JP2002543151A - Death domain containing receptor 5 - Google Patents

Death domain containing receptor 5

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JP2002543151A JP2000615040A JP2000615040A JP2002543151A JP 2002543151 A JP2002543151 A JP 2002543151A JP 2000615040 A JP2000615040 A JP 2000615040A JP 2000615040 A JP2000615040 A JP 2000615040A JP 2002543151 A JP2002543151 A JP 2002543151A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーのメンバーであり、そして現在、ＴＲＡＩＬに結合することが示されている、新規な死ドメイン含有レセプター５（ＤＲ５）タンパク質に関する。詳細には、ヒトＤＲ５タンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。ＤＲ５ポリペプチドもまた、ＤＲ５ポリペプチドを作製するためのベクター、宿主細胞、および組換え方法と同様に提供される。本発明はさらに、ＤＲ５活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。   (57) [Summary] The present invention relates to a novel death domain containing receptor 5 (DR5) protein that is a member of the tumor necrosis factor (TNF) receptor family and has now been shown to bind to TRAIL. In particular, an isolated nucleic acid molecule encoding a human DR5 protein is provided. DR5 polypeptides are also provided, as are vectors, host cells, and recombinant methods for making DR5 polypeptides. The invention further relates to screening methods for identifying agonists or antagonists of DR5 activity.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、レセプターの腫瘍壊死因子ファミリーの新規なメンバーに関する。
より詳細には、ヒト死ドメイン含有レセプター５（すなわち、単純に「ＤＲ５」
）をコードする単離された核酸分子が提供される。ＤＲ５ポリペプチドもまた提
供され、ベクター、宿主細胞、およびこれらを産生するための組換え方法も提供
される。本発明はさらに、ＤＲ５活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定
するためのスクリーニング方法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION Field of the Invention The present invention relates to novel members of the tumor necrosis factor family of receptors.
More specifically, human death domain containing receptor 5 (ie, simply “DR5”
) Is provided. DR5 polypeptides are also provided, as are vectors, host cells, and recombinant methods for producing them. The invention further relates to screening methods for identifying agonists and antagonists of DR5 activity.

【０００２】 （関連分野） 多数の生物学的作用（例えば、特定の刺激への応答および天然の生物学的プロ
セス）は、サイトカインのような因子によって制御される。多くのサイトカイン
は、レセプターを係合し、そして細胞内応答を産生することによって、レセプタ
ーを通して作用する。Related Art [0002] Many biological effects (eg, response to specific stimuli and natural biological processes) are controlled by factors such as cytokines. Many cytokines act through receptors by engaging the receptor and producing an intracellular response.

【０００３】 例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αおよびβはサイトカインであり、これは多
数の生物学的プロセスを制御するＴＮＦレセプターを通して作用し、このプロセ
スとしては、感染およびショックの導入および炎症性疾患に対する防御が挙げら
れる。ＴＮＦ分子は、「ＴＮＦリガンド」スーパーファミリーに属し、そしてそ
れらのレセプターまたは対抗リガンド「ＴＮＦレセプター」スーパーファミリー
とともに作用する。従来、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの９のメンバーが
同定されており、そしてＴＮＦレセプタースーパーファミリーの１０のメンバー
が特徴付けられている。[0003] For example, tumor necrosis factors (TNF) α and β are cytokines that act through TNF receptors that control a number of biological processes, including the induction of infection and shock and inflammatory disease Defense against. TNF molecules belong to the "TNF ligand" superfamily and work with their receptor or counter-ligand "TNF receptor" superfamily. Previously, nine members of the TNF ligand superfamily have been identified, and ten members of the TNF receptor superfamily have been characterized.

【０００４】 リガンドとしては、ＴＮＦα、リンホトキシンα（ＬＴ−α、ＴＮＦβとして
もまた公知である）、ＬＴ−β（複合体異種三量体のＬＴ−α２−βに見出され
る）、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４
０Ｌ、および神経成長因子（ＮＧＦ）が挙げられる。ＴＮＦレセプターのスーパ
ーファミリーとしては、ｐ５５ＴＮＦレセプター、ｐ７５ＴＮＦレセプター、Ｔ
ＮＦレセプター関連タンパク質、ＦＡＳ抗原、またはＡＰＯ−１、ＣＤ４０、Ｃ
Ｄ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、低親和性ｐ７５、およびＮＧＦレセ
プターが挙げられる（Ｍｅａｇｅｒ，Ａ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２２：２
９１−２９５（１９９４））。[0004] Ligands include TNFα, lymphotoxin α (also known as LT-α, TNFβ), LT-β (found in the complex heterotrimeric LT-α2-β), FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, OX4
0L, and nerve growth factor (NGF). The superfamily of TNF receptors includes p55TNF receptor, p75TNF receptor,
NF receptor-related protein, FAS antigen, or APO-1, CD40, C
D27, CD30, 4-1BB, OX40, low affinity p75, and the NGF receptor (Meager, A., Biologicals, 22: 2).
91-295 (1994)).

【０００５】 ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの多くのメンバーは、活性化Ｔ細胞によっ
て発現され、このことは、細胞個体発生および機能の基礎となる他の細胞型との
Ｔ細胞相互作用に必要であることを意味する。（Ｍｅａｇｅｒ，Ａ．，前出）。[0005] Many members of the TNF ligand superfamily are expressed by activated T cells, indicating that they are required for T cell interaction with other cell types underlying cell ontogenesis and function. means. (Meager, A., supra).

【０００６】 ＴＮＦレセプターファミリーのいくつかのメンバーの必須の機能に関する考慮
すべき見識は、これらのタンパク質の発現を回避する変異体の同定および創生か
ら得られている。例えば、ＦＡＳ抗原およびそのリガンドに天然に存在する変異
は、リンパ球増殖性疾患を引き起こし（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ，
Ｒ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５６：３１４（１９９２））、これはおそらく、プ
ログラムされた細胞死の失敗を反映する。ＣＤ４０リガンドの変異は、血漿中の
高レベルの免疫グロブリンＭおよび低レベルの免疫グロブリンＧによって特徴付
けられるＸ関連免疫欠損状態を引き起こし、これは欠陥のあるＴ細胞依存性Ｂ細
胞活性化を引き起こす（Ａｌｌｅｎ，Ｒ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９
９０（１９９３））。低親和性神経成長因子レセプターの標的化変異は、末梢構
造の欠陥のある感覚性新機軸（ｓｅｎｓｏｒｙ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）によっ
て特徴付けられる障害を引き起こす（Ｌｅｅ，Ｋ．Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ ６９：７
３７（１９９２））。Considerable insight into the essential functions of some members of the TNF receptor family has come from the identification and creation of mutants that evade the expression of these proteins. For example, naturally occurring mutations in the FAS antigen and its ligands cause lymphoproliferative disorders (Watanabe-Fukunaga,
R. , Et al., Nature 356: 314 (1992)), presumably reflecting failure of programmed cell death. Mutations in the CD40 ligand cause an X-related immunodeficiency state characterized by high levels of immunoglobulin M and low levels of immunoglobulin G in plasma, which results in defective T cell-dependent B cell activation ( Allen, RC, et al., Science 259: 9.
90 (1993)). Targeted mutations of the low-affinity nerve growth factor receptor cause disorders that are characterized by defective sensory innovations in peripheral structures (Lee, KF et al., Cell 69: 7).
37 (1992)).

【０００７】 ＴＮＦおよびＬＴ−αは、２つのＴＮＦレセプター（５５ｋｄおよび７５ｋｄ
のＴＮＦレセプター）に結合し得る。ＴＮＦおよびＬＴ−αによって誘発される
（それらのレセプターを通じて作用する）多数の生物学的効果としては、移植さ
れた腫瘍の出血性壊死、細胞傷害性、内毒素ショックにおける役割、炎症、免疫
調節、増殖および抗ウイルス応答、ならびに電離放射線の有害な効果に対する防
御が挙げられる。ＴＮＦおよびＬＴ−αは、広範な疾患の病原性に関与し、これ
には、内毒素ショック、大脳マラリア、腫瘍、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、および
移植片−宿主拒絶が挙げられる（Ｂｅｕｔｌｅｒ，ＢおよびＶｏｎ Ｈｕｆｆｅ
ｌ，Ｃ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：６６７−６６８（１９９４））。ｐ５５レ
セプターにおける変異は、微生物感染に対する感受性を増加させる。[0007] TNF and LT-α are two TNF receptors (55 kd and 75 kd)
TNF receptor). Numerous biological effects elicited by TNF and LT-α (acting through their receptors) include hemorrhagic necrosis of transplanted tumors, cytotoxicity, role in endotoxin shock, inflammation, immunomodulation, Proliferative and antiviral responses, and protection against the deleterious effects of ionizing radiation. TNF and LT-α are involved in the pathogenesis of a wide range of diseases, including endotoxin shock, cerebral malaria, tumors, autoimmune diseases, AIDS, and graft-host rejection (Beutler, B and Von Huffe
1, C.I. , Science 264: 667-668 (1994)). Mutations in the p55 receptor increase susceptibility to microbial infection.

【０００８】 さらに、ＴＮＦＲ−１（ｐ５５）およびＦａｓのＣ末端付近の約８０アミノ酸
ドメインが、「死ドメイン」として報告され、これはプログラムされた細胞死に
ついての形質導入シグナル伝達を担う（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｃｅｌｌ ７４
：８４５（１９９３））。In addition, an approximately 80 amino acid domain near the C-terminus of TNFR-1 (p55) and Fas is reported as the “death domain”, which is responsible for transduction signaling for programmed cell death (Tartaglia et al.). , Cell 74
: 845 (1993)).

【０００９】 アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、多細胞生物の正常な発生およ
び恒常性に必須の生理学的プロセスである（Ｈ．Ｓｔｅｌｌｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２６７：１４４５−１４４９（１９９５））。アポトーシスの撹乱は、ガン
、神経変性疾患、および後天性免疫疾患症候群を含むいくつかのヒト疾患の病原
性に寄与する（Ｃ．Ｂ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１４５６
−１４６２（１９９５））。近年、多くの注目が、２つの細胞表面死レセプター
Ｆａｓ／ＡＰＯ−１およびＴＮＦＲ−１のシグナル形質導入および生物学的機能
に集中している（Ｊ．Ｌ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら、Ｃｅｌｌ ８１：４７９−４
８２（１９９５）；Ａ．Ｆｒａｓｅｒら、Ｃｅｌｌ ８５：７８１−７８４（１
９９６）；Ｓ．Ｎａｇａｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１４４９−５６（１
９９５））。両方とも、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーであり、これら
はまた、とりわけ、ＴＮＦＲ−２、低親和性ＮＧＦＲ、ＣＤ４０、およびＣＤ３
０を含む（Ｃ．Ａ．Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０１９−２３（
１９９０）；Ｍ．Ｔｅｗａｒｉら、Ｍｏｄｕｌａｒ Ｔｅｘｔｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍ．Ｐｕｒｔｏｎ，Ｈｅｌ
ｄｉｎ，Ｃａｒｌ編、（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１
９９５））。ファミリーメンバーは、それらの細胞外ドメインにおけるシステイ
ンリッチ反復の存在によって規定されるが、Ｆａｓ／ＡＰＯ−１およびＴＮＦＲ
−１もまた、細胞内相同性の領域（適切には「死ドメイン」と称され、これはＤ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｕｉｃｉｄｅ遺伝子ｒｅａｐｅｒの遠縁にあたる）を共
有する（Ｐ．Ｇｏｌｓｔｅｉｎら、Ｃｅｌｌ ８１：１８５−１８６（１９９５
）；Ｋ．Ｗｈｉｔｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：６７７−８３（１９９４））
。この共有された死ドメインは、両方のレセプターが、最近まで未確認のままの
、関連セットのシグナル伝達形質導入分子と相互作用することを示唆する。Ｆａ
ｓ／ＡＰＯ−１の活性化は、死ドメイン含有アダプター分子ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ
１（Ａ．Ｍ．Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５０５−１２（１９９
５）；Ｍ．Ｐ．Ｂｏｌｄｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：７７９５−
８（１９９５）；Ｆ．Ｃ．Ｋｉｓｃｈｋｅｌら、ＥＭＢＯ １４：５５７９−５
５８８（１９９５））を補充し、これは順に、ＦＬＩＣＥ／ＭＡＣＨ１（プロア
ポトーシスプロテアーゼのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリーのメンバー）に結合し
、そしておそらく活性化する（Ｍ．Ｍｕｚｉｏら、Ｃｅｌｌ ８５：８１７−８
２７（１９９６）；Ｍ．Ｐ．Ｂｏｌｄｉｎら、Ｃｅｌｌ ８５：８０３−８１５
（１９９６））。Ｆａｓ／ＡＰＯ−１の中心の役割は、細胞死を引き起こすこと
であるが、ＴＦＮＲ−１は、その多くがＮＦ−ｋＢを活性化する能力に由来する
多様な生物学的活性の整列をシグナル伝達し得る（Ｌ．Ａ．Ｔａｒｔａｇｌｉａ
ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １３：１５１−３（１９９２））。従って、
ＴＮＦＲ−１は、多価アダプター分子ＴＲＡＤＤを補充し、これはＦＡＤＤに類
似し、死ドメインもまた含む（Ｈ．Ｈｓｕら、Ｃｅｌｌ ８１：４９５−５０４
（１９９５）；Ｈ．Ｈｓｕら、Ｃｅｌｌ ８４：２９９−３０８（１９９６））
。ＦＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、およびＲＩＰを含む多くのシグナル伝達分子との関連
を通じて、ＴＲＡＤＤは、アポトーシスおよびＮＦ−ｋＢ活性化の両方をシグナ
ル伝達し得る（Ｈ．Ｈｓｕら、Ｃｅｌｌ ８４：２９９−３０８（１９９６）；
Ｈ．Ｈｓｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：３８７−３９６（１９９６））。[0009] Apoptosis or programmed cell death is a physiological process essential for the normal development and homeostasis of multicellular organisms (H. Steller, Sciencec)
e 267: 1445-1449 (1995)). Disruption of apoptosis contributes to the pathogenicity of several human diseases, including cancer, neurodegenerative diseases, and acquired immune disease syndrome (CB Thompson, Science 267: 1456).
-1462 (1995)). In recent years, much attention has been focused on signal transduction and biological function of two cell surface death receptors, Fas / APO-1 and TNFR-1, (JL Cleveland et al., Cell 81: 479-4).
82 (1995); Fraser et al., Cell 85: 781-784 (1
996); Nagata et al., Science 267: 1449-56 (1
995)). Both are members of the TNF receptor family, which also include, among others, TNFR-2, low affinity NGFR, CD40, and CD3
0 (CA Smith et al., Science 248: 1019-23 (
1990); Tewari et al., Modular Texts in Mol.
ecological and Cell Biology M. Purton, Hel
din, Carl, (Chapman and Hall, London, 1
995)). Family members are defined by the presence of cysteine-rich repeats in their extracellular domains, whereas Fas / APO-1 and TNFR
-1 is also referred to as the region of intracellular homology (suitably referred to as the "dead domain"
rosophila suicide gene reaper (P. Golstein et al., Cell 81: 185-186 (1995)).
); White et al., Science 264: 677-83 (1994)).
. This shared death domain suggests that both receptors interact with a related set of signaling transducing molecules that remain unidentified until recently. Fa
Activation of s / APO-1 is based on the death domain-containing adapter molecule FADD / MORT.
1 (AM Chinnaiyan et al., Cell 81: 505-12 (199).
5); P. Boldin et al. Biol Chem 270: 7795-
8 (1995); C. Kischkel et al., EMBO 14: 5579-5.
588 (1995)), which in turn binds and probably activates FLICE / MACH1 (a member of the ICE / CED-3 family of pro-apoptotic proteases) (M. Muzio et al., Cell 85: 817-). 8
27 (1996); P. Boldin et al., Cell 85: 803-815.
(1996)). While the central role of Fas / APO-1 is to cause cell death, TFNR-1 signals an array of diverse biological activities, many of which derive from their ability to activate NF-KB. (LA Tartaglia)
Et al., Immunol Today 13: 151-3 (1992)). Therefore,
TNFR-1 recruits the multivalent adapter molecule TRADD, which is similar to FADD and also contains a death domain (H. Hsu et al., Cell 81: 495-504).
(1995); Hsu et al., Cell 84: 299-308 (1996)).
. Through its association with many signaling molecules, including FADD, TRAF2, and RIP, TRADD can signal both apoptosis and NF-kB activation (H. Hsu et al., Cell 84: 299-308 (1996)). ;
H. Hsu et al., Immunity 4: 387-396 (1996)).

【００１０】 近年、新たなアポトーシス誘導性ＴＮＦリガンドが発見されている。Ｓ．Ｒ．
Ｗｉｌｅｙら（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：６７３−６８２（１９９５））は、この
分子を「ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド」または単純に「ＴＲＡＩＬ］
と命名した。この分子はまた、「Ａｐｏ−２リガンド」または「Ａｐｏ−２Ｌ」
とも称された。Ｒ．Ｍ．Ｐｉｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２６
８７−１２６９０（１９９６）。便宜上、この分子は、本明細書中でＴＲＡＩＬ
として称される。In recent years, new apoptosis-inducing TNF ligands have been discovered. S. R.
Wiley et al. (Immunity 3: 673-682 (1995)) describe this molecule as a "TNF-related apoptosis-inducing ligand" or simply "TRAIL]
It was named. This molecule may also be referred to as an "Apo-2 ligand" or "Apo-2L"
It was also called. R. M. Pitt et al. Biol. Chem. 271: 126
87-12690 (1996). For convenience, this molecule is referred to herein as TRAIL
Referred to as

【００１１】 ＦＡＳリガンド（この転写物は、刺激されたＴ細胞に非常に制限されるようで
ある）とは異なり、有意なレベルのＴＲＡＩＬが、多くのヒト組織（例えば、脾
臓、肺、前立腺、胸腺、卵巣、小腸、結腸、末梢血リンパ球、胎盤、腎臓）にお
いて検出され、そしていくつかの細胞株によって連続的に転写される。ＴＲＡＩ
ＬはＦａｓリガンドから独立して作用することが示されている（Ｗｉｌｅｙら、
前出）。ＴＲＡＩＬはＦａｓ／Ａｐｏ−１Ｌによる死伝達と同様の時間枠内で、
迅速にアポトーシスを活性化するが、ＴＮＦ誘導性アポトーシスより早いことも
また示されている。Ｓ．Ａ．Ｍａｒｓｔｅｒｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ６：７５０−７５２（１９９６）。ＴＲＡＩＬのＴＮＦＲ−１、Ｆａｓ、
または近年同定されたＤＲ３への結合の不能性は、ＴＲＡＩＬは、独特のレセプ
ターと相互作用し得ることを示唆する。[0011] Unlike FAS ligands, whose transcripts appear to be very restricted to stimulated T cells, significant levels of TRAIL are found in many human tissues such as spleen, lung, prostate, It is detected in the thymus, ovary, small intestine, colon, peripheral blood lymphocytes, placenta, kidney) and is continuously transcribed by several cell lines. TRAI
L has been shown to act independently of Fas ligand (Wiley et al.,
Supra). TRAIL is within the same time frame as the death transmission by Fas / Apo-1L,
It has also been shown to activate apoptosis rapidly but earlier than TNF-induced apoptosis. S. A. Marsters et al., Current Biolo
gy 6: 750-752 (1996). TRAIL TNFR-1, Fas,
Or the recently identified inability to bind DR3 suggests that TRAIL may interact with unique receptors.

【００１２】 ＴＮＦファミリーリガンドおよびＴＮＦファミリーレセプターの効果は変化し
、そして哺乳動物系の生物学的プロセスにおいて正常および異常の両方の多数の
機能に影響する。それゆえ、正常および疾患状態の両方において生物学的活性に
影響するようなレセプターおよびリガンドの同定および特徴づけのための明確な
必要性が存在する。特に、ＴＲＡＩＬに結合するさらなる新規なレセプターを単
離および特徴付ける必要性が存在する。[0012] The effects of TNF family ligands and receptors are altered and affect many functions, both normal and abnormal, in biological processes in mammalian systems. Therefore, there is a clear need for the identification and characterization of receptors and ligands that affect biological activity in both normal and disease states. In particular, there is a need to isolate and characterize additional novel receptors that bind TRAIL.

【００１３】 （発明の要旨） 本発明は、単離された核酸分子を提供し、これは、図１（配列番号２）に示さ
れるアミノ酸配列または１９９７年３月７日にＡＴＣＣ受託番号９７９２０とし
て寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列をコードする核酸配列
を含むか、またはそれからなる。SUMMARY OF THE INVENTION [0013] The present invention provides an isolated nucleic acid molecule, which has the amino acid sequence set forth in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or ATCC Accession No. 97920 on March 7, 1997. It comprises or consists of a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence encoded by the deposited cDNA.

【００１４】 本発明はまた、組換えベクター（本発明の単離された核酸分子を含む）を提供
し、そして組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび
宿主細胞を作製する方法、およびＤＲ５ポリペプチドまたはペプチドの組換え技
術による産生のためにそれらを使用するための方法を提供する。The present invention also provides recombinant vectors (including the isolated nucleic acid molecules of the invention) and host cells containing the recombinant vectors, and methods of making such vectors and host cells, And methods for using them for recombinant production of DR5 polypeptides or peptides.

【００１５】 本発明はさらに、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドによってコードさ
れるアミノ酸配列を有する単離されたＤＲ５ポリペプチドを提供する。[0015] The present invention further provides an isolated DR5 polypeptide having an amino acid sequence encoded by a polynucleotide described herein.

【００１６】 本発明はまた、ＤＲ５タンパク質のレベルを検出するための定量的および診断
用アッセイのような診断用アッセイを提供する。従って、例えば、正常なコント
ロール組織サンプルと比較してＤＲ５またはその可溶性形態の過剰発現を検出す
るための本発明による診断用アッセイが、腫瘍の存在を検出するのに使用され得
る。[0016] The present invention also provides diagnostic assays, such as quantitative and diagnostic assays for detecting levels of DR5 protein. Thus, for example, a diagnostic assay according to the invention for detecting overexpression of DR5 or a soluble form thereof compared to a normal control tissue sample can be used to detect the presence of a tumor.

【００１７】 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーリガンドは、最も多面性のサイトカインの
中にあることが公知であり、これは、細胞毒性、抗ウイルス活性、免疫調節活性
、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む大多数の細胞性応答を含む。ＴＮＦ
ファミリーリガンドに対する細胞性応答は、正常な生理学的応答だけでなく、増
加したアポトーシスに関連する疾患またはアポトーシスの阻害も含む。アポトー
シス（プログラムされた細胞死）は、免疫系の末梢Ｔリンパ球の欠失に関与する
生理学的機構であり、そしてその調節不全は、多数の異なる病原性プロセスを導
き得る。増加した細胞生存に関連する疾患、またはアポトーシスの阻害としては
、ガン、自己免疫疾患、ウイルス感染、炎症、移植片対宿主疾患、急性移植片拒
絶、および慢性移植片拒絶が挙げられる。増加したアポトーシスに関連する疾患
としては、ＡＩＤＳ、神経変性障害、脊髄形成異常症候群、虚血性障害、毒素誘
導性肝臓疾患、敗血症性ショック、悪液質、および摂食障害が挙げられる。[0017] Tumor necrosis factor (TNF) family ligands are known to be among the most pleiotropic cytokines, including cytotoxicity, antiviral activity, immunomodulatory activity, and transcriptional regulation of several genes. Including the majority of cellular responses. TNF
Cellular responses to family ligands include normal physiological responses as well as diseases associated with increased apoptosis or inhibition of apoptosis. Apoptosis (programmed cell death) is a physiological mechanism involved in the loss of peripheral T lymphocytes of the immune system, and its dysregulation can lead to a number of different pathogenic processes. Diseases associated with increased cell survival, or inhibition of apoptosis, include cancer, autoimmune diseases, viral infections, inflammation, graft versus host disease, acute graft rejection, and chronic graft rejection. Diseases associated with increased apoptosis include AIDS, neurodegenerative disorders, myelodysplastic syndromes, ischemic disorders, toxin-induced liver diseases, septic shock, cachexia, and eating disorders.

【００１８】 従って、本発明はさらに、ＴＮＦファミリーリガンドによって誘導されるアポ
トーシスを増強するための方法を提供し、これは、ＤＲ５ポリペプチドを発現す
る細胞に、ＤＲ５媒介性シグナル伝達を増加し得る有効量のアゴニストを投与す
る工程を包含する。好ましくは、ＤＲ５媒介性シグナル伝達は、疾患を処置およ
び／または予防するために増加され、ここで減少したアポトーシスが示される。Accordingly, the present invention further provides a method for enhancing apoptosis induced by a TNF family ligand, which is effective in cells expressing a DR5 polypeptide to increase DR5-mediated signaling. Administering an amount of the agonist. Preferably, DR5-mediated signaling is increased to treat and / or prevent disease, where reduced apoptosis is exhibited.

【００１９】 さらなる局面において、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドによって誘導さ
れるアポトーシスを阻害するための方法に関し、これはＤＲ５ポリペプチドを発
現する細胞に、ＤＲ５媒介性伝達を減少し得る有効量のアンタゴニストを投与す
る工程を包含する。好ましくは、ＤＲ５媒介性伝達は、疾患を処置および／また
は予防するために減少され、ここで増加したアポトーシスが示される。In a further aspect, the invention relates to a method for inhibiting apoptosis induced by a TNF family ligand, comprising administering to a cell expressing a DR5 polypeptide an effective amount of an antagonist capable of reducing DR5-mediated transmission. Is administered. Preferably, DR5-mediated transmission is reduced to treat and / or prevent disease, where increased apoptosis is exhibited.

【００２０】 本発明のいずれの候補体「アゴニスト」または「アンタゴニスト」がアポトー
シスを増強または阻害し得るかどうか、当該分野で公知のＴＮＦファミリーリガ
ンド／レセプター細胞応答アッセイを用いて決定され得、これには以下により詳
細に記載されるものが挙げられる。従って、さらなる局面において、候補体アゴ
ニストまたはアンタゴニストがＴＮＦファミリーリガンドに対する細胞応答を増
強または阻害し得るかどうかを決定するためのスクリーニング方法が提供される
。この方法は、ＤＲ５ポリペプチドを発現する細胞を、候補体化合物およびＴＮ
Ｆファミリーリガンドと接触させる工程、細胞応答をアッセイする工程、ならび
に細胞応答を標準的な細胞応答と比較する工程を含み、この標準は、候補体化合
物の非存在下でリガンドとの接触がなされる場合にアッセイされ、それにより、
標準を超える増加した細胞応答は、候補化合物がリガンド／レセプター伝達経路
のアゴニストであることを示し、そして標準に比べて減少した細胞応答は、候補
体化合物が、リガンド／レセプター伝達経路のアンタゴニストであることを示す
。本発明によって、ＤＲ５ポリペプチドを発現する細胞は、内因性または外因的
に投与されたＴＮＦファミリーリガンドのいずれかと接触させられ得る。Whether any of the candidate “agonists” or “antagonists” of the present invention can enhance or inhibit apoptosis can be determined using TNF family ligand / receptor cell response assays known in the art, Include those described in more detail below. Thus, in a further aspect, there is provided a screening method for determining whether a candidate agonist or antagonist can enhance or inhibit a cellular response to a TNF family ligand. This method comprises converting cells expressing a DR5 polypeptide into a candidate compound and TN.
Contacting with an F-family ligand, assaying a cellular response, and comparing the cellular response to a standard cellular response, wherein the standard is contacted with the ligand in the absence of the candidate compound. Assayed in cases where
An increased cellular response above the standard indicates that the candidate compound is an agonist of the ligand / receptor pathway, and a decreased cellular response relative to the standard indicates that the candidate compound is an antagonist of the ligand / receptor pathway. It indicates that. According to the invention, cells expressing the DR5 polypeptide can be contacted with either endogenously or exogenously administered TNF family ligands.

【００２１】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明は、図１（配列番号２）で示されるアミノ酸配列を有するＤＲ５ポリペ
プチド、またはこのポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチド
を含むかまたはそれからなる、単離された核酸分子を提供する。本発明のＤＲ５
ポリペプチドは、ＴＮＦＲファミリーの、他の既知の死ドメイン含有レセプター
（図２のヒトＴＮＦＲ−１、ＤＲ３、およびＦａｓを含む）と配列相同性を共有
する。図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列は、ＨＬＹＢＸ８８のよ
うなｃＤＮＡクローンの配列決定によって得られ、このクローンは、１９９７年
３月７日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１０８０１ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ
２０１１０−２２０９に寄託され、そして受託番号９７９２０が与えられた。寄
託されたｃＤＮＡは、ｐＳｐｏｒｔ １プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に含まれる。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention comprises or comprises a polynucleotide encoding a DR5 polypeptide having the amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), or a fragment of this polypeptide. The present invention provides an isolated nucleic acid molecule. DR5 of the present invention
The polypeptide shares sequence homology with other known death domain-containing receptors of the TNFR family, including human TNFR-1, DR3, and Fas in FIG. The nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) was obtained by sequencing a cDNA clone such as HLYBX88, which was obtained on March 7, 1997, American Type Culture, 10801 Uni.
Verity Boulevard, Manassas, Virginia
Deposit No. 20110-2209 and given accession number 97920. The deposited cDNA is a pSport 1 plasmid (Life Technology)
, O., Giesersburg, MD).

【００２２】 （核酸分子） 他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決
定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ ３７３）を用いて
決定され、そして本明細書中で決定されたＤＮＡ分子によってコードされるポリ
ペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるＤＮＡ配列の翻訳
によって推定された。従って、この自動化アプローチによって決定された任意の
ＤＮＡ配列について当該分野において公知のように、本明細書中で決定される任
意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含み得る。自動化によって決定される
ヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対
して、代表的には少なくとも約９０％同一、より代表的には少なくとも約９５％
〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野において周知の
手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってさらに正確に決定され得
る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較して、決定されたヌ
クレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳にお
いてフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されたヌクレオチド配列によ
ってコードされる推定アミノ酸配列は、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際
にコードされるアミノ酸配列（このような挿入または欠失の点にて始まる）とは
完全に異なる。Nucleic Acid Molecules Unless otherwise indicated, all nucleotide sequences determined herein by sequencing a DNA molecule refer to an automated DNA sequencer (eg, Ap
Plied Biosystems, Inc. The entire amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA molecule determined herein was determined by translation of the DNA sequence determined as described above. Thus, as is known in the art for any DNA sequence determined by this automated approach, any nucleotide sequence determined herein may contain some errors. The nucleotide sequence determined by the automation is typically at least about 90% identical to the actual nucleotide sequence of the DNA molecule being sequenced, more typically at least about 95%.
~ At least about 99.9% identical. The actual sequence can be more accurately determined by other approaches, including manual DNA sequencing methods well known in the art. As is also known in the art, a single insertion or deletion in a determined nucleotide sequence, as compared to the actual sequence, causes a frameshift in translation of the nucleotide sequence, such that the determined nucleotide sequence Is completely different from the amino acid sequence actually encoded by the sequenced DNA molecule (starting at such an insertion or deletion).

【００２３】 本明細書中で提供される情報（例えば、配列番号１に示される核酸配列）を使
用して、ＤＲ５ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、出発物質として
ｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡをクローニングするための手順のような、標準的な
クローニングおよびスクリーニング手順を使用して得られ得る。本発明の例示と
なる、本発明の核酸分子は、以下の組織のｃＤＮＡライブラリーで同定された：
一次樹状細胞、内皮組織、脾臓、慢性リンパ性白血病、およびヒト胸腺間質細胞
。Using the information provided herein (eg, the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1), a nucleic acid molecule of the invention encoding a DR5 polypeptide can be prepared using mRNA as a starting material. It can be obtained using standard cloning and screening procedures, such as those for cloning cDNA. Exemplary nucleic acid molecules of the invention have been identified in cDNA libraries of the following tissues:
Primary dendritic cells, endothelial tissue, spleen, chronic lymphocytic leukemia, and human thymic stromal cells.

【００２４】 配列番号１のＤＲ５ ｃＤＮＡの決定されたヌクレオチド配列は、約４１１ア
ミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、そ
の開始コドンは、約５１アミノ酸残基のリーダー配列を有する、図１（配列番号
１）に示されるヌクレオチド配列の１３０〜１３２位にある。公知のＴＮＦレセ
プターファミリーのメンバーの、本発明のＤＲ５ポリペプチドは、複数のシステ
インリッチドメインにわたって有意な配列相同性を含む、図２に示されるヒトＴ
ＮＦＲ−１、ＦＡＳ、およびＤＲ３ポリペプチドと高度な相同性を共有する。Ｄ
Ｒ５が、他の死ドメイン含有レセプターに対して示す相同性は、ＤＲ５もまたア
ポトーシスを誘導する能力を有する死ドメイン含有レセプターであることを強く
示す。ＤＲ５はまた現在、ＴＲＡＩＬを結合することが示されている。The determined nucleotide sequence of the DR5 cDNA of SEQ ID NO: 1 contains an open reading frame encoding a protein of about 411 amino acid residues, the start codon of which has a leader sequence of about 51 amino acid residues. 1 (SEQ ID NO: 1) at positions 130-132 of the nucleotide sequence shown. The DR5 polypeptide of the present invention, a member of the known TNF receptor family, contains significant sequence homology across multiple cysteine-rich domains, and the human T5 shown in FIG.
Shares a high degree of homology with NFR-1, FAS, and DR3 polypeptides. D
The homology that R5 shows to other death domain containing receptors strongly indicates that DR5 is also a death domain containing receptor with the ability to induce apoptosis. DR5 has also now been shown to bind TRAIL.

【００２５】 示されるように、本発明はまた、本発明のＤＲ５タンパク質の成熟形態を提供
する。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、
粗面小胞体を横切る伸長中のタンパク質鎖の搬出が一旦開始されると、成熟タン
パク質から切断される、シグナルまたは分泌リーダー配列を有する。大半の哺乳
動物細胞および昆虫細胞でさえも、分泌タンパク質を同じ特異性で切断する。し
かし、いくつかの場合では、分泌タンパク質の切断は完全には均一ではなく、タ
ンパク質において２つ以上の成熟種を生じる。さらに、分泌タンパク質の切断特
異性は、究極的には完全タンパク質の一次構造によって決定され、すなわち、そ
れはポリペプチドのアミノ酸配列に固有なものであることが長い間知られていた
。As indicated, the invention also provides mature forms of the DR5 proteins of the invention. According to the signal hypothesis, proteins secreted by mammalian cells are:
Once export of a growing protein chain across the rough endoplasmic reticulum is initiated, it has a signal or secretory leader sequence that is cleaved from the mature protein. Most mammalian cells and even insect cells cleave secreted proteins with the same specificity. However, in some cases, cleavage of the secreted protein is not completely uniform, resulting in more than one mature species in the protein. In addition, the cleavage specificity of a secreted protein is ultimately determined by the primary structure of the entire protein, ie, it has long been known to be unique to the amino acid sequence of a polypeptide.

【００２６】 従って、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号９７９２０として同定されるプラスミド
中に含まれるｃＤＮＡによってコードされ、そして図１（配列番号２）に示され
るようなアミノ酸配列を有する、成熟ＤＲ５ポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を提供する。ＡＴＣＣ受託番号９７９２０として同定されるプラスミド
中に含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＤＲ５タ
ンパク質とは、寄託されたプラスミドに含まれるヒトＤＮＡによってコードされ
る完全オープンリーディングフレームの、哺乳動物細胞（例えば、以下に記載す
るようなＣＯＳ細胞）中での発現によって産生されるＤＲ５タンパク質の成熟形
態を意味する。以下に示すように、ＡＴＣＣ受託番号９７９２０に含まれるｃＤ
ＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＤＲ５は、コンピュータ分
析に基づいて推定された切断部位の正確さに依存して、配列番号２に示された推
定「成熟」ＤＲ５タンパク質（アミノ酸約１〜約３６０）と異なっても、異なら
なくとも良い。Accordingly, the present invention provides a mature DR5 polypeptide encoded by a cDNA contained in a plasmid identified as ATCC Accession No. 97920, and having the amino acid sequence as shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). 1 provides the encoding nucleotide sequence. Mature DR5 protein having the amino acid sequence encoded by the cDNA contained in the plasmid identified as ATCC Accession No. 97920 is defined as a mammalian cell of a fully open reading frame encoded by human DNA contained in a deposited plasmid. (Eg, COS cells as described below) means the mature form of the DR5 protein produced by expression. As shown below, the cD contained in ATCC Accession No. 97920
The mature DR5, having the amino acid sequence encoded by NA, has the predicted “mature” DR5 protein shown in SEQ ID NO: 2 (amino acids from about 1 to about 360) or may not be different.

【００２７】 タンパク質が、分泌リーダーならびにリーダー配列の切断点を有するか否かを
推定する方法が利用可能である。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ
．３：２７１−２８６（１９８５））およびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６））の方法が
使用され得る。これらの各方法の公知の哺乳動物分泌タンパク質の切断点の推定
の正確さは、７５〜８０％の範囲内にある。ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前出。しか
し、２つの方法は、所定のタンパク質に対して常に同じ推定切断点を生成するわ
けではない。Methods are available for estimating whether a protein has a secretory leader as well as a breakpoint in the leader sequence. For example, McGeoch (Virus Res
. 3: 271-286 (1985)) and von Heinje (Nuclee).
ic Acids Res. 14: 4683-4690 (1986)). The accuracy of estimating the breakpoints of known mammalian secretory proteins for each of these methods is in the range of 75-80%. von Heinje, supra. However, the two methods do not always generate the same putative breakpoint for a given protein.

【００２８】 本発明の場合、本発明の完全ＤＲ５ポリペプチドの推定アミノ酸配列は、コン
ピュータープログラム（「ＰＳＯＲＴ」）によって分析された。Ｋ．Ｎａｋａｉ
およびＭ．Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：８９７−９１１（１９
９２）を参照のこと。ＰＳＯＲＴは、アミノ酸配列に基づいてタンパク質の細胞
性位置を推定するためのエキスパートシステムである。この位置付けのコンピュ
ーター推定の一部として、ＭｃＧｅｏｃｈおよびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法が
援用される。ＰＳＯＲＴプログラムによる分析は、図１におけるアミノ酸５１と
５２の間（配列番号２の−１と１の間）の切断部位を推定した。その後、完全ア
ミノ酸配列を目視検査によってさらに分析し、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの（−１，
−３）規則の単純形態を適用した。ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前出。従って、ＤＲ
５タンパク質のリーダー配列は、図１の下線を付したアミノ酸残基約１〜約５１
（配列番号２の約−５１〜約１のアミノ酸残基に対応する）からなると推定され
、一方で、推定成熟ＤＲ５タンパク質は、図１の残基約５２〜約４１１（配列番
号２の約１〜約３６０のアミノ酸残基に対応する）からなる。In the present case, the deduced amino acid sequence of the complete DR5 polypeptide of the present invention was analyzed by a computer program (“PSORT”). K. Nakai
And M. Kanehisa, Genomics 14: 897-911 (19
92). PSORT is an expert system for estimating the cellular position of a protein based on the amino acid sequence. As part of the computer estimation of this position, the methods of McGeoch and von Heinje are incorporated. Analysis by the PSORT program estimated the cleavage site between amino acids 51 and 52 in FIG. 1 (between -1 and 1 in SEQ ID NO: 2). Thereafter, the complete amino acid sequence was further analyzed by visual inspection and the von Heinje's (-1,
-3) A simple form of rule was applied. von Heinje, supra. Therefore, DR
The leader sequence for the five proteins is underlined from about 1 to about 51 amino acid residues in FIG.
(Corresponding to about -51 to about 1 amino acid residues of SEQ ID NO: 2), while the predicted mature DR5 protein has residues from about 52 to about 411 of FIG. ~ Corresponding to about 360 amino acid residues).

【００２９】 当業者が理解するように、配列決定誤差の可能性および異なる既知のタンパク
質におけるリーダーについての切断部位の可変性に起因して、寄託されたｃＤＮ
Ａによってコードされる推定ＤＲ５レセプターポリペプチドは、約４１１アミノ
酸を含むが、４０１〜４２１アミノ酸の範囲中のいずれかであってもよい；そし
て、このタンパク質の推定リーダー配列は、約５１アミノ酸であるが、約４１〜
約６１アミノ酸の範囲中のいずれかであってもよい。本明細書中に記載されるド
メインは、コンピューター分析によって推定されており、従って、種々の機能的
ドメインを同定するために使用される分析判断基準に依存して、例えば、ＤＲ５
の細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、死ドメイン、システインリッチモチーフ、
および膜貫通ドメインの正確な「所在地（ａｄｄｒｅｓｓ）」は、わずかに異な
り得ることがさらに理解される。例えば、図１（配列番号２）におけるＤＲ５細
胞外ドメインの正確な位置は、ドメインを規定するために使用される判断基準に
依存して、わずかに変化し得る（例えば、所在地は、約１〜約２０残基、より可
能性があるには、約１〜約５残基程度「シフト」し得る）。いずれにせよ、以下
でさらに考察するように、本発明はさらに、完全ＤＲ５のＮ末端および／または
Ｃ末端から種々の残基を欠失したポリペプチドを提供し、これには、ＤＲ５ポリ
ペプチドの細胞外ドメインの可溶性形態を構築する、本明細書中に記載の細胞外
ドメインのＮ末端から１以上のアミノ酸を欠失したポリペプチドが含まれる。As the skilled artisan will appreciate, due to the possibility of sequencing errors and the variability of the cleavage site for the leader in different known proteins, the deposited cDN
The putative DR5 receptor polypeptide encoded by A contains about 411 amino acids, but may be anywhere in the range of 401-421 amino acids; and the putative leader sequence for this protein is about 51 amino acids. But about 41-
It may be anywhere in the range of about 61 amino acids. The domains described herein have been estimated by computer analysis and, thus, depending on the analytical criteria used to identify various functional domains, for example, DR5
Extracellular domain, intracellular domain, death domain, cysteine-rich motif,
It is further understood that the exact “address” of the transmembrane domain and can vary slightly. For example, the exact location of the DR5 extracellular domain in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) may vary slightly (e.g., the location may be between about 1 and 2), depending on the criteria used to define the domain. About 20 residues, and more likely about 1 to about 5 residues. In any event, as discussed further below, the present invention further provides polypeptides having various residues deleted from the N-terminal and / or C-terminal of the complete DR5, including those of the DR5 polypeptide. Included are polypeptides that delete one or more amino acids from the N-terminus of the extracellular domain described herein that make up the soluble form of the extracellular domain.

【００３０】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、
またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングによって得られるか、または合成的
に生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。ＤＮＡは、二本
鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡは、コード鎖（センス鎖としても公知
）であり得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖とも呼ばれる）であり得る
。As indicated, the nucleic acid molecules of the invention can be in the form of RNA (eg, mRNA),
Alternatively, it can be in the form of DNA, including, for example, cDNA and genomic DNA obtained by cloning or produced synthetically. DNA can be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA can be the coding strand (also known as the sense strand) or the non-coding strand (also called the antisense strand).

【００３１】 「単離された」核酸分子とは、そのネイティブな環境から取り出された核酸分
子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意図する。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤ
ＮＡ分子は、本発明の目的のために、単離されたとみなされる。単離されたＤＮ
Ａ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分
子、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられ
る。By “isolated” nucleic acid molecule is intended a nucleic acid molecule (DNA or RNA) that has been removed from its native environment. For example, the recombinant D contained in the vector
NA molecules are considered isolated for the purposes of the present invention. Isolated DN
Further examples of A molecules include recombinant DNA molecules that are maintained in a heterologous host cell, or (partially or substantially) purified DNA molecules in solution.

【００３２】 しかし、混合されたクローンのライブラリー（例えば、ゲノムライブラリーま
たはｃＤＮＡライブラリー）のメンバーであって、ライブラリーの他のクローン
から単離されていない（例えば、ライブラリーの他のメンバーを伴なわずに、ク
ローンを含む均質な溶液の形態で）クローン中に含まれる核酸分子、あるいは細
胞または細胞溶解産物から単離されたか、または取り出された染色体（例えば、
核型におけるような「染色体スプレッド（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｐｒｅａｄ
）」）は、本発明の目的のためには、「単離され」ていない。単離されたＲＮＡ
分子としては、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写
物が挙げられる。本発明に従って単離された核酸分子にはさらに、合成的に生成
されるような分子が含まれる。However, members of a mixed clone library (eg, a genomic library or a cDNA library) that are not isolated from other clones of the library (eg, other members of the library) (In the form of a homogenous solution containing the clone), or a chromosome isolated or removed from a cell or cell lysate (eg, in the form of a homogeneous solution containing the clone)
"Chromosome spread" as in karyotype
) ") Are not" isolated "for the purposes of the present invention. RNA isolated
Molecules include in vivo or in vitro RNA transcripts of a DNA molecule of the present invention. Nucleic acid molecules isolated according to the present invention further include those molecules that are produced synthetically.

【００３３】 本発明の単離された核酸分子としては、以下が挙げられる：配列番号１に示さ
れるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むか、あるいはそれからなる
ＤＲ５ ＤＮＡ分子；成熟ＤＲ５タンパク質のコード配列を含むか、あるいはそ
れからなる、ＤＮＡ分子；および、上記のＤＮＡ分子とは実質的に異なるが、遺
伝暗号の縮重に起因して、なおＤＲ５タンパク質をコードする配列を含むか、あ
るいはそれからなる、ＤＮＡ分子。当然のことながら、遺伝暗号は、当該分野に
おいて周知である。従って、当業者にとって、このような縮重改変体を生成する
ことは慣用的である。The isolated nucleic acid molecules of the present invention include: a DR5 DNA molecule comprising or consisting of the open reading frame (ORF) set forth in SEQ ID NO: 1; A DNA molecule comprising or consisting of; and a DNA molecule substantially different from that of the above, but still comprising or consisting of a sequence encoding the DR5 protein, due to the degeneracy of the genetic code. molecule. Of course, the genetic code is well known in the art. Accordingly, it is conventional for those skilled in the art to generate such degenerate variants.

【００３４】 さらに、本発明は、以下の関連ｃＤＮＡから決定された、配列番号１の広範な
部分に関連するヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する：ＨＡＰＢＵ１３
Ｒ（配列番号６）およびＨＳＢＢＵ７６Ｒ（配列番号７）。ＨＡＰＢＵ１３Ｒお
よびＨＳＢＢＵ７６Ｒのヌクレオチド配列を、図４に示す。Further, the present invention provides a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence related to a broad portion of SEQ ID NO: 1, determined from the following related cDNAs: HAPBU13
R (SEQ ID NO: 6) and HSBBU76R (SEQ ID NO: 7). The nucleotide sequences of HAPBU13R and HSBBU76R are shown in FIG.

【００３５】 Ｇｅｎａｂａｎｋ登録番号Ｚ６６０８３を割り当てられた、さらなる関連のポ
リヌクレオチドのヌクレオチド配列を、配列番号１４に示す。The nucleotide sequence of a further related polynucleotide, assigned Genabank accession number Z66083, is shown in SEQ ID NO: 14.

【００３６】 別の局面において、本発明は、１９９７年３月７日にＡＴＣＣ受託番号９７９
２０として寄託されたプラスミド中に含まれるｃＤＮＡによってコードされるア
ミノ酸配列を有するＤＲ５ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提
供する。さらなる実施形態では、Ｎ末端メチオニンを欠いた、成熟ＤＲ５ポリペ
プチドまたは全長ＤＲ５ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。本発明
はさらに、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、もしくは上記の寄託された
プラスミド中に含まれるＤＲ５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有する単離され
た核酸分子、または上記の配列の１つに対して相補的な配列を有する核酸分子を
提供する。このような単離された分子（特に、ＤＮＡ分子）は、例えば、染色体
を用いたインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子地図作製のためのプ
ローブとして、そしてヒト組織におけるＤＲ５遺伝子の発現を検出する（例えば
、ノーザンブロット分析による）ためのプローブとしての用途が挙げられるが、
これらに限定されない用途を有する。[0036] In another aspect, the invention relates to ATCC Accession No. 979 on March 7, 1997.
20. An isolated nucleic acid molecule encoding a DR5 polypeptide having the amino acid sequence encoded by the cDNA contained in the plasmid deposited as 20. In a further embodiment, there is provided a nucleic acid molecule encoding a mature or full-length DR5 polypeptide lacking an N-terminal methionine. The present invention further provides an isolated nucleic acid molecule having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence of the DR5 cDNA contained in the deposited plasmid as described above, or complementary to one of the above sequences. Nucleic acid molecule having a specific sequence. Such isolated molecules (especially DNA molecules) can be used, for example, as probes for genetic mapping by in situ hybridization using chromosomes and to detect the expression of the DR5 gene in human tissues (eg, Northern Blot analysis) as a probe for
It has uses not limited to these.

【００３７】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する単離されたＤＮＡ分
子のフラグメント、または寄託されたｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号９７９２０と
して寄託されたプラスミド中に含まれるｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列を有する
単離されたＤＮＡ分子のフラグメントとは、少なくとも２０ｎｔ、そしてより好
ましくは少なくとも３０ｎｔ長、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約４
０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０
、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００
、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、または１２００ヌクレオ
チド長のＤＮＡフラグメントを意図する。これは、上記で考察したように、ＤＮ
Ａプローブとして有用である。当然のことながら、配列番号１に示されるヌクレ
オチド配列のすべてではなくとも大部分に対応するＤＮＡフラグメントもまた、
ＤＮＡプローブとして有用である。例えば、少なくとも約２０ｎｔ長のフラグメ
ントとは、寄託されたＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１に示されるよ
うなヌクレオチド配列由来の２０個以上連続した塩基を含むフラグメントを意図
する。この文脈において「約（おおよそ）」は、特に示されるサイズ、いずれか
の末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１
個）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さなサイズを含む。[0037] The present invention is further directed to fragments of the isolated nucleic acid molecules described herein. A fragment of an isolated DNA molecule having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or an isolated DNA having the nucleotide sequence of the deposited cDNA (cDNA contained in a plasmid deposited as ATCC Accession No. 97920) A fragment of a molecule is at least 20 nt, and more preferably at least 30 nt long, and even more preferably at least about 4 nt.
0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450
, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900
, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, or 1200 nucleotides in length are contemplated. This is, as discussed above, the DN
Useful as an A probe. It will be appreciated that DNA fragments corresponding to most, if not all, of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 are also
Useful as a DNA probe. For example, a fragment of at least about 20 nt in length is intended to include a nucleotide sequence of the deposited DNA or a fragment containing 20 or more consecutive bases derived from the nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 1. In this context, "about" means a number (e.g., 5, 4, 3, 2, or 1) at the indicated size, either or both ends.
) Nucleotides larger or smaller in size.

【００３８】 本発明のＤＲ５ポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例としては、例えば
、おおよそヌクレオチド１〜１３０、１３０〜１８０、１８１〜２３１、２３２
〜２８２、２８３〜３３３、３３４〜３８４、３８５〜４３５、４３６〜４８６
、４８７〜５３７、５３８〜５８８、５８９〜６３９、６４０〜６８１、６８２
〜７３２、７３３〜７５３、７５４〜８０４、８０５〜８５５、８５６〜９０６
、９０７〜９５７、９５８〜１００８、１００９〜１０５９、１０６０〜１０９
８、１０９９〜１１４９、１１５０〜１２００、１２０１〜１２５１、１２５２
〜１３０２、１３０３〜１３５３、１３５４〜１３６２および１３６３〜配列番
号１の末端までの配列、もしくはこれらに対して相補的なＤＮＡ鎖、または寄託
されたプラスミド中に含まれるｃＤＮＡを含むか、あるいはそれらからなるフラ
グメントが挙げられる。この文脈において「約（おおよそ）」は、特に示される
範囲、いずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３
、２、または１個）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな範囲を含む。これ
らのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明によっ
て包含される。Representative examples of DR5 polynucleotide fragments of the present invention include, for example, approximately nucleotides 1-130, 130-180, 181-231,232
282, 283-333, 334-384, 385-435, 436-486
, 487-537, 538-588, 589-639, 640-681, 682
732, 733 to 753, 754 to 804, 805 to 855, 856 to 906
, 907-957, 958-1008, 1009-1059, 1060-109
8, 1099 to 1149, 1150 to 1200, 1201 to 1251, 1252
1 to 1302, 1303 to 1353, 1354 to 1362 and 1363 to the end of SEQ ID NO: 1, or the DNA strand complementary thereto, or the cDNA contained in the deposited plasmid, or Fragments. In this context, "about" refers to a region, particularly at the indicated range, at either or both termini, a few (5, 4, 3, 3).
, 2, or 1) nucleotides larger or smaller. The polypeptides encoded by these polynucleotides are also encompassed by the present invention.

【００３９】 本発明はさらに、ＤＲ５のドメインをコードする単離された核酸分子を含むか
、あるいはそれからなるポリヌクレオチドに関する。１つの局面では、本発明は
、表Ｉに示されるＤＲ５タンパク質のβシート領域をコードする核酸分子を含む
か、あるいはそれからなるポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレ
オチドの代表的な例としては、配列番号２において約−１６位〜約−２位のアミ
ノ酸残基、約２位〜約９位のアミノ酸残基、約６０位〜約６７位のアミノ酸残基
、約１３５位〜約１５１位のアミノ酸残基、約１９３位〜約１９９位のアミノ酸
残基、そして約３０２位〜約３１０位のアミノ酸残基からなる群から選択される
１個、２個、３個、４個、５個、またはそれより多くのアミノ酸配列を含むか、
あるいはそれらからなるポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられる。この
文脈において「約（おおよそ）」は、特に示される値、これより数個（５、４、
３、２、または１個）のアミノ酸残基だけ大きいかまたは小さな値を含む。これ
らのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明によっ
て包含される。[0039] The invention further relates to a polynucleotide comprising or consisting of an isolated nucleic acid molecule encoding a domain of DR5. In one aspect, the invention provides a polynucleotide comprising or consisting of a nucleic acid molecule encoding the β sheet region of the DR5 protein set forth in Table I. Representative examples of such polynucleotides include the amino acid residues at about position -16 to about -2, the amino acid residues at about position 2 to about 9 and the amino acid residues at about position 60 to about position 67 in SEQ ID NO: 2. One amino acid residue selected from the group consisting of about 135 to about 151 amino acid residues, about 193 to about 199 amino acid residues, and about 302 to about 310 amino acid residues. Comprising 2, 3, 4, 5, or more amino acid sequences;
Alternatively, a nucleic acid molecule encoding a polypeptide consisting thereof can be mentioned. In this context, "about" means a value specifically indicated, a few more (5, 4,
3, 2, or 1) amino acid residues. The polypeptides encoded by these polynucleotides are also encompassed by the present invention.

【００４０】 特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、ＤＲ５の機
能的活性を示すポリペプチドをコードする。ＤＲ５の「機能的活性」を示すポリ
ペプチドとは、完全（全長）ＤＲ５ポリペプチドまたは成熟ＤＲ５ポリペプチド
、ならびにＤＲ５の分泌形態に関連した１以上の既知の機能的活性を示し得るポ
リペプチドを意味する。このような機能的活性としては、以下が挙げられるが、
これらに限定されない：生物学的活性（例えば、ポリペプチドを発現する細胞に
おいてアポトーシスを誘導する能力（例えば、実施例５を参照のこと））；抗原
性（抗ＤＲ５抗体に結合する（すなわち、結合について、ＤＲ５ポリペプチドと
競合する）能力）、免疫原性（ＤＲ５ポリペプチドに結合する抗体を産生する能
力）、マルチマーを形成する能力、およびＤＲ５ポリペプチドについてのレセプ
ターまたはリガンドに結合する能力（例えば、ＴＲＡＩＬ；Ｗｉｌｅｙら、Ｉｍ
ｍｕｎｉｔｙ ３、６７３−６８２（１９９５））。In certain embodiments, polynucleotide fragments of the present invention encode polypeptides that exhibit a DR5 functional activity. By a polypeptide exhibiting a “functional activity” of DR5 is meant a complete (full-length) or mature DR5 polypeptide, as well as a polypeptide capable of exhibiting one or more known functional activities associated with the secreted form of DR5. I do. Such functional activities include the following,
Without limitation: biological activity (eg, the ability to induce apoptosis in cells expressing the polypeptide (eg, see Example 5)); antigenicity (eg, binding to anti-DR5 antibody (ie, binding The ability to compete with a DR5 polypeptide), the immunogenicity (the ability to produce antibodies that bind to a DR5 polypeptide), the ability to form multimers, and the ability to bind to a receptor or ligand for a DR5 polypeptide (eg, TRAIL; Wiley et al., Im.
munity 3, 673-682 (1995)).

【００４１】 ＤＲ５ポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、改変体、誘導体、およ
びアナログの機能的活性を、種々の方法によってアッセイし得る。The functional activity of DR5 polypeptides, and fragments, variants, derivatives, and analogs thereof, can be assayed by various methods.

【００４２】 例えば、抗ＤＲ５抗体に結合するか、または抗ＤＲ５抗体への結合について全
長（完全）ＤＲ５ポリペプチドと競合する能力についてアッセイする、１つの実
施形態では、当該分野で公知の種々のイムノアッセイが使用され得る。このよう
なアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソル
ベント検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックア
ッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（
例えば、金コロイド、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロ
ット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ
）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫
電気泳動アッセイなどのような技術を用いる競合的および非競合的アッセイ系が
挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、抗体結合は、一次
抗体の標識を検出することによって検出される。別の実施形態では、一次抗体は
、この一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出
される。さらなる実施形態では、二次抗体が標識される。多くの手段が、イムノ
アッセイにおける結合の検出について当該分野で公知であり、そして本発明の範
囲内にある。For example, in one embodiment, various immunoassays known in the art are assayed for the ability to bind to an anti-DR5 antibody or compete with a full-length (complete) DR5 polypeptide for binding to an anti-DR5 antibody. Can be used. Such assays include radioimmunoassays, ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assays), "sandwich" immunoassays, immunoradiometric assays, gel diffusion sedimentation reactions, immunodiffusion assays, in situ immunoassays (
(Eg, using colloidal gold, enzyme or radioisotope labels), Western blots, sedimentation reactions, agglutination assays (eg, gel agglutination assays, hemagglutination assays), complement binding assays, immunofluorescence assays, protein A assays, and immunological Includes, but is not limited to, competitive and non-competitive assay systems using techniques such as electrophoresis assays. In one embodiment, antibody binding is detected by detecting a label on the primary antibody. In another embodiment, the primary antibody is detected by detecting binding of a secondary antibody or reagent to the primary antibody. In a further embodiment, the secondary antibody is labeled. Many means are known in the art for detecting binding in immunoassays and are within the scope of the invention.

【００４３】 ＤＲ５リガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）を同定するか、または本発明のポリペ
プチドフラグメント、改変体、もしくは誘導体が多量体化する能力を評価する別
の実施形態において、結合は、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィ
ー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニティーブ
ロッティングのような当該分野で周知の手段によってアッセイされ得る。一般に
は、Ｐｈｉｚｉｃｋｙら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（
１９９５）を参照のこと。別の実施形態では、その基質へのＤＲ５結合の生理学
的相関（シグナル伝達）をアッセイし得る。In another embodiment of identifying a DR5 ligand (eg, TRAIL) or assessing the ability of a polypeptide fragment, variant, or derivative of the invention to multimerize, the binding may be, for example, reduction and It can be assayed by means well known in the art, such as non-reducing gel chromatography, protein affinity chromatography, and affinity blotting. Generally, see Phizicky et al., Microbiol. Rev .. 59: 94-123 (
1995). In another embodiment, the physiological correlation (signaling) of DR5 binding to its substrate may be assayed.

【００４４】 さらに、本明細書中に記載されるアッセイ（実施例５および６を参照のこと）
さもなくば当該分野で公知のアッセイが、ＤＲ５ポリペプチドおよびそのフラグ
メント、改変体、誘導体、およびアナログが、ＤＲ５に関連した生物学的活性を
誘発する能力（例えば、このポリペプチドを発現する細胞においてアポトーシス
を誘導する能力（例えば、実施例５を参照のこと）、およびインビトロまたはイ
ンビボにおいて、リガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）に結合する能力（例えば、実
施例６を参照のこと））を測定するために慣用的に適用され得る。例えば、生物
学的活性は、本質的に、以前に記載されたように（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｃ
ｅｌｌ ８１：５０５−５１２（１９９５）；Ｂｏｌｄｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７０：７７９５−８（１９９５）；Ｋｉｓｃｈｋｅｌら、ＥＭＢＯ
１４：５５７９−５５８８（１９９５）；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４９６１−４９６５（１９９６））、そして以下の実
施例５において示されたように実施される細胞死アッセイを使用して、慣用的に
測定され得る。ＭＣＦ７細胞の関与する１つの実施形態では、全長ＤＲ５または
レセプターを含む候補細胞死ドメインをコードするプラスミドを、グリーン蛍光
タンパク質をコードするｐＬａｎｔｅｒｎレセプター構築物と共に同時トランス
フェクトする。ＤＲ５をトランスフェクトされた細胞の核は、ＤＡＰＩ染色によ
って評価される場合に、アポトーシス形態を示す。In addition, the assays described herein (see Examples 5 and 6)
Alternatively, assays known in the art may determine the ability of a DR5 polypeptide and fragments, variants, derivatives, and analogs thereof, to elicit the biological activity associated with DR5 (eg, in cells that express the polypeptide). To determine the ability to induce apoptosis (see, eg, Example 5) and to bind a ligand (eg, TRAIL) in vitro or in vivo (eg, see Example 6) It can be applied conventionally. For example, biological activity can be determined essentially as previously described (Chinnaiyan et al., C
ell 81: 505-512 (1995); Boldin et al. Biol.
Chem. 270: 7795-8 (1995); Kischkel et al., EMBO.
14: 5579-5588 (1995); Chinnaiyan et al. Bi
ol. Chem. 271: 4961-4965 (1996)), and can be routinely measured using a cell death assay performed as set forth in Example 5 below. In one embodiment involving MCF7 cells, a plasmid encoding a full-length DR5 or candidate cell death domain comprising the receptor is co-transfected with a pLantern receptor construct encoding a green fluorescent protein. The nuclei of cells transfected with DR5 show apoptotic morphology as assessed by DAPI staining.

【００４５】 他の方法は、当業者に公知であり、そして本発明の範囲内である。Other methods are known to those skilled in the art and are within the scope of the present invention.

【００４６】 本発明の好ましい核酸フラグメントとしては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：ＤＲ５細胞外ドメイン（図１のアミノ酸残基約５２〜約１８４（
配列番号２のアミノ酸残基約１〜約１３３））を含むか、あるいはそれからなる
ポリペプチド；ＤＲ５膜貫通ドメイン（図１のアミノ酸残基約１８５〜約２０８
（配列番号２のアミノ酸残基約１３４〜約１５７））を含むか、あるいはそれか
らなるポリペプチド；ＤＲ５のシステインリッチドメイン（図１のアミノ酸残基
約８４〜約１７９（配列番号２の約３３〜約１２８））を含むか、あるいはそれ
からなるポリペプチド；ＤＲ５細胞内ドメイン（図１のアミノ酸残基約２０９〜
約４１１（配列番号２のアミノ酸残基約１５８〜約３６０））を含むか、あるい
はそれからなるポリペプチド；推定成熟ＤＲ５ポリペプチドのフラグメント（こ
こで、このフラグメントは、ＤＲ５の機能的活性（例えば、抗原性活性または生
物学的活性）を有する）を含むか、あるいはそれからなるポリペプチド；膜貫通
ドメインのすべてまたは一部分が欠失した、ＤＲ５レセプターの細胞外ドメイン
および細胞内ドメインを含むか、あるいはそれからなるポリペプチド；ＤＲ５死
ドメイン（図１のアミノ酸残基約３２４〜約３９１（配列番号２の約２７３〜約
３４０））を含むか、あるいはそれからなるポリペプチド；ならびに、ＤＲ５レ
セプタータンパク質の１個、２個、３個、４個、またはそれより多くのエピトー
プ保有部分を含むか、あるいはそれからなるポリペプチド。さらなる実施形態で
は、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、１個、２個、３個、４個、５個
、６個、７個、または８個すべての上記メンバーの任意の組合せを含むか、ある
いはそれらからなるポリペプチドをコードする。これらのドメインの位置は、コ
ンピューターグラフィックスによって推定されたので、当業者は、これらのドメ
インを構成するアミノ酸残基が、各ドメインを規定するために使用された判断基
準に依存して、わずかに（例えば、約１〜１５残基程度）変動し得ることを理解
する。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明によ
って包含される。Preferred nucleic acid fragments of the present invention include, but are not limited to, the DR5 extracellular domain (amino acid residues from about 52 to about 184 (FIG. 1).
A polypeptide comprising or consisting of amino acid residues from about 1 to about 133 of SEQ ID NO: 2); a DR5 transmembrane domain (amino acid residues from about 185 to about 208 of FIG. 1).
A polypeptide comprising or consisting of (amino acid residues about 134 to about 157 of SEQ ID NO: 2); a cysteine-rich domain of DR5 (amino acid residues of about 84 to about 179 of FIG. 1 (about 33 to about 179 of SEQ ID NO: 2). A polypeptide comprising or consisting of about 128)); the DR5 intracellular domain (amino acid residues about 209 to 209 of FIG. 1).
A polypeptide comprising or consisting of about 411 (amino acid residues about 158 to about 360 of SEQ ID NO: 2); a fragment of a putative mature DR5 polypeptide, wherein the fragment has a functional activity of DR5 (eg, Or a polypeptide having or comprising an antigenic or biological activity) comprising or consisting of the extracellular and intracellular domains of the DR5 receptor, wherein all or part of the transmembrane domain has been deleted. A polypeptide comprising or consisting of a DR5 death domain (amino acid residues about 324 to about 391 of FIG. 1 (about 273 to about 340 of SEQ ID NO: 2)); and one of the DR5 receptor proteins; Contains two, three, four or more epitope-bearing moieties Or even from consisting of the polypeptide. In a further embodiment, the polynucleotide fragment of the invention comprises any combination of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 all of the above members, or It encodes a polypeptide consisting of them. Since the locations of these domains were estimated by computer graphics, those skilled in the art will recognize that the amino acid residues making up these domains may vary slightly, depending on the criteria used to define each domain. It is understood that (for example, about 1 to 15 residues) may be varied. The polypeptides encoded by these nucleic acid molecules are also encompassed by the present invention.

【００４７】 図１に開示されるＤＲ５の細胞外システインリッチモチーフの１つまたは両方
が、ＤＲ５とそのリガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）との間の相互作用に重要であ
ると考えられる。従って、本発明の特定の実施形態は、図１に示されるＤＲ５配
列のアミノ酸残基８４〜１３１、および／またはアミノ酸残基１３２〜１７９（
配列番号２のアミノ酸残基３３〜８０、および／またはアミノ酸残基８１〜１２
８）からなる群から選択される、１つまたは両方のアミノ酸配列を含むか、ある
いはそれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。特定
の実施形態では、本発明のＤＲ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは
、図１に開示される細胞外システインリッチモチーフの両方を含むか、あるいは
それからなる。One or both of the extracellular cysteine-rich motifs of DR5 disclosed in FIG. 1 are believed to be important for the interaction between DR5 and its ligand (eg, TRAIL). Accordingly, certain embodiments of the present invention are directed to amino acid residues 84-131 and / or amino acid residues 132-179 of the DR5 sequence shown in FIG.
Amino acid residues 33-80 and / or amino acid residues 81-12 of SEQ ID NO: 2
8) a polynucleotide encoding a polypeptide comprising or consisting of one or both amino acid sequences selected from the group consisting of: In certain embodiments, a polynucleotide encoding a DR5 polypeptide of the invention comprises or consists of both of the extracellular cysteine-rich motifs disclosed in FIG.

【００４８】 特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、上記のシステインリッチ
ドメインをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、８５
％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であ
るポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからなる。本発明はまた、異
種ポリヌクレオチド配列に融合された上記ポリヌクレオチド配列を包含する。こ
れらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明によ
って包含される。参照ポリヌクレオチド配列に対するポリヌクレオチド配列のパ
ーセント同一性を測定するための方法は、以下に記載される。In certain embodiments, the polynucleotides of the present invention comprise at least 80%, 85%, of a polynucleotide sequence encoding a cysteine rich domain as described above.
Comprise or consist of polynucleotide sequences that are%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical. The invention also includes the above polynucleotide sequences fused to a heterologous polynucleotide sequence. The polypeptides encoded by these polynucleotides are also encompassed by the present invention. Methods for determining the percent identity of a polynucleotide sequence to a reference polynucleotide sequence are described below.

【００４９】 別の実施形態では、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記のポリヌクレオチドをコードするシステインリッチドメインに相補
的な核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれらから
なる、単離された核酸分子を提供する。本明細書中で使用される場合、句「スト
リンジェントな条件」の意味は、以下に説明される。このようなポリヌクレオチ
ドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって包含される。In another embodiment, the present invention comprises or comprises a polynucleotide that hybridizes under stringent hybridization conditions to a nucleic acid that is complementary to a cysteine-rich domain encoding the polynucleotide described above. The present invention provides an isolated nucleic acid molecule. As used herein, the meaning of the phrase "stringent conditions" is described below. Polypeptides encoded by such polynucleotides are also encompassed by the present invention.

【００５０】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、アミノ末端メチオニンをコードするヌ
クレオチドを欠く全長ＤＲ５ポリペプチド（配列番号１のヌクレオチド１３０〜
１３２）をコードする。なぜなら、メチオニンは天然で切断されることが公知で
あり、そしてこのような配列は、ＤＲ５発現ベクターを遺伝子操作するにおいて
おそらく有用であるからである。このようなポリヌクレオチドによってコードさ
れるポリペプチドもまた、本発明によって意図される。A preferred nucleic acid fragment of the present invention is a full-length DR5 polypeptide lacking the nucleotide encoding the amino-terminal methionine (nucleotides 130 to 130 of SEQ ID NO: 1).
132). Because methionine is known to be cleaved in nature, and such sequences are probably useful in engineering DR5 expression vectors. Polypeptides encoded by such polynucleotides are also contemplated by the present invention.

【００５１】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＲ５の機能的特
性をコードする。この点に関して、本発明の好ましい実施形態は、１、２、３、
４、またはそれより多くの以下の機能ドメインを含むか、あるいはそれらからな
るフラグメントを含む：ＤＲ５のα−へリックスおよびα−へリックス形成領域
（「α−領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「β−領域」）、タ
ーンおよびターン形成領域（「ターン−領域」）、コイルおよびコイル形成領域
（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性
領域、可撓性領域、表面形成領域および高抗原性指標領域。In a further embodiment, a polynucleotide of the invention encodes a functional property of DR5. In this regard, preferred embodiments of the present invention are 1, 2, 3,
Includes fragments comprising or consisting of four or more of the following functional domains: DR5 α-helix and α-helix forming region (“α-region”), β-sheet and β-helix. Sheet-forming region (“β-region”), turn and turn-forming region (“turn-region”), coil and coil-forming region (“coil-region”), hydrophilic region, hydrophobic region, α-amphiphilic region , Β amphipathic region, flexible region, surface forming region and high antigenic index region.

【００５２】 上記のように、図３および／または表Ｉに示されるＤＲ５の構造的特性もしく
は機能的特性を表わすデータを、デフォルトパラメータに設定したＤＮＡ*ＳＴ
ＡＲの種々の同定されたモジュールおよびアルゴリズムを使用して作成した。好
ましい実施形態において、表Ｉの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶに
示されるデータを使用して、抗原性について高い程度の可能性を示すＤＲ５の領
域を決定し得る。高抗原性の領域は、抗原認識が免疫応答の開始のプロセスにお
いて生じ得る環境で、ポリペプチドの表面に露出される可能性が高いポリペプチ
ドの領域を示す値を選択することによって、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およ
び／またはＸＩＶに示されるデータから決定される。[0052] As described above, the data representing the structural properties or functional properties of DR5 as shown in Figure 3 and / or Table I, set to the default parameters the DNA * ST
The AR was generated using various identified modules and algorithms. In a preferred embodiment, the data shown in Table I, columns VIII, IX, XIII, and XIV can be used to determine regions of DR5 that exhibit a high degree of potential for antigenicity. Regions of high antigenicity are selected by selecting a value that indicates the region of the polypeptide that is likely to be exposed on the surface of the polypeptide, in an environment where antigen recognition can occur in the process of initiating an immune response, column VIII, Determined from the data shown in IX, XIII, and / or XIV.

【００５３】 これらに関して特定の好ましい領域を図３に示すが、これは、表Ｉに示される
ように、図３に示されるデータの表計算表示を使用することによって、提示また
は同定されてもよい。図３を作成するために使用されたＤＮＡ*ＳＴＡＲコンピ
ュータアルゴリズム（最初のデフォルトパラメータに設定された）を使用して、
表計算形式（表Ｉを参照のこと）で図３のデータを示した。図３におけるデータ
の表計算形式を使用して、好ましい領域の特定の境界を容易に決定し得る。Certain preferred regions for these are shown in FIG. 3, which may be presented or identified by using a spreadsheet representation of the data shown in FIG. 3, as shown in Table I. . Using the DNA * STAR computer algorithm (set to the initial default parameters) used to generate FIG.
The data of FIG. 3 is shown in a spreadsheet format (see Table I). Using the spreadsheet format of the data in FIG. 3, the specific boundaries of the preferred region can be easily determined.

【００５４】 図３および表Ｉに示される上記の好ましい領域は、配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列の分析によって同定される上述の型の領域を含むが、これらに限定され
ない。図３および表Ｉに示されるように、そのような好ましい領域としては、Ｇ
ａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ α−領域、β−領域、ターン−領域、およびコイ
ル−領域（表Ｉにおける欄Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、およびＶＩＩ）、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓ
ｍａｎ α−領域、β−領域、およびターン−領域（表Ｉにおける欄ＩＩ、ＩＶ
、およびＶＩ）、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域（表Ｉの欄ＶＩＩＩ
）、Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ疎水性領域（表Ｉの欄ＩＸ）、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ
α−両親媒性領域およびＥｉｓｅｎｂｅｒｇ β−両親媒性領域（表Ｉにおける
欄ＸおよびＸＩ）、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域（表Ｉの欄ＸＩＩ
）、高抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域（表Ｉの欄ＸＩＩＩ）、およ
びＥｍｉｎｉ表面形成領域（表Ｉの欄ＸＩＶ）が挙げられる。The above preferred regions shown in FIG. 3 and Table I include, but are not limited to, regions of the above type identified by analysis of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. As shown in FIG. 3 and Table I, such preferred regions include G
arrier-Robson α-region, β-region, turn-region, and coil-region (columns I, III, V, and VII in Table I), Chou-Fas
man α-region, β-region, and turn-region (columns II, IV in Table I)
, And VI), Kyte-Doolittle hydrophilic region (column VIII of Table I)
), Hopp-Woods hydrophobic region (column IX of Table I), Eisenberg
α-amphiphilic and Eisenberg β-amphiphilic regions (columns X and XI in Table I), Karplus-Schulz flexible region (column XII in Table I)
), The Jameson-Wolf region of high antigenicity index (column XIII in Table I), and the Emini surface-forming region (column XIV in Table I).

【００５５】[0055]

【表１】 この点において非常に好ましいフラグメントは、いくつかの構造的特徴（例え
ば、上記のいくつかの特徴）を組合せるＤＲ５の領域を含むか、またあるいはこ
れらからなるフラグメントである。本発明の好ましい核酸フラグメントとしては
また、ＤＲ５タンパク質の１個、２個、３個、４個、５個、またはそれより多く
のエピトープ保有部分を含むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチドをコー
ドする核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本発明のそのよ
うな核酸フラグメントとしては、以下のポリぺプチドをコードする核酸分子が挙
げられる：以下からなる群から選択される１、２、３またはそれより多くのアミ
ノ酸配列を含むか、またあるいはそれらからなるポリぺプチド：図１のおよそ６
２〜およそ１１０のアミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸残基およそ１１〜およ
そ５９）；図１のアミノ酸残基およそ１１９〜およそ１６４（配列番号２のアミ
ノ酸残基およそ６８〜およそ１１３）を含むか、あるいはそれらからなる、ポリ
ペプチド；図１のアミノ酸残基およそ２２４〜およそ２７１（配列番号２のアミ
ノ酸残基およそ１７３〜およそ２２０）を含むか、あるいはそれらからなる、ポ
リペプチド；および図１のアミノ酸残基およそ２７５〜３７０（配列番号２のア
ミノ酸残基およそ２２４〜およそ３１９）を含むか、あるいはそれらからなる、
ポリペプチド。本発明者らは、上記ポリペプチドフラグメントが、ＤＲ５タンパ
ク質の抗原領域であることを決定した。ＤＲ５のタンパク質のそのようなエピト
ープ保有部分を決定するための方法が、以下に詳細に記載される。この文脈にお
いて、「およそ（約）」とは、特に列挙されたいくつか（５、４、３、２または
１）のアミノ酸残基だけ大きいかまたは小さい値（単数または複数）を意味する
。これらの核酸にコードされるポリぺプチドもまた、本発明に含まれる。[Table 1] Highly preferred fragments in this regard are those that comprise or consist of a region of DR5 that combines several structural features (eg, some of the features described above). Preferred nucleic acid fragments of the present invention also encode polypeptides comprising or consisting of one, two, three, four, five, or more epitope-bearing portions of the DR5 protein. Nucleic acid molecules, but are not limited thereto. In particular, such nucleic acid fragments of the present invention include nucleic acid molecules encoding the following polypeptides: Do they contain one, two, three or more amino acid sequences selected from the group consisting of: , Or alternatively, a polypeptide consisting thereof: about 6 in FIG.
2 to about 110 amino acid residues (about 11 to about 59 amino acid residues of SEQ ID NO: 2); including about 119 to about 164 amino acid residues of FIG. A polypeptide comprising or consisting of about 224 to about 271 amino acid residues of FIG. 1 (about 173 to about 220 amino acid residues of SEQ ID NO: 2); and FIG. Comprises or consists of about 275 to 370 amino acid residues (about 224 to about 319 of SEQ ID NO: 2) of
Polypeptide. The present inventors have determined that the polypeptide fragment is an antigenic region of the DR5 protein. Methods for determining such epitope-bearing portions of the DR5 protein are described in detail below. In this context, “about” means a value or values that are larger or smaller by some (5, 4, 3, 2, 2 or 1) amino acid residues specifically listed. The polypeptides encoded by these nucleic acids are also included in the present invention.

【００５６】 さらに、本発明は、配列番号１の残基２８３〜１，３６２、好ましくは２８３
〜６８１のうち、少なくとも約３０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０
ヌクレオチドの任意の部分を含むか、またはこれらからなるポリぺプチドを含む
。これらのポリヌクレオチドにコードされるポリぺプチドもまた本発明に含まれ
る。Further, the present invention relates to the present invention, wherein the residues 283 to 1,362 of SEQ ID NO: 1, preferably 283
~ 681, at least about 30 nucleotides, preferably at least about 50 nucleotides.
And polypeptides comprising or consisting of any portion of the nucleotides. The polypeptides encoded by these polynucleotides are also included in the present invention.

【００５７】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１０００００ｋｂ長
未満、５００００ｋｂ長未満、１００００ｋｂ長未満、１０００ｋｂ長未満、５
００ｋｂ長未満、４００ｋｂ長未満、３５０ｋｂ長未満、３００ｋｂ長未満、２
５０ｋｂ長未満、２００ｋｂ長未満、１７５ｋｂ長未満、１５０ｋｂ長未満、１
２５ｋｂ長未満、１００ｋｂ長未満、７５ｋｂ長未満、５０ｋｂ長未満、４０ｋ
ｂ長未満、３０ｋｂ長未満、２５ｋｂ長未満、２０ｋｂ長未満、１５ｋｂ長未満
、１０ｋｂ長未満、７．５ｋｂ長未満、または５ｋｂ長未満である。In certain embodiments, the polynucleotide of the invention has a length of less than 100,000 kb, less than 50,000 kb, less than 10,000 kb, less than 1000 kb, 5 or less.
Less than 00 kb length, less than 400 kb length, less than 350 kb length, less than 300 kb length, 2
Less than 50 kb length, less than 200 kb length, less than 175 kb length, less than 150 kb length, 1
Less than 25 kb, less than 100 kb, less than 75 kb, less than 50 kb, 40 k
Less than b length, less than 30 kb length, less than 25 kb length, less than 20 kb length, less than 15 kb length, less than 10 kb length, less than 7.5 kb length, or less than 5 kb length.

【００５８】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＲ５コード配列
の少なくとも１５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００
個、または少なくとも２５０個、少なくとも５００個、または少なくとも１００
０個連続するヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなるが、図１（配列番
号１）に示される５’コードヌクレオチドまたは３’コードヌクレオチドに隣接
するゲノムＤＮＡのうちの１０００ｋｂ以下、５００ｋｂ以下、２５０ｋｂ以下
、２００ｋｂ以下、１５０ｋｂ以下、１００ｋｂ以下、７５ｋｂ以下、５０ｋｂ
以下、３０ｋｂ以下、２５ｋｂ以下、２０ｋｂ以下、１５ｋｂ以下、１０ｋｂ以
下、または５ｋｂ以下からなる。さらなる実施形態において、本発明のポリヌク
レオチドは、ＤＲ５コード配列の少なくとも１５個、少なくとも３０個、少なく
とも５０個、少なくとも１００個、または少なくとも２５０個、少なくとも５０
０個、または少なくとも１０００個連続するヌクレオチドを含むか、あるいはそ
れらからなるが、いかなるＤＲ５イントロンの全てまたは一部も含まないか、ま
たはそれらからならない。別の実施形態において、ＤＲ５コード配列を含むか、
あるいはそれらからなる、核酸は、ゲノム隣接遺伝子（すなわち、ゲノムにおけ
るＤＲ５遺伝子に対して５’側または３’側）のコード配列を含まない。別の実
施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１０００個より多く、５００個
より多く、２５０個より多く、１００個より多く、５０個より多く、２５個より
多く、２０個より多く、１５個より多く、１０個より多く、５個より多く、４個
より多く、３個より多く、２個より多く、または１個より多くのゲノム隣接遺伝
子のコード配列を含まない。In a further embodiment, the polynucleotide of the present invention comprises at least 15, at least 30, at least 50, at least 100 of the DR5 coding sequence.
, Or at least 250, at least 500, or at least 100
It contains or consists of 0 consecutive nucleotides, but 1000 kb or less, 500 kb or less, or 250 kb or less of the genomic DNA adjacent to the 5 ′ coding nucleotide or 3 ′ coding nucleotide shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). , 200 kb or less, 150 kb or less, 100 kb or less, 75 kb or less, 50 kb
Hereinafter, it is 30 kb or less, 25 kb or less, 20 kb or less, 15 kb or less, 10 kb or less, or 5 kb or less. In further embodiments, the polynucleotide of the invention comprises at least 15, at least 30, at least 50, at least 100, or at least 250, at least 50, of the DR5 coding sequence.
It contains or consists of zero, or at least 1000 contiguous nucleotides, but does not contain or consist of all or part of any DR5 intron. In another embodiment, comprising a DR5 coding sequence,
Alternatively, the nucleic acid consisting thereof does not include the coding sequence of a genomic flanking gene (ie, 5 'or 3' to the DR5 gene in the genome). In another embodiment, the polynucleotide of the invention has more than 1000, more than 500, more than 250, more than 100, more than 50, more than 25, more than 20, 15 Not more than 10, more than 5, more than 4, more than 3, more than 2, or not more than one genomic flanking gene coding sequence.

【００５９】 別の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるように、本発明の
核酸分子におけるポリヌクレオチドの一部に、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むか、ある
いはそれらからなる、単離された核酸分子、例えば、配列番号１に示されるコー
ド配列および／または非コード配列（すなわち転写された配列、転写されていな
い配列）と相補的な配列、ＡＴＣＣ登録番号９７９２０に含まれるｃＤＮＡなら
びにＤＲ５ドメインをコードする配列またはポリヌクレオチドフラグメントを提
供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％ホルム
アミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸三ナトリウム
）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％
デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ***ＤＮＡを含むか、あ
るいはそれらからなる溶液中で４２℃にて一晩インキュベーションし、続いて約
６５℃において０．１×ＳＳＣでそのフィルターを洗浄することが意図される。
これらのポリヌクレオチドにコードされるポリぺプチドもまた、本発明に含まれ
る。In another embodiment, the invention provides a polynucleotide that hybridizes under stringent hybridization conditions to a portion of the polynucleotide in a nucleic acid molecule of the invention, as described herein. An isolated nucleic acid molecule comprising or consisting of, for example, a sequence complementary to a coding and / or non-coding sequence shown in SEQ ID NO: 1 (ie, a transcribed sequence, a non-transcribed sequence). , ATCC Accession No. 97920, as well as sequences or polynucleotide fragments encoding the DR5 domain. The “stringent hybridization conditions” are 50% formamide, 5 × SSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 × Denhardt solution, 10%
Incubating overnight at 42 ° C. in a solution containing or consisting of dextran sulfate and 20 μg / ml denatured sheared salmon sperm DNA, followed by washing the filter with 0.1 × SSC at about 65 ° C. Is intended.
The polypeptides encoded by these polynucleotides are also included in the present invention.

【００６０】 ポリヌクレオチドの「部分（一部）」とハイブリダイズするポリヌクレオチド
とは、少なくとも参照ポリヌクレオチドの約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、および
より好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０
ｎｔ、およびさらにより好ましくは約３０〜７０ｎｔ、または８０〜１５０ｎｔ
、あるいは全長とハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡの
いずれか）が意図される。「少なくとも約２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの一
部とは、例えば、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託され
たｃＤＮＡまたは配列番号１に示されるヌクレオチド配列）由来の２０個以上連
続するヌクレオチドを意図する。この文脈において、「およそ（約）」とは、特
に列挙されたサイズ（いずれかの末端または両方の末端において、いくつか（５
、４、３、２または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さいサイズ）を含
む。これらは、上記および以下に詳細に議論されるような診断プローブおよびプ
ライマーとしての使用が挙げられるが、これらに限定されない。A polynucleotide that hybridizes to a “portion” of a polynucleotide is at least about 15 nucleotides (nt) of the reference polynucleotide, and more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least about 30 nt.
nt, and even more preferably about 30-70 nt, or 80-150 nt
Alternatively, polynucleotides (either DNA or RNA) that hybridize to the full length are contemplated. A portion of a polynucleotide "at least about 20 nt in length" is intended to mean, for example, 20 or more consecutive nucleotides derived from the nucleotide sequence of a reference polynucleotide (eg, the deposited cDNA or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1). I do. In this context, "approximately" refers to a particular recited size (at either or both ends, some (5)
, 4, 3, 2 or 1) nucleotides larger or smaller). These include, but are not limited to, use as diagnostic probes and primers as discussed in detail above and below.

【００６１】 もちろん、ポリＡ配列（例えば、図１（配列番号１）に示されるＤＲ５ｃＤＮ
Ａの３’末端ポリ（Ａ）トラクト（ｔｒａｃｔ））、あるいはＴ（またはＵ）残
基の相補ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核
酸の一部とハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドに
含まれない。なぜなら、そのようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチ
またはその相補体（例えば、特に、オリゴｄＴでプライムされたｃＤＮＡライブ
ラリーから生成された任意の二本鎖ｃＤＮＡ）を含む任意の核酸分子とハイブリ
ダイズするためである。Of course, the polyA sequence (eg, the DR5cDN shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)
Polynucleotides that hybridize only to the 3'-terminal poly (A) tract (A) or the complementary stretch of T (or U) residues are used to hybridize to a portion of the nucleic acids of the invention. Not included in the polynucleotide of the present invention. Such a polynucleotide may be associated with any nucleic acid molecule comprising a poly (A) stretch or its complement (eg, in particular, any double-stranded cDNA generated from a cDNA library primed with oligo dT). This is for hybridization.

【００６２】 示されるように、ＤＲ５ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子としては
、以下が挙げられるが、これらに限定されない：成熟ポリヌクレオチドのアミノ
酸配列を単独でコードする配列；成熟ポリペプチドおよびさらなる配列のコード
配列（例えば、アミノ酸リーダー配列または分泌配列（例えば、プレタンパク質
配列、もしくはプロタンパク質配列もしくはプレプロタンパク質配列）をコード
する配列）；さらなる非コード配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（ス
プライシング、およびポリアデニル化シグナルを含む）において役割（例えば、
リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）を果たす転写された非翻訳配列のよう
なイントロンおよび非コード５’および３’配列が挙げられるが、これらに限定
されない）と共に、上述のさらなるコード配列を含むか、または含まない成熟ポ
リペプチドのコード配列；さらなるアミノ酸（例えば、さらなる機能性を提供す
るアミノ酸）をコードするさらなるコード配列。従って、例えばポリペプチドは
、マーカー配列（例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するペプチドをコード
する配列）と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施形態におい
て、マーカー配列は、ヘキサヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑ
ｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、中でも、これらの多
くは市販されている。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、例えば、ヘキ
サ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、
インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する、精製
のための有用な別のペプチドであり、これは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７
：７６７−７７８（１９８４）によって記載されている。以下に議論されるよう
に、他のそのような融合タンパク質としては、Ｎ末端またはＣ末端でＦｃと融合
されたＤＲ５レセプターが挙げられる。As indicated, nucleic acid molecules of the invention that encode a DR5 polypeptide include, but are not limited to: a sequence that alone encodes the amino acid sequence of a mature polynucleotide; A coding sequence for the additional sequence (eg, a sequence encoding an amino acid leader sequence or a secretory sequence (eg, a preprotein sequence, or a proprotein or preproprotein sequence)); And includes a polyadenylation signal) (eg,
Ribosome binding and mRNA stability), including but not limited to introns and non-coding 5 'and 3' sequences, such as transcribed non-translated sequences). Or a coding sequence for a mature polypeptide that does not include; an additional coding sequence that encodes an additional amino acid (eg, an amino acid that provides additional functionality). Thus, for example, a polypeptide can be fused to a marker sequence, such as a sequence encoding a peptide that facilitates purification of the fusion polypeptide. In certain preferred embodiments of this aspect of the invention, the marker sequence is a hexahistidine peptide (eg, a pQE vector (Q
iagen, Inc. )), Among which many are commercially available. Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86: 821-824 (1989), for example, hexa-histidine provides for convenient purification of the fusion protein. The “HA” tag
Another peptide useful for purification, corresponding to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein, is described in Wilson et al., Cell 37.
: 767-778 (1984). As discussed below, other such fusion proteins include the DR5 receptor fused to Fc at the N-terminus or C-terminus.

【００６３】 本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関し、その改変体は、ＤＲ５レ
セプターの部分、アナログまたは誘導体をコードする。改変体は、例えば、天然
の対立遺伝子改変体として天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」によって、
生物体の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の中の
一つが意図される。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない改変体は、
当該分野で公知の変異誘発技術を使用して作製され得る。The present invention further relates to variants of the nucleic acid molecules of the invention, which variants encode a part, analog or derivative of the DR5 receptor. Variants can occur naturally, for example, as natural allelic variants. By "allelic variants"
One of several alternative forms of the gene occupying a given locus on the chromosome of the organism is contemplated. Genes II, Lewin, B .; Hen, John Wil
ey & Sons, New York (1985). Non-naturally occurring variants are
It can be made using mutagenesis techniques known in the art.

【００６４】 そのような改変体としては、ヌクレオチド置換、欠失または付加によって産生
される改変体が挙げられる。置換、欠失または付加は、一つ以上のヌクレオチド
を含み得る。これらの改変体は、コード領域、非コード領域または両方において
変更され得る。コード領域における変更は、保存的または非保存的アミノ酸置換
、欠失または付加を生じ得る。これらの中で特に好ましいのは、サイレントな置
換、付加および欠失であり、これらはＤＲ５レセプターまたはそれら部分の特性
ならびに機能的活性を変更しない。この点において特に好ましいのは、保存的置
換である。[0065] Such variants include those produced by nucleotide substitutions, deletions or additions. Substitutions, deletions or additions may involve one or more nucleotides. These variants can be altered in the coding region, non-coding region, or both. Changes in the coding region can result in conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions or additions. Especially preferred among these are silent substitutions, additions and deletions, which do not alter the properties and functional activity of the DR5 receptor or portions thereof. Particularly preferred in this regard are conservative substitutions.

【００６５】 本発明のさらなる実施形態は、以下：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む
か、あるいはそれらからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ
）アミノ末端メチオニンを欠く（配列番号２のアミノ酸配列を含むか、あるいは
それらからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２
において、およそ１位〜およそ３６０位アミノ酸配列を含むか、あるいはそれら
からなる、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ登録番
号９７９２０に含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含むか、
あるいはそれらからなる、ＤＲ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）ＡＴＣＣ登録番号９７９２０に含まれるｃＤＮＡによってコードされるア
ミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる成熟ＤＲ５ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列；（ｆ）配列番号２のおよそ１〜１３３位のアミノ酸配列
、またはＡＴＣＣ登録番号９７９２０に含まれるｃＤＮＡによりコードされるＤ
Ｒ５細胞外ドメインを含むか、あるいはそれらからなる、ＤＲ５細胞外ドメイン
をコードするヌクレオチド配列；（ｇ）配列番号２のおよそ３３〜およそ１２８
位のアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ登録番号９７９２０に含まれるｃＤＮＡによ
りコードされるＤＲ５システインリッチドメインを含むか、あるいはそれらから
なるＤＲ５システインリッチドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）配
列番号２のおよそ１３４〜およそ１５７位のアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ登録
番号９７９２０に含まれるｃＤＮＡによりコードされるＤＲ５膜貫通ドメインを
含むか、あるいはそれらからなるＤＲ５膜貫通ドメインをコードするヌクレオチ
ド配列；（ｉ）配列番号２のおよそ１５８〜およそ３６０位のアミノ酸配列、ま
たはＡＴＣＣ登録番号９７９２０に含まれるｃＤＮＡによりコードされるＤＲ５
細胞内ドメインを含むか、あるいはそれらからなるＤＲ５細胞内ドメインをコー
ドするヌクレオチド配列；（ｊ）全てまたは一部削除された膜貫通ドメインを有
するＤＲ５レセプター細胞外ドメインおよび細胞内ドメインをコードするヌクレ
オチド配列；（ｋ）配列番号２のおよそ２７３〜およそ３４０位のアミノ酸配列
、またはＡＴＣＣ登録番号９７９２０に含まれるｃＤＮＡによりコードされるＤ
Ｒ５デスドメインを含むか、あるいはそれらからなるＤＲ５デスドメインをコー
ドするヌクレオチド配列；（ｌ）ＤＲ５機能活性（例えば、抗原性活性または生
物学的活性）を有する（ｃ）のポリペプチドのフラグメントをコードするヌクレ
オチド配列；および（ｍ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（
ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、または（ｌ）におけるヌクレ
オチド配列のいずれかと相補的なヌクレオチド配列と、少なくとも８０％同一、
そしてより好ましくは、少なくとも８５％、９０％，９２％，９５％、９６％、
９７％、９８％または９９％同一である単離された核酸分子を含む。これらのポ
リヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって含ま
れる。[0065] Further embodiments of the invention include the following: (a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
) A nucleotide sequence encoding a polypeptide lacking the amino terminal methionine (comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2); (c) SEQ ID NO: 2
A nucleotide sequence encoding the polypeptide comprising or consisting of the amino acid sequence from about position 1 to about 360; or (d) comprising the amino acid sequence encoded by the cDNA contained in ATCC accession number 97920,
Or a nucleotide sequence encoding a DR5 polypeptide consisting thereof;
(E) a nucleotide sequence encoding a mature DR5 polypeptide comprising or consisting of the amino acid sequence encoded by the cDNA contained in ATCC Accession No. 97920; (f) an amino acid sequence at about positions 1-133 of SEQ ID NO: 2 Or Dc encoded by the cDNA contained in ATCC Accession No. 97920
A nucleotide sequence encoding the DR5 extracellular domain comprising or consisting of the R5 extracellular domain; (g) about 33 to about 128 of SEQ ID NO: 2
A nucleotide sequence encoding or comprising a DR5 cysteine-rich domain encoded by, or consisting of, a DR5 cysteine-rich domain encoded by the cDNA contained in ATCC Accession No. 97920; An amino acid sequence at about position 157, or a nucleotide sequence encoding a DR5 transmembrane domain encoded by or consisting of the cDNA contained in ATCC Accession No. 97920; DR5 encoded by the amino acid sequence of positions 158 to about 360, or the cDNA contained in ATCC Accession No. 97920
A nucleotide sequence encoding a DR5 intracellular domain comprising or consisting of an intracellular domain; (j) a nucleotide sequence encoding a DR5 receptor extracellular domain and an intracellular domain having all or partially deleted transmembrane domains. (K) the amino acid sequence from about position 273 to about 340 of SEQ ID NO: 2, or D encoded by the cDNA contained in ATCC Accession No. 97920;
A nucleotide sequence encoding a DR5 death domain comprising or consisting of an R5 death domain; (1) encoding a fragment of the polypeptide of (c) having DR5 functional activity (eg, antigenic or biological activity) And (m) the above (a), (b), (c), (d), (e), (
f) at least 80% identical to a nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences in (g), (h), (i), (j), (k), or (l);
And more preferably at least 85%, 90%, 92%, 95%, 96%,
Isolated nucleic acid molecules that are 97%, 98% or 99% identical. The polypeptides encoded by these polynucleotides are also included by the present invention.

