obtained. The water retention amount of this carrier (C7) was 21 g / g. Further, this carrier (C7) contained 0.1 mg / g of artificial polypeptide (P4).
<実施例8>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」以外、実施例1に記載の方法と同様にして粒子(架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩粒子)を得た。この粒子を表面架橋処理せずこのまま、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A5)とした。また、「細胞培養用担体の調製において、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の代わりに架橋ポリアクリル酸塩粒子(A5)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、細胞培養用担体(C8)を得た。この担体(C8)の保水量は22g/gであった。また、この担体(C8)には、5mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 8>
Particles (crosslinked poly- acrylate) were produced in the same manner as in Example 1 except that the amount of the ethylene glycol diglycidyl ether used as the crosslinkable monomer during polymerization was changed from 4.52 parts to 0.90 parts. Acrylic acid sodium salt particles) were obtained. The particles were not subjected to surface cross-linking treatment and were used as cross-linked polyacrylate particles (A5). Further, in the same manner as in Example 1, except for using “crosslinked polyacrylate particles (A5) instead of crosslinked polyacrylate particles (A1) in the preparation of cell culture carrier”, A carrier (C8) was obtained. The water retention amount of this carrier (C8) was 22 g / g. Further, this carrier (C8) contained 5 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<実施例9>
<人工ポリペプチド(P5)の準備>
(1)人工ポリペプチド(P5A)の調製
「ペプチド合成の基礎と実験」第114〜117貢(昭和60年1月20日、丸善株式会社発行)等に記載されているDCC法に準じて、人工ポリペプチド(P4)同士で反応させた架橋ポリペプチドを約5%の濃度で含む溶液を作製した。この溶液の10mLを、0.45μmのメンブレンフィルターでろ過した後、ゲルろ過カラム(商品名:Superdex30pg、アマシャムバイオサイエンス(株)製)を用いて、濾液を分画した後、Mw約1000の分画をえた{流速:1mL/分、溶出液:PBS、予め同じ条件でゲルろ過した分子量マーカーの溶出時間を指標に、Mw約1000の分画を分取した。}。このMw約1000の分画を、イオン交換水中で透析して脱塩した後、−20℃、0.1kPa以下の条件で、凍結乾燥を24時間行い、人工ポリペプチド(P5A){Gly Arg Gly Asp Ser配列(63)を約2個有する。}を得た。
(2)人工ポリペプチド(P5C)の調製
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P5A)同士で反応させること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約22000の分画を分取すること」以外、人工ポリペプチド(P5A)の調製と同様にして、人工ポリペプチド(P5B){Gly Arg Gly Asp Ser配列(63)を約4個有する。}を得た。
ついで、「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P5B)同士で反応させること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約4000の分画を分取すること」以外、人工ポリペプチド(P5A)の調製と同様にして、人工ポリペプチド(P5C){Gly Arg Gly Asp Ser配列(63)を約8個有する。}を得た。
(3)人工ポリペプチド(P5)の調製
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P5A)と人工ポリペプチド(P5C)とをモル比1:1で反応させること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約5000の分画を分取すること」以外、人工ポリペプチド(P5A)の調製と同様にして、人工ポリペプチド(P5){Gly Arg Gly Asp Ser配列(63)を約10個有する。}を得た。
<細胞培養用担体(C9)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P5)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C9)を得た。この担体(C9)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C9)には、0.5mg/gの人工ポリペプチド(P5)が含まれていた。
<Example 9>
<Preparation of artificial polypeptide (P5)>
(1) Preparation of artificial polypeptide (P5A) According to the DCC method described in “Basics and Experiments of Peptide Synthesis” Nos. 114 to 117 (issued on January 20, 1985, published by Maruzen Co., Ltd.) A solution containing a cross-linked polypeptide reacted with the artificial polypeptide (P4) at a concentration of about 5% was prepared. After 10 mL of this solution was filtered with a 0.45 μm membrane filter, the filtrate was fractionated using a gel filtration column (trade name: Superdex 30 pg, manufactured by Amersham Biosciences Co., Ltd.). Fractions were obtained {flow rate: 1 mL / min, eluent: PBS, fractions with an Mw of about 1000 were collected using the elution time of molecular weight markers previously gel-filtered under the same conditions as an index. }. This fraction with a Mw of about 1000 was desalted by dialysis in ion-exchanged water, and then freeze-dried under the conditions of −20 ° C. and 0.1 kPa or less for 24 hours to produce artificial polypeptide (P5A) {Gly Arg Gly It has about 2 Asp Ser sequences (63). }.
(2) Preparation of artificial polypeptide (P5C) “Instead of reacting with artificial polypeptides (P4), react with artificial polypeptides (P5A)” and “Mw instead of fraction of about 1000 Mw It has about 4 artificial polypeptides (P5B) {Gly Arg Gly Asp Ser sequence (63) in the same manner as the preparation of artificial polypeptide (P5A) except that "fraction of about 22000 fractions". }.
Next, “react with artificial polypeptides (P5B) instead of reacting with artificial polypeptides (P4)” and “fraction with a fraction of Mw of about 4000 instead of a fraction of Mw of about 1,000. Except that, it has about 8 artificial polypeptides (P5C) {Gly Arg Gly Asp Ser sequences (63) in the same manner as in the preparation of the artificial polypeptide (P5A). }.
(3) Preparation of artificial polypeptide (P5) “Instead of reacting artificial polypeptides (P4) with each other, artificial polypeptide (P5A) and artificial polypeptide (P5C) are reacted at a molar ratio of 1: 1” And “manufacturing the artificial polypeptide (P5A) {Gly Arg Gly Asp” in the same manner as the preparation of the artificial polypeptide (P5A) except that a fraction having an Mw of about 5000 is collected instead of a fraction having an Mw of about 1000. It has about 10 Ser sequences (63). }.
<Preparation of cell culture carrier (C9)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether from 4.52 parts to 0.90 parts during polymerization” and “artificial polypeptide (P5) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C9) were obtained in the same manner as in Example 1 except that “. The water retention amount of this carrier (C9) was 21 g / g. Further, this carrier (C9) contained 0.5 mg / g of the artificial polypeptide (P5).
<実施例10>
<人工ポリペプチド(P6)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P5)同士で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名:Superdex30pgを使用する代わりに、商品名Superdex75pgを使用すること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約10000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P6){Gly Arg Gly Asp Ser配列(63)を約20個有する。}を得た。
<細胞培養用担体(C10)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P6)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C10)を得た。この担体(C10)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C10)には、2mg/gの人工ポリペプチド(P6)が含まれていた。
<Example 10>
<Preparation of artificial polypeptide (P6)>
“Instead of reacting with artificial polypeptides (P4), instead of reacting with artificial polypeptides (P5)”, “Instead of using Superdex 30 pg as the gel filtration column, use Superdex 75 pg as the product name. ”And“ artificial polypeptide (P6) {Gly Arg Gly Asp Ser ”in the same manner as in Example 9 (1) except that a fraction having an Mw of about 10,000 is collected instead of a fraction having an Mw of about 1,000. It has about 20 sequences (63). }.
<Preparation of cell culture carrier (C10)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether from 4.52 parts to 0.90 parts during polymerization” and “artificial polypeptide (P6) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C10) were obtained in the same manner as in Example 1 except that “. The carrier (C10) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C10) contained 2 mg / g of the artificial polypeptide (P6).
<実施例11>
<人工ポリペプチド(P7)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P5)と人工ポリペプチド(P6)とをモル比1:1で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名Superdex30pgを使用する代わりに、商品名Superdex75pgを使用すること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約15000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P7){Gly Arg Gly Asp Ser配列(63)を約30個有する。}を得た。
<細胞培養用担体(C11)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P7)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C11)を得た。この担体(C11)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C11)には、2mg/gの人工ポリペプチド(P7)が含まれていた。
<Example 11>
<Preparation of artificial polypeptide (P7)>
“Instead of reacting the artificial polypeptide (P4) with each other, the artificial polypeptide (P5) and the artificial polypeptide (P6) are reacted at a molar ratio of 1: 1”, “As a gel filtration column, the trade name Superdex30pg is used. Instead of using the product name Superdex 75 pg "and" Separating a fraction with an Mw of about 15000 instead of a fraction with an Mw of about 1000 "in the same manner as in Example 9 (1), Artificial polypeptide (P7) {has about 30 Gly Arg Gly Asp Ser sequences (63) }.
<Preparation of cell culture carrier (C11)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P7) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C11) were obtained in the same manner as in Example 1 except that “. The water retention amount of this carrier (C11) was 21 g / g. Further, this carrier (C11) contained 2 mg / g of the artificial polypeptide (P7).
<実施例12>
<人工ポリペプチド(P8)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P6)同士で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名Superdex30pgを使用する代わりに、商品名Superdex75pgを使用すること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約20000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P8){Gly Arg Gly Asp Ser配列(63)を約40個有する。}を得た。
<細胞培養用担体(C12)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P8)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C12)を得た。この担体(C12)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C12)には、3mg/gの人工ポリペプチド(P8)が含まれていた。
<Example 12>
<Preparation of artificial polypeptide (P8)>
“Instead of reacting with artificial polypeptide (P4), instead of reacting with artificial polypeptide (P6)”, “Instead of using Superdex 30 pg as the gel filtration column, use Superdex 75 pg as the commercial name” And “artificial polypeptide (P8) {Gly Arg Gly Asp Ser sequence” in the same manner as in Example 9 (1) except that a fraction having an Mw of about 20000 is collected instead of a fraction having an Mw of about 1000. There are about 40 (63). }.
<Preparation of cell culture carrier (C12)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether from 4.52 parts to 0.90 parts during polymerization” and “artificial polypeptide (P8) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C12) were obtained in the same manner as in Example 1 except that “ This carrier (C12) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C12) contained 3 mg / g of the artificial polypeptide (P8).
<実施例13>
<人工ポリペプチド(P9)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P4)とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)からなるポリペプチドとをモル比1:1で反応させること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P9){Gly Arg Gly Asp Ser配列(63)の約1個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)の約1個とを有する。}を得た。
<細胞培養用担体(C13)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P9)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C13)を得た。この担体(C13)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C13)には、0.2mg/gの人工ポリペプチド(P9)が含まれていた。
<Example 13>
<Preparation of artificial polypeptide (P9)>
Implementation other than “reacting artificial polypeptide (P4) and polypeptide comprising Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequence (64) at a molar ratio of 1: 1 instead of reacting with artificial polypeptide (P4)” In the same manner as in Example 9 (1), the artificial polypeptide (P9) {has about 1 Gly Arg Gly Asp Ser sequence (63) and about 1 Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequence (64). }.
