JP2003180379A - サイトスタチンｉｉ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 正常および異常な細胞増殖および分化を調節
する因子を同定および特徴付ける。 【解決手段】 サイトスタチンII増殖調節ペプチド、該
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、とくに該
ポリヌクレオチドを発現することによって、ポリペプチ
ドを製造する方法および該ポリペプチドのアゴニストお
よびアンタゴニストを提供する。
する因子を同定および特徴付ける。 【解決手段】 サイトスタチンII増殖調節ペプチド、該
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、とくに該
ポリヌクレオチドを発現することによって、ポリペプチ
ドを製造する方法および該ポリペプチドのアゴニストお
よびアンタゴニストを提供する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、部分的に新たに同
定されたポリヌクレオチド、およびポリペプチドに関す
る；該ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの変異体および誘導体；該ポリヌクレオチ
ドおよび該ポリペプチドおよびその変異体および誘導体
の製造方法；該ポリペプチドのアゴニストおよびアンタ
ゴニスト；および該ポリヌクレオチド、ポリペプチド、
変異体、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストの使
用に関する。とりわけ、これらおよび他の点において、
本発明は、ヒトサイトスタチンIIに関する。 【０００２】 【従来の技術】細胞の増殖および分化および組織および
腺の成長は、自己分泌および傍分泌因子、増殖因子など
のようにホルモンの作用を調節または媒介し、それ自体
でホルモンであるものにより制御される。例えば、局所
的に増殖を中止させるシグナルを出し、ついで増殖途中
の上皮の細胞の分化を刺激するペプチドは乳腺の発達に
非常に有効である。これらの因子は、特にヒトにおいて
は同定または特徴つけられることはめったにない。 【０００３】組織および腺、特に乳腺中の細胞の増殖の
液体培地中で役割を果たす少しの因子は非ヒト生物体中
において同定されている。そのような因子は乳腺由来増
殖阻害剤（「ＭＤＧＩ」）であり、少なくともマウスと
ウシにおいては、上皮細胞増殖を抑制し、および上皮細
胞の分化を刺激する。ＭＤＧＩは最初にウシの乳および
乳腺中において単離されていた。続いて、該ペプチドを
マウス中において同定された。 【０００４】ＭＤＧＩは翻訳後の工程の別経路によって
少なくとも２つの形態において存在する。元来の形態は
ＭＤＧＩとして呼ばれて存在し、ついで第２形態はＭＤ
ＧＩ−２と呼ばれるものである。ＭＤＧＩは乳脂肪小球
膜（「ＭＦＧＭ」）に主に結合し、抗ＭＤＧＩ抗体を用
いて免疫学的アッセイにより評価される。類似の時間経
過実験はＭＤＧＩが運搬に従い、授乳開始で劇的に乳腺
中で増加することを示すＭＤＧＩ−２はこの点において
ＭＤＧＩと異なっている。該ＭＤＧＩ−２は授乳期では
なく妊娠期に乳腺において見い出される。 【０００５】ＭＤＧＩの２つの形態の役割および作用の
機構は明らかには定義されていない。マウスおよびウシ
ＭＤＧＩは互いに類似しており、低分子量親水性リガン
ド結合性タンパク質（「低分子量ＨＬＢＰ」）であり、
それには、脳、心臓、肝臓および腸由来の脂肪酸結合タ
ンパク質（「ＦＡＢＰ」）ｐ４４２と呼ばれるガストロ
ピンなる脂肪細胞の分化関連タンパク質および細胞性レ
チノイン酸結合タンパク質（「ＣＲＡＢＰ」）を含む。
これらのタンパク質は、長鎖脂肪酸、レチノイドおよび
エイコンサノリド（eiconsanolid）などの親水的に結合
し、脂肪酸および脂肪酸誘導体の輸送、隔離または代謝
において役割を果たすと考えられている。しがしがら、
それらは分化において特異的なやり方で乳腺、心臓、肝
臓、脳および腸の細胞において発現し、それらは基礎代
謝において役割を果たすのみならず、分化および増殖に
おいても重要な役割を有するようである。 【０００６】ＭＤＧＩの低分子量ＨＬＢＰｓに対するホ
モロジーはＭＤＧＩは少なくともその機能の一部におい
て、親水性リガンドに結合し、ついでこのリガンドへの
結合は、ＭＤＧＩが細胞の増殖を抑制し、分化を刺激す
ることによって該メカニズムにとって重要である；ガス
トロピンを除く他のすべての低分子量ＨＬＢＰｓは細胞
内で作用するが、ＭＤＧＩはイン・ビトロで細胞外で作
用する。 【０００７】低分子量ＭＬＢＰにおいて、ＭＤＧＩは、
脂肪酸結合タンパク質（「ＦＡＢＰ」）に密接に類似す
る。ＦＡＢＰは脳、心臓、肝臓および腸において同定さ
れている。心臓ＦＡＢＰはＭＤＧＩのように、天然資源
から産生されるかまたは、異種宿主中のクローニングさ
れた遺伝子の発現によって産生され、マウス起源の正常
乳腺上皮細胞（「ＭＥＣ」）の増殖を阻害する。さら
に、該ＦＡＢＰは乳タンパク質合成を刺激し、それ自身
のこれらの細胞中での発現を刺激する。しかしながら、
ウシ心臓ＦＡＢＰのようではなく、ウシＭＤＧＩは脂肪
酸に結合しなかった。これらの２つのタンパク質は互い
に９５％類似であったが結合しなかった。心臓ＦＡＢＰ
は実際、ＭＤＧＩの形態であってよいことが示唆され
る。従って、たとえＤＧＩが低分子量ＨＬＢＰであると
しても、その基質アフィニティーがそのファミリー内の
密接な関係物とは全く異なるが、それゆえ、それは異な
る生理学的役割を果たすようである。 【０００８】イン・ビボにおいてＭＤＧＩは、マウスま
たはウシにおける毛細血管内皮細胞および乳腺実質中で
見いだされる。ＭＤＧＩは、最初に毛細血管内皮細胞に
現れ、後に分泌上皮細胞において現れる。乳腺毛細血管
内皮細胞中のＭＦＧＩの局在は、内皮細胞増殖を調節す
る役割と一致する。 【０００９】多くのＭＤＧＩの関係物は、イン・ビトロ
で証明されている。例えば、新生児ラット心臓細胞のベ
ータアドレナリン刺激に対するＬ（＋）−酪酸−、アラ
キドン酸−および１５−Ｓ−ヒドロキシエイコサテラエ
ノイン酸−誘発超感受性が示されてる。その誘発された
過剰感受性は、β２−アドレナリン受容体の小集団によ
って媒介され、それゆえ、ＭＤＧＩがこれらの受容体の
成城機能を邪魔することが示唆されている。これらの受
容体との相互作用は、ＭＤＧＩが細胞の増殖を阻害する
ことによって、そのメカニズムの一部でもある。この活
性はまた、ＭＤＧＩはもともと心臓筋肉細胞のβ−アド
レナリン感受性を天然において調節している。 【００１０】乳腺上皮細胞（「ＭＥＣ」）へのＭＤＧＩ
の効果は、さらに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドを用いてアンチセンス阻害実験によってさらに示さ
れている。これらの実験はＭＤＧＩアンチセンス分子は
β−カゼインレベルを低減させ、組織培養中の肺胞末端
芽（alveolar end buds）の出現を抑圧する。さらに、
ＭＤＧＩは上皮増殖因子のマイトジェン効果を抑圧す
る。ＭＤＧＩは乳腺分化を促進させる最初に公知の増殖
阻害剤である。ＭＤＧＩの調節特性は完全に１１−アミ
ノ酸配列によって模擬されることができ、それはＭＤＧ
Ｉのカルボキシル末端および低分子量ＨＬＢＰのサブフ
ァミリーにおいて代表される。 【００１１】乳腺上皮細胞株すべてではないが、同様に
ＭＤＧＩに応答する。ＭＤＧＦは、正常ヒトＭＥＣの増
殖を抑制し、時間の長さを変化させるよう経過する。そ
れはまたマウス乳癌上皮細胞株ｍＭａＣａ２０１７７の
増殖を阻害し、ヒト悪性腫瘍乳腺細胞株ＭａＴｕおよび
Ｔ４７Ｄおよびそれはイン・ビトロの静止エールリッヒ
腹水癌細胞（「ＥＡＣ」）の増殖の続行を阻害する。逆
に、ＭＤＧＦは、わずかにヒト悪性腫瘍乳腺上皮細胞株
ＭＣＦ７の増殖を刺激する。最終的に、ＭＤＧＩはマウ
ス多分化能胎児幹細胞の分化を促進する。 【００１２】ＭＤＧＩの細胞への影響のメカニズムはい
まなお知られていない。イン・ビトロにおける静止エー
ルリッヒ腹水癌細胞（「ＥＡＣ」）の増殖の続行は、細
胞性ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｒａｓ ｍＲＮＡに
おいて急激に増殖することによって達成される。ＭＤＧ
Ｉにさらしたこれらの遺伝子の急激な誘発は増殖調節に
対する癌遺伝子の発現の重要性をはっきり示し、ついで
細胞増殖とｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｒａｓの発現
との間に正の相関があることを示している。さらに、こ
れらの遺伝子の発現へのＭＤＧＩの影響はそれが、直接
または１またはそれ以上のシグナル経路を介してかまた
はその両者であれ、細胞性前癌遺伝子の正のエフェクタ
ーであることを示している。 【００１３】ＭＤＧＩは、可能性のある腫瘍抑圧遺伝子
として機能することができることも示されている。ＭＤ
ＧＩ発現構築物でトランスフェクションしたヒト乳癌細
胞は分化した形態、増殖速度の減少、軟アガーにおける
減少したクローン産生度、およびヌードマウス中の減少
した腫瘍産生度を示す。この遺伝子のヒトホモログは染
色体１ｐ３３−３５にマッピングされ、以前示された遺
伝子座はヒト乳癌(腫瘍の約４０％)の異種性(heterozyg
osity)の頻繁な損失を示す。ＭＤＧＩのイン・ビボおよ
びイン・ビトロ腫瘍サプレッサー活性の大きさは、ＢＲ
ＣＡ１、ｐ５３、ＲｂおよびＨ１９に関して以前に観察
されたものと比較することができる。 【００１４】 【発明が解決しようとする課題】ＭＤＧＦの細胞増殖お
よび分化への影響および細胞性前癌遺伝子発現の発現へ
の影響は異常な細胞増殖、機能不全および疾患での細
胞、組織、腺および器官ならびにその役割の重要性を繰
り返す。明らかに、正常および異常な細胞増殖および分
化を調節する因子の必要性がある。それゆえ、正常およ
び疾患状態の両者において細胞増殖および分化を調節す
るような因子の同定および特徴付けの必要性がある。特
に、成長過程および成熟ヒト女性の乳腺などの適切な成
長および組織および器官の健康に不可欠である、上皮細
胞、特に乳腺上皮細胞などの細胞増殖および分化を調節
するサイトスタチンを単離し、同定する必要性がある。 【００１５】 【課題を解決するための手段】これらの目的および他の
目的のため、特に、ＭＤＧＩなどの公知のサイトスタチ
ンに対するホモロジーにより新規なサイトスタチンであ
ると同定された、図１に示されたアミノ酸配列のポリペ
プチドを提供することは本発明の目的である。さらに、
サイトスタチンをコードするポリヌクレオチド、特に本
明細書においてサイトスタチンIIと称するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供することが本発明
の目的である。 【００１６】本発明のこの局面の特に好ましい態様にお
いて、該ポリヌクレオチドは図１に示される配列または
ＡＴＣＣ受託番号第９７２８７号におけるｃＤＮＡ（本
明細書において寄託したクローンという）におけるヒト
サイトスタチンIIをコードする領域を含む。本発明のこ
の局面により、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡを含むヒトサイトスタチンIIをコードする単離され
た核酸分子を提供し、本発明のこの局面のさらなる態様
において、生物学上、診断上、臨床上または治療上有用
な変異体、類似体および誘導体の断片を含む、変異体、
類似体またはその誘導体、またはその断片を提供する。
本発明のこの局面の特に好ましい態様は、ヒトサイトス
タチンIIの天然に存在するアレル変異体である。 【００１７】上皮細胞の増殖活性を調節するサイトスタ
チンIIポリペプチド、特にヒトサイトスタチンIIポリペ
プチドを提供することは、本発明の目的である。本発明
のこの局面により、本明細書中でサイトスタチンIIとい
うヒト起源の新規ポリペプチドならびに生物学上、診断
上または治療上有用な断片、変異体、ホモログ、類似体
およびその誘導体を提供する。本明細書の特に好ましい
態様はヒトサイトスタチンII遺伝子の天然に存在するア
レルによりコードされるヒトサイトスタチンIIの変異体
である。 【００１８】上記のポリペプチド、ポリペプチド断片、
変異体、類似体、誘導体およびその断片を調製する方法
を提供することが本発明の他の目的である。本発明のこ
の局面の好ましい態様において、宿主内でヒトサイトス
タチンIIの発現の条件下で、外在的に由来するヒトサイ
トスタチンIIをコードするポリヌクレオチドを発現上組
み込ませる宿主細胞を培養し、ついで発現されたポリペ
プチドを回収することを含む、上記のサイトスタチンII
をポリペプチドを調製する方法を提供する。 【００１９】上記ポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ド、特に生物学的、臨床上および治療上の目的を利用す
るための産物、組成物、工程および方法を提供すること
が他の目的である。本明細書のこの局面の好ましい態様
により、他のもの；例えば、イン・ビトロ、エクス・ビ
ボまたはイン・ビボにおいて細胞増殖を調製すること；
タンパク質またはｍＲＮＡを決定することにより細胞中
のサイトスタチンII発現を査定する；およびサイトスタ
チンII遺伝子中の欠失などの遺伝子変異および異常のア
ッセイ、の方法を提供する。本発明の他の局面のある好
ましい態様において、ヒトサイトスタチンIIに特異的に
ハイブリダイズするプローブを提供する。 【００２０】本発明のさらに好ましい態様において、サ
イトスタチンIIポリペプチドに対する抗体を提供する。
この点で特に好ましい態様において、該抗体はヒトサイ
トスタチンIIに非常に選択的である。本発明の他の局面
において、サイトスタチンII受容体に結合し、かつサイ
トスタチンII誘発応答を引き出す、サイトスタチンIIを
模擬するようなサイトスタチンIIアゴニストを提供す
る。そのようなアゴニストにおいて、サイトスタチンII
または他のモジュレーターまたは受容体と相互作用し、
かつそれによってヒトサイトスタチンIIの効果が可能に
なる。 【００２１】本発明のさらに別の局面により、サイトス
タチンII受容体に結合し、しかしサイトスタチンII誘発
応答を引き出さず、その効果を阻害するようにヒトサイ
トスタチンIIと相互作用するものを提供する。該アゴニ
ストおよびアンタゴニストは、例えばそのようなポリペ
プチドの作用を模擬する、増大するまたは阻害するため
に使用することができ、ついでそれらはサイトスタチ
ン、特に、サイトスタチンIIによって影響された細胞の
異常増殖と関連した障害の治療において使用することが
できる。 【００２２】本発明の他の目的、特徴、利点および局面
は以下の記載から当業者には明らかとなるであろう。し
かしながら、以下の記載および具体的な実施例は本発明
の好ましい態様を示しているが、それは例示のためにの
みであることを理解すべきである。開示された発明の精
神および範囲内での多様な変更および改変は、以下の記
載を読み、本開示の他の部分を読むことから当業者には
容易に明らかとなるであろう。 【００２３】用語集 以下の例示的説明は、本明細書で頻繁に使用される、特
に実施例中で使用されるある語句の理解を容易にするこ
とを提供する。該説明は便宜を提供するものであって、
本発明に制限を加えるものではない。ＤＮＡの「消化」
は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素で、ＤＮ
Ａを触媒開裂することを示す。本明細書中でいう多様な
制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子
および他の必要条件は、当業者に公知でかつ日常的であ
るように使用した。分析目的には、典型的に、バッファ
ー溶液約２０μｌ中、１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ
断片を約２単位の酵素と共に消化する。プラスミド構築
のためのＤＮＡ断片を単離する目的には、正比例的によ
り多量の容積中、一般にＤＮＡ５〜５０μｇを２０〜２
５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当なバ
ッファーおよび基質量は、以下に参照する標準実験マニ
ュアルおよび市販の提供者によって明らかにされてい
る。３７℃で１時間のインキュベーション時間が通常利
用されるが、その条件は、供給者の指示およびその反応
の項目に従って変えてもよい。消化後、その反応物をポ
リアクリルアミドゲル上で直接電気泳動し、分析または
所望の断片の単離またはその両方を行う。 【００２４】遺伝子要素は、一般に、ポリペプチドまた
は宿主細胞内のポリペプチドの発現に重要な転写または
翻訳または他のプロセスを調節する領域またはポリペプ
チドまたは発現を調節する領域をコードする領域両方を
含むポリヌクレオチドを意味する。遺伝子要素は、エピ
ソーム要素として複製されるベクター内に含まれること
ができる；すなわち、宿主細胞ゲノムから生理学的に独
立した分子である。それらは真核細胞中のメトトレキセ
ート選択によとてトランスフェクションされたＤＮＡの
増幅の間に生じる微小染色体内に含まれる。遺伝的要素
はまた、宿主細胞ゲノム内に含まれることができる；そ
の天然の状態ではなく、むしろ単離、クローニングおよ
び精製したＤＮＡまたはベクターなどの形態の宿主細胞
への導入などの操作であってよい。 【００２５】「単離された」とは、物質がその元の状態
を変えられた；例えば、それが天然に存在するなら、そ
の主との環境から除去されていることをいう。例えば、
生存動物中にある天然に存在するポリヌクレオチドまた
はアポリペプチドは「単離されて」いないが、天然の系
における共存物質のいくつかまたはすべてから分離され
た同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細
書で使用するように「単離されて」いる。 【００２６】単離の一部として、またえは単離後の一部
として、そのようなポリヌクレオチドは変異原発生のた
めに、ついで例えば、宿主中の繁殖または発現のために
他のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡｓなどと結合し
て、融合タンパク質を形成することができる。単離され
たポリヌクレオチドは、単独またはベクターなどの他の
ポリヌクレオチドに結合され、培養物または全器官にお
いて、宿主中に導入されることができる。培養物または
全器官における宿主細胞中に導入された、例えばＤＮＡ
ｓは、本明細書で使用されるように、単離されている。
というのは、それらは天然に存在する形態または環境に
おいて存在しないであろうからである。同様に、該ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば培地組織化
などの組成物中で存在することができ、例えばポリヌク
レオチドまたはポリペプチドの細胞への導入用溶液、化
学または酵素反応のための組成物または容易、例えばそ
れらは天然に存在しない組成物であり、そこには、本明
細書で使用する語句の意味内での単離されたポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドが存在する。 【００２７】「ライゲーション」は、２またはそれ以上
の、しばしば二本鎖ＤＮＡであるポリヌクレオチドの間
にホスホジエステル結合を形成する過程をいう。ライゲ
ーションの技術は当該技術においてはよく知られてお
り、ライゲーションのプロトコールは標準的な実験マニ
ュアルおよび参考文献、例えば、サンブルック（Ｓambr
ook）ら、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラト
リー・マニュアル（MOLECULAR CLONING, A LABORATORY
MANUAL）第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory
Press）、コールド・スプリン・ハーバー（Cold Spring
Harbor）、ニューヨーク（１９８９）および以下に引
用するようにマニアチスら、第１４６ページに記載され
ている。 【００２８】「オリゴヌクレオチド」とは、相対的に短
いポリヌクレオチドである。この語は最も頻繁には一本
鎖デオキシリボヌクレオチドをいうが、短い一本鎖また
は二本鎖リボヌクレオチド、短いＲＮＡ：ＤＮＡハイブ
リッドおよび短い二本鎖ＤＮＡなどをいうこともでき
る。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどのオ
リゴヌクレオチドは、しばしば自動化オリゴヌクレオチ
ド合成機にて実施されるように化学的な方法によって合
成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドはイン・
ビトロ組換えＤＮＡ媒介技術を含む多様な他の方法によ
って、および細胞または器官中のＤＮＡの発現によって
製造されることができる。 【００２９】最初、化学的合成されたＤＮＡは、典型的
には、５'リン酸なしで得られる。そのようなオリゴヌ
クレオチドの５'末端は組換えＤＮＡ分子を形成するた
めに典型的に使用されるＤＮＡリガーゼを使用するライ
ゲーション反応によるホスホジエステル結合形成のため
の基質ではない。そのようなオリゴヌクレオチドのライ
ゲーションが望まれるところでは、リン酸は、キナーゼ
およびＡＴＰを使用するものなど、標準技術によって付
加されることができる。 【００３０】化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの
３'末端は、遊離ヒドロキシル基を有して、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼなどのリガーゼの存在下で他のオリゴヌクレオ
チドの５'リン酸とホスホジエステル結合を容易に形成
する。よく知られているように、および反応は望まれれ
ば、反応中の他のポリヌクレオチドの５'脱リン酸化に
よって妨害されることができる。 【００３１】プラスミドは、一般に本明細書で、前置き
する小文字のｐおよび／または続けて大文字および／ま
たは数字にて、当業者によく知られた標準的名付けのし
きたりにより示す。本明細書中の出発プラスミドは、市
販されているか、限定されない基盤の下に公に入手可能
であるか、または公開された方法によりよく知られた日
常的な応用により入手可能なプラスミドから構築でき
る。本発明により使用することができる多くのプラスミ
ドおよび他のクローニングおよび発現ベクターは、当業
者に容易に利用できるものである。さらに、当業者は本
発明通の使用により適当な他の任意の数のプラスミドを
構築することができる。本発明の特性、構築物およびそ
のようなプラスミドの使用ならびに他のベクターは、本
開示から当業者に容易に明らかであろう。 【００３２】ポリヌクレオチドは、一般に修飾されてい
ないＲＮＡまたはＤＮＡまたは修飾したＲＮＡまたはＤ
ＮＡであってよい、任意のポリヌクレオチドまたはポリ
デオキシリボヌクレオチドをいう。従って、例えば、本
明細書で使用するポリヌクレオチドは数ある中で、一本
鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域
の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮ
Ａ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮ
Ａ、一本鎖であるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッ
ド分子、一層典型的には、二本鎖領域または一本鎖およ
び二本鎖領域の混合物をいう。 【００３３】さらに、本明細書で使用するＲＮＡまたは
ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両者を含む三本鎖領
域をいう。そのような領域の鎖は同一分子または異なる
分子由来であってよい。該領域はすべての１またはそれ
以上の分子を含むが、一層典型的には、該分子のいくつ
かの領域のみを含む。３本鎖領域の分子の１つはしばし
ばオリゴヌクレオチドである。 【００３４】本明細書で使用するように、ポリヌクレオ
チドなる語は上記のように１またはそれ以上の修飾した
塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡを含む。従って、安定性
のためまたは他の理由のために修飾された骨格を有する
ＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で意図する「ポリヌ
クレオチド」である。さらに、通常ではない、例えばイ
ノシンなどの塩基、またはトリチル化した塩基などの修
飾した塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、ちょうど２つ
の例を挙げるが、明細書で使用する語句としてのポリヌ
クレオチドである。 【００３５】非常に多様な修飾は、当業者に公知の多く
の有用な目的に役立つＤＮＡおよびＲＮＡに加えられる
ことが認識されるであろう。本明細書で使用されるポリ
ヌクレオチドなる語は、化学的、酵素的または代謝的に
修飾した形態のポリヌクレオチドならびに、特に単細胞
および多細胞を含むウイルスおよび細胞のＤＮＡおよび
ＲＮＡ特徴の化学形態を含む。 【００３６】本発明は数ある中で、以下に最も詳細に記
載されているように、新規のサイトスタチンIIポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドに関する。特に、本発明
は、新規ヒトサイトスタチンIIのポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドに関し、ウシおよびマウス中の乳腺由来
増殖インヒビター（「ＭＤＧＦ」）にアミノ酸配列ホモ
ロジーによって関連しているものである。本発明は特
に、サイトスタチンIIおよび図１に示されるアミノ酸配
列に関する。 【００３７】ポリヌクレオチド 本発明の１つの局面により、図１の推定アミノ酸配列を
有する成熟ポリペプチドまたは、本明細書中で以下に
「寄託されたクローン」としていうＡＴＣＣ受託番号第
９７２８７号におけるヒトｃＤＮＡによってコードされ
る成熟ポリペプチドをコードする単離したポリヌクオレ
オチドを提供する。本明細書中で提供した、例えば、図
１に示されたポリヌクレオチド、ヒトサイトスタチンII
ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチド
は、出発物質としての上皮細胞のｍＲＮＡを使用するク
ローニングｃＤＮＡなどの標準的クローニングおよびス
クリーニング方法から得た。本発明の例示として、図１
に示されたポリヌクレオチドはヒト胎児脳組織由来のｃ
ＤＮＡライブラリーにおいて見いだされた。 【００３８】本発明のヒトサイトスタチンIIは、ＡＴＣ
Ｃ受託番号第９７２８７号中のヒトサイトスタチンIIを
コードするｃＤＮＡをシークエンシングした結果により
示されるように、増殖調節因子のサイトスタチンファミ
リーの他のタンパク質に関係する。このｃＤＮＡ配列
は、図１に示されているが、約１４.８kＤaの推定分子
量を有する約１３２のタンパク質をコードするオープン
・リーディング・フレームを示す。タンパク質は、マウ
ス乳腺由来増殖インヒビター（これも「ＭＤＧＩ」とも
呼ばれる）の最も高いホモロジーの程度を示し、それは
１３２アミノ酸配列に６４％の同一性および７９％の類
似性を示す。 【００３９】本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡな
どのＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤ
ＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡ
が含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり
得、また一本鎖であるなら、コーディング鎖または非コ
ーディング(アンチセンス)鎖であり得る。該ポリヌクレ
オチドは、例えば天然に存在するアレル変異体である配
列を有することができ、イン・ビトロ変異原発生の技術
によって変えられる配列を有する天然に存在する配列を
有することができる。 【００４０】図１に示されるポリヌクレオチドのコーデ
ィング配列または寄託されたクローンのコーディング配
列に同一であることができるポリヌクレオチドのコーデ
ィング配列に同一であってよい。それはまた、遺伝的コ
ードによる縮重の結果として、図１のＤＮＡのポリペプ
チド、または寄託されたｃＤＮＡにポリペプチドをコー
ドする異なる配列を有するポリヌクレオチドであってよ
い。 【００４１】図１のポリペプチドまたは寄託されたｃＤ
ＮＡによりコードされるポリペプチドをコードする本発
明のポリヌクレオチドは成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列に限るわけではないが、それ自身を含む；プレタ
ンパク質またはプロタンパク質またはプレプロタンパク
質配列なおリーダーまたは分泌配列をコードするような
成熟ポリペプチドまたは上記のさらなるコーディング配
列を有するか有しないかでの成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列；転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシ
ングおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソー
ム結合およびｍＲＮＡの安定性に役割を果たす転写され
たまたは非転写配列などのイントロンおよび非コーディ
ング５'および３'配列を含むさらなる非コーディング配
列とともに、上記のさらなるコーディング配列を有する
かまたは有さない成熟ポリペプチドのコーディング配列
を含んでよい。 【００４２】前記により、本明細書で使用する「ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる語は本発明
のポリペプチドをコードする、特に、図１に支援された
アミノ酸配列またはＡＴＣＣ受託番号第９７２８７号中
のｃＤＮＡによってコードされるヒトサイトスタチンII
のアミノ酸配列を有するヒトサイトスタチンIIをコード
する配列を含むポリヌクレオチドを含む。該語は、コー
ディングおよび／または非コーディング配列を含むこと
もできるさらなる領域と共にポリペプチドをコードする
単一の持続的領域または断続的領域を含むポリヌクレオ
チドを含む。 【００４３】本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列
または寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードす
るポリペプチドの断片、類似体および誘導体をコードす
る本明細書上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。
該ポリヌクレオチドの変異体は天然に存在するアレル変
異体などの天然に存在する変異体または天然に存在する
とは知られていない変異体であってよい。そのような天
然に存在しないポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレ
オチド、細胞または生物体に応用されるものを含む変異
体発生技術によって製造されることができる。 【００４４】本発明は、図１に示されるのと同じ成熟ポ
リペプチド、または寄託されたクローンのｃＤＮＡによ
ってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを含む。さらに、本発明は図１のポリペプチ
ドまたは寄託されたクドーンのｃＤＮＡによってコード
されるポリペプチド断片、誘導体または類似体をコード
するようなポリヌクレオチドの変異体を含む。この点に
おいて変異体は、ヌクレオチド置換、欠失または付加に
よって上記のポリヌクレオチドと異なる変異体である。
置換、欠失または付加は１またはそれ以上のヌクレオチ
ドに関係することができる。変異体はコーディングまた
は非コーディング領域の両者において変化されることが
できる。コーディング領域中の変化は、保存的または非
保存的アミノ酸置換、欠失または付加を製造する。 【００４５】本発明の変異体は、天然に存在する配列ま
たは天然には存在しない配列を有することができる。本
明細書上記に示したように、該ポリヌクレオチドは図１
中に示されるコーディング配列または寄託されたクロー
ンのコーディング配列の天然に存在するアレル変異体で
あるコーディング配列を有する。当該技術において公知
のように、アレル変異体は１またはそれ以上のヌクレオ
チドの置換、欠失または付加を有することができるポリ
ヌクレオチド配列の別形態である。この点において、本
発明の特に好ましい態様は図１に示されたサイトスタチ
ンIIのアミノ酸配列または寄託されたクローンまたは寄
託されたクローンのｃＤＮＡのサイトスタチンIIのアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドである；変異体、類似体、誘導体およびその断
片、その変異体の断片、類似体および誘導体である。 【００４６】この点において、さらに特に好ましい態様
は、いくつかまたは少しの５〜１０、１〜５、１〜３、
２、１のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されてい
るか、またはアミノ酸残基が全く置換、欠失または付加
されていないかの図１または寄託されているクローンの
サイトスタチンIIのアミノ酸配列を有している。この中
で、特に好ましい態様は、静寂置換、付加および欠失で
あり、サイトスタチンIIの特性および活性を変化させな
いものである。またこの点において特に好ましい態様
は、保存置換である。最も好ましいのは、図１または寄
託されたクローンのアミノ酸配列（置換なし）である。 【００４７】本発明のさらに好ましい態様は、図１に示
すアミノ酸配列を有するサイトスタチンIIポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドに８５％以上同一である
ポリヌクレオチドかまたは、上記のように、変異体、密
接なホモログ、誘導体および類似体である。かわりに、
最も好ましいのは、寄託されたクローンのｃＤＮＡのサ
イトスタチンIIポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドに８５％以上同一である領域を含むポリヌクレオチ
ドである。この点において、同ポリヌクレオチドに９０
％以上同一であるポリヌクレオチドは特に好ましく、つ
いでこれらのうちで特に好ましいポリヌクレオチドは、
９５％またはそれ以上であるのが特に好ましい。さら
に、９７％またはそれ以上の同一性は９５％またはそれ
以上の同一性のものの間で非常に好ましく、および９８
％またはそれ以上および９９％またはそれ以上の同一性
を有するこれらのもののうちでは、９９％またはそれ以
上が一層好ましい。 【００４８】また、この点において特に好ましい態様
は、図１に示すサイトスタチンのアミノ酸配列または寄
託されたクローンのサイトスタチンのアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであ
る。本明細書の任意の場所において示すように、該ポリ
ヌクレオチドは持続的領域におけるポリペプチドまたは
２またはそれ以上の複数のエクソンにおけるポリペプチ
ドをコードすることができ、該ポリヌクレオチドはコー
ディング領域または領域に関連しないさらなる領域も含
むことができる。 【００４９】この点において最も好ましいのは図１に示
すポリヌクレオチドのサイトスタチンIIコードする部分
に８５％以上同一である領域を含むポリヌクレオチドで
ある。別法として、最も好ましいのは、寄託されたクロ
ーンのｃＤＮＡの一部をコードするサイトスタチンIIに
８５％以上同一である領域を含むポリヌクレオチドであ
る。それらのポリヌクレオチドのうちで、９０％以上同
一であるのが特に好ましく、その中でも、９５％または
それ以上の同一性をもつものが特に好ましい。さらに、
９５％またはそれ以上の同一性を有するものの中では９
７％またはそれ以上の同一性を有するものが、およびそ
れらの中でも９８％またはそれ以上および９９％または
それ以上の同一性を有するものが非常に好ましく、９９
％またはそれ以上が、これらのうちで一層好ましい。 【００５０】本発明はまた、成熟ポリペプチドをコード
する配列が、別の配列に同じリーディングフレームにお
いて融合されるポリヌクレオチドを含む。そのような配
列は、シグナル配列を含み、それは小胞体に発生初期の
タンパク質を輸送するのを促進し、該ポリペプチドの不
活性な前駆体形態と関連したプロ配列、それは細胞内ま
たは細胞外のタンパク質のやりとり（trafficking）を
促進するか、または細胞内または細胞外コンパートメン
トのタンパク質の、持続性を改良することができる。そ
のような配列はまた、製造および精製を容易にするため
に加えることができ、または本明細書の任意の場所にお
いて議論されるさらなる機能的なドメインに加えること
ができる。 【００５１】従って、本発明のポリヌクレオチドは、成
熟サイトスタチン、特にサイトスタチンIIに加えて、小
胞体のルーメンにポリペプチドの輸送を制御する分泌配
列として機能するシグナルペプチドなどの例えばリーダ
ー配列をコードすることができる。該リーダー配列は、
宿主細胞によって、シグナルペプチドに一般的であるよ
うに、除去され、他の前駆体タンパク質または成熟ポリ
ペプチドを産生する。リーダー配列をしばしば有する前
駆体タンパク質はプレタンパク質と呼ばれる。 【００５２】該ポリヌクレオチドは、また、成熟タンパ
ク質と別のアミノ酸またはカルボキシル末端アミノ酸ま
たは成熟ポリペプチドの内部のアミノ酸（例えば、成熟
形態は１つのポリペプチド以上を有する場合）であるポ
リペプチドもコードできる。そのような配列は、前駆体
から成熟形態へのタンパク質のプロセシングにおける役
割を演ずることができ、タンパク質のやりとりを容易に
することができ、タンパク質の半減期を延長または短縮
することができ、または他のものの間でアッセイのため
のタンパク質または製造物の操作を容易にすることがで
きる。イン・サイチュでの場合に一般的なように、別の
アミノ酸は細胞性酵素によって成熟タンパク質から離れ