【００６６】 ＤＲ５ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくと
も９５％「同一」なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そのポリ
ヌクレオチド配列が、ＤＲ５をコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌク
レオチドあたり５つまでのミスマッチを含み得ることを除いて、そのポリヌクレ
オチドのヌクレオチド配列が、参照配列に対して同一であることを意図する。換
言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを得るために、その参照配列のヌクレオチドの５
％までが、欠失され得るかまたは別のヌクレオチドで置換され得、あるいは、そ
の参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが、その参照配列
に挿入され得る。本明細書に記載されるように、参照（照会（ｑｕｅｒｙ））配
列は、図１（配列番号１）または任意のポリヌクレオチドフラグメント（例えば
、本明細書に記載されるようなＤＲ５のＮ末端および／またはＣ末端欠失のアミ
ノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）に示されるような全ＤＲ５ヌクレオチ
ド配列であり得る。A polynucleotide having a nucleotide sequence that is, for example, at least 95% “identical” to a reference nucleotide sequence that encodes a DR5 polypeptide is defined as a polynucleotide sequence whose nucleotide sequence is at least 100 nucleotides per 100 nucleotides of the reference nucleotide sequence encoding DR5. It is intended that the nucleotide sequence of the polynucleotide be identical to the reference sequence, except that it can contain up to five mismatches. In other words, to obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence at least 95% identical to a reference nucleotide sequence, 5
Up to% can be deleted or replaced with another nucleotide, or up to 5% of the total nucleotides in the reference sequence can be inserted into the reference sequence. As described herein, the reference (query) sequence may be the sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or any polynucleotide fragment (eg, the N-terminus of DR5 as described herein and And / or a polynucleotide encoding a C-terminally deleted amino acid sequence).

【００６７】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１に示されるヌ
クレオチド配列、または寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列に対して、少な
くとも８０％同一、８５％同一、９０％同一、９２％同一、９５％同一、９６％
同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆ
ｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｐａｃｋａｇｅ，Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａ
ｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１
１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来通りに決定され得
る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間で相同性の最も高いセグメントを見出すた
めに、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１））の局所的
相同性アルゴリズムを使用する。特定の配列が本発明に従う参照配列に対して、
例えば、９５％同一であるか否かを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意
の他の配列整列プログラムを使用する場合、当然のことながら、同一性のパーセ
ンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内
のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように
パラメーターを設定する。As a practical matter, any particular nucleic acid molecule is at least 80%, 85%, 90% identical to, for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence of the deposited cDNA. , 92% identical, 95% identical, 96%
Whether it is identical, 97% identical, 98% identical or 99% identical is determined by Bestf
it program (Wisconsin Sequence Analysis)
Version 8, for Package, Unix (registered trademark), Genetics C
output Group, University Research Pa
rk, 575 Science Drive, Madison, WI 5371.
It can be determined conventionally using known computer programs such as 1). Bestfit uses Smith and Waterman (Advances in Appl.) To find the segment of highest homology between the two sequences.
ied Mathematics 2: 482-489 (1981)). The specific sequence is relative to a reference sequence according to the invention,
For example, when using Bestfit or any other sequence alignment program to determine if it is 95% identical, it is understood that the percent identity is calculated over the entire length of the reference nucleotide sequence, and The parameters are set such that gaps in homology of up to 5% of the total number of nucleotides in the reference sequence are tolerated.

【００６８】 特定の実施形態では、参照（照会）配列（本発明の配列）と対象配列との間の
同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａ
ｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づ
くＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。同一性パーセ
ントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好まし
いパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉ
ｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、
Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ
Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌ
ｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列
の長さ（いずれかより短い方）である。この実施形態に従って、同一性パーセン
トを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’および３’の短
縮を考慮しないという事実を考慮するために、対象配列が、５’または３’欠失
のために（内部欠失が理由ではなく）、照会配列より短い場合、手動の補正が結
果に対してなされる。照会配列に対して、５’末端または３’末端で短縮化され
た対象配列について、同一性パーセントは、照会配列の総塩基のパーセントとし
て、一致／整列されない対象配列の５’および３’である照会配列の塩基の数を
計算することによって補正される。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かの決
定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセン
トが、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定
された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに
到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的に使用されるものである
。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示される場合、照会配列と一致／整列されいていな
い、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのス
コアを手動で調整する目的で算定される。例えば、９０塩基の対象配列は、同一
性パーセントを決定するために１００塩基の照会配列に整列される。欠失は、対
象配列の５’末端で生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０
塩基で一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致して
いない５’および３’末端での塩基の数／照会配列の塩基の総数）を表し、その
ため１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントの
スコアから差し引かれる。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同
一性パーセントは９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩
基の照会配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、照
会と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基は存在しない。この場合
、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再
び、照会配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で
補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。In certain embodiments, the identity (also referred to as an overall sequence alignment) between a reference (query) sequence (a sequence of the invention) and a subject sequence is determined by Brutlag et al. (Comp. A
pp. Biosci. 6: 237-245 (1990)). Preferred parameters used in the FASTDB alignment of DNA sequences to calculate percent identity are: Matrix = Unitary, k-tuple = 4, Mi
smart Penalty = 1, Joining Penalty = 30,
Randomization Group Length = 0, Cutoff
Score = 1, Gap Penalty = 5, Gap Size Penal
ty 0.05, Window Size = 500 or the length of the nucleotide sequence of interest (whichever is shorter). According to this embodiment, when calculating the percent identity, due to the fact that the FASTDB program does not take into account the 5 'and 3' truncations of the subject sequence, the subject sequence must have a 5 'or 3' deletion. Thus, if shorter than the query sequence (not because of an internal deletion), a manual correction is made to the result. For subject sequences truncated at the 5 'or 3' end relative to the query sequence, the percent identity is the 5 'and 3' of the subject sequence that are not matched / aligned as a percentage of the total bases of the query sequence. It is corrected by calculating the number of bases in the query sequence. The determination of whether nucleotides are matched / aligned is determined by the result of the FASTDB sequence alignment. This percentage is then subtracted from the percent identity calculated by the FASTDB program above using the specified parameters to arrive at a final percent identity score. This corrected score is used for the purpose of the present embodiment. As indicated by FASTDB alignment, only those bases outside of the 5 'and 3' bases of the subject sequence that are not matched / aligned with the query sequence are calculated for the purpose of manually adjusting the percent identity score. For example, a 90 base subject sequence is aligned to a 100 base query sequence to determine percent identity. The deletion occurs at the 5 'end of the subject sequence, so the FASTDB alignment is the first 10' of the 5 'end.
No match / alignment with base. The 10 unpaired bases represent 10% of the sequence (number of bases at the unmatched 5 'and 3' ends / total number of bases in the query sequence), so 10% was calculated by the FASTDB program. Is subtracted from the percent identity score. If the remaining 90 bases match exactly, the final percent identity is 90%. In another example, a 90 base subject sequence is compared to a 100 base query sequence. In this case, the deletion is an internal deletion, so that there are no 5 'or 3' bases of the subject sequence that do not match / align with the query. In this case, the percent identity calculated by FASTDB is not manually corrected. Again, only the 5 'and 3' bases of the subject sequence that do not match / align with the query sequence are manually corrected. Other manual corrections are not made for the purposes of this embodiment.

【００６９】 本願は、配列番号１に示される核酸配列、寄託されたｃＤＮＡの核酸配列また
はそのフラグメントに対して、それらがＤＲ５の機能的活性を有するポリペプチ
ドをコードするか否かに関わらず、少なくとも８０％同一、８５％同一、９０％
同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または
９９％同一である核酸分子に関する。これらのポリヌクレオチドによってコード
されるポリペプチドはまた、本発明によって包含される。特定の核酸分子が、Ｄ
Ｒ５機能活性を有するポリペプチドをコードしない場合ですら、当業者はこの核
酸分子を使用する方法（例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして）をなお知っているからである。Ｄ
Ｒ５機能活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用は、
特に、（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＤＲ５遺伝子またはその対立遺伝子改変
体を単離する工程；（２）Ｖｅｒｍａら（Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ
：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍ
ｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））に記載されるような、ＤＲ
５遺伝子の正確な染色***置を提供するための、***中期染色体スプレッド（ｓ
ｐｒｅａｄ）に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳ
Ｈ」）；および（３）特定の組織におけるＤＲ５のｍＲＮＡ発現を検出するため
のノーザンブロット分析が挙げられる。The present application relates to the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the nucleic acid sequence of the deposited cDNA or a fragment thereof, whether or not they encode a polypeptide having DR5 functional activity. At least 80% identical, 85% identical, 90%
Nucleic acid molecules that are identical, 92% identical, 95% identical, 96% identical, 97% identical, 98% identical, or 99% identical. The polypeptides encoded by these polynucleotides are also encompassed by the present invention. The specific nucleic acid molecule is D
Even if they do not encode a polypeptide having R5 functional activity, those of skill in the art still know how to use the nucleic acid molecule (eg, as a hybridization probe or a polymerase chain reaction (PCR) primer). D
Use of a nucleic acid molecule of the invention that does not encode a polypeptide having R5 functional activity
In particular, (1) a step of isolating a DR5 gene or an allelic variant thereof in a cDNA library; (2) Verma et al. (Human Chromosomes)
: A Manual of Basic Technologies, Pergam
on Press, New York (1988)).
Metaphase chromosome spread (s) to provide the exact chromosomal location of the five genes
in situ hybridization (e.g., "FIS
H "); and (3) Northern blot analysis to detect DR5 mRNA expression in specific tissues.

【００７０】 しかし、配列番号１に示される核酸配列、寄託されたｃＤＮＡの核酸配列、ま
たはそれらのフラグメントに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２
％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する核酸分子
が好ましい。これらは、事実、ＤＲ５タンパク質の機能的活性を有するポリペプ
チドをコードする。「ＤＲ５の機能的活性を有するポリペプチド」によって、特
定の生物学的アッセイにおいて測定されるように、本発明のＤＲ５タンパク質（
全長（すなわち、完全）タンパク質または好ましくは成熟タンパク質のいずれか
）の機能活性と類似する活性（しかし、同一である必要はない）を示すポリペプ
チドが意図される。例えば、ＤＲ５ポリペプチド機能活性は、本明細書中に記載
されるポリペプチド配列が完全ＤＲ５とマルチマー（例えば、ホモダイマーおよ
びホモトリマー）を形成して、そしてＤＲ５リガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）を
結合する能力によって測定され得る。ＤＲ５ポリペプチド機能活性はまた、例え
ば、このポリペプチドを発現している細胞でアポトーシスを誘導する能力を決定
することによって測定され得る。これらの機能活性は、本明細書中に記載される
技術および当該分野で公知のそれ以外の技術を使用して慣用的に行われ得る。However, at least 80%, 85%, 90%, 92% or more of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the nucleic acid sequence of the deposited cDNA, or a fragment thereof.
%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical nucleic acid molecules are preferred. These in fact encode polypeptides having the functional activity of the DR5 protein. By "a polypeptide having a functional activity of DR5", a DR5 protein of the invention (as measured in a particular biological assay)
Polypeptides that exhibit activity similar to, but need not be identical to, the functional activity of the full-length (ie, complete) protein or, preferably, the mature protein are contemplated. For example, DR5 polypeptide functional activity is the ability of the polypeptide sequences described herein to form multimers (eg, homodimers and homotrimers) with intact DR5 and to bind DR5 ligands (eg, TRAIL). Can be measured by DR5 polypeptide functional activity can also be measured, for example, by determining its ability to induce apoptosis in cells expressing the polypeptide. These functional activities can be routinely performed using the techniques described herein and other techniques known in the art.

【００７１】 例えば、ＤＲ５タンパク質機能活性（例えば、生物学的活性）は、本質的に以
前に記載されたように（Ａ．Ｍ．Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５
０５〜５１２（１９９５）；Ｍ．Ｐ．Ｂｏｌｄｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７０：７７９５〜８（１９９５）；Ｆ．Ｃ．Ｋｉｓｃｈｋｅｌら、ＥＭＢＯ
１４：５５７９〜５５８８（１９９５）；Ａ．Ｍ．Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４９６１〜４９６５（１９９６））、および
以下の実施例５に示されるように行われる細胞死アッセイを使用して測定され得
る。ＭＣＦ７細胞では、全長ＤＲ５、または候補となるデスドメイン含有レセプ
ターをコードするプラスミドが、緑色蛍光タンパク質をコードするｐＬａｎｔｅ
ｒｎレポーター構築物とともに同時トランスフェクトされる。ＤＲ５をトランス
フェクトされた細胞の核は、ＤＡＰＩ染色によってアッセイされるようなアポト
ーシスの形態を示す。ＴＮＦＲ−１およびＦａｓ／ＡＰＯ−１（Ｍ．Ｍｕｚｉｏ
ら、Ｃｅｌｌ ８５：８１７〜８２７（１９９６）；Ｍ．Ｐ．Ｂｏｌｄｉｎら、
Ｃｅｌｌ ８５：８０３〜８１５（１９９６）；Ｍ．Ｔｅｗａｒｉら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３２５５〜６０（１９９５））と同様に、ＤＲ５誘導
性アポトーシスは、ＩＣＥ様プロテアーゼのインヒビター（ＣｒｍＡおよびｚ−
ＶＡＤ−ｆｍｋ）によって好ましくはブロックされる。For example, DR5 protein functional activity (eg, biological activity) can be determined essentially as previously described (AM Chinnaiyan et al., Cell 81: 5).
05-512 (1995); P. Boldin et al. Biol. Chem
. 270: 7795-8 (1995); C. Kischkel et al., EMBO
14: 5579-5588 (1995); M. Chinnaiyan et al.
J. Biol. Chem. 271: 4961-4965 (1996)), and cell death assays performed as shown in Example 5 below. In MCF7 cells, the plasmid encoding full-length DR5, or a candidate death domain-containing receptor, contains pLante encoding green fluorescent protein.
Co-transfected with rn reporter construct. The nuclei of cells transfected with DR5 show a form of apoptosis as assayed by DAPI staining. TNFR-1 and Fas / APO-1 (M. Muzio
Et al., Cell 85: 817-827 (1996); P. Boldin et al.
Cell 85: 803-815 (1996); Tewari et al. Bi
ol. Chem. 270: 3255-60 (1995)), DR5-induced apoptosis is inhibited by inhibitors of ICE-like proteases (CrmA and z-
VAD-fmk).

【００７２】 もちろん、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、例えば、寄託されたｃＤ
ＮＡの核酸配列、もしくは配列番号１に示される核酸配列、またはそれらのフラ
グメントに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６
％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する多くの核酸分子が「ＤＲ５
タンパク質の機能的活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識
する。事実、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体は全て、同じポリペプチド
をコードするので、多くの場合において、これは、上記の比較アッセイを行うこ
となく、なお当業者に明らかである。縮重改変体ではないこのような核酸分子に
ついては、妥当な数がまたＤＲ５タンパク質機能活性を有するポリペプチドをコ
ードすることは当該分野でさらに認識される。これは、以下にさらに記載される
ように、当業者が、タンパク質機能をあまり有意にもたらすようではないまたは
もたらさないようであるかのいずれかであるアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪
族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸と置換すること）を十分認識しているためで
ある。Of course, due to the degeneracy of the genetic code, one skilled in the art will appreciate, for example, the deposited cD
At least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96% of the nucleic acid sequence of NA, or the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof.
%, 97%, 98% or 99% identical nucleic acid molecules have the "DR5
It immediately recognizes that it encodes a polypeptide "having the functional activity of a protein." In fact, in many cases this will still be apparent to the skilled artisan without performing the above-described comparative assays, since all of these degenerate variants of the nucleotide sequence encode the same polypeptide. For such nucleic acid molecules that are not degenerate variants, it will be further recognized in the art that a reasonable number will also encode a polypeptide having DR5 protein functional activity. This is because, as described further below, one of skill in the art will recognize that amino acid substitutions that do not or do not appear to result in significant protein function (e.g., replacing one aliphatic amino acid with a (Replacement with 2 aliphatic amino acids).

【００７３】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関するガイダンス
は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａ
ｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ
Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供される。ここで、著者らは、タンパ
ク質がアミノ酸置換に驚くほど許容性であることを示す。For example, guidance on how to make phenotypically silent amino acid substitutions can be found in Bowie, J. et al. U. Et al., "Deciphering the Messa
Ge in Protein Sequences: Tolerance to
Amino Acid Substitutions "Science 24
7: 1306-1310 (1990). Here, the authors show that the protein is surprisingly tolerant of amino acid substitutions.

【００７４】 （ポリヌクレオチドアッセイ） 本発明はまた、相補的なポリヌクレオチドを検出するためのＤＲ５ポリヌクレ
オチド（例えば、診断試薬として）の使用に関する。機能不全と関連するＤＲ５
の変異形態の検出は、ＤＲ５またはその可溶性形態の発現の低下、過剰発現、ま
たは発現の変更から生じる、疾患（例えば、腫瘍または自己免疫疾患など）また
は疾患に対する感受性の診断を加え得るか、または定義し得る診断ツールを提供
する。Polynucleotide Assays The present invention also relates to the use of DR5 polynucleotides (eg, as diagnostic reagents) for detecting complementary polynucleotides. DR5 associated with dysfunction
Detection of a mutant form of DR5 or a soluble form thereof may add to the diagnosis of a disease (eg, a tumor or an autoimmune disease) or susceptibility to the disease resulting from reduced, over-, or altered expression of DR5 or a soluble form thereof, or Provides a diagnostic tool that can be defined.

【００７５】 ＤＲ５遺伝子に変異を保有する個体は、種々の技術により、ＤＮＡレベルで検
出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液、尿、唾液、組織
生検および剖検材料に由来する）から得られ得る。ゲノムＤＮＡは、検出のため
に直接使用され得るか、または分析の前に、ＰＣＲを用いることにより酵素的に
増幅され得る（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：１６３−１６６（１９８
６））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡはまた同じ目的のために使用され得る。例として
、ＤＲ５をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、ＤＲ５の発
現および変異を同定および分析し得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝
子型と比較した際に、増幅産物のサイズの変化により検出され得る。点変異は、
放射性標識されたＤＲ５ ＲＮＡまたは代替的に、放射性標識されたＤＲ５アン
チセンスＤＮＡ配列に対して、増幅されたＤＮＡがハイブリダイズすることによ
り同定され得る。完全に一致した配列は、ＲＮａｓｅ Ａ消化または融解点の差
異により一致しなかった二重鎖から区別され得る。An individual carrying a mutation in the DR5 gene can be detected at the DNA level by various techniques. Nucleic acids for diagnosis can be obtained from patient cells, such as from blood, urine, saliva, tissue biopsies, and autopsy material. Genomic DNA can be used directly for detection or can be amplified enzymatically by using PCR prior to analysis (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (198).
6)). RNA or cDNA can also be used for the same purpose. As an example, PCR primers complementary to a nucleic acid encoding DR5 can be used to identify and analyze DR5 expression and mutation. For example, deletions and insertions can be detected by a change in size of the amplification product when compared to a normal genotype. Point mutations are
The amplified DNA can be identified by hybridizing the amplified DNA to a radiolabeled DR5 RNA or, alternatively, to a radiolabeled DR5 antisense DNA sequence. Perfectly matched sequences can be distinguished from mismatched duplexes by RNase A digestion or by differences in melting points.

【００７６】 参照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の差異もまた、直接的なＤＮＡ
配列決定によって示され得る。さらに、クローニングされたＤＮＡセグメントは
、特定のＤＮＡセグメントを検出するプローブとして用いられ得る。このような
方法の感度は、ＰＣＲまたは別の増幅方法の適切な使用によって大いに増強され
得る。例えば、配列決定プライマーは、改変ＰＣＲによって作製された、二本鎖
ＰＣＲ産物または一本鎖鋳型分子を用いて使用される。配列の決定は、放射性標
識ヌクレオチドを用いる従来の手順によってか、または蛍光タグを用いる自動配
列決定手順によって行われる。The sequence differences between the reference gene and the mutated gene are also direct DNA
It can be shown by sequencing. In addition, cloned DNA segments can be used as probes to detect specific DNA segments. The sensitivity of such a method can be greatly enhanced by the appropriate use of PCR or another amplification method. For example, sequencing primers are used with double-stranded PCR products or single-stranded template molecules generated by modified PCR. Sequence determination is performed by conventional procedures using radiolabeled nucleotides or by automated sequencing procedures using fluorescent tags.

【００７７】 ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝子試験は、変性剤を含むか、または含まないゲ
ルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により達成
され得る。小さな配列の欠失および挿入は、高い分解能のゲル電気泳動により可
視化され得る。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、異なるＤＮＡフラグメント
の移動度が、それらの特異的な融解温度または部分融解温度により異なる位置で
ゲルにおいて遅延される変性ホルムアミド勾配ゲルにおいて区別され得る（例え
ば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１２４２（１９８５）を参照のこ
と）。Genetic testing based on DNA sequence differences can be achieved by detecting changes in the electrophoretic mobility of DNA fragments in gels with or without denaturing agents. Small sequence deletions and insertions can be visualized by high resolution gel electrophoresis. DNA fragments of different sequences can be distinguished in denaturing formamide gradient gels, in which the mobility of the different DNA fragments is delayed in the gel at different locations by their specific or partial melting temperatures (eg, Myers et al., Science). , 230: 1242 (1985)).

【００７８】 特定の位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａ
ｓｅおよびＳ１保護、または化学切断方法）により明らかにされ得る（例えば、
Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：４３
９７−４４０１（１９８５））。Sequence changes at certain positions can also be caused by nuclease protection assays (eg, RNa
(eg, se and S1 protection, or chemical cleavage methods).
Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:43
97-4401 (1985)).

【００７９】 従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、例えば、ハイブリダイゼーション、ＲＮ
ａｓｅ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例えば、制
限フラグメント長多型（「ＲＦＬＰ」）、およびゲノムＤＮＡのサザンブロッテ
ィング）を含むが、これらに限定されない方法により達成され得る。Thus, detection of a particular DNA sequence can be performed, for example, by hybridization, RN
ase protection, chemical cleavage, direct DNA sequencing or the use of restriction enzymes, such as, but not limited to, restriction fragment length polymorphism ("RFLP"), and Southern blotting of genomic DNA.

【００８０】 より従来のゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、インサ
イチュ分析により検出され得る。[0080] In addition to more conventional gel electrophoresis and DNA sequencing, mutations can also be detected by in situ analysis.

【００８１】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明のＤＮＡ分子を含むベクター、本発明のベクターで遺伝
子操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に
関する。Vectors and Host Cells The present invention also relates to vectors containing the DNA molecules of the present invention, host cells genetically engineered with the vectors of the present invention, and the production of polypeptides of the present invention by recombinant techniques.

【００８２】 宿主細胞は、遺伝子操作されて核酸分子を組込み得、そして本発明のポリペプ
チドを発現し得る。ポリヌクレオチドは、単独または他のポリヌクレオチドと共
に導入され得る。このような他のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドか
ら独立して導入されるか、本発明のポリペプチドと共に導入されるか、または本
発明のポリペプチドに結合して導入され得る。A host cell can be genetically engineered to incorporate a nucleic acid molecule and express a polypeptide of the invention. Polynucleotides can be introduced alone or with other polynucleotides. Such other polynucleotides can be introduced independently of the polypeptide of the present invention, introduced together with the polypeptide of the present invention, or introduced in association with the polypeptide of the present invention.

【００８３】 本発明のこの局面に従って、このベクターは、例えばプラスミドベクター、一
本鎖または二本鎖ファージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウ
イルスベクターであり得る。このようなベクターは、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞
に導入するための周知の技術によって、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡと
して細胞に導入され得る。ウイルスベクターは、複製適格性または複製欠損であ
り得る。後者の場合、一般的にウイルス増殖は、相補的な宿主細胞においてのみ
起こる。According to this aspect of the invention, the vector may be, for example, a plasmid vector, a single- or double-stranded phage vector, a single- or double-stranded RNA or DNA viral vector. Such vectors can be introduced into cells as polynucleotides, preferably DNA, by well known techniques for introducing DNA and RNA into cells. Viral vectors can be replication competent or replication defective. In the latter case, viral propagation generally occurs only in complementary host cells.

【００８４】 特定の観点においては、ベクターの中でも、本発明のポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの発現のためのベクターが好ましい。一般的に、このようなベクタ
ーは、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に結合した宿主における発現
のために有効なシス作用制御領域を含む。適切なトランス作用因子は、宿主によ
って供給されるか、相補ベクターによって供給されるか、または宿主への導入の
際にベクター自身によって供給されるかのいずれかである。[0084] In certain aspects, among vectors, vectors for expression of the polynucleotide and polypeptide of the present invention are preferable. Generally, such vectors contain a cis-acting control region effective for expression in a host operably linked to the polynucleotide to be expressed. Suitable trans-acting factors are either supplied by the host, supplied by a complementing vector, or supplied by the vector itself upon introduction into the host.

【００８５】 非常に様々な発現ベクターを使用して、本発明のポリペプチドを発現し得る。
このようなベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウ
イルス誘導ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピ
ソーム、酵母染色体要素、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイル
ス（例えば、ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス
、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス）由来のベクターならびにこれらの
組み合わせ由来のベクター（例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝
子要素（例えば、コスミドおよびファージミド）由来のベクター）が挙げられ、
すべて本発明のこの局面に従う発現のために使用され得る。一般的に、宿主にお
いてポリペプチドを発現するために維持し、増殖し、またはポリヌクレオチドを
発現するのに適した任意のベクターは、この点において発現のために使用され得
る。[0085] A wide variety of expression vectors can be used to express the polypeptides of the present invention.
Such vectors include chromosomal vectors, episomal vectors, and virus-derived vectors (eg, bacterial plasmids, bacteriophages, yeast episomes, yeast chromosomal elements, viruses (eg, baculovirus, papovavirus (eg, SV40), vaccinia virus, Vectors derived from adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus and retrovirus) and vectors derived from combinations thereof (eg, vectors derived from plasmids and bacteriophage genetic elements (eg, cosmids and phagemids);
All may be used for expression according to this aspect of the invention. Generally, any vector suitable to maintain, propagate, or express a polynucleotide in a host for expression can be used in this regard for expression.

【００８６】 発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、適切な発現制御配列（例えば、直接的な
ｍＲＮＡ転写に対するプロモーターを含む）に作動可能に連結される。このよう
なプロモーターの例としては、周知のプロモーターのうちのほんの少しの名前を
挙げると、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐおよび
ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターならびにレトロウイ
ルスＬＴＲのプロモーターが挙げられる。一般的に、発現構築物は、転写開始お
よび終止に関する部位、ならびに転写された領域中に、翻訳のためのリボソーム
結合部位を含む。この構築物により発現された成熟転写産物のコード部分は、翻
訳されるポリペプチドの先頭で翻訳開始ＡＵＧおよび翻訳されるポリペプチドの
末端に適切に配置された終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）を含む。[0086] The DNA sequence in the expression vector is operably linked to an appropriate expression control sequence, including, for example, a promoter for direct mRNA transcription. Examples of such promoters include the phage λPL promoter, E. coli, to name just a few of the well-known promoters. coli lac, trp and tac promoters, the SV40 early and late promoters and the promoter of the retroviral LTR. In general, expression constructs will contain sites for transcription initiation and termination, and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of the mature transcript expressed by this construct contains a translation initiation AUG at the beginning of the translated polypeptide and a stop codon (UAA, UGA, or UAG) appropriately positioned at the end of the translated polypeptide. Including.

【００８７】 さらに、構築物は、発現を調節し、そして発現を引き起こす制御領域を含み得
る。一般的に、このような領域は、転写を制御することによって、例えば、リプ
レッサー結合部位およびエンハンサーなどを操作する。In addition, the constructs can include control regions that regulate expression and cause expression. Generally, such regions manipulate transcription by controlling, for example, repressor binding sites and enhancers.

【００８８】 増殖および発現のためのベクターは、一般的に選択マーカーを含む。このよう
なマーカーはまた、増殖のために適切であり得るか、またはこのベクターは、こ
の目的のためにさらなるマーカーを含み得る。この点において、発現ベクターは
、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特徴を提供するた
めに、１以上の選択マーカー遺伝子を含む。このようなマーカーとしては、真核
生物細胞培養のためにはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、な
らびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌を培養するためにはテトラサイクリンまたは
アンピシリン耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。[0088] Vectors for propagation and expression generally include a selectable marker. Such a marker may also be suitable for propagation, or the vector may include an additional marker for this purpose. In this regard, the expression vectors preferably include one or more selectable marker genes to provide phenotypic characteristics for selection of the transformed host cells. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture, and E. coli. Culturing E. coli and other bacteria includes, but is not limited to, tetracycline or ampicillin resistance genes.

【００８９】 本明細書中のいずれかに記載されるような適切なＤＮＡ配列、ならびに適切な
プロモーターおよび他の適切な制御配列を含むベクターは、所望のポリペプチド
をそこにおいて発現するために適切な種々の周知の技術を用いて、適切な宿主に
導入され得る。適切な宿主の代表的な例には、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ
、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐ
ｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば
、ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢｏｗｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ細胞）；および植物細
胞が挙げられる。上記の宿主細胞のために適切な培養培地および条件は、当該分
野において公知である。A vector containing a suitable DNA sequence as described elsewhere herein, as well as a suitable promoter and other suitable control sequences, is suitable for expression therein of a desired polypeptide. It can be introduced into a suitable host using a variety of well-known techniques. Representative examples of suitable hosts include bacterial cells (eg, E. coli).
, Streptomyces and Salmonella typhimuri
um cells); fungal cells (eg, yeast cells); insect cells (eg, Drosop)
Hila S2 and Spodoptera Sf9 cells); animal cells (eg, CHO, COS, and Bowes melanoma cells); and plant cells. Suitable culture media and conditions for the above-described host cells are known in the art.

【００９０】 細菌における使用に好ましいベクター中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０および
ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒ
ｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、
ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびに
ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩ
Ｔ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が挙げられる。好ましい真核生物ベク
ターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐ
ＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、
ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。これらの
ベクターは、当業者が利用可能な多くの市販ベクターおよび周知のベクターの例
示のみの目的で列挙される。Among the preferred vectors for use in bacteria are pQE70, pQE60 and pQE-9 (available from Qiagen); pBS vector, Phagecr
ipt vector, Bluescript vector, pNH8A, pNH16a,
pNH18A, pNH46A (available from Stratagene); and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRI
T5 (available from Pharmacia). Among preferred eukaryotic vectors are pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and p
SG (available from Stratagene); and pSVK3, pBPV,
There are pMSG and pSVL (available from Pharmacia). These vectors are listed for the purpose of illustration only of the many commercially available vectors and well-known vectors available to those of skill in the art.

【００９１】 宿主細胞における発現のための適切なベクターおよびプロモータの選択は、周
知の手順であり、そしてベクター構築物の発現のため、ベクターの宿主への導入
のためおよび宿主における発現のために必要な技術は、当該分野における慣用的
な技術である。The selection of an appropriate vector and promoter for expression in a host cell is a well-known procedure, and is necessary for the expression of the vector construct, for the introduction of the vector into the host, and for expression in the host. The technology is a conventional technology in the field.

【００９２】 本発明はまた、本明細書中に記載される上記のベクター構築物を含む宿主細胞
に関し、そしてさらに、当該分野において公知の技術を用いて１以上の異種制御
領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に作動可能に結合す
る本発明のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を包含する。この宿主細胞は、高等
真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞））、もしくは下
等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、またはこの宿主細胞は、原
核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。宿主鎖は、所望の特定の様式で、
挿入された遺伝子配列の発現を調節するかまたは遺伝子産物を修飾および処理す
るように選択され得る。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導因子の存
在下で増大され得；従って遺伝子操作されたポリペプチドの発現が制御され得る
。さらに、異なる宿主細胞は、翻訳プロセシングおよび翻訳後プロセシングなら
びにタンパク質の改変（例えば、リン酸化、切断）のための特徴および特定の機
構を有する。適切な細胞株は、発現された外来タンパク質の所望の改変およびプ
ロセシングを確実にするために選択され得る。The present invention also relates to host cells comprising the above-described vector constructs described herein, and further using one or more techniques known in the art, for one or more heterologous control regions (eg, promoter and / or Or a host cell comprising a nucleotide sequence of the present invention operably linked to an enhancer). The host cell can be a higher eukaryotic cell (eg, a mammalian cell (eg, a human-derived cell)) or a lower eukaryotic cell (eg, a yeast cell), or the host cell can be a prokaryotic cell. It can be a biological cell, such as a bacterial cell. The host chain is, in the desired specific manner,
It can be chosen to regulate the expression of the inserted gene sequence or to modify and process the gene product. Expression from a particular promoter can be increased in the presence of a particular inducer; thus, expression of the engineered polypeptide can be controlled. In addition, different host cells have characteristics and specific mechanisms for translational and post-translational processing as well as protein modification (eg, phosphorylation, cleavage). Appropriate cell lines can be chosen to ensure the desired modification and processing of the foreign protein expressed.

【００９３】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載され
ている（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。The introduction of the construct into the host cell can be performed by calcium phosphate transfection, DE
It can result from AE-dextran-mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals (eg, Davis et al., Basic Methods in Mole).
cultural Biology (1986)).

【００９４】 本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａｒ
ｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を
含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、ＤＲ５コード配列）を
欠失または置換するように操作されており、そして／または本発明のＤＲ５ポリ
ヌクレオチドと作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド
配列）を含むように操作され、そして内因性のＤＲ５ポリヌクレオチドを活性化
、変更、および／または増幅する。例えば、当該分野で公知の技術は、相同組換
えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー
）ならびに内因性ＤＲ５ポリヌクレオチド配列を作動可能に連結するために使用
され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，
６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ ９６／２９４１
１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ ９４／１２６５０号；
Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９
３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４
２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと。これらの開示の各々は、それら
全体において参考として援用される）。[0094] In addition to including host cells containing the vector constructs discussed herein, the present invention also provides primary (primar) mammalian origin, particularly of vertebrate origin.
y) Including host cells, secondary host cells, and immortalized host cells. These host cells have been engineered to delete or replace endogenous genetic material (eg, a DR5 coding sequence) and / or are genetically operably linked to a DR5 polynucleotide of the present invention (eg, (Eg, a heterologous polynucleotide sequence) and activate, alter, and / or amplify an endogenous DR5 polynucleotide. For example, techniques known in the art can be used to operably link heterologous control regions (eg, promoters and / or enhancers) and endogenous DR5 polynucleotide sequences via homologous recombination (eg, US Patent No. 5,641, issued June 24, 1997.
No. 670; International Publication No. WO 96/2941 published September 26, 1996.
No. 1; International Publication No. WO 94/12650 published on August 4, 1994;
See Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:89
32-8935 (1989); and Zijlstra et al., Nature 34.
2: 435-438 (1989). Each of these disclosures is incorporated by reference in their entirety).

【００９５】 本発明のポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質（ペプチ
ド結合を介して（異なるタンパク質の）異種タンパク質配列に結合したポリペプ
チドを含む）で発現され得、そして分泌シグナルのみならず、さらなる異種機能
領域をも含み得る。このような融合タンパク質は、当該分野において公知の方法
によって、適切なリーディングフレームにおいて、本発明のポリヌクレオチドお
よび所望のアミノ酸配列をコードする所望の核酸配列を互いに連結させる工程、
ならびに当該分野において公知の方法によって、この融合タンパク質産物を発現
させる工程により作製され得る。あるいは、このような融合タンパク質は、例え
ば、ペプチド合成装置を使用することにより、タンパク質合成技術によって作製
され得る。従って、例えば、さらなるアミノ酸（特に、荷電アミノ酸）の領域が
、精製の間または引き続く取り扱いおよび保存の間の宿主細胞における安定性お
よび持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、領
域はまた、精製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領
域は、ポリペプチドの最終的な調製の前に除去され得る。例えば、１つの実施形
態において、本発明のＤＲ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、グ
ラム陰性細菌においてこのようなポリペプチドの発現および精製の効率を増加す
るためにｐｅｌＢペクチン酸リアーゼシグナル配列に融合され得る。米国特許第
５，５７６，１９５号および同第５，８４６，８１８号（これらの内容は、本明
細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと。The polypeptides of the present invention can be expressed in altered forms, such as fusion proteins, including polypeptides linked to heterologous protein sequences (of different proteins) via peptide bonds, and only secretion signals Such fusion proteins may also comprise, in an appropriate reading frame, the polynucleotide of the invention and the desired nucleic acid sequence encoding the desired amino acid sequence by methods known in the art. Connecting each other,
And by expressing the fusion protein product by methods known in the art. Alternatively, such fusion proteins can be made by protein synthesis techniques, for example, by using a peptide synthesizer. Thus, for example, regions of additional amino acids, particularly charged amino acids, can be added to the N-terminus of a polypeptide to improve stability and persistence in a host cell during purification or during subsequent handling and storage. . Also, regions can be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. For example, in one embodiment, a polynucleotide encoding a DR5 polypeptide of the present invention is fused to a pelB pectate lyase signal sequence to increase the efficiency of expression and purification of such a polypeptide in Gram-negative bacteria. obtain. See U.S. Patent Nos. 5,576,195 and 5,846,818, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

【００９６】 あるいは、このような融合タンパク質は、例えば、ペプチド合成装置を使用す
ることにより、タンパク質合成技術によって作製され得る。従って、例えば、さ
らなるアミノ酸（特に、荷電アミノ酸）の領域が、精製の間または引き続く取り
扱いおよび保存の間の宿主細胞における安定性および持続性を改善するために、
ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。さらに、領域はまた、精製を容易にする
ためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペプチドの最終的
な調製の前に除去され得る。特に、分泌または排出を生じさせるため、安定性を
改善するため、および精製を容易にするためにポリペプチドにペプチド部分を付
加することは、当該分野でよく知られておりかつ慣用的な技術である。好ましい
融合タンパク質は、タンパク質の可溶化に有用な免疫グロブリン由来の異種領域
を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ国対応出願２０４５８
６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定
常領域の種々の部分を含む、融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タン
パク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従っ
て、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２
）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載される有利な様式
で発現、検出、および精製された後に、Ｆｃ部分が欠失され得ることが望ましい
。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用の障害であると判明する場
合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合）で
ある。薬物探索において、例えばｈＩＬ−５レセプターのようなヒトタンパク質
が、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニ
ングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている。Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら
、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，８：
５２−５８（１９９５）およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７０：９４５９−９
４７１（１９９５）を参照のこと。Alternatively, such fusion proteins can be made by protein synthesis techniques, for example, by using a peptide synthesizer. Thus, for example, regions of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be used to improve stability and persistence in host cells during purification or during subsequent handling and storage.
It can be added to the N-terminus of the polypeptide. In addition, regions can also be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. In particular, the addition of peptide moieties to polypeptides to cause secretion or excretion, to improve stability, and to facilitate purification is well known and routine in the art. is there. Preferred fusion proteins contain heterologous regions from immunoglobulins useful for solubilizing the protein. For example, EP-A-O 464 533 (Canadian application 20458)
69) discloses a fusion protein comprising various parts of the constant region of an immunoglobulin molecule together with another human protein or part thereof. In many cases, the Fc portion in a fusion protein is sufficiently advantageous for use in therapy and diagnostics, thus resulting, for example, in improved pharmacokinetic properties (EP-A 0232 262
). On the other hand, for some uses, it is desirable that the Fc portion can be deleted after the fusion protein has been expressed, detected, and purified in the advantageous manner described. This is when the Fc portion proves to be an obstacle for use in therapy and diagnosis (eg, when the fusion protein is to be used as an antigen for immunization). In drug discovery, for example, human proteins, such as the hIL-5 receptor, have been fused with Fc portions for the purpose of high-throughput screening assays to identify antagonists of hIL-5. D. Bennett et al., Journal of Molecular Recognition, 8:
52-58 (1995); Johanson et al., The Journal.
l of Biological Chemistry, 270: 9459-9.
471 (1995).

【００９７】 本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、化学合成手順の生成物およ
び組換え技術によって原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵
母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む）から産生された産
物を含む。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペ
プチドは、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。さら
に、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合において宿主媒介プロセスの
結果として、初期改変メチオニン残基を含み得る。 （トランスジェニックおよび「ノックアウト」） 本発明のＤＲ５ポリペプチドはまた、トランスジェニック動物中で発現され得
る。任意の種の動物（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ
、ミクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシ、および非ヒト霊
長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）を含むがこれらに限定されな
い）が、トランスジェニック動物を作製するために使用され得る。特定の実施形
態において、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野の公知の技術が、遺
伝子治療プロトコルの一部として、ヒトにおいて本発明のポリペプチドを発現す
るために使用される。The polypeptides of the present invention may be obtained from naturally purified products, products of chemical synthesis procedures and recombinant or prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insects, etc.). Cells and mammalian cells). Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptide of the invention may be glycosylated or non-glycosylated. In addition, the polypeptides of the invention may also contain an initial modified methionine residue, in some cases as a result of a host-mediated process. (Transgenic and "knockout") DR5 polypeptides of the present invention can also be expressed in transgenic animals. Including animals of any species (mouse, rat, rabbit, hamster, guinea pig, pig, micro-pig, goat, sheep, cow, and non-human primates (eg, baboon, monkey, and chimpanzee) (Not limited to these), can be used to generate transgenic animals. In certain embodiments, techniques described herein or otherwise known in the art are used to express a polypeptide of the invention in humans as part of a gene therapy protocol.

【００９８】 当該分野で公知の任意の技術が、導入遺伝子（すなわち、本発明の核酸）を動
物に導入して、トランスジェニック動物の創始系統を作製するために使用され得
る。このような技術としては、前核マイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏ
ｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−
６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１
１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；およびＨｏｐｐｅら、米国特
許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺
伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚盤胞または胚へ
のレトロウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚の
エレクトロポレーション（Ｌｏ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−
１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（
例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参照
のこと）；胚性多能性幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞へのこの幹細胞
の再移入；ならびに***媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５
７：７１７−７２３（１９８９））；などを含むがこれらに限定されない。この
ような技術の総説については、本明細書中にその全体が参考として援用される、
Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ
．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）を参照のこと。米国特許第
５，４６４，７６４号（Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｐｒｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔ
ｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ）；米
国特許第５，６３１，１５３号（Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｎ
ｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｅｄｅｔ
ｅｒｍｉｎｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏ
ｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎ
ｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ Ｓａｍｅ）；米国特許第４，７３
６，８６６号（Ｌｅｄｅｒら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ａ
ｎｉｍａｌｓ）；ならびに米国特許第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒら、
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｙｇｏｔｅｓ）；も
また参照のこと（これらの各々は、本明細書中にその全体が参考として援用され
る）。さらに、この段落に列挙された資料の各々の内容が、本明細書中でその全
体が参考として援用される。[0098] Any technique known in the art can be used to introduce a transgene (ie, a nucleic acid of the present invention) into an animal to create a founder line of the transgenic animal. Such techniques include pronuclear microinjection (Paterso).
n et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 691-
698 (1994); Carver et al., Biotechnology (NY) 1
1: 1263-1270 (1993); Wright et al., Biotechnol.
ogy (NY) 9: 830-834 (1991); and Hoppe et al., U.S. Patent No. 4,873,191 (1989)); retroviral-mediated gene transfer into the germline (Vander Putten et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82: 6148-6152 (1985)), retrovirus-mediated gene transfer into blastocysts or embryos; gene targeting in embryonic stem cells (Thom
Pson et al., Cell 56: 313-321 (1989)); Electroporation of cells or embryos (Lo, Mol Cell. Biol. 3: 1803-
1814 (1983)); Introduction of the polynucleotide of the present invention using a gene gun (
See, e.g., Ulmer et al., Science 259: 1745 (1993)); introduction of a nucleic acid construct into embryonic pluripotent stem cells and retransfer of the stem cells into blastocysts; and sperm-mediated gene transfer (Lavitrano et al.). , Cell 5
7: 717-723 (1989)); and the like, but is not limited thereto. A review of such techniques is hereby incorporated by reference in its entirety.
Gordon, "Transgenic Animals", Intl. Rev
. Cytol. 115: 171-229 (1989). U.S. Patent No. 5,464,764 (Capecchi et al., Prospective-Negat).
U.S. Patent No. 5,631,153 (Capecchi et al., Cells and N).
on-Human Organisms Containing Predet
ermined Genomic Modifications and Po
Sit-Negative Selection Methods an
d Vectors for Making Same); US Pat. No. 4,734.
No. 6,866 (Leder et al., Transgenic Non-Human A).
and US Patent No. 4,873,191 (Wagner et al.,
See also Genetic Transformation of Zygotes; each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Further, the contents of each of the materials listed in this paragraph are hereby incorporated by reference in their entirety.

【００９９】 当該分野で公知の任意の技術が、本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジ
ェニッククローンを作製するために使用され得、そのような技術は、例えば、徐
核した卵母細胞への、休止期に誘導された培養した、胚性（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
）細胞由来の核、胎児細胞由来の核または成体細胞由来の核の、核移入である（
Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌｍ
ｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）、これらのそれぞ
れは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。[0099] Any technique known in the art can be used to generate transgenic clones containing the polynucleotides of the present invention, including, for example, resting into a nucleated oocyte. Embryonic (embryonic)
) Nuclear import of nuclei from cells, nuclei from fetal cells or nuclei from adult cells (
Campell et al., Nature 380: 64-66 (1996); Wilm.
ut et al., Nature 385: 810-813 (1997), each of which is incorporated herein by reference in its entirety).

【０１００】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイクまたはキメラ動物）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定の細胞型に選択
的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異的活性化に必要
とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明
らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染色体部位に組み
込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。手短に言えば、こ
のような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同ないくつかのヌクレ
オチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換えを介して内在性遺伝
子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列の機能を破壊するこ
とを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に選択的に導入さ
れ得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１０６（１
９９４））の教示に従って、導入された細胞型においてのみ内在性遺伝子が不活
化される。そのような細胞型特異的不活化に必要とされる調節配列は、目的の特
定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかである。この段落に列挙さ
れた資料の各々の内容が、本明細書中でその全体が参考として援用される。The present invention provides transgenic animals that have the transgene in all of their cells, as well as animals that have the transgene in some (but not all) cells (ie, mosaic or chimeric animals). I do. The transgene can be a single transgene or a concatamer (eg, head-to-head tandem or head-to-head).
Tail tandem). This transgene is also described, for example, in the teachings of Lasko et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89: 6322-2236 (1992)) and can be selectively introduced into specific cell types and activated. The regulatory sequences required for such cell type-specific activation will depend on the particular cell type of interest, and they will be apparent to those skilled in the art. If it is desired that the polynucleotide transgene be integrated into the chromosomal site of the endogenous gene, gene targeting is preferred. Briefly, when such a technique is used, a vector containing several nucleotide sequences homologous to the endogenous gene is transformed into a nucleotide sequence of the endogenous gene through homologous recombination with a chromosomal sequence. And designed to disrupt the function of the nucleotide sequence. The transgene may also be selectively introduced into a particular cell type, and thus may be, for example, Gu et al. (Science 265: 103-106 (1
994)), the endogenous gene is inactivated only in the introduced cell type. The regulatory sequences required for such cell type-specific inactivation will depend on the particular cell type of interest, and they will be apparent to those skilled in the art. The contents of each of the materials listed in this paragraph are hereby incorporated by reference in their entirety.

【０１０１】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物由来の組織サンプルのノーザン
ブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。[0101] Once the transgenic animal has been produced, expression of the recombinant gene can be assayed using standard techniques. Initial screening can be accomplished by Southern blot analysis or PCR techniques, and analysis of animal tissue can confirm that transgene integration has occurred. Transgene mRNA expression levels in tissues of transgenic animals can also be determined by Northern blot analysis, in situ hybridization analysis, and reverse transcriptase P of tissue samples from animals.
It can be assessed using techniques including, but not limited to, CR (rt-PCR). Samples of the transgenic gene-expressing tissue can also be assessed immunocytochemically or immunohistochemically using antibodies specific for the transgene product.

【０１０２】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような
交配戦略の例は、以下を含むがこれらに限定されない：別の系統を樹立するため
の１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相
加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジ
ェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析
による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部
位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の
交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合
系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導
入遺伝子を配置するための交配。Once founders have been generated, they can be bred, inbred, outbred or crossed to produce colonies of a particular animal. Examples of such mating strategies include, but are not limited to: outcrossing founders with more than one integration site to establish another lineage; additive expression of each transgene By effect, inbreeding of separate strains to produce complex transgenics expressing higher levels of the transgene; certain routines for both enhancing expression and eliminating the need to screen animals by DNA analysis. Crosses of heterozygous transgenic animals that produce animals homozygous for the integration site; crosses of separate homozygous lines to generate compound heterozygous or homozygous lines; and the desired experimental model Crosses to place the transgene on a suitable different background.

【０１０３】 本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、ＤＲ５ポリペプ
チドの生物学的機能の詳述、異常なＤＲ５発現に関連する状態および／または障
害の研究、ならびにこのような状態および／または障害の改善に有効な化合物に
ついてのスクリーニングに有用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない用
途を有する。The transgenic and “knock-out” animals of the present invention can be used to elaborate the biological function of DR5 polypeptides, study conditions and / or disorders associated with aberrant DR5 expression, and to study such conditions and / or disorders. It has uses, including but not limited to animal model systems, useful for screening for compounds that are effective in ameliorating the disorder.

【０１０４】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のタンパク質を発現するために遺
伝子操作される細胞、あるいは本発明のタンパク質を発現しないように遺伝子操
作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。このよ
うな細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナーから
入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂肪細
胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞を、
例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入遺伝
子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プラス
ミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソームな
どの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポリペ
プチドのコード配列を導入するために、あるいは本発明のポリペプチドに結合し
ているコード配列および／または内因性の調節配列を破壊するために、組換えＤ
ＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチドのコー
ド配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたはプロモー
ター／エンハンサーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現および好ま
しくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましくは分泌す
る操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ全身的に
導入し得る。あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移
植し得る（例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し
得る）；遺伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として
移植し得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号；
ならびにＭｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９
号を参照のこと。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用され
る）。In a further embodiment of the present invention, cells that have been genetically engineered to express a protein of the present invention or that have been genetically engineered to not express a protein of the present invention (eg, knockouts) can be used in vivo. Administer to patients. Such cells can be obtained from patients (ie, animals including humans) or MHC compatible donors, and include fibroblasts, bone marrow cells, blood cells (eg, lymphocytes), adipocytes, muscle cells, endothelial cells, and the like. But not limited to them. This cell,
For example, transduction (using viral vectors and, preferably, vectors that incorporate the transgene into the cell genome), or transfection procedures (including the use of plasmids, cosmids, YACs, naked DNA, electroporation, liposomes, etc. , But not limited to, for introducing a coding sequence of a polypeptide of the present invention into a cell, or for destroying a coding sequence and / or an endogenous regulatory sequence bound to a polypeptide of the present invention. The recombinant D
Genetically engineered in vitro using NA technology. The coding sequence for a polypeptide of the present invention may be placed under the control of a strong constitutive or inducible promoter or promoter / enhancer to achieve expression and preferably secretion of the polypeptide of the present invention. Engineered cells that express and preferably secrete a polypeptide of the present invention can be introduced systemically into a patient, for example, in the circulation or intraperitoneally. Alternatively, the cells can be incorporated into a matrix and implanted into the body (eg, engineered fibroblasts can be implanted as part of a skin graft); Can be implanted as part of an implant (eg, Anderson et al., US Pat. No. 5,399,349;
And Mulligan and Wilson, US Patent No. 5,460,959.
See issue. Each of these is hereby incorporated by reference in its entirety).

【０１０５】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。If the cells to be administered are non-autologous or non-MHC compatible cells, they may be administered using well-known techniques that would prevent the generation of a host immune response against the transduced cells. For example, the cells can be introduced in a capsular form, which does not allow the introduced cells to be recognized by the host immune system, while allowing the components to exchange with the immediate extracellular environment.

【０１０６】 （ＤＲ５タンパク質およびフラグメント） 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリぺプチ
ド配列を含むタンパク質を提供する。(DR5 Protein and Fragment) The present invention further provides a protein comprising a polypeptide sequence encoded by the polynucleotide of the present invention.

【０１０７】 本発明のＤＲ５タンパク質は、モノマーまたはマルチマー（すなわち、ダイマ
ー、トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。従って、
本発明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のＤＲ５タンパク質、それらの調
製物ならびにそれらを含む組成物（好ましくは薬学的組成物）に関する。特定の
実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマー、トリマーまたは
テトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のマルチマーは、少なくとも
ダイマー、少なくともトリマー、または少なくともテトラマーである。The DR5 proteins of the present invention can be monomeric or multimeric (ie, dimers, trimers, tetramers and higher multimers). Therefore,
The invention relates to monomeric and multimeric DR5 proteins of the invention, their preparation and compositions comprising them (preferably pharmaceutical compositions). In certain embodiments, a polypeptide of the invention is a monomer, dimer, trimer or tetramer. In a further embodiment, a multimer of the invention is at least a dimer, at least a trimer, or at least a tetramer.

【０１０８】 本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、本発明のＤＲ５タンパク質（
本明細書中に記載されるＤＲ５フラグメント、改変体、および融合タンパク質を
含む）のみを含むマルチマーをいう。これらのホモマーは、同一または異なるポ
リぺプチド配列を有するＤＲ５タンパク質を含み得る。特定の実施形態では、本
発明のホモマーは、同一のポリぺプチド配列を有するＤＲ５タンパク質のみを含
むマルチマーである。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、異なるポ
リぺプチド配列を有するＤＲ５タンパク質を含むマルチマーである。特定の実施
形態では、本発明のマルチマーは、ホモダイマー（例えば、同一または異なるポ
リぺプチド配列を有するＤＲ５タンパク質を含む）あるいはホモトリマー（例え
ば、同一または異なるポリぺプチド配列を有するＤＲ５タンパク質を含む）であ
る。さらなる実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモ
ダイマー、少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーである。The multimers encompassed by the present invention can be homomers or heteromers. As used herein, the term homomer refers to a DR5 protein of the invention (
(Including DR5 fragments, variants, and fusion proteins described herein). These homomers may include DR5 proteins having the same or different polypeptide sequences. In certain embodiments, a homomer of the invention is a multimer that includes only DR5 proteins having the same polypeptide sequence. In another specific embodiment, a homomer of the invention is a multimer comprising DR5 proteins having different polypeptide sequences. In certain embodiments, the multimers of the invention are homodimers (eg, including DR5 proteins having the same or different polypeptide sequences) or homotrimers (eg, including DR5 proteins having the same or different polypeptide sequences). It is. In a further embodiment, the homomeric multimer of the invention is at least a homodimer, at least a homotrimer or at least a homotetramer.

【０１０９】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のＤＲ５タンパク
質に加えて異種タンパク質（すなわち、ＤＲ５遺伝子によりコードされるポリペ
プチド配列に対応しないポリぺプチド配列のみを含むタンパク質）を含むマルチ
マーをいう。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ヘテロダイマー、ヘ
テロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明の
ヘテロマー性マルチマーは、少なくともヘテロダイマー、少なくともヘテロトリ
マーまたは少なくともヘテロテトラマーである。As used herein, the term heteromer refers to a protein comprising only a polypeptide sequence that does not correspond to a polypeptide sequence encoded by a DR5 gene in addition to a heterologous protein in addition to the DR5 protein of the present invention. )). In certain embodiments, a multimer of the invention is a heterodimer, heterotrimer or heterotetramer. In a further embodiment, the heteromeric multimer of the invention is at least a heterodimer, at least a heterotrimer or at least a heterotetramer.

【０１１０】 本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合
的な結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接
連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例えば、ホ
モダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のタンパク質が溶液中で互いに
接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー（例
えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のタンパク質が
、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質におけ
る異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成される。他
の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のＤＲ５タンパク質との、およ
び／または本発明のＤＲ５タンパク質間での共有結合によって形成される。この
ような共有結合は、タンパク質のポリぺプチド配列（例えば、配列番号２に記載
されるポリぺプチド配列に含まれるか、または寄託されたｃＤＮＡによってコー
ドされるポリペプチド）に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では
、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチドにお
いて相互作用するタンパク質のポリペプチド配列内に存在するシステイン残基間
での架橋である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操作の
結果である。あるいは、このような共有結合は、ＤＲ５融合タンパク質中の異種
ポリペプチド配列において含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では
、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、
米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合
は、（本明細書中に記載されるような）本発明のＤＲ５−Ｆｃ融合タンパク質に
含まれる異種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有
結合は、共有結合したマルチマーを形成し得る別のＴＮＦファミリーリガンド／
レセプターメンバー（例えば、オステオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅ
ｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある（例えば、国際公開番
号ＷＯ ９８／４９３０５号（この内容はその全体が本明細書中で参考として援
用される）を参照のこと）。別の実施形態では、２以上の本発明のＤＲ５ポリペ
プチドは、合成リンカー（例えば、ペプチド、炭水化物、または可溶性ポリマー
リンカー）を通して連結される。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号
（本明細書中に参考として援用される）に記載されるペプチドリンカーが挙げら
れるが、これらに限定されない。ペプチドリンカーによって隔てられた複数のＤ
Ｒ５ポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて生成さ
れ得る。The multimers of the present invention may be the result of hydrophobic, hydrophilic, ionic and / or covalent associations and / or may be indirectly linked, for example, by liposome formation. Thus, in one embodiment, a multimer of the invention, such as a homodimer or homotrimer, is formed when the proteins of the invention contact each other in solution. In another embodiment, a heteromultimer of the invention (eg, a heterotrimer or heterotetramer) is an antibody against a polypeptide of the invention in solution (a heterologous polypeptide in a fusion protein of the invention). (Including antibodies to the sequence). In other embodiments, the multimers of the invention are formed by covalent bonds with and / or between DR5 proteins of the invention. Such covalent linkages may include one or more of the polypeptide sequences of the protein (eg, included in the polypeptide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or encoded by the deposited cDNA). It may include amino acid residues. In one example, the covalent bond is a bridge between cysteine residues present within the polypeptide sequence of the interacting protein in the native (ie, naturally occurring) polypeptide. In another example, the covalent bond is the result of a chemical or recombinant operation. Alternatively, such covalent bonds may include one or more amino acid residues contained in a heterologous polypeptide sequence in a DR5 fusion protein. In one example, the covalent bond is between heterologous sequences included in a fusion protein of the invention (eg,
See U.S. Patent No. 5,478,925). In certain instances, the covalent bond is between heterologous sequences contained in a DR5-Fc fusion protein of the invention (as described herein). In another particular example, the covalent attachment of the fusion protein of the invention is to another TNF family ligand /
Receptor members (eg, osteoprotegerin)
gerin) (see, eg, International Publication No. WO 98/49305, the contents of which are hereby incorporated by reference in its entirety). In another embodiment, two or more DR5 polypeptides of the invention are linked through a synthetic linker (eg, a peptide, carbohydrate, or soluble polymer linker). Examples include, but are not limited to, the peptide linkers described in US Pat. No. 5,073,627, incorporated herein by reference. Multiple Ds separated by a peptide linker
Proteins containing R5 polypeptides can be produced using conventional recombinant DNA techniques.

【０１１１】 本発明のマルチマーＤＲ５ポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシ
ンジッパーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融
合されたＤＲ５ポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイ
ソロイシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチ
マー形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかの
ＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以来種々の異なるタンパ
ク質において見出されている。とりわけ公知のロイシンジッパーは、ダイマー形
成またはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体である
。可溶性マルチマーＤＲ５タンパク質を生成するために適切なロイシンジッパー
ドメインの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１
０３０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中でダイマー形成
またはトリマー形成をするペプチドに融合された可溶性ＤＲ５ポリペプチドを含
む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可溶
性マルチマーＤＲ５は、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から回収される
。Another method for preparing a multimeric DR5 polypeptide of the invention involves the use of a DR5 polypeptide fused to a leucine zipper polypeptide sequence or an isoleucine zipper polypeptide sequence. Leucine zipper domains and isoleucine zipper domains are polypeptides that promote multimerization of the protein in which the domain is found. Leucine zippers were originally identified in several DNA binding proteins (Landschulz et al., Science
ce 240: 1759, (1988)), and since then have been found in a variety of different proteins. In particular, the known leucine zippers are naturally occurring peptides and derivatives thereof that form dimers or trimers. An example of a leucine zipper domain suitable for producing a soluble multimeric DR5 protein is described in PCT application WO 94/1, which is incorporated herein by reference.
0308 is a leucine zipper domain. A recombinant fusion protein comprising a soluble DR5 polypeptide fused to a peptide that dimerizes or trimers in solution is expressed in a suitable host cell, and the resulting soluble multimeric DR5 is prepared using techniques known in the art. Is recovered from the culture supernatant using

【０１１２】 ＴＮＦファミリーの特定のメンバーは、トリマーの形態で存在すると考えられ
る（ＢｅｕｔｌｅｒおよびＨｕｆｆｅｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：６６７、１
９９４；Ｂａｎｎｅｒら、Ｃｅｌｌ７３：４３１（１９９３））。従って、トリ
マーＤＲ５は、増強された生物学的活性の利点を提供し得る。好ましいロイシン
ジッパー部分は、有線的な形態のトリマーである。１例は、肺界面活性剤タンパ
ク質Ｄ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーであり、Ｈｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１（１９９４））および米国特許出願番号第０８／
４４６、９２２に記載され、本明細書中において参考として援用される。天然に
存在するトリマータンパク質由来の他のペプチドは、トリマーＤＲ５を調製する
際に使用され得る。Certain members of the TNF family are believed to exist in trimeric forms (Beutler and Huffel, Science 264: 667, 1).
994; Banner et al., Cell 73: 431 (1993)). Thus, trimer DR5 may offer the advantage of enhanced biological activity. A preferred leucine zipper moiety is a trimmer in wired form. One example is a leucine zipper from lung surfactant protein D (SPD), as described in Hoppe et al. (FEBS L
etters 344: 191 (1994)) and U.S. patent application Ser.
446, 922, which are incorporated herein by reference. Other peptides from naturally occurring trimeric proteins can be used in preparing trimeric DR5.

【０１１３】 別の例において、本発明のタンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）ＤＲ５に含ま
れるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列または本発明のＦｌａｇ（登録商標
）ＤＲ５融合タンパク質の間の相互作用によって結合する。さらなる実施形態に
おいて、本発明の結合タンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）ＤＲ５に含まれる異
種ポリペプチド配列または本発明のＦｌａｇ（登録商標）ＤＲ５融合タンパク質
と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって結合される。In another example, a protein of the invention is bound by an interaction between a Flag® polypeptide sequence contained in Flag® DR5 or a Flag® DR5 fusion protein of the invention. I do. In a further embodiment, a binding protein of the invention is a heterologous polypeptide sequence contained in Flag® DR5 or an interaction between a Flag® DR5 fusion protein of the invention and an anti-Flag® antibody. Combined by action.

【０１１４】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を使用して生成され得る。
例えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるタンパク質は、当該分
野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を使用して、化学的に
架橋され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは本明細書中で
その全体が参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマ
ーは、当該分野で公知の技術を使用して生成されて、マルチマー中に含まれるこ
とが所望されるタンパク質のポリぺプチド配列内に位置するシステイン残基間に
、１つ以上の分子間架橋を形成し得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５
号（これは、本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）。The multimers of the present invention can be produced using chemical techniques known in the art.
For example, proteins desired to be included in the multimers of the invention can be chemically cross-linked using linker molecules and linker length optimization techniques known in the art (eg, US Pat. No. 478,925, which is hereby incorporated by reference in its entirety). In addition, the multimers of the present invention can be generated using techniques known in the art, with one between the cysteine residues located within the polypeptide sequence of the protein desired to be included in the multimer. These intermolecular crosslinks can be formed (see, for example, US Pat. No. 5,478,925).
No., which is hereby incorporated by reference in its entirety).

【０１１５】 さらに、本発明のタンパク質は、このタンパク質のポリぺプチド配列のＣ末端
またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加により慣用的に改変され得、
当該分野で公知の技術が、１つ以上のこれらの改変されたタンパク質を含むマル
チマーを生成するために適用され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５
号（これはその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。さ
らに、当該分野で公知技術は、本発明のマルチマーに含まれることを所望される
タンパク質成分を含むリポソームを生成するために適用され得る（例えば、米国
特許第５，４７８，９２５号（これはその全体が本明細書中で参考として援用さ
れる）を参照のこと）。In addition, the proteins of the present invention can be conventionally modified by the addition of cysteine or biotin to the C-terminus or N-terminus of the polypeptide sequence of the protein,
Techniques known in the art can be applied to generate multimers containing one or more of these modified proteins (eg, US Pat. No. 5,478,925).
No., which is hereby incorporated by reference in its entirety). In addition, techniques known in the art can be applied to generate liposomes containing the protein component desired to be included in the multimers of the present invention (see, for example, US Pat. ), Incorporated herein by reference in its entirety).

【０１１６】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるタンパク質
は、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技術
を用いて組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用さ
れる、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では、
本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列
に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペプチ
ドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連結
することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では、
本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して、
膜貫通ドメインを含み、そして膜再構成技術によってリポソームに取り込まれ得
る、本発明の組換えポリペプチドを生成する（例えば、本明細書中にその全体が
参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。Alternatively, the multimers of the present invention can be generated using genetic engineering techniques known in the art. In one embodiment, the proteins comprised in the multimers of the invention are recombinantly produced using fusion protein techniques described herein or otherwise known in the art (eg, as described herein). See U.S. Patent No. 5,478,925, which is incorporated by reference in its entirety). In certain embodiments,
The polynucleotide encoding the homodimer of the present invention is obtained by linking the polynucleotide sequence encoding the polypeptide of the present invention to the sequence encoding the linker polypeptide, and then further in the direction opposite to the original C-terminal to N-terminal direction. (E.g., U.S. Patent No. 5,478, incorporated herein by reference in its entirety). 925). In another embodiment,
Applying the recombinant techniques described herein or otherwise known in the art,
Produce recombinant polypeptides of the present invention that include a transmembrane domain and can be incorporated into liposomes by membrane reconstitution techniques (see, eg, US Pat. 478,925).

【０１１７】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供される。「単離
されたポリペプチド」によって、そのネイティブ環境から取り出されたポリペプ
チドが意図される。従って、組換え宿主内で産生されるポリペプチドおよび／ま
たは組換え宿主細胞内に含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離さ
れたと考えられる。「単離されたポリペプチド」としてまた意図されるのは、組
換え宿主から、部分的または実質的に精製されたポリペプチドである。例えば、
ＤＲ５ポリペプチドの組換え産生されたバージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｈｏ
ｎｓｏｎ（Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８））に記載される一工程法に
よって実質的に精製され得る。[0117] The polypeptides of the present invention are preferably provided in an isolated form. By "isolated polypeptide" is intended a polypeptide that has been removed from its native environment. Thus, a polypeptide produced in a recombinant host and / or a polypeptide contained in a recombinant host cell is considered isolated for the purposes of the present invention. Also contemplated as "isolated polypeptide" is a polypeptide that has been partially or substantially purified from a recombinant host. For example,
Recombinantly produced versions of the DR5 polypeptide are available from Smith and Jho.
nson (Gene 67: 31-40 (1988)).

【０１１８】 １つの実施形態では、本発明は、寄託されたｃＤＮＡによりコードされるアミ
ノ酸配列、もしくは配列番号２のアミノ酸配列を有する単離されたＤＲ５ポリペ
プチド、あるいは上記ポリペプチドの一部（すなわち、フラグメント）を含むか
、あるいはそれらからなるポリペプチドまたはペプチドを提供する。これらのポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。In one embodiment, the present invention relates to an isolated DR5 polypeptide having the amino acid sequence encoded by the deposited cDNA, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a portion of said polypeptide (ie, , Fragments) are provided. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.

【０１１９】 本発明のポリぺプチドフラグメントは、以下を含むか、またあるいは以下から
なる、ポリぺプチドを含む：配列番号２に含まれるアミノ酸配列、寄託されたプ
ラスミドに含まれるｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、あるいは寄託さ
れたプラスミドに含まれるヌクレオチド配列に（例えば、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下で）ハイブリダイズする核酸によりコードされるア
ミノ酸配列か、または図１（配列番号１）に示されるアミノ酸配列か、またはそ
れらの相補鎖。タンパク質フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄ
ｉｎｇ）」であり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド内（そのフラグメン
トが、部分または領域を、最も好ましくは単一の連続した領域として形成する）
に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例え
ば、以下を含むかあるいは以下からなる、フラグメントが挙げられる：配列番号
２のコード領域のアミノ酸残基およそ−５１〜−１、１〜２７、２８〜４０、４
１〜６０、６１〜８３、８４〜１００、１０１〜１２７、１２８〜１３３、１３
４〜１５７、１５８〜１６７、１６８〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２
０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２７２、２７３〜３１０、３１
１〜３４０および３４１〜３６０からな群より選択されるメンバー、ならびにこ
れらのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。さらなる本発明
のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、以下を含むかある
いは以下からなる、フラグメントが挙げられる：配列番号２のコード領域のアミ
ノ酸残基１〜６０、１１〜７０、２１〜８０、３１〜９０、４１〜１００、５１
〜１１０、６１〜１２０、７１〜１３０、８１〜１４０、９１〜１５０、１０１
〜１６０、１１１〜１７０、１２１〜１８０、１３１〜１９０、１４１〜２００
、１５１〜２１０、１６１〜２２０、１７１〜２３０、１８１〜２４０、１９１
〜２５０、２０１〜２６０、２１１〜２７０、２２１〜２８０、２３１〜２９０
、２４１〜３００、２５１〜３１０、２６１〜３２０、２７１〜３３０、２８１
〜３４０、２９１〜３５０および３０１〜３６０からな群より選択されるメンバ
ー、ならびに、これらのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド
はまた、本発明に含まれる。A polypeptide fragment of the invention comprises a polypeptide comprising or alternatively consisting of: the amino acid sequence contained in SEQ ID NO: 2, encoded by the cDNA contained in the deposited plasmid An amino acid sequence, or an amino acid sequence encoded by a nucleic acid that hybridizes (eg, under stringent hybridization conditions) to a nucleotide sequence contained in a deposited plasmid, or the amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) Sequences or their complements. Protein fragments are "free-standing"
ing) "or within a larger polypeptide, the fragments of which form a portion or region, most preferably as a single continuous region.
Can be included. Representative examples of polypeptide fragments of the present invention include, for example, fragments containing or consisting of: about -51 to -1, 1-27 amino acid residues of the coding region of SEQ ID NO: 2. , 28-40, 4
1 to 60, 61 to 83, 84 to 100, 101 to 127, 128 to 133, 13
4-157, 158-167, 168-180, 181-200, 201-22
0, 221-240, 241-260, 261-272, 273-310, 31
Members selected from the group consisting of 1-340 and 341-360, and isolated polynucleotides encoding these polypeptides. Further representative examples of polypeptide fragments of the present invention include, for example, fragments comprising or consisting of: amino acid residues 1-60, 11-70, 21 of the coding region of SEQ ID NO: 2. -80, 31-90, 41-100, 51
To 110, 61 to 120, 71 to 130, 81 to 140, 91 to 150, 101
~ 160, 111 ~ 170, 121 ~ 180, 131 ~ 190, 141 ~ 200
, 151-210, 161-220, 171-230, 181-240, 191
~ 250, 201 ~ 260, 211 ~ 270, 221-280, 231-290
, 241 to 300, 251 to 310, 261 to 320, 271 to 330, 281
Members selected from the group consisting of -340, 291-350 and 301-360, as well as isolated polynucleotides encoding these polypeptides, are also included in the invention.

【０１２０】 さらに、ポリぺプチドフラグメントは、少なくとも約１０、２０、３０、４０
、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０ま
たは１５０アミノ酸長であり得る。この文脈における、「およそ」とは、いずれ
かの末端もしくは両末端において、特に列挙された範囲のいくつか（５、４、３
、２もしくは１）のアミノ酸だけ大きいか、もしくは小さい範囲を含む。これら
のポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドはまた本発明に含まれる。Further, the polypeptide fragment may have at least about 10, 20, 30, 40
, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 or 150 amino acids in length. In this context, “approximately” means at either or both termini, some of the specifically recited ranges (5, 4, 3, 3).
2, or 1) amino acids that are larger or smaller. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.

【０１２１】 本発明の好ましいポリペプチドフラグメントは、以下の群から選択される１、
２、３、４、５またはそれ以上のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからな
るポリペプチドを含む：ＤＲ５レセプター細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ
酸残基およそ１〜およそ１３３を構成すると推定される）を含むか、あるいはそ
れらからなる、ポリペプチド；ＤＲ５のシステインリッチドメイン（配列番号２
のアミノ酸残基３３〜１２８を構成すると推定される）を含むか、あるいはそれ
らからなる、ポリペプチド；ＤＲ５レセプター膜貫通ドメイン（配列番号２のア
ミノ酸残基およそ１３４〜およそ１５７を構成すると推定される）を含むか、あ
るいはそれらからなる、ポリペプチド；推定成熟ＤＲ５ポリペプチドのフラグメ
ントを含むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチド（ここで、そのフラグメ
ントは、ＤＲ５機能活性（例えば、抗原性活性もしくは生物学的活性）を有する
）；ＤＲ５レセプター細胞内ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基およそ１５８
〜およそ３６０を構成すると推定される）を含むか、あるいはそれらからなる、
ポリペプチド；欠失した膜貫通ドメインの全てか、もしくは部分を有する、ＤＲ
５レセプター細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むか、あるいはそれらか
らなる、ポリペプチド；ＤＲ５レセプターデスドメイン（配列番号２のアミノ酸
残基およそ２７３〜およそ３４０を構成すると推定される）を含むか、あるいは
それらからなる、ポリペプチド；およびＤＲ５レセプタータンパク質の１、２、
３、４個以上のエピトープ保有部分を含むか、あるいはそれらからなる、ポリペ
プチド。さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドフラグメントは、上
記のメンバーの１、２、３、４、５、６、７または８個全ての任意の組み合わせ
を含むか、あるいはそれらからなる。上記のように、リーダー配列と共に、ＤＲ
５レセプター細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを構成する
アミノ酸残基がコンピュータ分析によって推定される。従って、当業者が理解す
るように、これらのドメインを構成するアミノ酸残基は、各ドメインを定義する
ために使用される判定基準に依存して、わずかに変動し得る（例えば、およそ１
〜およそ１５アミノ酸残基）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドはまた、本発明に含まれる。A preferred polypeptide fragment of the present invention is one selected from the following group:
Includes a polypeptide comprising or consisting of two, three, four, five or more amino acid sequences: DR5 receptor extracellular domain (presumed to constitute about 1 to about 133 amino acid residues of SEQ ID NO: 2) A polypeptide comprising or consisting of a cysteine-rich domain of DR5 (SEQ ID NO: 2).
A polypeptide comprising or consisting of amino acid residues 33 to 128 of the following; DR5 receptor transmembrane domain (presumed to constitute amino acids from about 134 to about 157 of SEQ ID NO: 2) A polypeptide comprising or consisting of a fragment of a putative mature DR5 polypeptide, wherein the fragment has a DR5 functional activity (eg, antigenic activity or biological activity). DR5 receptor intracellular domain (approximately 158 amino acid residues of SEQ ID NO: 2).
~ Consisting of about 360) or consisting of
A polypeptide having all or a portion of the deleted transmembrane domain, DR
A polypeptide comprising or consisting of a 5 receptor extracellular domain and an intracellular domain; or comprising a DR5 receptor death domain (estimated to comprise amino acid residues from about 273 to about 340 of SEQ ID NO: 2), or A polypeptide consisting of them; and one or two of the DR5 receptor proteins.
A polypeptide comprising or consisting of three, four or more epitope-bearing portions. In a further embodiment, a polypeptide fragment of the invention comprises or consists of any combination of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or all 8 of the above members. As described above, along with the leader sequence, DR
Amino acid residues constituting the 5-receptor extracellular domain, transmembrane domain and intracellular domain are estimated by computer analysis. Thus, as will be appreciated by those skilled in the art, the amino acid residues that make up these domains may vary slightly, depending on the criteria used to define each domain (eg, approximately 1
~ About 15 amino acid residues). Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.

【０１２２】 上記で議論されるように、ＤＲ５の１つまたは両方の細胞外システインリッチ
モチーフが、ＤＲ５とそのリガンドとの間の相互作用のために重要であると考え
られる。従って、好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドフラグメン
トは、配列番号２のアミノ酸残基３３〜８０および／または８１〜１２８を含む
か、あるいはそれらからなる。特定の実施形態において、本発明のポリペプチド
は、配列番号２に開示される両方の細胞外システインリッチモチーフを含むか、
あるいはこれらからなる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
もまた本発明に含まれる。As discussed above, one or both extracellular cysteine-rich motifs of DR5 are believed to be important for the interaction between DR5 and its ligand. Thus, in a preferred embodiment, a polypeptide fragment of the invention comprises or consists of amino acid residues 33-80 and / or 81-128 of SEQ ID NO: 2. In certain embodiments, the polypeptide of the invention comprises both extracellular cysteine-rich motifs disclosed in SEQ ID NO: 2,
Or consist of these. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.

【０１２３】 とりわけ、特に好ましい本発明のフラグメントは、ＤＲ５の構造的特性もしく
は機能的特性を含むか、あるいはそれらからなる、フラグメントである。そのよ
うなフラグメントは、ＤＲ５のα−へリックスおよびα−へリックス形成領域（
「α領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「β領域」）、ターンお
よびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイ
ル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面
形成領域、および高抗原性指標領域（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプロ
グラムのデフォルトパラメータを使用して同定されるように、１．５以上の抗原
性指標を有するアミノ酸残基を構成するポリペプチドの領域）を含むアミノ酸残
基を含むか、あるいは、これらの機能的ドメインの１、２、３、４、またはそれ
以上からなるアミノ酸残記載を含む。In particular, particularly preferred fragments of the invention are fragments which comprise or consist of the structural or functional properties of DR5. Such fragments contain the α-helix and α-helix forming region of DR5 (
“Α region”), β-sheet and β-sheet forming region (“β region”), turn and turn forming region (“turn region”), coil and coil forming region (“coil region”), hydrophilic region, Hydrophobic, alpha amphipathic, beta amphiphilic, surface forming, and high antigenic index regions (i.e., 1.5 or more, as identified using the default parameters of the Jameson-Wolf program) The amino acid residue comprising an amino acid residue having an antigenic index of 1), or an amino acid residue comprising 1, 2, 3, 4, or more of these functional domains including.

【０１２４】 特定の好ましい領域は、図３および表１に開示される領域であり、そして、図
１に示されるアミノ酸配列の分析によって同定される上述の型の領域を含むが、
それらに限定されず、そのような好ましい領域としては、これらのコンピュータ
プログラムのデフォルトパラメーターを使用して推定されるような、Ｇａｒｎｉ
ｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ推定α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域；Ｃｈ
ｏｕ−Ｆａｓｍａｎ推定α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；Ｋｙｔ
ｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ推定親水性領域および疎水性領域；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ
α両親媒性領域およびβ両親媒性領域；Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性
領域；Ｅｍｉｎｉ表面形成領域ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指標
領域が挙げられる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた
、本発明により含まれる。Certain preferred regions are those disclosed in FIG. 3 and Table 1, and include regions of the type described above identified by analysis of the amino acid sequence shown in FIG.
Without limitation, such preferred areas include Garni, as estimated using the default parameters of these computer programs.
er-Robson putative α region, β region, turn region, and coil region; Ch
ou-Fasman putative α region, β region, turn region and coil region; Kyt
e-Doolittle putative hydrophilic and hydrophobic regions; Eisenberg
α-amphiphilic region and β-amphiphilic region; Karplus-Schulz flexible region; Emini surface-forming region and Jameson-Wolf high antigenic index region. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included by the present invention.

【０１２５】 別の局面において、本発明は、１、２、３、４、５またはそれ以上の本発明の
ポリペプチドのエピトープ保有部分を含むか、あるいはそれらからなるペプチド
またはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本明細
書中に記載のポリペプチドの免疫原性または抗体性エピトープをである。これら
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。In another aspect, the invention provides a peptide or polypeptide comprising or consisting of 1, 2, 3, 4, 5, or more epitope-bearing portions of a polypeptide of the invention. The epitope of the polypeptide portion is an immunogenic or antibody epitope of a polypeptide described herein. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.

【０１２６】 抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が
結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択について、タンパク質配列の一
部に模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を慣用的に誘発し得ることが、当該分野で周知である。例えば、Ｓｕ
ｔｃｌｉｆｆｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｐ
ｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２１９：６６０〜６６６（１９８３）を参照のこと。タンパク質反応性の
血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列においてしばしば示され、
一組の単純な化学法則によって特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質
の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にもアミノ末端もしくはカル
ボキシ末端のいずれにも制限されない。For the selection of peptides or polypeptides bearing an antigenic epitope (ie, including regions of the protein molecule to which an antibody can bind), relatively short synthetic peptides that mimic a portion of the protein sequence may be partially It is well known in the art that antisera reactive with mimicked proteins can be routinely induced. For example, Su
tcliffe, Antibodies that react with w p
determined sites on proteins. Scien
ce 219: 660-666 (1983). Peptides that can elicit protein-reactive sera are often shown in the primary sequence of proteins,
It can be characterized by a set of simple chemical rules and is not restricted to the immunodominant region (ie, immunogenic epitope) of the intact protein, nor to the amino or carboxy terminus.

【０１２７】 従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発
明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起
するために有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７
７８（１９８４）の７７７頁を参照のこと。本発明の抗原性エピトープ保有ペプ
チドおよびポリペプチドは、好ましくは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内
に含まれる少なくとも７つ、より好ましくは少なくとも９つ、そして最も好まし
くは少なくとも約１５〜約３０の間のアミノ酸の配列を含む。本発明において、
抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくと
も６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少
なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、そ
して最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。免疫原性ま
たは抗原性のエピトープを含むか、またはこれらからなる好ましいポリペプチド
は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５
、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００のアミノ酸
残基長である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本
発明に含まれる。Accordingly, the antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are useful for raising antibodies (including monoclonal antibodies) that specifically bind to the polypeptides of the present invention. See, eg, Wilson et al., Cell 37: 767-7.
78 (1984) at page 777. The antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the invention preferably have at least 7, more preferably at least 9, and most preferably at least between about 15 and about 30 amino acids contained within the amino acid sequence of the polypeptide of the invention. Amino acid sequence. In the present invention,
The antigenic epitope is preferably at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, more preferably at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25 And most preferably between about 15 and about 30 amino acid sequences. Preferred polypeptides comprising or consisting of an immunogenic or antigenic epitope are at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55
, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, or 100 amino acid residues in length. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.

【０１２８】 抗原性エピトープは、例えば、このエピトープに特異的に結合する抗体（モノ
クローナル抗体を含む）を惹起するために有用である。さらに、抗原性エピトー
プは、イムノアッセイにおける標的分子として使用され得る（例えば、Ｗｉｌｓ
ｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと）。An antigenic epitope is useful, for example, for raising antibodies (including monoclonal antibodies) that specifically bind to this epitope. In addition, antigenic epitopes can be used as target molecules in immunoassays (eg, Wils
on et al., Cell 37: 767-778 (1984); Sutcliffe et al., Science 219: 660-666 (1983)).

【０１２９】 ＤＲ５レセプター特異的抗体を作製するために使用され得る抗原性ポリペプチ
ドまたはペプチドの非限定的な例としては、以下が挙げられる：配列番号２にお
ける約１１〜約５９のアミノ酸残基、配列番号２における約６８〜約１１３のア
ミノ酸残基、配列番号２における約１７３〜約２２０のアミノ酸残基、および配
列番号２における約２２４〜約３１９のアミノ酸残基を含むか、あるいはこれら
からなるポリペプチド。この文脈において、「約」は、いずれかの末端または両
方の末端で、いくつか（５、４、３、２または１）のアミノ酸残基だけ大きいか
または小さい、特定の列挙された範囲を含む。上記に示されるように、本発明者
らは、上記のポリペプチドフラグメントがＤＲ５レセプタータンパク質の抗原性
領域であることを決定した。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドもまた、本発明に含まれる。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate DR5 receptor-specific antibodies include: about 11 to about 59 amino acid residues in SEQ ID NO: 2, Includes or consists of about 68 to about 113 amino acid residues in SEQ ID NO: 2, about 173 to about 220 amino acid residues in SEQ ID NO: 2, and about 224 to about 319 amino acid residues in SEQ ID NO: 2 Polypeptide. In this context, “about” includes the specified recited range, either large or small by several (5, 4, 3, 2, or 1) amino acid residues at either or both termini. . As indicated above, we have determined that the above polypeptide fragment is an antigenic region of the DR5 receptor protein. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.

【０１３０】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、従来の任意の手段に
よって産生され得る。Ｒ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、「Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔ
ｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄｓ，」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１
３１−５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕ
ｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号においてさらに記
載される。[0130] The epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention can be produced by any conventional means. R. A. Houghten, "General Meth
Od for the Rapid Solid-Phase Syntheses
is of Large Numbers of Peptides: Spec
ifity of Antigen-Antibody Interact
ion at the Level of Individual Amino
Acids, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:51
31-5135 (1985). This "Simultaneous Multip
The Le Peptide Synthesis (SMPS) process is
Ghten et al. (1986) in U.S. Pat. No. 4,631,211.

【０１３１】 免疫原性エピトープは、例えば、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導す
るために使用され得る（例えばＳｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、
前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９
１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４
７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは、分
泌されたタンパク質を含む。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチド
は、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に抗体応答を誘発するために、アル
ブミンのようなキャリアータンパク質と一緒に存在し得るか、またはこのポリペ
プチドが十分な長さ（少なくとも約２５アミノ酸）である場合、このポリペプチ
ドはキャリアーなしで存在し得る。しかし、８〜１０程度のアミノ酸を含む免疫
原性エピトープは、少なくとも変性ポリペプチドにおける直鎖エピトープに結合
し得る（例えば、ウエスタンブロッティングにおいて）抗体を惹起するのに十分
であることが示された。[0131] Immunogenic epitopes can be used, for example, to elicit antibodies according to methods well known in the art (eg, Sutcliffe et al., Supra; Wilson et al.,
See above; Chow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 9
10-914; and Bittle et al. Gen. Virol. 66: 234
7-2354 (1985)). Preferred immunogenic epitopes include secreted proteins. The polypeptide comprising one or more immunogenic epitopes may be present together with a carrier protein such as albumin, or the polypeptide to elicit an antibody response in an animal system (eg, rabbit or mouse) If is long enough (at least about 25 amino acids), the polypeptide can be present without a carrier. However, immunogenic epitopes containing as few as 8 to 10 amino acids have been shown to be sufficient to elicit antibodies capable of binding at least linear epitopes on denatured polypeptides (eg, in Western blotting).

【０１３２】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法（インビボ免
疫化、インビトロ免疫化、およびファージディスプレイ法が挙げられるがこれら
に限定されない）に従って抗体を誘導するために使用され得る。例えば、Ｓｕｔ
ｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。イ
ンビボ免疫化が使用される場合、動物は、遊離ペプチドで免疫化され得るが；抗
ペプチド抗体の力価は、このペプチドの、キーホールインプレットヘモシアニン
（ＫＬＨ）または破傷風トキソイドのような高分子キャリアーとの結合によって
ブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプチドは、マレイミドベン
ゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを
使用してキャリアーと結合され得、一方、他のペプチドはグルタルアルデヒドの
ようなより一般的な連結剤を使用してキャリアーに結合され得る。例えばウサギ
、ラット、およびマウスのような動物は、遊離ペプチドまたはキャリアー結合ペ
プチドのいずれかで、例えば、約１００マイクログラムのペプチドまたはキャリ
アータンパク質およびＦｒｅｕｎｄアジュバントまたは免疫応答を刺激すること
が公知の他の任意のアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮
内注射によって免疫化される。例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使
用するＥＬＩＳＡアッセイで検出され得る抗ペプチド抗体の有用な力価を提供す
るために、例えば約２週間の間隔で、いくつかのブースターの注射が必要とされ
得る。免疫化動物由来の血清における抗ペプチド抗体の力価は、例えば、固体支
持体上のペプチドへの吸着および当該分野で周知の方法に従う選択された抗体の
溶出による、抗ペプチド抗体の選択によって増加され得る。The epitope-bearing polypeptides of the invention can be used to elicit antibodies according to methods well known in the art, including but not limited to in vivo immunization, in vitro immunization, and phage display methods. . For example, Sut
Cliffe et al., supra; Wilson et al., supra, and Bittle et al. G
en. Virol. , 66: 2347-2354 (1985). If in vivo immunization is used, the animal can be immunized with the free peptide; however, the titer of the anti-peptide antibody will be determined by the macromolecular carrier of the peptide, such as keyhole apple hemocyanin (KLH) or tetanus toxoid. Can be boosted. For example, a peptide containing a cysteine residue can be attached to a carrier using a linker such as maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), while other peptides are more common such as glutaraldehyde. It can be linked to a carrier using a linking agent. Animals such as, for example, rabbits, rats, and mice can be treated with either free peptide or carrier-bound peptide, for example, about 100 micrograms of peptide or carrier protein and Freund's adjuvant or other known to stimulate an immune response. It is immunized by intraperitoneal and / or intradermal injection of an emulsion containing any adjuvant. For example, several booster injections are required, for example, at intervals of about two weeks to provide useful titers of anti-peptide antibodies that can be detected in an ELISA assay using the free peptide adsorbed on a solid surface. Can be done. The titer of the anti-peptide antibody in the serum from the immunized animal is increased by selection of the anti-peptide antibody, for example, by adsorption to the peptide on a solid support and elution of the selected antibody according to methods well known in the art. obtain.

【０１３３】 当業者に理解されるように、本発明のＤＲ５レセプターポリペプチドおよび本
明細書中に記載されるそのエピトープ保有フラグメント（例えば、配列番号２の
アミノ酸残基１〜１３３のような細胞外ドメインの部分に対応する）は、異種ポ
リペプチド配列と組合わされ得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロ
ブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）またはその部分（ＣＨ１、ＣＨ２、
ＣＨ３、ならびにドメイン全体およびその部分の両方を含むその任意の組合わせ
）の定常ドメインに融合され得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タ
ンパク質は、精製を容易にし、そして増加した半減期を示す。これは、例えば、
ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリ
ンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質につ
いて示されている（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分によるジスルフィド
結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体ＤＲ５タンパク質または
タンパク質フラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効
率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：
３９５８−３９６４（１９９５））。上記のエピトープをコードする核酸はまた
、発現されたポリペプチドの検出および精製を助けるためのエピトープタグ（例
えば、赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（ｆｌａｇ ｔａｇ）
）として、目的の遺伝子と組合わされ得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによ
って記載される系は、ヒト細胞株において発現された未変性の融合タンパク質の
迅速な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７）。この系において、
目的の遺伝子は、この遺伝子のオープンリーディングフレームが６つのヒスチジ
ン残基からなるアミノ末端タグに翻訳的に融合されるように、ワクシニア組換え
プラスミド内にサブクローニングされる。このタグは、融合タンパク質のための
マトリックス結合ドメインとして役立つ。組換えワクシニアウイルスに感染した
細胞からの抽出物は、Ｎｉ2+ニトリロ酢酸−アガロースカラム上にロードされ、
そしてヒスチジンタグ付けされたタンパク質は、イミダゾール含有緩衝液で選択
的に溶出され得る。これらの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもま
た、本発明に含まれる。As will be appreciated by those skilled in the art, the DR5 receptor polypeptides of the present invention and epitope-bearing fragments thereof described herein (eg, extracellular such as amino acid residues 1-133 of SEQ ID NO: 2) (Corresponding to part of a domain) can be combined with a heterologous polypeptide sequence. For example, a polypeptide of the present invention may comprise an immunoglobulin (IgA, IgE, IgG, IgM) or a portion thereof (CH1, CH2,
CH3, and any combination thereof that includes both the entire domain and portions thereof), resulting in a chimeric polypeptide. These fusion proteins facilitate purification and exhibit an increased half-life. This is, for example,
A chimeric protein consisting of the first two domains of the human CD4-polypeptide and various domains of the constant region of the heavy or light chain of a mammalian immunoglobulin has been shown (EP A 394,827; Traunecker et al., Na.
cure 331: 84-86 (1988)). Fusion proteins with a disulfide-linked dimer structure by an IgG moiety may also be more efficient at binding and neutralizing other molecules than the monomeric DR5 protein or protein fragment alone (Funtoulakis et al., J. Biochem). .270:
3958-3964 (1995)). Nucleic acids encoding the above-described epitopes may also be epitope tags (eg, hemagglutinin ("HA") tags or flag tags) to aid detection and purification of the expressed polypeptide.
) Can be combined with the gene of interest. For example, the system described by Janknecht et al. Allows for the rapid purification of native fusion proteins expressed in human cell lines (Janknecht et al., 1991, Proc. Nat.
l. Acad. Sci. ScL USA 88: 8972-897). In this system,
The gene of interest is subcloned into a vaccinia recombination plasmid such that the open reading frame of the gene is translationally fused to an amino-terminal tag consisting of six histidine residues. This tag serves as a matrix binding domain for the fusion protein. Extracts from cells infected with the recombinant vaccinia virus were loaded onto Ni2 + nitriloacetic acid-agarose columns,
The histidine-tagged protein can then be selectively eluted with an imidazole containing buffer. Polynucleotides encoding these fusion proteins are also included in the present invention.