<Preparation of cell culture carrier (C13)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether from 4.52 parts to 0.90 parts during polymerization” and “artificial polypeptide (P9) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C13) were obtained in the same manner as in Example 1 except that “. This carrier (C13) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C13) contained 0.2 mg / g of the artificial polypeptide (P9).
<実施例14>
<人工ポリペプチド(P10)の準備>
(1)人工ポリペプチド(P10A)の調製
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)同士で反応させること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P10A){Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)を約2個有する。}を得た。
(2)人工ポリペプチド(P10D)の調製
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P10A)同士で反応させること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約2000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P10B){Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)を約4個有する。}を得た。
ついで、「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P10B)同士で反応させること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約3000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P10C){Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)を約8個有する。}を得た。
ついで、「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P10A)と人工ポリペプチド(P10C)とをモル比1:1で反応させること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約4000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P10D){Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)を約10個有する。}を得た。
(3)人工ポリペプチド(P10)の調製
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P4)と人工ポリペプチド(P10D)とをモル比1:1で反応させること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約5000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P10){Gly Arg Gly Asp Ser配列(63)の約1個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)の約10個とを有する。}を得た。
<細胞培養用担体(C14)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P10)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C14)を得た。この担体(C14)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C14)には、0.3mg/gの人工ポリペプチド(P10)が含まれていた。
<Example 14>
<Preparation of artificial polypeptide (P10)>
(1) Preparation of Artificial Polypeptide (P10A) Example 9 (1) except for “reacting with Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequences (64) instead of reacting with artificial polypeptides (P4)” Similarly, it has about 2 artificial polypeptides (P10A) {Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequence (64). }.
(2) Preparation of artificial polypeptide (P10D) “Instead of reacting with artificial polypeptides (P4), react with artificial polypeptides (P10A)” and “Mw instead of fraction of about 1000 Mw It has about 4 artificial polypeptides (P10B) {Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequences (64) in the same manner as in Example 9 (1) except that about 2000 fractions are collected. }.
Next, “react with artificial polypeptides (P10B) instead of reacting with artificial polypeptides (P4)” and “fraction with a fraction of Mw of about 3000 instead of a fraction of about 1000 Mw. Except that, it has about 8 artificial polypeptides (P10C) {Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequences (64) in the same manner as in Example 9 (1). }.
Next, instead of reacting the artificial polypeptide (P4) with each other, the artificial polypeptide (P10A) and the artificial polypeptide (P10C) are reacted at a molar ratio of 1: 1. Instead of fractionating a fraction with a Mw of about 4000 ”, the artificial polypeptide (P10D) {having about 10 Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequences (64) in the same manner as in Example 9 (1) . }.
(3) Preparation of artificial polypeptide (P10) “Instead of reacting artificial polypeptides (P4) with each other, artificial polypeptide (P4) and artificial polypeptide (P10D) are reacted at a molar ratio of 1: 1” And the artificial polypeptide (P10) {Gly Arg Gly Asp Ser sequence in the same manner as in Example 9 (1) except that a fraction with an Mw of about 5000 is taken instead of a fraction with an Mw of about 1000. About 63 of (63) and about 10 of Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequence (64). }.
<Preparation of cell culture carrier (C14)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P10) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C14) were obtained in the same manner as in Example 1 except that “. This carrier (C14) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C14) contained 0.3 mg / g of the artificial polypeptide (P10).
<実施例15>
<人工ポリペプチド(P11)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P10D)同士で反応させること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約8000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P11A){Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)を約20個有する。}を得た。
ついで、「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P4)と人工ポリペプチド(P11A)とをモル比1:1で反応させること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約9000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P11){Gly Arg Gly Asp Ser配列(63)の約1個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)の約20個とを有する。}を得た。
<細胞培養用担体(C15)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P11)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C15)を得た。この担体(C15)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C15)には、1mg/gの人工ポリペプチド(P11)が含まれていた。
<Example 15>
<Preparation of artificial polypeptide (P11)>
“Instead of reacting between artificial polypeptides (P4), instead of reacting with artificial polypeptides (P10D)” and “Fractionation of about 8000 Mw instead of fractionation of about 1000 Mw” Except for the above, in the same manner as in Example 9 (1), about 20 artificial polypeptides (P11A) {Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequences (64) are included. }.
Next, “instead of reacting the artificial polypeptide (P4) with each other, the artificial polypeptide (P4) and the artificial polypeptide (P11A) are reacted in a molar ratio of 1: 1” and “the fraction of about 1000 Mw. Instead of fractionating a fraction with an Mw of about 9000 ”, except for the artificial polypeptide (P11) {Gly Arg Gly Asp Ser sequence (63) and Gly, as in Example 9 (1) Ala Gly about 20 of Ala Gly Ser sequences (64). }.
<Preparation of cell culture carrier (C15)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P11) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C15) were obtained in the same manner as in Example 1 except that “. The water retention amount of this carrier (C15) was 21 g / g. Further, this carrier (C15) contained 1 mg / g of artificial polypeptide (P11).
<実施例16>
<人工ポリペプチド(P12)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P10D)と人工ポリペプチド(P11A)とをモル比1:1で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名Superdex30pgを使用する代わりに、商品名Superdex75pgを使用すること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約13000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P12A){Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)を約30個有する。}を得た。
ついで、「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P4)と人工ポリペプチド(P12A)とをモル比1:1で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名Superdex30pgを使用する代わりに、商品名Superdex75pgを使用すること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約13000の分画を分取すること」以外は、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P12){Gly Arg Gly Asp Ser配列(63)の約1個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)の約30個とを有する。}を得た。
<細胞培養用担体(C16)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P12)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C16)を得た。この担体(C16)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C16)には、2mg/gの人工ポリペプチド(P12)が含まれていた。
<Example 16>
<Preparation of artificial polypeptide (P12)>
“Instead of reacting the artificial polypeptide (P4) with each other, react the artificial polypeptide (P10D) and the artificial polypeptide (P11A) at a molar ratio of 1: 1”, “As a gel filtration column, trade name Superdex 30pg Instead of using the product name Superdex 75 pg "and" Separating a fraction with an Mw of about 13000 instead of a fraction with an Mw of about 1000 ", in the same manner as in Example 9 (1), Artificial polypeptide (P12A) {has about 30 Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequences (64). }.
Next, “reacting artificial polypeptide (P4) and artificial polypeptide (P12A) in a molar ratio of 1: 1 instead of reacting them with artificial polypeptide (P4)”, “ Similar to Example 9 (1), except that instead of using Superdex 30 pg, the product name Superdex 75 pg is used ”and“ Fractionation of about 13,000 Mw instead of fractionation of about 1000 Mw ”. And about 1 of the artificial polypeptide (P12) {Gly Arg Gly Asp Ser sequence (63) and about 30 of the Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequence (64). }.
<Preparation of cell culture carrier (C16)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether from 4.52 parts to 0.90 parts during polymerization” and “artificial polypeptide (P12) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C16) were obtained in the same manner as in Example 1 except that “. The water retention amount of this carrier (C16) was 21 g / g. Further, this carrier (C16) contained 2 mg / g of the artificial polypeptide (P12).
<実施例17>
<人工ポリペプチド(P13)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P11A)と人工ポリペプチド(P12A)とをモル比1:1で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名Superdex30pgを使用する代わりに、商品名Superdex75pgを使用すること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約21000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P13A){Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)を約50個有する。}を得た。
ついで、「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P4)と人工ポリペプチド(P13A)とをモル比1:1で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名Superdex30pgを使用する代わりに、商品名Superdex75pgを使用すること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約21000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P13){Gly Arg Gly Asp Ser配列(63)の約1個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)の約50個とを有する。}を得た。
<細胞培養用担体(C17)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P13)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C17)を得た。この担体(C17)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C17)には、2mg/gの人工ポリペプチド(P13)が含まれていた。
<Example 17>
<Preparation of artificial polypeptide (P13)>
“Instead of reacting the artificial polypeptide (P4) with each other, the artificial polypeptide (P11A) and the artificial polypeptide (P12A) are reacted at a molar ratio of 1: 1”, “As a gel filtration column, the trade name Superdex 30pg is used. Instead of using the product name Superdex 75 pg "and" Separating a fraction with an Mw of about 21000 instead of a fraction with an Mw of about 1000 "in the same manner as in Example 9 (1), Artificial polypeptide (P13A) {has about 50 Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequences (64). }.
Next, “reacting artificial polypeptide (P4) and artificial polypeptide (P13A) at a molar ratio of 1: 1 instead of reacting them with artificial polypeptide (P4)”, “ Instead of using Superdex 30 pg, use the product name Superdex 75 pg ”and“ separate fraction with Mw of about 21000 instead of fraction with Mw of about 1000 ”as in Example 9 (1). And about 1 of the artificial polypeptide (P13) {Gly Arg Gly Asp Ser sequence (63) and about 50 of the Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequence (64). }.
<Preparation of cell culture carrier (C17)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P13) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C17) were obtained in the same manner as in Example 1 except that “. This carrier (C17) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C17) contained 2 mg / g of artificial polypeptide (P13).
<実施例18>
<架橋ポリアクリル酸塩粒子(A6)の準備>
アクリル酸ナトリウム88部、アクリル酸22.85部、N,N’−メチレンビスアクリルアミド0.2部及び脱イオン水293、ジクロロトリス(トリフェニルフォスフィン)ルテニウム0.001部を攪拌・混合しながら、1〜2℃に保った。そして、この混合液中に窒素を流入して、混合液中の溶存酸素濃量を0.5ppm以下とした。
引き続き、この混合液に、1%過酸化水素水溶液0.3部、0.2%アスコルビン酸水溶液0.8部及び2%の2,2’−アゾビスアミジノプロパンジハイドロクロライド水溶液0.8部を添加・混合して重合を開始させた。そして、反応液が80℃に達した後、重合温度80±2℃で約5時間重合することにより、含水樹脂(ゲル)を得た。
この含水樹脂(ゲル)400部をミンチ機(目皿穴径:6mm、飯塚工業社製 12VR−400K)にて25℃で5分間細断した後、通気型バンド乾燥機(135℃、2.0m/秒;井上金属工業(株)製)で乾燥し、乾燥重合体を得た。
この乾燥重合体をジューサーミキサー(National MX−X53、松下電器(株)製)で粉砕し、目開きが63μmのふるい及び53μmのふるい(JIS Z8801−1:2000)により分級して、粒子径53〜63μmの粒子{架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩粒子}を得た。この100部を高速攪拌(細川ミクロン製 高速攪拌タービュライザーミキサー:回転数2000rpm)しながらエチレングリコールジグリシジルエーテルの1%水/メタノール混合溶液(水/メタノールの重量比=60/40)の1部をスプレー噴霧しながら添加・混合し、140℃で30分間静置し加熱架橋(表面架橋)することにより架橋ポリアクリル酸塩粒子(A6)を得た。
<細胞培養用担体(C18)の調製>
「架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の代わりに架橋ポリアクリル酸塩粒子(A6)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、細胞培養用担体(C18)を得た。この担体(C18)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C18)には、10mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 18>
<Preparation of crosslinked polyacrylate particles (A6)>
While stirring and mixing 88 parts of sodium acrylate, 22.85 parts of acrylic acid, 0.2 part of N, N′-methylenebisacrylamide, 293 deionized water, and 0.001 part of dichlorotris (triphenylphosphine) ruthenium , Kept at 1-2 ° C. And nitrogen was flowed into this liquid mixture, and the dissolved oxygen concentration in a liquid mixture was 0.5 ppm or less.
