JP2002541843A - Mutants of protease activated receptor 2 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （ｉ）野生型ＰＡＲ−２に比較してトリプシンに対する低下した感受性を有し；（ｉｉ）野生型ＰＡＲ−２に比較してｔｒａｎｓ−シンナモイル−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ₂に対する高まった感受性を有し；及び（ｉｉｉ）ＴＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂により活性化される、変異ＰＡＲ−２受容体ポリペプチド又はそのフラグメントが提供され、前記ポリペプチド又はそのフラグメントは、野生型ポリペプチドの対応するＥＣＬ−２アミノ酸配列から少なくとも１つのアミノ酸の違いを有する細胞外ループ−２（ＥＣＬ−２）を含む。 (57) Abstract: (i) wild-type PAR-2 compared to the have a reduced sensitivity to trypsin; heightened for (ii) as compared to wild-type PAR-2 trans- cinnamoyl -LIGRLO-NH ₂ has a sensitivity; and (iii) activated by TLIGRL-NH _2, mutant PAR-2 receptor polypeptide or fragment thereof is provided, wherein the polypeptide or fragment thereof, the corresponding ECL of wild-type polypeptide -2 comprises extracellular loop-2 (ECL-2) having at least one amino acid difference from the amino acid sequence.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 発明の分野 本発明は、野生型に比較して変化した諸特性を有するプロテアーゼ活性化受容
体２ポリペプチドの多型の同定に関する。FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to the identification of polymorphisms in a protease-activated receptor 2 polypeptide with altered properties as compared to wild-type.

【０００２】 背景技術 プロテアーゼであるトロンビン、トリプシン及びトリプターゼの生物学的作用
は、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）と呼ばれる新規クラスのＧ−タンパク
調節型受容体の活性化にますます帰せられている（１）。ＰＡＲアミノ末端のエ
クソドメインがタンパク分解すると、この受容体の本体上に分子内結合する鎖付
きの（tethered）リガンドを露出させ、シグナル伝達を開始させる。現在では、
４種のＰＡＲがクローン化され、このうちＰＡＲ−１及びＰＡＲ−３はトロンビ
ンにより活性化され（２，３）、ＰＡＲ−２はトリプシン及びマスト細胞トリプ
ターゼにより活性化され（４〜６）、ＰＡＲ−４はトロンビンとトリプシンの両
方により活性化される（７）。ＰＡＲ−３を例外として、この受容体の鎖付きリ
ガンドにある最初の５つのアミノ酸に対応する合成ペプチドは、ＰＡＲを活性化
することができる（１）。ＳＬＩＧＫＶ−ＮＨ₂はヒトＰＡＲ−２を活性化する
のに使用されているが、マウスの配列であるＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂と選択的ＰＡ
Ｒ−２作動薬であるｔｃ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ₂は、ＰＡＲ−２のより強力なア
クチベータである（８）。ヒトＰＡＲ−１作動薬のＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂は、ＰＡ
Ｒ−１の作動薬としてあまり信頼し得ないことが判明したが、それはヒトＰＡＲ
−２を活性化するからである（９，１０）。しかしながら、高度に選択的なＰＡ
Ｒ−１作動薬である、ＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂とＡｌａ−パラフルオロＰｈｅ−Ａｒ
ｇ−シクロヘキシルＡｌａ−シトルリン−Ｔｙｒ（Ｃｉｔ）−ＮＨ₂が今日では
ＰＡＲ−１の選択的に活性化するために使用されている。ヒトＰＡＲ−４のペプ
チド作動薬であるＧＹＰＧＱＶ−ＮＨ₂は、他のペプチドと異なり、受容体の活
性化を刺激するのにより高い濃度を必要とする（７）。従って、上記の低ペプチ
ドは、ＰＡＲのin vivoにおける潜在的な生物学的役割を同定するのに有用なツ
ールであることが判明している。BACKGROUND OF THE INVENTION The biological effects of the proteases thrombin, trypsin and tryptase are increasingly attributable to the activation of a new class of G-protein regulated receptors called protease-activated receptors (PARs). (1). Proteolysis of the exodomain at the PAR amino terminus exposes an intramolecularly bound tethered ligand on the body of the receptor and initiates signaling. Currently,
Four PARs were cloned, of which PAR-1 and PAR-3 were activated by thrombin (2,3), PAR-2 was activated by trypsin and mast cell tryptase (4-6), and -4 is activated by both thrombin and trypsin (7). With the exception of PAR-3, synthetic peptides corresponding to the first five amino acids in the chained ligand of this receptor are able to activate PAR (1). SLIGKV-NH ₂ is used to activate the human PAR-2, but selective PA and SLIGRL-NH ₂ is the sequence of the mouse
Tc-LIGRLO-NH ₂ is R-2 agonist is a more potent activator of PAR-2 (8). SFLLR-NH ₂ human PAR-1 agonist, PA
It turned out to be less reliable as an agonist of R-1 but it was
-2 is activated (9, 10). However, highly selective PA
Is a R-1 agonists, and TFLLR-NH ₂ Ala- para fluoro Phe-Ar
The g- cyclohexyl Ala- citrulline -Tyr (Cit) -NH ₂ today is used to selectively activate the PAR-1. GYPGQV-NH ₂ is a peptide agonist of human PAR-4, unlike other peptides require higher concentrations to stimulate the activation of the receptor (7). Thus, the low peptides described above have proven to be useful tools for identifying the potential biological role of PAR in vivo.

【０００３】 ＰＡＲ−２は、上皮細胞（２，１１）、内皮細胞（１２，１３）、平滑筋細胞
（１４）、角化細胞（１５，１６）、好中球（１７）及びある種のＴ細胞系を含
む、多種多様な細胞で発現されている。かなりの証拠により、今日では、ＰＡＲ
−２は炎症における重要な受容体と示唆されている。例えば、炎症メディエータ
ーのＴＮＦ、ＩＬ−１及びＬＰＳは、内皮細胞のＰＡＲ−２発現をアップレギュ
レートし（１９）、ＰＡＲ−２の活性化は、角化細胞からの炎症性サイトカイン
の放出（１６）と、白血球の内皮細胞へのローリング及び接着をもたらす（２０
）。さらに、ＰＡＲ−２作動薬（ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂）のin vivoにおける投与
は炎症反応を誘発する（２１）。生成する浮腫はニューロンのＰＡＲ−２活性化
により発生する（２２）。マスト細胞トリプターゼは、炎症の主要メディエータ
ーとＰＡＲ−２のアクチベータであり、ヒト内皮細胞（２３）及び上皮細胞（２
４）からのサイトカイン放出を刺激し、モルモットの皮膚へ注射すると、脈管漏
出（２５）と好酸球及び好中球の蓄積（２６）を誘発する。プロテアーゼのトリ
プシン及びトリプターゼはＰＡＲ−２の選択的活性化により炎症反応を始動し得
るので、受容体の活性化を変化させ得る受容体の多型性は、疾患に対して重要な
意味をもつ可能性がある。[0003] PAR-2 is involved in epithelial cells (2,11), endothelial cells (12,13), smooth muscle cells (14), keratinocytes (15,16), neutrophils (17) and certain types of neutrophils (17). It is expressed on a wide variety of cells, including the T cell line. With considerable evidence, today, PAR
-2 has been suggested as an important receptor in inflammation. For example, the inflammatory mediators TNF, IL-1 and LPS upregulate endothelial cell PAR-2 expression (19), and activation of PAR-2 results in the release of inflammatory cytokines from keratinocytes (16). ) Results in rolling and adhesion of leukocytes to endothelial cells (20).
). Additionally, administration in in vivo of PAR-2 agonist (SLIGRL-NH ₂₎ induces an inflammatory response (21). The resulting edema results from PAR-2 activation of neurons (22). Mast cell tryptase is a major mediator of inflammation and an activator of PAR-2, and it has been shown that human endothelial cells (23) and epithelial cells (2
Stimulation of cytokine release from 4) and injection into guinea pig skin induces vascular leakage (25) and accumulation of eosinophils and neutrophils (26). Since the proteases trypsin and tryptase can trigger an inflammatory response through selective activation of PAR-2, receptor polymorphisms that can alter receptor activation can have important implications for disease There is.

【０００４】 鎖付きリガンドがＰＡＲ−２を活性化する正確な機序は明確に確立されていな
い。近縁のトロンビン受容体（ＰＡＲ−１）を用いた洗練された研究により、鎖
付きリガンドが細胞外ループ−２（ＥＣＬ−２）と相互作用することが示された
（２７〜２９）。さらに、ＥＣＬ−２は、作動薬の特異性と受容体のシグナル伝
達を支配するのに重要であるようにみえる。最近の証拠も、ＰＡＲ−２のＥＣＬ
−２が作動薬特異性の決定的な領域であることを示唆している（３０）。上記の
研究は、ＰＡＲ−２作動薬ペプチド（ＰＡＲ−２ＡＰ）であるＳＬＩＧＲＬ−Ｎ
Ｈ₂（これはＰＡＲ−１を活性化し得ない）が、ＰＡＲ−２のＥＣＬ−２をＰＡ
Ｒ−１へ置換したＰＡＲ−１キメラを活性化し得ることを示した。さらに、ＰＡ
Ｒ−１において重要であることが見出された、ＰＡＲ−２のＥＣＬ−２の突然変
異残基は受容体の機能を有意に変化させる（３１）。従って、ＰＡＲ−１とＰＡ
Ｒ−２は、受容体活性化を始動させるのに同一の細胞外ドメインを使用するよう
に思われる。[0004] The exact mechanism by which a chained ligand activates PAR-2 has not been clearly established. Refined studies with the closely related thrombin receptor (PAR-1) have shown that chained ligands interact with extracellular loop-2 (ECL-2) (27-29). In addition, ECL-2 appears to be important in governing agonist specificity and receptor signaling. Recent evidence also shows the ECL of PAR-2
-2 suggests a critical area for agonist specificity (30). The above study demonstrated that the PAR-2 agonist peptide (PAR-2AP) SLIGRL-N
H ₂ (which cannot activate PAR-1) causes ECL-2 of PAR-2 to
It was shown that the PAR-1 chimera substituted with R-1 could be activated. In addition, PA
Mutated residues of ECL-2 of PAR-2, which were found to be important in R-1, significantly alter receptor function (31). Therefore, PAR-1 and PA
R-2 appears to use the same extracellular domain to trigger receptor activation.

【０００５】 発明の要約 ヒト結腸のｃＤＮＡライブラリーからＰＡＲ−２をクローニングする間に、我
々は、細胞外ループ−２（ＥＣＬ−２）の残基２４０でのフェニルアラニンから
セリンへの突然変異により特徴づけられる、ヒトＰＡＲ−２の多型的形態（ＰＡ
Ｒ₂Ｆ２４０Ｓ）を同定した。多数の人々のゲノム分析により、両方の対立遺伝
子の存在が確かめられたが、対立遺伝子の頻度は、野生型と突然変異体の対立遺
伝子でそれぞれ０．９１６（Ｆ₂₄₀）と０．０８４（Ｓ₂₄₀）であった。カルシウ
ムのシグナル伝達を、永久にトランスフェクトした細胞系における受容体活性化
の指標として使用した。ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓは、トリプシン（〜３．７倍）、Ｐ
ＡＲ活性化ペプチドのＳＫＬＩＧＶ−ＮＨ₂（〜２．５倍）及びＳＬＩＧＲＬ−
ＮＨ₂（〜２．８倍）に対する感受性の有意な低下を示したが、選択的ＰＡＲ−
２作動薬のｔｒａｎｓ−シンナモイル−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ₂に対しては高まっ
た感受性（４倍）を示した。高まった感受性はまた、選択的ＰＡＲ−１作動薬で
あるＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂（〜７倍）に対しても観察されたが、試験した他のＰＡ
Ｒ−１作動薬では観察されなかった。ＰＡＲ−４作動薬であるＧＹＰＧＫＦ−Ｎ
Ｈ₂は効果がなかったが、ｔｒａｎｓ−シンナモイル−ＹＰＧＫＦ−ＮＨ₂はＰＡ
Ｒ₂Ｆ２４０Ｓ受容体を選択的に活性化し得たが、野生型の受容体は活性化しな
かった。さらに、我々は、ＴＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂が選択的なＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ作
動薬であることを見出した。Ｆ２４０Ｓ突然変異をラットＰＡＲ−２へ導入する
ことによって、我々は、ヒトＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓで見られるものを反映する作動
薬効力のシフトを観察し、Ｆ２４０が作動薬の特異性において重要な役割を担う
ことを確認した。この多型性により誘発される、この劇的に変化する薬理学的プ
ロフィールは、ＰＡＲをターゲットとする拮抗薬の設計にとって重要な意義を有
し、炎症性疾患に貢献するか又はそれを予測するものとなる可能性がある。SUMMARY OF THE INVENTION During cloning of PAR-2 from a human colon cDNA library, we are characterized by a phenylalanine to serine mutation at residue 240 of extracellular loop-2 (ECL-2). Attached to a polymorphic form of human PAR-2 (PA
R ₂ F240S). Genomic analysis of a large number of people confirmed the presence of both alleles, but the allele frequencies were 0.916 (F ₂₄₀ ) and 0.084 (S ₂₄₀ ). Calcium signaling was used as an indicator of receptor activation in permanently transfected cell lines. PAR ₂ F240S is trypsin (up to 3.7 times), P
SKLIGV-NH ₂ of the AR activation peptide (2.5 fold) and SLIGRL-
Showed a significant decrease in sensitivity to NH ₂ (〜2.8-fold), but selective PAR-
It showed increased susceptibility (4-fold) for the 2 agonist trans- cinnamoyl -LIGRLO-NH _2. Increased sensitivity also has been observed against TFLLR-NH ₂ is a selective PAR-1 agonist (7-fold), other PA tested
Not observed with R-1 agonist. GYPGKF-N, a PAR-4 agonist
H ₂ had no effect but, trans- cinnamoyl -YPGKF-NH ₂ is PA
The R ₂ F240S receptor could be selectively activated, but the wild-type receptor did not. Furthermore, we have found that TLIGRL-NH ₂ is a selective PAR ₂ F240S agonist. The F240S mutation by introducing into rat PAR-2, we observed a shift of the working potency to reflect those found in human PAR ₂ F240S, play an important role in the specificity of the F240 are agonists It was confirmed. This dramatically changing pharmacological profile induced by this polymorphism has important implications for the design of PAR-targeting antagonists and contributes to or predicts inflammatory diseases Could be

【０００６】 従って、本発明は、変異プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ−２）ポリペプ
チド又はそのフラグメントを提供し、これは （ｉ）野生型ＰＡＲ−２に比較してトリプシンに対する低下した感受性を有し；
（ｉｉ）野生型ＰＡＲ−２に比較してｔｒａｎｓ−シンナモイル−ＬＩＧＲＬＯ
−ＮＨ₂に対する高まった感受性を有し；及び （ｉｉｉ）ＴＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂により活性化され、 このポリペプチド又はそのフラグメントは、野生型ポリペプチドの対応する細胞
外ループ２（ＥＣＬ−２）アミノ酸配列から少なくとも１つのアミノ酸の違いを
有するＥＣＬ−２を含む。Accordingly, the present invention provides mutant protease-activated receptor 2 (PAR-2) polypeptides or fragments thereof, which (i) have reduced sensitivity to trypsin compared to wild-type PAR-2. Have;
(Ii) trans-cinnamoyl-LIGRLO compared to wild-type PAR-2
Has a heightened sensitivity to -NH _2; and (iii) by TLIGRL-NH ₂ is activated, the polypeptide or fragment thereof, of the wild-type polypeptide corresponding extracellular loop 2 (ECL-2) the amino acid sequence And ECL-2 having at least one amino acid difference from

【０００７】 好ましくは、比較目的のために使用される野生型ポリペプチドは、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．２に示されるアミノ酸配列を有するヒトＰＡＲ−２である。 好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸の違いは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に
示されるアミノ酸配列の残基２４０、又はその同等物における修飾、より好まし
くは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるアミノ酸配列の残基２４０、又はその
同等物における置換を包含する。このように、好ましい態様では、本発明は、残
基２４０がフェニルアラニンでないような、残基２４０、又はその同等物での置
換を含むＰＡＲ−２ポリペプチド又はそのフラグメントを提供する。好ましくは
、アミノ酸残基２４０は芳香族アミノ酸ではない。[0007] Preferably, the wild-type polypeptide used for comparative purposes is SEQ.
D No. 2. Human PAR-2 having the amino acid sequence shown in FIG. Preferably, at least one amino acid difference is determined by SEQ ID NO. 2. Modification at residue 240 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an equivalent thereof, more preferably SEQ ID NO. 2 includes substitutions at residue 240 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2, or equivalents thereof. Thus, in a preferred aspect, the invention provides a PAR-2 polypeptide or fragment thereof comprising a substitution with residue 240, or an equivalent thereof, such that residue 240 is not phenylalanine. Preferably, amino acid residue 240 is not an aromatic amino acid.

【０００８】 好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるア
ミノ酸配列の残基２４０、又はその同等物におけるフェニルアラニンからセリン
への置換を含む。[0008] Preferably, the polypeptide of the present invention has SEQ ID NO. 2 includes substitution of phenylalanine for serine at residue 240 of the amino acid sequence shown in 2, or its equivalent.

【０００９】 本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチドと、本発明の
ポリペプチドの宿主細胞における発現を指令し得る転写調節配列と機能可能的に
連結される本発明のヌクレオチドをそのなかに含んでなる前記宿主細胞を提供す
る。好ましくは、本発明のヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示される
ヌクレオチド配列のコーディング領域のセンス鎖の７１９位にチミジン残基を含
む。[0009] The present invention also relates to a nucleotide encoding the polypeptide of the present invention, and a nucleotide of the present invention operably linked to a transcription regulatory sequence capable of directing the expression of the polypeptide of the present invention in a host cell. There is provided the host cell comprising therein. Preferably, the nucleotides of the present invention have SEQ ID No. It contains a thymidine residue at position 719 of the sense strand of the coding region of the nucleotide sequence shown in No. 1.

【００１０】 さらなる側面では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも１０個
の連続したヌクレオチドをそれぞれ含んでなる、オリゴヌクレオチドプライマー
の対を提供し、前記プライマーは、ＰＡＲ−２遺伝子のＥＣＬ−２領域を増幅す
るポリメラーゼ連鎖反応における使用に適している。さらに本発明は、片方又は
両方のＰＡＲ−２対立遺伝子の多型性をＥＣＬ−２領域に有する個体を同定する
方法における、前記プライマーの使用を提供する。[0010] In a further aspect, the invention provides a pair of oligonucleotide primers, each comprising at least 10 contiguous nucleotides of a polynucleotide of the invention, wherein said primers comprise an ECL-gene of the PAR-2 gene. Suitable for use in the polymerase chain reaction to amplify two regions. The invention further provides the use of the primer in a method for identifying an individual having a polymorphism of one or both PAR-2 alleles in the ECL-2 region.

