JP2003113111A - 糖尿病治療用医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明の目的は、膵臓特異的に発現するＡＬ
Ｋ７のリガンドを同定し、膵臓のインスリン分泌を促進
させる作用を有する医薬、ならびに該医薬のスクリーニ
ング方法を提供することにある。 【解決手段】 本発明によれば、アクチビンＡＢ、アク
チビンＢおよびアクチビン受容体様キナーゼ７（ＡＬＫ
７）より選ばれる蛋白質を有効成分として含有する糖尿
病の治療および／または予防のための医薬、該蛋白質を
コードするＤＮＡを有効成分として含有する糖尿病の治
療および／または予防のための医薬、該蛋白質または該
ＤＮＡを利用した糖尿病の治療および／または予防のた
めの医薬のスクリーニング方法、該ＤＮＡ、または該蛋
白質を特異的に認識する抗体を用いた糖尿病の診断薬お
よび診断用キット、ならびＡＬＫ７を特異的に認識する
抗体を用いた糖尿病治療薬の腎臓への輸送方法が提供さ
れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オーファン受容体
ＡＬＫ７、該受容体のリガンド蛋白質であるアクチビン
ＡＢ、アクチビンＢ、該受容体をコードするＤＮＡ、ま
たは該リガンド蛋白質コードするＤＮＡを含有する糖尿
病の治療および／または予防のための医薬および診断薬
に関する。また、該受容体、該リガンド蛋白質、該受容
体をコードするＤＮＡ、または該リガンド蛋白質コード
するＤＮＡを利用した糖尿病の治療および／または予防
のための医薬のスクリーニング方法、該スクリーニング
方法により得られる医薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖尿病は先進諸国において最も大きな問
題となっている生活習慣病の一種である。糖尿病は膵臓
β細胞から分泌されるホルモンであるインスリンの絶対
的不足（１型糖尿病）、あるいは相対的不足・作用不足
（２型糖尿病）に起因する疾患である。２型糖尿病の病
態は、β細胞からのインスリン分泌不全とインスリン標
的細胞でのインスリン作用障害（インスリン抵抗性）の
二者で構成され、複数の遺伝因子・環境因子が複雑に関
与する他因子疾患であることが知られている。ヒト２型
糖尿病では、健常人と比較して膵β細胞が約６０％に減
少しているとの報告もあり〔Tohoku J. Exp. Med., 12
9, 273-283, (1979)〕、β細胞数の低下が１型のみなら
ず２型糖尿病患者においても病態と関連することが示唆
されている。

【０００３】インスリン分泌能を根本的に回復させる一
方法として膵移植が1960年代から行われているが、ドナ
ー・移植材料の確保が困難であることに加え、膵移植は
非常に高度な技術を必要とする移植であることが問題と
されている〔Nature Med., 6, 250-251, 2000〕。

【０００４】一方、近年、膵移植と比較すると技術的に
は容易な膵ランゲルハンス氏島移植が試みられるように
なってきたが、１年正着率が２７％と低い点、および個
体の膵臓から十分な数のランゲルハンス氏島を取得し難
いことが問題とされている。

【０００５】膵ランゲルハンス氏島はインスリンを分泌
するβ細胞のみならずグルカゴンを産生するα細胞、PP
を産生するPP細胞、ソマトスタチンを産生するδ細胞の
４種から成る。これら膵内分泌細胞は高度に最終分化し
た細胞であり、成体における新生現象はほとんど観察さ
れず細胞***能も極めて低い。しかし非常に特殊な状況
下、特に膵破壊・ランゲルハンス氏島破壊を伴う状況に
おいてはβ細胞の再生が観察されることが主に動物モデ
ルで証明されている〔Diabetes, 45, 941-945(1996)、D
iabetes, 46, 1281-1290 (1997)、Endocrinology, 138,
1750-1762 (1997)、Development, 118, 33-46, (199
3)〕。よって、少なくともげっ歯類においては成体の膵
臓にも内分泌細胞を増殖・再生させる潜在能力が存在
し、特に膵導管に成体膵幹細胞が存在すると考えられて
いる。

【０００６】ヒトにおいては、上述したげっ歯類で観察
されるような成体β細胞の再生現象は観察されていない
が、糖尿病でない死者の剖検で、膵導管付近に数個以内
の細胞から成るインスリン陽性細胞（single beta cell
unit）が高頻度で観察されると報告されている。このs
ingle beta cell unitはランゲルハンス氏島を形成する
β細胞と比較し形態が小さいことから、より未分化なβ
細胞であると考えられ、ヒト成体においてもβ細胞の再
生が起こる可能性が示唆されている〔Diabetologia, 4
1, 629-633 (1998)〕。

【０００７】膵移植に替わるβ細胞補充法として、ある
特定の物質を投与することでin vivoでβ細胞の増殖・
新生を誘導する物質としては、ポリADPリボースシンテ
ターゼインヒビターであるニコチンアミド〔Biomed. Re
s., 18, 171 (1997)、DiabetesRes. Clin. Pract., 41,
1 (1998)〕、Reg蛋白質〔Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 91, 3589 (1994)〕の報告がある。しかし、ニコチン
アミドは、糖尿病発症後の経口投与については、インス
リン分泌能がある程度保たれている症例に約1年間に限
りインスリン分泌持続効果があるのみであり〔Molecula
r Medicine, 38,62-67 (2001)〕、またRegを過剰発現さ
せたトランスジェニックマウスでは、β細胞数が減少
し、インスリン含量が減少した。その結果、耐糖能障害
がみられ３８％が糖尿病を発症した。その後１００週齢
までに死亡したマウスの死因のほとんどは、膵導管、卵
巣での悪性腫瘍、リンパ腫の形成であった〔2000年、日
本糖尿病学会要旨集〕。reg遺伝子の発現が癌化に関連
していることを示す報告もあり〔Brit. J. Cancer, 83,
188-1(2000)〕、ニコチンアミド、Reg蛋白質ともヒト
糖尿病治療への利用は難しいと考えられる。

【０００８】近年、成体のあらゆる組識において成体幹
細胞の存在が明らかにされ、種々の臓器不全、疾患に対
する再生療法の可能性が期待されている。上述したよう
な成体の膵臓、主に膵導管に潜むと考えられる膵成体幹
細胞を、インスリンを分泌するβ細胞へと効率的に分化
誘導することができれば、１型のみならず２型糖尿病患
者における膵β細胞数の低下および機能低下を補い、糖
尿病の根治治療へ繋がると考えられが、そのような技術
は確立していない。

【０００９】一方、近年の膵臓発生初期過程の解析にお
いて、アクチビン受容体様キナーゼ7（ＡＬＫ７）が特
異的に膵臓細胞に発現されていることが明らかにされて
きた〔Biochem. Biophys. Res. Comm., 254, 707-712
(1999)〕。ＡＬＫ７はＴＧＦ−β受容体ファミリーに属
する分子で〔Mol. Cell Neurosci., 7, 467-478 (199
6); J. Biol. Chem., 271, 30603-30609 (1996)〕、Ｉ
型受容体に分類されているがそのリガンドはこれまで明
らかにされていない。

【００１０】一般にＴＧＦ−β受容体ファミリーに属す
る受容体の機能は、Ｉ型、II型の異なる分子により担わ
れていることが明らかにされており、リガンドはII型受
容体にまず結合し、リガンドとII型受容体の複合体がＩ
型受容体と複合体を形成し、Ｉ型受容体が活性化される
ことにより細胞内にシグナルが伝達される〔Endocrino
l., 141, 2281-2284 (2000) 〕。

【００１１】特表平10-510143には、ラット由来のＡＬ
Ｋ７が取得され、該ＡＬＫ７のアミノ酸およびｃＤＮＡ
の配列が示されており、また該ＡＬＫ７ ｍＲＮＡのラ
ットの各臓器における発現分布の解析により、該ＡＬＫ
７は神経疾患の治療に有効と推定しているが、該ＡＬＫ
７のリガンドについては、具体的に特定、取得したとの
記載はない。

【００１２】一方、アクチビン類はTGF-βスーパーファ
ミリーに属するサイトカインであり、ＴＧＦ−β等と同
様に二量体構造を有するが、それを構成するサブユニッ
ト（βサブユニットと呼ばれる）は５種類が知られてお
り、哺乳類では、βＡ、βＢの他にβＣ、βＥが存在す
ることが明らかにされている〔Biochem. Biophys. Res.
Commun., 228, 669-674 (1996); Biochim. Biophys. A
cta., 1307, 145-148(1996)〕。これまでに哺乳動物生
体内で蛋白質として発現が確認されているアクチビン類
は、アクチビンＡ（βＡ−βＡ）、アクチビンＡＢ（β
Ａ−βＢ）、アクチビンＢ（βＢ−βＢ）である。アク
チビン類（アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビン
Ｂ）の受容体構成は、上記したようにＴＧＦ−β受容体
ファミリーの典型であり、II型受容体（ActRIIAあるい
はActRIIB）に結合し、その複合体がＩ型受容体（ＡＬ
Ｋ４）を活性化することによりシグナルが伝達されるも
のと考えられている〔Endocrinol., 141, 2281-2284 (2
000)〕。また、現在の知見ではアクチビンＡ、ＡＢ、Ｂ
の間に明確な活性の相異は認められていない。

【００１３】酵素活性を欠損した変異型II型アクチビン
受容体遺伝子や、構成活性型Ｉ型アクチビン受容体遺伝
子導入マウスの解析から、アクチビン類が膵臓β細胞の
機能分化に重要である点は指摘されているが〔J. Clin.
Invest., 102, 294-301 (1998)〕、他のＴＧＦ−βフ
ァミリーに属する分子との機能の重複性の影響が判別さ
れず、アクチビン類の機能の詳細は明らかにされておら
ず、また、アクチビン類の機能上の相異も示唆されてい
ない。これまでに、βＢの発現は下垂体、卵巣などβＡ
に比較して比較的限局されていることが明らかにされて
きた〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 247-251(198
8)〕。その後、βＡ、βＢ共に膵臓で発現していること
も報告されているが〔Endocrinology, 133, 624-630 (1
993); FEBS Letters, 319, 217-220 (1993); J. Gastro
intest. Surg., 4, 269-275 (2000)〕、これらの検討結
果はｍＲＮＡ発現に関する検討を示すのみであり、アク
チビンＡ、ＡＢ、Ｂに機能上の相異があるとは指摘され
ていない。

【００１４】この様に、アクチビン類に関しては、膵臓
機能等に何らかの作用を有することが示唆されてはいる
が、各分子種間において機能上の差異を窺わせる知見は
存在せず、アクチビンＡ、ＡＢ、Ｂの間に膵臓の発生・
分化並びに機能制御等に異なる機能が担われているとは
予想されていない。以上の様に、膵臓再生因子の探索は
新規膵臓機能改善作用を有する治療薬として注目されて
いるが、実際の医療に応用可能な分子は特定されていな
い。また、ＡＬＫ７は膵臓β細胞で発現されていること
が明かにされており、膵臓の機能制御等に何らかの役割
を担うことが示唆されてはいるがその具体的機能、およ
びそのリガンドに関しては知られていない。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】成体の膵臓に存在する
と考えられる成体膵幹細胞を、インスリンを分泌し機能
的に成熟した膵β細胞へと分化誘導することができれ
ば、１型および２型糖尿病患者における膵β細胞数の低
下および機能低下を補い糖尿病の根治治療へと繋がる。
こうした活性を有する分子の特定とそれを利用した膵臓
機能を改善する薬剤の開発が望まれている。

【００１６】即ち、本発明は、グルコース依存性のイン
シュリン分泌の促進作用を示す物質を糖尿病の治療およ
び／または予防のための医薬として提供することを解決
すべき課題とした。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意研究し、膵臓β細胞で特異的に発現して
いることが知られているＴＧＦ−β受容体ファミリーの
タイプＩ型受容体に属するＡＬＫ７のリガンドが公知の
アクチビンＡＢおよびＢであることを同定した。さら
に、膵臓β細胞で発現するタイプＩ型受容体ＡＬＫ７と
タイプII受容体ActRIIAを介して情報を伝達することを
明らかにした。さらにアクチビンＡＢを膵臓β細胞様の
モデル細胞に投与することでグルコース依存性のインシ
ュリン分泌の促進作用を示すことを見出し、本発明を完
成させた。すなわち、本発明は以下の（１）〜（３５）
を提供するものである。

【００１８】（１） アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、
およびＡＬＫ７からなる群より選ばれる蛋白質を有効成
分として含有する糖尿病の治療および／または予防のた
めの医薬。 （２） 下記の何れかの蛋白質を有効成分として含有す
る糖尿病の治療および／または予防のための医薬。 ［ａ］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリ
ペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列か
らなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質； ［ｂ］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリ
ペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列に
おいて１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および
／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
から構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガ
ンドとしての機能を有する蛋白質； ［ｃ］配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以
上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付
加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配
列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
から構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガ
ンドとしての機能を有する蛋白質；または ［ｄ］配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以
上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付
加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配
列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミ
ノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加された
アミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量
体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を
有する蛋白質：

【００１９】（３） 下記の何れかの蛋白質を有効成分
として含有する糖尿病の治療および／または予防のため
の医薬。 ［ａ］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドから構成される二量体蛋白質； ［ｂ］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリ
ペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列に
おいて１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および
／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
から構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガ
ンドとしての機能を有する蛋白質；または ［ｃ］配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以
上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付
加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成さ
れる二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとして
の機能を有する蛋白質：

【００２０】（４） 下記の何れかの蛋白質を有効成分
として含有する糖尿病の治療および／または予防のため
の医薬。 ［ａ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡによりコードされる蛋白質；または ［ｂ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１以上
のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加
されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチ
ビンＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての機
能を有する蛋白質：

【００２１】（５） 下記の何れかのポリペプチドを有
効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防
のための医薬。 ［ａ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
なるポリペプチド；または ［ｂ］配列番号１または２において１以上のアミノ酸残
基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ
酸配列からなるポリペプチドであって、かつＡＬＫ７の
リガンドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペ
プチド；

【００２２】（６） 糖尿病の治療および／または予防
のための医薬が、膵臓機能改善作用を有するものである
上記（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬。 （７） 糖尿病の治療および／または予防のための医薬
が、膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を有する
ものである上記（１）〜（５）のいずれかに記載の医
薬。 （８） 糖尿病の治療および／または予防のための医薬
が、膵外分泌細胞および膵内分泌細胞の再生を促進する
作用を有するものである上記（１）〜（５）のいずれか
に記載の医薬。 （９） アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ
７からなる群より選ばれる蛋白質を有効成分として含有
する、インスリン分泌促進剤。

【００２３】（１０）アクチビンβA鎖、アクチビンβB
鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを含有する、糖
尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤。 （１１）下記の何れかのＤＮＡを含有する、糖尿病の治
療および／または予防のための遺伝子治療剤。 ［ａ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
なるポリペプチドをコードするＤＮＡ； ［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列にお
いて１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／
または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドで
あり、かつＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋
白質を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ；また
は ［ｃ］配列番号３および４で表される塩基配列を含むＤ
ＮＡ：

【００２４】（１２） 下記の何れかのＤＮＡを含有す
る、糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治
療剤。 ［ａ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡにコードされる蛋白質をコードするＤＮＡ；また
は ［ｂ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のア
ミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加され
たアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビン
ＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての機能を
有する蛋白質をコードするＤＮＡ：

【００２５】（１３） 糖尿病の治療および／または予
防のための遺伝子治療剤が、膵臓機能改善作用を有する
ものである上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の
遺伝子治療剤。 （１４） 糖尿病の治療および／または予防のための遺
伝子治療剤が、膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作
用を有するものである上記（１０）〜（１２）のいずれ
かに記載の遺伝子治療剤。 （１５） 糖尿病の治療および／または予防のための遺
伝子治療剤が、膵外分泌細胞および膵内分泌細胞の再生
を促進する作用を有するものである上記（１０）〜（１
２）のいずれかに記載の遺伝子治療剤。 （１６） アクチビンβA鎖、アクチビンβB鎖、または
ＡＬＫ７をコードするＤＮＡを含有する、インスリン分
泌促進剤。

【００２６】（１７） 以下の［ａ］〜［ｃ］のいずれ
かに記載のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたは該オリゴ
ヌクレオチドの誘導体を含有する糖尿病の診断薬。 ［ａ］アクチビンβA鎖、アクチビンβB鎖、またはＡＬ
Ｋ７をコードするＤＮＡ、またはそれらＤＮＡの部分断
片であるＤＮＡ； ［ｂ］配列番号３または４で表される塩基配列からなる
ＤＮＡ、配列番号５および６で表される塩基配列を含む
ｃＤＮＡ、またはそれらＤＮＡの部分断片であるＤＮＡ
より選ばれるＤＮＡ ［ｃ］配列番号３または４で表される塩基配列、または
配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ
の塩基配列において、連続した５〜６０塩基からなる配
列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチド
と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オ
リゴヌクレオチドの誘導体

【００２７】（１８） アクチビンＡＢ、アクチビン
Ｂ、ＡＬＫ７からなる群より選ばれる蛋白質を認識する
抗体を含有する糖尿病の診断薬。 （１９） 上記（１７）に記載のＤＮＡ、オリゴヌクレ
オチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体、または上
記（１８）に記載の抗体を含有する、糖尿病の診断キッ
ト。

【００２８】（２０） （i）以下の［ａ］〜［ｄ］の
いずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質を発現する
細胞での該ポリペプチドまたは蛋白質の発現量と、（i
i）該ポリペプチドまたは蛋白質を発現する細胞と被験
試料を接触させた場合の該ポリペプチドまたは蛋白質の
発現量とを比較し、被験試料より以下の［ａ］〜［ｄ］
のいずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質の発現量
を増大させる化合物を選択することを特徴とする、糖尿
病の治療および／または予防のための医薬のスクリーニ
ング方法。 ［ａ］アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７
より選ばれる蛋白質； ［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
なるポリペプチド、および配列番号５および６で表され
る塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質より選
ばれるポリペプチドまたは蛋白質； ［ｃ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が
欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配
列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガン
ドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチ
ド；または ［ｄ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のア
ミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加され
たアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビン
ＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての活性を
有する蛋白質：