Subsequently, 0.3 part of 1% aqueous hydrogen peroxide solution, 0.8 part of 0.2% aqueous ascorbic acid solution and 0.8 part of 2% 2,2′-azobisamidinopropane dihydrochloride aqueous solution were added to this mixture. Was added and mixed to initiate polymerization. And after the reaction liquid reached 80 degreeC, the hydrous resin (gel) was obtained by superposing | polymerizing at the superposition | polymerization temperature of 80 +/- 2 degreeC for about 5 hours.
400 parts of this water-containing resin (gel) was shredded for 5 minutes at 25 ° C. with a mincing machine (diameter hole diameter: 6 mm, 12VR-400K manufactured by Iizuka Kogyo Co., Ltd.), and then a ventilated band dryer (135 ° C., 2. 0 m / sec; manufactured by Inoue Metal Industry Co., Ltd.) to obtain a dry polymer.
The dried polymer was pulverized with a juicer mixer (National MX-X53, manufactured by Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.), classified with a sieve having an opening of 63 μm and a sieve having a size of 53 μm (JIS Z8801-1: 2000), and a particle size of 53 ˜63 μm particles {cross-linked polyacrylic acid sodium salt particles} were obtained. 1 part of 1% water / methanol mixed solution of ethylene glycol diglycidyl ether (weight ratio of water / methanol = 60/40) while 100 parts of this was stirred at high speed (high speed stirring turbulizer mixer: Hosokawa Micron: 2,000 rpm). The parts were added and mixed while spraying, and left at 140 ° C. for 30 minutes, followed by heat crosslinking (surface crosslinking) to obtain crosslinked polyacrylate particles (A6).
<Preparation of cell culture carrier (C18)>
A cell culture carrier (C18) was obtained in the same manner as in Example 1 except that “crosslinked polyacrylate particles (A6) were used instead of crosslinked polyacrylate particles (A1)”. The water retention amount of this carrier (C18) was 21 g / g. Further, this carrier (C18) contained 10 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<実施例19>
「28%水酸化ナトリウム水溶液の使用量を207部から110部に変更すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A7)及び細胞培養用担体(C19)を得た。この担体(C19)の保水量は4g/gであった。また、この担体(C19)には、0.1mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 19>
A crosslinked polyacrylate particle (A7) and a cell culture carrier (C19) are obtained in the same manner as in Example 1 except that the amount of 28% sodium hydroxide aqueous solution is changed from 207 parts to 110 parts. It was. This carrier (C19) had a water retention amount of 4 g / g. Further, this carrier (C19) contained 0.1 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<実施例20>
「架橋性単量体{エチレングリコールジグリシジルエーテル}の使用量を4.52部から6.91部に変更すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A8)及び細胞培養用担体(C20)を得た。この担体(C20)の保水量は7g/gであった。また、この担体(C20)には、0.5mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 20>
Crosslinked polyacrylate particles (A8) in the same manner as in Example 1 except that the amount of the crosslinkable monomer {ethylene glycol diglycidyl ether} is changed from 4.52 parts to 6.91 parts. And a cell culture carrier (C20) was obtained. The water retention amount of this carrier (C20) was 7 g / g. Further, this carrier (C20) contained 0.5 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<実施例21>
「架橋性単量体{エチレングリコールジグリシジルエーテル}の使用量を4.52部から0.0166部に変更すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A9)及び細胞培養用担体(C21)を得た。この担体(C21)の保水量は28g/gであった。また、この担体(C21)には、8mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 21>
Crosslinked polyacrylate particles (A9) in the same manner as in Example 1 except that “the amount of the crosslinkable monomer {ethylene glycol diglycidyl ether} is changed from 4.52 parts to 0.0166 parts”. And a cell culture carrier (C21) was obtained. This carrier (C21) had a water retention amount of 28 g / g. Further, this carrier (C21) contained 8 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<実施例22>
「架橋性単量体{エチレングリコールジグリシジルエーテル}の使用量を4.52部から0.0111部に変更すること」及び「エチレングリコールジグリシジルエーテルを溶液濃度として2%含むメタノール/イオン交換水溶液の使用量を7.5から2.5に変更すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A10)及び細胞培養用担体(C22)を得た。この担体(C22)の保水量は39g/gであった。また、この担体(C22)には、10mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 22>
"Changing the amount of crosslinkable monomer {ethylene glycol diglycidyl ether} from 4.52 parts to 0.0111 parts" and "Methanol / ion exchange aqueous solution containing 2% ethylene glycol diglycidyl ether as a solution concentration" The crosslinked polyacrylate particles (A10) and the carrier for cell culture (C22) were obtained in the same manner as in Example 1 except that the amount used was changed from 7.5 to 2.5. This carrier (C22) had a water retention amount of 39 g / g. Further, this carrier (C22) contained 10 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<実施例23>
<架橋ポリアクリル酸塩粒子(A11)の準備>
「架橋性単量体{エチレングリコールジグリシジルエーテル}の使用量を4.52部から0.0111部に変更すること」及び「表面架橋しなかったこと{エチレングリコールジグリシジルエーテルを溶液濃度として2%含むメタノール/イオン交換水溶液を添加せず、80℃で1時間保持しなかったこと}」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A11)を得た。
<細胞培養用担体(C23)の調製>
「架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の代わりに架橋ポリアクリル酸塩粒子(A11)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、細胞培養用担体(C23)を得た。この担体(C23)の保水量は48g/gであった。また、この担体(C23)には、12mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 23>
<Preparation of crosslinked polyacrylate particles (A11)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer {ethylene glycol diglycidyl ether} from 4.52 parts to 0.0111 parts” and “no surface crosslinking {2 with ethylene glycol diglycidyl ether as a solution concentration %, Methanol / ion exchange aqueous solution was not added, and the mixture was not kept at 80 ° C. for 1 hour} ”to obtain crosslinked polyacrylate particles (A11) in the same manner as in Example 1.
<Preparation of cell culture carrier (C23)>
A cell culture carrier (C23) was obtained in the same manner as in Example 1 except that “crosslinked polyacrylate particles (A11) were used instead of crosslinked polyacrylate particles (A1)”. This carrier (C23) had a water retention amount of 48 g / g. Further, this carrier (C23) contained 12 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<実施例24>
「80%アクリル酸水溶液173部の代わりに80%メタクリル酸水溶液207部を使用すること」以外、実施例18と同様にして、架橋ポリメタクリル酸塩粒子(A12)及び細胞培養用担体(C24)を得た。この担体(C24)の保水量は20g/gであった。また、この担体(C24)には、4mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 24>
Crosslinked polymethacrylate particles (A12) and cell culture carrier (C24) in the same manner as in Example 18 except that “207 parts of 80% aqueous methacrylic acid solution is used instead of 173 parts of 80% aqueous acrylic acid solution”. Got. The carrier (C24) had a water retention amount of 20 g / g. Further, this carrier (C24) contained 4 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<実施例25>
「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14){特表平3−502935号公報中の実施例記載の方法に準じて製造した、Ile Lys Val Ala Val配列(7)(x2)の13個と(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)9配列(21)(y1)の12個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約11万のポリペプチド(「プロネクチンL」)}を使用すること」以外、実施例1と同様にして、細胞培養用担体(C25)を調製した。この担体(C25)の保水量は13g/gであった。また、この担体(C25)には、1mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Example 25>
“Instead of artificial polypeptide (P1), artificial polypeptide (P14) {Ile Lys Val Ala Val sequence (7) (x2 produced according to the method described in Examples in JP-T-3-502935) ) And 12 (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 9 sequences (21) (y1), and having a structure in which these are alternately chemically bound, a polypeptide having a structure of about 110,000 Mw (“pronectin A cell culture carrier (C25) was prepared in the same manner as in Example 1 except that L ")}" was used. The water retention amount of this carrier (C25) was 13 g / g. Further, this carrier (C25) contained 1 mg / g of artificial polypeptide (P14).
<実施例26>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から1.81部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A2)及び細胞培養用担体(C26)を調製した。この担体(C26)の保水量は18g/gであった。また、この担体(C26)には、3mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Example 26>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 1.81 parts” and “artificial polypeptide (P14) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A2) and the cell culture carrier (C26) were prepared in the same manner as in Example 1 except that “. The water retention amount of this carrier (C26) was 18 g / g. Further, this carrier (C26) contained 3 mg / g of the artificial polypeptide (P14).
<実施例27>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C27)を調製した。この担体(C27)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C27)には、5mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Example 27>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether from 4.52 parts to 0.90 parts during polymerization” and “artificial polypeptide (P14) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C27) were prepared in the same manner as in Example 1 except that “ The water retention amount of this carrier (C27) was 21 g / g. Further, this carrier (C27) contained 5 mg / g of artificial polypeptide (P14).
<実施例28>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.09部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A4)及び細胞培養用担体(C28)を調製した。この担体(C28)の保水量は23g/gであった。また、この担体(C28)には、5mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Example 28>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.09 parts” and “artificial polypeptide (P14) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A4) and the cell culture carrier (C28) were prepared in the same manner as in Example 1 except that “. The water retention amount of this carrier (C28) was 23 g / g. Further, this carrier (C28) contained 5 mg / g of artificial polypeptide (P14).
<実施例29>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P15){特表平3−502935号公報中の実施例記載の方法に準じて製造した、Ile Lys Val Ala Val配列(7)(x2)の5個と(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)9配列(21)(y1)の5個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約2万のポリペプチド(「プロネクチンL2」)}を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C29)を調製した。この担体(C29)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C29)には、1mg/gの人工ポリペプチド(P15)が含まれていた。
<Example 29>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P15) instead of artificial polypeptide (P1)” ) {5 Ile Lys Val Ala Val sequences (7) (x2) and 9 (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 9 sequences (produced according to the method described in the examples in JP-T-3-502935) 21) Use the polypeptide of (y1) having 5 and a polypeptide having an Mw of about 20,000 (“pronectin L2”)} having a structure in which these are alternately chemically bonded. Thus, crosslinked polyacrylate particles (A3) and a cell culture carrier (C29) were prepared. The water retention amount of this carrier (C29) was 21 g / g. Further, this carrier (C29) contained 1 mg / g of artificial polypeptide (P15).