【０１３４】 遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、
および／またはコドンシャッフリング（集合的に「ＤＮＡシャッフリング」とい
われる）の技術は、ＤＲ５の活性を調節するために使用され得、それによってＤ
Ｒ５のアゴニストおよびアンタゴニストが効率的に作製される。一般的には、米
国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，
７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、なら
びにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ
，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；な
らびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）を参照のこと（これらの特許
および刊行物の各々は、ここで参考として援用される）。１つの実施形態におい
て、ＤＲ５ポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドの変化は、ＤＮＡシャ
ッフリングによって達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、同種組換えまたは
部位特異的組換えによる２つ以上のＤＮＡセグメントの、所望のＤＲ５分子への
集合を含む。別の実施形態において、ＤＲ５ポリヌクレオチドおよび対応するポ
リペプチドは、組換えの前の誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ラ
ンダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダムな突然変異誘発に供され
ることによって変化され得る。Gene shuffling, motif shuffling, exon shuffling,
The technique of and / or codon shuffling (collectively referred to as "DNA shuffling") can be used to modulate the activity of DR5, thereby
R5 agonists and antagonists are efficiently produced. In general, U.S. Patent Nos. 5,605,793; 5,811,238;
No. 721; 5,834,252; and 5,837,458; A. Et al., Curr. Opinion Biotechn
ol. 8: 724-33 (1997); Harayama, S .; Trends
Biotechnol. 16 (2): 76-82 (1998); Hansson.
, L .; O. J. et al. Mol. Biol. 287: 265-76 (1999); and Lorenzo, M .; M. And Blasco, R.A. Biotechni
ques 24 (2): 308-13 (1998) (each of these patents and publications is hereby incorporated by reference). In one embodiment, altering the DR5 polynucleotide and the corresponding polypeptide can be achieved by DNA shuffling. DNA shuffling involves the assembly of two or more DNA segments into the desired DR5 molecule by homologous or site-specific recombination. In another embodiment, the DR5 polynucleotide and corresponding polypeptide are subjected to random mutagenesis by error-prone PCR, random nucleotide insertion or other methods prior to recombination. Can be changed.

【０１３５】 別の実施形態において、ＤＲ５の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ド
メイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ
、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどで組換えられ得る。好ましい実施形
態において、異種分子は、例えばＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、
ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合体へテロ三量体ＬＴ−α２−βにお
いて見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ
、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ ９６
／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ ９７／３３８９９）、ＡＩＭ
−ＩＩ（国際公開番号ＷＯ ９７／３４９１１）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１８８（６）：１１８５−１１９０）、エンドカイン−α（国際公開番号
ＷＯ ９８／０７８８０）、Ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−α（国際公開番号ＷＯ ９
８／１８９２１）、ＯＰＧ、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＤＲ３（国際公開番号Ｗ
Ｏ ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ ９８／３２８５６）、Ｔ
Ｒ５（国際公開番号ＷＯ ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ ９
８／３０６９４）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ ９８／５６８９２
）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開
番号ＷＯ ９８／０６８４２）、ＴＲ１２、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３
／ＡＰＯ−３／ＷＳＬ／ＬＡＲＤ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／ＤＲ４／ＡＰＯ−２、Ｔ
ＲＡＩＬ−Ｒ２／ＤＲ５、ＤｃＲｌ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ３／ＴＲＩＤ／ＬＩＴ、Ｄ
ｃＲ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＣＡＤ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＭＰ、およびｖ−ＦＬ
ＩＰである。さらなる好ましい実施形態において、この異種分子は、例えばＦａ
ｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢの可溶化形態である。In another embodiment, one or more components, motifs, segments, portions, domains, fragments, etc. of DR5 are one or more components, motifs, segments, portions, domains, of one or more heterologous molecules. It can be recombined with a fragment or the like. In a preferred embodiment, the heterologous molecule is, for example, TNF-α, lymphotoxin-α (LT-α,
TNF-β), LT-β (found in complex heterotrimer LT-α2-β), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L
4-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-γ (International Publication No. WO 96
/ 14328), AIM-I (International Publication Number WO 97/33899), AIM
-II (International Publication Number WO 97/34911), APRIL (J. Exp. M)
ed. 188 (6): 1185-1190), endokine-α (International Publication Number WO 98/07880), Neutrokine-α (International Publication Number WO 9)
8/18921), OPG, nerve growth factor (NGF), DR3 (International Publication No. W
O 97/33904), DR4 (International Publication Number WO 98/32856), T
R5 (International Publication Number WO 98/30693), TR6 (International Publication Number WO 9
8/30694), TRANK, TR9 (International Publication Number WO 98/56892).
), TR10 (International Publication Number WO 98/54202), 312C2 (International Publication Number WO 98/06842), TR12, TNF-R1, TRAMP / DR3
/ APO-3 / WSL / LARD, TRAIL-R1 / DR4 / APO-2, T
RAIL-R2 / DR5, DcRl / TRAIL-R3 / TRID / LIT, D
cR2 / TRAIL-R4, CAD, TRAIL, TRAMP, and v-FL
IP. In a further preferred embodiment, the heterologous molecule is, for example, Fa
s, CD30, CD27, CD40 and 4-IBB solubilized forms.

【０１３６】 さらに好ましい実施形態において、この異種分子はＴＮＦファミリーの任意の
メンバーである。In a further preferred embodiment, the heterologous molecule is any member of the TNF family.

【０１３７】 ＤＲ５ポリペプチドの特徴を改善または変化させるために、タンパク質工学が
使用され得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術は、１つまたは複数のアミノ酸
の置換、欠失、付加、または融合タンパク質を含む新規な変異体タンパク質また
は「ムテイン」を生成するために使用され得る。このような改変されたポリペプ
チドは、例えば、増大した活性または増加した安定性を示し得る。さらに、これ
らは高収率で精製され得、そして、少なくとも特定の精製条件下および貯蔵条件
下で、対応する天然のポリペプチドよりも高い溶解性を示す。[0137] Protein engineering can be used to improve or alter the characteristics of a DR5 polypeptide. Recombinant DNA techniques known to those skilled in the art can be used to generate novel mutant proteins or "muteins", including one or more amino acid substitutions, deletions, additions, or fusion proteins. Such modified polypeptides can exhibit, for example, increased activity or increased stability. In addition, they can be purified in high yields and exhibit, at least under certain purification and storage conditions, higher solubility than the corresponding native polypeptide.

【０１３８】 例えば、膜会合タンパク質または分泌タンパク質の成熟形態の細胞外ドメイン
を含む多くのタンパク質について、生物学的機能の実質的な損失なく、１つ以上
のアミノ酸がＮ末端またはＣ末端から欠失され得ることが当該分野において公知
である。しかし、タンパク質のＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の
欠失がこのタンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じたとし
ても、他のＤＲ５の機能的活性は依然として保持され得る。例えば、多くの場合
において、短縮されたタンパク質が、ＤＲ５を認識する抗体（好ましくは、ＤＲ
５に特異的に結合する抗体）を誘導し、および／または結合する能力は、欠失の
大きさまたは位置に関係なく保持される。実際、６つのＤＲ５アミノ酸残基から
なるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。完全なタンパク質のＮ末端お
よび／またはＣ末端の残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫原性活性
を保有するか否かは、本明細書中に記載の、およびさもなくば当該分野で公知の
慣用的方法によって、容易に決定され得る。For example, for many proteins, including the extracellular domain of the mature form of a membrane-associated or secreted protein, one or more amino acids have been deleted from the N-terminus or C-terminus without substantial loss of biological function It is known in the art that this can be done. However, even though the deletion of one or more amino acids from the N-terminus or C-terminus of the protein results in a modification or loss of one or more biological functions of the protein, the functional activity of the other DR5 is still Can be retained. For example, in many cases, the truncated protein is an antibody that recognizes DR5 (preferably, DR5).
5) is retained regardless of the size or location of the deletion. In fact, peptides consisting of six DR5 amino acid residues can often elicit an immune response. Whether a particular polypeptide lacking the N- and / or C-terminal residues of an intact protein possesses such immunogenic activity is described herein and otherwise in the art. Can be easily determined by conventional methods known in US Pat.

【０１３９】 上記のように、タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失がこのタ
ンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じたとしても、他の機
能的活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、ＤＲ５リガンドに結合す
る能力）は依然として保持され得る。例えば、短縮されたＤＲ５ムテインが、こ
のポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導し、および／ま
たは結合する能力は、完全または成熟したポリペプチドの大部分未満の残基がＮ
末端から除去される場合、一般的に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残
基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫性の活性を保持しているか否かは
、本明細書中に記載され、そしてさもなくば当該分野で公知の慣用的な方法によ
って容易に決定され得る。おそらく、多数の欠失Ｎ末端アミノ酸残基を有するＤ
Ｒ５ムテインは、ある程度の生物学的活性または免疫原性の活性を保持し得る。As mentioned above, even though the deletion of one or more amino acids from the N-terminus of a protein results in the modification or loss of one or more biological functions of the protein, other functional activities (eg, For example, biological activity, ability to multimerize, ability to bind DR5 ligand) can still be retained. For example, the ability of a truncated DR5 mutein to induce and / or bind an antibody that recognizes the full or mature form of the polypeptide is such that less than the majority of the residues in the complete or mature polypeptide have N residues.
When removed from the terminus, it is generally retained. Whether a particular polypeptide lacking the N-terminal residue of an intact polypeptide retains such immunogenic activity is described herein and otherwise known in the art. Can be easily determined by a practical method. Possibly, D with a large number of deleted N-terminal amino acid residues
R5 muteins may retain some biological or immunogenic activity.

【０１４０】 ＤＲ５のいくつかのアミノ酸配列は、このタンパク質の構造または機能上の有
意な効果なく変化され得ることが、当該分野で認識されている。配列におけるこ
のような差異が意図される場合、活性を決定するタンパク質上に重大な領域が存
在することを記憶しておくべきである。このような領域は、通常リガンド結合部
位または死ドメインを構成する残基、またはこれらのドメインに影響する三次構
造を形成する残基を含む。It is recognized in the art that some amino acid sequences of DR5 can be changed without significant effect on the structure or function of the protein. If such differences in sequence are contemplated, it should be remembered that there is a critical region on the protein that determines activity. Such regions usually contain residues that make up the ligand binding site or death domain, or that form tertiary structures that affect these domains.

【０１４１】 従って、本発明は、図１に示されるＤＲ５アミノ酸配列のアミノ末端から４０
６位のアラニン残基までの１つ以上の残基の欠失を有するポリペプチド、および
このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。詳細
には、本発明は、図１の残基ｎ1−４１１のアミノ酸配列を含むか、あるいはこ
れらからなるポリペプチドを提供し、ここで、ｎ1は図１（これは、図１におけ
るアミノ酸残基がＮ末端からＣ末端に１〜４１１まで連続的に番号付けされてい
るが、配列番号２におけるアミノ酸残基は予想されるシグナルペプチドの位置を
反映して−５１〜３６０まで連続的に番号付けされていることを除いて、配列番
号２に示される配列と同一である）におけるアミノ酸残基の位置に対応する２〜
４０６の整数である。Therefore, the present invention relates to the DR5 amino acid sequence shown in FIG.
Further provided are polypeptides having a deletion of one or more residues up to the alanine residue at position 6, and polynucleotides encoding such polypeptides. In particular, the present invention comprises, or the amino acid sequence of residues n 1 -411 of FIG. 1, or to provide a polypeptide consisting, wherein, n 1 is 1 (which is the amino acid in Figure 1 Residues are numbered consecutively from N-terminal to C-terminal from 1 to 411, but amino acid residues in SEQ ID NO: 2 are consecutively from -51 to 360, reflecting the position of the predicted signal peptide. (Same as the sequence shown in SEQ ID NO: 2 except that they are numbered)
It is an integer of 406.

【０１４２】 より詳細には、本発明は、図１（これは、図１におけるアミノ酸残基がＮ末端
からＣ末端に１〜４１１まで連続的に番号付けされているが、配列番号２におけ
るアミノ酸残基は予想されるシグナルペプチドの位置を反映して−５１〜３６０
まで連続的に番号付けされていることを除いて、配列番号２に示される配列と同
一である）において示されるＤＲ５の配列の以下の残基からなる群から選択され
るメンバーのアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなるポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを提供する：Ｅ−２〜Ｓ−４１１；Ｑ−３〜Ｓ−４１
１；Ｒ−４〜Ｓ−４１１；Ｇ−５〜Ｓ−４１１；Ｑ−６〜Ｓ−４１１；Ｎ−７〜
Ｓ−４１１；Ａ−８〜Ｓ−４１１；Ｐ−９〜Ｓ−４１１；Ａ−１０〜Ｓ−４１１
；Ａ−１１〜Ｓ−４１１；Ｓ−１２〜Ｓ−４１１；Ｇ−１３〜Ｓ−４１１；Ａ−
１４〜Ｓ−４１１；Ｒ−１５〜Ｓ−４１１；Ｋ−１６〜Ｓ−４１１；Ｒ−１７〜
Ｓ−４１１；Ｈ−１８〜Ｓ−４１１；Ｇ−１９〜Ｓ−４１１；Ｐ−２０〜Ｓ−４
１１；Ｇ−２１〜Ｓ−４１１；Ｐ−２２〜Ｓ−４１１；Ｒ−２３〜Ｓ−４１１；
Ｅ−２４〜Ｓ−４１１；Ａ−２５〜Ｓ−４１１；Ｒ−２６〜Ｓ−４１１；Ｇ−２
７〜Ｓ−４１１；Ａ−２８〜Ｓ−４１１；Ｒ−２９〜Ｓ−４１１；Ｐ−３０〜Ｓ
−４１１；Ｇ−３１〜Ｓ−４１１；Ｐ−３２〜Ｓ−４１１；Ｒ−３３〜Ｓ−４１
１；Ｖ−３４〜Ｓ−４１１；Ｐ−３５〜Ｓ−４１１；Ｋ−３６〜Ｓ−４１１；Ｔ
−３７〜Ｓ−４１１；Ｌ−３８〜Ｓ−４１１；Ｖ−３９〜Ｓ−４１１；Ｌ−４０
〜Ｓ−４１１；Ｖ−４１〜Ｓ−４１１；Ｖ−４２〜Ｓ−４１１；Ａ−４３〜Ｓ−
４１１；Ａ−４４〜Ｓ−４１１；Ｖ−４５〜Ｓ−４１１；Ｌ−４６〜Ｓ−４１１
；Ｌ−４７〜Ｓ−４１１；Ｌ−４８〜Ｓ−４１１；Ｖ−４９〜Ｓ−４１１；Ｓ−
５０〜Ｓ−４１１；Ａ−５１〜Ｓ−４１１；Ｅ−５２〜Ｓ−４１１；Ｓ−５３〜
Ｓ−４１１；Ａ−５４〜Ｓ−４１１；Ｌ−５５〜Ｓ−４１１；Ｉ−５６〜Ｓ−４
１１；Ｔ−５７〜Ｓ−４１１；Ｑ−５８〜Ｓ−４１１；Ｑ−５９〜Ｓ−４１１；
Ｄ−６０〜Ｓ−４１１；Ｌ−６１〜Ｓ−４１１；Ａ−６２〜Ｓ−４１１；Ｐ−６
３〜Ｓ−４１１；Ｑ−６４〜Ｓ−４１１；Ｑ−６５〜Ｓ−４１１；Ｒ−６６〜Ｓ
−４１１；Ａ−６７〜Ｓ−４１１；Ａ−６８〜Ｓ−４１１；Ｐ−６９〜Ｓ−４１
１；Ｑ−７０〜Ｓ−４１１；Ｑ−７１〜Ｓ−４１１；Ｋ−７２〜Ｓ−４１１；Ｒ
−７３〜Ｓ−４１１；Ｓ−７４〜Ｓ−４１１；Ｓ−７５〜Ｓ−４１１；Ｐ−７６
〜Ｓ−４１１；Ｓ−７７〜Ｓ−４１１；Ｅ−７８〜Ｓ−４１１；Ｇ−７９〜Ｓ−
４１１；Ｌ−８０〜Ｓ−４１１；Ｃ−８１〜Ｓ−４１１；Ｐ−８２〜Ｓ−４１１
；Ｐ−８３〜Ｓ−４１１；Ｇ−８４〜Ｓ−４１１；Ｈ−８５〜Ｓ−４１１；Ｈ−
８６〜Ｓ−４１１；Ｉ−８７〜Ｓ−４１１；Ｓ−８８〜Ｓ−４１１；Ｅ−８９〜
Ｓ−４１１；Ｄ−９０〜Ｓ−４１１；Ｇ−９１〜Ｓ−４１１；Ｒ−９２〜Ｓ−４
１１；Ｄ−９３〜Ｓ−４１１；Ｃ−９４〜Ｓ−４１１；Ｉ−９５〜Ｓ−４１１；
Ｓ−９６〜Ｓ−４１１；Ｃ−９７〜Ｓ−４１１；Ｋ−９８〜Ｓ−４１１；Ｙ−９
９〜Ｓ−４１１；Ｇ−１００〜Ｓ−４１１；Ｑ−１０１〜Ｓ−４１１；Ｄ−１０
２〜Ｓ−４１１；Ｙ−１０３〜Ｓ−４１１；Ｓ−１０４〜Ｓ−４１１；Ｔ−１０
５〜Ｓ−４１１；Ｈ−１０６〜Ｓ−４１１；Ｗ−１０７〜Ｓ−４１１；Ｎ−１０
８〜Ｓ−４１１；Ｄ−１０９〜Ｓ−４１１；Ｌ−１１０〜Ｓ−４１１；Ｌ−１１
１〜Ｓ−４１１；Ｆ−１１２〜Ｓ−４１１；Ｃ−１１３〜Ｓ−４１１；Ｌ−１１
４〜Ｓ−４１１；Ｒ−１１５〜Ｓ−４１１；Ｃ−１１６〜Ｓ−４１１；Ｔ−１１
７〜Ｓ−４１１；Ｒ−１１８〜Ｓ−４１１；Ｃ−１１９〜Ｓ−４１１；Ｄ−１２
０〜Ｓ−４１１；Ｓ−１２１〜Ｓ−４１１；Ｇ−１２２〜Ｓ−４１１；Ｅ−１２
３〜Ｓ−４１１；Ｖ−１２４〜Ｓ−４１１；Ｅ−１２５〜Ｓ−４１１；Ｌ−１２
６〜Ｓ−４１１；Ｓ−１２７〜Ｓ−４１１；Ｐ−１２８〜Ｓ−４１１；Ｃ−１２
９〜Ｓ−４１１；Ｔ−１３０〜Ｓ−４１１；Ｔ−１３１〜Ｓ−４１１；Ｔ−１３
２〜Ｓ−４１１；Ｒ−１３３〜Ｓ−４１１；Ｎ−１３４〜Ｓ−４１１；Ｔ−１３
５〜Ｓ−４１１；Ｖ−１３６〜Ｓ−４１１；Ｃ−１３７〜Ｓ−４１１；Ｑ−１３
８〜Ｓ−４１１；Ｃ−１３９〜Ｓ−４１１；Ｅ−１４０〜Ｓ−４１１；Ｅ−１４
１〜Ｓ−４１１；Ｇ−１４２〜Ｓ−４１１；Ｔ−１４３〜Ｓ−４１１；Ｆ−１４
４〜Ｓ−４１１；Ｒ−１４５〜Ｓ−４１１；Ｅ−１４６〜Ｓ−４１１；Ｅ−１４
７〜Ｓ−４１１；Ｄ−１４８〜Ｓ−４１１；Ｓ−１４９〜Ｓ−４１１；Ｐ−１５
０〜Ｓ−４１１；Ｅ−１５１〜Ｓ−４１１；Ｍ−１５２〜Ｓ−４１１；Ｃ−１５
３〜Ｓ−４１１；Ｒ−１５４〜Ｓ−４１１；Ｋ−１５５〜Ｓ−４１１；Ｃ−１５
６〜Ｓ−４１１；Ｒ−１５７〜Ｓ−４１１；Ｔ−１５８〜Ｓ−４１１；Ｇ−１５
９〜Ｓ−４１１；Ｃ−１６０〜Ｓ−４１１；Ｐ−１６１〜Ｓ−４１１；Ｒ−１６
２〜Ｓ−４１１；Ｇ−１６３〜Ｓ−４１１；Ｍ−１６４〜Ｓ−４１１；Ｖ−１６
５〜Ｓ−４１１；Ｋ−１６６〜Ｓ−４１１；Ｖ−１６７〜Ｓ−４１１；Ｇ−１６
８〜Ｓ−４１１；Ｄ−１６９〜Ｓ−４１１；Ｃ−１７０〜Ｓ−４１１；Ｔ−１７
１〜Ｓ−４１１；Ｐ−１７２〜Ｓ−４１１；Ｗ−１７３〜Ｓ−４１１；Ｓ−１７
４〜Ｓ−４１１；Ｄ−１７５〜Ｓ−４１１；Ｉ−１７６〜Ｓ−４１１；Ｅ−１７
７〜Ｓ−４１１；Ｃ−１７８〜Ｓ−４１１；Ｖ−１７９〜Ｓ−４１１；Ｈ−１８
０〜Ｓ−４１１；Ｋ−１８１〜Ｓ−４１１；Ｅ−１８２〜Ｓ−４１１；Ｓ−１８
３〜Ｓ−４１１；Ｇ−１８４〜Ｓ−４１１；Ｉ−１８５〜Ｓ−４１１；Ｉ−１８
６〜Ｓ−４１１；Ｉ−１８７〜Ｓ−４１１；Ｇ−１８８〜Ｓ−４１１；Ｖ−１８
９〜Ｓ−４１１；Ｔ−１９０〜Ｓ−４１１；Ｖ−１９１〜Ｓ−４１１；Ａ−１９
２〜Ｓ−４１１；Ａ−１９３〜Ｓ−４１１；Ｖ−１９４〜Ｓ−４１１；Ｖ−１９
５〜Ｓ−４１１；Ｌ−１９６〜Ｓ−４１１；Ｉ−１９７〜Ｓ−４１１；Ｖ−１９
８〜Ｓ−４１１；Ａ−１９９〜Ｓ−４１１；Ｖ−２００〜Ｓ−４１１；Ｆ−２０
１〜Ｓ−４１１；Ｖ−２０２〜Ｓ−４１１；Ｃ−２０３〜Ｓ−４１１；Ｋ−２０
４〜Ｓ−４１１；Ｓ−２０５〜Ｓ−４１１；Ｌ−２０６〜Ｓ−４１１；Ｌ−２０
７〜Ｓ−４１１；Ｗ−２０８〜Ｓ−４１１；Ｋ−２０９〜Ｓ−４１１；Ｋ−２１
０〜Ｓ−４１１；Ｖ−２１１〜Ｓ−４１１；Ｌ−２１２〜Ｓ−４１１；Ｐ−２１
３〜Ｓ−４１１；Ｙ−２１４〜Ｓ−４１１；Ｌ−２１５〜Ｓ−４１１；Ｋ−２１
６〜Ｓ−４１１；Ｇ−２１７〜Ｓ−４１１；Ｉ−２１８〜Ｓ−４１１；Ｃ−２１
９〜Ｓ−４１１；Ｓ−２２０〜Ｓ−４１１；Ｇ−２２１〜Ｓ−４１１；Ｇ−２２
２〜Ｓ−４１１；Ｇ−２２３〜Ｓ−４１１；Ｇ−２２４〜Ｓ−４１１；Ｄ−２２
５〜Ｓ−４１１；Ｐ−２２６〜Ｓ−４１１；Ｅ−２２７〜Ｓ−４１１；Ｒ−２２
８〜Ｓ−４１１；Ｖ−２２９〜Ｓ−４１１；Ｄ−２３０〜Ｓ−４１１；Ｒ−２３
１〜Ｓ−４１１；Ｓ−２３２〜Ｓ−４１１；Ｓ−２３３〜Ｓ−４１１；Ｑ−２３
４〜Ｓ−４１１；Ｒ−２３５〜Ｓ−４１１；Ｐ−２３６〜Ｓ−４１１；Ｇ−２３
７〜Ｓ−４１１；Ａ−２３８〜Ｓ−４１１；Ｅ−２３９〜Ｓ−４１１；Ｄ−２４
０〜Ｓ−４１１；Ｎ−２４１〜Ｓ−４１１；Ｖ−２４２〜Ｓ−４１１；Ｌ−２４
３〜Ｓ−４１１；Ｎ−２４４〜Ｓ−４１１；Ｅ−２４５〜Ｓ−４１１；Ｉ−２４
６〜Ｓ−４１１；Ｖ−２４７〜Ｓ−４１１；Ｓ−２４８〜Ｓ−４１１；Ｉ−２４
９〜Ｓ−４１１；Ｌ−２５０〜Ｓ−４１１；Ｑ−２５１〜Ｓ−４１１；Ｐ−２５
２〜Ｓ−４１１；Ｔ−２５３〜Ｓ−４１１；Ｑ−２５４〜Ｓ−４１１；Ｖ−２５
５〜Ｓ−４１１；Ｐ−２５６〜Ｓ−４１１；Ｅ−２５７〜Ｓ−４１１；Ｑ−２５
８〜Ｓ−４１１；Ｅ−２５９〜Ｓ−４１１；Ｍ−２６０〜Ｓ−４１１；Ｅ−２６
１〜Ｓ−４１１；Ｖ−２６２〜Ｓ−４１１；Ｑ−２６３〜Ｓ−４１１；Ｅ−２６
４〜Ｓ−４１１；Ｐ−２６５〜Ｓ−４１１；Ａ−２６６〜Ｓ−４１１；Ｅ−２６
７〜Ｓ−４１１；Ｐ−２６８〜Ｓ−４１１；Ｔ−２６９〜Ｓ−４１１；Ｇ−２７
０〜Ｓ−４１１；Ｖ−２７１〜Ｓ−４１１；Ｎ−２７２〜Ｓ−４１１；Ｍ−２７
３〜Ｓ−４１１；Ｌ−２７４〜Ｓ−４１１；Ｓ−２７５〜Ｓ−４１１；Ｐ−２７
６〜Ｓ−４１１；Ｇ−２７７〜Ｓ−４１１；Ｅ−２７８〜Ｓ−４１１；Ｓ−２７
９〜Ｓ−４１１；Ｅ−２８０〜Ｓ−４１１；Ｈ−２８１〜Ｓ−４１１；Ｌ−２８
２〜Ｓ−４１１；Ｌ−２８３〜Ｓ−４１１；Ｅ−２８４〜Ｓ−４１１；Ｐ−２８
５〜Ｓ−４１１；Ａ−２８６〜Ｓ−４１１；Ｅ−２８７〜Ｓ−４１１；Ａ−２８
８〜Ｓ−４１１；Ｅ−２８９〜Ｓ−４１１；Ｒ−２９０〜Ｓ−４１１；Ｓ−２９
１〜Ｓ−４１１；Ｑ−２９２〜Ｓ−４１１；Ｒ−２９３〜Ｓ−４１１；Ｒ−２９
４〜Ｓ−４１１；Ｒ−２９５〜Ｓ−４１１；Ｌ−２９６〜Ｓ−４１１；Ｌ−２９
７〜Ｓ−４１１；Ｖ−２９８〜Ｓ−４１１；Ｐ−２９９〜Ｓ−４１１；Ａ−３０
０〜Ｓ−４１１；Ｎ−３０１〜Ｓ−４１１；Ｅ−３０２〜Ｓ−４１１；Ｇ−３０
３〜Ｓ−４１１；Ｄ−３０４〜Ｓ−４１１；Ｐ−３０５〜Ｓ−４１１；Ｔ−３０
６〜Ｓ−４１１；Ｅ−３０７〜Ｓ−４１１；Ｔ−３０８〜Ｓ−４１１；Ｌ−３０
９〜Ｓ−４１１；Ｒ−３１０〜Ｓ−４１１；Ｑ−３１１〜Ｓ−４１１；Ｃ−３１
２〜Ｓ−４１１；Ｆ−３１３〜Ｓ−４１１；Ｄ−３１４〜Ｓ−４１１；Ｄ−３１
５〜Ｓ−４１１；Ｆ−３１６〜Ｓ−４１１；Ａ−３１７〜Ｓ−４１１；Ｄ−３１
８〜Ｓ−４１１；Ｌ−３１９〜Ｓ−４１１；Ｖ−３２０〜Ｓ−４１１；Ｐ−３２
１〜Ｓ−４１１；Ｆ−３２２〜Ｓ−４１１；Ｄ−３２３〜Ｓ−４１１；Ｓ−３２
４〜Ｓ−４１１；Ｗ−３２５〜Ｓ−４１１；Ｅ−３２６〜Ｓ−４１１；Ｐ−３２
７〜Ｓ−４１１；Ｌ−３２８〜Ｓ−４１１；Ｍ−３２９〜Ｓ−４１１；Ｒ−３３
０〜Ｓ−４１１；Ｋ−３３１〜Ｓ−４１１；Ｌ−３３２〜Ｓ−４１１；Ｇ−３３
３〜Ｓ−４１１；Ｌ−３３４〜Ｓ−４１１；Ｍ−３３５〜Ｓ−４１１；Ｄ−３３
６〜Ｓ−４１１；Ｎ−３３７〜Ｓ−４１１；Ｅ−３３８〜Ｓ−４１１；Ｉ−３３
９〜Ｓ−４１１；Ｋ−３４０〜Ｓ−４１１；Ｖ−３４１〜Ｓ−４１１；Ａ−３４
２〜Ｓ−４１１；Ｋ−３４３〜Ｓ−４１１；Ａ−３４４〜Ｓ−４１１；Ｅ−３４
５〜Ｓ−４１１；Ａ−３４６〜Ｓ−４１１；Ａ−３４７〜Ｓ−４１１；Ｇ−３４
８〜Ｓ−４１１；Ｈ−３４９〜Ｓ−４１１；Ｒ−３５０〜Ｓ−４１１；Ｄ−３５
１〜Ｓ−４１１；Ｔ−３５２〜Ｓ−４１１；Ｌ−３５３〜Ｓ−４１１；Ｙ−３５
４〜Ｓ−４１１；Ｔ−３５５〜Ｓ−４１１；Ｍ−３５６〜Ｓ−４１１；Ｌ−３５
７〜Ｓ−４１１；Ｉ−３５８〜Ｓ−４１１；Ｋ−３５９〜Ｓ−４１１；Ｗ−３６
０〜Ｓ−４１１；Ｖ−３６１〜Ｓ−４１１；Ｎ−３６２〜Ｓ−４１１；Ｋ−３６
３〜Ｓ−４１１；Ｔ−３６４〜Ｓ−４１１；Ｇ−３６５〜Ｓ−４１１；Ｒ−３６
６〜Ｓ−４１１；Ｄ−３６７〜Ｓ−４１１；Ａ−３６８〜Ｓ−４１１；Ｓ−３６
９〜Ｓ−４１１；Ｖ−３７０〜Ｓ−４１１；Ｈ−３７１〜Ｓ−４１１；Ｔ−３７
２〜Ｓ−４１１；Ｌ−３７３〜Ｓ−４１１；Ｌ−３７４〜Ｓ−４１１；Ｄ−３７
５〜Ｓ−４１１；Ａ−３７６〜Ｓ−４１１；Ｌ−３７７〜Ｓ−４１１；Ｅ−３７
８〜Ｓ−４１１；Ｔ−３７９〜Ｓ−４１１；Ｌ−３８０〜Ｓ−４１１；Ｇ−３８
１〜Ｓ−４１１；Ｅ−３８２〜Ｓ−４１１；Ｒ−３８３〜Ｓ−４１１；Ｌ−３８
４〜Ｓ−４１１；Ａ−３８５〜Ｓ−４１１；Ｋ−３８６〜Ｓ−４１１；Ｑ−３８
７〜Ｓ−４１１；Ｋ−３８８〜Ｓ−４１１；Ｉ−３８９〜Ｓ−４１１；Ｅ−３９
０〜Ｓ−４１１；Ｄ−３９１〜Ｓ−４１１；Ｈ−３９２〜Ｓ−４１１；Ｌ−３９
３〜Ｓ−４１１；Ｌ−３９４〜Ｓ−４１１；Ｓ−３９５〜Ｓ−４１１；Ｓ−３９
６〜Ｓ−４１１；Ｇ−３９７〜Ｓ−４１１；Ｋ−３９８〜Ｓ−４１１；Ｆ−３９
９〜Ｓ−４１１；Ｍ−４００〜Ｓ−４１１；Ｙ−４０１〜Ｓ−４１１；Ｌ−４０
２〜Ｓ−４１１；Ｅ−４０３〜Ｓ−４１１；Ｇ−４０４〜Ｓ−４１１；Ｎ−４０
５〜Ｓ−４１１；およびＡ−４０６〜Ｓ−４１１。More specifically, the present invention relates to FIG. 1 (where the amino acid residues in FIG. 1 are numbered consecutively from N-terminal to C-terminal from 1 to 411, Residues are -51-360, reflecting the expected position of the signal peptide.
Identical to the sequence set forth in SEQ ID NO: 2 except that they are consecutively numbered up to) (SEQ ID NO: 2), comprising the amino acid sequence of a member selected from the group consisting of the following residues of the sequence of DR5: Or a polynucleotide encoding a polypeptide consisting thereof: E-2 to S-411; Q-3 to S-41.
1; R-4 to S-411; G-5 to S-411; Q-6 to S-411; N-7 to
S-411; A-8 to S-411; P-9 to S-411; A-10 to S-411.
A-11 to S-411; S-12 to S-411; G-13 to S-411;
14 to S-411; R-15 to S-411; K-16 to S-411; R-17 to
S-411; H-18 to S-411; G-19 to S-411; P-20 to S-4.
11; G-21 to S-411; P-22 to S-411; R-23 to S-411;
E-24 to S-411; A-25 to S-411; R-26 to S-411; G-2
7-S-411; A-28-S-411; R-29-S-411; P-30-S
-411; G-31 to S-411; P-32 to S-411; R-33 to S-41.
1; V-34 to S-411; P-35 to S-411; K-36 to S-411; T
-37 to S-411; L-38 to S-411; V-39 to S-411; L-40
V-41 to S-411; V-42 to S-411; A-43 to S-
411; A-44 to S-411; V-45 to S-411; L-46 to S-411.
L-47 to S-411; L-48 to S-411; V-49 to S-411;
50-S-411; A-51-S-411; E-52-S-411; S-53-
S-411; A-54 to S-411; L-55 to S-411; I-56 to S-4.
11; T-57 to S-411; Q-58 to S-411; Q-59 to S-411;
D-60 to S-411; L-61 to S-411; A-62 to S-411; P-6
3-S-411; Q-64 to S-411; Q-65 to S-411; R-66 to S
-411; A-67 to S-411; A-68 to S-411; P-69 to S-41.
1; Q-70 to S-411; Q-71 to S-411; K-72 to S-411; R
-73 to S-411; S-74 to S-411; S-75 to S-411; P-76
S-77 to S-411; E-78 to S-411; G-79 to S-
411; L-80 to S-411; C-81 to S-411; P-82 to S-411.
P-83 to S-411; G-84 to S-411; H-85 to S-411;
86-S-411; I-87-S-411; S-88-S-411; E-89-
S-411; D-90 to S-411; G-91 to S-411; R-92 to S-4.
11; D-93 to S-411; C-94 to S-411; I-95 to S-411;
S-96 to S-411; C-97 to S-411; K-98 to S-411; Y-9
9 to S-411; G-100 to S-411; Q-101 to S-411; D-10
2-S-411; Y-103 to S-411; S-104 to S-411; T-10
5-S-411; H-106 to S-411; W-107 to S-411; N-10
8-S-411; D-109 to S-411; L-110 to S-411; L-11
1 to S-411; F-112 to S-411; C-113 to S-411; L-11
4-S-411; R-115 to S-411; C-116 to S-411; T-11
7 to S-411; R-118 to S-411; C-119 to S-411; D-12
0 to S-411; S-121 to S-411; G-122 to S-411; E-12
3-S-411; V-124 to S-411; E-125 to S-411; L-12
6 to S-411; S-127 to S-411; P-128 to S-411; C-12
9 to S-411; T-130 to S-411; T-131 to S-411; T-13
2-S-411; R-133 to S-411; N-134 to S-411; T-13
V-136 to S-411; C-137 to S-411; Q-13
8-S-411; C-139 to S-411; E-140 to S-411; E-14
1 to S-411; G-142 to S-411; T-143 to S-411; F-14
4-S-411; R-145 to S-411; E-146 to S-411; E-14
7 to S-411; D-148 to S-411; S-149 to S-411; P-15
0 to S-411; E-151 to S-411; M-152 to S-411; C-15
3-S-411; R-154 to S-411; K-155 to S-411; C-15
6 to S-411; R-157 to S-411; T-158 to S-411; G-15
9 to S-411; C-160 to S-411; P-161 to S-411; R-16
G-163 to S-411; M-164 to S-411; V-16
K-166 to S-411; V-167 to S-411; G-16
8-S-411; D-169 to S-411; C-170 to S-411; T-17
1 to S-411; P-172 to S-411; W-173 to S-411; S-17
4-S-411; D-175 to S-411; I-176 to S-411; E-17
7 to S-411; C-178 to S-411; V-179 to S-411; H-18
0 to S-411; K-181 to S-411; E-182 to S-411; S-18
3-S-411; G-184 to S-411; I-185 to S-411; I-18
6 to S-411; I-187 to S-411; G-188 to S-411; V-18
9-S-411; T-190-S-411; V-191-S-411; A-19
A-193 to S-411; V-194 to S-411; V-19
L-196 to S-411; I-197 to S-411; V-19
8-S-411; A-199 to S-411; V-200 to S-411; F-20
1 to S-411; V-202 to S-411; C-203 to S-411; K-20
4-S-411; S-205 to S-411; L-206 to S-411; L-20
7-S-411; W-208-S-411; K-209-S-411; K-21
0-S-411; V-211-S-411; L-212-S-411; P-21
3-S-411; Y-214 to S-411; L-215 to S-411; K-21
6 to S-411; G-217 to S-411; I-218 to S-411; C-21
9 to S-411; S-220 to S-411; G-221 to S-411; G-22
G-223 to S-411; G-224 to S-411; D-22
5-S-411; P-226 to S-411; E-227 to S-411; R-22
8 to S-411; V-229 to S-411; D-230 to S-411; R-23
1 to S-411; S-232 to S-411; S-233 to S-411; Q-23
4-S-411; R-235 to S-411; P-236 to S-411; G-23
7 to S-411; A-238 to S-411; E-239 to S-411; D-24
N-241 to S-411; V-242 to S-411; L-24
3-S-411; N-244 to S-411; E-245 to S-411; I-24
6 to S-411; V-247 to S-411; S-248 to S-411; I-24
9-S-411; L-250-S-411; Q-251-S-411; P-25
2-S-411; T-253 to S-411; Q-254 to S-411; V-25
5-S-411; P-256 to S-411; E-257 to S-411; Q-25
8-S-411; E-259 to S-411; M-260 to S-411; E-26
1-S-411; V-262 to S-411; Q-263 to S-411; E-26
4-S-411; P-265 to S-411; A-266 to S-411; E-26
7 to S-411; P-268 to S-411; T-269 to S-411; G-27
0 to S-411; V-271 to S-411; N-272 to S-411; M-27
3-S-411; L-274 to S-411; S-275 to S-411; P-27
6-S-411; G-277-S-411; E-278-S-411; S-27
9-S-411; E-280-S-411; H-281-S-411; L-28
2-S-411; L-283 to S-411; E-284 to S-411; P-28
5-S-411; A-286 to S-411; E-287 to S-411; A-28
8-S-411; E-289-S-411; R-290-S-411; S-29
1-S-411; Q-292-S-411; R-293-S-411; R-29
4-S-411; R-295-S-411; L-296-S-411; L-29
7 to S-411; V-298 to S-411; P-299 to S-411; A-30
0 to S-411; N-301 to S-411; E-302 to S-411; G-30
3-S-411; D-304-S-411; P-305-S-411; T-30
6 to S-411; E-307 to S-411; T-308 to S-411; L-30
9-S-411; R-310-S-411; Q-311-S-411; C-31
2-S-411; F-313 to S-411; D-314 to S-411; D-31
F-316 to S-411; A-317 to S-411; D-31
8-S-411; L-319 to S-411; V-320 to S-411; P-32.
1 to S-411; F-322 to S-411; D-323 to S-411; S-32
4-S-411; W-325-S-411; E-326-S-411; P-32
7-S-411; L-328-S-411; M-329-S-411; R-33
0-S-411; K-331-S-411; L-332-S-411; G-33
L-334 to S-411; M-335 to S-411; D-33
6 to S-411; N-337 to S-411; E-338 to S-411; I-33
9-S-411; K-340-S-411; V-341-S-411; A-34
2-S-411; K-343 to S-411; A-344 to S-411; E-34
A-346 to S-411; A-347 to S-411; G-34
8-S-411; H-349-S-411; R-350-S-411; D-35
1-S-411; T-352-S-411; L-353-S-411; Y-35
4-S-411; T-355-S-411; M-356-S-411; L-35
7-S-411; I-358-S-411; K-359-S-411; W-36
V-361 to S-411; N-362 to S-411; K-36
3-S-411; T-364-S-411; G-365-S-411; R-36
6-S-411; D-367-S-411; A-368-S-411; S-36
9-S-411; V-370-S-411; H-371-S-411; T-37
2-S-411; L-373 to S-411; L-374 to S-411; D-37
5-S-411; A-376 to S-411; L-377 to S-411; E-37
8-S-411; T-379-S-411; L-380-S-411; G-38
1-S-411; E-382-S-411; R-383-S-411; L-38
4-S-411; A-385 to S-411; K-386 to S-411; Q-38
7-S-411; K-388-S-411; I-389-S-411; E-39
0-S-411; D-391-S-411; H-392-S-411; L-39
3-S-411; L-394-S-411; S-395-S-411; S-39
6-S-411; G-397-S-411; K-398-S-411; F-39
9-S-411; M-400-S-411; Y-401-S-411; L-40
2-S-411; E-403 to S-411; G-404 to S-411; N-40
5-S-411; and A-406-S-411.

【０１４３】 本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少
なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、
または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらからな
る核酸分子に関する。本発明はさらに、上記のポリペプチドに少なくとも８０％
、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同
一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこ
れらからなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融
合した上記のポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドによってコー
ドされるポリペプチドもまた、本発明に含まれる。The present invention also relates to polynucleotide sequences encoding the above-described polypeptides, wherein at least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%,
Or a nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide sequence that is 99% identical. The invention further provides that the above polypeptide has at least 80%
, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to a nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide sequence. The invention also includes the above polynucleotide fused to a heterologous polynucleotide sequence. The polypeptides encoded by these polynucleotides are also included in the present invention.

【０１４４】 別の実施形態において、ＤＲ５ポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｎ2−１
８４で記載され得、ここで、ｎ2は図１において同定されるアミノ酸配列に対応
する１〜１７９の数である（または、ｎ2は配列番号２において同定されるアミ
ノ酸配列に対応する−５１〜１２８の数である）。特定の実施形態において、本
発明のＤＲ５のＮ末端欠失は、図１（これは、図１におけるアミノ酸残基がＮ末
端からＣ末端に１〜４１１まで連続的に番号付けされているが、配列番号２にお
けるアミノ酸残基は予想されるシグナルペプチドの位置を反映して−５１〜３６
０まで連続的に番号付けされていることを除いて、配列番号２に示される配列と
同一である）において示されるＤＲ５細胞外ドメイン配列の以下の残基のアミノ
酸残基からなる群から選択されるメンバーを含むか、あるいはこれらからなる：
Ｅ−２〜Ｇ−１８４；Ｑ−３〜Ｇ−１８４；Ｒ−４〜Ｇ−１８４；Ｇ−５〜Ｇ−
１８４；Ｑ−６〜Ｇ−１８４；Ｎ−７〜Ｇ−１８４；Ａ−８〜Ｇ−１８４；Ｐ−
９〜Ｇ−１８４；Ａ−１０〜Ｇ−１８４；Ａ−１１〜Ｇ−１８４；Ｓ−１２〜Ｇ
−１８４；Ｇ−１３〜Ｇ−１８４；Ａ−１４〜Ｇ−１８４；Ｒ−１５〜Ｇ−１８
４；Ｋ−１６〜Ｇ−１８４；Ｒ−１７〜Ｇ−１８４；Ｈ−１８〜Ｇ−１８４；Ｇ
−１９〜Ｇ−１８４；Ｐ−２０〜Ｇ−１８４；Ｇ−２１〜Ｇ−１８４；Ｐ−２２
〜Ｇ−１８４；Ｒ−２３〜Ｇ−１８４；Ｅ−２４〜Ｇ−１８４；Ａ−２５〜Ｇ−
１８４；Ｒ−２６〜Ｇ−１８４；Ｇ−２７〜Ｇ−１８４；Ａ−２８〜Ｇ−１８４
；Ｒ−２９〜Ｇ−１８４；Ｐ−３０〜Ｇ−１８４；Ｇ−３１〜Ｇ−１８４；Ｐ−
３２〜Ｇ−１８４；Ｒ−３３〜Ｇ−１８４；Ｖ−３４〜Ｇ−１８４；Ｐ−３５〜
Ｇ−１８４；Ｋ−３６〜Ｇ−１８４；Ｔ−３７〜Ｇ−１８４；Ｌ−３８〜Ｇ−１
８４；Ｖ−３９〜Ｇ−１８４；Ｌ−４０〜Ｇ−１８４；Ｖ−４１〜Ｇ−１８４；
Ｖ−４２〜Ｇ−１８４；Ａ−４３〜Ｇ−１８４；Ａ−４４〜Ｇ−１８４；Ｖ−４
５〜Ｇ−１８４；Ｌ−４６〜Ｇ−１８４；Ｌ−４７〜Ｇ−１８４；Ｌ−４８〜Ｇ
−１８４；Ｖ−４９〜Ｇ−１８４；Ｓ−５０〜Ｇ−１８４；Ａ−５１〜Ｇ−１８
４；Ｅ−５２〜Ｇ−１８４；Ｓ−５３〜Ｇ−１８４；Ａ−５４〜Ｇ−１８４；Ｌ
−５５〜Ｇ−１８４；Ｉ−５６〜Ｇ−１８４；Ｔ−５７〜Ｇ−１８４；Ｑ−５８
〜Ｇ−１８４；Ｑ−５９〜Ｇ−１８４；Ｄ−６０〜Ｇ−１８４；Ｌ−６１〜Ｇ−
１８４；Ａ−６２〜Ｇ−１８４；Ｐ−６３〜Ｇ−１８４；Ｑ−６４〜Ｇ−１８４
；Ｑ−６５〜Ｇ−１８４；Ｒ−６６〜Ｇ−１８４；Ａ−６７〜Ｇ−１８４；Ａ−
６８〜Ｇ−１８４；Ｐ−６９〜Ｇ−１８４；Ｑ−７０〜Ｇ−１８４；Ｑ−７１〜
Ｇ−１８４；Ｋ−７２〜Ｇ−１８４；Ｒ−７３〜Ｇ−１８４；Ｓ−７４〜Ｇ−１
８４；Ｓ−７５〜Ｇ−１８４；Ｐ−７６〜Ｇ−１８４；Ｓ−７７〜Ｇ−１８４；
Ｅ−７８〜Ｇ−１８４；Ｇ−７９〜Ｇ−１８４；Ｌ−８０〜Ｇ−１８４；Ｃ−８
１〜Ｇ−１８４；Ｐ−８２〜Ｇ−１８４；Ｐ−８３〜Ｇ−１８４；Ｇ−８４〜Ｇ
−１８４；Ｈ−８５〜Ｇ−１８４；Ｈ−８６〜Ｇ−１８４；Ｉ−８７〜Ｇ−１８
４；Ｓ−８８〜Ｇ−１８４；Ｅ−８９〜Ｇ−１８４；Ｄ−９０〜Ｇ−１８４；Ｇ
−９１〜Ｇ−１８４；Ｒ−９２〜Ｇ−１８４；Ｄ−９３〜Ｇ−１８４；Ｃ−９４
〜Ｇ−１８４；Ｉ−９５〜Ｇ−１８４；Ｓ−９６〜Ｇ−１８４；Ｃ−９７〜Ｇ−
１８４；Ｋ−９８〜Ｇ−１８４；Ｙ−９９〜Ｇ−１８４；Ｇ−１００〜Ｇ−１８
４；Ｑ−１０１〜Ｇ−１８４；Ｄ−１０２〜Ｇ−１８４；Ｙ−１０３〜Ｇ−１８
４；Ｓ−１０４〜Ｇ−１８４；Ｔ−１０５〜Ｇ−１８４；Ｈ−１０６〜Ｇ−１８
４；Ｗ−１０７〜Ｇ−１８４；Ｎ−１０８〜Ｇ−１８４；Ｄ−１０９〜Ｇ−１８
４；Ｌ−１１０〜Ｇ−１８４；Ｌ−１１１〜Ｇ−１８４；Ｆ−１１２〜Ｇ−１８
４；Ｃ−１１３〜Ｇ−１８４；Ｌ−１１４〜Ｇ−１８４；Ｒ−１１５〜Ｇ−１８
４；Ｃ−１１６〜Ｇ−１８４；Ｔ−１１７〜Ｇ−１８４；Ｒ−１１８〜Ｇ−１８
４；Ｃ−１１９〜Ｇ−１８４；Ｄ−１２０〜Ｇ−１８４；Ｓ−１２１〜Ｇ−１８
４；Ｇ−１２２〜Ｇ−１８４；Ｅ−１２３〜Ｇ−１８４；Ｖ−１２４〜Ｇ−１８
４；Ｅ−１２５〜Ｇ−１８４；Ｌ−１２６〜Ｇ−１８４；Ｓ−１２７〜Ｇ−１８
４；Ｐ−１２８〜Ｇ−１８４；Ｃ−１２９〜Ｇ−１８４；Ｔ−１３０〜Ｇ−１８
４；Ｔ−１３１〜Ｇ−１８４；Ｔ−１３２〜Ｇ−１８４；Ｒ−１３３〜Ｇ−１８
４；Ｎ−１３４〜Ｇ−１８４；Ｔ−１３５〜Ｇ−１８４；Ｖ−１３６〜Ｇ−１８
４；Ｃ−１３７〜Ｇ−１８４；Ｑ−１３８〜Ｇ−１８４；Ｃ−１３９〜Ｇ−１８
４；Ｅ−１４０〜Ｇ−１８４；Ｅ−１４１〜Ｇ−１８４；Ｇ−１４２〜Ｇ−１８
４；Ｔ−１４３〜Ｇ−１８４；Ｆ−１４４〜Ｇ−１８４；Ｒ−１４５〜Ｇ−１８
４；Ｅ−１４６〜Ｇ−１８４；Ｅ−１４７〜Ｇ−１８４；Ｄ−１４８〜Ｇ−１８
４；Ｓ−１４９〜Ｇ−１８４；Ｐ−１５０〜Ｇ−１８４；Ｅ−１５１〜Ｇ−１８
４；Ｍ−１５２〜Ｇ−１８４；Ｃ−１５３〜Ｇ−１８４；Ｒ−１５４〜Ｇ−１８
４；Ｋ−１５５〜Ｇ−１８４；Ｃ−１５６〜Ｇ−１８４；Ｒ−１５７〜Ｇ−１８
４；Ｔ−１５８〜Ｇ−１８４；Ｇ−１５９〜Ｇ−１８４；Ｃ−１６０〜Ｇ−１８
４；Ｐ−１６１〜Ｇ−１８４；Ｒ−１６２〜Ｇ−１８４；Ｇ−１６３〜Ｇ−１８
４；Ｍ−１６４〜Ｇ−１８４；Ｖ−１６５〜Ｇ−１８４；Ｋ−１６６〜Ｇ−１８
４；Ｖ−１６７〜Ｇ−１８４；Ｇ−１６８〜Ｇ−１８４；Ｄ−１６９〜Ｇ−１８
４；Ｃ−１７０〜Ｇ−１８４；Ｔ−１７１〜Ｇ−１８４；Ｐ−１７２〜Ｇ−１８
４；Ｗ−１７３〜Ｇ−１８４；Ｓ−１７４〜Ｇ−１８４；Ｄ−１７５〜Ｇ−１８
４；Ｉ−１７６〜Ｇ−１８４；Ｅ−１７７〜Ｇ−１８４；Ｃ−１７８〜Ｇ−１８
４；およびＶ−１７９〜Ｇ−１８４。In another embodiment, the N-terminal deletion of the DR5 polypeptide has the general formula n 2 -1
84, where n 2 is a number from 1 to 179 corresponding to the amino acid sequence identified in FIG. 1 (or n 2 is −51 corresponding to the amino acid sequence identified in SEQ ID NO: 2). ~ 128). In certain embodiments, the N-terminal deletion of DR5 of the present invention is shown in FIG. 1 (where the amino acid residues in FIG. 1 are numbered consecutively from N-terminal to C-terminal from 1 to 411, The amino acid residues in SEQ ID NO: 2 reflect the position of the predicted signal peptide from -51 to 36.
The same as the sequence shown in SEQ ID NO: 2 except that they are numbered consecutively to 0)) from the group consisting of the following residues of the DR5 extracellular domain sequence shown in Includes or consists of:
E-2 to G-184; Q-3 to G-184; R-4 to G-184; G-5 to G-
184; Q-6 to G-184; N-7 to G-184; A-8 to G-184;
9 to G-184; A-10 to G-184; A-11 to G-184; S-12 to G
-184; G-13 to G-184; A-14 to G-184; R-15 to G-18
4; K-16 to G-184; R-17 to G-184; H-18 to G-184; G
-19 to G-184; P-20 to G-184; G-21 to G-184; P-22
-G-184; R-23 to G-184; E-24 to G-184; A-25 to G-
184; R-26 to G-184; G-27 to G-184; A-28 to G-184
R-29 to G-184; P-30 to G-184; G-31 to G-184;
32-G-184; R-33 to G-184; V-34 to G-184; P-35
G-184; K-36 to G-184; T-37 to G-184; L-38 to G-1
84; V-39 to G-184; L-40 to G-184;
V-42 to G-184; A-43 to G-184; A-44 to G-184; V-4
L-46 to G-184; L-47 to G-184; L-48 to G
-184; V-49 to G-184; S-50 to G-184; A-51 to G-18.
4; E-52 to G-184; S-53 to G-184; A-54 to G-184; L
-55 to G-184; I-56 to G-184; T-57 to G-184; Q-58.
-G-184; Q-59 to G-184; D-60 to G-184; L-61 to G-.
184; A-62 to G-184; P-63 to G-184; Q-64 to G-184
Q-65 to G-184; R-66 to G-184; A-67 to G-184;
68-G-184; P-69-G-184; Q-70-G-184;
G-184; K-72 to G-184; R-73 to G-184; S-74 to G-1
84; S-75 to G-184; P-76 to G-184; S-77 to G-184;
E-78 to G-184; G-79 to G-184; L-80 to G-184; C-8
P-82 to G-184; P-83 to G-184; G-84 to G
-184; H-85 to G-184; H-86 to G-184; I-87 to G-18.
4; S-88 to G-184; E-89 to G-184; D-90 to G-184; G
-91 to G-184; R-92 to G-184; D-93 to G-184; C-94.
G-184; I-95 to G-184; S-96 to G-184; C-97 to G-.
184; K-98 to G-184; Y-99 to G-184; G-100 to G-18
4: Q-101 to G-184; D-102 to G-184; Y-103 to G-18
4; S-104 to G-184; T-105 to G-184; H-106 to G-18
4; W-107 to G-184; N-108 to G-184; D-109 to G-18
4; L-110 to G-184; L-111 to G-184; F-112 to G-18
4; C-113 to G-184; L-114 to G-184; R-115 to G-18
4; C-116 to G-184; T-117 to G-184; R-118 to G-18
4; C-119 to G-184; D-120 to G-184; S-121 to G-18
4; G-122 to G-184; E-123 to G-184; V-124 to G-18
4; E-125 to G-184; L-126 to G-184; S-127 to G-18
4; P-128 to G-184; C-129 to G-184; T-130 to G-18
4; T-131 to G-184; T-132 to G-184; R-133 to G-18
4; N-134 to G-184; T-135 to G-184; V-136 to G-18
4; C-137 to G-184; Q-138 to G-184; C-139 to G-18
4; E-140 to G-184; E-141 to G-184; G-142 to G-18
4; T-143 to G-184; F-144 to G-184; R-145 to G-18
4; E-146 to G-184; E-147 to G-184; D-148 to G-18
4: S-149 to G-184; P-150 to G-184; E-151 to G-18
4; M-152 to G-184; C-153 to G-184; R-154 to G-18
4; K-155 to G-184; C-156 to G-184; R-157 to G-18
4; T-158 to G-184; G-159 to G-184; C-160 to G-18
4: P-161 to G-184; R-162 to G-184; G-163 to G-18
4; M-164 to G-184; V-165 to G-184; K-166 to G-18
4; V-167 to G-184; G-168 to G-184; D-169 to G-18
4; C-170 to G-184; T-171 to G-184; P-172 to G-18
4; W-173 to G-184; S-174 to G-184; D-175 to G-18
4; I-176 to G-184; E-177 to G-184; C-178 to G-18
4; and V-179 to G-184.

【０１４５】 本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、少
なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、
または９９％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはその配列からなる
核酸分子に関する。本発明はさらに、上記のポリペプチドと、少なくとも８０％
、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同
一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはそ
の配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に
融合される上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチドによ
りコードされるポリペプチドはまた、本発明により含まれる。The present invention also provides a polynucleotide sequence encoding a polypeptide as defined above, comprising at least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%,
Or, a nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide sequence that is 99% identical. The invention further relates to a polypeptide as described above comprising at least 80%
, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to a nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide sequence. The invention also includes the above polynucleotide sequences fused to a heterologous polynucleotide sequence. The polypeptides encoded by these polynucleotides are also included by the present invention.

【０１４６】 また上述のように、タンパク質のＣ末端から１つ以上のアミノ酸の欠失が、タ
ンパク質の１つ以上の生物学的機能の欠損の改変を生じる場合でさえ、他の機能
的な活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、ＤＮ４リガンドに結合す
る能力（例えば、ＴＲＡＩＬ））は、なお保持され得る。完全ポリペプチドまた
は成熟ポリペプチドの大多数ではない残基がＣ末端から除去される場合、例えば
、ポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導および／また
はそれに結合する短縮されたＤＲ５ムテインの能力が、一般に保持される。完全
ポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活
性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣例的な方法および当該分野で
公知の他の方法により容易に決定され得る。多数の欠失Ｃ末端アミノ酸残基を有
するＤＲ５ムテインは、おそらく、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性
を保持し得るだろう。事実、６個ものＤＲ５アミノ酸残基から構成されるペプチ
ドは、しばしば、免疫応答を惹起し得る。Also, as described above, other functional activities, even when deletion of one or more amino acids from the C-terminus of the protein results in alteration of the deficiency of one or more biological functions of the protein. (Eg, biological activity, ability to multimerize, ability to bind DN4 ligand (eg, TRAIL)) can still be retained. If less than a majority of residues of the complete or mature polypeptide are removed from the C-terminus, for example, a shortened DR5 that induces and / or binds to an antibody that recognizes the complete or mature form of the polypeptide Mutein's ability is generally retained. Whether a particular polypeptide lacking the C-terminal residue of a complete polypeptide will retain such immunological activity will depend on routine methods described herein and other methods known in the art. Can easily be determined. DR5 muteins with a large number of deleted C-terminal amino acid residues are likely to retain some biological or immunogenic activity. In fact, peptides composed of as many as six DR5 amino acid residues can often elicit an immune response.

【０１４７】 従って、本発明はさらに、図１（配列番号２）に示されるＤＲ５ポリペプチド
のアミノ酸配列のカルボキシ末端から、位置番号５２のグルタミン酸残基まで、
欠失される１つ以上の残基を有するポリペプチドおよびこのようなポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１（すなわち、
配列番号２）の残基５２−ｍ1のアミノ酸配列を含むか、あるいはそのアミノ酸
からなるポリペプチドを提供し、ここでｍ1は、図１（または、ここでｍ1は、配
列番号２におけるアミノ酸残基の位置に対応する６から３６０までの整数である
）におけるアミノ酸残基の位置に対応する５７から４１０までの整数である。よ
り特に、本発明は、図１において示されるＤＲ５配列の以下の残基からなる群よ
り選択されるメンバーを含むか、あるいはそのメンバーからなるポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを提供する（これは、図１におけるアミノ酸残基が
Ｎ末端〜Ｃ末端まで、１〜４１１まで連続して番号を付けられる他は、配列番号
２として示される配列と同一であり、一方配列番号２におけるアミノ酸残基は、
５１〜３６０まで連続して番号を付けられ、予測されたシグナルペプチドの位置
に反映する）：Accordingly, the present invention further relates to the DR5 polypeptide amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) from the carboxy terminus to the glutamic acid residue at position 52.
Provided are polypeptides having one or more residues deleted and polynucleotides encoding such polypeptides. In particular, the present invention relates to FIG.
Or comprising the amino acid sequence of residues 52-m 1 of SEQ ID NO: 2), or to provide a polypeptide consisting of the amino acid, wherein m 1 is 1 (or, where m 1 is SEQ ID NO: 2 (An integer from 6 to 360 corresponding to the position of the amino acid residue). More particularly, the present invention provides a polynucleotide encoding a polypeptide comprising or consisting of a member selected from the group consisting of the following residues of the DR5 sequence shown in FIG. 1 is identical to the sequence shown as SEQ ID NO: 2, except that the amino acid residues in FIG. 1 are numbered consecutively from N-terminal to C-terminal, from 1 to 411,
(Numbered consecutively from 51 to 360, reflecting the position of the predicted signal peptide):

【０１４８】[0148]

【化１】 本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、少
なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、
または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのポリヌク
レオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はさらに、上記のポリペプチド
と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９
８％、または９９％同一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含
むか、あるいはその配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌ
クレオチド配列に融合される上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらのポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドはまた、本発明により含まれる。Embedded image The present invention also provides a polynucleotide sequence encoding the above-described polypeptide, comprising at least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%,
Or a nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide sequence that is 99% identical. The invention further relates to a polypeptide as described above and at least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 9%
A nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide sequence encoding an 8% or 99% identical polypeptide. The invention also includes the above polynucleotide sequences fused to a heterologous polynucleotide sequence. The polypeptides encoded by these polynucleotides are also included by the present invention.

【０１４９】 別の実施形態において、ＤＲ５ポリペプチドのＣ末端欠失は、一般式５２−ｍ 2 により記載され得、ここでｍ2は、図１（配列番号２）に同定されるアミノ酸配
列に対応する５７〜１８３の数である。特定の実施形態において、本発明のＤＲ
５のＣ末端欠失は、図１（配列番号２）において示されるＤＲ５細胞外ドメイン
配列の以下の残基からなる群より選択されるメンバーを含むか、あるいはそのメ
ンバーからなる：In another embodiment, the C-terminal deletion of the DR5 polypeptide has the general formula 52-m Two Where mTwoIs the amino acid sequence identified in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2)
It is the number of 57 to 183 corresponding to the column. In certain embodiments, the DRs of the present invention
The C-terminal deletion of 5 is equivalent to the DR5 extracellular domain shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2).
Contains or is a member selected from the group consisting of the following residues in the sequence:
Consists of:

【０１５０】[0150]

【化２】 本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、少
なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、
または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはその配列から
なる核酸分子に関する。本発明はさらに、上記のポリペプチドと、少なくとも８
０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９
％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、あるい
はその配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配
列に融合される上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチドはまた、本発明により含まれる。Embedded image The present invention also provides a polynucleotide sequence encoding the above-described polypeptide, comprising at least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%,
Or a nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide sequence that is 99% identical. The present invention further provides a polypeptide as described above comprising at least 8
0%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%
A nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide sequence that encodes a polypeptide that is% identical. The invention also includes the above polynucleotide sequences fused to a heterologous polynucleotide sequence. The polypeptides encoded by these polynucleotides are also included by the present invention.

【０１５１】 本発明はまた、ＤＲ５ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方
から欠失される１つ以上アミノ酸を有するポリペプチドを提供し、このポリペプ
チドは、図１（すなわち、配列番号２）の残基ｎ1−ｍ1および／またはｎ2−ｍ2 を有するとして一般に記載され得、ここで、ｎ1、ｎ2、ｍ1、およびｍ2は、上記
のように整数である。The present invention also provides a polypeptide having one or more amino acids deleted from both the amino and carboxy termini of a DR5 polypeptide, wherein the polypeptide has the structure shown in FIG. 1 (ie, SEQ ID NO: 2). Have the residues n 1 -m 1 and / or n 2 -m 2 , where n 1 , n 2 , m 1 and m 2 are integers as described above.

【０１５２】 ＡＴＣＣ受託番号９７９２０に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる
完全ＤＲ５アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列もまた含まれ、ここで、この部分はＡＴＣＣ受託番号９７９２０に含まれる
ｃＤＮＡによりコードされる完全アミノ酸配列のアミノ末端由来の１〜約７８の
アミノ酸、またはカルボキシル末端由来の１〜約２３３のアミノ酸、あるいはＡ
ＴＣＣ受託番号９７９２０に含まれるｃＤＮＡによりコードされる完全アミノ酸
配列の上記のアミノ末端欠失およびカルボキシル末端欠失の任意の組合せを除外
する。上記の欠失変異ポリペプチド形態の全てをコードするポリヌクレオチドも
また提供される。Also included is a nucleotide sequence encoding a polypeptide consisting of a portion of the complete DR5 amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97920, wherein the portion is a cDNA contained in ATCC Accession No. 97920 1 to about 78 amino acids from the amino terminus of the complete amino acid sequence encoded by
Any combination of the above amino terminal deletion and carboxyl terminal deletion of the complete amino acid sequence encoded by the cDNA contained in TCC Accession No. 97920 is excluded. Polynucleotides encoding all of the above deletion mutant polypeptide forms are also provided.

【０１５３】 Ｎ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体のなかで好ましいのは、細胞外ドメ
インの部分のみを含むか、あるいはそれのみからなる変異体である；すなわち、
残基５２〜１８４である。なぜなら、その任意の部分は、可溶性であると予測さ
れるからである。Preferred among the N-terminal deletion mutants and C-terminal deletion mutants are those that comprise or consist solely of the extracellular domain portion;
Residues 52-184. Because any part of it is expected to be soluble.

【０１５４】 ＤＲ５のいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能に有意な効
果なしに変化され得ることが、当該分野で認識される。配列中でのこのような差
違を意図する場合、活性を決定するタンパク質の決定的な領域が存在することに
留意すべきである。そのような領域は、通常、リガンド結合部位、もしくは死ド
メインを構成するか、またはこれらのドメインに影響する３次構造を形成する残
基を含む。It is recognized in the art that some amino acid sequences of DR5 can be changed without significant effect on protein structure or function. When such differences in sequence are contemplated, it should be noted that there are critical regions of the protein that determine activity. Such regions usually contain residues that either make up the ligand binding site, or death domains, or form tertiary structures that affect these domains.

【０１５５】 従って、本発明はさらに、実質的なＤＲ５タンパク質活性を示すＤＲ５タンパ
ク質の改変体、または以下で議論されるタンパク質部分のようなＤＲ５の領域を
含むＤＲ５タンパク質改変体を含む。このような変異体は、欠失、挿入、反転、
反復、および、型置換を含む。先に示されるように、どのアミノ酸変化が表現型
的にサイレントであるようであるかに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ
．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）で見い出され
得る。Accordingly, the present invention further includes variants of the DR5 protein that exhibit substantial DR5 protein activity, or variants of the DR5 protein that include regions of DR5, such as the protein portions discussed below. Such variants include deletions, insertions, inversions,
Includes repetition and type substitution. As indicated above, guidance on which amino acid changes appear to be phenotypically silent is provided by Bowie, J. et al. U
. Et al., Science 247: 1306-1310 (1990).

【０１５６】 従って、配列番号２のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、
あるいは寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、
誘導体またはアナログは、（ｉ）少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が保存アミ
ノ酸残基もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基、そしてよ
り好ましくは少なくとも１個であるが１０個より少ない保存アミノ酸残基）で置
換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコード
されるものであってもよいしそうでなくともよいもの、または（ｉｉ）１つ以上
のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポ
リペプチドの半減期を増加させるための化合物（例えば、ポリエチレングリコー
ル）のような別の化合物と融合したもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が成
熟ポリペプチド（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド配列）、またはリーダ
ー配列もしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列
の精製に使用される配列と融合されたものであり得る。このようなフラグメント
、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示より当業者の範囲内であると考え
られる。これらのフラグメント、誘導体またはアナログをコードするポリヌクレ
オチドはまた、本発明により含まれる。Thus, a fragment, derivative or analog of the polypeptide of SEQ ID NO: 2,
Or a fragment of the polypeptide encoded by the deposited cDNA,
Derivatives or analogs include (i) at least one or more amino acid residues are conserved or non-conserved amino acid residues (preferably conserved amino acid residues, and more preferably at least one but less than ten conserved amino acid residues Amino acid residues) and such substituted amino acid residues may or may not be encoded by the genetic code, or (ii) one or more amino acid residues Contains a substituent, or (iii) the mature polypeptide is fused to another compound such as a compound (eg, polyethylene glycol) to increase the half-life of the polypeptide, or (iv) an additional amino acid. Is a mature polypeptide (eg, an IgG Fc fusion region peptide sequence), or a leader sequence or secretory sequence. Or fused to a sequence used for purification of a mature polypeptide or proprotein sequence. Such fragments, derivatives and analogs are deemed to be within the skill of the art in light of the teachings herein. Polynucleotides encoding these fragments, derivatives or analogs are also encompassed by the present invention.

【０１５７】 特に興味深いのは、荷電したアミノ酸の、別の荷電したアミノ酸、および中性
のアミノ酸、または負に荷電したアミノ酸との置換である。後者は、正の電荷が
減少したタンパク質を生じてＤＲ５タンパク質の特徴を改善する。さらに、本発
明の１つ以上のアミノ酸残基（例えば、アルギニン残基およびリジン残基）は、
欠失されるかまたは別の残基で置換され得、プロテアーゼ（例えば、フリンまた
はケキシンのような）による望まないプロセシングを排除し得る。凝集の防止は
非常に望ましい。タンパク質の凝集は活性を減少させるだけではなく、凝集体は
免疫原性であり得ることから薬学的処方物を調製する場合にまた、問題であり得
る（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３
４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４
５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（１９
９３））。Of particular interest is the replacement of a charged amino acid with another charged amino acid and a neutral or negatively charged amino acid. The latter results in a protein with a reduced positive charge and improves the characteristics of the DR5 protein. Further, one or more amino acid residues of the invention (eg, arginine and lysine residues)
It may be deleted or replaced with another residue, eliminating unwanted processing by a protease such as, for example, furin or kexin. Prevention of agglomeration is highly desirable. Aggregation of proteins not only reduces activity, but can also be problematic when preparing pharmaceutical formulations because aggregates can be immunogenic (Pinkard et al., Clin. Exp. Immunol. 2: 331-3
40 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-84.
5 (1987); Cleland et al., Crit. Rev .. Therapeuti
c Drug Carrier Systems 10: 307-377 (19
93)).

【０１５８】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面のレセプターに対する結合の選択性を変化さ
せ得る。Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２６８（１９９３）
は、ＴＮＦ−レセプターの２つの公知の型の１つのみに対するＴＮＦ−αの選択
的な結合を生じる特定の変異を記載する。従って、本発明のＤＲ５レセプターは
、天然の変異または人工操作のいずれかに由来する１つ以上のアミノ酸の置換、
欠失、または付加を含み得る。Amino acid substitutions may also alter the selectivity of binding to cell surface receptors. Ostade et al., Nature 361: 266-268 (1993).
Describe certain mutations that result in the selective binding of TNF-α to only one of the two known types of TNF-receptors. Thus, the DR5 receptor of the present invention is a method for replacing one or more amino acids derived from either natural mutations or man-made manipulations,
It may include deletions or additions.

【０１５９】 示されるように、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意には影響を与えない
保存的アミノ酸置換のような、重要でない性質の変化が好ましい（表ＩＩを参照
のこと）。As indicated, changes in non-essential properties are preferred, such as conservative amino acid substitutions that do not significantly affect the folding or activity of the protein (see Table II).

【０１６０】[0160]

【表２】 特定の実施形態において、図１のアミノ酸配列および／または本明細書中に記
載されるポリペプチドフラグメント（例えば、細胞外ドメインまたは細胞内ドメ
イン）のいずれかにおける置換、付加または欠失の数は、７５、７０、６０、５
０、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３
、２、１あるいは３０〜２０、２０〜１５、２０〜１０、１５〜１０、１０〜１
、５〜１０、１〜５、１〜３、または１〜２である。これらのポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドはまた、本発明によって包含される。[Table 2] In certain embodiments, the number of substitutions, additions or deletions in the amino acid sequence of FIG. 1 and / or any of the polypeptide fragments (eg, extracellular or intracellular domains) described herein is: 75, 70, 60, 5
0, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3,
2, 1, or 30 to 20, 20 to 15, 20 to 10, 15 to 10, 10 to 1
, 5-10, 1-5, 1-3, or 1-2. Polynucleotides encoding these polypeptides are also encompassed by the present invention.

【０１６１】 機能に必須である、本発明のＤＲ５タンパク質のアミノ酸は、当該分野におい
て公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発（
ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１〜
１０８５（１９８９））によって同定され得る。後者の手順は、分子中の各残基
に１個のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、生物学的活
性（例えば、レセプター結合、またはインビトロもしくはインビボでの増殖活性
）について試験される。リガンド−レセプター結合に重要である部位はまた、結
晶化、核磁気共鳴または光親和性標識のような構造分析（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９〜９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６〜３１２（１９９２））によって決定され得る
。The amino acids of the DR5 protein of the present invention that are essential for function can be determined by methods known in the art (eg, site-directed mutagenesis or alanine scan mutagenesis).
Cunningham and Wells, Science 244: 1081-
1085 (1989)). The latter procedure introduces one alanine mutation at each residue in the molecule. The resulting mutant molecules are then tested for biological activity (eg, receptor binding, or in vitro or in vivo proliferative activity). Sites important for ligand-receptor binding can also be determined by structural analysis such as crystallization, nuclear magnetic resonance or photoaffinity labeling (Smith et al., JM).
ol. Biol. 224: 899-904 (1992) and de Vos et al.
Science 255: 306-312 (1992)).

【０１６２】 さらに、タンパク質工学を使用して、ＤＲ５ポリペプチドの特徴を改善または
変更し得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を使用して、単一または複数のア
ミノ酸の置換タンパク質、欠失タンパク質、付加タンパク質または融合タンパク
質を含む、新規な変異体タンパク質またはムテインを作製し得る。このような改
変ポリペプチドは、例えば、増強された活性または増加された安定性を示し得る
。さらに、それらは、少なくとも特定の精製条件下および保存条件下でより高い
収量で生成され得、そして対応する天然のポリペプチドよりも上昇した溶解度を
示し得る。Further, protein engineering can be used to improve or alter the characteristics of a DR5 polypeptide. Novel mutant proteins or muteins, including single or multiple amino acid substitutions, deletions, additions or fusions, can be made using recombinant DNA techniques known to those of skill in the art. Such modified polypeptides can exhibit, for example, enhanced activity or increased stability. In addition, they can be produced in higher yields, at least under certain purification and storage conditions, and can exhibit increased solubility over the corresponding native polypeptide.

【０１６３】 天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され
得る。これらの技術としては、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発、アラニンスキ
ャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅ
ｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照のこ
と）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１
９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌ
ｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１
９８６）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。[0163] Non-naturally occurring variants can be generated using mutagenesis techniques known in the art. These techniques include oligonucleotide-mediated mutagenesis, alanine scanning, PCR mutagenesis, site-directed mutagenesis (eg, Carter et al., N.
ucl. Acids Res. 13: 4331 (1986); and Zolle
r et al, Nucl. Acids Res. 10: 6487 (1982)), cassette mutagenesis (e.g., Wells et al., Gene 34: 315 (1
985)), restriction selection mutagenesis (eg, Wells et al., Phil).
os. Trans. R. Soc. London SerA 317: 415 (1
986)), but is not limited thereto.

【０１６４】 従って、本発明はまた、選択された宿主細胞において、発現、スケールアップ
などにより良好に適したＤＲ５ポリペプチドを生成するために欠失、付加または
置換された１以上のアミノ酸残基を有する、ＤＲ５の誘導体およびアナログを包
含する。例えば、システイン残基は、ジスルフィド架橋を除去するために欠失さ
れ得るか、または別のアミノ酸残基で置換され得る；Ｎ結合型グリコシル化部位
は、例えば、Ｎ結合部位を高グリコシル化する（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａ
ｔｅ）ことが公知である酵母宿主から、より容易に回収および精製される均質な
産物の発現を達成するために、改変または除去され得る。この目的のために、本
発明のＤＲ５ポリペプチドの任意の１以上のグリコシル化認識配列上の第１また
は第３のアミノ酸位置の１つあるいは両方での種々のアミノ酸置換、および／ま
たは任意の１以上のこのような認識配列の第２の位置でのアミノ酸欠失は、その
改変トリペプチド配列でのＤＲ５のグリコシル化を妨げる（例えば、Ｍｉｙａｊ
ｉｍｏら、ＥＭＢＯ Ｊ ５（６）：１１９３−１１９７を参照のこと）。Accordingly, the present invention also provides for the deletion, addition or substitution of one or more amino acid residues in a selected host cell to produce a DR5 polypeptide that is more suitable for expression, scale-up, etc. And derivatives and analogs of DR5. For example, a cysteine residue can be deleted to remove a disulfide bridge or replaced with another amino acid residue; an N-linked glycosylation site, for example, hyperglycosylates the N-linked site ( hyperglycosyla
te) can be modified or removed to achieve expression of a homogeneous product that is more easily recovered and purified from yeast hosts. To this end, various amino acid substitutions at one or both of the first or third amino acid positions on any one or more of the glycosylation recognition sequences of a DR5 polypeptide of the invention, and / or any one of Such amino acid deletions at the second position in the recognition sequence prevent glycosylation of DR5 at the modified tripeptide sequence (eg, Miyaja
See imo et al., EMBO J 5 (6): 1193-1197).

【０１６５】 本発明のポリペプチドはまた、リーダーを含む寄託されたｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ
受託番号９７９２０を有する寄託物）によってコードされるポリペプチド；リー
ダーを有しない寄託されたｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチド（す
なわち、成熟タンパク質）；配列番号２において約−５１〜約３６０のアミノ酸
を含むか、あるいはこのアミノ酸からなるポリペプチド；配列番号２において約
−５０〜約３６０のアミノ酸を含むか、あるいはこのアミノ酸からなるポリペプ
チド；配列番号２において約１〜約３６０のアミノ酸を含むか、あるいはこのア
ミノ酸からなるポリペプチド；ＤＲ５細胞外ドメインを含むか、あるいはこのド
メインからなるペプチド；ＤＲ５システインリッチドメインを含むか、あるいは
このドメインからなるポリペプチド；ＤＲ５膜貫通ドメインを含むか、あるいは
このドメインからなるポリペプチド；ＤＲ５細胞内ドメインを含むか、あるいは
このドメインからなるポリペプチド；欠失した膜貫通ドメインの全てまたは一部
を有する細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むか、あるいはこのポリペプ
チドからなるポリペプチド；およびＤＲ５死ドメインを含むか、あるいはこのド
メインからなるポリペプチド；ならびに上記のポリペプチドに対して少なくとも
８０％同一であるポリペプチド、より好ましくは少なくとも９０％または９５％
同一であるポリペプチド、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８
％または９９％同一であるポリペプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０個
のアミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を有するこのよう
なポリペプチドの一部を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドはまた、本発明によって包含される。The polypeptides of the present invention may also comprise a deposited cDNA containing a leader (ATCC
(The deposit having accession number 97920); the mature polypeptide (ie, the mature protein) encoded by the deposited cDNA without the leader; amino acids from about -51 to about 360 in SEQ ID NO: 2; A polypeptide comprising or consisting of about -50 to about 360 amino acids in SEQ ID NO: 2; or a polypeptide consisting of about 1 to about 360 amino acids in SEQ ID NO: 2; Or a polypeptide consisting of this amino acid; containing a DR5 extracellular domain, or a peptide consisting of this domain; a polypeptide containing a DR5 cysteine-rich domain, or consisting of this domain; containing a DR5 transmembrane domain, or containing this domain From A polypeptide comprising or consisting of a DR5 intracellular domain; a polypeptide comprising or consisting of an extracellular domain and an intracellular domain having all or part of a deleted transmembrane domain. A polypeptide comprising or consisting of the DR5 death domain; and a polypeptide that is at least 80% identical to the above polypeptide, more preferably at least 90% or 95%
Polypeptides that are identical, even more preferably at least 96%, 97%, 98%
% Or 99% identical polypeptides, and also includes portions of such polypeptides having at least 30 amino acids and more preferably at least 50 amino acids. Polynucleotides encoding these polypeptides are also encompassed by the present invention.

【０１６６】 ＤＲ５ポリペプチドの参照アミノ酸配列に、少なくとも例えば、９５％「同一
な」アミノ酸配列を有するポリペプチドによって、そのポリペプチドのアミノ酸
配列が、ＤＲ５ポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸あたり５つまで
のアミノ酸変異を含み得るポリペプチド配列を除いて、参照配列に同一である、
このポリペプチドのアミノ酸配列が意図される。言い換えれば、参照アミノ酸配
列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドを得る
ために、参照配列において５％までのアミノ酸残基が欠失され得るか、もしくは
別のアミノ酸で置換され得るか、または参照配列において全アミノ酸残基の５％
までの多数のアミノ酸が、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異
は、参照配列における残基中、もしくは参照配列内の１つ以上連続する群におけ
る残基中のいずれかで個々に散在して、この参照アミノ酸配列のアミノ末端位置
またはカルボキシ末端位置で、またはこれらの末端位置間のどこかで起こり得る
。A polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95% “identical” to a reference amino acid sequence of a DR5 polypeptide, such that the amino acid sequence of the polypeptide is 5 per 100 amino acids of each of the reference amino acids of the DR5 polypeptide. Identical to the reference sequence, except for the polypeptide sequence, which may contain up to amino acid mutations,
The amino acid sequence of this polypeptide is contemplated. In other words, to obtain a polynucleotide having an amino acid sequence that is at least 95% identical to the reference amino acid sequence, up to 5% of the amino acid residues in the reference sequence can be deleted or replaced with another amino acid Or 5% of all amino acid residues in the reference sequence
Up to as many amino acids as can be inserted into the reference sequence. These variations of the reference sequence may be individually scattered, either in residues in the reference sequence or in one or more contiguous groups in the reference sequence, at the amino-terminal position of the reference amino acid sequence or in the carboxy group. It can occur at terminal positions or somewhere between these terminal positions.

【０１６７】 実際には、例えば、任意の特定のポリペプチドが、図１（配列番号２）に示さ
れるアミノ酸配列、寄託されたｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、また
はそのフラグメントに少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９
６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプロ
グラムのような公知のコンピュータープログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ
Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ ５３７１１）を使用して慣習的に決定さ
れ得る。例えば、特定の配列が本発明に従う参照配列に９５％同一であるか否か
を決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アライメントプログラ
ムを使用する場合、パラメータは、当然、同一性のパーセンテージが参照アミノ
酸配列の全長に対して算定され、そして参照配列中のアミノ酸残基の総数の５％
までの、相同性におけるギャップが許容されるように設定される。In practice, for example, any particular polypeptide may have at least 80%, 85% or less of the amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), the amino acid sequence encoded by the deposited cDNA, or a fragment thereof. %, 90%, 92%, 95%, 9
Whether it is 6%, 97%, 98% or 99% identical is determined by known computer programs such as the Bestfit program (Wisconsin Seq).
uence Analysis Package, Version 8 for
Unix (registered trademark), Genetics Computer Group,
University Research Park, 575 Science
Drive, Madison, WI 53711). For example, if Bestfit or any other sequence alignment program is used to determine whether a particular sequence is 95% identical to a reference sequence according to the present invention, the parameters will, of course, have a percentage identity of 5% of the total number of amino acid residues in the reference sequence, calculated against the total length of the reference amino acid sequence
Are set to allow for gaps in homology to

【０１６８】 特定の実施形態において、全体的な配列アライメントともいわれる、参照（問
合せ）配列（本発明の配列）と対象配列との間の同一性は、Ｂｒｕｔｌａｇら（
Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５（１９９０））のアルゴ
リズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定される。Ｆ
ＡＳＴＤＢアミノ酸アライメントにおいて使用される好ましいパラメータは、以
下である：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ
Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍ
ｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝
１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａ
ｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００ま
たは対象アミノ酸配列の長さ（いずれかの短い方）。この実施形態に従うと、対
象配列が、内部の欠失のためではなく、Ｎ末端またはＣ末端の欠失に起因して問
合せ配列よりも短い場合、全体的なパーセント同一性を算定する場合に、ＦＡＳ
ＴＤＢプログラムが対象配列のＮ末端およびＣ末端の短縮型を説明しない事実を
考慮に入れて、手動の補正が、結果に対してなされる。問合せ配列に対してＮ末
端およびＣ末端にて短縮した対象配列について、パーセント同一性は、対応する
対象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問合せ配列
の残基数を、問合せ配列の総塩基のパーセントとして算定することによって補正
される。残基が一致／整列されるか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメン
トの結果によって決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメータを
使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定されるパーセント同一性か
ら差し引かれ、最終的なパーセント同一性スコアに至る。この最終パーセント同
一性スコアは、この実施形態の目的のために使用されるものである。問合せ配列
と一致／整列されない、対象配列のＮ末端およびＣ末端の残基のみが、パーセン
ト同一性スコアを手動で調整する目的のために考慮される。すなわち、対象配列
の最も遠いＮ末端残基およびＣ末端残基の外側の問合せ残基位置のみである。例
えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、パーセント同一性を決定するために、１
００残基の問合せ配列と整列される。この欠失は、対象配列のＮ末端にて生じ、
従って、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端の最初の１０残基に一致／整列を
示さない。１０個の非対残基は、１０％の配列（一致されないＮ末端およびＣ末
端の残基数／問合せ配列中の残基の総数）を表す。その結果、１０％が、ＦＡＳ
ＴＤＢプログラムによって算定されるパーセント同一性スコアから差し引かれる
。残りの９０残基が、完全に一致された場合に、最終的なパーセント同一性は、
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問合せ配
列と比較される。今回この欠失が内部欠失であり、対象配列のＮ末端またはＣ末
端に、この問合せと一致／整列しない残基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定されるパーセント同一性が手動で補正されない。もう一度、ＦＡ
ＳＴＤＢアライメントにおいて示されるような、問合せ配列と一致／整列しない
、対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側の残基位置のみが、手動で補正される。
他の手動の補正は、この実施形態の目的のためになされない。In certain embodiments, the identity between a reference (query) sequence (a sequence of the invention) and a subject sequence, also referred to as an overall sequence alignment, is determined by the method of Brutlag et al.
Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990)). F
Preferred parameters used in the ASTDB amino acid alignment are: Matrix = PAM 0, k-tuple = 2, Mismatch
Penalty = 1, Joining Penalty = 20, Random
Ization Group Length = 0, Cutoff Score =
1, Window Size = length of array, Gap Penalty = 5, Ga
p Size Penalty = 0.05, Window Size = 500 or the length of the amino acid sequence of interest (whichever is shorter). According to this embodiment, when calculating the overall percent identity, if the subject sequence is shorter than the query sequence due to N- or C-terminal deletions, not due to internal deletions, FAS
Taking into account the fact that the TDB program does not account for the N-terminal and C-terminal truncations of the subject sequence, manual corrections are made to the results. For subject sequences truncated at the N- and C-termini to the query sequence, the percent identity is the number of residues in the query sequence that are N- and C-terminal to the subject sequence that do not match / align with the corresponding subject residue Is calculated as a percentage of the total bases of the query sequence. The determination of whether residues are matched / aligned is determined by the result of the FASTDB sequence alignment. This percentage is then subtracted from the percent identity calculated by the above FASTDB program using the specified parameters, leading to a final percent identity score. This final percent identity score is what is used for the purposes of this embodiment. Only N-terminal and C-terminal residues of the subject sequence that are not matched / aligned with the query sequence are considered for the purpose of manually adjusting the percent identity score. That is, only the query residue positions outside the farthest N- and C-terminal residues of the subject sequence. For example, a subject sequence of 90 amino acid residues may have 1% to determine percent identity.
Aligned with a query sequence of 00 residues. This deletion occurs at the N-terminus of the subject sequence,
Thus, the FASTDB alignment shows no match / alignment for the first 10 residues at the N-terminus. The 10 unpaired residues represent 10% of the sequence (number of unmatched N- and C-terminal residues / total number of residues in query sequence). As a result, 10%
It is subtracted from the percent identity score calculated by the TDB program. If the remaining 90 residues were perfectly matched, the final percent identity would be
90%. In another example, a 90 residue subject sequence is compared to a 100 residue query sequence. This deletion is now an internal deletion and there is no residue at the N- or C-terminus of the subject sequence that does not match / align with this query. In this case, FASTD
The percent identity calculated by B is not manually corrected. Again, FA
Only residue positions outside the N- and C-termini of the subject sequence that do not match / align with the query sequence, as shown in the STDB alignment, are manually corrected.
No other manual corrections are made for the purposes of this embodiment.

【０１６９】 本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カ
ラムにおける分子量マーカーとして、および当業者に周知の方法を使用して本発
明のポリペプチドを結合する抗体を生成するための供給源としての用途を含むが
、これらに限定されない用途を有する。The polypeptides of the present invention can be used as molecular weight markers on SDS-PAGE gels or molecular sieve gel filtration columns, and for generating antibodies that bind the polypeptides of the present invention using methods well known to those skilled in the art. It has uses, including but not limited to uses as a source.

【０１７０】 本願はまた、ｎ1−ｍ1、および／またはｎ2−ｍ2として本明細書中で示される
ＤＲ５ポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、
９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含む
タンパク質に関する。好ましい実施形態において、本願は、本明細書中に記載し
た特定のＤＲ５のＮ末端欠失およびＣ末端欠失のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含むタンパク質に関する
。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明によって
包含される。[0170] The present also, n 1 -m 1, and / or at least 80% DR5 polypeptide sequence shown herein as n 2 -m 2, 85%, 90%, 92%,
A protein comprising polypeptides that are 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical. In a preferred embodiment, the present application provides for at least 80%, 85%, 90%, 92% of the polypeptides having the specific DR5 N-terminal and C-terminal deletion amino acid sequences described herein. , 95%, 96%, 9
A protein comprising polypeptides that are 7%, 98%, or 99% identical. Polynucleotides encoding these polypeptides are also encompassed by the present invention.

【０１７１】 特定の好ましい実施形態において、本発明のＤＲ５タンパク質は、上記の融合
タンパク質を含み、ここでこのＤＲ５ポリペプチドは、本明細書中でｎ1−ｍ1、
およびｎ2−ｍ2として記載されるポリペプチドである。好ましい実施形態におい
て、本願は、本明細書中に記載した特定のＮ末端欠失およびＣ末端欠失のアミノ
酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列に対して少なくとも８０％、
８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一
である核酸分子に関する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
はまた、本発明によって包含される。In certain preferred embodiments, a DR5 protein of the invention comprises a fusion protein as described above, wherein the DR5 polypeptide is herein defined as n 1 -m 1 ,
And a polypeptide described as n 2 -m 2. In a preferred embodiment, the application is at least 80% relative to a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having the specific N-terminal and C-terminal deletion amino acid sequences described herein,
It relates to nucleic acid molecules that are 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical. Polynucleotides encoding these polypeptides are also encompassed by the present invention.

【０１７２】 ＤＲ５ポリペプチドが、３つの主な構造ドメインを示す、４１１残基のタンパ
ク質であることが、本発明者らに発見された。第１に、リガンド結合ドメイン（
細胞外ドメイン）は、図１の約５２〜約１８４の残基（配列番号２における約１
〜約１３３のアミノ酸残基）内であると同定された。第２に、膜貫通ドメインは
、図１の約１８５〜約２０８の残基（配列番号２における約１３４〜約１５７の
アミノ酸残基）内であると同定された。第３に、細胞内ドメインは、図１の約２
０９〜約４１１の残基（配列番号２における約１５８〜約３６０のアミノ酸残基
）内であると同定された。重要なことには、この細胞内ドメインは、約３２４〜
約３９１の残基（配列番号２における約２７３〜約３４０のアミノ酸残基）の死
ドメインを含む。図１に示されているこのポリペプチドのさらなる好ましいフラ
グメントとしては、約５２〜約４１１の残基（配列番号２における約１〜約３６
０のアミノ酸残基）の成熟タンパク質および細胞外ドメインもしくは細胞内ドメ
インの全てまたは一部を含むが、膜貫通ドメインを欠失する可溶性ポリペプチド
が挙げられる。We have discovered that the DR5 polypeptide is a 411 residue protein that exhibits three major structural domains. First, the ligand binding domain (
The extracellular domain) comprises about 52 to about 184 residues of FIG. 1 (about 1 to about 1 in SEQ ID NO: 2).
約 133 amino acid residues). Second, the transmembrane domain was identified to be within about 185 to about 208 residues of FIG. 1 (about 134 to about 157 amino acid residues in SEQ ID NO: 2). Third, the intracellular domain is approximately 2 in FIG.
From about 09 to about 411 (about 158 to about 360 amino acid residues in SEQ ID NO: 2). Importantly, this intracellular domain is about 324-
It includes a death domain of about 391 residues (about 273 to about 340 amino acid residues in SEQ ID NO: 2). Further preferred fragments of the polypeptide shown in FIG. 1 include residues from about 52 to about 411 (about 1 to about 36 in SEQ ID NO: 2).
0 amino acid residues) and soluble polypeptides containing all or part of the extracellular or intracellular domains, but lacking the transmembrane domain.

【０１７３】 本発明はさらに、リーダーを含む寄託されたｃＤＮＡによってコードされるＤ
Ｒ５ポリペプチドおよび成熟タンパク質、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細
胞内ドメイン、死ドメイン、およびそれらの全ての組み合わせから選択されるＤ
Ｒ５ポリペプチドフラグメントを提供する。The present invention further relates to the DNA encoded by the deposited cDNA containing the leader.
R5 polypeptides and mature proteins, extracellular domains, transmembrane domains, intracellular domains, death domains, and Ds selected from all combinations thereof.
An R5 polypeptide fragment is provided.

【０１７４】 さらに、本発明のタンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて化学合成され
得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆ
ｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍら，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、本
発明のＤＲ５ポリペプチドのフラグメントに対応するペプチドは、ペプチド合成
機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化
学的アミノ酸のアナログが、置換または付加としてこのＤＲ５ポリペプチド配列
に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定
されない：一般的なアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイ
ソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、
６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸
、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、
シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチル
アラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオ
ロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸）、Ｃａ−メチ
ルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸アナログ。さらに、
アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。Further, the proteins of the present invention can be chemically synthesized using techniques known in the art (eg, Creighton, 1983, Proteins: Struc).
tures and Molecular Principles, W.C. H. F
Leeman & Co. , N .; Y. And Hunkapiller, M et al., N
atature 310: 105-111 (1984)). For example, a peptide corresponding to a fragment of a DR5 polypeptide of the present invention can be synthesized by use of a peptide synthesizer. In addition, if desired, analogs of non-classical amino acids or chemical amino acids can be introduced as substitutions or additions into the DR5 polypeptide sequence. Non-classical amino acids include, but are not limited to, the D isomers of common amino acids, 2,4-diaminobutyric acid, a-aminoisobutyric acid, 4-aminobutyric acid, Abu, 2-aminobutyric acid, g-Abu, e-Ahx,
6-aminohexanoic acid, Aib, 2-aminoisobutyric acid, 3-aminopropionic acid, ornithine, norleucine, norvaline, hydroxyproline, sarcosine,
Citrulline, homocitrulline, cysteic acid, t-butylglycine, t-butylalanine, phenylglycine, cyclohexylalanine, b-alanine, fluoroamino acid, designer amino acid (for example, b-methyl amino acid), Ca-methyl amino acid, Na-methyl Amino acids, and common amino acid analogs. further,
The amino acid can be D (dextrorotary) or L (levorotary).