【００１１】 もう１つの側面では、本発明は、本発明のポリペプチドの活性をモジュレート
する化合物を同定する方法を提供し、前記方法は、前記ポリペプチドを前記候補
化合物と接触させること、及びこの候補化合物が前記ポリペプチドの活性をモジ
ュレートするかどうかを決定することを含む。[0011] In another aspect, the invention provides a method of identifying a compound that modulates the activity of a polypeptide of the invention, the method comprising: contacting the polypeptide with the candidate compound; Determining whether the candidate compound modulates the activity of the polypeptide.

【００１２】 さらなる態様では、本発明は本発明のポリペプチドを選択的に阻害する化合物
を同定する方法を提供し、前記方法は： （ｉ）前記ポリペプチドをＰＡＲ−２作動薬の存在及び不在下で候補化合物と接
触させること； （ｉｉ）このポリペプチドの作動薬介在性の活性化を阻害するか又は低下させる
候補化合物群を選択すること； （ｉｉｉ）野生型ＰＡＲ−２ポリペプチドをＰＡＲ−２作動薬の存在及び不在下
で、工程（ｉｉ）において選択される候補化合物と接触させること；及び （ｉｖ）野生型ＰＡＲ−２ポリペプチドの作動薬介在性の活性化を有意には阻害
しない候補化合物を選択することを含む。In a further aspect, the present invention provides a method for identifying a compound that selectively inhibits a polypeptide of the present invention, said method comprising: (Ii) selecting a group of candidate compounds that inhibit or reduce agonist-mediated activation of the polypeptide; (iii) PAR-specifically transforming the wild-type PAR-2 polypeptide into a PAR Contacting with the candidate compound selected in step (ii) in the presence and absence of a-2nd agonist; and (iv) significantly inhibiting agonist-mediated activation of wild-type PAR-2 polypeptide And selecting candidate compounds that do not.

【００１３】 本発明はさらに、本発明の上記方法により同定される化合物と、本発明のポリ
ペプチドを含んでなる、患者を治療するときのその使用を提供する。このように
、本発明は、炎症により特徴づけられる病態を治療する方法における使用のため
に、本発明のポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を提供する。好まし
くは、この化合物は、本発明のポリペプチドの活性を阻害する。The invention further provides a compound identified by the above method of the invention and its use in treating a patient, comprising a polypeptide of the invention. Thus, the present invention provides compounds that modulate the activity of a polypeptide of the present invention for use in a method of treating a condition characterized by inflammation. Preferably, the compound inhibits the activity of the polypeptide of the invention.

【００１４】 もう１つの側面では、本発明は、炎症性障害の増加したリスクを有する患者を
同定する方法を提供し、前記方法は、前記患者から得られる生物学的サンプルに
おいて、本発明のポリペプチド又は本発明のポリヌクレオチドの存在又は不在を
決定することを含む。[0014] In another aspect, the invention provides a method of identifying a patient having an increased risk of an inflammatory disorder, said method comprising, in a biological sample obtained from said patient, the method comprising: Determining the presence or absence of the peptide or polynucleotide of the invention.

【００１５】 発明の詳細な説明 一般に、本明細書において述べられる技術は当技術分野でよく知られているが
、特に参考になり得るのは、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laborato
ry Manual (1989) と Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology
(1999) 4th Ed., John Wiley & Sons, Inc. であろう。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION In general, the techniques described herein are well known in the art, but may be of particular reference to Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laborato.
ry Manual (1989) and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology
(1999) 4th Ed., John Wiley & Sons, Inc.

【００１６】 Ａ．ＰＡＲ−２の変異ポリペプチド 野生型ＰＡＲ−２の配列は、ヒト、マウス及びラットについて公表されている
（それぞれ、５，３７，３５）。これらの配列はＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号Ｐ５
５０８５及びＺ４９９９４（ヒト）、Ｐ５５０８６（マウス）及びＱ６３６４５
（ラット）の下で公共データベースより入手可能である。他のＰＡＲ−２配列も
、他の霊長類の種やげっ歯類の種のような他の種から得られる。一般に、上記の
ＰＡＲ−２配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として示されるヒト配列と、少なく
とも５０ないし１００個のアミノ酸全体でのアミノ酸レベルにおいて、少なくと
も６０、７０又は８０％同一である。特に、典型的には、非本質的な隣接配列よ
りも、ＰＡＲ−２の機能に必須であることが知られている配列の領域に関して相
同性が考慮されるべきである。相同性はまた類似性（即ち、類似の化学的特性／
機能を有するアミノ酸残基）に関して考慮され得るが、本発明の文脈では、相同
性を配列同一性により表現することが好ましい。A. Mutant Polypeptides of PAR-2 The sequence of wild-type PAR-2 has been published for human, mouse and rat (5, 37, 35 respectively). These sequences have GenBank accession number P5.
5085 and Z49994 (human), P55086 (mouse) and Q63645
Available from public databases under (rat). Other PAR-2 sequences are also obtained from other species, such as other primate and rodent species. Generally, the PAR-2 sequence described above is at least 60, 70 or 80% identical at the amino acid level over at least 50 to 100 amino acids to the human sequence shown as SEQ ID NO: 2. In particular, homology should be considered for regions of the sequence that are typically known to be essential for PAR-2 function, rather than non-essential flanking sequences. Homology also indicates similarity (ie, similar chemical properties /
(Functional amino acid residues), but in the context of the present invention, it is preferred to express homology by sequence identity.

【００１７】 相同性比較は、目視、又はより普通には、容易に入手し得る配列比較プログラ
ムの助けで実施され得る。これらの市販コンピュータ・プログラムは、２種又は
それ以上の配列間の相同性比率（％）を算出し得る。Homology comparisons can be conducted by eye, or more usually, with the aid of readily available sequence comparison programs. These commercially available computer programs can calculate the percent homology (%) between two or more sequences.

【００１８】 相同性比率（％）は、連続した配列について算出され得る、即ち一方の配列を
他方の配列と並置し、一方の配列の各アミノ酸を他方の配列の対応アミノ酸と１
つずつ比較する。これは「非ギャップ」並置と呼ばれる。典型的には，このよう
な非ギャップ並置が実施されるは、比較的少ない数の残基（例えば、５０未満の
連続アミノ酸）だけである。The percent homology (%) can be calculated for contiguous sequences, that is, aligning one sequence with the other sequence and replacing each amino acid in one sequence with the corresponding amino acid in the other sequence.
Compare one by one. This is called "non-gap" juxtaposition. Typically, such ungapped alignments are performed with only a relatively small number of residues (eg, less than 50 contiguous amino acids).

【００１９】 これはごく単純で矛盾のない方法であるが、例えば、１つの挿入又は欠失によ
り以降のアミノ酸残基が並置を狂わされ、全体の並置を実施したときに、他の点
では同一な配列の対において相同性比率が大きく減少する可能性があることを考
慮していない。従って、ほとんどの配列比較法は、全体の相同性スコアを不当に
不利にすることなく、あり得る挿入及び欠失を考慮に容れる最適な並置を産出す
るように設計されている。このことは、、局所の相同性を最大化するために、配
列並置に「ギャップ」を挿入することによって達成される。Although this is a very simple and consistent method, for example, when one insertion or deletion disrupts the alignment of subsequent amino acid residues and the entire alignment is performed, otherwise it is identical. It does not take into account that the homology ratio may be significantly reduced in different pairs of sequences. Thus, most sequence comparison methods are designed to produce optimal alignments that take into consideration possible insertions and deletions without unduly penalizing the overall homology score. This is achieved by inserting "gaps" in the sequence alignment to maximize local homology.

【００２０】 しかしながら、このより複雑な方法は、同一数の同一アミノ酸について（２つ
の比較される配列間のより高い関連性を反映して）できるだけ少ないギャップを
有する配列並置が多くのギャップのあるものより高いスコアを達成するように、
「ギャップペナルティ」を帰属において生じる各ギャップへ帰属する。典型的に
は、ギャップの存在について比較的高い代償とギャップ内のそれぞれの後続残基
についてより少ないペナルティを科す「アフィンギャップコスト」が使用される
。これは最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。当然な
がら、高いギャップペナルティはより少ないギャップのある最適化された並置を
もたらす。ほとんどの並置プログラムはこのギャップペナルティが変更されるこ
とを可能にする。しかしながら、このような配列比較のソフトウェアを使用する
ときはデフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシン
ベストフィット（Wisconsin Bestfit）パッケージ（以下参照）を使用するとき
は、アミノ酸配列についてのデフォルトギャップペナルティは、１つのギャップ
につき−１２であり、各伸張部分につき−４である。[0020] However, this more complex method is that sequence alignments with as few gaps as possible (reflecting the higher relatedness between the two compared sequences) for the same number of identical amino acids are those with many gaps. To achieve a higher score,
Assign a "gap penalty" to each gap that occurs in the assignment. Typically, "affine gap costs" are used, which impose a relatively high price on the existence of a gap and a smaller penalty for each subsequent residue in the gap. This is the most commonly used gap scoring system. Of course, a higher gap penalty results in an optimized juxtaposition with fewer gaps. Most juxtaposition programs allow this gap penalty to be changed. However, it is preferred to use the default values when using such sequence comparison software. For example, when using the GCG Wisconsin Bestfit package (see below), the default gap penalty for amino acid sequences is -12 per gap and -4 for each extension.

【００２１】 従って、最大相同性比率（％）の算出には、第一に、ギャップペナルティを考
慮にした、最適並置の作成を必要とする。このような並置を実行するのに適した
プログラムは、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（ウィスコンシ
ン大学、Ｕ．Ｓ．Ａ．；Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:
387）である。配列比較を実行し得る他のソフトウェアの例には、限定しないが
、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al., 1999, 同上、１８章を参照のこと）
、ＦＡＳＴＡ（Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410）、及びＧＥＮ
ＥＷＯＲＫＳの比較ツールセットが含まれる。ＢＬＡＳＴもＦＡＳＴＡもオフラ
イン及びオンライン検索で利用可能である（Ausubel et al., 1999, 同上、7-58
〜7-60頁を参照のこと）。しかしながら、ＧＣＧベストフィットプログラムを使
用することが好ましい。Therefore, the calculation of the maximum homology ratio (%) first requires the creation of an optimal juxtaposition in consideration of the gap penalty. A suitable program for performing such juxtaposition is the GCG Wisconsin Best Fit Package (University of Wisconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:
387). Examples of other software that can perform the sequence comparison include, but are not limited to, the BLAST package (see Ausubel et al., 1999, supra, Chapter 18).
, FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410), and GEN
Includes EWORKS comparison toolset. Both BLAST and FASTA are available for offline and online search (Ausubel et al., 1999, ibid., 7-58).
Pp. 7-60). However, it is preferred to use the GCG best fit program.

【００２２】 最終相同性比率は同一性について測定し得るが、並置法そのものは、典型的に
は、全か無かの対比較に基づいているわけではない。その代わり、化学的類似性
や進化上の距離に基づいたそれぞれの対比較に対してスコアをつける尺度化類似
性スコアマトリックスが一般に使用される。そのような一般的に使用されるマト
リックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−ＢＬＡＳＴプログラムセット
用のデフォルトマトリックスである。一般に、ＧＣＧウィスコンシンプログラム
は、公知のデフォルト値か又は、提供される場合は、カスタム記号比較表を使用
する（さらに詳細についてはユーザーマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケ
ージについては公知のデフォルト値を使用し、又は他のソフトウェアの場合は、
ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。Although the final homology ratio can be measured for identity, the juxtaposition method itself is typically not based on an all-or-nothing pair comparison. Instead, a scaled similarity score matrix that scores each pairwise comparison based on chemical similarity or evolutionary distance is commonly used. An example of such a commonly used matrix is the BLOSUM62 matrix-the default matrix for the BLAST program set. In general, the GCG Wisconsin program uses known default values or, if provided, a custom symbol comparison table (see the user manual for more details). Use the known default values for the GCG package, or for other software,
Preferably, a default matrix such as BLOSUM62 is used.

【００２３】 ソフトウェアにより最適の並置が作成されたなら、相同性比率、好ましくは配
列同一性比率を算出することが好ましい。このソフトウェアは、典型的には配列
比較の一部としてそれを実行し、数的結果を産出する。Once the software has created the optimal alignment, it is preferable to calculate the homology ratio, preferably the sequence identity ratio. This software typically performs it as part of the sequence comparison and produces numerical results.

【００２４】 上記に述べたヒト、マウス及びラットの配列以外のＰＡＲ−２配列は、例えば
、標準的なクローニング技術を使用するか、又は公知のデータベースの検索によ
り得ることができる。PAR-2 sequences other than the human, mouse and rat sequences described above can be obtained, for example, using standard cloning techniques or by searching known databases.

【００２５】 本発明は、野生型ポリペプチドの対応する細胞外ループ２（ＥＣＬ−２）アミ
ノ酸配列から少なくとも１つのアミノ酸の違いをＥＣＬ−２が有するという点で
野生型配列とは異なる、本発明の変異ＰＡＲ−２ポリペプチドを提供する。この
アミノ酸変化は、変異ＰＡＲ−２ポリペプチドが以下の特性を有するようなもの
である： （ｉ） それは、野生型ＰＡＲ−２に比較してトリプシンへの低下した感受性を
有する； （ｉｉ） それは、野生型ＰＡＲ−２に比較してｔｒａｎｓ−シンナモイル−Ｌ
ＩＧＲＬＯ−ＮＨ₂に対する高まった感受性を有し；及び （ｉｉｉ）ＴＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂により活性化される。The invention differs from the wild-type sequence in that ECL-2 has at least one amino acid difference from the corresponding extracellular loop 2 (ECL-2) amino acid sequence of the wild-type polypeptide. The present invention provides a mutant PAR-2 polypeptide of This amino acid change is such that the mutant PAR-2 polypeptide has the following properties: (i) it has reduced sensitivity to trypsin compared to wild-type PAR-2; , Trans-cinnamoyl-L compared to wild-type PAR-2
Activated by and (iii) TLIGRL-NH _2; has a heightened sensitivity to IGRLO-NH _2.

【００２６】 ヒトＰＡＲ−２の細胞外ループ２は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２として示される
配列の残基２１２〜２４５付近、又は他の種からのＰＡＲ−２配列における同等
の領域に位置している。このように、本発明の変異ＰＡＲ−２ポリペプチドは、
野生型配列からのこの領域において少なくとも１つのアミノ酸の違いを有する。
この比較は対応する野生型配列に対してなされるべきである。「野生型」という
用語は、当技術分野で知られていて、一般には、天然に存在するほとんどのメン
バーに特徴的であり、突然変異体の表現型と対照的である表現型を意味すると受
けとれる。好ましくは、本発明の文脈では，野生型の配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２に示されるヒト野生型のアミノ酸配列であると考えられる。The extracellular loop 2 of human PAR-2 has SEQ ID No. 2 is located near residues 212-245 of the sequence shown as 2, or an equivalent region in the PAR-2 sequence from other species. Thus, the mutant PAR-2 polypeptide of the present invention
It has at least one amino acid difference in this region from the wild-type sequence.
This comparison should be made to the corresponding wild-type sequence. The term "wild-type" is known in the art and is generally taken to mean a phenotype that is characteristic of most naturally occurring members and that is in contrast to the phenotype of the mutant. I can take it. Preferably, in the context of the present invention, the wild-type sequence is SEQ ID N
This is considered to be the amino acid sequence of human wild type shown in O: 2.

【００２７】 好ましい態様では、このアミノ酸の違いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として示
される配列の残基２３６〜２４５（を含む）の間に位置している（特定のアミノ
酸の番号付けに対する以後の言及はすべて他のＰＡＲ−２配列にある対応する／
同等の残基を含むとみなされるべきである−「又はその同等物」という用語は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるヒト配列の特に番号づけられた残基に対応す
る他のＰＡＲ−２配列のアミノ酸を意味する）。より好ましくは、この違いは、
残基２４０における欠失、置換又は挿入、好ましくは置換である。特に、本発明
の変異ＰＡＲ−２ポリペプチドは、残基２４０に非芳香族のアミノ酸、好ましく
はセリンを含む。In a preferred embodiment, this amino acid difference is located between and including residues 236-245 of the sequence set forth as SEQ ID NO: 2 (see below for specific amino acid numbering). Correspond to the corresponding / all in the other PAR-2 sequence
Should be considered to include equivalent residues-the term "or its equivalent"
(Meaning other amino acids of the PAR-2 sequence corresponding to the specifically numbered residues of the human sequence shown in SEQ ID NO: 2). More preferably, the difference is
A deletion, substitution or insertion at residue 240, preferably a substitution. In particular, the mutant PAR-2 polypeptides of the present invention comprise a non-aromatic amino acid at residue 240, preferably serine.

【００２８】 もう１つの態様では、本発明の変異ＰＡＲ−２ポリペプチドは、残基２４０、
又は他のＰＡＲ−２配列におけるその同等物において、フェニルアラニンのよう
な芳香族アミノ酸を含まない。In another aspect, the mutant PAR-2 polypeptide of the invention comprises the residue 240,
Or, in its equivalent in other PAR-2 sequences, does not include aromatic amino acids such as phenylalanine.

【００２９】 本発明の変異ポリペプチドは、例えば実施例に記載のアッセイを使用して、ト
リプシン及びｔｒａｎｓ−シンナモイル−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ₂に対するその感
受性を判定するために試験し得る。このように、典型的には、トリプシン感受性
は、変異ＰＡＲ−２ポリペプチドを発現する細胞をトリプシンに曝露し、カルシ
ウム応答性（カルシウムの細胞シグナル伝達アッセイの詳細については参考文献
３１を参照）を測定することによって測定し得る。選択的ＰＡＲ−２作動薬のｔ
ｒａｎｓ−シンナモイル−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ₂に対する感受性も同様のアッセ
イを使用して判定し得る。比較は、典型的には、同等の条件のもとで試験された
野生型ＰＡＲ−２に対してなされる。The mutant polypeptides of the present invention, for example, using the assays described in Examples, may be tested to determine their susceptibility to trypsin and trans- cinnamoyl -LIGRLO-NH _2. Thus, typically, trypsin sensitivity exposes cells expressing the mutant PAR-2 polypeptide to trypsin and increases calcium responsiveness (see ref. 31 for details of calcium cell signaling assays). It can be measured by measuring. T of selective PAR-2 agonist
also sensitive to rans- cinnamoyl -LIGRLO-NH ₂ may be determined using the same assay. Comparisons are typically made to wild-type PAR-2 tested under equivalent conditions.

【００３０】 好ましくは、本発明のポリペプチドは、野生型ＰＡＲ−２よりトリプシン感受
性が少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍低い。さらに、本発明のポ
リペプチドは、好ましくは、野生型ＰＡＲ−２よりｔｒａｎｓ−シンナモイル−
ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ₂への感受性が少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも
３〜４倍高い。さらに、本発明のポリペプチドは、好ましくは、野生型ＰＡＲ−
２よりｔｒａｎｓ−シンナモイル−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ₂への感受性がせいぜい
２０又は４０倍高い。Preferably, the polypeptide of the invention is at least 2-fold, more preferably at least 3-fold, less trypsin sensitive than wild-type PAR-2. Further, the polypeptide of the present invention is preferably trans-cinnamoyl- from wild-type PAR-2.
Sensitivity at least twice to LIGRLO-NH _2, more preferably at least 3 to 4 times higher. Further, the polypeptide of the present invention is preferably a wild-type PAR-
The sensitivity to trans-cinnamoyl-LIGRLO-NH ₂ is more than 20 or 40 times higher than 2.