<実施例30>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P16){特表平3−502935号公報中の実施例記載の方法に準じて製造した、Ile Lys Val Ala Val配列(7)(x2)の3個と(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)9配列(21)(y1)の3個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約1万のポリペプチド(「プロネクチンL3」)}を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C30)を調製した。この担体(C30)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C30)には、1mg/gの人工ポリペプチド(P16)が含まれていた。
<Example 30>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P16) instead of artificial polypeptide (P1)” ) {Three Ile Lys Val Ala Val sequences (7) (x2) and 9 (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 9 sequences (produced according to the method described in the Examples in JP-T-3-502935) 21) Use the same polypeptide as in Example 1 except that a polypeptide with a molecular weight of about 10,000 ("pronectin L3")} having a structure in which three of (y1) and these are alternately chemically bonded is used. Thus, crosslinked polyacrylate particles (A3) and cell culture carrier (C30) were prepared. The water retention amount of this carrier (C30) was 21 g / g. Further, this carrier (C30) contained 1 mg / g of artificial polypeptide (P16).
<実施例31>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P17){Ile Lys Val Ala Val配列(x2)を有するMw529のポリペプチド;Ile Lys Val Ala Val配列(7)、NEOSYSTEM社製}を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C31)を調製した。この担体(C31)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C31)には、0.1mg/gの人工ポリペプチド(P17)が含まれていた。
<Example 31>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether from 4.52 parts to 0.90 parts during polymerization” and “artificial polypeptide (P17) instead of artificial polypeptide (P1)” ) {Use the Mw529 polypeptide having the Ile Lys Val Ala Val sequence (x2); Ile Lys Val Ala Val sequence (7), manufactured by NEOSYSTEM} in the same manner as in Example 1 except that the crosslinked polyacrylic is used. Acid salt particles (A3) and a cell culture carrier (C31) were prepared. This carrier (C31) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C31) contained 0.1 mg / g of the artificial polypeptide (P17).
<実施例32>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A5)及び細胞培養用担体(C32)を調製した。この担体(C32)の保水量は22g/gであった。また、この担体(C32)には、6mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Example 32>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether from 4.52 parts to 0.90 parts during polymerization” and “artificial polypeptide (P14) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A5) and the cell culture carrier (C32) were prepared in the same manner as in Example 1 except that “. This carrier (C32) had a water retention amount of 22 g / g. Further, this carrier (C32) contained 6 mg / g of artificial polypeptide (P14).
<実施例33>
<人工ポリペプチド(P18)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)の代わりに、人工ポリペプチド(P17)を使用すること」以外、実施例9の「人工ポリペプチド(P5)の準備」と同様にして、人工ポリペプチド(P18){Ile Lys Val Ala Val配列(7)を約10個有するポリペプチド}を得た。
<細胞培養用担体(C33)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P18)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C33)を調製した。この担体(C33)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C33)には、0.3mg/gの人工ポリペプチド(P18)が含まれていた。
<Example 33>
<Preparation of artificial polypeptide (P18)>
In the same manner as in “Preparation of artificial polypeptide (P5)” in Example 9, except that “an artificial polypeptide (P17) is used instead of artificial polypeptide (P4)”, artificial polypeptide (P18) { A polypeptide having about 10 Ile Lys Val Ala Val sequences (7)} was obtained.
<Preparation of cell culture carrier (C33)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether from 4.52 parts to 0.90 parts during polymerization” and “artificial polypeptide (P18) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C33) were prepared in the same manner as in Example 1 except that “. This carrier (C33) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C33) contained 0.3 mg / g of an artificial polypeptide (P18).
<実施例34>
<人工ポリペプチド(P19)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)の代わりに、人工ポリペプチド(P18)を使用すること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名:Superdex30pgを使用する代わりに、商品名Superdex75pgを使用すること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約10000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P19){Ile Lys Val Ala Val配列(7)を約20個有する。}を得た。
<細胞培養用担体(C34)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P19)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C34)を調製した。この担体(C34)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C34)には、0.7mg/gの人工ポリペプチド(P19)が含まれていた。
<Example 34>
<Preparation of artificial polypeptide (P19)>
“Use artificial polypeptide (P18) instead of artificial polypeptide (P4)”, “Use the trade name Superdex 75 pg instead of using Superdex 30 pg as the gel filtration column” and “Mw Artificial polypeptide (P19) {Ile Lys Val Ala Val sequence (7) in the same manner as in Example 9 (1) except that a fraction having an Mw of about 10,000 is collected instead of about 1000. About 20 }.
<Preparation of cell culture carrier (C34)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P19) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C34) were prepared in the same manner as in Example 1 except that “. The water retention amount of this carrier (C34) was 21 g / g. Further, this carrier (C34) contained 0.7 mg / g of an artificial polypeptide (P19).
<実施例35>
<人工ポリペプチド(P20)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P18)と人工ポリペプチド(P19)とをモル比1:1で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名Superdex30pgを使用する代わりに、商品名Superdex75pgを使用すること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約15000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P20){Ile Lys Val Ala Val配列(7)を約30個有する。}を作製した。
<細胞培養用担体(C35)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P20)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C35)を調製した。この担体(C35)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C35)には、1mg/gの人工ポリペプチド(P20)が含まれていた。
<Example 35>
<Preparation of artificial polypeptide (P20)>
“Instead of reacting the artificial polypeptide (P4) with each other, the artificial polypeptide (P18) and the artificial polypeptide (P19) are reacted in a molar ratio of 1: 1”, “As a gel filtration column, the trade name Superdex 30pg is used. Instead of using the product name Superdex 75 pg "and" Separating a fraction with an Mw of about 15000 instead of a fraction with an Mw of about 1000 "in the same manner as in Example 9 (1), Artificial polypeptide (P20) {has about 30 Ile Lys Val Ala Val sequences (7) } Was produced.
<Preparation of cell culture carrier (C35)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether from 4.52 parts to 0.90 parts during polymerization” and “artificial polypeptide (P20) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C35) were prepared in the same manner as in Example 1 except that “. The water retention amount of this carrier (C35) was 21 g / g. Further, this carrier (C35) contained 1 mg / g of artificial polypeptide (P20).
<実施例36>
<人工ポリペプチド(P21)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P19)同士で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名Superdex30pgを使用する代わりに、商品名Superdex75pgを使用すること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約20000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P21){Ile Lys Val Ala Val配列(7)を約40個有する。}を作製した。
<細胞培養用担体(C36)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P21)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C36)を調製した。この担体(C36)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C36)には、2mg/gの人工ポリペプチド(P21)が含まれていた。
<Example 36>
<Preparation of artificial polypeptide (P21)>
“Instead of reacting between artificial polypeptides (P4) instead of reacting with artificial polypeptides (P19)”, “Instead of using Superdex 30 pg as the gel filtration column, use Superdex 75 pg as the trade name” And the artificial polypeptide (P21) {Ile Lys Val Ala Val sequence in the same manner as in Example 9 (1) except that a fraction with an Mw of about 20000 is collected instead of a fraction with an Mw of about 1000. There are about 40 (7). } Was produced.
<Preparation of cell culture carrier (C36)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P21) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C36) were prepared in the same manner as in Example 1 except that “. The water retention amount of this carrier (C36) was 21 g / g. Further, this carrier (C36) contained 2 mg / g of artificial polypeptide (P21).
<実施例37>
<人工ポリペプチド(P22)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P17)とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)からなるポリペプチドとをモル比1:1で反応させること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P22){Ile Lys Val Ala Val配列(7)の約1個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)の約1個とを有する。}を作製した。
<細胞培養用担体(C37)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P22)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C37)を調製した。この担体(C37)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C37)には、0.2mg/gの人工ポリペプチド(P22)が含まれていた。
<Example 37>
<Preparation of artificial polypeptide (P22)>
Other than "reacting artificial polypeptide (P17) and polypeptide consisting of Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequence (64) at a molar ratio of 1: 1 instead of reacting with artificial polypeptide (P4)" In the same manner as in Example 9 (1), the artificial polypeptide (P22) {has about 1 of the Ile Lys Val Ala Val sequence (7) and about 1 of the Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequence (64). } Was produced.
<Preparation of cell culture carrier (C37)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P22) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C37) were prepared in the same manner as in Example 1 except that “. This carrier (C37) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C37) contained 0.2 mg / g of an artificial polypeptide (P22).
<実施例38>
<人工ポリペプチド(P23)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P17)と人工ポリペプチド(P10D)とをモル比1:1で反応させること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約5000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P23){Ile Lys Val Ala Val配列(7)の約1個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)の約10個とを有する。}を作製した。
<細胞培養用担体(C38)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P23)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C38)を調製した。この担体(C38)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C38)には、0.5mg/gの人工ポリペプチド(P23)が含まれていた。
<Example 38>
<Preparation of artificial polypeptide (P23)>
“Instead of reacting the artificial polypeptides (P4) with each other, react the artificial polypeptide (P17) and the artificial polypeptide (P10D) at a molar ratio of 1: 1” and “instead of the fraction of about 1000 Mw” Except for fractionating a fraction of Mw of about 5000 ”, in the same manner as in Example 9 (1), an artificial polypeptide (P23) {about one of Ile Lys Val Ala Val sequence (7) and Gly Ala Gly About 10 of the Ala Gly Ser sequences (64). } Was produced.
<Preparation of cell culture carrier (C38)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether from 4.52 parts to 0.90 parts during polymerization” and “artificial polypeptide (P23) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C38) were prepared in the same manner as in Example 1 except that “. The water retention amount of this carrier (C38) was 21 g / g. Further, this carrier (C38) contained 0.5 mg / g of the artificial polypeptide (P23).
<実施例39>
<人工ポリペプチド(P24)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P17)と人工ポリペプチド(P11A)とをモル比1:1で反応させること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約9000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P24){Ile Lys Val Ala Val配列(7)の約1個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)の約20個とを有する。}を作製した。
<細胞培養用担体(C39)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P24)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C39)を調製した。この担体(C39)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C39)には、1mg/gの人工ポリペプチド(P24)が含まれていた。
<Example 39>
<Preparation of artificial polypeptide (P24)>
“Instead of reacting the artificial polypeptides (P4) with each other, react the artificial polypeptide (P17) and the artificial polypeptide (P11A) at a molar ratio of 1: 1” and “instead of the fraction of about 1000 Mw” Except that the fraction of Mw of about 9000 is fractionated, ”an artificial polypeptide (P24) {Ile Lys Val Ala Val sequence (7) and Gly Ala Gly About 20 of the Ala Gly Ser sequence (64). } Was produced.