【００２９】（２１） （i）以下の［ａ］〜［ｄ］の
いずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質を発現する
細胞の機能と、（ii）該ポリペプチドまたは蛋白質を発
現する細胞と被験試料を接触させた場合の細胞の機能と
を比較し、被験試料より細胞の機能を制御する活性を有
する化合物を選択することを特徴とする、糖尿病の治療
および／または予防のための医薬のスクリーニング方
法。 ［ａ］アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７
より選ばれる蛋白質； ［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
なるポリペプチド、および配列番号５および６で表され
る塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質より選
ばれるポリペプチドまたは蛋白質； ［ｃ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が
欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配
列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガン
ドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチ
ド；または ［ｄ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のア
ミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加され
たアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビン
ＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての活性を
有する蛋白質：

【００３０】（２２） 細胞が、II型アクチビン受容体
を発現している細胞である、上記（２０）または（２
１）に記載のスクリーニング方法。 （２３） 細胞が、膵臓β細胞種細胞である上記（２
０）〜（２２）のいずれかに記載のスクリーニング方
法。 （２４） 以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれかに記載のポ
リペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝子の転写を制
御する領域の下流にレポーター遺伝の連結されたＤＮＡ
を含むＤＮＡで形質転換された形質転換体と被験試料を
接触させ、被験試料より以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれ
かに記載のポリペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝
子の発現を増大させる化合物を選択することを特徴とす
る、糖尿病の治療および／または予防のための医薬のス
クリーニング方法。 ［ａ］アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７
より選ばれる蛋白質； ［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
なるポリペプチド、および配列番号５および６で表され
る塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質より選
ばれるポリペプチドまたは蛋白質； ［ｃ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が
欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配
列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガン
ドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチ
ド；または ［ｄ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のア
ミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加され
たアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビン
ＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての活性を
有する蛋白質：

【００３１】（２５） 糖尿病の治療および／または予
防のための医薬が膵臓機能改善作用を有する化合物であ
る（２０）〜（２４）のいずれかに記載の方法。 （２６） 糖尿病の治療および／または予防のための医
薬が膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を有する
化合物である上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載
の方法。 （２７） 糖尿病の治療および／または予防のための医
薬が膵外分泌細胞または膵内分泌細胞の再生を促進する
作用を有する化合物である上記（２０）〜（２４）のい
ずれかに記載の方法。 （２８） 上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の
方法によって得られる化合物、またはその薬理学的に許
容される塩。

【００３２】（２９） 上記（２８）に記載の化合物、
またはその薬理学的に許容される塩を含有する糖尿病の
治療および／または予防のための医薬。 （３０） ＡＬＫ７を認識する抗体と上記（２８）に記
載の化合物またはその薬理学的に許容される塩とを結合
して得られる、糖尿病の治療および／または予防のため
の医薬。 （３１） 膵臓機能改善作用を有する医薬である、上記
（２９）または（３０）に記載の糖尿病の治療および／
または予防のための医薬。 （３２） 膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を
有する医薬である上記（２９）または（３０）に記載の
糖尿病の治療および／または予防のための医薬。 （３３） 膵外分泌細胞または膵内分泌細胞の再生を促
進する作用を有する医薬である上記（２９）または（３
０）に記載の糖尿病の治療および／または予防のための
医薬。

【００３３】（３４） ＡＬＫ７を認識する抗体とＡＬ
Ｋ７に作用する糖尿病の治療および／または予防のため
の医薬とを結合して得られる融合抗体を膵臓へ選択的に
蓄積させることを特徴とする、糖尿病の治療および／ま
たは予防のための医薬の輸送方法。 （３５） 糖尿病の治療および／または予防のための医
薬が、上記（２８）に記載の化合物またはその薬理学的
に許容される塩である上記（３４）に記載の方法。

【００３４】本発明のさらに別の側面によれば、治療お
よび／または予防に有効量の上記（１）から（５）の何
れかに記載の蛋白質またはポリペプチドを、ヒトを含む
哺乳動物に投与することを含む、糖尿病の治療および／
または予防のための方法が提供される。本発明のさらに
別の側面によれば、糖尿病の治療および／または予防の
ための医薬の製造における、上記（１）から（５）の何
れかに記載の蛋白質またはポリペプチドの使用が提供さ
れる。

【００３５】本発明のさらに別の側面によれば、治療お
よび／または予防に有効量の上記（１０）から（１２）
の何れかに記載のＤＮＡを、ヒトを含む哺乳動物に投与
することを含む、糖尿病の治療および／または予防のた
めの方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれ
ば、糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治
療剤の製造における、上記（１０）から（１２）の何れ
かに記載のＤＮＡの使用が提供される。

【００３６】

【発明の実施の形態】本発明の医薬に含有される蛋白質
としては、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、ＡＬＫ７を
挙げることができる。アクチビンＡＢ、アクチビンＢ
は、ＡＬＫ７のリガンド蛋白質としての活性を有する蛋
白質であれば、天然物由来の蛋白質でも、遺伝子工学的
手法により製造された蛋白質であってもよく、例えば天
然由来の該蛋白質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、
ヒツジ、ウマ、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬ
Ｋ７のリガンド蛋白質を挙げることができる。アクチビ
ンＡＢの具体的例としては、配列番号１で表されるアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチドより構成される二量
体蛋白質を挙げることができ、アクチビンＢの具体的例
としては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポ
リペプチドにより構成される二量体蛋白質を挙げること
ができる。ＡＬＫ７は、ＡＬＫ７としての活性、すなわ
ちアクチビンＡＢまたはアクチビンＢで活性化され、細
胞のインスリン分泌を促進する活性を有する蛋白質であ
れば天然物由来の蛋白質でも、遺伝子工学的手法により
製造された蛋白質であってもよく、例えば天然由来の該
蛋白質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウ
マ、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ７を挙げ
ることができる。ＡＬＫ７の具体的例としては、配列番
号９で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げるこ
とができる。

【００３７】また、本発明の医薬に含有される蛋白質と
しては、（ａ）配列番号1で表されるアミノ酸配列にお
いて１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／
または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドより構成される二量体蛋白質でありかつＡＬＫ７リガ
ンドとしての活性を有する蛋白質、（ｂ）配列番号１で
表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が
欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配
列からなるポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ
酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿
入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドより構成される二量体蛋白質でありかつＡＬＫ
７リガンドとしての活性を有する蛋白質、（ｃ）配列番
号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと配
列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミ
ノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加された
アミノ酸配列からなるポリペプチドにより構成される二
量体蛋白質でありかつＡＬＫ７リガンドとしての活性を
有する蛋白質、（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配
列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入お
よび／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプ
チドにより構成される二量体蛋白質でありかつＡＬＫ７
リガンドとしての活性を有する蛋白質、（ｅ）配列番号
５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコード
されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠
失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
からなる蛋白質でありかつＡＬＫ７の活性を有する蛋白
質、も挙げられる。

【００３８】また、本発明の医薬に含有されるポリペプ
チドとしては、アクチビンβＡ鎖、およびアクチビンβ
Ｂ鎖を挙げることができる。具体的には、配列番号１で
表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配
列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
をあげることができる。さらに、配列番号１で表される
アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置
換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からな
るポリペプチドでありかつ、アクチビンＡＢとしての活
性を有する蛋白質を構成するポリペプチド、配列番号２
で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基
が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸
配列からなるポリペプチドでありかつ、アクチビンＡＢ
またはアクチビンＢとしての活性を有する蛋白質を構成
するポリペプチドも、本発明の医薬に含有されるポリペ
プチドとして挙げられる。

【００３９】さらには、上記蛋白質またはポリペプチド
に様々なポリペプチドを付加した上記蛋白質またはポリ
ペプチドとの融合蛋白質も本発明の医薬に含有される蛋
白質またはポリペプチドである。融合蛋白質の例として
は、マルトース結合蛋白質、オリゴ・ヒスチジン、抗体
ペプチドエピトープ、ヒト免疫グロブリン定常領域、プ
ロテインＡなどを結合した融合蛋白質を挙げることがで
きる。また、融合蛋白は公知の手法により特異的に切断
可能な配列を有することもできる。

【００４０】配列番号１または２で表されるアミノ酸配
列、または配列番号５および６で表される塩基配列を含
むｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上
のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加
されたアミノ酸配列からなり、かつアクチビンＡＢ、ア
クチビンＢまたはＡＬＫ７としての活性を有する蛋白
質、またはアクチビンＡＢまたはアクチビンＢとしての
活性を有する蛋白質を構成するポリペプチドは、Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、
モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons
(1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン
・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acid
s Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucl
eic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 82, 488 (1985) 等に記載の部位特異的
変異導入法を用いて、例えば配列番号１または２で表さ
れるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番
号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコー
ドされる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を
導入することにより、取得することができる。

【００４１】欠失、置換、挿入および／または付加され
るアミノ酸の数は１以上であり上限は特に限定されない
が、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠
失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から
数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１
０個、さらに好ましくは１〜５個である。

【００４２】本発明の医薬に含有される蛋白質またはポ
リペプチドのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残
基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、
同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中
の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、
置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠
失、置換、挿入および／または付加が同時に生じてもよ
く、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型
と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基として
は、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、
L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジ
ン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-アルギ
ニン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリ
ン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チ
ロシン、L-バリン、L-システインなどが挙げられる。

【００４３】以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の
例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換
可能である。 Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリ
ン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオ
ニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチル
アラニン、シクロヘキシルアラニン Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギ
ン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミ
ノスベリン酸 Ｃ群：アスパラギン、グルタミン Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノ
ブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸 Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシ
プロリン Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン

【００４４】また、本発明の医薬に含有される蛋白質ま
たはポリペプチドが、アクチビンＡＢまたはアクチビン
Ｂとしての活性を有する蛋白質またはアクチビンＡＢま
たはアクチビンＢとしての活性を有する蛋白質を構成す
るポリペプチドであるためには、配列番号１または２で
表されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％以上、通常
は８０％以上、特に９５％以上の同一性を有しているこ
とが好ましい。また、本発明の医薬に含有される蛋白質
がＡＬＫ７としての活性を有するためには、配列番号５
および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡによりコー
ドされるアミノ酸配列と、少なくとも６０％以上、通常
は８０％以上、特に９５％以上の同一性を有しているこ
とが好ましい。

【００４５】アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karl
in and AltschulによるアルゴリズムBLAST〔Pro. Natl.
Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)〕やFASTA〔Methods
Enzymol., 183, 63 (1990)〕を用いて決定することがで
きる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLA
STXとよばれるプログラムが開発されている〔J. Mol. B
iol., 215, 403(1990)〕。BLASTに基づいてBLASTNによ
って塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例え
ばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに
基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合に
は、パラメーターは例えばscore＝50、wordlength＝3と
する。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合に
は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http:/
/www.ncbi.nlm.nih.gov.）。

【００４６】本発明の医薬に含有される蛋白質又はポリ
ペプチドが、ＡＬＫ７のリガンドとしての活性を有して
いるか否を確認する方法としては、例えば、II型アクチ
ビン受容体とＡＬＫ７とを発現する組換え細胞と該蛋白
質とを接触させたときの細胞の応答を測定する方法、ま
たは膵臓β細胞の形質を保有する培養細胞と該ポリペプ
チドまたは蛋白質を接触させたときの該培養細胞からの
インスリン分泌量を測定する方法などをあげることがで
きる。

【００４７】細胞の応答の例としては、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃ
ＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生
成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内
蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下、細
胞増殖活性、メラニン色素の凝集または拡散、またはレ
ポーター遺伝子の発現量などをあげることができる。

【００４８】本発明の医薬に含有される蛋白質が、ＡＬ
Ｋ７としての活性を有しているか否かを確認する方法と
しては、II型アクチビン受容体と該蛋白質とを発現させ
た組み換え細胞とアクチビンＡＢまたはアクチビンＢを
接触させたときの該細胞の応答又は該細胞からのインス
リン分泌量を測定する方法などを挙げることができる。
細胞応答の例としては上記の応答をあげることができ
る。

【００４９】１．アクチビンＡＢ、アクチビンＢおよび
ＡＬＫ７の取得方法 アクチビンＡＢおよびアクチビンＢのように、完全長ｃ
ＤＮＡが公知である場合、該完全長ｃＤＮＡをもとに、
必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な
長さのＤＮＡ断片を調製する。

【００５０】ヒトＡＬＫ７のように、完全長ｃＤＮＡが
公知でない場合、配列番号１０で表される塩基配列を有
するラット由来のＡＬＫ７遺伝子、または公知のヒトＡ
ＬＫ７のＥＳＴ（expressed sequnece tag）をプローブ
に用いて、例えばヒト膵臓ｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングすることにより、ヒトＡＬＫ７をコードする
ｃＤＮＡを単離することができる。得られたｃＤＮＡが
全長ｃＤＮＡでない場合は、このクローンをプローブと
したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングや、ＲＡＣ
Ｅ法〔rapid amplification of cDNA ends; Frohman MA
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998 (19
88)〕により全長のｃＤＮＡを取得することができる。

【００５１】得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列をＤ
ＮＡシークエンサー等を用いて決定し、その塩基配列に
ついて各フレームでアミノ酸配列に翻訳した後、公知の
ラット由来のＡＬＫ７のアミノ酸配列と比較することに
より、取得されたｃＤＮＡがヒトＡＬＫ７をコードする
ＤＮＡであるかを確認することができる。取得されたヒ
トＡＬＫ７をコードするＤＮＡを用いて、上記したよう
に必要に応じて適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。

【００５２】該ＤＮＡ断片、あるいは完全長ｃＤＮＡを
発現ベクター内のプロモーターの下流に挿入することに
より、該蛋白質の組換発現ベクターを作製する。具体的
には、例えば、配列番号1または２で表されるアミノ酸
配列からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ある
いは配列番号５および６で表される塩基配列を含む完全
長ｃＤＮＡが挿入された発現ベクターを作製する。ある
いは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドをコードするｃＤＮＡと配列番号２で表される
アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａとが独立のプロモーターにより発現調節されるように
配置された同一の発現ベクター内に挿入されていても良
い。

【００５３】該組換発現ベクターを、該発現ベクターに
適合した宿主細胞内に導入する。宿主細胞としては、目
的とするＤＮＡを発現できるものは全て用いることがで
き、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属、セラチ
ア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacter
ium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、
シュードモナス（Pseudomonas）属、バチルス（Bacillu
s）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属等に
属する細菌、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、
サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロ
マイセス（Shizosaccharomyces）属、トリコスポロン
（Trichosporon）属、シワニオミセス（Schwanniomyce
s）属等に属する酵母や動物細胞、昆虫細胞等を用いる
ことができる。

【００５４】発現ベクターとしては、宿主細胞において
自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、該
ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している
ものが用いられる。

【００５５】細菌を宿主細胞として用いる場合は、該Ｄ
ＮＡ組換発現ベクターは該細菌中で自立複製可能である
と同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該ポリ
ペプチドのＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組
換発現ベクターであることが好ましい。ベクターにはプ
ロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。

【００５６】発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、
pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社
製）、pKK233-2（Amersham Pharmacia Biotech社製）、
pSE280（Invitrogen社製)、pGEMEX-1（Promega社製）、p
QE-8（QIAGEN社製）、pKYP10〔特開昭58-110600〕、pKY
P200〔Agricultural Biological Chemistry, 48, 669
(1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (198
9)〕、pGEL1〔Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 82, 4306
(1985)〕、pBluescript II SK(-)（Stratagene社製）、
pGEX（Amersham Pharmacia Biotech社製）、pET-3（Nov
agen社製）、pTerm2(USP4686191、USP4939094、USP5160
735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J. Bact
eriol., 172, 2392 (1990)〕等を例示することができ
る。

【００５７】発現ベクターとしては、リボソーム結合配
列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と
開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）
に調節したものを用いることが好ましい。

【００５８】プロモーターとしては、宿主細胞中で機能
するものであればいかなるものでもよい。例えば、trp
プロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、P
_Lプロモーター、P_Rプロモーター、T7プロモーター等の
大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１
プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモ
ーター等を挙げることができる。またＰtrpを２つ直列
させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーター、
letIプロモーター〔Gene, 44, 29(1986）〕、lacT7プロ
モーターのように人為的に設計改変されたプロモーター
等も用いることができる。

【００５９】アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡ
ＬＫ７をコードする部分のＤＮＡの塩基配列を、宿主細
胞での発現に最適なコドンとなるように置換することに
より、目的とするポリペプチドまたは蛋白質の生産率を
向上させることができる。上記ポリペプチドまたは蛋白
質をコードするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずし
も必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結
配列を配置することが望ましい。

【００６０】宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラ
チア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウ
ム属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1
-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli
DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY
3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM1
09、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.4
9、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、
Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bre
vibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immarioph
ilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATC
C14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Cory
nebacteriumglutamicum ATCC14067、Corynebacterium g
lutamicum ATCC13869、Corynebacte rium acetoacidophi
lum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15
354、Pseudomonas sp. D-0110等を挙げることができ
る。

【００６１】組換発現ベクターの導入方法としては、上
記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用
いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方
法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (197
2)〕、プロトプラスト法〔特開昭63-248394〕、またはG
ene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics,
168, 111 (1979)に記載の方法等を挙げることができ
る。

【００６２】酵母を宿主細胞として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC3711
5）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC3741
9）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができ
る。

【００６３】プロモーターとしては、酵母中で機能する
ものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５
プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモータ
ー、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇ
ａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモ
ーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモータ
ー等を挙げることができる。

【００６４】宿主細胞としては、サッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロ
ミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリ
ュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、
トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulan
s）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces
alluvius）等を挙げることができる。

【００６５】組換発現ベクターの導入方法としては、酵
母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いること
ができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods.
inEnzymol., 194, 182 (1990)、スフェロプラスト法
〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929 (1978)〕、
酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163 (1983)〕、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)に記載
の方法等を挙げることができる。