【００３１】 本発明の変異ポリペプチドはまた、好ましくはＴＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂により活
性化される。活性化は、やはり、典型的には参考文献３１に記載のアッセイのよ
うなカルシウムの細胞シグナル伝達アッセイを使用して試験され得る。The mutant polypeptides of the present invention is also preferably activated by TLIGRL-NH _2. Activation can also be tested using a calcium cell signaling assay, typically such as the one described in ref.

【００３２】 本発明のポリペプチドにはまた、それがアミノ酸の違いを含むＥＣＬ−２の領
域を少なくとも含むならば、上記変異体の完全長配列のフラグメントも含まれる
。典型的には、ポリペプチドフラグメントは少なくとも６個のアミノ酸を含む。The polypeptides of the present invention also include fragments of the full-length sequences of the above mutants, provided that they comprise at least a region of ECL-2 that includes amino acid differences. Typically, a polypeptide fragment contains at least 6 amino acids.

【００３３】 さらに本発明のポリペプチドとして含まれるのは、上記の変異体及び誘導体で
ある。本発明のアミノ酸配列に関連した「変異体（variant）」又は「誘導体（d
erivative）」という用語には、当該配列の１つ（又はそれ以上）のアミノ酸の
置換、変異、修飾、置き換え、欠失、又はこの配列への１つ（又はそれ以上）の
アミノ酸の追加が含まれるが、但し、生じた配列は、対応する野生型の配列に対
して少なくとも１つのアミノ酸の違いがあるＥＣＬ−２領域を含む。Further included as polypeptides of the present invention are the above mutants and derivatives. "Variants" or "derivatives (d) related to the amino acid sequences of the invention
The term "erivative" includes the substitution, mutation, modification, substitution, deletion of one (or more) amino acid of the sequence or addition of one (or more) amino acid to this sequence. With the proviso that the resulting sequence contains an ECL-2 region that differs by at least one amino acid from the corresponding wild-type sequence.

【００３４】 このように、本発明のポリペプチドは本発明における使用のために修飾され得
る。典型的には、この配列の生物学的活性を維持する修飾がなされる。アミノ酸
の置換は、例えば、１、２又は３〜１０、２０又は３０個の置換でなし得る。ア
ミノ酸の置換は、例えば、治療用に投与されるポリペプチドの血漿半減期を増加
させるために、天然に存在しない類似体の使用を含んでよい。Thus, the polypeptides of the present invention may be modified for use in the present invention. Typically, modifications are made that maintain the biological activity of the sequence. Amino acid substitutions can be made, for example, with 1, 2, or 3-10, 20, or 30 substitutions. Amino acid substitutions may involve the use of non-naturally occurring analogs, for example, to increase the plasma half-life of a therapeutically administered polypeptide.

【００３５】 例えば、以下の表により、保守的な置換もなし得る。第二のカラムの同一ブロ
ック、及び好ましくは第三のカラムの同一ライン内のアミノ酸は互いに置換され
得る。For example, a conservative substitution may be made according to the following table. Amino acids in the same block of the second column, and preferably in the same line of the third column, may be substituted for each other.

【００３６】[0036]

【表１】 [Table 1]

【００３７】 本発明のポリペプチドは、典型的には、例えば以下に記載のような組換え手段
によりつくられる。しかしながら、それはまた、固相合成のような当業者に周知
の技術を使用する合成手段によってつくることが可能である。本発明のタンパク
質はまた、例えば、抽出及び精製を促進するために、融合タンパク質として産生
され得る。融合タンパク質のパートナーの例には、グルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合性及び／又は転写活
性化のドメイン）及びβ−ガラクトシダーゼが含まれる。融合タンパク質の配列
の除去を可能にするために、融合タンパク質のパートナーと注目タンパク質配列
の間にタンパク分解部位を含むことも好便であり得る。好ましくは、融合タンパ
ク質は注目配列のタンパク質の機能を妨げない。本発明のポリペプチドはまた、
多型のＰＡＲ−２形態を自然に発現する個体から採取した細胞／組織から精製さ
れ得る。The polypeptides of the present invention are typically made by recombinant means, for example, as described below. However, it can also be made by synthetic means using techniques well known to those skilled in the art, such as solid phase synthesis. The proteins of the present invention can also be produced as fusion proteins, for example, to facilitate extraction and purification. Examples of fusion protein partners include glutathione-S-transferase (GST), 6xHis, GAL4 (a domain for DNA binding and / or transcriptional activation) and β-galactosidase. It may also be convenient to include a proteolytic site between the fusion protein partner and the protein sequence of interest to allow removal of the sequence of the fusion protein. Preferably, the fusion protein does not interfere with the function of the protein of interest sequence. The polypeptide of the present invention also includes
It can be purified from cells / tissue taken from individuals who naturally express the polymorphic PAR-2 form.

【００３８】 本発明のポリペプチドは、実質的に単離された形態であり得る。このタンパク
質は本発明の意図された目的に干渉しない担体又は希釈剤とともに混合されても
、実質的に単離されているものとみなし得る。本発明のタンパク質はまた、実質
的に精製された形態であり得て、この場合、それは調製物中にこのタンパク質を
概して含み、調製物中のタンパク質の９０％以上、例えば９５％、９８％又は９
９％が本発明のタンパク質である。[0038] The polypeptides of the present invention may be in a substantially isolated form. The protein can be considered substantially isolated when mixed with a carrier or diluent that does not interfere with the intended purpose of the present invention. The protein of the present invention can also be in a substantially purified form, in which case it generally comprises the protein in the preparation and more than 90% of the protein in the preparation, for example 95%, 98% or 9
9% is the protein of the present invention.

【００３９】 Ｂ．ポリヌクレオチド 本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸配
列を含む。遺伝暗号の縮重性の結果として、数多くの異なるポリヌクレオチドが
同一のポリペプチドをコードし得ることは、当業者の理解するところである。さ
らに、定常的な技術を使用して、本発明のポリペプチドが発現され得る特定の宿
主生物のコドン使用法を反映させるために、本発明のポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換をし得ること
も当業者の理解するところである。本発明の特に好ましいポリヌクレオチドは、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるヌクレオチド配列のコーディング領域のセン
ス鎖の７１９位にチミジン残基を含む。B. Polynucleotide The polynucleotide of the present invention comprises a nucleic acid sequence encoding the polypeptide sequence of the present invention. It is understood by those skilled in the art that many different polynucleotides can encode the same polypeptide as a result of the degeneracy of the genetic code. In addition, routine techniques may be used to affect the polypeptide sequence encoded by the polynucleotide of the present invention to reflect the codon usage of the particular host organism in which the polypeptide of the present invention may be expressed. It is also understood by those skilled in the art that no nucleotide substitutions can be made. Particularly preferred polynucleotides of the present invention are
SEQ ID No. It contains a thymidine residue at position 719 of the sense strand of the coding region of the nucleotide sequence shown in No. 1.

【００４０】 本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。それらは一本鎖又
は二本鎖であり得る。それらはまた、そのなかに合成又は修飾されたヌクレオチ
ドを包含するポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対する数多く
の異なるタイプの修飾が当技術分野で知られている。それには、メチルホスホネ
ート及びホスホロチオエート骨格、分子の３’及び／又は５’端でのアクリジン
又はポリリシンの付加、が含まれる。本発明の目的のためには、本明細書に記載
のポリヌクレオチドは当技術分野で利用可能な任意の方法により修飾され得ると
考えられる。そのような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのin vivo活性又は
寿命を亢進するために実施され得る。[0040] The polynucleotide of the present invention may comprise DNA or RNA. They can be single-stranded or double-stranded. They can also be polynucleotides, including synthetic or modified nucleotides therein. Many different types of modifications to oligonucleotides are known in the art. It includes a methylphosphonate and phosphorothioate backbone, the addition of acridine or polylysine at the 3 'and / or 5' end of the molecule. For the purposes of the present invention, it is contemplated that the polynucleotides described herein may be modified by any of the methods available in the art. Such modifications can be made to enhance the in vivo activity or longevity of the polynucleotide of the invention.

【００４１】 本発明のポリヌクレオチドが二本鎖である場合、この二重鎖の２つの鎖は、個
別か又は組み合わせて、本発明に包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である
場合、このポリヌクレオチドの相補配列も本発明の範囲内に含まれると理解され
るべきである。When the polynucleotide of the present invention is double-stranded, the two strands of the duplex are included in the present invention either individually or in combination. Where the polynucleotide is single-stranded, it is to be understood that the complementary sequence of the polynucleotide is also included within the scope of the invention.

【００４２】 野生型ＰＡＲ−２又は天然に存在する変異体をコードするポリヌクレオチドは
、数多くの方法において得ることができる。本明細書に記載される配列の他の変
異体は、例えば、広範囲の個体、例えば様々な集団の個体から作成されるＤＮＡ
ライブラリーをプローブすることにより得られる場合がある。さらに、他の相同
体、特に哺乳動物（例、ハムスター、ウシ、又は霊長類の細胞）に見出される相
同体は、他の動物種から作成されるｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリ
ーをプローブし、既知のＰＡＲ−２配列の全部又は一部を含んでなるプローブを
用いて中位〜高いストリンジェンシーの条件下で、そのようなライブラリーをプ
ローブすることによって得られる場合がある。同様の考察は、既知のヒト、ラッ
ト又はマウスのＰＡＲ−２配列の種相同体と対立遺伝子の変異体を得ることにも
適用される。[0042] Polynucleotides encoding wild-type PAR-2 or naturally occurring variants can be obtained in a number of ways. Other variants of the sequences described herein include, for example, DNA produced from a wide range of individuals, eg, individuals of various populations.
It may be obtained by probing the library. In addition, other homologs, especially those found in mammals (eg, hamster, bovine, or primate cells), can be used to probe cDNA libraries or genomic libraries made from other animal species, and Under moderate to high stringency conditions using a probe comprising all or a portion of the PAR-2 sequence of the present invention. Similar considerations apply to obtaining species homologs and allelic variants of the known human, rat or mouse PAR-2 sequence.

【００４３】 変異体及び株／種相同体はまた、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコード
する変異体及び相同体の内部にある配列をターゲットにするように設計されたプ
ライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて得られる場合がある。保存配列は、例え
ば、いくつかの変異体／相同体由来のアミノ酸配列を並置することによって予測
し得る。配列並置は当技術分野で知られているコンピュータ・ソフトウェアを使
用して実施し得る。例えば、ＧＣＧウィスコンシンＰｉｌｅＵｐプログラムが広
く使用されている。Variants and strain / species homologs may also be obtained using primers designed to target sequences internal to the variants and homologs encoding conserved amino acid sequences within the sequences of the invention. It may be obtained using double PCR. Conserved sequences can be predicted, for example, by aligning amino acid sequences from several variants / homologues. Sequence alignment can be performed using computer software known in the art. For example, the GCG Wisconsin PileUp program is widely used.

【００４４】 縮重ＰＣＲに使用されるプライマーは、１つ又はそれ以上の縮重位置を含有し
、既知配列に対する単一の配列プライマーで配列をクローニングするために使用
されるものより低いストリンジェンシー条件で使用される。The primers used for degenerate PCR contain one or more degenerate positions and have lower stringency conditions than those used to clone sequences with a single sequence primer to a known sequence Used in.

【００４５】 他のやり方では、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のような特徴づけられた配列の部位
特異的突然変異誘発によって、そのようなポリヌクレオチドが得られる場合があ
る。このことは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細
胞のコドン選好性を最適化するために配列に対してサイレントなコドン変化が求
められる場合に有用であるかもしれない。制限酵素認識部位を導入すること、又
はポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの特性又は機能を変化させ
ることのために他の配列変化が所望される場合もある。In another approach, SEQ ID No. Such polynucleotides may be obtained by site-directed mutagenesis of a characterized sequence such as 1. This may be useful, for example, when silent codon changes to the sequence are required to optimize the codon preference of the particular host cell in which the polynucleotide sequence is being expressed. Other sequence changes may be desired to introduce restriction enzyme recognition sites or to alter the properties or functions of the polypeptide encoded by the polynucleotide.

【００４６】 本発明のポリヌクレオチドは、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、選択的
増幅反応用のプライマー、例えば放射活性又は非放射活性ラベルを使用する従来
手段により表示ラベルで標識されたプローブを産生するために使用され得るか、
又はこのポリヌクレオチドはベクターへクローン化され得る。このようなプライ
マー、プローブ及び他のフラグメントは、少なくとも１５、好ましくは少なくと
も２０、例えば少なくとも２５、３０又は４０個のヌクレオチドの長さであり、
本明細書に使用されるような本発明のポリヌクレオチドの用語にも含まれる。The polynucleotides of the present invention can be used to produce probes labeled with a label by conventional means using primers, eg, PCR primers, primers for selective amplification reactions, eg, radioactive or non-radioactive labels. Can be used or
Alternatively, the polynucleotide can be cloned into a vector. Such primers, probes and other fragments are at least 15, preferably at least 20, for example at least 25, 30 or 40 nucleotides in length,
It is also included in the term of the polynucleotide of the present invention as used herein.

【００４７】 プライマーとプローブは、以下に記載のように、個人の遺伝子型を同定し、そ
のＰＡＲ−２状態を確定するために好便にも使用され得る。 本発明によるＤＮＡポリヌクレオチド及びプローブのようなポリヌクレオチド
は、組換え的、合成的、又は当業者に利用可能な手段により産生され得る。それ
らはまた、標準技術によりクローン化され得る。Primers and probes can also be conveniently used to identify an individual's genotype and determine its PAR-2 status, as described below. Polynucleotides such as DNA polynucleotides and probes according to the present invention can be produced recombinantly, synthetically, or by means available to those of skill in the art. They can also be cloned by standard techniques.

【００４８】 一般に，プライマーは、所望される核酸配列を一度に１個ずつ段階的に製造す
ることを含む、合成手段により産生され得る。自動化技術を使用してこのことを
達成する技術は、当技術分野で容易に利用可能である。In general, primers may be produced by synthetic means, involving a stepwise manufacture of the desired nucleic acid sequence one at a time. Techniques for accomplishing this using automated techniques are readily available in the art.

【００４９】 より長いポリヌクレオチドは、組換え手段、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖
反応）クローニング技術を使用して産生される。このことは、クローン化するこ
とが所望される配列の領域に隣接するプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレ
オチド）をつくること、動物又はヒトの細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ
にこのプライマーを接触させること、所望される領域の増幅をもたらす条件下で
ポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、増幅されたフラグメントを単離すること
（例えば、反応混合物をアガロースゲル上で精製することによって）、及び増幅
されたＤＮＡを回収することを含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡが好適な
クローニング・ベクターへクローン化されるように、好適な制限酵素認識部位を
含有するように設計され得る。Longer polynucleotides are produced using recombinant means, for example using PCR (polymerase chain reaction) cloning techniques. This involves making primers (eg, about 15-30 nucleotides) flanking the region of the sequence desired to be cloned, mRNA or cDNA obtained from animal or human cells.
Contacting the primers, performing the polymerase chain reaction under conditions that result in amplification of the desired region, isolating the amplified fragments (eg, by purifying the reaction mixture on an agarose gel). ), And recovering the amplified DNA. Primers can be designed to contain suitable restriction enzyme recognition sites so that the amplified DNA can be cloned into a suitable cloning vector.

【００５０】 Ｃ．ヌクレオチドベクター 本発明のポリヌクレオチドは複製可能な組換えベクターへ取り込ませることが
できる。このベクターは、適合する宿主細胞においてこの核酸を複製するために
使用され得る。従って、さらなる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチ
ドを複製可能なベクターへ導入すること、適合する宿主細胞へこのベクターを導
入すること、及びこのベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させる
ことによって本発明のポリヌクレオチドを創出する方法を提供する。ベクターは
宿主細胞から回収し得る。好適な宿主細胞には、E.coliのような細菌、酵母、哺
乳動物細胞、及び他の真核細胞系、例えば昆虫のＳｆ９細胞が含まれる。C. Nucleotide Vector The polynucleotide of the present invention can be incorporated into a replicable recombinant vector. This vector can be used to replicate the nucleic acid in a compatible host cell. Thus, in a further aspect, the present invention provides for introducing a polynucleotide of the invention into a replicable vector, introducing the vector into a compatible host cell, and transforming the host cell under conditions that result in replication of the vector. Methods are provided for creating a polynucleotide of the invention by growing. The vector can be recovered from the host cell. Suitable host cells include bacteria such as E. coli, yeast, mammalian cells, and other eukaryotic cell lines, for example, insect Sf9 cells.

【００５１】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ベクターにおいて、宿主細胞によ
るコーディング配列の発現をもたらし得る調節配列と機能可能的に連結される。
即ち、このベクターは発現ベクターである。「機能可能的に連結される」という
用語は、上記の諸成分がその意図されたやり方において機能することを可能にす
る関係にあることを意味する。コーディング配列に「機能可能的に連結される」
調節配列は、コーディング配列の発現が調節配列に適合した条件下で達成される
ようなやり方で連結される。Preferably, the polynucleotide of the present invention is operably linked in a vector to regulatory sequences capable of effecting the expression of the coding sequence by a host cell.
That is, this vector is an expression vector. The term "operably linked" means that the components described above are in a relationship permitting them to function in their intended manner. "Operably linked" to a coding sequence
The control sequences are ligated in such a way that expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.

【００５２】 調節配列は、例えば、調節配列により指令される転写のレベルを転写モジュレ
ーターに対してより応答させるために、さらなる転写調節要素の付加により修飾
され得る。[0052] Regulatory sequences can be modified by the addition of additional transcriptional regulatory elements, for example, to make the level of transcription dictated by the regulatory sequence more responsive to transcription modulators.

【００５３】 本発明のベクターは、本発明のタンパク質の発現をもたらすために、以下に記
載のような好適な宿主細胞へ形質転換されるか又はトランスフェクトされ得る。
この方法は、上記のような発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、当該タン
パク質をコードするコーディング配列がこのベクターにより発現される条件下で
培養すること、及び、発現されたタンパク質を所望により回収することを含み得
る。A vector of the invention can be transformed or transfected into a suitable host cell as described below to effect expression of a protein of the invention.
This method comprises culturing host cells transformed with the expression vector as described above under conditions in which the coding sequence encoding the protein is expressed by the vector, and optionally recovering the expressed protein Can include:

【００５４】 ベクターは、複製起点、所望により前記ポリペプチドの発現についてのプロモ
ーター、及び所望によりプロモーターのレギュレーターが備わった、例えばプラ
スミド又はウイルスベクターであり得る。このベクターは、１つ又はそれ以上の
選択マーカー、例えば細菌プラスミドの場合のアンピシリン耐性遺伝子、又は哺
乳動物ベクターのネオマイシン耐性遺伝子を含有し得る。ベクターは、例えば、
宿主細胞をトランスフェクトするか又は形質転換するために使用され得る。The vector can be, for example, a plasmid or viral vector, provided with an origin of replication, optionally a promoter for expression of the polypeptide, and optionally a regulator of the promoter. The vector may contain one or more selectable markers, for example, the ampicillin resistance gene in the case of a bacterial plasmid, or the neomycin resistance gene of a mammalian vector. Vectors, for example,
It can be used to transfect or transform a host cell.