<Preparation of cell culture carrier (C39)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P24) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C39) were prepared in the same manner as in Example 1 except that “. The water retention amount of this carrier (C39) was 21 g / g. Further, this carrier (C39) contained 1 mg / g of artificial polypeptide (P24).
<実施例40>
<人工ポリペプチド(P25)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P17)と人工ポリペプチド(P12A)とをモル比1:1で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名Superdex30pgを使用する代わりに、商品名Superdex75pgを使用すること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約13000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P25){Ile Lys Val Ala Val配列(7)の約1個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)の約30個とを有する。}を作製した。
<細胞培養用担体(C40)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P25)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C40)を調製した。この担体(C40)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C40)には、1mg/gの人工ポリペプチド(P25)が含まれていた。
<Example 40>
<Preparation of artificial polypeptide (P25)>
“Instead of reacting the artificial polypeptide (P4) with each other, the artificial polypeptide (P17) and the artificial polypeptide (P12A) are reacted at a molar ratio of 1: 1”, “As a gel filtration column, the trade name Superdex 30 pg Instead of using the product name Superdex 75 pg "and" Separating a fraction with an Mw of about 13000 instead of a fraction with an Mw of about 1000 ", in the same manner as in Example 9 (1), Artificial polypeptide (P25) {has about one Ile Lys Val Ala Val sequence (7) and about 30 Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequences (64). } Was produced.
<Preparation of cell culture carrier (C40)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P25) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C40) were prepared in the same manner as in Example 1 except that “. The carrier (C40) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C40) contained 1 mg / g of artificial polypeptide (P25).
<実施例41>
<人工ポリペプチド(P26)の準備>
「人工ポリペプチド(P4)同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド(P17)と人工ポリペプチド(P13A)とをモル比1:1で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名Superdex30pgを使用する代わりに、商品名Superdex75pgを使用すること」及び「Mw約1000の分画の代わりに、Mw約21000の分画を分取すること」以外、実施例9(1)と同様にして、人工ポリペプチド(P26){Ile Lys Val Ala Val配列(7)の約1個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列(64)の約50個とを有する。}を作製した。
<細胞培養用担体(C41)の調製>
「重合時の架橋性単量体のエチレングリコールジグリシジルエーテルの使用量を4.52部から0.90部に変更すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P26)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)及び細胞培養用担体(C41)を調製した。この担体(C41)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C41)には、2mg/gの人工ポリペプチド(P26)が含まれていた。
<Example 41>
<Preparation of artificial polypeptide (P26)>
“Instead of reacting the artificial polypeptide (P4) with each other, react the artificial polypeptide (P17) and the artificial polypeptide (P13A) at a molar ratio of 1: 1”, “As a gel filtration column, trade name Superdex 30pg Instead of using the product name Superdex 75 pg "and" Separating a fraction with an Mw of about 21000 instead of a fraction with an Mw of about 1000 "in the same manner as in Example 9 (1), Artificial polypeptide (P26) {has about 1 Ile Lys Val Ala Val sequence (7) and about 50 Gly Ala Gly Ala Gly Ser sequences (64). } Was produced.
<Preparation of cell culture carrier (C41)>
“Changing the amount of the crosslinkable monomer ethylene glycol diglycidyl ether used in the polymerization from 4.52 parts to 0.90 parts” and “artificial polypeptide (P26) instead of artificial polypeptide (P1)” The crosslinked polyacrylate particles (A3) and the cell culture carrier (C41) were prepared in the same manner as in Example 1 except that “. This carrier (C41) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C41) contained 2 mg / g of artificial polypeptide (P26).
<実施例42>
架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の代わりに架橋ポリアクリル酸塩粒子(A6)を使用すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、細胞培養用担体(C42)を調製した。この担体(C42)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C42)には、8mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Example 42>
Other than “Use cross-linked polyacrylate particles (A6) instead of cross-linked polyacrylate particles (A1)” and “Use artificial polypeptide (P14) instead of artificial polypeptide (P1)” In the same manner as in Example 1, a cell culture carrier (C42) was prepared. The water retention amount of this carrier (C42) was 21 g / g. Further, this carrier (C42) contained 8 mg / g of artificial polypeptide (P14).
<実施例43>
架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の代わりに架橋ポリアクリル酸塩粒子(A7){実施例19}を使用すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、細胞培養用担体(C43)を調製した。この担体(C43)の保水量は4g/gであった。また、この担体(C43)には、0.1mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Example 43>
Instead of cross-linked polyacrylate particles (A1), use cross-linked polyacrylate particles (A7) {Example 19} "and" in place of artificial polypeptide (P1), artificial polypeptide (P14) A cell culture carrier (C43) was prepared in the same manner as in Example 1 except for “Using”. The water retention amount of this carrier (C43) was 4 g / g. Further, this carrier (C43) contained 0.1 mg / g of an artificial polypeptide (P14).
<実施例44>
架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の代わりに架橋ポリアクリル酸塩粒子(A8){実施例20}を使用すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、細胞培養用担体(C44)を調製した。この担体(C44)の保水量は7g/gであった。また、この担体(C44)には、0.2mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Example 44>
Instead of cross-linked polyacrylate particles (A1), use cross-linked polyacrylate particles (A8) {Example 20} "and" instead of artificial polypeptide (P1), artificial polypeptide (P14) A cell culture carrier (C44) was prepared in the same manner as in Example 1 except that “Use” was performed. The water retention amount of this carrier (C44) was 7 g / g. Further, this carrier (C44) contained 0.2 mg / g of an artificial polypeptide (P14).
<実施例45>
架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の代わりに架橋ポリアクリル酸塩粒子(A9){実施例21}を使用すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、細胞培養用担体(C45)を調製した。この担体(C45)の保水量は28g/gであった。また、この担体(C45)には、6mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Example 45>
Instead of cross-linked polyacrylate particles (A1), use cross-linked polyacrylate particles (A9) {Example 21} "and" in place of artificial polypeptide (P1), artificial polypeptide (P14) A cell culture support (C45) was prepared in the same manner as in Example 1 except that “Use” was performed. The water retention amount of this carrier (C45) was 28 g / g. Further, this carrier (C45) contained 6 mg / g of artificial polypeptide (P14).
<実施例46>
架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の代わりに架橋ポリアクリル酸塩粒子(A10){実施例22}を使用すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、細胞培養用担体(C46)を調製した。この担体(C46)の保水量は39g/gであった。また、この担体(C46)には、10mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Example 46>
Instead of cross-linked polyacrylate particles (A1), use cross-linked polyacrylate particles (A10) {Example 22} "and" in place of artificial polypeptide (P1) artificial polypeptide (P14) A cell culture carrier (C46) was prepared in the same manner as in Example 1 except that “Use” was performed. The water retention amount of this carrier (C46) was 39 g / g. Further, this carrier (C46) contained 10 mg / g of artificial polypeptide (P14).
<実施例47>
架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の代わりに架橋ポリアクリル酸塩粒子(A11){実施例23}を使用すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、細胞培養用担体(C47)を調製した。この担体(C47)の保水量は48g/gであった。また、この担体(C47)には、10mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Example 47>
Instead of the crosslinked polyacrylate particles (A1), use the crosslinked polyacrylate particles (A11) {Example 23} "and" instead of the artificial polypeptide (P1), artificial polypeptide (P14) A cell culture carrier (C47) was prepared in the same manner as in Example 1 except that “Use” was performed. This carrier (C47) had a water retention amount of 48 g / g. Further, this carrier (C47) contained 10 mg / g of artificial polypeptide (P14).
<実施例48>
架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の代わりに架橋ポリアクリル酸塩粒子(A12){実施例24}を使用すること」及び「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14)を使用すること」以外、実施例1と同様にして、細胞培養用担体(C48)を調製した。この担体(C48)の保水量は20g/gであった。また、この担体(C48)には、2mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Example 48>
Instead of cross-linked polyacrylate particles (A1), use cross-linked polyacrylate particles (A12) {Example 24} "and" in place of artificial polypeptide (P1), artificial polypeptide (P14) A cell culture carrier (C48) was prepared in the same manner as in Example 1 except that “Use” was performed. This carrier (C48) had a water retention amount of 20 g / g. Further, this carrier (C48) contained 2 mg / g of artificial polypeptide (P14).
<実施例49>
水溶性カルボジイミド(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド ハイドロクロライド、(株)同仁化学研究所製)を0.1mMの濃度でPBSに溶解させ、噴霧液(1)を得た。また、人工ポリペプチド(P1)を1μg/mLの濃度でPBSに溶解させ、噴霧液(2)を得た。
架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)の1gに、噴霧液(1)0.4mLをスプレー噴霧しながら、約25℃で約2分間、スパチュラを用いて混合・攪拌した後、静置下で1時間反応させて、カルボジイミド結合粒子を得た。
引き続き、カルボジイミド結合粒子に、噴霧液(2)0.4mLをスプレー噴霧しながら、約25℃で混合・攪拌して1時間反応させて、人工ポリペプチド結合粒子を得た。その後、人工ポリペプチド結合粒子をPBS40mLを添加、吸引除去する洗浄操作を5回行い、さらにイオン交換水の40mLを添加、吸引除去する洗浄操作を2回行った。
最後に、減圧乾燥機の中に入れ、120℃、0.1kPa以下の条件での乾燥を4時間行い、本発明の細胞培養用担体(C49)を得た。この担体(C49)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C49)には、5ng/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 49>
Water-soluble carbodiimide (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, manufactured by Dojindo Laboratories) was dissolved in PBS at a concentration of 0.1 mM to obtain a spray liquid (1). . Moreover, the artificial polypeptide (P1) was dissolved in PBS at a concentration of 1 μg / mL to obtain a spray solution (2).
1 g of the crosslinked polyacrylate particles (A3) was mixed and stirred with a spatula for about 2 minutes at about 25 ° C. while spraying 0.4 mL of the spray liquid (1), and then left to stand for 1 Carbodiimide-bonded particles were obtained by reacting for a period of time.
Subsequently, 0.4 ml of the spray liquid (2) was sprayed on the carbodiimide-bound particles, and the mixture was stirred and reacted at about 25 ° C. for 1 hour to obtain artificial polypeptide-bound particles. Thereafter, 40 mL of PBS was added to the artificial polypeptide-bound particles, and the washing operation for suction removal was performed 5 times, and further, 40 mL of ion exchange water was added and the washing operation for suction removal was performed twice.
Finally, it was placed in a vacuum dryer and dried under conditions of 120 ° C. and 0.1 kPa or less for 4 hours to obtain a cell culture carrier (C49) of the present invention. This carrier (C49) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C49) contained 5 ng / g of artificial polypeptide (P1).