【０１７５】 天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して作製さ
れ得、それらの技術としては、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発、アラニンスキ
ャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅ
ｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照のこ
と）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１
９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌら、Ｐｈｉｌｏ
ｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９
８６）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。[0175] Non-naturally occurring variants can be made using mutagenesis techniques known in the art, including oligonucleotide-mediated mutagenesis, alanine scanning, PCR mutagenesis, site-directed mutagenesis. Induction (eg, Carter et al., N
ucl. Acids Res. 13: 4331 (1986); and Zolle
r et al, Nucl. Acids Res. 10: 6487 (1982)), cassette mutagenesis (e.g., Wells et al., Gene 34: 315 (1
985)), restriction selection mutagenesis (eg, Well et al., Philo).
s. Trans. R. Soc. London SerA 317: 415 (19
86)), but is not limited thereto.

【０１７６】 本発明はさらに、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル
化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク
質分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に
改変されたＤＲ５ポリペプチドを包含する。多数の化学的改変のうちのいずれも
、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シ
アン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4
による特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシ
ンの存在下での代謝合成；など。The present invention further provides for the use of, eg, glycosylated, acetylated, phosphorylated, amidated, derivatized with known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, antibody molecules or other cells during or after translation. DR5 polypeptides that are differentially modified, such as by binding to a sex ligand. Any of numerous chemical modifications, including the following may be carried out by known, but not limited to techniques: cyanogen bromide, trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, NaBH 4
Chemical cleavage, acetylation, formylation, oxidation, reduction; metabolic synthesis in the presence of tunicamycin;

【０１７７】 本発明によって包含されるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが
挙げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシ
ング）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖の
化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の
付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、酵素標
識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク
質の検出および単離を可能にし得る。Additional post-translational modifications encompassed by the present invention include, for example, the following: N-linked or O-linked sugar chains (N- or C-terminal processing), chemical moieties to the amino acid backbone. Modification, chemical modification of N-linked or O-linked sugar chains, and addition or deletion of N-terminal methionine residues as a result of prokaryotic host cell expression. The polypeptide may also be modified with a detectable label (eg, an enzymatic, fluorescent, isotopic or affinity label) to allow for detection and isolation of the protein.

【０１７８】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、ＤＲ５の化
学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。
誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコー
ル、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチル
セルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得る。こ
のポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこの分子内の所定
の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を含み得る。The present invention also provides chemically modified derivatives of DR5 that can provide additional benefits, such as increased solubility, stability and circulation time, or reduced immunogenicity of the polypeptide (US See patent 4,179,337).
The chemical moiety for derivatization can be selected from water-soluble polymers such as polyethylene glycol, ethylene glycol / propylene glycol copolymer, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, and the like. The polypeptide can be modified at random positions within the molecule or at predetermined positions within the molecule, and can include one, two, three or more attached chemical moieties.

【０１７９】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつか
の分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示
す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の時間、（
存在する場合には）生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程
度または抗原性の欠如、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチ
レングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例
えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２
０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５
００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９００
０、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１
２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４
，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，
０００、１７，５００、１８，０００、１８、５００、１９，０００、１９，５
００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，００
０、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００
、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、
または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。The polymer can be of any molecular weight and can be branched or unbranched. For polyethylene glycol, the preferred molecular weight is between about 1 kDa and about 100 kDa for ease of handling and manufacture (the term "about" means that some molecules have been referred to in the preparation of polyethylene glycol). Heavier than the molecular weight, and some are lighter than the indicated molecular weight). The desired treatment profile (e.g., the desired time of sustained release, (
(If present) effects on biological activity, ease of handling, degree of antigenicity or lack of antigenicity, and other known effects of polyethylene glycol on therapeutic proteins or analogs). Size can be used. For example, polyethylene glycol is about 200, 500, 1000, 1500, 2
000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 55
00, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 900
0, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 1
2,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14
, 500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,
000, 17,500, 18,000, 18, 500, 19,000, 19,5
00, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,00
0, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000
, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000,
Or it may have an average molecular weight of 100,000 kDa.

【０１８０】 上記のように、ポリエチレングリコールは、分枝構造を有し得る。分枝ポリエ
チレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒ
ｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７２
（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ １８：２７４５−２７５０（１９９９）；およびＣａｌｉｃｅｔｉら
、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）（これら
の各々の開示が、本明細書中で参考として援用される）において記載される。As mentioned above, polyethylene glycol can have a branched structure. Branched polyethylene glycols are described, for example, in US Pat. No. 5,643,575; Morpur.
go et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 59-72
(1996); Vorovjev et al., Nucleosides Nucleot.
ids 18: 2745-2750 (1999); and Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10: 638-646 (1999), the disclosure of each of which is incorporated herein by reference.

【０１８１】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に
結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば
、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦ
にＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２
８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリ
エチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル
基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエ
チレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸
残基としては、例えば、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；
遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グ
ルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル基も
また、ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得
る。治療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端または
リジン基での結合である。A polyethylene glycol molecule (or other chemical moiety) should be attached to the protein in view of its effect on the functional or antigenic domains of the protein. There are a number of conjugation methods available to those of skill in the art (eg, EP 0 401 384 (G-CSF, which is incorporated herein by reference).
To PEG), Malik et al., Exp. Hematol. 20: 102
8-1035 (1992) (tresyl chloride)
(See also report PEGylation of GM-CSF). For example, polyethylene glycol can be covalently linked by an amino acid residue via a reactive group (eg, a free amino or carboxyl group). Reactive groups are groups to which activated polyethylene glycol molecules can bind. Amino acid residues having a free amino group can include, for example, lysine residues and N-terminal amino acid residues;
Amino acid residues having a free carboxyl group may include aspartic acid residues, glutamic acid residues and C-terminal amino acid residues. Sulfhydryl groups can also be used as a reactive group for attaching polyethylene glycol molecules. Preferred for therapeutic purposes is attachment at an amino group, such as attachment at the N-terminus or lysine group.

【０１８２】 上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、任意の多くのアミノ酸
残基への連結を介して、タンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレングリ
コールは、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残
基、またはシステイン残基への共有結合を介して、タンパク質に連結され得る。
１つ以上の反応化学が使用されて、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、
リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）また
はタンパク質の１より多い型のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン、およびそれらの組み合わせ）
にポリエチレングリコールを結合させ得る。[0182] As suggested above, polyethylene glycol can be linked to proteins via linkage to any of a number of amino acid residues. For example, polyethylene glycol can be linked to a protein via a covalent bond to a lysine residue, a histidine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, or a cysteine residue.
One or more reaction chemistries may be used to bind specific amino acid residues (eg,
Lysine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, or cysteine) or amino acid residues of more than one type of protein (eg, lysine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, or cysteine, and combinations thereof)
To polyethylene glycol.

【０１８３】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを本発明の組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのタンパク質（または、ポ
リペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の比、行われるべきペグ
化反応の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法が選択され得
る。Ｎ末端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモ
ノペグ化部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末
端ペグ化物質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選り抜きの
タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１
級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によ
って達成され得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた
、Ｎ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。[0183] Proteins that are chemically modified at the N-terminus may be particularly desirable. Using polyethylene glycol as an example of a composition of the present invention, the ratio of polyethylene glycol to protein (or polypeptide) molecules in a reaction mixture from various polyethylene glycol molecules (by molecular weight, branching, etc.), The type of PEGylation reaction to be performed and the method of obtaining the selected N-terminal PEGylated protein can be selected. The method of obtaining an N-terminal PEGylated preparation (ie, if necessary, separating this portion from other mono-PEGylated portions) is accomplished by purification of the N-terminal PEGylated material from a population of PEGylated protein molecules. obtain. Select proteins chemically modified with an N-terminal modification are the first of a different type available for derivatization in a particular protein.
It can be achieved by reductive alkylation utilizing the differential reactivity of the primary amino group (lysine versus the N-terminus). Under the appropriate reaction conditions, substantially selective derivatization of the protein at the N-terminus with a carbonyl group containing polymer is achieved.

【０１８４】 上記で示されたように、本発明のタンパク質のペグ化は、かなり多数の手段に
よって達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、直接的または介在リ
ンカーによってのいずれかで、タンパク質に結合され得る。タンパク質にポリエ
チレングリコールを結合させるためのリンカーレス（ｌｉｎｋｅｒｌｅｓｓ）系
は、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉ
ｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅ
ｒｎ．Ｊ．ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）；米国特許第４
，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２号；ＷＯ９５／０６０５８
；およびＷＯ９８／３２４６６（これらの各々の開示は、本明細書中で参考とし
て援用される）に記載される。As indicated above, pegylation of the proteins of the present invention can be accomplished by any number of means. For example, polyethylene glycol can be attached to the protein, either directly or by an intervening linker. Linkerless systems for attaching polyethylene glycol to proteins are described in Delgado et al., Crit. Rev .. Thera. Drug Carri
er Sys. 9: 249-304 (1992); Francis et al., Inte.
rn. J. of Hematol. 68: 1-18 (1998); U.S. Pat.
U.S. Pat. No. 5,349,052; WO 95/06058.
And WO 98/32466, the disclosure of each of which is incorporated herein by reference.

【０１８５】 介在するリンカーを伴わずに、タンパク質のアミノ酸残基に直接的にポリエチ
レングリコールを結合させる１つの系は、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ）
ＭＰＥＧ（これは、塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＣｌＳＯ 2 ＣＨ2ＣＦ3）を使用して、モノメトキシ（ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエチレ
ングリコール（ＭＰＥＧ）を改変することによって生成される）を使用する。ト
レシル化ＭＰＥＧとのタンパク質の反応に際して、ポリエチレングリコールは、
タンパク質のアミン基に直接結合される。従って、本発明は、本発明のタンパク
質と２，２，２−トリフルオロエタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スル
ホニル基を有するポリエチレングリコール分子とを反応させることによって生成
されるタンパク質−ポリエチレングリコール結合体を含む。[0185] Polypeptides directly at amino acid residues of the protein without intervening linkers
One system for attaching renglycol is tresylated.
MPEG (this is tresylchloride (ClSO Two CHTwoCFThree) Using monomethoxy (polyethylene)
Glycol (MPEG)). G
Upon reaction of the protein with resylated MPEG, polyethylene glycol
Directly attached to the amine group of the protein. Therefore, the present invention relates to the protein of the present invention.
Quality and 2,2,2-trifluoroethane sul
Produced by reacting with a polyethylene glycol molecule having a honyl group
Protein-polyethylene glycol conjugate.

【０１８６】 ポリエチレングリコールはまた、多くの異なる介在リンカーを使用して、タン
パク質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この開示全
体が、本明細書中で参考として援用される）は、タンパク質にポリエチレングリ
コールを結合させるためのウレタンリンカーを開示する。ポリエチレングリコー
ルが、リンカーによってタンパク質に結合されるタンパク質−ポリエチレングリ
コール結合体はまた、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート（ｓｕｃｃｉｎ
ｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、１，１'−カルボニルジイミダゾールで活
性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロフェニルカルボネート
（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｅｎｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロ
フェノールカルボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体のような
化合物とのタンパク質の反応によって生成され得る。さらなる多くのポリエチレ
ングリコール誘導体およびタンパク質にポリエチレングリコールを結合させるた
めの反応化学が、ＷＯ９８／３２４６６（この開示全体が、本明細書中で参考と
して援用される）に記載される。本明細書中に示される反応化学を使用して生成
されるペグ化タンパク質産物は、本発明の範囲内に含まれる。[0186] Polyethylene glycol can also be attached to proteins using a number of different intervening linkers. For example, US Pat. No. 5,612,460, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference, discloses a urethane linker for attaching polyethylene glycol to proteins. The protein-polyethylene glycol conjugate, where polyethylene glycol is linked to the protein by a linker, is also known as MPEG-succinimidyl succinate (succin
imidylsuccinate), MPEG activated with 1,1'-carbonyldiimidazole, MPEG-2,4,5-trichlorophenylcarbonate, MPEG-p-nitrophenol carbonate, and various MPEG-succinate derivatives Can be produced by the reaction of a protein with a compound such as A number of additional polyethylene glycol derivatives and reaction chemistries for attaching polyethylene glycol to proteins are described in WO 98/32466, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. PEGylated protein products produced using the reaction chemistry set forth herein are included within the scope of the present invention.

【０１８７】 本発明の各タンパク質に結合されたポリエチレングリコール部分の数（すなわ
ち、置換の程度）もまた、変動し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、
平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２
０またはそれより多いポリエチレングリコール分子を連結し得る。同様に、平均
の置換の程度は、タンパク質１分子あたり１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５
〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜
１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、または
１８〜２０ポリエチレングリコール部分のような範囲内である。置換の程度を決
定する方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄ
ｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）において考
察される。[0187] The number of polyethylene glycol moieties attached to each protein of the invention (ie, the degree of substitution) can also vary. For example, a PEGylated protein of the invention
On average 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 2,
Zero or more polyethylene glycol molecules may be linked. Similarly, the average degree of substitution is 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5 per protein molecule.
-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-
14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19, or 18-20 within such ranges as polyethylene glycol moieties. Methods for determining the degree of substitution are described, for example, in Delgado et al., Crit. Rev .. Thera. D
rug Carrier Sys. 9: 249-304 (1992).

【０１８８】 上記のように、ＤＲ５ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプ
ロセスによって、または当該技術分野で周知の化学的改変技術のいずれかによっ
て、改変され得る。同じ型の改変が、所定のＤＲ５ポリペプチド中のいくつかの
部位で、同じまたは種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のＤ
Ｒ５ポリペプチドは多くの型の改変を含み得る。ＤＲ５ポリペプチドは、例えば
、ユビキチン化の結果として分枝状であり得、そしてそのポリペプチドは、分枝
を含むかまたは含まない、環状であり得る。環状、分枝状および分枝した環状の
ＤＲ５ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生じ得るか、または合成方法
によって作製され得る。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシ
ル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファ
チジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合
、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シス
テインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グ
リコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル
化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング、リ
ン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような
タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化
が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏ
ｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩ
ＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１−１２頁（１９８３）；Ｓｅ
ｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０
）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２
（１９９２）を参照のこと）。As noted above, DR5 polypeptides can be modified by natural processes, such as post-translational processing, or by any of the chemical modification techniques well known in the art. It is understood that the same type of modification may be present at the same or varying degrees at several sites in a given DR5 polypeptide. In addition, given D
An R5 polypeptide may contain many types of modifications. A DR5 polypeptide can be branched, for example, as a result of ubiquitination, and the polypeptide can be cyclic, with or without branching. Cyclic, branched and branched cyclic DR5 polypeptides can result from natural post-translational processes or can be made by synthetic methods. Modifications include acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, covalent linkage of flavin, covalent linkage of heme moieties, covalent linkage of nucleotides or nucleotide derivatives, covalent linkage of lipids or lipid derivatives, phosphatidylinositol. Covalent bond, crosslink, cyclization, disulfide bond formation, demethylation, formation of covalent crosslink, formation of cysteine, formation of pyroglutamic acid, formylation, γ-carboxylation, glycosylation, GPI anchor formation, hydroxylation, Transfer R of amino acids to proteins such as iodination, methylation, myristoylation, oxidation, pegylation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, selenoylation, sulphation, arginylation A mediated addition, and ubiquitination. (For example, PROTEINS-STRUCTURE AND M
OLECULAR PROPERTIES, 2nd ed. E. FIG. Creighto
n, W. H. Freeman and Company, New York (1
993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODI
FICATION OF PROTEINS, B.I. C. Edited by Johnson, Ac
ademic Press, New York, pp. 1-12 (1983); Se.
ifter et al., Meth Enzymol. 182: 626-646 (1990)
Rattan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48-62
(1992)).

【０１８９】 ＤＲ５ポリペプチドは、以下に挙げられるが、これらに限定されない標準方法
により、化学合成および組み換え細胞培養から修復かつ精製され得る：硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフ
ィーおよびレシチンクロマトグラフィー。最も好ましくは、高性能液体クロマト
グラフィー（「ＨＰＬＣ」）は、精製のために使用され得る。タンパク質を再折
り畳みするための周知の技術が使用され、ポリペプチドが単離および／または精
製の間に変性される場合に、活性なコンホメーションを再産生し得る。The DR5 polypeptide can be repaired and purified from chemical synthesis and recombinant cell culture by standard methods, including, but not limited to: ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, Phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lecithin chromatography. Most preferably, high performance liquid chromatography ("HPLC") can be used for purification. Well-known techniques for refolding proteins can be used to regenerate an active conformation when the polypeptide is denatured during isolation and / or purification.

【０１９０】 ＤＲ５ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、種々の適用、特に、ＤＲ５の
化学的かつ生物学的特性を使用する種々の適用について本発明に従って使用され
得る。これらのうちの１つは、腫瘍、寄生虫感染、細菌感染、ウイルス感染、再
狭窄、および移植片対宿主疾患の処置および／または予防の際の適用であり、寄
生虫、細菌およびウイルスに対する耐性を誘導し；Ｔ細胞、内皮細胞および特定
の造血性細胞の増幅を誘導し；抗ウイルス応答を調節し；そしてアゴニストによ
るＤＲ５の刺激の後特定の自己免疫疾患を処置および／または予防する。さらな
る適用は、細胞、組織および器官の診断、処置および／または予防に関する。本
発明のこれらの局面は、さらに以下に議論される。[0190] DR5 polynucleotides and polypeptides may be used in accordance with the present invention for various applications, particularly those that make use of the chemical and biological properties of DR5. One of these is the application in the treatment and / or prevention of tumors, parasitic infections, bacterial infections, viral infections, restenosis, and graft-versus-host disease, and is resistant to parasites, bacteria and viruses. Induces the expansion of T cells, endothelial cells and certain hematopoietic cells; modulates the antiviral response; and treats and / or prevents certain autoimmune diseases after stimulation of DR5 by agonists. Further applications relate to the diagnosis, treatment and / or prevention of cells, tissues and organs. These aspects of the invention are discussed further below.

【０１９１】 本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープまた
はＡＴＣＣ寄託番号９７９２０として寄託されたｃＤＮＡに含まれるポリヌクレ
オチド配列によってコードされるかまたは前出に規定されたようなストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件または低ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下で配列番号１の配列の相補体にハイブリダイズするかもしくはＡ
ＴＣＣ寄託番号９７９２０として寄託されたｃＤＮＡ中に含まれるポリヌクレオ
チドによってコードされるポリペプチド配列のエピトープを含むかあるいはこれ
らからなるポリペプチドを含む。本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列の
エピトープをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１に開示され
る配列）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポ
リヌクレオチド配列、および前出に規定されるストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件または低ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で
相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。The present invention relates to a strain as encoded by the epitope of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide sequence contained in the cDNA deposited as ATCC Deposit No. 97920 or as defined above. Hybridizes to the complement of the sequence of SEQ ID NO: 1 under mild or low stringency hybridization conditions, or
Includes a polypeptide comprising or consisting of an epitope of the polypeptide sequence encoded by the polynucleotide contained in the cDNA deposited as TCC Deposit No. 97920. The present invention further provides a polynucleotide sequence encoding an epitope of the polypeptide sequence of the present invention (eg, the sequence disclosed in SEQ ID NO: 1), a polynucleotide sequence complementary to the polynucleotide sequence encoding the epitope of the present invention, And polynucleotide sequences that hybridize to the complementary strand under stringent or low stringency hybridization conditions as defined above.

【０１９２】 別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチドのエピト
ープ保有部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド
部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープ
である。本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」とは、動物において
、好ましくは、哺乳動物において、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性ま
たは免疫原性活性を有するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態におい
て、本発明は、エピトープを含むポリペプチドおよびこのポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを含む。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免
疫原である場合、抗体応答を誘導する、タンパク質の一部として定義される。一
方、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定
義され得る。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般に、抗原性エピトー
プの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８〜４００２（１９８３）を参照の
こと。In another aspect, the invention provides a peptide or polypeptide comprising an epitope-bearing portion of a polypeptide described herein. The epitope of the polypeptide portion is an immunogenic or antigenic epitope of a polypeptide of the invention. As used herein, the term "epitope" refers to that portion of a polypeptide that has antigenic or immunogenic activity in an animal, preferably in a mammal, and most preferably in a human. In a preferred embodiment, the invention includes a polypeptide comprising an epitope and a polynucleotide encoding the polypeptide. An "immunogenic epitope" is defined as a portion of a protein that elicits an antibody response when the entire protein is an immunogen. On the other hand, the region of a protein molecule to which an antibody can bind can be defined as an "antigenic epitope." The number of immunogenic epitopes on a protein is generally less than the number of antigenic epitopes. See, for example, Geysen, H .; M. Proc. Natl
. Acad. Sci. ScL USA 81: 3998-4002 (1983).

【０１９３】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生さ
れ得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。これはさらに
、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される）。[0193] Fragments that function as epitopes can be produced by any conventional method. (See, for example, Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci.
. USA 82: 5131-5135 (1985). This is further described in U.S. Pat. No. 4,631,211).

【０１９４】 抗原性エピトープを有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が結
合し得るタンパク質分子の領域を含むもの）の選択に関して、比較的短い合成ペ
プチド（タンパク質配列の部分を模倣する）が、その部分的に模倣されたタンパ
ク質と反応する抗血清を慣用的に惹起し得ることは当該分野において周知である
（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１９：６６０
−６６６（１９８３）を参照のこと）。タンパク質反応性の血清を誘発し得るペ
プチドは、しばしば、タンパク質の一次配列において示され、単純な化学的規則
のセットによって特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領
域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ末端もしくはカルボキシル末
端にも拘束されない。For the selection of peptides or polypeptides having an antigenic epitope (ie, those that include a region of a protein molecule to which an antibody can bind), relatively short synthetic peptides (which mimic portions of the protein sequence) may It is well known in the art that antisera that react with chemically mimicked proteins can be routinely raised (eg, Sutcliffe, JG, et al., Science, 219: 660).
-666 (1983)). Peptides that can elicit protein-reactive sera are often represented in the primary sequence of a protein, can be characterized by a simple set of chemical rules, and can be characterized by an immunodominant region of an intact protein (ie, an immunogenic epitope). ) Or amino terminal or carboxyl terminal.

【０１９５】 ＤＲ−５特異的抗体を産生するために使用され得る、抗原性ポリペプチドまた
はペプチドの非限定の例としては、以下が挙げられる：図１（配列番号２におけ
る約１１〜約５９）中の約６２〜約１１０のアミノ酸残基を含むかあるいはこれ
らからなるポリペプチド；図１（配列番号２における約６８〜約１１３）中の約
１１９〜約１６４のアミノ酸残基を含むかまたはこれらからなるポリペプチド；
図１（配列番号２における約１７３〜約２２０）中の約２２４〜約２７１のアミ
ノ酸残基を含むかまたはこれらからなるポリペプチド；ならびに図１（配列番号
２における約２２４〜約３１９）中の約２７５〜約３７０のアミノ酸残基を含む
かまたはこれらからなるポリペプチド。上記に示されるように、本発明者らは、
上記のポリペプチドフラグメントは、ＤＲ５タンパク質の抗原領域であると決定
した。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to raise DR-5 specific antibodies include the following: FIG. 1 (about 11 to about 59 in SEQ ID NO: 2). A polypeptide comprising or consisting of about 62 to about 110 amino acid residues in SEQ ID NO: 2; comprising or about 119 to about 164 amino acid residues in FIG. 1 (about 68 to about 113 in SEQ ID NO: 2). A polypeptide consisting of;
A polypeptide comprising or consisting of about 224 to about 271 amino acid residues in FIG. 1 (about 173 to about 220 in SEQ ID NO: 2); and in FIG. 1 (about 224 to about 319 in SEQ ID NO: 2). A polypeptide comprising or consisting of about 275 to about 370 amino acid residues. As shown above, we have:
The above polypeptide fragment was determined to be the antigenic region of the DR5 protein.

【０１９６】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段に
より生成され得る。Ｈｏｕｇｔｈｅｎ，Ｒ．Ａ， 「Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｓｐｅ
ｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒａｃ
ｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ａｍｉｎ
ｏ Ａｃｉｄｓ」， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
５１３１−５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔ
ｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈ
ｏｕｇｔｈｅｎらに対する米国特許第４，６３１，２１１号（１９８６）でさら
に記載される。当業者が理解するように、本発明のＤＲ５ポリペプチドおよび上
記のそのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメ
インの一部と合わされ得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク
質は、精製を促進し、そしてインビボで半減期の増加を示す。これは、例えば、
ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリ
ンのＨ鎖またはＬ鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質につ
いて示されている（ＥＰＡ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分によるジスルフィド結
合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、他の分子との結合および中和にお
いて、単量体ＤＲ５タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも効率的
であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７０：３９
５８−３９６４（１９９５））。The epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention can be produced by any conventional means. Houghten, R .; A, "General Meth
Od for the Rapid Solid-Phase Syntheses
is of Large Numbers of Peptides: Spe
severity of Antigen-Antibody Interac
Tion at the Level of Individual Amin
o Acids ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:
5131-5135 (1985). This Simultaneous Multi
The “ipple Peptide Synthesis (SMPS)” process is based on H
No. 4,631,211 to Augusten et al. (1986). As those skilled in the art will appreciate, the DR5 polypeptide of the present invention and the epitope-bearing fragments thereof described above may be combined with a portion of an immunoglobulin (IgG) constant domain, resulting in a chimeric polypeptide. These fusion proteins facilitate purification and show an increased half-life in vivo. This is, for example,
Chimeric proteins consisting of the first two domains of human CD4-polypeptide and various domains of the constant region of the heavy or light chain of a mammalian immunoglobulin have been shown (EPA 394,827; Traunecker et al., Nat.
ure 331: 84-86 (1988)). Fusion proteins with a disulfide-linked dimer structure by an IgG moiety may also be more efficient at binding and neutralizing other molecules than monomeric DR5 proteins or protein fragments alone (Funtoulakis et al., J Biochem 270). : 39
58-3964 (1995)).

【０１９７】 （抗体） さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするた
めの当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の配列
番号２の、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、または改変体、および／
またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（Ｔ
ＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、
多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフ
ラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生
されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体
に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメ
ントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは
、免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわ
ち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫
グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、
ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブク
ラスであり得る。Antibodies In addition, the polypeptides of the present invention may be those of SEQ ID NO: 2, as determined by immunoassays well known in the art for assaying specific antibody-antigen binding. , Polypeptide fragments, or variants, and / or
Or an antibody that immunospecifically binds to an epitope and a T cell antigen receptor (T
CR). Antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies,
Multispecific antibodies, human antibodies, humanized or chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments, F (ab ') fragments, fragments produced by Fab expression libraries, anti-idiotype (anti-Id) antibodies (eg, (Including anti-Id antibodies to the antibodies of the present invention), and any of the above-described epitope binding fragments. As used herein, the term "antibody" refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, i.e., molecules that include an antigen binding site that immunospecifically binds to an antigen. Say. The immunoglobulin molecules of the present invention can be of any type (eg, IgG, IgE,
IgM, IgD, IgA, and IgY), any class (eg, IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) or any subclass.

【０１９８】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗
原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起点由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネ
ズミ（ｍｕｒｉｎｅ）、ロバ、シップウサギ（ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ
、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。本明細書中で使用される
場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み
、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまたは１つ以上のヒト免疫グロブリン
についてトランスジェニックであり、そして内因性免疫グロブリンを発現しない
動物から単離さた抗体（下に記載のように、そして例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐ
ａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号において記載のような）を含む
。Most preferably, the antibody is a human antigen binding antibody fragment of the invention, including Fab, Fab ′ and F (ab ′) 2, Fd, single chain Fvs (sc
Fv), single chain antibodies, disulfide-linked Fvs (sdFv) and VL or V
Fragments that include any of the H domains include, but are not limited to. Antigen binding antibody fragments, including single chain antibodies, may include the variable region alone or in combination with all or part of the following: hinge region, CH1 domain, C1
H2 domain and CH3 domain. Also included in the invention are antigen binding fragments that also include any combination of a variable region with a hinge region, a CH1, a CH2 domain, and a CH3 domain. The antibodies of the invention can be from any animal origin, including birds and mammals. Preferably, the antibody is human, murine, donkey, ship rabbit, goat, guinea pig, camel, horse, or chicken. As used herein, a "human" antibody includes an antibody having the amino acid sequence of a human immunoglobulin, and is transgenic for a human immunoglobulin library or one or more human immunoglobulins, and Antibodies isolated from animals that do not express sex immunoglobulins (as described below, and for example, Kucherlap
ati et al., as described in US Pat. No. 5,939,598).

【０１９９】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方
に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９
２／０８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕ
ｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４
，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、
同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。The antibodies of the present invention can be monospecific, bispecific, trispecific or more multispecific. Multispecific antibodies can be specific for different epitopes of a polypeptide of the invention, or both a polypeptide of the invention and a heterologous epitope (eg, a heterologous polypeptide or solid support material). May be specific to For example, PCT publication WO 93/17715; WO 9/17715
WO08 / 00802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tu
tt et al. Immunol. 147: 60-69 (1991); U.S. Pat.
No. 4,474,893, No. 4,714,681, No. 4,925,648,
Nos. 5,573,920 and 5,601,819; Kostelny et al.
J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992).

【０２００】 本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチ
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように、また
は表および図に列挙されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピトープ
またはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本
発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペプチド
の排除を可能にする抗体を含む。The antibodies of the present invention may be described or specified in terms of the epitopes or portions of the polypeptides of the present invention, to which they recognize or specifically bind. The portion of the epitope or polypeptide may be specified as described herein, for example, by N-terminal and C-terminal positions, by size in contiguous amino acid residues, or as listed in the tables and figures. Can be Antibodies that specifically bind to any epitope or polypeptide of the present invention can also be excluded. Accordingly, the present invention includes antibodies that specifically bind a polypeptide of the present invention and allow for exclusion of a polypeptide of the present invention.

【０２０１】 本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた、
本発明に含まれる。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８
５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５
５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に
記載される方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドを結合しない抗
体もまた、本発明に含まれる。さらに、ハイブリダイゼーション条件下（本明細
書中で記載されるような）で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポ
リヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合する抗体が、本発明に含
まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和
性について記載または特定化され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０ -2 Ｍ未満、１０-2Ｍ未満、５×１０-3Ｍ未満、１０-3Ｍ未満、５×１０-4Ｍ未満
、１０-4Ｍ未満、５×１０-5Ｍ未満、１０-5Ｍ未満、５×１０-6Ｍ未満、１０-6 Ｍ未満、５×１０-7Ｍ未満、１０-7Ｍ未満、５×１０-8Ｍ未満、１０-8Ｍ未満、
５×１０-9Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、１０-10Ｍ未満、５×１
０-11Ｍ未満、１０-11Ｍ未満、５×１０-12Ｍ未満、１０-12Ｍ未満、５×１０-1 3 Ｍ未満、１０-13Ｍ未満、５×１０-14Ｍ未満、１０-14Ｍ未満、５×１０-15Ｍ
未満または１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる
。The antibodies of the present invention may also be described or specified for their cross-reactivity. Book
Binds any other analog, ortholog or homolog of a polypeptide of the invention
No antibodies are included. At least 95% less than the polypeptide of the invention.
At least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 75%, less
At least 70%, at least 65%, at least 60%, at least 55% and
At least 50% identity (methods known in the art and as described herein)
An antibody that binds a polypeptide having
Included in the present invention. Less than 95%, less than 90%, 8 relative to the polypeptide of the invention
Less than 5%, less than 80%, less than 75%, less than 70%, less than 65%, less than 60%, 5
Less than 5% and less than 50% identity (methods known in the art and as used herein)
Antibodies that do not bind polypeptides (when calculated using the described method)
The body is also included in the present invention. Furthermore, under hybridization conditions (this specification
(As described herein) to a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide of the invention.
Antibodies that bind the polypeptide encoded by the nucleotide are included in the present invention.
I will. The antibodies of the present invention also relate to their binding affinity for the polypeptides of the present invention.
Sex may be described or specified. Preferred binding affinity is 5 × 10 -2 Less than M, 10-2Less than M, 5 × 10-3Less than M, 10-3Less than M, 5 × 10-FourLess than M
, 10-FourLess than M, 5 × 10-FiveLess than M, 10-FiveLess than M, 5 × 10-6Less than M, 10-6 Less than M, 5 × 10-7Less than M, 10-7Less than M, 5 × 10-8Less than M, 10-8Less than M,
5 × 10-9Less than M, 10-9Less than M, 5 × 10-TenLess than M, 10-TenLess than M, 5 × 1
0-11Less than M, 10-11Less than M, 5 × 10-12Less than M, 10-12Less than M, 5 × 10-1 Three Less than M, 10-13Less than M, 5 × 10-14Less than M, 10-14Less than M, 5 × 10-15M
Less than or 10-15Affinities with dissociation constants less than M or Kd
.

【０２０２】 本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例
えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、この抗体は、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少
なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの
結合を競合的に阻害する。The present invention also provides antibodies to epitopes of the invention, as determined by any method known in the art for determining competitive binding (eg, the immunoassays described herein). Antibodies that competitively inhibit the binding of. In preferred embodiments, the antibody competitively inhibits binding to the epitope by at least 90%, at least 80%, at least 70%, at least 60%, or at least 50%.

【０２０３】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リ
ガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。本発明
は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方の特徴を有する。本
発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活性化を妨害するレセプタ
ー特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は
、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野で公知の技術により決定
され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターのリン酸化（例えば、チロ
シンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それに続くウェスタンブロッ
ト分析（例えば、上記のような）によってその基質を検出することにより、決定
され得る。特定の実施形態において、この抗体の非存在下で、リガンド活性また
はレセプター活性を、その活性の少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なく
とも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提供さ
れる。The antibodies of the present invention can act as agonists or antagonists of the polypeptide of the present invention. For example, the invention includes antibodies that disrupt receptor / ligand interactions with the polypeptides of the invention, either partially or completely. The invention has the characteristics of both receptor-specific and ligand-specific antibodies. The invention also features receptor-specific antibodies that do not interfere with ligand binding but do interfere with receptor activation. Receptor activation (ie, signal transduction) can be determined by techniques described herein or otherwise known in the art. For example, receptor activation can be determined by phosphorylation of the receptor (eg, tyrosine or serine / threonine), or by detecting its substrate by immunoprecipitation followed by Western blot analysis (eg, as described above). In certain embodiments, an antibody is provided that inhibits ligand activity or receptor activity in the absence of the antibody by at least 90%, at least 80%, at least 70%, at least 60%, or at least 50%. You.

【０２０４】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しな
い抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し、そしてレセプタ
ーへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結合し、それにより
レセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合することを妨げない
抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体を含む。これらの
抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例えば、レセプター
の二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性化の生物学的活性
化の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性化し得る。この抗
体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物学的活性を含む生
物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特
定化され得る。したがって、本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニス
トまたはアンタゴニストとして作用する抗体に関する。上記抗体アゴニストは、
当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４
０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（
６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒ
ａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８
）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１
７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）
：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎ
ｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅ
ｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（これらは全て、
その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。The invention also relates to receptor-specific antibodies that prevent both ligand binding and receptor activation, as well as to recognize receptor-ligand complexes and, preferably, to bind unbound receptors or unbound ligands to specific Have the characteristics of an antibody that does not recognize Similarly, the present invention relates to neutralizing antibodies that bind to a ligand and prevent the binding of the ligand to the receptor, and bind to the ligand, thereby preventing receptor activation but not preventing the ligand from binding the receptor. Including antibodies. Furthermore, the present invention includes antibodies that activate the receptor. These antibodies can act as receptor agonists, i.e., enhance or activate any or all of the biological activations of ligand-mediated receptor activation, e.g., by inducing receptor dimerization. obtain. The antibody can be specified as an agonist, antagonist or inverse agonist for a biological activity, including the specific biological activity of a peptide of the invention disclosed herein. Accordingly, the present invention further relates to antibodies that act as agonists or antagonists of the polypeptides of the present invention. The antibody agonist,
It can be made using methods known in the art. For example, PCT publication WO96 / 4
0281; U.S. Patent No. 5,811,097; Deng et al., Blood 92 (
6): 1981-1988 (1998); Chen et al., Cancer Res.
58 (16): 3668-3678 (1998); Harrop et al. Imm
unol. 161 (4): 1786-1794 (1998); Zhu et al., Can.
cer Res: 58 (15): 3209-3214 (1998); Yoon et al. Immunol. 160 (7): 3170-3179 (1998); Pr.
at et al. Cell. Sci. 111 (Pt2): 237-247 (1998
); Pitard et al. Immunol. Methods 205 (2): 1
77-190 (1997); Liauard et al., Cytokine 9 (4).
: 233-241 (1997); Carlson et al. Biol. Chem.
272 (17): 11295-11301 (1997); Taryman et al., N.
euron 14 (4): 755-762 (1995); Muller et al., St.
structure 6 (9): 1153-1167 (1998); Bartune.
k et al., Cytokine 8 (1): 14-20 (1996) (all of which
(Incorporated herein by reference in its entirety).

【０２０５】 本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを
精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロ
およびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は
、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定
量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照の
こと。The antibodies of the invention can be used, for example, but not limited to, purify, detect and target a polypeptide of the invention. These include diagnostic and therapeutic methods both in vitro and in vivo. For example, the antibodies have use in immunoassays for qualitatively and quantitatively measuring levels of a polypeptide of the invention in biological samples. For example, Harl
ow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (
Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Second Edition, 1988), which is incorporated herein by reference in its entirety.

【０２０６】 以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の化合
物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、ポリペプチド
または他の化合物へＮ末端でもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融
合され得るか、または化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得
る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およ
び異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェクター分子
へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９
５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９
９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。As discussed in further detail below, the antibodies of the present invention can be used either alone or in combination with other compounds. The antibody can be further recombinantly fused to the polypeptide or other compound at the N-terminus or C-terminus to a heterologous polypeptide, or chemically conjugated (including covalent and non-covalent bonds). For example, the antibodies of the present invention can be recombinantly fused or conjugated to molecules useful as labels in detection assays and to effector molecules such as heterologous polypeptides, drugs, radionuclides, or toxins. For example, PCT Publication WO92 / 0849
5; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. Pat. No. 5,314,9.
95; and EP 396,387.

【０２０７】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げ
ないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含
む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチ
ル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏ
ｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）
による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質
への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が
、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成など
を含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘
導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。The antibodies of the present invention may be modified (ie, covalently attached).
Attachment) includes derivatives (by covalent attachment of any type of molecule to the antibody) that do not prevent the antibody from producing an anti-idiotypic response. For example, without limitation, antibody derivatives include, for example, glycosylation, acetylation, pegylation, phosphorylation, and the like.
n), amidation, known protecting / blocking group
Antibodies that have been modified by derivatization, proteolytic cleavage, ligation to cellular ligands or other proteins, and the like. Numerous optional chemical modifications can be performed by known techniques, including but not limited to specific chemical cleavage, acetylation, formylation, metabolic synthesis of tunicamycin, and the like. Further, the derivative may contain one or more non-classical amino acids.

【０２０８】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、種々の宿主動物（ウサギ、
マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対し
て特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバ
ントが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そし
てこれにはフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネ
ラルゲル（ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プ
ルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマ
ルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに
ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐ
ａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定さ
れない。このようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。[0208] Antibodies of the present invention can be produced by any suitable method known in the art.
Polyclonal antibodies to an antigen of interest can be produced by various procedures well known in the art. For example, the polypeptides of the present invention can be used in various host animals (rabbits,
(Including but not limited to mice, rats, etc.) to induce the production of serum containing polyclonal antibodies specific for the antigen. Various adjuvants can be used to increase the immunological response, depending on the host species, including Freund (complete and incomplete), mineral gels such as aluminum hydroxide, mineral gels, Surfactants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin, dinitrophenol, and BCG (bacillus Calmette-Guerin) and corynebacterium p
Including but not limited to potentially useful human adjuvants such as arvum. Such adjuvants are also well-known in the art.

【０２０９】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてそれが生
成される方法に由来する抗体ではない。従って、用語「モノクローナル抗体」は
、ハイブリドーマ技術を通じて産生される抗体に限定されない。モノクローナル
抗体は、ハイブリドーマおよび組換えならびにファージディスプレイ技術の使用
を含む、当該分野で公知の広範な種々の技術を使用して調製され得る。[0209] Monoclonal antibodies can be prepared using a wide variety of techniques known in the art, including the use of hybridoma, recombinant, and phage display technologies, or a combination thereof. For example, monoclonal antibodies can be produced using the following hybridoma techniques known in the art and include, for example, Harr
low et al., Antibodies: A Laboratory Manual,
(Cold Spring Harbor Laboratory Press
Hammerling et al., Monoclonal An.
tibodies and T-Cell Hybridomas 563-6
81 (Elsevier, NY 1981), the above references being incorporated by reference in their entirety. As used herein, the term "monoclonal antibody" is not limited to antibodies produced through hybridoma technology. The term "monoclonal antibody" refers to an antibody derived from a single clone, including any eukaryotic, prokaryotic, or phage clone, and not the method by which it was generated. Thus, the term "monoclonal antibody" is not limited to antibodies produced through hybridoma technology. Monoclonal antibodies can be prepared using a wide variety of techniques known in the art, including the use of hybridoma and recombinant and phage display technologies.

【０２１０】 ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例１１に詳細に議論される。
手短に言えば、マウスは、本発明のポリペプチドまたはそのようなペプチドを発
現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応答が検出される（例えば、抗原に
特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウスの脾臓を収集しそして
脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の技術によって任意の適切な骨髄腫
細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に融合させ
る。ハイブリドーマを限界希釈によって選択およびクローン化する。次に、ハイ
ブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドを結合し得る抗体を分泌する細胞
について、当該分野で公知の方法によってアッセイする。一般的に高いレベルの
抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ）が、陽性ハイブリドーマクロー
ンを用いてマウスを免疫させることによって、産生され得る。Methods for producing and screening for specific antibodies using hybridoma technology are routine and well known in the art, and are discussed in detail in Example 11.
Briefly, mice can be immunized with a polypeptide of the invention or cells expressing such a peptide. Once an immune response is detected (eg, an antibody specific for the antigen is detected in the serum of the mouse), the spleen of the mouse is collected and splenocytes are isolated. The splenocytes are then fused by well known techniques to any suitable myeloma cells (eg, cells from cell line SP20 available from the ATCC). Hybridomas are selected and cloned by limiting dilution. Next, the hybridoma clones are assayed for cells secreting antibodies capable of binding the polypeptide of the invention by methods known in the art. Ascites fluid, which generally contains high levels of antibody, can be produced by immunizing mice with a positive hybridoma clone.

【０２１１】 従って、本発明は、モノクローナル抗体ならびに本発明の抗体を分泌するハイ
ブリドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成
する方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と
本発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発
明のポリペプチドを結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて
、融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成され
る。Accordingly, the present invention provides methods for producing monoclonal antibodies as well as antibodies produced by methods comprising culturing hybridoma cells secreting the antibodies of the present invention, wherein preferably the method comprises the steps of: Hybridomas are obtained by fusing myeloma cells with splenocytes isolated from a mouse immunized with an antigen of the invention, and then hybridomas resulting from the fusion, for hybridoma clones secreting antibodies capable of binding a polypeptide of the invention. Are produced by screening.

【０２１２】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。[0212] Antibody fragments that recognize a particular epitope can be generated by known techniques. For example, Fab and F (ab ') 2 fragments of the present invention comprise (Fa
It can be produced by proteolytic cleavage of immunoglobulin molecules using an enzyme such as papain (to produce the b-fragment) or pepsin (to produce the F (ab ') 2 fragment). The F (ab ') 2 fragment contains the variable region, the light chain constant region and the CH1 domain of the heavy chain.

【０２１３】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特に、そのようなファージは、レパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏ
ｉｒｅ）またはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス
）から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原
を結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同
定され得る（例えば、標識した抗原あるいは固体表面またはビーズに結合または
捕捉された抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代
表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタン
パク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定
化されたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３
結合ドメインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）であ
る。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例
としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；
Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−
９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７：９−１８（１９９７
）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：
１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；
ＰＣＴ公開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０
１０４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１
５９８２；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号
；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７
１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２
１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５
，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；
同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、
本明細書中でその全体が参考として援用される）。[0213] For example, the antibodies of the present invention can also be produced using various phage display methods known in the art. In phage display methods, functional antibody domains are displayed on the surface of phage particles that carry the polynucleotide sequences that encode them. In particular, such phages have a repertoire (reperto).
ire) or antigen binding domains expressed from combinatorial antibody libraries (eg, human or mouse). Phage expressing an antigen binding domain that binds the antigen of interest can be selected or identified using the antigen (eg, using a labeled antigen or an antigen bound or captured to a solid surface or beads). The phage used in these methods is typically a phage having the antibody domain of a Fab, Fv or disulfide stabilized Fv recombinantly fused to either the phage gene III protein or the phage gene VIII protein. Fd and M13 expressed from
Filamentous phage containing a binding domain. Examples of phage display methods that can be used to make the antibodies of the invention include the methods disclosed below: Brinkman et al. Im
munol. Methods 182: 41-50 (1995); Ames et al.,
J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995);
Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-
958 (1994); Persic et al., Gene 187: 9-18 (1997).
Burton et al., Advances in Immunology 57:
191-280 (1994); PCT Application No. PCT / GB91 / 01134;
PCT Publication WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/0
1047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/1
WO 95/20401; and U.S. Patent Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,7.
No. 17, No. 5,427,908; No. 5,750, 753; No. 5,82
No. 1,047; No. 5,571,698; No. 5,427,908; No. 5
, 516,637; 5,780,225; 5,658,727;
Nos. 5,733,743 and 5,969,108 (each of which is
Which is hereby incorporated by reference in its entirety).

【０２１４】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳
細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を
含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野
で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲ
Ｉ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（これらの参考文献は、その全体が参
考として援用される）。As described in the above references, after phage selection, the regions encoding phage-derived antibodies may be used to generate whole antibodies, including human antibodies, or any other desired antigen-binding fragment. Can be isolated and used, and can be expressed in any desired host, including, for example, mammalian cells, insect cells, plant cells, yeast and bacteria, as described in detail below. For example, techniques for recombinantly producing Fab, Fab ', and F (ab') 2 fragments can also be used using methods known in the art, and such methods are disclosed below. : PC
T-Publication WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechnique.
es 12 (6): 864-869 (1992); and Sawai et al., AJR.
I 34: 26-34 (1995); and Better et al., Science.
240: 1041-1043 (1988) (these references are incorporated by reference in their entirety).

【０２１５】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボの使用およびインビ
トロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体また
はヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部分が、
異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領
域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体を産生
するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７
，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号を参照
のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）。ヒト
化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫
グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原を結合する非
ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内のフレ
ームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合を変化さ
せるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置
換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によって同定
され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲお
よびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における
異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば、Ｑｕｅ
ｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体が参考と
して本明細書中に援用される）。）抗体は、以下を含む当該分野で公知の種々の
技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３９，４０
０号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；
同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（
ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（
欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９
１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７
（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９
６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓ
ｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。Examples of techniques that can be used to produce single chain Fvs and antibodies include US Pat. Nos. 4,946,778 and 5,258,498; Huston.
Et al., Methods in Enzymology 203: 46-88 (19
91); Shu et al., PNAS 90: 7995-7999 (1993); and Skerra et al., Science 240: 1038-1040 (1988). For some uses, including in vivo use of antibodies in humans and in vitro detection assays, the use of chimeric, humanized or human antibodies may be preferred. Chimeric antibodies are different parts of an antibody,
Molecules from different animal species (eg, antibodies having a variable region derived from a mouse monoclonal antibody and a human immunoglobulin constant region). Methods for producing chimeric antibodies are known in the art. For example, Morrison,
Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechni.
ques 4: 214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Am. Im
munol. Methods 125: 191-202; U.S. Pat. No. 5,807.
Nos. 4,715,567; and 4,816,397, which are incorporated herein by reference in their entirety. A humanized antibody is an antibody molecule from a non-human species antibody that binds a desired antigen having one or more complementarity determining regions (CDRs) from a non-human species and framework regions from a human immunoglobulin molecule. . Often, framework residues within the human framework regions are replaced with corresponding residues from a CDR donor antibody to alter (preferably improve) antigen binding. These framework substitutions are identified by methods well known in the art, for example, modeling the interaction of CDR and framework residues to identify framework residues important for antigen binding, and at specific positions. By sequence comparison to identify abnormal framework residues. (For example, Que
en et al., US Patent No. 5,585,089; Riechmann et al., Natur.
e 332: 323 (1988), which are incorporated herein by reference in their entirety. ) Antibodies can be humanized using various techniques known in the art, including: CDR-grafting (EP 239,40)
No. 0; PCT Publication WO 91/09967; US Pat. No. 5,225,539;
Nos. 5,530,101 and 5,585,089), veneer rings (
Vening or resurfacing (
EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Mole.
cultural Immunology 28 (4/5): 489-498 (199)
1); Studnicka et al., Protein Engineering 7
(6): 805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91: 9.
69-973 (1994)), and chain shuffling (chains).
huffling) (U.S. Pat. No. 5,565,332).

【０２１６】 完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ
公開ＷＯ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９
３、ＷＯ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３
５、およびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本
明細書中に援用される）もまた参照のこと。[0216] Fully human antibodies are particularly desirable for therapeutic treatment of human patients. Human antibodies can be produced by various methods known in the art, including the phage display method described above using an antibody library derived from human immunoglobulin sequences. U.S. Pat. Nos. 4,444,887 and 4,716,111; and PCT
Published WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/2489
3, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/3373
5, and WO 91/10741; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

【０２１７】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入
と別々にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失
は、内因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を拡張させ、そしてキメ
ラマウスを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次いで、キメラマウスを、
ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジ
ェニックマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体また
は部分）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、
従来のハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得ら
れ得る。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子
は、Ｂ細胞分化の間に再編成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細
胞変異を受ける。従って、そのような技術を使用して、治療的に有用なＩｇＧ抗
体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を
産生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ
、１９９５、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３を参照のこと
。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術ならびにそ
のような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、
ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３
５；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６
３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第
５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；および同第５，９３９，５
９８号を参照のこと（これらはその全体が本明細書中に参考として援用される）
。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎ
Ｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に類似した
技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。Human antibodies can also be produced using transgenic mice that are unable to express functional endogenous immunoglobulin, but are capable of expressing human immunoglobulin genes. For example, a complex of a human heavy chain immunoglobulin gene and a human light chain immunoglobulin gene can be introduced randomly or by homologous recombination into mouse embryonic stem cells. Alternatively, the human variable region, constant region, and diversity region (diversity)
region) can be introduced into mouse embryonic stem cells in addition to the human heavy and light chain genes. The mouse heavy and light chain immunoglobulin genes can be rendered non-functional separately or simultaneously with the introduction of the human immunoglobulin locus by homologous recombination. In particular, homozygous deletion of the JH region prevents endogenous antibody production. The modified embryonic stem cells are expanded and microinjected into blastocysts to produce chimeric mice. Then, the chimeric mouse was
Breed to produce homozygous offspring that express human antibodies. The transgenic mice are immunized in the normal fashion with a selected antigen (eg, all or a portion of a polypeptide of the invention). Monoclonal antibodies against the antigen
It can be obtained from immunized transgenic mice using conventional hybridoma technology. The human immunoglobulin transgenes retained in the transgenic mice rearrange during B cell differentiation, and subsequently undergo class switching and somatic mutation. Thus, using such a technique, it is possible to produce therapeutically useful IgG, IgA, IgM and IgE antibodies. For an overview of this technology for producing human antibodies, see Lonberg and Huszar.
, 1995, Int. Rev .. Immunol. 13: 65-93. For a detailed discussion of this technology for producing human and human monoclonal antibodies and protocols for producing such antibodies, see, e.g.,
PCT Publication WO98 / 24893; WO96 / 34096; WO96 / 3373
5, U.S. Patent Nos. 5,413,923; 5,625,126; 5,6.
Nos. 33,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; and 5,939,5.
No. 98, which are incorporated herein by reference in their entirety.
. Further, Abgenix, Inc. (Freemont, CA) and Gen
Companies such as Pharm (San Jose, CA) may be engaged in providing human antibodies against the selected antigen using techniques similar to those described above.

【０２１８】 選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体を、「誘導された（ｇｕｉｄ
ｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、選
択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトープ
を完全に認識するヒト抗体の選択を誘導するために使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓ
ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。A fully human antibody recognizing the selected epitope was identified as “guided (guid).
ed) Selection "techniques. In this approach, selected non-human monoclonal antibodies (eg, mouse antibodies) are used to guide the selection of human antibodies that fully recognize the same epitope (Jespers.
Et al., Bio / technology 12: 899-903 (1988)).

【０２１９】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドの多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競
合的に阻害する抗体が、ポリペプチドの多量体化ドメインおよび／または結合ド
メインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、そして結
果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する。
このような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグ
メントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに使用
され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチド
を結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターを結合するために使用
され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。In addition, antibodies to the polypeptides of the invention may in turn be utilized to generate anti-idiotypic antibodies that "mimic" the polypeptides of the invention using techniques well known to those of skill in the art. (Eg, Greenspan and Bona, FASEB
J. 7 (5): 437-444; (1989) and Nissinoff, J.
. Immunol. 147 (8): 2429-2438 (1991). E.g., bind and multimerize polypeptides
) and / or antibodies that competitively inhibit the binding of the polypeptide of the invention to its ligand are used to produce anti-idiotypes that "mimic" the multimerization and / or binding domains of the polypeptide. And thus binds and neutralizes the polypeptide and / or its ligand.
Neutralization of such anti-idiotypes or Fab fragments of such anti-idiotypes can be used in therapeutic regimes to neutralize polypeptide ligand. For example, such anti-idiotype antibodies can be used to bind a polypeptide of the invention and / or bind its ligand / receptor, thereby blocking its biological activity.

【０２２０】 （Ａ．抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異
的に結合する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む。A. Polynucleotides Encoding Antibodies The present invention further provides polynucleotides comprising nucleotide sequences encoding the antibodies of the present invention and fragments thereof. The present invention also provides antibodies (preferably as specifically defined above) under stringent or lower stringency hybridization conditions (preferably, which specifically bind to a polypeptide of the present invention, preferably , An antibody that binds to a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2).

【０２２１】 ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。[0221] A polynucleotide can be obtained by any method known in the art, and the nucleotide sequence of the polynucleotide is determined. For example, if the nucleotide sequence of an antibody is known, the polynucleotide encoding the antibody can be constructed from chemically synthesized oligonucleotides (eg, Kutmeie).
et al., BioTechniques 17: 242 (1994), which, in brief, involves the following steps: Synthesis of overlapping oligonucleotides containing portions of the sequence encoding the antibody. Annealing and ligation of these oligonucleotides, followed by amplification of the ligated oligonucleotides by PCR.

【０２２２】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する
任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体の発現のために選択されたハイ
ブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離さ
れた核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から、例えば、その抗体をコードする
ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、配列の３’末
端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅
によって、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使
用するクローニングによって得られ得る。ＰＣＲによって生成された増幅された
核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニン
グベクターにクローニングされ得る。Alternatively, a polynucleotide encoding an antibody can be produced from nucleic acid from a suitable source. If no clone is available containing the nucleic acid encoding the particular antibody, but the sequence of the antibody molecule is known, the nucleic acid encoding the immunoglobulin can be obtained from a suitable source (eg, an antibody cDNA library, or an antibody cDNA library). From any tissue or cell that expresses (eg, a hybridoma cell selected for expression of an antibody of the invention), or a nucleic acid (preferably poly A + RNA) isolated therefrom. For example, to identify a cDNA clone from a cDNA library that encodes the antibody, by PCR amplification using synthetic primers that can hybridize to the 3 'and 5' ends of the sequence, or specific to a particular gene sequence Can be obtained by cloning using a unique oligonucleotide probe The amplified nucleic acid generated by PCR can then be cloned into a replicable cloning vector using any method known in the art.

【０２２３】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。Once the nucleotide sequence and the corresponding amino acid sequence of the antibody have been determined,
The nucleotide sequence of an antibody can be determined by methods known in the art for manipulating nucleotide sequences (eg, recombinant DNA technology, site-directed mutagenesis, PCR, etc. (eg,
Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, AL.
laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
And Ausubel et al., Eds. 1998, Current Protocols.
in Molecular Biology, John Wiley & Sons
, NY. These are both incorporated herein by reference in their entirety. )) Can be used to generate antibodies with different amino acid sequences to make, for example, amino acid substitutions, deletions, and / or insertions.

【０２２４】 特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。In certain embodiments, the amino acid sequences of the heavy and / or light chain variable domains are identified by methods well known in the art for identification of complementarity determining region (CDR) sequences (eg, sequences To determine the region of hypervariability, other heavy chains,
And by comparing the variable region of the light chain with the known amino acid sequence). Using conventional recombinant DNA techniques, one or more CDRs can be inserted into a framework region as described above (eg, into a human framework region to humanize a non-human antibody). . The framework region can be naturally occurring or a consensus framework region, and can preferably be a human framework region (eg, for the listed human framework regions, see Chothia et al., J. Mol. Biol.278: 457-479 (1
998)). Preferably, the polynucleotide generated by the combination of the framework regions and the CDRs encodes an antibody that specifically binds a polypeptide of the invention. Preferably, as discussed above, one or more amino acid substitutions can be made within the framework regions, and preferably, the amino acid substitutions improve the binding of the antibody to its antigen. Further, such methods can produce antibody molecules that lack one or more intrachain disulfide bonds,
It can be used to make amino acid substitutions or deletions of cysteine residues in one or more of the variable regions involved in intrachain disulfide bonds. Other changes to polynucleotides are encompassed by the present invention and in the art.

【０２２５】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ
ら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４）が使用され得る。上記
のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、こ
のような分子は、マウスモノクローナル抗体およびヒト免疫グロブリンの定常領
域由来の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。Furthermore, by splicing genes from mouse antibody molecules of appropriate antigen specificity with genes from human antibody molecules of appropriate biological activity,
Techniques developed to produce "chimeric antibodies" (Morrison et al., 1984)
Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855; Neube
rger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda.
Et al., 1985, Nature 314: 452-454) may be used. As described above, chimeric antibodies are molecules in which different portions are derived from different animal species, and such molecules have variable regions derived from the constant regions of mouse monoclonal antibodies and human immunoglobulins (eg, humanized antibodies). ).

【０２２６】 あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，６９４，
７７８号；Ｂｉｒｄ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２；Ｈｕ
ｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５
：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：
５４４−５５４）が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の
重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されるこ
とによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能性
Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋｅｒｒ
ａら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１）。Alternatively, techniques described for the production of single-chain antibodies (US Pat. No. 4,694,941)
No. 778; Bird, 1988, Science 242: 423-42; Hu
Stone et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85
: 5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334:
544-554) can be adapted for the production of single chain antibodies. Single chain antibodies are formed by linking the heavy and light chain fragments of the Fv region via an amino acid bridge, resulting in a single chain polypeptide. E. FIG. Techniques for the assembly of functional Fv fragments in E. coli can also be used (Skerr
a, et al., 1988, Science 242: 1038-1041).

【０２２７】 （Ｂ．抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生
され得る。B. Methods for Producing Antibodies The antibodies of the present invention can be prepared by any method known in the art for synthesizing antibodies, particularly by chemical synthesis, or preferably, by recombinant expression techniques. Can be produced.

【０２２８】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖）の組換え発現は、その抗体をコードするポリ
ヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。一旦、本発明の抗体
分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分（好ましくは、重鎖
または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られ
ると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を用いる組換
えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコードするヌクレオチド配
列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法
は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列なら
びに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの
構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば、インビトロの組換えＤ
ＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本
発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはそ
の重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌク
レオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、
抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開
ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと
）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの抗体の可変ドメインは、
重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得
る。The antibodies of the present invention, or fragments, derivatives or analogs thereof (eg,
Recombinant expression of the antibody (heavy or light chain) of the present invention requires the construction of an expression vector containing a polynucleotide encoding the antibody. Once a polynucleotide encoding the antibody molecule or antibody heavy or light chain, or portions thereof, (preferably containing the heavy or light chain variable domains) of the invention is obtained, the production of the antibody molecule is Can be produced by recombinant DNA technology using techniques well known in the art. Accordingly, methods for preparing a protein by expression of a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding an antibody are described herein. Methods well known to those skilled in the art can be used for the construction of expression vectors containing antibody-encoding sequences and appropriate transcriptional and translational control signals. These methods include, for example, in vitro recombinant D
NA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination. Accordingly, the present invention provides a replicable vector comprising a nucleotide sequence encoding an antibody molecule of the present invention, or a heavy or light chain thereof, or a variable domain of a heavy or light chain, operably linked to a promoter. I will provide a. Such a vector is
And may comprise a nucleotide sequence encoding the constant region of an antibody molecule (see, eg, PCT Publication WO 86/05807; PCT Publication WO 89/01036; and US Pat. No. 5,122,464), and the variable domain of the antibody. Is
It can be cloned into such a vector for expression of the entire heavy or light chain.

【０２２９】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
した、本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチ
ドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態におい
て、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように、
免疫グロブリン分子の全体の発現のために宿主細胞において同時発現され得る。The expression vector is transferred to a host cell by conventional techniques, and the transfected cells are then cultured by conventional techniques to produce an antibody of the present invention. Accordingly, the invention includes a host cell comprising a polynucleotide encoding an antibody of the invention, or a heavy or light chain thereof, operably linked to a heterologous promoter. In a preferred embodiment for expression of a double-chain antibody, the vector encoding both the heavy and light chains is, as detailed below,
It may be co-expressed in a host cell for total expression of the immunoglobulin molecule.

【０２３０】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表すが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形質
転換またはトランスフェクトされる場合には、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、抗体をコードする配列を含む組換えバ
クテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクター
を用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
のような微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転
換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体を
コードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス
）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー
モザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植
物細胞系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例
えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞の
ゲノムから誘導されたプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）
または哺乳動物のウイルスから誘導されたプロモーター（例えば、アデノウイル
ス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え
発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９
３、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。組換え抗体分子の発
現のために、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞
、そしてより好ましくは、特に、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細
胞が使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子
プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハム
スターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発
現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、１９８６，Ｇｅｎｅ ４５：１０１；Ｃｏｃ
ｋｅｔｔら、１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２）。[0230] A variety of host expression vector systems can be utilized to express the antibody molecules of the present invention. Such host expression systems represent vehicles in which the coding sequence of interest can be produced and subsequently purified, but also when transformed or transfected with sequences encoding the appropriate nucleotides, in situ. 1 represents a cell capable of expressing the antibody molecule of the present invention. These include bacteria (eg, E. coli, B. subtilis) transformed with a recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA expression vector containing the sequence encoding the antibody.
Such as microorganisms; yeast transformed with a recombinant yeast expression vector containing a sequence encoding an antibody (eg, Saccharomyces, Pichia); and a recombinant virus expression vector containing a sequence encoding an antibody (eg, baculovirus). Infected insect cell lines; plant cell lines infected with a recombinant viral expression vector (eg, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or a recombinant plasmid expression vector containing a sequence encoding an antibody (eg, a Ti plasmid )); Or a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg, a metallothionein promoter).
Alternatively, a mammalian cell line (eg, COS, CHO, BHK, 29) carrying a recombinant expression construct containing a promoter derived from a mammalian virus (eg, adenovirus late promoter; vaccinia virus 7.5K promoter).
3, 3T3 cells). For expression of recombinant antibody molecules, preferably bacterial cells such as Escherichia coli, and more preferably, eukaryotic cells are used, especially for expression of whole recombinant antibody molecules. For example, mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells (CHO) in combination with vectors such as the major intermediate early gene promoter element from human cytomegalovirus are an effective expression system for antibodies. (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101; Coc.
kett et al., 1990, Bio / Technology 8: 2).

【０２３１】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
場合、抗体分子の薬学組成物の作製のために、容易に精製される融合タンパク質
産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクター
には、抗体をコードする領域がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにイン
フレームで個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏ
ｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３，ＥＭＢＯ Ｊ．２
：１７９１）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、１９８５，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅ
ｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３
−５５０９）などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターも
また、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質とし
て、外来性ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、このような
融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞から、マトリックスグルタ
チオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グルタチオン存
在化での溶出によって容易に精製され得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビ
ンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、この
クローン化された標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から放出され得る。[0231] In bacterial systems, a number of expression vectors may be advantageously selected depending upon the use intended for the expression of the antibody molecule. For example, where large quantities of such proteins are produced, vectors that direct high levels of expression of fusion protein products that are readily purified may be desirable for the production of pharmaceutical compositions of antibody molecules. In such a vector, the region encoding the antibody can be separately linked in frame with the vector along with the region encoding lacZ, resulting in the production of a fusion protein. co
li expression vector pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J.2
: 1791); pIN vector (Inouye & Inouye, 1985, Nu)
cleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Hee
ke & Schuster, 1989, J. Am. Biol. Chem. 24: 5503
-5509) and the like, but are not limited thereto. The pGEX vector can also be used as a fusion protein with glutathione S-transferase (GST) to express foreign polypeptides. Generally, such fusion proteins are soluble and can be readily purified from lysed cells by adsorption and binding to matrix glutathione-agarose beads, followed by elution in the presence of free glutathione. The pGEX vector is designed to include a thrombin or factor Xa protease cleavage site so that the cloned target gene product can be released from the GST moiety.

【０２３２】 昆虫系において、オートグラファカリフォルニカ核多核体病ウイルス（Ａｕｔ
ｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒ
ｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、外来性遺伝子を発現させるためのベ
クターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉ
ｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。この抗体をコードする配列は、ウイルスの非必須
領域（例えば、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）に個々にクロー
ン化され得、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモータ
ー）の制御下に配置され得る。In an insect system, Autographa californica nuclear polynucleosis virus (Aut)
Ographa California nuclear polyhedr
Osis virus (AcNPV) is used as a vector for expressing a foreign gene. The virus is Spodoptera frugi
Proliferate in perda cells. Sequences encoding this antibody can be cloned individually into non-essential regions of the virus, such as the polyhedrin gene, and placed under the control of an AcNPV promoter, such as the polyhedrin promoter.

【０２３３】 哺乳動物の宿主細胞において、多くのウイルスベースの発現系が利用され得る
。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、抗体をコードする目的
の配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターお
よび３部からなるリーダー配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は
、インビトロまたはインビボの組換えによって、アデノウイルスゲノム中に挿入
され得る。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への
挿入は、感染した宿主において生存し、かつ抗体分子を発現し得る組換えウイル
スを生じる。（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９を参照のこと）。特定の
開始シグナルもまた、挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳のために
必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を
含む。さらに、この開始コドンは、挿入物全体の翻訳を保証するように、所望の
コード配列のリーディングフレームと同調でなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源ので
あり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネー
ターなどを含めることによって増大され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４を参照のこと）。[0233] In mammalian host cells, a number of viral-based expression systems may be utilized. If an adenovirus is used as the expression vector, the sequence of interest encoding the antibody may be ligated to an adenovirus transcription / translation control complex (eg, the late promoter and tripartite leader sequence). This chimeric gene can then be inserted into the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. Insertion into a non-essential region of the viral genome (eg, region E1 or E3) results in a recombinant virus that survives in the infected host and can express the antibody molecule. (See, e.g., Logan & Shenk, 1984, Proc. Nat.
l. Acad. Sci. ScL USA 81: 355-359). Certain initiation signals may also be required for efficient translation of the inserted antibody-encoding sequence. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences. In addition, this initiation codon must be in phase with the reading frame of the desired coding sequence to ensure translation of the entire insert. These exogenous translational control signals and initiation codons can be of various origins, both natural and synthetic. The efficiency of expression can be increased by including appropriate transcription enhancer elements, transcription terminators, etc. (Bittner et al., 1987, M
methods in Enzymol. 153: 51-544).

【０２３４】 さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特定
の様式に改変およびプロセスする宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質産物
のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断
）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク
質産物および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変について特徴的かつ特
定の機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現した外来性タンパク質の
正確な改変およびプロセシングを保証するように選択され得る。この目的のため
に、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン
酸化のための細胞の機構を有する真核生物の宿主細胞が使用され得る。このよう
な哺乳動物の宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、Ｍ
ＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および、特に、乳癌細胞株（例えば、ＢＴ
４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄなど）、ならびに正
常な乳腺細胞株（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなど）が挙げ
られるが、これらに限定されない。In addition, a host cell strain may be chosen which modulates the expression of the inserted sequences, or modifies and processes the gene product in the specific fashion desired. Such modifications (eg, glycosylation) and processing (eg, cleavage) of protein products may be important for the function of the protein. Different host cells have characteristic and specific mechanisms for the post-translational processing and modification of protein and gene products. Appropriate cell lines or host systems can be chosen to ensure the correct modification and processing of the foreign protein expressed. To this end, eukaryotic host cells that have the cellular machinery for proper processing of the primary transcript, glycosylation of the gene product, and phosphorylation can be used. Such mammalian host cells include CHO, VERY, BHK, Hela, COS, M
DCK, 293, 3T3, WI38, and especially breast cancer cell lines (eg, BT
483, Hs578T, HTB2, BT20 and T47D) and normal mammary gland cell lines (such as CRL7030 and Hs578Bst).

【０２３５】 組換えタンパク質の長期的で高収率の産生のために、安定した発現が好ましい
。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株が操作され得る。宿主細胞は、ウ
イルスの複製起点を含む発現ベクターの使用ではなく、適切な発現制御エレメン
ト（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリア
デニル化部位など）、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換
され得る。外来性ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、濃縮された培地中
で１〜２日間増殖され得、次いで選択培地に切り換えられる。組換えプラスミド
中の選択マーカーは、選択への耐性を与え、そして細胞がプラスミドをそれらの
染色体に安定に組み込むことを可能とし、そして増殖し、次いで細胞株にクロー
ニングおよび増殖され得る病巣を形成する。この方法は、抗体分子を発現する細
胞株を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、抗
体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価
において特に有用であり得る。For long-term, high-yield production of recombinant proteins, stable expression is preferred. For example, cell lines that stably express the antibody molecule can be engineered. Rather than using an expression vector containing a viral origin of replication, the host cells are transfected with appropriate expression control elements (eg, promoters, enhancers, sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.), and DNA controlled by a selectable marker. Can be converted. Following the introduction of the exogenous DNA, the engineered cells can be grown for 1-2 days in a concentrated medium and then switched to a selective medium. The selectable marker in the recombinant plasmid confers resistance to selection and allows cells to stably integrate the plasmid into their chromosomes, and grow, forming foci that can then be cloned and propagated into cell lines. . This method can be advantageously used to engineer cell lines that express the antibody molecule. Such engineered cell lines may be particularly useful in screening and evaluating compounds that interact directly or indirectly with the antibody molecule.

【０２３６】 多くの選択系が使用され得、それらには、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、ま
たはａｐｒｔ−細胞において使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナ
ーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７，Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン
−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚ
ｙｂａｌｓｋｉ、１９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４
８：２０２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら
、１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子が挙げられるが、これらに限定さ
れない。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用され
得る：メトトレキサートへの耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０
，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７）；Ｏ’Ｈａｒｅら、１
９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７；ミ
コフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、１
９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２）；
アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈ
ａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ、１９９１，Ｂｉｏｔｈ
ｅｒａｐｙ ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉ
ｇａｎ、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２；ならびにＭｏｒ
ｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
６２：１９１−２１７；１９９３年５月，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５
５−２１５）；ならびにハイグロマイシンへの耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎ
ｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ １９８４，３０：１４７（））。当該分野で一般に公
知である組換えＤＮＡ技術の方法は、所望の組換えクローンの選択に慣用的に適
用され得、そしてこのような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９
３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９
０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ならび
にＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，
ＮＹの１２および１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１，Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１に記載され、これらはその全体が本明細書にお
いて参考として援用される。A number of selection systems can be used, including herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hypo, which can be used in tk-, hgprt-, or aprt- cells, respectively. Xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Szybalska and Sz
ybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4
8: 202), and the adenine phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) gene. Also, antimetabolite resistance can be used as a basis for selection of the following genes: dhfr (Wigler et al., 1980), which confers resistance to methotrexate.
Natl. Acad. Sci. ScL USA 77: 357); O'Hare et al., 1
981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527; gpt conferring resistance to mycophenolic acid (Mulligan and Berg, 1
981, Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 78: 2072);
Neo (Clinical Ph) which confers resistance to aminoglycoside G-418
armacy 12: 488-505; Wu and Wu, 1991, Bioth.
erapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Re
v. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulli
gan, 1993, Science 260: 926-932; and Mor
gan and Anderson, 1993, Ann. Rev .. Biochem.
62: 191-217; May 1993, TIB TECH 11 (5): 15.
5-215); and hygro (San) which confers resistance to hygromycin.
Terre et al., Gene 1984, 30: 147 ()). Methods of recombinant DNA technology generally known in the art can be routinely applied to the selection of desired recombinant clones, and such methods are described, for example, in Ausubel et al.
3, Current Protocols in Molecular Bio
Kryegler, 199, J. Logy, John Wiley & Sons, NY;
0, Gene Transfer and Expression, A Lab
laboratory Manual, Stockton Press, NY; and Dracopoli et al. (eds.), 1994, Current Protocol.
s in Human Genetics, John Wiley & Sons,
NY Chapters 12 and 13; Colberre-Garapin et al., 1981, J.
. Mol. Biol. 150: 1, which are incorporated herein by reference in their entirety.

【０２３７】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加され得る（総説について
は、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ
ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉ
ｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，第３巻
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。抗体を発
現するベクター系においてマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養液に
おいて存在するインヒビターのレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピーの数を
増加する。この増幅された領域が抗体遺伝子と結合しているために、この抗体の
産生もまた、増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３：２５７）。The expression level of an antibody molecule can be increased by vector amplification (for a review, see Bebbington and Hentschel, The use of
vectors based on gene amplification
for the expression of cloned genes i
n mammarian cells in DNA cloning, Volume 3 (Academic Press, New York, 1987). If the marker is amplifiable in a vector system expressing the antibody, increasing the level of inhibitor present in the culture of the host cell will increase the number of copies of the marker gene. Because the amplified region is linked to the antibody gene, production of the antibody is also increased (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Bio.
l. 3: 257).

【０２３８】 その宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター（重鎖から誘導されるポリペプ
チドをコードする第１のベクターおよび軽鎖から誘導されるポリペプチドをコー
ドする第２のベクター）で同時トランスフェクトされ得る。この２つのベクター
は、重鎖および軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能とする同一の選択マーカ
ーを含み得る。あるいは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの両方をコードする単
一のベクターが使用され得る。このような状況において、この軽鎖は、過剰の有
毒な遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆ
ｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ １９８６，３２２：５２；Ｋｏｈｌｅｒ、１９８０，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７）。重鎖および
軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。The host cells may be co-expressed with two expression vectors of the invention (a first vector encoding a polypeptide derived from the heavy chain and a second vector encoding a polypeptide derived from the light chain). Can be transfected. The two vectors may contain the same selectable marker that allows for equal expression of the heavy and light chain polypeptides. Alternatively, a single vector encoding both heavy and light chain polypeptides can be used. In such situations, the light chain should be placed before the heavy chain to avoid excess toxic free heavy chains (Proudf
oot, Nature 1986, 322: 52; Kohler, 1980, P.
rc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 77: 2197). The heavy and light chain coding sequences can include cDNA or genomic DNA.

【０２３９】 一旦、本発明の抗体分子が、動物、化学合成、または組換え的に発現されると
、この抗体分子は、免疫グロブリン分子の精製についての当該分野で公知の任意
の方法によって（例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティー（特にタンパク質Ａの後の特異的抗原へのアフィニテ
ィーによる）クロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー
）、遠心分離、差示的溶解度によって、またはタンパク質の精製についての他の
任意の標準的な技術によって）精製され得る。Once an antibody molecule of the invention has been expressed in animals, chemically synthesized, or recombinantly, the antibody molecule can be purified by any method known in the art for the purification of immunoglobulin molecules (eg, , Chromatography (eg, ion exchange chromatography, affinity (especially by protein A followed by affinity to a specific antigen), and sizing column chromatography), centrifugation, differential solubility, or protein purification. Can be purified (by any other standard technique).

【０２４０】 （Ｃ．抗体接合体） 本発明は、融合タンパク質を作製するために、本発明のポリペプチド（または
それらの一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、２０もしくは５０
個のアミノ酸）と組換え的に融合したか、あるいは化学的に結合（共有結合およ
び非共有結合の両方を含む）した抗体を含む。この融合は、必ずしも直接的であ
る必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。この抗体は、本発明のポリ
ペプチド（またはそれらの一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、
２０もしくは５０個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗体
は、本発明のポリペプチドを、インビトロまたはインビボのいずれかで、特定の
細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合させるかまたは結合させることによっ
て、本発明のポリペプチドを特定の細胞型に標的化するために使用され得る。本
発明のポリペプチドに融合されたかまたは結合された抗体はまた、当該分野で公
知の方法を使用してインビトロイムノアッセイおよび精製方法にて使用され得る
。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出およびＰＣＴ公開ＷＯ ９３／２１２３２；Ｅ
Ｐ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９
１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、
ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）（これらは、それらの全体が
参考として援用される）を参照のこと。C. Antibody Conjugates The present invention relates to polypeptides of the present invention (or a portion thereof, preferably at least 10, 20 or 50 of a polypeptide) for making fusion proteins.
Amino acids), or antibodies that are chemically fused (including both covalent and non-covalent bonds). The fusion need not be direct, but can occur through a linker sequence. The antibody may comprise a polypeptide of the invention (or a portion thereof, preferably at least 10,
(20 or 50 amino acids). For example, an antibody can be used to fuse a polypeptide of the invention, either in vitro or in vivo, to an antibody specific for a particular cell surface receptor, thereby binding the polypeptide of the invention to a particular cell type. Can be used to target Antibodies fused or conjugated to a polypeptide of the invention can also be used in in vitro immunoassays and purification methods using methods known in the art. See, for example, Harbor et al., Supra and PCT Publication WO 93/21232;
P439, 095; Naramura et al., Immunol. Lett. 39: 9
1-99 (1994); U.S. Pat. No. 5,474,981; Gillies et al.
PNAS 89: 1428-1432 (1992); Fell et al. Immu
nol. 146: 2446-2452 (1991), which are incorporated by reference in their entirety.

【０２４１】 本発明はさらに、可変領域以外の抗体のドメインに融合されたかまたは結合さ
れた本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチド
を、抗体のＦｃ領域、あるいはその一部に融合または結合され得る。本発明のポ
リペプチドに融合された抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、
ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、あるいはそれらのドメイン全体または
部分の任意の組合せを含み得る。このポリペプチドはまた、上記の抗体部分に融
合または結合し、マルチマーを形成し得る。例えば、本発明のポリペプチドと融
合したＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合を介して二量体を形成し得る
。より高次なマルチマー形態は、このポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分
に融合することにより作製され得る。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合ま
たは結合するための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第
５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号
；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９
４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ ９６
／０４３８８；ＷＯ ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１
）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０〜５６００（１９９
５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
；１１３３７〜１１３４１（１９９２）（上記の参考文献は、それらの全体が参
考として援用される）を参照のこと。The present invention further includes compositions comprising a polypeptide of the present invention fused or conjugated to a domain of an antibody other than the variable region. For example, a polypeptide of the invention can be fused or conjugated to the Fc region of an antibody, or a portion thereof. The antibody portion fused to the polypeptide of the present invention comprises a constant region, a hinge region, a CH1 domain,
It may comprise a CH2 domain, and a CH3 domain, or any combination of all or part of those domains. The polypeptide can also be fused or conjugated to the antibody portion described above to form a multimer. For example, an Fc portion fused to a polypeptide of the invention can form a dimer via a disulfide bond between the Fc portions. Higher order multimeric forms can be made by fusing the polypeptide to portions of IgA and IgM. Methods for fusing or linking a polypeptide of the invention to an antibody moiety are known in the art. For example, U.S. Patent Nos. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851; 5,112,9
No. 46; EP 307, 434; EP 367, 166; PCT Publication WO 96
WO 91/06570; Ashkenazi et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10538 (1991)
); Zheng et al. Immunol. 154: 5590-5600 (199
5); and Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89
11337-11341 (1992) (the above references are incorporated by reference in their entirety).

【０２４２】 上記で議論されるように、本発明のポリペプチドは、このポリペプチドのイン
ビボの半減期を増加するか、または当該分野で公知の方法を使用するイムノアッ
セイにおける使用のために、上記の抗体部分と融合または結合され得る。さらに
、本発明のポリペプチドは、精製を容易にするために、上記の抗体部分に融合ま
たは結合され得る。１つの報告された実施例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの第１
の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域
の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する。（ＥＰ ３９４，８２
７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８）
）。ジスルフィド連結した二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合
または結合した本発明のポリヌクレオチドはまた、単量体分泌タンパク質または
タンパク質フラグメント単独よりも、他の分子との結合および中和においてより
効率的であり得る。（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７
０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合において、融合タンパク質
のＦｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、例えば、改良され
た薬物動態学的な特性を生じ得る。（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるいは、
融合タンパク質が発現、検出、および精製された後のＦｃ部分の欠損が、好まし
い。例えば、この融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、
このＦｃタンパク質は、治療および診断を妨げ得る。薬物の開発において、例え
ば、ヒトタンパク質（例えばｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同
定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のために、Ｆｃタ
ンパク質と融合された。（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒ
ｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照の
こと）。As discussed above, the polypeptides of the invention may increase the in vivo half-life of the polypeptide or may be used as described above for use in immunoassays using methods known in the art. It can be fused or conjugated to an antibody moiety. Further, the polypeptides of the present invention can be fused or conjugated to the antibody portions described above to facilitate purification. One reported example is the first human CD4 polypeptide.
And a chimeric protein consisting of two domains of various regions of the heavy or light chain constant region of a mammalian immunoglobulin. (EP 394, 82
7; Traunecker et al., Nature 331: 84-86 (1988).
). Polynucleotides of the invention fused or conjugated to an antibody having a disulfide-linked dimeric structure (due to IgG) also bind and neutralize other molecules than monomeric secreted proteins or protein fragments alone. May be more efficient. (Funtoulakis et al., J. Biochem. 27
0: 3958-3964 (1995)). In many cases, the Fc portion of the fusion protein is advantageous in therapy and diagnosis, and thus may result, for example, in improved pharmacokinetic properties. (EP A 232,262). Or,
Deletion of the Fc portion after the fusion protein has been expressed, detected, and purified is preferred. For example, if this fusion protein is used as an antigen for immunization,
This Fc protein can interfere with therapy and diagnosis. In drug development, for example, human proteins (eg, hIL-5) have been fused with Fc proteins for the purpose of high-throughput screening assays to identify antagonists of hIL-5. (D. Bennett et al., J. Molecular R.
Economy 8: 52-58 (1995); Johanson et al. Biol. Chem. 270: 9449-9471 (1995)).

【０２４３】 さらに、本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、精製を容易にするペプ
チドのような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において、この
マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．
，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１
１）において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、それ
らの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８４）に記載されるように
、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用
な他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピト
ープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９
８４））および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。Further, the antibodies or fragments thereof of the present invention can be fused to a marker sequence, such as a peptide to facilitate purification. In a preferred embodiment, the marker amino acid sequence is, inter alia, a pQE vector (QIAGEN, Inc.).
, 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 9131.
Hex-histidine peptides such as the tags provided in 1), many of which are commercially available. See, for example, Gentz et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 86: 821-824 (1984), hexa-histidine provides for convenient purification of the fusion protein. Other peptide tags useful for purification include the “HA” tag corresponding to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein (Wilson et al., Cell 37: 767 (19).
84)) and the "flag" tag.

【０２４４】 本発明はさらに、診断剤、または試料薬剤に結合する抗体またはそのフラグメ
ントを含む。この抗体は、例えば、臨床試験の手順の一部（例えば、所定の治療
レジメおよび／または予防レジメの有効性を決定するための）として、腫瘍の発
生または進行をモニターするために診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出
可能な物質にカップリングすることによって容易にされ得る。検出可能な物質の
例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性
物質、種々の陽電子射出断層撮影法を使用する陽電子射出金属、および非放射性
常磁性金属イオンが挙げられる。本発明に従う診断薬として使用するための抗体
に結合され得る金属イオンとしては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号
を参照のこと。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙
げられ；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよ
びアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン
、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロ
トリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリ
ンが挙げられ；発光物質の例には、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例に
は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；適切な放射
性物質の例には、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎまたは99Ｔｃが挙げられる。The present invention further includes antibodies or fragments thereof that bind to a diagnostic or sample agent. The antibodies can be used diagnostically to monitor tumor development or progression, for example, as part of a clinical trial procedure (eg, to determine the efficacy of a given therapeutic and / or prophylactic regime). Can be done. Detection can be facilitated by coupling the antibody to a detectable substance. Examples of detectable substances include various enzymes, prosthetic groups, fluorescent materials, luminescent materials, bioluminescent materials, radioactive materials, positron-emitting metals using various positron emission tomography, and non-radioactive paramagnetic metals Ions. See, for example, US Pat. No. 4,741,900 for metal ions that can be conjugated to antibodies for use as diagnostics according to the present invention. Examples of suitable enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, or acetylcholinesterase; examples of suitable prosthetic group complexes include streptavidin / biotin and avidin / biotin; Examples of suitable fluorescent materials include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride or phycoerythrin; examples of luminescent materials include luminol; Examples include luciferase, luciferin, and aequorin; examples of suitable radioactive materials include 125 I, 131 I, 111 In, or 99 Tc.

【０２４５】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、細胞毒（例えば、細胞増殖抑制剤ま
たは細胞破壊剤）、試料薬剤または放射性金属イオンのような治療的な部分と結
合され得る。細胞毒または細胞毒性の薬剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。
例には、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロ
マイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓ
ｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダ
ウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、ミトラマイ
シン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド
、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイ
シンならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。試料薬剤としては
、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオ
グアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（
例えば、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオエパ（ｔｉ
ｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロ
ムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄ
ｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐ
ｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金
（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃ
ｌｉｎｅ）（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、およびドキソ
ルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン
）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａ
ｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸***剤（例えば、ビンクリスチンお
よびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。In addition, the antibodies or fragments thereof can be conjugated to a therapeutic moiety, such as a cytotoxin (eg, a cytostatic or cytocidal agent), a sample agent or a radiometal ion. Cytotoxic or cytotoxic agents include any agents that are harmful to cells.
Examples include paclitaxel, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetin, mitomycin, etoposide, tenoposide (tenopos).
ide), vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracindione, mitozantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, and puromycin and the like. Analogs or homologs may be mentioned. Sample drugs include antimetabolites (eg, methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, 5-fluorouracil decarbazine), alkylating agents (
For example, mechlorethamine, thioepa (ti)
oepa) chlorambucil, melphalan, carmustine (BSNU) and lomustine (CCNU), cyclophosphamide (cyclophosphamide)
e), busulfan, dibromomannitol, streptozotocin (strep)
tozotocin), mitomycin C, and cis-dichlorodiamineplatinum (II) (DDP) cisplatin), anthracycline
line) (eg, daunorubicin (formerly daunomycin), and doxorubicin), antibiotics (eg, dactinomycin (formerly actinomycin), bleomycin, mitramycin, and anthramycin (anthramicin)
mycin) (AMC)), and antimitotic agents (eg, vincristine and vinblastine).

【０２４６】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答の改変のために使用され得、この試料
薬剤または薬物部分は、古典的な化学療法剤に制限されると解釈されるべきでは
ない。例えば、この薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質また
はポリペプチドであり得る。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リ
シンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死
因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由
来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓剤または抗脈管形成剤（例
えば、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）またはエンドスタチン（ｅ
ｎｄｏｓｔａｔｉｎ））のようなタンパク質；あるいは、生物学的応答改変剤（
例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイ
キン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マ
クロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子
（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子など）が挙げられ得る。The conjugates of the present invention can be used for modifying a given biological response, and the sample drug or drug moiety should not be construed as being limited to classic chemotherapeutic agents. . For example, the drug moiety can be a protein or polypeptide that possesses the desired biological activity. Such proteins include, for example, toxins such as abrin, ricin A, pseudomonas exotoxin, or diphtheria toxin; tumor necrosis factor, α-interferon, β-interferon, nerve growth factor, platelet-derived growth factor, tissue plasminol. Gene activators, thrombotics or anti-angiogenic agents (eg, angiostatin or endostatin (e
ndostatin)); or a biological response modifier (
For example, lymphokines, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), granulocyte macrophage colony stimulating factor ("GM- CSF "), granulocyte colony stimulating factor (" G-CSF "), or other growth factors and the like.

【０２４７】 抗体はまた、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固体支持体に
付着され得る。このような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリル
アミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げ
られるが、これらに限定されない。Antibodies can also be attached to a solid support that is particularly useful for immunoassays or purification of the target antigen. Such solid supports include, but are not limited to, glass, cellulose, polyacrylamide, nylon, polystyrene, polyvinyl chloride or polypropylene.

【０２４８】 このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅ
ｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒ
ｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１
９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒ
ｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ
Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃｎａｃｅｒ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、
３０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒ
ｐｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐ
ｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこ
と。Techniques for coupling such therapeutic moieties to antibodies are well known and include, for example, Arnon
Et al., "Monoclonal Antibodies For Immunot."
arranging Of Drugs In Cancer Therapy "
Monoclonal Antibodies And Cancer The The
rapy, Reisfeld et al. (eds.), pages 243-56 (Alan R. Lis.
s, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies F.
or Drug Delivery ", Controlled Drug De
livery (second edition), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Mar
cel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibod
y Carriers Of Cytotoxic Agents In Ca
nc Therapy: A Review ", Monoclonal An
tibodies'84: Biological And Clinical
Applications, Pinchera et al. (Eds.), Pages 475-506 (1
985); “Analysis, Results, And Future Pr.
Ospective Of The Therapeutic Use Of
Radiolabeled Antibody In Cancer Ther
apy ", Monoclonal Antibodies For Cance
r Detection And Therapy, Baldwin et al.
Pages 303-16 (Academic Press 1985), and Thor
Pe et al., "The Preparation And Cytotoxic P
rightsies of Antibody-Toxin Conjugator
es ", Immunol. Rev .. 62: 119-58 (1982).

【０２４９】 あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（こ
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る
。Alternatively, the antibody is conjugated to a secondary antibody and antibody heteroconjugates as described by Segal in US Pat. No. 4,676,980, which is incorporated by reference herein in its entirety. Heterojugates may be formed.

【０２５０】 単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与
される、抗体に結合される治療部分を有するかまたは有さない抗体が、試料薬剤
として使用され得る。Antibodies with or without therapeutic moieties attached to the antibodies, administered alone or in combination with cytotoxic factors and / or cytokines, can be used as sample agents.

【０２５１】 （Ｄ．抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、（いくつかの
ものについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ
、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ
、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集ア
ッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロ
テインＡイムノアッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッ
セイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的で
あり、そして当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参
考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例
示的なイムノアッセイが、以下に簡潔に記載される（しかし、これらは限定を目
的とすることが意図されない）。D. Assays for Antibody Binding The antibodies of the invention can be assayed for immunospecific binding by any method known in the art. Immunoassays that can be used include (only a few named Western blot, radioimmunoassay, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), "sandwich" immunoassay, immunoprecipitation assay, sedimentation reaction, gel diffusion sedimentation. Competitive and non-competitive assay systems using techniques such as reactions, immunodiffusion assays, agglutination assays, complement fixation assays, immunoradiometric assays, fluorescent immunoassays, protein A immunoassays. Such assays are conventional and well known in the art (eg, Ausubel et al., Eds., 1994, Current Pro, which is incorporated herein by reference in its entirety).
tocols in Molecular Biology, Volume 1, John
Wiley & Sons, Inc. , New York). Exemplary immunoassays are briefly described below (although these are not intended to be limiting).

【０２５２】 免疫沈降プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロ
テアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン
酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２での０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、１％ Ｔｒ
ａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体
を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間）４℃でインキュ
ベートする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズ
を細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４℃でインキュベートする工程、溶
解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、ならびにＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビー
ズを再懸濁する工程を含む。目的の抗体の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、
例えば、ウエスタンブロット分析により、アッセイされ得る。当業者は、抗体の
抗原への結合を増加させ、そしてバックグラウンドを減少させるように改変され
得るパラメータ（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれ
いにすること）に関して、精通している。免疫沈降プロトコルに関するさらなる
考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．
１を参照のこと。[0252] Immunoprecipitation protocols generally involve RIPA buffer (1% NP-40 or Trito) supplemented with protein phosphatase and / or protease inhibitors (eg, EDTA, PMSF, aprotinin, sodium vanadate).
nX-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.1%
0.01 M sodium phosphate at 15 M NaCl, pH 7.2, 1% Tr
lysing a population of cells in a lysis buffer, such as asylol, adding the antibody of interest to the cell lysate, incubating at 4 ° C. for a period of time (eg, 1-4 hours), protein A and Adding protein G Sepharose beads to the cell lysate, incubating at 4 ° C. for at least about 1 hour, washing the beads in lysis buffer, and resuspending the beads in SDS / sample buffer The step of performing The ability of an antibody of interest to immunoprecipitate a particular antigen
For example, it can be assayed by Western blot analysis. One skilled in the art is familiar with parameters that can be modified to increase the binding of the antibody to the antigen and reduce the background (eg, pre-clearing cell lysate using Sepharose beads). . For further discussion of immunoprecipitation protocols, see, for example, Ausubel et al., Eds., 1994, Current P.
rotocols in Molecular Biology, Volume 1, Jo
hn Wiley & Sons, Inc. , New York, 10.16.
See 1.

【０２５３】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、タ
ンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８
％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動する工程、タンパク質サンプルをそ
のポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのよ
うな膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉乳を
有するＰＢＳ）中でその膜をブロッキングする工程、その膜を洗浄緩衝液（例え
ば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希
釈された一次抗体（目的の抗体）を有するその膜をブロッキングする工程、その
膜を洗浄緩衝液中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質
（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるい
は放射性分子（例えば、32Ｐまたは125Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認
識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いてその膜をブロッキングする工程、洗浄緩
衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を含む
。当業者は、検出されるシグナルを増加させ、そしてバックグラウンドノイズを
減少させるように改変され得るパラメータに関して、精通している。ウエスタン
ブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ
．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。[0253] Western blot analysis generally involves preparing a protein sample, subjecting the protein sample to a polyacrylamide gel (for example, an 8 depending on the molecular weight of the antigen).
% In 20% SDS-PAGE), transferring the protein sample from the polyacrylamide gel to a membrane such as nitrocellulose, PVDF or nylon, having a blocking solution (eg, 3% BSA or skim milk) Blocking the membrane in PBS), washing the membrane in a wash buffer (eg, PBS-Tween 20), membrane with primary antibody (antibody of interest) diluted in blocking buffer Blocking, washing the membrane in a washing buffer, adding an enzyme substrate (eg, horseradish peroxidase or alkaline phosphatase) or a radioactive molecule (eg, 32 P or 125 I) diluted in the blocking buffer. Bound secondary antibody (recognizing primary antibody, eg, anti-human Blocking the membrane with an antibody), washing the membrane in a wash buffer, and detecting the presence of the antigen. One skilled in the art is familiar with parameters that can be modified to increase the signal detected and reduce background noise. For further discussion on Western blot protocols, see, for example, Ausubel
Ed., 1994, Current Protocols in Molecul.
ar Biology, Volume 1, John Wiley & Sons, Inc.
. , New York, 10.8.1.