【００５５】 本発明のタンパク質をコードする配列に機能可能的に連結される調節配列には
、プロモーター／エンハンサー、及び他の発現調節シグナルが含まれる。これら
の調節配列は、発現ベクターがその中で使用されるように設計されている宿主細
胞と適合性があるように選択され得る。プロモーターという用語は当技術分野で
よく知られていて、それには、大きさ及び複雑性において最小のプロモーターか
ら上流の要素及びエンハンサーを包含するプロモーターまでの範囲にある核酸領
域が含まれる。Regulatory sequences operably linked to sequences encoding the proteins of the present invention include promoters / enhancers and other expression control signals. These regulatory sequences can be chosen to be compatible with the host cell in which the expression vector is designed to be used. The term promoter is well known in the art and includes nucleic acid regions that range in size and complexity from minimal promoters to promoters containing upstream elements and enhancers.

【００５６】 プロモーターは、典型的には、哺乳動物細胞において機能的であるプロモータ
ーから選択されるが、原核プロモーターや他の真核細胞において機能的なプロモ
ーターも使用され得る。プロモーターは、典型的には、ウイルス又は真核性の遺
伝子のプロモーター配列から誘導される。例えば、それは、その中で発現が起こ
り得る細胞のゲノムから誘導されるプロモーターであり得る。真核プロモーター
に関して言えば、それらは、（ａ−アクチン、ｂ−アクチン、チューブリンのプ
ロモーターのように）普遍的なやり方か、又は他のやり方では、（ピルビン酸キ
ナーゼ遺伝子のプロモーターのように）組織特異的なやり方で機能するプロモー
ターであり得る。それはまた、特定の刺激に応答するプロモーター、例えば、ス
テロイドホルモン受容体に結合するプロモーターであり得る。ウイルスプロモー
ターも使用され得る。例えば、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端繰り返
し（ＭＭＬＶ−ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプ
ロモーター、又はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターである
。The promoter is typically selected from promoters that are functional in mammalian cells, although prokaryotic and other eukaryotic promoters can be used. Promoters are typically derived from promoter sequences of viral or eukaryotic genes. For example, it can be a promoter derived from the genome of the cell in which expression can take place. With respect to eukaryotic promoters, they are either universal (like the promoters for a-actin, b-actin, tubulin) or in other ways (like the promoter for the pyruvate kinase gene). It may be a promoter that functions in a tissue-specific manner. It can also be a promoter responsive to a particular stimulus, such as a promoter that binds to a steroid hormone receptor. Viral promoters can also be used. For example, the Moloney murine leukemia virus long terminal repeat (MMLV-LTR) promoter, the Rous sarcoma virus (RSV) LTR promoter, or the human cytomegalovirus (CMV) IE promoter.

【００５７】 本発明のポリヌクレオチドの発現レベルが細胞の寿命の間に調節され得るよう
にプロモーターが誘導可能であることも有利であり得る。「誘導可能である」と
は、このプロモーターを使用して得られる発現のレベルが調節され得ることを意
味する。It may also be advantageous for the promoter to be inducible so that the expression level of the polynucleotide of the invention can be regulated during the life of the cell. "Inducible" means that the level of expression obtained using this promoter can be regulated.

【００５８】 さらに、上記のプロモーターは、さらなる調節性の配列、例えばエンハンサー
配列の付加により修飾され得る。上記の２種又はそれ以上の異なるプロモーター
に由来する配列要素をを含んでなるキメラプロモーターも使用され得る。In addition, the above promoters can be modified by the addition of additional regulatory sequences, for example, enhancer sequences. Chimeric promoters comprising sequence elements from the two or more different promoters described above may also be used.

【００５９】 Ｄ．宿主細胞 本発明のベクター及びポリヌクレオチドは、このベクター／ポリヌクレオチド
を複製すること、及び／又は本発明のポリヌクレオチドによりコードされる本発
明のタンパク質を発現させることの目的のために、宿主細胞へ導入され得る。本
発明のポリペプチドを発現させるには、真核細胞、例えば酵母、昆虫又は哺乳動
物の細胞、特に哺乳動物の細胞を使用することが好ましい。D. Host cells The vectors and polynucleotides of the present invention may be used to replicate host cells for the purpose of replicating the vector / polynucleotide and / or expressing a protein of the present invention encoded by the polynucleotide of the present invention. Can be introduced. In order to express the polypeptide of the present invention, it is preferable to use eukaryotic cells, for example, yeast, insect or mammalian cells, particularly mammalian cells.

【００６０】 本発明のベクター／ポリヌクレオチドは、トランスフェクション、形質転換及
びエレクトロポレーションのような、当技術分野で知られている多種多様な技術
を使用して、好適な宿主細胞へ導入され得る。本発明のベクター／ポリヌクレオ
チドが動物へ投与される場合、いくつかの技術が当技術分野で知られている。例
えば、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びアデノウイルスのような組換
えウイルスベクターを用いた感染、核酸の直接注射、及び全体的な形質転換であ
る。The vectors / polynucleotides of the present invention can be introduced into a suitable host cell using a wide variety of techniques known in the art, such as transfection, transformation and electroporation. . When the vector / polynucleotide of the present invention is administered to an animal, several techniques are known in the art. For example, infection with recombinant viral vectors such as retroviruses, herpes simplex viruses and adenoviruses, direct injection of nucleic acids, and total transformation.

【００６１】 Ｅ．タンパク質の発現及び精製 本発明のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞は、本発明のタンパク質を発
現するために使用され得る。宿主細胞は、本発明のタンパク質の発現を可能にす
る好適な条件の下で培養され得る。本発明のタンパク質の発現は、それが連続的
に産生されるように構成的であり得るか、又は、発現を始動させる刺激を必要と
して誘導され得る。誘導される発現の場合、タンパク質の産生が始動され得るの
は、例えば、培地への誘導物質（例、デキサメタゾン又はＩＰＴＧ）の添加によ
り必要とされる場合である。E. Protein Expression and Purification Host cells comprising a polynucleotide of the invention can be used to express a protein of the invention. Host cells can be cultured under suitable conditions that allow for expression of the proteins of the invention. Expression of a protein of the invention may be constitutive such that it is produced continuously or may be induced in need of a stimulus to trigger expression. In the case of induced expression, production of the protein can be triggered, for example, as required by the addition of an inducer (eg, dexamethasone or IPTG) to the medium.

【００６２】 本発明のタンパク質は、酵素的、化学的、及び／又は浸透圧溶解、及び物理的
な破壊を含む、当技術分野で知られている多種多様な技術により宿主細胞から抽
出され得る。[0062] The proteins of the invention can be extracted from host cells by a wide variety of techniques known in the art, including enzymatic, chemical, and / or osmotic lysis, and physical disruption.

【００６３】 Ｆ．抗体 本発明はまた、本発明のポリペプチド又はそのフラグメントに対するモノクロ
ーナル又はポリクローナル抗体を提供する。従って、本発明はさらに本発明のポ
リペプチドに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体の産生法を提供する
。好ましくは、これらの抗体は本発明のポリペプチドに特異的である、即ち、野
生型ＰＡＲ−２とはほとんど、ないし全く交叉反応性を有さない。F. Antibodies The invention also provides monoclonal or polyclonal antibodies against the polypeptides of the invention or fragments thereof. Accordingly, the present invention further provides a method for producing a monoclonal or polyclonal antibody against the polypeptide of the present invention. Preferably, these antibodies are specific for a polypeptide of the invention, ie, have little or no cross-reactivity with wild-type PAR-2.

【００６４】 ポリクローナル抗体が所望される場合、選択される哺乳動物（例、マウス、ウ
サギ、ヤギ、ウマ、等）を、変異ＥＣＬ−２配列エピトープを含んでなる免疫原
性ポリペプチドで免疫化する。免疫化した動物から血清を採取し、既知の方法に
より処理する。ＰＡＲ−２エピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血
清が他の抗原に対する抗体を含む場合、このポリクローナル抗体を免疫アフィニ
ティー・クロマトグラフィーにより精製し得る。ポリクローナル抗血清を産生し
て処理するための技術は当技術分野で知られている。そのような抗体が作られる
ために、本発明はまた、動物又はヒトの免疫原として使用される別のポリペプチ
ドをハプテンとする、本発明のポリペプチド又はそのフラグメントを提供する。If a polyclonal antibody is desired, a selected mammal (eg, mouse, rabbit, goat, horse, etc.) is immunized with an immunogenic polypeptide comprising a mutant ECL-2 sequence epitope. . Serum is collected from the immunized animal and processed by known methods. If the serum containing the polyclonal antibody against the PAR-2 epitope contains antibodies against other antigens, the polyclonal antibody can be purified by immunoaffinity chromatography. Techniques for producing and processing polyclonal antisera are known in the art. In order to make such antibodies, the invention also provides a polypeptide of the invention or a fragment thereof, wherein another polypeptide used as an animal or human immunogen is a hapten.

【００６５】 本発明のポリペプチド中のエピトープに対して向けられるモノクローナル抗体
も、当業者により容易に産生し得る。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体
をつくるための一般的な方法論はよく知られている。不死の抗体産生細胞系は、
細胞融合、さらに、腫瘍遺伝子ＤＮＡを用いてＢリンパ球を直接形質転換するこ
と、又はエプシュタイン−バー・ウイルスを用いたトランスフェクションのよう
な他の技術により創出し得る。オービット（orbit）エピトープに対して産生さ
れるモノクローナル抗体のパネルを様々な特性、即ち、イソ型及びエピトープ親
和性につきスクリーニングすることができる。[0065] Monoclonal antibodies directed against an epitope in a polypeptide of the present invention can also be readily produced by those skilled in the art. The general methodology for making monoclonal antibodies by hybridomas is well known. Immortal antibody-producing cell lines
It can be created by other techniques such as cell fusion, as well as direct transformation of B lymphocytes with oncogene DNA, or transfection with Epstein-Barr virus. Panels of monoclonal antibodies produced against orbit epitopes can be screened for various properties, ie, isoform and epitope affinity.

【００６６】 他の技術は、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーをスクリーニングするこ
とを含むが、ここでは例えば、ファージが多種多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）
の付いたそのコートの表面にｓｃＦｖフラグメントを発現する。この技術は当技
術分野でよく知られている。Another technique involves screening a phage display library, where, for example, the phage has a wide variety of complementarity determining regions (CDRs).
The scFv fragment is expressed on the surface of the coat marked with. This technique is well-known in the art.

【００６７】 ＥＣＬ−２エピトープに対して向けられる抗体は、モノクローナルとポリクロ
ーナルの両方とも、特に診断において有用である。モノクローナル抗体は、特に
、抗イディオタイプ抗体を産生するのに使用され得る。抗イディオタイプ抗体は
、それに対する防護が所望される薬剤の抗原の「内部イメージ」を担う免疫グロ
ブリンである。抗イディオタイプ抗体を産生する技術は当技術分野で知られてい
る。これら抗イディオタイプ抗体は治療に有用でもあり得る。Antibodies directed against the ECL-2 epitope, both monoclonal and polyclonal, are particularly useful in diagnostics. Monoclonal antibodies can in particular be used to raise anti-idiotype antibodies. Anti-idiotype antibodies are immunoglobulins that carry the "internal image" of the antigen of the drug against which protection is desired. Techniques for producing anti-idiotype antibodies are known in the art. These anti-idiotype antibodies may also be therapeutically useful.

【００６８】 本発明の目的のためには、「抗体」という用語は、他に特定しなければ、ター
ゲット抗原に結合する活性を保持する、全抗体のフラグメントも包含する。その
ようなフラグメントには、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）₂フラグメント
、並びに単鎖抗体（ＳｃＦｖ）が含まれる。さらに、抗体及びそのフラグメント
は、例えばＥＰ−Ａ−２３９４００に記載のように、ヒト化抗体であり得る。For the purposes of the present invention, the term “antibody” also encompasses, unless otherwise specified, fragments of a whole antibody that retain the activity of binding to a target antigen. Such fragments include Fv, F (ab ') and F (ab') ₂ fragments, as well as single chain antibodies (ScFv). Furthermore, the antibodies and fragments thereof can be humanized antibodies, for example as described in EP-A-239400.

【００６９】 抗体は、生物学的サンプルに存在する本発明のポリペプチドを検出する方法に
おいて使用され得るが、前記方法は： （ａ）本発明の抗体を提供すること； （ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で前記抗体とともに生物学
的サンプルをインキュベートすること；及び （ｃ）前記抗体を含んでなる抗体−抗原複合体が形成されるかどうかを判定す
ること、を含む。The antibodies can be used in a method for detecting a polypeptide of the invention present in a biological sample, said method comprising: (a) providing an antibody of the invention; (b) antibody-antigen Incubating a biological sample with said antibody under conditions that allow complex formation; and (c) determining whether an antibody-antigen complex comprising said antibody is formed. Including.

【００７０】 好適なサンプルには、脳、***、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、筋肉及び骨組
織のような組織抽出物、又はそのような組織から誘導される新生物の増殖物から
の抽出物が含まれる。Suitable samples include tissue extracts such as brain, breast, ovary, lung, colon, pancreas, testis, muscle and bone tissue, or neoplastic growths derived from such tissue. Extract.

【００７１】 本発明の抗体は、固形支持体に結合しているか、又は好適な試薬、対照物、使
用説明書とともに好適な容器に入ったキットへパッケージされ得る。The antibodies of the present invention may be bound to a solid support or packaged in a suitable container with suitable reagents, controls, and instructions for use in a kit.

【００７２】 Ｇ．使用 （ｉ）遺伝子型の決定（ジェノタイピング） 我々は、ＰＡＲ−２のＦ２４０Ｓ多型が１２５名の群において８．４％の対立
遺伝子頻度で存在し、１５．２％の個体が少なくとも１つの変異対立遺伝子を担
っていることを示した。さらに、我々は、Ｆ２４０Ｓの多型が野生型ＰＡＲ−２
に比較してＰＡＲ−活性化作動薬に対し異なる反応を示すことを示した。多型の
変化した特質は、ＰＡＲ−２をターゲットにする拮抗薬を使用することに基づい
た薬物療法に関してきわめて重要となり得る。なぜなら、野生型ＰＡＲ−２タン
パク質をターゲットにするように設計された拮抗薬が、Ｓ対立遺伝子を有する個
体へ投与される場合、無効となるか、又は実際には有害になるかもしれないから
である。また、ＦＳヘテロ接合体及び／又はＳＳホモ接合体は、炎症性疾患のよ
うな疾患に対して高まった罹病性を有する場合がある。従って、個体のＰＡＲ−
２状態を決定することは、変異ＰＡＲ−２に関連した疾患に罹るリスクにある個
体を同定することに使用し得る。G. Uses (i) Genotyping (genotyping) We show that the F240S polymorphism of PAR-2 is present at an allele frequency of 8.4% in a group of 125 and that 15.2% of individuals have at least one It was shown to carry the mutant allele. In addition, we show that the polymorphism of F240S is wild-type PAR-2.
Showed a different response to PAR-activated agonists compared to The altered nature of the polymorphism can be crucial for pharmacotherapy based on the use of antagonists targeting PAR-2. This is because antagonists designed to target the wild-type PAR-2 protein may be ineffective or actually deleterious when administered to individuals with the S allele. is there. Also, FS heterozygotes and / or SS homozygotes may have increased susceptibility to diseases such as inflammatory diseases. Therefore, the PAR-
Determining the two states can be used to identify individuals at risk for developing a disease associated with mutant PAR-2.

【００７３】 このように、ＰＡＲ−２作動薬が投与され得る個体がＳ対立遺伝子か又は他の
同様な変異を有するかどうかを判定することは、その遺伝子型を確定するために
きわめて望ましいだろう。Thus, determining whether an individual to whom a PAR-2 agonist can be administered has the S allele or other similar mutation would be highly desirable to determine its genotype. .

【００７４】 従って、本発明は個体のＰＡＲ−２遺伝子型を決定する方法を提供し、この方
法は、個体のＰＡＲ−２遺伝子内にあるＥＣＬ−２領域の配列の全部又は一部を
決定することを含む。好ましくは、アミノ酸２４０、又はその同等物を特定する
ヌクレオチドコドンの配列が決定されるか、より好ましくは、ヌクレオチド７１
９における多型部位の配列が決定される。Accordingly, the present invention provides a method for determining the PAR-2 genotype of an individual, the method comprising determining all or part of the sequence of the ECL-2 region within the PAR-2 gene of the individual. Including. Preferably, the sequence of nucleotide codons specifying amino acid 240, or its equivalent, is determined, or more preferably, nucleotide 71
The sequence of the polymorphic site at 9 is determined.

【００７５】 この配列は、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ、好ましくはゲノムＤＮＡについて決
定され得る。このことをするための多様な技術が、ＰＦＬＰ分析又は直接ゲノム
配列決定（いずれも実施例で説明される）のように、当技術分野で知られている
。この文脈における配列の決定は、正確なヌクレオチド配列が確定されなければ
ならないということを必ずしも意味しない。なぜなら、例えば、特定サイズの制
限フラグメントの存在又は不在がわかれば十分であり得るからである（実施例を
参照のこと）。The sequence can be determined on genomic DNA or mRNA, preferably on genomic DNA. A variety of techniques for doing this are known in the art, such as PFLP analysis or direct genomic sequencing (both described in the Examples). Determining a sequence in this context does not necessarily mean that the exact nucleotide sequence must be determined. This is because, for example, it may be sufficient to know the presence or absence of restriction fragments of a particular size (see examples).

【００７６】 注目の個体由来の核酸は、典型的には、血液サンプル又は他の組織サンプルの
ような、個体から取られる生物学的サンプルから得られる。 典型的には、ジェノタイピングは、ＥＣＬ−２領域に隣接するＰＣＲプライマ
ーを使用して実施され得る。従って、本発明は、ＰＡＲ−２ヌクレオチド配列の
少なくとも１０個の連続したヌクレオチドをそれぞれ含んでなり、ＥＣＬ−２領
域に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーの対を提供する。このプライマー対
は、個体のＰＡＲ−２遺伝子型を確定することの使用に提供される。ＰＣＲプラ
イマーは、緩衝液のような他の成分、使用説明書などとともにキットへパッケー
ジされ得る。[0076] Nucleic acids from the individual of interest are typically obtained from a biological sample taken from the individual, such as a blood sample or other tissue sample. Typically, genotyping can be performed using PCR primers flanking the ECL-2 region. Thus, the present invention provides a pair of oligonucleotide primers, each comprising at least 10 contiguous nucleotides of the PAR-2 nucleotide sequence and flanking the ECL-2 region. This primer pair is provided for use in determining an individual's PAR-2 genotype. The PCR primers can be packaged in a kit with other components such as buffers, instructions for use, and the like.