【００６６】動物細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、発現ベクターとして、例えば、pｃＤＮＡ１．１(In
vitrogen社製)、ｐＣＤＭ８（Invitrogen社製）、ｐＡ
ＧＥ１０７〔特開平3-22979；Cytotechnology, 3, 133
(1990)〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐｃＤＮ
Ａ１．１／Ａｍｐ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（In
vitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem., 101,
1307(1987)〕、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができ
る。

【００６７】プロモーターとしては、動物細胞中で機能
するものであればいずれも用いることができ、例えば、
サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅ
ｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ
４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋
白質プロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげること
ができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサ
ーをプロモーターと共に用いてもよい。

【００６８】宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマ
ルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、
チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、Ｈ
ＢＴ５６３７〔特開昭63-299〕等をあげることができ
る。

【００６９】組換発現ベクターの導入法としては、動物
細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることが
でき、例えば、エレクトロポーレーション法〔Cytotech
nology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開
平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Aca
d. Sci., USA, 84, 7413 (1987)、Virology, 52, 456
(1973)〕等を用いることができる。

【００７０】昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、例えばバキュロウイルス・エクスプレッション・ベ
クターズ，ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculoviru
s Expression Vectors, A Laboratory Manual）、カレ
ント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロ
ジーサプルメント１−３８(1987-1997)、Bio/Technolog
y, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、ポリペ
プチドまたは蛋白質を発現することができる。

【００７１】即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバ
キュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上
清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルス
を昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドまたは蛋白質を発
現させることができる。遺伝子導入用ベクターとして
は、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌ
ｕｅＢａｃIII（ともにInvitrogen社製）等をあげるこ
とができる。バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗
蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カ
リフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス
(Autographa californica nuclear polyhedrosis viru
s)等を用いることができる。

【００７２】昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperd
aの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Baculovirus Exp
ression Vectors, A Laboratory Manual、W.H.Freeman
andCompany，New York，(1992)〕、Trichoplusia niの
卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（Invitrogen社製）等を用
いることができる。

【００７３】組換えウイルスを調製するための、昆虫細
胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウ
イルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法〔特開平2-227075〕、リポフェクション法〔Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 84,7413 (1987)〕等をあげる
ことができる。

【００７４】遺伝子の発現方法としては、直接発現以外
に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されてい
る方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行う
ことができる。酵母、動物細胞または昆虫細胞により発
現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペ
プチドまたは蛋白質を得ることができる。

【００７５】該蛋白質のＤＮＡを組み込んだ組換え体Ｄ
ＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に
目的ポリペプチドまたは目的蛋白質を生成蓄積させ、該
培養物より該ポリペプチドまたは蛋白質を採取すること
により、目的ポリペプチドまたは目的蛋白質を製造する
ことができる。アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡ
ＬＫ７を製造するための形質転換体を培地に培養する方
法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って
行うことができる。

【００７６】上記形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵
母等の真核生物を宿主細胞とする場合、これら形質転換
体を培養する培地は、該宿主細胞が資化し得る炭素源、
窒素源、無機物等を含有し、形質転換体の培養を効率的
に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでも
よい。

【００７７】炭素源としては、それぞれの宿主細胞が資
化し得るものであればよく、グルコース、フラクトー
ス、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンある
いはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオ
ン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアル
コール類を用いることができる。

【００７８】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の各種無機酸若しくは有機酸のアンモニ
ウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加
水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌
体およびその消化物等が用いられる。

【００７９】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。

【００８０】培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養
などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃が
よく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養
中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、
無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カル
シウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要
に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物
質を培地に添加してもよい。

【００８１】プロモーターとして誘導性のプロモーター
を有する発現ベクターを用いた形質転換体を培養すると
きには、必要に応じてインデューサーを培地に添加して
もよい。例えば、lacプロモーターを有する発現ベクタ
ーを用いた形質転換体を培養するときにはイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、
trpプロモーターを有する発現ベクターを用いた形質転
換体を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡ
Ａ）等を培地に添加してもよい。

【００８２】動物細胞を宿主細胞として得られた形質転
換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲ
ＰＭＩ１６４０培地〔The Journal of the American Me
dical Association, 199, 519 (1967)〕、Ｅａｇｌｅの
ＭＥＭ培地〔Science, 122,501 (1952)〕、ダルベッコ
改変ＭＥＭ培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、１９９
培地〔Proceeding of the Society for the Biological
Medicine, 73, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児
血清等を添加した培地等を用いることができる。

【００８３】培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、
５％ＣＯ₂存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、
培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗
生物質を培地に添加してもよい。

【００８４】昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転
換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴ
ＮＭ−ＦＨ培地（Pharmingen社製）、Ｓｆ−９００ Ｉ
ＩＳＦＭ培地（Life Technologies社製）、ＥｘＣｅｌ
ｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもJRH Bioscien
ces社製）、Grace's Insect Medium〔Grace, T.C.C.,Na
ture, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。培
養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１
〜５日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイ
シン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

【００８５】形質転換体の培養物から、目的ポリペプチ
ドまたは目的蛋白質を単離精製するには、通常のポリペ
プチドまたは蛋白質の単離、精製法を用いればよい。例
えば、ポリペプチドまたは蛋白質が、細胞内に溶解状態
で産生した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離によ
り回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレン
チプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミ
ル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細
胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、
通常のポリペプチドまたは蛋白質の単離精製法、即ち、
溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒に
よる沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セフ
ァロース、DIAION HPA-75（三菱化学社製）等レジンを
用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharos
e FF(Amersham Pharmacia Biotech社製)等のレジンを用
いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファ
ロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水
性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、
アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォー
カシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を
単独あるいは組み合わせて用い、ポリペプチドまたは蛋
白質の精製標品を得ることができる。

【００８６】また、ポリペプチドまたは蛋白質が細胞内
に不溶体を形成して産生した場合は、細胞を回収後破砕
し、遠心分離することにより、沈殿画分としてポリペプ
チドまたは蛋白質の不溶体を回収する。回収したポリペ
プチドまたは蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化す
る。可溶化液を希釈あるいは透析して、可溶化液中の蛋
白質変性剤の濃度を下げることにより、ポリペプチドま
たは蛋白質の構造を正常な立体構造に戻した後、上記と
同様の単離精製法によりポリペプチドまたは蛋白質の精
製標品を得る。

【００８７】ポリペプチドまたは蛋白質あるいはその糖
修飾体等が細胞外に分泌された場合には、培養上清か
ら、該ポリペプチドまたは蛋白質あるいはその糖修飾体
等を回収することができる。即ち、培養物から遠心分離
等の手法により培養上清を回収し、該培養上清から、上
記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を
得ることができる。

【００８８】このようにして取得されるポリペプチドま
たは蛋白質として、例えば、配列番号１および２で表さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１お
よび２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドか
ら構成される二量体蛋白質、配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドから構成される二量体蛋
白質および配列番号５および６で表される塩基配列を含
むｃＤＮＡにコードされる蛋白質等をあげることができ
る。

【００８９】また、該ポリペプチドまたは蛋白質を、Ｆ
ｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔ
Ｂｏｃ法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法
によっても製造することができる。また、米国Advanced
ChemTech社製、Perkin-Elmer社製、Amersham Pharmaci
a Biotech社製、米国Protein Technology Instrument社
製、米国Synthecell-Vega社製、米国PerSeptive社製、
島津製作所社製等のペプチド合成機を利用し合成するこ
ともできる。

【００９０】２．アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたは
ＡＬＫ７を特異的に認識する抗体の作製 上記１で取得されるポリペプチドまたは蛋白質の部分断
片精製標品、あるいは配列番号１または２で表されるア
ミノ酸配列、配列番号５および６で表される塩基配列を
含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質のアミノ酸配列を用
いて、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等、ア
クチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７を認識する
抗体を作製することができる。

【００９１】（１）ポリクローナル抗体の作製 アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７または該
蛋白質の部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいは該
蛋白質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原と
して用い、動物に投与することによりポリクローナル抗
体を作製することができる。投与する動物として、ウサ
ギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いること
ができる。

【００９２】該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１
００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチ
ドをスカシガイヘモシアニン（keyhole limpet haemocy
anin）や牛チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結
合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペ
プチドは、ペプチド合成機で合成することができる。

【００９３】該抗原の投与は、1 回目の投与の後１〜２
週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼
底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応
することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ法）：医学書院刊（１９７６年）、Antibodies-A Lab
oratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (198
8)〕等で確認する。

【００９４】免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分
な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該
血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を
取得することができる。分離、精製する方法としては、
遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩
析、カプリル酸沈殿〔Antibodies, A Laboratory manua
l, Cold SpringHarbor Laboratory, (1988)〕、または
ＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、
プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム
等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合
わせて処理する方法があげられる。

【００９５】（２）モノクローナル抗体の作製 （ａ）抗体産生細胞の調製 免疫に用いた蛋白質の部分断片ポリペプチドに対し、そ
の血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の
供給源として供する。該抗体価を示したラットに抗原物
質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。

【００９６】該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で
細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分
間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の
脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６
５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培
地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として
用いる。

【００９７】（ｂ）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した
株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マ
ウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(以下、
Ｐ３−Ｕ１と略す)〔Curr. Topics. Microbiol. Immuno
l., 81, 1 (1978)、Europ. J. Immunol., 6, 511 (197
6)〕、SP2/0-Ag14(SP-2)〔Nature, 276, 269 (197
8)〕、P3-X63-Ag8653(653)〔J. Immunol., 123, 1548
(1979)〕、P3-X63-Ag8(X63)〔Nature, 256, 495 (197
5)〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−
アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミ
ン（１．５mmol/l）、２−メルカプトエタノール（５×
１０^-5mol/l）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）
および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を
加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−ア
ザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代す
るが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合
には該細胞を２×１０⁷個以上用いる。

【００９８】（ｃ）ハイブリドーマの作製 （ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム
１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６
５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、
細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１に
なるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し
た後、上清を捨てる。

【００９９】得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐし、
該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０⁸抗体産生
細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（Ｐ
ＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌおよびジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を
０．２〜１ｍｌ添加し、さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培
地１〜２ｍｌを数回添加する。

【０１００】添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍ
ｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５
分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細
胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込
み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキ
サンチン（１０^-4mol/l）、チミジン（１．５×１０^{- 5}m
ol/l）およびアミノプテリン（４×１０^-7 mol/l）を加
えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。

【０１０１】該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００
μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ₂インキュベーター中、
３７℃で７〜１４日間培養する。

【０１０２】培養後、培養上清の一部をとりアンチボデ
ィイズ〔Antibodies, A Laboratorymanual, Cold Sprin
g Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)〕等に述べら
れている酵素免疫測定法により、アクチビンＡＢ、アク
チビンＢまたはＡＬＫ７の部分断片ポリペプチドに特異
的に反応するハイブリドーマを選択する。

【０１０３】酵素免疫測定法の具体例として、以下の方
法をあげることができる。免疫の際、抗原に用いたアク
チビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７の部分断片ポ
リペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドー
マ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を
第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチ
ン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識
した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反
応させた後に標識物質に応じた反応を行い、アクチビン
ＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７に特異的に反応する
ものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリ
ドーマとして選択する。

【０１０４】該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法に
よりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地
（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回
目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認
められたものを本発明のモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ株として選択する。

【０１０５】（ｄ）モノクローナル抗体の調製 プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投
与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまた
はヌードマウスに、（ｃ）で取得したモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０⁶細胞／匹を
腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは
腹水癌化する。

【０１０６】該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、
３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去す
る。得られた上清より、ポリクローナル抗体で用いた方
法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得する
ことができる。

【０１０７】抗体のサブクラスの決定は、マウスモノク
ローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクロー
ナル抗体タイピングキットを用いて行う。ポリペプチド
量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算
出する。

【０１０８】３．アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたは
ＡＬＫ７をコードするＤＮＡを用いたアクチビンＡＢ、
アクチビンＢまたはＡＬＫ７遺伝子のｍＲＮＡの検出方
法 該検出方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば配列番
号３または４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、また
は配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮ
Ａ、もしくはそれらから得られるＤＮＡ断片等が挙げら
れる。以下、これらを本発明に用いるＤＮＡとも称す
る。該遺伝子のｍＲＮＡの発現量や構造変化を検出する
方法としては、例えば（１）ノーザンブロット法（２）
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、（３）定量
的ＰＣＲ法、（４）デファレンシャル・ハイブリダイゼ
ーション法、（５）ＤＮＡチップ法、（６）ＲＮａｓｅ
保護アッセイ法などの方法等があげられる。

【０１０９】上記方法による分析に供する検体として
は、糖尿病患者ならびに健常者より取得した膵臓組織、
血清、唾液等の生体試料、あるいは該生体試料から細胞
を取得して試験管内の適当な培地中で培養した初代培養
細胞試料から取得したｍＲＮＡあるいは全ＲＮＡが用い
られる（以後、該ｍＲＮＡおよび全ＲＮＡを検体由来Ｒ
ＮＡと称する）。また、生体試料から取得した組織を、
パラフィンあるいはクリオスタット切片として単離した
ものを用いることもできる。

【０１１０】ノーザンブロット法では、検体由来ＲＮＡ
をゲル電気泳動で分離後、ナイロンフィルター等の支持
体に転写し、本発明に用いるＤＮＡより調製した標識プ
ローブを用いて、ハイブリダイゼーションならびに洗浄
を行うことで、該遺伝子ｍＲＮＡに特異的に結合したバ
ンドを検出することにより、該遺伝子ｍＲＮＡの発現量
ならびに構造の変化を検出することができる。ハイブリ
ダイゼーションを行う際には、プローブと検体由来ＲＮ
Ａ中の該遺伝子ｍＲＮＡが安定なハイブリッドを形成す
る条件でインキュベーションする。偽陽性を防ぐために
は、ハイブリダイゼーションならびに洗浄工程は高スト
リンジェントな条件で行うことが望ましい。この条件
は、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ、お
よびホルムアミド濃度等の多数の因子により決定され
る。これらの因子は、例えば、モレキュラー・クローニ
ング 第２版に記載されている。

【０１１１】ノーザンブロット法に用いる標識プローブ
は、例えば、公知の方法(ニック・トランスレーショ
ン、ランダム・プライミングまたはキナージング)によ
り放射性同位体、ビオチン、蛍光基、化学発光基等を、
本発明に用いるＤＮＡあるいは該ＤＮＡの配列から設計
したオリゴヌクレオチドに取り込ませることで調製する
ことができる。標識プローブの結合量は該遺伝子ｍＲＮ
Ａの発現量を反映することから、結合した標識プローブ
の量を定量することで該遺伝子ｍＲＮＡの発現量を定量
することができる。また、標識プローブ結合部位を分析
することで、該遺伝子ｍＲＮＡの構造変化を知ることが
できる。

【０１１２】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法
は、上記標識プローブと、生体から取得した組織をパラ
フィンあるいはクリオスタット切片として単離したもの
を用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄の工程を行
うことにより、該遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出する
方法である。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法
で、偽陽性を防ぐためには、ハイブリダイゼーションな
らびに洗浄工程は高ストリンジェントな条件で行うこと
が望ましい。この条件は、温度、イオン強度、塩基組
成、プローブの長さ、およびホルムアミド濃度等の多数
の因子により決定される。これらの因子は、例えばカレ
ント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロ
ジーに記載されている。

【０１１３】定量的ＰＣＲ法、デファレンシャル・ハイ
ブリダイゼーション法またはＤＮＡチップ法等の該遺伝
子のｍＲＮＡの検出法は、検体由来ＲＮＡに、オリゴｄ
Ｔプライマーあるいはランダムプライマーおよび逆転写
酵素を用いてｃＤＮＡを合成することに基づいた方法で
行うことができる（以後、該ｃＤＮＡを検体由来ｃＤＮ
Ａと称する）。検体由来ＲＮＡがｍＲＮＡの場合は、上
記いずれのプライマーも用いることができるが、該検体
由来ＲＮＡが全ＲＮＡである場合は、オリゴｄＴプライ
マーを用いる。

【０１１４】定量的ＰＣＲ法では、検体由来ｃＤＮＡを
テンプレートとし、アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ
鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの塩基配列に基
づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、
該遺伝子のｍＲＮＡ由来のＤＮＡ断片を増幅する方法で
ある。増幅ＤＮＡ断片の量は該遺伝子のｍＲＮＡの発現
量を反映することから、アクチンやG3PDH(glyceraldehy
de 3-phosphate dehydrogenase)等をコードするＤＮＡ
を内部コントロールとして置くことで該遺伝子のｍＲＮ
Ａの量を定量することが可能である。また、増幅ＤＮＡ
断片をゲル電気泳動により分離することで、該遺伝子の
ｍＲＮＡの構造の変化を知ることもできる。本検出法で
は、標的配列を特異的にかつ効率的に増幅する適当なプ
ライマーを用いることが望ましい。適当なプライマー
は、プライマー間の結合やプライマー内の結合を起こさ
ず、アニーリング温度で標的ｃＤＮＡと特異的に結合し
て、変性条件で標的ｃＤＮＡからはずれる等の条件に基
づき設計することができる。増幅ＤＮＡ断片の定量は増
幅産物が指数関数的に増加しているＰＣＲ反応の内に行
うことが必要である。このようなＰＣＲ反応は、各反応
ごとに生産される該増幅ＤＮＡ断片を回収してゲル電気
泳動で定量分析することで知ることができる。

【０１１５】デファレンシャル・ハイブリダイゼーショ
ン法〔Trends in Genetics, 7, 314-317(1991)〕やＤＮ
Ａチップ法〔Genome Research, 6, 639-645(1996)〕
は、検体由来ｃＤＮＡをプローブとして、本発明に用い
るＤＮＡを固定化させたフィルターまたはスライドガラ
スあるいはシリコンなどの基板に対して、ハイブリダイ
ゼーションならびに洗浄を行うことにより、該遺伝子ｍ
ＲＮＡの発現量の変動を検出する方法である。いずれの
方法もフィルターまたは基板上に、アクチンやＧ３ＰＤ
Ｈなどの内部コントロールを固定化することで、対照検
体と標的検体の間での該遺伝子のｍＲＮＡの発現の違い
を正確に検出することができる。また対照検体と標的検
体由来のＲＮＡを基にそれぞれ異なる標識ｄＮＴＰを用
いて標識ｃＤＮＡ合成を行い、フィルターまたは基板に
二つの標識ｃＤＮＡプローブを同時にハイブリダイズさ
せることにより正確な該遺伝子のｍＲＮＡの発現量の定
量を行うことができる。