させられることができる。 【００５３】前駆体タンパク質は、１またはそれ以上の
プロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有する
が、これはポリペプチドの不活性形態であることができ
る。プロ配列が除去されると、そのような不活性前駆体
が一般的に活性化される。プロ配列全体のうちのいくつ
かは、活性化の前に除去される。一般に、そのような前
駆体はプロタンパク質という。 【００５４】要するに、本発明のポリヌクレオチドは、
成熟タンパク質、成熟タンパク質とリーダー配列（プレ
タンパク質という）、プレタンパク質のリーダー配列で
はない１またそれ以上のプロ配列を有する成熟タンパク
質の前駆体、またはプレプロタンパク質（プロタンパク
質の前駆体であって、リーダー配列および１またはそれ
以上のプロ配列を有しており、一般に該ポリペプチドの
活性および成熟形態を生み出すプロセシング工程お会い
代に除去される）をコードすることができる。 【００５５】本発明のポリヌクレオチドは、上記で議論
したとおり、数ある中でも、成熟または前駆体プレ−、
プロ−、またはプレプロポリペプチドをコードすること
ができ、さらに別の機能性（fanctionaloities）を提供
するものなどの、別のアミノ酸に融合される。従って、
例えば、該ポリペプチドは融合したポリペプチドの精製
を容易にするペプチドなどのマーカー配列に融合されて
よい。本発明のこの局面のある好ましい態様において、
該マーカー配列はヘキサヒスチジンペプチド（中でもｐ
ＱＥ−９ベクターにより与えられるタグなど）の多く
は、市販されており、入手可能である。ゲンツ（Ｇent
z）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.、USA 86:821-824 (198
9)に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジは
融合タンパク質の便利な精製を提供する。典型的には、
それはタンパク質の構造または機能に広範には影響を及
ぼさず、ついで金属キレート樹脂、特にニッケルキレー
ト樹脂に効果的に、選択的におよびしっかりと結合す
る。例えば、よく知られているようにヘキサヒスチジン
タグはしばしばニッケル−ＮＴＡ樹脂に特によく結合
し、それはよく知られており、容易に入手可能であり、
ついで例えばキアゲン（Ｑiagen）などから市販されて
いる。さらに、ヒスチジン金属相互作用は、非特異的に
結合した金属を除去するのに有用な多様な条件に安定で
ありなお、その融合ポリペプチドが穏やかな非変性条件
下で結合および除去することができる。ヘキサヒスチジ
ンタグは、アミノ酸またはサイトスタチンポリペプチド
のカルボキシル末端に最も便利に融合することができ
る。ヘキサヒスチジンのタグは特に細菌の発現に有用で
ある。 【００５６】ある他の好ましい態様における有用な他の
マーカー配列は赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグであり、
特に、哺乳動物細胞が発現に使用される場合；例えばＣ
ＯＳ−７細胞である。例えば、ＨＡタグはウィルソン
（Ｗilson）ら、Ｃell ３７：７６７（１９８４）に記
載されるように、インフルエンザ赤血球凝集素由来のエ
ピトープに一致する。 【００５７】プローブ 本発明はさらに、本明細書の上記のサイトスタチン配
列、特に２つの配列にハイブリダイズするポリヌクレオ
チドに関する。この点において好ましいのは、上記の配
列に少なくとも５０％の同一性を有するポリヌクレオチ
ドである。特に好ましい配列は、少なくとも７０％の同
一性を有する配列である。この点において本発明は特に
上記ポリペプチドにストリンジェント条件下でハイブリ
ダイズするポリヌクエオチドに特に関する。本明細書中
で使用する場合、「ストリンジェント条件」なる語は、
配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも
９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーシ
ョンが起こるであろうことを意味する。 【００５８】この点において、特に好ましい態様は、上
記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオ
チド、またはおよび図１のｃＤＮＡまたは寄託されたク
ローンのｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチド
と実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。 【００５９】寄託した物質 ヒトサイトスタチンII ｃＤＮＡを含む寄託は、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American T
ype Culture Collection）（「ＡＴＣＣ」）で寄託され
た。該寄託は、ＡＴＣＣ受託番号第９７２８７号の番号
を付与され、本明細書中では「寄託されたクローン」と
いう。寄託は特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に
関するブダペスト条約の条件の下に保持されるであろ
う。 【００６０】これらの寄託は、単に当業者への便宜とし
て与えられるものであって、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１
１２下に要求されることを承認するものではない。寄託
された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さら
にはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の
配列のいずれかの記載と矛盾する際には、該寄託された
物質中の配列が優先する。寄託された物質を製造し、使
用しまたは販売するには、実施許諾が要求され得、また
そのような実施許諾はここでは付与されない。 【００６１】ポリペプチド 本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有する、ま
たは寄託されたクローンによりコードされるアミノ酸配
列を有するヒトサイトスタチンIIポリペプチド、に関す
る。本発明はこれらのポリペプチドの断片、類似体およ
び誘導体にも関する。図１のポリペプチドまたは寄託さ
れたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場
合、「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語
は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機
能もしくは活性を保持するポリペプチドを意味する。従
って、類似体には、プロプロテイン部分を切断すること
により活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造する
ことができるプロプロテインが含まれる。本発明のポリ
ペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドま
たは合成ポリペプチドであってよい。ある好ましい態様
において、組換ポリペプチドであってよい。 【００６２】図１のポリペプチドまたは寄託されたクロ
ーン中のcＤＮＡによりコードされるポリペプチドの断
片、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたはそれ以上
のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ま
しくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそ
のような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードさ
れるものであってもよく、またはコードされたものでな
くてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸
残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリ
ペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合
物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化
合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしく
は分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用され
る配列、またはプロプロテイン配列といったような、付
加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているもので
あり得る。そのような断片、誘導体および類似体は、本
明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。 【００６３】この点において、本発明の特に好ましい態
様は図１に示されたサイトスタチンIIのアミノ酸配列ま
たは寄託されたクローンまたは寄託されたクローンのｃ
ＤＮＡのサイトスタチンIIのアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドである；変異
体、類似体、誘導体およびその断片、その変異体の断
片、類似体および誘導体である。 【００６４】この点において、さらに特に好ましい態様
は、いくつかまたは少しの５〜１０、１〜５、１〜３、
２、１のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されてい
るか、またはアミノ酸残基が全く置換、欠失または付加
されていない図１または寄託されているクローンのサイ
トスタチンIIのアミノ酸配列を有している。この中で、
特に好ましい態様は、静寂置換、付加および欠失であ
り、サイトスタチンIIの特性および活性を変化させない
ものである。またこの点において特に好ましい態様は、
保存置換である。最も好ましいのは、図１または寄託さ
れたクローンのアミノ酸配列（置換なし）である。本発
明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離され
た形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一とな
るまで精製される。 【００６５】「単離された」とは、物質がその元の状態
を変えられた；例えば、それが天然に存在するなら、そ
の主との環境から除去されていることをいう。例えば、
生存動物中にある天然に存在するポリヌクレオチドまた
はアポリペプチドは「単離されて」いないが、天然の系
における共存物質のいくつかまたはすべてから分離され
た同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細
書で使用するように「単離されて」いる。 【００６６】単離の一部として、またえは単離後の一部
として、そのようなポリヌクレオチドは変異原発生のた
めに、ついで例えば、宿主中の繁殖または発現のために
他のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡなどと結合して、
融合タンパク質を形成することができる。単離されたポ
リヌクレオチドは、単独またはベクターなどの他のポリ
ヌクレオチドに結合され、培養物または全器官におい
て、宿主中に導入されることができる。培養物または全
器官における宿主細胞中に導入された、例えばＤＮＡ
は、本明細書で使用されるように、単離されている。と
いうのは、それらは天然に存在する形態または環境にお
いて存在しないであろうからである。同様に、該ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドは、例えば培地組織化な
どの組成物中で存在することができ、例えばポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの細胞への導入用溶液、化学
または酵素反応のための組成物または容易、例えばそれ
らは天然に存在しない組成物であり、そこには、本明細
書で使用する語句の意味内での単離されたポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドが存在する。 【００６７】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベ
クター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細
胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製
造にも関する。宿主細胞は、ポリヌクレオチドを組み込
むようにかつ本発明のポリペプチドを発現するように遺
伝的に操作され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、感
染、トランスダクション、またはトランスフェクション
および形質転換のよくしられた技術を用いて、宿主細胞
中に導入されることができる。該ポリヌクレオチドは単
独または他のポリヌクレオチドと共に導入されることあ
できる。そのような他のポリヌクレオチドは独立して導
入されるか、同時導入されるかまたは本発明のポリヌク
レオチドに結合して導入されることができる。 【００６８】従って、例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドは、他と共に宿主細胞にトランスフェクションされる
ことができ、例えば哺乳動物細胞にコトランスフェクシ
ョンおよび選択のための標準技術を用いて、選択可能な
マーカーをコードするポリヌクレオチド分離することが
できる。この場合、該ポリヌクレオチドは一般的に、宿
主細胞ゲノムに安定的に組み込まれることができるであ
ろう。 【００６９】別に、該ポリヌクレオチドは宿主中での増
殖のための選択可能なマーカーを含むベクターに結合さ
れことができる。該ベクター構築物は、前記技術によっ
て宿主細胞に導入されることができる。一般的に、プラ
スミドベクターは、例えばリン酸カルシウム沈澱などの
沈澱物中の、または帯電した液体との錯体中のＤＮＡと
して導入される。エレクトロポレーションもまた、宿主
にポリヌクレオチドを導入するために使用されることが
できる。該ベクターがウイルスである場合、それはイン
・ビトロにパッケージングされることができるか、また
はパッケージング細胞に導入され、ついでパッケージン
グされたウイルスは細胞中にトランスデュースされるこ
とができる。本明細書のこの局面により、ポリヌクレオ
チドの製造およびポリヌクレオチドを細胞に導入される
に適当な広範囲の多様な技術は当業者によく知られてお
り、日常的である。そのような技術は、本明細書中に引
用されているサンブルックら中に十分に概説されてお
り、それらはこれらの技術を詳細に説明している多くの
実験マニュアルの例である。 【００７０】本発明の多くの局面により、該ベクター
は、例えばプラスミドベクター、一本鎖または二本鎖フ
ァージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮ
Ａベクターであってよい。そのようなベクターは、ポリ
ヌクレオチド、好ましくはＤＮＡとしてＤＮＡおよびＲ
ＮＡを細胞中に導入するための公知の技術によって、導
入することができる。該ベクターは、ファージおよびウ
イルスベクターの場合には、好ましくは、感染およびト
ランスダクションのよく知られた技術によってパッケー
ジされたまたはキャプシド化されたウイルスとして細胞
に導入される。ウイルスベクターは複製要素または複製
欠陥（replication defective）であってよい。後者の
場合には、ウイルス増殖は一般的に宿主細胞を補足する
ことにおいてのみ起こるであろう。 【００７１】ある点において、好ましいベクターは本発
明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現ベクタ
ーである。一般に、そのようなベクターは、発現される
べきポリヌクレオチドに作動可能に結合された宿主中の
発現に有効なシス−作用コントロール領域を含む。適当
なトランス−作用因子のいずれかは、宿主によって提供
され、補足ベクターによって提供されまたは宿主中に導
入されたベクター自身によって提供される。 【００７２】この点におけるある好ましい態様におい
て、該ベクターは特異的発現を提供する。そのような特
異的発現は、誘発可能な発現であってよく、またはある
タイプの細胞でのみの発現または誘発可能でありかつ細
胞特異的である発現であってよい。誘発可能なベクター
のうち、特に好ましいものは、温度または添加栄養素な
どの操作が容易である環境因子による発現のために誘発
されることができるベクターである。本発明のこの局面
に適当な多様なベクターは、原核細胞宿主および真核細
胞宿主において使用するための構築可能なおよび誘発可
能な発現ベクターを含み、当業者によく知られて、日常
的に使用される。 【００７３】操作された宿主細胞は、従来的な栄養培地
中で培養されることができ、特に、活性化されているプ
ロモーター、トランスフォーマントを選択することまた
は遺伝子を増幅するために適当に修飾されることができ
る。一般的に発現のために選択された宿主細胞で以前に
使用した、ｐＨなどの培養条件は、本発明のポリペプチ
ドの発現に適当であり、当業者に明らかであるであろ
う。 【００７４】発現ベクターの多大な多様性は、本発明の
ポリペプチドを発現するのに使用することができる。そ
のようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイ
ルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来のベ
クター、バクテリオファージ由来のベクター、酵母エピ
ソーム由来のベクター、酵母染色体要素由来のベクタ
ー、バキュロウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイル
ス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイル
スおよびレトロウイルスなどのパポバウイルスなどのウ
イルス由来のベクターおよびそれらの組合せ由来のベク
ター、例えば、プラスミドとバクテリオファージ遺伝的
要素由来のベクター、コスミドとファージミドなどのベ
クターが含まれ、すべては本発明のこの局面により発現
のために使用されることができる。一般的に、宿主細胞
中のポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチドを
維持、増殖または発現させるのに適した任意のベクター
は、この点において発現に使用することができる。 【００７５】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当該技術分野で公知の方法により適当な制限エンドヌク
レアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方
法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクター
中のＤＮＡ配列を、適当な発現調節配列（プロモータ
ー）に作動可能に連結して、ｍＲＮＡ合成を行わせる。
そのようなプロモーターの代表例としては、よく知られ
たプロモーターのほんの数例を挙げると、ファージラム
ダＰ Lプロモーター、大腸菌（E. coli）、lac、またはt
rpおよびtacプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プ
ロモーターおよびレトロウイルスＬＴＲが挙げられる。 【００７６】一般に、発現構築物は転写開始および終結
部位を含み、転写された領域、翻訳のためのリボソーム
結合部位を含むであろう。該構築物によって発現された
成熟転写物のコーディング部位は、翻訳されるべきポリ
ペプチドの開始部位でＡＵＧで翻訳を開始することおよ
び末端部位で適当に位置する終結コドンを含むであろ
う。さらに、該構築物は、発現を調節ならびに起こすコ
ントロール領域を含むことができる。一般的に、共通し
て実施する多くの方法により、そのような領域は転写を
コントロールすることによって、例えば、中でもリプレ
ッサー結合部位およびエンハンサーなどは作動する。 【００７７】一般的に、増殖および発現のためのベクタ
ーは選択可能なマーカーを含むであろう。そのようなマ
ーカーは増幅に適当であってよく、または該ベクターは
この目的のためさらなるマーカーを含むことができる。
この点において、該発現ベクターは好ましくは１または
それ以上の選択可能なマーカーを含み、形質転換した宿
主細胞の選択のための表現型の特徴を提供する。好まし
いマーカーは、真核生物細胞培養のためのジヒドロ葉酸
レダクターゼまたはネオマイシン耐性および大腸菌また
はその他の細菌を培養するためのテトラサイクリンまた
はアンピシリン耐性遺伝子を含む。 【００７８】上記のような適当なＤＮＡ配列、さらには
また、適当なプロモーターまたは調節配列を含むベクタ
ーを、適当な宿主を形質転換するために使用して、その
宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができ
る。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられ
る：大腸菌、ストレプトマイセス（Streptomyces）、サ
ルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimuriu
m）といったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；
ドロソフィラ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプテラ
（Spodoptera）Ｓｆ９といったような昆虫細胞；ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったような動物
細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当な宿主の選択
は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思わ
れる。 【００７９】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物
も含まれる。該構築物は、本発明のそのような配列が挿
入されているベクター（例えば、プラスミドまたはウイ
ルスベクターなど）が含まれる。該配列は、順方向また
は逆方向にて挿入されることができる。ある好ましい態
様において、構築物は、本発明の配列が順方向または逆
方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベク
ターといったようなベクターを含む。この実施態様の好
ましい側面では、該構築物はさらに、例えば、該配列に
作動可能に連結したプロモーターなどの、調節配列をさ
らに含む。適当なベクターおよびプロモーターが多数、
当業者に知られていて、市販されている。 【００８０】以下のベクターは、市販されており、実施
例のために例として挙げる。細菌用で好ましいベクター
は、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲンか
ら入手可能）；ｐＢｓ、ｐＤ１０、phagescript、psiＸ
１７４、pbluescript ＳＫ、pbsks、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮ
Ｈ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジー
ン（Ｓtratagene)から入手可能）；ptrc９９a、pＫＫ２
２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５
(ファルマシア（Ｐharmacia）から入手可能)。真核生物
用で好ましいベクターは pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡ
Ｔ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(ストラタジーンより入
手可能)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(ファ
ルマシアより入手可能)。これらのベクターは単に、本
発明のこの局面により、使用するため、当業者にとって
利用可能な、多くの市販されており、よく知られている
ベクターの例として挙げている。該ベクターは例えば、
本発明のこの局面において使用されることができる宿主
中の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導
入、維持、増殖または発現に適していると認識されるで
あろう。 【００８１】プロモーター領域は、クロラムアセチルト
ランスフェラーゼ（「ｃａｔ」）転写単位、候補プロモ
ーター断片、すなわちプロモーターを含む断片を導入す
る制限部位の下流にあるプロモーター領域を欠如してい
る任意の所望の遺伝子から選択することができる。よく
知られているように、ＣＡＴ活性の産生を起こすｃａｔ
遺伝子の上流の制限部位で、プロモーター含有断片のベ
クターへの導入、それは標準ＣＡＴアッセイによって検
出されることができる。この目的に適しているベクター
はよく知られており、容易に利用可能である。２つのそ
のようなベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７
である。従って、本発明のポリヌオチドの発現プロモー
ターには、よく知られていて容易に入手可能なプロモー
ターだけでなく、前記技術によってリポーター遺伝子を
用いて得ることができるプロモーターも含まれる。 【００８２】本発明によりポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの発現に適している公知の細菌プロモーターに
は、大腸菌 lacＩ、lacＺ、およびプロモーター、Ｔ３
およびＴ７プロモーター、gptプロモーター、ラムダ
ＰR、ＰLプロモーターおよびtrpプロモーターが含まれ
る。この点において適当な真核プロモーターには、ＣＭ
Ｖ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモ
ーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロ
ウイルスＬＴＲのプロモーターおよびマウスメタロチオ
ネイン−Ｉなどのメタロチオネインプロモーターが含ま
れる。 【００８３】宿主内の発現のための適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、よく知られた手続であり、か
つ発現ベクター構築のための必要技術、宿主へのベクタ
ーの導入および宿主中での発現は、当業者にとって日常
的である。本発明はまた、上記の構築物を含む宿主細胞
に関する。そのような宿主細胞は、哺乳動物細胞のよう
な高等真核細胞、酵母細胞のような下等真核細胞であり
得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞で
あり得る。 【００８４】構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カル
シウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン
媒介トランスフェクション、陽イオン液体媒介トランス
フェクション、エレクトロポレーション、トランスダク
ション、感染などの方法により行うことができる。その
ような方法は例えば、デイビス（Ｄavis,Ｌ.）、ディブ
ナー（Ｄibner,Ｍ.）、バッティ（Ｂattey,Ｌ.）、ベー
シック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー
（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY）（１９８６）
などの多くの標準的実験マニュアルにおいて記載されて
いる。宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組
換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造すること
ができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従
来のペプチド合成装置により合成的に製造することがで
きる。 【００８５】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
調節下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、サンブルックら、モレキュ
ラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、
第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュ
ーヨーク、（１９８９)により記載されている。 【００８６】通例、組換え発現ベクターには、複製起点
並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発
現される遺伝子から得られるプロモーターおよび該ベク
ターにさらした後、細胞を含むベクターの単離を可能に
する選択可能なマーカーが含まれるであろう。適当なプ
ロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ（ＰＧＫ）のような解糖系酵素、α−因子、酸性ホ
スファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコー
ドする遺伝子から得ることができる。選択可能なマーカ
ーには例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子および
サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）ｔｒｐ
１遺伝子が含まれる。 【００８７】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増大する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期
プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にある
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーが含まれる。 【００８８】本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポ
リペプチドのヘテロロガス構造配列をコードし、標準技
術を用いてベクターに挿入され、発現のためにプロモー
ターに作動可能に結合する。該ポリヌクレオチドは、転
写開始部位がリボソーム結合部位のほぼ５'側に位置す
るように配置される。該リボソーム結合部位は発現され
るべきポリペプチドの翻訳を開始させるＡＵＧの５'側
である。一般的に、開始コドン、通例ＡＵＧで開始する
オープンリーディングフレームは他になく、リボソーム
結合部位と開始コドンＡＵＧの間に存在する。また、一
般的に、該ポリペプチドの末端で翻訳停止コドンが存在
し、ポリアデニル化シグナルおよび転写された領域の
３'末端にほぼ配置された転写終結シグナルが存在する
であろう。 【００８９】翻訳されたタンパク質の小胞体のルーメン
への分泌、細胞周辺腔への分泌または細胞外環境への分
泌のため、適当な分泌シグナルは、発現したポリペプチ
ドに組み込まれることができる。該シグナルは該ポリペ
プチドに内在性であるかまたはヘテロロガスシグナルで
あってもよい。 【００９０】該ポリペプチドは融合タンパク質などの修
飾した形態に発現されることができ、ついで分泌シグナ
ルならびにさらに別のヘテロロガス機能的シグナルを含
むことができる。従って例えば、別のアミノ酸、特に帯
電したアミノ酸は、精製または操作及び保存の間に宿主
細胞中の安定性および持続性を改良するための該ポリペ
プチドのＮ−末端が付加されることができる。また、領
域も精製を簡易化するためにペプチドに付加されること
ができる。そのような領域は該ポリペプチドの採取的な
調製の前に取り除くことができる。特に分泌または***
を起こすため、安定性を改善するためおよび精製を簡易
化するために該ポリペプチドにペプチド残基を付加する
ことは当該技術分野においてよく知られかつ日常的な技
術である。 【００９１】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの増殖、維持、発現に適当な原核宿主には、大腸
菌、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、サル
モネラ・ティフィムリウムが含まれる。シュードモナス
（Pseudomonas）属、ストレプトマイセス属、およびス
タフィロコッカス（Staphylococcus）属の様々な種はこ
の点において、適当な宿主である。さらに他のものもま
た、選択物質として使用することができる。 【００９２】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニン
グベクター pＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺
伝要素を含む市販のプラスミドから得られる、選択可能
なマーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。そのよう
な市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３（フ
ァルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine C
hemicals）、ウプサラ（Ｕppsala）、スウェーデン）お
よびＧＥＭ１（プロメガ・バイオテク（Promega Biote
c）、マディソン、ウィスコンシン、米国）が含まれ
る。これらのpＢＲ３２２「骨格」部分を適当なプロモ
ーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。 【００９３】適当な宿主株を形質転換して、その宿主株
を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモ
ーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学誘
導）により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細
胞を、典型的には、遠心分離により収集し、物理的また
は化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の
抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発
現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超
音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含
め、いずれの便利な方法によっても破壊でき、そのよう
な方法は、当業者に周知である。 【００９４】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、ガルツマン（Ｇluzman）、Ｃ
ell、２３：１７５（１９８１）により記載されてい
る、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合
可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、
例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨ
Ｋ細胞系が含まれる。 【００９５】哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当
なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必
要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプラ
イスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、お
よび５’に隣接する非転写配列もまた含むであろう。Ｓ
Ｖ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およ
びポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写
遺伝要素を与えることができる。 【００９６】サイトスタチンIIポリペプチドは、硫酸ア
ンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンま
たは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシ
ルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロ
マトグラフィーが含まれるよく知られた方法により、組
換え細胞培養物から回収して、精製することができる。
必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク
質の立体配置を完成するのに使用することができる。最
後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最
終精製工程に使用することができる。タンパク質の再折
畳みのためのよく知られた技術は、単離または精製の間
に該ポリペプチドが変性される場合に、活性化形態を再