【００７７】 ジェノタイピングはまた、タンパク質をベースとするアプローチを使用して、
例えば本発明のＰＡＲ−２ポリペプチドに対する抗体（Ｆ節参照）を使用して実
行され得る。 （ｉｉ）変異ＰＡＲ−２ポリペプチドの作動薬／拮抗薬を同定するためのアッセ
イ 上記に論じたように、Ｆ２４０Ｓ ＰＡＲ−２多型は野生型ＰＡＲ−２とは異
なる特質を有するので、野生型ＰＡＲ−２受容体の活性に影響を及ぼすために使
用され得る作動薬／拮抗薬はこの多型に対して有効でない可能性がある。従って
、少なくとも１つのＳ対立遺伝子、又は野生型に比較して変換した特質を有する
他の多型を保有する患者に有効である作動薬／拮抗薬を同定することが望ましい
だろう。[0086] Genotyping also uses a protein-based approach,
For example, it can be carried out using an antibody against the PAR-2 polypeptide of the invention (see section F). (Ii) Assays for Identifying Agonists / Antagonists of Mutant PAR-2 Polypeptides As discussed above, the F240S PAR-2 polymorphism has different properties from wild-type PAR-2, and therefore, Agonists / antagonists that can be used to affect the activity of the PAR-2 receptor may not be effective against this polymorphism. Accordingly, it would be desirable to identify agonists / antagonists that are efficacious in patients carrying at least one S allele, or other polymorphism with altered characteristics compared to wild type.

【００７８】 従って、本発明は、本発明のポリペプチドの活性をモジュレートする、例えば
本発明のポリペプチドを刺激するか又は阻害する化合物を同定するスクリーニン
グ方法を提供する。Thus, the present invention provides screening methods for identifying compounds that modulate the activity of a polypeptide of the invention, eg, stimulate or inhibit a polypeptide of the invention.

【００７９】 容易に実施される１つのタイプのin vitroアッセイでは、本発明のポリペプチ
ドへ結合することについて、候補化合物が試験され得る。結合アッセイは当技術
分野で周知である。好ましい態様では、候補化合物は既知の作動薬又は拮抗薬と
の競合アッセイにおいて試験される。この作動薬又は拮抗薬は検出し得るラベル
で標識され得る。１つの典型的なプロトコールでは、様々な濃度の候補化合物が
一定濃度の標識化作動薬又は拮抗薬とともに供給され、標識化作動薬／拮抗薬の
受容体に対する結合の阻害が既知の技術を使用して評価され得る。In one type of in vitro assay that is readily performed, candidate compounds may be tested for binding to a polypeptide of the invention. Binding assays are well-known in the art. In a preferred embodiment, candidate compounds are tested in competition assays with known agonists or antagonists. The agonist or antagonist can be labeled with a detectable label. In one exemplary protocol, varying concentrations of the candidate compound are provided with a fixed concentration of a labeled agonist or antagonist, and techniques that are known to inhibit binding of the labeled agonist / antagonist to the receptor are used. Can be evaluated.

【００８０】 より洗練された機能アッセイは、本発明のポリペプチドに候補物質を接触させ
ること、及びこのポリペプチドが刺激されるか又は阻害されるかを決定すること
を含む。本発明のポリペプチドを刺激する作動薬について試験する場合、１つの
好適なアッセイは、実施例及び参考文献３１に記載のカルシウムシグナル伝達ア
ッセイである。このように、例えば、作動薬誘導性の応答に対する候補化合物の
効果は、本発明の変異ＰＡＲ−２受容体を組換え的に発現する細胞において測定
され得る。A more sophisticated functional assay involves contacting a candidate agent with a polypeptide of the invention and determining whether the polypeptide is stimulated or inhibited. When testing for agonists that stimulate the polypeptides of the invention, one suitable assay is the calcium signaling assay described in the Examples and References 31. Thus, for example, the effect of a candidate compound on an agonist-induced response can be measured in cells that recombinantly express a mutant PAR-2 receptor of the present invention.

【００８１】 上記細胞に対する受容体活性化の効果についてのアッセイ系には、本明細書に
おいてより詳しく説明される、カルシウム可動性及び電圧固定法が含まれる。こ
れらのアッセイは、候補化合物の受容体に結合する能力より、受容体の活性に対
する効果の評価を可能にする。変異ＰＡＲ−２受容体を発現する細胞により作動
薬に誘導されたＣａ放出が増加することは、既知の技術を使用して評価し得る。
１つのそのようなプロトコールは、参照により本明細書に組込まれている米国特
許第５，８７４，４００号に説明されている。これらのタイプのアッセイを使用
すれば、受容体を活性化する候補化合物の能力を直接試験することができる。カ
ルシウム可動性を測定する他の方法では、受容体活性化についての測定として電
圧固定アッセイを使用し得る。作動薬に誘導された内側への塩化物の流れは、単
電極電圧固定技術を使用する以外は本質的に既報（Julius et al., Science (19
88) 241: 558-563）のようにして、変異ＰＡＲ−２受容体を発現する電圧固定さ
れた細胞において測定される。Assay systems for the effects of receptor activation on the cells include the calcium mobilization and voltage clamp methods described in more detail herein. These assays allow the assessment of the effect on the activity of the receptor by the ability of the candidate compound to bind to the receptor. Increased agonist-induced Ca release by cells expressing a mutant PAR-2 receptor can be assessed using known techniques.
One such protocol is described in US Pat. No. 5,874,400, which is incorporated herein by reference. Using these types of assays, one can directly test the ability of a candidate compound to activate a receptor. In another method of measuring calcium mobility, a voltage clamp assay can be used as a measure for receptor activation. Agonist-induced inward chloride flow was essentially as previously described (Julius et al., Science (19).
88) 241: 558-563) as measured in voltage-clamped cells expressing a mutant PAR-2 receptor.

【００８２】 他のアッセイは、角化細胞からのサイトカイン放出を測定すること（１６）、
及び白血球の内皮細胞へのローリング及び接着を含む。 拮抗薬は、既知の作動薬が対照サンプルにおいて単独で使用され、試験サンプ
ルにおいて候補化合物とともに細胞へ同時投与されること以外は、同様のやり方
で試験され得る。Other assays measure cytokine release from keratinocytes (16)
And rolling and adhesion of leukocytes to endothelial cells. Antagonists can be tested in a similar manner, except that the known agonist is used alone in the control sample and co-administered to the cells with the candidate compound in the test sample.

【００８３】 好適な既知の作動薬には、トリプシン、トリプターゼ、ＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂、
ｔｒａｎｓ−シンナモイル−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ₂、並びに米国特許第５，８７
４，４００号に記載の多数の作動薬が含まれる。本発明のアッセイ法における使
用に適した既知の拮抗薬も米国特許第５，７８４，４００号に記載されている。Suitable known agonists include trypsin, tryptase, TFLLR-NH ₂ ,
trans-cinnamoyl-LIGRLO-NH ₂ , and US Pat.
No. 4,400 include a large number of agonists. Known antagonists suitable for use in the assays of the invention are also described in US Pat. No. 5,784,400.

【００８４】 １つの側面では、本発明のポリペプチドに特異的であり、野生型ＰＡＲ−２に
はほとんど、又は全く影響を及ぼさない、このペプチドの活性のモジュレーター
を同定することが好ましい場合がある。In one aspect, it may be preferable to identify modulators of the activity of this polypeptide that are specific for the polypeptide of the invention and have little or no effect on wild-type PAR-2. .

【００８５】 もう１つの側面では、野生型ＰＡＲ−２もモジュレートする、本発明のポリペ
プチドの活性のモジュレーターを同定することが好ましい場合がある。 従って、本発明のアッセイは、同様のアッセイ技術を使用して、本発明のポリ
ペプチドの作動薬又は拮抗薬の野生型ＰＡＲ−２に対する効果を決定する工程を
さらに含み得る。In another aspect, it may be preferable to identify modulators of the activity of a polypeptide of the invention that also modulate wild-type PAR-2. Accordingly, the assays of the present invention may further comprise the step of determining the effect of an agonist or antagonist of a polypeptide of the present invention on wild-type PAR-2 using similar assay techniques.

【００８６】 本発明の候補化合物はまた、例えば、ＰＡＲ−２作動薬の投与により引き起こ
される炎症反応にそれらが影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、動物モ
デルを使用して試験し得る（参考文献２１を参照のこと）。[0086] Candidate compounds of the invention can also be tested using animal models to determine, for example, whether they can affect the inflammatory response caused by administration of a PAR-2 agonist ( See reference 21).

【００８７】 そのような動物モデルの１つが米国特許第５，８７４，４００号に記載されて
いて、ここでは作動薬をラットの大腿静脈に注射し、動脈圧をモニターする。こ
のアッセイは、既知の作動薬の代わりに候補化合物を投与することによって候補
作動薬をアッセイすること、又は既知の作動薬とともに候補化合物を同時投与す
ることによって候補拮抗薬をアッセイすることのために使用され得る。候補化合
物の効果はまた、米国特許第５，８７４，４００号に記載のように、大腿静脈の
刺激の結果としての血管拡張を観察することによっても測定され得る。One such animal model is described in US Pat. No. 5,874,400, in which an agonist is injected into the femoral vein of a rat and the arterial pressure is monitored. This assay is for assaying a candidate agonist by administering a candidate compound instead of a known agonist, or for assaying a candidate antagonist by co-administering the candidate compound with a known agonist. Can be used. The effect of a candidate compound can also be measured by observing vasodilation as a result of stimulation of the femoral vein, as described in US Pat. No. 5,874,400.

【００８８】 候補化合物 好適な候補化合物には、ペプチド、特にＰＡＲ−２の配列に基づいた、約５〜
３０、又は１０〜２５アミノ酸のサイズのペプチド、特定すると、ＰＡＲ−２に
存在する鎖付きのリガンド配列、又は１つ又はそれ以上の残基が置換されたその
ようなペプチドの変異体が含まれる。他のペプチド候補物には、米国特許第５，
７８４，４００号に記載のペプチド作動薬及び拮抗薬、又は１つ又はそれ以上の
残基が置換されたそのようなペプチドの変異体が含まれる。ランダム配列、又は
最大に多様化したペプチドのパネルを提供する首尾一貫して変化した配列を含ん
でなるペプチドのパネルに由来するペプチドも使用され得る。Candidate Compounds Suitable candidate compounds include about 5 to about 5 based on the sequence of the peptide, especially PAR-2.
Includes peptides having a size of 30, or 10-25 amino acids, specifically the chained ligand sequence present in PAR-2, or variants of such peptides in which one or more residues have been substituted. . Other peptide candidates include U.S. Pat.
No. 784,400, including peptide agonists and antagonists, or variants of such peptides wherein one or more residues have been substituted. Peptides derived from a panel of peptides comprising a random sequence, or a consistently varied sequence that provides a panel of maximally diversified peptides, may also be used.

【００８９】 好適な候補物質には、本発明のポリペプチドに特異的である抗体産物（例えば
、モノクローナル及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体及びＣＤＲ−
移植抗体）も含まれる。さらに、コンビナトリアルライブラリー、ペプチド及び
ペプチド模擬体、明確化された化学物質、オリゴヌクレオチド、及び天然産物ラ
イブラリーもＰＡＲ−２活性のモジュレーターとしての活性についてスクリーニ
ングされ得る。候補物質は、初回スクリーニングでは、例えば各反応につき１０
種の物質のバッチで使用され、阻害を示すバッチの物質が個別に試験され得る。
記載の競合結合アッセイのようなin vitroスクリーニングにおいて活性を示す候
補物質は、次いで、やはり上記の全細胞系において試験され得る。Suitable candidate substances include antibody products specific for the polypeptides of the invention (eg, monoclonal and polyclonal antibodies, single chain antibodies, chimeric antibodies and CDR-
(Implanted antibody). In addition, combinatorial libraries, peptides and peptidomimetics, defined chemicals, oligonucleotides, and natural product libraries can be screened for activity as modulators of PAR-2 activity. In the initial screening, candidate substances are, for example, 10 per reaction.
Used in batches of species, the batches of material that show inhibition can be tested individually.
Candidate substances that show activity in in vitro screens, such as the competitive binding assays described, can then be tested in the whole cell lines, also described above.

【００９０】 Ｈ．治療上の使用 本発明のポリペプチドの拮抗薬／作動薬は、様々な障害に罹患している患者を
より効果的に治療するために使用され得るが、この患者は本発明による１種又は
それ以上のＰＡＲ−２多型を保有する。例えば、本発明のポリペプチドの拮抗薬
は、炎症性疾患、又は炎症により特徴づけられる病態、例えば喘息、慢性閉塞性
肺疾患、関節炎、炎症性腸疾患、乾癬及び湿疹を治療するのに使用され得る。そ
れらはまた、多発性硬化症のような障害を治療すること、及び血圧を高めること
にも使用され得る。H. Therapeutic Uses The antagonists / agonists of the polypeptides of the present invention can be used to more effectively treat patients suffering from various disorders, provided that the patient has one or more of the present inventions. It possesses the above PAR-2 polymorphism. For example, antagonists of the polypeptides of the invention are used to treat inflammatory diseases or conditions characterized by inflammation, such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, arthritis, inflammatory bowel disease, psoriasis and eczema. obtain. They can also be used to treat disorders such as multiple sclerosis and to increase blood pressure.

【００９１】 対照的に、本発明のポリペプチドの作動薬は、例えば、降圧薬として使用され
得る。 本発明のポリペプチドの活性をモジュレートする本発明の化合物、例えば、本
発明のアッセイ法によって同定されるか又は同定可能な物質は、好ましくは、本
発明の組成物を製造するために様々な成分と組み合わせ得る。好ましくは、この
組成物は、医薬組成物（ヒト又は動物に使用し得る）を製造するために製剤的に
許容される担体又は希釈剤と組み合わせられる。好適な担体及び希釈剤には、等
張生理食塩液、例えばリン酸緩衝化生理食塩水が含まれる。In contrast, agonists of the polypeptides of the invention can be used, for example, as antihypertensives. A compound of the invention that modulates the activity of a polypeptide of the invention, e.g., a substance identified or identifiable by an assay of the invention, is preferably a variety of materials for producing a composition of the invention. Can be combined with ingredients. Preferably, the composition is combined with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent to produce a pharmaceutical composition (which can be used for humans or animals). Suitable carriers and diluents include isotonic saline solutions, for example phosphate-buffered saline.

【００９２】 本発明の組成物は、直接的な注射により投与され得る。組成物は、腸管外、筋
肉内、皮下、経口、又は経皮投与のために製剤化され得る。より最近、ペプチド
を全身投与するための他の方法が設計されたが、これには胆汁酸塩又はフシジン
酸、又は他の界面活性剤のような浸透剤を使用する経粘膜及び経皮投与が含まれ
る。さらに、腸溶外皮又は被包化の製剤で適切に製剤化すれば、経口投与もまた
可能であり得る。上記化合物はまた、軟膏、ペースト、ゲル等の形態で、局所及
び／又は局在化して投与され得る。The compositions of the present invention can be administered by direct injection. The composition can be formulated for parenteral, intramuscular, subcutaneous, oral, or transdermal administration. More recently, other methods for systemic administration of peptides have been designed, including transmucosal and transdermal administration using penetrants such as bile salts or fusidic acid, or other surfactants. included. In addition, if properly formulated in enteric coated or encapsulated formulations, oral administration may also be possible. The compounds can also be administered topically and / or locally, in the form of ointments, pastes, gels and the like.

【００９３】 典型的には、各化合物は、０．０１〜３０ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは０．１
〜１０ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは０．１〜１ｍｇ／体重ｋｇの用量で投与
され得る。Typically, each compound is present in an amount of 0.01-30 mg / kg of body weight, preferably 0.1
It may be administered at a dose of from 10 to 10 mg / kg, more preferably from 0.1 to 1 mg / kg of body weight.

【００９４】 専門医は特定の患者及び病態にとって最適の投与経路及び投与量を容易に決定
し得るだろうから、記載の投与経路及び投与量は１つのガイドとしてのみ意図さ
れている。[0094] The described routes of administration and dosages are intended only as a guide, since a specialist may easily determine the optimum route of administration and dosage for a particular patient and condition.

【００９５】 本発明を以下の非限定的な実施例を参照にして、以下詳しく説明する。The present invention is described in more detail below with reference to the following non-limiting examples.

【００９６】[0096]

【実施例】【Example】

材料と方法 ペプチドと他の試薬 ペプチドはすべて固相法により、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｆａ
ｃｉｌｉｔｙ（カルガリー大学医学部、カルガリー、アルバータ、カナダ）で合
成した。このペプチドの性質及び純度をＨＰＬＣ分析、質量スペクトル分析、及
び定量アミノ酸分析により評価した。ペプチドを２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、
ｐＨ７．４において調製し、定量アミノ酸分析により標準化して、ペプチドの濃
度及び純度を確かめた。ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター、ＳＡＵ ９６ Ｉ、
ｔａｑポリメラーゼ、デオキシ核三リン酸塩（ｄＮＴＰ）、ＭｇＣｌ及び１０ｘ
ＰＣＲ反応緩衝液は、プロメガ（サウサンプトン、ＵＫ）より購入した。オリゴ
ヌクレオチドはすべてＯｓｗｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（サウサンプトン
、ＵＫ）で合成し；ＦＣＳ、ＤＭＥＭ、非酵素的細胞解離液、ペニシリン、スト
レプトマイシン、アンホテリシン、ピルビン酸ナトリウム、及びＰＢＳ（カルシ
ウムとマグネシウムを含まない）はＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（ゲイサースブルグ、Ｍ
Ｄ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）からのものであり；ブタ膵臓ＩＸ型トリプシン、スルフィン
ピラゾン、及びカルシウムイオノホア（Ａ２３１８７）は、シグマ（セントルイ
ス、ＭＯ）からで、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）及びＧｅｎｅｔｉｃｉｎはＩｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ（オランダ）からのものであった。Materials and Methods Peptides and other reagents All peptides were obtained by solid phase method using Peptide Synthesis Fa.
synthesized at the University of Calgary School of Medicine, Calgary, Alberta, Canada. The properties and purity of this peptide were evaluated by HPLC analysis, mass spectrum analysis, and quantitative amino acid analysis. Peptide in 25 mM HEPES buffer,
Prepared at pH 7.4 and normalized by quantitative amino acid analysis to confirm peptide concentration and purity. pGEM-T-Easy vector, SAU 96 I,
taq polymerase, deoxynuclear triphosphate (dNTP), MgCl and 10x
PCR reaction buffer was purchased from Promega (Southampton, UK). All oligonucleotides were synthesized at Oswel Laboratories (Southampton, UK); FCS, DMEM, non-enzymatic cell lysate, penicillin, streptomycin, amphotericin, sodium pyruvate, and PBS (without calcium and magnesium) were Gibco BRL ( Gaithersburg, M
D, U. S. A. Porcine pancreatic type IX trypsin, sulfinpyrazone, and calcium ionophore (A23187) are from Sigma (St. Louis, MO); pcDNA3.1 (+) and Geneticin are from Invitro.
trogen (Netherlands).