【０１１６】ＲＮａｓｅ保護アッセイ法は、以下の方法
により行う。まず、本発明に用いるＤＮＡの３’末端に
Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどのプロモー
ター配列を結合し、ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ
ｖｉｔｒｏの転写系により標識したｒＮＴＰを用いて、
標識したアンチセンスＲＮＡを合成する。該標識アンチ
センスＲＮＡを検体由来ＲＮＡと結合させて、ＲＮＡ−
ＲＮＡハイブリッドを形成させた後、ＲＮａｓｅで消化
し、消化から保護されたＲＮＡ断片をゲル電気泳動によ
りバンドを形成させ検出する。得られたバンドを定量す
ることで、該遺伝子のｍＲＮＡの発現量を定量すること
ができる。

【０１１７】４．アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、また
はＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体を用いた免疫
学的検出または定量方法 アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質
を特異的に認識する抗体（ポリクローナル抗体またはモ
ノクローナル抗体）を用いて、微生物、動物細胞あるい
は昆虫細胞または組織の細胞内あるいは細胞外に発現し
たアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白
質を免疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光
抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質
標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞
染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法
等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティ
ング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法〔単ク
ローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィッ
ク）（１９８７）、続生化学実験講座５ 免疫生化学研
究法（東京化学同人）（１９８６）〕などが挙げられ
る。

【０１１８】蛍光抗体法とは、アクチビンＡＢ、アクチ
ビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外
に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組
織に、本発明の抗体を反応させ、さらにフルオレシン・
イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質でラベ
ルした抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させ
た後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法
である。

【０１１９】酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）とは、ア
クチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を
細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞ある
いは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、
さらにペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識など
を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応さ
せた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。

【０１２０】放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）と
は、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋
白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細
胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応
させ、さらに放射線標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あ
るいはその断片を反応させた後、シンチレーションカウ
ンターなどで測定する方法である。

【０１２１】免疫細胞染色法、免疫組織染色法などの免
疫組織化学染色法とは、アクチビンＡＢ、アクチビン
Ｂ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発
現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織
に、本発明の抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍
光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を
施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させ
た後、顕微鏡を用いて観察する方法である。

【０１２２】ウェスタンブロッティング法とは、アクチ
ビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞
内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは
昆虫細胞または組織の抽出液をＳＤＳ-ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動〔Antibodies-A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, （1988）〕で分画し
た後、該ゲルをＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜
にブロッティングし、該膜に本発明の抗体を反応させ、
さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビ
オチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体ある
いはその断片を反応させた後、確認する方法である。

【０１２３】ドットブロッティング法とは、アクチビン
ＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あ
るいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫
細胞または組織の抽出液をニトロセルロース膜にブロッ
ティングし、該膜にアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、ま
たはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体を反応さ
せ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダー
ゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗
体あるいは結合断片を反応させた後、確認する方法であ
る。

【０１２４】免疫沈降法とは、アクチビンＡＢ、アクチ
ビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外
に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組
織の抽出液をアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡ
ＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体と反応させた後、
プロテインＧ−セファロース等イムノグロブリンに特異
的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降
させる方法である。サンドイッチＥＬＩＳＡ法とは、ア
クチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を
特異的に認識する抗体で、抗原認識部位の異なる２種類
の抗体のうち、あらかじめ一方の抗体をプレートに吸着
させ、もう一方の抗体をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペル
オキシダーゼ、ビオチンなどの酵素で標識しておき、抗
体吸着プレートに、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、ま
たはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した
微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液
を反応させた後、標識した抗体を反応させ、結合した標
識物質により検出を行う方法である。

【０１２５】５．アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ
鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの変異同定方法 当該方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば配列番号
３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または
配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮ
Ａ、もしくはそれらから得られるＤＮＡ断片等があげら
れる。

【０１２６】アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、ま
たはＡＬＫ７遺伝子座中に存在する糖尿病の原因となる
変異の存在の有無を評価するための最も明確な試験は、
対照集団からの遺伝子と糖尿病患者からの遺伝子とを直
接比較することである。

【０１２７】具体的には糖尿病患者ならび健常人から、
膵臓組織、血清、唾液等のヒト生体試料あるいは、該生
体試料から樹立した初代培養細胞由来の試料を集め、該
生体試料ならびに該初代培養細胞由来試料中からＤＮＡ
を抽出する（以後、該ＤＮＡを検体由来ＤＮＡと称す
る）。該検体由来ＤＮＡは、直接あるいは配列番号３ま
たは４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列
番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩
基配列に基づき設計したプライマーを用いて増幅したア
クチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７を
コードするＤＮＡを試料ＤＮＡとして用いることができ
る。別法として、該検体由来ｃＤＮＡをテンプレートと
して、配列番号３または４で表される塩基配列を有する
ＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列
を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマー
によりＰＣＲを行うことで増幅したＤＮＡ断片を試料Ｄ
ＮＡとして用いることができる。

【０１２８】アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、ま
たはＡＬＫ７をコードするＤＮＡに糖尿病の原因となる
変異があるかどうかを検出する方法として、野生型対立
遺伝子を有するＤＮＡ鎖と変異対立遺伝子を有するＤＮ
Ａ鎖とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖
を検出する方法を用いることができる。

【０１２９】ヘテロ二本鎖を検出する方法としては、
（１）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二
本鎖検出法〔Trends Genet., 7, 5 (1991)〕、（２）一
本鎖コンフォメーション多型解析法〔Genomics, 16, 32
5-332 (1993)〕、（３）ミスマッチの化学的切断法（CC
M, chemical cleavage of mismatches）[Human Genetic
s (1996), Tom Strachan and Andrew P. Read, BIOS Sc
ientific Publishers Limited]、（４）ミスマッチの酵
素的切断法〔Nature Genetics, 9, 103-104 (1996)〕、
（５）変性ゲル電気泳動法〔Mutat. Res., 288, 103-11
2 (1993)〕 等の方法をあげることができる。

【０１３０】ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘ
テロ二本鎖検出法は、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来
ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３または４で
表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５お
よび６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に
基づき設計したプライマーを用いたＰＣＲによって、２
００ｂｐよりも小さい断片としてアクチビンβＡ鎖、ア
クチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの
断片を増幅し、該増幅ＤＮＡ断片を、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動し、変異を有さないホモ二本鎖と泳動度
を比較する方法である。アクチビンβＡ鎖、アクチビン
βＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの変異によ
りヘテロ二本鎖が形成された場合は、変異を持たないホ
モ二本鎖よりもゲルの移動度が遅く、それらはホモ二本
鎖と異なるバンドとして検出することができる。該電気
泳動には、市販のゲル〔Ｈｙｄｒｏ−ｌｉｎｋ，ＭＤＥ
（ＦＭＣ社製）など〕を用いることもできる。また、２
００ｂｐよりも小さいＤＮＡ断片を用いたヘテロ二本鎖
検出法では、１塩基の挿入、欠失および置換を検出可能
である。ヘテロ二本鎖解析は、次に述べる一本鎖コンフ
ォメーション多型解析と組み合わせた１枚のゲルで行う
ことが望ましい。

【０１３１】一本鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳ
ＣＰ解析；single strand conformation polymorphism
analysis）は、検体由来ＤＮＡまたは検体由来ｃＤＮＡ
をテンプレートに、配列番号３または４で表される塩基
配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表さ
れる塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計し
たプライマーを用いたＰＣＲにより、２００ｂｐよりも
小さい断片として増幅したアクチビンβＡ鎖、アクチビ
ンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを変性
後、未変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動す
る方法である。ＤＮＡの増幅を行う際にプライマーを放
射性同位体あるいは蛍光色素で標識するか、または未標
識の増幅産物を銀染色することにより、増幅したアクチ
ビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコー
ドするＤＮＡをバンドとして検出することができる。野
生型の泳動パターンとの相違を明らかにするために、コ
ントロールの検体も同時に電気泳動すると、塩基配列に
変異を持った断片を移動度の違いから検出することがで
きる。

【０１３２】ミスマッチの化学的切断法（ＣＣＭ法）
は、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプ
レートに、配列番号３または４で表される塩基配列を有
するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基
配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライ
マーでアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡ
ＬＫ７をコードするＤＮＡ断片を増幅させ、該増幅ＤＮ
Ａ断片と配列番号３または４で表される塩基配列を有す
るＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配
列を含むｃＤＮＡに放射性同位体あるいは蛍光色素をと
り込ませた標識ＤＮＡとをハイブリダイズさせ、四酸化
オスミウムで処理することでミスマッチしている場所の
ＤＮＡの一方の鎖を切断させ塩基配列の変異を検出する
方法である。ＣＣＭ法は最も感度の高い検出法の１つで
あり、キロベースの長さの検体にも適応できる。

【０１３３】上記、四酸化オスミウムの代わりにＴ４フ
ァージリゾルベースとエンドヌクレアーゼＶＩＩのよう
な細胞内でミスマッチの修復に関与する酵素とＲＮａｓ
ｅＡと組み合わせることで、酵素的にミスマッチを切断
することもできる。

【０１３４】変性ゲル電気泳動法（denaturing gradien
t gel electrophoresis：DGGE法）は、検体由来ＤＮＡ
または検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番
号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、また
は配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮ
Ａの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したア
クチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７を
コードするＤＮＡ断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度
勾配を有するゲルを用いて電気泳動する方法である。増
幅したＤＮＡ断片はゲル内を一本鎖に変性する位置まで
移動し、変性後は移動しなくなる。アクチビンβＡ鎖、
アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡ
に変異がある場合とない場合では増幅したＤＮＡのゲル
内での移動度が異なることから、変異の存在を検出する
ことが可能である。ＰＣＲに使用するそれぞれのプライ
マーにポリ（Ｇ：Ｃ）端末を付けて検出感度を上げるこ
ともできる。

【０１３５】糖尿病の原因遺伝子を検出する別の方法と
して、蛋白質短縮試験（protein truncation test：Ｐ
ＴＴ法）〔Genomics, 20, 1-4 (1994)〕がある。該試験
により蛋白質の欠損を生み出すフレームシフト突然変
異、スプライス部位突然変異、ナンセンス突然変異を特
異的に検出することができる。ＰＴＴ法は、配列番号３
または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配
列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの
５’末端にＴ７プロモーター配列と真核生物翻訳開始配
列をつないだプライマーを設計し、該プライマーを用い
て検体由来ＲＮＡより逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法
でアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ
７をコードするｃＤＮＡを作製する。該ｃＤＮＡを用
い、in vitro転写、翻訳を行うと蛋白質が生産される。
該蛋白質をポリアクリルアミド電気泳動して、該蛋白質
の泳動位置が完全長蛋白質に相当する位置にあれば欠損
を生み出す変異は存在せず、該蛋白質に欠損がある場合
は、完全長蛋白質より短い位置に該蛋白質は泳動され、
該位置より欠損の程度を知ることができる。

【０１３６】検体由来ＤＮＡおよび検体由来ｃＤＮＡの
塩基配列を決定するために配列番号３または４で表され
る塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６
で表される塩基配列を含むｃＤＮＡに基づいて設計した
プライマーを用いることが可能である。決定された塩基
配列を解析することにより、検体由来ＤＮＡまたは検体
由来ｃＤＮＡに糖尿病の原因となる変異があるか否かを
判別することができる。

【０１３７】アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、ま
たはＡＬＫ７遺伝子のコード領域以外の変異は、該遺伝
子の付近またはその中のイントロンおよび調節配列など
の、非コード領域を検査することによって検出すること
ができる。非コード領域中の変異に起因する糖尿病は、
上記に記載した方法と同様の方法により検出することが
できる。

【０１３８】このようにして非コード領域における変異
の存在が示唆された該遺伝子については、配列番号３ま
たは４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列
番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡをハ
イブリダイゼーションのプローブとして用いることによ
り、クローン化することができる。非コード領域におけ
る変異は上述のいずれかの方法に準じて探索することが
できる。

【０１３９】見出された変異は、Handbook of Human Ge
netics Linkage. The John HopkinsUniversity Press,
Baltimore(1994)に記載された方法に従い統計処理を行
うことで、糖尿病との連鎖があるＳＮＰｓ(シングル・
ヌクレオチド・ポリモルフィズム）として同定すること
ができる。また、糖尿病の病歴を持つ家族から、先に示
した方法に従いＤＮＡを取得し、変異を検出すること
で、糖尿病の原因遺伝子を同定することができる。

【０１４０】６．アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ
鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを用いた糖尿病
の診断方法 上記方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば配列番号
３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または
配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮ
Ａ、もしくはそれらから得られるＤＮＡ断片等があげら
れる。糖尿病の原因は、ヒトのいずれかの組織における
遺伝子の変異を検出することによって確認することがで
きる。例えば、生殖細胞系に変異がある場合、当該変異
を遺伝した個人は、糖尿病を発症し易い傾向である可能
性がある。当該変異は、該個人の体のいずれかの組織か
ら抽出したＤＮＡを試験することによって検出すること
ができる。例えば、ヒトから採血した血液の細胞からＤ
ＮＡを抽出し、該ＤＮＡを用いて、遺伝子の変異を検出
することにより、糖尿病を診断することができる。ま
た、胎児細胞、胎盤細胞または羊膜細胞を採取してＤＮ
Ａを抽出し、該ＤＮＡを用いて、遺伝子の変異を検出す
ることにより、出生前の糖尿病診断を行うことができ
る。

【０１４１】また糖尿病を発症した患者の、病巣部位の
生体組織からＤＮＡを取得し、遺伝子の変異を検出する
ことにより、糖尿病の種類を診断し、投与する薬物の選
択などに利用することができる。生体組織からのＤＮＡ
は、周囲の正常組織から遊離した病巣部位の組織を単離
してトリプシンなどで処理し、得られた細胞を適当な培
地で培養し、培養した細胞から染色体ＤＮＡならびにｍ
ＲＮＡを抽出することにより取得することができる。

【０１４２】以下、診断を目的としてヒト検体から上記
いずれかの方法で取得したＤＮＡを診断検体由来ＤＮＡ
と称する。また、診断を目的としてヒト検体から上記い
ずれかの方法で取得したＲＮＡより合成したｃＤＮＡを
診断検体由来ｃＤＮＡと称する。配列番号３または４で
表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５お
よび６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、および診断
検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡを用い、
上記５のアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、または
ＡＬＫ７をコードするＤＮＡの変異を検出する方法に準
じた方法により糖尿病の診断を行うことができるが、上
記５の方法により、糖尿病との因果関係が見出された変
異を診断検体由来ＤＮＡまたは診断検体由来ｃＤＮＡが
有しているか否かを診断する方法としては、（１）制限
酵素部位の検出、（２）対立遺伝子特異的なオリゴヌク
レオチドプローブを利用する方法（ASO：allele specif
ic oligonucleotide hybridization）、（３）対立遺伝
子特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ（ARMS：
amplification refractory mutation system）、（４）
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（OLA：oli
gonucleotide ligation assay）、（５）PCR-PHFA法（P
CR-preferential homoduplex formation assay）、
（６）オリゴＤＮＡアレイを用いる方法〔蛋白質核酸酵
素、43, 2004-2011(1998)〕等の方法が挙げられる。

【０１４３】制限酵素部位の検出は、以下に記載の方法
に従い行うことができる。すなわち、単一塩基の変化に
より制限酵素部位が消失または発生する場合は、診断検
体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡを、配列番
号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、また
は配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮ
Ａの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてPCR
で増幅したのち、制限酵素で消化し、得られた制限酵素
切断ＤＮＡ断片を正常人の場合と比較することで簡便に
変異を検出することができる。さらに詳細に塩基の変化
を診断する方法としては、配列番号３または４で表され
る塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６
で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列情報なら
びに上記５の方法により同定された変異の情報を組合せ
ることでオリゴヌクレオチドプロ−ブを設計し、該オリ
ゴヌクレオチドプローブをフィルターに結合させてハイ
ブリダイズを行うリバースドットブロット法で変異を検
出する方法を挙げることができる。

【０１４４】対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプ
ローブ（ＡＳＯ）を利用する方法は、短い合成ＤＮＡプ
ローブが、完全に対合する塩基配列とのみハイブリダイ
ズする特徴を利用した方法で、１塩基の変異を容易に検
出することができる。具体的には、配列番号３または４
で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５
および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列
と、上記５で同定された塩基の変異に基づき設計したオ
リゴヌクレオチドをフィルターに結合させ、診断検体由
来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡをテンプレート
として用い、配列番号３または４で表される塩基配列を
有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩
基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列を用いて設計したプラ
イマーと標識したｄＮＴＰを用いたＰＣＲにより得られ
る増幅ＤＮＡ断片をプローブに用いてハイブリダイズを
行うリバースドットブロット法をあげることができる。

【０１４５】リバースドットブロットとは、スライドガ
ラスまたはシリコンなどの基盤に直接、測定対象とする
ＤＮＡに対応する変異のないＤＮＡの塩基配列と別途同
定された該ＤＮＡの変異に基づき設計したオリゴヌクレ
オチドを合成して、高密度のアレイであるＤＮＡチップ
を用いて、少量の診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体
由来ｃＤＮＡを反応させて多様な変異をより簡便に検出
する方法である。本方法は、大規模な診断目的に適した
変異検出法である。