生するために使用されることができる。 【００９７】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から（例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て）組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され
得ない。さらに、本発明のポリペプチドにはまた、ある
場合には宿主媒介プロセスの結果として、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。 【００９８】さらに例示的な応用 サイトスタチンIIポリヌクレオチドおよびポリペプチド
は本発明により、多様な応用、特にサイトスタチンIIの
化学的および生物学的特性を利用することができるもの
に使用されることができる。特に、これらは細胞および
生物体を特徴付けおよび細胞及び生物の増殖における応
用である。さらなる応用は細胞、組織おんよび生物体の
診断または治療または障害に関する。 【００９９】従って、とりわけ、サイトスタチンIIの増
殖阻害および分化刺激活性はイン・ビトロでの腫瘍細胞
などの腫瘍細胞の増殖を抑制することおよび分化を刺激
することに、生物学的目的に関して有用である。同じ活
性は、腫瘍細胞などの生物体中の異常な細胞増殖の処理
に応用することができる。これらの点において、サイト
スタチンIIポリペプチドは好ましく、特に、図１に示す
アミノ酸配列または寄託されたクローンのｃＤＮＡのサ
イトスタチンIIのアミノ酸配列を有するサイトスタチン
IIが好ましい。 【０１００】同様に、サイトスタチンIIの、静脈（venu
s）内皮細胞などの内皮細胞の増殖を抑制する能力は、
培養中またはイン・サイチュにおける血管形成を妨害、
減速または改変に使用することができる。静脈に関連し
て、転移の部位ならびに元々の部位での腫瘍細胞は新規
な血管が増殖するのを引き付けなければならないので、
サイトスタチンIIの血管内皮細胞の抑制は、転移能を低
減するかまたは転移性疾患の進行を減速させるのに有用
であることができる。 【０１０１】さらに、乳腺上皮細胞増殖および調整乳腺
分化を抑制するサイトスタチンIIはまた、肺胞末端芽の
形成を促進し、分化した肺小葉の助力の発展、乳タンパ
ク質の製造の刺激および脂肪小滴の蓄積に使用されるこ
とができる。そのような授乳刺激活性は商用乳製造哺乳
類において乳の製造を助けることができ、かつ例えばヒ
ト母親による乳製造を助けるのに有用であり得る。 【０１０２】関連した応用において、胸の大きさに影響
を及ぼすサイトスタチンIIの調節活性は出産後の、拡大
した胸を通常の大きさに戻すのを助けるのに有用であ
る。例えばアンチセンスホスホロチオエートまたは抗体
によるサイトスタチンII活性の抑制は、肺胞末端芽の出
現を抑圧し、ついでβ−カゼインレベルを低下させるた
めの乳腺上皮細胞に内在するサイトスタチンII活性の選
択的な抑制に有用であってよい。 【０１０３】さらに以下に示すように、サイトスタチン
IIポリヌクレオチドおよび本発明のポリペプチドのこれ
らおよび他の活性および特性は、イン・ビトロでの細胞
増殖、乳および乳製品の商業上の製造に関するもの、お
よび腫瘍学、心臓学、免疫学、内分泌学、血液学、代謝
障害、骨格筋問題および婦人科学および産科学などの分
野に関連する診断および治療に関するものを含む多大な
分野において、多様な応用および使用を有する。 【０１０４】完全長のサイトスタチンII ｃＤＮＡは、
全体または部分的に、完全長ｃＤＮＡの単離およびヒト
サイトスタチンIＩ遺伝子に高い配列類似性を有するま
たは類似の生物学的活性を有する他のｃＤＮＡの単離の
ためのｃＤＮＡライブラリーに関するハイブリダイゼー
ションプローブとして使用されてよい。そのようなプロ
ーブは、一般に少なくとも２０塩基を有する。しかしな
がら、好ましくは該プローブは少なくとも３０塩基を含
み５０塩基は越えない。 【０１０５】そのようなプローブは、完全長転写物に対
応するさらに別のｃＤＮＡクローンおよびゲノムクロー
ンまたは調節およびプロモーター領域、エクソンおよび
イントロンを含む完全なヒトサイトスタチンII遺伝子を
含むクローンを同定するのに使用してよい。 【０１０６】例えば、サイトスタチンII遺伝子のコーデ
ィング領域はオリゴヌクレオチドプローブを合成するた
めに既知のＤＮＡ配列を使用してスクリーニングするこ
とにより遺伝子のコーディング領域を単離することがで
きる。本発明の遺伝子の配列に相補的である配列を有す
る標識したオリゴヌクレオチドを、プローブがライブラ
リーのどの成員にハイブリダイズするかを決定するた
め、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライ
ブラリーをスクリーニングするために使用する。本発明
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、治療の方法
およびヒトの疾患の診断のための実験試薬および物質と
して使用してよい。 【０１０７】サイトスタチンII−結合分子 本発明はまた受容体分子などのサイトスタチンIIに結合
する分子の同定方法をも提供する。受容体タンパク質な
どのサイトスタチンIIに結合するタンパク質をコードす
る遺伝子は例えば、リガンドパンニング（panning）およ
びＦＡＣＳ分離などの当業者によく知られた多くの方法
によって同定されることができる。そのような方法は例
えば、コリガン（Ｃoligan）ら、カレント・プロトコー
ルズ・イン・イムノロジー（Current Protocols in Imm
unology）１（２）：第５章（１９９１）。 【０１０８】例えば、発現クローニングはこの目的に使
用されることができる。この目的のため、ポリアデニル
化したＲＮＡがサイトスタチンII応答性の細胞から調製
され、ｃＤＮＡライブラリーがこのＲＮＡから作られ、
該ライブラリーはプールに分けられ、ついで該プールは
サイトスタチンIIに応答性でない細胞に個々にトランス
フェクションされる。ついで、トランスフェクションさ
れた細胞は標識されたサイトスタチンIIにさらされる
（サイトスタチンIIは放射性ヨウ素の標準方法まてたは
部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の含有などの
多様なよく知られた技術によって標識されることができ
る）。さらされた後、該細胞を固定し、サイトスタチン
の結合を決定する。これらの手続は、便利なことにガラ
ススライド上で行われる。 【０１０９】プールはサイトスタチンII−結合細胞を産
生するｃＤＮＡについて同定される。サブプールはこれ
らの陽性から調製され、宿主細胞にトランスフェクショ
ンされ、ついで上記のようにスクリーニングされる。反
復したサブプールおよび再度のスクリーニングを用いて
受容体などの推定結合分子をコードする１またはそれ以
上の単一クローンを単離することができる。 【０１１０】別法として、標識されたリガンドは膜また
は膜抽出物などの細胞抽出物に光親和的に結合されるこ
とができ、受容体分子などの結合する分子を発現する細
胞から調製される。架橋した物質はポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）により分解され、Ｘ線フ
ィルムにさらされる。リガンド受容体を含む標識した複
合体は切り出され、ペプチド断片に分解され、タンパク
質微小シークエンシングにかけられた。マイクロシーク
エンシングから得られたアミノ酸配列は、推定受容体を
コードする遺伝子を同定するためにｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングするため単独または変性したオリゴ
ヌクレオチドプローブを設計するために使用されること
ができる。本発明のポリペプチドは、サイトスタチンII
の細胞または無細胞系調製において受容体などのサイト
スタチンII結合分子の結合能力を評価するのに使用する
ことができる。 【０１１１】アゴニストおよびアンタゴニストおよびそ
れらのアッセイ 本発明はまた、受容体などのサイトスタチンII結合分子
との相互作用などの細胞上のサイトスタチンIIの作用を
増強または阻害する物を同定するための化合物のスクリ
ーニング方法を提供する。アゴニストは天然のサイトス
タチンIIの生物学的機能を増加させる化合物であり、ア
ンタゴニストはそのような機能を低減または排除する。 【０１１２】例えば、膜またはその調製物など、膜調製
物などの細胞コンパートメントは、サイトスタチンIIに
よって調節されたシグナルまたは調節経路の分子などの
サイトスタチンIIを結合する分子を発現する細胞から調
製される。該調製物はサイトスタチンIIアゴニストまた
はアンタゴニストであり得る候補分子の不在下または存
在下で標識されたサイトスタチンIIとインキュベートさ
れる。該候補分子の該結合分子への結合能力は標識され
たリガンドの低減された結合において反映される。無報
酬に結合する、すなわちサイトスタチンII結合分子を結
合することへのサイトスタチンIIの効果を誘発すること
なしに結合する分子は、有能なアンタゴニストである可
能性が高い。しっかりと結合し、効果を引き出す分子は
同じかまたは密接のものである。 【０１１３】可能性のあるアゴニストおよびアンタゴニ
ストのサイトスタチンII−様効果は、例えば、候補分子
と細胞または適当な細胞調製物との相互作用ののちの第
２メッセンジャー系の活性を決定することにより、およ
びサイトスタチンIIと同様の効果を引き出すサイトスタ
チンIIまたは分子の効果とを比較することによって、測
定されることができる。この点において有用である第２
メッセンジャー系には、制限するものではないが、ＡＭ
Ｐグアニレートシクラーゼ、イオンチャンネルまたはホ
スホイノシチド加水分解第２メッセンジャー系を含む。 【０１１４】サイトスタチンIIアンタゴニストのアッセ
イの他の例には、サイトスタチンIIと可能性のあるアン
タゴニストを競合的阻害アッセイに適当な条件の下で、
膜結合性サイトスタチンII受容体または組換えサイトス
タチンII受容体を結合させる競合アッセイである。サイ
トスタチンIIは、放射能などによって標識されることが
でき、受容体に結合された複数のサイトスタチンIIは可
能性のあるアンタゴニストの有効性を正確に評価するた
めに決定されることができる。 【０１１５】可能性のあるアンタゴニストは本発明のポ
リペプチドに結合する小有機分子、ペプチド、ポリペプ
チドおよび抗体を含み、それによってその活性を阻害ま
たは消滅させる。可能性のあるアンタゴニストはまた、
ペプチド、密接に関連した他ナウ質または受容体などの
結合分子上の同じ部位にサイトスタチン誘発活性を含ま
ずに結合する、サイトスタチンIIが結合から排除される
ことによって、サイトスタチンIIの作用を妨害するポリ
ペプチドである。 【０１１６】別の可能性のあるアンタゴニストにはま
た、アンチセンス技術の利用によって調製されたアンチ
センス構築物も含まれる。アンチセンス技術を利用し
て、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくは
ＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この
方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮ
Ａへの結合に基づく。アンチセンス技術は、例えばオカ
ノ（Ｏkano）、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９
１）；オリゴデオキシヌクレオチズ・アズ・アンチセン
ス・インヒビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッショ
ン（Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors
of Gene Expression）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐres
s）、ボカ・レイトン（Ｂoca Ｒaton）、フロリダ（１
９８８）)中に議論されている。三重らせん形成につい
ては、例えば、リー（Ｌee）ら、Nucl. Acids Res.、
６：３０７３（１９７９）；クーニー（Ｃooney）ら、
Ｓcience、２４１：４５６（１９８８）；およびダーバ
ン（Ｄervan）ら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９
９１）において議論される。 【０１１７】該方法はポリヌクレオチドを相補的ＤＮＡ
またはＲＮＡのポリヌクレオチド結合に基づいている。
例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリ
ヌクレオチド配列の５'コーディング部分を使用して、
長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌ
クレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、
転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設
計し、そのことによって、転写およびサイトスタチンII
の産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチ
ドは、イン・ビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズし
て、mＲＮＡ分子サイトスタチンIIポリペプチドへの翻
訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドをまた、
細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤ
ＮＡをイン・ビボにおいて発現させて、サイトスタチンI
Iの産生を阻害することができる。 【０１１８】該アンタゴニストは製薬学的に許容し得る
担体（例えば、後に記載する）を有する組成物中に使用
されることができる。該アゴニストは、例えば心臓筋細
胞肥厚または白血病を治療するために使用することがで
きる。 【０１１９】組成物 本発明のポリペプチドは、適当な製薬学的担体と組み合
わせて使用することができる。そのような組成物は、治
療上有効な量のポリペプチド、および製薬学上許容され
得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体に
は、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩
衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。そ
の製剤は、投与方法に適合すべきである。 【０１２０】キット 本発明はさらに、本発明の医薬組成物の成分を１つまた
はそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含ん
でなる医薬品パックまたはキットも提供する。そのよう
な容器には、製薬学的または生物学的製品の製造、使用
または販売を規制する政府当局により規定された形の通
知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための
製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。 【０１２１】投与 本発明のポリペプチドは、治療化合物などの他の化合物
と共に使用することができる。該医薬組成物は、経口、
局所、肛門内、膣内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、
鼻腔内または皮内経路といったような、便利な方法で投
与することができる。 【０１２２】該医薬組成物は、特定の適応症を治療およ
び／または予防するのに有効な量で投与される。一般
に、該組成物は、１日当たり少なくとも約１０μg／kg
(体重)の量で投与され、たいていの場合、約８mg／kg
(体重)を超えない量で投与されるであろう。好ましくは
たいていの場合、投与量は、毎日約１０μg／kg〜約１m
g／kg(体重)である。徴候、重篤度、投与経路および複
雑な症状等を考慮に入れて、様式または徴候の各治療の
ための標準的方法によって、最適投与量は決定されると
認識されるであろう。 【０１２３】遺伝子療法 サイトスタチンIIポリヌクレオチド、ポリペプチド、ア
ゴニストおよびアンタゴニストはまた、しばしば「遺伝
子治療」と呼ばれる、そのようなポリペプチドのイン・
ビボにおける発現により、本発明に従って使用してよ
い。従って、例えば、患者由来の細胞を、エクス・ビボ
（ex vivo）においてポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作し
た細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのよ
うな方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本発
明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイ
ルスプラスミドベクターの使用によって、細胞を当該技
術分野で公知の方法により操作することができる。その
ような方法は当該技術分野でよく知られており、および
本発明でのそれらの使用は、本明細書の教示により明ら
かであるだろう。 【０１２４】同様に、細胞を当該技術分野において公知
の方法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現
のために、細胞をイン・ビボにおいて操作することがで
きる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは上記で議論
されたように、複製欠損レトロウイルスベクター中での
発現のために操作されることができる。ついで、該レト
ロウイルス発現構築物は、単離され、本発明のポリペプ
チドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミ
ドベクターでトランスデュースされるパッキング細胞に
導入され、結果、パッキング細胞が、関心のある遺伝子
を含む感染性ウイルス粒子を産生する。これらのプロデ
ューサー細胞をイン・ビボでの細胞を操作するため、お
よびイン・ビボで該ポリペプチドの発現のために患者に
投与することができる。そのような方法により本発明の
ポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の
方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。 【０１２５】前記レトロウイルスプラスミドベクターが
由来するレトロウイルスは、以下に限られるものではな
いが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイル
ス、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハ
ーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル
白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイル
ス、骨髄増殖肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを含む。
１つの態様において、レトロウイルスプラスミドベクタ
ーは、モロニーマウス白血病ウイルスから得られる。 【０１２６】そのようなベクターは該ポリペプチドを発
現するための１つまたはそれ以上のプロモーターを含
む。使用されてよい適切なプロモーターには、以下に限
られるものではないが、レトロウイルス ＬＴＲ；ＳＶ
４０プロモーター；およびミラー（Ｍiller）ら、Biote
chniques、Ｖol．７、Ｎo．９、９８０−９９０（１９
８９）に記載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プ
ロモーター、またはその他のプロモーター（例えば、以
下に限るものではないが、ヒストン、ｐｏｌ IIIおよび
β−アクチンプロモーターを含む真核生物細胞のプロモ
ーターなどの細胞プロモーターが含まれる）が含まれ
る。使用されてよい他のウイルスプロモーターは、以下
に限るものではないが、アデノウイルスプロモーター、
チミジンキナーゼ(ＴＫ)プロモーターおよびＢ１９ パ
ルボウイルスプロモーターを含む。適切なプロモーター
の選択は、本明細書中の教示から当業者には明らかであ
ろう。 【０１２７】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適切なプロモーターの調節下にある。使用されてよ
い適切なプロモーターには、以下に限られるものではな
いが、アデノウイルス主要後期プロモーター（major la
te promoter）などのアデノウイルスプロモーター；ま
たはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなど
の異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）
プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネイン
プロモーターなどの誘導可能なプロモーター；熱ショッ
クプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプ
ロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純ヘルペ
スチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジ
ンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（上記
の修飾したレトロウイルスＬＴＲを含む）；β−アクチ
ンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーター
が含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチドを
コードする遺伝子を調節する本来のプロモーターであっ
てよい。 【０１２８】レトロウイルスプラスミドベクターはプロ
デューサー細胞株を形成するためパッケージング細胞株
を形質導入するのに使用してよい。トランスフェクショ
ンしてよいパッケージング細胞の例には、以下に限るも
のではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−
ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−
Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋
ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が含まれる（ミラ
ー、Human Gene Therapy、Ｖol．１、５−１４頁（１９
９０）に記載）。該ベクターは当該技術分野において公
知の方法によりパッケージング細胞を形質導入する。こ
のような方法には、以下に限るものではないが、エレク
トロポレーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ4沈降
が含まれる。１つの別法として、該レトロウイルスプラ
スミドベクターはリポソーム中にカプセル化して入れら
れてよく、または脂質と結合され、ついで宿主に投与さ
れてよい。 【０１２９】該プロデューサー細胞株は該ポリペプチド
をコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベク
ター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクタ
ー粒子はイン・ビトロであれイン・ビボであれ、真核生
物細胞をトランスデュースするため使用してよい。トラ
ンスデュースした真核生物細胞は該ポリペプチドをコー
ドする核酸配列を発現するであろう。トランスデュース
されてよい真核生物細胞には、以下に限られるものでは
ないが、胎児幹細胞、胎児癌細胞、ならびに造血幹細
胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細
胞および気管支上皮細胞が含まれる。 【０１３０】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば診断用としてなど相補的なポリヌ
クレオチドを検出するためのサイトスタチンIIポリヌク
レオチドの使用にも関する。機能不全に関するサイトス
タチンIIの変異形態の検出により、サイトスタチンIIの
の過少発現、過剰発現または変化した発現による疾患
（例えば乳癌）の診断または疾患の罹患し易さの診断が
可能であろう。 【０１３１】本発明の遺伝子における変異を有する個体
は、多様な技術を用いてＤＮＡレベルで検出できる。診
断のための核酸は、以下に限られるものではないが、血
液、尿、唾液、組織生検および剖検物質などの患者の細
胞から得られる。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用しても
よいし、分析前にＰＣＲ（サイキ（Ｓaiki）ら、Ｎatur
e、３２４：１６３−１６６（１９８６））により酵素
的に増幅してもよい。同様の目的のため、ＲＮＡまたは
ｃＤＮＡもまた使用してよい。一例として、サイトスタ
チンIIをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマー
は、サイトスタチンII発現および変異を同定し分析する
のに使用することができる。例えば、欠失および挿入
は、通常の遺伝子型に比較して増幅した産物の大きさに
おける変化によって検出することができる。点突然変異
は、増幅したＤＮＡを放射性標識したＲＮＡまたは、別
法として放射性標識したアンチセンスＤＮＡ配列にハイ
ブリダイズさせることによって同定することができる。
完全にマッチした配列は、ＲＮアーゼＡ消化によるか、
または融点における差異によってミスマッチの二本鎖か
ら区別することができる。 【０１３２】参照遺伝子と変異を有する遺伝子間の配列
の相違は、直接ＤＮＡシークエンシング方法によって明
らかにされてよい。加えて、クローニングされたＤＮＡ
セグメントは特定のＤＮＡセグメントを検出するプロー
ブとして使用してよい。この方法の感度はＰＣＲと組み
合わされると非常に増強される。例えば、シークエンシ
ングプライマーは二本鎖ＰＣＲ産物または修飾したＰＣ
Ｒによって生成した一本鎖鋳型分子とともに使用され
る。該配列の決定は放射性標識したヌクレオチドによる
従来手法または蛍光標識による自動シークエンシング手
法によって行われる。 【０１３３】ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝的検査は、
変性剤を使用するかまたは使用しないゲルにおけるＤＮ
Ａ断片の電気泳動の移動度における変化の検出によって
行われる。小さな配列の欠失および挿入は高分離（high
resolution）ゲル電気泳動によって可視化することが
できる。異なる配列のＤＮＡ断片は、別々のＤＮＡ断片
が、その特異的な融点または部分的な融点に従って別個
の位置でゲルにて減速される変性ホルムアミド濃度勾配
ゲル上で区別してよい（例えば、マイヤーズ（Ｍyers）
ら、Ｓcience、２３０：１２４２（１９８５））。 【０１３４】特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮア
ーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法（例えばコッ
トン（Ｃotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９
７−４４０１（１９８５））などのヌクレアーゼ保護ア
ッセイによって明らかにされてよい。従って、特異的な
ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮア
ーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡシークエンシングま
たは制限酵素の使用（例えば、制限断片長多型（「ＲＦ
ＬＰ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロットなどの
方法により行われてよい。一層従来のゲル電気泳動およ
びＤＮＡシークエンシングに加えて、変異はまたイン・
サイチュ分析により検出することができる。 【０１３５】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、正常および異常なレベルの決定を含む、
細胞および組織中のサイトスタチンIIタンパク質のレベ
ルを検出するための定量および診断アッセイなどの診断
アッセイにも関する。従って、例えば、正常コントロー
ル組織サンプルに比較してサイトスタチンIIの過剰発現
を検出するための本発明による診断アッセイは、例え
ば、心筋梗塞の存在を検出するために使用されることが
できる。タンパク質、例えば、宿主細胞由来のサンプル
中の本発明のサイトスタチンIIタンパク質のレベルを決
定するために使用されることができるアッセイ技術は、
当業者にはよく知られている。そのようなアッセイ方法
には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエ
スタンブロット分析および好ましくはＥＬＩＳＡアッセ
イが含まれる。これらの中ではＥＬＩＳＡが好ましいこ
とが多い。ＥＬＩＳＡアッセイは最初に、サイトスタチ
ンIIに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を
調製することを含む。加えて、リポーター抗体が該モノ
クローナル抗体に対して調製される。リポーター抗体に
は放射線、蛍光またはこの例においては西洋ワサビペル
オキシダーゼ酵素など検出可能な試薬が付着される。 【０１３６】ＥＬＩＳＡアッセイを実施するため、サン
プルを宿主から除去し、該サンプル中のタンパク質を結
合する固相支持体（例えばポリスチレンディッシュ）上
でインキュベートする。ついで、該ディッシュ上の遊離
タンパク質結合部位をウシ血清アルブミンなどの非特異
的タンパク質でインキュベートすることによりカバーす
る。ついで、該モノクローナル抗体を該ディッシュでイ
ンキュベートすると、その間に該モノクローナル抗体
は、該ポリスチレンディッシュに付着したサイトスタチ
ンIIタンパク質に付着する。すべての結合していないモ
ノクローナル抗体をバッファーで洗い落とす。西洋ワサ
ビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を今度は
ディッシュに置くと、サイトスタチンIIに結合したモノ
クローナル抗体に該リポーター抗体が結合することにな
る。ついで、付着していないリポーター抗体を洗い落と
す。ペルオキシダーゼ活性（発色性（colorimetric）基
質を含む）のための試薬は、ディッシュに添加する。免
疫化したペルオキシダーゼ、第１および第２抗体を通し
てサイトスタチンIIに結合したものは、着色した反応産
物を産生する。所定の時間における発色量は、標準カー
ブに比較して、患者のサンプルの所定量中に存在するサ
イトスタチンIIタンパク質の量でなる。 【０１３７】サイトスタチンIIに特異的な抗体を固相支
持体に付着させ、標識したサイトスタチンIIおよび宿主
から得たサンプルを該固相支持体に通し、ついで該固相
支持体に付着した標識の検出量を該サンプルにおけるサ
イトスタチンIIの量に相関させることができる、競合ア
ッセイを使用してよい。 【０１３８】染色体アッセイ 本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。該配
列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して特異的に
標的化して、ハイブリダイズさせることができる。その
うえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要があ
る。実際の配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マ
ーキング試薬は、現在、染色***置をマークするのには
ほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へ
のマッピングは、それらの配列を疾患関連遺伝子と関係
づける重要な第一段階である。 【０１３９】簡単に言えば、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー(好ましくは、１５−２５bp)を調製することによ
り、配列を染色体にマップすることができる。該遺伝子
の３'非翻訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲ
ノムＤＮＡ中の１を越えるエクソンにまたがらないプラ
イマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なも
のとする。ついで、これらのプライマーを、個々のヒト
染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニン
グに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む
ハイブリッドのみが、増幅された断片を与えるであろ
う。 【０１４０】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来の断片のパネルを用いる類似の方法で達成するこ
とができる。その染色体へマップするのに同様に利用す
ることができる他のマッピング方法には、イン・サイチ
ュハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッ
ド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニン
グ、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築す
るためのハイブリダイゼーションによるプレセレクショ
ンが含まれる。 【０１４１】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
（spread）への蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーシ
ョン(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色***置を一工程
で与えることができる。この技術は、少なくとも５００
または６００塩基を有するｃＤＮＡで利用することがで
きる；しかしながら、２０００ｂｐを越える大きなクロ
ーンは、単一の検出のために十分強いシグナルで独特の
染色体の位置に結合する可能性が高い。例えば、２,０
００ｂｐは十分であり、４,０００ｂｐは一層よく、４,
０００より大きいものは、該時間の合理的なパーセント
のよい結果を得るのにはおそらく必要ではない。この技
術の概説には、ベルマ（Ｖerma）ら、ヒューマン・クロ
モソームズ（HUMAN CHROMOSOMES）：ア・マニュアル・
オブ・ベーシック・テクニクス（A MANUAL OF BASIC TE
CHNIQUES）、パガモン・プレス（Ｐergamon Ｐress）、
ニューヨーク（１９８８）を参照。 【０１４２】ある配列が正確な染色***置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、マックジック（Ｖ.ＭcＫusick）、メンデリア
ン・インヘリタンス・イン・マン（MENDELIAN INHERITA
NCE IN MAN）(ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシテ
ィー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー（JohnsHop
kins University Welch Medical Library）を介してオ
ンラインで利用できる)に見い出される。ついで、同じ
染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関
係を連鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinhe
ritance))によって確認する。 【０１４３】次に、罹患した個体と罹患していない個体
との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必
要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全て
において認められるが、いずれの正常な個体においても
認められないなら、その変異は疾患の原因となるもので
あるらしい。現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピングの解析から、疾患と関連する染色体領域に正確に
局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因とな
る遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガ
ベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子
を仮定する)。 【０１４４】免疫学的な応用 ポリペプチド、それらの断片もしくは他の誘導体、もし
くはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を
免疫原として使用して、それらに対する抗体を製造する
ことができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナ
ルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはま
た、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、
Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成
物も含まれる。当該技術分野で公知の様々な方法を、そ
のような抗体および断片の製造に使用することができ
る。 【０１４５】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。ついで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドの断片のみをコードする配列さえも、完全な天
然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用す
ることができる。ついで、そのような抗体を使用して、
そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単
離することができる。 【０１４６】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ法
（コーラー（Ｋohler，Ｇ.）およびミルシュタイン（Ｍ
ilstein，Ｃ.）、１９７５、Ｎature、２５６:４９５−
４９７)、トリオーマ(trioma)法、ヒトＢ細胞ハイブリ
ドーマ法(コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Immuno
logy Today ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体
を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法(コール
（Ｃole）ら、１９８５、モノクローナル・アンチボデ
ィーズ・アンド・キャンサー・セラピー（MONOCLONAL A
NTIBODIES AND CANCER THERAPY）、アラン・アール・リ
ス、インク（Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.）、７７−９６頁に
おいて)が含まれる。 【０１４７】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原
性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに
適合し得る。また、トランスジェニックマウスは本発明
の免疫原性ポリペプチド産生物に対するヒト化抗体を発
現するのに使用してよい。 【０１４８】 【実施例】本発明をさらに、以下の実施例に関して記載
する。実施例は、特定の態様のために参照のために本発
明を例示するためにのみ提供される。本発明のある特定
の面を例示するのであって、これらの例証は、開示され
た本発明の制限を意味したり、範囲の限定を行うもので
はない。本明細書で使用するある語句は、前記の用語集
で説明している。以下の実施例において示される部また
は量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。 【０１４９】特に断らない限り、以下の実施例における
断片の大きさの分離は、例えば、ゲッデル（Ｇoeddel）
ら、Nucleic Acids Res. ８：４０５７（１９８０）に
よって記載されるように、８％ゲルでポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(「ＰＡＧＥ」)の標準的な技術を用いて
行った。特にことわらない限り、ライゲーションは、ラ
イゲートさせるべきＤＮＡ断片のほぼ等モル量の０.５
μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)
と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げるこ
とができる。すべての実施例は、特に断って詳細に記載
しない限り、当業者によく知られており、かつ日常的で
ある標準的非技術を用いて行った。 【０１５０】実施例１ 細菌を用いたヒトサイトスタチンIIの発現および精製 寄託されたポリヌクレオチド中のヒトサイトスタチンII
をコードするＤＮＡ配列を、ヒトサイトスタチンIIタン
パク質のカルボキシル末端配列および該遺伝子の３'ベ
クター配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて増幅した。クローニングを容易にする制限
部位を含むさらなるヌクレオチドをそれぞれ５'および
３'配列に加えた。 【０１５１】５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配
列： 5' CGC GGA TCC GTG GAG GCT TTC TG 3'（配列番号３） を有し、該配列は下線を付したＢam ＨＩ制限酵素部
位、続いて、第２コドン；すなわち、推定Ｎ−末端メチ
オニンのＡＵＧの次のコドンから開始する、１４ヌクレ
オチドのヒトサイトスタチンコーディング配列を含む。 ３'プライマーは、配列： 5' CGC AAG CTT TTA TGC CTT CTC ATA GTG 3'（配列番
号４） を有し、該配列は下線を付したＨind III制限酵素部位
を含み、続いて停止コドンを含むサイトスタチンIIの最
終の６コドンに相補的な１８ヌクレオチドが続く。 【０１５２】該制限部位は、これらの実施例における細
菌発現のために使用された、細菌発現ベクター ｐＱＥ
−７０(キアゲン、インク． ９２５９ イートン・アベ
ニュー（Ｅton Ａvenue）、チャッツワース（Ｃhatswor
th）、カリフォルニア、９１３１１)上の制限酵素部位
に都合よい。ｐＱＥ−７０は、抗生物質耐性(Ａmpr)、細
菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ誘発プロモーター、リボ
ソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素
部位をコードする。pＱＥ−７０をＢam ＨＩおよびＨin
d IIIで消化し、増幅されたヒトサイトスタチンＤＮＡ
をＢamＨＩ／ＨindIII消化したベクターＤＮＡにライゲ
ーションした。ＢamＨＩ／ＨindIII制限化ベクターへの
挿入は、IPTG-誘発可能なプロモーターの下流領域をコ
ードするヒトサイトスタチンIIを配置し、ついで、翻訳
のため開始ＡＵＧとインフレームで行った。 【０１５３】ライゲーション混合物を使用して、コンピ
テント大腸菌細胞に、標準技術を用いて形質転換した。
そのような方法はサンブルックら、モレキュラー・クロ
ーニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・
スプリング・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリ
ング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）に記載され
ている。大腸菌株Ｍ１５／rep４は、プラスミドｐＲＥ
Ｐ４の多数のコピーを含み、ｌａｃリプレッサーを発現
し、カナマイシン耐性を与え（「Ｋanr」）、これは本
明細書に記載の例示的実施例を実施するのに使用した。
この株はキアゲンから市販されていて入手可能であるサ
イトスタチンIIを発現するのに適した多くのもののうち
の１つにすぎない。 【０１５４】形質転換体を、アンピシリンの存在下、そ
れらがＬＢプレートで増殖する能力により同定した。プ
ラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離して、クローニ
ングされたＤＮＡの同定は、制限分析によって確認し
た。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp（１００ug／
ml）とＫan（２５ug／ml）の両方を補ったＬＢ培地中で
の液体培養で一晩増殖させた（Ｏ／Ｎ）。 【０１５５】そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養
物を１：１００〜１：２５０の割合で播種した。細胞
が、０.４〜０.６の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.600)まで増
殖した。ついで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、最終濃度が１mＭとな
るまで加えた。引き続き、細胞をさらに３〜４時間増殖
させた。ついで、細胞を標準的な方法により、遠心分離
および破壊によって収集した。日常的な回収技術を用い
て破壊された細胞から、含有体（inclusion bodies）を
精製し、ついでタンパク質を、８Ｍ尿素中の含有体から
可溶化した。その８Ｍ尿素を、２×リン酸緩衝食塩水
（「ＰＢＳ」）に変え、ついでタンパク質を標準ＰＤ−
１０溶液中で再折り畳んだ。そのタンパク質をさらに、
サイズ排除クロマトグラフィーによって、ついで、エン
ドトキシンを除去するために、さらなるクロマトグラフ
ィーの工程によって精製した。滅菌濾過したタンパク質
調製物は、９５μｇ／ｍＬの濃度の２×ＰＢＳ中に保存
された。標準的なポリアクリルアミドゲル電気泳動方法
による調製物の分析は、該調製物が期待された分子量、
すなわち約１４ｋＤａを有する約８０％のモノマーサイ
トスタチンIIを含むことを明らかにした。 【０１５６】実施例２ 寄託されたクローン中の完全長ヒトサイトスタチンIIタ
ンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、該遺伝子の５'
および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて増幅する： ５'プライマーは、配列： 5' GC GGA TCC CGT GGA GGC TTT CTG TGC 3'（配列番号
５） を有し、該配列は下線を付したＢam ＨＩ制限酵素部
位、続いて、２−５コドンおよび図１のサイトスタチン
IIの配列のコドン６の２塩基を含む。以下に記載のとお
り、発現ベクターに挿入されたヒトサイトスタチンIIを
コードする増幅された断片の５'末端は、特に、コザッ
ク（Ｋozak，Ｍ.）、J. Mol. Biol.、１９６：９４７−
９５０（１９８７）により記載されるように、真核細胞
中の翻訳開始の有効なシグナルを提供する。 【０１５７】３'プライマーは、配列： 5' GC GGT ACC TTA TGC CTT CTC ATA GTG 3'（配列番号
８） を有し、該配列は下線を付したＡsp７１８制限部位を含
み、続いて停止コドンに相補的であるヌクレオチドおよ
び図１のサイトスタチンIIｃＤＮＡの最終の５アミノ酸
のコドンが続く。増幅された断片は１％アガロースゲル
から市販されており入手可能なキット（「ジーン・クリ
ーン（Ｇeneclean）」、バイオ（ＢＩＯ)１０１インク
(Ｉnc.）、ラ・ホラ（Ｌa Ｊolla）、カリフォルニア）
を用いて単離する。ついで、該断片をＢamＨＩおよびＡ
sp７１８で消化し、再度１％アガロースゲル上で精製す
る。この断片を本明細書ではＦ２と称する。 【０１５８】該ベクターｐＡ２−ＧＰを、サマーズ（Ｓ
ummers）ら、ア・マニュアル・オブ・メソッド・フォー
・バキュロウイルス・ベクターズ・アンド・インセクト
・セル・カルチャー・プロシーデュアーズ（A MANUAL O
F METHODS FOR BACULOVIRUSVECTORS AND INSECT CELL C
ULTURE PROCEDURES）、テキサス・アグリカルチュアル
・エクスパーリメンタル・ステーション（Texas Agricu
ltural ExperimentalStation Blletin）第１５５５号
（１９８７）に記載されるように標準方法を用いてバキ
ュロウイルス発現系においてサイトスタチンIIタンパク
質を発現するのに使用する。この発現ベクターは、便利
な制限部位が続く、Autgrapha californica 核ポリヘド
ロシスウイルス(ＡｃＭＮＰＶ）の強ポリヘドリンプロ
モーターを含む。ＡｃＭＮＰＶgp６７のシグナルペプチ
ドは、Ｎ−末端メチオニンを含むが、ＢamＨＩ部位の上
流にちょうど位置する。シミアンウイルス４０（「ＳＶ
４０」）は、有効なポリアデニル化に使用される。組換
えウイルスの容易な選択のために大腸菌からのβ−ガラ
クトシド遺伝子をポリへドリンプロモーターと同じ方向
で挿入し、後にポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シ
グナルが続く。そのポリヘドリン配列はクローニングさ
れたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを
産生するための野生型ウイルスＤＮＡを有する細胞媒介
類似組換え体のウイルス配列によって両側をフランキン
グする。 【０１５９】他の多くのバキュロウイルスがｐＡ２−Ｇ
Ｐの代わりに、例えばｐＡｃ３７３、ｐＬＶ９４１およ
びｐＡｃＩＭ１などを使用することができる。そのよう
なベクターは、とりわけラッコウ（Ｌuckow）ら、Ｖiro
logy １７０：３１−３９に記載されている。そのプラ
スミドを制限酵素ＢamＨＩおよびＡsp７１８で消化し、
ついで、ウシ腸ホスファターゼを用いて、当該技術分野
において日常的な方法を用いて脱リン酸化する。ついで
ＤＮＡを１％アガロースゲルから市販されており入手可
能なキット（「ジーン・クリーン」、バイオ１０１イン
ク、ラ・ホラ、カリフォルニア）を用いて単離する。こ
の断片を本明細書ではＶ２と称する。 【０１６０】断片Ｆ２および脱リン酸化したプラスミド
Ｖ２をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて一緒にライゲーショ
ンする。大腸菌ＨＢ１０１細胞をライゲーションミック
スを用いて形質転換して、培養皿に撒く。細菌をＢamＨ
ＩおよびＡsp７１８を用いて個々のコロニーからのＤＮ
Ａを消化してヒトサイトスタチンIIを有するプラスミド
を含むことを確認し、ついでゲル電気泳動によって消化
産物を分析する。クローニングされた断片の配列をＤＮ
Ａシークエンシングにより確認する。このプラスミドを
本明細ではｐＢacＣytostatin IIと称する。 【０１６１】リポフェクション法(フェロナー（Ｆelone
r）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８４：７４１３
−７４１７（１９８７）)を利用して、プラスミド pＢa
cＣstostatine II ５μgを市販の線形化バキュロウイル
ス(「BaculoGoldTM バキュロウイルス ＤＮＡ」、ファ
ーミンゲン（Ｐharmingen）、サン・ディエゴ（ＳanＤi
ego）、カリフォルニア)１.０μgと共に同時トランスフ
ェクションする。 【０１６２】BaculoGoldTM ウイルス ＤＮＡ １μgおよ
びプラスミド pＢacＳＣＧＦ ５μgを、無血清グレイス
(Ｇrace's)培地(ライフ・テクノロジーズ・インク（Lif
e Technologies Inc.）、ゲイザーズバーグ（Ｇaithers
burg）、メリーランド)５０μlを含むマイクロタイター
プレートの無菌ウェル中で混合する。その後、リポフェ
クチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを
加え、混合して、室温で１５分間インキュベートする。
ついで、トランスフェクション混合物を、無血清グレイ
ス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種し
たＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴加す
る。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた
溶液を混合する。ついで、そのプレートを２７℃で５時
間インキュベートする。５時間後、そのトランスフェク
ション溶液をプレートから除去して、１０％ ウシ胎児
血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加える。そのプレ
ートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養
し続ける。 【０１６３】４日後、上清を集めて、サマーズおよびス
ミス(上記)により記載されたようにして、プラークアッ
セイを行う。変法として、「Ｂlue Ｇal」(ライフ・テ
クノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)を含むアガ
ロースゲルを使用したが、このことにより、青色に染色
されたプラークを容易に単離することが可能となる。
(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞
培養に関する利用者のガイド、およびライフ／テクノロ
ジーズ・インク、ゲイザーズバーグにより配布されたバ
キュロウイルス学、９−１０頁にも見出すことができ
る)。 【０１６４】４日後、連続希釈のウイルスを細胞に加え
て、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペッ
トの先端で採取する。ついで、組換えウイルスを含む寒
天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフチ
ューブ内で再懸濁させる。その寒天を短時間の遠心分離
により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清
を、３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに
使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集した
後、４℃で保存する。適切に挿入されたサイトスタチン
IIを、制限マッピングおよびシークエンシングを含むＤ
ＮＡ分析によって同定する。これを本明細書ではＶ−サ
イトスタチンと称する。 【０１６５】Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを
補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多
重度(ＭＯＩ) ２で組換えバキュロウイルス Ｖ−サイト
スタチン IIを感染させる。６時間後、その培地を除去
して、メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９０
０ II 培地(ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザ
ーズバーグ)に替える。４２時間後、５μＣiの35Ｓ−メ
チオニンおよび５μＣiの35Ｓ システイン５μＣi(アマ
シャム(Amersham))を加える。その細胞をさらに１６時
間インキュベートした後、それらを遠心分離により収集
して、標識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオ
ートラジオグラフィーにより可視化する。 【０１６６】実施例３ ＣＯＳ細胞におけるヒトサイトスタチンIIの発現 発現プラスミド、Ｃytostatin II ＨＡは以下を含むベ
クターpcＤＮＡＩ／Ａmp（インビトロゲン（Invitroge
n）由来である：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシ
リン耐性遺伝子、３）大腸菌複製起点、４）ポリリンカ
ー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニレーショ
ン部位が続くＣＭＶプロモーター。サイトスタチンII前
駆体全体をコードするＤＮＡ断片および３'端にインフ
レームで融合するＨＡタグをそのベクターのポリリンカ
ー領域にクローニングし、それゆえ、その組換えタンパ
ク質発現をＣＭＶプロモーターの下で行う。そのＨＡタ
グは、以前に記載したように（ウィルソン（Ｗilson）
ら、Ｃell ３７：７６７（１９８４））、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに一致す
る。ＨＡタグの我々の標的タンパク質への注入によりＨ
Ａエピトープを認識する抗体を有する組換えタンパク質
の検出を容易にする。 【０１６７】そのプラスミドの構築策は以下に記載する
とおりである：寄託されたクローンのサイトスタチンII
をコードするＤＮＡ配列を２つのプライマーを用いて元
々のＥＳＴクローニングに関してＰＣＲによって構築す
る。５'プライマーは、 5' GCGC GGATCC GCC ACC ATG GTG GAG GCT TTC TGT 3'
（配列番号６） であり、下線を付したＢamＨＩ部位を生み、続いて開始
コドンから出発するサイトスタチンIIコーディング配列
の８ヌクレオチドを含む。３'配列は、 5' GCGC TCTAGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG
GTA TGC CTT ATA GTG 3'（配列番号７） であり、下線を付したＸbaＩ部位、翻訳終結コドン、Ｈ
ＡタグおよびサイトスタチンIIコーディング配列の最終
の１２ヌクレオチド（終止コドンを含まない）を含む。
それゆえ、そのＰＣＲ産物はＨindIII部位およびインフ
レームで融合したＨＡタグが続くサイトスタチンIIコー
ディング配列、ＨＡタグに隣接する翻訳終結コドンおよ
びＸbaＩ部位を含む。 【０１６８】そのＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片およびベク
ターpcＤＮＡＩ／ＡmpをＨindIIIおよびＸbaＩ制限酵素
で消化してライゲーションする。そのライゲーション混
合物を大腸菌株ＳＵＲＥ（ストラタジーン・クローニン
グ・システムズ、１１０９９ノース・トーレイ・パイン
ズ・ロード（North Torrey Pines Roard）、ラ・ホラ、
カリフォルニア ９２０３７）に形質転換して、その形
質転換した培養物をアンピシリン培地プレートにプレー
ティングし、ついで耐性コロニーを選択する。プラスミ
ドＤＮＡを形質転換体から単離し、ついで正確な断片の
存在のために制限分析によって試験する。 【０１６９】組換えサイトスタチンIIの発現のため、Ｃ
ＯＳ細胞を例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（サンブ
ルック、フィリッチ（Ｅ．Ｆritsch）、マニアチス
（Ｔ．Ｍaniatis）、モレキュラー・クローニング：ア
・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・
ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク（１９８９））に記載されるような方
法を用いて発現ベクターでトランスフェクションする。
サイトスタチンII ＨＡ融合タンパク質の発現を、例え
ば、ハーロウ（Ｅ．Ｈarlow）、レーン（Ｄ．Ｌane）、
アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス、（１９８８）に記載される方法を用いて、放射線標
識および免疫沈降法により検出する。２日間のトランス
フェクションの後、35Ｓ−システインで８時間標識す
る。ついで培養培地を回収し、その細胞を界面活性剤
（ＲＩＰＡバッファー（１５０mＭ ＮaＣl、１％ ＮＰ
−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０.５％
ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ７.５）にて溶解する（ウ
ィルソンら、上記）。細胞リゼイトおよび培養培地の両
者をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈澱させる。沈澱
したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にて
分析し、その結果は期待された大きさの発現産物を示
す。 【０１７０】実施例４ ヒト組織におけるサイトスタチンIIの発現のレベルを調
べるため、とりわけ、サンブルックら（上記に引用）に
よって記載される方法を用いてノーザンブロット分析を
行った。総細胞ＲＮＡサンプルをＲＮＡzolTMＢシステ
ム（バイオテックス・ラボラトリーズ・インク（Biotec
x Laboratories, Inc.）６０２３ サウス・ループ・イ
ースト（South Loop East）、ヒューストン、テキサス
７７０３３）で単離した。特定の各ヒト組織から単離し
た総ＲＮＡの約１０μgを１％ アガロースゲル上で分離
した。そのゲルをナイロンフィルター完全長サイトスタ
チンII遺伝子にブロットし、標識されたポリヌクレオチ
ドプローブにハイブリダイズさせた。その標識反応は、
５０ｎgのＤＮＡ断片とともにストラタジーンプライム
−イット キット（Stratagene Prime-It kit）に従って
行った。標識したＤＮＡをＳelect−Ｇ−５０カラムで
精製した。（５ プライム−３ プライム、インク、ブル
ダー（Ｂoulder）、コロラド）。ついで、フィルターを
放射性標識したサイトスタチンII遺伝子の全長と０.５
Ｍ ＮaＰＯ4、ｐＨ７.４および７％ ＳＤＳ中で１,００
０,０００cpm／mlで６５℃で一夜ハイブリダイズさせ
た。室温で２回洗浄した後、６０℃で０.５×ＳＳＣ、
０.１％ＳＤＳで２回洗浄し、ついでフィルターを増感
紙で−７０℃で一晩露光させた。サイトスタチンIIのｍ
ＲＮＡは脳に豊富である。 【０１７１】実施例５ 遺伝子治療を介する発現 線維芽細胞を皮膚生検により被験体より得る。得られた
組織を組織培養培地中に置き、ついで小片に分ける。そ
の組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表面に置く
（各フラスコに約１０片の塊を置く）。該フラスコを上
下ひっくり返し、固く閉め、室温にて一晩放置する。室
温で２４時間後、該フラスコを逆さにし、ついで組織の
塊はフラスコの底に固定したままにし、ついで、１０％
ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む新
しい培地（例えば、ハムＦ１２培地（Ｈam's Ｆ１２ me
dia））を添加する。ついでこれを３７℃で約１週間イ
ンキュベートする。このとき、新しい培地を添加し引き
続き数日毎に変える。さらに２週間の後、培養液中に線
維芽細胞の単層が現れる。その単層をトリプシン処理し
ついでさらに大きなフラスコに合わせて調整する。 【０１７２】遺伝子療法のためのベクターは発現される
べき断片をクローニングする制限酵素で消化する。消化
されたベクターは、自己ライゲーションを防ぐためにウ
シ腸ホスファターゼで処理する。脱リン酸化され、線形
化したベクターをアガロースゲル上で画分して精製す
る。 【０１７３】活性化サイトスタチンIIを発現することが
できるサイトスタチンｃＤＮＡを単離する。その断片の
末端は必要であれば就職されて、ベクターにクローニン
グされる。例えば、５'オーバーハンギング（overhangi
ng）は、平滑末端をつくるＤＮＡポリメラーゼで処理さ
れることができる。３'オーバーハンギング末端はＳ１
ヌクレアーゼを用いて除去することができる。リンカー
はＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて平滑末端にライゲーショ
ンすることができる。 【０１７４】モロニーマウス肉腫ウイルスの線形骨格お
よびサイトスタチンII断片の等量を混合し、Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させる。ライゲーション混合物
を大腸菌を形質転換するために使用し、ついで該菌をカ
ナマイシン含有アガー上に播種する。カナマイシン表現
型および制限分析は、ベクターが適当に挿入された遺伝
子を含むことを確認する。 【０１７５】パッケージング細胞を、１０％ 仔ウシ血
清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有
するダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modifie
d Eagles Medium）（ＤＭＥＭ）中で全面密度になるま
で組織培養中で増殖させる。サイトスタチンII伝子を有
するベクターを標準技術を用いてパッケージング細胞に
導入する。パッケージング細胞は、サイトスタチンII遺
伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パッケージ
ング細胞を以後、プロデューサー細胞という）。 【０１７６】新しい培地を形質導入したプロデューサー
細胞に添加し、引き続き培地をプレート全面のプロデュ
ーサー細胞から回収する。感染性ウイルス粒子を含む培
地をミリポアフィルターで濾過して分離したプロデュー
サー細胞を除去した。ついで濾過した培地を線維芽細胞
を感染させるのに使用する。培地を線維芽細胞のサブ全
面プレートから除去し、濾過した培地とすばやく取り替
える。ポリブレン(アルドリッチ（Ａldrich）)を培地に
導入してトランスダクションを容易にする。適当なイン
キュベーションの後、その培地を除去し、ついで新鮮培
地と取り換える。ウイルス力価が高い場合、本質的にす
べての線維芽細胞が感染し、選択は一切必要ないであろ
う。力価が非常に低い場合は、拡大のためにトランスデ
ュースされた細胞を選択するため、ｎｅｏまたはｈｉｓ
などの選択可能なマーカーを有するレトロウイルスベク
ターを使用する必要がある。 【０１７７】操作された線維芽細胞を、単独またはサイ
トデックス３ミクロキャリアビーズ（cytodex 3 microc
arrier beads）などの微小担体上全面に増殖した後に、
宿主に注入する。注入された線維芽細胞はサイトスタイ
ンIIタンパク質産物を産生し、ついで該タンパク質の生
物学的な作用を宿主に付与する。特に前記の明細書およ
び実施例中以外にも、本発明が実施されることができる
ことは明らかである。先の教示から見て、本発明の多数
の変更および変化が可能であることから、追記する請求
の範囲内で、詳しく記載した以外に、本発明を行うこと
ができる。 【０１７８】 SEQUENCE LISTING <110> Human Genome Sciences, Inc. <120> Cytostatin II <130> 185645 <160> 8 <210> 1 <211> 731 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (16)...(411) <400> 1 ggggaaaggg caagg atg gtg gag gct ttc tgt gct acc tgg aag ctg acc 51 Met Val Glu Ala Phe Cys Ala Thr Trp Lys Leu Thr 1 5 10 aac agt cag aac ttt gat gag tac atg aag gct cta ggc gtg ggc ttt 99 Asn Ser Gln Asn Phe Asp Glu Tyr Met Lys Ala Leu Gly Val Gly Phe 15 20 25 gcc act agg cag gtg gga aat gtg acc aaa cca acg gta att atc agt 147 Ala Thr Arg Gln Val Gly Asn Val Thr Lys Pro Thr Val Ile Ile Ser 30 35 40 caa gaa gga gac aaa gtg gtc atc agg act ctc agc aca ttc aag aac 195 Gln Glu Gly Asp Lys Val Val Ile Arg Thr Leu Ser Thr Phe Lys Asn 45 50 55 60 acg gag att agt ttc cag ctg gga gaa gag ttt gat gaa acc act gca 243 Thr Glu Ile Ser Phe Gln Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Thr Thr Ala 65 70 75 gat gat aga aac tgt aag tct gtt gtt agc ctg gat gga gac aaa ctt 291 Asp Asp Arg Asn Cys Lys Ser Val Val Ser Leu Asp Gly Asp Lys Leu 80 85 90 gtt cac ata cag aaa tgg gat ggc aaa gaa aca aat ttt gta aga gaa 339 Val His Ile Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Asn Phe Val Arg Glu 95 100 105 att aag gat ggc aaa atg gtt atg acc ctt act ttt ggt gat gtg gtt 387 Ile Lys Asp Gly Lys Met Val Met Thr Leu Thr Phe Gly Asp Val Val 110 115 120 gct gtt cgc cac tat gag aag gca t aaaaatgtcc ctggtcgggg 432 Ala Val Arg His Tyr Glu Lys Ala 125 130 cttggaagag ctcttcagtt tttctgtttc ctcaagtctc agtgctatcc tattacaaca 492 tggctgatca ttaattagaa ggttatcctt ggtgtggagg tggaaaatgg tgatttaaaa 552 acttgttact ccaagcaact tgcccaattt taatctgaaa atttatcatg ttttataatt 612 tgaattaaag ttttgtcccc cccccctttt ttttataaac aagtgaatac attttataat 672 ttcttttgga atgtaaatca aatttgaata aaaatcttac acgtgaaaaa aaaaaaaaa 731 <210> 2 <211> 132 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Val Glu Ala Phe Cys Ala Thr Trp Lys Leu Thr Asn Ser Gln Asn 1 5 10 15 Phe Asp Glu Tyr Met Lys Ala Leu Gly Val Gly Phe Ala Thr Arg Gln 20 25 30 Val Gly Asn Val Thr Lys Pro Thr Val Ile Ile Ser Gln Glu Gly Asp 35 40 45 Lys Val Val Ile Arg Thr Leu Ser Thr Phe Lys Asn Thr Glu Ile Ser 50 55 60 Phe Gln Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Thr Thr Ala Asp Asp Arg Asn 65 70 75 80 Cys Lys Ser Val Val Ser Leu Asp Gly Asp Lys Leu Val His Ile Gln 85 90 95 Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Asn Phe Val Arg Glu Ile Lys Asp Gly 100 105 110 Lys Met Val Met Thr Leu Thr Phe Gly Asp Val Val Ala Val Arg His 115 120 125 Tyr Glu Lys Ala 130 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cgcggatccg tggaggcttt ctg 23 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cgcaagcttt tatgccttct catagtg 27 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gcggatcccg tggaggcttt ctgtgc 26 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gcgcggatcc gccaccatgg tggaggcttt ctgt 34 <210> 7 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gcgctctaga tcaagcgtag tctgggacgt cgtatgggta tgccttatag tg 52 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gcggtacctt atgccttctc atagtg 26
定されたポリヌクレオチド、およびポリペプチドに関す
る；該ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの変異体および誘導体；該ポリヌクレオチ
ドおよび該ポリペプチドおよびその変異体および誘導体
の製造方法；該ポリペプチドのアゴニストおよびアンタ
ゴニスト；および該ポリヌクレオチド、ポリペプチド、
変異体、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストの使
用に関する。とりわけ、これらおよび他の点において、
本発明は、ヒトサイトスタチンIIに関する。 【０００２】 【従来の技術】細胞の増殖および分化および組織および
腺の成長は、自己分泌および傍分泌因子、増殖因子など
のようにホルモンの作用を調節または媒介し、それ自体
でホルモンであるものにより制御される。例えば、局所
的に増殖を中止させるシグナルを出し、ついで増殖途中
の上皮の細胞の分化を刺激するペプチドは乳腺の発達に
非常に有効である。これらの因子は、特にヒトにおいて
は同定または特徴つけられることはめったにない。 【０００３】組織および腺、特に乳腺中の細胞の増殖の
液体培地中で役割を果たす少しの因子は非ヒト生物体中
において同定されている。そのような因子は乳腺由来増
殖阻害剤（「ＭＤＧＩ」）であり、少なくともマウスと