【００９７】 ＰＡＲ−２のクローニングとＰＡＲ−２の多型性 結腸癌の患者から手術時に切除したヒト結腸組織をＲＮＡの供給源として使用
した。簡潔に言うと、採取したばかりの結腸組織をホモジェナイズした後に、Ｔ
ｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ、ペーズリー、スコットランド、ＵＫ）及びクロロ
ホルムを加えた。ＲＮＡを一晩イソプロパノールにおいて−２０℃で沈澱させた
。このＲＮＡペレットを４℃で遠心分離して回収し、８０％エタノールで洗浄し
、風乾し、ＤＥＰＣ処理水に懸濁し、２６０ｎｍで分光光度法により定量した。
全細胞ＲＮＡの１マイクログラムを、ポリｄ（Ｔ）₁₅をプライマーとして使用し
て、４２℃で１時間、ＡＭＶ逆転写酵素により逆転写（ＲＴ）した。（１Ｕ−セ
ンス５’−ＣＣＡＧＧＡＧＧＡＴＧＣＧＧＡＧＣ−３’）の始めとＰＡＲ−２リ
ーディングフレームの終わり（１Ｄ−アンチセンス５’−ＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧ
ＡＡＡＡＣＴＣＡＡＴＡ−３’）にある配列に対して特定のオリゴヌクレオチド
を使用して、ｃＤＮＡを増幅させた。予測サイズ（〜１２００ｂｐ）のＰＣＲ産
物を、連結キット（プロメガ、サウサンプトン、ＵＫ）を使用して、ｐＧＥＭ−
Ｔ Ｅａｓｙベクターへクローン化した。次いで、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎｃ
ｅ ＤＮＡポリメラーゼ配列決定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ、バックス、ＵＫ）を利用する、ジデオキシヌクレオチド配列決定法
（３２）を使用して、この産物の両鎖について配列を決定した。ヒトＰＡＲ−２
をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１へサブクローン化し、ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ケンブリッジ、ＵＫ）を使用して増幅し、Ｑ
ｉａｇｅｎ最大調製（maxiprep）キット（Ｑｉａｇｅｎ社、ハーフォードシア、
ＵＫ）を使用して精製した。この産物を配列決定し、リーディングフレームの正
確な配向性を確かめた。Cloning of PAR-2 and PAR-2 Polymorphism Human colon tissue excised at the time of surgery from a patient with colon cancer was used as a source of RNA. Briefly, after homogenizing freshly collected colon tissue, T
Rizol reagent (Gibco, Paisley, Scotland, UK) and chloroform were added. RNA was precipitated overnight at -20 ° C in isopropanol. The RNA pellet was collected by centrifugation at 4 ° C., washed with 80% ethanol, air-dried, suspended in DEPC-treated water, and quantified spectrophotometrically at 260 nm.
One microgram of total cellular RNA was reverse transcribed (RT) with AMV reverse transcriptase at 42 ° C. for 1 hour using poly d (T) ₁₅ as a primer. (1U-sense 5'-CCAGGAGGATGCCGGAGC-3 ') and end of PAR-2 reading frame (1D-antisense 5'-GAGGACCCTGG
AAAACTCAATA-3 ') was used to amplify the cDNA using specific oligonucleotides. PCR products of the expected size (（1200 bp) were ligated using the ligation kit (Promega, Southampton, UK) to pGEM-
Cloned into T Easy vector. Next, ThermoSequenc
e DNA polymerase sequencing kit (Amersham Life Sci)
encodes, Bax, UK), and sequenced on both strands of this product using dideoxynucleotide sequencing (32). Human PAR-2
Is subcloned into pcDNA3.1 and pBluesc
Amplify using Rip (Stratagene, Cambridge, UK)
iagen maxiprep kit (Qiagen, Herfordshire,
(UK). This product was sequenced to confirm the correct orientation of the reading frame.

【００９８】 ＰＡＲ２の野生型ｃＤＮＡ配列（５）のコピーを得るために、ＱｕｉｋＣｈａ
ｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ケンブリッジ、ＵＫ）を使用する部位特
異的突然変異誘発を、製造業者の使用説明書に則って実施した。次いで、Ｃ７１
９からＴ７１９へのヌクレオチド変化を確かめるためにこのクローンの配列を決
定した。Ｐｈｅ２４０残基がＰＡＲ−２活性化の全般的な機序にとって重要であ
るのか、又はヒトＰＡＲ−２の機能に干渉する特異的な突然変異に他ならないの
かを確定するために、我々は、ラットＰＡＲ−２クローン（８）に対してＴ７１
９をＣ７１９へ突然変異させる部位特異的突然変異誘発を実施した。次いで、こ
のクローンの配列を決定し、この突然変異の存在を確かめた。To obtain a copy of the wild-type cDNA sequence of PAR2 (5),
Site-directed mutagenesis using the nge kit (Stratagene, Cambridge, UK) was performed according to the manufacturer's instructions. Then, C71
The clone was sequenced to confirm the nucleotide change from 9 to T719. To determine whether the Phe240 residue is important for the overall mechanism of PAR-2 activation or a specific mutation that interferes with the function of human PAR-2, we used rat T71 against PAR-2 clone (8)
Site-directed mutagenesis to mutate 9 to C719 was performed. The clone was then sequenced to confirm the presence of the mutation.

【００９９】 制限フラグメントの長さ多型性分析（ＲＦＬＰ） 正常な白色人種の人間１２５名の血液から標準技術（３３）により、ゲノムＤ
ＮＡを抽出した。細胞外ループＩＩにあるヌクレオチド６９９−７１８に対応す
る特定のＰＡＲ−２プライマー（Ｔ２Ｄ−センス５’−ＧＣＴＣＴＴＧＧＴＧＧ
ＧＡＧＡＣＡＧＧＴ−３’）と細胞外ループＩＩＩにあるヌクレオチド９２６−
９４９に対応するそれ（Ｔ４Ｕ−アンチセンス５’−ＧＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＡ
ＧＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＡ−３’）を使用して、ゲノムＤＮＡサンプルから２５
０ｂｐのＰＣＲ産物を産生した。ＳＡＵ９６Ｉ部位をＴ２Ｄ−センスプライマー
の中へ設計し、Ｇの代わりに７１６（Ｔ）を置換することによって達成した（上
記のプライマーＴ２Ｄを参照のこと、Ｇ（７１６）は下線を施されている）。対
照のＳａｕ９６Ｉ制限部位はＰＣＲ産物の３’末端から１００ｂｐのところに存
在していた。ＰＣＲ反応は、５０μｌの反応量にＤＮＡ ３００ｎｇ、各プライ
マー １５０ｎｇ、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ及びＴａｑポ
リメラーゼ １Ｕを有するＧｅｎｅ Ａｍｐ ２４００ＰＣＲシステムにおいて
、９４℃、５分で開始し、９４℃、３０秒の変性を３５サイクル、５８℃、３０
秒でアニーリング、７２℃、３０秒で伸張、７２℃、５分で最終伸張して、実施
した。生成した２５０ｂｐのＰＣＲ産物を、反応あたりＳａｕ９６Ｉ ６Ｕを使
用して、３７℃で一晩消化した。この生成物をアクリルアミドゲル上で泳動し、
エチジウムブロミドに５分間染色し、紫外光の下での発光により観察した。１５
０ｂｐ及び１００ｂｐのバンドの存在が、多型対立遺伝子の不在を示すのに対し
、１５０ｂｐバンドの不在で１３０ｂｐ及び１００ｂｐのバンドが存在している
ことは、両方の多型対立遺伝子の存在を示した。Restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP) Genomic DNA from blood of 125 normal Caucasians by standard techniques (33)
NA was extracted. Specific PAR-2 primers corresponding to nucleotides 699-718 in extracellular loop II (T2D-sense 5'-GCCTTGTGTGGG
GAGACA G GT-3 ') and nucleotide 926 in extracellular loop III.
949 (T4U-antisense 5'-GGCTCTTAATCA
GAAAATAATGCA-3 ′) from genomic DNA samples using 25
A 0 bp PCR product was produced. This was achieved by designing the SAU96I site into the T2D-sense primer and substituting 716 (T) for G (see primer T2D above, G (716) is underlined). . A control Sau96I restriction site was located 100 bp from the 3 'end of the PCR product. The PCR reaction was started in a Gene Amp 2400 PCR system with 300 ng of DNA, 150 ng of each primer, 200 μM dNTPs, 2.5 mM MgCl and 1 U of Taq polymerase in a 50 μl reaction volume at 94 ° C. for 5 minutes and 94 ° C. for 30 seconds. 35 cycles of denaturation, 58 ° C, 30
Annealing in seconds, stretching at 72 ° C. for 30 seconds, and final stretching at 72 ° C. for 5 minutes were performed. The resulting 250 bp PCR product was digested overnight at 37 ° C. using 6 U Sau96I per reaction. Run this product on an acrylamide gel,
The cells were stained with ethidium bromide for 5 minutes and observed by emission under ultraviolet light. Fifteen
The presence of the 0 bp and 100 bp bands indicates the absence of the polymorphic allele, while the absence of the 150 bp band and the presence of the 130 bp and 100 bp bands indicated the presence of both polymorphic alleles. .

【０１００】 ゲノムＤＮＡの配列決定 ＲＦＬＰ分析から得られたデータを確かめるために、細胞外ループＩのヌクレ
オチド３８９−４０９（ＳＩＤ−センス５’−ＴＧＡＡＧＡＴＴＧＣＣＴＡＴＣ
ＡＣＡＴＡＣ−３’）と細胞外ループＩＩＩのヌクレオチド９２６−９４９（Ｔ
４Ｕ−アンチセンス５’−ＧＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＡ
−３’）に対応するオリゴヌクレオチドを使用して、ヒトゲノムＤＮＡを増幅し
た。アニーリング温度を５４℃に設定したことの他は、ＲＦＰＬ分析に記載のよ
うにしてＰＣＲ反応を実施した。多型ヌクレオチド部位、７１９を含有する５６
０ｂｐの生成物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した後に、
ＡＢＩ ３７７（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−２１Ｍ１３ ＦＳ及びＭ１３ＲＥＶ ＦＳ Ｒｅａｄ
ｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ）において、蛍光をベースとした自動サイクル
配列決定を実施した。Sequencing of genomic DNA To confirm the data obtained from the RFLP analysis, nucleotides 389-409 (SID-sense 5'-TGAAGATTGCCCTATC of extracellular loop I)
ACATAC-3 ') and nucleotides 926-949 of extracellular loop III (T
4U-antisense 5'-GGCCTTAATCAGAAAATAATGCA
Human genomic DNA was amplified using the oligonucleotide corresponding to -3 ′). The PCR reaction was performed as described for RFPL analysis, except that the annealing temperature was set at 54 ° C. 56 containing the polymorphic nucleotide site, 719
After purifying the 0 bp product using a PCR purification kit (Qiagen),
ABI 377 (ABI PRISM ™ Dye Primer Cycle)
Sequencing-21M13 FS and M13REV FS Read
y Reaction Kits), fluorescence-based automated cycle sequencing was performed.

【０１０１】 細胞培養とトランスフェクション：キルステン（Ｋｉｒｓｔｅｎ）肉腫により
形質転換されたラット腎臓上皮細胞（ＫＮＲＫ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕ
ｅ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ベテスダ、ＭＤ、Ｕ．
Ｓ．Ａ）を新鮮な培地（ＤＭＥＭ，５％（体積／体積）ＦＣＳ、１００μＭ ピ
ルビン酸ナトリウム、ペニシリン １００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン １０
０μｇ／ｍｌ、及びアンホテリシンＢ ２５０ｎｇ／ｍｌ）において６０ｍｍペ
トリ皿へ播き、空気９５％、ＣＯ₂ ５％、３７℃で一晩インキュベートした。
集密度６０％で、製造業者（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）のプロトコールにより、ペト
リ皿の各構築体８μｇにつき、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法を使用して、トラ
ンスフェクションを実施した。トランスフェクトされた細胞を、培地を含有する
ジェネチシン（０．６ｍｇ／ｍｌ）においてサブクローン化し、トリプシンとＰ
ＡＲ−２選択ペプチドｔｃ−ＮＨ₂に反応してカルシウムシグナルを発する能力
により、最初にクローンを選択した。各受容体についての永久細胞系を得るため
に、Ｂ５抗ＰＡＲ−２ポリクローナルウサギ抗体を使用する蛍光標示式細胞分取
により、高レベルのＰＡＲ−２を発現する細胞を単離した（（３４）に記載され
ている）。すべての細胞系を、空気９５％、ＣＯ₂ ５％、３７℃で、トリプシ
ンを使用せず、ジェネチシン含有培地において常法により増殖させた。このラッ
トＰＡＲ−２細胞系については他にも記載されている（８，３１）。ＦＡＣＳ分
析により評価されるような適合した発現を有するクローンを、機能上の試験用に
選択した。Cell culture and transfection: Rat kidney epithelial cells (KRK, American Tissue) transformed by Kirsten's sarcoma
e Type Culture Collection, Bethesda, MD, U.S.A.
S. A) A fresh medium (DMEM, 5% (vol / vol) FCS, 100 μM sodium pyruvate, penicillin 100 U / ml, streptomycin 10
(0 μg / ml, and amphotericin B 250 ng / ml) in 60 mm Petri dishes and incubated overnight at 37 ° C., 95% air, 5% CO ₂ .
Transfection was performed using the Lipofectamine method on 8 μg of each construct in a Petri dish according to the manufacturer's (Gibco / BRL) protocol at 60% confluency. Transfected cells were subcloned in Geneticin containing medium (0.6 mg / ml) and trypsin and P
The ability to emit calcium signaling in response to AR-2 selective peptide tc-NH _2, select the first clone. Cells expressing high levels of PAR-2 were isolated by fluorescence activated cell sorting using a B5 anti-PAR-2 polyclonal rabbit antibody to obtain permanent cell lines for each receptor ((34) It is described in). All cell lines, 95% air, CO ₂ 5%, at 37 ° C., without using trypsin, were grown in a conventional manner in geneticin-containing medium. This rat PAR-2 cell line has been described elsewhere (8, 31). Clones with matched expression as assessed by FACS analysis were selected for functional testing.

【０１０２】 カルシウムシグナル伝達アッセイ カルシウムシグナル伝達アッセイは既報（３１）のように実施した。簡潔に言
うと、細胞を８０ｃｍ²フラスコ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）に播き、９０％の集密
度が達成されるまでインキュベートした。（カルシウム及びマグネシウムを含ま
ない）ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を非酵素的細胞解離液５ｍｌとともにイン
キュベートし、２００ｇで１０分間遠心分離した。この細胞ペレットをＤＭＥＭ
、１０％ ＦＣＳ及び０．２５ｍＭ スルフィピラゾンの１ｍｌに再懸濁した。
この細胞懸濁液へ、２．５ｍｇ／ｍｌのＦｌｕｏ−３アセトキシメチルエステル
（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、ＯＲ）１０μｌを加えて
から、室温で３５分間穏やかに振盪した。次いで、カルシウムアッセイ緩衝液（
１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＣａＣｌ₂，１０ｍＭ
グルコース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，２．５ｍＭ スルフィンピラゾン、ｐＨ７
．４）において細胞を洗浄し、過剰な色素を除去し、カルシウムアッセイ緩衝液
１．５ｍｌに再懸濁した。パーキン−エルマー蛍光光度計（ＬＭ１５０？）にお
いて、励起波長４８０ｎｍで、５３０ｎｍで発光を記録して、蛍光測定を実施し
た。細胞懸濁液（３ｘ１０⁵細胞／ｍｌの２ｍｌ）を４ｍｌキュベットの中でミ
ニ磁気棒を用いて撹拌し、２４℃に維持した。濃度効果曲線を確定するために、
試験作動薬の添加により産生されるシグナルを、カルシウムイオノホア ２μＭ
により産生される蛍光ピーク高の比率として測定した。以前の実験で、用量反応
曲線の最高値がカルシウムイオノホア ２μＭで得られることが確立していたた
めである。プロテアーゼ阻害剤（アマスタチン）の添加は試験ペプチドの反応に
少しも影響しなかったので、プロテアーゼ阻害剤は実験法から省略した。Calcium Signaling Assay Calcium signaling assays were performed as previously described (31). Briefly, cells were seeded in 80 cm ² flasks (Gibco / BRL) and incubated until 90% confluence was achieved. After washing twice with PBS (without calcium and magnesium), the cells were incubated with 5 ml of non-enzymatic cell lysate and centrifuged at 200 g for 10 minutes. This cell pellet is transferred to DMEM
Resuspended in 1 ml of 10% FCS and 0.25 mM sulfipyrazone.
To this cell suspension, 10 μl of 2.5 mg / ml Fluo-3 acetoxymethyl ester (Molecular Probes, Eugene, OR) was added, followed by gentle shaking at room temperature for 35 minutes. Then the calcium assay buffer (
150 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.5 mM CaCl ₂ , 10 mM
Glucose, 20 mM HEPES, 2.5 mM sulfinpyrazone, pH 7
. The cells were washed in 4) to remove excess dye and resuspended in 1.5 ml of calcium assay buffer. Emission was recorded at 530 nm with an excitation wavelength of 480 nm on a Perkin-Elmer fluorimeter (LM150?) And fluorescence measurements were performed. The cell suspension (2 ml of 3 × 10 ⁵ cells / ml) was stirred with a mini-magnetic bar in a 4 ml cuvette and kept at 24 ° C. To determine the concentration effect curve,
The signal produced by the addition of the test agonist is determined by the calcium ionophore 2 μM
Measured as the ratio of the fluorescence peak heights produced by Earlier experiments had established that the highest dose-response curve was obtained with 2 μM of the calcium ionophore. Since the addition of the protease inhibitor (Amasteratin) did not affect the reaction of the test peptide in any way, the protease inhibitor was omitted from the experimental procedure.

【０１０３】 結果 ヒトＰＡＲ−２受容体のクローニング 公知の配列（４）の５’及び３’末端を基にして合成された特定のプライマー
を使用して、ヒト結腸組織から誘導したｃＤＮＡより、ＰＡＲ−２のリーディン
グフレームをクローン化した。得られた配列の公知の配列との比較から、ヌクレ
オチド７１９位におけるチミンからシトシンへの変化が示された。まず、我々は
、この突然変異がＰＣＲの人工産物であるのか、又は正常な集団の内部に存在す
るのかを確定しようとした。従って、我々は白色人種の集団から正常な選択個体
の配列を決定し、ＤＮＡ配列決定により突然変異の存在を確かめた（図１）。野
生型ＰＡＲ−２についてホモ接合である人が７１９位の単一チミン残基により同
定された（図１ａ）のに対し、多型性ＰＡＲ−２についてホモ接合である人は７
１９位のシトシンの存在により同定された（図１ｂ）。最後に、ヘテロ接合性の
人は、７１９位にチミンとシトシンが両方存在していることにより同定された（
図１ｃ）。この突然変異は、フェニルアラニン２４０（Ｆ２４０）からセリン２
４０（Ｓ２４０）へのアミノ酸変化を誘発すると予測される。この突然変異部位
は、ＥＣＬ−２において、第五の膜貫通ドメインから約６個目のアミノ酸である
（図２）。Results Cloning of Human PAR-2 Receptor Using specific primers synthesized based on the 5 ′ and 3 ′ ends of the known sequence (4), PAR was determined from cDNA derived from human colon tissue. The -2 reading frame was cloned. Comparison of the resulting sequence with a known sequence indicated a change from thymine to cytosine at nucleotide position 719. First, we sought to determine whether this mutation was a PCR artifact or was present within a normal population. Therefore, we sequenced normal selected individuals from a Caucasian population and confirmed the presence of the mutation by DNA sequencing (FIG. 1). Those homozygous for wild-type PAR-2 were identified by a single thymine residue at position 719 (FIG. 1a), whereas those homozygous for polymorphic PAR-2 were 7
Identified by the presence of cytosine at position 19 (FIG. 1b). Finally, heterozygous individuals were identified by the presence of both thymine and cytosine at position 719 (
FIG. 1c). This mutation involves the conversion of phenylalanine 240 (F240) to serine 2
It is predicted to induce an amino acid change to 40 (S240). This mutation site is about six amino acids from the fifth transmembrane domain in ECL-2 (FIG. 2).