<実施例50>
「水溶性カルボジイミドの濃度を0.1mMから0.5mMに変更したこと」及び「人工ポリペプチド(P1)の濃度を1μg/mLから5μg/mLに変更したこと」以外、実施例49と同様にして、本発明の細胞培養用担体(C50)を得た。この担体(C50)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C50)には、50ng/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 50>
Except that “the concentration of the water-soluble carbodiimide was changed from 0.1 mM to 0.5 mM” and “the concentration of the artificial polypeptide (P1) was changed from 1 μg / mL to 5 μg / mL”, the same as in Example 49. Thus, the cell culture carrier (C50) of the present invention was obtained. This carrier (C50) had a water retention amount of 21 g / g. Further, this carrier (C50) contained 50 ng / g of artificial polypeptide (P1).
<実施例51>
「水溶性カルボジイミドの濃度を0.1mMから2mMに変更したこと」及び「人工ポリペプチド(P1)の濃度を1μg/mLから20μg/mLに変更したこと」以外、実施例49と同様にして、本発明の細胞培養用担体(C51)を得た。この担体(C51)の保水量は21g/gであった。また、この担体(C51)には、500ng/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 51>
In the same manner as in Example 49, except that “the concentration of the water-soluble carbodiimide was changed from 0.1 mM to 2 mM” and “the concentration of the artificial polypeptide (P1) was changed from 1 μg / mL to 20 μg / mL”, The cell culture carrier (C51) of the present invention was obtained. The water retention amount of this carrier (C51) was 21 g / g. Further, this carrier (C51) contained 500 ng / g of artificial polypeptide (P1).
<実施例52>
「架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の代わりに架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)を使用すること」、「水溶性カルボジイミドの濃度を60mMから500mMに変更したこと」及び「人工ポリペプチド(P1)の濃度を600μg/mLから5mg/mLに変更したこと」以外、実施例1と同様にして、本発明の細胞培養用担体(C52)を得た。この担体(C52)の保水量は19g/gであった。また、この担体(C52)には、50mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 52>
“Use of crosslinked polyacrylate particles (A3) instead of crosslinked polyacrylate particles (A1)”, “Change of water-soluble carbodiimide concentration from 60 mM to 500 mM” and “artificial polypeptide (P1 The cell culture support (C52) of the present invention was obtained in the same manner as in Example 1, except that the concentration of) was changed from 600 μg / mL to 5 mg / mL. The water retention amount of this carrier (C52) was 19 g / g. Further, this carrier (C52) contained 50 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<実施例53>
「架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の代わりに架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)を使用すること」、「水溶性カルボジイミドの濃度を60mMから500mMに変更したこと」及び「人工ポリペプチド(P1)の濃度を600μg/mLから25mg/mLに変更したこと」以外、実施例1と同様にして、本発明の細胞培養用担体(C53)を得た。この担体(C53)の保水量は14g/gであった。また、この担体(C53)には、500mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Example 53>
“Use of crosslinked polyacrylate particles (A3) instead of crosslinked polyacrylate particles (A1)”, “Change in water-soluble carbodiimide concentration from 60 mM to 500 mM” and “artificial polypeptide (P1 The cell culture carrier (C53) of the present invention was obtained in the same manner as in Example 1, except that the concentration of) was changed from 600 μg / mL to 25 mg / mL. The water retention amount of this carrier (C53) was 14 g / g. Further, this carrier (C53) contained 500 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<比較例1>
架橋ポリアクリル酸塩粒子(A3)を比較用の細胞培養用担体(C54)とした。この担体(C54)の保水量は21g/gであった。
<Comparative Example 1>
Cross-linked polyacrylate particles (A3) were used as a carrier for cell culture (C54) for comparison. The water retention amount of this carrier (C54) was 21 g / g.
<比較例2>
市販のコラーゲン結合デキストランビーズ(商品名:Cytodex3、アマシャムバイオサイエンス(株)製)を比較用の細胞培養用担体(C55)とした。この担体(C55)の保水量は9g/gであった。
<Comparative example 2>
Commercially available collagen-binding dextran beads (trade name: Cytodex3, manufactured by Amersham Biosciences) were used as a carrier for cell culture (C55) for comparison. The water retention amount of this carrier (C55) was 9 g / g.
<比較例3>
特開2003−189848号公報の実施例1の記載を参考にして、以下のようにして、比較用の細胞培養担体(C56)を得た。
スチレン99%、ジビニルベンゼン1%を懸濁重合して得られたポリスチレンビーズを
次いで、人工ポリペプチド(P1)の4.5規定の過塩素酸リチウム水溶液{人工ポリペプチド(P1)の濃度;1mg/ml}をリン酸バッファー液(PBS)で人工ポリペプチド(P1)の濃度が15μg/mlとなるように希釈し、人工ポリペプチド(P1)溶液を作製した。
人工ポリペプチド(P1)溶液の25mlに上記で得られたビーズを5g加え、ポリフッ化エチレン樹脂{テフロン(登録商標)}製撹拌子で12時間撹拌した。得られたビーズスラリーを振盪器上にセットしたステンレス製バットに移し、100℃の熱風を吹きつけながら、24時間振盪乾燥した。得られた乾燥ビーズをPBS50mlで2回洗浄し、乾燥することにより、比較用の細胞培養用担体(C56)を得た。この担体(C56)の保水量は0g/gであった。また、この担体(C56)には、1mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Comparative Example 3>
With reference to the description in Example 1 of JP-A-2003-189848, a comparative cell culture carrier (C56) was obtained as follows.
Next, polystyrene beads obtained by suspension polymerization of 99% styrene and 1% divinylbenzene were then added to a 4.5N lithium perchlorate aqueous solution of artificial polypeptide (P1) {concentration of artificial polypeptide (P1); / Ml} was diluted with a phosphate buffer solution (PBS) so that the concentration of the artificial polypeptide (P1) was 15 μg / ml to prepare an artificial polypeptide (P1) solution.
5 g of the beads obtained above were added to 25 ml of the artificial polypeptide (P1) solution, and the mixture was stirred with a stirrer made of polyfluorinated ethylene resin {Teflon (registered trademark)} for 12 hours. The obtained bead slurry was transferred to a stainless steel vat set on a shaker, and dried by shaking for 24 hours while blowing hot air at 100 ° C. The obtained dried beads were washed twice with 50 ml of PBS and dried to obtain a comparative cell culture carrier (C56). The water retention amount of this carrier (C56) was 0 g / g. Further, this carrier (C56) contained 1 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<比較例4>
攪拌機、モノマー供給管、窒素ガス導入管、温度計、還流冷却器を備えた反応容器にシクロヘキサン624部、重合分散剤としてソルビタンモノステアレート3.1部を仕込み、窒素バブリングを30分以上行って、溶存空気を追い出し75℃まで昇温した。
別の反応器にアクリルアミド138部及び水242部を仕込んだ。この水溶液に架橋性単量体{N,N’−メチレンビスアクリルアミド}0.0098部及び重合開始剤{過硫酸カリウム}0.278部、連鎖移動剤{次亜リン酸ナトリウム}0.053部を添加した後、窒素バブリングを行い、溶存空気を追い出しモノマー水溶液を得た。
得られたモノマー水溶液を上記の重合反応器のモノマー供給管より6.5ml/分の割合で連続的に重合反応器内の撹拌中(撹拌速度は500rpm)のシクロヘキサン液中に約1時間かけて供給してシクロヘキサン還流下で重合を行った。
次に共沸脱水によって160部の水を抜き出した後、含水ゲルポリマーを取り出し、更に120℃で2時間乾燥して、乾燥架橋ポリアクリルアミドを得た。
乾燥架橋ポリアクリルアミドを、目開きが63μmのふるい及び53μmのふるい(JIS Z8801−1:2000)により分級して、粒子径53〜63μmの粒子{架橋ポリアクリルアミド粒子}を得た。
「架橋ポリアクリル酸塩粒子(A1)の代わりに架橋ポリアクリルアミド粒子を使用すること」以外、実施例1と同様にして、比較用の細胞培養用担体(C57)を得た。この担体(C57)の保水量は4g/gであった。また、この担体(C57)には、0.1mg/gの人工ポリペプチド(P1)が含まれていた。
<Comparative example 4>
A reaction vessel equipped with a stirrer, a monomer supply pipe, a nitrogen gas introduction pipe, a thermometer, and a reflux condenser was charged with 624 parts of cyclohexane and 3.1 parts of sorbitan monostearate as a polymerization dispersant, and nitrogen bubbling was performed for 30 minutes or more. The dissolved air was driven out and the temperature was raised to 75 ° C.
A separate reactor was charged with 138 parts of acrylamide and 242 parts of water. In this aqueous solution, 0.0098 part of a crosslinkable monomer {N, N′-methylenebisacrylamide} and 0.278 part of a polymerization initiator {potassium persulfate}, a chain transfer agent {sodium hypophosphite} 0.053 part Then, nitrogen bubbling was performed to drive out dissolved air to obtain an aqueous monomer solution.
The obtained monomer aqueous solution was continuously fed at a rate of 6.5 ml / min from the monomer supply pipe of the above polymerization reactor into a cyclohexane solution being stirred in the polymerization reactor (stirring speed was 500 rpm) for about 1 hour. The polymerization was carried out under reflux of cyclohexane.
Next, 160 parts of water was extracted by azeotropic dehydration, and then the hydrogel polymer was taken out and further dried at 120 ° C. for 2 hours to obtain dry crosslinked polyacrylamide.
The dried crosslinked polyacrylamide was classified with a sieve having an aperture of 63 μm and a sieve having a size of 53 μm (JIS Z8801-1: 2000) to obtain particles {crosslinked polyacrylamide particles} having a particle size of 53 to 63 μm.
A comparative cell culture carrier (C57) was obtained in the same manner as in Example 1 except that “crosslinked polyacrylamide particles were used instead of the crosslinked polyacrylate particles (A1)”. The water retention amount of this carrier (C57) was 4 g / g. Further, this carrier (C57) contained 0.1 mg / g of the artificial polypeptide (P1).
<比較例5>
「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14)を使用すること」以外、比較例3と同様にして、比較用の細胞培養用担体(C58)を得た。この担体(C58)の保水量は0g/gであった。また、この担体(C58)には、1mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Comparative Example 5>
A comparative cell culture carrier (C58) was obtained in the same manner as in Comparative Example 3 except that “the artificial polypeptide (P14) was used instead of the artificial polypeptide (P1)”. The water retention amount of this carrier (C58) was 0 g / g. Further, this carrier (C58) contained 1 mg / g of artificial polypeptide (P14).