ウシにおいては、上皮細胞増殖を抑制し、および上皮細
胞の分化を刺激する。ＭＤＧＩは最初にウシの乳および
乳腺中において単離されていた。続いて、該ペプチドを
マウス中において同定された。 【０００４】ＭＤＧＩは翻訳後の工程の別経路によって
少なくとも２つの形態において存在する。元来の形態は
ＭＤＧＩとして呼ばれて存在し、ついで第２形態はＭＤ
ＧＩ−２と呼ばれるものである。ＭＤＧＩは乳脂肪小球
膜（「ＭＦＧＭ」）に主に結合し、抗ＭＤＧＩ抗体を用
いて免疫学的アッセイにより評価される。類似の時間経
過実験はＭＤＧＩが運搬に従い、授乳開始で劇的に乳腺
中で増加することを示すＭＤＧＩ−２はこの点において
ＭＤＧＩと異なっている。該ＭＤＧＩ−２は授乳期では
なく妊娠期に乳腺において見い出される。 【０００５】ＭＤＧＩの２つの形態の役割および作用の
機構は明らかには定義されていない。マウスおよびウシ
ＭＤＧＩは互いに類似しており、低分子量親水性リガン
ド結合性タンパク質（「低分子量ＨＬＢＰ」）であり、
それには、脳、心臓、肝臓および腸由来の脂肪酸結合タ
ンパク質（「ＦＡＢＰ」）ｐ４４２と呼ばれるガストロ
ピンなる脂肪細胞の分化関連タンパク質および細胞性レ
チノイン酸結合タンパク質（「ＣＲＡＢＰ」）を含む。
これらのタンパク質は、長鎖脂肪酸、レチノイドおよび
エイコンサノリド（eiconsanolid）などの親水的に結合
し、脂肪酸および脂肪酸誘導体の輸送、隔離または代謝
において役割を果たすと考えられている。しがしがら、
それらは分化において特異的なやり方で乳腺、心臓、肝
臓、脳および腸の細胞において発現し、それらは基礎代
謝において役割を果たすのみならず、分化および増殖に
おいても重要な役割を有するようである。 【０００６】ＭＤＧＩの低分子量ＨＬＢＰｓに対するホ
モロジーはＭＤＧＩは少なくともその機能の一部におい
て、親水性リガンドに結合し、ついでこのリガンドへの
結合は、ＭＤＧＩが細胞の増殖を抑制し、分化を刺激す
ることによって該メカニズムにとって重要である；ガス
トロピンを除く他のすべての低分子量ＨＬＢＰｓは細胞
内で作用するが、ＭＤＧＩはイン・ビトロで細胞外で作
用する。 【０００７】低分子量ＭＬＢＰにおいて、ＭＤＧＩは、
脂肪酸結合タンパク質（「ＦＡＢＰ」）に密接に類似す
る。ＦＡＢＰは脳、心臓、肝臓および腸において同定さ
れている。心臓ＦＡＢＰはＭＤＧＩのように、天然資源
から産生されるかまたは、異種宿主中のクローニングさ
れた遺伝子の発現によって産生され、マウス起源の正常
乳腺上皮細胞（「ＭＥＣ」）の増殖を阻害する。さら
に、該ＦＡＢＰは乳タンパク質合成を刺激し、それ自身
のこれらの細胞中での発現を刺激する。しかしながら、
ウシ心臓ＦＡＢＰのようではなく、ウシＭＤＧＩは脂肪
酸に結合しなかった。これらの２つのタンパク質は互い
に９５％類似であったが結合しなかった。心臓ＦＡＢＰ
は実際、ＭＤＧＩの形態であってよいことが示唆され
る。従って、たとえＤＧＩが低分子量ＨＬＢＰであると
しても、その基質アフィニティーがそのファミリー内の
密接な関係物とは全く異なるが、それゆえ、それは異な
る生理学的役割を果たすようである。 【０００８】イン・ビボにおいてＭＤＧＩは、マウスま
たはウシにおける毛細血管内皮細胞および乳腺実質中で
見いだされる。ＭＤＧＩは、最初に毛細血管内皮細胞に
現れ、後に分泌上皮細胞において現れる。乳腺毛細血管
内皮細胞中のＭＦＧＩの局在は、内皮細胞増殖を調節す
る役割と一致する。 【０００９】多くのＭＤＧＩの関係物は、イン・ビトロ
で証明されている。例えば、新生児ラット心臓細胞のベ
ータアドレナリン刺激に対するＬ（＋）−酪酸−、アラ
キドン酸−および１５−Ｓ−ヒドロキシエイコサテラエ
ノイン酸−誘発超感受性が示されてる。その誘発された
過剰感受性は、β２−アドレナリン受容体の小集団によ
って媒介され、それゆえ、ＭＤＧＩがこれらの受容体の
成城機能を邪魔することが示唆されている。これらの受
容体との相互作用は、ＭＤＧＩが細胞の増殖を阻害する
ことによって、そのメカニズムの一部でもある。この活
性はまた、ＭＤＧＩはもともと心臓筋肉細胞のβ−アド
レナリン感受性を天然において調節している。 【００１０】乳腺上皮細胞（「ＭＥＣ」）へのＭＤＧＩ
の効果は、さらに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドを用いてアンチセンス阻害実験によってさらに示さ
れている。これらの実験はＭＤＧＩアンチセンス分子は
β−カゼインレベルを低減させ、組織培養中の肺胞末端
芽（alveolar end buds）の出現を抑圧する。さらに、
ＭＤＧＩは上皮増殖因子のマイトジェン効果を抑圧す
る。ＭＤＧＩは乳腺分化を促進させる最初に公知の増殖
阻害剤である。ＭＤＧＩの調節特性は完全に１１−アミ
ノ酸配列によって模擬されることができ、それはＭＤＧ
Ｉのカルボキシル末端および低分子量ＨＬＢＰのサブフ
ァミリーにおいて代表される。 【００１１】乳腺上皮細胞株すべてではないが、同様に
ＭＤＧＩに応答する。ＭＤＧＦは、正常ヒトＭＥＣの増
殖を抑制し、時間の長さを変化させるよう経過する。そ
れはまたマウス乳癌上皮細胞株ｍＭａＣａ２０１７７の
増殖を阻害し、ヒト悪性腫瘍乳腺細胞株ＭａＴｕおよび
Ｔ４７Ｄおよびそれはイン・ビトロの静止エールリッヒ
腹水癌細胞（「ＥＡＣ」）の増殖の続行を阻害する。逆
に、ＭＤＧＦは、わずかにヒト悪性腫瘍乳腺上皮細胞株
ＭＣＦ７の増殖を刺激する。最終的に、ＭＤＧＩはマウ
ス多分化能胎児幹細胞の分化を促進する。 【００１２】ＭＤＧＩの細胞への影響のメカニズムはい
まなお知られていない。イン・ビトロにおける静止エー
ルリッヒ腹水癌細胞（「ＥＡＣ」）の増殖の続行は、細
胞性ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｒａｓ ｍＲＮＡに
おいて急激に増殖することによって達成される。ＭＤＧ
Ｉにさらしたこれらの遺伝子の急激な誘発は増殖調節に
対する癌遺伝子の発現の重要性をはっきり示し、ついで
細胞増殖とｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｒａｓの発現
との間に正の相関があることを示している。さらに、こ
れらの遺伝子の発現へのＭＤＧＩの影響はそれが、直接
または１またはそれ以上のシグナル経路を介してかまた
はその両者であれ、細胞性前癌遺伝子の正のエフェクタ
ーであることを示している。 【００１３】ＭＤＧＩは、可能性のある腫瘍抑圧遺伝子
として機能することができることも示されている。ＭＤ
ＧＩ発現構築物でトランスフェクションしたヒト乳癌細
胞は分化した形態、増殖速度の減少、軟アガーにおける
減少したクローン産生度、およびヌードマウス中の減少
した腫瘍産生度を示す。この遺伝子のヒトホモログは染
色体１ｐ３３−３５にマッピングされ、以前示された遺
伝子座はヒト乳癌(腫瘍の約４０％)の異種性(heterozyg
osity)の頻繁な損失を示す。ＭＤＧＩのイン・ビボおよ
びイン・ビトロ腫瘍サプレッサー活性の大きさは、ＢＲ
ＣＡ１、ｐ５３、ＲｂおよびＨ１９に関して以前に観察
されたものと比較することができる。 【００１４】 【発明が解決しようとする課題】ＭＤＧＦの細胞増殖お
よび分化への影響および細胞性前癌遺伝子発現の発現へ
の影響は異常な細胞増殖、機能不全および疾患での細
胞、組織、腺および器官ならびにその役割の重要性を繰
り返す。明らかに、正常および異常な細胞増殖および分
化を調節する因子の必要性がある。それゆえ、正常およ
び疾患状態の両者において細胞増殖および分化を調節す
るような因子の同定および特徴付けの必要性がある。特
に、成長過程および成熟ヒト女性の乳腺などの適切な成
長および組織および器官の健康に不可欠である、上皮細
胞、特に乳腺上皮細胞などの細胞増殖および分化を調節
するサイトスタチンを単離し、同定する必要性がある。 【００１５】 【課題を解決するための手段】これらの目的および他の
目的のため、特に、ＭＤＧＩなどの公知のサイトスタチ
ンに対するホモロジーにより新規なサイトスタチンであ
ると同定された、図１に示されたアミノ酸配列のポリペ
プチドを提供することは本発明の目的である。さらに、
サイトスタチンをコードするポリヌクレオチド、特に本
明細書においてサイトスタチンIIと称するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供することが本発明
の目的である。 【００１６】本発明のこの局面の特に好ましい態様にお
いて、該ポリヌクレオチドは図１に示される配列または
ＡＴＣＣ受託番号第９７２８７号におけるｃＤＮＡ（本
明細書において寄託したクローンという）におけるヒト
サイトスタチンIIをコードする領域を含む。本発明のこ
の局面により、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡを含むヒトサイトスタチンIIをコードする単離され
た核酸分子を提供し、本発明のこの局面のさらなる態様
において、生物学上、診断上、臨床上または治療上有用
な変異体、類似体および誘導体の断片を含む、変異体、
類似体またはその誘導体、またはその断片を提供する。
本発明のこの局面の特に好ましい態様は、ヒトサイトス
タチンIIの天然に存在するアレル変異体である。 【００１７】上皮細胞の増殖活性を調節するサイトスタ
チンIIポリペプチド、特にヒトサイトスタチンIIポリペ
プチドを提供することは、本発明の目的である。本発明
のこの局面により、本明細書中でサイトスタチンIIとい
うヒト起源の新規ポリペプチドならびに生物学上、診断
上または治療上有用な断片、変異体、ホモログ、類似体
およびその誘導体を提供する。本明細書の特に好ましい
態様はヒトサイトスタチンII遺伝子の天然に存在するア
レルによりコードされるヒトサイトスタチンIIの変異体
である。 【００１８】上記のポリペプチド、ポリペプチド断片、
変異体、類似体、誘導体およびその断片を調製する方法
を提供することが本発明の他の目的である。本発明のこ
の局面の好ましい態様において、宿主内でヒトサイトス
タチンIIの発現の条件下で、外在的に由来するヒトサイ
トスタチンIIをコードするポリヌクレオチドを発現上組
み込ませる宿主細胞を培養し、ついで発現されたポリペ
プチドを回収することを含む、上記のサイトスタチンII
をポリペプチドを調製する方法を提供する。 【００１９】上記ポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ド、特に生物学的、臨床上および治療上の目的を利用す
るための産物、組成物、工程および方法を提供すること
が他の目的である。本明細書のこの局面の好ましい態様
により、他のもの；例えば、イン・ビトロ、エクス・ビ
ボまたはイン・ビボにおいて細胞増殖を調製すること；
タンパク質またはｍＲＮＡを決定することにより細胞中
のサイトスタチンII発現を査定する；およびサイトスタ
チンII遺伝子中の欠失などの遺伝子変異および異常のア
ッセイ、の方法を提供する。本発明の他の局面のある好
ましい態様において、ヒトサイトスタチンIIに特異的に
ハイブリダイズするプローブを提供する。 【００２０】本発明のさらに好ましい態様において、サ
イトスタチンIIポリペプチドに対する抗体を提供する。
この点で特に好ましい態様において、該抗体はヒトサイ
トスタチンIIに非常に選択的である。本発明の他の局面
において、サイトスタチンII受容体に結合し、かつサイ
トスタチンII誘発応答を引き出す、サイトスタチンIIを
模擬するようなサイトスタチンIIアゴニストを提供す
る。そのようなアゴニストにおいて、サイトスタチンII
または他のモジュレーターまたは受容体と相互作用し、
かつそれによってヒトサイトスタチンIIの効果が可能に
なる。 【００２１】本発明のさらに別の局面により、サイトス
タチンII受容体に結合し、しかしサイトスタチンII誘発
応答を引き出さず、その効果を阻害するようにヒトサイ
トスタチンIIと相互作用するものを提供する。該アゴニ
ストおよびアンタゴニストは、例えばそのようなポリペ
プチドの作用を模擬する、増大するまたは阻害するため
に使用することができ、ついでそれらはサイトスタチ
ン、特に、サイトスタチンIIによって影響された細胞の
異常増殖と関連した障害の治療において使用することが
できる。 【００２２】本発明の他の目的、特徴、利点および局面
は以下の記載から当業者には明らかとなるであろう。し
かしながら、以下の記載および具体的な実施例は本発明
の好ましい態様を示しているが、それは例示のためにの
みであることを理解すべきである。開示された発明の精
神および範囲内での多様な変更および改変は、以下の記
載を読み、本開示の他の部分を読むことから当業者には
容易に明らかとなるであろう。 【００２３】用語集 以下の例示的説明は、本明細書で頻繁に使用される、特
に実施例中で使用されるある語句の理解を容易にするこ
とを提供する。該説明は便宜を提供するものであって、
本発明に制限を加えるものではない。ＤＮＡの「消化」
は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素で、ＤＮ
Ａを触媒開裂することを示す。本明細書中でいう多様な
制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子
および他の必要条件は、当業者に公知でかつ日常的であ
るように使用した。分析目的には、典型的に、バッファ
ー溶液約２０μｌ中、１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ
断片を約２単位の酵素と共に消化する。プラスミド構築
のためのＤＮＡ断片を単離する目的には、正比例的によ
り多量の容積中、一般にＤＮＡ５〜５０μｇを２０〜２
５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当なバ
ッファーおよび基質量は、以下に参照する標準実験マニ
ュアルおよび市販の提供者によって明らかにされてい
る。３７℃で１時間のインキュベーション時間が通常利
用されるが、その条件は、供給者の指示およびその反応
の項目に従って変えてもよい。消化後、その反応物をポ
リアクリルアミドゲル上で直接電気泳動し、分析または
所望の断片の単離またはその両方を行う。 【００２４】遺伝子要素は、一般に、ポリペプチドまた
は宿主細胞内のポリペプチドの発現に重要な転写または
翻訳または他のプロセスを調節する領域またはポリペプ
チドまたは発現を調節する領域をコードする領域両方を
含むポリヌクレオチドを意味する。遺伝子要素は、エピ
ソーム要素として複製されるベクター内に含まれること
ができる；すなわち、宿主細胞ゲノムから生理学的に独
立した分子である。それらは真核細胞中のメトトレキセ
ート選択によとてトランスフェクションされたＤＮＡの
増幅の間に生じる微小染色体内に含まれる。遺伝的要素
はまた、宿主細胞ゲノム内に含まれることができる；そ
の天然の状態ではなく、むしろ単離、クローニングおよ
び精製したＤＮＡまたはベクターなどの形態の宿主細胞
への導入などの操作であってよい。 【００２５】「単離された」とは、物質がその元の状態
を変えられた；例えば、それが天然に存在するなら、そ
の主との環境から除去されていることをいう。例えば、
生存動物中にある天然に存在するポリヌクレオチドまた
はアポリペプチドは「単離されて」いないが、天然の系
における共存物質のいくつかまたはすべてから分離され
た同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細
書で使用するように「単離されて」いる。 【００２６】単離の一部として、またえは単離後の一部
として、そのようなポリヌクレオチドは変異原発生のた
めに、ついで例えば、宿主中の繁殖または発現のために
他のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡｓなどと結合し
て、融合タンパク質を形成することができる。単離され
たポリヌクレオチドは、単独またはベクターなどの他の
ポリヌクレオチドに結合され、培養物または全器官にお
いて、宿主中に導入されることができる。培養物または
全器官における宿主細胞中に導入された、例えばＤＮＡ
ｓは、本明細書で使用されるように、単離されている。
というのは、それらは天然に存在する形態または環境に
おいて存在しないであろうからである。同様に、該ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば培地組織化
などの組成物中で存在することができ、例えばポリヌク
レオチドまたはポリペプチドの細胞への導入用溶液、化
学または酵素反応のための組成物または容易、例えばそ
れらは天然に存在しない組成物であり、そこには、本明
細書で使用する語句の意味内での単離されたポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドが存在する。 【００２７】「ライゲーション」は、２またはそれ以上
の、しばしば二本鎖ＤＮＡであるポリヌクレオチドの間
にホスホジエステル結合を形成する過程をいう。ライゲ
ーションの技術は当該技術においてはよく知られてお
り、ライゲーションのプロトコールは標準的な実験マニ
ュアルおよび参考文献、例えば、サンブルック（Ｓambr
ook）ら、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラト
リー・マニュアル（MOLECULAR CLONING, A LABORATORY
MANUAL）第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory
Press）、コールド・スプリン・ハーバー（Cold Spring
Harbor）、ニューヨーク（１９８９）および以下に引
用するようにマニアチスら、第１４６ページに記載され
ている。 【００２８】「オリゴヌクレオチド」とは、相対的に短
いポリヌクレオチドである。この語は最も頻繁には一本
鎖デオキシリボヌクレオチドをいうが、短い一本鎖また
は二本鎖リボヌクレオチド、短いＲＮＡ：ＤＮＡハイブ
リッドおよび短い二本鎖ＤＮＡなどをいうこともでき
る。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどのオ
リゴヌクレオチドは、しばしば自動化オリゴヌクレオチ
ド合成機にて実施されるように化学的な方法によって合
成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドはイン・
ビトロ組換えＤＮＡ媒介技術を含む多様な他の方法によ
って、および細胞または器官中のＤＮＡの発現によって
製造されることができる。 【００２９】最初、化学的合成されたＤＮＡは、典型的
には、５'リン酸なしで得られる。そのようなオリゴヌ
クレオチドの５'末端は組換えＤＮＡ分子を形成するた
めに典型的に使用されるＤＮＡリガーゼを使用するライ
ゲーション反応によるホスホジエステル結合形成のため
の基質ではない。そのようなオリゴヌクレオチドのライ
ゲーションが望まれるところでは、リン酸は、キナーゼ
およびＡＴＰを使用するものなど、標準技術によって付
加されることができる。 【００３０】化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの
３'末端は、遊離ヒドロキシル基を有して、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼなどのリガーゼの存在下で他のオリゴヌクレオ
チドの５'リン酸とホスホジエステル結合を容易に形成
する。よく知られているように、および反応は望まれれ
ば、反応中の他のポリヌクレオチドの５'脱リン酸化に
よって妨害されることができる。 【００３１】プラスミドは、一般に本明細書で、前置き
する小文字のｐおよび／または続けて大文字および／ま
たは数字にて、当業者によく知られた標準的名付けのし
きたりにより示す。本明細書中の出発プラスミドは、市
販されているか、限定されない基盤の下に公に入手可能
であるか、または公開された方法によりよく知られた日
常的な応用により入手可能なプラスミドから構築でき
る。本発明により使用することができる多くのプラスミ
ドおよび他のクローニングおよび発現ベクターは、当業
者に容易に利用できるものである。さらに、当業者は本
発明通の使用により適当な他の任意の数のプラスミドを
構築することができる。本発明の特性、構築物およびそ
のようなプラスミドの使用ならびに他のベクターは、本
開示から当業者に容易に明らかであろう。 【００３２】ポリヌクレオチドは、一般に修飾されてい
ないＲＮＡまたはＤＮＡまたは修飾したＲＮＡまたはＤ
ＮＡであってよい、任意のポリヌクレオチドまたはポリ
デオキシリボヌクレオチドをいう。従って、例えば、本
明細書で使用するポリヌクレオチドは数ある中で、一本
鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域
の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮ
Ａ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮ
Ａ、一本鎖であるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッ
ド分子、一層典型的には、二本鎖領域または一本鎖およ
び二本鎖領域の混合物をいう。 【００３３】さらに、本明細書で使用するＲＮＡまたは
ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両者を含む三本鎖領
域をいう。そのような領域の鎖は同一分子または異なる
分子由来であってよい。該領域はすべての１またはそれ
以上の分子を含むが、一層典型的には、該分子のいくつ
かの領域のみを含む。３本鎖領域の分子の１つはしばし
ばオリゴヌクレオチドである。 【００３４】本明細書で使用するように、ポリヌクレオ
チドなる語は上記のように１またはそれ以上の修飾した
塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡを含む。従って、安定性
のためまたは他の理由のために修飾された骨格を有する
ＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で意図する「ポリヌ
クレオチド」である。さらに、通常ではない、例えばイ
ノシンなどの塩基、またはトリチル化した塩基などの修
飾した塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、ちょうど２つ
の例を挙げるが、明細書で使用する語句としてのポリヌ
クレオチドである。 【００３５】非常に多様な修飾は、当業者に公知の多く
の有用な目的に役立つＤＮＡおよびＲＮＡに加えられる
ことが認識されるであろう。本明細書で使用されるポリ
ヌクレオチドなる語は、化学的、酵素的または代謝的に
修飾した形態のポリヌクレオチドならびに、特に単細胞
および多細胞を含むウイルスおよび細胞のＤＮＡおよび
ＲＮＡ特徴の化学形態を含む。 【００３６】本発明は数ある中で、以下に最も詳細に記
載されているように、新規のサイトスタチンIIポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドに関する。特に、本発明
は、新規ヒトサイトスタチンIIのポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドに関し、ウシおよびマウス中の乳腺由来
増殖インヒビター（「ＭＤＧＦ」）にアミノ酸配列ホモ
ロジーによって関連しているものである。本発明は特
に、サイトスタチンIIおよび図１に示されるアミノ酸配
列に関する。 【００３７】ポリヌクレオチド 本発明の１つの局面により、図１の推定アミノ酸配列を
有する成熟ポリペプチドまたは、本明細書中で以下に
「寄託されたクローン」としていうＡＴＣＣ受託番号第
９７２８７号におけるヒトｃＤＮＡによってコードされ
る成熟ポリペプチドをコードする単離したポリヌクオレ
オチドを提供する。本明細書中で提供した、例えば、図
１に示されたポリヌクレオチド、ヒトサイトスタチンII
ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチド
は、出発物質としての上皮細胞のｍＲＮＡを使用するク
ローニングｃＤＮＡなどの標準的クローニングおよびス
クリーニング方法から得た。本発明の例示として、図１
に示されたポリヌクレオチドはヒト胎児脳組織由来のｃ
ＤＮＡライブラリーにおいて見いだされた。 【００３８】本発明のヒトサイトスタチンIIは、ＡＴＣ
Ｃ受託番号第９７２８７号中のヒトサイトスタチンIIを
コードするｃＤＮＡをシークエンシングした結果により
示されるように、増殖調節因子のサイトスタチンファミ
リーの他のタンパク質に関係する。このｃＤＮＡ配列
は、図１に示されているが、約１４.８kＤaの推定分子
量を有する約１３２のタンパク質をコードするオープン
・リーディング・フレームを示す。タンパク質は、マウ
ス乳腺由来増殖インヒビター（これも「ＭＤＧＩ」とも
呼ばれる）の最も高いホモロジーの程度を示し、それは
１３２アミノ酸配列に６４％の同一性および７９％の類
似性を示す。 【００３９】本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡな
どのＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤ
ＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡ
が含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり
得、また一本鎖であるなら、コーディング鎖または非コ
ーディング(アンチセンス)鎖であり得る。該ポリヌクレ
オチドは、例えば天然に存在するアレル変異体である配
列を有することができ、イン・ビトロ変異原発生の技術
によって変えられる配列を有する天然に存在する配列を
有することができる。 【００４０】図１に示されるポリヌクレオチドのコーデ
ィング配列または寄託されたクローンのコーディング配
列に同一であることができるポリヌクレオチドのコーデ
ィング配列に同一であってよい。それはまた、遺伝的コ
ードによる縮重の結果として、図１のＤＮＡのポリペプ
チド、または寄託されたｃＤＮＡにポリペプチドをコー
ドする異なる配列を有するポリヌクレオチドであってよ
い。 【００４１】図１のポリペプチドまたは寄託されたｃＤ
ＮＡによりコードされるポリペプチドをコードする本発
明のポリヌクレオチドは成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列に限るわけではないが、それ自身を含む；プレタ
ンパク質またはプロタンパク質またはプレプロタンパク
質配列なおリーダーまたは分泌配列をコードするような
成熟ポリペプチドまたは上記のさらなるコーディング配
列を有するか有しないかでの成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列；転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシ
ングおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソー
ム結合およびｍＲＮＡの安定性に役割を果たす転写され
たまたは非転写配列などのイントロンおよび非コーディ
ング５'および３'配列を含むさらなる非コーディング配
列とともに、上記のさらなるコーディング配列を有する
かまたは有さない成熟ポリペプチドのコーディング配列
を含んでよい。 【００４２】前記により、本明細書で使用する「ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる語は本発明
のポリペプチドをコードする、特に、図１に支援された
アミノ酸配列またはＡＴＣＣ受託番号第９７２８７号中
のｃＤＮＡによってコードされるヒトサイトスタチンII
のアミノ酸配列を有するヒトサイトスタチンIIをコード
する配列を含むポリヌクレオチドを含む。該語は、コー
ディングおよび／または非コーディング配列を含むこと
もできるさらなる領域と共にポリペプチドをコードする
単一の持続的領域または断続的領域を含むポリヌクレオ
チドを含む。 【００４３】本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列
または寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードす
るポリペプチドの断片、類似体および誘導体をコードす
る本明細書上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。
該ポリヌクレオチドの変異体は天然に存在するアレル変
異体などの天然に存在する変異体または天然に存在する
とは知られていない変異体であってよい。そのような天
然に存在しないポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレ
オチド、細胞または生物体に応用されるものを含む変異
体発生技術によって製造されることができる。 【００４４】本発明は、図１に示されるのと同じ成熟ポ
リペプチド、または寄託されたクローンのｃＤＮＡによ
ってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを含む。さらに、本発明は図１のポリペプチ
ドまたは寄託されたクドーンのｃＤＮＡによってコード
されるポリペプチド断片、誘導体または類似体をコード
するようなポリヌクレオチドの変異体を含む。この点に
おいて変異体は、ヌクレオチド置換、欠失または付加に
よって上記のポリヌクレオチドと異なる変異体である。
置換、欠失または付加は１またはそれ以上のヌクレオチ
ドに関係することができる。変異体はコーディングまた
は非コーディング領域の両者において変化されることが
できる。コーディング領域中の変化は、保存的または非
保存的アミノ酸置換、欠失または付加を製造する。 【００４５】本発明の変異体は、天然に存在する配列ま
たは天然には存在しない配列を有することができる。本
明細書上記に示したように、該ポリヌクレオチドは図１
中に示されるコーディング配列または寄託されたクロー
ンのコーディング配列の天然に存在するアレル変異体で
あるコーディング配列を有する。当該技術において公知
のように、アレル変異体は１またはそれ以上のヌクレオ
チドの置換、欠失または付加を有することができるポリ
ヌクレオチド配列の別形態である。この点において、本
発明の特に好ましい態様は図１に示されたサイトスタチ
ンIIのアミノ酸配列または寄託されたクローンまたは寄
託されたクローンのｃＤＮＡのサイトスタチンIIのアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドである；変異体、類似体、誘導体およびその断
片、その変異体の断片、類似体および誘導体である。 【００４６】この点において、さらに特に好ましい態様
は、いくつかまたは少しの５〜１０、１〜５、１〜３、
２、１のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されてい
るか、またはアミノ酸残基が全く置換、欠失または付加
されていないかの図１または寄託されているクローンの
サイトスタチンIIのアミノ酸配列を有している。この中
で、特に好ましい態様は、静寂置換、付加および欠失で
あり、サイトスタチンIIの特性および活性を変化させな
いものである。またこの点において特に好ましい態様
は、保存置換である。最も好ましいのは、図１または寄
託されたクローンのアミノ酸配列（置換なし）である。 【００４７】本発明のさらに好ましい態様は、図１に示
すアミノ酸配列を有するサイトスタチンIIポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドに８５％以上同一である
ポリヌクレオチドかまたは、上記のように、変異体、密
接なホモログ、誘導体および類似体である。かわりに、
最も好ましいのは、寄託されたクローンのｃＤＮＡのサ
イトスタチンIIポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドに８５％以上同一である領域を含むポリヌクレオチ
ドである。この点において、同ポリヌクレオチドに９０
％以上同一であるポリヌクレオチドは特に好ましく、つ
いでこれらのうちで特に好ましいポリヌクレオチドは、
９５％またはそれ以上であるのが特に好ましい。さら
に、９７％またはそれ以上の同一性は９５％またはそれ
以上の同一性のものの間で非常に好ましく、および９８
％またはそれ以上および９９％またはそれ以上の同一性
を有するこれらのもののうちでは、９９％またはそれ以
上が一層好ましい。 【００４８】また、この点において特に好ましい態様
は、図１に示すサイトスタチンのアミノ酸配列または寄
託されたクローンのサイトスタチンのアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであ
る。本明細書の任意の場所において示すように、該ポリ
ヌクレオチドは持続的領域におけるポリペプチドまたは
２またはそれ以上の複数のエクソンにおけるポリペプチ
ドをコードすることができ、該ポリヌクレオチドはコー
ディング領域または領域に関連しないさらなる領域も含
むことができる。 【００４９】この点において最も好ましいのは図１に示
すポリヌクレオチドのサイトスタチンIIコードする部分
に８５％以上同一である領域を含むポリヌクレオチドで
ある。別法として、最も好ましいのは、寄託されたクロ
ーンのｃＤＮＡの一部をコードするサイトスタチンIIに
８５％以上同一である領域を含むポリヌクレオチドであ
る。それらのポリヌクレオチドのうちで、９０％以上同
一であるのが特に好ましく、その中でも、９５％または
それ以上の同一性をもつものが特に好ましい。さらに、
９５％またはそれ以上の同一性を有するものの中では９
７％またはそれ以上の同一性を有するものが、およびそ
れらの中でも９８％またはそれ以上および９９％または
それ以上の同一性を有するものが非常に好ましく、９９
％またはそれ以上が、これらのうちで一層好ましい。 【００５０】本発明はまた、成熟ポリペプチドをコード
する配列が、別の配列に同じリーディングフレームにお
いて融合されるポリヌクレオチドを含む。そのような配
列は、シグナル配列を含み、それは小胞体に発生初期の
タンパク質を輸送するのを促進し、該ポリペプチドの不
活性な前駆体形態と関連したプロ配列、それは細胞内ま
たは細胞外のタンパク質のやりとり（trafficking）を
促進するか、または細胞内または細胞外コンパートメン
トのタンパク質の、持続性を改良することができる。そ
のような配列はまた、製造および精製を容易にするため
に加えることができ、または本明細書の任意の場所にお
いて議論されるさらなる機能的なドメインに加えること
ができる。 【００５１】従って、本発明のポリヌクレオチドは、成
熟サイトスタチン、特にサイトスタチンIIに加えて、小
胞体のルーメンにポリペプチドの輸送を制御する分泌配
列として機能するシグナルペプチドなどの例えばリーダ
ー配列をコードすることができる。該リーダー配列は、
宿主細胞によって、シグナルペプチドに一般的であるよ
うに、除去され、他の前駆体タンパク質または成熟ポリ
ペプチドを産生する。リーダー配列をしばしば有する前
駆体タンパク質はプレタンパク質と呼ばれる。 【００５２】該ポリヌクレオチドは、また、成熟タンパ
ク質と別のアミノ酸またはカルボキシル末端アミノ酸ま
たは成熟ポリペプチドの内部のアミノ酸（例えば、成熟
形態は１つのポリペプチド以上を有する場合）であるポ
リペプチドもコードできる。そのような配列は、前駆体
から成熟形態へのタンパク質のプロセシングにおける役
割を演ずることができ、タンパク質のやりとりを容易に
することができ、タンパク質の半減期を延長または短縮
することができ、または他のものの間でアッセイのため
のタンパク質または製造物の操作を容易にすることがで
きる。イン・サイチュでの場合に一般的なように、別の
アミノ酸は細胞性酵素によって成熟タンパク質から離れ
させられることができる。 【００５３】前駆体タンパク質は、１またはそれ以上の
プロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有する
が、これはポリペプチドの不活性形態であることができ
る。プロ配列が除去されると、そのような不活性前駆体
が一般的に活性化される。プロ配列全体のうちのいくつ
かは、活性化の前に除去される。一般に、そのような前
駆体はプロタンパク質という。 【００５４】要するに、本発明のポリヌクレオチドは、
成熟タンパク質、成熟タンパク質とリーダー配列（プレ
タンパク質という）、プレタンパク質のリーダー配列で
はない１またそれ以上のプロ配列を有する成熟タンパク
質の前駆体、またはプレプロタンパク質（プロタンパク
質の前駆体であって、リーダー配列および１またはそれ
以上のプロ配列を有しており、一般に該ポリペプチドの
活性および成熟形態を生み出すプロセシング工程お会い
代に除去される）をコードすることができる。 【００５５】本発明のポリヌクレオチドは、上記で議論
したとおり、数ある中でも、成熟または前駆体プレ−、
プロ−、またはプレプロポリペプチドをコードすること
ができ、さらに別の機能性（fanctionaloities）を提供
するものなどの、別のアミノ酸に融合される。従って、
例えば、該ポリペプチドは融合したポリペプチドの精製
を容易にするペプチドなどのマーカー配列に融合されて
よい。本発明のこの局面のある好ましい態様において、
該マーカー配列はヘキサヒスチジンペプチド（中でもｐ
ＱＥ−９ベクターにより与えられるタグなど）の多く
は、市販されており、入手可能である。ゲンツ（Ｇent
z）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.、USA 86:821-824 (198
9)に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジは
融合タンパク質の便利な精製を提供する。典型的には、
それはタンパク質の構造または機能に広範には影響を及
ぼさず、ついで金属キレート樹脂、特にニッケルキレー
ト樹脂に効果的に、選択的におよびしっかりと結合す
る。例えば、よく知られているようにヘキサヒスチジン
タグはしばしばニッケル−ＮＴＡ樹脂に特によく結合
し、それはよく知られており、容易に入手可能であり、
ついで例えばキアゲン（Ｑiagen）などから市販されて
いる。さらに、ヒスチジン金属相互作用は、非特異的に