【０１４６】塩基の変異は、オリゴヌクレオチドライゲ
ーションアッセイ（ＯＬＡ）法によって以下に示す方法
によっても検出できる。調べようとするアクチビンβＡ
鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤ
ＮＡの変異部位をその３’末端に有する２０塩基程度の
オリゴヌクレオチド、および該変異部位に続く２０塩基
程度のオリゴヌクレオチドを配列番号３または４で表さ
れる塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および
６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づ
き設計、合成する。このとき、例えば前者のオリゴヌク
レオチドの５’末端にはビオチンを、後者のオリゴヌク
レオチドの３’末端にはジゴケシゲニンなどの異なる標
識体を付加しておく。次に診断検体由来ＤＮＡあるいは
診断検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号
３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または
配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ
の塩基配列に基づき設計したプライマーを用い、ＰＣＲ
によりアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡ
ＬＫ７をコードするＤＮＡを増幅する。次に該増幅ＤＮ
Ａ断片と上記２本のオリゴヌクレオチドとをハイブリダ
イズさせる。ハイブリダイズ後、ＤＮＡリガーゼで２本
のオリゴヌクレオチドを連結させる。連結反応後、2本
鎖ＤＮＡを熱変性させて得られるビオチン標識一本鎖Ｄ
ＮＡを、例えばアビジンに結合するＤＮＡとして回収す
る。変位部位を有する増幅ＤＮＡ断片とハイブリダイズ
した上記２種類のオリゴヌクレオチドは上記連結反応に
より連結しているので、その３’末端にジゴケシゲニン
を有するＤＮＡとして得られ、該結合ＤＮＡを簡単に検
出することができる。よって、変位を有するアクチビン
βＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードす
るＤＮＡを迅速、簡便に検出可能である。ＯＬＡは電気
泳動や遠心分離操作が不要なために、多数のサンプルを
効果的に短期間で診断するのに適した変異検出法であ
る。

【０１４７】また、以下のPCR-PHFA法により微量な変異
遺伝子を定量的かつ容易に検出することができる。PCR-
PHFA法は、遺伝子増幅法（ＰＣＲ）、非常に高い特異性
を示す液相でのハイブリダイゼーション、およびELISA
と同様の操作でＰＣＲ産物を検出するED-PCR(enzymatic
detection of PCR product)の３つを組み合わせた方法
である。dinitrophenyl(DNP)標識およびビオチン標識し
たプライマーセットを用いて、配列番号３または４で表
される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５およ
び６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡをテンプレート
にＰＣＲを行い、両末端標識増幅ＤＮＡ断片を調製す
る。次に、標識プライマーと同じ塩基配列を有する未標
識プライマーセットを用いて、診断検体由来ＤＮＡある
いは診断検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに増幅して得
られる非標識増幅ＤＮＡ断片を、該標識増幅ＤＮＡ断片
と混合する。このとき非標識増幅ＤＮＡ断片は標識増幅
ＤＮＡ断片に対し、２０〜１００倍の大過剰量を用い
る。そして該混合物を熱変性処理後、１℃／５分〜１０
分間程度の緩やかな温度勾配で冷却し、完全な相補鎖を
優先的に形成させる。こうして再形成された標識ＤＮＡ
は、ビオチンを介してストレプトアビジン固定化ウエル
に捕獲吸着させ、ＤＮＰを介して酵素標識抗ＤＮＰ抗体
を結合させて酵素による発色反応により検出する。検体
中に標識ＤＮＡと同じ配列の遺伝子が存在しない場合
は、元の２本鎖の標識ＤＮＡが優先的に再形成されて発
色を示す。これに対し、同じ塩基配列の遺伝子が存在す
る場合は、相補鎖の置換がランダムに生じるため再形成
される標識ＤＮＡは減少するので、発色は著しく低下す
る。これにより、既知の変異・多型遺伝子の検出・定量
が可能となる。

【０１４８】７．アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、また
はＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体を用いた糖尿
病の診断方法 ヒト生体試料ならびヒト初代培養細胞での、アクチビン
ＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質の発現量の
変化ならびに発現している蛋白質の構造変化を同定する
ことは、糖尿病を発症する危険性や既に発症した膵臓機
能低下の原因を知る上で有用である。

【０１４９】アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡ
ＬＫ７蛋白質の発現量や構造変化を検出して診断する方
法としては、上記４に記載した蛍光抗体法、酵素免疫測
定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（Ｒ
ＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組
織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブ
ロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降
法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などがあげられる。

【０１５０】上記方法による診断に供する検体として
は、患者より取得した膵臓病巣部位の組織、血液、血
清、尿、便、唾液などの生体試料そのものあるいは、該
生体試料から取得した細胞ならびに細胞抽出液が用いら
れる。また、生体試料から取得した組織を、パラフィン
あるいはクリオスタット切片として単離したものを用い
ることもできる。

【０１５１】８．アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたは
ＡＬＫ７蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、または
該蛋白質のいずれかを認識する抗体を用いた糖尿病治療
薬のスクリーニング方法 本発明のスクリーニング方法に用いられる蛋白質として
は、アクチビンＡＢ、アクチビンＢおよびＡＬＫ７を挙
げることができる。アクチビンＡＢ、アクチビンＢは、
ＡＬＫ７のリガンド蛋白質としての活性を有する蛋白質
であれば、天然物由来の蛋白質でも、遺伝子工学的手法
により製造された蛋白質であってもよく、例えば天然由
来の該蛋白質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツ
ジ、ウマ、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ７
のリガンド蛋白質を挙げることができる。アクチビンＡ
Ｂの具体的例としては、配列番号１で表されるアミノ酸
配列からなるポリペプチドと配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドより構成される二量体蛋
白質を挙げることができ、アクチビンＢの具体的例とし
ては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペ
プチドにより構成される二量体蛋白質を挙げることがで
きる。ＡＬＫ７は、ＡＬＫ７としての活性、すなわちア
クチビンＡＢまたはアクチビンＢで活性化され、細胞の
インスリン分泌を促進する活性を有する蛋白質であれば
天然物由来の蛋白質でも、遺伝子工学的手法により製造
された蛋白質であってもよく、例えば天然由来の該蛋白
質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、
ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ７を挙げるこ
とができる。ＡＬＫ７の具体的例としては、配列番号５
および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードさ
れる蛋白質、配列番号９で表されるアミノ酸配列からな
る蛋白質を挙げることができる。本発明のスクリーニン
グ方法に用いられるＤＮＡとしては、アクチビンＡＢ、
アクチビンＢおよびＡＬＫ７をコードするＤＮＡを挙げ
ることができる。該ＤＮＡは、上記本発明のスクリーニ
ング方法に用いられる蛋白質をコードするＤＮＡであれ
ばいずれでもよい。アクチビンＡＢ、またはアクチビン
ＢをコードするＤＮＡの具体的例としては、配列番号３
または４で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげるこ
とができる。またＡＬＫ７をコードするＤＮＡの具体的
例としては、配列番号５および６で表される塩基配列を
含むｃＤＮＡ、配列番号１０で表される塩基配列を有す
るＤＮＡがあげられる。本発明のスクリーニング方法に
用いられる抗体としては、上記本発明のスクリーニング
方法に用いられる蛋白質、またはそのポリペプチド断片
を認識する抗体をあげることができる。

【０１５２】（１）アクチビンＡＢ、アクチビンＢまた
はＡＬＫ７蛋白質に特異的に作用する化合物のスクリー
ニング ＡＬＫ７蛋白質をII型アクチビン受容体と共に発現する
ように形質転換した微生物、動物細胞、または昆虫細
胞、および精製したアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、ま
たはＡＬＫ７蛋白質は、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ
またはＡＬＫ７蛋白質に特異的に作用する化合物をスク
リーニングするために有用である。II型アクチビン受容
体としては、II型アクチビン受容体としての活性を有す
る蛋白質であればいずれでもよく、例えばCell, 65, 97
3-982(1991)に記載されているActRIIA等を挙げることが
できる。スクリーニングにより得られた化合物は、糖尿
病治療薬として有用である。

【０１５３】上記スクリーニングの１つの方法は、ＡＬ
Ｋ７蛋白質とII型アクチビン受容体を生産するように形
質転換した動物細胞（以後、探索用形質転換体と称す
る）において、ＡＬＫ７の活性化を特異的に誘導する化
合物を選択することである。ＡＬＫ７の活性化を検出す
る方法としては、該探索用形質転換体の細胞応答を測定
する方法を挙げることができる。

【０１５４】具体的な細胞の応答としては、例えば、ア
ラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内
ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨ
の低下、細胞増殖活性、メラニン色素の凝集または拡
散、またはレポーター遺伝子の発現変動などをあげるこ
とができる〔J. Biol. Chem., 271, 1857 (1996)、Scie
nce, 268, 98 (1995) 、Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics, 275, 1274 (1995)、J. Bi
ol. Chem., 272,1822 (1997)、 Journal of Receptor a
nd Signal Transduction Research, 17,57 (1997)、End
ocrinology 138, 1400 (1997)、Endocrinology 138, 14
71 (1997)、 Nat. Biotechnol., 16, 1334 (1998)、Bio
chem. Biophys. Res. Commun., 251, 471 (1998)、Bri
t. J. Pharmacol., 125, 1387 (1998)、Trends Biotech
nol., 15, 487 (1997)、Anal. Biochem., 252, 115 (19
97)、Nature, 358, 325 (1992)、Nature, 393, 272 (19
98)、Cell, 92, 573 (1998)、J. Biol. Chem., 272,274
97 (1997)、Trends Pharmacol. Sci., 18, 430 (199
7)、Trends Pharmacol.Sci., 20, 370 (1999)、WO98/46
995〕。

【０１５５】レポーター遺伝子を用いて細胞の応答をモ
ニターする場合は、例えば、該探索用形質転換体に、Ａ
ＬＫ７の活性化により発現が誘導される遺伝子のプロモ
ーター配列の下流に適当なレポーター遺伝子を連結した
ＤＮＡを導入することにより、ＡＬＫ７の活性化をレポ
ーター遺伝子の発現で測定することができる。該プロモ
ーターとしては、例えばＩＣＡＭ−１遺伝子のプロモー
ター、ｃ−ｆｏｓのプロモーター、Ｋｒｏｘ−２４のプ
ロモーター〔Biochem. J., 320, 145 (1996)〕、インス
リン遺伝子のプロモーター、コリンアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子のプロモーター、チロシンハイドロキシ
ラーゼ遺伝子のプロモーターなどが利用できる。また、
該プロモーターは、適当な転写因子の結合配列と基本プ
ロモーターからなる人工プロモーターでもよい。転写因
子の結合配列としては、例えばＣＲＥ（CREB binding e
lement）、ＴＲＥ（TPA responsive element）、ＳＲＥ
（serum responsive element）、ＳＢＥ−ｌｕｘプロモ
ーター〔J. Biol. Chem.,273, 21145-21152 (1998)〕な
どが利用できる。レポーター遺伝子としては、クロラム
フェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β
−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝
子、β-ラクタマーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、ルシ
フェラーゼ遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・
プロテイン遺伝子などが利用できる。

【０１５６】また、精製したアクチビンＡＢ、アクチビ
ンＢまたはＡＬＫ７蛋白質、または該蛋白質の一部を構
成するポリペプチドは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ
またはＡＬＫ７蛋白質に特異的に結合する標的化合物を
選択するのに用いることができる。例えば、該蛋白質を
固相担体等に固定しておき、被験試料を接触させた後、
十分に該プレートを洗浄し、アクチビンＡＢ、アクチビ
ンＢまたはＡＬＫ７蛋白質に結合している化合物を該蛋
白質から遊離させることにより、標的化合物を選択する
ことができる。

【０１５７】上記スクリーニングのもう１つの方法とし
ては、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋
白質の一部を構成するペプチドを多数、プラスチックピ
ンまたはある種の固体支持体上で高密度に合成し、該ペ
プチドに選択的に結合する化合物あるいは蛋白質を効率
的にスクリーニングする方法がある（ＷＯ84/03564）。

【０１５８】（２）アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ
鎖またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの転写あるいは翻
訳を調節する化合物のスクリーニング方法 膵臓由来の細胞株で、アクチビンβＡ鎖、アクチビンβ
Ｂ鎖またはＡＬＫ７遺伝子のｍＲＮＡあるいはアクチビ
ンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質の発現を促
進する活性を有する化合物も、糖尿病治療薬として有用
である。膵臓由来の細胞株としては、マウス膵臓β細胞
種ＭＩＮ６細胞［Endocrinology, 127,126-132（199
0）］、マウスインスリノーマ細胞ＮＩＴ−１細胞 （AT
CC CRL-2055）、マウス膵臓α細胞種αＴＣ１細胞（ATC
C CRL-2350）、ラット膵管上皮細胞ＡＲＩＰ細胞（ATCC
CRL-1674）などを挙げることができる。

【０１５９】膵臓由来の細胞株と種々の被験試料を接触
させた場合と、被験試料を接触させない場合での該細胞
株におけるアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖または
ＡＬＫ７遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定、比較するこ
とでアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ
７遺伝子の転写を抑制または促進する物質をスクリーニ
ングすることができる。アクチビンβＡ鎖、アクチビン
βＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、上
記３のＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＲＮase保護ア
ッセイ法により検出することができる。

【０１６０】また、膵臓由来の細胞株と種々の被験試料
を接触させた場合と、被験試料を接触させない場合での
該細胞株におけるアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたは
ＡＬＫ７蛋白質の発現量を測定、比較することでアクチ
ビンＡＢ、アクチビンＢならびにＡＬＫ７遺伝子の転写
もしくは翻訳を抑制または促進する物質をスクリーニン
グすることができる。アクチビンＡＢ、アクチビンＢま
たはＡＬＫ７蛋白質の発現量は、上記４のアクチビンＡ
Ｂ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識
する抗体を用いた蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩ
ＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫
組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法
（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング
法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッ
チＥＬＩＳＡ法により測定することができる。

【０１６１】さらに、アクチビンβＡ鎖、アクチビンβ
Ｂ鎖またはＡＬＫ７遺伝子のプロモーターの下流にレポ
ーター遺伝子を連結した組換え体ＤＮＡで形質転換され
た動物細胞と種々の被験試料を接触させた場合と、被験
試料を接触させない場合での該動物細胞における該レポ
ーター遺伝子の発現量を測定、比較することでアクチビ
ンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子の発
現を抑制または促進する物質をスクリーニングすること
ができる。アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖または
ＡＬＫ７遺伝子のプロモーターは、該プロモーターの塩
基配列が公知である場合は、該配列に従い設計、合成す
ることができるオリゴヌクレオチドを用いて動物由来の
染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにて取得することがで
きる。プロモーター配列が公知でない場合は、上記遺伝
子のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドをプローブとし
て、公知の方法〔東京大学医科学研究所制癌研究部編、
新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３年）〕
を用いて、該遺伝子のプロモーター領域を取得すること
ができる。

【０１６２】細胞中のレポーター遺伝子の発現量は公知
の方法〔東京大学医科学研究所 制癌研究部編, 新細胞
工学実験プロトコール, 秀潤社 (1993)、Biotechnique
s, 20, 914 (1996)、J. Antibiotics, 49, 453 (1996)
、Trends in Biochemical Sciences, 20, 448 (199
5)、細胞工学, 16, 581 (1997)〕を用いて測定すること
ができる。

【０１６３】レポーター遺伝子としては、例えば、クロ
ラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝
子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺
伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン・フルオレッセ
ント・プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子等をあげることがで
きる。

【０１６４】上記の方法により取得した化合物は、NOD
(Non-Obese Diabetes)マウスなどの糖尿病モデル動物に
薬剤として投与し、該動物のインスリン分泌量ならびに
血糖値などを公知の方法に従って測定することにより、
該化合物のその糖尿病への治療効果を評価することが可
能である。

【０１６５】９．アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、また
はＡＬＫ７蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治
療および／または予防のための医薬 アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質
は、膵機能低下を原因とする種々の糖尿病において、膵
臓の構造ならびに機能を再構築することならびに膵臓か
らのインスリン分泌を促進することに用いることができ
る。

【０１６６】上記アクチビンＡＢ、アクチビンＢは、Ａ
ＬＫ７のリガンド蛋白質であれば天然由来のものでも、
遺伝子工学的手法によって製造された組み換え蛋白質で
あってもよい。天然由来のＡＬＫ７のリガンド蛋白質と
しては、例えばヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウ
マ、マウス、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ
７リガンド蛋白質をあげることができるが、ヒト糖尿病
の治療および／または予防のための医薬、すなわち膵臓
機能改善剤、膵臓再生促進剤として用いる場合は、ヒト
由来のＡＬＫ７リガンド蛋白質とアミノ酸配列が一致す
る蛋白質を用いることが好ましい。

【０１６７】アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡ
ＬＫ７蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療お
よび／または予防のための医薬は、有効成分として該蛋
白質のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的
に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合
し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法
により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、
ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌
的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に
近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的
に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナ
トリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナ
トリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥し
て貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いること
もできる。

【０１６８】投与経路は、治療に際し最も効果的なもの
を使用するのが望ましく、経口投与、あるいは口腔内、
気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口
投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧
剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座
剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。

【０１６９】経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シ
ロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげら
れる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物
は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエ
チレングリコール、プロピレングリコール等のグリコー
ル類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒ
ドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリー
フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤
として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆
粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の
賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、
ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビ
ニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラ
チン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリ
セリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。

【０１７０】非経口投与に適当な製剤としては、注射
剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、
塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる
担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪
またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、
噴霧剤は該ポリペプチドそのもの、ないしは受容者の口
腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該ポリペプチドを微
細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用
いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン
等が例示される。該ポリペプチドおよび用いる担体の性
質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能
である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添
加剤として例示した成分を添加することもできる。

【０１７１】投与量または投与回数は、目的とする治療
効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なる
が、通常成人１日当たり10μｇ/kg〜８mg/kgである。

【０１７２】１０．アクチビンＡＢ、アクチビンＢまた
はＡＬＫ７を特異的に認識する抗体を有効成分として含
有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬 アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７を特異的
に認識する抗体を有効成分として含有する糖尿病の治療
および／または予防のための医薬は、該有効成分を単独
で投与することも可能ではあるが、通常は該有効成分を
薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一
緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任
意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望
ましい。好ましい医薬製剤形態、および投与方法等は、
上記９のとおりである。