【０２５４】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、および抗原の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は
、検出可能な化合物に結合されている必要はない；その代わり、検出可能な化合
物に結合した二次抗体（目的の抗体を認識する）がウェルに添加され得る。さら
に、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングさ
れ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した二次抗体が、コーティングされ
たウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は、検出される
シグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野において
公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、精通している。ＥＬＩＳＡに
関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，１１．２．１を参照のこと。ELISA involves preparing an antigen, coating the wells of a 96-well microtiter plate with the antigen, binding to a detectable compound such as an enzyme substrate (eg, horseradish peroxidase or alkaline phosphatase). Adding the antibodies to the wells and incubating for a period of time, and detecting the presence of the antigen. In an ELISA, the antibody of interest need not be conjugated to a detectable compound; instead, a secondary antibody (recognizing the antibody of interest) conjugated to the detectable compound can be added to the well. Further, instead of coating the well with the antigen, the antibody can be coated on the well. In this case, a secondary antibody conjugated to the detectable compound can be added following addition of the antigen of interest to the coated wells. One skilled in the art is familiar with parameters that can be modified to increase the signal detected, and other variations of ELISAs known in the art. For further discussion on ELISA, see, for example, Ausubel et al., Ed., 1994, Cu.
rent Protocols in Molecular Biology
, Volume 1, John Wiley & Sons, Inc. , New York
, 11.2.1.

【０２５５】 抗体の抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート
（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッ
セイの一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、漸
増量の非標識抗原の存在下での標識した抗原（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）と目的
の抗体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含
む。目的の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフレートは、スキ
ャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。二次抗体との競合は
また、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量
の非標識二次抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）に結
合した目的の抗体とともにインキュベートされる。The binding affinity of the antibody to the antigen and the off-rate of the antibody-antigen interaction can be determined by competitive binding assays. One example of a competitive binding assay is a radioimmunoassay, which involves incubation of a labeled antigen (eg, 3 H or 125 I) with an antibody of interest in the presence of increasing amounts of unlabeled antigen, and Includes detection of antibody bound to labeled antigen. The affinity of the antibody of interest for a particular antigen, and the binding off-rate, can be determined from data by Scatchard plot analysis. Competition with the secondary antibody can also be determined using a radioimmunoassay. In this case, the antigen is incubated with the antibody of interest conjugated to a labeled compound (eg, 3 H or 125 I) in the presence of increasing amounts of unlabeled secondary antibody.

【０２５６】 （Ｅ．抗体を基礎とした治療） 本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を
、本明細書中に記載される１つ以上の障害または状態を処置および／または予防
するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投
与する工程を含む。本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に
記載するような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならび
に本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフ
ラグメント、アナログおよび誘導体を含む）が挙げられるがこれらに限定されな
い。E. Antibody-Based Therapy The present invention further relates to antibody-based therapies, wherein the therapy comprises treating the antibody of the invention with one or more disorders or disorders described herein. Administering to an animal, preferably a mammal, and most preferably a human patient, to treat and / or prevent the condition. Therapeutic compounds of the invention include antibodies of the invention (including fragments, analogs and derivatives thereof, as described herein) and nucleic acids encoding the antibodies of the invention (described herein). As well as fragments, analogs and derivatives thereof).

【０２５７】 理論に縛られることを意図しないが、ＤＲ５レセプターは、異なるレセプター
分子間のデスドメインの会合／架橋を包含するプロセスにより、プログラムされ
た細胞死を誘導すると考えられる。さらに、ＤＲ５媒介性プログラム細胞死を誘
導するＤＲ５リガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）は、ＤＲ５デスドメインの会合／
架橋を引き起こすことにより機能すると考えられる。従って、ＤＲ５デスドメイ
ンの会合／架橋を妨げる薬剤（例えば、抗体）は、ＤＲ５媒介性プログラム細胞
死を防止し、そしてＤＲ５デスドメインの会合／架橋を促進する薬剤（例えば、
抗体）は、ＤＲ５媒介性プログラム細胞死を誘導する。Although not intending to be bound by theory, it is believed that the DR5 receptor induces programmed cell death by a process involving death domain association / crosslinking between different receptor molecules. In addition, DR5 ligands (eg, TRAIL) that induce DR5-mediated programmed cell death are associated with DR5 death domain association /
It is thought to work by causing crosslinking. Thus, agents that prevent DR5 death domain association / crosslinking (eg, antibodies) prevent DR5-mediated programmed cell death and agents that promote DR5 death domain association / crosslinking (eg,
Antibody) induces DR5-mediated programmed cell death.

【０２５８】 上記のように、ＤＲ５レセプターは、ＴＲＡＩＬに結合することが示されてき
た。ＤＲ５レセプターはまた、多数の組織中、および多数の細胞型の表面上に存
在することが知られている。これらの組織および細胞型には、慢性リンパ性白血
病を有する患者の一次樹状細胞、内皮組織、脾臓、リンパ球、およびヒト胸腺間
質細胞が挙げられる。さらに、以下でより詳細に説明されるように、ＴＲＡＩＬ
は、アポトーシスを誘導し、そしてインビボで腫瘍細胞の増殖を阻害することが
示されている。さらに、ＴＲＡＩＬ活性は、少なくとも部分的に、ＤＲ４および
ＤＲ５レセプターとの相互作用によって、変調されると考えられる。As noted above, the DR5 receptor has been shown to bind to TRAIL. DR5 receptors are also known to be present in many tissues and on the surface of many cell types. These tissues and cell types include primary dendritic cells, endothelial tissue, spleen, lymphocytes, and human thymic stromal cells in patients with chronic lymphocytic leukemia. Further, as described in more detail below, TRAIL
Has been shown to induce apoptosis and inhibit the growth of tumor cells in vivo. Furthermore, TRAIL activity is thought to be modulated, at least in part, by interaction with DR4 and DR5 receptors.

【０２５９】 ＴＲＡＩＬは、多くの腫瘍細胞株におけるアポトーシス細胞死を誘導すること
が示されている、サイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーであり、そしてＤ
Ｒ４およびＤＲ５レセプターとの相互作用による効果を誘導そのアポトーシスを
媒介するようである。これらのデスドメイン含有レセプターは、カスパーゼの切
断によりアポトーシスを開始する膜結合自己活性化シグナル伝達複合体を形成す
ると考えられる。TRAIL is a member of the TNF family of cytokines, which has been shown to induce apoptotic cell death in many tumor cell lines, and
It appears to mediate its apoptosis by inducing effects by interaction with R4 and DR5 receptors. These death domain containing receptors are thought to form a membrane-bound self-activating signaling complex that initiates apoptosis by caspase cleavage.

【０２６０】 ＤＲ４およびＤＲ５レセプターに加えて、ＴＲＡＩＬはまた、「おとり（ｄｅ
ｃｏｙ）」レセプターであることが提案されるいくつかのレセプター、ＤｃＲ２
（切断されたデスドメインを有するレセプター）、ＤｃＲ１（ＧＰＩ固定ドメイ
ン）、およびＯＰＧ（ＴＮＦファミリーの別のメンバーに結合する分泌タンパク
質、ＲＡＮＫＬ）に結合する。In addition to the DR4 and DR5 receptors, TRAIL also
coy) ", a number of receptors proposed to be receptors, DcR2
(Receptor with a truncated death domain), DcR1 (GPI anchoring domain), and OPG (RANKL, a secreted protein that binds to another member of the TNF family).

【０２６１】 さらに、最近の研究により、組換え可溶性形態のレセプターに対するＴＲＡＩ
Ｌの親和性の順位は、非常に温度依存性であることが示された。特に、３７℃に
おいて、ＤＲ５は、ＴＲＡＩＬに対する最も高い親和性を有し、そしてＯＰＧは
最も低い親和性を有する。In addition, recent studies have shown that TRAIs for recombinant soluble forms of the receptor
The order of affinity of L was shown to be very temperature dependent. In particular, at 37 ° C., DR5 has the highest affinity for TRAIL and OPG has the lowest affinity.

【０２６２】 ＤＲ４およびＤＲ５レセプター遺伝子、ならびに２つのおとりレセプターをコ
ードする遺伝子は、ヒト染色体８ｐ２１−２２上に位置することが示された。さ
らに、この領域のヒトゲノムは、頭部および頸部癌において頻繁に***する。The DR4 and DR5 receptor genes, and the genes encoding the two decoy receptors, have been shown to be located on human chromosome 8p21-22. In addition, the human genome in this region divides frequently in head and neck cancer.

【０２６３】 ＦａＤｕ鼻咽癌細胞株は、異常染色体８ｐ２１−２２領域を含むことが、最近
見出された（Ｏｚｏｒｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１６：９１７−９２５
（２０００））。特に、ＤＲ５ではなくＤＲ４を含むホモ接合欠損が、これらの
細胞において見出された（Ｏｚｏｒｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１６：９
１７−９２５（２０００））。これらのＦａＤｕ細胞中のＤＲ４レセプター遺伝
子内のホモ接合欠損は、ＤＲ４レセプターデスドメインを含む。ＤＲ４レセプタ
ーデスドメインのこの***は、ＴＲＡＩＬ媒介性細胞毒性に対する耐性に関連す
る。さらに、野生型ＤＲ４レセプター遺伝子の再導入は、アポトーシスおよびＦ
ａＤｕ細胞のＴＲＡＩＬ感受性の修復の両方を引き起こすことが示された（Ｏｚ
ｏｒｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１６：９１７−９２５（２０００））。
これらのデータは、ＤＲ４レセプター遺伝子が、ヒト癌において不活性化され得
、そしてＤＲ４レセプター遺伝子***がＴＲＡＩＬ治療に対する耐性に寄与し得
ることを示す。ＤＲ５遺伝子における類似の欠失を有する細胞において、同様の
結果が見出されることが予想される。The FaDu nasopharyngeal carcinoma cell line was recently found to contain an abnormal chromosome 8p21-22 region (Ozoren et al., Int. J. Oncol. 16: 917-925).
(2000)). In particular, homozygous deletions involving DR4 but not DR5 were found in these cells (Ozoren et al., Int. J. Oncol. 16: 9).
17-925 (2000)). The homozygous deletion in the DR4 receptor gene in these FaDu cells contains the DR4 receptor death domain. This disruption of the DR4 receptor death domain is associated with resistance to TRAIL-mediated cytotoxicity. In addition, reintroduction of the wild-type DR4 receptor gene can reduce apoptosis and F
It has been shown to cause both TRAIL-sensitive repair of aDu cells (Oz
oren et al., Int. J. Oncol. 16: 917-925 (2000)).
These data indicate that the DR4 receptor gene can be inactivated in human cancers and that DR4 receptor gene splitting can contribute to resistance to TRAIL treatment. It is expected that similar results will be found in cells with a similar deletion in the DR5 gene.

【０２６４】 ヒト***、肺、および結腸ガン細胞株におけるＤＲ４レセプターの細胞質ドメ
インの過剰発現は、カスパーゼの切断を包含するｐ５３非依存性アポトーシス細
胞死を引き起こすことも示されている（Ｘｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６９：１７９−１９０（２０００））。さらに、
ＤＲ４細胞質ドメインの過剰発現はまた、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラー
ゼ（ＰＡＲＰ）およびＤＮＡ切断因子（すなわち、ＩＣＡＤ−ＤＦＦ４５）の両
方の切断を引き起こすことが示された（Ｘｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６９：１７９−１９０（２０００））。さらに、
試験されたガン細胞と比較して同様のレベルのＤＲ４細胞質ドメインタンパク質
にもかかわらず、正常な肺線維芽細胞は、ＤＲ４細胞質ドメインの過剰発現に対
して耐性であることが示され、カスパーゼ切断の証拠を示さないことが示された
（Ｘｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６９：
１７９−１９０（２０００））。また、同様の結果は、ＤＲ５の細胞質ドメイン
を過剰発現する細胞を用いた場合に予想される。従って、ＤＲ４およびＤＲ５レ
セプターの細胞質ドメインは、例えば、ガン細胞において、アポトーシスを誘導
するための薬剤として有用である。Overexpression of the cytoplasmic domain of the DR4 receptor in human breast, lung, and colon cancer cell lines has also been shown to cause p53-independent apoptotic cell death, including caspase cleavage (Xu et al., Biochem). .Biophy
s. Res. Commun. 269: 179-190 (2000)). further,
Overexpression of the DR4 cytoplasmic domain has also been shown to cause cleavage of both poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) and a DNA-cleaving factor (ie, ICAD-DFF45) (Xu et al., Biochem. Biophy).
s. Res. Commun. 269: 179-190 (2000)). further,
Despite similar levels of DR4 cytoplasmic domain protein compared to cancer cells tested, normal lung fibroblasts were shown to be resistant to overexpression of DR4 cytoplasmic domain, indicating that caspase-cleaved No evidence was shown (Xu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 269:
179-190 (2000)). Similar results are expected when cells that overexpress the DR5 cytoplasmic domain are used. Thus, the cytoplasmic domains of DR4 and DR5 receptors are useful as agents for inducing apoptosis, for example, in cancer cells.

【０２６５】 さらに、サイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１
）、ならびにこのタンパク質のＮ末端９１アミノ酸の過剰発現は、細胞サイクル
阻害活性を有し、そしてＤＲ４細胞質ドメイン依存性カスパーゼ切断を阻害する
。従って、ＤＲ４レセプターはまた、細胞サイクルの進行の調節に関与する。上
記のように、同様の結果が、ＤＲ５レセプターを用いた場合に期待される。従っ
て、ＤＲ４およびＤＲ５レセプター、ならびにそれらのレセプターのアゴニスト
およびアンタゴニストが、細胞サイクルの進行を調節するために有用である。Furthermore, the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 (WAF1 / CIP1
), As well as overexpression of the N-terminal 91 amino acids of this protein has cell cycle inhibitory activity and inhibits DR4 cytoplasmic domain-dependent caspase cleavage. Thus, the DR4 receptor is also involved in regulating cell cycle progression. As described above, similar results are expected when using the DR5 receptor. Thus, the DR4 and DR5 receptors, and agonists and antagonists of those receptors, are useful for regulating cell cycle progression.

【０２６６】 ＤＲ５レセプターに結合する抗体は、増加または減少したＤＲ５誘導性アポト
ーシス細胞死に関連する疾患および状態を処置および／または予防するために有
用である。さらに、これらの抗体は、それらがＤＲ５レセプターに対して有する
効果が異なる。これらの効果は、抗体が結合するＤＲ５レセプターの特定の部分
、この抗体分子自体の三次元構造、および／またはそれらがＤＲ５レセプターと
相互作用する様式に基づいて異なる。従って、ＤＲ５レセプターの細胞外ドメイ
ンに結合する抗体は、ＤＲ５活性（例えば、アポトーシスの誘導）を刺激するか
阻害するかのいずれかであり得る。ＤＲ５レセプター活性を刺激する（例えば、
ＤＲ５レセプターデスドメイン間の会合を促進することによって）抗体はＤＲ５
アゴニストであり、そしてＤＲ５レセプター活性を阻害する（例えば、ＴＲＡＩ
Ｌの結合をブロックし、そして／またはＤＲ５レセプターデスドメイン間の会合
を妨げることにより）抗体は、ＤＲ５アンタゴニストである。Antibodies that bind to the DR5 receptor are useful for treating and / or preventing diseases and conditions associated with increased or decreased DR5-induced apoptotic cell death. Furthermore, these antibodies differ in the effects they have on the DR5 receptor. These effects differ based on the particular portion of the DR5 receptor to which the antibody binds, the three-dimensional structure of the antibody molecule itself, and / or the manner in which they interact with the DR5 receptor. Thus, antibodies that bind to the extracellular domain of the DR5 receptor can either stimulate or inhibit DR5 activity (eg, induction of apoptosis). Stimulates DR5 receptor activity (eg,
By promoting association between the DR5 receptor death domains)
Are agonists and inhibit DR5 receptor activity (eg, TRAI
Antibodies are DR5 antagonists (by blocking L binding and / or preventing association between DR5 receptor death domains).

【０２６７】 ＤＲ５レセプターのアゴニストおよびアンタゴニストとして機能する本発明の
抗体には、抗原結合抗体フラグメント、例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フ
ラグメント、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦ
ｖ）、およびＶLまたはＶHドメインのいずれかを含むフラグメント、ならびにポ
リクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびヒト化抗体が挙げられる。二価
の抗体は、アゴニストとして好ましい。これらの抗原結合抗体フラグメントおよ
び抗体の各々は、本明細書の別の場所でより詳細に記載される。Antibodies of the present invention that function as agonists and antagonists of the DR5 receptor include antigen-binding antibody fragments such as Fab and F (ab ') 2 fragments, Fd, single chain Fvs (scFv), disulfide-bonded Fvs (sdF
v), and fragments comprising either the VL or VH domains, as well as polyclonal, monoclonal, and humanized antibodies. Bivalent antibodies are preferred as agonists. Each of these antigen-binding antibody fragments and antibodies is described in more detail elsewhere herein.

【０２６８】 上記の点から、本発明の抗体、ならびに他のアゴニストは、ＤＲ５デスドメイ
ン活性を刺激して、ＤＲ５レセプターを発現する細胞（例えば、ガン細胞）にお
けるアポトーシスを促進するために有用である。この型の抗体は、増加した細胞
生存および／またはアポトーシス誘導剤（例えば、ＴＲＡＩＬ）に対する非感受
性に関連する疾患および状態（例えば、充実性組織癌（例えば、皮膚癌、頭部お
よび頸部腫瘍、***腫瘍、内皮腫、肺癌、骨芽細胞腫、破骨細胞腫、およびカポ
ージ肉腫）、ならびに白血病）を予防および／または処置するために有用である
。In view of the above, the antibodies of the present invention, as well as other agonists, are useful for stimulating DR5 death domain activity to promote apoptosis in cells expressing DR5 receptor (eg, cancer cells). . Antibodies of this type are useful for diseases and conditions associated with increased cell survival and / or insensitivity to apoptosis inducers (eg, TRAIL), such as solid tissue cancers (eg, skin cancer, head and neck tumors, Breast cancer, endothelioma, lung cancer, osteoblastoma, osteoclastoma, and Kaposi's sarcoma), and leukemia).

【０２６９】 本発明のアンタゴニスト（例えば、抗ＤＲ５抗体）は、ＤＲ５媒介性アポトー
シスを防止することにより機能し、そして増加したアポトーシス細胞死に関連す
る疾患を予防および／または処置するために有用である。このような疾患の例に
は、糖尿病、ＡＩＤＳ、神経変性障害、脊髄形成異常症、虚血性外傷、毒素誘発
性肝臓疾患、敗血症ショック、悪液質および食欲不振が挙げられる。The antagonists (eg, anti-DR5 antibodies) of the present invention function by preventing DR5-mediated apoptosis, and are useful for preventing and / or treating diseases associated with increased apoptotic cell death. Examples of such diseases include diabetes, AIDS, neurodegenerative disorders, myelodysplasia, ischemic trauma, toxin-induced liver disease, septic shock, cachexia and anorexia.

【０２７０】 上記のように、ＤＲ５レセプターは、Ｔ細胞の表面上に存在する。従って、本
発明のアゴニスト（例えば、抗ＤＲ５レセプター抗体）はまた、Ｔ細胞媒介性免
疫応答を阻害し、そして増加したＴ細胞増殖に関連する疾患および状態を予防お
よび／または処置するために有用である。Ｔ細胞媒介性免疫応答および増加した
Ｔ細胞増殖に関連する疾患および状態には、対宿主性反応および疾患、変形性関
節症、乾癬、敗血症、炎症性腸疾患、一般的な炎症、自己免疫疾患、およびＴ細
胞白血病が挙げられる。As mentioned above, the DR5 receptor is on the surface of T cells. Accordingly, the agonists of the invention (eg, anti-DR5 receptor antibodies) are also useful for inhibiting T cell mediated immune responses and preventing and / or treating diseases and conditions associated with increased T cell proliferation. is there. Diseases and conditions associated with T cell-mediated immune responses and increased T cell proliferation include anti-host reactions and diseases, osteoarthritis, psoriasis, sepsis, inflammatory bowel disease, general inflammation, autoimmune diseases , And T-cell leukemia.

【０２７１】 本発明のアゴニストが、増加したＴ細胞集団または増加した細胞増殖に関連す
る疾患および状態（例えば、癌）の処置および／または予防のために個体に投与
される場合、アンタゴニストが、アポトーシスを誘導する別の薬剤（例えば、Ｔ
ＲＡＩＬ）、またはそうでなければ細胞増殖を阻害する薬剤（例えば、抗癌剤）
と同時に投与され得る。この特徴の組み合わせ治療、ならびに他の組み合わせ治
療は、以下でより詳細に議論される。When an agonist of the invention is administered to an individual for the treatment and / or prevention of a disease and condition associated with an increased T cell population or increased cell proliferation (eg, cancer), the antagonist will undergo apoptosis. (Eg, T
RAIL), or an agent that otherwise inhibits cell proliferation (eg, an anticancer agent)
It can be administered simultaneously. Combination treatments for this feature, as well as other combination treatments, are discussed in more detail below.

【０２７２】 さらに、本発明のアンタゴニスト（例えば、抗ＤＲ５−レセプター抗体）はま
た、Ｔ細胞媒介免疫応答を増強するため、ならびにＴ細胞増殖の減少に関連した
疾患および状態を予防および／または処置するために有用である。ＤＲ５レセプ
ターに対するＤＲ５レセプターリガンドの結合をブロックするか、または膜のシ
グナル伝達に関連する、ＤＲ５レセプターの立体構造的な変化を妨害する本発明
の抗体は、ＤＲ５媒介Ｔ細胞アポトーシスを阻害し得る。ＤＲ５媒介アポトーシ
スの阻害は、例えば、インビボでＴ細胞集団の増殖率の増加を生じ得るか、また
はこのような集団のサイズの減少を妨害し得るかのいずれかである。従って、本
発明のアンタゴニストは、減少したＴ細胞集団またはＴ細胞集団の減少と関連す
る疾患または状態を予防および／または処置するために使用され得る。このよう
な疾患および状態の例には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および関連する
苦痛（例えば、ＡＩＤＳ関連複合体）、Ｔ細胞免疫欠損、放射線宿酔、ならびに
放射線治療および化学療法によるＴ細胞欠損が挙げられる。In addition, antagonists of the present invention (eg, anti-DR5-receptor antibodies) also enhance T cell-mediated immune responses and prevent and / or treat diseases and conditions associated with decreased T cell proliferation. Useful for. Antibodies of the invention that block DR5 receptor ligand binding to the DR5 receptor or prevent DR5 receptor conformational changes associated with membrane signaling can inhibit DR5 mediated T cell apoptosis. Inhibition of DR5-mediated apoptosis, for example, can either result in an increased rate of proliferation of the T cell population in vivo, or can prevent a decrease in the size of such a population. Thus, the antagonists of the present invention can be used to prevent and / or treat a disease or condition associated with a reduced T cell population or reduced T cell population. Examples of such diseases and conditions include acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and related distress (eg, AIDS-related complex), T-cell immunodeficiency, radiation sickness, and T-cell deficiency due to radiation therapy and chemotherapy Is mentioned.

【０２７３】 本発明のアンタゴニストがＴ細胞集団の減少と関連した疾患または状態の処置
および／または予防のために個体に投与される場合、このアンタゴニストは、リ
ンパ球増殖を活性化および／または誘導する薬剤（例えば、サイトカイン）とと
もに同時投与され得る。この性質の組み合わせ治療、ならびに他の組み合わせ治
療は、以下により詳細に記載される。When an antagonist of the present invention is administered to an individual for the treatment and / or prevention of a disease or condition associated with a decrease in the T cell population, the antagonist activates and / or induces lymphocyte proliferation. It can be co-administered with an agent (eg, a cytokine). Combination treatments of this nature, as well as other combination treatments, are described in more detail below.

【０２７４】 同様に、本発明のアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、抗ＤＲ５レセプ
ター抗体）もまた、単独でまたは別の治療薬剤と組み合わせて投与された場合に
、Ｂ細胞媒介免疫応答を阻害するためもしくは増強するためのいずれかで、なら
びに増加もしくは減少したＢ細胞増殖に関連した疾患および状態を予防および／
もしくは処置するために有用である。Similarly, agonists and antagonists of the invention (eg, anti-DR5 receptor antibodies) also inhibit or enhance B cell-mediated immune responses when administered alone or in combination with another therapeutic agent. To prevent and / or prevent diseases and conditions associated with increased or decreased B cell proliferation.
Or it is useful for treating.

【０２７５】 従って、抗ＤＲ５抗体は、ＤＲ５レセプターを発現する組織または細胞型（例
えば、内皮細胞）が関与する悪性疾患、異常、疾患、および／または状態を処置
および／または予防するために有用である。さらに、ＤＲ５レセプターを発現す
る細胞におけるプログラムされた細胞死の誘導によって処置および／または予防
され得る悪性疾患、異常、疾患、および／または状態は、本発明のＤＲ５レセプ
ターアゴニストを使用して処置および／または予防され得る。同様に、ＤＲ５レ
セプターを発現する細胞におけるプログラムされた細胞死を阻害することによっ
て処置および／または予防され得る悪性疾患、異常、疾患、および／または状態
は、本発明のＤＲ５レセプターアンタゴニストを使用して処置および／または予
防され得る。Accordingly, anti-DR5 antibodies are useful for treating and / or preventing malignancies, abnormalities, diseases, and / or conditions involving tissues or cell types that express the DR5 receptor (eg, endothelial cells). is there. Further, malignancies, abnormalities, diseases, and / or conditions that can be treated and / or prevented by the induction of programmed cell death in cells that express the DR5 receptor are treated and / or treated using the DR5 receptor agonists of the present invention. Or can be prevented. Similarly, malignancies, abnormalities, diseases, and / or conditions that can be treated and / or prevented by inhibiting programmed cell death in cells expressing the DR5 receptor are described using a DR5 receptor antagonist of the present invention. It can be treated and / or prevented.

【０２７６】 さらに、本発明の抗体ならびに他のアゴニストは、内皮細胞中でＤＲ５死ドメ
イン活性を刺激するために有用であり、これは、抗血管形成活性を生じる。この
型の抗体は、慢性関節リウマチおよび固形組織癌のような過剰血管新生および新
生血管形成に関連する疾患および状態（例えば、皮膚癌、頭部および頸部腫瘍、
乳癌、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、およびカポージ肉腫）ならびに慢性炎
症と関連する疾患および状態を予防および／または処置するために有用である。Further, the antibodies of the present invention, as well as other agonists, are useful for stimulating DR5 death domain activity in endothelial cells, which results in anti-angiogenic activity. Antibodies of this type are used in diseases and conditions associated with hypervascularization and neovascularization, such as rheumatoid arthritis and solid tissue cancer (eg, skin cancer, head and neck tumors,
(Breast cancer, endothelioma, osteoblastoma, giant cell tumor of the bone, and Kaposi's sarcoma) and diseases and conditions associated with chronic inflammation.

【０２７７】 慢性炎症（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病）と関連する疾患および状
態は、しばしば、炎症を起こした組織中への新規な血管の内部成長と関連する組
織学的変化を示す。ＤＲ５死ドメインの活性を刺激する本発明のアゴニストは、
これらのレセプターを発現する内皮細胞においてアポトーシスを誘導する。結果
として、本発明のアゴニストは、血管およびリンパ管の形成を阻害し得、従って
、過剰血管形成および新生血管形成に関連する疾患および状態を予防および／ま
たは処置するために使用され得る。Diseases and conditions associated with chronic inflammation (eg, ulcerative colitis and Crohn's disease) often show histological changes associated with ingrowth of new blood vessels into inflamed tissue. An agonist of the invention that stimulates the activity of the DR5 death domain,
Induces apoptosis in endothelial cells expressing these receptors. As a result, the agonists of the invention may inhibit the formation of blood vessels and lymphatic vessels, and thus may be used to prevent and / or treat diseases and conditions associated with hypervascularization and neovascularization.

【０２７８】 本発明のアゴニストを使用して予防および／または処置され得る血管形成に関
連する他の疾患および状態には、肥大性およびケロイド瘢痕、増殖性糖尿病性網
膜症、動静脈先天異常、アテローム性動脈硬化症プラーク、血友病性関節、偽関
節骨折、オースラー−ウェーバー症候群、乾癬、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコ
ーマ（ｔｒａｃｏｍａ）、月経過多、および血管癒着が挙げられる。Other diseases and conditions associated with angiogenesis that can be prevented and / or treated using the agonists of the invention include hypertrophic and keloid scars, proliferative diabetic retinopathy, congenital arteriovenous disorders, atheroma Atherosclerotic plaques, hemophilic joints, pseudoarticular fractures, Ausler-Weber syndrome, psoriasis, suppurative granuloma, scleroderma, trachoma, menorrhagia, and vascular adhesions.

【０２７９】 さらに、ＤＲ５死ドメイン活性を阻害する薬剤（例えば、ＤＲ５アンタゴニス
ト）はまた、血管新生の減少に関連する多数の疾患および状態を予防および／ま
たは処置するために有用である。上記に示したように、ＤＲ５レセプター活性の
アンタゴニストの例には、抗ＦＲ５レセプター抗体が含まれる。これらの抗体は
、例えば、ＤＲ５レセプターに結合することおよびＤＲ５死ドメイン活性を刺激
するリガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）の結合をブロックすること、または膜シグ
ナル伝達に関連するＤＲ５レセプターの立体構造の変化を阻害するかのいずれか
によって機能し得る。Additionally, agents that inhibit DR5 death domain activity (eg, DR5 antagonists) are also useful for preventing and / or treating a number of diseases and conditions associated with reduced angiogenesis. As indicated above, examples of antagonists of DR5 receptor activity include anti-FR5 receptor antibodies. These antibodies, for example, bind to the DR5 receptor and block the binding of ligands (eg, TRAIL) that stimulate DR5 death domain activity, or inhibit DR5 receptor conformational changes associated with membrane signaling. It can work by either.

【０２８０】 本発明のアンタゴニストを使用して処置され得る血管新生の減少と関連する状
態の例は、創傷治癒の遅延である。特に高齢者は、しばしば、若い個体よりもよ
り遅い速度で治癒する。従って、本発明のアンタゴニストは、創傷部位にある内
皮細胞中でアポトーシスが発生することを予防および／または阻害し得、それに
よって、治癒が損なわれた個体、ならびに「正常な」速度で治癒する個体におけ
る創傷治癒を促進する。従って、本発明のアンタゴニストは、創傷治癒を促進お
よび／または加速するために使用され得る。本発明のアンタゴニストはまた、他
の疾患および状態（再狭窄、心筋梗塞、末梢動脈疾患、重症四肢虚血（ｃｒｉｔ
ｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、アンギナ、アテローム性動脈硬化症
、虚血、水腫、肝硬変、変形性関節症、および肺線維症を含む）を処置および／
または予防するために有用である。An example of a condition associated with reduced angiogenesis that can be treated using an antagonist of the invention is delayed wound healing. In particular, the elderly often heal at a slower rate than younger individuals. Thus, the antagonists of the present invention may prevent and / or inhibit apoptosis from occurring in endothelial cells at the site of a wound, thereby impairing healing as well as individuals healing at a "normal" rate. Promotes wound healing in Thus, the antagonists of the present invention can be used to promote and / or accelerate wound healing. The antagonists of the invention may also inhibit other diseases and conditions (restenosis, myocardial infarction, peripheral arterial disease, severe limb ischemia (crit)
ical limb ischemia), angina, atherosclerosis, ischemia, edema, cirrhosis, osteoarthritis, and pulmonary fibrosis) and / or
Or useful to prevent.

【０２８１】 本発明のアゴニストおよびアンタゴニストを使用して処置され得る多数のさら
なる悪性疾患、異常、疾患、および／または状態は、本明細書中の他の箇所（例
えば、以下の「試料薬剤」と題された節）において示される。A number of additional malignancies, abnormalities, diseases, and / or conditions that can be treated using the agonists and antagonists of the present invention are described elsewhere herein (eg, in conjunction with “Sample Drug” below). Entitled section).

【０２８２】 本発明の抗体は、多数の方法で治療的に使用され得る。例えば、本発明のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを結合する抗体は、局所的または全身的のいず
れかで個体（例えば、ヒト）に投与され得る。さらに、これらの抗体は、単独で
、別の治療薬剤と組み合わせて、または毒素に付随してもしくは毒素に結合され
て、投与され得る。The antibodies of the present invention can be used therapeutically in a number of ways. For example, an antibody that binds a polynucleotide or polypeptide of the invention can be administered to an individual (eg, a human) either locally or systemically. Further, these antibodies can be administered alone, in combination with another therapeutic agent, or associated with or conjugated to a toxin.

【０２８３】 抗ＤＲ５抗体は、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、あるいはリンホ
カイン、腫瘍壊死因子、またはＴＮＦ関連分子（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−
β、ＴＮＦ−γ、ＴＮＦ−γ−α、ＴＮＦ−γ−β、およびＴＲＡＩＬ）、また
は造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７）と組み合わせて
利用され得る。例えば、アゴニスト性抗ＤＲ５抗体は、本発明のＤＲ５レセプタ
ーを発現する細胞においてＤＲ５媒介細胞死を誘導することを求める場合に、Ｔ
ＲＡＩＬとともに同時投与され得る。この性質の組み合わせ治療および他の組み
合わせ治療が、以下でより詳細に議論され得る。Anti-DR5 antibodies can be other monoclonal or chimeric antibodies, or lymphokines, tumor necrosis factors, or TNF-related molecules (eg, TNF-α, TNF-
β, TNF-γ, TNF-γ-α, TNF-γ-β, and TRAIL), or in combination with hematopoietic growth factors (eg, IL-2, IL-3 and IL-7). For example, an agonistic anti-DR5 antibody is required to induce DR5-mediated cell death in cells that express the DR5 receptor of the present invention.
It can be co-administered with RAIL. Combination treatments of this nature and other combination treatments may be discussed in more detail below.

【０２８４】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒト抗体、フ
ラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒトの
患者に投与される。The antibodies of the present invention can be administered alone or in combination with other types of treatment, such as radiation therapy, chemotherapy, hormonal therapy, immunotherapy and anti-tumor agents.
Generally, administration of a species-derived or species-reactive product that is the same species as the patient (in the case of antibodies) is preferred. Thus, in a preferred embodiment, a human antibody, fragment derivative, analog, or nucleic acid is administered to a human patient for treatment or prevention.

【０２８５】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
関する免疫アッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本発
明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または強
力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメント、
またはそれらの領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント
、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（
そのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性として
は、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8 Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１
０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14 Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍより小さい解離定数すなわち
Ｋｄを有する結合親和性が挙げられる。For both immunoassays for the polynucleotides or polypeptides of the invention (including fragments thereof) and the treatment of disorders related thereto, high affinity and / or high affinity for the polypeptides or polynucleotides of the invention are provided. Or potent, in vivo inhibitory and / or neutralizing antibodies, fragments thereof,
Alternatively, it is preferable to use those regions. Such an antibody, fragment or region is preferably a polynucleotide or polypeptide (
(Including its fragments). Preferred binding affinities include 5 × 10 −6 M, 10 −6 M, 5 × 10 −7 M, 10 −7 M, 5 × 10 −8 M, 10 −8 M, 5 × 10 −9 M, 10 −9 M, 5 × 10 −10 M, 10 −10 M, 5 × 10 −11 M, 1
0 −11 M, 5 × 10 −12 M, 10 −12 M, 5 × 10 −13 M, 10 −13 M, 5 × 10 −14 M, 10 −14 M, 5 × 10 −15 M, and 10 Binding affinities with a dissociation constant less than -15 M, ie, Kd.

【０２８６】 （ポリぺプチドアッセイ） 本発明はまた、細胞および組織におけるＤＲ５タンパク質またはその可溶性形
態のレベルを検出する（正常および異常なレベルの判定を含む）ための定量的ア
ッセイおよび診断アッセイのような診断アッセイに関する。従って、例えば、正
常コントロール組織サンプルと比較して、ＤＲ５またはその可溶性形態の過剰発
現を検出するための、本発明に従う診断アッセイは、例えば腫瘍の存在を検出す
るために使用され得る。宿主由来のサンプルにおいて、タンパク質（例えば、本
発明のＤＲ５タンパク質またはその可溶性形態）のレベルを決定するために使用
され得るアッセイ技術は、当業者に周知である。このようなアッセイ方法として
は、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析および
ＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。Polypeptide Assays The present invention also provides quantitative and diagnostic assays for detecting the level of DR5 protein or its soluble form in cells and tissues, including determining normal and abnormal levels. Diagnostic assays. Thus, for example, a diagnostic assay according to the invention for detecting overexpression of DR5 or a soluble form thereof, as compared to a normal control tissue sample, can be used, for example, to detect the presence of a tumor. Assay techniques that can be used to determine levels of a protein, such as a DR5 protein of the invention or a soluble form thereof, in a sample derived from a host are well-known to those of skill in the art. Such assay methods include radioimmunoassays, competitive binding assays, western blot analysis and ELISA assays.

【０２８７】 生物学的サンプル中のＤＲ５タンパク質レベルのアッセイは、任意の当該分野
で公知の方法を使用して行われ得る。「生物学的サンプル」により、ＤＲ５レセ
プタータンパク質またはｍＲＮＡを含む、個体、細胞株、組織培養物、または他
の供給源から得られた任意の生物学的サンプルが意図される。抗体に基づく技術
が、生物学的サンプル中のＤＲ５タンパク質レベルをアッセイするために好まし
い。例えば、組織におけるＤＲ５タンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法
で研究され得る。（Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０
１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７））。ＤＲ５タンパク質遺伝
子発現を検出するために有用な、抗体に基づく他の方法としては、イムノアッセ
イ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ検定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。Assaying DR5 protein levels in a biological sample can be performed using any method known in the art. By "biological sample" is intended any biological sample obtained from an individual, cell line, tissue culture, or other source that contains the DR5 receptor protein or mRNA. Antibody-based techniques are preferred for assaying DR5 protein levels in a biological sample. For example, DR5 protein expression in tissues can be studied with classical immunohistological methods. (Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 10
1: 976-985 (1985); Jalkanen, M .; J. et al. Cell.
Biol. 105: 3087-3096 (1987)). Other antibody-based methods useful for detecting DR5 protein gene expression include immunoassays (eg, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA)).

【０２８８】 適切な標識は、当該分野で公知であり、これらとしては、酵素標識（例えば、
グルコースオキシダーゼ）および放射性同位体（例えば、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ
）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）
およびテクネチウム（99mＴｃ））；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセイ
ンおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。Suitable labels are known in the art and include enzyme labels (eg,
Glucose oxidase) and radioisotopes (eg, iodine ( 125 I, 121 I
), Carbon ( 14 C), sulfur ( 35 S), tritium ( 3 H), indium ( 112 In)
And technetium ( 99mTc )); and fluorescent labels (eg, fluorescein and rhodamine), and biotin.

【０２８９】 （試料薬剤） 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーリガンドが、細胞傷害性、抗ウイルス活性
、免疫調節活性、および数種の遺伝子の転写制御を含む、多数の細胞応答を誘導
する、最も多面的なサイトカインに属することは、公知である（Ｇｏｅｄｄｅｌ
，Ｄ．Ｖ．ら、「Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」
、Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：５９７−６０９（１９８６）、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．およびＣｅｒａｍｉ
，Ａ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：５０５−５１８（１９８８
）；Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．、Ｓｃｉ．Ａｍ．２５８：５９−７５（１９８８）；Ｆｉ
ｅｒｓ，Ｗ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８５：１９９−２２４（１９９１））。
ＴＮＦ−ファミリーリガンドは、ＴＮＦ−ファミリーレセプター（本発明のＤＲ
５を含む）と結合することによって、このような種々の細胞応答を誘導する。Sample Drugs The most versatile tumor necrosis factor (TNF) family ligands induce a number of cellular responses, including cytotoxicity, antiviral activity, immunomodulatory activity, and transcriptional regulation of several genes Are known to belong to specific cytokines (Goeddel
, D. V. Et al., “Tumor Necrosis Factors: Gene.
Structure and Biological Activities "
, Symp. Quant. Biol. 51: 597-609 (1986), Co
ld Spring Harbor; Beutler, B .; And Cerami
, A. , Annu. Rev .. Biochem. 57: 505-518 (1988)
Old, L .; J. , Sci. Am. 258: 59-75 (1988); Fi.
ers, W.S. , FEBS Lett. 285: 199-224 (1991)).
The TNF-family ligand is a TNF-family receptor (DR of the present invention).
5 to induce such various cellular responses.

【０２９０】 本発明のＤＲ５ポリヌクレオチド、およびポリペプチド、アゴニスト、および
／またはアンタゴニストは、欠損しているかまたは不十分な量のＤＲ５によって
（直接的または間接的に）媒介される任意の疾患または障害に罹患した患者（例
えば、哺乳動物、好ましくは、ヒト）に投与され得る。あるいは、遺伝子治療ア
プローチが、このような疾患または障害を処置および／または予防するために適
用され得る。本発明の１つの実施形態において、ＤＲ５ポリヌクレオチド配列は
、欠損遺伝子を含むムテインＤＲ５遺伝子を検出するために使用される。ムテイ
ン遺伝子は、インビトロ診断アッセイにおいて、および本明細書中に開示された
ＤＲ５ヌクレオチド配列の、この遺伝子の欠損を有すると疑われている患者から
得られたＤＲ５遺伝子のヌクレオチド配列との比較によって同定され得る。欠損
遺伝子は、当業者に公知の技術を使用する通常のＤＲ５コード遺伝子で置換され
得る。The DR5 polynucleotides and polypeptides, agonists, and / or antagonists of the invention may be any disease or disorder mediated (directly or indirectly) by a defective or insufficient amount of DR5. (Eg, mammals, preferably humans). Alternatively, gene therapy approaches can be applied to treat and / or prevent such diseases or disorders. In one embodiment of the invention, a DR5 polynucleotide sequence is used to detect a mutein DR5 gene, including a defective gene. The mutein gene was identified in an in vitro diagnostic assay and by comparing the DR5 nucleotide sequence disclosed herein with the nucleotide sequence of a DR5 gene obtained from a patient suspected of having a deficiency in this gene. obtain. The defective gene can be replaced with a normal DR5-encoding gene using techniques known to those skilled in the art.

【０２９１】 別の実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニス
ト、および／またはアンタゴニストは、種々の細胞型でのＴＲＡＩＬ／ＤＲ５相
互作用を阻害することから生じる表現型的効果を研究するための研究用ツールと
して使用され得る。ＤＲ５ポリペプチドおよびアンタゴニストはまた、ＴＲＡＩ
ＬまたはＤＲ５またはそれらの相互作用を検出するためのインビトロアッセイに
おいて使用され得る。In another embodiment, the polypeptides, polynucleotides, agonists, and / or antagonists of the invention study phenotypic effects resulting from inhibiting TRAIL / DR5 interaction in various cell types. Can be used as a research tool for DR5 polypeptides and antagonists also have TRAI
It can be used in in vitro assays to detect L or DR5 or their interactions.

【０２９２】 （ＴＲＡＩＬがそのメンバーである）ＴＮＦファミリーの特定のリガンドは、
１より多い別個の細胞表面レセプタータンパク質に結合することが報告されてい
る。例えば、ＤＲ４と名付けられたレセプタータンパク質は、ＴＲＡＩＬを結合
することが報告されているが、本発明のＤＲ５とは別のものである（Ｐａｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１１−１１３（１９９７）；本発明中に参考として
援用される）。別の実施形態において、精製したＤＲ５ポリペプチド、アゴニス
ト、および／またはアンタゴニストが、ＴＲＡＩＬの内因性細胞表面ＴＲＡＩＬ
への結合を阻害するために使用される。ＴＲＡＩＬ結合について競合することに
よって、本発明の可溶性ＤＲ５ポリペプチドは、ＴＲＡＩＬの、細胞表面ＤＲ５
への相互作用を阻害するためのみならず、ＤＲ５とは別個のＴＲＡＩＬレセプタ
ータンパク質への結合を阻害するためにもまた、利用され得る。従って、さらな
る実施形態において、本発明のＤＲ５ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニ
スト、および／またはアンタゴニストは、インビトロまたはインビボ手順におい
て、ＴＲＡＩＬの機能的活性を阻害するために使用される。ＴＲＡＩＬの細胞表
面レセプターへの結合を阻害することによって、ＤＲ５はまた、内因性レセプタ
ーへのＴＲＡＩＬの結合から生じる生物学的効果を阻害する。ＤＲ５ポリペプチ
ドの種々の形態が利用され得、これらには、例えば、上記のＤＲ５フラグメント
、誘導体、およびＴＲＡＩＬを結合可能である改変体が含まれる。好ましい実施
形態において、可溶性ＤＲ５は、ＴＲＡＩＬの機能的活性を阻害するために（例
えば、このようなアポトーシスに感受性である細胞のＴＲＡＩＬ媒介アポトーシ
スを阻害するために）使用される。従って、さらなる実施形態において、ＤＲ５
は、ＴＲＡＩＬ媒介障害を処置および／または予防するために哺乳動物（例えば
、ヒト）に投与される。このようなＴＲＡＩＬ媒介障害には、ＴＲＡＩＬによっ
て（直接的または間接的に）引き起こされるか、または悪化する状態が含まれる
。Particular ligands of the TNF family (of which TRAIL is a member)
It has been reported to bind to more than one distinct cell surface receptor protein. For example, a receptor protein named DR4 has been reported to bind TRAIL, but is distinct from DR5 of the present invention (Pan et al.,
Science 276: 111-113 (1997); incorporated herein by reference). In another embodiment, the purified DR5 polypeptide, agonist and / or antagonist is TRAIL endogenous cell surface TRAIL
Used to inhibit binding to By competing for TRAIL binding, the soluble DR5 polypeptides of the present invention allow TRAIL to bind to the cell surface DR5
Not only to inhibit the interaction with TRAIL receptor protein, but also to inhibit binding to the TRAIL receptor protein distinct from DR5. Thus, in a further embodiment, the DR5 polynucleotides, polypeptides, agonists and / or antagonists of the invention are used to inhibit TRAIL functional activity in in vitro or in vivo procedures. By inhibiting TRAIL binding to cell surface receptors, DR5 also inhibits biological effects resulting from TRAIL binding to endogenous receptors. Various forms of the DR5 polypeptide may be utilized, including, for example, the above-described DR5 fragments, derivatives, and variants capable of binding TRAIL. In a preferred embodiment, soluble DR5 is used to inhibit the functional activity of TRAIL (eg, to inhibit TRAIL-mediated apoptosis in cells that are susceptible to such apoptosis). Thus, in a further embodiment, DR5
Is administered to a mammal (eg, a human) to treat and / or prevent a TRAIL-mediated disorder. Such TRAIL-mediated disorders include conditions caused or worsened (directly or indirectly) by TRAIL.

【０２９３】 ＤＲ５ポリペプチドを発現し、かつＤＲ５リガンドに対する有効な細胞応答を
有すると考えられる細胞としては、初代樹状細胞、内皮組織、脾臓、慢性リンパ
性白血病、およびヒト胸腺間質細胞が挙げられる。「ＴＮＦファミリーリガンド
に対する細胞応答」により、ＴＮＦファミリーリガンドにより誘導される、細胞
、細胞株、組織、組織培養物または患者に対する、遺伝子型、表現型、および／
または形態型のいかなる変化もが意図される。示されるように、このような細胞
応答は、ＴＮＦファミリーのリガンドに対する正常な生理学的応答だけでなく、
増加したアポトーシスまたはアポトーシスの阻害に関連する疾患をも含む。アポ
トーシス（プログラムされた細胞死）は、免疫系の末梢Ｔリンパ球の欠失に関与
する生理学的メカニズムであり、その調節不全は、多くの異なる病原性のプロセ
スを導き得る（Ａｍｅｉｓｅｎ，Ｊ．Ｃ．、ＡＩＤＳ ８：１１９７−１２１３
（１９９４）；Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｈ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．６：２７９−２８９（１９９４））。Cells expressing a DR5 polypeptide and believed to have an effective cellular response to a DR5 ligand include primary dendritic cells, endothelial tissue, spleen, chronic lymphocytic leukemia, and human thymic stromal cells. Can be By "cell response to a TNF family ligand", a genotype, phenotype, and / or a cell, cell line, tissue, tissue culture or patient induced by a TNF family ligand is induced.
Or any change in morphology is contemplated. As shown, such cellular responses are not only normal physiological responses to TNF family ligands, but also
Also included are diseases associated with increased apoptosis or inhibition of apoptosis. Apoptosis (programmed cell death) is a physiological mechanism involved in the loss of peripheral T lymphocytes of the immune system, and its dysregulation can lead to many different pathogenic processes (Ameisen, JC). , AIDS 8: 1197-1213.
(1994); Krammer, P .; H. Et al., Curr. Opin. Immun
ol. 6: 279-289 (1994)).

【０２９４】 本発明のＤＲ５ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストを用いて、処置、予防、診断、および／または予後判定
され得る、増加した細胞生存またはアポトーシスの阻害に関連する疾患としては
、以下が挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌、およ
びホルモン依存性腫瘍（大腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神
経膠芽細胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リン
パ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立
腺癌、カポジ肉腫および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない））；自
己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁
性肝硬変、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔ）病、クローン病、多発性筋炎、全身性
エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎および慢性関節リウマチ）；および
ウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイ
ルス）；炎症；対宿主性移植片病；急性移植片拒絶および慢性移植片拒絶。好ま
しい実施形態において、本発明のＤＲ５ポリヌクレオチド、ポリぺプチド、およ
び／またはアンタゴニストは、特に上記に列挙される癌の、増殖、進行および／
または転移を阻害するために使用される。A disease associated with increased cell survival or inhibition of apoptosis that can be treated, prevented, diagnosed, and / or prognosed using a DR5 polynucleotide, polypeptide, and / or agonist or antagonist of the present invention. Include: cancer (eg, follicular lymphoma, cancer with a p53 mutation, and hormone-dependent tumors (colorectal cancer, heart tumor, pancreatic cancer, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, Lung cancer, bowel cancer, testicular cancer, gastric cancer, neuroblastoma, myxoma, fibroid, lymphoma, endothelioma, osteoblastoma, giant cell tumor, osteosarcoma, chondrosarcoma, adenoma, breast cancer, prostate cancer, Kaposi's sarcoma And ovarian cancer), autoimmune disorders (eg, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, Hashimoto's thyroiditis, biliary cirrhosis) Behcet's disease, Crohn's disease, polymyositis, systemic lupus erythematosus and immune-associated glomerulonephritis and rheumatoid arthritis); and viral infections (eg, herpesvirus, poxvirus and adenovirus); inflammation; Graft disease; acute and chronic graft rejection. In a preferred embodiment, the DR5 polynucleotides, polypeptides, and / or antagonists of the invention are used in the growth, progression and / or growth of the above-listed cancers, among others.
Or used to inhibit metastasis.

【０２９５】 本発明のＤＲ５ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／あるいはアンタゴ
ニストまたはアゴニストによって処置、予防、診断および／またはまたは予後判
定され得る、細胞生存の増大に関連するさらなる疾患または状態には、悪性疾患
ならびに以下のような関連する障害の進行および／または転移が挙げられるが、
これらに限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急
性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病
を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病
および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジ
キン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロ
ブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、
粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅ
ｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫
、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌
、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭
状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、
胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、
肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫
、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神
経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜
芽細胞腫）を含むが、これらに限定されない）。[0295] Additional diseases or conditions associated with increased cell survival that can be treated, prevented, diagnosed and / or prognosed by the DR5 polynucleotides, polypeptides, and / or antagonists or agonists of the invention include malignancies And progression and / or metastasis of related disorders such as:
Without limitation: leukemias (including acute leukemias, including, for example, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, including myeloblastic, promyelocytic, myelomonocytic, monocytic and erythroleukemia); Chronic leukemia (eg, chronic myeloid (granulocytic) leukemia and chronic lymphocytic leukemia), polycythemia vera, lymphoma (eg, Hodgkin's disease and non-Hodgkin's disease), multiple myeloma, Waldenstrom macro Globulinemia, heavy chain disease, and solid tumors (sarcomas and carcinomas such as fibrosarcomas,
Myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma, chordoma, hemangiosarcoma, endothelial sarcoma (e
ndotheliosarcoma), lymphatic sarcoma, lymphatic endothelioma, periosteoma, mesothelioma, Ewing tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon carcinoma, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell carcinoma, basal Cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous carcinoma, papillary carcinoma, papillary carcinoma, cystic adenocarcinoma, medullary carcinoma, bronchial progenitor carcinoma, renal cell carcinoma, hepatocellular carcinoma,
Cholangiocarcinoma, choriocarcinoma, seminoma, embryonic cancer, Wilms tumor, cervical cancer, testicular tumor,
Lung cancer, small cell lung cancer, bladder cancer, epithelial cancer, glioma, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharyngioma, ventricular ependymoma, pinealoma, hemangioblastoma, auditory neuroma , Oligodendroma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, and retinoblastoma).

【０２９６】 本発明のＤＲ５ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／あるいはアンタゴ
ニストまたはアゴニストによって処置、予防、診断および／またはまたは予後判
定され得る、アポトーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パ
ーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍また
は以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン
症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄ
ｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫
関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再
生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流
傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害または疾患（例えば、肝炎関連肝臓
傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）
および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコール引き起こされるようなもの）
、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。好ましい実施形態において、Ｄ
Ｒ５ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアゴニストは、上記の疾患
および障害を処置および／またはするために使用される。[0296] Diseases associated with increased apoptosis that can be treated, prevented, diagnosed and / or prognosed by the DR5 polynucleotides, polypeptides, and / or antagonists or agonists of the invention include: Without limitation: AIDS; neurodegenerative disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, retinitis pigmentosa, cerebellar degeneration and brain tumors or previously related diseases); autoimmune disorders (eg, Multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, Hashimoto's thyroiditis, biliary cirrhosis, Behcet's disease
disease, Crohn's disease, polymyositis, systemic lupus erythematosus and immune-associated glomerulonephritis and rheumatoid arthritis), myelodysplastic syndrome (eg, aplastic anemia), graft versus host disease, ischemic injury (cardiac muscle) Infarction, stroke and reperfusion injury, liver injury or disease (eg, hepatitis-related liver injury, ischemia / reperfusion injury, cholestosis (bile duct injury)
And liver cancer); poison-induced liver disease (such as that caused by alcohol)
, Septic shock, cachexia and anorexia. In a preferred embodiment, D
R5 polynucleotides, polypeptides and / or agonists are used to treat and / or treat the above diseases and disorders.

【０２９７】 ＡＩＤＳを規定する免疫不全の状態は、ＣＤ４+Ｔリンパ球の数および機能の
減少に対して二次的である。最近の報告は、毎日のＣＤ４+Ｔ細胞の損失が、３
．５×１０7と２×１０9個の細胞の間であると推定する（Ｗｅｉ Ｘら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３７３：１１７−１２２（１９９５））。ＨＩＶ感染のセッティングに
おけるＣＤ４+Ｔ細胞の枯渇の一つの原因は、ＨＩＶ誘導性アポトーシスと考え
られている（例えば、Ｍｅｙａａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：２１７−２
１９、（１９９２）；Ｇｒｏｕｘら、Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７５：３３１、
（１９９２）；およびＯｙａｉｚｕら、Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎ
ｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＨＩＶ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ａｎｄｒｉｅｕ
およびＬｕ、編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５、１
０１−１１４頁を参照のこと）。実際に、ＨＩＶ誘導性アポトーシス細胞死は、
インビトロで実証されただけではなく、より重要なことに、感染した個体におい
て実証された（Ａｍｅｉｓｅｎ，Ｊ．Ｃ．、ＡＩＤＳ ８：１１９７−１２１３
（１９９４）；Ｆｉｎｋｅｌ，Ｔ．Ｈ．およびＢａｎｄａ，Ｎ．Ｋ．、Ｃｕｒｒ
．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：６０５−６１５（１９９５）；Ｍｕｒｏ−Ｃ
ａｃｈｏ，Ｃ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５５５−５５６６（１
９９５））。さらに、アポトーシスおよびＣＤ４+Ｔリンパ球の枯渇は、ＡＩＤ
Ｓの異なる動物モデルに密接に相関し（Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ
３７３：４４１−４４４（１９９５）；Ｇｏｕｇｅｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら、ＡＩＤ
Ｓ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ９：５５３−５６３（１９９
３））、そしてアポトーシスは、ウイルス複製がＡＩＤＳを生じないこれらの動
物モデルにおいては観察されない（Ｇｏｕｇｅｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら、ＡＩＤＳ Ｒ
ｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ９：５５３−５６３（１９９３））
。さらなるデータは、ＨＩＶに感染した個体由来の感染していないＴリンパ球で
あるが、プライムされるか活性化されたＴリンパ球が、ＴＦＮ−ファミリーリガ
ンドＦａｓＬと遭遇した後にアポトーシスを受けることを示す。ＨＩＶ感染後に
死を生じる単球細胞株を使用して、Ｕ９３７細胞のＨＩＶでの感染が、ＦａｓＬ
の新規の発現を生じ、そしてＦａｓＬが、ＨＩＶ誘導性アポトーシスを媒介する
ことが実証された（Ｂａｄｌｅｙ，Ａ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１９９
−２０６（１９９６））。さらに、ＴＮＦファミリーのリガンドは、感染されて
いないマクロファージにおいて検出可能であり、そしてその発現は、上方制御さ
れ、その後ＨＩＶ感染が、感染されていないＣＤ４ Ｔリンパ球の選択的殺傷を
生じる（Ｂａｄｌｅｙ，Ａ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１９９−２０６（
１９９６））。さらに、さらなる研究は、Ｆａｓ媒介性アポトーシスが、ＨＩＶ
個体におけるＴ細胞の損失を含意する（Ｋａｔｓｉｋｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１８１：２０２９−２０３６、１９９５）。The immunodeficient condition that defines AIDS is secondary to a decrease in the number and function of CD4 + T lymphocytes. Recent reports indicate that daily CD4 + T cell loss
. Estimate to be between 5 × 10 7 and 2 × 10 9 cells (Wei X et al., Nat
ure 373: 117-122 (1995)). One cause of CD4 + T cell depletion in the setting of HIV infection is thought to be HIV-induced apoptosis (eg, Meyaard et al., Science 257: 217-2).
19, (1992); Groux et al., J Exp. Med. 175: 331,
(1992); and Oyaizu et al., Cell Activation an.
d Apoptosis in HIV Infection, Andrieu
And Lu, Ed., Plenum Press, New York, 1995, 1
01-114). Indeed, HIV-induced apoptotic cell death is
Not only demonstrated in vitro, but more importantly, in infected individuals (Ameisen, JC, AIDS 8: 1197-1213).
(1994); Finkel, T .; H. And Banda, N .; K. , Curr
. Opin. Immunol. 6: 605-615 (1995); Muro-C.
acho, C .; A. J. et al. Immunol. 154: 5555-5566 (1
995)). In addition, apoptosis and depletion of CD4 + T lymphocytes are associated with AID
Closely correlates with different animal models of S. (Brunner, T. et al., Nature
373: 441-444 (1995); Gougeon, M .; L. AID
S Res. Hum. Retroviruses 9: 553-563 (199
3)), and apoptosis is not observed in these animal models where viral replication does not result in AIDS (Gougeon, ML et al., AIDS R).
es. Hum. Retroviruses 9: 553-563 (1993))
. Further data indicate that uninfected T lymphocytes from HIV-infected individuals, but primed or activated T lymphocytes undergo apoptosis after encountering the TFN-family ligand FasL . Using a monocyte cell line that dies after HIV infection, infection of U937 cells with HIV was
And FasL has been demonstrated to mediate HIV-induced apoptosis (Badley, AD, et al., J. Virol. 70: 199).
-206 (1996)). In addition, TNF family ligands are detectable in uninfected macrophages, and their expression is up-regulated, after which HIV infection results in the selective killing of uninfected CD4 T lymphocytes (Badley, A. D. et al., J. Virol. 70: 199-206 (
1996)). Furthermore, further studies indicate that Fas-mediated apoptosis is
Implies T cell loss in individuals (Katsikis et al., J. Exp. Me.
d. 181: 2029-2036, 1995).

【０２９８】 従って、本発明によって、ＨＩＶ+個体を処置および／または予防するための
方法が提供され、この方法は、本発明のＤＲ５、ＤＲ５アゴニストおよび／また
はＤＲ５アゴニストを投与する工程を包含し、ＣＤ４+Ｔリンパ球の選択的殺傷
を減少させる。投与および用量の様式を、以下に詳細に議論する。Thus, the present invention provides a method for treating and / or preventing an HIV + individual, comprising administering a DR5, DR5 agonist and / or DR5 agonist of the invention, Reduces selective killing of CD4 + T lymphocytes. Modes of administration and dosage are discussed in detail below.

【０２９９】 同種移植片拒絶では、レシピエント動物の免疫系は、ほとんどの場合免疫系は
周囲抗原によってのみ感作されるので、応答するように前もって感作されていな
い。同種のその他のメンバーからの組織は、例えば、ウイルスおよび細菌が提示
されるのと同じようには、提示されていない。同種移植片拒絶の場合、免疫抑制
養生法は、免疫系がエフェクター期に到達することを阻むように設計される。し
かし、異種移植片拒絶の免疫プロフィールは、同種移植片拒絶よりも疾患再発に
より類似し得る。疾患再発の場合、免疫系は、天然の島細胞の破壊によって示さ
れるように、すでに活性化されている。従って、疾患再発では、免疫系はすでに
エフェクター期にある。活性化され、エフェクター細胞へ分化されたリンパ球は
、ＤＲ５ポリペプチドを発現するので、本発明のアゴニストは、同種移植片およ
び異種移植片の両方に対する免疫応答を抑制し得、そのことによって、アポトー
シスを増強する化合物に感受性である。従って、本発明はさらに、免疫学的寛容
組織を作製するための方法を提供する。In allograft rejection, the immune system of the recipient animal has not been previously sensitized to respond, since in most cases the immune system is sensitized only by surrounding antigens. Tissues from other members of the same species are not presented in the same way that, for example, viruses and bacteria are presented. In the case of allograft rejection, immunosuppressive regimens are designed to prevent the immune system from reaching the effector phase. However, the immune profile of xenograft rejection may be more similar to disease recurrence than to allograft rejection. In the case of disease recurrence, the immune system is already activated, as indicated by the destruction of natural islet cells. Thus, in disease recurrence, the immune system is already in the effector phase. Since the activated and differentiated lymphocytes into effector cells express the DR5 polypeptide, the agonists of the invention may suppress the immune response to both allografts and xenografts, thereby reducing apoptosis. Sensitive to compounds that enhance Accordingly, the present invention further provides a method for producing an immunologically tolerant tissue.

【０３００】 本発明のＤＲ５アンタゴニストまたはアゴニストは、炎症疾患（例えば炎症腸
疾患、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、および敗血症）の処置および／
または予防に有用であり得る。The DR5 antagonists or agonists of the present invention may be used to treat and / or treat inflammatory diseases (eg, inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, psoriasis, and sepsis).
Or it may be useful for prevention.

【０３０１】 さらに、リンパ芽球のＤＲ５の発現に起因して、可溶性ＤＲ５アゴニスト、ま
たはアンタゴニスト（ｍＡＢ）この形態の癌の処置および／または予防に使用さ
れ得る。さらに、可溶性ＤＲ５または中和ｍＡＢは、種々の慢性および急性な形
態の炎症（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、敗血症および炎症
性腸疾患）の処置および／または予防に使用され得る。In addition, due to the expression of DR5 in lymphoblasts, soluble DR5 agonists, or antagonists (mABs) can be used to treat and / or prevent this form of cancer. In addition, soluble DR5 or neutralizing mAB may be used in the treatment and / or prevention of various chronic and acute forms of inflammation, such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, psoriasis, sepsis and inflammatory bowel disease. .

【０３０２】 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドならびに／あるいはそ
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、広範な疾患および／または状態
の診断および処置、予防、診断および／または検出において有用である。このよ
うな疾患および状態には、癌（例えば、免疫細胞関連癌、乳癌、前立腺癌、卵巣
癌、濾胞性リンパ腫、膠芽腫、ｐ５３の変異または変化と関連した癌、脳腫瘍、
膀胱癌、子宮頸部癌、大腸癌、結腸直腸癌、肺の非小細胞癌、肺の小細胞癌、胃
癌など）、リンパ増殖性障害（例えば、リンパ節造影およびリンパ節腫瘍（例え
ば、ホジキン病））、微生物（例えば、ウイルス、細菌など）感染（例えば、Ｈ
ＩＶ−感染、ＨＩＶ−２感染、ヘルペスウイルス感染（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２
、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＥＢＶを含むがこれらに限定され
ない）、アデノウイルス感染、ポックスウイルス感染、ヒトパピローマウイルス
感染、肝炎感染（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなど）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃ
ｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染、侵襲性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉａなど）、寄生
生物感染、腎炎、骨疾患（例えば、骨粗しょう症）、アテローム性動脈硬化症、
疼痛、心臓血管障害（例えば、新生血管形成、低血管形成または循環の減少（例
えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、発作など）））、ＡＩＤＳ、アレルギー
、炎症、神経変性性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮
性側索硬化症、色素性網膜症、小脳変性など）、移植拒絶（急性および慢性）、
対宿主性移植片病、骨髄形成異常症に起因する疾患（例えば、再生不良性貧血な
ど）、リウマチにおける関節組織破壊、肝臓疾患（例えば、急性および慢性肝炎
、肝臓損傷、および肝硬変）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、慢性関節
リウマチ、全身性エリテマトーデス、免疫複合体性糸球体腎炎、自己免疫性糖尿
病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グレーヴズ病、橋本甲状腺、炎炎症性自己
免疫疾患など）、心筋症（例えば、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病性合併症（
例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性ニューロパシー、糖尿病性網膜症）、インフル
エンザ、ぜん息、乾癬、骨髄炎、糸球体腎炎、敗血症性ショック、および潰瘍性
大腸炎が挙げられるがこれらに限定されない。The polynucleotides and / or polypeptides of the invention and / or agonists and / or antagonists thereof are useful in diagnosing and treating, preventing, diagnosing and / or detecting a wide range of diseases and / or conditions. Such diseases and conditions include cancers (eg, immune cell-associated cancers, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, follicular lymphoma, glioblastoma, cancers associated with p53 mutations or alterations, brain tumors,
Bladder cancer, cervical cancer, colorectal cancer, colorectal cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, gastric cancer, etc., lymphoproliferative disorders such as lymph node imaging and lymph node tumors such as Hodgkin Disease)), microbial (eg, virus, bacterial, etc.) infection (eg, H
IV-infection, HIV-2 infection, herpes virus infection (HSV-1, HSV-2
, CMV, VZV, HHV-6, HHV-7, EBV), adenovirus infection, poxvirus infection, human papillomavirus infection, hepatitis infection (eg, HAV, HBV, HCV, etc.), Helicobacter
ter pylori infection, invasive Staphylococcia, etc.), parasite infection, nephritis, bone disease (eg, osteoporosis), atherosclerosis,
Pain, cardiovascular disorders (eg, neovascularization, hypovascularization or decreased circulation (eg, ischemic disease (eg, myocardial infarction, stroke, etc.)), AIDS, allergies, inflammation, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, pigmented retinopathy, cerebellar degeneration), transplant rejection (acute and chronic),
Graft-versus-host disease, diseases caused by myelodysplasia (eg, aplastic anemia), joint tissue destruction in rheumatism, liver disease (eg, acute and chronic hepatitis, liver injury, and cirrhosis), autoimmunity Diseases (eg, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, immune complex glomerulonephritis, autoimmune diabetes, autoimmune thrombocytopenic purpura, Graves' disease, Hashimoto's thyroid, inflammatory autoimmunity Diseases, etc.), cardiomyopathy (eg, dilated cardiomyopathy), diabetes, diabetic complications (
(Eg, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy), influenza, asthma, psoriasis, osteomyelitis, glomerulonephritis, septic shock, and ulcerative colitis.

【０３０３】 本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／あるいは
そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、造血の調節、新脈管形成の
調節（例えば、促進）、創傷治癒（例えば、創傷、熱傷、および骨折）ならびに
骨形成の調節において有用である。The polynucleotides and / or polypeptides and / or agonists and / or antagonists thereof of the present invention may be used to modulate hematopoiesis, modulate (eg, promote) angiogenesis, wound healing (eg, wounds, burns, and Fractures) as well as in regulating bone formation.

【０３０４】 ＤＲ５ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤＲ５のアゴニストは
、感染因子の処置および／または予防に用いられ得る。例えば、感染性因子に対
する免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増
殖および分化を増加させることによって、感染性疾患が処置および／または予防
され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答
を開始させるかのいずれかにより上昇され得る。あるいは、ＤＲ５ポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチド、またはＤＲ５のアゴニストもしくはアンタゴニスト
はまた、必ずしも免疫応答を誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る。A DR5 polynucleotide or polypeptide, or an agonist of DR5, can be used for the treatment and / or prevention of an infectious agent. For example, an infectious disease can be treated and / or prevented by increasing the immune response to the infectious agent, particularly by increasing the proliferation and differentiation of B cells and / or T cells. The immune response can be raised either by raising an existing immune response or by starting a new immune response. Alternatively, DR5 polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of DR5, can also directly inhibit infectious agents, without necessarily eliciting an immune response.

【０３０５】 ウイルスは、ＤＲ５ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤＲ５ア
ゴニストにより処置および／または予防され得る疾患または症状を引き起こし得
る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡの
ウイルスおよびウイルス科が挙げられるがこれらに限定されない：アルボウイル
ス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス
科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉ
ｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２
、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎）、ヘルペスウイ
ルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス１および２、ヘルペス帯
状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヘルペスＢ型ウイル
ス、ならびにヒトヘルペスウイルス６，７および８）、モルビリウイルス科、ラ
ブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス）、オルソミクソウイルス科（例えば
、インフルエンザＡウイルス、およびインフルエンザＢ）、パラミクソウイルス
科（例えば、パラインフルエンザウイルス）、パピローマウイルス、パポバウイ
ルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科（例えば、ＥＭＣＶおよびポリ
オウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡またはワクシニアウイルス）
、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ
、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、ならびにトガウイルス科（例えば、ルビ
ウイルス属）。これらのウイルスまたはウイルス科は、以下を含むがこれらに限
定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒ
ｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性疾患、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎
、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デ
ルタ）、日本脳炎Ｂ型、アルゼンチン出血熱、チングニア、リフトバレー熱、黄
熱病、髄膜炎、痘瘡、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ、カポージ肉腫）、肺炎
、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエ
ンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポ
ージ、いぼ）、ならびにウイルス血症。ＤＲ５ポリペプチドもしくはポリヌクレ
オチド、またはＤＲ５のアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意のこ
れらの症状または疾患を処置、予防および／または検出し得る。特定の実施形態
において、ＤＲ５ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストは、以下
の処置および／または予防に使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／
または肝炎。さらなる具体的な実施形態において、ＤＲ５ポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、またはアゴニストは、１以上の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性
の患者を処置するために使用される。さらに特定の実施形態において、ＤＲ５ポ
リヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストは、ＡＩＤＳを処置するため
に使用される。A virus is an example of an infectious agent that can cause a disease or condition that can be treated and / or prevented by a DR5 polynucleotide or polypeptide, or DR5 agonist. Examples of viruses include, but are not limited to, the following DNA and RNA viruses and virions: arbovirus, adenoviridae, arenaviridae, arterivirus, birnaviridae, bunyaviridae, calcivirus. Family, sarcoviridae (Circovi)
Ridae), Coronaviridae, Dengue virus, HIV-1, HIV-2
Flaviviridae, Hepadnaviridae (eg, hepatitis B), Herpesviridae (eg, cytomegalovirus, herpes simplex 1 and 2, herpes zoster virus, Epstein-Barr virus (EBV), herpes B virus And human herpesviruses 6, 7, and 8), Morbilliviridae, Rhabdoviridae (eg, rabies virus), Orthomyxoviridae (eg, influenza A virus, and influenza B), Paramyxoviridae (eg, Parainfluenza virus), papillomavirus, papovaviridae, parvoviridae, picornaviridae (eg, EMCV and poliovirus), poxviridae (eg, smallpox or vaccinia virus)
, Reoviridae (eg, rotavirus), Retroviridae (HTLV-I)
HTLV-II, lentivirus), and Togaviridae (e.g., Rubivirus). These viruses or virions can cause a variety of diseases or conditions, including but not limited to: arthritis, bronchiolitis (br
onchiollitis), respiratory disease, encephalitis, ocular infections (eg, conjunctivitis, keratitis), chronic fatigue syndrome, hepatitis (type A, type B, type C, type E, chronic activity, delta), Japanese encephalitis B Type, Argentine hemorrhagic fever, chinnia, Rift Valley fever, yellow fever, meningitis, smallpox, opportunistic infections (eg, AIDS, Kaposi's sarcoma), pneumonia, Burkitt's lymphoma, chickenpox, hemorrhagic fever, measles, mumps Adenitis, parainfluenza, rabies, cold, polio, leukemia, rubella, sexually transmitted diseases, skin diseases (eg, caposi, warts), and viremia. Any of these conditions or diseases may be treated, prevented and / or detected using a DR5 polypeptide or polynucleotide, or an agonist or antagonist of DR5. In certain embodiments, a DR5 polynucleotide, polypeptide, or agonist is used for the following treatments and / or prophylaxis: meningitis, dengue, EBV, and / or
Or hepatitis. In further specific embodiments, a DR5 polynucleotide, polypeptide, or agonist is used to treat a patient non-responsive to one or more other commercially available hepatitis vaccines. In a more specific embodiment, a DR5 polynucleotide, polypeptide, or agonist is used to treat AIDS.

【０３０６】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつＤＲ５ポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、またはＤＲ５のアゴニストもしくはアンタゴニストによって処
置および／または予防され得る細菌あるいは真菌は、以下の細菌を含むがこれら
に限定されない。細菌としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Similarly, bacteria or fungi that can cause a disease or condition and that can be treated and / or prevented by a DR5 polynucleotide or polypeptide, or an agonist or antagonist of DR5 include, but are not limited to, the following bacteria: . Bacteria include, but are not limited to, the following:

【０３０７】[0307]

【化３】 真菌としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Embedded image Fungi include, but are not limited to, the following:

【０３０８】[0308]

【化４】 これらおよび他の細菌または真菌は、以下を含むがこれらに限定されない疾患ま
たは症状を引き起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、ブドウ膜炎
）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、
プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症
）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフ
ス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、パラ結核、
結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性
感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ
））、毒血症、***症、および創傷感染症。ＤＲ５ポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、またはＤＲ５のアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、
任意のこれらの症状もしくは疾患を処置、予防および／または検出し得る。具体
的な実施形態において、ＤＲ５ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはそれら
のアゴニストは、以下を処置および／または予防するために使用される：破傷風
、ジフテリア、ボツリヅム、および／またはＢ型髄膜炎。Embedded image These and other bacteria or fungi can cause diseases or conditions including, but not limited to: bacteremia, endocarditis, ocular infections (conjunctivitis, uveitis), gingivitis, opportunistic infections. (Eg, infections associated with AIDS), periungualitis,
Prosthesis-related infections, Reiter's disease, respiratory tract infections (eg, pertussis or pyometra), sepsis, Lyme disease, cat scratching, dysentery, paratyphoid fever, food poisoning, typhoid fever, pneumonia, gonorrhea, meningitis, chlamydia, syphilis, diphtheria , Leprosy, paratuberculosis,
Tuberculosis, lupus, botulism, gangrene, tetanus, impetigo, rheumatic fever, scarlet fever, sexually transmitted diseases, skin diseases (eg, cellulitis, dermatomycoses)
)), Toxemia, urinary tract infections, and wound infections. Using DR5 polynucleotides or polypeptides, or DR5 agonists or antagonists,
Any of these conditions or diseases may be treated, prevented and / or detected. In a specific embodiment, a DR5 polynucleotide, polypeptide, or agonist thereof is used to treat and / or prevent: tetanus, diphtheria, botulinum, and / or meningitis B.

【０３０９】 さらに、ＤＲ５ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤＲ５のアゴ
ニストにより処置および／または予防され得る、寄生性疾患または症状を引き起
こす寄生生物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：In addition, parasites that cause a parasitic disease or condition that can be treated and / or prevented by a DR5 polynucleotide or polypeptide, or an agonist of DR5 include, but are not limited to, the following:

【０３１０】[0310]

【化５】 を含むが、これらに限定されない原生動物寄生生物；ならびにEmbedded image Protozoan parasites, including, but not limited to; and

【０３１１】[0311]

【化６】 を含むが、これらに限定されない蠕虫寄生生物。これらの寄生生物は、以下を含
むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツ
ガムシ病、眼性感染症（例えば、河川盲目症）、象皮病、腸疾患（例えば、赤痢
、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ
関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。ＤＲ５ポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチド、またはＤＲ５のアゴニストもしくはアンタゴニスト
を用いて、任意のこれらの症状または疾患を処置、予防および／または検出し得
る。特定の実施形態において、ＤＲ５ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または
それらのアゴニストは、マラリアを処置および／または予防するために使用され
る。Embedded image Helminth parasites, including, but not limited to. These parasites can cause a variety of diseases or conditions, including but not limited to: scabies, tsutsugamushi disease, ocular infections (eg, river blindness), elephantiasis, bowel diseases (eg, dysentery, giardia) Flagellosis, liver disease, lung disease, opportunistic infections (eg AIDS
Related), malaria, pregnancy complications, and toxoplasmosis. Any of these conditions or diseases may be treated, prevented and / or detected using a DR5 polynucleotide or polypeptide, or an agonist or antagonist of DR5. In certain embodiments, a DR5 polynucleotide, polypeptide, or agonist thereof is used to treat and / or prevent malaria.

【０３１２】 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいは
それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストはまた、特定の抗原、腫瘍特
異的免疫応答、および／または抗ウイルス免疫応答に対する免疫応答性を増強す
るために、ワクチンアジュバントとして有用である。The polynucleotides and / or polypeptides of the invention, and / or agonists and / or antagonists thereof, may also enhance immune responsiveness to certain antigens, tumor-specific immune responses, and / or anti-viral immune responses And is useful as a vaccine adjuvant.

【０３１３】 抗ウイルス免疫応答を増強するアジュバント。アジュバントとして、本発明の
組成物を使用して増強され得る抗ウイルス免疫応答は、本明細書中に記載される
か、またはそうでなければ当該分野で公知のウイルス疾患もしくは症状、または
ウイルス関連性の疾患もしくは症状を含む。特定の実施形態において、本発明の
組成物は、以下からなる群より選択されるウイルス、疾患、または症状に対する
免疫応答を増強するためにアジュバントとして使用され得る：ＡＩＤＳ、髄膜炎
、デング熱、ＥＢＶおよび肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。別の特定の実施形態にお
いて、本発明の組成物は、以下からなる群より選択されるウイルス、疾患または
症状に対する免疫応答を増強するためにアジュバントとして使用される：ＨＩＶ
／ＡＩＤＳ、ＲＳウイルス、デング熱、ロタウイルス、日本脳炎Ｂ型、インフル
エンザＡおよびＢ、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、狂犬病
、アルゼンチン出血熱、チクングニヤ、リフトバレー熱、単純ヘルペスウイルス
、および黄熱病。An adjuvant that enhances the antiviral immune response. As an adjuvant, an anti-viral immune response that can be enhanced using the compositions of the present invention is a viral disease or condition described herein or otherwise known in the art, or a virus-associated disease. Disease or condition. In certain embodiments, the compositions of the present invention may be used as adjuvants to enhance an immune response to a virus, disease, or condition selected from the group consisting of: AIDS, meningitis, dengue, EBV. And hepatitis (eg, hepatitis B). In another specific embodiment, a composition of the invention is used as an adjuvant to enhance an immune response to a virus, disease or condition selected from the group consisting of: HIV
/ AIDS, RS virus, dengue, rotavirus, Japanese encephalitis type B, influenza A and B, parainfluenza, measles, cytomegalovirus, rabies, Argentine hemorrhagic fever, chikungunya, rift valley fever, herpes simplex virus, and yellow fever.

【０３１４】 アジュバントとして、本発明の組成物を使用して増強され得る抗細菌または抗
真菌免疫応答としては、本明細書中に記載されるか、またはそうでなければ当該
分野で公知である、細菌または真菌性疾患または症状、および細菌または真菌に
関連する疾患または症状が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成
物は、以下からなる群より選択される細菌もしくは真菌、疾患または症状に対す
る免疫応答を増強するためにアジュバントとして使用される：破傷風、ジフテリ
ア、ボツリヌス中毒、および髄膜炎Ｂ型。別の特定の実施形態において、本発明
の組成物は、以下からなる群より選択される細菌に対する免疫応答を増強するた
めにアジュバントして使用される：As an adjuvant, anti-bacterial or anti-fungal immune responses that can be enhanced using the compositions of the present invention are described herein or otherwise known in the art. Bacterial or fungal diseases or conditions, and diseases or conditions associated with bacteria or fungi. In certain embodiments, the compositions of the present invention are used as adjuvants to enhance an immune response to a bacterium or fungus, disease or condition selected from the group consisting of: tetanus, diphtheria, botulism, and Meningitis type B. In another specific embodiment, the compositions of the present invention are used as an adjuvant to enhance an immune response against a bacterium selected from the group consisting of:

【０３１５】[0315]

【化７】 アジュバントとして、本発明の組成物を使用して増強され得る抗寄生生物免疫
応答としては、本明細書中に記載されるか、またはそうでなければ当該分野で公
知である、寄生生物性疾患または症状、および寄生生物関連性疾患または症状が
挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、寄生生物に対する免
疫応答を増強するためにアジュバントとして使用される。別の特定の実施形態に
おいて、本発明の組成物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．（マラリア）に対
する免疫応答を増強するためにアジュバントして使用される。Embedded image As an adjuvant, antiparasitic immune responses that can be enhanced using the compositions of the present invention include those described herein or otherwise known in the art, such as parasitic disease or Symptoms, and parasite-related diseases or conditions. In certain embodiments, the compositions of the present invention are used as adjuvants to enhance an immune response against a parasite. In another specific embodiment, the composition of the present invention comprises Plasmodium spp. (Malaria) is used as an adjuvant to enhance the immune response.

【０３１６】 より一般的には、本発明のＤＲ５ポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプ
チドならびに／あるいはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、免
疫応答を調節する（すなわち、上昇または減少させる）際に有用である。例えば
、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、手術、外傷、放射
線治療、化学療法、および移植からの準備または回復において有用であり得る。
さらに、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、また、高齢
の個体および免疫無防備状態の個体において免疫応答をブースとするため、なら
びに／または回復を促進するために、あるいは、免疫抑制治療を受ける前に個体
の免疫状態を上昇させる薬剤として、使用され有る。また、本発明のポリヌクレ
オチドおよび／もしくはポリペプチドは、より高い親和性の抗体を誘導するため
の薬剤として、または血清免疫グロブリン濃度を増加するための薬剤として、有
用であり得る。More generally, DR5 polynucleotides and / or polypeptides of the invention and / or agonists and / or antagonists thereof are useful in modulating (ie, increasing or decreasing) an immune response. For example, the polynucleotides and / or polypeptides of the invention may be useful in preparing for or recovering from surgery, trauma, radiation therapy, chemotherapy, and transplantation.
In addition, the polynucleotides and / or polypeptides of the present invention may also be used to boost the immune response in elderly and immunocompromised individuals and / or to promote recovery, or to provide immunosuppressive treatment. It is used as a drug to increase the immune status of an individual before receiving it. Also, the polynucleotides and / or polypeptides of the present invention may be useful as agents for inducing higher affinity antibodies or as agents for increasing serum immunoglobulin concentrations.

【０３１７】 １つの実施形態において、本発明のＤＲ５ポリヌクレオチドおよび／またはポ
リペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストは、骨髄移植および／または他
の移植（例えば、同種異系器官移植または外因性器官移植）の前、間またはその
後に、免疫系エンハンサーとして使用され得る。移植に関して、本発明の組成物
は、移植の前、移植と同時、および／または移植の後に、投与され得る。特定の
実施形態において、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回復開始の前に
、投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、まず、移植後
に、Ｔ細胞集団の回復開始後だが、Ｂ細胞集団の完全な回復の前に、投与される
。In one embodiment, the DR5 polynucleotides and / or polypeptides of the invention, and / or agonists thereof, are used in bone marrow transplants and / or other transplants (eg, allogeneic or exogenous organ transplants). Before, during or after, it can be used as an immune system enhancer. For transplantation, the compositions of the present invention may be administered before, simultaneously with, and / or after transplantation. In certain embodiments, the compositions of the invention are administered after transplantation and before the onset of T cell population recovery. In another specific embodiment, the compositions of the invention are administered first after transplantation, after the onset of recovery of the T cell population, but before complete recovery of the B cell population.

【０３１８】 別の実施形態において、本発明のＤＲ５ポリペプチドおよび／またはポリヌク
レオチド、あるいはそのアゴニストは、Ｂ細胞免疫不全の個体間の免疫応答性を
ブーストするための因子として使用され得る。本発明のＤＲ５ポリヌクレオチド
および／またはポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストを投与するこ
とにより緩和または処置および／または予防され得るＢ細胞免疫不全としては、
重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、先天性無ガンマグロブリン血症、分類不能型
免疫不全、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、および過剰ＩｇＭを伴うＸ連
鎖性免疫不全（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｗｉｔ
ｈ ｈｙｐｅｒ ＩｇＭ）が挙げられるが、こららに限定されない。In another embodiment, DR5 polypeptides and / or polynucleotides of the invention, or agonists thereof, can be used as a factor to boost immune responsiveness between B cell immunodeficient individuals. B cell immunodeficiencies that can be alleviated or treated and / or prevented by administering the DR5 polynucleotides and / or polypeptides of the invention and / or agonists thereof include:
Severe combined immunodeficiency (SCID), congenital agammaglobulinemia, unclassifiable immunodeficiency, Viscott-Aldrich syndrome, and X-linked immunodeficiency wit with excess IgM
h hyper IgM), but is not limited thereto.

【０３１９】 さらに、本発明のＤＲ５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、なら
びに／あるいはそのアゴニストは、Ｂ細胞機能の後天的損失を有する個体の間で
免疫応答性をブーストするための因子として使用され得る。本発明のＤＲ５ポリ
ペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、ならびに／あるいはそのアゴニスト
を投与することにより緩和、処置および／または予防され得る一時的免疫欠損を
生じる状態としては、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄移植、およびＢ細胞慢性リン
パ性白血病（ＣＬＬ）が、挙げられるがこれらに限定されない。In addition, the DR5 polynucleotides and / or polypeptides of the invention, and / or agonists thereof, may be used as a factor to boost immune responsiveness among individuals with an acquired loss of B cell function. . Conditions that produce a temporary immune deficiency that can be alleviated, treated and / or prevented by administering a DR5 polypeptide and / or polynucleotide of the invention and / or an agonist thereof include HIV infection, AIDS, bone marrow transplantation, and B cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) includes, but is not limited to.

【０３２０】 さらに、本発明のＤＲ５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、なら
びに／あるいはそのアゴニストは、一時的免疫不全を有する個体の間で免疫応答
性をブーストするための因子として使用され得る。本発明のＤＲ５ポリヌクレオ
チドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストを投与す
ることにより緩和、処置および／または予防され得る一時的免疫不全の後天性損
失を生じる状態としては、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）からの回復
、栄養失調に関係する状態、感染性単核細胞症からの回復、またはストレスに関
係する状態、麻疹からの回復、血液輸血からの回復、手術からの回復が挙げられ
るが、これらに限定されない。In addition, the DR5 polynucleotides and / or polypeptides of the invention, and / or agonists thereof, can be used as an agent to boost immune responsiveness among individuals with transient immunodeficiency. Conditions that result in acquired loss of transient immunodeficiency that can be alleviated, treated and / or prevented by administering the DR5 polynucleotides and / or polypeptides of the invention, and / or agonists thereof, include viral infections (eg, Influenza), malnutrition-related conditions, recovery from infectious mononucleosis, or stress-related conditions, recovery from measles, recovery from blood transfusions, recovery from surgery, It is not limited to these.

【０３２１】 本発明のＤＲ５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あ
るいはそのアゴニストはまた、単球、樹状細胞および／またはＢ細胞による抗原
提示の調節因子として使用され得る。１つの実施形態において、ＤＲ５（可溶性
形態、膜結合形態または膜貫通形態）は、インビトロまたはインビボでの抗原提
示を増強するかまたは抗原提示と拮抗する。The DR5 polynucleotides and / or polypeptides of the invention, and / or agonists thereof, may also be used as modulators of antigen presentation by monocytes, dendritic cells and / or B cells. In one embodiment, DR5 (soluble, membrane-bound or transmembrane) enhances or antagonizes antigen presentation in vitro or in vivo.

【０３２２】 関連する実施形態において、この抗原提示の増強または拮抗作用は、抗腫瘍処
置としてかまたはその免疫系を調節するために、有用であり得る。例えば、本発
明のＤＲ５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいは
そのアゴニストは、ＴＨ１細胞性応答とは対照的に、体液性応答（すなわち、Ｔ
Ｈ２）の発生へと個体の免疫系を向けるための因子として使用され得る。また、
本発明のＤＲ５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／ある
いはそのアゴニストは、病因（例えば、ＡＩＤＳ、慢性リンパ球障害および／ま
たは分類不能型免疫不全）におけるＢ細胞産生の刺激因子として使用され得る。In a related embodiment, this enhancement or antagonism of antigen presentation may be useful as an anti-tumor treatment or to modulate its immune system. For example, a DR5 polynucleotide and / or polypeptide of the invention, and / or an agonist thereof, may have a humoral response (i.e., T
H2) can be used as a factor to direct an individual's immune system toward development. Also,
The DR5 polynucleotides and / or polypeptides of the invention, and / or agonists thereof, can be used as stimulators of B cell production in the pathogenesis (eg, AIDS, chronic lymphocytic disorders and / or unclassifiable immunodeficiency).

【０３２３】 別の実施形態において、本発明のＤＲ５ポリヌクレオチドおよび／またはポリ
ペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストは、腫瘍増殖を誘導するため、従
って抗腫瘍性因子に対してその腫瘍をより感受性にするための、手段として使用
され得る。例えば、多発性骨髄種は、ゆっくり***する疾患であり、従って事実
上すべての抗腫瘍性レジメンに対して治療抵抗性である。これらの細胞が無理に
より迅速に増殖させられた場合、おそらくその感受性プロフィールは変化する。In another embodiment, the DR5 polynucleotides and / or polypeptides of the invention, and / or agonists thereof, induce tumor growth and thus make the tumor more susceptible to anti-tumor agents. Can be used as a means for For example, multiple myeloma is a slowly dividing disease and is therefore refractory to virtually all antitumor regimens. If these cells are forced to grow rapidly, their sensitivity profile will probably change.

【０３２４】 本発明のＤＲ５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あ
るいはそのアゴニストが使用され得る他の実施形態としては、病因（例えば、Ａ
ＩＤＳ、慢性リンパ球障害および／または分類不能型免疫不全）におけるＢ細胞
産生の刺激因子として；手術、外傷または遺伝子欠損の後のリンパ系組織の産生
および／または再生のための治療として；ＳＣＩＤ患者の間で観察されるような
免疫不全を生じる、遺伝的障害についての遺伝子に基づく治療として；ＤＲ５媒
介性応答を阻害または増強するための抗体の産生のための抗原として；Ｔ細胞を
活性化するための手段として；移植前の骨髄サンプルの事前処理として（このよ
うな処理は、Ｂ細胞提示を増大し、それにより回復を促進させる）；ＤＲ５によ
り惹起される分泌サイトカインを調節する手段として；インビトロまたはインビ
ボでのＩｇＥ濃度を調節するため；ならびに喘息、鼻炎、および湿疹を含むがこ
れらに限定されない、ＩｇＥ媒介性アレルギー反応を処置および／または予防す
るため、が挙げられるがこれらに限定されない。Other embodiments in which DR5 polynucleotides and / or polypeptides of the invention and / or agonists thereof may be used include, but are not limited to, pathogenesis (eg, A
As a stimulator of B-cell production in IDS, chronic lymphocytic disorders and / or non-classifiable immunodeficiency); as a treatment for the production and / or regeneration of lymphoid tissue following surgery, trauma or genetic deficiency; SCID patients Activating T cells as a gene-based therapy for genetic disorders resulting in immunodeficiency as observed between; as an antigen for the production of antibodies to inhibit or enhance a DR5-mediated response; As a pretreatment of bone marrow samples prior to transplantation (such treatment increases B cell presentation and thereby promotes recovery); as a means of modulating DR5-induced secreted cytokines; in vitro Or to regulate IgE levels in vivo; and, but not limited to, asthma, rhinitis, and eczema For the treatment and / or prevention of IgE mediated allergic reactions, but are not limited to these.

【０３２５】 あるいは、本発明のＤＲ５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、な
らびに／あるいはそのアゴニストは、例えば、自己免疫障害の処置および／また
は予防する際に、免疫抑制因子として有用である。特定の実施形態において、本
発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、慢性の炎症状態、アレ
ルギー状態または自己免疫状態（例えば、本明細書中に記載される状態さもなけ
れば当該分野で公知である状態）を処置および／または予防するために使用され
る。Alternatively, DR5 polynucleotides and / or polypeptides of the invention, and / or agonists thereof, are useful as immunosuppressive factors, for example, in treating and / or preventing an autoimmune disorder. In certain embodiments, the polynucleotides and / or polypeptides of the invention have a chronic inflammatory, allergic, or autoimmune condition (eg, as described herein or otherwise known in the art). Condition) for treatment and / or prevention.

【０３２６】 好ましくは、ＤＲ５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、あるいは
そのＤＲ５のアゴニストを使用する処置は、患者に有効量のＤＲ５ポリペプチド
を投与することか、または患者から細胞を取り出し、その細胞にＤＲ５ポリペプ
チドを供給し、そしてその患者に操作した細胞を戻すこと（エキソビボ治療）の
いずれかによってであり得る。さらに、本明細書中にさらに考察されるように、
このＤＲ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、感染性疾患に対する免疫応
答を惹起するためのワクチンにおけるアジュバントとして使用され得る。Preferably, treatment using a DR5 polynucleotide and / or polypeptide, or an agonist of DR5 thereof, comprises administering to the patient an effective amount of the DR5 polypeptide or removing cells from the patient and allowing the cells to It can be by either supplying the DR5 polypeptide and returning the engineered cells to the patient (ex vivo treatment). Further, as discussed further herein,
The DR5 polypeptide or polynucleotide can be used as an adjuvant in a vaccine to elicit an immune response against an infectious disease.

【０３２７】 本発明のさらに好ましい実施形態としては、適用後におけるＤＲ５ポリペプチ
ドおよび機能性アゴニストの使用；免疫系をブーストするために動物（例えば、
マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミクロピッグ（ｍｉ
ｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ラクダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ
、非ヒト霊長類、およびヒト（最も好ましくは、ヒト））に投与して、１つ以上
の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）の量の増大を生じる
ため、より高親和性の抗体産生（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇ
Ｅ）を誘導するため、そして／または免疫応答を増強するため；あるいは機能性
の内因性抗体分子を産生し得ないか、さもなければ弱められた内因性免疫系を有
するが、別の動物由来の再構築または部分的再構築された免疫系によりヒト免疫
グロブリン分子を産生し得る動物（上記に列挙したものを含むがそれらに限定さ
れず、そしてトランスジェニック動物も含む）への投与が、挙げられるがこれら
に限定されない（例えば、公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２４８９３、Ｗ
Ｏ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１０７４１を参照
のこと）。A further preferred embodiment of the present invention includes the use of DR5 polypeptides and functional agonists after application; animals (eg,
Mouse, rat, rabbit, hamster, guinea pig, pig, micropig (mi
cro-pig), chickens, camels, goats, horses, cows, sheep, dogs, cats, non-human primates, and humans (most preferably, humans), and one or more antibodies (eg, IgG) , IgA, IgM, and IgE), resulting in higher affinity antibody production (eg, IgG, IgA, IgM, and Ig).
E) to induce and / or enhance the immune response; or have an endogenous immune system that is incapable of producing functional endogenous antibody molecules, or otherwise has a weakened endogenous immune system Administration to animals capable of producing human immunoglobulin molecules by the reconstituted or partially reconstituted immune system, including but not limited to those listed above, and also including transgenic animals. But not limited to them (eg, published PCT Application No. WO 98/24893, W.
O96 / 34096, WO96 / 33735 and WO91 / 10741).