結合した金属を除去するのに有用な多様な条件に安定で
ありなお、その融合ポリペプチドが穏やかな非変性条件
下で結合および除去することができる。ヘキサヒスチジ
ンタグは、アミノ酸またはサイトスタチンポリペプチド
のカルボキシル末端に最も便利に融合することができ
る。ヘキサヒスチジンのタグは特に細菌の発現に有用で
ある。 【００５６】ある他の好ましい態様における有用な他の
マーカー配列は赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグであり、
特に、哺乳動物細胞が発現に使用される場合；例えばＣ
ＯＳ−７細胞である。例えば、ＨＡタグはウィルソン
（Ｗilson）ら、Ｃell ３７：７６７（１９８４）に記
載されるように、インフルエンザ赤血球凝集素由来のエ
ピトープに一致する。 【００５７】プローブ 本発明はさらに、本明細書の上記のサイトスタチン配
列、特に２つの配列にハイブリダイズするポリヌクレオ
チドに関する。この点において好ましいのは、上記の配
列に少なくとも５０％の同一性を有するポリヌクレオチ
ドである。特に好ましい配列は、少なくとも７０％の同
一性を有する配列である。この点において本発明は特に
上記ポリペプチドにストリンジェント条件下でハイブリ
ダイズするポリヌクエオチドに特に関する。本明細書中
で使用する場合、「ストリンジェント条件」なる語は、
配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも
９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーシ
ョンが起こるであろうことを意味する。 【００５８】この点において、特に好ましい態様は、上
記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオ
チド、またはおよび図１のｃＤＮＡまたは寄託されたク
ローンのｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチド
と実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。 【００５９】寄託した物質 ヒトサイトスタチンII ｃＤＮＡを含む寄託は、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American T
ype Culture Collection）（「ＡＴＣＣ」）で寄託され
た。該寄託は、ＡＴＣＣ受託番号第９７２８７号の番号
を付与され、本明細書中では「寄託されたクローン」と
いう。寄託は特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に
関するブダペスト条約の条件の下に保持されるであろ
う。 【００６０】これらの寄託は、単に当業者への便宜とし
て与えられるものであって、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１
１２下に要求されることを承認するものではない。寄託
された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さら
にはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の
配列のいずれかの記載と矛盾する際には、該寄託された
物質中の配列が優先する。寄託された物質を製造し、使
用しまたは販売するには、実施許諾が要求され得、また
そのような実施許諾はここでは付与されない。 【００６１】ポリペプチド 本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有する、ま
たは寄託されたクローンによりコードされるアミノ酸配
列を有するヒトサイトスタチンIIポリペプチド、に関す
る。本発明はこれらのポリペプチドの断片、類似体およ
び誘導体にも関する。図１のポリペプチドまたは寄託さ
れたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場
合、「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語
は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機
能もしくは活性を保持するポリペプチドを意味する。従
って、類似体には、プロプロテイン部分を切断すること
により活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造する
ことができるプロプロテインが含まれる。本発明のポリ
ペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドま
たは合成ポリペプチドであってよい。ある好ましい態様
において、組換ポリペプチドであってよい。 【００６２】図１のポリペプチドまたは寄託されたクロ
ーン中のcＤＮＡによりコードされるポリペプチドの断
片、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたはそれ以上
のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ま
しくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそ
のような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードさ
れるものであってもよく、またはコードされたものでな
くてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸
残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリ
ペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合
物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化
合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしく
は分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用され
る配列、またはプロプロテイン配列といったような、付
加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているもので
あり得る。そのような断片、誘導体および類似体は、本
明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。 【００６３】この点において、本発明の特に好ましい態
様は図１に示されたサイトスタチンIIのアミノ酸配列ま
たは寄託されたクローンまたは寄託されたクローンのｃ
ＤＮＡのサイトスタチンIIのアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドである；変異
体、類似体、誘導体およびその断片、その変異体の断
片、類似体および誘導体である。 【００６４】この点において、さらに特に好ましい態様
は、いくつかまたは少しの５〜１０、１〜５、１〜３、
２、１のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されてい
るか、またはアミノ酸残基が全く置換、欠失または付加
されていない図１または寄託されているクローンのサイ
トスタチンIIのアミノ酸配列を有している。この中で、
特に好ましい態様は、静寂置換、付加および欠失であ
り、サイトスタチンIIの特性および活性を変化させない
ものである。またこの点において特に好ましい態様は、
保存置換である。最も好ましいのは、図１または寄託さ
れたクローンのアミノ酸配列（置換なし）である。本発
明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離され
た形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一とな
るまで精製される。 【００６５】「単離された」とは、物質がその元の状態
を変えられた；例えば、それが天然に存在するなら、そ
の主との環境から除去されていることをいう。例えば、
生存動物中にある天然に存在するポリヌクレオチドまた
はアポリペプチドは「単離されて」いないが、天然の系
における共存物質のいくつかまたはすべてから分離され
た同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細
書で使用するように「単離されて」いる。 【００６６】単離の一部として、またえは単離後の一部
として、そのようなポリヌクレオチドは変異原発生のた
めに、ついで例えば、宿主中の繁殖または発現のために
他のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡなどと結合して、
融合タンパク質を形成することができる。単離されたポ
リヌクレオチドは、単独またはベクターなどの他のポリ
ヌクレオチドに結合され、培養物または全器官におい
て、宿主中に導入されることができる。培養物または全
器官における宿主細胞中に導入された、例えばＤＮＡ
は、本明細書で使用されるように、単離されている。と
いうのは、それらは天然に存在する形態または環境にお
いて存在しないであろうからである。同様に、該ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドは、例えば培地組織化な
どの組成物中で存在することができ、例えばポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの細胞への導入用溶液、化学
または酵素反応のための組成物または容易、例えばそれ
らは天然に存在しない組成物であり、そこには、本明細
書で使用する語句の意味内での単離されたポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドが存在する。 【００６７】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベ
クター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細
胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製
造にも関する。宿主細胞は、ポリヌクレオチドを組み込
むようにかつ本発明のポリペプチドを発現するように遺
伝的に操作され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、感
染、トランスダクション、またはトランスフェクション
および形質転換のよくしられた技術を用いて、宿主細胞
中に導入されることができる。該ポリヌクレオチドは単
独または他のポリヌクレオチドと共に導入されることあ
できる。そのような他のポリヌクレオチドは独立して導
入されるか、同時導入されるかまたは本発明のポリヌク
レオチドに結合して導入されることができる。 【００６８】従って、例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドは、他と共に宿主細胞にトランスフェクションされる
ことができ、例えば哺乳動物細胞にコトランスフェクシ
ョンおよび選択のための標準技術を用いて、選択可能な
マーカーをコードするポリヌクレオチド分離することが
できる。この場合、該ポリヌクレオチドは一般的に、宿
主細胞ゲノムに安定的に組み込まれることができるであ
ろう。 【００６９】別に、該ポリヌクレオチドは宿主中での増
殖のための選択可能なマーカーを含むベクターに結合さ
れことができる。該ベクター構築物は、前記技術によっ
て宿主細胞に導入されることができる。一般的に、プラ
スミドベクターは、例えばリン酸カルシウム沈澱などの
沈澱物中の、または帯電した液体との錯体中のＤＮＡと
して導入される。エレクトロポレーションもまた、宿主
にポリヌクレオチドを導入するために使用されることが
できる。該ベクターがウイルスである場合、それはイン
・ビトロにパッケージングされることができるか、また
はパッケージング細胞に導入され、ついでパッケージン
グされたウイルスは細胞中にトランスデュースされるこ
とができる。本明細書のこの局面により、ポリヌクレオ
チドの製造およびポリヌクレオチドを細胞に導入される
に適当な広範囲の多様な技術は当業者によく知られてお
り、日常的である。そのような技術は、本明細書中に引
用されているサンブルックら中に十分に概説されてお
り、それらはこれらの技術を詳細に説明している多くの
実験マニュアルの例である。 【００７０】本発明の多くの局面により、該ベクター
は、例えばプラスミドベクター、一本鎖または二本鎖フ
ァージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮ
Ａベクターであってよい。そのようなベクターは、ポリ
ヌクレオチド、好ましくはＤＮＡとしてＤＮＡおよびＲ
ＮＡを細胞中に導入するための公知の技術によって、導
入することができる。該ベクターは、ファージおよびウ
イルスベクターの場合には、好ましくは、感染およびト
ランスダクションのよく知られた技術によってパッケー
ジされたまたはキャプシド化されたウイルスとして細胞
に導入される。ウイルスベクターは複製要素または複製
欠陥（replication defective）であってよい。後者の
場合には、ウイルス増殖は一般的に宿主細胞を補足する
ことにおいてのみ起こるであろう。 【００７１】ある点において、好ましいベクターは本発
明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現ベクタ
ーである。一般に、そのようなベクターは、発現される
べきポリヌクレオチドに作動可能に結合された宿主中の
発現に有効なシス−作用コントロール領域を含む。適当
なトランス−作用因子のいずれかは、宿主によって提供
され、補足ベクターによって提供されまたは宿主中に導
入されたベクター自身によって提供される。 【００７２】この点におけるある好ましい態様におい
て、該ベクターは特異的発現を提供する。そのような特
異的発現は、誘発可能な発現であってよく、またはある
タイプの細胞でのみの発現または誘発可能でありかつ細
胞特異的である発現であってよい。誘発可能なベクター
のうち、特に好ましいものは、温度または添加栄養素な
どの操作が容易である環境因子による発現のために誘発
されることができるベクターである。本発明のこの局面
に適当な多様なベクターは、原核細胞宿主および真核細
胞宿主において使用するための構築可能なおよび誘発可
能な発現ベクターを含み、当業者によく知られて、日常
的に使用される。 【００７３】操作された宿主細胞は、従来的な栄養培地
中で培養されることができ、特に、活性化されているプ
ロモーター、トランスフォーマントを選択することまた
は遺伝子を増幅するために適当に修飾されることができ
る。一般的に発現のために選択された宿主細胞で以前に
使用した、ｐＨなどの培養条件は、本発明のポリペプチ
ドの発現に適当であり、当業者に明らかであるであろ
う。 【００７４】発現ベクターの多大な多様性は、本発明の
ポリペプチドを発現するのに使用することができる。そ
のようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイ
ルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来のベ
クター、バクテリオファージ由来のベクター、酵母エピ
ソーム由来のベクター、酵母染色体要素由来のベクタ
ー、バキュロウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイル
ス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイル
スおよびレトロウイルスなどのパポバウイルスなどのウ
イルス由来のベクターおよびそれらの組合せ由来のベク
ター、例えば、プラスミドとバクテリオファージ遺伝的
要素由来のベクター、コスミドとファージミドなどのベ
クターが含まれ、すべては本発明のこの局面により発現
のために使用されることができる。一般的に、宿主細胞
中のポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチドを
維持、増殖または発現させるのに適した任意のベクター
は、この点において発現に使用することができる。 【００７５】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当該技術分野で公知の方法により適当な制限エンドヌク
レアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方
法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクター
中のＤＮＡ配列を、適当な発現調節配列（プロモータ
ー）に作動可能に連結して、ｍＲＮＡ合成を行わせる。
そのようなプロモーターの代表例としては、よく知られ
たプロモーターのほんの数例を挙げると、ファージラム
ダＰ Lプロモーター、大腸菌（E. coli）、lac、またはt
rpおよびtacプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プ
ロモーターおよびレトロウイルスＬＴＲが挙げられる。 【００７６】一般に、発現構築物は転写開始および終結
部位を含み、転写された領域、翻訳のためのリボソーム
結合部位を含むであろう。該構築物によって発現された
成熟転写物のコーディング部位は、翻訳されるべきポリ
ペプチドの開始部位でＡＵＧで翻訳を開始することおよ
び末端部位で適当に位置する終結コドンを含むであろ
う。さらに、該構築物は、発現を調節ならびに起こすコ
ントロール領域を含むことができる。一般的に、共通し
て実施する多くの方法により、そのような領域は転写を
コントロールすることによって、例えば、中でもリプレ
ッサー結合部位およびエンハンサーなどは作動する。 【００７７】一般的に、増殖および発現のためのベクタ
ーは選択可能なマーカーを含むであろう。そのようなマ
ーカーは増幅に適当であってよく、または該ベクターは
この目的のためさらなるマーカーを含むことができる。
この点において、該発現ベクターは好ましくは１または
それ以上の選択可能なマーカーを含み、形質転換した宿
主細胞の選択のための表現型の特徴を提供する。好まし
いマーカーは、真核生物細胞培養のためのジヒドロ葉酸
レダクターゼまたはネオマイシン耐性および大腸菌また
はその他の細菌を培養するためのテトラサイクリンまた
はアンピシリン耐性遺伝子を含む。 【００７８】上記のような適当なＤＮＡ配列、さらには
また、適当なプロモーターまたは調節配列を含むベクタ
ーを、適当な宿主を形質転換するために使用して、その
宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができ
る。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられ
る：大腸菌、ストレプトマイセス（Streptomyces）、サ
ルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimuriu
m）といったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；
ドロソフィラ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプテラ
（Spodoptera）Ｓｆ９といったような昆虫細胞；ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったような動物
細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当な宿主の選択
は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思わ
れる。 【００７９】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物
も含まれる。該構築物は、本発明のそのような配列が挿
入されているベクター（例えば、プラスミドまたはウイ
ルスベクターなど）が含まれる。該配列は、順方向また
は逆方向にて挿入されることができる。ある好ましい態
様において、構築物は、本発明の配列が順方向または逆
方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベク
ターといったようなベクターを含む。この実施態様の好
ましい側面では、該構築物はさらに、例えば、該配列に
作動可能に連結したプロモーターなどの、調節配列をさ
らに含む。適当なベクターおよびプロモーターが多数、
当業者に知られていて、市販されている。 【００８０】以下のベクターは、市販されており、実施
例のために例として挙げる。細菌用で好ましいベクター
は、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲンか
ら入手可能）；ｐＢｓ、ｐＤ１０、phagescript、psiＸ
１７４、pbluescript ＳＫ、pbsks、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮ
Ｈ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジー
ン（Ｓtratagene)から入手可能）；ptrc９９a、pＫＫ２
２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５
(ファルマシア（Ｐharmacia）から入手可能)。真核生物
用で好ましいベクターは pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡ
Ｔ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(ストラタジーンより入
手可能)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(ファ
ルマシアより入手可能)。これらのベクターは単に、本
発明のこの局面により、使用するため、当業者にとって
利用可能な、多くの市販されており、よく知られている
ベクターの例として挙げている。該ベクターは例えば、
本発明のこの局面において使用されることができる宿主
中の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導
入、維持、増殖または発現に適していると認識されるで
あろう。 【００８１】プロモーター領域は、クロラムアセチルト
ランスフェラーゼ（「ｃａｔ」）転写単位、候補プロモ
ーター断片、すなわちプロモーターを含む断片を導入す
る制限部位の下流にあるプロモーター領域を欠如してい
る任意の所望の遺伝子から選択することができる。よく
知られているように、ＣＡＴ活性の産生を起こすｃａｔ
遺伝子の上流の制限部位で、プロモーター含有断片のベ
クターへの導入、それは標準ＣＡＴアッセイによって検
出されることができる。この目的に適しているベクター
はよく知られており、容易に利用可能である。２つのそ
のようなベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７
である。従って、本発明のポリヌオチドの発現プロモー
ターには、よく知られていて容易に入手可能なプロモー
ターだけでなく、前記技術によってリポーター遺伝子を
用いて得ることができるプロモーターも含まれる。 【００８２】本発明によりポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの発現に適している公知の細菌プロモーターに
は、大腸菌 lacＩ、lacＺ、およびプロモーター、Ｔ３
およびＴ７プロモーター、gptプロモーター、ラムダ
ＰR、ＰLプロモーターおよびtrpプロモーターが含まれ
る。この点において適当な真核プロモーターには、ＣＭ
Ｖ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモ
ーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロ
ウイルスＬＴＲのプロモーターおよびマウスメタロチオ
ネイン−Ｉなどのメタロチオネインプロモーターが含ま
れる。 【００８３】宿主内の発現のための適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、よく知られた手続であり、か
つ発現ベクター構築のための必要技術、宿主へのベクタ
ーの導入および宿主中での発現は、当業者にとって日常
的である。本発明はまた、上記の構築物を含む宿主細胞
に関する。そのような宿主細胞は、哺乳動物細胞のよう
な高等真核細胞、酵母細胞のような下等真核細胞であり
得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞で
あり得る。 【００８４】構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カル
シウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン
媒介トランスフェクション、陽イオン液体媒介トランス
フェクション、エレクトロポレーション、トランスダク
ション、感染などの方法により行うことができる。その
ような方法は例えば、デイビス（Ｄavis,Ｌ.）、ディブ
ナー（Ｄibner,Ｍ.）、バッティ（Ｂattey,Ｌ.）、ベー
シック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー
（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY）（１９８６）
などの多くの標準的実験マニュアルにおいて記載されて
いる。宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組
換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造すること
ができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従
来のペプチド合成装置により合成的に製造することがで
きる。 【００８５】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
調節下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、サンブルックら、モレキュ
ラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、
第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュ
ーヨーク、（１９８９)により記載されている。 【００８６】通例、組換え発現ベクターには、複製起点
並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発
現される遺伝子から得られるプロモーターおよび該ベク
ターにさらした後、細胞を含むベクターの単離を可能に
する選択可能なマーカーが含まれるであろう。適当なプ
ロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ（ＰＧＫ）のような解糖系酵素、α−因子、酸性ホ
スファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコー
ドする遺伝子から得ることができる。選択可能なマーカ
ーには例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子および
サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）ｔｒｐ
１遺伝子が含まれる。 【００８７】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増大する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期
プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にある
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーが含まれる。 【００８８】本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポ
リペプチドのヘテロロガス構造配列をコードし、標準技
術を用いてベクターに挿入され、発現のためにプロモー
ターに作動可能に結合する。該ポリヌクレオチドは、転
写開始部位がリボソーム結合部位のほぼ５'側に位置す
るように配置される。該リボソーム結合部位は発現され
るべきポリペプチドの翻訳を開始させるＡＵＧの５'側
である。一般的に、開始コドン、通例ＡＵＧで開始する
オープンリーディングフレームは他になく、リボソーム
結合部位と開始コドンＡＵＧの間に存在する。また、一
般的に、該ポリペプチドの末端で翻訳停止コドンが存在
し、ポリアデニル化シグナルおよび転写された領域の
３'末端にほぼ配置された転写終結シグナルが存在する
であろう。 【００８９】翻訳されたタンパク質の小胞体のルーメン
への分泌、細胞周辺腔への分泌または細胞外環境への分
泌のため、適当な分泌シグナルは、発現したポリペプチ
ドに組み込まれることができる。該シグナルは該ポリペ
プチドに内在性であるかまたはヘテロロガスシグナルで
あってもよい。 【００９０】該ポリペプチドは融合タンパク質などの修
飾した形態に発現されることができ、ついで分泌シグナ
ルならびにさらに別のヘテロロガス機能的シグナルを含
むことができる。従って例えば、別のアミノ酸、特に帯
電したアミノ酸は、精製または操作及び保存の間に宿主
細胞中の安定性および持続性を改良するための該ポリペ
プチドのＮ−末端が付加されることができる。また、領
域も精製を簡易化するためにペプチドに付加されること
ができる。そのような領域は該ポリペプチドの採取的な
調製の前に取り除くことができる。特に分泌または***
を起こすため、安定性を改善するためおよび精製を簡易
化するために該ポリペプチドにペプチド残基を付加する
ことは当該技術分野においてよく知られかつ日常的な技
術である。 【００９１】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの増殖、維持、発現に適当な原核宿主には、大腸
菌、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、サル
モネラ・ティフィムリウムが含まれる。シュードモナス
（Pseudomonas）属、ストレプトマイセス属、およびス
タフィロコッカス（Staphylococcus）属の様々な種はこ
の点において、適当な宿主である。さらに他のものもま
た、選択物質として使用することができる。 【００９２】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニン
グベクター pＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺
伝要素を含む市販のプラスミドから得られる、選択可能
なマーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。そのよう
な市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３（フ
ァルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine C
hemicals）、ウプサラ（Ｕppsala）、スウェーデン）お
よびＧＥＭ１（プロメガ・バイオテク（Promega Biote
c）、マディソン、ウィスコンシン、米国）が含まれ
る。これらのpＢＲ３２２「骨格」部分を適当なプロモ
ーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。 【００９３】適当な宿主株を形質転換して、その宿主株
を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモ
ーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学誘
導）により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細
胞を、典型的には、遠心分離により収集し、物理的また
は化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の
抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発
現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超
音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含
め、いずれの便利な方法によっても破壊でき、そのよう
な方法は、当業者に周知である。 【００９４】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、ガルツマン（Ｇluzman）、Ｃ
ell、２３：１７５（１９８１）により記載されてい
る、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合
可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、
例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨ
Ｋ細胞系が含まれる。 【００９５】哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当
なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必
要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプラ
イスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、お
よび５’に隣接する非転写配列もまた含むであろう。Ｓ
Ｖ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およ
びポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写
遺伝要素を与えることができる。 【００９６】サイトスタチンIIポリペプチドは、硫酸ア
ンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンま
たは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシ
ルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロ
マトグラフィーが含まれるよく知られた方法により、組
換え細胞培養物から回収して、精製することができる。
必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク
質の立体配置を完成するのに使用することができる。最
後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最
終精製工程に使用することができる。タンパク質の再折
畳みのためのよく知られた技術は、単離または精製の間
に該ポリペプチドが変性される場合に、活性化形態を再
生するために使用されることができる。 【００９７】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から（例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て）組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され
得ない。さらに、本発明のポリペプチドにはまた、ある
場合には宿主媒介プロセスの結果として、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。 【００９８】さらに例示的な応用 サイトスタチンIIポリヌクレオチドおよびポリペプチド
は本発明により、多様な応用、特にサイトスタチンIIの
化学的および生物学的特性を利用することができるもの
に使用されることができる。特に、これらは細胞および
生物体を特徴付けおよび細胞及び生物の増殖における応
用である。さらなる応用は細胞、組織おんよび生物体の
診断または治療または障害に関する。 【００９９】従って、とりわけ、サイトスタチンIIの増
殖阻害および分化刺激活性はイン・ビトロでの腫瘍細胞
などの腫瘍細胞の増殖を抑制することおよび分化を刺激
することに、生物学的目的に関して有用である。同じ活
性は、腫瘍細胞などの生物体中の異常な細胞増殖の処理
に応用することができる。これらの点において、サイト
スタチンIIポリペプチドは好ましく、特に、図１に示す
アミノ酸配列または寄託されたクローンのｃＤＮＡのサ
イトスタチンIIのアミノ酸配列を有するサイトスタチン
IIが好ましい。 【０１００】同様に、サイトスタチンIIの、静脈（venu
s）内皮細胞などの内皮細胞の増殖を抑制する能力は、
培養中またはイン・サイチュにおける血管形成を妨害、
減速または改変に使用することができる。静脈に関連し
て、転移の部位ならびに元々の部位での腫瘍細胞は新規
な血管が増殖するのを引き付けなければならないので、
サイトスタチンIIの血管内皮細胞の抑制は、転移能を低
減するかまたは転移性疾患の進行を減速させるのに有用
であることができる。 【０１０１】さらに、乳腺上皮細胞増殖および調整乳腺
分化を抑制するサイトスタチンIIはまた、肺胞末端芽の
形成を促進し、分化した肺小葉の助力の発展、乳タンパ
ク質の製造の刺激および脂肪小滴の蓄積に使用されるこ
とができる。そのような授乳刺激活性は商用乳製造哺乳
類において乳の製造を助けることができ、かつ例えばヒ
ト母親による乳製造を助けるのに有用であり得る。 【０１０２】関連した応用において、胸の大きさに影響