<比較例6>
「人工ポリペプチド(P1)の代わりに、人工ポリペプチド(P14)を使用すること」以外、比較例4と同様にして、比較用の細胞培養用担体(C59)を調製した。この担体(C59)の保水量は4g/gであった。また、この担体(C59)には、0.1mg/gの人工ポリペプチド(P14)が含まれていた。
<Comparative Example 6>
A comparative cell culture carrier (C59) was prepared in the same manner as in Comparative Example 4 except that “the artificial polypeptide (P14) was used instead of the artificial polypeptide (P1)”. The water retention amount of this carrier (C59) was 4 g / g. Further, this carrier (C59) contained 0.1 mg / g of the artificial polypeptide (P14).
<細胞増殖性評価1>
実施例1〜24、実施例49〜53及び比較例1〜4の細胞培養用担体(C1)〜(C24)及び(C49)〜(C57)について、生理食塩水で膨潤した細胞培養用担体を150Gで90秒間遠心脱水を行い余剰水を取り除いたものの重量が4gになるように、各々の担体を作動容量100mLのスピンナーフラスコに投入した。すなわち、担体(C1)は0.29g、担体(C2)は0.21g、担体(C3)は0.18g、担体(C4)は0.17g、担体(C5)〜(C7)は0.18g、担体(C8)は0.17g、担体(C9)〜(C17)は0.18g、担体(C18)は0.18g、担体(C19)は0.80g、担体(C20)は0.50g、担体(C21)は0.14g、担体(C22)は0.10g、担体(C23)は0.08g、担体(C24)は0.19g、(C49)〜(C51)は0.18g、(C52)は0.20g、(C53)は0.27g、担体(C54)は0.18g、担体(C55)は0.40g、担体(C56)は4g、担体(C57)は0.80gを各々スピンナーフラスコに投入した。
次に、各々のスピンナーフラスコへ、生理食塩水を100mL/フラスコで加え、オートクレーブ滅菌(121℃、20分間)した。オートクレーブ滅菌後、生理食塩水をアスピレータで吸引除去した後、無血清培地(商品名:VP−SFM、インビトロジェン(株)製)に抗菌剤(商品名:PSA、カスケード社製)を0.2%で含有させた無血清培地を50mL/フラスコで添加し、1時間放置した後、培地を吸引除去し、再度、同じ無血清培地を100mL/フラスコで添加した。スピンナーフラスコを37℃、二酸化炭素ガス濃度5容量%のCO2インキュベーターの中に2時間放置した後、予めプレ培養していたVERO細胞(大日本住友製薬(株)製)を細胞濃度が20万個/mLになるように無血清培地に播種した。37℃、二酸化炭素ガス濃度5容量%のCO2インキュベーターの中で、30rpmの攪拌をしながら、7日間の培養を行った。尚、培養4日目、5日目及び6日目に培地の半分を交換した。培養7日目にサンプリングし、単位体積当たりの細胞核数をクリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法により計数し、培地中の細胞濃度(万個/mL)を測定した。これらの結果を、細胞培養用担体の保水量と共に表1に示した。
<Cell proliferation evaluation 1>
Regarding the cell culture carriers (C1) to (C24) and (C49) to (C57) of Examples 1 to 24, Examples 49 to 53 and Comparative Examples 1 to 4, the cell culture carriers swollen with physiological saline were used. Each carrier was put into a spinner flask having a working capacity of 100 mL so that the weight of the product after centrifugal dehydration at 150 G for 90 seconds to remove excess water was 4 g. That is, the carrier (C1) is 0.29 g, the carrier (C2) is 0.21 g, the carrier (C3) is 0.18 g, the carrier (C4) is 0.17 g, and the carriers (C5) to (C7) are 0.18 g. The carrier (C8) is 0.17 g, the carriers (C9) to (C17) are 0.18 g, the carrier (C18) is 0.18 g, the carrier (C19) is 0.80 g, the carrier (C20) is 0.50 g, Carrier (C21) is 0.14 g, Carrier (C22) is 0.10 g, Carrier (C23) is 0.08 g, Carrier (C24) is 0.19 g, (C49) to (C51) is 0.18 g, (C52 ) Is 0.20 g, (C53) is 0.27 g, the carrier (C54) is 0.18 g, the carrier (C55) is 0.40 g, the carrier (C56) is 4 g, and the carrier (C57) is 0.80 g. Charged to flask.
Next, physiological saline was added to each spinner flask at 100 mL / flask and autoclaved (121 ° C., 20 minutes). After autoclave sterilization, physiological saline is removed by suction with an aspirator, and then an antibacterial agent (trade name: PSA, Cascade) 0.2% is added to a serum-free medium (trade name: VP-SFM, manufactured by Invitrogen Corporation). The serum-free medium contained in (1) was added at 50 mL / flask and allowed to stand for 1 hour. The medium was removed by suction, and the same serum-free medium was added again at 100 mL / flask. The spinner flask was allowed to stand in a CO 2 incubator at 37 ° C. and a carbon dioxide gas concentration of 5% by volume for 2 hours, and then precultured VERO cells (manufactured by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) at a cell concentration of 200,000. Inoculated into serum-free medium at a concentration of 1 cell / mL. The culture was carried out for 7 days in a CO 2 incubator at 37 ° C. and a carbon dioxide gas concentration of 5% by volume while stirring at 30 rpm. Note that half of the medium was changed on the 4th, 5th and 6th days of culture. Sampling was performed on the 7th day of culture, and the number of cell nuclei per unit volume was counted by the cell nuclei counting method using crystal violet to measure the cell concentration (10,000 cells / mL) in the medium. These results are shown in Table 1 together with the water retention amount of the cell culture carrier.
表1の結果から、比較例1〜4の細胞培養用担体はVERO細胞が全く増殖していないのに対し、本発明の細胞培養用担体(実施例1〜24及び49〜53)はVERO細胞が良く増殖していることが判明した。 From the results of Table 1, the cell culture carriers of Comparative Examples 1 to 4 have no VERO cells growing, whereas the cell culture carriers of the present invention (Examples 1 to 24 and 49 to 53) are VERO cells. Was found to proliferate well.
<細胞増殖性評価2>
「無血清培地(商品名:VP−SFM、インビトロジェン(株)製)を無血清培地(商品名:Opti−PROTMSFM、インビトロジェン(株)製)に変更したこと」及び「VERO細胞をMDCK細胞(大日本住友製薬(株)製)に変更したこと」以外、<細胞増殖性評価1>と同様にして、培地中の細胞濃度(万個/mL)を測定した。これらの結果を、細胞培養用担体の保水量と共に表2に示した。
<Cell proliferation evaluation 2>
“Change in serum-free medium (trade name: VP-SFM, manufactured by Invitrogen) to serum-free medium (trade name: Opti-PRO ™ SFM, manufactured by Invitrogen)” and “VERO cells as MDCK cells The cell concentration (10,000 cells / mL) in the medium was measured in the same manner as in <Cell Proliferation Evaluation 1> except that it was changed to “Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.”. These results are shown in Table 2 together with the water retention amount of the cell culture carrier.
表2の結果から、本発明の細胞培養用担体(実施例1〜24及び49〜53)は、比較例1〜4の細胞培養用担体に比べ、MDCK細胞が格段に増殖していることが判明した。 From the results of Table 2, it can be seen that the MDCK cells proliferated markedly in the cell culture carriers of the present invention (Examples 1 to 24 and 49 to 53) compared to the cell culture carriers of Comparative Examples 1 to 4. found.
<細胞増殖性評価3>
実施例1〜24、実施例49〜53及び比較例1〜4の細胞培養用担体(C1)〜(C24)及び(C49)〜(C57)について、生理食塩水で膨潤した細胞培養用担体を150Gで90秒間遠心脱水を行い余剰水を取り除いたものの重量が0.4gになるように、各々の担体を作動容量10mLのスピンナーフラスコに投入した。すなわち、担体(C1)は0.029g、担体(C2)は0.021g、担体(C3)は0.018g、担体(C4)は0.017g、担体(C5)〜(C7)は0.018g、担体(C8)は0.017g、担体(C9)〜(C17)は0.018g、担体(C18)は0.018g、担体(C19)は0.080g、担体(C20)は0.050g、担体(C21)は0.014g、担体(C22)は0.010g、担体(C23)は0.008g、担体(C24)は0.019g、(C49)〜(C51)は0.18g、(C52)は0.20g、(C53)は0.27g、担体(C54)は0.018g、担体(C55)は0.040g、担体(C56)は0.4g、担体(C57)は0.080gを各々スピンナーフラスコに投入した。
次に、各々のスピンナーフラスコへ、生理食塩水を10mL/フラスコで加え、オートクレーブ滅菌(121℃、20分間)した。オートクレーブ滅菌後、生理食塩水をアスピレータで吸引除去した後、血清培地{Opti−MEMTMI培地(インビトロジェン(株
)製)に、牛インスリン(シグマアルドリッチ社製)を5μg/mL、ヒドロコルチゾン(シグマアルドリッチ社製)を400ng/mL、イソプロテレノール(シグマアルドリッチ社製)を250ng/mL、rhEGF(シグマアルドリッチ社製)を10ng/mL 、牛胎児血清(インビトロジェン(株)製)を10容量%及び抗菌剤(商品名:PSA、カスケード社製)を0.2重量%で含有させた血清培地}を5mL/フラスコで添加し、1時間放置した後、培地を吸引除去し、再度、同じ血清培地を10mL/フラスコで添加した。スピンナーフラスコを37℃、二酸化炭素ガス濃度5容量%のCO2インキュベーターの中に2時間放置した後、予めプレ培養していた上皮細胞(商品名:NHEK(F)、倉敷紡績(株)製)を細胞濃度が20万個/mLになるように血清培地に播種した。37℃、二酸化炭素ガス濃度5容量%のCO2インキュベーターの中で、30rpmの攪拌をしながら、7日間の培養を行った。尚、培養4日目、5日目及び6日目に培地の半分を交換した。培養7日目にサンプリングし、単位体積当たりの細胞核数をクリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法により計数し、培地中の細胞濃度(万個/mL)を測定した。こららの結果を、細胞培養用担体の保水量と共に表3に示した。
<Cell proliferation evaluation 3>
Regarding the cell culture carriers (C1) to (C24) and (C49) to (C57) of Examples 1 to 24, Examples 49 to 53 and Comparative Examples 1 to 4, the cell culture carriers swollen with physiological saline were used. Each carrier was put into a spinner flask having a working capacity of 10 mL so that the weight of the product after removing the excess water by performing centrifugal dehydration at 150 G for 90 seconds was 0.4 g. That is, the carrier (C1) is 0.029 g, the carrier (C2) is 0.021 g, the carrier (C3) is 0.018 g, the carrier (C4) is 0.017 g, and the carriers (C5) to (C7) are 0.018 g. The carrier (C8) is 0.017 g, the carriers (C9) to (C17) are 0.018 g, the carrier (C18) is 0.018 g, the carrier (C19) is 0.080 g, the carrier (C20) is 0.050 g, Carrier (C21) is 0.014 g, Carrier (C22) is 0.010 g, Carrier (C23) is 0.008 g, Carrier (C24) is 0.019 g, (C49) to (C51) are 0.18 g, (C52 ) 0.20 g, (C53) 0.27 g, carrier (C54) 0.018 g, carrier (C55) 0.040 g, carrier (C56) 0.4 g, carrier (C57) 0.080 g Put into each spinner flask It was.