【０３２８】 ＤＲ５のアンタゴニストは、ＤＲ５レセプターの結合抗体および／または阻害
抗体、アンチセンス核酸、リボザイムまたは可溶性形態を含む。これらは、本明
細書中の活性の多くを逆転すること、ならびに以下の適用を含むがそれらに限定
されない臨床適用または実地適用を見出すことが、予期される。ＤＲ５アンタゴ
ニストは、外来因子または自己に対する免疫応答の種々の局面（例えば、自己免
疫障害（例えば、狼瘡、および関節炎、ならびに皮膚アレルギーに対する免疫応
答性、炎症、腸疾患、損傷および病原体）をブロックすることにより使用され得
る。本発明者らの現在のデータは、Ｂ細胞およびＴ細胞に関連する病因における
ＤＲ５の潜在的役割を直接に述べるが、他の細胞型がＤＲ５に対する発現または
応答性を獲得し得ることが可能なままである。従って、ＤＲ５は、ＣＤ４０およ
びそのリガンドと同様に、免疫系の状態および細胞が位置する微小環境によって
調節され得る。ＤＲ５アンタゴニストは、自己免疫疾患（例えば、特発性血小板
減少性紫斑病、全身エリテマトーデス）と関連するＢ細胞増殖およびＩｇ分泌を
予防するための治療として；対宿主性移植片病または移植片拒絶のインヒビター
として；Ｂ細胞悪性疾患（例えば、ＡＬＬ、ホジキン病、非ホジキンリンパ種、
慢性リンパ性白血病、プラズマ細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、お
よびＥＢＶ形質転換疾患）の治療として；慢性高ガンマグロブリン血症事象（例
えば、原因不明の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌｇａｍｍｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃ
ａｎｃｅ）（ＭＧＵＳ）、ヴァルデンストレーム病、関連する特発性単一クロー
ン性高ガンマグロブリン血症、およびプラズマ細胞腫）の治療として；大Ｂ細胞
リンパ腫の細胞増殖を減少するための治療として；慢性骨髄性白血病と関連する
Ｂ細胞およびＩｇの関与を減少する手段として；あるいは免疫抑制剤として、使
用され得る。[0328] Antagonists of DR5 include binding and / or inhibitory antibodies, antisense nucleic acids, ribozymes or soluble forms of the DR5 receptor. These are expected to reverse many of the activities herein, as well as find clinical or field applications, including but not limited to the following applications. DR5 antagonists block various aspects of the immune response to foreign factors or to self, such as autoimmune disorders such as lupus and arthritis, and immune responsiveness to skin allergies, inflammation, bowel disease, injury and pathogens. Our current data directly describes the potential role of DR5 in B cell and T cell related pathogenesis, but other cell types gain expression or responsiveness to DR5. Thus, DR5, like CD40 and its ligands, can be regulated by the state of the immune system and the microenvironment in which cells are located. Prevent B cell proliferation and Ig secretion associated with thrombocytopenic purpura, systemic lupus erythematosus) As because the treatment; as inhibitors of graft versus host disease or transplant rejection; B-cell malignancies (e.g., ALL, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma,
As a treatment for chronic lymphocytic leukemia, plasmacytoma, multiple myeloma, Burkitt's lymphoma, and EBV transformation disease; chronic hypergammaglobulinemia events (eg, monoclonal hypergammaglobulinemia of unknown cause) (Monoclona
lgammapathy of undetermined signific
ance) (MGUS), Waldenstrom's disease, related idiopathic monoclonal gammopathy, and plasmacytoma); as a treatment to reduce cell proliferation of large B-cell lymphoma; It can be used as a means to reduce the involvement of B cells and Ig associated with chronic myeloid leukemia; or as an immunosuppressant.

【０３２９】 さらに、本発明のＤＲ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそれ
らのアンタゴニストは、インビトロまたはインビボでＩｇＥ濃度を調節するため
、あるいはＩｇＥ媒介性アレルギー反応（喘息、鼻炎および湿疹を含むが、これ
らに限定されない）を処置および／または予防するために、使用され得る。In addition, the DR5 polypeptides or polynucleotides, or antagonists thereof, of the present invention may be used to modulate IgE levels in vitro or in vivo, or to regulate IgE-mediated allergic reactions (including, but not limited to, asthma, rhinitis and eczema). (Non-limiting) to treat and / or prevent.

【０３３０】 本明細書中に記載の本発明のＤＲ５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプ
チド、ならびに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの治療
適用のすべては、ヒト医療におけるそれらの使用に加えて、脊椎動物医療におい
て使用され得る。本発明は、伴侶動物（イヌ、ネコ、フェレット、鳥類、および
ウマを含むがこれらに限定されない）；食用動物（ウシ、ブタ、ニワトリ、およ
びヒツジを含むがこれらに限定されない）；ならびに風変わりな動物（例えば、
動物園の動物）の処置を含む。[0330] All of the therapeutic applications of the DR5 polynucleotides and / or polypeptides of the invention described herein and / or agonists and / or antagonists thereof, in addition to their use in human medicine, include vertebrate animals. Can be used in medicine. The present invention relates to companion animals (including but not limited to dogs, cats, ferrets, birds, and horses); food animals (including but not limited to cows, pigs, chickens, and sheep); and quirky animals (For example,
Zoo animals).

【０３３１】 上記に言及される適用は、広範な種類の宿主における使用を有する。このよう
な宿主としては、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マ
ウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワ
トリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げれら
れるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、この宿主は、マウス
、ウサギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、
イヌ、またはネコである。好ましい実施形態において、この宿主は哺乳動物であ
る。最も好ましい実施形態において、この宿主はヒトである。The applications mentioned above have use in a wide variety of hosts. Such hosts include human, mouse, rabbit, goat, guinea pig, camel, horse, mouse, rat, hamster, pig, micro-pig, chicken, goat, cow, sheep, dog, cat, non-human Include, but are not limited to, human primates, and humans. In certain embodiments, the host is a mouse, rabbit, goat, guinea pig, chicken, rat, hamster, pig, sheep,
Dog or cat. In a preferred embodiment, the host is a mammal. In a most preferred embodiment, the host is human.

【０３３２】 本明細書中に記載される本発明のＤＲ５ポリヌクレオチドおよび／またはポリ
ペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは
、例えば、本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能なキャリアを含む
組成物において、使用され得る。[0332] The DR5 polynucleotides and / or polypeptides of the invention described herein, and / or agonists and / or antagonists thereof, can be used, for example, pharmaceutically as described herein. It may be used in a composition comprising an acceptable carrier.

【０３３３】 １つの局面において、本発明は、本発明は、ＴＮＦ−ファミリーリガンドによ
り誘導されるアポトーシスを増強するための方法に関し、この方法は、このＤＲ
５ポリペプチドを発現する細胞に、ＤＲ５媒介性シグナル伝達を増強し得るＤＲ
５リガンド、アナログ、またはアゴニストの有効量を投与する工程を包含する。
好ましくは、ＤＲ５媒介性シグナル伝達は、アポトーシスの減少またはサイトカ
インおよび接着分子の発現の減少が示される疾患を、処置および／または予防す
るように増加される。アゴニストとしては、ＤＲ５の可溶性形態、およびＤＲ５
ポリペプチドに対するモノクローナル抗体が、挙げられ得る。In one aspect, the present invention relates to a method for enhancing apoptosis induced by a TNF-family ligand, said method comprising:
DR capable of enhancing DR5 mediated signaling in cells expressing 5 polypeptide
Administering an effective amount of the five ligands, analogs, or agonists.
Preferably, DR5 mediated signaling is increased to treat and / or prevent a disease that shows reduced apoptosis or reduced expression of cytokines and adhesion molecules. Agonists include soluble forms of DR5 and DR5
Monoclonal antibodies to the polypeptide may be mentioned.

【０３３４】 さらなる局面において、本発明は、ＴＮＦ−ファミリーリガンドにより誘導さ
れるアポトーシスを阻害するための方法に関し、この方法は、このＤＲ５ポリペ
プチドを発現する細胞に、ＤＲ５媒介性シグナル伝達を減少し得るアンタゴニス
トの有効量を投与する工程を包含する。好ましくは、ＤＲ５媒介性シグナル伝達
は、アポトーシスまたはＮＦ−κＢ発現の増加が示される疾患を、処置および／
または予防するように減少される。アンタゴニストとしては、ＤＲ５の可溶性形
態（例えば、ＤＲ５の細胞外ドメインのすべてまたは一部を含む、ポリペプチド
）およびＤＲ５ポリペプチドに対するモノクローナル抗体が挙げられ得る。In a further aspect, the present invention relates to a method for inhibiting TNF-family ligand-induced apoptosis, comprising reducing DR5-mediated signaling in a cell expressing the DR5 polypeptide. Administering an effective amount of the resulting antagonist. Preferably, DR5-mediated signaling treats and / or treats diseases that show apoptosis or increased NF-κB expression.
Or reduced to prevent. Antagonists may include soluble forms of DR5 (eg, a polypeptide comprising all or part of the extracellular domain of DR5) and monoclonal antibodies to DR5 polypeptide.

【０３３５】 「アゴニスト」によって、アポトーシスを増強または強化し得る、天然に存在
する化合物および合成の化合物が意図される。「アンタゴニスト」によって、ア
ポトーシスを阻害し得る、天然に存在する化合物および合成の化合物が意図され
る。本発明の任意の候補「アゴニスト」または「アンタゴニスト」がアポトーシ
スを増強し得るかまたは阻害し得るかは、当該分野で公知のＴＮＦ−ファミリー
リガンド／レセプター細胞応答アッセイ（以下により詳細に記載されるものを含
む）を用いて決定され得る。By “agonist” is meant naturally occurring and synthetic compounds that can enhance or enhance apoptosis. By “antagonist” is intended naturally occurring and synthetic compounds that can inhibit apoptosis. Whether any candidate "agonist" or "antagonist" of the present invention is capable of enhancing or inhibiting apoptosis is known in the art as a TNF-family ligand / receptor cell response assay (described in more detail below). ).

【０３３６】 １つのこのようなスクリーニング手順は、本発明のレセプターを発現するよう
にトランスフェクトされたメラニン保有細胞の使用を包含する。このようなスク
リーニング技術は、１９９２年２月６日に公開された、ＰＣＴ ＷＯ９２／０１
８１０に記載される。このようなアッセイは、例えば、本発明のレセプターポリ
ペプチドの活性化を阻害（または増強）する化合物についてスクリーニングする
ために使用され得、このスクリーニングは、レセプターをコードするメラニン保
有細胞をＴＮＦファミリーリガンドおよび候補アンタゴニスト（またはアゴニス
ト）の両方と接触させることによる。リガンドによって生成されるシグナルの阻
害または増強は、その化合物が、リガンド／レセプターシグナル伝達経路のアン
タゴニストまたはアゴニストであることを示す。One such screening procedure involves the use of melanophore cells transfected to express the receptor of the invention. Such a screening technique is described in PCT WO 92/01 published February 6, 1992.
810. Such assays can be used, for example, to screen for compounds that inhibit (or enhance) the activation of a receptor polypeptide of the invention, which screens melanophore cells encoding the receptor for TNF family ligands and By contacting with both candidate antagonists (or agonists). Inhibition or enhancement of the signal produced by the ligand indicates that the compound is an antagonist or agonist of the ligand / receptor signaling pathway.

【０３３７】 他のスクリーニング技術には、レセプター活性化によって引き起こされる細胞
外ｐＨ変化を測定する系においてレセプターを発現する細胞（例えば、トランス
フェクトしたＣＨＯ細胞）の使用が含まれる。例えば、化合物は、本発明のレセ
プターポリペプチドを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャ
ー応答（例えば、シグナル伝達またはｐＨ変化）が測定され得、その潜在的な化
合物がレセプターを活性化するかまたは阻害するかを決定し有る。Other screening techniques include the use of cells that express the receptor (eg, transfected CHO cells) in a system that measures extracellular pH changes caused by receptor activation. For example, a compound can be contacted with a cell that expresses a receptor polypeptide of the invention, and a second messenger response (eg, signal transduction or pH change) can be measured to determine if the potential compound activates the receptor. Or to inhibit.

【０３３８】 別のこのようなスクリーニング技術は、そのレセプターをコードするＲＮＡを
Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に導入して、そのレセプターを一過性に発現する工程を
包含する。次いで、そのレセプター卵母細胞は、レセプターリガンドおよびスク
リーニングされる化合物と接触され得、続いてレセプターの活性化を阻害すると
考えられている化合物についてのスクリーニングの場合、カルシウムシグナルの
阻害または活性化を検出することによって行われ得る。Another such screening technique involves introducing RNA encoding the receptor into a Xenopus oocyte to transiently express the receptor. The receptor oocyte can then be contacted with a receptor ligand and the compound to be screened, followed by screening for a compound that is believed to inhibit receptor activation, thereby detecting inhibition or activation of the calcium signal This can be done by doing

【０３３９】 別のスクリーニング技術には、構築物を細胞中で発現することが含まれ、ここ
でそのレセプターは、ホスホリパーゼＣまたはＤに連結されている。このような
細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞、胚腎臓細胞なとが含まれる。このスクリーニ
ングは、本明細書中上記のように、ホスホリパーゼシグナルから、レセプターの
活性化またはレセプターの活性化の阻害の検出によって達成され得る。Another screening technique involves expressing the construct in a cell, wherein the receptor is linked to phospholipase C or D. Such cells include endothelial cells, smooth muscle cells, embryonic kidney cells and the like. This screening can be accomplished by detecting receptor activation or inhibition of receptor activation from the phospholipase signal, as described herein above.

【０３４０】 別の方法は、その表面上にレセプターを有する細胞への標識リガンドの結合の
阻害を決定することによって、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害
する化合物（アンタゴニスト）についてスクリーニングする工程を包含する。こ
のような方法は、レセプターをコードするＤＮＡで真核生物細胞をトランスフェ
クトして、その結果その細胞がその表面でそのレセプターを発現するようにする
工程、および標識した形態の既知のリガンドの存在下でその細胞を化合物と接触
させる工程を包含する。そのリガンドは、例えば、放射能によって標識され得る
。レセプターに結合した標識されたリガンドの量は、例えば、レセプターの放射
能を測定することによって測定される。その化合物が、レセプターに結合する標
識されたリガンドの減少によって決定されるようにレセプターに結合する場合、
そのレセプターに対する標識されたリガンドの結合は阻害される。Another method is to screen for compounds (antagonists) that inhibit the activation of the receptor polypeptide of the invention by determining inhibition of binding of the labeled ligand to cells having the receptor on its surface. Is included. Such a method involves transfecting a eukaryotic cell with the DNA encoding the receptor so that the cell expresses the receptor on its surface, and the presence of a labeled form of the known ligand. Contacting the cells with the compound below. The ligand can be labeled, for example, by radioactivity. The amount of labeled ligand bound to the receptor is measured, for example, by measuring the radioactivity of the receptor. If the compound binds to the receptor as determined by a decrease in labeled ligand that binds to the receptor,
Binding of the labeled ligand to the receptor is inhibited.

【０３４１】 本発明のアゴニストおよびアンタゴニストについてのさらなるスクリーニング
アッセイは、Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｌ．Ａ．およびＧｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４−４３０７（１９９２）に記
載される。Further screening assays for agonists and antagonists of the invention are described in Tartaglia, L .; A. And Goeddel, D .; V. ,
J. Biol. Chem. 267 (7): 4304-4307 (1992).

【０３４２】 従って、さらなる局面において、候補アゴニストまたはアンタゴニストがＴＮ
Ｆファミリーリガンドに対する細胞応答を増強し得るかまたは阻害し得るかを決
定するためのスクリーニング方法が提供される。この方法は、ＤＲ５ポリペプチ
ドを発現する細胞を候補化合物およびＴＮＦファミリーリガンドと接触させる工
程、細胞応答をアッセイする工程、ならびにその細胞応答を標準的な細胞応答と
比較する工程を包含し、その標準は、候補化合物の非存在下でリガンドとの接触
がなされた場合にアッセイされ、それによって、標準を上回る細胞応答の増加は
、その候補化合物がリガンド／レセプターシグナル伝達経路のアゴニストである
ことを示し、そして標準と比較して減少した細胞応答は、その候補化合物がリガ
ンド／レセプターシグナル伝達経路のアンタゴニストであることを示す。「細胞
応答をアッセイする」によって、候補化合物および／またはＴＮＦファミリーリ
ガンドに対する細胞応答を定性的または定量的に測定すること（例えば、Ｔ細胞
増殖またはＢ細胞増殖あるいはトリチウム化されたチミジン標識における、増加
または減少を決定または見積もること）が意図される。本発明によって、ＤＲ５
ポリペプチドを発現する細胞は、内因性ＴＮＦファミリーリガンドまたは外因性
投与されたＴＮＦファミリーリガンドのいずれかと接触され得る。Therefore, in a further aspect, the candidate agonist or antagonist is TN
Screening methods are provided for determining whether a cellular response to an F family ligand can be enhanced or inhibited. The method comprises contacting a cell expressing the DR5 polypeptide with a candidate compound and a TNF family ligand, assaying a cellular response, and comparing the cellular response to a standard cellular response. Are assayed when contact is made with the ligand in the absence of the candidate compound, whereby an increase in the cellular response above the standard indicates that the candidate compound is an agonist of the ligand / receptor signaling pathway. And a reduced cellular response compared to a standard indicates that the candidate compound is an antagonist of the ligand / receptor signaling pathway. By "assaying a cellular response", qualitatively or quantitatively measuring the cellular response to a candidate compound and / or a TNF family ligand (eg, an increase in T cell proliferation or B cell proliferation or tritiated thymidine labeling) Or to determine or estimate the reduction). According to the present invention, DR5
Cells expressing the polypeptide can be contacted with either an endogenous TNF family ligand or an exogenously administered TNF family ligand.

【０３４３】 本発明に従うアゴニストには、天然に存在する化合物および合成化合物（例え
ば、ＴＮＦファミリーリガンドペプチドフラグメント、トランスホーミング増殖
因子、神経伝達物質（例えば、グルタミン酸、ドパミン、Ｎ−メチル−Ｄ−アス
パラギン酸）、腫瘍サプレッサー（ｐ５３）、細胞溶解性Ｔ細胞、および代謝拮
抗物質）が含まれる。好ましいアゴニストには、化学療法剤（例えば、シスプラ
チン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、ナイトロジェ
ンマスタード、メトトレキサート、およびビンクリスチン）が含まれる。他のア
ゴニストには、エタノールおよびアミロイドペプチドが含まれる（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２６７：１４５７−１４５８（１９９５））。さらに好ましいアゴニストに
は、ＤＲ５ポリペプチドまたはそのフラグメントに対して惹起されたポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。ＴＮＦファミリーレセプターに
対して惹起されたこのようなアゴニスト抗体は、Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｌ．Ａ．
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９２９２−９２９
６（１９９１）；ならびにＴａｒｔａｇｌｉａ，Ｌ．Ａ．およびＧｏｅｄｄｅｌ
，Ｄ．Ｖ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４−４３０７（１
９９２）に開示される。ＰＣＴ出願ＷＯ ９４／０９１３７もまた参照のこと。Agonists according to the present invention include naturally occurring and synthetic compounds (eg, TNF family ligand peptide fragments, transforming growth factors, neurotransmitters (eg, glutamate, dopamine, N-methyl-D-aspartate). ), Tumor suppressors (p53), cytolytic T cells, and antimetabolites). Preferred agonists include chemotherapeutic agents (eg, cisplatin, doxorubicin, bleomycin, cytosine arabinoside, nitrogen mustard, methotrexate, and vincristine). Other agonists include ethanol and amyloid peptide (Science
e 267: 1457-1458 (1995)). Further preferred agonists include polyclonal and monoclonal antibodies raised against the DR5 polypeptide or a fragment thereof. Such agonistic antibodies raised against the TNF family receptor are described in Tartaglia, L .; A.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9292-929.
6 (1991); and Tartaglia, L .; A. And Goeddel
, D. V. J. Biol. Chem. 267 (7): 4304-4307 (1
992). See also PCT application WO 94/09137.

【０３４４】 本発明に従うアンタゴニストには、天然に存在する化合物および合成化合物（
例えば、ＣＤ４０リガンド、天然アミノ酸、亜鉛、エストロゲン、アンドロゲン
、ウイルス遺伝子（例えば、アデノウイルス ＥｌＢ、バキュロウイルスｐ３５
およびＩＡＰ、牛痘ウイルスｃｒｍＡ、エプスタイン−バーウイルスＢＨＲＦ１
、ＬＭＰ−１、アフリカ豚コレラウイルスＬＭＷ５−ＨＬ、およびヘルペスウイ
ルスｙｌ ３４．５）、カルパインインヒビター、システインプロテアーゼイン
ヒビター、および腫瘍プロモーター（例えば、ＰＭＡ、フェノバルビタール、お
よびα−ヘキサクロロシクロヘキサン））が含まれる。The antagonists according to the invention include naturally occurring compounds and synthetic compounds (
For example, CD40 ligand, natural amino acids, zinc, estrogens, androgens, viral genes (eg, adenovirus ElB, baculovirus p35
And IAP, cowpox virus crmA, Epstein-Barr virus BHRF1
, LMP-1, African swine fever virus LMW5-HL, and herpes virus yl 34.5), calpain inhibitors, cysteine protease inhibitors, and tumor promoters (eg, PMA, phenobarbital, and α-hexachlorocyclohexane)). .

【０３４５】 他の可能なアンタゴニストとしては、アンチセンス核酸が挙げられる。アンチ
センス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して、または三重ヘリッ
クス形成を通して、遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技
術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１
）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）において議論される。三重
ヘリックス形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１
３６０（１９９１）において議論される。この方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａへのポリヌクレオチドの結合に基づく。[0345] Other possible antagonists include antisense nucleic acids. Antisense technology can be used to control gene expression through antisense DNA or RNA, or through triple helix formation. Antisense technology is described, for example, in Okano, J .; Neurochem. 56: 560 (1991)
); Oligodeoxynucleotides as Antisense
Inhibitors of Gene Expression, CRCP
res, Boca Raton, FL (1988). Triple helix formation is described, for example, by Lee et al., Nucleic Acids Res.
arch 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 24.
1: 456 (1988); and Dervan et al., Science 251: 1.
360 (1991). This method uses complementary DNA or RN
Based on the binding of the polynucleotide to A.

【０３４６】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分は、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設
計するために使用され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝
子の領域に相補的であるように設計され、それによってレセプターの転写および
産生を妨害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮ
Ａにハイブリダイズし、そしてレセプターポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳
をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、そのアンチセンスＲＮＡま
たはＤＮＡがＤＲ５レセプターの産生を阻害するようにインビボで発現され得る
ように、細胞に送達され得る。For example, the 5 'coding portion of a polynucleotide encoding a mature polypeptide of the present invention can be used to design antisense RNA oligonucleotides of about 10-40 base pairs in length. DNA oligonucleotides are designed to be complementary to the region of the gene involved in transcription, thereby preventing transcription and production of the receptor. Antisense RNA oligonucleotides are used in vivo to mRN
Hybridizes to A and blocks translation of the mRNA molecule into the receptor polypeptide. The oligonucleotides described above can also be delivered to cells such that the antisense RNA or DNA can be expressed in vivo to inhibit production of the DR5 receptor.

【０３４７】 １つの実施形態において、本発明のＤＲ５アンチセンス核酸は、外因性配列か
らの転写によって細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその部分は、転
写されて、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクタ
ーは、ＤＲ５アンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは
、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するために転写され得る限りにおいて、エピ
ソームのままであっても、または染色体に組み込まれてもよい。このようなベク
ターは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ技術方法によって構築され得る。ベク
ターは、脊椎動物細胞中での複製および発現のために使用される、プラスミド、
ウイルス、または当該分野において公知の他のものであり得る。ＤＲ５またはそ
のフラグメントをコードする配列の発現は、脊椎動物（好ましくは、ヒト）の細
胞において作用することが当該分野において公知の任意のプロモーターによって
であり得る。このようなプロモーターは、誘導性であってもまたは構成的であっ
てもよい。このようなプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅ
ｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２９：３０４−３１０（１
９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙ
ａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペス
チミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチオネイン
遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２（
１９８２））などが含まれるがこれらに限定されない。In one embodiment, a DR5 antisense nucleic acid of the invention is produced intracellularly by transcription from an exogenous sequence. For example, a vector or portion thereof is transcribed to produce an antisense nucleic acid (RNA) of the invention. Such a vector contains a sequence encoding a DR5 antisense nucleic acid. Such vectors may remain episomal or integrate into the chromosome, as long as they can be transcribed to produce the desired antisense RNA. Such vectors can be constructed by recombinant DNA technology methods standard in the art. The vector is a plasmid, used for replication and expression in vertebrate cells,
It can be a virus, or others known in the art. Expression of the sequence encoding DR5 or a fragment thereof may be by any promoter known in the art to act in vertebrate (preferably human) cells. Such a promoter may be inducible or constitutive. Such promoters include the SV40 early promoter region (Be
rnoist and Chambon, Nature 29: 304-310 (1
981)), a promoter contained in the 3 'long terminal repeat of Rous sarcoma virus (Y
amamoto et al., Cell 22: 787-797 (1980)), herpes thymidine promoter (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sc).
i. U. S. A. 78: 1441-1445 (1981)), the regulatory sequence of the metallothionein gene (Brinster et al., Nature 296: 39-42 (
1982)), but are not limited thereto.

【０３４８】 本発明のアンチセンス核酸は、ＤＲ５遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部
に相補的な配列を含む。しかし、完全な相補性は、好ましいものの、必要なわけ
ではない。「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、本明細書中で言及
される場合、ＲＮＡにハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成し得るに十分な
相補性を有する配列を意味し；二本鎖ＤＲ５アンチセンス核酸の場合、一本鎖の
二重鎖ＤＮＡがそのように試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得
る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの
両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それが二重鎖
を含み得、そしてなお安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を形成し得
るＤＲ５ ＲＮＡとの塩基のミスマッチがより多くなる。当業者は、ハイブリダ
イズした複合体の融点を決定するための標準的な手段の使用によってミスマッチ
の許容できる程度を確認し得る。The antisense nucleic acids of the present invention include a sequence that is complementary to at least a portion of a DR5 gene RNA transcript. However, perfect complementarity, while preferred, is not required. A sequence that is "complementary to at least a portion of the RNA," as referred to herein, refers to a sequence that has sufficient complementarity to hybridize to RNA to form a stable duplex. Meaning; in the case of double-stranded DR5 antisense nucleic acids, single-stranded double-stranded DNA can be so tested or triplex formation can be assayed. The ability to hybridize depends on both the degree of complementarity and the length of the antisense nucleic acid. In general, the longer the hybridizing nucleic acid, the more base mismatches it has with the DR5 RNA that it may contain duplexes and still form stable duplexes (or in some cases triplexes) Become. One skilled in the art can ascertain an acceptable degree of mismatch by the use of standard means for determining the melting point of the hybridized complex.

【０３４９】 メッセージの５’末端に相補的なオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開始コ
ドンまでおよびＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳を阻害する際
に最も効率的に働くはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な
配列は、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する際にも同様に有効であることが示されてきた
。一般的には、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３５（
１９９４）を参照のこと。従って、図１に示されるＤＲ５の５’非翻訳非コード
領域または３’ 非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチド
は、内因性ＤＲ５ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチに
おいて使用され得る。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチド
は、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的
なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳のより効率的でないインヒビターで
あるが、本発明に従って使用され得る。ＤＲ５ ｍＲＮＡの５’、３’、または
コード領域にハイブリダイズするように設計されたかどうかに関わらず、アンチ
センス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好ましく
は、６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の局面
において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なく
とも約１７ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、または少なくとも約
５０ヌクレオチドである。Oligonucleotides complementary to the 5 'end of the message (eg, the 5' untranslated sequence up to and including the AUG start codon) should work most efficiently at inhibiting translation. However, sequences complementary to the 3 'untranslated sequence of mRNA have been shown to be equally effective in inhibiting translation of mRNA. Generally, Wagner, R.A. , Nature 372: 333-335 (
1994). Thus, oligonucleotides complementary to either the 5 'or 3' non-translated non-coding region of DR5 shown in Figure 1 can be used in an antisense approach to inhibit the translation of endogenous DR5 mRNA. Can be used. Oligonucleotides complementary to the 5 'untranslated region of the mRNA should include the complement of the AUG start codon. Antisense oligonucleotides complementary to the mRNA coding region are less efficient inhibitors of translation, but can be used in accordance with the present invention. Whether designed to hybridize to the 5 ′, 3 ′, or coding region of DR5 mRNA, the antisense nucleic acid should be at least 6 nucleotides in length, and preferably from 6 to about 50 nucleotides. A range of oligonucleotides. In certain aspects, the oligonucleotide is at least about 10, at least about 17, at least about 25, or at least about 50 nucleotides.

【０３５０】 本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡま
たはそのキメラ混合物または誘導体または修飾バージョンであり得る。このオリ
ゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾されて、例えば
、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善し得る。このオリゴヌクレ
オチドは、ペプチドのような他の付加された基（例えば、インビボで宿主細胞レ
セプターを標的化するために）または細胞膜を横切る輸送を容易にするための薬
剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４．６４８−６５２（１
９８７）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開
）を参照のこと）、または血液脳関門横切る輸送を容易にするための薬剤（例え
ば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４（１９８８年４月２５日公開）を参照
のこと）、ハイブリダイゼーションによって誘発される切断剤（例えば、Ｋｒｏ
ｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６（１９８８）を参照の
こと）またはインターカレート（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）薬剤（例えば、
Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）
を含み得る。この目的のために、このオリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば
、ペプチド、ハイブリダイゼーションによって誘発される架橋剤、輸送剤、ハイ
ブリダイゼーションによって誘発される切断剤など）と結合体化され得る。The polynucleotides of the present invention can be single- or double-stranded DNA or RNA or chimeric mixtures or derivatives or modified versions thereof. The oligonucleotide can be modified with a base moiety, sugar moiety, or phosphate backbone to improve, for example, molecular stability, hybridization, and the like. The oligonucleotide can be used to add other attached groups such as peptides (eg, to target host cell receptors in vivo) or agents to facilitate transport across cell membranes (eg, Letsinger et al., Proc. Natl.Acad, Sci.
U. S. A. 86: 6553-6556 (1989); Lemaitre et al., P.
rc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84.648-652 (1
987); PCT Publication No. WO 88/09810 (published December 15, 1988), or agents that facilitate transport across the blood-brain barrier (eg, PCT Publication No. WO 89/10134 (Apr. 1988). 25)), cleavage agents induced by hybridization (eg, Kro
et al., BioTechniques 6: 958-976 (1988)) or intercalating agents (e.g.,
Zon, Pharm. Res. 5: 539-549 (1988)).
May be included. For this purpose, the oligonucleotide can be conjugated to another molecule, such as a peptide, a hybridization-triggered cross-linking agent, a transport agent, a hybridization-triggered cleavage agent, and the like.

【０３５１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される
：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨー
ドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カル
ボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュー
オシン、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−
メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）
、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュー
オシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル
、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエ
ステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３
−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ
、および２，６−ジアミノプリン。The antisense oligonucleotide can include at least one modified base moiety, wherein the base moiety is selected from the group including, but not limited to: 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5 -Chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2
-Thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, β-D-galactosylcuosin, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine,
2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D- Mannosylcuosin, 5-methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-
Methylthio-N6-isopentenyl adenine, uracil-5-oxyacetic acid (v)
, Wybutoxine, pseudouracil, cuosine, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid (V), 5-methyl-2-thiouracil, 3
-(3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil, (acp3) w
, And 2,6-diaminopurine.

【０３５２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る：アラビノース
、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。An antisense oligonucleotide can also include at least one modified sugar moiety selected from the group including, but not limited to: arabinose, 2-fluoroarabinose, xylulose, and hexose.

【０３５３】 さらなる別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を
含むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変されたリン
酸骨格を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチ
オエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロ
ジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホル
ムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはそれらのアナログ。In yet another embodiment, the antisense oligonucleotide comprises at least one modified phosphate backbone selected from the group including, but not limited to: phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphorothioate Amidothioates, phosphoramidates, phosphorodiamidates, methylphosphonates, alkyl phosphotriesters and formacetals or analogs thereof.

【０３５４】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、−アノマ
ーオリゴヌクレオチドである。−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮ
Ａと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常の−ユニットとは反対に、その
鎖は互いに平行にする（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは、２−０−
メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡア
ナログである（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７
−３３０）。In still another embodiment, the antisense oligonucleotide is a -anomeric oligonucleotide. The anomeric oligonucleotide has a complementary RN
A forms a specific double-stranded hybrid with A, and the chains are parallel to each other, as opposed to the normal -unit (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids).
Res. , 15: 6625-6641). This oligonucleotide has 2-0-
Methyl ribonucleotide (Inoue et al., 1987, Nucl. Aci)
ds Res. , 15: 6131-6148) or a chimeric RNA-DNA analog (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327).
-330).

【０３５５】 本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。一方、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザ
イムを使用して、ＤＲ５ ｍＲＮＡを破壊し得るが、ハンマーヘッド型リボザイ
ムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な
塩基対を形成する隣接領域により決定される位置で、ｍＲＮＡを切断する。たっ
た１つの必要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基配列を有することである
：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生成は当該分野
で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、
３３４：５８５−５９１（１９８８）により十分に記載される。ＤＲ５のヌクレ
オチド配列（図１）内に多くの潜在的なハンマーヘッド型リボザイム切断部位が
存在する。好ましくは、このリボザイムは、切断認識部位がＤＲ５ ｍＲＮＡの
５’末端付近に位置するように；すなわち、効率を増大し、そして非機能的ｍＲ
ＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するように、操作される。リボザイムをコード
するＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの導入についての上記と
同様の様式で細胞に導入され得る。リボザイムは、アンチセンス分子とは違って
触媒性であるので、より低い細胞内濃度が効率のために必要である。Potential antagonists according to the present invention also include catalytic RNAs, ie, ribozymes (see, eg, PCT Publication WO 90/11364, October 4, 1990).
Sunver et al., Science, 247: 1222-1225 (19
90)). On the other hand, a ribozyme that cleaves mRNA at a site-specific recognition sequence can be used to destroy DR5 mRNA, but the use of a hammerhead ribozyme is preferred. Hammerhead ribozymes cleave mRNAs at locations determined by flanking regions that form complementary base pairs with the target mRNA. The only requirement is that the target mRNA has the following two base sequences: 5'-UG-3 '. The construction and production of hammerhead ribozymes is well known in the art, and is disclosed in Haseloff and Gerlach, Nature,
334: 585-591 (1988). There are many potential hammerhead ribozyme cleavage sites within the nucleotide sequence of DR5 (FIG. 1). Preferably, the ribozyme is such that the cleavage recognition site is located near the 5 'end of the DR5 mRNA; that is, to increase efficiency and to provide a non-functional mR
It is engineered to minimize intracellular accumulation of NA transcripts. A ribozyme-encoding DNA construct can be introduced into a cell in a manner similar to that described above for introducing antisense encoding DNA. Because ribozymes are catalytic, unlike antisense molecules, lower intracellular concentrations are required for efficiency.

【０３５６】 本発明によるさらなるアンタゴニストは、ＤＲ５の可溶性型（すなわち、全長
レセプターの細胞外領域からリガンド結合ドメインを含むＤＲ５フラグメント）
を含む。レセプターのこのような可溶性型（天然に存在するか、または合成であ
り得る）は、ＴＮＦ−ファミリーリガンドへの結合について細胞表面ＤＲ５と競
合することにより、ＤＲ５媒介性シグナリングに拮抗する。従って、リガンド結
合ドメインを含むレセプターの可溶性型は、ＴＮＦ−ファミリーリガンドによっ
て誘導されるアポトーシスを阻害し得る、新規サイトカインである。これらは、
モノマーとして発現され得るが、好ましくは、二量体または三量体として発現さ
れる。なぜなら、これらはアンタゴニストとしての可溶性レセプターの単量体の
形態（例えば、ＩｇＧＦｃ−ＴＮＦレセプターファミリー融合体）より優れるこ
とが示されているからである。その他のこのようなサイトカインは当該分野で公
知であり、Ｆａｓリガンドにより誘導されるアポトーシスを制限するように生理
学的に作用する、Ｆａｓ Ｂ（マウスＦａｓレセプターの可溶性形態）を含む（
Ｈｕｇｈｅｓ，Ｄ．Ｐ．およびＣｒｉｓｐｅ，Ｉ．Ｎ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．
１８２：１３９５−１４０１（１９９５））。Additional antagonists according to the present invention are soluble forms of DR5 (ie, a DR5 fragment containing the ligand binding domain from the extracellular region of the full length receptor).
including. Such soluble forms of the receptor, which can be naturally occurring or synthetic, antagonize DR5-mediated signaling by competing with cell surface DR5 for binding to TNF-family ligands. Thus, the soluble form of the receptor containing the ligand binding domain is a novel cytokine that can inhibit apoptosis induced by TNF-family ligands. They are,
It can be expressed as a monomer, but is preferably expressed as a dimer or trimer. This is because they have been shown to be superior to monomeric forms of soluble receptors as antagonists (eg, IgGFc-TNF receptor family fusions). Other such cytokines are known in the art and include Fas B, a soluble form of the mouse Fas receptor, which acts physiologically to limit apoptosis induced by Fas ligand (
Hughes, D .; P. And Crispe, I .; N. , J. et al. Exp. Med.
182: 1395-1401 (1995)).

【０３５７】 上で議論されるように、本明細書で使用される用語「抗体」（Ａｂ）または「
モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、抗原に結合し得るインタクトな分子ならび
にそれらのフラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメント）
を含むことを意味する。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）2フラグメント
はインタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠落し、循環からより迅速に除去され
、そしてインタクトな抗体の非特異的な組織へのより少ない結合を有し得る（Ｗ
ａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。As discussed above, the term “antibody” (Ab) or “Ab” as used herein
“Monoclonal antibodies” (mAbs) are intact molecules and fragments thereof (eg, Fab and F (ab ′) 2 fragments) that can bind antigen.
Is included. Fab, Fab ', and F (ab') 2 fragments lack the Fc fragment of intact antibody, are cleared more rapidly from the circulation, and have less binding of the intact antibody to nonspecific tissues. Get (W
ahl et al. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).

【０３５８】 本発明による抗体は、本発明のＤＲ５免疫原を使用する種々の方法のいずれか
により、調製され得る。示されるように、このようなＤＲ５免疫原は、全長ＤＲ
５ポリペプチド（リーダー配列を含むか、または含まなくとも良い）およびＤＲ
５ポリペプチドフラグメント（例えば、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン
、細胞内ドメインおよび死ドメイン）を含む。[0358] Antibodies according to the present invention can be prepared by any of a variety of methods using the DR5 immunogen of the present invention. As shown, such a DR5 immunogen has a full-length DR
5 polypeptides (with or without leader sequence) and DR
5 polypeptide fragments (eg, ligand binding domain, transmembrane domain, intracellular domain, and death domain).

【０３５９】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチド配列の位置および活性に関して、当該
分野で公知の方法（例えば、これらのポリペプチドを画像化するため、適切な生
理学的サンプルにおけるそのレベルを測定するためなど）において使用され得る
。抗体はまた、ＤＲ５のアゴニストおよびアンタゴニストとして、イムノアッセ
イおよび治療法における使用もまた有する。The antibodies of the present invention may be measured by methods known in the art for the location and activity of a polypeptide sequence of the present invention (eg, to measure these levels in a suitable physiological sample to image these polypeptides). Etc.). Antibodies also have use in immunoassays and therapeutics as agonists and antagonists of DR5.

【０３６０】 ＤＲ５ドメインに結合するタンパク質および他の化合物はまた、本発明の候補
アゴニストおよび候補アンタゴニストである。このような結合化合物は、酵母ツ
ーハイブリッドシステムを用いて「捕捉され」得る（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎ
ｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６（１９８９））。酵母ツーハイブリ
ッドシステムの改変型は、Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔおよび彼の共同研究者らによ
って記載されている（Ｇｙｕｒｉｓ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ ７５：７９１−８０３
（１９９３）；Ｚｅｒｖｏｓ，Ａ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２（
１９９３））。好ましくは、酵母ツーハイブリッドシステムは、ＤＲ５リガンド
結合ドメインまたはＤＲ５細胞内ドメインのいずれかに結合する化合物を捕捉す
るために、本発明に従って使用される。このような化合物は、本発明の良い候補
アゴニストおよび良い候補アンタゴニストである。[0360] Proteins and other compounds that bind to the DR5 domain are also candidate agonists and antagonists of the present invention. Such binding compounds can be "captured" using the yeast two-hybrid system (Fields and Son
g, Nature 340: 245-246 (1989)). A modified version of the yeast two-hybrid system has been described by Roger Brent and his co-workers (Gyuris, J. et al., Cell 75: 791-803).
(1993); S. Et al., Cell 72: 223-232 (
1993)). Preferably, the yeast two-hybrid system is used according to the present invention to capture compounds that bind to either the DR5 ligand binding domain or the DR5 intracellular domain. Such compounds are good candidate agonists and good candidate antagonists of the present invention.

【０３６１】 「ＴＮＦ−ファミリーリガンド」によって、ＴＮＦレセプターファミリーのメ
ンバーに結合し得る、天然に存在するリガンド、組換えリガンド、および合成リ
ガンドが意図され、これは、リガンド／レセプターシグナリング経路を誘導し得
る。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーには、ＤＲ５リガンド、ＴＲＡＩＬ、
ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知である）
、ＬＴ−β（複合体へテロトリマーＬＴ−α２−βに見出される）、ＦａｓＬ、
ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、および神経成長因子（
ＮＧＦ）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＲ５およびその誘導体（フラ
グメントを含む）ならびにそのアナログのＴＲＡＩＬに結合する能力を決定する
ために行われ得るアッセイの例は、以下の実施例６に記載される。By "TNF-family ligand" is intended naturally occurring, recombinant, and synthetic ligands that can bind to members of the TNF receptor family, and which can induce ligand / receptor signaling pathways. . Members of the TNF ligand family include DR5 ligand, TRAIL,
TNF-α, lymphotoxin-α (also known as LT-α, TNF-β)
, LT-β (found in the complex heterotrimer LT-α2-β), FasL,
CD40, CD27, CD30, 4-1BB, OX40, and nerve growth factor (
NGF). Examples of assays that can be performed to determine the ability of DR5 and its derivatives (including fragments) and analogs thereof to bind TRAIL are described in Example 6 below.

【０３６２】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害および／または予防するために、遺伝子治療の目的で
投与される。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体へ
の投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、そ
れらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する
。Gene Therapy In certain embodiments, a nucleic acid comprising a sequence encoding an antibody or a functional derivative thereof treats a disease or disorder associated with aberrant expression and / or activity of a polypeptide of the invention. Administered for gene therapy purposes to inhibit and / or prevent. Gene therapy refers to therapy performed by the administration of an expressed or expressible nucleic acid to a subject. In this embodiment of the invention, the nucleic acids produce their encoded protein, which mediates a therapeutic effect.

【０３６３】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。[0363] Any of the methods for gene therapy available in the art can be used according to the present invention. An exemplary method is described below.

【０３６４】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；および
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ（１９９０）に記載される。For a general review of methods for gene therapy, see Goldspiel et al., Cli.
natural Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstos.
hev, Ann. Rev .. Pharmacol. Toxicol. 32: 573
-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-.
932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann.
Rev .. Biochem. 62: 191-217 (1993); May, TIB.
TECH 11 (5): 155-215 (1993). Methods generally known in the recombinant DNA art that can be used are Ausubel
Et al. (Ed.), Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expressio.
n, A Laboratory Manual, Stockton Press
, NY (1990).

【０３６５】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って抗体をコードする核酸の染
色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；
Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの
核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラ
グメントを含む。In a preferred aspect, the compound comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody, wherein said nucleic acid sequence is an expression vector that expresses the antibody, or a fragment or chimeric protein thereof, or a heavy or light chain thereof, in a suitable host. Part of. In particular, such nucleic acid sequences have a promoter operably linked to the antibody coding region, wherein the promoter is inducible or constitutive, and optionally tissue-specific. In another particular embodiment, a nucleic acid molecule is used in which the sequence encoding the antibody and any other desired sequences are flanked by regions that promote homologous recombination at the desired site in the genome, thus rendering the antibody Provides intrachromosomal expression of the encoding nucleic acid (Koller and Smithies, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989);
Zijlstra et al., Nature 342: 435-438 (1989)).
In certain embodiments, the expressed antibody molecule is a single-chain antibody; or the nucleic acid sequence comprises a sequence encoding both the heavy and light chains of the antibody or a fragment thereof.

【０３６６】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。Delivery of the nucleic acid to the patient can be direct (where the patient is directly exposed to the nucleic acid or nucleic acid-bearing vector) or indirect (where the cells are first transduced with the nucleic acid in vitro). Converted and then implanted into the patient). These two approaches are known, respectively, as in vivo gene therapy or as ex vivo gene therapy.

【０３６７】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し
、そしてそれを（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウ
イルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いる感染
により）細胞内になるように投与することにより、あるいは、裸のＤＮＡの直接
注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌ
ｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面のレセ
プターでコーティングするか、もしくは薬剤をトランスフェクトすることにより
、あるいは、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化に
より、あるいは、それらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与
することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合
させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異
的に発現する細胞の型を標的にするために用いられ得る）などのいずれかにより
達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、こ
こで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎ
ｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、この核酸がリソゾーム分解を回避することを
可能にする。さらに別の実施形態において、核酸は、特定のレセプターを標的化
することにより、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的化さ
れ得る（例えば、１９９２年４月１６日のＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号
（Ｗｕら）；１９９２年１２月２３日の同第ＷＯ９２／２２６３５号（Ｗｉｌｓ
ｏｎら）；１９９２年１１月２６日の同第ＷＯ９２／２０３１６号（Ｆｉｎｄｅ
ｉｓら）；１９９３年７月２２日の同第ＷＯ９３／１４１８８号（Ｃｌａｒｋｅ
ら）、１９９３年１０月１４日の同第ＷＯ９３／２０２２１号（Ｙｏｕｎｇ）を
参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得、そして相同組換えに
より、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（ＫｏｌｌｅｒおよびＳ
ｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９
３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４
３５−４３８（１９８９））。In certain embodiments, a nucleic acid sequence is administered directly in vivo, where the nucleic acid sequence is expressed to produce an encoded product. This involves a number of methods known in the art, such as constructing them as part of a suitable nucleic acid expression vector, and then constructing it (eg, a defective or attenuated retrovirus or other viral vector (US Pat. No. 4,980,286), by intracellular administration, or by direct injection of naked DNA, or by microparticle bombardment (eg, a gene gun; Biol.
istic, Dupont), or by coating with lipids or cell surface receptors, or by transfecting the drug, or by encapsulation in liposomes, microparticles, or microcapsules, or by nucleating them. By conjugation with a peptide known to enter into the cell, and by conjugation with a ligand that undergoes receptor-mediated endocytosis (eg, Wu and Wu, J. Biol. Chem.
. 262: 4429-4432 (1987)), which can be used to target cell types that specifically express the receptor. In another embodiment, a nucleic acid-ligand complex may be formed, wherein the ligand is a fusogen that disrupts endosomes.
ic) a viral peptide, which enables this nucleic acid to avoid lysosomal degradation. In yet another embodiment, nucleic acids can be targeted in vivo for cell-specific uptake and expression by targeting specific receptors (eg, PCT Publication No. WO 92/06180 on April 16, 1992). No. (Wu et al.); WO 92/22635, Dec. 23, 1992 (Wils
on et al.); WO92 / 20316, Nov. 26, 1992 (Finde);
WO93 / 14188, Jul. 22, 1993 (Clarke).
Et al., WO 93/20221 (Young), Oct. 14, 1993). Alternatively, the nucleic acid can be introduced inside the cell and integrated into host cell DNA for expression by homologous recombination (Koller and S.A.
mities, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:89
32-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342: 4.
35-438 (1989)).

【０３６８】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムのパッ
ケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要でないレトロウイルス
配列を欠失している。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列
は、一つ以上のベクター中にクローニングされ、これは、患者内への遺伝子の送
達を容易にする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅ
ｎら，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細
胞を化学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞に
送達するための、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。
遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、
以下である：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６
５１（１９９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９
９４）；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよ
びＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅ
ｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）。In certain embodiments, a viral vector that includes a nucleic acid sequence encoding an antibody of the invention is used. For example, retroviral vectors can be used (Mi
ller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)
checking). These retroviral vectors lack retroviral sequences that are not required for packaging of the viral genome and integration into host cell DNA. Nucleic acid sequences encoding antibodies used in gene therapy are cloned into one or more vectors, which facilitates delivery of the gene into a patient. Further details on retroviral vectors can be found in Boese
n et al., Biotherapy 6: 291-302 (1994) (this describes the use of retroviral vectors to deliver the mdr1 gene to hematopoietic stem cells to make them more resistant to chemotherapy. ) Can be found.
Other references describing the use of retroviral vectors in gene therapy include:
The following are: Crowes et al. Clin. Invest. 93: 644-6
51 (1994); Kiem et al., Blood 83: 1467-1473 (19).
94); Salmons and Gunzberg, Human Gene Th.
erapy 4: 129-141 (1993); and Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and De
vel. 3: 110-114 (1993).

【０３６９】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系
、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非***細胞を感染すること
ができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治
療の概説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３
−１０（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイ
ルスベクターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の
例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９
９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）
；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２
３４（１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。
好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。[0369] Adenoviruses are other viral vectors that can be used in gene therapy. Adenoviruses are particularly attractive vehicles for delivering genes to the respiratory epithelium. Adenoviruses naturally infect respiratory epithelia where they cause a mild disease. Other targets for adenovirus-based delivery systems are the liver, central nervous system, endothelial cells, and muscle. Adenovirus has the advantage that it can infect non-dividing cells. Kozarsky and Wilson, Curr
ent Opinion in Genetics and Development
ent 3: 499-503 (1993) provides an overview of adenovirus-based gene therapy. Bout et al., Human Gene Therapy 5: 3.
-10 (1994) showed the use of adenovirus vectors to transfer genes to the airway epithelium of rhesus monkeys. Other examples of the use of adenoviruses in gene therapy include Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (19).
91); Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155 (1992).
Mastranelli et al., J .; Clin. Invest. 91: 225-2
34 (1993); PCT Publication No. WO 94/12649; and Wang et al.,
Gene Therapy 2: 775-783 (1995).
In a preferred embodiment, an adenovirus vector is used.

【０３７０】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：
２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。Adeno-associated virus (AAV) has also been proposed for use in gene therapy (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:
289-300 (1993); U.S. Patent No. 5,436,146).

【０３７１】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入
の方法は、選択マーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入された遺
伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選択下に置かれる。次いで
、それらの細胞は患者に送達される。Another approach to gene therapy involves transferring the gene to cells in tissue culture by such methods as electroporation, lipofection, calcium phosphate mediated transfection, or viral infection. Usually, the method of transfer involves the transfer of a selectable marker to the cells. The cells are then placed under selection to isolate cells that take up and express the transferred gene. The cells are then delivered to the patient.

【０３７２】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクショ
ン、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感
染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフ
ェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野におい
て多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，
Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２（１９８５）を参照のこと）、そ
してレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないならば
、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を提
供するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、好まし
くは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。In this embodiment, the nucleic acid is introduced into the cells prior to in vivo administration of the resulting recombinant cells. Such introduction can be performed by any method known in the art, including, but not limited to: transfection, electroporation, microinjection, viruses including nucleic acid sequences. Vector or bacteriophage vector infection, cell fusion, chromosome-mediated gene transfer, microcell-mediated gene transfer, spheroplast fusion, and the like. Numerous techniques are known in the art for introducing foreign genes into cells (eg, Loeffler and Behr, Met).
h. Enzymol. 217: 599-618 (1993); Cohen et al., M.
eth. Enzymol. 217: 618-644 (1993); Cline,
Pharmac. Ther. 29: 69-92 (1985)) and can be used in accordance with the present invention provided that the necessary developmental and physiological functions of the recipient cells are not disrupted. The technique should provide for a stable transfer of the nucleic acid into the cell, so that the nucleic acid is expressible by the cell, and preferably is hereditary and expressible by the progeny of the cell.

【０３７３】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。The resulting recombinant cells can be delivered to a patient by various methods known in the art. Recombinant blood cells (eg, hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells) are preferably administered intravenously. The amount of cells contemplated for use depends on the desired effect, patient condition, etc., and can be determined by one skilled in the art.

【０３７４】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、
ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球
、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹細
胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍帯
血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。Cells into which nucleic acids can be introduced for purposes of gene therapy include any desired available cell type, including but not limited to: epithelial cells, endothelial cells,
Keratinocytes, fibroblasts, myocytes, hepatocytes; blood cells such as T lymphocytes, B lymphocytes, monocytes, macrophages, neutrophils, eosinophils, megakaryocytes, granulocytes; various stem or progenitor cells; In particular, hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells (eg, cells obtained from bone marrow, umbilical cord blood, peripheral blood, fetal liver, etc.).

【０３７５】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。In a preferred embodiment, the cells used for gene therapy are autologous to the patient.

【０３７６】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにインビボ
で投与される。具体的な実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる
。インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞およ
び／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（
例えば、１９９４年４月２８日のＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：Ｓｔｅ
ｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２
）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９
８０）；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉ
ｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１９８６）を参照のこと）。In embodiments where recombinant cells are used in gene therapy, the nucleic acid sequence encoding the antibody is introduced into the cell such that the nucleic acid sequence is expressible by the cell or progeny thereof, and then the recombinant cell is Administered in vivo for therapeutic effect. In a specific embodiment, stem cells or progenitor cells are used. Any stem and / or progenitor cells that can be isolated in vitro and maintained in vitro can potentially be used according to this embodiment of the invention (
For example, PCT Publication No. WO 94/08598 on April 28, 1994: Ste
Mple and Anderson, Cell 71: 973-985 (1992).
Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (19
80); and Pittelkow and Scott, Mayo Cini.
c Proc. 61: 771 (1986)).

【０３７７】 特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コード
領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発
現は、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可能であ
る。In certain embodiments, the nucleic acid to be introduced for gene therapy purposes contains an inducible promoter operably linked to the coding region so that expression of the nucleic acid is controlled by a suitable transcription inducing factor Can be controlled by controlling the presence or absence of.

【０３７８】 （投与の形態） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明のポリペプチドまたは抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を
提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その
効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被
験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げ
られるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、
そして最も好ましくはヒトである。Modes of Administration The present invention provides methods for treatment, inhibition and prevention by administering to a subject an effective amount of a compound or pharmaceutical composition of the invention, preferably a polypeptide or antibody of the invention. I do. In a preferred aspect, the compound is substantially purified (eg, substantially free of substances that limit its effect or produce undesired side effects). The subject is preferably an animal, including but not limited to animals such as cows, pigs, horses, chickens, cats, dogs, and is preferably a mammal,
And most preferably human.

【０３７９】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。Formulations and methods of administration that can be used when the compound comprises a nucleic acid or immunoglobulin are described above; further suitable formulations and routes of administration are selected from those described herein below. Can be done.

【０３８０】 本明細書中に記載されるアゴニストまたはアンタゴニストは、インビトロ、エ
キソビボ、またはインビボで、細胞に投与され得る。それらは、本発明のレセプ
ターを発現する。アゴニストまたはアンタゴニストの「有効量」の投与とは、化
合物の量を意図する。これは、ＴＮＦファミリーリガンドの細胞応答を、十分に
増強または阻害し、そしてポリペプチドを含む。特に、アゴニストまたはアンタ
ゴニストの「有効量」の投与とは、ＤＲ５媒介性アポトーシスを増強または阻害
する有効量を意図する。もちろん、アポトーシスが増強されることが望まれる場
合、本発明に従うアゴニストは、ＴＮＦファミリーリガンドと共に投与され得る
。当業者は以下のことを理解する。アゴニストまたはアンタゴニストの有効量が
、経験的に決定され得、そして純粋な形態または薬学的に受容可能な塩の形態、
エステルの形態、あるいはプロドラッグの形態で使用され得ることを理解する。
アゴニストまたはアンタゴニストは、１以上の薬学的に受容可能な賦形剤と組み
合わされた組成物において投与され得る（すなわち、キャリア）。The agonists or antagonists described herein can be administered to cells in vitro, ex vivo, or in vivo. They express the receptor of the invention. Administration of an "effective amount" of an agonist or antagonist intends the amount of the compound. It sufficiently enhances or inhibits the cellular response of TNF family ligands and includes polypeptides. In particular, administration of an “effective amount” of an agonist or antagonist contemplates an effective amount that enhances or inhibits DR5-mediated apoptosis. Of course, if apoptosis is desired to be enhanced, an agonist according to the invention may be administered with a TNF family ligand. Those skilled in the art will understand the following. An effective amount of an agonist or antagonist can be determined empirically, and can be in pure or pharmaceutically acceptable salt form;
It is understood that it can be used in the form of an ester or in the form of a prodrug.
The agonist or antagonist can be administered in a composition in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients (ie, a carrier).

【０３８１】 以下のことが理解される。ヒト患者に投与される場合、本発明の化合物および
組成物の全体の日々の使用は、主治医である医師によって信頼できる医療の判断
の範囲内で決定される。任意の特別な患者に対する特定の治療有効量の用量レベ
ルは、医療分野で周知の因子に依存する。The following is understood. When administered to a human patient, the overall daily use of the compounds and compositions of the present invention will be decided by the attending physician within the scope of sound medical judgment. The dosage level for a particular therapeutically effective amount for any particular patient will depend on factors well known in the medical arts.

【０３８２】 一般的提案として、１用量あたりで非経口投与されるＤＲ５ポリペプチドの総
薬学的有効量は、患者の体重の約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲
であるが、上記のように、これは治療的自由裁量に供される。より好ましくは、
この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も好ましくはヒトに
ついて、ホルモンに関して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と１ｍｇ／ｋｇ／日との間
である。連続的に与えられる場合、ＤＲ５アドニストまたはアンタゴニストは、
代表的には、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、１
日あたり１〜４回の注射、または例えば、ミニポンプを用いる連続的皮下注入の
いずれかにより投与される。静脈内バック溶液もまた用いられ得る。As a general suggestion, the total pharmaceutically effective amount of a DR5 polypeptide administered parenterally per dose will range from about 1 μg / kg / day to 10 mg / kg / day of the patient's body weight, As noted above, this is subject to therapeutic discretion. More preferably,
This dose is at least 0.01 mg / kg / day, and most preferably for humans, between about 0.01 mg / kg / day and 1 mg / kg / day for hormones. When given continuously, a DR5 adonist or antagonist
Typically, at dose rates of about 1 μg / kg / hr to about 50 μg / kg / hr,
It is administered either by 1-4 injections per day or by continuous subcutaneous infusion using, for example, a minipump. An intravenous bag solution may also be used.

【０３８３】 投与はまた、患者に特異的な様式でアレンジされ、決定された濃度のアゴニス
トまたはアンタゴニストを血液に提供する（ＲＩＡ技術によって決定されたよう
に）。従って、患者に投与することは、調節され得、ＲＩＡによって測定される
血液レベルによってレギュラーな継続を達成する。そのオーダーは、５０〜１０
００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１５０〜５００ｎｇ／ｍｌである。Administration will also be arranged in a patient-specific manner to provide a determined concentration of agonist or antagonist to the blood (as determined by RIA techniques). Thus, dosing to the patient can be adjusted to achieve regular continuation with blood levels measured by RIA. The order is 50-10
00 ng / ml, preferably 150 to 500 ng / ml.

【０３８４】 アゴニストまたはアンタゴニスト（本発明のＤＲ５ポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドを含む）、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む薬
学的組成物が提供され、これは、経口投与、直腸投与、非経口投与、槽内（ｉｎ
ｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）投与、鞘膜内投与、腹腔内投与、局所投与（散剤
、軟膏、ドロップまたは経皮パッチによって）、頬投与され得るか、あるいは経
口スプレーまたは経鼻スプレーとして投与され得る。重要なことに、アゴニスト
およびＴＮＦ−ファミリーリガンドを同時投与することによって、臨床的な副作
用は、リガンドおよびアゴニストの両方のより低い用量によって軽減され得る。
特定の治療適用の緊急性に依存して、アゴニストがＴＮＦ−ファミリーリガンド
の前に、後に、またはＴＮＦ−ファミリーリガンドと同時に「同時投与」され得
ることが理解される。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半
固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。
具体的な実施形態において、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、
そしてさらに特にヒトにおける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府に
より認められたか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列
挙されたことを意味する。用語「キャリア」とは、試料薬剤とともに投与される
、希釈剤、アジュバンド、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的な
キャリアは、水および油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油
（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌し
た液体であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましい
キャリアである。生理食塩水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロール
の水溶液はまた、特に注射可能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得
る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロ
ース、ゼラチン、麦芽、イネ、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸
ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳
、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
組成物はまた、所望されるならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩
衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセ
ル剤、散剤、持続放出処方物などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合
剤およびトリグリセリドのようなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。
経口処方物は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン
酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの
ような標準キャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒ
ｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ」に記載される。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好
ましくは精製された形態で、適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切
な投与のための形態を提供する。処方物は、投与形態に適するべきである。A pharmaceutical composition comprising an agonist or antagonist (including the DR5 polynucleotides and polypeptides of the invention) and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient is provided, which can be administered orally, rectally. , Parenteral administration, in the tank (in
It can be administered tracistemally, intrathecally, intraperitoneally, topically (by powder, ointment, drop or transdermal patch), buccally, or administered as an oral or nasal spray. Importantly, by co-administering an agonist and a TNF-family ligand, clinical side effects may be reduced by lower doses of both the ligand and the agonist.
It is understood that, depending on the urgency of the particular therapeutic application, the agonist may be "co-administered" before, after, or simultaneously with the TNF-family ligand. “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to a non-toxic solid, semi-solid or liquid filler, diluent, encapsulating material or any type of formulation auxiliary.
In a specific embodiment, the term "pharmaceutically acceptable" refers to
And more particularly, for use in humans, means approved by the Federal Regulatory Authority or the United States Government, or listed in the United States Pharmacopeia or other generally accepted pharmacopeias. The term "carrier" refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the sample agent is administered. Such pharmaceutical carriers include sterile liquids such as water and oils, including oils of petroleum, animal, plant, or synthetic origin (eg, peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like). Can be Water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skim milk powder, glycerol, propylene , Glycol, water, ethanol and the like.
The composition may also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents, if desired. These compositions may take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release formulations and the like. The composition can be formulated as a suppository, with traditional binders and carriers such as triglycerides.
Oral formulations can include standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharine, cellulose, magnesium carbonate, and the like. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in W. Mar
"Remington's Pharmaceutical Sc
items ". Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the compound, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier to provide a form for proper administration to the patient. The formulation should suit the mode of administration.

【０３８５】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓ
ａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。In a preferred embodiment, the compositions are formulated according to conventional procedures, as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to humans. Typically, compositions for intravenous administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer. Where necessary, the composition may also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lignocaine to ease pain at the site of the injection. Generally, the components are either separated or mixed together in a single dosage form, for example, in an ampoule or sachet (s) representing a fixed amount of active agent.
Supplied as a lyophilized powder or water-free concentrate in a sealed container such as an acetette. If the composition is to be administered by infusion, the composition can be dispensed into infusion bottles containing sterile pharmaceutical grade water or saline. When the composition is administered by injection, the components can be mixed prior to administration.
An ampoule of sterile water for injection or saline can be provided.

【０３８６】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののよ
うなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。The compounds of the present invention may be formulated as neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include those formed with anions such as those derived from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids and the like, and sodium, potassium, ammonium, calcium, ferric hydroxide, Isopropylamine, triethylamine,
Salts formed with cations such as those derived from 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine, and the like.

【０３８７】 用語「非経口的」とは本明細書中において使用される場合、静脈内、筋肉内、
腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。The term “parenteral,” as used herein, refers to intravenous, intramuscular,
Refers to modes of administration including intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intraarticular injection and infusion.

【０３８８】 様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ
得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発現が可
能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば
、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１
９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核
酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔
内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物また
は組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射によ
り、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通
しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与
され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化
合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し
；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けら
れた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入すること
が望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用
いた処方により、肺投与もまた使用され得る。Various delivery systems are known and can be used to administer the compounds of the invention (eg, liposomes, microparticles, microcapsules, encapsulation in recombinant cells capable of expressing the compounds). , Receptor-mediated endocytosis (eg, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1.
987)), construction of nucleic acids as part of retroviruses or other vectors, etc.). Methods of introduction include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The compound or composition may be administered by any convenient route, such as by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucosal linings such as oral, rectal and intestinal mucosa, and other It can be administered together with a biologically active agent. Administration can be systemic or local. In addition, the pharmaceutical compounds or compositions of the present invention can be administered by any suitable route, including intraventricular and intrathecal injections; intraventricular injection can be, for example, an intraventricularly attached reservoir such as an Ommaya reservoir. It may be desirable to introduce it into the central nervous system (which can be facilitated by a catheter). Pulmonary administration may also be used, for example, with the use of an inhaler or nebulizer, and formulation with an aerosolizing agent.

【０３８９】 具体的な実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必
要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではない
が、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み
合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプ
ラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよ
うな膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達
成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパ
ク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。In a specific embodiment, it may be desirable to administer the pharmaceutical compounds or compositions of the invention locally to the area in need of treatment; this is not a limitation, for example, By local injection during surgery, topical application (eg, in combination with a post-operative wound dressing), by injection, by catheter, by suppository, or by an implant (this implant is a membrane such as a sialastic membrane) Or a porous, non-porous, or glue-like material comprising fibers). Preferably, when administering a protein of the invention, including an antibody, care must be taken to use materials to which the protein does not absorb.

【０３９０】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。In another embodiment, the compound or composition can be delivered into vesicles, especially liposomes (Langer, Science 249: 1527-1533 (
1990); Treat et al., Liposomes in the Therap.
y of Infectious Disease and Cancer, L
opez-Berstein and Fidler (eds.), Liss, New
York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berstein,
See pages 317-327 of the same book; see broadly the same book).

【０３９１】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、徐放系中で送達され得
る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，（前出）
；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２
０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９
８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８
９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅ
ｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ
ｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ
Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ
ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉ
ｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ
．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６
１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（
１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９
）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もま
た参照のこと）。さらに別の実施形態において、徐放系は、治療標的、即ち、脳
の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏ
ｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を
参照のこと）。In yet another embodiment, the compound or composition can be delivered in a sustained release system. In one embodiment, a pump may be used (Langer, supra).
Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 2
01 (1987); Buchwald et al., Surgery 88: 507 (19).
80); Saudek et al. Engl. J. Med. 321: 574 (198
9)). In another embodiment, a polymeric material may be used (Me
digital Applications of Controlled Rel
ease, Langer and Wise (eds.), CRC Pres. , Boca
Raton, Florida (1974); Controlled Drug
Bioavailability, Drug Product Design
and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wi
ley, New York (1984); Ranger and Peppas, J.
. Macromol. Sci. Rev .. Macromol. Chem. 23: 6
1 (1983); Levy et al., Science 228: 190 (
1985); During et al., Ann. Neurol. 25: 351 (1989)
); Howard et al., J. Mol. Neurosurg. 71: 105 (1989)). In yet another embodiment, a sustained release system can be placed near the therapeutic target, ie, the brain, and thus requires only a portion of the systemic dose (eg, Goo
dson, Medical Applications of Control
led Release, supra, Vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

【０３９２】 他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。Other sustained release systems are discussed in a review by Langer (Science
249: 1527-1533 (1990)).

【０３９３】 本発明のＤＲ５組成物はまた、徐放性の系により、適切に投与される。徐放性
組成物の適切な例としては、適切なポリマー材料（例えば、成形品の形態の半透
過性ポリマーマトリックス（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）のよう
な）、適切な疎水性材料（例えば、受容可能な油における乳剤として）またはイ
オン交換樹脂、および控えめに（ｓｐａｒｉｎｇｌｙ）可溶性の誘導体（例えば
、控えめに可溶性な塩のような）が挙げられる。The DR5 compositions of the present invention are also suitably administered via sustained release systems. Suitable examples of sustained release compositions include suitable polymeric materials (eg, such as semipermeable polymer matrices in the form of shaped articles (eg, films or microcapsules)), suitable hydrophobic materials (eg, Or an ion exchange resin, and sparingly soluble derivatives (such as, for example, a sparingly soluble salt).

【０３９４】 徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメー
トのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ，Ｕら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７
−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．
Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７
７（１９８１）およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１
０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、同書）
またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げら
れる。As a sustained release matrix, polylactide (US Pat. No. 3,773,919)
No. EP 58,481), a copolymer of L-glutamic acid and γ-ethyl-L-glutamate (Sidman, U et al., Biopolymers 22: 547).
-556 (1983)), poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (R.
Langer et al. Biomed. Mater. Res. 15: 167-27
7 (1981) and R.A. Langer, Chem. Tech. 12: 98-1
05 (1982)), ethylene vinyl acetate (R. Langer et al., Ibid.)
Or poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid (EP133,988).

【０３９５】 徐放性組成物はまた、リポソームに封入された本発明の組成物（一般に、Ｌａ
ｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅ
ａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅ
ｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ、Ｌｏｐｅｚ Ｂｅｒｅ
ｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３１７−
３２７頁および３５３−３６５頁（１９８９）を参照のこと）を包含する。ＤＲ
５を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製される（ＤＥ
３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０−４０３４（１９８０
）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９
４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許
第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ１０２
，３２４）。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型
であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選
択された比率が、最適なＤＲ５ポリペプチド治療のために調整される。[0397] Sustained-release compositions also include liposome-encapsulated compositions of the invention (generally La-based).
nger, Science 249: 1527-1533 (1990); Tre.
at et al., Liposomes in the Therapy of Infe
ctious Disease and Cancer, Lopez Bere
Stein and Fidler (eds.), Liss, New York, 317-
327 and 353-365 (1989)). DR
5 containing liposomes are prepared by methods known per se (DE
3, 218, 121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc.
. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980)
EP52,322; EP36,676; EP88,046; EP143,9).
49; EP 142,641; Japanese Patent Application No. 83-118008; U.S. Patent Nos. 4,485,045 and 4,544,545;
, 324). Usually, liposomes are in the small (about 200-800 °) unilamellar form, where the lipid content is greater than about 30 mol% cholesterol and the selected ratio is adjusted for optimal DR5 polypeptide treatment. Is done.

【０３９６】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入るこ
とが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、
Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８
６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタン
パク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細
胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に
組み込まれ得る。In a specific embodiment, where the compound of the invention is a protein-encoding nucleic acid, the nucleic acid is such that it is part of a suitable nucleic acid expression vector and is intracellular. By administration (eg, by use of a retroviral vector (see US Pat. No. 4,980,286)), or by direct injection, or by microparticle bombardment (eg, a gene gun; Biolis).
tic, Dupont) or by coating with lipids or cell surface receptors or transfectants, or in conjunction with a homeobox-like peptide known to enter the nucleus (eg,
Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:18
64-1868 (1991)), and the like, to enhance the expression of the encoded protein. Alternatively, the nucleic acid can be introduced intracellularly and integrated into host cell DNA by homologous recombination for expression.

【０３９７】 さらに別の実施形態において、本発明の組成物は、ポンプの方法によって送達
される。（Ｌａｎｇｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ
．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓ
ｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ
．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。In yet another embodiment, a composition of the present invention is delivered by a pump. (Langer, supra); Sefton, CRC Crit. Ref.
. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., S.
urgery 88: 507 (1980); Saudek et al. Engl. J
. Med. 321: 574 (1989)).

【０３９８】 他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。Other controlled release systems are discussed in a review by Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)).

【０３９９】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入るこ
とが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、
Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８
６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタン
パク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細
胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に
組み込まれ得る。In a specific embodiment, where the compound of the invention is a protein-encoding nucleic acid, the nucleic acid is constructed such that it is part of a suitable nucleic acid expression vector and is intracellular. By administration (eg, by use of a retroviral vector (see US Pat. No. 4,980,286)), or by direct injection, or by microparticle bombardment (eg, a gene gun; Biolis).
tic, Dupont) or by coating with lipids or cell surface receptors or transfectants, or in conjunction with a homeobox-like peptide known to enter the nucleus (eg,
Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:18
64-1868 (1991)), and the like, to enhance the expression of the encoded protein. Alternatively, the nucleic acid can be introduced intracellularly and integrated into host cell DNA by homologous recombination for expression.

【０４００】 非経口注射のための本発明の薬学的組成物は、使用の直前に滅菌注射溶液また
は分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）への再形成のために以下を含み得る。薬学的
に受容可能な滅菌された水性または非水性溶液、分散剤、懸濁液またはエマルジ
ョン、ならびにの滅菌粉末。A pharmaceutical composition of the invention for parenteral injection may include the following for reconstitution into a sterile injectable solution or dispersion immediately before use. Pharmaceutically acceptable sterile aqueous or non-aqueous solutions, dispersions, suspensions or emulsions, and sterile powders.

【０４０１】 可溶性ＤＲ５ポリペプチドに加えて、膜貫通領域を含むＤＲ５ポリペプチドは
また、以下の場合に使用され得る。界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳまたはＮＰ
−４０）を含むことによって緩衝液に適切に可溶化される場合。[0401] In addition to soluble DR5 polypeptides, DR5 polypeptides that include a transmembrane region may also be used in the following cases. Surfactants (eg, CHAPS or NP
-40) when properly solubilized in buffer by including

【０４０２】 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験され
る。例えば、化合物または薬学的組成物の治療有用性または予防有用性を実証す
るためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する
化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物
または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよび
細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得
る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるかどうかを決定するために
用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げ
られ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養において増殖され、そして化
合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに
対するそのような化合物の効果が観察される。The compounds or pharmaceutical compositions of the invention are preferably tested in vitro prior to use in humans and then in vivo for the desired therapeutic or prophylactic activity. For example, in vitro assays to demonstrate the therapeutic or prophylactic utility of a compound or pharmaceutical composition include the effect of the compound on a cell line or patient tissue sample. The effect of a compound or composition on a cell line and / or tissue sample can be determined utilizing techniques known to those of skill in the art, including, but not limited to, rosette formation assays and cell lysis assays. In vitro assays that can be used to determine whether administration of a particular compound is indicated, in accordance with the present invention, include in vitro cell culture assays, in which a patient tissue sample is grown in culture and the compound Or the compound is administered otherwise, and the effect of such compound on the tissue sample is observed.

【０４０３】 本発明の組成物を単独でまたは他の補助剤と組み合わせて投与し得る。本発明
の組成物と共に投与され得る補助剤は、ミョウバン、ミョウバンおよびデオキシ
コール酸（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ Ｃｏｒｐ．）
、ＱＳ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、およびＭＰＬを含み得
るが、これに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物をミョウ
バンと組み合わせて投与する。別の特定の実施形態において、本発明の組成物を
ＱＳ−２１と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得るさらな
る補助剤は、モノホスホリル液体免疫調節物質、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、Ｑ
Ｓ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、ＭＦ−５９、および
Ｖｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術を含むが、これらに限定されない。本発明
の組成物と共に投与され得るワクチンは、ＭＭＲ（はしか、おたふくかぜ、風疹
）、ポリオ、水痘、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエ
ンザ菌、百日咳、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイルス、コレラ、黄
熱病、日本脳炎、ポリオ、狂犬病、腸チフス、および百日咳に対する防御へ指向
されるワクチンを含むがこれらに限定されない。同時に（例えば、混合剤として
）、別々であるが同時もしくは並行して；または経時的にのいずれかの配合物を
投与し得る。これは、組み合わせた薬剤を治療混合剤として共に投与する提示、
また組み合わせ剤を別々であるが、同時に（例えば、別々の静脈内ラインを個々
の同じ静脈ラインへ通すように）投与する手順を含む。さらに、「組み合わせて
の」投与は、化合物の１つの別々の投与または、所与の第１の、続いて第２の薬
剤の投与を含む。The compositions of the present invention may be administered alone or in combination with other auxiliaries. Adjuvants that can be administered with the composition of the present invention include alum, alum and deoxycholic acid (ImmunoAg), MTP-PE (Biocine Corp.).
, QS21 (Genentech, Inc.), BCG, and MPL. In certain embodiments, a composition of the present invention is administered in combination with alum. In another specific embodiment, a composition of the invention is administered in combination with QS-21. Additional adjuvants that can be administered with the compositions of the present invention include the monophosphoryl liquid immunomodulator, AdjuVax 100a, Q
Including but not limited to S-21, QS-18, CRL1005, aluminum salts, MF-59, and Virosomal adjuvant technology. Vaccines that can be administered with the compositions of the present invention include MMR (measles, mumps, rubella), polio, varicella, tetanus / diphtheria, hepatitis A, hepatitis B, influenza B, pertussis, pneumonia, influenza, lime Vaccines directed to protection against disease, rotavirus, cholera, yellow fever, Japanese encephalitis, polio, rabies, typhoid fever, and pertussis. Any of the formulations may be administered simultaneously (eg, as a mixture), separately but simultaneously or concurrently; or over time. This suggests that the combined drugs be administered together as a therapeutic mixture,
It also includes the step of administering the combination separately but simultaneously (eg, passing separate intravenous lines through each and the same intravenous line). Further, “in combination” administration includes the separate administration of a compound or the administration of a given first and then second agent.

【０４０４】 上で示されるように、本発明の組成物は、単独で、または他の治療的薬剤と組
み合わせて投与され得る。本発明の組成物とともに投与され得る治療的薬剤とし
ては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＴＮＦファミリーの他のメ
ンバー、化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤、ステロイド性および非ステロイ
ド性の抗炎症剤、従来の免疫療法剤、サイトカイン、ケモカインならびに／また
は増殖因子。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時に
もしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み
合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み
合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを
通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与え
られ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与する
ことをさらに含む。As indicated above, the compositions of the present invention may be administered alone or in combination with other therapeutic agents. Therapeutic agents that can be administered with the compositions of the present invention include, but are not limited to: other members of the TNF family, chemotherapeutic agents, antibiotics, antiviral agents, steroidal and non-steroidal Anti-inflammatory agents, conventional immunotherapeutic agents, cytokines, chemokines and / or growth factors. The combination may be administered, for example, either simultaneously, as a mixture, separately but simultaneously or concurrently; or sequentially. This includes presentations where the combined agents are administered together as a therapeutic mixture, and also procedures where the combined agents are administered separately but simultaneously (eg, through separate intravenous lines to the same individual). Also includes. "Combination" administration further includes separately administering one of the compounds or agents given first, followed by the second.

【０４０５】 １つの実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦファミリーの他のメンバ
ーと組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得るＴＮＦ分子
、ＴＮＦ関連分子、またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これら
に限定されない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α、
ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−βの状
態で見出された）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ
、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／
１４３２８）、ＴＲＡＩＬ、ＡＩＭ−ＩＩ、（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１
１）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）：１１８５−１１９０）
、エンドカイン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０
）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧ、および神経成長因
子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、可溶性形態のＣＤ３０、可溶性形
態のＣＤ２７、可溶性形態のＣＤ４０および可溶性形態の４−ＩＢＢ、ＴＲ２（
国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９
０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号
ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８
９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公
開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、ならびに可溶性形態のＣＤ１
５４、可溶性形態のＣＤ７０、および可溶性形態のＣＤ１５３。In one embodiment, the compositions of the invention are administered in combination with other members of the TNF family. TNF molecules, TNF-related molecules, or TNF-like molecules that can be administered with the compositions of the invention include, but are not limited to: soluble forms of TNF-α, lymphotoxin-α, (LT-α,
TNF-β), LT-β (found in composite heterotrimer LT-α2-β), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L
4-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-γ (International Publication No. WO96 /
14328), TRAIL, AIM-II, (International Publication No. WO 97/3491)
1), APRIL (J. Exp. Med. 188 (6): 1185-1190)
Endokine-α (International Publication No. WO 98/07880)
), TR6 (International Publication No. WO 98/30694), OPG, and nerve growth factor (NGF), and soluble forms of Fas, soluble forms of CD30, soluble forms of CD27, soluble forms of CD40 and soluble forms of 4-IBB, TR2 (
International Publication No. WO96 / 34095), DR3 (International Publication No. WO97 / 339)
04), DR4 (International publication number WO98 / 32856), TR5 (International publication number WO98 / 30693), TRANK, TR9 (International publication number WO98 / 568).
92), TR10 (WO 98/54202), 312C2 (WO 98/06842), and TR12, and the soluble form of CD1
54, soluble form of CD70, and soluble form of CD153.

【０４０６】 別の実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）
、可溶性形態のＣＤ４０Ｌ（例えば、ＡＶＲＥＮＤTM）、生物学的に活性なフラ
グメント、変異体、またはＣＤ４０Ｌの誘導体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、ア
ゴニストまたはアンタゴニストの抗体）、および／または抗ＣＤ４０抗体（例え
ば、アゴニストまたはアンタゴニストの抗体）と組み合わせて、投与される。In another embodiment, the composition of the present invention comprises a CD40 ligand (CD40L)
, A soluble form of CD40L (eg, AVREND ™ ), a biologically active fragment, variant, or derivative of CD40L, an anti-CD40L antibody (eg, an agonist or antagonist antibody), and / or an anti-CD40 antibody (eg, (Agonist or antagonist antibodies).

【０４０７】 なお別の実施形態において、本発明の組成物は、１個、２個、３個、４個、５
個、またはそれ以上の以下の組成物と組み合わせて投与される：タクロリムス（
Ｆｕｊｉｓａｗａ）、サリドミド（例えば、Ｃｅｌｇｅｎｅ）、抗Ｔａｃ（Ｆｖ
）−ＰＥ４０（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）、イノリモ
マブ（ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）（Ｂｉｏｔｅｓｔ）、ＭＡＫ−１９５Ｆ（Ｋｎｏ
ｌｌ）、ＡＳＭ−９８１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、インターロイキン−１レセプタ
ー（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ）、インターロイキン−４レセプター（例えば、Ｉ
ｍｍｕｎｅｘ）、ＩＣＭ３（ＩＣＯＳ）、ＢＭＳ−１８８６６７（Ｂｒｉｓｔｏ
ｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、抗ＴＮＦ Ａｂ（例えば、Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ抗体）、ＣＧ−１０８８（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、抗−Ｂ７モノクローナル抗
体（例えば、Ｉｎｎｏｇｅｔｉｃｓ）、ＭＥＤＩ−５０７（Ｂｉｏ Ｔｒａｎｓ
ｐｌａｎｔ）、ＡＢＸ−ＣＢＬ（Ａｂｇｅｎｉｘ）。In still another embodiment, the composition of the present invention comprises 1, 2, 3, 4, 5,
Administered in combination with one or more of the following compositions: tacrolimus (
Fujisawa), thalidomide (eg, Celgene), anti-Tac (Fv
) -PE40 (e.g., Protein Design Labs), inolimomab (Biotest), MAK-195F (Kno)
11), ASM-981 (Novartis), interleukin-1 receptor (e.g. Immunex), interleukin-4 receptor (e.g.
mmunex), ICM3 (ICOS), BMS-188667 (Bristo)
l-Myers Squibb), anti-TNF Ab (eg, Therapeu
tic antibody), CG-1088 (Celgene), anti-B7 monoclonal antibody (e.g., Innotics), MEDI-507 (BioTrans)
plant), ABX-CBL (Abgenix).

【０４０８】 本発明によれば、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）媒介細胞死およびＴＲＡＩＬ
媒介細胞死の両方に敏感な患者は、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ相互作用を阻害
する薬剤およびＦａｓ−Ｌ／Ｆａｓ相互作用を阻害する薬剤の両方を用いて処置
され得る。Ｆａｓ−ＬのＦａｓへの結合を遮断するための適切な薬剤として、以
下が挙げられるが、これらに限定されない：可溶性Ｆａｓポリペプチド；可溶性
Ｆａｓポリペプチド（例えば、ｓＦａｓ／Ｆｃのダイマー）のオリゴマー形態；
アポトーシスを生じる生物学的シグナルを変換することなくＦａｓと結合する抗
Ｆａｓ抗体；Ｆａｓ−ＬのＦａｓへの結合を遮断する抗Ｆａｓ−Ｌ抗体；および
Ｆａｓと結合するが、アポトーシスを生じる生物学的シグナルを変換しないＦａ
ｓ−Ｌのムテイン。好ましくは、この方法に従って使用された抗体は、モノクロ
ーナル抗体である。Ｆａｓ−Ｌ／Ｆａｓ相互作用を遮断するための適切な薬剤（
抗Ｆａｓモノクローナル抗体を含む）の例は、本明細書中において参考として援
用されるＷＯ９５／１０５４０に記載される。According to the present invention, Fas ligand (Fas-L) mediated cell death and TRAIL
Patients who are susceptible to both mediated cell death can be treated with both agents that inhibit TRAIL / TRAIL-R interaction and agents that inhibit Fas-L / Fas interaction. Suitable agents for blocking the binding of Fas-L to Fas include, but are not limited to: soluble Fas polypeptide; oligomeric forms of soluble Fas polypeptide (eg, sFas / Fc dimer) ;
An anti-Fas antibody that binds to Fas without transducing the biological signal that causes apoptosis; an anti-Fas-L antibody that blocks the binding of Fas-L to Fas; Fa that does not convert the signal
sL mutein. Preferably, the antibodies used according to this method are monoclonal antibodies. Suitable agents for blocking the Fas-L / Fas interaction (
Examples (including anti-Fas monoclonal antibodies) are described in WO 95/10540, which is incorporated herein by reference.

【０４０９】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、およ
び／またはプロテアーゼインヒビターとの組み合わせで投与される。本発明の組
成物との組み合わせで投与され得るヌクレオシド逆転写酵素インヒビターは、Ｒ
ＥＴＲＯＶＩＲTM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸTM（ジダノシン／ｄｄｌ
）、ＨＩＶＩＤTM（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴTM（スタブジン（ｓｔ
ａｖｕｄｉｎｅ）／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲTM（ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉ
ｎｅ）／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲTM（ジドブジン／ラミブジン）が挙
げられるがこれらに限定されない。本発明の組成物との組み合わせで投与され得
る非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターは、ＶＩＲＡＭＵＮＥTM（ネビラピン
（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ））、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲTM（デラビジン（ｄｅｌａ
ｖｉｒｄｉｎｅ））、およびＳＵＳＴＩＶＡTM（エファビレン（ｅｆａｖｉｒｅ
ｎｚ））が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の組成物との組み合わせ
で投与され得るプロテアーゼインヒビターは、ＣＲＩＸＩＶＡＮTM（インディナ
ビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ））、ＮＯＲＶＩＲTM（リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖ
ｉｒ））、ＩＮＶＩＲＡＳＥTM（サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ））、およ
びＶＩＲＡＣＥＰＴTM（ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ））が挙げられ
るがこれらに限定されない。特定の実施形態において、抗レトロウイルス薬剤、
ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター
、および／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤＳの処置、および／また
はＨＩＶ感染を予防または処置するために、本発明の組成物との任意の組み合わ
せにおいて使用され得る。In certain embodiments, the compositions of the invention are administered in combination with an antiretroviral agent, a nucleoside reverse transcriptase inhibitor, a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor, and / or a protease inhibitor. Nucleoside reverse transcriptase inhibitors that can be administered in combination with the compositions of the present invention include R
ETROVIR ™ (Zidovudine / AZT), VIDEX ™ (Zidanocine / ddl)
), HIVID ™ (Zalcitabine / ddC), ZERIT ™ (Stavudine (st
avudine) / d4T), EPIVIR ™ (lamivudi)
ne) / 3TC), and COMBIVIR ™ (Zidovudine / Lamivudine). Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors that can be administered in combination with the compositions of the present invention include VIRAMUNE ™ (nevirapine), RESCRIPTOR ™ (delavidin)
virdine)), and SUSTIVA ™ (efavirene).
nz)), but are not limited thereto. Protease inhibitors that may be administered in combination with the compositions of the present invention include CRIXIVAN ™ (indinavir), NORVIR ™ (ritonavir)
ir)), INVIRASE ™ (saquinavir), and VIRACEPT ™ (nelfinavir). In certain embodiments, an antiretroviral agent,
A nucleoside reverse transcriptase inhibitor, a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor, and / or a protease inhibitor is used in any combination with the compositions of the invention to treat AIDS and / or prevent or treat HIV infection. obtain.

【０４１０】 他の実施形態において、本発明の組成物は、抗日和見感染薬剤と組み合わせて
投与され得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗日和見感染薬剤は
、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳ
ＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTM、ＩＳＯＮＩＡ
ＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、ＥＴＨＡＭＢＵ
ＴＯＬTM、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＡＺＩＴ
ＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、ＣＩ
ＤＯＦＯＶＩＲTM、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、
ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ TM 、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTM、ＮＥＵＰＯＧＥ
ＮTM（フィルグラスチン（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥ
ＵＫＩＮＥTM（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳＦ
）が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組
成物は、日和見性のニューモシスティス肺炎感染を予防的に処置または予防する
ために、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、Ｄ
ＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯ
ＮＥTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態では、本発明の
組成物は、日和見性のトリ菌感染を予防的に処置または予防するために、ＩＳＯ
ＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、および／
またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の
実施形態では、日和見性の結核菌感染を予防的に処置または予防するために、本
発明の組成物は、ＲＩＦＡＢＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、およ
び／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTMとの任意の組み合わせで使用される。別
の特定の実施形態において、本発明の組成物は、日和見性のサイトメガロウイル
ス感染を予防的に処置または予防するために、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯ
ＳＣＡＲＮＥＴTM、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲTMとの任意の組み合わせ
で使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、日和見性の真
菌症感染を予防的に処置または予防するために、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、Ｉ
ＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥTMとの任
意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は
、日和見性の単純性疱疹ウイルスＩ型および／またはＩＩ型感染を予防的に処置
または予防するために、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTMおよび／またはＦＡＭＣＩＣＯＬ
ＶＩＲTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本
発明の組成物は、日和見性のＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ感染を予防的
に処置または予防するために、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTMおよび／またはＬ
ＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態
において、本発明の組成物は、日和見性の細菌感染を予防的に処置または予防す
るために、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮTMとの任意
の組み合わせで使用される。In another embodiment, the compositions of the present invention are combined with an anti-opportunistic infectious agent.
Can be administered. Anti-opportunistic infectious agents that can be administered in combination with the compositions of the present invention are
, TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM, DAPS
ONETM, PENTAMIDINETM, ATOVAQONETM, ISONIA
ZIDTM, RIFAMPINTM, PYRAZINAMIDETM, ETHAMBU
TOLTM, RIFABUTINTM, CLARATHROMYCINTM, AZIT
HROMYCINTM, GANICLOVIRTM, FOSCARNETTM, CI
DOFOVIRTM, FLUCONAZOLETM, ITRACONAZOLETM,
KETOCONAZOLETM, ACYCLOVIRTM, FAMCICOLVIR TM , PYRIMETHAMINETM, LEUCOVORINTM, NEUPAGE
NTM(Filgrastim / G-CSF), and LE
UKINETM(Sargramostim / GM-CSF
), But is not limited thereto. In certain embodiments, the present invention
Adults preventively treat or prevent opportunistic Pneumocystis pneumonia infection
TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM, D
APSONETM, PENTAMIDINETM, And / or ATOVAQUA
NETMUsed in any combination with In another specific embodiment, the present invention
The composition may be used to prophylactically treat or prevent opportunistic avian infections.
NIAZIDTM, RIFAMPINTM, PYRAZINAMIDETM,and/
Or ETHAMBUTOLTMUsed in any combination with Another specific
In embodiments, the present invention provides for the treatment or prevention of an opportunistic M. tuberculosis infection.
The composition of the invention comprises RIFABTINTM, CLARATHROMYCINTM, And
And / or AZITHROMYCINTMUsed in any combination with Another
In certain embodiments, the composition of the present invention comprises an opportunistic cytomegaloyl
GANICLOVIR to prevent or prevent prophylactic infectionsTM, FO
SCARNETTMAnd / or CIDOFOVIRTMAny combination with
Used in. In another specific embodiment, the composition of the present invention is an opportunistic drug.
FLUCONAZOLE for the prophylactic treatment or prevention of mycosisTM, I
TRACONAZOLETMAnd / or KETOCONAZOLETMAnd responsibilities
Used in any combination. In another specific embodiment, the composition of the invention comprises
Treatment of opportunistic herpes simplex virus type I and / or type II infection
Or to prevent, ACYCLOVIRTMAnd / or FAMCICOL
VIRTMUsed in any combination with In another specific embodiment, the book
The compositions of the invention prevent opportunistic Toxoplasma gondii infection
PYRIMETHAMINE to treat or preventTMAnd / or L
EUCOVORINTMUsed in any combination with Another specific embodiment
Wherein the composition of the invention prophylactically treats or prevents opportunistic bacterial infections.
LEUCOVORINTMAnd / or NEUPOGENTMOptional with
Used in combination.

【０４１１】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗ウイルス薬剤と組み合わせ
て投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗ウイルス薬剤は、アシクロ
ビル、リバビリン、アマンタジン、およびリマンタジンが挙げられるがこれらに
限定されない。In a further embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with an antiviral agent. Antiviral agents that can be administered with the compositions of the present invention include, but are not limited to, acyclovir, ribavirin, amantadine, and rimantadine.

【０４１２】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗生物質薬剤と組み合わせて
投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗生物質薬剤は、アモキシリン
、アミノグリコシド、β−ラクタム（グリコペプチド）、β−ラクタマーゼ、ク
リンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシ
ン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マクロライド
、メトロニダゾル、ペニシリン、キノロン、リファンピン、ストレプトマイシン
、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリムトプリム、トリムトプリム−スル
ファメトキサゾールおよびバンコマイシンが挙げられるがこれらに限定されない
。In a further embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with an antibiotic drug. Antibiotic agents that can be administered with the compositions of the present invention include amoxicillin, aminoglycosides, β-lactams (glycopeptides), β-lactamases, clindamycin, chloramphenicol, cephalosporins, ciprofloxacin, ciprofl. Examples include, but are not limited to, loxacin, erythromycin, fluoroquinolone, macrolide, metronidazole, penicillin, quinolone, rifampin, streptomycin, sulfonamide, tetracycline, trimtoprim, trimtoprim-sulfamethoxazole and vancomycin.

【０４１３】 本発明の組成物と組み合わせて投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤として
は、ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリン類似体、シクロホスファミド
、メチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−
デオキシスパガリン、およびＴ細胞に応答する機能を抑制することによって作用
する他の免疫抑制剤が挙げられるがこれらに限定されない。Conventional non-specific immunosuppressants that can be administered in combination with the compositions of the present invention include steroids, cyclosporins, cyclosporin analogs, cyclophosphamide, methylprednisone, prednisone, azathioprine, FK-506, 15 −
Examples include, but are not limited to, deoxyspagarin, and other immunosuppressants that act by inhibiting the function of responding to T cells.