を及ぼすサイトスタチンIIの調節活性は出産後の、拡大
した胸を通常の大きさに戻すのを助けるのに有用であ
る。例えばアンチセンスホスホロチオエートまたは抗体
によるサイトスタチンII活性の抑制は、肺胞末端芽の出
現を抑圧し、ついでβ−カゼインレベルを低下させるた
めの乳腺上皮細胞に内在するサイトスタチンII活性の選
択的な抑制に有用であってよい。 【０１０３】さらに以下に示すように、サイトスタチン
IIポリヌクレオチドおよび本発明のポリペプチドのこれ
らおよび他の活性および特性は、イン・ビトロでの細胞
増殖、乳および乳製品の商業上の製造に関するもの、お
よび腫瘍学、心臓学、免疫学、内分泌学、血液学、代謝
障害、骨格筋問題および婦人科学および産科学などの分
野に関連する診断および治療に関するものを含む多大な
分野において、多様な応用および使用を有する。 【０１０４】完全長のサイトスタチンII ｃＤＮＡは、
全体または部分的に、完全長ｃＤＮＡの単離およびヒト
サイトスタチンIＩ遺伝子に高い配列類似性を有するま
たは類似の生物学的活性を有する他のｃＤＮＡの単離の
ためのｃＤＮＡライブラリーに関するハイブリダイゼー
ションプローブとして使用されてよい。そのようなプロ
ーブは、一般に少なくとも２０塩基を有する。しかしな
がら、好ましくは該プローブは少なくとも３０塩基を含
み５０塩基は越えない。 【０１０５】そのようなプローブは、完全長転写物に対
応するさらに別のｃＤＮＡクローンおよびゲノムクロー
ンまたは調節およびプロモーター領域、エクソンおよび
イントロンを含む完全なヒトサイトスタチンII遺伝子を
含むクローンを同定するのに使用してよい。 【０１０６】例えば、サイトスタチンII遺伝子のコーデ
ィング領域はオリゴヌクレオチドプローブを合成するた
めに既知のＤＮＡ配列を使用してスクリーニングするこ
とにより遺伝子のコーディング領域を単離することがで
きる。本発明の遺伝子の配列に相補的である配列を有す
る標識したオリゴヌクレオチドを、プローブがライブラ
リーのどの成員にハイブリダイズするかを決定するた
め、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライ
ブラリーをスクリーニングするために使用する。本発明
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、治療の方法
およびヒトの疾患の診断のための実験試薬および物質と
して使用してよい。 【０１０７】サイトスタチンII−結合分子 本発明はまた受容体分子などのサイトスタチンIIに結合
する分子の同定方法をも提供する。受容体タンパク質な
どのサイトスタチンIIに結合するタンパク質をコードす
る遺伝子は例えば、リガンドパンニング（panning）およ
びＦＡＣＳ分離などの当業者によく知られた多くの方法
によって同定されることができる。そのような方法は例
えば、コリガン（Ｃoligan）ら、カレント・プロトコー
ルズ・イン・イムノロジー（Current Protocols in Imm
unology）１（２）：第５章（１９９１）。 【０１０８】例えば、発現クローニングはこの目的に使
用されることができる。この目的のため、ポリアデニル
化したＲＮＡがサイトスタチンII応答性の細胞から調製
され、ｃＤＮＡライブラリーがこのＲＮＡから作られ、
該ライブラリーはプールに分けられ、ついで該プールは
サイトスタチンIIに応答性でない細胞に個々にトランス
フェクションされる。ついで、トランスフェクションさ
れた細胞は標識されたサイトスタチンIIにさらされる
（サイトスタチンIIは放射性ヨウ素の標準方法まてたは
部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の含有などの
多様なよく知られた技術によって標識されることができ
る）。さらされた後、該細胞を固定し、サイトスタチン
の結合を決定する。これらの手続は、便利なことにガラ
ススライド上で行われる。 【０１０９】プールはサイトスタチンII−結合細胞を産
生するｃＤＮＡについて同定される。サブプールはこれ
らの陽性から調製され、宿主細胞にトランスフェクショ
ンされ、ついで上記のようにスクリーニングされる。反
復したサブプールおよび再度のスクリーニングを用いて
受容体などの推定結合分子をコードする１またはそれ以
上の単一クローンを単離することができる。 【０１１０】別法として、標識されたリガンドは膜また
は膜抽出物などの細胞抽出物に光親和的に結合されるこ
とができ、受容体分子などの結合する分子を発現する細
胞から調製される。架橋した物質はポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）により分解され、Ｘ線フ
ィルムにさらされる。リガンド受容体を含む標識した複
合体は切り出され、ペプチド断片に分解され、タンパク
質微小シークエンシングにかけられた。マイクロシーク
エンシングから得られたアミノ酸配列は、推定受容体を
コードする遺伝子を同定するためにｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングするため単独または変性したオリゴ
ヌクレオチドプローブを設計するために使用されること
ができる。本発明のポリペプチドは、サイトスタチンII
の細胞または無細胞系調製において受容体などのサイト
スタチンII結合分子の結合能力を評価するのに使用する
ことができる。 【０１１１】アゴニストおよびアンタゴニストおよびそ
れらのアッセイ 本発明はまた、受容体などのサイトスタチンII結合分子
との相互作用などの細胞上のサイトスタチンIIの作用を
増強または阻害する物を同定するための化合物のスクリ
ーニング方法を提供する。アゴニストは天然のサイトス
タチンIIの生物学的機能を増加させる化合物であり、ア
ンタゴニストはそのような機能を低減または排除する。 【０１１２】例えば、膜またはその調製物など、膜調製
物などの細胞コンパートメントは、サイトスタチンIIに
よって調節されたシグナルまたは調節経路の分子などの
サイトスタチンIIを結合する分子を発現する細胞から調
製される。該調製物はサイトスタチンIIアゴニストまた
はアンタゴニストであり得る候補分子の不在下または存
在下で標識されたサイトスタチンIIとインキュベートさ
れる。該候補分子の該結合分子への結合能力は標識され
たリガンドの低減された結合において反映される。無報
酬に結合する、すなわちサイトスタチンII結合分子を結
合することへのサイトスタチンIIの効果を誘発すること
なしに結合する分子は、有能なアンタゴニストである可
能性が高い。しっかりと結合し、効果を引き出す分子は
同じかまたは密接のものである。 【０１１３】可能性のあるアゴニストおよびアンタゴニ
ストのサイトスタチンII−様効果は、例えば、候補分子
と細胞または適当な細胞調製物との相互作用ののちの第
２メッセンジャー系の活性を決定することにより、およ
びサイトスタチンIIと同様の効果を引き出すサイトスタ
チンIIまたは分子の効果とを比較することによって、測
定されることができる。この点において有用である第２
メッセンジャー系には、制限するものではないが、ＡＭ
Ｐグアニレートシクラーゼ、イオンチャンネルまたはホ
スホイノシチド加水分解第２メッセンジャー系を含む。 【０１１４】サイトスタチンIIアンタゴニストのアッセ
イの他の例には、サイトスタチンIIと可能性のあるアン
タゴニストを競合的阻害アッセイに適当な条件の下で、
膜結合性サイトスタチンII受容体または組換えサイトス
タチンII受容体を結合させる競合アッセイである。サイ
トスタチンIIは、放射能などによって標識されることが
でき、受容体に結合された複数のサイトスタチンIIは可
能性のあるアンタゴニストの有効性を正確に評価するた
めに決定されることができる。 【０１１５】可能性のあるアンタゴニストは本発明のポ
リペプチドに結合する小有機分子、ペプチド、ポリペプ
チドおよび抗体を含み、それによってその活性を阻害ま
たは消滅させる。可能性のあるアンタゴニストはまた、
ペプチド、密接に関連した他ナウ質または受容体などの
結合分子上の同じ部位にサイトスタチン誘発活性を含ま
ずに結合する、サイトスタチンIIが結合から排除される
ことによって、サイトスタチンIIの作用を妨害するポリ
ペプチドである。 【０１１６】別の可能性のあるアンタゴニストにはま
た、アンチセンス技術の利用によって調製されたアンチ
センス構築物も含まれる。アンチセンス技術を利用し
て、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくは
ＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この
方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮ
Ａへの結合に基づく。アンチセンス技術は、例えばオカ
ノ（Ｏkano）、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９
１）；オリゴデオキシヌクレオチズ・アズ・アンチセン
ス・インヒビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッショ
ン（Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors
of Gene Expression）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐres
s）、ボカ・レイトン（Ｂoca Ｒaton）、フロリダ（１
９８８）)中に議論されている。三重らせん形成につい
ては、例えば、リー（Ｌee）ら、Nucl. Acids Res.、
６：３０７３（１９７９）；クーニー（Ｃooney）ら、
Ｓcience、２４１：４５６（１９８８）；およびダーバ
ン（Ｄervan）ら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９
９１）において議論される。 【０１１７】該方法はポリヌクレオチドを相補的ＤＮＡ
またはＲＮＡのポリヌクレオチド結合に基づいている。
例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリ
ヌクレオチド配列の５'コーディング部分を使用して、
長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌ
クレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、
転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設
計し、そのことによって、転写およびサイトスタチンII
の産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチ
ドは、イン・ビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズし
て、mＲＮＡ分子サイトスタチンIIポリペプチドへの翻
訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドをまた、
細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤ
ＮＡをイン・ビボにおいて発現させて、サイトスタチンI
Iの産生を阻害することができる。 【０１１８】該アンタゴニストは製薬学的に許容し得る
担体（例えば、後に記載する）を有する組成物中に使用
されることができる。該アゴニストは、例えば心臓筋細
胞肥厚または白血病を治療するために使用することがで
きる。 【０１１９】組成物 本発明のポリペプチドは、適当な製薬学的担体と組み合
わせて使用することができる。そのような組成物は、治
療上有効な量のポリペプチド、および製薬学上許容され
得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体に
は、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩
衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。そ
の製剤は、投与方法に適合すべきである。 【０１２０】キット 本発明はさらに、本発明の医薬組成物の成分を１つまた
はそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含ん
でなる医薬品パックまたはキットも提供する。そのよう
な容器には、製薬学的または生物学的製品の製造、使用
または販売を規制する政府当局により規定された形の通
知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための
製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。 【０１２１】投与 本発明のポリペプチドは、治療化合物などの他の化合物
と共に使用することができる。該医薬組成物は、経口、
局所、肛門内、膣内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、
鼻腔内または皮内経路といったような、便利な方法で投
与することができる。 【０１２２】該医薬組成物は、特定の適応症を治療およ
び／または予防するのに有効な量で投与される。一般
に、該組成物は、１日当たり少なくとも約１０μg／kg
(体重)の量で投与され、たいていの場合、約８mg／kg
(体重)を超えない量で投与されるであろう。好ましくは
たいていの場合、投与量は、毎日約１０μg／kg〜約１m
g／kg(体重)である。徴候、重篤度、投与経路および複
雑な症状等を考慮に入れて、様式または徴候の各治療の
ための標準的方法によって、最適投与量は決定されると
認識されるであろう。 【０１２３】遺伝子療法 サイトスタチンIIポリヌクレオチド、ポリペプチド、ア
ゴニストおよびアンタゴニストはまた、しばしば「遺伝
子治療」と呼ばれる、そのようなポリペプチドのイン・
ビボにおける発現により、本発明に従って使用してよ
い。従って、例えば、患者由来の細胞を、エクス・ビボ
（ex vivo）においてポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作し
た細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのよ
うな方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本発
明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイ
ルスプラスミドベクターの使用によって、細胞を当該技
術分野で公知の方法により操作することができる。その
ような方法は当該技術分野でよく知られており、および
本発明でのそれらの使用は、本明細書の教示により明ら
かであるだろう。 【０１２４】同様に、細胞を当該技術分野において公知
の方法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現
のために、細胞をイン・ビボにおいて操作することがで
きる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは上記で議論
されたように、複製欠損レトロウイルスベクター中での
発現のために操作されることができる。ついで、該レト
ロウイルス発現構築物は、単離され、本発明のポリペプ
チドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミ
ドベクターでトランスデュースされるパッキング細胞に
導入され、結果、パッキング細胞が、関心のある遺伝子
を含む感染性ウイルス粒子を産生する。これらのプロデ
ューサー細胞をイン・ビボでの細胞を操作するため、お
よびイン・ビボで該ポリペプチドの発現のために患者に
投与することができる。そのような方法により本発明の
ポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の
方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。 【０１２５】前記レトロウイルスプラスミドベクターが
由来するレトロウイルスは、以下に限られるものではな
いが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイル
ス、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハ
ーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル
白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイル
ス、骨髄増殖肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを含む。
１つの態様において、レトロウイルスプラスミドベクタ
ーは、モロニーマウス白血病ウイルスから得られる。 【０１２６】そのようなベクターは該ポリペプチドを発
現するための１つまたはそれ以上のプロモーターを含
む。使用されてよい適切なプロモーターには、以下に限
られるものではないが、レトロウイルス ＬＴＲ；ＳＶ
４０プロモーター；およびミラー（Ｍiller）ら、Biote
chniques、Ｖol．７、Ｎo．９、９８０−９９０（１９
８９）に記載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プ
ロモーター、またはその他のプロモーター（例えば、以
下に限るものではないが、ヒストン、ｐｏｌ IIIおよび
β−アクチンプロモーターを含む真核生物細胞のプロモ
ーターなどの細胞プロモーターが含まれる）が含まれ
る。使用されてよい他のウイルスプロモーターは、以下
に限るものではないが、アデノウイルスプロモーター、
チミジンキナーゼ(ＴＫ)プロモーターおよびＢ１９ パ
ルボウイルスプロモーターを含む。適切なプロモーター
の選択は、本明細書中の教示から当業者には明らかであ
ろう。 【０１２７】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適切なプロモーターの調節下にある。使用されてよ
い適切なプロモーターには、以下に限られるものではな
いが、アデノウイルス主要後期プロモーター（major la
te promoter）などのアデノウイルスプロモーター；ま
たはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなど
の異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）
プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネイン
プロモーターなどの誘導可能なプロモーター；熱ショッ
クプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプ
ロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純ヘルペ
スチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジ
ンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（上記
の修飾したレトロウイルスＬＴＲを含む）；β−アクチ
ンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーター
が含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチドを
コードする遺伝子を調節する本来のプロモーターであっ
てよい。 【０１２８】レトロウイルスプラスミドベクターはプロ
デューサー細胞株を形成するためパッケージング細胞株
を形質導入するのに使用してよい。トランスフェクショ
ンしてよいパッケージング細胞の例には、以下に限るも
のではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−
ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−
Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋
ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が含まれる（ミラ
ー、Human Gene Therapy、Ｖol．１、５−１４頁（１９
９０）に記載）。該ベクターは当該技術分野において公
知の方法によりパッケージング細胞を形質導入する。こ
のような方法には、以下に限るものではないが、エレク
トロポレーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ4沈降
が含まれる。１つの別法として、該レトロウイルスプラ
スミドベクターはリポソーム中にカプセル化して入れら
れてよく、または脂質と結合され、ついで宿主に投与さ
れてよい。 【０１２９】該プロデューサー細胞株は該ポリペプチド
をコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベク
ター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクタ
ー粒子はイン・ビトロであれイン・ビボであれ、真核生
物細胞をトランスデュースするため使用してよい。トラ
ンスデュースした真核生物細胞は該ポリペプチドをコー
ドする核酸配列を発現するであろう。トランスデュース
されてよい真核生物細胞には、以下に限られるものでは
ないが、胎児幹細胞、胎児癌細胞、ならびに造血幹細
胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細
胞および気管支上皮細胞が含まれる。 【０１３０】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば診断用としてなど相補的なポリヌ
クレオチドを検出するためのサイトスタチンIIポリヌク
レオチドの使用にも関する。機能不全に関するサイトス
タチンIIの変異形態の検出により、サイトスタチンIIの
の過少発現、過剰発現または変化した発現による疾患
（例えば乳癌）の診断または疾患の罹患し易さの診断が
可能であろう。 【０１３１】本発明の遺伝子における変異を有する個体
は、多様な技術を用いてＤＮＡレベルで検出できる。診
断のための核酸は、以下に限られるものではないが、血
液、尿、唾液、組織生検および剖検物質などの患者の細
胞から得られる。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用しても
よいし、分析前にＰＣＲ（サイキ（Ｓaiki）ら、Ｎatur
e、３２４：１６３−１６６（１９８６））により酵素
的に増幅してもよい。同様の目的のため、ＲＮＡまたは
ｃＤＮＡもまた使用してよい。一例として、サイトスタ
チンIIをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマー
は、サイトスタチンII発現および変異を同定し分析する
のに使用することができる。例えば、欠失および挿入
は、通常の遺伝子型に比較して増幅した産物の大きさに
おける変化によって検出することができる。点突然変異
は、増幅したＤＮＡを放射性標識したＲＮＡまたは、別
法として放射性標識したアンチセンスＤＮＡ配列にハイ
ブリダイズさせることによって同定することができる。
完全にマッチした配列は、ＲＮアーゼＡ消化によるか、
または融点における差異によってミスマッチの二本鎖か
ら区別することができる。 【０１３２】参照遺伝子と変異を有する遺伝子間の配列
の相違は、直接ＤＮＡシークエンシング方法によって明
らかにされてよい。加えて、クローニングされたＤＮＡ
セグメントは特定のＤＮＡセグメントを検出するプロー
ブとして使用してよい。この方法の感度はＰＣＲと組み
合わされると非常に増強される。例えば、シークエンシ
ングプライマーは二本鎖ＰＣＲ産物または修飾したＰＣ
Ｒによって生成した一本鎖鋳型分子とともに使用され
る。該配列の決定は放射性標識したヌクレオチドによる
従来手法または蛍光標識による自動シークエンシング手
法によって行われる。 【０１３３】ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝的検査は、
変性剤を使用するかまたは使用しないゲルにおけるＤＮ
Ａ断片の電気泳動の移動度における変化の検出によって
行われる。小さな配列の欠失および挿入は高分離（high
resolution）ゲル電気泳動によって可視化することが
できる。異なる配列のＤＮＡ断片は、別々のＤＮＡ断片
が、その特異的な融点または部分的な融点に従って別個
の位置でゲルにて減速される変性ホルムアミド濃度勾配
ゲル上で区別してよい（例えば、マイヤーズ（Ｍyers）
ら、Ｓcience、２３０：１２４２（１９８５））。 【０１３４】特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮア
ーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法（例えばコッ
トン（Ｃotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９
７−４４０１（１９８５））などのヌクレアーゼ保護ア
ッセイによって明らかにされてよい。従って、特異的な
ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮア
ーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡシークエンシングま
たは制限酵素の使用（例えば、制限断片長多型（「ＲＦ
ＬＰ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロットなどの
方法により行われてよい。一層従来のゲル電気泳動およ
びＤＮＡシークエンシングに加えて、変異はまたイン・
サイチュ分析により検出することができる。 【０１３５】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、正常および異常なレベルの決定を含む、
細胞および組織中のサイトスタチンIIタンパク質のレベ
ルを検出するための定量および診断アッセイなどの診断
アッセイにも関する。従って、例えば、正常コントロー
ル組織サンプルに比較してサイトスタチンIIの過剰発現
を検出するための本発明による診断アッセイは、例え
ば、心筋梗塞の存在を検出するために使用されることが
できる。タンパク質、例えば、宿主細胞由来のサンプル
中の本発明のサイトスタチンIIタンパク質のレベルを決
定するために使用されることができるアッセイ技術は、
当業者にはよく知られている。そのようなアッセイ方法
には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエ
スタンブロット分析および好ましくはＥＬＩＳＡアッセ
イが含まれる。これらの中ではＥＬＩＳＡが好ましいこ
とが多い。ＥＬＩＳＡアッセイは最初に、サイトスタチ
ンIIに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を
調製することを含む。加えて、リポーター抗体が該モノ
クローナル抗体に対して調製される。リポーター抗体に
は放射線、蛍光またはこの例においては西洋ワサビペル
オキシダーゼ酵素など検出可能な試薬が付着される。 【０１３６】ＥＬＩＳＡアッセイを実施するため、サン
プルを宿主から除去し、該サンプル中のタンパク質を結
合する固相支持体（例えばポリスチレンディッシュ）上
でインキュベートする。ついで、該ディッシュ上の遊離
タンパク質結合部位をウシ血清アルブミンなどの非特異
的タンパク質でインキュベートすることによりカバーす
る。ついで、該モノクローナル抗体を該ディッシュでイ
ンキュベートすると、その間に該モノクローナル抗体
は、該ポリスチレンディッシュに付着したサイトスタチ
ンIIタンパク質に付着する。すべての結合していないモ
ノクローナル抗体をバッファーで洗い落とす。西洋ワサ
ビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を今度は
ディッシュに置くと、サイトスタチンIIに結合したモノ
クローナル抗体に該リポーター抗体が結合することにな
る。ついで、付着していないリポーター抗体を洗い落と
す。ペルオキシダーゼ活性（発色性（colorimetric）基
質を含む）のための試薬は、ディッシュに添加する。免
疫化したペルオキシダーゼ、第１および第２抗体を通し
てサイトスタチンIIに結合したものは、着色した反応産
物を産生する。所定の時間における発色量は、標準カー
ブに比較して、患者のサンプルの所定量中に存在するサ
イトスタチンIIタンパク質の量でなる。 【０１３７】サイトスタチンIIに特異的な抗体を固相支
持体に付着させ、標識したサイトスタチンIIおよび宿主
から得たサンプルを該固相支持体に通し、ついで該固相
支持体に付着した標識の検出量を該サンプルにおけるサ
イトスタチンIIの量に相関させることができる、競合ア
ッセイを使用してよい。 【０１３８】染色体アッセイ 本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。該配
列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して特異的に
標的化して、ハイブリダイズさせることができる。その
うえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要があ
る。実際の配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マ
ーキング試薬は、現在、染色***置をマークするのには
ほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へ
のマッピングは、それらの配列を疾患関連遺伝子と関係
づける重要な第一段階である。 【０１３９】簡単に言えば、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー(好ましくは、１５−２５bp)を調製することによ
り、配列を染色体にマップすることができる。該遺伝子
の３'非翻訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲ
ノムＤＮＡ中の１を越えるエクソンにまたがらないプラ
イマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なも
のとする。ついで、これらのプライマーを、個々のヒト
染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニン
グに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む
ハイブリッドのみが、増幅された断片を与えるであろ
う。 【０１４０】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来の断片のパネルを用いる類似の方法で達成するこ
とができる。その染色体へマップするのに同様に利用す
ることができる他のマッピング方法には、イン・サイチ
ュハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッ
ド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニン
グ、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築す
るためのハイブリダイゼーションによるプレセレクショ
ンが含まれる。 【０１４１】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
（spread）への蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーシ
ョン(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色***置を一工程
で与えることができる。この技術は、少なくとも５００
または６００塩基を有するｃＤＮＡで利用することがで
きる；しかしながら、２０００ｂｐを越える大きなクロ
ーンは、単一の検出のために十分強いシグナルで独特の
染色体の位置に結合する可能性が高い。例えば、２,０
００ｂｐは十分であり、４,０００ｂｐは一層よく、４,
０００より大きいものは、該時間の合理的なパーセント
のよい結果を得るのにはおそらく必要ではない。この技
術の概説には、ベルマ（Ｖerma）ら、ヒューマン・クロ
モソームズ（HUMAN CHROMOSOMES）：ア・マニュアル・
オブ・ベーシック・テクニクス（A MANUAL OF BASIC TE
CHNIQUES）、パガモン・プレス（Ｐergamon Ｐress）、
ニューヨーク（１９８８）を参照。 【０１４２】ある配列が正確な染色***置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、マックジック（Ｖ.ＭcＫusick）、メンデリア
ン・インヘリタンス・イン・マン（MENDELIAN INHERITA
NCE IN MAN）(ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシテ
ィー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー（JohnsHop
kins University Welch Medical Library）を介してオ
ンラインで利用できる)に見い出される。ついで、同じ
染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関
係を連鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinhe
ritance))によって確認する。 【０１４３】次に、罹患した個体と罹患していない個体
との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必
要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全て
において認められるが、いずれの正常な個体においても
認められないなら、その変異は疾患の原因となるもので
あるらしい。現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピングの解析から、疾患と関連する染色体領域に正確に
局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因とな
る遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガ
ベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子
を仮定する)。 【０１４４】免疫学的な応用 ポリペプチド、それらの断片もしくは他の誘導体、もし
くはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を
免疫原として使用して、それらに対する抗体を製造する
ことができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナ
ルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはま
た、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、
Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成
物も含まれる。当該技術分野で公知の様々な方法を、そ
のような抗体および断片の製造に使用することができ
る。 【０１４５】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。ついで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドの断片のみをコードする配列さえも、完全な天
然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用す
ることができる。ついで、そのような抗体を使用して、
そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単
離することができる。 【０１４６】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ法
（コーラー（Ｋohler，Ｇ.）およびミルシュタイン（Ｍ
ilstein，Ｃ.）、１９７５、Ｎature、２５６:４９５−
４９７)、トリオーマ(trioma)法、ヒトＢ細胞ハイブリ
ドーマ法(コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Immuno
logy Today ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体
を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法(コール
（Ｃole）ら、１９８５、モノクローナル・アンチボデ
ィーズ・アンド・キャンサー・セラピー（MONOCLONAL A
NTIBODIES AND CANCER THERAPY）、アラン・アール・リ
ス、インク（Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.）、７７−９６頁に
おいて)が含まれる。 【０１４７】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原
性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに
適合し得る。また、トランスジェニックマウスは本発明
の免疫原性ポリペプチド産生物に対するヒト化抗体を発
現するのに使用してよい。 【０１４８】 【実施例】本発明をさらに、以下の実施例に関して記載