【０１７３】１１．上記８のスクリーニング方法により
得られた化合物を有効成分として含有する糖尿病の治療
および／または予防のための医薬 上記８のスクリーニング方法により得られた化合物を有
効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防
のための医薬は、該有効成分を単独で投与することも可
能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容され
る一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学
の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造
した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましい医
薬製剤形態等は、および投与方法等は、上記９のとおり
である。

【０１７４】１２．アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ
鎖、またはＡＬＫ７蛋白質をコードするＤＮＡを含有す
る糖尿病用遺伝子治療剤 アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７
蛋白質をコードするＤＮＡを糖尿病の遺伝子治療薬とて
して用いる方法としては、該ＤＮＡを単独あるいはレト
ロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ
ウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当
なベクターに挿入した後、上記９に記載した常法に従っ
て製剤化、処方および投与する方法、あるいは非ウイル
ス遺伝子移入法により投与する方法をあげることができ
る。

【０１７５】組換えウイルスベクターは、以下に記載の
方法に従い作製することができる。アクチビンβＡ鎖、
アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７蛋白質の完全長ｃＤ
ＮＡをもとに、必要に応じて、該蛋白質をコードする部
分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。該ＤＮＡ
断片、あるいは完全長ｃＤＮＡをウイルスベクター内の
プロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイ
ルスベクターを造成する。

【０１７６】ＲＮＡウイルスベクターの場合には、アク
チビンＡＢ、アクチビンＢの完全長ｃＤＮＡに相同なＲ
ＮＡ断片を調製し、それらをウイルスベクター内のプロ
モーターの下流に挿入することにより、組換えウイルス
を造成する。ＲＮＡ断片は、２本鎖のほか、ウイルスベ
クターの種類に応じて、センス鎖もしくはアンチセンス
鎖のどちらか一方の鎖を選択する。例えば、レトロウイ
ルスベクターの場合は、センス鎖に相同なＲＮＡを、セ
ンスウイルスベクターの場合には、アンチセンス鎖に相
同なＲＮＡを選択する。

【０１７７】該組換えウイルスベクターを、該ベクター
に適合したパッケージング細胞に導入する。パッケージ
ング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要な
蛋白質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損して
いる組換えウイルスベクターの該欠損する蛋白質を補給
できる細胞であればいかなるものでもよい。例えば、ヒ
ト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス繊維芽細胞ＮＩ
Ｈ３Ｔ３などを用いることができる。パッケージング細
胞で補給する蛋白質としては、レトロウイルスベクター
の場合はマウスレトロウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、
ｅｎｖなど、レンチウイルスベクターの場合はＨＩＶウ
イルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐ
ｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆなど、アデノウイ
ルスベクターの場合はアデノウイルス由来のＥ１Ａ、Ｅ
１Ｂなど、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５，
ｐ１９，ｐ４０）、Ｖｐ（Ｃａｐ）などの蛋白質があげ
られる。

【０１７８】ウイルスベクターとしては、上記パッケー
ジング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細
胞でアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬ
Ｋ７をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモータ
ーを含有しているものが用いられる。プラスミドベクタ
ーとしてはＭＦＧ[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,67
33-6737 (1995)]、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ[Nucleic Acids
Res., 18, 3587-3596(1990)]、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−Ｃ
Ｇ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ[Journal of Virology,72, 815
0-8157(1998)]、ｐＡｄｅｘ１[Nucleic Acids Res., 2
3, 3816-3821(1995)]等が用いられる。プロモーターと
しては、ヒト組織中で機能するものであればいずれも用
いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒト
ＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモー
ター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスの
プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒート
ショック蛋白質プロモーター、ＳＲαプロモーター等を
あげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子の
エンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。パッ
ケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法と
しては、例えば、リン酸カルシウム法〔特開平2-227075
号公報〕、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。

【０１７９】また、上記組換えウイルスベクターの投与
方法としては、上記９の方法に加え、リポソームデリバ
リーを用いる直接的イン・ビボ(in vivo)遺伝子移入と
組み合わせることにより、膵臓病巣にウイルスベクター
を指向させるようにすることもできる。すなわち、適当
なサイズのアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、また
はＡＬＫ７をコードするＤＮＡを、アデノウイルス・ヘ
キソン蛋白質に特異的なポリリジン-コンジュゲート抗
体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコ
ンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させるこ
とにより、ウイルスベクターを調製することができる。
該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンド
ソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効
率的に遺伝子を発現させることができる。

【０１８０】アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡ
ＬＫ７遺伝子のＤＮＡは、非ウイルス遺伝子移入法によ
っても病巣に輸送することができる。当該分野で公知の
非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法
[Virology, 52, 456-467 (1973)；Science, 209, 1414-
1422 (1980)]、マイクロインジェクション法[Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA，77, 5399-5403 (1980)；Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA，77, 7380-7384 (1980)；Cell, 27,
223-231 (1981)；Nature, 294, 92-94 (1981)]、リポ
ソームを介した膜融合-介在移入法[Proc. Natl.Acad. S
ci. USA，84, 7413-7417 (1987)；Biochemistry, 28, 9
508-9514 (1989)；J. Biol. Chem., 264, 12126-12129
(1989)；Hum. Gene Ther., 3, 267-275,(1992)；Scienc
e, 249, 1285-1288 (1990)；Circulation, 83, 2007-20
11 (1992)]あるいは直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体-
媒介ＤＮＡ移入法[Science, 247,1465-1468 (1990)；J.
Biol. Chem., 266, 14338-14342 (1991)；Proc. Natl.
Acad. Sci. USA，87, 3655-3659 (1991)；J. Biol. Ch
em., 264, 16985-16987 (1989)；BioTechniques, 11, 4
74-485 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 341
0-3414 (1990)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88, 425
5-4259 (1991)；Proc.Natl. Acad. Sci. USA，87, 4033
-4037 (1990)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88, 8850
-8854 (1991)；Hum. Gene Ther., 3, 147-154 (1991)]
等をあげることができる。

【０１８１】リポソームを介した膜融合−介在移入法で
はリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与するこ
とにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび
発現が可能であることが腫瘍に関する研究において報告
されている[Hum. Gene Ther.3, 399-410 (1992)]。した
がって同様の効果が膵臓病巣でも期待される。ＤＮＡを
膵臓病巣に直接標的化するには、直接ＤＮＡ取り込み技
術が好ましい。受容体-媒介ＤＮＡ移入は、例えば、ポ
リリジンを介して、蛋白質リガンドにＤＮＡ(通常、共
有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をと
る)をコンジュゲートすることによって行う。リガンド
は、標的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガン
ド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド-Ｄ
ＮＡコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射す
ることができ、受容体結合およびＤＮＡ-蛋白質コンプ
レックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。ＤＮ
Ａの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同
時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもで
きる。

【０１８２】１３．ＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する
抗体を用いて膵臓に特異的に薬物を輸送する方法（ドラ
ッグデリバリー方法） 当該ドラッグデリバリー方法に用いられる抗体は、ＡＬ
Ｋ７蛋白質を特異的に認識する抗体であればいずれでも
良いが、特にヒト化抗体を用いることが望ましい。

【０１８３】ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、
ヒト型CDR（Complementary Determining Region;相補性
決定領域；以下、CDRと記す）移植抗体などがあげられ
る。ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可
変領域（以下、重鎖はH鎖として、可変領域はV領域とし
てHVまたはVHとも称す）および抗体軽鎖可変領域（以
下、軽鎖はL鎖としてLVまたはVLとも称す）とヒト抗体
の重鎖定常領域（以下、定常領域はC領域としてCHとも
称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、CLとも称
す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物として
は、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することが可能
であれば、いかなるものも用いることができる。

【０１８４】ＡＬＫ７蛋白質に結合するモノクローナル
抗体を生産するハイブリドーマより、VHおよびVLをコー
ドするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体CHおよびヒト抗体CL
をコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに
それぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築
し、動物細胞へ導入することにより発現させ製造するこ
とができる。

【０１８５】ヒト型キメラ抗体のCHとしては、ヒトイム
ノグロブリン（以下、hIgと表記する）に属すればいか
なるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、
更にhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4と
いったサブクラスのいずれも用いることができる。ま
た、ヒト型キメラ抗体のCLとしては、hIgに属すればい
かなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのもの
を用いることができる。

【０１８６】ヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の
抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列をヒト抗体のVH
およびVLの適切な位置に移植した抗体を意味する。ヒト
型CDR 移植抗体は、ＡＬＫ７蛋白質に反応し、ＡＬＫ７
蛋白質に結合する、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVL
のCDR 配列で任意のヒト抗体のVHおよびVLのCDR 配列を
それぞれ置換したV 領域をコードするcＤＮＡを構築
し、ヒト抗体のCHおよびヒト抗体のCLをコードする遺伝
子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入して
ヒト型CDR 移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ
導入し、発現させることにより製造することができる。

【０１８７】ヒト型CDR移植抗体のCHとしては、hIgに属
すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好
適であり、更にhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG
3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることがで
きる。また、ヒト型CDR移植抗体のCLとしては、hIgに属
すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラ
スのものを用いることができる。

【０１８８】ヒト抗体は、元来、ヒトの体内に天然に存
在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工
学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗
体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジ
ェニック動物から得られる抗体等も含まれる。

【０１８９】ヒトの体内に存在する抗体は、例えば、以
下の方法により取得することができる。ヒト末梢血リン
パ球を単離し、EBウイルス等を感染させ不死化させた
後、クローニングする。得られた目的とする抗体を産生
するリンパ球を培養し、培養物中より該抗体を取得する
ことができる。

【０１９０】ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトB
細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入す
ることにより、Fab、一本鎖抗体等の抗体断片をファー
ジ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリ
ーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標
として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現して
いるファージを回収することができる。該抗体断片は、
更に遺伝子工学的手法により、完全型ヒト抗体へ変換す
ることができる。

【０１９１】ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、
ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。
具体的には、マウスES細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、
該ES細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させるこ
とによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製す
ることができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物
からのヒト抗体の作製方法としては、通常のヒト以外の
哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法により
ヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養
物中にヒト抗体を産生蓄積させる方法があげられる。

【０１９２】抗体断片としては、Fab、Fab'、F(ab')₂、
一本鎖抗体、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（dsFv）、
CDRを含むペプチドなどがあげられる。Fabは、ＩｇＧを
蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち
（H鎖の224番目のアミノ酸残基で切断される）、H鎖の
Ｎ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合し
た分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片であ
る。Fabは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡ
ＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素
パパインで処理して得ることができる。また、該抗体の
FabをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターある
いは真核生物用発現ベクターに挿入後、該ベクターを原
核生物あるいは真核生物へ導入し、該ＤＮＡを発現させ
ることによりFabを取得することができる。

【０１９３】F(ab')₂は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプ
シンで処理して得られる断片のうち（H鎖の234番目のア
ミノ酸残基で切断される）、Fabがヒンジ領域のジスル
フィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分
子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。F
(ab')₂は、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬ
Ｋ７蛋白質に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素ペ
プシンで処理して得ることができる。また、該抗体のF
(ab')₂をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあ
るいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該ベクターを
原核生物あるいは真核生物へ導入し、該ＤＮＡを発現さ
せることにより、F(ab')₂を取得することができる。

【０１９４】Fab'は、上記F(ab')₂のヒンジ領域のジス
ルフィド結合を切断した分子量約5万の抗原結合活性を
有する抗体断片である。Fab'は、アクチビンＡＢ、アク
チビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗
体を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができ
る。また、該抗体のFab'断片をコードするＤＮＡを原核
生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに
挿入後、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入
し、該ＤＮＡを発現させることにより、Fab'を取得する
ことができる。

【０１９５】一本鎖抗体（以下、scFvとも称す）は、一
本のVHと一本のVLとを適当なペプチドリンカー（以下、
Pと称す）を用いて連結した、VH−P−VLないしはVL−P
−VHポリペプチドを示す。本発明で使用されるscFvに含
まれるVHおよびVLは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、
またはＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体、例え
ば、ヒト化抗体またはヒト抗体から由来したものを用い
ることができる。

【０１９６】一本鎖抗体は、以下の方法により取得でき
る。ＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体のVHおよび
VLをコードするｃＤＮＡを取得後、一本鎖抗体をコード
するＤＮＡを構築する。該ＤＮＡを原核生物用発現ベク
ターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該発現
ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入し、該ＤＮ
Ａを発現させることにより、一本鎖抗体を取得すること
ができる。

【０１９７】ジスルフィド安定化V領域断片（以下、dsF
vとも称す）は、VHおよびVL中のそれぞれ１アミノ酸残
基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システ
イン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたもの
をいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はReit
erらにより示された方法［Protein Engineering, 7,697
(1994)］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選
択することができる。本発明で使用されるdsFvに含まれ
るVHおよびVLはＡＬＫ７に特異的に反応する抗体、例え
ば、ヒト化抗体またはヒト抗体から由来したものを用い
ることができる。

【０１９８】ジスルフィド安定化V領域断片(dsFv)は、
以下の方法により取得することができる。ＡＬＫ７蛋白
質に特異的に反応する抗体のVHおよびVLをコードするｃ
ＤＮＡを取得後、dsFvをコードするＤＮＡを構築する。
該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用
発現ベクターに挿入後、該発現ベクターを原核生物ある
いは真核生物へ導入し、該ＤＮＡを発現させることによ
り、dsFvを取得することができる。CDRを含むペプチド
は、Fmoc法、tBoc法等の化学合成法によって製造するこ
とができる。

【０１９９】ＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体か
ら調製される融合抗体は、膵臓の病巣へ特異的に薬剤や
蛋白質を運ぶ、ドラッグデリバリーに用いることができ
る。融合抗体は、ＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗
体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体およびそれらの抗体
断片に、蛋白質、低分子化合物等の薬剤などを化学的あ
るいは遺伝子工学的に結合させた抗体をいう。該融合抗
体は、ＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体および抗
体断片のH鎖或いはL鎖のN末端側或いはC末端側、抗体お
よび抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには
抗体および抗体断片中の糖鎖に、蛋白質、低分子化合物
等の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させ
ることにより製造することができる。

【０２００】低分子化合物としては、上記８のスクリー
ニング方法によって得られた化合物をあげることができ
る。該化合物は化学的手法〔抗体入門（金光修著、１９
９４年、地人書館）〕により上記抗体に結合させること
ができる。蛋白質としては、膵臓の機能を亢進する活性
化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトベータ
ーセルリン、ヒトアクチビンＡＢ、ヒトアクチビンＢ、
ヒトHGF(Hepatocyte Growth Factor)等があげられる。

【０２０１】蛋白質との融合抗体は、以下の方法により
取得できる。抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡ
に蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させて、融合抗体
をコードするＤＮＡを構築する。該ＤＮＡを原核生物あ
るいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該発現ベクタ
ーを原核生物あるいは真核生物などの宿主細胞へ導入
し、該ＤＮＡを発現させることにより、融合抗体を取得
することができる。以下の実施例により本発明を具体的
に説明するが、本発明は実施例によって限定されること
はない。

【０２０２】

【実施例】実施例１：ＡＬＫ７過剰発現細胞におけるリ
ガンド依存性の転写活性の解析 内因性にＡＬＫ７を発現していない、ヒト腎上皮細胞HE
K293細胞（ATCC CRL-1573）を１０％ウシ胎児血清、２m
mol/L グルタミン、1g/Lグルコースを含有するＤ−ＭＥ
Ｍ培地に懸濁し、12ウェル細胞培養用プレートに6×10⁴
細胞/ウェルになるように播き、炭酸ガスインキュベー
ター内（５％炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で
培養した。翌日、（１）ラットＡＬＫ７の全長ｃDNAを
含むプラスミド［Mol. Cell Neurosci., 7, 467-478（1
996）］のＳｍａＩ−ＸｂａＩ断片と動物細胞用発現プ
ラスミドｐｃＤＮＡ１（インビトロジェン社製）のＥｃ
ｏＲＶ−ＸｂａＩ断片とをライゲーションすることによ
り作成されたプラスミド［Mol. Cell Neurosci., 7, 46
7-478（1996）］1.5μg、（２）マウスのII型アクチビ
ン受容体ActRIIAｃＤＮＡを含むプラスミド［Cell, 65,
973-982（1991）］を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し平滑
末端化したＤＮＡ断片と、公知の動物細胞用発現プラス
ミドｐｃＤＬＳＲ−α［Mol. Cell. Biol., 8, 466-472
（1988）］をＸｈｏＩで消化し平滑末端化したＤＮＡ断
片とをライゲーションすることにより作成されたプラス
ミド［J. Biol. Chem., 272, 13835-13842（1997）］30
0ng、（３）SBE-luxルシフェラーゼレポータープラスミ
ド［J. Biol. Chem., 273, 21145-21152（1998）、Ludw
ig Institute for Cancer Research より譲渡］500ng、
（４）ベータ・ガラクトシダーゼが動物細胞中でＣＭＶ
プロモーターの制御下で発現するように設計されている
プラスミドｐＣＭＶβ（クロンテック社製）300ngをそ
れぞれリン酸カルシウム法により上記培養で得られた細
胞に遺伝子導入し、更に10％ウシ胎児血清、2mmol/L グ
ルタミン、1g/Lグルコースを含有するＤ−ＭＥＭ培地を
用いて炭酸ガスインキュベーター内において３７℃で培
養し、形質転換細胞を得た。翌日、PBS緩衝液で該形質
転換細胞を洗浄し、上記培地に懸濁後、J. Biol. Che
m., 267, 16385-16389（1992）に従ってウシ卵胞液より
精製された20ng/mlのアクチビンＡ、ＡＢまたはＢを添
加した。炭酸ガスインキュベーター内において37℃で16
時間培養した後、PBS緩衝液で該形質転換細胞を洗浄
後、100μLの細胞溶解液（1%TritonX-100、15mmol/L 硫
酸マグネシウム、4mmol/L EGTA、1mmol/L ジチオスレイ
トール、25mmol/L グリシルグリシン、ｐH7.8）に懸濁
し、50μLをルシフェラーゼアッセイに、40μLをベータ
・ガラクトシダーゼアッセイに使用した。