【０４１４】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫抑制剤調製物と組み合わせ
て投与される。さらに、本発明の組成物と組み合わせて投与され得る免疫抑制剤
調製物は、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥTM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥTM／Ｎ
ＥＯＲＡＬTM／ＳＡＮＧＤＹＡTM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦTM（タク
ロリムス）、ＣＥＬＬＣＥＰＴTM（マイコフェノラート）、アザチオプリン、グ
ルコミコステロイド（ｇｌｕｃｏｍｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）、およびＲＡＰＡＭ
ＵＮＥTM（シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））が挙げられるがこれらに限定さ
れない。特定の実施形態において、免疫抑制薬が、器官の拒絶または骨髄移植の
拒絶を予防するために使用され得る。In certain embodiments, the compositions of the invention are administered in combination with an immunosuppressant preparation. Furthermore, immunosuppressive agent preparations which can be administered in combination with the compositions of the present invention, ORTHOCLONE TM (OKT3), SANDIMMUNE TM / N
EORAL ™ / SANGDYA ™ (cyclosporine), PROGRAF ™ (tacrolimus), CELLCEPT ™ (mycophenolate), azathioprine, glucomicosteroid, and RAPAM
UNE ™ (sirolimus), including but not limited to. In certain embodiments, immunosuppressive drugs may be used to prevent organ rejection or bone marrow transplant rejection.

【０４１５】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは１以上の静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投
与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲTM、ＩＶＥＥＧ
ＡＭTM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮTM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／ＤTMおよび
ＧＡＭＩＭＵＮＥTMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態に
おいて、本発明の組成物は、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈内免疫
グロブリン調製物と組み合わせて投与される。In a further embodiment, the compositions of the present invention are administered alone or in combination with one or more intravenous immunoglobulin preparations. Intravenous immunoglobulin preparations that can be administered with the compositions of the present invention include GAMMER ™ , IVEEG
AM ™ , SANDOGLOBULIN ™ , GAMMAGARD S / D ™ and GAMIMUNE ™, but are not limited thereto. In certain embodiments, the compositions of the invention are administered in combination with an intravenous immunoglobulin preparation in a transplantation therapy (eg, a bone marrow transplant).

【０４１６】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは抗炎症剤と組
み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗炎症剤としては
、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸
誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリ
ールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チ
アジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオ
ニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎ
ｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾー
ル、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン
、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、
ピフオキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、
これらに限定されない。In a further embodiment, a composition of the present invention is administered alone or in combination with an anti-inflammatory agent. Anti-inflammatory agents that can be administered with the compositions of the present invention include glucocorticoid and non-steroidal anti-inflammatory agents, aminoarylcarboxylic acid derivatives, arylacetic acid derivatives, arylbutyric acid derivatives, arylcarboxylic acids, arylpropionic acid derivatives, pyrazoles, Pyrazolones, salicylic acid derivatives, thiazinecarboxamides, e-acetamidocaproic acid, S-adenosylmethionine, 3-amino-4-hydroxybutyric acid, amixetrine
e), bendazac, benzidamine, bucolome, difenpyramide, ditazole, emorfazone, guaiazulene, nabumetone, nimesulide, orgothein, oxaseprol, paranyline, perisoxal,
Pifoxime, procazone, proxazole, and tenidap,
It is not limited to these.

【０４１７】 １つの実施形態において、本発明の組成物は、ステロイド療法と組み合わせて
投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るステロイドとしては、
オーラル（経口）コルチコステロイド、プレドニゾン、およびメチルプレドニゾ
ロン（例えば、ＩＶメチルプレドニゾロン）が挙げられるがこれらに限定されな
い。特定の実施形態において、本発明の組成物は、プレドニゾンと組み合わせて
投与される。さらに特定の実施形態において、本発明の組成物は、プレドニゾン
および免疫抑制剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物およびプレドニゾ
ンと投与され得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載される免疫抑制剤であり、ア
ザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドＩＶが挙げられ
るがこれらに限定されない。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、
メチルプレドニゾロンと組み合わせて投与される。さらに特定の実施形態におい
て、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロンおよび免疫抑制剤と組み合わせて
投与される。本発明の組成物およびメチルプレドニゾロンと共に投与され得る免
疫抑制剤は、本明細書中に記載される免疫抑制剤であり、そしてアザチオプリン
、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドＩＶが挙げられるがこれらに
限定されない。[0417] In one embodiment, the compositions of this invention are administered in combination with steroid therapy. Steroids that can be administered in combination with the compositions of the present invention include:
Oral (oral) corticosteroids, prednisone, and methylprednisolone (eg, IV methylprednisolone). In certain embodiments, the compositions of the present invention are administered in combination with prednisone. In a more particular embodiment, the compositions of the invention are administered in combination with prednisone and an immunosuppressant. The immunosuppressive agents that can be administered with the compositions and prednisone of the present invention are the immunosuppressive agents described herein, including but not limited to azathioprine, cyclophosphamide, and cyclophosphamide IV Not done. In another specific embodiment, the composition of the invention comprises:
It is administered in combination with methylprednisolone. In a more particular embodiment, the compositions of the invention are administered in combination with methylprednisolone and an immunosuppressant. Immunosuppressive agents that can be administered with the compositions of the present invention and methylprednisolone are the immunosuppressive agents described herein, and include azathioprine, cyclophosphamide, and cyclophosphamide IV It is not limited to.

【０４１８】 別の実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア薬と組み合わせて投与
される。本発明の組成物と共に投与され得る抗マラリア薬としては、ヒドロキシ
クロロキン、および／またはキナクリンが挙げられるがこれらに限定されない。In another embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with an antimalarial agent. Antimalarials that can be administered with the compositions of the present invention include, but are not limited to, hydroxychloroquine and / or quinacrine.

【０４１９】 別の実施形態において、本発明の組成物は、ＮＳＡＩＤと組み合わせて投与さ
れる。[0419] In another embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with an NSAID.

【０４２０】 非独占的な実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５、１０
、またはそれ以上の、以下の薬物と組み合わせて投与される：ＮＲＤ−１０１（
Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ）、ジクロフェナク（Ｄｉｍｅ
ｔｈａｉｄ）、オキサプロジンカリウム（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、メカセルミン（
ｍｅｃａｓｅｒｍｉｎ）（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｔ−６１４（Ｔｏｙａｍａ）、ペメ
トレクスト二ナトリウム（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ）（Ｅｌｉ
Ｌｉｌｌｙ）、オトレルートン（ａｔｒｅｌｅｕｔｏｎ）（Ａｂｂｏｔｔ）ヴ
ァルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、エルテナク（
Ｂｙｋ Ｇｕｌｄｅｎ）、カンパッチ（ｃａｍｐａｔｈ）、ＡＧＭ−１４７０（
Ｔａｋｅｄａ）、ＣＤＰ−５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、ＣＭ−１０１（ＣａｒｂｏＭｅｄ）、ＭＬ−３０００（Ｍｅｒｃｋｌｅ）
、ＣＢ−２４３１（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＣＢＦ−ＢＳ２（ＫＳ Ｂｉｏ
ｍｅｄｉｘ）、ＩＬ−１Ｒａ遺伝子治療（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）（Ｖａｌ
ｅｎｔｉｓ）、ＪＴＥ−５２２（Ｊａｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ）、パクリタキセ
ル（Ａｎｇｉｏｔｅｃｈ）、ＤＷ−１６６ＨＣ（Ｄｏｎｇ Ｗｈａ）、ダルブフ
ェロンメシレート（ｄａｒｂｕｆｅｌｏｎｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）（Ｗａｒｎｅ
ｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）、可溶性ＴＮＦレセプター１（ｓｙｎｅｒｇｅｎ；Ａｍｇ
ｅｎ）、ＩＰＲ−６００１（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、トロケード（ｔｒｏｃａｄｅ）（Ｈｏｆｆｍ
ａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、ＥＦ−５（Ｓｃｏｔｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌｓ）、ＢＩＩＬ−２８４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）
、ＢＩＩＦ−１１４９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｌｅｕ
ｋｏＶａｘ（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｃｓ）、ＭＫ−６６３（Ｍｅｒｃｋ）、ＳＴ
−１４８２（Ｓｉｇｍａ−Ｔａｕ）およびブチソコートプロピオネート（ｂｕｔ
ｉｘｏｃｏｒｔ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＷａｒｎｅｒＬａｍｂｅｒｔ）。In a non-exclusive embodiment, the composition of the invention comprises 1,2,3,4,5,10
Or more, in combination with the following drugs: NRD-101 (
Hoechst Marion Roussel), Diclofenac (Dime)
thid), potassium oxaprozin (Monsanto), mecamermin (
mecasermin) (Chiron), T-614 (Toyama), pemetrexed disodium (Eli)
Lilly), atreluton (Abbott), valdecoxib (Monsanto), Eltenac (
Byk Gulden), campath, AGM-1470 (
Takeda), CDP-571 (Celltech Chiroscience)
e), CM-101 (CarboMed), ML-3000 (Merckle)
, CB-2431 (KS Biomedix), CBF-BS2 (KS Biomedix)
medix), IL-1Ra gene therapy (Val)
entis), JTE-522 (Japan Tobacco), paclitaxel (Angiotech), DW-166HC (Dong Wha), darbuferone mesylate (Warne)
r-Lambert), soluble TNF receptor 1 (syngen; Amg)
en), IPR-6001 (Institute for Pharmaceu)
physical Research), trocade (Hoffm)
an-La Roche), EF-5 (Scotia Pharmaceuti)
cals), BIIL-284 (Boehringer Ingelheim)
, BIIF-1149 (Boehringer Ingelheim), Leu
koVax (Inflammatics), MK-663 (Merck), ST
-1482 (Sigma-Tau) and butisocoat propionate (but
ixocort proposal (WarnerLambert).

【０４２１】 なお別の実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５、１０、
またはそれ以上の、以下の薬物と組み合わせて投与される：メトトレキセート、
スルファサラジン、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、シクロスポリ
ン、ペニシラミン、アザチオプリン、抗マラリア薬（例えば、本明細書において
記載されるものなど）、シクロホスファミド、クロラムブシル、金、ＥＮＢＲＥ
ＬTM（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦ抗体、およびプレドニゾロン。より好
ましい実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア薬、メトトレキセート
、抗ＴＮＦ抗体、ＥＭＢＲＥＬTMおよび／またはスルファサラジンと組み合わせ
て投与される。１つの実施形態において、本発明の組成物は、メトトレキセート
と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、抗ＴＮ
Ｆ抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、
メトトレキセートおよび抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態
において、本発明の組成物は、スルファサラジンと組み合わせて投与される。別
の特定の実施形態において、本発明の組成物は、メトトレキセート、抗ＴＮＦ抗
体、およびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実施形態において
、本発明の組成物は、ＥＭＢＲＥＬTMと組み合わせて投与される。別の実施形態
において、本発明の組成物は、ＥＭＢＲＥＬTMおよびメトトレキセートと組み合
わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＭＢＲＥＬTM 、メトトレキセートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実
施形態において、本発明の組成物は、ＥＭＢＲＥＬTM、メトトレキセートおよび
スルファサラジンと組み合わせて投与される。他の実施形態において、１つ以上
の抗マラリア薬は、上記に列挙された組み合わせ剤の１つと組み合わせられる。
特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア薬（例えば、ヒドロキ
シクロロキン）、ＥＭＢＲＥＬTM、メトトレキセートおよびスルファサラジンと
組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗
マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン）、スルファサラジン、抗ＴＮＦ抗
体、およびメトトレキセートと組み合わせて投与される。In yet another embodiment, a composition of the present invention comprises 1, 2, 3, 4, 5, 10,
Or more, in combination with the following drugs: methotrexate,
Sulfasalazine, sodium gold thiomalate, auranofin, cyclosporine, penicillamine, azathioprine, antimalarial (such as those described herein), cyclophosphamide, chlorambucil, gold, ENBRE
L ™ (Etanercept), anti-TNF antibody, and prednisolone. In a more preferred embodiment, the compositions of the present invention are administered in combination with an antimalarial drug, methotrexate, anti-TNF antibody, EMBREL ™ and / or sulfasalazine. In one embodiment, the compositions of the present invention are administered in combination with methotrexate. In another embodiment, the composition of the present invention comprises an anti-TN
It is administered in combination with the F antibody. In another embodiment, the composition of the present invention comprises:
It is administered in combination with methotrexate and an anti-TNF antibody. In another embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with sulfasalazine. In another specific embodiment, a composition of the invention is administered in combination with methotrexate, an anti-TNF antibody, and sulfasalazine. In another embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with EMBREL ™ . In another embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with EMBREL ™ and methotrexate. In another embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with EMBREL ™ , methotrexate and sulfasalazine. In another embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with EMBREL ™ , methotrexate and sulfasalazine. In other embodiments, one or more antimalarials are combined with one of the combinations listed above.
In certain embodiments, the compositions of the invention are administered in combination with an antimalarial drug (eg, hydroxychloroquine), EMBREL ™ , methotrexate and sulfasalazine. In another specific embodiment, the compositions of the invention are administered in combination with an antimalarial (eg, hydroxychloroquine), sulfasalazine, an anti-TNF antibody, and methotrexate.

【０４２２】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の組成物とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導
体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチ
ノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば
、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インタ
ーフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）
、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルム
スチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホス
ファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイ
シン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン
（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
チニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテス
トステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン
、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファ
レン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メ
クロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類お
よび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（
例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトー
テン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げら
れるが、これらに限定されない。In another embodiment, a composition of the invention is administered in combination with a chemotherapeutic agent. Chemotherapeutic agents that can be administered with the compositions of the present invention include antibiotic derivatives (eg, doxorubicin, bleomycin, daunorubicin, and dactinomycin); anti-estrogens (eg, tamoxifen); antimetabolites (eg, fluorouracil, 5 -FU, methotrexate, floxuridine, interferon α-2b, glutamic acid, plicamycin
, Mercaptopurine, and 6-thioguanine); cytotoxic agents (eg, carmustine, BCNU, lomustine, CCNU, cytosine arabinoside, cyclophosphamide, estramustine, hydroxyurea, procarbazine, mitomycin, busulfan, cis-platin) And vincristine sulfate); hormones (eg, medroxyprogesterone, estramustine sodium phosphate, ethinyl estradiol, estradiol, megestrol acetate, methyltestosterone, diethylstilbestrol diphosphate, chlorotrianisene, and test lactone); Nitrogen mustard derivatives (eg, mephalen, chlorambucil, mechlorethamine (ni Roger emissions mustard) and thiotepa); steroids and combinations (e.g., betamethasone sodium); and others (
Examples include, but are not limited to, dicarbazine, asparaginase, mitotene, vincristine sulfate, vinblastine sulfate, and etoposide.

【０４２３】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド
、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と組み合わせてまた
はＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせにおいて投与される。別の実施形態におい
て、本発明の組成物は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さらな
る実施形態において、本発明の組成物は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰとと
もに、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせととも
に投与される。In certain embodiments, the compositions of the invention are administered in combination with CHOP (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone) or in any combination of the components of CHOP. In another embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with Rituximab. In a further embodiment, a composition of the invention is administered with Rituxmab and CHOP, or with any combination of components of Rituxmab and CHOP.

【０４２４】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせて
投与され得る。本発明の組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、以
下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−
１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ
−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−
１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、ＣＤ４
０Ｌ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−β。In a further embodiment, the compositions of the present invention may be administered in combination with a cytokine. Cytokines that can be administered with the compositions of the present invention include, but are not limited to: GM-CSF, G-CSF, IL-
1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL
-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-
17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, anti-CD40, CD4
0L, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, and TNF-β.

【０４２５】 別の実施形態において、本発明の組成物は、造血性増殖因子と組合せて投与さ
れる。本発明の組成物とともに投与され得る造血性増殖因子としては、ＬＥＵＫ
ＩＮＥ（登録商標）（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭ（登録商標））およびＮＥＵＰ
ＯＧＥＮ（登録商標）（ＦＩＬＧＲＡＳＴＩＭ（登録商標））が挙げられるがこ
れらに限定されない。In another embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with a hematopoietic growth factor. Hematopoietic growth factors that can be administered with the compositions of the present invention include LEUK
INE® (SARGRAMOSTIM®) and NEUP
OGEN (registered trademark) (FILGRASTIM (registered trademark)).

【０４２６】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗原性タンパク質と組み合わ
せて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗原性タンパク質として
は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：神経膠腫由来増殖因子（ＧＤ
ＧＦ）（欧州特許番号ＥＰ−３９９８１６に開示される）；血小板由来増殖因子
Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）（欧州特許番号ＥＰ−６８２１１０に開示される）；血小板
由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）（欧州特許番号ＥＰ−２８２３１７に開示され
る）；胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）（国際出願公開番号ＷＯ９２／０６１９４に開
示される）；胎盤増殖因子−２（ＰｌＧＦ−２）（Ｈａｕｓｅｒら，Ｇｏｒｗｔ
ｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，４：２５９−２６８（１９９３）に開示される）；血管内
皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（国際出願公開番号ＷＯ９０／１３６４９に開示される
）；血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）（欧州特許番号ＥＰ−５０６４７７
に開示される）；血管内皮増殖因子−２（ＶＥＧＦ−２）（国際出願公開番号Ｗ
Ｏ９６／３９５１５に開示される）；血管内皮増殖因子−Ｂ１８６（ＶＥＧＦ−
Ｂ１８６）（国際出願公開番号ＷＯ９６／２６７３６に開示される）；血管内皮
増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）（国際出願公開番号ＷＯ９８／０２５４３に開示
される）；血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）（国際出願公開番号ＷＯ９８
／０７８３２に開示される）；および血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）（
ドイツ国特許番号ＤＥ１９６３９６０１に開示される）。上記の参考文献は、本
明細書中に参考として援用される。In a further embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with an antigenic protein. Antigenic proteins that can be administered with the compositions of the present invention include, but are not limited to: Glioma-derived growth factor (GD
GF) (disclosed in European Patent No. EP-399816); Platelet-derived growth factor A (PDGF-A) (disclosed in European Patent No. EP-682110); Platelet-derived growth factor B (PDGF-B) (Europe) Placental growth factor (PlGF) (disclosed in International Application Publication No. WO 92/06194); placental growth factor-2 (PlGF-2) (Hauser et al., Gorwt).
h Factors, 4: 259-268 (1993)); Vascular endothelial growth factor (VEGF) (disclosed in International Application Publication No. WO 90/13649); Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) ( European Patent No. EP-506577
Vascular endothelial growth factor-2 (VEGF-2) (International Application Publication No. W
O96 / 39515); vascular endothelial growth factor-B186 (VEGF-
B186) (disclosed in International Application Publication No. WO 96/26736); Vascular endothelial growth factor-D (VEGF-D) (disclosed in International Application Publication No. WO 98/02543); Vascular endothelial growth factor-D (VEGF-D) D) (International application publication number WO98
/ 07832); and vascular endothelial growth factor-E (VEGF-E) (
German Patent No. DE19639601). The above references are incorporated herein by reference.

【０４２７】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、線維芽細胞増殖因子と組み合
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子と
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２
、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８
、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、Ｆ
ＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５。In a further embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with a fibroblast growth factor. Fibroblast growth factors that can be administered with the compositions of the present invention include, but are not limited to: FGF-1, FGF-2
, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8
, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, F
GF-14 and FGF-15.

【０４２８】 １つの実施形態において、本発明の組成物を、１つ以上のケモカインと組合せ
て投与する。特定の実施形態において、本発明の組成物を、γインターフェロン
誘導性タンパク質−１０（γＩＰ−１０）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、
血小板因子−４（ＰＦ４）、好中球活性化タンパク質（ＮＡＰ−２）、ＧＲＯ−
α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、好中球活性化合物ペプチド（ＥＮＡ−７８）、顆
粒球化学誘引タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、および間質性細胞由来因子−１（
ＳＤＦ−１、またはプレＢ細胞刺激因子（ＰＢＳＦ））；からなる群より選択さ
れるα（ＣｘＣ）ケモカインと；および／または、ＲＡＮＴＥＳ（活性化におい
て調節された、発現および分泌された正常Ｔ）、マクロファージ炎症性タンパク
質−１α（ＭＩＰ−１α）、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−
１β）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、単球走化性タンパク質−２
（ＭＣＰ−２）、単球走化性タンパク質−３（ＭＣＰ−３）、単球走化性タンパ
ク質−４（ＭＣＰ−４）、マクロファージ炎症性タンパク質−１γ（ＭＩＰ−１
γ）、マクロファージ炎症性タンパク質−３（ＭＩＰ−３α）、マクロファージ
炎症性タンパク質−３β（ＭＩＰ−３ β）、マクロファージ炎症性タンパク質
−４（ＭＩＰ−４／ＤＣ−ＣＫ−１／ＰＡＲＣ）、エオタキシン（ｅｏｔａｘｉ
ｎ）、エクソダス（Ｅｘｏｄｕｓ）、およびＩ−３０９、からなる群より選択さ
れるβ（ＣＣ）；および／またはγ（Ｃ）ケモカイン、リンホタクチン（ｌｙｍ
ｐｈｏｔａｃｔｉｎ）と組合せて投与する。In one embodiment, a composition of the invention is administered in combination with one or more chemokines. In certain embodiments, the composition of the present invention comprises gamma interferon-inducible protein-10 (γIP-10), interleukin 8 (IL-8),
Platelet factor-4 (PF4), neutrophil activating protein (NAP-2), GRO-
α, GRO-β, GRO-γ, neutrophil active compound peptide (ENA-78), granulocyte chemoattractant protein-2 (GCP-2), and stromal cell-derived factor-1 (
Α (CxC) chemokines selected from the group consisting of SDF-I, or pre-B cell stimulating factor (PBSF)); and / or RANTES (regulated, expressed and secreted normal T in activation) , Macrophage inflammatory protein-1α (MIP-1α), macrophage inflammatory protein-1β (MIP-
1β), monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), monocyte chemotactic protein-2
(MCP-2), monocyte chemotactic protein-3 (MCP-3), monocyte chemotactic protein-4 (MCP-4), macrophage inflammatory protein-1γ (MIP-1
γ), macrophage inflammatory protein-3 (MIP-3α), macrophage inflammatory protein-3β (MIP-3β), macrophage inflammatory protein-4 (MIP-4 / DC-CK-1 / PARC), eotaxin ( eotaxi
β) selected from the group consisting of: n), Exodus, and I-309; and / or γ (C) chemokines, lymphotactin (lym
(photoactin).

【０４２９】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、例えば、放射線療法のような
他の治療レジメンまたは予防レジメンと組み合わせて投与される。In a further embodiment, the compositions of the present invention are administered in combination with other therapeutic or prophylactic regimes, such as, for example, radiation therapy.

【０４３０】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。特定の実施形態において、
用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおけ
る使用について、連邦規制当局もしくは州政府により許可されたか、または米国
薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に収載されたことを意味する。[0430] The present invention also provides pharmaceutical compositions. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the compound, and a pharmaceutically acceptable carrier. In certain embodiments,
The term "pharmaceutically acceptable" is approved by a federal regulatory authority or state government for use in animals, and more particularly in humans, or listed in the United States Pharmacopeia or other generally accepted pharmacopoeias. Means that

【０４３１】 本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または
障害の処置、阻害および予防において効果的である本発明の化合物の量は、標準
的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じ
て、最適な投薬量の範囲の同定を補助するために使用され得る。処方において使
用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに
依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである
。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量応答曲線か
ら外挿され得る。The amount of a compound of the present invention that is effective in treating, inhibiting and preventing a disease or disorder associated with abnormal expression and / or activity of a polypeptide of the present invention can be determined by standard clinical techniques. . In addition, in vitro assays may optionally be employed to help identify optimal dosage ranges. The precise dose to be used in the formulation will also depend on the route of administration, and the seriousness of the disease or disorder, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient's circumstances. Effective doses can be extrapolated from dose-response curves obtained from in vitro or animal model test systems.

【０４３２】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体をより低い投薬量および頻度のより少ない投与で投
与することが、しばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量およ
び投与の頻度は、改変（例えば、脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）など）による
（例えば、脳への）抗体の取り込みおよび組織浸透を増強することにより減少さ
れ得る。For antibodies, the dosage administered to a patient is typically 0.1 mg / kg to 100 mg / kg of the patient's body weight. Preferably, the dosage administered to a patient is between 0.1 mg / kg and 20 mg / kg of the patient's body weight, more preferably between 1 mg / kg and 10 mg / kg of the patient's body weight. Generally, human antibodies have a longer half-life in the human body than antibodies from other species, due to the immune response to the foreign polypeptide. Thus, it is often possible to administer human antibodies at lower dosages and less frequent administration. Further, the dosage and frequency of administration of the antibodies of the present invention can be reduced by enhancing antibody uptake (eg, into the brain) and tissue penetration by modification (eg, lipidation, etc.). .

【０４３３】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて付随し得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the present invention. A notice in a format prescribed by a governmental agency regulating the manufacture, use or sale of pharmaceutical or biological products may optionally accompany such containers. This notice,
Reflects the agency's approval of manufacture, use or sale for human administration.

【０４３４】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患、障害および／または状態を検出、診
断またはモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出に
ついて提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を
使用して、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする
工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較
する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッ
セイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示
す。Diagnostics and Imaging Labeled antibodies that specifically bind to a polypeptide of interest, and derivatives and analogs thereof, are used for diagnostic purposes to detect abnormal expression and expression of a polypeptide of the invention. Diseases, disorders and / or conditions associated with / or activity may be detected, diagnosed or monitored. The present invention provides for the detection of abnormal expression of a polypeptide of interest, comprising the steps of (a) using one or more antibodies specific for the polypeptide of interest in a cell or body fluid of an individual. Assaying the expression of the polypeptide of the invention, and (b) comparing the gene expression level to the level of standard gene expression, whereby the assayed assay is compared to the standard expression level. An increase or decrease in the level of polypeptide gene expression indicates abnormal expression.

【０４３５】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。The present invention provides a diagnostic assay for diagnosing a disorder, the assay comprising:
a) assaying the expression of the polypeptide of interest in cells or body fluids of an individual using one or more antibodies specific for the polypeptide of interest; and (b) Comparing the level of gene expression, whereby an increase or decrease in the assayed polypeptide gene expression level compared to its standard expression level is indicative of a particular disorder. For cancer, the presence of relatively high amounts of transcripts in biopsy tissue from an individual may indicate a predisposition for the development of the disease, or provide a means for detecting the disease before the actual clinical symptoms appear. Can provide. A more conclusive diagnosis of this type may allow health professionals to use preventive measures, or allow early aggressive treatment, thereby preventing the development or further progression of cancer.

【０４３６】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベ
ント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適
切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例え
ば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１
２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム
（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミ
ノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、な
らびにビオチンが挙げられる。The antibodies of the present invention can be used to assay protein levels in biological samples using classical immunohistological methods known to those of skill in the art (eg, Jalk
anen et al. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985);
Jalkanen et al. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (
1987)). Other antibody-based methods useful for detecting protein gene expression include immunoassays, such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) and radioimmunoassays (RIAs). Suitable antibody assay labels are known in the art, and are enzymatic labels (eg, glucose oxidase); radioisotopes (eg, iodine (125I,
21I), carbon (14C), sulfur (35S), tritium (3H), indium (112In), and technetium (99Tc)); luminescent labels (eg, luminol); and fluorescent labels (eg, fluorescein and rhodamine); Biotin.

【０４３７】 本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結
合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与
後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；および
ｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバッ
クグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプ
チドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バック
グラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出さ
れた標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。One aspect of the present invention is the detection and diagnosis of a disease or disorder associated with aberrant expression of a polypeptide of interest in an animal, preferably a mammal, and most preferably a human. In one embodiment, the diagnosis comprises: a) administering to the subject (eg, parenterally, subcutaneously, or intraperitoneally) an effective amount of a labeled molecule that specifically binds the polypeptide of interest. B) to allow the labeled molecule to preferentially concentrate at the site in the subject where the polypeptide is expressed (and to remove unbound labeled molecule to background levels); A) waiting for a time interval after administration; c) determining a background level; and d) detecting a labeled molecule in the subject, such that the label exceeds the background level. Detection of an activating molecule indicates that the subject has a particular disease or disorder associated with abnormal expression of the polypeptide of interest. Background levels can be determined by a variety of methods, including comparing the amount of labeled molecule detected with standard values previously determined for a particular system.

【０４３８】 被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するため
に必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体
部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、約５〜
２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲である。次いで、標識された抗体または抗
体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。
インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒ
ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉ
ｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ
ｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編
、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）に記載される。It will be understood in the art that the size of the subject and the imaging system used will determine the amount of imaging moiety needed to generate a diagnostic image. In the case of a radioisotope moiety, for a human subject, the amount of radioactivity injected will usually be about 5-
It is in the range of 99 mTc of 20 millicuries. The labeled antibody or antibody fragment is then preferentially accumulated at locations in the cell that contain the particular protein.
In vivo tumor imaging is described by S.D. W. Burchiel et al., "Immunophar.
mackinetics of Radiolabeled Antibod
is and Their Fragments "(Tumor Image
ng: The Radiochemical Detection of Ca
Chapter 13, S.Ncer. W. Burchiel and B.A. A. Rhodes, Masson Publishing Inc. (1982).

【０４３９】 用いられる標識の型および投与の様式を含む、いくつかの可変要素に依存して
、標識された分子が被験体の部位に優先的に濃縮し、そして結合されていない標
識された分子がバックグラウンドレベルまで一掃されることを可能にする、投与
後の時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。
別の実施形態においては、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日
間である。Depending on several variables, including the type of label used and the mode of administration, the labeled molecule will preferentially concentrate at the site of the subject and the unbound labeled molecule Is between 6 and 48 hours or between 6 and 24 hours or between 6 and 12 hours after which administration can be cleared to background levels.
In another embodiment, the time interval after administration is 5-20 days or 5-10 days.

【０４４０】 １つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、その疾患また
は障害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最
初の診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。In one embodiment, monitoring a disease or disorder comprises repeating the method for diagnosing the disease or disorder (eg, 1 month after first diagnosis, 6 months after initial diagnosis, first diagnosis One year later).

【０４４１】 標識された分子の存在は、インビボ走査について当該分野において公知の方法
を用いて、患者から検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に依存
する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明
の診断方法において用いられ得る方法およびデバイスとしては、限定はされない
が、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影
法（ＰＥＴ）のような全身走査、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、および超音波診断法が
挙げられる。The presence of a labeled molecule can be detected from a patient using methods known in the art for in vivo scanning. These methods depend on the type of label used. One of skill in the art can determine the appropriate method for detecting a particular label. Methods and devices that can be used in the diagnostic methods of the invention include, but are not limited to, computerized tomography (CT), whole body scanning such as proton emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI). , And ultrasound diagnostics.

【０４４２】 特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射
線応答性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合
物で標識され、そして蛍光応答性の走査機器を用いて患者から検出される。別の
実施形態においては、この分子は陽電子放出金属で標識され、そして陽子射出断
層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）から検出される。さらに別の実施形態に
おいては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴映像（ＭＲＩ）を
用いて患者から検出される。In certain embodiments, the molecule is labeled with a radioisotope and detected from the patient using a radiation-responsive surgical instrument (Thurston et al., US Pat. No. 5,441,050). . In another embodiment, the molecule is labeled with a fluorescent compound and detected from the patient using a fluorescence-responsive scanning device. In another embodiment, the molecule is labeled with a positron emitting metal and is detected from the patient using proton emission tomography. In yet another embodiment, the molecule is labeled with a paramagnetic label and detected from the patient using magnetic resonance imaging (MRI).

【０４４３】 （キット） 本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。１つの実施形
態においては、キットは、１以上の容器中に、本発明の抗体（好ましくは精製さ
れた抗体）を備える。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキッ
トに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に分離
されたポリペプチドを備える。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプ
チドと反応しないコントロール抗体を、さらに備える。別の特定の実施形態にお
いては、本発明のキットは、目的のポリペプチドとの抗体の結合（例えば、この
抗体は、検出可能な基質（例えば、抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合
物または発光化合物）と結合体化され得るか、あるいは第一の抗体を認識する第
二の抗体は、検出可能な基質と結合体化され得る）を検出するための手段を備え
る。(Kit) The present invention provides a kit that can be used in the above method. In one embodiment, the kit comprises an antibody (preferably a purified antibody) of the invention in one or more containers. In certain embodiments, a kit of the invention comprises a substantially isolated polypeptide comprising an epitope that is specifically immunoreactive with the antibodies contained in the kit. Preferably, the kit of the present invention further comprises a control antibody that does not react with the polypeptide of interest. In another specific embodiment, the kits of the present invention provide for the binding of an antibody to a polypeptide of interest (eg, the antibody is a detectable substrate (eg, the antibody is a fluorescent compound, an enzyme substrate, a radioactive compound or (A second antibody that can be conjugated with a luminescent compound) or that recognizes the first antibody can be conjugated to a detectable substrate).

【０４４４】 本発明の別の特定の実施形態においては、このキットは、増殖性および／また
は癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清
をスクリーニングする際に用いる診断用キットである。このようなキットは、目
的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキット
は、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性であるエピ
トープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。さらに、この
ようなキットは、この抗体の抗原への結合（例えば、この抗体は、フローサイト
メトリーにより検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光化
合物と結合体化され得る）を検出するための手段を備える。特定の実施形態にお
いては、このキットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に
合成されたポリペプチド抗原を備え得る。このキットのポリペプチド抗原はまた
、固体支持体に付着され得る。In another specific embodiment of the invention, the kit is used for screening diagnostic sera containing antibodies specific for proliferative and / or cancerous polynucleotides and polypeptides. It is a kit. Such a kit can include a control antibody that does not react with the polypeptide of interest. Such a kit may comprise a substantially isolated polypeptide antigen comprising an epitope specifically immunoreactive with at least one anti-polypeptide antigen antibody. In addition, such kits can be used to detect binding of the antibody to an antigen (eg, the antibody can be conjugated to a fluorescent compound such as fluorescein or rhodamine, which can be detected by flow cytometry). Means. In certain embodiments, the kit may comprise a recombinantly produced polypeptide antigen or a chemically synthesized polypeptide antigen. The polypeptide antigens of the kit can also be attached to a solid support.

【０４４５】 より特定の実施形態においては、上記のキットの検出手段は、このポリペプチ
ド抗原が付着される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識抗ヒト抗体を備える。この実施形態においては、抗体のポリペプチド抗
原との結合はこのレポーター標識抗体の結合により検出され得る。In a more particular embodiment, the detection means of the above kit comprises a solid support to which the polypeptide antigen is attached. Such kits also include a non-attached reporter-labeled anti-human antibody. In this embodiment, binding of the antibody to the polypeptide antigen can be detected by binding of the reporter-labeled antibody.

【０４４６】 さらなる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む
血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットを含む。この診断用キットは
、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である、実質
的に単離された抗体、およびこのポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の抗
体との結合を検出する手段を備える。１つの実施形態においては、この抗体は、
固体支持体に付着される。特定の実施形態においては、この抗体は、モノクロナ
ール抗体であり得る。このキットの検出手段は、第二の標識されたモノクロナー
ル抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識された、競
合抗原を含み得る。In a further embodiment, the present invention includes a diagnostic kit for use in screening serum containing an antigen of a polypeptide of the present invention. The diagnostic kit comprises a substantially isolated antibody that is specifically immunoreactive with a polypeptide or polynucleotide antigen, and means for detecting binding of the polynucleotide or polypeptide antigen to the antibody. . In one embodiment, the antibody is:
Attached to a solid support. In certain embodiments, the antibodies can be monoclonal antibodies. The detection means of the kit may include a second labeled monoclonal antibody. Alternatively or additionally, the detection means may include a labeled, competitor antigen.

【０４４７】 １つの診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法により得られる表面
結合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ
、そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合す
る抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、この試
薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。この試薬は、結合されない標識抗
体を除去するため、再び洗浄され、そしてこの試薬と会合したレポーターの量が
決定される。代表的には、レポーターは、適切な蛍光測定基質、発光基質または
比色基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、この固相をイン
キュベートすることにより検出される酵素である。In one diagnostic configuration, a test serum is reacted with a solid phase reagent having a surface-bound antigen obtained by a method of the invention. After binding specific antigen-antibody to the reagent and removing unbound serum components by washing, depending on the amount of anti-antigen antibody bound on the solid support, to bind the reporter to the reagent, This reagent is reacted with a reporter-labeled anti-human antibody. The reagent is washed again to remove unbound labeled antibody and the amount of reporter associated with the reagent is determined. Typically, a reporter is an enzyme that is detected by incubating this solid phase in the presence of a suitable fluorometric, luminescent or colorimetric substrate (Sigma, St. Louis, MO).

【０４４８】 上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（
例えば、高分子ビーズ、計深棒、９６ウェルプレートまたは濾過材料）に付着さ
せるための公知の技術により調製される。これらの付着方法としては、一般的に
、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に活性な
基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）と
のタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（代表的
には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンで
コートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。[0448] The solid surface reagents in the above assays were prepared by converting the protein material to a solid support material (
For example, prepared by known techniques for attachment to polymeric beads, dipsticks, 96-well plates or filtration materials). These methods of attachment generally include non-specific adsorption of proteins to a support or chemically active groups (eg, activated carboxyl, hydroxyl, or aldehyde groups) on a solid support. Covalent attachment of the protein (typically via a free amine group). Alternatively, streptavidin-coated plates can be used with biotinylated antigen.

【０４４９】 従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供
する。このキットは、一般的に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト
抗体を備える。Thus, the present invention provides an assay system or kit for performing this diagnostic method. The kit generally comprises a support having a surface-bound recombinant antigen, and a reporter-labeled anti-human antibody for detecting the surface-bound anti-antigen antibody.

【０４５０】 （染色体アッセイ） 本発明の核酸配列はまた、染色体同定に有用である。この配列は、個々のヒト
染色体における特定の位置に特異的に標的化され、そしてハイブリダイズし得る
。本発明による染色体へのＤＮＡのマッピングは、それらの配列を、疾患に関連
した遺伝子と相関づけることにおいて重要な第一歩である。Chromosome Assays The nucleic acid sequences of the present invention are also useful for chromosome identification. This sequence is specifically targeted to specific locations on individual human chromosomes and is capable of hybridizing. Mapping of DNA to chromosomes according to the present invention is an important first step in correlating those sequences with disease-related genes.

【０４５１】 この点における特定の好ましい実施形態において、本明細書中で開示されるｃ
ＤＮＡおよび／またはポリヌクレオチドは、ＤＲ５遺伝子のゲノムＤＮＡをクロ
ーニングするために用いられる。これは、一般的に入手可能である、種々の周知
の技術およびライブラリーを用いて達成され得る。次いで、この目的のために周
知の技術を用いて、インサイチュ染色体マッピングのためにゲノムＤＮＡが用い
られる。In certain preferred embodiments in this regard, c disclosed herein.
The DNA and / or polynucleotide is used to clone the genomic DNA of the DR5 gene. This can be accomplished using a variety of well-known techniques and libraries that are commonly available. The genomic DNA is then used for in situ chromosome mapping, using techniques well known for this purpose.

【０４５２】 さらに、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂ
ｐ）を調製することにより、染色体にマッピングされ得る。遺伝子の３’非翻訳
領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおいて１つを超えるエキソ
ンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、従って、増幅プロセスを複雑化す
る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブ
リッドのＰＣＲスクリーニングのために用いられる。In addition, the sequence can be obtained from the cDNA by PCR primers (preferably 15-25b
By preparing p), it can be mapped to a chromosome. Computer analysis of the 3 'untranslated region of the gene is used to rapidly select primers that do not span more than one exon in genomic DNA, thus complicating the amplification process. These primers are then used for PCR screening of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes.

【０４５３】 中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）へのｃＤＮＡの蛍光インサイチュハイ
ブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）は、一工程で、正確な染色***置を提供す
るために用いられ得る。この技術は、５０または６０ｂｐ程度の短さのｃＤＮＡ
由来のプローブと共に用いられ得る。この技術の概説については、Ｖｅｒｍａら
、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（
１９８８）を参照のこと。Fluorescence in situ hybridization (“FISH”) of the cDNA to a metaphase chromosome spread can be used in one step to provide the exact chromosomal location. This technique uses cDNAs as short as 50 or 60 bp.
It can be used with probes from origin. For a review of this technology, see Verma et al., Human Chromosomes: A Manual Of Basic.
Techniques, Pergamon Press, New York (
1988).

【０４５４】 一旦、配列が正確な染色***置にマッピングされると、染色体上の配列の物理
学的な位置は、遺伝子マップデータと相関づけられ得る。このようなデータは、
例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ
Ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌ
ｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）に見
出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関
連が、連鎖分析（物理学的に隣接した遺伝子の共同遺伝）によって同定される。Once the sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical location of the sequence on the chromosome can be correlated with genetic map data. Such data,
For example, V. McKusick, Mendelian Inheritance
In Man (Johns Hopkins University, Wel)
ch, available online from the Medical Library). The association between the gene and the disease mapped to the same chromosomal region is then identified by linkage analysis (co-inheritance of physically adjacent genes).

【０４５５】 次に、罹患個体と非罹患個体との間でのｃＤＮＡまたはゲノム配列における差
異を決定することが必要である。罹患個体のいくらかまたは全てにおいて変異が
認められるが、いずれの正常個体でも認められない場合、変異は、疾患の原因因
子のようである。Next, it is necessary to determine the differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals. If the mutation is found in some or all of the affected individuals but not in any of the normal individuals, then the mutation is likely a causative agent of the disease.

【０４５６】 本発明に一般的に記載されるように、以下の実施例を参照することにより、本
発明は、より容易に理解されるが、以下の実施例は、例示の目的で提供され、限
定として意図されない。While the present invention will be more readily understood by reference to the following examples, as generally described in the present invention, the following examples are provided for illustrative purposes, Not intended as a limitation.

【０４５７】 （実施例１） （Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現と精製） 寄託したｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号９７９２０）の成熟ＤＲ５タンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列を、ＤＲ５タンパク質のアミノ末端配列、および遺伝子の３’
側のベクター配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅
する。クローニングを容易にするための制限酵素部位を含むさらなるヌクレオチ
ドを、５’および３’配列にそれぞれ加える。Example 1 Expression and Purification in E. coli The DNA sequence encoding the mature DR5 protein of the deposited cDNA (ATCC No. 97920) was replaced with the amino-terminal sequence of the DR5 protein and 3 ′ of the gene.
Amplify using PCR oligonucleotide primers specific to the side vector sequence. Additional nucleotides containing restriction sites to facilitate cloning are added to the 5 'and 3' sequences, respectively.

【０４５８】 以下のプライマーを、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＲ５細胞外ドメインの発現に用いる：
５’プライマーは、以下の配列：The following primers were used For expression of the E. coli DR5 extracellular domain:
The 5 'primer has the following sequence:

【０４５９】[0459]

【化８】 を有し、そして下線を付したＮｃｏＩ部位を含み：ならびに３’プライマーは、
以下の配列：Embedded image And contains an underlined NcoI site:
The following array:

【０４６０】[0460]

【化９】 を有し、そして下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。Embedded image And includes an underlined HindIII site.

【０４６１】 制限部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ６０中の制限酵素部位に好都合であり、
これらは、本実施例における細菌発現に用いられる。（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．
９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１
）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐr」）をコードし、そ
して細菌複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、およびリボゾ
ーム結合部位（「ＲＢＳ」）を含む。The restriction sites are convenient for restriction enzyme sites in the bacterial expression vector pQE60,
These are used for bacterial expression in this example. (Qiagen, Inc.
9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311.
). pQE60 encodes ampicillin antibiotic resistance ("Amp r ") and contains a bacterial origin of replication ("ori"), an IPTG-inducible promoter, and a ribosome binding site ("RBS").

【０４６２】 増幅したＤＲ５ ＤＮＡおよびベクターｐＱＥ６０の両方を、ＮｃｏＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで、消化したＤＮＡをお互いに連結した。ＤＲ５
タンパク質ＤＮＡの制限化ｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、ベクターのＩＰＴＧ
−誘導性プロモーターの下流にかつ作動可能に連結させて、そしてＤＲ５タンパ
ク質の翻訳のために適切に配置した開始ＡＵＧにインフレームで、ＤＲ５タンパ
ク質コード領域を配置する。[0462] Both the amplified DR5 DNA and the vector pQE60 were digested with NcoI and HindIII, and the digested DNAs were then ligated together. DR5
Insertion of the protein DNA into the restricted pQE60 vector was performed by
-Placing the DR5 protein coding region in frame with the starting AUG, which is operably linked downstream of the inducible promoter and is appropriately positioned for translation of the DR5 protein.

【０４６３】 連結混合物を、標準的な手順を使用して、コンピテントなＥ．Ｃｏｌｉ細胞に
形質転換する。このような手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている。Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｍ１５／ｒｅｐ４株（複数のコピーのプラスミドｐＲＥＰ４を含有し
、ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎr」）を与
える）が、本明細書中に記載の例示的な実施例を実施することにおいて使用され
る。この株は、ＤＲ５タンパク質の発現に適した多くのうちの唯一の１つであり
、Ｑｉａｇｅｎ（前出）から市販されている。The ligation mixture was transformed into competent E. coli using standard procedures. Transform E. coli cells. Such a procedure is described in Sambrook et al., Molecular.
Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition; Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.M. Y. (1989). E. FIG.
The E. coli strain M15 / rep4, which contains multiple copies of the plasmid pREP4, expresses the lac repressor, and confers kanamycin resistance ("Kan r "), has been described in the illustrative examples described herein. Used in implementing. This strain is one of many suitable for expressing the DR5 protein and is commercially available from Qiagen (supra).

【０４６４】 形質転換体は、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下におけるＬＢプレー
ト上で増殖するそれらの能力によって同定される。プラスミドＤＮＡは耐性コロ
ニーから単離され、そしてクローン化ＤＮＡの正体は制限分析、ＰＣＲ、および
ＤＮＡ配列決定によって確認される。[0464] Transformants are identified by their ability to grow on LB plates in the presence of ampicillin and kanamycin. Plasmid DNA is isolated from resistant colonies and the identity of the cloned DNA is confirmed by restriction analysis, PCR, and DNA sequencing.

【０４６５】 所望の構築物を含有するクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およ
びカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中での液体培養に
おいて、一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させる。このＯ／Ｎ培養物を、約１：１００〜
１：２５０の希釈で多くの培養物を接種するために使用する。細胞を、６００ｎ
ｍでの光学密度（「ＯＤ６００」）が０．４と０．６との間になるまで増殖させ
る。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）
を最終濃度１ｍＭまで添加し、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより
、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞を、続け
てさらに３〜４時間インキュベートする。Clones containing the desired construct are grown overnight (“O / N”) in liquid culture in LB medium supplemented with both ampicillin (100 μg / ml) and kanamycin (25 μg / ml). . The O / N culture is prepared at about 1: 100-
Used to inoculate many cultures at a dilution of 1: 250. 600 n cells
Grow until the optical density at m ("OD600") is between 0.4 and 0.6. Then, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (“IPTG”)
Is added to a final concentration of 1 mM to induce transcription from the lac repressor sensitive promoter by inactivating the lacI repressor. The cells are subsequently incubated for a further 3-4 hours.

【０４６６】 次いで、細胞を、標準的な方法を使用して、遠心分離により採取し、そして破
壊する。封入体を破壊細胞から慣用的な採集技術を使用して精製し、そしてタン
パク質を封入体から８Ｍ尿素に可溶化する。可溶化タンパク質を含有する８Ｍ尿
素溶液を、２×リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中でＰＤ−１０カラムに
通し、それにより尿素を除去し、緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再折畳み
させる。このタンパク質をクロマトグラフィーのさらなる段階によって精製し、
エンドトキシンを除去する。次いで、これを滅菌濾過する。滅菌濾過されたタン
パク質調製物を、９５μｇ／ｍｌの濃度で２×ＰＢＳ中に保存する。The cells are then harvested by centrifugation and disrupted using standard methods. The inclusion bodies are purified from the disrupted cells using conventional harvesting techniques, and the protein is solubilized from the inclusion bodies in 8M urea. The 8M urea solution containing the solubilized protein is passed over a PD-10 column in 2x phosphate buffered saline ("PBS"), thereby removing the urea, replacing the buffer, and removing the protein. Let it refold. The protein is purified by a further step of chromatography,
Remove endotoxin. This is then sterile filtered. The sterile filtered protein preparation is stored in 2 × PBS at a concentration of 95 μg / ml.

【０４６７】 （実施例２） （哺乳動物細胞における発現） 代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（ｍＲＮＡの転写
の開始を媒介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物
のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エン
ハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、ならびにＲＮＡスプライシングのためのドナー部位
およびアクセプター部位に隣接する介在配列が挙げられる。非常に効率的な転写
を、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来の長末端
反復（ＬＴＲ）（例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）ならびにサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成し得る。しかし、細胞性
エレメントもまた使用され得る（例えば、ヒトアクチンプロモーター）。本発明
の実施における使用に適切な発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶＬおよびｐ
ＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶ
ｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）
、ならびにｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターが挙げら
れる。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトＨｅｌａ細胞、２９３細胞
、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細
胞、Ｃｏｓ１細胞、Ｃｏｓ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マ
ウスＬ細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−細胞が挙げられ
る。Example 2 Expression in Mammalian Cells Representative mammalian expression vectors include promoter elements (which mediate the initiation of transcription of mRNA), protein coding sequences, and polyadenylation of transcription termination and transcripts. Includes signals required for transformation. Additional elements include enhancers, Kozak sequences, and intervening sequences flanking donor and acceptor sites for RNA splicing. Highly efficient transcription was achieved using the early and late promoters from SV40, the long terminal repeat (LTR) from retroviruses (eg, RSV, HTLVI, HIVI) and the early promoter of cytomegalovirus (CMV). obtain. However, cellular elements can also be used (eg, the human actin promoter). Expression vectors suitable for use in the practice of the present invention include, for example, pSVL and pSVL.
MSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSV
cat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146)
And vectors such as pBC12MI (ATCC 67109). Mammalian host cells that can be used include human Hela cells, 293 cells, H9 cells and Jurkat cells, mouse NIH3T3 cells and C127 cells, Cos1 cells, Cos7 cells and CV1 cells, quail QC1-3 cells, mouse L cells, and Chinese hamster ovary (CHO) -cells.

【０４６８】 あるいは、目的の遺伝子は、染色体に組み込まれるその遺伝子を含む安定な細
胞株において発現され得る。選択マーカー（例えば、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマ
イシン、ハイグロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェク
トされた細胞の同定および単離を可能にする。Alternatively, the gene of interest can be expressed in a stable cell line that contains the gene that integrates into the chromosome. Co-transfection with a selectable marker (eg, dhfr, gpt, neomycin, hygromycin) allows identification and isolation of the transfected cells.

【０４６９】 トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて大量のコードされたタンパ
ク質を発現し得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的の
遺伝子の数百または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用である。
別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒ
ｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅ
ｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（
１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において
増殖させ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色
体に組み込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。The transfected gene can also be amplified to express large amounts of the encoded protein. DHFR (dihydrofolate reductase) markers are useful for developing cell lines with hundreds or thousands of copies of the gene of interest.
Another useful selectable marker is the enzyme glutamine synthase (GS) (Mur
phy et al., Biochem J .; 227: 277-279 (1991); Be.
Bobington et al., Bio / Technology 10: 169-175 (
1992)). Using these markers, mammalian cells are grown in selective media and cells with the highest resistance are selected. These cell lines contain the amplified gene integrated into the chromosome. Chinese hamster ovary (CH
O) Cells are often used for the production of proteins.

【０４７０】 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモータ
ー（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４３８−４４７（１９８５年３月））およびＣＭＶ−エ
ンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３
０（１９８５））を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位
ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８を有する）は、目的の遺伝子のクロ
ーニングを容易にする。ベクターはさらに、ラットプレプロインシュリン遺伝子
の３'イントロン、ポリアデニル化、および終結シグナルを含む。The expression vectors pC1 and pC4 are compatible with the Rous sarcoma virus strong promoter (LTR) (Cullen et al., Molecular and Cellula).
r Biology, 438-47 (March 1985)) and fragments of the CMV-enhancer (Boshart et al., Cell 41: 521-53).
0 (1985)). Multiple cloning sites (eg, having restriction sites BamHI, XbaI, and Asp718) facilitate cloning of the gene of interest. The vector further contains the 3 'intron, polyadenylation, and termination signal of the rat preproinsulin gene.

【０４７１】 （クローニングおよびＣＨＯ細胞における発現） ベクターｐＣ４を、ＤＲ５ポリペプチドの発現のために使用する。プラスミド
ｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘
導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下で、マウス
ＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ
葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学療
法剤メトトレキサート（ＭＴＸ）を補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖させることによって選択され
得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の
増幅は、よく考証されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．，Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ
．Ｍ．，Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ
．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，
１０９７：１０７−１４３（１９９０）；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎ
ｈａｍ，Ｍ．Ａ．１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１
９９１）を参照のこと）。漸増濃度のＭＴＸにおける細胞増殖は、ＤＨＦＲ遺伝
子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することによって薬物への
耐性を生じる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結される場合、通常、同時増
幅され、そして過剰発現される。増幅した遺伝子の１，０００を超えるコピーを
有する細胞株を開発するためにこのアプローチを使用し得ることは、当該分野に
おいて公知である。続いて、メトトレキサートが取り除かれる場合、宿主細胞の
１つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。Cloning and Expression in CHO Cells The vector pC4 is used for expression of the DR5 polypeptide. Plasmid pC4 is a derivative of plasmid pSV2-dhfr (ATCC Accession No. 37146). This plasmid contains the mouse DHFR gene under the control of the SV40 early promoter. Chinese hamster ovary cells or other cells lacking dihydrofolate activity transfected with these plasmids are selected from selective media (α minus MEM, Li) supplemented with the chemotherapeutic agent methotrexate (MTX).
fe Technologies). Amplification of the DHFR gene in cells that are resistant to methotrexate (MTX) has been well documented (eg, Alt, FW, Kellems, R
. M. , Bertino, J. et al. R. And Schimke, R .; T. , J. et al. Bi
ol. Chem. 253: 1357-1370 (1978); Hamlin, J.
. L. And Ma, C.I. , Biochem. et Biophys. Acta,
1097: 107-143 (1990); Page, M .; J. And Syden
ham, M .; A. 1991, Biotechnology 9: 64-68 (1
991)). Cell growth at increasing concentrations of MTX results in resistance to the drug by overproducing the target enzyme DHFR as a result of amplification of the DHFR gene. When a second gene is linked to a DHFR gene, it is usually co-amplified and overexpressed. It is known in the art that this approach can be used to develop cell lines with more than 1,000 copies of the amplified gene. Subsequently, if the methotrexate is removed, a cell line is obtained that contains the amplified gene integrated into one or more chromosomes of the host cell.

【０４７２】 プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルスの長
末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：４３８−４４７ （１９
８５年３月））、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子の
エンハンサーから単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１
：５２１−５３０（１９８５））を含む。プロモーターの下流には、遺伝子の組
み込みを可能にする以下の単一の制限酵素切断部位、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよ
びＡｓｐ７１８が存在する。これらのクローニング部位の後ろに、プラスミドは
、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位
を含む。他の高効率プロモーターもまた、発現のために使用され得る（例えば、
ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、または
他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）。
ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系ならびに同
様の系は、哺乳動物細胞において調節された方法でＤＲ５ポリペプチドを発現す
るために使用され得る（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１（１９
９２））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成
長ホルモン由来またはグロビン遺伝子由来）も同様に使用され得る。Plasmid pC4 contains a strong promoter for the Rous sarcoma virus long terminal repeat (LTR) (Cullen et al., Molecula) for expression of the gene of interest.
r and Cellular Biology 5: 438-47 (19
March 1985)), and a fragment isolated from an enhancer of the immediate early gene of human cytomegalovirus (CMV) (Boshart et al., Cell 41).
: 521-530 (1985)). Downstream of the promoter are the following single restriction enzyme cleavage sites, BamHI, XbaI and Asp718, which allow for gene integration. Behind these cloning sites, the plasmid contains the 3 'intron and polyadenylation site of the rat preproinsulin gene. Other high efficiency promoters can also be used for expression (eg,
Human β-actin promoter, SV40 early or late promoter, or long terminal repeats from other retroviruses (eg, HIV and HTLVI).
Clontech's Tet-Off and Tet-On gene expression systems and similar systems can be used to express DR5 polypeptides in a regulated manner in mammalian cells (Gossen, M., and Bujard, H., et al. Pr
oc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 89: 5547-5551 (19
92)). For polyadenylation of mRNA, other signals, such as from human growth hormone or from the globin gene, can be used as well.

【０４７３】 染色体に組み込まれた目的の遺伝子を保有する安定な細胞株もまた、選択マー
カー（例えば、ｇｐｔ、Ｇ４１８、またはヒグロマイシン）と同時トランスフェ
クションする際に選択し得る。開始時に１つより多い選択マーカー（例えば、Ｇ
４１８およびメトトレキサート）を使用することは有利である。Stable cell lines that carry the gene of interest integrated into the chromosome may also be selected for co-transfection with a selectable marker (eg, gpt, G418, or hygromycin). At the start, more than one selectable marker (eg, G
418 and methotrexate) are advantageous.

【０４７４】 プラスミドｐＣ４を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いでウシ腸ホスフェート
を使用して、当該分野で公知の手順により脱リン酸化する。次いで、ベクターを
１％アガロースゲルから単離する。The plasmid pC4 is digested with the restriction enzyme BamHI and then dephosphorylated using bovine intestinal phosphate by procedures known in the art. The vector is then isolated from a 1% agarose gel.

【０４７５】 完全なポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列を、遺伝子の所望の部分の５’お
よび３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅す
る。下線を付したＢａｍＨＩ部位、Ｋｏｚａｋ配列、およびＡＵＧ開始コドンを
含む５’プライマーは、以下の配列を有する： ５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＧＧＧＧＡＣＡＧ
ＡＡＣ−３’（配列番号１０）。 下線を付したＡｓｐ７１８部位を含む３’プライマーは、以下の配列を有する：
５’−ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧＴＣ−３’（配列
番号１１）。The DNA sequence encoding the complete polypeptide is amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of the desired portion of the gene. The 5 'primer containing the underlined BamHI site, Kozak sequence, and AUG start codon has the following sequence: 5'-CGC GGATCC GCCATCATGGAACAACGGGGACAG
AAC-3 '(SEQ ID NO: 10). The 3 'primer containing the underlined Asp718 site has the following sequence:
5′-CGC GGTAC TTAGGACATGGCAGAGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 11).

【０４７６】 増幅されたフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１
８で消化し、次いで、１％アガロースゲル上で再び精製する。次いで、単離した
フラグメントおよび脱リン酸化したベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結す
る。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転
換し、そしてプラスミドｐＣ４に挿入したフラグメントを含有する細菌を、例え
ば、制限酵素分析を使用して同定する。The amplified fragment was digested with the endonucleases BamHI and Asp71.
Digest at 8, then re-purify on a 1% agarose gel. The isolated fragment and the dephosphorylated vector are then ligated with T4 DNA ligase. Then, E. E. coli HB101 or XL-1 Blue cells are transformed and bacteria containing the fragment inserted into plasmid pC4 are identified using, for example, restriction enzyme analysis.

【０４７７】 活性ＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフ
ェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェクチ
ン法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を使用して、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎ
ｅｏと同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択マ
ーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対する耐性を付与する酵素をコードす
るＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充
したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そして１
０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４
１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート（Ｇ
ｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日後、単一のクロー
ンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１０
０ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウェルペトリ皿ま
たは１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖
するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、
１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、１０
０〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所望の遺伝
子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって
、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。[0477] Chinese hamster ovary cells lacking the active DHFR gene are used for transfection. 5 μg of the expression plasmid pC4 was combined with 0.5 μg of the plasmid pSVn using the lipofectin method (Felgner et al., Supra).
Co-transfect with eo. Plasmid pSV2-neo contains a dominant selectable marker (the neo gene from Tn5 encoding an enzyme that confers resistance to a group of antibiotics, including G418). Cells are seeded in α-min MEM supplemented with 1 mg / ml G418. Two days later, the cells are trypsinized and
0, 25 or 50 ng / ml methotrexate and 1 mg / ml G4
Hybridoma cloning plate (G
reiner, Germany). After about 10-14 days, a single clone was trypsinized and then different concentrations of methotrexate (50 nM, 10
(0 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) into 6-well petri dishes or 10 ml flasks. The clones growing at the highest concentration of methotrexate were then replaced with higher concentrations of methotrexate (1 μM, 2 μM, 5 μM,
(10 mM, 20 mM). Do the same for 10
Repeat until a clone is obtained that grows at a concentration of 0-200 μM. The expression of the desired gene product is analyzed, for example, by SDS-PAGE and Western blot or by reverse phase HPLC analysis.

【０４７８】 （ＣＯＳ細胞でのクローニングおよび発現） 発現プラスミドｐＤＲ５−ＨＡを、ＤＲ５タンパク質の可溶性細胞外ドメイン
をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐまたはｐｃＤＮＡ
ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．から入手可能）中にクローニングする
ことにより作製する。発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは以下を含む：（１）
Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の原核生物細胞での増殖に有効なＥ．ｃｏｌｉ複製起点；
（２）プラスミド含有原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（
３）真核生物細胞での増殖のためのＳＶ４０複製起点；（４）ｃＤＮＡが都合良
くＣＭＶプロモーターの発現制御下に置かれ、そしてポリリンカー中の制限部位
によりＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結し得
るように配置された、ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０、およびポ
リアデニル化シグナル。その３’末端にインフレームで融合したＤＲ５ポリぺプ
チドの細胞外ドメインおよびＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメントを、組換
えタンパク質発現がＣＭＶプロモーターによって指向されるように、ベクターの
ポリリンカー領域にクローニングする。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ
３７：７６７（１９８４）により記載されるインフルエンザ赤血球凝集素タン
パク質由来のエピトープに対応する。標的タンパク質へのＨＡタグの融合により
、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いて組換えタンパク質の検出と回収が容易
になる。(Cloning and Expression in COS Cells) The expression plasmid pDR5-HA was replaced with the cDNA encoding the soluble extracellular domain of the DR5 protein, using the expression vector pcDNAI / Amp or pcDNA.
III (available from Invitrogen, Inc.). The expression vector pcDNAI / amp contains: (1)
E. FIG. E. coli effective for growth in E. coli and other prokaryotic cells. coli origin of replication;
(2) ampicillin resistance gene for selection of prokaryotic cells containing the plasmid; (
3) SV40 origin of replication for growth in eukaryotic cells; (4) the cDNA is conveniently placed under expression control of the CMV promoter and is operable by restriction sites in the polylinker to the SV40 intron and polyadenylation signal. CMV promoter, polylinker, SV40, and polyadenylation signal, arranged so that they can be linked to The DNA fragment encoding the extracellular domain of the DR5 polypeptide and the HA tag fused in-frame to its 3 'end is cloned into the polylinker region of the vector such that recombinant protein expression is driven by the CMV promoter. . HA tags are described in Wilson et al., Cell.
37: 767 (1984), corresponding to the epitope from the influenza hemagglutinin protein. Fusion of the HA tag to the target protein facilitates detection and recovery of the recombinant protein using an antibody that recognizes the HA epitope.

【０４７９】 プラスミド構築ストラテジーは、以下の通りである。寄託プラスミドのＤＲ５
ｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉでのＤＲ５の発現のためのベクター構築について上
で詳しく記載した都合の良い制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。[0479] The plasmid construction strategy is as follows. Deposited plasmid DR5
The cDNA was obtained from E. coli. Amplification is performed using primers containing convenient restriction sites as detailed above for vector construction for expression of DR5 in E. coli.

【０４８０】 発現されたＤＲ５の検出、精製、および特徴付けを容易にするために、プライ
マーの１つは、上記のように赤血球凝集素タグ（「ＨＡタグ」）を含む。To facilitate the detection, purification, and characterization of the expressed DR5, one of the primers includes a hemagglutinin tag (“HA tag”) as described above.

【０４８１】 好適なプライマーとしては、この実施例で使用される以下のものがあげられる
。下線のＢａｍＨＩ部位を含む５’プライマーは、以下の配列を有する：５’−
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＧＧＧＧＡＣＡＧＡＡＣ
−３’（配列番号１０）。下線を付したＡｓｐ７１８制限配列を含む３’プライ
マーは、以下の配列を有する：５’−ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＣＣＴＧＡＴ
ＴＣＴＴＴＴＧＧＡＣ−３’（配列番号１２）。Suitable primers include the following used in this example. The 5 'primer containing the underlined BamHI site has the following sequence: 5'-
CGC GGATCC GCCATCATGGGAACAACGGGGACAGAAC
-3 '(SEQ ID NO: 10). The 3 'primer containing the underlined Asp718 restriction sequence has the following sequence: 5'-CGC GGTACTC TTAGCCTGAT
TCTTTTGGAC-3 '(SEQ ID NO: 12).

【０４８２】 ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメント、およびベクター、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、
ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、次いで連結する。連結混合物を、Ｅ．
ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ
、１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏ
ｌｌａ，ＣＡ ９２０３７から入手可能）に形質転換し、形質転換した培養物を
アンピシリン培地プレートにプレートし、次いでこれをインキュベートしてアン
ピシリン耐性コロニーを増殖させる。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離
し、そして制限分析またはその他の手段により、ＤＲ５ポリぺプチドの細胞外ド
メインをコードするフラグメントの存在について試験する。The PCR amplified DNA fragment and the vector, pcDNAI / Amp,
Digest with BamHI and Asp718 and then ligate. The ligation mixture is
E. coli strain SURE (Stratagene Cloning Systems)
, 11099 North Torrey Pines Road, La Jo
Ila, CA 92037), and the transformed culture is plated on ampicillin media plates, which are then incubated to grow ampicillin-resistant colonies. Plasmid DNA is isolated from resistant colonies and tested for the presence of a fragment encoding the extracellular domain of the DR5 polypeptide by restriction analysis or other means.

【０４８３】 組換えＤＲ５の発現のために、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されるように、ＤＥＡＥ−
ＤＥＸＴＲＡＮを用いて、上述のように、ＣＯＳ細胞を発現ベクターでトランス
フェクトする。細胞を、このベクターによるＤＲ５の発現の条件下でインキュベ
ートする。For expression of recombinant DR5, see, eg, Sambrook et al., Molecul.
ar Cloning: a Laboratory Manual, Cold
Spring Laboratory Press, Cold Spring
As described in Harbor, New York (1989), DEAE-
Using DEXTRAN, COS cells are transfected with the expression vector as described above. The cells are incubated under conditions for expression of DR5 by this vector.

【０４８４】 ＤＲ５−ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載の方法を用い
て、放射標識および免疫沈降法により検出する。この目的のため、トランスフェ
クションの２日後、細胞を35Ｓ−システイン含有培地で８時間インキュベートす
ることにより標識する。上述のＷｉｌｓｏｎらにより記載されるように、細胞お
よび培地を回収し、そして細胞を洗浄し、そして界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液
：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０
、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５で溶解する。タンパク質を
、ＨＡ特異的モノクロナール抗体を用い、細胞溶解物および培養培地から沈殿さ
せる。次いで、沈殿させたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオ
グラフィーにより分析する。期待されるサイズの発現産物は細胞溶解物中に見い
だされ、ネガティブコントロールには見いだされない。The expression of a DR5-HA fusion protein can be determined, for example, by using Harlow et al., Antib.
odies: A Laboratory Manual, 2nd edition; Cold S
spring Harbor Laboratory Press, Cold S
Detection is by radiolabeling and immunoprecipitation using the method described in Spring Harbor, New York (1988). For this purpose, two days after transfection, the cells are labeled by incubating them in medium containing 35 S-cysteine for 8 hours. Cells and media are harvested and cells are washed and RIPA buffer containing detergent: 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% as described by Wilson et al., Supra. NP-40
, 0.5% DOC, 50 mM TRIS, pH 7.5. Proteins are precipitated from cell lysates and culture media using an HA-specific monoclonal antibody. The precipitated protein is then analyzed by SDS-PAGE and autoradiography. An expression product of the expected size is found in the cell lysate, not in the negative control.

【０４８５】 この実施例での発現に使用するプライマーセットは、この実施例でＣＨＯ発現
について使用するｐＣ４、この実施例でのＣＯＳ発現についてのｐｃＤＮＡＩ／
Ａｍｐ、および以下の実施例でのバキュロウイルス発現について使用するｐＡ２
と適合性である。従って、例えば、ＣＨＯ発現について増幅された完全なＤＲ５
コードフラグメントはまた、ＣＯＳ発現についてのｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐまたは
バキュロウイルス発現についてのｐＡ２に連結され得る。The primer set used for expression in this example was pC4 used for CHO expression in this example, pcDNAI / CDNA expression for COS expression in this example.
Amp, and pA2 used for baculovirus expression in the Examples below.
And compatible. Thus, for example, complete DR5 amplified for CHO expression
The coding fragment can also be ligated to pcDNAI / Amp for COS expression or pA2 for baculovirus expression.

【０４８６】 （実施例３） （ＤＲ５のタンパク質融合物） 本発明のＤＲ５融合タンパク質は、必要に応じて、他のタンパク質に融合され
得る。これらの融合タンパク質は、種々の適用に対して有用であり得る。例えば
、ＤＲ５ポリペプチドのＨｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン
、およびマルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする。（ＥＰ Ａ
３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８
６（１９８８）を参照のこと）。同様に、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３、およびアル
ブミンへの融合は、インビボでの半減期を増加させる。ＤＲ５ポリペプチドに融
合された核限局化シグナルは、タンパク質を特定の細胞内位置に標的化し得、一
方で、共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、融合タンパク質の活性を
増加し得るか、または減少し得る。融合タンパク質はまた、１より多い機能を有
するキメラ分子を生成し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合のタンパク質
と比較して融合タンパク質の溶解性および／または安定性を増加し得る。上記の
融合タンパク質の型の全ては、当該分野で公知の技術を使用して、あるいは以下
のプロトコル（これは、ポリペプチドのＩｇＧ分子への融合を概説する）を使用
するか、または慣用的に改変することによって、作製され得る。Example 3 (DR5 Protein Fusion) The DR5 fusion protein of the present invention can be fused to another protein, if necessary. These fusion proteins may be useful for various applications. For example, fusion of a DR5 polypeptide to a His tag, HA tag, Protein A, IgG domain, and maltose binding protein facilitates purification. (EP A
394,827; Traunecker et al., Nature 331: 84-8.
6 (1988)). Similarly, fusion to IgG-1, IgG-3, and albumin increases half-life in vivo. A nuclear localization signal fused to a DR5 polypeptide can target the protein to a specific subcellular location, while a covalent heterodimer or homodimer can increase or decrease the activity of the fusion protein . Fusion proteins can also produce chimeric molecules with more than one function. Finally, the fusion protein may increase the solubility and / or stability of the fusion protein as compared to the unfused protein. All of the above types of fusion proteins can be obtained using techniques known in the art, or using the following protocol, which outlines the fusion of polypeptides to IgG molecules, or It can be made by modification.

【０４８７】 簡潔に、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、配列番号１３に記載される配列の５’
末端および３’末端にわたるプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅され得る。これ
らのプライマーはまた、好ましくは、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現
ベクター）へのクローニングを容易にする好都合な制限酵素部位を含む。[0487] Briefly, the human Fc portion of an IgG molecule is 5 'of the sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
PCR can be performed using primers that span the ends and the 3 'end. These primers also preferably contain convenient restriction enzyme sites to facilitate cloning into expression vectors, preferably mammalian expression vectors.

【０４８８】 例えば、ｐＣ４（寄託番号２０９６４６）発現ベクターが使用される場合、ヒ
トＦｃ部分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部
位は破壊されるべきであることに注意すべきである。次に、ヒトＦｃ部分を含む
ベクターは、ＢａｍＨＩで再制限酵素切断され、ベクターを線状化し、そして、
実施例１に記載のＰＣＲプロトコルにより単離されたＤＲ５ポリヌクレオチドを
、このＢａｍＨＩ部位に連結する。このポリヌクレオチドは、終止コドンなしで
クローニングされ、さもなければ、融合タンパク質は、産生されないことに注意
すべきである。For example, if a pC4 (Accession No. 209646) expression vector is used, the human Fc portion can be ligated into a BamHI cloning site. Note that the 3 'BamHI site should be destroyed. The vector containing the human Fc portion is then re-restricted with BamHI, linearizing the vector, and
A DR5 polynucleotide isolated by the PCR protocol described in Example 1 is ligated to this BamHI site. It should be noted that the polynucleotide is cloned without a stop codon, otherwise no fusion protein will be produced.

【０４８９】 天然のシグナル配列を使用して、分泌タンパク質を産生する場合、ｐＣ４は、
第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然のシグナル配列が使用
されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むために改変され得る。（例
えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。When using a native signal sequence to produce a secreted protein, pC4
No second signal peptide is required. Alternatively, if a native signal sequence is not used, the vector can be modified to include a heterologous signal sequence. (See, for example, WO 96/34891).

【０４９０】 （実施例４） （バキュロウイルス発現系におけるＤＲ５の可溶性細胞外ドメインのクローニ
ングおよび発現） この例示的な実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を使用して
、完全なＤＲ５タンパク質をコードするｃＤＮＡ（その天然に付随するシグナル
配列を含む）を、バキュロウイルスへ挿入し、標準的な方法（例えば、Ｓｕｍｍ
ｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９
８７）に記載される方法）を使用して、ＤＲ５タンパク質を発現させる。この発
現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイル
ス（ＡＣＭＮＰＶ）の強力なポリヘドロンプロモーター、続いて都合の良い制限
部位を含む。組換えウイルスの平易な選択のために、プラスミドは、同じ方向で
、弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガ
ラクトシダーゼ遺伝子、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナル
を含む。挿入遺伝子は、クローニングされたポリヌクレオチドを発現する生存ウ
イルスを生成するために、野生型ウイルスのＤＮＡとの細胞媒介性相同組換えの
ためのウイルス配列を両側に隣接させている。Example 4 Cloning and Expression of the Soluble Extracellular Domain of DR5 in a Baculovirus Expression System In this illustrative example, the plasmid shuttle vector pA2 was used to encode a complete DR5 protein. (Including its naturally associated signal sequence) was inserted into a baculovirus, using standard methods (eg, Summ
ers et al., A Manual of Methods for Baculov.
iirs Vectors and Insect Cell Culture
Procedures, Texas Acrocultural Expe
rimental Station Bulletin No. 1555 (19
87), the DR5 protein is expressed. This expression vector contains the strong polyhedron promoter of Autograph californica nuclear polyhedrosis virus (ACMNPV), followed by convenient restriction sites. For easy selection of recombinant viruses, the plasmid was transformed in the same orientation, under the control of the weak Drosophila promoter, into E. coli. It contains the β-galactosidase gene from E. coli, followed by the polyadenylation signal of the polyhedrin gene. The inserted gene is flanked by viral sequences for cell-mediated homologous recombination with wild-type virus DNA to produce a live virus expressing the cloned polynucleotide.

【０４９１】 当業者に容易に理解されるように、構築物が転写、翻訳、分泌などのための適
切に配置されたシグナル（例えば、インフレームのＡＵＧおよび必要ならばシグ
ナルペプチド）を提供する限り、多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば
、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭＩ）が、ｐＡ２の代わりに使
用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。As will be readily appreciated by those of skill in the art, as long as the construct provides appropriately arranged signals for transcription, translation, secretion, etc. (eg, an in-frame AUG and, if necessary, a signal peptide) Many other baculovirus vectors, such as pAc373, pVL941, and pAcIMI, can be used instead of pA2. Such vectors are described, for example, in Luckow et al., Virlog.
y 170: 31-39 (1989).

【０４９２】 寄託されたプラスミド（ＡＴＣＣ番号９７９２０）のＤＲ５タンパク質の可溶
性細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’配列および３
’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。The cDNA sequence encoding the soluble extracellular domain of the DR5 protein of the deposited plasmid (ATCC No. 97920) was replaced with the 5 ′ sequence and 3
'Amplify using PCR oligonucleotide primers corresponding to the sequence.

【０４９３】 ＤＲ５に対する５’プライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ制限酵素部位を含
む、配列５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＧＧＧＧＡ
ＣＡＧＡＡＣ−３’（配列番号１０）を有する。発現ベクター中に挿入されて、
以下に記載のように、ＤＲ５をコードする増幅されたフラグメントの５’末端は
、効率的な切断シグナルペプチドを提供する。真核生物細胞における翻訳の開始
のための効率的なシグナルは、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９
６：９４７−９５０（１９８７）に記載されるように、構築物のベクター部分に
適切に配置される。The 5 ′ primer for DR5 contains the sequence 5 ′ CGC GGATCC GCCATCATGGAACAACGGGGA, which contains an underlined BamHI restriction enzyme site.
CAGAAC-3 '(SEQ ID NO: 10). Inserted into an expression vector,
As described below, the 5 'end of the amplified fragment encoding DR5 provides an efficient cleavage signal peptide. Efficient signals for initiation of translation in eukaryotic cells are described in Kozak, M .; , J. et al. Mol. Biol. 19
6: 947-950 (1987).

【０４９４】 ＤＲ５についての３’プライマーは、下線を付したＡｓｐ７１８制限、続いて
図１中のＤＲ５ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド、続いて終止コドンを
含む配列５’−ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＣＣＴＧＡＴＴＣＴＴＴＧＴＧＧＡ
Ｃ−３’（配列番号１２）を有する。3 'primer for [0494] DR5 is, Asp718 restriction underlined, followed by nucleotides complementary to the DR5 nucleotide sequence in FIG. 1, followed by sequence containing the termination codon 5'-CGC GGTACC TTAGCCTGATTCTTTGTGGA
C-3 '(SEQ ID NO: 12).

【０４９５】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を用いて１％アガロースゲルから
単離する。次いで、このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化
し、そして再度１％アガロースゲル上で精製する。このフラグメントを「Ｆ１」
と命名する。The amplified fragment was prepared using a commercially available kit (“Geneclean” BIO
101 Inc. , La Jolla, Ca) from a 1% agarose gel. The fragment is then digested with BamHI and Asp718 and purified again on a 1% agarose gel. This fragment is called "F1"
It is named.

【０４９６】 プラスミドを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、そして必要
に応じて、当該分野で公知の日常的な手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを
用いて脱リン酸化し得る。次いで、このＤＮＡを市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌ
ｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を用いて１％
アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを本明細書中で「Ｖ１」と命
名する。The plasmid can be digested with the restriction enzymes BamHI and Asp718, and optionally dephosphorylated with calf intestinal phosphatase using routine procedures known in the art. This DNA was then transferred to a commercially available kit ("Genecl
ean "BIO 101 Inc. , La Jolla, Ca. 1% using
Isolate from agarose gel. This vector DNA is designated herein as "V1".

【０４９７】 フラグメントＦ１と脱リン酸化プラスミドＶ１とを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで
連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ
）のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合物で形質転換し、そして培
養プレートに塗布する。ヒトＤＲ５を有するプラスミドを含む細菌を、ＰＣＲ法
を用いて同定する。このＰＣＲ法では、この遺伝子を増幅するために使用される
プライマーの一つはＤＲ５配列に指向され、そして第２のプライマーは、十分に
ベクター内に由来し、その結果、ＤＲ５遺伝子フラグメントを含むそれらの細菌
コロニーのみがＤＮＡの増幅を示す。クローニングされたフラグメントの配列を
、ＤＮＡ配列決定によって確認する。このプラスミドを、本明細書中で、ｐＢａ
ｃ ＤＲ５と命名する。The fragment F1 and the dephosphorylated plasmid V1 are ligated with T4 DNA ligase. E. FIG. coli HB101 cells or XL-1 Blue cells (St
ratagene Cloning Systems, La Jolla, CA
Other suitable E.C. The E. coli host is transformed with the ligation mixture and spread on culture plates. Bacteria containing the plasmid with human DR5 are identified using the PCR method. In this PCR method, one of the primers used to amplify the gene is directed to the DR5 sequence, and the second primer is fully derived from the vector, such that those containing the DR5 gene fragment Only bacterial colonies show DNA amplification. The sequence of the cloned fragment is confirmed by DNA sequencing. This plasmid is referred to herein as pBa
c Named DR5.

【０４９８】 ５μｇのプラスミドｐＢａｃ ＤＲ５を、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８７）によ
って記載されるリポフェクチン法を用いて、１．０μｇの市販の線状化バキュロ
ウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ
」， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）とともに同時ト
ランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡおよび５
μｇのプラスミドｐＢａｃ ＤＲ５を、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）
を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、１０μｌ
のリポフェクチンおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温
にて１５分間インキュベートする。次いで、このトランスフェクション混合物を
、１ｍｌの無血清グレース培地を有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種され
たＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下する。プレートを、前
後に揺らして新たに添加された溶液を混合する。次いで、プレートを２７℃で５
時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから
除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加
する。プレートをインキュベーターに戻し、そして培養を２７℃で４日間続ける
。5 μg of plasmid pBac DR5 was transferred to Felgner et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417 using the lipofectin method described by (1987), a commercially available linearized baculovirus DNA of 1.0 [mu] g ( "BaculoGold TM baculovirus DNA
", Pharmingen, San Diego, CA. ) And co-transfected. 1 μg of BaculoGold ™ viral DNA and 5
μg of plasmid pBac DR5 was added to 50 μl of serum-free Grace's medium (Lif
e Technologies Inc. , Gaithersburg, MD)
Mix in sterile wells of a microtiter plate containing Then, 10 μl
Of Lipofectin and 90 μl of Grace's medium are added, mixed and incubated at room temperature for 15 minutes. This transfection mixture is then added dropwise to Sf9 insect cells (ATCC CRL 1711) seeded in 35 mm tissue culture plates with 1 ml of serum-free Grace's medium. The plate is rocked back and forth to mix the newly added solution. The plate is then placed at 27 ° C. for 5
Incubate for hours. After 5 hours, the transfection solution is removed from the plate and 1 ml of Grace's insect medium supplemented with 10% fetal calf serum is added. Return the plate to the incubator and continue the culture at 27 ° C. for 4 days.

【０４９９】 ４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）に記
載されるようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を有す
るアガロースゲルを、青く染色されたプラークを産生するｇａｌ発現クローンの
容易な同定および単離を可能にするために用いる。（このタイプの「プラークア
ッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．
、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤによって配布される昆虫細胞培養およびバキ
ュロウイルス学のための使用者ガイド（第９〜１０頁）においても見い出され得
る）。適切なインキュベーションの後、青く染色されたプラークを、マイクロピ
ペッター（例えば、エッペンドルフ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルス
を含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含む微小遠心管中に再懸濁する。そ
して、組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を用いて、３５ｍｍディッシュに播
種された昆虫Ｓｆ９細胞に感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清
を回収し、次いでそれらを４℃で保存する。この組換えウイルスをＶ−ＤＲ５と
称する。After 4 days, supernatants are collected and plaque assays are performed as described in Summers and Smith (supra). "Blue Gal" (Life T
technologies Inc. An agarose gel with (Gaithersburg, MD) is used to allow easy identification and isolation of gal-expressing clones producing blue-stained plaques. (A detailed description of this type of “plaque assay” is also available from Life Technologies Inc.
(Also found in the User's Guide for Insect Cell Culture and Baculovirology distributed by Gaithersburg, MD (pages 9-10)). After appropriate incubation, the blue-stained plaques are picked up with the tips of a micropipettor (eg, Eppendorf). The agar containing the recombinant virus is then resuspended in a microcentrifuge tube containing 200 μl Grace's medium. The suspension containing the recombinant baculovirus is used to infect insect Sf9 cells seeded on a 35 mm dish. After 4 days, the supernatants of these culture dishes are collected and then they are stored at 4 ° C. This recombinant virus is called V-DR5.

【０５００】 ＤＲ５遺伝子の発現を確認するために、Ｓｆ９細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳ
を補充したグレース培地中で増殖させる。細胞を、約２（約１〜約３）の感染多
重度（「ＭＯＩ」）にて組換えバキュロウイルスＶ−ＤＲ５で感染させる。６時
間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９０
０ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ， ＭＤから入手可能）に置き換える。放射性標識されたタンパク
質が所望される場合、４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉ
の35Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさら
に１６時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集する。上清中の
タンパク質ならびに細胞内タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて（放射性標識
されていれば）オートラジオグラフィーにより分析する。精製タンパク質のアミ
ノ末端のアミノ酸配列の微小配列決定を用いて、成熟タンパク質のアミノ末端配
列を決定し得、従って分泌シグナルペプチドの切断点および長さを決定し得る。To confirm DR5 gene expression, Sf9 cells were transformed with 10% heat-inactivated FBS.
Grown in Grace's medium supplemented with Cells are infected with recombinant baculovirus V-DR5 at a multiplicity of infection ("MOI") of about 2 (about 1 to about 3). After 6 hours, the medium was removed and SF90 without methionine and cysteine was removed.
0 II medium (Life Technologies Inc., Gaithe)
rsburg, available from MD). If radiolabeled protein is desired, after 42 hours, 5 μCi of 35 S-methionine and 5 μCi
Of 35 S-cysteine (available from Amersham) is added. The cells are incubated for a further 16 hours, and the cells are then collected by centrifugation. The proteins in the supernatant as well as the intracellular proteins are analyzed by SDS-PAGE, followed by autoradiography (if radiolabeled). Microsequencing of the amino-terminal amino acid sequence of the purified protein can be used to determine the amino-terminal sequence of the mature protein and thus determine the breakpoint and length of the secretory signal peptide.

【０５０１】 （実施例５） （哺乳動物細胞におけるＤＲ５誘導アポトーシス） Ｆａｓ／ＡＰＯ−１およびＴＮＦＲ−１の哺乳動物細胞における過剰発現は、
レセプター活性化を模倣する（Ｍ．Ｍｕｚｉｏら、Ｃｅｌｌ ８５：８１７−８
２７（１９９６）；Ｍ．Ｐ．Ｂｏｌｄｉｎら、Ｃｅｌｌ ８５：８０３−８１５
（１９９６））。従って、この系を、アポトーシスの誘導におけるＤＲ５の機能
的役割を研究するために利用する。この実施例は、ＭＣＦ７ヒト乳ガン細胞およ
びヒト類上皮ガン（ＨｅＬａ）細胞の両方において、ＤＲ５の過剰発現がアポト
ーシスを誘導したことを実証する。Example 5 DR5 Induced Apoptosis in Mammalian Cells Overexpression of Fas / APO-1 and TNFR-1 in mammalian cells
Mimic receptor activation (M. Muzio et al., Cell 85: 817-8).
27 (1996); P. Boldin et al., Cell 85: 803-815.
(1996)). Therefore, this system is utilized to study the functional role of DR5 in inducing apoptosis. This example demonstrates that overexpression of DR5 induced apoptosis in both MCF7 human breast cancer cells and human epidermoid carcinoma (HeLa) cells.

【０５０２】 （実験の設計） 細胞死アッセイを、本質的に以前に記載されるように行った（Ａ．Ｍ．Ｃｈｉ
ｎｎａｉｙａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５０５−１２（１９９５）；Ｍ．Ｐ．Ｂｏ
ｌｄｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：７７９５−８（１９９５）；Ｆ
．Ｃ．Ｋｉｓｃｈｋｅｌら、ＥＭＢＯ １４：５５７９−５５８８（１９９５）
；Ａ．Ｍ．Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：４９６
１−４９６５（１９９６））。簡単には、ＭＣＦ−７ヒト乳ガンクローン細胞株
およびＨｅＬａ細胞を、ベクター、ＤＲ５、ＤＲ５(（５２−４１１）、または
ＴＮＦＲ−１と、βガラクトシダーゼレポーター構築物と一緒に同時トランスフ
ェクトした。Experimental Design Cell death assays were performed essentially as previously described (AM Chi).
Nnaiyan et al., Cell 81: 505-12 (1995); P. Bo
ldin et al. Biol Chem 270: 7795-8 (1995); F
. C. Kischkel et al., EMBO 14: 5579-5588 (1995).
A. M. Chinnaiyan et al., J Biol Chem 271: 496.
1-4946 (1996)). Briefly, the MCF-7 human breast cancer clonal cell line and HeLa cells were co-transfected with the vector, DR5, DR5 ((52-411), or TNFR-1, together with the β-galactosidase reporter construct.

【０５０３】 ＭＣＦ７およびＨｅＬａ細胞を、リポフェクタミン手順（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ
）を使用して、製造業者の指示に従ってトランスフェクトした。２９３細胞を、
ＣａＰＯ4沈澱を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの２４
時間後に、以前に記載のように（Ａ．Ｍ．Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｃｅｌｌ
８１：５０５−１２（１９９５）：Ｍ．Ｐ．Ｂｏｌｄｉｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃ
ｈｅｍ ２７０：７７９５−８（１９９５）；Ｆ．Ｃ．Ｋｉｓｃｈｋｅｌら、Ｅ
ＭＢＯ １４：５５７９−５５８８（１９９５））、細胞を固定してＸ−Ｇａｌ
で染色し、そして顕微鏡で観察した。図５に示すデータ（平均±ＳＤ）は、円形
のアポトーシス細胞のパーセントを総βガラクトシダーゼポジティブ細胞の関数
として表す（ｎ＝３）。ＤＲ５の過剰発現は、ＭＣＦ７（図５Ａ）およびＨｅＬ
ａ細胞（図５Ｂ）の両方においてアポトーシスを誘導した。[0503] MCF7 and HeLa cells were subjected to the lipofectamine procedure (GIBCO-BRL).
) Was used to transfect according to the manufacturer's instructions. 293 cells,
Transfected using CaPO 4 precipitate. 24 of transfection
After an hour, as previously described (AM Chinnaiyan et al., Cell
81: 505-12 (1995): M. P. Boldin et al., J Biol C
hem 270: 7795-8 (1995); C. Kischkel et al., E
MBO 14: 5579-5588 (1995)), cells were fixed and X-Gal
And observed under a microscope. The data shown in FIG. 5 (mean ± SD) represent the percentage of round apoptotic cells as a function of total β-galactosidase positive cells (n = 3). Overexpression of DR5 was confirmed by MCF7 (FIG. 5A) and HeL
Apoptosis was induced in both a cells (FIG. 5B).

【０５０４】 ＭＣＦ７細胞をまた、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（２０μｌ）（Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）の存在下で、ＤＲ５発現
構築物でトランスフェクトするか、または３倍過剰のＣｒｍＡ（Ｍ．Ｔｅｗａｒ
ｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：３２５５−６０（１９９５））、もし
くはＦＡＤＤ−ＤＮ発現構築物、もしくはベクター単独で同時トランスフェクト
した。図５Ｃに示すデータは、ＤＲ５によって誘導されたアポトーシスが、カス
パーゼインヒビターによって弱められるが、優性ネガティブＦＡＤＤによっては
弱められないことを示す。[0504] MCF7 cells were also transferred to z-VAD-fmk (20 μl) (Enzyme Sy).
transfected with a DR5 expression construct or in the presence of a three-fold excess of CrmA (M. Tewar) in the presence of stems Products, Dublin, CA
i et al., J Biol Chem 270: 3255-60 (1995)), or a FADD-DN expression construct, or vector alone. The data shown in FIG. 5C indicate that apoptosis induced by DR5 is attenuated by caspase inhibitors but not by dominant negative FADD.

【０５０５】 図５Ｄに示されるように、ＤＲ５は、ＦＡＤＤまたはＴＲＡＤＤとはインビボ
で会合しなかった。２９３細胞を、リン酸カルシウム沈澱を使用して、示された
発現構築物とともに同時トランスフェクトした。トランスフェクションの後（４
０時間で）、細胞溶解物を調製し、そしてＦｌａｇ Ｍ２抗体アフィニティーゲ
ル（ＩＢＩ，Ｋｏｄａｋ）で免疫沈降させ、そしてＦＡＤＤまたはｍｙｃ−タグ
化ＴＲＡＤＤ（ｍｙｃ−ＴＲＡＤＤ）の存在を、ＦＡＤＤに対するポリクローナ
ル抗体またはｍｙｃに対する西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化抗
体（ＢＭＢ）を用いる免疫ブロッティングによって検出した（Ｂａｋｅｒ，Ｓ．
Ｊ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １２：１（１９９６）；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ
．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９０（１９９６））。As shown in FIG. 5D, DR5 did not associate with FADD or TRADD in vivo. 293 cells were co-transfected with the indicated expression construct using calcium phosphate precipitation. After transfection (4
At time 0), cell lysates are prepared and immunoprecipitated on a Flag M2 antibody affinity gel (IBI, Kodak), and the presence of FADD or myc-tagged TRADD (myc-TRADD) is determined by polyclonal antibodies against FADD or Myc was detected by immunoblotting using horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody (BMB) against Myc (Baker, S. et al.
J. Et al., Oncogene 12: 1 (1996); Chinnaiyan, A.
. M. Et al., Science 274: 990 (1996)).

【０５０６】 図５Ｅに示すように、ＦＬＩＣＥ２−ＤＮは、ＤＲ５誘導アポトーシスをブロ
ックする。２９３細胞を、ＤＲ５またはＴＮＦＲ−１発現構築物と同時トランス
フェクトし、そして示されたように４倍過剰のＣｒｍＡ、ＦＬＩＣＥ−ＤＮ、Ｆ
ＬＩＣＥ ２−ＤＮ、またはベクター単独とともに、βガラクトシダーゼの報告
された構築物の存在下で同時トランスフェクトした。細胞を染色し、そして２５
〜３０時間後に試験した。As shown in FIG. 5E, FLICE2-DN blocks DR5-induced apoptosis. 293 cells were co-transfected with a DR5 or TNFR-1 expression construct and a 4-fold excess of CrmA, FLICE-DN, F as indicated.
Co-transfected with LICE 2-DN, or vector alone, in the presence of the reported construct of β-galactosidase. Stain cells and
Tested after ~ 30 hours.

【０５０７】 （結果） ＤＲ５の過剰発現は、ＭＣＦ７ヒト乳ガン細胞（図５Ａ）およびヒト類上皮ガ
ン（ＨｅＬａ）細胞（図５Ｂ）の両方において、アポトーシスを誘導した。トラ
ンスフェクトした細胞のほとんどは、アポトーシスを経験している細胞に特徴的
な形態学的な変化（Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｗ．Ｃ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：３
３７（１９９５））を示し、円形になり濃縮されて、そしてディッシュから脱離
した。死ドメインの欠失は、殺傷能力を消失させた。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５誘
導アポトーシスは、カスパーゼインヒビター、ＣｒｍＡおよびｚ−ＶＡＤ−ｆｍ
ｋによってブロックされたが、優性ネガティブＦＡＤＤは効果がなかった（図５
Ｃ）。これと一致して、ＤＲ５はＦＡＤＤおよびＴＲＡＤＤとインビボで相互作
用しなかった（図５Ｄ）。新たに同定したＦＬＩＣＥ様分子の優性ネガティブバ
ージョン、ＦＬＩＣＥ２（Ｖｉｎｃｅｎｚ，Ｃら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７２：６５７８（１９９７））は、効率的にＤＲ５誘導アポトーシスをブロック
したのに対し、優性ネガティブＦＬＩＣＥは、ブロックした条件下で部分的な効
果を有するのみであった。ＴＮＦＲ−１は、アポトーシスを効率的に誘導した（
図５Ｅ）。まとめると、証拠は、ＲＤ５が、ＦＬＩＣＥ２および下流のカプラー
ゼの活性化を包含するアポトーシスプログラムに関与しているが、ＦＡＤＤとは
独立であることを示唆する。(Results) Overexpression of DR5 induced apoptosis in both MCF7 human breast cancer cells (FIG. 5A) and human epidermoid carcinoma (HeLa) cells (FIG. 5B). Most of the transfected cells have morphological changes characteristic of cells undergoing apoptosis (Earnshaw, WC, Curr. Biol. 7: 3).
37 (1995)), rounded, concentrated and detached from the dish. Deletion of the death domain abolished the killing ability. As with DR4, DR5-induced apoptosis was determined by caspase inhibitors, CrmA and z-VAD-fm.
k, but dominant negative FADD had no effect (FIG. 5).
C). Consistent with this, DR5 did not interact with FADD and TRADD in vivo (FIG. 5D). A dominant negative version of the newly identified FLICE-like molecule, FLICE2 (Vincenza, C et al., J. Biol. Chem. 2).
72: 6578 (1997)) effectively blocked DR5-induced apoptosis, whereas dominant negative FLICE had only a partial effect under blocked conditions. TNFR-1 efficiently induced apoptosis (
(FIG. 5E). Taken together, the evidence suggests that RD5 is involved in apoptosis programs, including activation of FLICE2 and downstream caprase, but is independent of FADD.