【０１０４】 ＰＡＲ−２多型性のジェノタイピング ＲＦＰＬ分析と自動化ＤＮＡ配列決定を利用して、白色人種の集団における多
型性の頻度を決定した。ホモ接合Ｓ／Ｓ遺伝子型の頻度は相対的に珍しく、試験
した個体のコホートから２％未満であることが見出された（表１）。このデータ
は、ハーディ・ワインベルグ式（Ｆ²＋２ＦＳ＋Ｓ²＝１；Ｆ²＝ホモ接合体Ｆ／
Ｆの頻度、Ｓ²＝ホモ接合体Ｓ／Ｓの頻度、及び２ＦＳ＝ヘテロ接合体Ｆ／Ｓの
頻度）に一致することが見出され、ＰＡＲ−２遺伝子の２つの対立遺伝子がメン
デル式に分離することを示した。Genotyping of PAR-2 Polymorphisms RFPL analysis and automated DNA sequencing were used to determine the frequency of polymorphisms in Caucasian populations. The frequency of homozygous S / S genotypes was found to be relatively rare and less than 2% from a cohort of individuals tested (Table 1). This data is based on the Hardy-Weinberg equation (F ² + 2FS + S ² = 1; F ² = homozygote F /
F frequency, S ² = frequency of homozygous S / S, and 2FS = frequency of heterozygous F / S), and the two alleles of the PAR-2 gene are expressed in a Mendelian fashion. It was shown to separate.

【０１０５】 表１．正常な白色人種集団におけるＰＡＲ−２対立遺伝子の分布。制限フラグ
メントの長さ多型性分析とゲノムＤＮＡの直接配列決定（方法を参照）を使用し
て、ＰＡＲ−２対立遺伝子［ヌクレオチド７１９Ｔ（２４０Ｆ）及び／又はヌク
レオチド７１９Ｃ（２４０Ｓ）］について正常人１２５名の遺伝子型を決定した
。対立遺伝子と遺伝子頻度を以下に示す。Table 1. Distribution of PAR-2 allele in normal Caucasian population. Using restriction fragment length polymorphism analysis and direct sequencing of genomic DNA (see Methods), the PAR-2 allele [nucleotide 719T (240F) and / or nucleotide 719C (240S)] was analyzed by The genotype of the name was determined. Alleles and gene frequencies are shown below.

【０１０６】[0106]

【表２】 [Table 2]

【０１０７】 ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓは、ＰＡＲ−２作動薬のトリプシン、ＳＬＩＧＫＶ−ＮＨ₂及
びＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂に対しては感受性が低いが、ｔｃ−ＮＨ₂に対しては感受
性が高い。PAR ₂ F240S is less sensitive to the PAR-2 agonist trypsin, SLIGKV-NH ₂ and SLIGRL-NH ₂ , but more sensitive to tc-NH ₂ .

【０１０８】 Ｆ２４０からＳ２４０への突然変異がその作動薬に対する受容体の反応性を変
化させるかどうかを確かめるために、適合する受容体の発現を有する永久のＫＮ
ＲＫ細胞系として野生型とＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓの両方を発現させ、細胞表面の蛍
光（ＦＡＣＳ）分析により評価した。次いで、この細胞系を使用して、細胞内カ
ルシウムの上昇によりモニターされる、受容体の作動薬活性化反応を試験した。To determine whether the F240 to S240 mutation alters the receptor's responsiveness to its agonist, a permanent KN with compatible receptor expression
Both wild-type and PAR ₂ F240S were expressed as RK cell lines and evaluated by cell surface fluorescence (FACS) analysis. This cell line was then used to test for agonist activation of the receptor, monitored by elevated intracellular calcium.

【０１０９】 トリプシンといくつかのＰＡＲ−２選択的活性化ペプチドの濃度効果曲線を図
３に示す。野生型受容体では、トリプシンはＰＡＲ−２ＡＰであるＳＬＩＧＫＶ
−ＮＨ₂、ｔｃ−ＮＨ₂及びＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂より３桁分強力であり、その相
対的な効力順位は、トリプシン＞＞＞＞ｔｃ−ＮＨ₂≧ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂＞Ｓ
ＬＩＧＫＶ−ＮＨ₂であった。この作動薬効力の順位は、既報（３１）に一致し
ている。トリプシンは１ｎＭで検出し得るカルシウム上昇を促進し、１００ｎＭ
でほぼ最大応答に達した。ＰＡＲ−２ＡＰであるｔｃ−ＮＨ₂に対する有効反応
は１〜１００μＭ、ＳＬＩＧＫＶ−ＮＨ₂は５〜２００μＭ、ＳＬＩＧＲＬ−Ｎ
Ｈ₂は２〜１００μＭで有効であった（それぞれ、図３ａ、ｂ、ｃ及びｄ）。Ｐ
ＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体では、このＰＡＲ−２作動薬すべての効力が有意に異な
っていた（図３）。トリプシンの強さは約１／４であり（図３及び表２）、５〜
５００ｎＭでＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体を活性化し、濃度効果曲線を右方へシフ
トさせた（図３ａ）。元の鎖付きリガンドペプチドであるＳＬＩＧＫＶ−ＮＨ₂
も、この系では強さが１／２以下であることが見出され、１０〜５００μＭでＰ
ＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体を活性化した（図３ｂ及び表２）。しかしながら、いず
れの系でも、ＳＬＩＧＫＶ−ＮＨ₂に対する最大反応は、他のＰＡＲ−２作動薬
で得られる最大反応より低いようであった（カルシウムイオノホアとの比較で約
６０％に対し、約５０％）。ｔｃ−ＮＨ₂ペプチドは、４倍以上強力で（図４ｃ
及び表２）、０．２〜２０μＭでＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体を活性化した（野生
型受容体では１〜５０μＭ）。ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂の効力はＳＬＩＧＫＶ−Ｎ
Ｈ₂のそれと同程度（約２．５倍）だけ減少し、５〜２００μＭでＰＡＲ₂Ｆ２４
０Ｓ受容体を活性化した（図３及び表２）。ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ系における上記
作動薬の効力の相対順位は野生型受容体についてのものから量的に異なり、トリ
プシン＞＞ｔｃ−ＮＨ₂＞＞ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂＞ＳＬＩＧＫＶ−ＮＨ₂であっ
た。The concentration effect curves for trypsin and some PAR-2 selective activating peptides are shown in FIG. In the wild-type receptor, trypsin is PAR-2AP SLIGKV
-NH ₂ , tc-NH ₂ and SLIGRL-NH ₂ are three orders of magnitude more potent and their relative potency is trypsin >> tc-NH ₂ ≧ SLIGRL-NH ₂ > S
It was LIGKV-NH _2. This ranking of the agonist efficacy is consistent with the previous report (31). Trypsin promotes a detectable increase in calcium at 1 nM and 100 nM
Almost reached the maximum response. The effective response to tc-NH ₂ which is PAR-2AP is ₁ to 100 μM, SLIGKV-NH ₂ is 5 to 200 μM, SLIGRL-N
H ₂ was effective in 2～100MyuM (respectively, Fig 3a, b, c and d). P
The AR ₂ F240S receptor, the PAR-2 agonist all efficacy were significantly different (Figure 3). The strength of trypsin is about 1/4 (FIG. 3 and Table 2),
PAR ₂ F240S receptor was activated at 500 nM, shifting the concentration effect curve to the right (FIG. 3a). Is the original chain with ligand peptide SLIGKV-NH ₂
Was also found to be less than 1/2 in strength in this system, with P
Activated the AR ₂ F240S receptor (FIG. 3b and Table 2). However, in any system, to a maximal response, about 60% in comparison seemed less than the maximum response obtained with other PAR-2 agonists and (calcium ionophore for SLIGKV-NH _2, about 50 %). tc-NH ₂ peptide is a potent than 4-fold (Fig. 4c
And Table 2), PAR ₂ F240S receptor was activated at 0.2-20 μM (1-50 μM for wild-type receptor). The efficacy of SLIGRL-NH ₂ is SLIGKV-N
Reduced by comparable to that of H ₂ (about 2.5 times), PAR ₂ F 24 in 5~200μM
The OS receptor was activated (FIG. 3 and Table 2). The relative order of potency of the agonist in the PAR ₂ F240S system differs quantitatively from that for the wild-type receptor was trypsin _{>> tc-NH 2 >> SLIGRL-} NH 2> SLIGKV-NH 2.

【０１１０】 ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓは選択的ＰＡＲ−１作動薬のＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂に対する感受
性がより高いが、ＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂とＣｉｔ−ＮＨ₂への感受性においては違い
を示さない。PAR ₂ F240S is more sensitive to the selective PAR-1 agonist TFLLR-NH ₂ , but shows no difference in sensitivity to SFLLR-NH ₂ and Cit-NH ₂ .

【０１１１】 ＰＡＲ−１ＡＰのＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂がＰＡＲ−２を活性化し得ること（９，
１０）を前提として、我々は、ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体がこのヒトＰＡＲ−１
誘導化ペプチドに対する反応性における違い、さらに２種の他の選択的ＰＡＲ−
１ＡＰであるＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂及びＣｉｔ−ＮＨ₂に対する可能な違いを示すか
どうかを研究することにした。野生型受容体では、効力の相対順位は、既報（３
５）のように、ＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂＞Ｃｉｔ−ＮＨ₂＞ＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂であっ
た。ＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂、Ｃｉｔ−ＮＨ₂及びＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂は、受容体活性
化を、それぞれ５〜２００μＭ、５０〜４００μＭ及び１００〜８００μＭで促
進することが見出された（図４ａ及び表２）。ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体では、
ＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂及びＣｉｔ−ＮＨ₂は、野生型受容体で見出されたように、５
〜１００μＭ及び５０〜４００μＭで反応を誘発することが見出された。驚くべ
きことに、ＰＡＲ−１選択的作動薬として開発されたＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂は、Ｐ
ＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体では７倍以上強力であることが見出され、１０〜４００
μＭで反応を引き起こした（図４ｂ及び表２）。ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体にお
けるこれらＰＡＲ−１ＡＰの相対効力の順位は、ＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂＞ＴＦＬＬ
Ｒ−ＮＨ₂＞Ｃｉｔ−ＮＨ₂であり、上記の野生型のそれとは量的に異なっていた
。ＰＡＲ−２選択的ペプチドのｔｃ−ＮＨ₂（５０μＭ）の前添加によりＰＡＲ₂ Ｆ２４０Ｓを脱感作した後で、我々は、ＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂（５０μＭ）が無効
になることを観察した（データ示さず）。さらに、トロンビン ５Ｕ／ｍｌ（Ｐ
ＡＲ−１活性化について最大であることが示された濃度（３５））は、野生型と
ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓの両方の細胞系でカルシウム反応を誘発しなかった（データ
示さず）。The ability of SFLLR-NH ₂ of PAR-1AP to activate PAR-2 (9,
10), we assume that the PAR ₂ F240S receptor is a human PAR-1
Differences in reactivity to derivatized peptides, plus two other selective PAR-
Whether show the difference possible for TFLLR-NH ₂ and Cit-NH ₂ is 1AP decided to study. For wild-type receptors, the relative ranking of potency was reported previously (3
As in 5) was _{SFLLR-NH 2> Cit-NH} 2> TFLLR-NH 2. SFLLR-NH ₂ , Cit-NH ₂ and TFLLR-NH ₂ were found to enhance receptor activation at 5-200 μM, 50-400 μM and 100-800 μM, respectively (FIG. 4 a and Table 2). . At the PAR ₂ F240S receptor,
SFLLR-NH ₂ and Cit-NH _2, as found in the wild-type receptor, 5
It was found to elicit a response at １００100 μM and 50-400 μM. Surprisingly, TFLLR-NH _2, which was developed as a PAR-1 selective agonist, has P
The AR ₂ F240S receptors found to be a potent than 7-fold, 10 to 400
Reactions were elicited at μM (FIG. 4b and Table 2). The order of relative potency of these PAR-1APs at the PAR ₂ F240S receptor is: SFLLR-NH ₂ > TFLL
A _{R-NH 2> Cit-NH} 2, from that of the wild-type differed quantitatively. After desensitize PAR ₂ F240S by addition before the tc-NH ₂ of the PAR-2 selective peptide (50 [mu] M), we, TFLLR-NH ₂ (50μM) was observed to be disabled (data shown Zu). Furthermore, thrombin 5U / ml (P
AR-1 activation for that is the maximum indicated concentration (35)) did not induce the calcium response in wild-type and PAR ₂ F240S both cell lines (data not shown).

【０１１２】[0112]

【表３】 [Table 3]

【０１１３】 表２．ＰＡＲ−２Ｓ及びＰＡＲ−２Ｆ受容体系間の作動薬効力の比（多型／野
生型）。ＰＡＲ−２Ｓ受容体系における各作動薬の活性を、Ｒ_EC,PAR2＝ＥＣ_{PAR 2F240S} ／ＥＣ_wild-typeの式により、ＰＡＲ−２Ｆ受容体における各作動薬の活
性に比較して表した。ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体における反応を引き起こす各作
動薬の濃度（ＥＣ_PAR2F240S）を、野性型受容体における（Ａ２３１８７２比較
した）同一のカルシウムシグナルを引き起こすのに必要とされる作動薬の濃度（
ＥＣ_wild-type）で割った。数値は、図３及び４に示される用量反応曲線の平行
領域に沿った４点から得られる平均値である。１．０より大きい数値は、野生型
受容体よりもＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体において感受性が低いことを示す。 ラットＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓは、作動薬感受性において、ヒトＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓと
同一の変化を示す。Table 2. Agonist potency ratio between PAR-2S and PAR-2F receptor systems (polymorphism / wild type). The activity of each agonist in the PAR-2S receptor system was expressed in comparison with the activity of each agonist in the PAR-2F receptor by the formula of R _{EC, PAR2} = EC _{PAR 2F240S} / EC _wild-type . The concentration of each agonist that elicits a response at the PAR ₂ F240S receptor (EC _PAR2F240S ) was determined by comparing the concentration of agonist required to cause the same calcium signal (compared to _A231872 ) at the wild-type receptor (EC).
EC _wild-type ). Values are averages from four points along the parallel region of the dose response curves shown in FIGS. A value greater than 1.0 indicates that the PAR ₂ F240S receptor is less sensitive than the wild-type receptor. Rat PAR ₂ F240S shows the same change in agonist sensitivity as human PAR ₂ F240S.

【０１１４】 Ｆ２４０残基がＰＡＲ−２作動薬の特異性にとって重要であるかどうかを決定
するために、我々はラットＰＡＲ−２に部位特異的突然変異誘発を実施し、Ｆ２
４０をＳ２４０へ突然変異させた。ラットＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体に対するＰ
ＡＲ活性化作動薬の相対効力を表ＩＩに示す。ラットＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体
では、トリプシンはラットＰＡＲ−２受容体系よりも約２倍強力ではなく、１〜
２０ｎＭの間で反応を引き起こした（データ示さず）。さらに、ＳＬＩＧＲＬ−
ＮＨ₂は、この系において約３倍強力ではないことが見出された。ｔｃ−ＮＨ₂は
、ＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂と同じように、ラットＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体において３
倍強力であった。 ＴＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂及びｔｃ−ＹＰＧＫＦ−ＮＨ₂は、ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓを選
択的に活性化し得るが、野生型ＰＡＲ−２受容体は活性化し得ない。To determine whether the F240 residue is important for the specificity of PAR-2 agonists, we performed site-directed mutagenesis on rat PAR-2 and
40 was mutated to S240. P for rat PAR ₂ F240S receptor
The relative potency of AR activating agonists is shown in Table II. At the rat PAR ₂ F240S receptor, trypsin is about 2-fold less potent than the rat PAR-2 receptor system,
A reaction was elicited between 20 nM (data not shown). Furthermore, SLIGRL-
NH _2, it is not about 3-fold more potent in this system were found. tc-NH _2, like TFLLR-NH _2, in rats PAR ₂ F240S receptor 3
Was twice as powerful. TLIGRL-NH ₂ and tc-YPGKF-NH ₂ is capable of selectively activating the PAR ₂ F240S, wild-type PAR-2 receptor can not activate.

【０１１５】 我々は、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂のセリンにスレオニンを置換することでこのペ
プチドの効力が高まるかどうかを決定することに興味があった。さらに、我々は
、ＰＡＲ−４ペプチドのＧＹＰＧＫＦ−ＮＨ₂と、ＰＡＲ−４の活性化配列を基
に設計された、活性化ペプチドのｔｃ−ＹＰＧＫＦ−ＮＨ₂を試験した。この結
果を図５に示す。ヒトとラットのＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ細胞系の両方において、Ｔ
ＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂（５０μＭ）は有意な活性の増加を示した。ヒト野生型受容
体では、ＴＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂（５０μＭ）はほとんど効果がなかったが、ＴＬ
ＩＧＲＬ−ＮＨ₂（５０μＭ）は、ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓでは、ＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂
（５０μＭ）のそれと同等の反応を引き起こした。ラットの野生型受容体では、
ＴＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂（５０μＭ）はわずかな反応を刺激したが、この反応はラ
ットＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ細胞系で観察されるものの半分であった。ＰＡＲ−４ペ
プチドのＧＹＰＧＫＦ−ＮＨ₂（４００μＭ）は、ラット及びヒトの野生型及び
ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ系において効果がなかった（データ示さず）。ｔｃ−ＹＰＧ
ＫＦ−ＮＨ₂ペプチドは、ラット又はヒトの野生型細胞系のいずれでも効果がな
かった（図５ｄ）が、ヒトＰＡＲ₂Ｆ２４０ＳではＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂に等しい明
確な反応を刺激し、ラットＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ系ではＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂反応の５
０％を刺激した。ｔｃ−ＮＨ₂（５０μＭ）の添加によりＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓを脱
感作した後では、我々は、ＴＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂（５０μＭ）もｔｃ−ＹＧＰＧ
ＫＦ−ＮＨ₂（１００μＭ）も無効であった（データ示さず）。さらに、ＴＬＩ
ＧＲＬ−ＮＨ₂（１００μＭ）の添加により、準最高用量（２０μＭ）のＳＬＩ
ＧＲＬ−ＮＨ₂による応答は除去された（データ示さず）。We were interested in determining whether substituting threonine for serine in SLIGRL-NH ₂ would increase the potency of this peptide. Furthermore, we have tested the GYPGKF-NH ₂ of PAR-4 peptide, was designed based on the activation sequence of PAR-4, the tc-YPGKF-NH ₂ of the activation peptide. The result is shown in FIG. In both the human and rat PAR ₂ F240S cell lines, T
LIGHT-NH ₂ (50 μM) showed a significant increase in activity. At the human wild-type receptor, TLIGL-NH ₂ (50 μM) had little effect;
IGRL-NH ₂ (50μM) is the PAR ₂ F240S, SFLLR-NH ₂
(50 μM). In the rat wild-type receptor,
TLIGL-NH ₂ (50 μM) stimulated a slight response, which was half that observed in the rat PAR ₂ F240S cell line. PAR-4 peptide GYPGKF-NH ₂ (400μM) had no effect in rats and wild-type and PAR ₂ F240S system of a human (data not shown). tc-YPG
KF-NH ₂ peptide, either the effect of the wild-type cell line of the rat or human did not (Figure 5d) is to stimulate a clear reaction equal to human PAR ₂ SFLLR-NH ₂ In F240S, rats PAR ₂ F240S In the system, 5 of the SFLLR-NH ₂ reaction
0% was stimulated. After desensitize PAR ₂ F240S by addition of tc-NH ₂ (50μM), we, TLIGRL-NH ₂ (50μM) also tc-YGPG
KF-NH ₂ (100 μM) was also ineffective (data not shown). In addition, TLI
Addition of GRL-NH ₂ (100 μM) resulted in sub-highest dose (20 μM) of SLI
Response by GRL-NH ₂ was removed (data not shown).