【０２０３】ルシフェラーゼの活性測定は、上記の50μ
Ｌの細胞を溶解した溶解液と5μLの30mmol/L ATP溶液、
100μLの0.5mmol/L luciferin溶液とを混合し、ルミノ
メーター（ベルトルド社）により発光量を測定すること
により行い［Anal. Biochem., 171, 404-408（198
8）］、ベータ・ガラクトシダーゼの活性測定は、o-nit
rophenyl-β-D-galactopyranoside（ONPG）を基質とし
て用いることにより、既報に従って行った［Bitechniqu
es, 7, 576-579（1989）］。ルシフェラーゼの活性値は
ベータ・ガラクトシダーゼの活性値で標準化した［Endo
crinology, 136, 5493-5503（1995）］。

【０２０４】図１に示すように、アクチビンＡＢ、アク
チビンＢによりＡＬＫ７遺伝子導入HEK293細胞で転写活
性の顕著な上昇が観察された。

【０２０５】実施例２：内因性ＡＬＫ７発現膵臓β細胞
におけるリガンド依存性の転写活性の解析 内因性にＡＬＫ７を発現している細胞株を検索する為、
配列番号７および８で表される塩基配列を有するＤＮＡ
を合成し、該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、マ
ウス膵臓β細胞種MIN6細胞［Endocrinology, 127, 126-
132（1990）］、ヒト腎上皮細胞ＨＥＫ２９３細胞（ATC
C CRL-1573）、マウスインスリノーマ細胞ＮＩＴ−１細
胞 （ATCC CRL-2055）、マウス膵臓α細胞種αＴＣ１細
胞（ATCC CRL-2350）、ラット膵管上皮細胞ＡＲＩＰ細
胞（ATCC CRL-1674）などから調製した全ＲＮＡを元に
作成した一本鎖ＤＮＡを鋳型としてPCR反応を行った。
その結果、マウス膵臓β細胞のモデル系として使用され
ているMIN6細胞で他の細胞よりも高い発現が認められ
た。

【０２０６】次にこの細胞を用いて、転写活性の測定、
マウスのドミナントネガティブＡＬＫ７受容体ｃＤＮＡ
導入によるシグナル伝達の抑制効果を検討した。マウス
膵臓β細胞種細胞であるMIN6細胞を10％ウシ胎児血清、
2mmol/L グルタミン、4.5g/Lグルコースを含有するＤ−
ＭＥＭ培地に懸濁し、12ウェル細胞培養用プレートに8
×10⁴細胞/ウェルになるように播き、炭酸ガスインキュ
ベーター内において37℃で培養した。翌日、（１）SBE-
luxルシフェラーゼレポータープラスミド1μg、（２）
ｐＣＭＶβ500ngをそれぞれリポフェクション法により
上記培養で得られた細胞に遺伝子導入し、更に炭酸ガス
インキュベーター内において37℃で培養することで形質
転換細胞を得た。翌日、PBS緩衝液で該形質転換細胞を
洗浄し、上記培地に懸濁後、60ng/mlのアクチビンＡ、
ＡＢまたはＢを添加した。炭酸ガスインキュベーター内
において37℃で16時間培養した後、PBS緩衝液で該細胞
を洗浄後、100μLの細胞溶解液に懸濁し、50μLをルシ
フェラーゼアッセイに、40μLをベータ・ガラクトシダ
ーゼアッセイに使用した。ルシフェラーゼの活性値はベ
ータ・ガラクトシダーゼの活性値で標準化した。

【０２０７】次に、配列番号７および８で表される塩基
配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、配
列番号１０で表される塩基配列を有するラットＡＬＫ７
ｃＤＮＡを含むプラスミド［Mol. Cell Neurosci., 7,
467-478（1996）］を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。
続いて該反応産物中の増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素
ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて消化した。反応終了後、該反
応産物をアガロース電気泳動により分離し、約５００塩
基対のＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片とプ
ラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製）のＥｃ
ｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片とをＤＮＡリガーゼを用いて結合
させた。反応物を用いて大腸菌をトランスフォームし、
アンピシリンを含む寒天プレート上で37℃にて培養し、
アンピシリン耐性を獲得したクローンを選択した。出現
したコロニーをアンピシリンを含む培地にて培養した
後、プラスミドを回収し、挿入されているＤＮＡ断片の
塩基配列を確認し、目的の塩基配列を有するクローンを
選択した。

【０２０８】以上の操作により、細胞内のキナーゼ領域
を欠損し、Ｎ末端より１６７個のアミノ酸残基をコード
するドミナントネガティブ型ＡＬＫ７受容体ＤＮＡを含
むプラスミドを取得した。

【０２０９】マウス膵臓β細胞種細胞であるMIN6細胞を
10％ウシ胎児血清、2mmol/L グルタミン、4.5g/Lグルコ
ースを含有するＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、12ウェル細胞
培養用プレートに8×10⁴細胞/ウェルになるように播
き、炭酸ガスインキュベーター内において37℃で培養し
た。翌日、（１）SBE-luxルシフェラーゼレポータープ
ラスミド1μg、（２）ベータ・ガラクトシダーゼが動物
細胞中でＣＭＶプロモーターの制御下で発現するように
設計されているプラスミド（クロンテック社製）500n
g、（３）上記で作製したドミナントネガティブ型ＡＬ
Ｋ７受容体ＤＮＡ3μgをそれぞれリポフェクション法に
よりＭＩＮ６細胞に遺伝子導入し、炭酸ガスインキュベ
ーター内において37℃で培養することで形質転換株を得
た。翌日、PBS緩衝液で該形質転換細胞を洗浄し、上記
培地に懸濁後、60ng/mlのアクチビンＡ、ＡＢ、または
Ｂを添加した。炭酸ガスインキュベーター内において37
℃で16時間培養した後、PBS緩衝液で該形質転換細胞を
洗浄後、100μLの細胞溶解液に懸濁し、50μLをルシフ
ェラーゼアッセイに、40μLをベータ・ガラクトシダー
ゼアッセイに使用した。ルシフェラーゼの活性値はベー
タ・ガラクトシダーゼの活性値で標準化した。

【０２１０】図２に示すように、アクチビンＡＢ、アク
チビンＢにより内因性ＡＬＫ７発現MIN6細胞で転写活性
の上昇が観察され、ドミナントネガティブＡＬＫ７ｃＤ
ＮＡの導入により転写活性の上昇は阻害された。

【０２１１】実施例３：マウス膵臓β細胞種細胞からの
インシュリン分泌の促進 内因性ＡＬＫ７受容体を発現し、アクチビンＡＢ、およ
びアクチビンＢに反応性を有することが確認されたMIN6
細胞を10％ウシ胎児血清、2mmol/L グルタミン、4.5g/L
グルコースを含有するＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、24ウェ
ル細胞培養用プレートに7×10⁴細胞/ウェルになるよう
に播き、炭酸ガスインキュベーター内において37℃で培
養した。二日後にPBS緩衝液で細胞を洗浄し、40または8
0ng/mlのアクチビンＡＢを加えた培養液300μLに該細胞
を懸濁した。更に二日間炭酸ガスインキュベーター内に
おいて３７℃で培養し、培養終了後上清を回収して、上
清30μLを用いて市販インスリン測定キット（森永生化
学研究所）を用いてELISA法によりインスリン分泌量を
測定した。図３に示すように、アクチビンＡＢにより内
因性ＡＬＫ７発現MIN6細胞でインスリンの分泌亢進が認
められた。

【０２１２】

【発明の効果】本発明により、アクチビンＡＢ、アクチ
ビンＢおよびアクチビン受容体様キナーゼ７（ＡＬＫ
７）より選ばれる蛋白質を有効成分として含有する糖尿
病治療剤、該蛋白質をコードするＤＮＡを有効成分とし
て含有する糖尿病治療剤、該蛋白質または該ＤＮＡを利
用した糖尿病治療剤のスクリーニング方法、該ＤＮＡま
たは該蛋白質を特異的に認識する抗体を用いた糖尿病の
診断薬および診断用キット、ならびＡＬＫ７を特異的に
認識する抗体を用いた糖尿病の治療および／または予防
のための医薬の腎臓への輸送方法が提供される。

【０２１３】

【配列表フリーテキスト】

配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

【０２１４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> A DRUG FOR DIABETES <130> A11334MA <160> 10

【０２１５】 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 1 Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys Cys Lys Lys Gly Phe 1 5 10 15 Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro 20 25 30 Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Ser His Ile 35 40 45 Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr Val Ile Asn 50 55 60 His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu Lys Ser Cys 65 70 75 80 Cys Tyr Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp 85 90 95 Gly Gly Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gly Asn Met Ile Val Glu Glu 100 105 110 Cys Gly Cys Ser 115

【０２１６】 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 2 Gly Leu Glu Cys Asp Gly Arg Thr Asn Leu Cys Cys Arg Gly Gly Phe 1 5 10 15 Phe Ile Asp Phe Arg Leu Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro 20 25 30 Thr Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Leu 35 40 45 Ala Gly Val Pro Gly Ser Ala Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn 50 55 60 Gly Tyr Arg Met Arg Gly Leu Asn Pro Gly Thr Val Asn Ser Cys Cys 65 70 75 80 Ile Pro Thr Lys Leu Ser Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu 85 90 95 Tyr Asn Ile Val Lys Arg Asp Val Pro Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 Gly Cys Ala 115

【０２１７】 <210> 3 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 3 ggc ttg gag tgt gat ggc aag gtc aac atc tgc tgt aag aaa cag ttc 48 Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys Cys Lys Lys Gln Phe 1 5 10 15 ttt gtc agt ttc aag gac atc ggc tgg aat gac tgg atc att gct ccc 96 Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro 20 25 30 tct ggc tat cat gcc aac tac tgc gag ggt gag tgc ccg agc cat ata 144 Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Ser His Ile 35 40 45 gca ggc acg tcc ggg tcc tca ctg tcc ttc cac tca aca gtc atc aac 192 Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr Val Ile Asn 50 55 60 cac tac cgc atg cgg ggc cat agc ccc ttt gcc aac ctc aaa tcg tgc 240 His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu Lys Ser Cys 65 70 75 80 tgt gtg ccc acc aag ctg aga ccc atg tcc atg ttg tac tat gat gat 288 Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp 85 90 95 ggt caa aac atc atc aaa aag gac att cag aac atg atc gtg gag gag 336 Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu 100 105 110 tgt ggg tgc tca 348 Cys Gly Cys Ser 115

【０２１８】 <210> 4 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 4 ggc ctg gag tgc gat ggc cgg acc aac ctc tgt tgc agg caa cag ttc 48 Gly Leu Glu Cys Asp Gly Arg Thr Asn Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe 1 5 10 15 ttc att gac ttc cgc ctc atc ggc tgg aac gac tgg atc ata gca ccc 96 Phe Ile Asp Phe Arg Leu Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro 20 25 30 acc ggc tac tac ggc aac tac tgt gag ggc agc tgc cca gcc tac ctg 144 Thr Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Leu 35 40 45 gca ggg gtc ccc ggc tct gcc tcc tcc ttc cac acg gct gtg gtg aac 192 Ala Gly Val Pro Gly Ser Ala Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn 50 55 60 cag tac cgc atg cgg ggt ctg aac ccc ggc acg gtg aac tcc tgc tgc 240 Gln Tyr Arg Met Arg Gly Leu Asn Pro Gly Thr Val Asn Ser Cys Cys 65 70 75 80 att ccc acc aag ctg agc acc atg tcc atg ctg tac ttc gat gat gag 288 Ile Pro Thr Lys Leu Ser Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu 85 90 95 tac aac atc gtc aag cgg gac gtg ccc aac atg att gtg gag gag tgc 336 Tyr Asn Ile Val Lys Arg Asp Val Pro Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 ggc tgc gcc 345 Gly Cys Ala 115

【０２１９】 <210> 5 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 5 agcggggtca ccgcccggct gcggggccag tggcaggagc gccacgcacc gccagccgca 60 gggggcgtgg gatgggggcg gccggggagg ggggcgccca cactgactag agccaaccgc 120 gcacttcaaa agggtgtcgg tgccgcgctc ccctcccgcg gcccgggaac ttcaaagcgg 180 gccgtgctgc cccggctgcc tcgctctgct ctggggcctc gcagccccgg cgcggccgcc 240 tggtggcgat gacccgggcg ctctgctcag cgctccgcca ggctctcctg ctgctcgcag 300 cggccgccga gctctcgcca ggactgaagt gtgtatgtct tntgtgtgat tcttcaaact 360 ttacctgcca aacagaagga gcatgtnggg catcagtcat gctaaccaat ggaaaagagc 420 aggtgatcaa atcctgtgtc tcccttccag aactga 456

【０２２０】 <210> 6 <211> 927 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 6 tttacctaag gcagaggcct gggcaatggc gggcgcccct cccccagtct cgttgccgcc 60 ttgcagttga tctcagactg ctgtgctagc aatcagcgag actccctggg cgtaggaccc 120 tctgagccag gtgtgggata tagtctcgtg gtgcgccgtt tcttaagccg gtctgaaaag 180 cgcaatattc gggtgggagt gacccgattt tccagcatca ccaaatgccc caaaacttgg 240 acccatggag ctggccatca ttattactgt gcctgtttgc ctcctgtcca tagctgcgat 300 gctgacagta tgggcatgcc agggtcgaca gtgctcctac aggaagaaaa agagaccaaa 360 tgtggaggaa ccactctctg agtgcaatct ggtaaatgct ggaaaaactc tgaaagatct 420 gatttatgat gtgaccgcct ctggatctgg ctctggtcta cctctgttgg ttcaaaggac 480 aattgcaagg acgattgtgc ttcaggaaat agtaggaaaa ggtagatttg gtgaggtgtg 540 gcatggaaga tggtgtgggg aagatgtggt gtgaaaatat tctcctccag agatgaaaag 600 atcttggttt cgtgaggcag aaaatttacc agacggtcat gctgcgaaat gaaaaccatc 660 ttggtttcat gggctgctga ccaccaagat aatggactgt ggctccactt ggggtggtat 720 ttgaatttca tgacagggtc ttatatgact atcgcataga attatggcgg gtgagagaca 780 aggggcccat gcggggtggg cctcttgggt gggcgcccag ggagccggtg gccgggccaa 840 accggaatct cgaacggatg gccccgccgt ggggcgacag gcaaccccat cgggacagat 900 tgcccgcgga tatctccctc cgtgacc 927

【０２２１】 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 7 cctaagcttg atgaccccag cgcgccgctc cgcactga 38

【０２２２】 <210> 8 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> ccgctcgagc taagatctga gggtttttcc agcattgaca agg 43

【０２２３】 <210> 9 <211> 493 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 9 Met Thr Pro Ala Arg Arg Ser Ala Leu Ser Leu Ala Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ser Asp Leu Ala Ala Gly Leu Lys Cys Val Cys Leu Leu 20 25 30 Cys Asp Ser Ser Asn Phe Thr Cys Gln Thr Glu Gly Ala Cys Trp Ala 35 40 45 Ser Val Met Leu Thr Asn Gly Lys Glu Gln Val Ser Lys Ser Cys Val 50 55 60 Ser Leu Pro Glu Leu Asn Ala Gln Val Phe Cys His Ser Ser Asn Asn 65 70 75 80 Val Thr Lys Thr Glu Cys Cys Phe Thr Asp Phe Cys Asn Asn Ile Thr 85 90 95 Gln His Leu Pro Thr Ala Ser Pro Asp Ala Pro Arg Leu Gly Pro Thr 100 105 110 Glu Leu Thr Val Val Ile Thr Val Pro Val Cys Leu Leu Ser Ile Ala 115 120 125 Ala Met Leu Thr Ile Trp Ala Cys Gln Asp Arg Gln Cys Thr Tyr Arg 130 135 140 Lys Thr Lys Arg His Asn Val Glu Glu Pro Leu Ala Glu Tyr Ser Leu 145 150 155 160 Val Asn Ala Gly Lys Thr Leu Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Ala Thr Ala 165 170 175 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala 180 185 190 Arg Thr Ile Val Leu Gln Glu Ile Val Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu 195 200 205 Val Trp His Gly Arg Trp Cys Gly Glu Asp Val Ala Val Lys Ile Phe 210 215 220 Ser Ser Arg Asp Glu Arg Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln 225 230 235 240 Thr Val Met Leu Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp 245 250 255 Asn Lys Asp Asn Gly Thr Trp Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Glu Tyr 260 265 270 His Glu Gln Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Asn Arg Asn Ile Val Thr 275 280 285 Val Ala Gly Met Val Lys Leu Ala Leu Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ala 290 295 300 His Leu His Met Glu Ile Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala 305 310 315 320 His Arg Asp Ile Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Cys Asp Thr 325 330 335 Cys Ala Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Lys His Asp Ser Ile Met 340 345 350 Asn Thr Ile Asp Ile Pro Gln Asn Pro Lys Val Gly Thr Lys Arg Tyr 355 360 365 Met Ala Pro Glu Met Leu Asp Asp Thr Met Asn Val Asn Ile Phe Glu 370 375 380 Ser Phe Lys Arg Ala Asp Ile Tyr Ser Val Gly Leu Val Tyr Trp Glu 385 390 395 400 Ile Ala Arg Arg Cys Ser Val Gly Gly Leu Val Glu Glu Tyr Gln Leu 405 410 415 Pro Tyr Tyr Asp Met Val Pro Ser Asp Pro Ser Ile Glu Glu Met Arg 420 425 430 Lys Val Val Cys Asp Gln Lys Leu Arg Pro Asn Leu Pro Asn Gln Trp 435 440 445 Gln Ser Cys Glu Ala Leu Arg Val Met Gly Arg Ile Met Arg Glu Cys 450 455 460 Trp Tyr Ala Asn Gly Ala Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Val Lys Lys 465 470 475 480 Thr Ile Ser Gln Leu Cys Val Lys Glu Asp Cys Lys Ala 485 490