Next, physiological saline was added to each spinner flask at 10 mL / flask and autoclaved (121 ° C., 20 minutes). After autoclave sterilization, physiological saline was aspirated and removed with an aspirator, then serum medium {Opti-MEM ™ I medium (Invitrogen Corp.)), bovine insulin (Sigma Aldrich) 5 μg / mL, hydrocortisone (Sigma Aldrich) 400 ng / mL, isoproterenol (Sigma Aldrich) 250 ng / mL, rhEGF (Sigma Aldrich) 10 ng / mL, fetal bovine serum (Invitrogen) 10% by volume and antibacterial The serum medium containing 0.2% by weight of the drug (trade name: PSA, manufactured by Cascade)} was added at 5 mL / flask, left to stand for 1 hour, the medium was removed by suction, and the same serum medium was again added. Added at 10 mL / flask. The spinner flask was allowed to stand in a CO 2 incubator with a carbon dioxide gas concentration of 5% by volume at 37 ° C. for 2 hours and then pre-cultured epithelial cells (trade name: NHEK (F), Kurashiki Boseki Co., Ltd.) Was seeded in serum medium to a cell concentration of 200,000 cells / mL. The culture was carried out for 7 days in a CO 2 incubator at 37 ° C. and a carbon dioxide gas concentration of 5% by volume while stirring at 30 rpm. Note that half of the medium was changed on the 4th, 5th and 6th days of culture. Sampling was performed on the 7th day of culture, and the number of cell nuclei per unit volume was counted by the cell nuclei counting method using crystal violet to measure the cell concentration (10,000 cells / mL) in the medium. These results are shown in Table 3 together with the water retention amount of the cell culture carrier.
表3の結果から、比較例1〜4の細胞培養用担体は上皮細胞が全く増殖していないのに対し、本発明の細胞培養用担体(実施例1〜24及び49〜53)は上皮細胞が良く増殖していることが判明した。 From the results of Table 3, the cell culture carriers of Comparative Examples 1 to 4 have no epithelial cells growing, whereas the cell culture carriers of the present invention (Examples 1 to 24 and 49 to 53) are epithelial cells. Was found to proliferate well.
<細胞増殖性評価4>
実施例25〜48、比較例1〜2及び比較例5〜6の細胞培養用担体(C25)〜(C48)、(C54)〜(C55)及び(C58)〜(C59)について、生理食塩水で膨潤した細胞培養用担体を150Gで90秒間遠心脱水を行い余剰水を取り除いたものの重量が4gになるように、各々の担体を作動容量100mLのスピンナーフラスコに投入した。すなわち、担体(C25)は0.29g、担体(C26)は0.21g、担体(C27)は0.18g、担体(C28)は0.17g、担体(C29)〜(C31)は0.18g、担体(C32)は0.17g、担体(C33)〜(C41)は0.18g、担体(C42)は0.18g、担体(C43)は0.80g、担体(C44)は0.50g、担体(C45)は0.14g、担体(C46)は0.10g、担体(C47)は0.08g、担体(C48)は0.19g、担体(C54)は0.18g、担体(C55)は0.40g、担体(C58)は4g、担体(C59)は0.80gを各々スピンナーフラスコに投入した。
各々のスピンナーフラスコへ、生理食塩水を100mL/フラスコで加え、オートクレーブ滅菌(121℃、20分間)した。オートクレーブ滅菌後、生理食塩水をアスピレータで吸引除去した後、PBSを50mL/フラスコで添加し、1時放置した。
次に、PBSを、アスピレータで吸引除去し、MEMダルベッコ液体培地(大日本住友製薬(株)製)に1容量%の牛胎児血清(インビトロジェン(株)製)を加えた血清培地を50mL/フラスコで添加し、1時間放置した後、培地を吸引除去し、再度、同じ血清培地を100mL/フラスコで添加した。スピンナーフラスコを37℃、二酸化炭素ガス濃度5容量%のCO2インキュベーターの中に2時間放置した後、予めプレ培養していたHT−1080細胞(大日本製薬(株)製)を細胞濃度が20万個/mLになるように培地に播種した。37℃、二酸化炭素ガス濃度5容量%のCO2インキュベーターの中で、30rpmの攪拌をしながら、7日間の培養を行った。尚、培養4日目、5日目および6日目に培地の半分を交換した。培養7日目にサンプリングし、単位体積当たりの細胞核数をクリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法により計数し、培地中の細胞濃度(個/mL)を測定した。これらの結果を、細胞培養担体の保水量と共に表4に示した。
<Cell proliferation evaluation 4>
About Examples 25-48, Comparative Examples 1-2 and Comparative Examples 5-6 Cell Culture Carriers (C25)-(C48), (C54)-(C55) and (C58)-(C59) Each carrier was put into a spinner flask having a working capacity of 100 mL so that the weight of the carrier for cell culture swollen in step 1 was centrifuged at 150 G for 90 seconds to remove excess water. That is, the carrier (C25) is 0.29 g, the carrier (C26) is 0.21 g, the carrier (C27) is 0.18 g, the carrier (C28) is 0.17 g, and the carriers (C29) to (C31) are 0.18 g. The carrier (C32) is 0.17 g, the carriers (C33) to (C41) are 0.18 g, the carrier (C42) is 0.18 g, the carrier (C43) is 0.80 g, the carrier (C44) is 0.50 g, Carrier (C45) is 0.14 g, Carrier (C46) is 0.10 g, Carrier (C47) is 0.08 g, Carrier (C48) is 0.19 g, Carrier (C54) is 0.18 g, Carrier (C55) is 0.40 g, 4 g of the carrier (C58) and 0.80 g of the carrier (C59) were charged into the spinner flask.
To each spinner flask, physiological saline was added at 100 mL / flask and autoclaved (121 ° C., 20 minutes). After autoclave sterilization, the physiological saline was removed by suction with an aspirator, and then PBS was added at 50 mL / flask and left for 1 hour.
Next, the PBS was removed by suction with an aspirator, and a serum medium obtained by adding 1% by volume of fetal calf serum (manufactured by Invitrogen Corporation) to MEM Dulbecco liquid medium (manufactured by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) was added to 50 mL / flask. And left for 1 hour, the medium was removed by aspiration, and the same serum medium was added again at 100 mL / flask. The spinner flask was left in a CO 2 incubator at 37 ° C. and a carbon dioxide gas concentration of 5% by volume for 2 hours, and then pre-cultured HT-1080 cells (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) having a cell concentration of 20 It seed | inoculated to the culture medium so that it might become 10,000 / mL. The culture was carried out for 7 days in a CO 2 incubator at 37 ° C. and a carbon dioxide gas concentration of 5% by volume while stirring at 30 rpm. Note that half of the medium was changed on the 4th, 5th and 6th days of culture. Sampling was performed on the 7th day of culture, and the number of cell nuclei per unit volume was counted by a cell nuclei counting method using crystal violet to measure the cell concentration (cells / mL) in the medium. These results are shown in Table 4 together with the water retention amount of the cell culture carrier.
表4の結果から、比較例1〜2及び比較例5〜6の細胞培養用担体はHT−1080細胞が全く増殖していないのに対し、本発明の細胞培養用担体(実施例25〜48)はHT−1080細胞が良く増殖していることが判明した。 From the results of Table 4, the cell culture carriers of Comparative Examples 1-2 and Comparative Examples 5-6 showed no growth of HT-1080 cells, whereas the cell culture carriers of the present invention (Examples 25-48). ) Showed that HT-1080 cells proliferated well.
本発明の細胞培養用担体は、無血清培養において優れた細胞増殖性を発揮することができ、またウイルス等の感染因子の混入の危険性がないため、細胞が関係する、研究開発、有用物質生産及び治療等に極めて有用である。
研究開発用としては、分化機能等の細胞機能評価用細胞の培養、動物実験(毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等)の代替用細胞の培養、遺伝子や蛋白質導入用細胞の培養等に利用できる。
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産用細胞の培養に利用できる。これらのうち、ワクチンの生産用細胞の培養に好適である。
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の細胞培養に利用できる。
The cell culture carrier of the present invention can exhibit excellent cell growth in serum-free culture and has no risk of contamination with infectious agents such as viruses. It is extremely useful for production and treatment.
For research and development, cell culture for cell function evaluation such as differentiation function, culture of substitute cells for animal experiments (toxicity test, stimulation test, metabolic function test, etc.), cell culture for gene and protein introduction, etc. Available.
For the production of useful substances, it can be used for culturing cells for production of cytokines, thrombolytic agents, blood coagulation factor preparations, vaccines, hormones, antibiotics, antibodies, growth factors and the like. Among these, it is suitable for culturing cells for vaccine production.
For treatment, skin, skull, muscle, skin tissue, bone, cartilage, blood vessel, nerve, tendon, ligament, follicular tissue, mucosal tissue, periodontal tissue, dentin, bone marrow, retina, serosa, gastrointestinal tract and fat It can be used for cell culture of tissues such as lung, liver, pancreas and kidney.
Claims (9)
該(P)の含有量が、細胞培養用担体の乾燥重量を基準として、500ng/g〜50mg/gであり、
保水量が10〜30g/gであることを特徴とする細胞培養用担体。 Cross-linked poly (meth) acrylic acid (salt) particles (A) and an artificial polypeptide (P) having at least one cell adhesion minimal amino acid sequence (X) in one molecule,
The content of (P) is 500 ng / g to 50 mg / g based on the dry weight of the cell culture carrier,
A cell culture carrier having a water retention amount of 10 to 30 g / g.
該(P)の含有量が、細胞培養用担体の乾燥重量を基準として、500ng/g〜50mg/gであり、
細胞培養用担体の保水量が10〜30g/gであることを特徴とする細胞培養用担体の製造方法。 Cell culture by mixing crosslinked poly (meth) acrylic acid (salt) particles (A) and an artificial polypeptide (P) having at least one cell adhesion minimal amino acid sequence (X) in a solvent in a solvent. Obtaining a carrier for use,
The content of (P) is 500 ng / g to 50 mg / g based on the dry weight of the cell culture carrier,
A method for producing a carrier for cell culture, wherein the water retention amount of the carrier for cell culture is 10 to 30 g / g.
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