【０５０８】 （実施例６：ＤＲ５の細胞外ドメインは、細胞傷害性リガンドＴＲＩＬに結合
し、そしてＴＲＩＬ誘導性アポトーシスをブロックする） 上記で議論されるように、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ
）リガンドファミリーに属し、そしてその死ドメイン含有レセプターＤＲ４が両
方の細胞型において発現されるにもかかわらず、多くの形質転換細胞株の迅速な
細胞死を誘導するが、正常組織の細胞死は誘導しない細胞傷害性リガンドである
。この実施例は、本発明のレセプターＤＲ５もまたＴＲＡＩＬに結合することを
示す。Example 6 Extracellular Domain of DR5 Binds Cytotoxic Ligand TRIL and Blocks TRIL-Induced Apoptosis As discussed above, TRAIL / Apo2L is a tumor necrosis factor ( TNF
2.) Induces rapid cell death in many transformed cell lines, but induces normal tissue cell death, despite belonging to the ligand family and its death domain containing receptor DR4 is expressed in both cell types Not a cytotoxic ligand. This example shows that the receptor DR5 of the present invention also binds TRAIL.

【０５０９】 ＤＲ５およびＤＲ４の細胞外リガンド結合システインリッチドメインの類似性
を考慮して、本発明者らは、ＤＲ５もまたＴＲＡＩＬに結合すると理論を立てた
。このことを確認するために、ＤＲ５の可溶性細胞外リガンド結合ドメインを、
ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）のＦｃ部分に対する融合物として発現した。配列
番号２におけるアミノ酸１〜１２９をコードするｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反
応によって入手し、そしてヒトＩｇＧのＦｃ部分とのインフレームの融合を可能
にする、改変されたｐＣＭＶ１ＦＬＡＧベクター中にクローン化した。In view of the similarity of the extracellular ligand-binding cysteine-rich domains of DR5 and DR4, we have reasoned that DR5 also binds TRAIL. To confirm this, the soluble extracellular ligand binding domain of DR5 was
It was expressed as a fusion to the Fc portion of human immunoglobulin (IgG). The cDNA encoding amino acids 1-129 in SEQ ID NO: 2 was obtained by polymerase chain reaction and cloned into a modified pCMV1FLAG vector that allows in-frame fusion with the Fc portion of human IgG.

【０５１０】 図６Ａに示すように、ＤＲ５−Ｆｃは、ＴＲＡＩＬに特異的に結合するが、関
連する細胞傷害性リガンドＴＮＦαには結合しなかった。この実験において、Ｄ
Ｒ５、ＤＲ４、ＴＲＩＤ、またはＴＮＦＲ−１の細胞外ドメイン−Ｆｃおよび対
応するリガンドを調製し、そして結合アッセイをＰａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７６：１１１（１９９７）に記載されるように行った。それぞれのＦｃ融合物を
、プロテインＧセファロースで沈澱させ、そして共沈した可溶性リガンドを、抗
Ｆｌａｇ（Ｂａｂｃｏ）または抗ｍｙｃ−ＨＲＰ（ＢＭＢ）を用いたイムノブロ
ッティングによって検出した。図６Ａの下のパネルは、結合アッセイにおいて存
在するインプットＦｃ融合物を示す。As shown in FIG. 6A, DR5-Fc specifically bound to TRAIL but did not bind to the related cytotoxic ligand TNFα. In this experiment, D
The extracellular domain-Fc of R5, DR4, TRID, or TNFR-1 and the corresponding ligand were prepared and the binding assay was performed according to Pan et al., Science 2
76: 111 (1997). Each Fc fusion was precipitated on Protein G Sepharose and co-precipitated soluble ligand was detected by immunoblotting with anti-Flag (Babco) or anti-myc-HRP (BMB). The lower panel of FIG. 6A shows the input Fc fusion present in the binding assay.

【０５１１】 さらに、ＤＲ５−Ｆｃは、ＴＲＡＩＬのアポトーシス誘導能をブロックした（
図６Ｂ）。ＭＣＦ７細胞を、等量のＦｃ融合物またはＦｃ単独の存在下で、可溶
性ＴＲＡＩＬ（２００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。６時間後、細胞を固定し、そし
てＰａｎら（同書）に記載されるように試験した。図６Ｂに示すデータ（平均±
ＳＤ）は、計数される総核のうちのアポトーシス核の百分率である（ｎ＝４）。Further, DR5-Fc blocked the ability of TRAIL to induce apoptosis (
(FIG. 6B). MCF7 cells were treated with soluble TRAIL (200 ng / ml) in the presence of an equal amount of Fc fusion or Fc alone. After 6 hours, cells were fixed and tested as described in Pan et al. (Ibid). Data shown in FIG. 6B (mean ±
SD) is the percentage of apoptotic nuclei of total nuclei counted (n = 4).

【０５１２】 最後に、ＤＲ５−Ｆｃは、ＴＮＦＲ１−Ｆｃが完全にＴＮＦα殺傷を消失させ
る条件下で、アポトーシスＴＮＦα誘導細胞死に対する効果を有さなかった（図
６Ｃ）。ＭＣＦ７細胞を、等量のＦｃ融合物またはＦｃ単独の存在下で、ＴＮＦ
α（４０ｎｇ／ｍｌ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）で処理した。核を染色し
、そして１１〜１５時間後に試験した。Finally, DR5-Fc had no effect on apoptotic TNFα-induced cell death under conditions where TNFR1-Fc completely abolished TNFα killing (FIG. 6C). MCF7 cells were isolated from TNF in the presence of an equal amount of Fc fusion or Fc alone.
Treated with α (40 ng / ml; Genentech, Inc.). Nuclei were stained and examined after 11 to 15 hours.

【０５１３】 ＴＲＡＩＬについてのレセプターとしてＤＲ５を新たに同定したことは、ＴＲ
ＡＩＬ開始シグナル伝達の生物学にさらなる複雑性を加える。The new identification of DR5 as a receptor for TRAIL indicates that TR5
Adds additional complexity to the biology of AIL initiation signaling.

【０５１４】 （実施例７：Ｂ細胞増殖および分化の刺激または阻害を検出するアッセイ） 機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系列の細胞とそれらの微小環境との間に、
可溶性のシグナル伝達および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナル
は、正の刺激（Ｂ系列の細胞がプログラムされた発生を持続するようにさせる）
、または負の刺激（細胞が現在の発生経路を停止させるように指示する）を伝え
得る。現在までに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５を含む、多数の刺激シグナル
および阻害シグナルがＢ細胞応答性に影響を与えることが見出されている。興味
深いことに、これらのシグナルはそれ自体は弱いエフェクターであるが、種々の
補助刺激タンパク質と組み合わさって、Ｂ細胞集団中の活性化、増殖、分化、ホ
ーミング、耐性、および死を誘導し得る。Ｂ細胞補助刺激タンパク質の最も研究
されたクラスの１つがＴＮＦスーパーファミリーである。このファミリー内で、
ＣＤ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、そのそれぞれのリガンドである、ＣＤ１
５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３と共に種々の免疫応答を調節することが見出さ
れている。これらのＢ細胞集団およびそれらの前駆細胞の増殖および分化の検出
および／または観察を可能にするアッセイは、種々のタンパク質がこれらのＢ細
胞集団に対して増殖および分化に関して有し得る効果を決定する際に価値のある
ツールである。以下に列挙するのは、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体の分化、
増殖、または阻害の検出を可能にするように設計された２つのアッセイである。Example 7 Assay to Detect Stimulation or Inhibition of B Cell Proliferation and Differentiation The generation of a functional humoral immune response depends on the interaction between B lineage cells and their microenvironment.
It requires both soluble and cognate signaling. The signal is a positive stimulus (allows the B lineage cells to sustain their programmed development)
, Or a negative stimulus (instructing the cells to stop the current developmental pathway). To date, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL
Numerous stimulatory and inhibitory signals have been found to affect B cell responsiveness, including -10, IL-13, IL-14 and IL-15. Interestingly, these signals are weak effectors themselves, but can be combined with various costimulatory proteins to induce activation, proliferation, differentiation, homing, tolerance, and death in B cell populations. One of the most studied classes of B cell costimulatory proteins is the TNF superfamily. Within this family,
CD40, CD27 and CD30 are their respective ligands, CD1
54, together with CD70 and CD153, have been found to modulate various immune responses. Assays that allow detection and / or observation of the proliferation and differentiation of these B cell populations and their progenitor cells determine the effects that various proteins may have on these B cell populations with respect to proliferation and differentiation. This is a valuable tool. Listed below are the differentiation of B cell populations and their precursors,
Two assays designed to allow detection of proliferation, or inhibition.

【０５１５】 （実験手順） （インビトロアッセイ）−精製したＤＲ５タンパク質またはその短縮型を、Ｂ
細胞集団およびそれらの前駆体において活性化、増殖、分化もしくは阻害および
／または死を誘導する能力について評価する。精製したヒト扁桃Ｂ細胞へのＤＲ
５タンパク質の活性（０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの用量範囲にわたって定
性的に測定した）を、標準的なＢリンパ球副刺激アッセイにおいて評価する。こ
のアッセイでは、精製した扁桃Ｂ細胞を、プライミング因子として、ホルマリン
固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ（ＳＡＣ）
、または固定化した抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在下で培養する。ＩＬ−２
およびＩＬ−１５のような第２のシグナルは、トリチウム化チミジン取り込みに
より測定した場合、ＳＡＣおよびＩｇＭ架橋と相乗作用してＢ細胞増殖を誘発す
る。新規な相乗作用因子を、このアッセイを用いて容易に同定し得る。このアッ
セイは、ＣＤ３陽性細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）枯渇によりヒト扁桃Ｂ細胞を
単離する工程を包含する。得られる細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現
により評価した場合、９５％より大きいＢ細胞である。種々の希釈のそれぞれの
サンプルを９６ウェルプレートの個々のウェルに配置し、ここへ、培養培地（１
０％ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ β−ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／
ｍｌストレプトマイシン、および１０-5希釈のＳＡＣを含有するＲＰＭＩ １６
４０）中で懸濁した、総量１５０μｌ中の、１０5個のＢ細胞を添加する。増殖
または阻害を、因子の添加後７２時間から開始して、3Ｈ−チミジン（６．７Ｃ
ｉ／ｍＭ）で２０ｈパルス（１μＣｉ／ウェル）により定量する。陽性コントロ
ールおよび陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および培地である。Experimental Procedures (In Vitro Assay)-Purified DR5 protein or truncated form thereof was
The ability to induce activation, proliferation, differentiation or inhibition and / or death in cell populations and their precursors is assessed. DR to purified human tonsillar B cells
The activity of the 5 proteins (determined qualitatively over a dose range of 0.1-10,000 ng / mL) is assessed in a standard B lymphocyte costimulation assay. In this assay, purified tonsillar B cells were used as priming factors in formalin-fixed Staphylococcus aureus Cowan I (SAC).
, Or in the presence of immobilized anti-human IgM antibodies. IL-2
And a second signal, such as IL-15, synergizes with SAC and IgM crosslinking to induce B cell proliferation as measured by tritiated thymidine incorporation. New synergists can be easily identified using this assay. This assay involves isolating human tonsils B cells by magnetic bead (MACS) depletion of CD3-positive cells. The resulting cell population is greater than 95% B cells as assessed by CD45R (B220) expression. Samples of each of the various dilutions were placed in individual wells of a 96-well plate, and the culture medium (1
0% FBS, 5 × 10 −5 M β-ME, 100 U / ml penicillin, 10 μg /
RPMI 16 containing ml streptomycin, and 10 -5 dilution of SAC
Add 10 5 B cells in a total volume of 150 μl suspended in 40). Growth or inhibition started 72 hours after addition of the factor and was measured using 3 H-thymidine (6.7 C
i / mM) and a 20 h pulse (1 μCi / well). Positive and negative controls are IL2 and medium, respectively.

【０５１６】 （インビボアッセイ）−ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液のみ、または本発明の
２ｍｇ／ＫｇのＤＲ５タンパク質もしくはその短縮形態を、１日２回注射（腹腔
内）する。マウスにこの処置を４日間連続して与え、この時点でそれらを屠殺し
、そして分析のために種々の組織および血清を収集した。正常な脾臓およびＤＲ
５タンパク質で処理した脾臓由来のＨ＆Ｅ切片の比較により、脾臓細胞に対する
ＤＲ５タンパク質の活性の結果、例えば、動脈周囲リンパ性鞘の拡散および／ま
たは赤色脾髄領域の有核の細胞充実性の顕著な増加（これは、Ｂ細胞集団の分化
および増殖の活性化を示し得る）が確認される。Ｂ細胞マーカーである、抗ＣＤ
４５Ｒ（Ｂ２２０）を用いる免疫組織化学的研究を用いて、脾臓細胞に対する任
意の生理的な変化（例えば、脾臓組織崩壊）が、樹立されたＴ細胞領域に浸潤す
る漠然と規定されたＢ細胞帯内のＢ細胞提示の増加に起因するか否かを決定する
。In Vivo Assay-BALB / c mice are injected (ip) twice daily with buffer alone or 2 mg / Kg DR5 protein of the invention or a shortened form thereof. Mice were given this treatment for 4 consecutive days, at which point they were sacrificed and various tissues and sera were collected for analysis. Normal spleen and DR
Comparison of H & E sections from spleen treated with 5 protein results in marked activity of DR5 protein on spleen cells, eg, marked proliferation of peri-arterial lymphatic sheath and / or nucleated cellularity of red pulp region An increase is confirmed, which may indicate activation of differentiation and proliferation of the B cell population. Anti-CD, a B cell marker
Using immunohistochemical studies with 45R (B220), any physiological changes to spleen cells (eg, spleen tissue disruption) are within a vaguely defined B cell band that infiltrates established T cell areas. To determine if this is due to increased B cell presentation.

【０５１７】 ＤＲ５タンパク質で処置したマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分析を
用いて、このＤＲ５タンパク質が、ＴｈＢ＋であるＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｄｕ
ｌｌ Ｂ細胞の比を、コントロールマウスで観察される比よりも特異的に増加さ
せるか否かを示す。Using flow cytometric analysis of spleens from mice treated with DR5 protein, the DR5 protein was identified as ThB +, CD45R (B220) du.
Indicates whether the ratio of 11 B cells is specifically increased above that observed in control mice.

【０５１８】 同様に、増加した成熟Ｂ細胞のインビボでの提示の推定される結果は、血清Ｉ
ｇ力価の相対的な増加である。従って、血清でのＩｇＭおよびＩｇＡのレベルを
緩衝液処置マウスとＤＲ５タンパク質処置マウスとの間で比較する。Similarly, the putative consequences of in vivo presentation of increased mature B cells is that serum I
g is a relative increase in titer. Therefore, IgM and IgA levels in serum are compared between buffer treated and DR5 protein treated mice.

【０５１９】 本実施例において記載する試験は、ＤＲ５タンパク質における活性を試験する
。しかし、当業者は、ＤＲ５ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ＤＲ５
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する
研究を容易に改変し得る。The test described in this example tests activity on the DR5 protein. However, one of skill in the art will appreciate that DR5 polynucleotides (eg, gene therapy), DR5
The exemplary studies can be readily modified to test the activity of agonists and / or antagonists of.

【０５２０】 （実施例８：Ｔ細胞増殖アッセイ） ＣＤ３誘導性の増殖アッセイをＰＢＭＣで実行し、そして3Ｈ−チミジンの取
り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する。９６ウェルプレ
ートを、ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の１００
μｌ／ウェル、またはアイソタイプが一致したコントロールｍＡｂ（Ｂ３３．１
）（０．０５Ｍ 炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）で４℃で１
晩、コートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆ／
Ｈ勾配遠心分離により単離し、そして種々の濃度のＤＲ５タンパク質の存在下で
、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＲＰＭＩ中、ｍＡｂでコートしたプレー
トの４連のウェル（５×１０4／ウェル）に添加する（総量２００μｌ）。関連
するタンパク質緩衝液および培地単独がコントロールである。３７℃で４８時間
後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間回転させ、そして１００μｌの上清を取
り出し、そして、増殖への効果が観察される場合、ＩＬ−２（または他のサイト
カイン）の測定のために−２０℃で貯蔵した。ウェルに０．５μＣｉの3Ｈ−チ
ミジンを含有する１００μｌの培地を補充し、そして３７℃で１８〜２４時間培
養する。ウェルを収集し、そして3Ｈ−チミジンの取り込みを増殖の指標として
用いた。抗ＣＤ３単独が増殖の陽性コントロールである。ＩＬ−２（１００Ｕ／
ｍｌ）をまた、増殖を増強するコントロールとして用いる。Ｔ細胞の増殖を誘導
しないコントロール抗体をＤＲ５タンパク質の効果についての陰性コントロール
として用いる。Example 8 T Cell Proliferation Assay A CD3-induced proliferation assay is performed on PBMC and measured by 3 H-thymidine incorporation. This assay is performed as follows. 96-well plates were loaded with 100 mAb against CD3 (HIT3a, Pharmingen).
μl / well or isotype matched control mAb (B33.1
) (1 μg / ml in 0.05 M bicarbonate buffer, pH 9.5) at 4 ° C.
Coat overnight, then wash three times with PBS. PBMC was obtained from human peripheral blood using F /
Quadruplicate wells (5 × 10 4 / well) of mAb coated plates in RPMI containing 10% FCS and P / S in the presence of various concentrations of DR5 protein and isolated by H gradient centrifugation ) (Total volume 200 μl). The relevant protein buffer and medium alone are controls. After 48 hours at 37 ° C., the plate is spun at 1000 rpm for 2 minutes, and 100 μl of the supernatant is removed, and if an effect on growth is observed, for measurement of IL-2 (or other cytokines) Stored at -20 ° C. The wells are supplemented with 100 μl of medium containing 0.5 μCi of 3 H-thymidine and incubated at 37 ° C. for 18-24 hours. Wells were collected and 3 H-thymidine incorporation was used as an indicator of proliferation. Anti-CD3 alone is a positive control for proliferation. IL-2 (100 U /
ml) is also used as a control to enhance proliferation. A control antibody that does not induce T cell proliferation is used as a negative control for the effect of the DR5 protein.

【０５２１】 本実施例において記載される研究は、ＤＲ５タンパク質の活性を試験する。し
かし、当業者は、ＤＲ５ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ＤＲ５のア
ゴニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究
を容易に改変し得る。The study described in this example tests the activity of DR5 protein. However, one of skill in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of DR5 polynucleotides (eg, gene therapy), agonists and / or antagonists of DR5.

【０５２２】 （実施例９：ＭＨＣクラスＩＩ、補助刺激分子および接着分子の発現、ならび
に単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化へのＤＲ５の効果） 樹状細胞を末梢血において見出される増殖前駆体の増殖により生成する：接着
性ＰＢＭＣまたは単離した単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）および
ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞
は、未成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０および
ＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−αのような活性化因子での処
理は、表面の表現型に迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、補助刺激分子お
よび接着分子の発現の増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の上方制御）を
生じる。これらの変化は抗原提示能力の増加、および樹状細胞の機能的成熟と相
関する。Example 9: Effect of DR5 on MHC Class II, costimulatory and adhesion molecule expression, and cell differentiation of monocytes and monocyte-derived human dendritic cells Dendritic cells are found in peripheral blood Produced by expansion of proliferative progenitors: adherent PBMCs or isolated monocyte fractions are cultured for 7-10 days with GM-CSF (50 ng / ml) and IL-4 (20 ng / ml). These dendritic cells have the characteristic phenotype of immature cells (CD1, CD80, CD86, CD40 and MHC class II antigen expression). Treatment with activators such as TNF-α rapidly changes the surface phenotype (MHC class I and II, increased expression of costimulatory and adhesion molecules, down-regulation of FCγRII, up-regulation of CD83) Is generated. These changes correlate with increased antigen-presenting capacity and functional maturation of dendritic cells.

【０５２３】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下の様に実施する。細胞を、漸増濃度のＤＲ５ま
たはＬＰＳ（陽性コントロール）で１〜３日処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２
ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１：２０希釈の適切な
ＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクローナル抗体とともに、
４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳ
ｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーにより
分析する。FACS analysis of surface antigens is performed as follows. Cells were treated with increasing concentrations of DR5 or LPS (positive control) for 1-3 days, 1% BSA and 0.02
Wash with PBS containing mM sodium azide, then with a 1:20 dilution of the appropriate FITC- or PE-labeled monoclonal antibody,
Incubate at 4 ° C for 30 minutes. After further washing, the labeled cells were
Analyze by flow cytometry on a can (Becton Dickinson).

【０５２４】 （サイトカインの産生への効果） 樹状細胞により生成されるサイトカイン、特にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免
疫応答の開始において重要である。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応
答の発達に強力に影響を与え、そして細胞傷害性Ｔ細胞機能およびＮＫ細胞機能
を誘導する。ＥＬＩＳＡを用いて以下のようにＩＬ−１２放出を測定する。樹状
細胞（１０6／ｍｌ）を、漸増濃度のＤＲ５で２４時間処理する。ＬＰＳ（１０
０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして細胞培養物に添加する。次いで、細
胞培養物からの上清を収集し、そして市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量
について分析する。キットに提供される標準的プロトコールを用いる。Effects on Cytokine Production Cytokines produced by dendritic cells, particularly IL-12, are important in initiating a T-cell dependent immune response. IL-12 strongly influences the development of a Th1 helper T cell immune response and induces cytotoxic and NK cell functions. The IL-12 release is measured using an ELISA as follows. Dendritic cells (10 6 / ml) are treated with increasing concentrations of DR5 for 24 hours. LPS (10
0 ng / ml) is added to the cell culture as a positive control. The supernatant from the cell culture is then collected and a commercially available ELISA kit (eg, R & D)
Analyze for IL-12 content using Systems (Minneapolis, MN). Use the standard protocol provided in the kit.

【０５２５】 （ＭＨＣクラスＩＩ、補助刺激分子および接着分子の発現への効果） 細胞表面抗原の３つの主なファミリー（接着分子、抗原提示に関与する分子、
およびＦｃレセプター）が、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原およ
び他の補助刺激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１）の発現の調節は、単球
の抗原提示能力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレ
セプターの発現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用
の改善と相関し得る。Effects on the Expression of MHC Class II, Co-stimulatory and Adhesion Molecules Three main families of cell surface antigens (adhesion molecules, molecules involved in antigen presentation,
And Fc receptors) can be identified on monocytes. Modulation of the expression of MHC class II antigens and other costimulatory molecules (eg, B7 and ICAM-1) can result in changes in the ability of monocytes to present antigen and to induce T cell activation. Increased expression of the Fc receptor may correlate with improved monocyte cytotoxic activity, cytokine release and phagocytosis.

【０５２６】 ＦＡＣＳ分析は、以下のように表面抗原を試験するために用いられる。単球を
、漸増濃度のＤＲ５またはＬＰＳ（陽性コントロール）で１〜５日処理し、１％
ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで
１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクロ
ーナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標
識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフロー
サイトメトリーにより分析する。[0526] FACS analysis is used to test for surface antigens as follows. Monocytes were treated with increasing concentrations of DR5 or LPS (positive control) for 1-5 days, 1%
Wash with PBS containing BSA and 0.02 mM sodium azide, then incubate with the appropriate FITC- or PE-labeled monoclonal antibody at a 1:20 dilution for 30 minutes at 4 ° C. After a further wash, the labeled cells are analyzed by flow cytometry on a FACScan (Becton Dickinson).

【０５２７】 （単球活性化および／または生存の増加） 単球を活性化する（あるいは、不活化する）および／または単球の生存を増加
させる（あるいは、単球の生存を低下させる）分子についてのアッセイは、当該
分野で公知であり、そして本発明の分子が単球のインヒビターまたはアクチベー
ターとして機能するか否かを決定するために慣用的に適用され得る。ＤＲ５、Ｄ
Ｒ５のアゴニストまたはアンタゴニストは、以下に記載の３つのアッセイを用い
てスクリーニングされ得る。これらのアッセイのそれぞれについて、末梢血単核
細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心分
離により、単一のドナー白血球パック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋ）（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から精製する。単球を向
流遠心性エルトリエーション（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａ
ｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によりＰＢＭＣから単離する。(Monocyte Activation and / or Increase in Survival) Molecules that activate (or inactivate) monocytes and / or increase the survival of monocytes (or decrease the survival of monocytes) Assays for are known in the art and can be routinely applied to determine if a molecule of the present invention functions as a monocyte inhibitor or activator. DR5, D
R5 agonists or antagonists can be screened using the three assays described below. For each of these assays, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were centrifuged through Histopaque gradients (Sigma) by single donor leukocyte packs (America).
n Red Cross, Baltimore, MD). Monocytes are counterflowed by centrifugal elutriation (counterflow centrifuga).
Isolation from PBMCs by elution.

【０５２８】 （１．単球生存アッセイ） ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在
下で培養した場合、次第に生存率が低下する。それらの死は、内部調節されたプ
ロセス（アポトーシス）から生じる。活性化因子、例えばＴＮＦ−αの培養物へ
の添加は、細胞の生存を劇的に改善し、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。ヨウ化
プロピジウム（ＰＩ）染色を用いて、以下のようにアポトーシスを測定する。単
球を、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの存在下（陰性コントロール）、および試
験される種々の濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培
地（陽性コントロール）中で、４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍ
ｌでＰＩを含有するＰＢＳ中で２×１０6／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣ
Ｓｃａｎ分析の前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩ取り込みは、この実
験パラダイムにおけるＤＮＡの断片化と相関することを示している。1. Monocyte Survival Assay Human peripheral blood monocytes gradually lose viability when cultured in the absence of serum or other stimuli. Their death results from an internally regulated process (apoptosis). Addition of an activator, such as TNF-α, to the culture dramatically improves cell survival and prevents DNA fragmentation. Apoptosis is measured using propidium iodide (PI) staining as follows. Monocytes were cultured for 48 hours in serum-free medium (positive control) in polypropylene tubes in the presence of 100 ng / ml TNF-α (negative control) and in the presence of various concentrations of compound to be tested. I do. Cells were grown to a final concentration of 5 μg / m
at a concentration of 2 × 10 6 / ml in PBS containing PI and then FAC
Incubate at room temperature for 5 minutes before Scan analysis. PI incorporation has been shown to correlate with DNA fragmentation in this experimental paradigm.

【０５２９】 （２．サイトカイン放出への影響） 単球／マクロファージの重要な機能は、
刺激後のサイトカインの放出を通じた免疫系の他の細胞集団へのそれらの調節活
性である。サイトカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡは、以下のように実施
する。ヒト単球を、５×１０5細胞／ｍｌの密度で、漸増濃度のＤＲ５とともに
、およびＤＲ５が存在しない以外は同じ条件下で、インキュベートする。ＩＬ−
１２の産生については、この細胞を、ＤＲ５の存在下でＩＦＮ−γ（１００Ｕ／
ｍｌ）とともに１晩プライムする。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加す
る。馴化培地を２４時間後に収集し、そして使用するまで凍結保存する。次いで
、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を市販のＥＬＩＳ
Ａキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）
を用い、そしてキットに提供される標準的プロトコールを適用して実施する。(2. Effect on cytokine release) The important functions of monocytes / macrophages are
Their regulatory activity on other cell populations of the immune system through the release of cytokines after stimulation. An ELISA for measuring cytokine release is performed as follows. Human monocytes are incubated at a density of 5 × 10 5 cells / ml with increasing concentrations of DR5 and under the same conditions but without DR5. IL-
For production of 12, the cells were transfected with IFN-γ (100 U /
primed overnight with 1 ml). Then LPS (10 ng / ml) is added. Conditioned media is collected after 24 hours and stored frozen until use. The measurement of TNF-α, IL-10, MCP-1 and IL-8 was then performed by a commercial ELISA.
A kit (eg, R & D Systems Minneapolis, MN)
And applying standard protocols provided in the kit.

【０５３０】 （３．酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ）） 精製した単球
を９６ウェルプレートに２〜１×１０5細胞／ウェルでプレートする。漸増濃度
のＤＲ５をこのウェルに、総量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１
０％ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）中で添加する。３日間のインキュベー
ション後、このプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除く。マクロフ
ァージの単層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、５．５ｍＭデキス
トロース、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を、
刺激物質（２００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加する。このプレートを３７℃で２
時間インキュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加
して反応を停止する。吸光度を６１０ｎｍで読み取る。マクロファージにより産
生されるＨ2Ｏ2の量を算出するため、既知のモル濃度のＨ2Ｏ2溶液の標準曲線を
それぞれの実験について実施する。(3. Oxidative burst) Purified monocytes are plated in a 96-well plate at 2-1 × 10 5 cells / well. Increasing concentrations of DR5 were added to the wells in a total volume of 0.2 ml of culture medium (RPMI 1640 + 1).
0% FCS, glutamine and antibiotics). After 3 days of incubation, the plate is centrifuged and the medium is removed from the wells. In a monolayer of macrophages, 0.2 ml of a phenol red solution (140 m
M NaCl, 10 mM potassium phosphate buffer pH 7.0, 5.5 mM dextrose, 0.56 mM phenol red and 19 U / ml HRPO)
Add with stimulant (200 nM PMA). Plate at 37 ° C for 2
Incubate for hours and stop the reaction by adding 20 μl per well of 1 N NaOH. The absorbance is read at 610 nm. To calculate the amount of H 2 O 2 produced by the macrophages, a standard curve of a known molar concentration of the H 2 O 2 solution is performed for each experiment.

【０５３１】 本実施例において記載される研究は、ＤＲ５タンパク質における活性を試験す
る。しかし、当業者は、ＤＲ５ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ＤＲ
５のアゴニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示す
る研究を容易に改変し得る。The study described in this example tests activity on DR5 protein. However, those skilled in the art will appreciate that DR5 polynucleotides (eg, gene therapy), DR5
To test the activity of 5 agonists and / or antagonists, the illustrated studies can be readily modified.

【０５３２】 （実施例１０：血管内皮細胞の増殖へのＤＲ５の効果） １日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ
）、１６ユニット／ｍｌヘパリン、および５０ユニット／ｍｌ内皮細胞増殖補充
物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含有するＭ１９９培地
中で、３５ｍｍシャーレあたり２〜５×１０4細胞の密度で播種する。２日目に
、この培地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌヘパリンを含有するＭ１９９で
置換する。配列番号２のＤＲ５タンパク質および陽性コントロール（例えば、Ｖ
ＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））を種々の濃度で添加する。４日目およ
び６日目に、培地を交換する。８日目に、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを用
いて細胞数を決定する。Example 10 Effect of DR5 on Proliferation of Vascular Endothelial Cells On day 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were treated with 4% fetal bovine serum (FBS).
), 16 units / ml heparin, and 50 units / ml endothelial cell growth supplement (ECGS, Biotechnique, Inc.) in M199 medium at a density of 2-5 x 10 4 cells per 35 mm dish. On day 2, the medium is replaced with M199 containing 10% FBS, 8 units / ml heparin. The DR5 protein of SEQ ID NO: 2 and a positive control (eg, V
EGF and basic FGF (bFGF)) are added at various concentrations. On days 4 and 6, the medium is changed. On day 8, cell numbers are determined using a Coulter Counter.

【０５３３】 ＨＵＶＥＣ細胞数の増加は、ＤＲ５が血管内皮細胞を増殖させ得ることを示す
。An increase in HUVEC cell numbers indicates that DR5 can proliferate vascular endothelial cells.

【０５３４】 本実施例において記載される研究は、ＤＲ５タンパク質における活性を試験す
る。しかし、当業者は、ＤＲ５ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）
、ＤＲ５のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを試験するために、例示す
る研究を容易に改変し得る。The study described in this example tests activity on the DR5 protein. However, those skilled in the art will appreciate that the activity of DR5 polynucleotides (eg, gene therapy)
The illustrated studies can be readily modified to test agonists and / or antagonists of DR5.

【０５３５】 （実施例１１：抗体の産生） （Ａ．ハイブリドーマ技術） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、ＤＲ
５を発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動
物に投与される。好ましい方法において、ＤＲ５タンパク質の調製物が調製され
、そして精製されて、ネイティブの夾雑物を実質的に含まないようにする。次い
で、このような調製物は、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成する
ために動物に導入される。Example 11 Production of Antibodies A. Hybridoma Technology Antibodies of the invention can be prepared by various methods (Current Pro
tocols, see Chapter 2). As one example of such a method, DR
Cells expressing 5 are administered to animals to induce the production of serum containing polyclonal antibodies. In a preferred method, a preparation of the DR5 protein is prepared and purified to be substantially free of native contaminants. Such a preparation is then introduced into an animal to produce a higher specific activity polyclonal antiserum.

【０５３６】 タンパク質ＤＲ５に特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使
用して調製され得る（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９
７５）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７
６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６
）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、
５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくは、マウス）を、Ｄ
Ｒ５ポリぺプチドで免疫するか、またはより好ましくは、分泌ＤＲ５ポリぺプチ
ド発現細胞で免疫する。このようなポリペプチド発現細胞は、任意の適切な組織
培養培地（好ましくは、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し
、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、
および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したアール改変イーグル
培地）において培養され得る。[0537] Monoclonal antibodies specific for protein DR5 can be prepared using hybridoma technology (Koehler et al., Nature 256: 495 (19
75); Koehler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (197)
6); Koehler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976)
); Hammerling et al .: Monoclonal Antibodies.
and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.W. Y. ,
563-681 (1981)). Generally, animals (preferably mice) are
Immunize with R5 polypeptide, or more preferably, with secreted DR5 polypeptide-expressing cells. Such polypeptide expressing cells are supplemented with any suitable tissue culture medium, preferably 10% fetal calf serum (inactivated at about 56 ° C.), and contain about 10 g / l of non-essential amino acids, about 1 2,000 U / ml penicillin,
And Earle's modified Eagle's medium supplemented with about 100 μg / ml streptomycin).

【０５３７】 このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切な骨髄腫細胞株と融合させる
。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、ＡＴＣ
Ｃから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合後
、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次いで
Ｗａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１
９８１））に記載されるように限界希釈によってクローニングする。次いで、こ
のような選択によって得られるハイブリドーマ細胞を、ＤＲ５ポリぺプチドに結
合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイする。The spleen cells of such mice are extracted and fused with a suitable myeloma cell line. Any suitable myeloma cell line can be used according to the present invention;
It is preferred to use the parental myeloma cell line (SP2O) available from C. After fusion, the resulting hybridoma cells are selectively maintained in HAT medium and then expanded to Wands et al. (Gastroenterology 80: 225-232 (1
Cloning by limiting dilution as described in 981)). The hybridoma cells resulting from such a selection are then assayed to identify clones that secrete antibodies capable of binding the DR5 polypeptide.

【０５３８】 あるいは、ＤＲ５ポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタイ
プ抗体を使用して２段階の手順において生成し得る。このような方法は、抗体自
体が抗原であり、それゆえ第２の抗体に結合する抗体を得ることが可能であると
いう事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使用して、動
物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾細胞を使用
して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ細胞をスク
リーニングして、ＤＲ５タンパク質特異的抗体に結合する能力が、ＤＲ５によっ
てブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定する。このような抗体は、Ｄ
Ｒ５タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を
免疫してさらなるＤＲ５タンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用され
得る。Alternatively, additional antibodies capable of binding the DR5 polypeptide can be generated in a two-step procedure using anti-idiotypic antibodies. Such methods take advantage of the fact that the antibody itself is an antigen, and thus it is possible to obtain an antibody that binds to a second antibody. According to this method, an animal, preferably a mouse, is immunized using a protein-specific antibody. The spleen cells of such animals are then used to produce hybridoma cells. The hybridoma cells are then screened to identify a clone that produces an antibody that can be blocked by DR5 for its ability to bind to a DR5 protein-specific antibody. Such an antibody is D
It includes anti-idiotypic antibodies to R5 protein-specific antibodies and can be used to immunize animals to induce the formation of additional DR5 protein-specific antibodies.

【０５３９】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は、「ヒト化」される。この
ような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来
する遺伝子構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト
化抗体を産生するための方法は当該分野で公知である（総説については、Ｍｏｒ
ｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許
第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒ
ｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５
３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１２：６４３ （１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。For in vivo use of antibodies in humans, the antibodies are “humanized”. Such antibodies can be produced by using a genetic construct derived from a hybridoma cell producing the monoclonal antibody described above. Methods for producing chimeric and humanized antibodies are known in the art (for a review, see Mor)
rison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., Bio.
Techniques 4: 214 (1986); Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Taniguchi et al., EP 171496; Mor.
Rison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 86015.
33; Robinson et al., WO 8702671; Boulianne et al., N.
Nature 312: 643 (1984); Neuberger et al., Natu.
re 314: 268 (1985)).

【０５４０】 （Ｂ．ｓｃＦｖｓのライブラリー由来のＤＲ５に対する抗体フラグメントの単
離） ヒトＰＢＬから単離された天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝露されても
、されていなくてもよい本発明のポリペプチドに対する反応性を有する抗体フラ
グメントの大きいライブラリーに構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７
９３号（参考としてその全体が本明細書中に援用される））。B. Isolation of Antibody Fragments Against DR5 from a Library of scFvs The present invention provides that naturally occurring V genes isolated from human PBLs may or may not be exposed to donors. (See, eg, US Pat. No. 5,885,7).
No. 93, which is hereby incorporated by reference in its entirety).

【０５４１】 （ライブラリーのレスキュー） ＷＯ ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖｓ
のライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレスキュー
するため、ファージミドを保有する約１０9個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍ
ｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種し、そして振盪しながら０．８のＯ．
Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ
−ＧＬＵに接種し、２×１０8ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３遺伝子ＩＩＩ
、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そして培養物を振盪なしで３
７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃で４５分間インキ
ュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そし
てペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０
μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そして一晩増殖させる。フ
ァージをＷＯ９２／０１０４７に記載のように調製する。(Library Rescue) As described in WO 92/01047, scFvs from human PBL RNA
Build a library for To rescue phage displaying antibody fragments, approximately 10 9 E. coli harboring phagemids were rescued. E. coli, 50m
1 × 2 × TY (containing 1% glucose and 100 μg / ml ampicillin) (2 × TY-AMP-GLU) and inoculate 0.8 O.L. with shaking.
D. Propagate to growth. Using 5 ml of this culture, 50 ml of 2 × TY-AMP
It was inoculated into -GLU, 2 × 10 8 TU of Δ gene 3 helper (M13 gene III
, WO92 / 01047) and the cultures are shaken without shaking for 3 hours.
Incubate at 7 ° C for 45 minutes and then at 37 ° C with shaking for 45 minutes. The culture is incubated at 4000 r. p. m. And pellet the pellet in 2 liters of 2 × TY (100 μg / ml ampicillin and 50 μl).
(containing μg / ml kanamycin) and grow overnight. Phage is prepared as described in WO 92/01047.

【０５４２】 Ｍ１３遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３遺伝子ＩＩＩヘルパーフ
ァージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグメン
トを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合アビデ
ィティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を供
給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖させる
ことにより、感染性Ｍ１３遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪なしで３
７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時間イン
キュベートする。細胞をペレット化し（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ．
ｐ．ｍ．／分で１０分間）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３
００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ
粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地か
ら精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィル
ター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０13 形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。The M13 gene III is prepared as follows: M13 gene III helper phage does not encode the gene III protein. Therefore, phage displaying antibody fragments (phagemids) have a greater binding avidity for the antigen. During phage morphogenesis, infectious M13 gene III particles are generated by growing helper phage in cells carrying a pUC19 derivative that supplies the wild-type gene III protein. Cultures were grown 3 times without shaking.
Incubate at 7 ° C. for 1 hour, then incubate at 37 ° C. for another hour with shaking. The cells are pelleted (IEC-Centra 8, 400r.
p. m. / Min for 10 minutes), 100 μg / ml ampicillin and 25 μg / ml
2 x TY broth containing 2 ml of kanamycin (2 x TY-AMP-KAN) 3
Resuspended in 00 ml and grown overnight at 37 ° C. with shaking. The phage particles were purified and concentrated from the culture medium by two PEG precipitations (Sambrook et al., 1990), resuspended in 2 ml PBS, and passed through a 0.45 μm filter (Minisart NML; Sartorius) to about 10 13 A final concentration of transduction units / ml (ampicillin resistant clone) is obtained.

【０５４３】 （ライブラリーのパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリぺプチドの１００ｍｇ
／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩コーテ
ィングする。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロ
ックし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをそのチュー
ブに適用し、そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベート
し、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリ
エチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることにより
ファージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７
℃で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対
数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、そのＥ．ｃｏｌｉを
１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート
上にプレーティングする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のように
Ｍ１３遺伝子ＩＩＩヘルパーファージでレスキューし、引き続く回の選択のため
のファージを調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回
について反復し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ−２０で２０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。(Panning of Library) Immunotubes (Nunc) was prepared by using 100 mg of the polypeptide of the present invention.
Coat overnight in PBS with 4 ml of either 10 / ml or 10 mg / ml. Tubes are blocked with 2% Marvel-PBS at 37 ° C. for 2 hours, then washed three times in PBS. Approximately 10 13 TU of phage is applied to the tube and incubated at room temperature for 30 minutes while tilting up and down on a rotating wheel and then allowed to stand for an additional 1.5 hours. Tube is PBS 0.1% Twe
Wash 10 times with en-20 and 10 times with PBS. The phage was eluted by adding 1 ml of 100 mM triethylamine and spinning up and down on a turntable for 15 minutes, after which 0.5 ml of 1.0 M Tris-HCl was added to the solution.
Neutralize immediately at pH 7.4. The eluted phages were then combined with bacteria with 37
C. for 30 minutes, using phage with 10 ml of mid-log phase E. coli. E. coli TG1. The E.C. E. coli is plated on a TYE plate containing 1% glucose and 100 μg / ml ampicillin. The resulting bacterial library is then rescued with M13 gene III helper phage as described above to prepare phage for subsequent rounds of selection. This process was then repeated for all four times of affinity purification, with the third and fourth times washing the tubes with PBS, 0.1% Tw.
Increase to 20 times with een-20 and 20 times with PBS.

【０５４４】 （結合剤の特徴付け） 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリぺプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかでコーティングしたマ
イクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを行う。ＥＬＩＳＡ中の陽性クロー
ンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＷＯ９２／０１０４７を参照の
こと）、次いで配列決定することによりさらに特徴付ける。Characterization of Binders Using phage eluted from the third and fourth rounds of selection, E. coli was used. coli
HB 2151 is infected and soluble scFv is generated from a single colony for the assay (Marks et al., 1991). 50 mM bicarbonate, pH 9.
ELISA is performed using microtiter plates coated with any of the polypeptides of the present invention in 6 at 10 pg / ml. Positive clones in the ELISA are further characterized by PCR fingerprinting (see, eg, WO 92/01047), followed by sequencing.

【０５４５】 （実施例１２：ＤＲ５遺伝子発現の組織分布） ノーザンブロット分析を行って、とりわけＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）によっ
て記載される方法を用いて、ヒト組織におけるＤＲ５遺伝子発現を調べた。ＤＲ
５タンパク質の全ヌクレオチド配列（配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブを、
ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）を製造者の説明書に従って用いて32Ｐで標識した。標識後、プロ
ーブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に
従って用いて精製した。次いで、精製した標識プローブを用いて、種々のヒト組
織をＤＲ５ ｍＲＮＡについて調べた。Example 12: Tissue distribution of DR5 gene expression Northern blot analysis was performed to determine DR5 gene expression in human tissues, particularly using the method described by Sambrook et al., Supra. DR
A cDNA probe containing the entire nucleotide sequence of the 5 proteins (SEQ ID NO: 1)
rediprime ™ DNA labeling system (Amersham Life S
) was labeled with 32 P according to the manufacturer's instructions. After labeling, the probe was applied to a CHROMA SPIN-100 ™ column (Clontech Lab).
oratories, Inc. ) Was purified according to the manufacturer's protocol number PT1200-1. Various human tissues were then examined for DR5 mRNA using the purified labeled probe.

【０５４６】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む複数組織のノーザ
ン（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から
入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って用いて標識プロ
ーブを用いて調べた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ブロットをマウン
トし、そして−７０℃にて一晩フィルムに曝した。このフィルムを標準的な手順
に従って現像した。ＤＲ５の発現は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓
、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸、末梢白血球（ＰＢＬ）
、リンパ節、骨髄および胎児肝臓で検出された。[0547] Northern (MTN) blots of multiple tissues, including various human tissues (H) or human immune system tissues (IM), were obtained from Clontech (Palo Alto, Calif.) And ExpressHyb ™ hybridization solution (Clon).
tech) was tested using a labeled probe according to the manufacturer's protocol number PT1190-1. After hybridization and washing, blots were mounted and exposed to film overnight at -70 ° C. The film was developed according to standard procedures. DR5 expression is detected in heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, pancreas, spleen, thymus, prostate, testis, uterus, small intestine, colon, peripheral leukocytes (PBL)
, Lymph nodes, bone marrow and fetal liver.

【０５４７】 ＤＲ５の発現もまた、以下の癌細胞株：ＨＬ−６０（前骨髄球性白血病、Ｈｅ
ｌａ Ｓ３、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎ
ｅｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ））、ＭＯＬＴ４（リンパ芽球性白血病）、Ｒａｊ
ｉ（バーキットリンパ腫）、ＳＷ４８０（結腸直腸腺癌）、Ａ５４９（肺癌腫）
、およびＧ３６１（黒色腫））においてノザンブロットにより評価し、そして試
験した細胞株の全てにおいて検出した。The expression of DR5 was also determined by the following cancer cell lines: HL-60 (promyelocytic leukemia, He
la S3, K562 (chronic myelogenous leukemia (chronic myelogen)
eous leukemia)), MOLT4 (lymphoblastic leukemia), Raj
i (Burkit's lymphoma), SW480 (colorectal adenocarcinoma), A549 (lung carcinoma)
And G361 (melanoma)) and were detected in all of the cell lines tested.

【０５４８】 （実施例１３：ＤＲ５遺伝子における変化を決定する方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者からＲＮ
Ａを単離する。次いで、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分野で公知
のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。次いで、
このｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを用いる
ＰＣＲのための鋳型として使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄｒａｎｓ
ｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の緩衝溶液
を使用する、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；および７０
℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルから構成される。Example 13 Method for Determining Changes in the DR5 Gene RNs from whole family or individual patients presenting the phenotype of interest (eg, disease)
A is isolated. CDNA is then generated from these RNA samples using protocols known in the art (see Sambrook). Then
This cDNA is used as a template for PCR using primers surrounding the region of interest in SEQ ID NO: 1. Suggested PCR conditions are Sidrans
ky, D.S. Et al., Science 252: 706 (1991) using a buffer solution at 95 ° C. for 30 seconds; 52-58 ° C. for 60-120 seconds; and 70
Consists of 35 cycles at 60C for 60-120 seconds.

【０５４９】 次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い
、それらの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識したプライマーを使
用して配列決定する。（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｄ
Ｒ５の選択したエキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、そしてゲノ
ムＰＣＲ産物を分析してその結果を確認する。次いで、ＤＲ５において疑わしい
変異を有するＰＣＲ産物をクローン化し、そして配列決定し、直接配列決定の結
果を確認する。The PCR products are then sequenced using SequiTherm Polymerase using primers labeled at their 5 ′ end with T4 polynucleotide kinase. (Epicentre Technologies). D
The intron-exon boundaries of the selected exon of R5 are also determined, and the genomic PCR products are analyzed to confirm the results. The PCR product with the suspected mutation in DR5 is then cloned and sequenced, confirming the results of direct sequencing.

【０５５０】 ＤＲ５のＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．ＡおよびＧｒａｈａｍ，Ｍ．Ｗ．
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６（１９９１
）に記載のようにＴテールベクターにクローン化し、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉ
ｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定する。罹患した個
体を、罹患していない個体には存在しないＤＲ５における変異により同定する。The PCR product of DR5 was purchased from Holton, T.W. A and Graham, M .; W.
Nucleic Acids Research, 19: 1156 (1991).
) And cloned into a T-tail vector as described in T7 polymerase (Uni).
Sequenced by ted States Biochemical. Affected individuals are identified by mutations in DR5 that are not present in unaffected individuals.

【０５５１】 ゲノム再配置もまた、ＤＲ５遺伝子における変化を決定する方法として観察さ
れる。当該分野で公知の技術を使用して単離したゲノムクローンを、ジゴキシゲ
ニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉ
ｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｇ．ら、
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３５：７３−９９（１９９１）に記載の
ようにＦＩＳＨを行う。ＤＲ５ゲノムの遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーシ
ョンのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プローブとのハイ
ブリダイゼーションを行う。[0555] Genomic rearrangement is also observed as a way to determine changes in the DR5 gene. Genomic clones isolated using techniques known in the art can be isolated from digoxigenin deoxy-uridine 5'-triphosphate (Boehringer Manheii).
nick translation using Johnson, Cg. Et al.,
Methods Cell Biol. FISH is performed as described in 35: 73-99 (1991). For specific hybridization to the DR5 genome locus, a large excess of human cot-1 DNA is used to hybridize with the labeled probe.

【０５５２】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピ
ングのための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメ
ラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィ
ルターとを組み合わせて用いて得る。（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｇ．ら、Ｇｅｎｅｔ
．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５（１９９１））。ＩＳｅｅ Ｇｒ
ａｐｈｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、イメージ収集、分
析および染色体部分長測定を行う。（Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ， Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）。ＤＲ５のゲノム領域の染色体変化（プローブに
よりハイブリダイズされる）を、挿入、欠失および転座として同定する。これら
のＤＲ５変化を関連疾患の診断マーカーとして使用する。The chromosomes are counterstained with 4,6-diamino-2-phenylidol and propidium iodide to generate a combination of C and R bands. Aligned images for accurate mapping were obtained using a triple band filter set (Chroma T).
technology, Brattleboro, VT) and a cooled charge-coupled device camera (Photometrics, Tucson, AZ) and a variable excitation wavelength filter. (Johnson, Cg. Et al., Genet.
. Anal. Tech. Appl. , 8:75 (1991)). Isee Gr
Image collection, analysis, and chromosome segment length measurements are performed using the aphical Program System. (Invision Corporati
on, Durham, NC). Chromosomal changes in the genomic region of DR5 (hybridized by the probe) are identified as insertions, deletions and translocations. These DR5 changes are used as diagnostic markers for related diseases.

【０５５３】 （実施例１４：生物学的サンプル中のＤＲ５の異常レベルを検出する方法） ＤＲ５ポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてＤＲ５の上昇
または低下が検出される場合、このポリペプチドは、特定の表現型についてのマ
ーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者は以下のアッセイ
をそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される。Example 14 Method of Detecting Abnormal Levels of DR5 in a Biological Sample A DR5 polypeptide can be detected in a biological sample, and if an increase or decrease in DR5 is detected, A polypeptide is a marker for a particular phenotype. It is understood that there are a number of detection methods and, therefore, those skilled in the art can modify the following assays to suit their particular needs.

【０５５４】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、サンプル中、好ましくは、
生物学的サンプル中のＤＲ５を検出する。マイクロタイタープレートのウェルを
、最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌでＤＲ５に対して特異的な抗体でコーティン
グする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであって
、そして当該分野で公知の技術を使用して産生される。ウェルに対するＤＲ５の
非特異的結合が減少するように、このウェルをブロックする。For example, using an antibody sandwich ELISA, preferably in a sample,
Detect DR5 in a biological sample. The wells of the microtiter plate are coated with an antibody specific for DR5 at a final concentration of 0.2-10 μg / ml. The antibodies are either monoclonal or polyclonal, and are produced using techniques known in the art. This well is blocked so that non-specific binding of DR5 to the well is reduced.

【０５５５】 次に、コーティングしたウェルを、ＤＲ５含有サンプルを用いて室温で２時間
を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの段階希釈を使用して結果
を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で３回洗浄し、
非結合ＤＲ５を除去する。Next, the coated wells are incubated with the sample containing DR5 for more than 2 hours at room temperature. Preferably, serial dilutions of the sample should be used to confirm the results. Next, the plate is washed three times with deionized or distilled water,
Remove unbound DR5.

【０５５６】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、そして室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イ
オン水または蒸留水で３回洗浄し、非結合の結合体を除去する。Next, 50 μl of the specific antibody-alkaline phosphatase conjugate was added to 25 to 400 n.
g and incubate for 2 hours at room temperature. The plate is again washed three times with deionized or distilled water to remove unbound conjugate.

【０５５７】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートして基質と蛍光とを切断する。蛍光をマイクロタイタープレートリーダ
ーにより測定する。コントロールサンプルの段階希釈からの実験結果を使用して
標準曲線を作成し、そしてＸ軸（対数スケール）にサンプル濃度を、そしてＹ軸
（直線スケール）に蛍光または吸光度をプロットする。次いで、このサンプルの
測定された蛍光に基づいた標準曲線を用いてサンプル中のＤＲ５ポリペプチド濃
度を補間する。Add 75 μl of 4-methylumbelliferyl phosphate (MUP) or p-nitrophenyl phosphate (NPP) substrate solution to each well and incubate at room temperature for 1 hour to cleave the substrate and fluorescence. Fluorescence is measured with a microtiter plate reader. A standard curve is generated using experimental results from serial dilutions of control samples, and plots sample concentration on the X-axis (log scale) and fluorescence or absorbance on the Y-axis (linear scale). The DR5 polypeptide concentration in the sample is then interpolated using a standard curve based on the measured fluorescence of the sample.

【０５５８】 （実施例１５：ＤＲ５のレベル低下を処置する方法） 本発明は、体内におけるＤＲ５の生物学的活性のレベルを増大させる必要のあ
る個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量のＤＲ５アゴニス
トを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。本発明における使
用のために好ましいアンタゴニストは、ＤＲ５特異的抗体である。Example 15 Method of Treating a Reduced Level of DR5 The present invention relates to a method for treating an individual in need of increasing the level of biological activity of DR5 in the body, comprising: Administering to such an individual a composition comprising a therapeutically effective amount of a DR5 agonist. Preferred antagonists for use in the present invention are DR5-specific antibodies.

【０５５９】 さらに、個体におけるＤＲ５の標準または正常発現レベルの低下により引き起
こされる状態は、ＤＲ５を、好ましくは可溶および／または分泌形態で投与する
ことにより処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ＤＲ５ポリ
ペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方法は、この
ような個体に、このような個体でＤＲ５の生物学的活性レベルを増加させる量の
ＤＲ５を含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。It is further understood that conditions caused by reduced levels of normal or normal expression of DR5 in an individual can be treated by administering DR5, preferably in a soluble and / or secreted form. Accordingly, the present invention also provides a method of treating an individual in need of increasing levels of a DR5 polypeptide. The method comprises administering to such an individual a pharmaceutical composition comprising DR5 in an amount that increases the level of biological activity of DR5 in such individual.

【０５６０】 例えば、ＤＲ５ポリペプチドのレベルが低下した患者は、ポリペプチドを、１
日用量０．１〜１００ｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、ポリペプチ
ドは可溶および／または分泌形態である。For example, a patient with a reduced level of DR5 polypeptide will have 1 polypeptide.
Take a daily dose of 0.1-100 g / kg for 6 consecutive days. Preferably, the polypeptide is in a soluble and / or secreted form.

【０５６１】 （実施例１６：ＤＲ５のレベル上昇を処置する方法） 本発明はまた、体内におけるＤＲ５の生物学的活性のレベルを減少させる必要
のある個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量のＤＲ５また
はそのアンタゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する
。Example 16 Method of Treating Elevated Levels of DR5 The present invention also relates to a method for treating an individual in need of decreasing the level of biological activity of DR5 in the body, the method comprising: Administering to such an individual a composition comprising a therapeutically effective amount of DR5 or an antagonist thereof.

【０５６２】 アンチセンス技術を使用してＤＲ５の産生を阻害する。この技術は、癌のよう
な様々な病因に起因するＤＲ５ポリペプチド、好ましくは可溶および／または分
泌形態のポリペプチドのレベルを低下させる方法の１つの例である。Inhibit DR5 production using antisense technology. This technique is one example of a method for reducing levels of a DR5 polypeptide, preferably in soluble and / or secreted form, resulting from various etiologies, such as cancer.

【０５６３】 例えば、ＤＲ５のレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチセンス
ポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／ｋｇ
／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば、７日
間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。For example, patients diagnosed with abnormally elevated levels of DR5 can receive antisense polynucleotides at 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 and 3.0 mg / kg.
/ Day intravenously for 21 days. If there is sufficient resistance to the treatment, the treatment is repeated after a 7 day drug holiday.

【０５６４】 （実施例１７：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、可溶性および／または成熟ＤＲ５ポリペプチドを
発現し得る線維芽細胞を患者に移植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮
膚生検により被験者から得られる。得られた組織を組織培養培地中に配置し、小
片に分割する。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、約１０片を各
フラスコに置く。このフラスコを倒置し、しっかりと閉め、そして室温で一晩放
置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定
させたままにし、そして新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびス
トレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコ
を３７℃で約１週間インキュベートする。Example 17 Treatment Methods Using Gene Therapy-Ex Vivo One method of gene therapy is to transplant fibroblasts capable of expressing a soluble and / or mature DR5 polypeptide into a patient. Generally, fibroblasts are obtained from a subject by skin biopsy. The resulting tissue is placed in a tissue culture medium and divided into small pieces. A small chunk of tissue is placed on the wet surface of a tissue culture flask and approximately 10 pieces are placed in each flask. The flask is inverted, closed tightly, and left at room temperature overnight. After 24 hours at room temperature, the flask is inverted, the tissue mass remains fixed at the bottom of the flask, and fresh medium (eg, Ham's F12 medium containing 10% FBS, penicillin and streptomycin) is added. The flask is then incubated at 37 ° C. for about one week.

【０５６５】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後、単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてさ
らに大きなフラスコにスケールアップする。At this point, fresh medium is added and then changed every few days. After another two weeks of culture, a monolayer of fibroblasts appears. The monolayer is trypsinized and scaled up to a larger flask.

【０５６６】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。PMV-7 (Ki) flanked by Moloney murine sarcoma virus long terminal repeats
rschmeier, P .; T. DNA, 7: 219-25 (1988)) is digested with EcoRI and HindIII and treated with calf intestinal phosphatase. The linear vector is fractionated on an agarose gel and purified using glass beads.

【０５６７】 ＤＲ５をコードするｃＤＮＡを、それぞれ５’および３’コード末端配列に対
応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、５’プライマーは
ＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等
量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格ならびに増幅したＥｃｏＲＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に
加える。得られた混合物を二つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する
。次に、連結混合物を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換する。次に
、それを、カナマイシン含有寒天上にプレーティングし、ベクターが適切に挿入
されたＤＲ５を有することを確認する。The cDNA encoding DR5 can be amplified using PCR primers corresponding to the 5 ′ and 3 ′ coding end sequences, respectively. Preferably, the 5 'primer contains an EcoRI site and the 3' primer contains a HindIII site. Equal amounts of the Moloney murine sarcoma virus linear skeleton and amplified EcoRI
And the HindIII fragment are added together in the presence of T4 DNA ligase. The resulting mixture is maintained under conditions appropriate for ligation of the two fragments. The ligation mixture was then used and E.I. E. coli HB101. It is then plated on agar containing kanamycin to confirm that the vector has the properly inserted DR5.

【０５６８】 アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベ
ッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな密度まで増
殖させる。次に、ＤＲ５遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、そしてパッ
ケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージング細胞はＤ
Ｒ５遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、パッケージング細胞
をプロデューサー細胞という）。The amphotropic pA317 or GP + am12 packaging cells were
Grow to confluent density in tissue culture in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) containing 10% calf serum (CS), penicillin and streptomycin. Next, the MSV vector containing the DR5 gene is added to the medium and the packaging cells are transduced with the vector. At this time, the packaging cells are D
Produces infectious viral particles containing the R5 gene (where packaging cells are referred to as producer cells).

【０５６９】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過して、はがれ
たプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を使用して、線維芽細胞を感染
させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そして
プロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そし
て新鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽
細胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈ
ｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必
要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染すると、線維芽細胞を分析し、ＤＲ
５タンパク質が産生されているか否かを決定する。Add fresh medium to the transduced producer cells and then add 10 c
Collect from m-plate confluent producer cells. Spent media containing infectious virus particles is filtered through a Millipore filter to remove detached producer cells, and the media is then used to infect fibroblasts. Remove the medium from the subconfluent plate of fibroblasts and immediately replace with the medium from the producer cells. The medium is removed and replaced with fresh medium. If the titer of the virus is high, virtually all fibroblasts will be infected and no selection is necessary. If the titer is very low, neo or h
It is necessary to use a retroviral vector with a selectable marker such as is. Once the fibroblasts are efficiently infected, the fibroblasts are analyzed and the DR
Determine if 5 proteins are being produced.

【０５７０】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に移植する
。The engineered fibroblasts are then implanted into a host, either alone or after being grown to confluence on Cytodex 3 microcarrier beads.

【０５７１】 （実施例１８：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、ＤＲ５ポリペプチドの
発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およ
びアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）ＤＲ５配列の導入に関する。ＤＲ５ポリヌ
クレオチドは、プロモーター、または標的組織によるＤＲ５ポリペプチドの発現
に必要な任意の他の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され得る。このような
遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｗ
Ｏ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２２号、同
第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａ Ｈ．ら、Ｃａｒｄ
ｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：４７０−４７９（１９９７）；Ｃｈａｏ Ｊ．ら
、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５：５１７−５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆ
ｆ Ｊ．Ａ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７：３１４−３１８（
１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：４０５−４
１１（１９９６）；Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４：
３２８１−３２９０（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参照
のこと。Example 18: Methods of Treatment Using Gene Therapy-In Vivo Another aspect of the invention is the use of in vivo gene therapy methods to treat disorders, diseases, and conditions. This method of gene therapy involves the introduction of a naked nucleic acid (DNA, RNA, and antisense DNA or RNA) DR5 sequence into an animal to increase or decrease the expression of a DR5 polypeptide. A DR5 polynucleotide can be operably linked to a promoter, or any other genetic element required for expression of a DR5 polypeptide by a target tissue. Techniques and methods for such gene therapy and delivery are known in the art, for example,
O90 / 11092, WO98 / 11779; U.S. Pat. Nos. 5,693,622, 5,705,151 and 5,580,859; Et al., Card
iovasc. Res. 35: 470-479 (1997); Chao J. et al. Et al., Pharmacol. Res. 35: 517-522 (1997); Wolf.
fJ. A. , Neuromuscul. Disord. 7: 314-318 (
1997), Schwartz B. et al. Et al., Gene Ther. 3: 405-4
11 (1996); Et al., Circulation 94:
3281-3290 (1996), incorporated herein by reference.

【０５７２】 ＤＲ５ポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細胞に送達する任
意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙空間へ
の注入）によって送達され得る。ＤＲ５ポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受
容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。The DR5 polynucleotide construct is delivered by any method that delivers an injectable substance to the cells of an animal, such as injection into the interstitial space of tissue (heart, muscle, skin, lung, liver, intestine, etc.). Can be done. DR5 polynucleotide constructs can be delivered in a pharmaceutically acceptable liquid or aqueous carrier.

【０５７３】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、ＤＲ５ポリヌクレオチドはまた、当業者に周
知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｐ
．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３
９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８５（１
）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。The term “naked” polynucleotide, DNA or RNA, refers to any delivery vehicle (viral sequence, viral particle, liposome formulation, lipofectin, or lipoprotein) that acts to assist, facilitate, or facilitate entry into cells. (Including a precipitant and the like). However, DR5 polynucleotides can also be prepared by liposome formulations (eg, Felgner P) which can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
. L. (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772: 126-13
9 and Abdallah B. (1995) Biol. Cell 85 (1
): 1-7).

【０５７４】 この遺伝子治療方法において使用されるＤＲ５ポリヌクレオチドベクター構築
物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も含まな
い構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡの発現を
駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を
標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合
成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて
、６ヶ月までの期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。The DR5 polynucleotide vector construct used in the gene therapy method is preferably a construct that does not integrate into the host genome and does not contain sequences that allow it to replicate. Any strong promoter known to those of skill in the art can be used to drive expression of the DNA. Unlike other gene therapy techniques, one major advantage of introducing a naked nucleic acid sequence into a target cell is the transient nature of polynucleotide synthesis in that cell. Studies have shown that non-replicating DNA sequences can be introduced into cells to provide production of the desired polypeptide for up to six months.

【０５７５】 ＤＲ５ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓
、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、
腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の
間隙空間に送達され得る。組織の間隙空間は、細胞間液、器官組織の細網線維間
のムコ多糖マトリクス、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織のコラ
ーゲン線維、あるいは筋肉細胞の鞘で囲まれた結合組織内の同じマトリクス（ｔ
ｈａｔ ｓａｍｅ ｍａｔｒｉｘ）または骨の裂孔中の結合組織内の同じマトリ
クス（ｔｈａｔ ｓａｍｅ ｍａｔｒｉｘ）を含む。これは、同様に、循環の血
漿およびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の
間隙空間への送達は、以下に考察する理由のために好ましい。それらは、これら
の細胞を含む組織への注入によって、好都合に送達され得る。それらは、好まし
くは、分化した持続性の非***細胞に送達され、そしてその細胞において発現さ
れるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例
えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボで
、筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現するそれらの能力にお
いて、特に適格である。The DR5 polynucleotide construct is used in tissues (muscle, skin, brain, lung, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, gallbladder, stomach,
(Including the intestine, testis, ovary, uterus, rectum, nervous system, eyes, glands, and connective tissue). The interstitial space of the tissue is within the intercellular fluid, the mucopolysaccharide matrix between the reticulum fibers of the organ tissue, the elastic fibers in the walls of the blood vessels or chambers, the collagen fibers of the fibrous tissue, or the connective tissue surrounded by the muscle cell sheath The same matrix (t
and the same matrix in connective tissue in a bone hiatus. This is also the space occupied by the circulating plasma and the lymph of the lymph channels. Delivery of muscle tissue to the interstitial space is preferred for reasons discussed below. They can be conveniently delivered by injection into the tissue containing these cells. They are preferably delivered to and expressed in differentiated, persistent, non-dividing cells, but are delivered and expressed in non-differentiated cells or in fully differentiated cells (eg, blood stem cells). Or dermal fibroblasts). In vivo, muscle cells are particularly competent in their ability to take up and express polynucleotides.

【０５７６】 裸のＤＲ５ポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量
は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましく
は、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そし
てより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん
、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って変化する。
核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして
処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間隙
空間への非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路（例えば、特
に肺もしくは気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処
方物の吸入）もまた用いられ得る。さらに、裸のＤＲ５ポリヌクレオチド構築物
が、血管形成術の間に、この手順において用いられるカテーテルによって動脈に
送達され得る。For a naked DR5 polynucleotide injection, an effective dosage of DNA or RNA ranges from about 0.05 g / kg to about 50 mg / kg body weight. Preferably, the dosage will be from about 0.005 mg / kg to about 20 mg / kg, and more preferably, from about 0.05 mg / kg to about 5 mg / kg. Of course, as the skilled artisan will appreciate, this dosage will vary according to the tissue site of the injection.
Appropriate and effective dosages of nucleic acid sequences can be readily determined by one skilled in the art, and will depend on the condition being treated and the route of administration. The preferred route of administration is by parenteral injection into the interstitial space of the tissue. However, other parenteral routes, such as inhalation of aerosol formulations, particularly for delivery to the lung or bronchial tissue, throat, or nasal mucosa, may also be used. In addition, naked DR5 polynucleotide constructs can be delivered to arteries during angioplasty by the catheter used in this procedure.

【０５７７】 インビボで筋肉に注入されたＤＲ５ポリヌクレオチドの用量応答効果を、以下
のようにして決定する。ＤＲ５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生成のため
の適切なＤＲ５鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。
鋳型ＤＮＡ（これは環状または線状のいずれかであり得る）を裸のＤＮＡとして
使用するか、またはリポソームと複合体化するかのいずれかである。次いで、マ
ウスの四頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。The dose response effect of DR5 polynucleotide injected into muscle in vivo is determined as follows. Appropriate DR5 template DNA for the production of an mRNA encoding a DR5 polypeptide is prepared according to standard recombinant DNA methodology.
The template DNA, which can be either circular or linear, is either used as naked DNA or complexed with liposomes. The quadriceps of the mouse are then injected with various amounts of template DNA.

【０５７８】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。ＤＲ５鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌ
のキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって、
筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの深さで注
入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、そしてその皮膚
をステンレス鋼クリップで閉じる。5-6 week old female and male Balb / C mice were given 0.3 ml of 2.5%
Anesthetize by injecting Avertin intraperitoneally. A 1.5 cm incision is made in the anterior thigh and the quadriceps are visualized directly. 0.1 ml of DR5 template DNA
In a 1cc syringe through a 27 gauge needle for 1 minute
The knee is injected at a depth of about 0.2 cm about 0.5 cm from the distal insertion site of the muscle. Sutures are made over the injection site for future positioning and the skin is closed with a stainless steel clip.

【０５７９】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、Ｄ
Ｒ５タンパク質発現について組織化学的に染色する。ＤＲ５タンパク質発現につ
いてのタイムコースを、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採取すること以
外は、同様な様式で行い得る。注入後の筋肉中のＤＲ５ ＤＮＡの持続性を、注
入したマウスおよびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上
清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける上記
実験の結果を、裸のＤＲ５ ＤＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において適切
な投薬量および他の処置パラメーターを外挿するために使用し得る。After an appropriate incubation time (eg, 7 days), a muscle extract is prepared by cutting out all four animals. A 15 μm section of every five quadriceps was placed on D
Histochemically stain for R5 protein expression. A time course for DR5 protein expression can be performed in a similar manner, except that four animals from different mice are harvested at different times. The persistence of DR5 DNA in muscle after injection can be determined by Southern blot analysis after preparing total cellular DNA and HIRT supernatant from injected and control mice. The results of the above experiments in mice can be used to extrapolate appropriate dosages and other treatment parameters in humans and other animals using naked DR5 DNA.

【０５８０】 （実施例１９：ＤＲ５−Ｆｃ融合タンパク質は、同時刺激アッセイにおいてイ
ンビトロでＢ細胞増殖を阻害する） ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン分子のＦｃ部分に連結したＤＲ５の可溶性形態（
配列番号２のアミノ酸−５１〜１３３に対応する）からなるＤＲ５−Ｆｃポリペ
プチドを、調製した。このタンパク質が、ヒトＢ細胞の増殖応答を変化させる能
力を、標準的な同時刺激アッセイにおいて評価する。簡潔には、ヒト扁桃腺Ｂ細
胞を、ＣＤ３陽性細胞の磁性ビーズ（ＭＡＣＳ）により精製した。得られた細胞
集団を、慣用的には、ＣＤ１９およびＣＤ２０染色の発現により評価されるよう
に、９５％ Ｂ細胞を超えていた。種々の希釈のｒＨｕニュートロカイン−α（
国際出願公開ＷＯ９８／１８９２１）またはコントロールタンパク質ｒＨｕＩＬ
２を、９６ウェルプレートの個々のウェルに配置し、ここへ、培養培地（１０％
ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌス
トレプトマイシン、および１０-5希釈のホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ（ＳＡＣ）（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ（Ｐａ
ｎ）としても公知）を含有するＲＰＭＩ １６４０）中で懸濁した、総量１５０
μｌ中の、１０5Ｂ細胞を添加した。ＤＲ５−Ｆｃを種々の濃度で添加した。次
いで、プレートを３日間インキュベーター中に置いた（３７℃、５％ＣＯ2、９
５％湿潤）。因子を添加して７２時間後に開始した3Ｈ−チミジン（６．７Ｃｉ
／ｍＭ）の２０時間のパルス（１μＣｉ／ウェル）により増殖を定量した。陽性
コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれ、ＩＬ−２および培地である
。Example 19: DR5-Fc fusion protein inhibits B cell proliferation in vitro in a costimulation assay Soluble form of DR5 linked to the Fc portion of a human IgG1 immunoglobulin molecule (
A DR5-Fc polypeptide consisting of SEQ ID NO: 2 (corresponding to amino acids -51 to 133) was prepared. The ability of this protein to alter the proliferative response of human B cells is evaluated in a standard costimulation assay. Briefly, human tonsil B cells were purified by magnetic beads (MACS) of CD3-positive cells. The resulting cell population routinely exceeded 95% B cells as assessed by the expression of CD19 and CD20 staining. Various dilutions of rHu Neutrokine-α (
International Application Publication WO98 / 18921) or the control protein rHuIL
2 were placed in individual wells of a 96-well plate, to which the culture medium (10%
FBS, 5 × 10 −5 M 2ME, 100 U / ml penicillin, 10 μg / ml streptomycin, and 10 −5 dilution of formalin-fixed Staphylococ.
cus aureus Cowan I (SAC) (Pansorbin (Pa
n) also suspended in RPMI 1640) containing
10 5 B cells in μl were added. DR5-Fc was added at various concentrations. The plate was then placed in an incubator for 3 days (37 ° C., 5% CO 2 , 9
5% wet). By adding factors was initiated after 72 hours 3 H- thymidine (6.7 Ci
/ MM) for 20 hours (1 μCi / well). Positive and negative controls are IL-2 and medium, respectively.

【０５８１】 この実験の結果を、ＤＲ５−Ｆｃが、プライミング因子としてＳｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ（ＳＡＣ）、および台２のシグ
ナルとしてニュートロカイン−αを用いた同時刺激アッセイにおいてＢ細胞増殖
を阻害したことを確認した（データは示さず）。他の腫瘍壊死因子レセプター（
ＴＮＦＲ）融合タンパク質（例えば、ＤＲ４−Ｆｃ（国際出願公開番号ＷＯ９８
／３２８５６）、ＴＲ６−Ｆｃ（国際出願公開番号ＷＯ９８／３１７９９）およ
びＴＲ９−Ｆｃ（国際出願公開番号ＷＯ９８／５６８９２））は増殖を阻害しな
かったことに注目することは重要である。[0580] The results of this experiment indicate that DR5-Fc was identified as Staphyl as a priming factor.
Ococcus aureus Cowan I (SAC) and co-stimulation assay using Neutrokine-α as platform 2 signal confirmed that it inhibited B cell proliferation (data not shown). Other tumor necrosis factor receptors (
TNFR) fusion protein (for example, DR4-Fc (International Application Publication No.
It is important to note that TR6-Fc (International Application Publication No. WO 98/31799) and TR9-Fc (International Application Publication No. WO 98/56892) did not inhibit proliferation.

【０５８２】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の
教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内に
ある。It is clear that the invention can be carried out in other ways than those described in detail in the foregoing description and examples. Numerous modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, and so are within the scope of the appended claims.

【０５８３】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特
許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）
は、本明細書中に参考として援用される。Full disclosure of each document cited in the Background, Detailed Description, and Examples of the Invention, including patents, patent applications, academic literature, abstracts, experimental manuals, books or other disclosures
Is incorporated herein by reference.

【０５８４】 さらに、本明細書にとともに紙形態で提出された配列表は、本明細書中にその
全体が参考として援用される。In addition, the Sequence Listing submitted in paper form with this specification is hereby incorporated by reference in its entirety.

【０５８５】[0585]

【表３】 [Table 3]

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図１は、ＤＲ５のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（
配列番号２）を示す。アミノ酸約１〜約５１（下線を付した）は、シグナル伝達
ペプチドを構成し（配列番号２のアミノ酸残基約−５１〜約−１）；アミノ酸約
５２〜約１８４は、細胞外ドメインを構成し（配列番号２のアミノ酸残基約１〜
約１３３）；アミノ酸約８４〜約１７９は、システインリッチドメインを構成し
（配列番号２のアミノ酸残基約３３〜約１２８）；アミノ酸約１８５〜約２０８
（下線を付した）は、膜貫通ドメインを構成し（配列番号２のアミノ酸残基約１
３４〜約１５７）；そしてアミノ酸約２０９〜約４１１は、細胞内ドメインを構
成し（配列番号２のアミノ酸残基約１５８〜約３６０）、そのアミノ酸約３２４
〜約３９１（斜字体）は死ドメインを構成する（配列番号２のアミノ酸残基約２
７３〜約３４０）と予測される。FIG. 1 shows the nucleotide sequence of DR5 (SEQ ID NO: 1) and its deduced amino acid sequence (
SEQ ID NO: 2) is shown. Amino acids about 1 to about 51 (underlined) make up the signaling peptide (amino acid residues about -51 to about -1 of SEQ ID NO: 2); amino acids about 52 to about 184 make up the extracellular domain (About 1 to about 1 amino acid residue of SEQ ID NO: 2)
About 133); amino acids about 84 to about 179 constitute a cysteine-rich domain (amino acid residues about 33 to about 128 of SEQ ID NO: 2); amino acids about 185 to about 208
(Underlined) constitute the transmembrane domain (about 1 amino acid residue of SEQ ID NO: 2)
34 to about 157); and amino acids 209 to 411 constitute an intracellular domain (amino acid residues about 158 to about 360 of SEQ ID NO: 2), and the amino acids about 324
~ About 391 (italics) constitutes the death domain (about 2 amino acid residues of SEQ ID NO: 2).
73 to about 340).

【図２】 図２は、ＤＲ５（ＨＬＹＢＸ８８）、ヒト腫瘍壊死因子レセプター１（ｈ Ｔ
ＮＦＲ−１）（配列番号３）、ヒトＦａｓタンパク質（配列番号４）、および死
ドメインを含むレセプター３（配列番号５）のアミノ酸配列間の類似性領域を示
す。比較は、ＤＮＡ Ｓｔａｒ ｓｕｉｔｅ プログラムに含まれる、Ｍｅｇａ
ｌｉｇｎプログラムで、Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用して行われた。コンセンサスと
一致する残基は、影をつける。FIG. 2 shows DR5 (HLYBX88), human tumor necrosis factor receptor 1 (h T
2 shows regions of similarity between the amino acid sequences of NFR-1) (SEQ ID NO: 3), human Fas protein (SEQ ID NO: 4), and receptor 3 (SEQ ID NO: 5), including the death domain. Comparisons were made using the Mega, included in the DNA Star suite program.
The light program was performed using the Clustal method. Residues that match the consensus are shaded.

【図３】 図３は、ＤＲ５アミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、およびコイル領
域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数、および表面
確率を、図１に示されるアミノ酸配列について、説明されるコンピュータープロ
グラムのデフォルトパラメーターを用いて予想したように示す。「抗原性指数−
Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」のグラフでは、図１に示されるアミノ酸残基約６２
〜約１１０、約１１９〜約１６４、約２２４〜約２７１、および約２７５〜約３
７０が、示されるＤＲ５タンパク質の高度な抗原性領域に一致する。図１におけ
るこれらの高度に抗原性のフラグメントは、配列番号２の以下のフラグメントに
それぞれ一致する：アミノ酸残基約１１〜約５９、約６８〜約１１３、約１７３
〜約２２０、および約２２４〜約３１９。FIG. 3 shows an analysis of the DR5 amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenicity index, and surface probability are calculated using the computer program described for the amino acid sequence shown in FIG. Shown as expected using default parameters. "Antigenicity index-
In the graph of "Jameson-Wolf", about 62 amino acid residues shown in FIG.
About 110, about 119 to about 164, about 224 to about 271, and about 275 to about 3
70 corresponds to the highly antigenic region of the indicated DR5 protein. These highly antigenic fragments in FIG. 1 correspond to the following fragments of SEQ ID NO: 2, respectively: about 11 to about 59, about 68 to about 113, about 173
２２０220, and 224-319.

【図４】 図４は、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列に関連する２つのｃ
ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（ＨＡＰＢＵ１３ＲおよびＨＳＢＢＵ７６Ｒ）を
示す。FIG. 4 shows two cs related to the nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
1 shows the nucleotide sequence of the DNA molecule (HAPBU13R and HSBBU76R).

【図５Ａ】 図５Ａは、ＤＲ５過剰発現がＭＣＦ７ヒト乳癌細胞においてアポトーシスを誘
導したこと示す棒グラフである。FIG. 5A is a bar graph showing that DR5 overexpression induced apoptosis in MCF7 human breast cancer cells.

【図５Ｂ】 図５Ｂは、ＤＲ５過剰発現がヒト類表皮癌（Ｈｅｌａ）細胞においてアポトー
シスを誘導したこと示す棒グラフである。FIG. 5B is a bar graph showing that DR5 overexpression induced apoptosis in human epidermoid carcinoma (Hela) cells.

【図５Ｃ】 図５Ｃは、ＤＲ５に誘導されるアポトーシスが、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ
）インヒビターであるＣｒｍＡおよびｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによってブロックされ
たが、優性ネガティブなＦＡＤＤは効果がなかったことを示す棒グラフである。FIG. 5C shows that apoptosis induced by DR5 is reduced by caspase.
4) Bar graph showing that the inhibitor was blocked by CrmA and z-VAD-fmk, but dominant negative FADD had no effect.

【図５Ｄ】 図５Ｄは、ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は、インビボではＦＡＤＤおよびＴＲＡＤ
Ｄと相互作用しなかったことを示すイムノブロットである。FIG. 5D shows that, like DR4, DR5 has FADD and TRAD in vivo.
9 is an immunoblot showing that it did not interact with D.

【図５Ｅ】 図５Ｅは、新しく同定した、ＦＬＩＣＥ様分子の優性ネガティブバージョン（
ｖｅｒｓｉｏｎ）である、ＦＬＩＣＥ２（Ｖｉｎｃｅｎｚ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６５７８（１９９７））が効率的にＤＲ５誘導性のアポ
トーシスをブロックしたが、一方優性ネガティブＦＬＩＣＥは、それがブロック
した条件下で部分的な効果のみ有したことを示す棒グラフである。ＴＮＦＲ−１
がアポトーシスを効果的にブロックしたことも示す。FIG. 5E shows a newly identified dominant negative version of the FLICE-like molecule (
version), FLICE2 (Vincenza, C. et al., J. Bio).
l. Chem. 272: 6578 (1997)) efficiently blocked DR5-induced apoptosis, whereas dominant negative FLICE had only a partial effect under the conditions it blocked. TNFR-1
Also effectively blocked apoptosis.

【図６Ａ】 図６Ａは、ＤＲ５−Ｆｃ（ならびにＤＲ４およびＴＲＩＤ）が、特異的にＴＲ
ＡＩＬを結合するが、関連する細胞毒性リガンドＴＮＦαを結合しないことを示
すイムノブロットである。図６Ａの下部のパネルは、結合アッセイ中に存在する
Ｆｃ融合物の入力を示す。FIG. 6A shows that DR5-Fc (and DR4 and TRID) specifically
FIG. 2 is an immunoblot showing that it binds AIL but not the related cytotoxic ligand TNFα. The lower panel of FIG. 6A shows the input of the Fc fusion present in the binding assay.

【図６Ｂ】 図６Ｂは、ＤＲ５−ＦｃがＴＲＡＩＬのアポトーシスを誘導する能力をブロッ
クしたことを示す棒グラフである。図６Ｂに示されるデータ（平均±ＳＤ）は、
計数された全核（ｎ＝４）中のアポトーシス性の核のパーセントである。FIG. 6B is a bar graph showing that DR5-Fc blocked the ability of TRAIL to induce apoptosis. The data (mean ± SD) shown in FIG.
Percentage of apoptotic nuclei in all nuclei counted (n = 4).

【図６Ｃ】 図６Ｃは、ＴＮＦＲ−１−Ｆｃが完全にＴＮＦα殺傷を無効にした条件下で、
ＤＲ５−Ｆｃはアポトーシス性ＴＮＦα誘導細胞死に効果を有さなかったことを
示す棒グラフである。FIG. 6C shows that under conditions where TNFR-1-Fc completely abolished TNFα killing,
9 is a bar graph showing that DR5-Fc had no effect on apoptotic TNFα-induced cell death.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｈ０４５ 35/00 37/04 37/04 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 17/08 17/08 19/00 19/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/566 33/53 33/577 Ｂ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ６０／１４８，９３９ (32)優先日 平成11年８月13日(1999．8．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ニ， ジアン アメリカ合衆国 メリーランド 20853， ロックビル， マナーフィールド ロー ド 5502 (72)発明者 ジェンツ， レイナー エル． アメリカ合衆国 メリーランド 20850， ロックビル マウント プロスペクト ドライブ 13608 (72)発明者 ユ， グオ−リャン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94705， バークレイ， グラバット ドライブ 242 (72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 DA78 FB02 FB03 4B024 AA01 BA63 CA04 DA02 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA12 HA15 4B064 AG27 AG31 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4C084 AA01 AA02 AA07 AA16 BA01 BA08 BA21 BA41 BA42 DA01 DA25 DA50 MA02 ZB072 ZB112 ZB262 ZB332 ZC422 ZC542 4C085 AA13 AA14 AA16 CC22 CC23 EE03 4H045 AA10 AA11 AA30 BA41 BA57 CA40 DA50 DA76 DA86 EA22 FA74 FA81 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 31/12 A61P 35/00 4H045 35/00 37/04 37/04 43/00 111 43/00 111 C07K 14/705 C07K 14/705 17/08 17/08 19/00 19/00 G01N 33/15 Z C12N 15/09 ZNA 33/50 Z G01N 33/15 33/53 D 33/50 33/566 33/53 33/577 B 33/566 C12P 21/02 C 33/577 A61K 37/02 // C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA (31) Priority claim number 60 / 148,939 (32) Priority date 1999 Aug. 13, 1999 (Aug. 13, 1999) (33) Priority Claimed States United States (US) (81) Designated States EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR) , IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA ( F, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS , JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) invention have two, Jian United States Maryland 20853, Rockville, manners field load 5502 (72) inventor Regents, Rainer El. United States Maryland 20850, Rockville Mount Prospect Drive 13608 (72) Inventor Yu, Guo-Liang United States of America 94705, Berkeley, Grabat Drive 242 (72) Inventor Rosen, Craig A. United States Maryland 20882, Layton'sville, Rolling Hill Road 22400 F-term (Reference) 2G045 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 DA78 FB02 FB03 4B024 AA01 BA63 CA04 DA02 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA12 HA15 4B064 AG27 AG31 CA02 CA01 ACA4 AA02 AA07 AA16 BA01 BA08 BA21 BA41 BA42 DA01 DA25 DA50 MA02 ZB072 ZB112 ZB262 ZB332 ZC422 ZC542 4C085 AA13 AA14 AA16 CC22 CC23 EE03 4H045 AA10 AA11 AA30 BA41 BA57 CA40 DA50 DA76 DA86 EA22 FA74 FA74

Claims (25)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 対宿主性移植片病、ウイルス感染、癌、白血病、免疫不全ま
たは自己免疫障害を処置するための方法であって、該方法は、治療有効量の以下
： （ａ）配列番号２のアミノ酸−５１〜３６０からなるポリペプチドに結合する
抗体を含有する、第１の治療薬剤；ならびに （ｂ）以下からなる群より選択される、第２の治療薬剤： （ｉ）ＴＲＡＩＬ； （ｉｉ）腫瘍壊死因子； （ｉｉｉ）腫瘍壊死因子遮断薬 （ｉｖ）免疫抑制剤； （ｖ）抗生物質； （ｖｉ）抗炎症剤； （ｖｉｉ）化学療法剤；および （ｖｉｉｉ）サイトカイン； を個体に投与する工程を包含する、方法。1. A method for treating graft versus host disease, viral infection, cancer, leukemia, immunodeficiency or autoimmune disorder, the method comprising the steps of: (a) SEQ ID NO: A first therapeutic agent comprising an antibody that binds to a polypeptide consisting of two amino acids -51 to 360; and (b) a second therapeutic agent selected from the group consisting of: (i) TRAIL; (ii) tumor necrosis factor; (iii) tumor necrosis factor blocker (iv) immunosuppressant; (v) antibiotic; (vi) anti-inflammatory agent; (vii) chemotherapeutic agent; and (viii) cytokine. A method comprising the step of administering. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記第１の治療薬剤
が配列番号２のアミノ酸１〜１３３からなるポリペプチドに結合する抗体を含有
する、方法。2. The method of claim 1, wherein the first therapeutic agent comprises an antibody that binds to a polypeptide consisting of amino acids 1-133 of SEQ ID NO: 2. 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記抗体がモノクロ
ーナル抗体である、方法。3. The method of claim 1, wherein said antibody is a monoclonal antibody. 【請求項４】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記抗体がポリクロ
ーナル抗体である、方法。4. The method of claim 1, wherein said antibody is a polyclonal antibody. 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記抗体がキメラ抗
体である、方法。5. The method of claim 1, wherein said antibody is a chimeric antibody. 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記抗体がヒト化抗
体である、方法。6. The method of claim 1, wherein said antibody is a humanized antibody. 【請求項７】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記抗体が単鎖Ｆｖ
抗体である、方法。7. The method of claim 1, wherein said antibody is a single-chain Fv.
The method, which is an antibody. 【請求項８】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記抗体がＦａｂ抗
体フラグメントである、方法。8. The method of claim 1, wherein said antibody is a Fab antibody fragment. 【請求項９】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記第１の治療薬剤
および第２の治療薬剤が、同時に前記個体へ投与される、方法。9. The method of claim 1, wherein the first therapeutic agent and the second therapeutic agent are administered to the individual at the same time. 【請求項１０】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記第１の治療薬
剤および第２の治療薬剤が、異なるときに前記個体へ投与される、方法。10. The method of claim 1, wherein the first therapeutic agent and the second therapeutic agent are administered to the individual at different times. 【請求項１１】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記第２の治療薬
剤がＴＲＡＩＬである、方法。11. The method of claim 1, wherein said second therapeutic agent is TRAIL. 【請求項１２】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記腫瘍壊死因子
遮断薬が以下： （ａ）ＴＮＦ−α； （ｂ）ＴＮＦ−β； （ｃ）ＴＮＦ−γ； （ｄ）ＴＮＦ−γ−α；および （ｅ）ＴＮＦ−γ−β からなる群より選択されるタンパク質に結合する抗体を含有する、方法。12. The method of claim 1, wherein the tumor necrosis factor blocking agent is: (a) TNF-α; (b) TNF-β; (c) TNF-γ; (d) C) an antibody that binds to a protein selected from the group consisting of: TNF-γ-α; and (e) TNF-γ-β. 【請求項１３】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記免疫抑制剤
が以下： （ａ）シクロスポリン； （ｂ）シクロホスファミド； （ｃ）メチルプレドニゾン； （ｄ）プレドニゾン； （ｅ）アザチオプリン； （ｆ）ＦＫ−５０６；および （ｇ）１５−デオキシスペルグアリン からなる群より選択される、方法。13. The method of claim 1, wherein the immunosuppressant comprises: (a) cyclosporin; (b) cyclophosphamide; (c) methylprednisone; (d) prednisone; (E) azathioprine; (f) FK-506; and (g) 15-deoxyspergualin. 【請求項１４】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記サイトカイ
ンが以下： （ａ）ＩＬ−２； （ｂ）ＩＬ−３； （ｃ）ＩＬ−４； （ｄ）ＩＬ−５； （ｅ）ＩＬ−６； （ｆ）ＩＬ−７； （ｇ）ＩＬ−１０； （ｈ）ＩＬ−１２； （ｉ）ＩＬ−１３； （ｊ）ＩＬ−１５；および （ｋ）ＩＦＮ−γ からなる群より選択される、方法。14. The method of claim 1, wherein the cytokine is: (a) IL-2; (b) IL-3; (c) IL-4; (d) IL- (E) IL-6; (f) IL-7; (g) IL-10; (h) IL-12; (i) IL-13; (j) IL-15; and (k) IFN-. A method selected from the group consisting of γ. 【請求項１５】 組成物であって、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸−５１〜３６０からなるポリペプチドに結合する
抗体を含有する、第１の治療薬剤；ならびに （ｂ）以下からなる群より選択される、第２の治療薬剤： （ｉ）ＴＲＡＩＬ； （ｉｉ）腫瘍壊死因子； （ｉｉｉ）腫瘍壊死因子遮断薬； （ｉｖ）免疫抑制剤； （ｖ）抗生物質； （ｖｉ）抗炎症剤； （ｖｉｉ）化学療法剤；および （ｖｉｉｉ）サイトカイン を含有する、組成物。15. A composition comprising: (a) a first therapeutic agent comprising an antibody that binds to a polypeptide consisting of amino acids 51-360 of SEQ ID NO: 2; and (b) A second therapeutic agent selected from the group: (i) TRAIL; (ii) tumor necrosis factor; (iii) tumor necrosis factor blocker; (iv) immunosuppressant; (v) antibiotic; A composition comprising: an inflammatory agent; (vii) a chemotherapeutic agent; and (viii) a cytokine. 【請求項１６】 請求項１５に記載の組成物であって、薬学的に受容可能な
キャリアまたは賦形剤をさらに含有する、組成物。16. The composition according to claim 15, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. 【請求項１７】 配列番号２のアミノ酸１〜１３３に少なくとも９０％同一
なアミノ酸配列を含有する単離されたポリペプチドであって； ここで該ポリペプチドは、ポリエチレングリコールに共有結合され、該ポリエ
チレングリコールは、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７
０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００および２０，０００
からなる群より選択される平均分子量を有する、 単離されたポリペプチド。17. An isolated polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 90% identical to amino acids 1-133 of SEQ ID NO: 2, wherein said polypeptide is covalently linked to polyethylene glycol, Glycol is 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7
000, 8000, 9000, 10,000, 15,000 and 20,000
An isolated polypeptide having an average molecular weight selected from the group consisting of: 【請求項１８】 配列番号２のアミノ酸１〜１３３に少なくとも９５％同一
なアミノ酸配列を含有する、請求項１７に記載のポリペプチド。18. The polypeptide according to claim 17, which comprises an amino acid sequence that is at least 95% identical to amino acids 1-133 of SEQ ID NO: 2. 【請求項１９】 請求項１８に記載のポリペプチドであって、前記アミノ酸
配列が配列番号２のアミノ酸１〜１３３を含有する、ポリペプチド。19. The polypeptide of claim 18, wherein said amino acid sequence comprises amino acids 1-133 of SEQ ID NO: 2. 【請求項２０】 請求項１７に記載のポリペプチドであって、ここで前記ポ
リペプチドは、ポリエチレングリコールと、１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、
５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１および１０〜１２からなる群より
選択される範囲内にある平均置換度を有する、ポリペプチド。20. The polypeptide according to claim 17, wherein the polypeptide comprises polyethylene glycol, 1-3, 2-4, 3-5, 4-6,
A polypeptide having an average degree of substitution within a range selected from the group consisting of 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11 and 10-12. 【請求項２１】 組換え宿主細胞によって産生される、請求項１７に記載の
ポリペプチド。21. The polypeptide of claim 17, produced by a recombinant host cell. 【請求項２２】 前記組換え宿主細胞が真核生物宿主細胞である、請求項２
１に記載のポリペプチド。22. The recombinant host cell of claim 2, wherein the host cell is a eukaryotic host cell.
2. The polypeptide according to 1. 【請求項２３】 異種ポリペプチドを含有する、請求項１７に記載のポリペ
プチド。23. The polypeptide according to claim 17, which contains a heterologous polypeptide. 【請求項２４】 請求項２３に記載のポリペプチドであって、前記異種ポリ
ペプチドが抗体のＦｃ部分を含有する、ポリペプチド。24. The polypeptide of claim 23, wherein said heterologous polypeptide contains an Fc portion of an antibody. 【請求項２５】 請求項１７に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能
なキャリアを含有する、組成物。25. A composition comprising the polypeptide of claim 17 and a pharmaceutically acceptable carrier.
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