【０２２４】 <210> 10 <211> 1562 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (32)...(1510) <400> 10 ccccgaagcc ttgcaccgcc gcggggtggc c atg acc cca gcg cgc cgc tcc 52 Met Thr Pro Ala Arg Arg Ser 1 5 gca ctg agc ctg gcc ctc ctg ctg gtg gca ctg gcc tcc gac ctt gcg 100 Ala Leu Ser Leu Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ala Ser Asp Leu Ala 10 15 20 gca gga ctg aag tgt gtg tgt ctt ttg tgt gat tcc tca aac ttt acc 148 Ala Gly Leu Lys Cys Val Cys Leu Leu Cys Asp Ser Ser Asn Phe Thr 25 30 35 tgc caa acc gaa gga gca tgc tgg gcc tct gtc atg cta acc aac ggg 196 Cys Gln Thr Glu Gly Ala Cys Trp Ala Ser Val Met Leu Thr Asn Gly 40 45 50 55 aaa gaa cag gtg agc aaa tcg tgc gtg tcc ctc ccg gaa cta aat gct 244 Lys Glu Gln Val Ser Lys Ser Cys Val Ser Leu Pro Glu Leu Asn Ala 60 65 70 cag gtc ttc tgt cac agt tcc aac aac gtg acc aag acc gaa tgt tgc 292 Gln Val Phe Cys His Ser Ser Asn Asn Val Thr Lys Thr Glu Cys Cys 75 80 85 ttc aca gac ttc tgc aac aac atc act cag cac ctt ccc aca gca tct 340 Phe Thr Asp Phe Cys Asn Asn Ile Thr Gln His Leu Pro Thr Ala Ser 90 95 100 cca gat gcc cct aga ctt ggc ccc aca gag ctg aca gtt gtt atc act 388 Pro Asp Ala Pro Arg Leu Gly Pro Thr Glu Leu Thr Val Val Ile Thr 105 110 115 gta cct gtt tgc ctc ctg tcc atc gca gcc atg cta acg ata tgg gcc 436 Val Pro Val Cys Leu Leu Ser Ile Ala Ala Met Leu Thr Ile Trp Ala 120 125 130 135 tgc cag gac cgc cag tgc aca tac agg aag acc aag aga cac aat gtg 484 Cys Gln Asp Arg Gln Cys Thr Tyr Arg Lys Thr Lys Arg His Asn Val 140 145 150 gag gaa cca ctg gca gag tac agc ctt gtc aat gct gga aaa acc ctc 532 Glu Glu Pro Leu Ala Glu Tyr Ser Leu Val Asn Ala Gly Lys Thr Leu 155 160 165 aaa gat ctg att tat gat gcc act gcc tcg ggc tca gga tct ggc ccg 580 Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Ala Thr Ala Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro 170 175 180 cct ctt ttg gtt caa aga acc atc gca agg aca att gta ctt caa gaa 628 Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln Glu 185 190 195 atc gta gga aaa ggt cgg ttt ggg gaa gtg tgg cac gga aga tgg tgt 676 Ile Val Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp His Gly Arg Trp Cys 200 205 210 215 gga gaa gat gtg gct gtg aaa ata ttc tcc tcc aga gat gag aga tct 724 Gly Glu Asp Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Asp Glu Arg Ser 220 225 230 tgg ttc cgt gag gca gaa att tat cag acg gta atg ctg aga cat gag 772 Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His Glu 235 240 245 aat att ctc ggt ttc atc gcg gcc gac aac aaa gat aat gga acc tgg 820 Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr Trp 250 255 260 act cag ctt tgg ctt gtg tca gag tat cac gag cag ggc tcc tta tat 868 Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Glu Tyr His Glu Gln Gly Ser Leu Tyr 265 270 275 gac tat ttg aat aga aac ata gtg acc gtg gct gga atg gtc aag ttg 916 Asp Tyr Leu Asn Arg Asn Ile Val Thr Val Ala Gly Met Val Lys Leu 280 285 290 295 gcg ctt tca ata gcg agt ggt ctg gct cac cta cac atg gag atc gtg 964 Ala Leu Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile Val 300 305 310 ggc act caa ggt aag cct gct att gct cac cga gat ata aag tca aag 1012 Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Ile Lys Ser Lys 315 320 325 aat atc tta gtc aaa aag tgt gac act tgt gcc ata gct gac tta ggg 1060 Asn Ile Leu Val Lys Lys Cys Asp Thr Cys Ala Ile Ala Asp Leu Gly 330 335 340 ctg gct gtg aaa cat gat tct atc atg aac act ata gat ata ccc cag 1108 Leu Ala Val Lys His Asp Ser Ile Met Asn Thr Ile Asp Ile Pro Gln 345 350 355 aat cct aaa gtg gga acc aag agg tat atg gct ccc gaa atg ctt gat 1156 Asn Pro Lys Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Met Leu Asp 360 365 370 375 gat aca atg aac gtc aac atc ttt gag tcc ttc aag cga gct gac atc 1204 Asp Thr Met Asn Val Asn Ile Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp Ile 380 385 390 tat tcg gtg ggg ctg gtt tac tgg gaa ata gct cga agg tgt tca gtt 1252 Tyr Ser Val Gly Leu Val Tyr Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser Val 395 400 405 gga gga ctt gtt gaa gag tac cag ttg cct tat tat gac atg gtg cct 1300 Gly Gly Leu Val Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Met Val Pro 410 415 420 tca gat cct tcc ata gag gaa atg agg aag gtc gtt tgt gat cag aaa 1348 Ser Asp Pro Ser Ile Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Asp Gln Lys 425 430 435 ctg cga cca aat ctc cca aac cag tgg caa agc tgt gag gcg ctc cgg 1396 Leu Arg Pro Asn Leu Pro Asn Gln Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu Arg 440 445 450 455 gtc atg gga aga ata atg cgt gag tgc tgg tat gcc aac ggg gca gct 1444 Val Met Gly Arg Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala Ala 460 465 470 cgc ctg acc gcc ctg cgc gtg aag aag acc att tct cag ctg tgt gtc 1492 Arg Leu Thr Ala Leu Arg Val Lys Lys Thr Ile Ser Gln Leu Cys Val 475 480 485 aag gaa gac tgt aag gcc taaggataca ggcgacggga aagccctcac 1540 Lys Glu Asp Cys Lys Ala 490 cactctcttt catgtctcct gc 1562

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＡＬＫ７過剰発現細胞におけるリガンド依存
性の転写活性の解析結果を示す図である。（−）はアク
チビン無添加を示し、ＡＬＫ７（−）はＡＬＫ７遺伝子
を導入していない細胞株を、ＡＬＫ７（＋）はＡＬＫ７
遺伝子導入株を示す。

【図２】 内因性ＡＬＫ７発現膵臓β細胞におけるリガ
ンド依存性の転写活性の解析結果を示す図である。塗り
つぶしカラムはＭＩＮ６細胞、白抜きカラムはドミナン
トネガティブＡＬＫ７発現ＭＩＮ６細胞を用いた結果を
示す。また（−）はアクチビン無添加を示す。

【図３】 アクチビン添加によるマウス膵臓β細胞腫細
胞からのインシュリン分泌量を測定した結果を示す図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８７ 48/00 Ａ６１Ｐ 1/18 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｐ 1/18 3/10 3/10 5/48 5/48 5/50 5/50 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｍ 33/566 33/566 Ｃ０７Ｋ 14/52 // Ｃ０７Ｋ 14/52 14/715 14/715 Ａ６１Ｋ 37/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 4B024 AA01 AA11 BA56 BA63 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA11 HA17 4B063 QA01 QA18 QQ01 QQ08 QQ13 QR33 QR59 QR77 QR80 QS05 QS36 QX02 4C084 AA01 AA02 AA13 AA17 BA01 BA02 BA08 BA21 BA44 CA18 DC50 NA13 NA14 ZA661 ZC351 ZC422 4C085 AA13 AA14 AA16 AA21 BB11 BB50 CC02 CC03 CC04 CC07 CC08 CC23 DD23 DD62 DD63 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA13 NA14 ZA66 ZC35 ZC42 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA01 DA51 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、および
   ＡＬＫ７からなる群より選ばれる蛋白質を有効成分とし
   て含有する糖尿病の治療および／または予防のための医
   薬。
2. 【請求項２】 下記の何れかの蛋白質を有効成分として
   含有する糖尿病の治療および／または予防のための医
   薬。 ［ａ］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリ
   ペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列か
   らなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質； ［ｂ］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリ
   ペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列に
   おいて１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および
   ／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
   から構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガ
   ンドとしての機能を有する蛋白質； ［ｃ］配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以
   上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付
   加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配
   列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
   から構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガ
   ンドとしての機能を有する蛋白質；または ［ｄ］配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以
   上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付
   加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配
   列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミ
   ノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加された
   アミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量
   体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を
   有する蛋白質：
3. 【請求項３】 下記の何れかの蛋白質を有効成分として
   含有する糖尿病の治療および／または予防のための医
   薬。 ［ａ］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリ
   ペプチドから構成される二量体蛋白質； ［ｂ］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリ
   ペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列に
   おいて１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および
   ／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
   から構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガ
   ンドとしての機能を有する蛋白質；または ［ｃ］配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以
   上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付
   加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成さ
   れる二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとして
   の機能を有する蛋白質：
4. 【請求項４】 下記の何れかの蛋白質を有効成分として
   含有する糖尿病の治療および／または予防のための医
   薬。 ［ａ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
   ＤＮＡによりコードされる蛋白質；または ［ｂ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
   ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１以上
   のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加
   されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチ
   ビンＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての機
   能を有する蛋白質：
5. 【請求項５】 下記の何れかのポリペプチドを有効成分
   として含有する糖尿病の治療および／または予防のため
   の医薬。 ［ａ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
   なるポリペプチド；または ［ｂ］配列番号１または２において１以上のアミノ酸残
   基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ
   酸配列からなるポリペプチドであって、かつＡＬＫ７の
   リガンドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペ
   プチド；
6. 【請求項６】 糖尿病の治療および／または予防のため
   の医薬が、膵臓機能改善作用を有するものである請求項
   １〜５のいずれか１項に記載の医薬。
7. 【請求項７】 糖尿病の治療および／または予防のため
   の医薬が、膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を
   有するものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の
   医薬。
8. 【請求項８】 糖尿病の治療および／または予防のため
   の医薬が、膵外分泌細胞および膵内分泌細胞の再生を促
   進する作用を有するものである請求項１〜５のいずれか
   １項に記載の医薬。
9. 【請求項９】 アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、および
   ＡＬＫ７からなる群より選ばれる蛋白質を有効成分とし
   て含有する、インスリン分泌促進剤。
10. 【請求項１０】 アクチビンβA鎖、アクチビンβB鎖、
    またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを含有する、糖尿病
    の治療および／または予防のための遺伝子治療剤。
11. 【請求項１１】 下記の何れかのＤＮＡを含有する、糖
    尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤。 ［ａ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
    なるポリペプチドをコードするＤＮＡ； ［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列にお
    いて１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／
    または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドで
    あり、かつＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋
    白質を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ；また
    は ［ｃ］配列番号３および４で表される塩基配列を含むＤ
    ＮＡ：
12. 【請求項１２】 下記の何れかのＤＮＡを含有する、糖
    尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤。 ［ａ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
    ＤＮＡにコードされる蛋白質をコードするＤＮＡ；また
    は ［ｂ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
    ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のア
    ミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加され
    たアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビン
    ＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての機能を
    有する蛋白質をコードするＤＮＡ：
13. 【請求項１３】 糖尿病の治療および／または予防のた
    めの遺伝子治療剤が、膵臓機能改善作用を有するもので
    ある請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子治
    療剤。
14. 【請求項１４】 糖尿病の治療および／または予防のた
    めの遺伝子治療剤が、膵臓β細胞からのインスリン分泌
    促進作用を有するものである請求項１０〜１２のいずれ
    か１項に記載の遺伝子治療剤。
15. 【請求項１５】 糖尿病の治療および／または予防のた
    めの遺伝子治療剤が、膵外分泌細胞および膵内分泌細胞
    の再生を促進する作用を有するものである請求項１０〜
    １２のいずれか１項に記載の遺伝子治療剤。
16. 【請求項１６】 アクチビンβA鎖、アクチビンβB鎖、
    またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを含有する、インス
    リン分泌促進剤。
17. 【請求項１７】 以下の［ａ］〜［ｃ］のいずれかに記
    載のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレ
    オチドの誘導体を含有する糖尿病の診断薬。 ［ａ］アクチビンβA鎖、アクチビンβB鎖、またはＡＬ
    Ｋ７をコードするＤＮＡ、またはそれらＤＮＡの部分断
    片であるＤＮＡ； ［ｂ］配列番号３または４で表される塩基配列からなる
    ＤＮＡ、配列番号５および６で表される塩基配列を含む
    ｃＤＮＡ、またはそれらＤＮＡの部分断片であるＤＮＡ
    より選ばれるＤＮＡ ［ｃ］配列番号３または４で表される塩基配列、または
    配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ
    の塩基配列において、連続した５〜６０塩基からなる配
    列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチド
    と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オ
    リゴヌクレオチドの誘導体
18. 【請求項１８】 アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、ＡＬ
    Ｋ７からなる群より選ばれる蛋白質を認識する抗体を含
    有する糖尿病の診断薬。
19. 【請求項１９】 請求項１７に記載のＤＮＡ、オリゴヌ
    クレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体、また
    は請求項１８に記載の抗体を含有する、糖尿病の診断キ
    ット。
20. 【請求項２０】 （i）以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれ
    かに記載のポリペプチドまたは蛋白質を発現する細胞で
    の該ポリペプチドまたは蛋白質の発現量と、（ii）該ポ
    リペプチドまたは蛋白質を発現する細胞と被験試料を接
    触させた場合の該ポリペプチドまたは蛋白質の発現量と
    を比較し、被験試料より以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれ
    かに記載のポリペプチドまたは蛋白質の発現量を増大さ
    せる化合物を選択することを特徴とする、糖尿病の治療
    および／または予防のための医薬のスクリーニング方
    法。 ［ａ］アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７
    より選ばれる蛋白質； ［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
    なるポリペプチド、および配列番号５および６で表され
    る塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質より選
    ばれるポリペプチドまたは蛋白質； ［ｃ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
    選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が
    欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配
    列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガン
    ドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチ
    ド；または ［ｄ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
    ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のア
    ミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加され
    たアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビン
    ＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての活性を
    有する蛋白質：
21. 【請求項２１】 （i）以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれ
    かに記載のポリペプチドまたは蛋白質を発現する細胞の
    機能と、（ii）該ポリペプチドまたは蛋白質を発現する
    細胞と被験試料を接触させた場合の細胞の機能とを比較
    し、被験試料より細胞の機能を制御する活性を有する化
    合物を選択することを特徴とする、糖尿病の治療および
    ／または予防のための医薬のスクリーニング方法。 ［ａ］アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７
    より選ばれる蛋白質； ［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
    なるポリペプチド、および配列番号５および６で表され
    る塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質より選
    ばれるポリペプチドまたは蛋白質； ［ｃ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
    選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が
    欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配
    列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガン
    ドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチ
    ド；または ［ｄ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
    ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のア
    ミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加され
    たアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビン
    ＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての活性を
    有する蛋白質：
22. 【請求項２２】 細胞が、II型アクチビン受容体を発現
    している細胞である、請求項２０または２１に記載のス
    クリーニング方法。
23. 【請求項２３】 細胞が、膵臓β細胞種細胞である請求
    項２０〜２２のいずれか１項に記載のスクリーニング方
    法。
24. 【請求項２４】 以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれかに記
    載のポリペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝子の転
    写を制御する領域の下流にレポーター遺伝の連結された
    ＤＮＡを含むＤＮＡで形質転換された形質転換体と被験
    試料を接触させ、被験試料より以下の［ａ］〜［ｄ］の
    いずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質をコードす
    る遺伝子の発現を増大させる化合物を選択することを特
    徴とする、糖尿病の治療および／または予防のための医
    薬のスクリーニング方法。 ［ａ］アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７
    より選ばれる蛋白質； ［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
    なるポリペプチド、および配列番号５および６で表され
    る塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質より選
    ばれるポリペプチドまたは蛋白質； ［ｃ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から
    選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が
    欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配
    列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガン
    ドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチ
    ド；または ［ｄ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃ
    ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のア
    ミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加され
    たアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビン
    ＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての活性を
    有する蛋白質：
25. 【請求項２５】 糖尿病の治療および／または予防のた
    めの医薬が膵臓機能改善作用を有する化合物である請求
    項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 【請求項２６】 糖尿病の治療および／または予防のた
    めの医薬が膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を
    有する化合物である請求項２０〜２４のいずれか１項に
    記載の方法。
27. 【請求項２７】 糖尿病の治療および／または予防のた
    めの医薬が膵外分泌細胞または膵内分泌細胞の再生を促
    進する作用を有する化合物である請求項２０〜２４のい
    ずれか１項に記載の方法。
28. 【請求項２８】 請求項２０〜２４のいずれか１項に記
    載の方法によって得られる化合物、またはその薬理学的
    に許容される塩。
29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の化合物、またはそ
    の薬理学的に許容される塩を含有する糖尿病の治療およ
    び／または予防のための医薬。
30. 【請求項３０】 ＡＬＫ７を認識する抗体と請求項２８
    に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩とを
    結合して得られる、糖尿病の治療および／または予防の
    ための医薬。
31. 【請求項３１】 膵臓機能改善作用を有する医薬であ
    る、請求項２９または３０に記載の糖尿病の治療および
    ／または予防のための医薬。
32. 【請求項３２】 膵臓β細胞からのインスリン分泌促進
    作用を有する医薬である請求項２９または３０に記載の
    糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
33. 【請求項３３】 膵外分泌細胞または膵内分泌細胞の再
    生を促進する作用を有する医薬である請求項２９または
    ３０に記載の糖尿病の治療および／または予防のための
    医薬。
34. 【請求項３４】 ＡＬＫ７を認識する抗体とＡＬＫ７に
    作用する糖尿病の治療および／または予防のための医薬
    とを結合して得られる融合抗体を膵臓へ選択的に蓄積さ
    せることを特徴とする、糖尿病の治療および／または予
    防のための医薬の輸送方法。
35. 【請求項３５】 糖尿病の治療および／または予防のた
    めの医薬が、請求項２８に記載の化合物またはその薬理
    学的に許容される塩である請求項３４に記載の方法。