する。実施例は、特定の態様のために参照のために本発
明を例示するためにのみ提供される。本発明のある特定
の面を例示するのであって、これらの例証は、開示され
た本発明の制限を意味したり、範囲の限定を行うもので
はない。本明細書で使用するある語句は、前記の用語集
で説明している。以下の実施例において示される部また
は量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。 【０１４９】特に断らない限り、以下の実施例における
断片の大きさの分離は、例えば、ゲッデル（Ｇoeddel）
ら、Nucleic Acids Res. ８：４０５７（１９８０）に
よって記載されるように、８％ゲルでポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(「ＰＡＧＥ」)の標準的な技術を用いて
行った。特にことわらない限り、ライゲーションは、ラ
イゲートさせるべきＤＮＡ断片のほぼ等モル量の０.５
μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)
と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げるこ
とができる。すべての実施例は、特に断って詳細に記載
しない限り、当業者によく知られており、かつ日常的で
ある標準的非技術を用いて行った。 【０１５０】実施例１ 細菌を用いたヒトサイトスタチンIIの発現および精製 寄託されたポリヌクレオチド中のヒトサイトスタチンII
をコードするＤＮＡ配列を、ヒトサイトスタチンIIタン
パク質のカルボキシル末端配列および該遺伝子の３'ベ
クター配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて増幅した。クローニングを容易にする制限
部位を含むさらなるヌクレオチドをそれぞれ５'および
３'配列に加えた。 【０１５１】５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配
列： 5' CGC GGA TCC GTG GAG GCT TTC TG 3'（配列番号３） を有し、該配列は下線を付したＢam ＨＩ制限酵素部
位、続いて、第２コドン；すなわち、推定Ｎ−末端メチ
オニンのＡＵＧの次のコドンから開始する、１４ヌクレ
オチドのヒトサイトスタチンコーディング配列を含む。 ３'プライマーは、配列： 5' CGC AAG CTT TTA TGC CTT CTC ATA GTG 3'（配列番
号４） を有し、該配列は下線を付したＨind III制限酵素部位
を含み、続いて停止コドンを含むサイトスタチンIIの最
終の６コドンに相補的な１８ヌクレオチドが続く。 【０１５２】該制限部位は、これらの実施例における細
菌発現のために使用された、細菌発現ベクター ｐＱＥ
−７０(キアゲン、インク． ９２５９ イートン・アベ
ニュー（Ｅton Ａvenue）、チャッツワース（Ｃhatswor
th）、カリフォルニア、９１３１１)上の制限酵素部位
に都合よい。ｐＱＥ−７０は、抗生物質耐性(Ａmpr)、細
菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ誘発プロモーター、リボ
ソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素
部位をコードする。pＱＥ−７０をＢam ＨＩおよびＨin
d IIIで消化し、増幅されたヒトサイトスタチンＤＮＡ
をＢamＨＩ／ＨindIII消化したベクターＤＮＡにライゲ
ーションした。ＢamＨＩ／ＨindIII制限化ベクターへの
挿入は、IPTG-誘発可能なプロモーターの下流領域をコ
ードするヒトサイトスタチンIIを配置し、ついで、翻訳
のため開始ＡＵＧとインフレームで行った。 【０１５３】ライゲーション混合物を使用して、コンピ
テント大腸菌細胞に、標準技術を用いて形質転換した。
そのような方法はサンブルックら、モレキュラー・クロ
ーニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・
スプリング・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリ
ング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）に記載され
ている。大腸菌株Ｍ１５／rep４は、プラスミドｐＲＥ
Ｐ４の多数のコピーを含み、ｌａｃリプレッサーを発現
し、カナマイシン耐性を与え（「Ｋanr」）、これは本
明細書に記載の例示的実施例を実施するのに使用した。
この株はキアゲンから市販されていて入手可能であるサ
イトスタチンIIを発現するのに適した多くのもののうち
の１つにすぎない。 【０１５４】形質転換体を、アンピシリンの存在下、そ
れらがＬＢプレートで増殖する能力により同定した。プ
ラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離して、クローニ
ングされたＤＮＡの同定は、制限分析によって確認し
た。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp（１００ug／
ml）とＫan（２５ug／ml）の両方を補ったＬＢ培地中で
の液体培養で一晩増殖させた（Ｏ／Ｎ）。 【０１５５】そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養
物を１：１００〜１：２５０の割合で播種した。細胞
が、０.４〜０.６の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.600)まで増
殖した。ついで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、最終濃度が１mＭとな
るまで加えた。引き続き、細胞をさらに３〜４時間増殖
させた。ついで、細胞を標準的な方法により、遠心分離
および破壊によって収集した。日常的な回収技術を用い
て破壊された細胞から、含有体（inclusion bodies）を
精製し、ついでタンパク質を、８Ｍ尿素中の含有体から
可溶化した。その８Ｍ尿素を、２×リン酸緩衝食塩水
（「ＰＢＳ」）に変え、ついでタンパク質を標準ＰＤ−
１０溶液中で再折り畳んだ。そのタンパク質をさらに、
サイズ排除クロマトグラフィーによって、ついで、エン
ドトキシンを除去するために、さらなるクロマトグラフ
ィーの工程によって精製した。滅菌濾過したタンパク質
調製物は、９５μｇ／ｍＬの濃度の２×ＰＢＳ中に保存
された。標準的なポリアクリルアミドゲル電気泳動方法
による調製物の分析は、該調製物が期待された分子量、
すなわち約１４ｋＤａを有する約８０％のモノマーサイ
トスタチンIIを含むことを明らかにした。 【０１５６】実施例２ 寄託されたクローン中の完全長ヒトサイトスタチンIIタ
ンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、該遺伝子の５'
および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて増幅する： ５'プライマーは、配列： 5' GC GGA TCC CGT GGA GGC TTT CTG TGC 3'（配列番号
５） を有し、該配列は下線を付したＢam ＨＩ制限酵素部
位、続いて、２−５コドンおよび図１のサイトスタチン
IIの配列のコドン６の２塩基を含む。以下に記載のとお
り、発現ベクターに挿入されたヒトサイトスタチンIIを
コードする増幅された断片の５'末端は、特に、コザッ
ク（Ｋozak，Ｍ.）、J. Mol. Biol.、１９６：９４７−
９５０（１９８７）により記載されるように、真核細胞
中の翻訳開始の有効なシグナルを提供する。 【０１５７】３'プライマーは、配列： 5' GC GGT ACC TTA TGC CTT CTC ATA GTG 3'（配列番号
８） を有し、該配列は下線を付したＡsp７１８制限部位を含
み、続いて停止コドンに相補的であるヌクレオチドおよ
び図１のサイトスタチンIIｃＤＮＡの最終の５アミノ酸
のコドンが続く。増幅された断片は１％アガロースゲル
から市販されており入手可能なキット（「ジーン・クリ
ーン（Ｇeneclean）」、バイオ（ＢＩＯ)１０１インク
(Ｉnc.）、ラ・ホラ（Ｌa Ｊolla）、カリフォルニア）
を用いて単離する。ついで、該断片をＢamＨＩおよびＡ
sp７１８で消化し、再度１％アガロースゲル上で精製す
る。この断片を本明細書ではＦ２と称する。 【０１５８】該ベクターｐＡ２−ＧＰを、サマーズ（Ｓ
ummers）ら、ア・マニュアル・オブ・メソッド・フォー
・バキュロウイルス・ベクターズ・アンド・インセクト
・セル・カルチャー・プロシーデュアーズ（A MANUAL O
F METHODS FOR BACULOVIRUSVECTORS AND INSECT CELL C
ULTURE PROCEDURES）、テキサス・アグリカルチュアル
・エクスパーリメンタル・ステーション（Texas Agricu
ltural ExperimentalStation Blletin）第１５５５号
（１９８７）に記載されるように標準方法を用いてバキ
ュロウイルス発現系においてサイトスタチンIIタンパク
質を発現するのに使用する。この発現ベクターは、便利
な制限部位が続く、Autgrapha californica 核ポリヘド
ロシスウイルス(ＡｃＭＮＰＶ）の強ポリヘドリンプロ
モーターを含む。ＡｃＭＮＰＶgp６７のシグナルペプチ
ドは、Ｎ−末端メチオニンを含むが、ＢamＨＩ部位の上
流にちょうど位置する。シミアンウイルス４０（「ＳＶ
４０」）は、有効なポリアデニル化に使用される。組換
えウイルスの容易な選択のために大腸菌からのβ−ガラ
クトシド遺伝子をポリへドリンプロモーターと同じ方向
で挿入し、後にポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シ
グナルが続く。そのポリヘドリン配列はクローニングさ
れたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを
産生するための野生型ウイルスＤＮＡを有する細胞媒介
類似組換え体のウイルス配列によって両側をフランキン
グする。 【０１５９】他の多くのバキュロウイルスがｐＡ２−Ｇ
Ｐの代わりに、例えばｐＡｃ３７３、ｐＬＶ９４１およ
びｐＡｃＩＭ１などを使用することができる。そのよう
なベクターは、とりわけラッコウ（Ｌuckow）ら、Ｖiro
logy １７０：３１−３９に記載されている。そのプラ
スミドを制限酵素ＢamＨＩおよびＡsp７１８で消化し、
ついで、ウシ腸ホスファターゼを用いて、当該技術分野
において日常的な方法を用いて脱リン酸化する。ついで
ＤＮＡを１％アガロースゲルから市販されており入手可
能なキット（「ジーン・クリーン」、バイオ１０１イン
ク、ラ・ホラ、カリフォルニア）を用いて単離する。こ
の断片を本明細書ではＶ２と称する。 【０１６０】断片Ｆ２および脱リン酸化したプラスミド
Ｖ２をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて一緒にライゲーショ
ンする。大腸菌ＨＢ１０１細胞をライゲーションミック
スを用いて形質転換して、培養皿に撒く。細菌をＢamＨ
ＩおよびＡsp７１８を用いて個々のコロニーからのＤＮ
Ａを消化してヒトサイトスタチンIIを有するプラスミド
を含むことを確認し、ついでゲル電気泳動によって消化
産物を分析する。クローニングされた断片の配列をＤＮ
Ａシークエンシングにより確認する。このプラスミドを
本明細ではｐＢacＣytostatin IIと称する。 【０１６１】リポフェクション法(フェロナー（Ｆelone
r）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８４：７４１３
−７４１７（１９８７）)を利用して、プラスミド pＢa
cＣstostatine II ５μgを市販の線形化バキュロウイル
ス(「BaculoGoldTM バキュロウイルス ＤＮＡ」、ファ
ーミンゲン（Ｐharmingen）、サン・ディエゴ（ＳanＤi
ego）、カリフォルニア)１.０μgと共に同時トランスフ
ェクションする。 【０１６２】BaculoGoldTM ウイルス ＤＮＡ １μgおよ
びプラスミド pＢacＳＣＧＦ ５μgを、無血清グレイス
(Ｇrace's)培地(ライフ・テクノロジーズ・インク（Lif
e Technologies Inc.）、ゲイザーズバーグ（Ｇaithers
burg）、メリーランド)５０μlを含むマイクロタイター
プレートの無菌ウェル中で混合する。その後、リポフェ
クチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを
加え、混合して、室温で１５分間インキュベートする。
ついで、トランスフェクション混合物を、無血清グレイ
ス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種し
たＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴加す
る。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた
溶液を混合する。ついで、そのプレートを２７℃で５時
間インキュベートする。５時間後、そのトランスフェク
ション溶液をプレートから除去して、１０％ ウシ胎児
血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加える。そのプレ
ートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養
し続ける。 【０１６３】４日後、上清を集めて、サマーズおよびス
ミス(上記)により記載されたようにして、プラークアッ
セイを行う。変法として、「Ｂlue Ｇal」(ライフ・テ
クノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)を含むアガ
ロースゲルを使用したが、このことにより、青色に染色
されたプラークを容易に単離することが可能となる。
(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞
培養に関する利用者のガイド、およびライフ／テクノロ
ジーズ・インク、ゲイザーズバーグにより配布されたバ
キュロウイルス学、９−１０頁にも見出すことができ
る)。 【０１６４】４日後、連続希釈のウイルスを細胞に加え
て、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペッ
トの先端で採取する。ついで、組換えウイルスを含む寒
天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフチ
ューブ内で再懸濁させる。その寒天を短時間の遠心分離
により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清
を、３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに
使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集した
後、４℃で保存する。適切に挿入されたサイトスタチン
IIを、制限マッピングおよびシークエンシングを含むＤ
ＮＡ分析によって同定する。これを本明細書ではＶ−サ
イトスタチンと称する。 【０１６５】Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを
補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多
重度(ＭＯＩ) ２で組換えバキュロウイルス Ｖ−サイト
スタチン IIを感染させる。６時間後、その培地を除去
して、メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９０
０ II 培地(ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザ
ーズバーグ)に替える。４２時間後、５μＣiの35Ｓ−メ
チオニンおよび５μＣiの35Ｓ システイン５μＣi(アマ
シャム(Amersham))を加える。その細胞をさらに１６時
間インキュベートした後、それらを遠心分離により収集
して、標識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオ
ートラジオグラフィーにより可視化する。 【０１６６】実施例３ ＣＯＳ細胞におけるヒトサイトスタチンIIの発現 発現プラスミド、Ｃytostatin II ＨＡは以下を含むベ
クターpcＤＮＡＩ／Ａmp（インビトロゲン（Invitroge
n）由来である：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシ
リン耐性遺伝子、３）大腸菌複製起点、４）ポリリンカ
ー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニレーショ
ン部位が続くＣＭＶプロモーター。サイトスタチンII前
駆体全体をコードするＤＮＡ断片および３'端にインフ
レームで融合するＨＡタグをそのベクターのポリリンカ
ー領域にクローニングし、それゆえ、その組換えタンパ
ク質発現をＣＭＶプロモーターの下で行う。そのＨＡタ
グは、以前に記載したように（ウィルソン（Ｗilson）
ら、Ｃell ３７：７６７（１９８４））、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに一致す
る。ＨＡタグの我々の標的タンパク質への注入によりＨ
Ａエピトープを認識する抗体を有する組換えタンパク質
の検出を容易にする。 【０１６７】そのプラスミドの構築策は以下に記載する
とおりである：寄託されたクローンのサイトスタチンII
をコードするＤＮＡ配列を２つのプライマーを用いて元
々のＥＳＴクローニングに関してＰＣＲによって構築す
る。５'プライマーは、 5' GCGC GGATCC GCC ACC ATG GTG GAG GCT TTC TGT 3'
（配列番号６） であり、下線を付したＢamＨＩ部位を生み、続いて開始
コドンから出発するサイトスタチンIIコーディング配列
の８ヌクレオチドを含む。３'配列は、 5' GCGC TCTAGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG
GTA TGC CTT ATA GTG 3'（配列番号７） であり、下線を付したＸbaＩ部位、翻訳終結コドン、Ｈ
ＡタグおよびサイトスタチンIIコーディング配列の最終
の１２ヌクレオチド（終止コドンを含まない）を含む。
それゆえ、そのＰＣＲ産物はＨindIII部位およびインフ
レームで融合したＨＡタグが続くサイトスタチンIIコー
ディング配列、ＨＡタグに隣接する翻訳終結コドンおよ
びＸbaＩ部位を含む。 【０１６８】そのＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片およびベク
ターpcＤＮＡＩ／ＡmpをＨindIIIおよびＸbaＩ制限酵素
で消化してライゲーションする。そのライゲーション混
合物を大腸菌株ＳＵＲＥ（ストラタジーン・クローニン
グ・システムズ、１１０９９ノース・トーレイ・パイン
ズ・ロード（North Torrey Pines Roard）、ラ・ホラ、
カリフォルニア ９２０３７）に形質転換して、その形
質転換した培養物をアンピシリン培地プレートにプレー
ティングし、ついで耐性コロニーを選択する。プラスミ
ドＤＮＡを形質転換体から単離し、ついで正確な断片の
存在のために制限分析によって試験する。 【０１６９】組換えサイトスタチンIIの発現のため、Ｃ
ＯＳ細胞を例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（サンブ
ルック、フィリッチ（Ｅ．Ｆritsch）、マニアチス
（Ｔ．Ｍaniatis）、モレキュラー・クローニング：ア
・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・
ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク（１９８９））に記載されるような方
法を用いて発現ベクターでトランスフェクションする。
サイトスタチンII ＨＡ融合タンパク質の発現を、例え
ば、ハーロウ（Ｅ．Ｈarlow）、レーン（Ｄ．Ｌane）、
アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス、（１９８８）に記載される方法を用いて、放射線標
識および免疫沈降法により検出する。２日間のトランス
フェクションの後、35Ｓ−システインで８時間標識す
る。ついで培養培地を回収し、その細胞を界面活性剤
（ＲＩＰＡバッファー（１５０mＭ ＮaＣl、１％ ＮＰ
−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０.５％
ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ７.５）にて溶解する（ウ
ィルソンら、上記）。細胞リゼイトおよび培養培地の両
者をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈澱させる。沈澱
したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にて
分析し、その結果は期待された大きさの発現産物を示
す。 【０１７０】実施例４ ヒト組織におけるサイトスタチンIIの発現のレベルを調
べるため、とりわけ、サンブルックら（上記に引用）に
よって記載される方法を用いてノーザンブロット分析を
行った。総細胞ＲＮＡサンプルをＲＮＡzolTMＢシステ
ム（バイオテックス・ラボラトリーズ・インク（Biotec
x Laboratories, Inc.）６０２３ サウス・ループ・イ
ースト（South Loop East）、ヒューストン、テキサス
７７０３３）で単離した。特定の各ヒト組織から単離し
た総ＲＮＡの約１０μgを１％ アガロースゲル上で分離
した。そのゲルをナイロンフィルター完全長サイトスタ
チンII遺伝子にブロットし、標識されたポリヌクレオチ
ドプローブにハイブリダイズさせた。その標識反応は、
５０ｎgのＤＮＡ断片とともにストラタジーンプライム
−イット キット（Stratagene Prime-It kit）に従って
行った。標識したＤＮＡをＳelect−Ｇ−５０カラムで
精製した。（５ プライム−３ プライム、インク、ブル
ダー（Ｂoulder）、コロラド）。ついで、フィルターを
放射性標識したサイトスタチンII遺伝子の全長と０.５
Ｍ ＮaＰＯ4、ｐＨ７.４および７％ ＳＤＳ中で１,００
０,０００cpm／mlで６５℃で一夜ハイブリダイズさせ
た。室温で２回洗浄した後、６０℃で０.５×ＳＳＣ、
０.１％ＳＤＳで２回洗浄し、ついでフィルターを増感
紙で−７０℃で一晩露光させた。サイトスタチンIIのｍ
ＲＮＡは脳に豊富である。 【０１７１】実施例５ 遺伝子治療を介する発現 線維芽細胞を皮膚生検により被験体より得る。得られた
組織を組織培養培地中に置き、ついで小片に分ける。そ
の組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表面に置く
（各フラスコに約１０片の塊を置く）。該フラスコを上
下ひっくり返し、固く閉め、室温にて一晩放置する。室
温で２４時間後、該フラスコを逆さにし、ついで組織の
塊はフラスコの底に固定したままにし、ついで、１０％
ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む新
しい培地（例えば、ハムＦ１２培地（Ｈam's Ｆ１２ me
dia））を添加する。ついでこれを３７℃で約１週間イ
ンキュベートする。このとき、新しい培地を添加し引き
続き数日毎に変える。さらに２週間の後、培養液中に線
維芽細胞の単層が現れる。その単層をトリプシン処理し
ついでさらに大きなフラスコに合わせて調整する。 【０１７２】遺伝子療法のためのベクターは発現される
べき断片をクローニングする制限酵素で消化する。消化
されたベクターは、自己ライゲーションを防ぐためにウ
シ腸ホスファターゼで処理する。脱リン酸化され、線形
化したベクターをアガロースゲル上で画分して精製す
る。 【０１７３】活性化サイトスタチンIIを発現することが
できるサイトスタチンｃＤＮＡを単離する。その断片の
末端は必要であれば就職されて、ベクターにクローニン
グされる。例えば、５'オーバーハンギング（overhangi
ng）は、平滑末端をつくるＤＮＡポリメラーゼで処理さ
れることができる。３'オーバーハンギング末端はＳ１
ヌクレアーゼを用いて除去することができる。リンカー
はＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて平滑末端にライゲーショ
ンすることができる。 【０１７４】モロニーマウス肉腫ウイルスの線形骨格お
よびサイトスタチンII断片の等量を混合し、Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させる。ライゲーション混合物
を大腸菌を形質転換するために使用し、ついで該菌をカ
ナマイシン含有アガー上に播種する。カナマイシン表現
型および制限分析は、ベクターが適当に挿入された遺伝
子を含むことを確認する。 【０１７５】パッケージング細胞を、１０％ 仔ウシ血
清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有
するダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modifie
d Eagles Medium）（ＤＭＥＭ）中で全面密度になるま
で組織培養中で増殖させる。サイトスタチンII伝子を有
するベクターを標準技術を用いてパッケージング細胞に
導入する。パッケージング細胞は、サイトスタチンII遺
伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パッケージ
ング細胞を以後、プロデューサー細胞という）。 【０１７６】新しい培地を形質導入したプロデューサー
細胞に添加し、引き続き培地をプレート全面のプロデュ
ーサー細胞から回収する。感染性ウイルス粒子を含む培
地をミリポアフィルターで濾過して分離したプロデュー
サー細胞を除去した。ついで濾過した培地を線維芽細胞
を感染させるのに使用する。培地を線維芽細胞のサブ全
面プレートから除去し、濾過した培地とすばやく取り替
える。ポリブレン(アルドリッチ（Ａldrich）)を培地に
導入してトランスダクションを容易にする。適当なイン
キュベーションの後、その培地を除去し、ついで新鮮培
地と取り換える。ウイルス力価が高い場合、本質的にす
べての線維芽細胞が感染し、選択は一切必要ないであろ
う。力価が非常に低い場合は、拡大のためにトランスデ
ュースされた細胞を選択するため、ｎｅｏまたはｈｉｓ
などの選択可能なマーカーを有するレトロウイルスベク
ターを使用する必要がある。 【０１７７】操作された線維芽細胞を、単独またはサイ
トデックス３ミクロキャリアビーズ（cytodex 3 microc
arrier beads）などの微小担体上全面に増殖した後に、
宿主に注入する。注入された線維芽細胞はサイトスタイ
ンIIタンパク質産物を産生し、ついで該タンパク質の生
物学的な作用を宿主に付与する。特に前記の明細書およ
び実施例中以外にも、本発明が実施されることができる
ことは明らかである。先の教示から見て、本発明の多数
の変更および変化が可能であることから、追記する請求
の範囲内で、詳しく記載した以外に、本発明を行うこと
ができる。 【０１７８】 SEQUENCE LISTING <110> Human Genome Sciences, Inc. <120> Cytostatin II <130> 185645 <160> 8 <210> 1 <211> 731 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (16)...(411) <400> 1 ggggaaaggg caagg atg gtg gag gct ttc tgt gct acc tgg aag ctg acc 51 Met Val Glu Ala Phe Cys Ala Thr Trp Lys Leu Thr 1 5 10 aac agt cag aac ttt gat gag tac atg aag gct cta ggc gtg ggc ttt 99 Asn Ser Gln Asn Phe Asp Glu Tyr Met Lys Ala Leu Gly Val Gly Phe 15 20 25 gcc act agg cag gtg gga aat gtg acc aaa cca acg gta att atc agt 147 Ala Thr Arg Gln Val Gly Asn Val Thr Lys Pro Thr Val Ile Ile Ser 30 35 40 caa gaa gga gac aaa gtg gtc atc agg act ctc agc aca ttc aag aac 195 Gln Glu Gly Asp Lys Val Val Ile Arg Thr Leu Ser Thr Phe Lys Asn 45 50 55 60 acg gag att agt ttc cag ctg gga gaa gag ttt gat gaa acc act gca 243 Thr Glu Ile Ser Phe Gln Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Thr Thr Ala 65 70 75 gat gat aga aac tgt aag tct gtt gtt agc ctg gat gga gac aaa ctt 291 Asp Asp Arg Asn Cys Lys Ser Val Val Ser Leu Asp Gly Asp Lys Leu 80 85 90 gtt cac ata cag aaa tgg gat ggc aaa gaa aca aat ttt gta aga gaa 339 Val His Ile Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Asn Phe Val Arg Glu 95 100 105 att aag gat ggc aaa atg gtt atg acc ctt act ttt ggt gat gtg gtt 387 Ile Lys Asp Gly Lys Met Val Met Thr Leu Thr Phe Gly Asp Val Val 110 115 120 gct gtt cgc cac tat gag aag gca t aaaaatgtcc ctggtcgggg 432 Ala Val Arg His Tyr Glu Lys Ala 125 130 cttggaagag ctcttcagtt tttctgtttc ctcaagtctc agtgctatcc tattacaaca 492 tggctgatca ttaattagaa ggttatcctt ggtgtggagg tggaaaatgg tgatttaaaa 552 acttgttact ccaagcaact tgcccaattt taatctgaaa atttatcatg ttttataatt 612 tgaattaaag ttttgtcccc cccccctttt ttttataaac aagtgaatac attttataat 672 ttcttttgga atgtaaatca aatttgaata aaaatcttac acgtgaaaaa aaaaaaaaa 731 <210> 2 <211> 132 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Val Glu Ala Phe Cys Ala Thr Trp Lys Leu Thr Asn Ser Gln Asn 1 5 10 15 Phe Asp Glu Tyr Met Lys Ala Leu Gly Val Gly Phe Ala Thr Arg Gln 20 25 30 Val Gly Asn Val Thr Lys Pro Thr Val Ile Ile Ser Gln Glu Gly Asp 35 40 45 Lys Val Val Ile Arg Thr Leu Ser Thr Phe Lys Asn Thr Glu Ile Ser 50 55 60 Phe Gln Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Thr Thr Ala Asp Asp Arg Asn 65 70 75 80 Cys Lys Ser Val Val Ser Leu Asp Gly Asp Lys Leu Val His Ile Gln 85 90 95 Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Asn Phe Val Arg Glu Ile Lys Asp Gly 100 105 110 Lys Met Val Met Thr Leu Thr Phe Gly Asp Val Val Ala Val Arg His 115 120 125 Tyr Glu Lys Ala 130 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cgcggatccg tggaggcttt ctg 23 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cgcaagcttt tatgccttct catagtg 27 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gcggatcccg tggaggcttt ctgtgc 26 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gcgcggatcc gccaccatgg tggaggcttt ctgt 34 <210> 7 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gcgctctaga tcaagcgtag tctgggacgt cgtatgggta tgccttatag tg 52 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gcggtacctt atgccttctc atagtg 26
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトサイトスタチンIIのヌクレオチドおよび
推定アミノ酸配列を示す。
推定アミノ酸配列を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 5/00 Ａ６１Ｐ 15/00
9/00 15/14
15/00 １７３
15/14 21/00
１７３ 35/00
21/00 37/00
35/00 43/00 １０５
37/00 Ｃ０７Ｋ 14/47
43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/24
(72)発明者 ニ・ジャン
アメリカ合衆国20853メリーランド州ロッ
クビル、マナーフィールド・ロード5502番
(72)発明者 ユ・グオ−リアン
アメリカ合衆国20878メリーランド州ダー
ネスタウン、ストロー・ベイル・レイン
13524番
(72)発明者 ライナー・ゲンツ
アメリカ合衆国20904メリーランド州シル
バー・スプリング、フェアランド・パー
ク・ドライブ13404番
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02
DA06 EA02 EA04 GA11 GA13
HA01 HA14
4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17
BA01 BA08 BA21 CA18 CA53
DB52 DB70 NA14 ZA26 ZA81
ZA94 ZB07 ZB21 ZB22 ZB26
ZC03 ZC21 ZC63
4H045 AA10 BA10 CA40 EA20 EA50
FA74 GA01 GA22
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 本明細書に記載のサイトスタチンIIをコ
ードするポリヌクレオチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002262714A JP2003180379A (ja) | 2002-09-09 | 2002-09-09 | サイトスタチンｉｉ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002262714A JP2003180379A (ja) | 2002-09-09 | 2002-09-09 | サイトスタチンｉｉ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51337497A Division JP2001507205A (ja) | 1995-09-29 | 1995-09-29 | サイトスタチン▲ｉｉ▼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003180379A true JP2003180379A (ja) | 2003-07-02 |
Family
ID=27606630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002262714A Withdrawn JP2003180379A (ja) | 2002-09-09 | 2002-09-09 | サイトスタチンｉｉ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003180379A (ja) |
-
2002
- 2002-09-09 JP JP2002262714A patent/JP2003180379A/ja not_active Withdrawn
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20040527 |