【０１１６】 考察 今回の研究の主たる知見は、トリプシン及び他のＰＡＲ作動薬に応答して異な
る活性化を示す、ヒトＰＡＲ−２の遺伝子多型性の発見である。ＰＡＲ₂Ｆ２４
０Ｓ受容体は、トリプシン、ＳＫＬＩＧＶ−ＮＨ₂及びＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂に対
しては低下した感受性を示したが、ｔｃ−ＮＨ₂と、驚くべきことに、ＰＡＲ−
１選択的作動薬のＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂に対する感受性において増加を示した。さ
らに、ペプチドのＴＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂がＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓの選択的作動薬とし
て使用し得ることも見出した。さらに、同一の突然変異をラットＰＡＲ−２にお
いて構築すると上記の知見を反映し、Ｆ２４０が作動薬の特異性を調節すること
に直接参画する可能性があることが示唆された。我々は、トリプシン及び他の作
動薬の効力における変化がＰＡＲ−２拮抗薬の開発にとって重要な意味を有する
と結論し、この多型性が疾患において意味があり得ることの可能性を提起する。Discussion The main finding of this study is the discovery of a genetic polymorphism in human PAR-2 that shows differential activation in response to trypsin and other PAR agonists. PAR ₂ F24
0S receptors, trypsin, but for SKLIGV-NH ₂ and SLIGRL-NH ₂ exhibited reduced sensitivity, the tc-NH _2, surprisingly, PAR-
1 showed an increase in sensitivity to TFLLR-NH ₂ selective agonist. Furthermore, also found that TLIGRL-NH ₂ peptide can be used as selective agonists of PAR ₂ F240S. Furthermore, constructing the same mutation in rat PAR-2 reflects the above findings, suggesting that F240 may directly participate in regulating agonist specificity. We conclude that changes in the potency of trypsin and other agonists have important implications for the development of PAR-2 antagonists, raising the possibility that this polymorphism could be meaningful in disease.

【０１１７】 直接のＤＮＡ配列決定とＲＦＬＰ分析により、正常なヒト集団におけるこの多
型性の存在が確かめられた。スクリーニングした１２５名の患者のうち、Ｓ２４
０対立遺伝子についてホモ接合であることが見出せたのは２名だけであり、この
遺伝子型を発現する個体がある病態に関連し得る可能性を示した。ハーディ・ワ
インベルグ式を使用してデータを分析すると、この対立遺伝子が普通に分布し、
メンデル形式で分離することが示された。残念ながら、患者の守秘性により、彼
らの表現型又は疾患とのあり得る関連を調査するために、関心対象になり得る患
者と接触することはできなかった。それでも、この多型性と数多くの病態との連
関の可能性を検証するための別の研究が進行中である。[0117] Direct DNA sequencing and RFLP analysis confirmed the presence of this polymorphism in the normal human population. Of the 125 patients screened, S24
Only two individuals were found to be homozygous for the 0 allele, indicating that individuals expressing this genotype may be associated with a condition. Analysis of the data using the Hardy-Weinberg equation shows that this allele is normally distributed,
Separation was shown in Mendelian form. Unfortunately, due to the confidentiality of the patients, it was not possible to contact potential patients of interest in order to investigate their possible association with phenotype or disease. Nevertheless, other studies are underway to test the possible link between this polymorphism and numerous disease states.

【０１１８】 この多型性がＰＡＲ−２シグナル伝達に対して直接影響するかどうかを研究す
るために、我々は、野生型とＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓのいずれかの受容体を発現する
トランスフェクトされた２種の永久細胞型を産生した。（ＦＡＣＳ分析により評
価される）比較可能な受容体密度を発現する細胞系を慎重に選択し、リガンド活
性における様々な違いが受容体機能の変化によるものであって、受容体密度の違
いによるのではないことを保証した。受容体活性化の指標としてカルシウム上昇
を使用し、我々は、トリプシンがＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体からの応答を誘発す
るのに強さが約１／４低下することを観察した。この鎖付きリガンドに対する受
容体感受性の明らかな低下に一致したのは、ＳＫＬＩＧＶ−ＮＨ₂とＳＬＩＧＲ
Ｌ−ＮＨ₂もより強力でなかった（それぞれ、約２．５倍と２．８倍の低下）と
いう知見である。トリプシンによる効力の損失が起きたのは、ファニルアラニン
からセリンへの突然変異により誘発されたコンホメーション変化の結果として、
露出した鎖付きリガンドが受容体の本体上にさほど効率よく合体し得なくなるた
めかもしれない。他の可能性としては、鎖付きリガンドは、受容体上には効率よ
く合体し得るのだが、野生型受容体において誘発されるものと比較し得るコンホ
メーション変化、即ち活性化を誘発することができないのかもしれない。他の研
究では、ラットＰＡＲ−２のＥＣＬ−２にあるＰ²³¹Ｅ²³²Ｅ²³³をＰ²³¹Ｒ²³²Ｒ^{2 33} へ突然変異させると、ＰＡＲ−２ＡＰに対する受容体活性の劇的な損失を生じ
るが、トリプシンの効力はこの多重アミノ酸置換によってさほど影響を受けなか
った（３１）。トリプシンがＳＫＶ−ＮＨ₂及びＳＲＬ−ＮＨ₂に比較して最も大
きく効力を失ったという知見は、Ｐｈｅ２４０が鎖付きリガンドと合成ペプチド
の両方に対する作動薬特異性において重要な役割を担う可能性があることを示唆
する。To study whether this polymorphism directly affects PAR-2 signaling, we used transfected 2 expressing both wild-type and PAR ₂ F240S receptors. Species of permanent cell types were produced. Careful selection of cell lines expressing comparable receptor densities (as assessed by FACS analysis), various differences in ligand activity are due to changes in receptor function, and differences in receptor densities Not guaranteed. Using the calcium rise as an indicator of receptor activation, it trypsin was observed that the intensity is reduced to about 1/4 to elicit a response from the PAR ₂ F240S receptor. The it was consistent with a clear reduction in receptor sensitivity to the chain with the ligand, SKLIGV-NH ₂ and SLIGR
L-NH ₂ was not more potent (respectively, 2.5 times and 2.8-fold reduction) of a finding that. The loss of potency due to trypsin occurred as a result of the conformational change induced by the mutation of fanylalanine to serine.
This may be because the exposed chained ligand may not coalesce so efficiently on the body of the receptor. Another possibility is that the chained ligand, although able to coalesce efficiently on the receptor, induces a conformational change, i.e. activation, comparable to that induced in the wild-type receptor. May not be able to. In other studies, when the P ²³¹ E ²³² E ²³³ in ECL-2 rat PAR-2 is mutated to P ²³¹ R ²³² R ^{2 33,} but results in a dramatic loss of receptor activity against PAR-2AP The potency of trypsin was not significantly affected by this multiple amino acid substitution (31). Finding that trypsin has lost the greatest efficacy compared to SKV-NH ₂ and SRL-NH ₂ is likely to play an important role in the agonist specificity for both Phe240 of synthetic peptide with a chain with ligand Suggest that.

【０１１９】 トリプシン、ＳＫＬＩＧＶ−ＮＨ₂、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂についての我々の観
察と、突然変異をＰＡＲに構築した他の報告（２７，３１）とは著しく対照的に
、ｔｃ−ＮＨ₂は、ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体を活性化することに４倍強力であっ
た。ｔｃ−ＮＨ₂化合物と他のＰＡＲ−２ＡＰ（天然の鎖付きリガンドを含む）
との主たる構造上の違いは、大きな芳香族のｔｒａｎｓ−シンナモイル基が付い
ていることにある。Ｆ２４０からＳ２４０への突然変異によりベンゼン基が失わ
れることがｔｒａｎｓ−シンナモイル基がより効率的に合体することを可能にし
、それによってより大きな受容体活性化を誘発するのかもしれない。ＰＡＲにつ
いての結合アッセイは問題があることが判明しているので、観察された作動薬効
力の違いがリガンドのアフィニティーか又は効力における違いによるのかを評価
することは難しい。しかしながら、すべてのペプチドについての最大反応は両方
の細胞系で同等だったので、試験した作動薬の本来的な活性は影響されていない
と論じることは妥当であろう。それでも、大きな芳香族のＦ２４０を小さな非芳
香族のＳ２４０に置換することは、ＰＡＲ−２作動薬に対する受容体の感受性を
著しく変化させると思われる。In sharp contrast to our observations on trypsin, SKLIGV-NH ₂ , SLIGRL-NH ₂ , and other reports (27,31) that constructed mutations on PAR, tc-NH ₂ was found to be PAR It was four times more potent in activating ₂ F240S receptor. tc-NH ₂ compound with other PAR-2AP (including naturally occurring chain with ligands)
The main structural difference from is that it has a large aromatic trans-cinnamoyl group. The loss of the benzene group due to the F240 to S240 mutation may allow the trans-cinnamoyl group to coalesce more efficiently, thereby triggering greater receptor activation. Since binding assays for PAR have proven problematic, it is difficult to assess whether differences in agonist potency observed are due to differences in ligand affinity or potency. However, since the maximal response for all peptides was comparable in both cell lines, it would be reasonable to argue that the intrinsic activity of the tested agonist was not affected. Nevertheless, replacing large aromatic F240 with small non-aromatic S240 appears to significantly alter the sensitivity of the receptor to PAR-2 agonists.

【０１２０】 我々は自らの研究を広げて、ＰＡＲ−１ＡＰの効力における可能なシフトに注
目した。ＰＡＲ−１鎖付きリガンド配列であるＳＦＬＬＲがＰＡＲ−２を活性化
し得るのに対し、ＰＡＲ−２ペプチド配列のＳＬＩＧＫＶ−ＮＨ₂がＰＡＲ−１
に対して効果のないことは十分確立されている（９，１０）。最も興味深いのは
、ＴＦ−ＮＨ₂が７倍以上の効力の増加を示し、相対効力の順位をＴＦＬＬＲ−
ＮＨ₂とＣｉｔ−ＮＨ₂との間にシフトさせたという知見である。しかしながら、
我々は、ＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂とＣｉｔ−ＮＨ₂が野生型とＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓの両
細胞系において等しい効力を有することに気づいた。これらの結果は、ＳＦＬＬ
Ｒ−ＮＨ₂とＣｉｔ−ＮＨ₂が他のＰＡＲ−２ＡＰとは異なるやり方でＰＡＲ−２
のＥＣＬ−２と相互作用する可能性を示唆するものであろう。実際、１５−残基
配列がＰＡＲ−１と同一であるラットＰＡＲ−２のＥＣＬ−２を突然変異させる
と、ＳＦＬＬＥＲ−ＮＨ₂が減少した効力を示すことがすでに報告されている（
３１）。また、上記の試験から、ＳＦＬＬＥＲ−ＮＨ₂が他のＰＡＲ−２ＡＰと
は異なったやり方で相互作用し得ることも結論された。ＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂とＣ
ｉｔ−ＮＨ₂について得られた濃度効果曲線も、効力におけるシフトは観察され
なかったので、受容体の密度は両細胞系について比較可能なレベルにあったとい
うＦＡＣＳの結果を支持する。We have extended our work to look at possible shifts in the efficacy of PAR-1AP. PAR-1 chain with a ligand sequence SFLLR Whereas capable of activating _PAR-2, SLIGKV-NH 2 of the PAR-2 peptide sequence PAR-1
It is well established that it has no effect on (9,10). The most interesting, TF-NH ₂ showed an increase in potency of more than 7 times, the rank of the relative potency TFLLR-
This is a finding that the shift was made between NH ₂ and Cit-NH ₂ . However,
It, SFLLR-NH ₂ and Cit-NH ₂ was noticed to have equal efficacy in both cell lines the wild-type and PAR ₂ F240S. These results indicate that SFLL
R-NH ₂ and PAR-2 in a manner different Cit-NH ₂ is the other PAR-2AP
May interact with ECL-2. In fact, 15 when residue sequence to mutate ECL-2 rat PAR-2 is identical to PAR-1, to show efficacy SFLLER-NH ₂ is reduced has been reported previously (
31). Further, from the above tests, it was concluded that SFLLER-NH ₂ are able to interact in different ways with other PAR-2AP. SFLLR-NH ₂ and C
Concentration effect curves obtained for it-NH ₂ also, since the shift in potency was observed, the density of the receptor supports the results of FACS there was a comparable level for both cell lines.

【０１２１】 ＴＦＬＬＥＲ−ＮＨ₂における明らかなシフトがＳＦＬＬＥＲ−ＮＨ₂ではみら
れなかったことの理由は大変興味深い。ＴＦＬＬＥＲ−ＮＨ₂ペプチドについて
得られたデータに照らし、ＳＦＬＬＥＲ−ＮＨ₂とＴＦＬＬＥＲ−ＮＨ₂との配列
における類似性に注目すれば、ＳＦＬＬＥＲ−ＮＨ₂がＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体
を活性化することにより強力であると予測しただろう。ＳＬＩＧＫＶ−ＮＨ₂と
ＳＦＬＬＥＲ−ＮＨ₂の位置１でのセリン残基の置換はＰＡＲ−２の上首尾な活
性化について十分許容されないことがすでに報告されている（９，１０）。実際
、我々は、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂におけるセリンをスレオニンへ置換することに
よって、我々のＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体に選択的であるペプチド（ＴＬＩＧＲ
Ｌ−ＮＨ₂）を産生することを見出した。これは、ＴＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂が野生型
ＰＡＲ−２に対しては減少した効力を有し、ＰＡＲ−１には全く効果がないから
である（１０）。ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓは、活性化ペプチドの位置１における保守
的な変化を許容し、それによりこの受容体が野生型受容体とは異なるやり方でペ
プチド作動薬と相互作用し得ることの確信的な証拠を提供し得ると思われる。こ
のことを銘記し、ＴＦＬＬＥＲ−ＮＨ₂がＰＡＲ−２の存在下においてＰＡＲ−
１を選択的に活性化するのに有用なツールとなったとすれば（３５）、ヒトの組
織又は細胞を使用するバイオアッセイにおいてこのペプチドについて派生したデ
ータはいくらか注意しながら分析すべきであると考える。[0121] The reason for that apparent shift was not observed in SFLLER-NH ₂ in TFLLER-NH ₂ is very interesting. Light of the data obtained for TFLLER-NH ₂ peptide, when focusing on the similarity in sequence between SFLLER-NH ₂ and TFLLER-NH _2, strong by SFLLER-NH ₂ activates PAR ₂ F240S receptor You would have expected. Substitution of a serine residue at position 1 of SLIGKV-NH ₂ and SFLLER-NH ₂ is not be fully acceptable for successful activation of PAR-2 it has been reported previously (9,10). In fact, we, by replacing the serine at SLIGRL-NH ₂ threonine, our PAR ₂ F240S is selective for the receptor peptide (TLIGR
L-NH ₂₎ was found to produce. This is because TLIGRL-NH ₂ has a reduced potency for wild-type PAR-2, no effect on the PAR-1 (10). PAR ₂ F240S allows conservative changes at position 1 of the activating peptide, thereby providing credible evidence that this receptor may interact with peptide agonists in a different manner than the wild-type receptor. It seems possible to provide. Noted the this, TFLLER-NH ₂ is in the presence of a PAR-2 PAR-
Given that this would be a useful tool to selectively activate 1 (35), the data derived for this peptide in bioassays using human tissues or cells should be analyzed with some care. Think.

【０１２２】 ヒトＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体について得られた結果を試験した後で、我々は
、Ｆ２４０が他の種におけるＰＡＲ−２受容体の作動薬特異性を決定する上で重
要な残基であるのか、また特異性に関するその影響がヒトＰＡＲ−２に限られて
いるのかを考察した。従って、我々はラットＰＡＲ−２に同一のＦ２４０からＳ
２４０への突然変異を構築した。ラット及びマウスのＰＡＲ−２のタンパク質配
列は、特にＥＣＬ−２の内部でヒトＰＡＲ−２と高度の相同性を示す（３６，３
７）。ラットＰＡＲ−２では、Ｆ２４０残基が保存され、残基２４１にはヒトＰ
ＡＲ−２におけるアスパラギンに代わってセリンが存在している。我々は、ラッ
トＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓにおいて、作動薬効力の相対シフトがヒトＰＡＲ−２Ｓで
観察されるものを反映することを見出した。トリプシンとＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂
はより強力ではなく、ヒトの系において見出されたように、ｔｃ−ＮＨ₂はより
強力であった。さらに、我々はまた、ＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂がラットＰＡＲ₂Ｆ２４
０Ｓ細胞系において高められた効力を示すことを認め、ヒトＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ
受容体についての我々の初期観察を確かめた。上記の結果は、Ｆ２４０残基が作
動薬特異性において重要な残基として役立つことを強く含意するだけでなく、こ
の受容体が特定の作動薬を同定するのに利用する根底の機序に関わり得ることも
示唆する。After examining the results obtained for the human PAR ₂ F240S receptor, we find that F240 is a key residue in determining the agonist specificity of the PAR-2 receptor in other species And whether its effect on specificity is limited to human PAR-2. Therefore, we have the same F240 to S for rat PAR-2.
A mutation to 240 was constructed. The protein sequence of rat and mouse PAR-2 shows a high degree of homology with human PAR-2, especially within ECL-2 (36,3).
7). In rat PAR-2, the F240 residue is conserved and residue 241 contains human P
Serine replaces asparagine in AR-2. We have found that in rat PAR ₂ F240S, the relative shift in agonist potency reflects that observed with human PAR-2S. Trypsin and SLIGRL-NH ₂
Not more potent, as found in the human system, tc-NH ₂ was more potent. In addition, it also, TFLLR-NH ₂ is rat PAR ₂ F24
The human PAR ₂ F240S was found to exhibit enhanced potency in the OS cell line.
We confirmed our initial observations on the receptor. The above results not only strongly imply that the F240 residue serves as an important residue in agonist specificity, but also implicate the underlying mechanism that this receptor utilizes to identify a particular agonist. It also suggests gaining.

【０１２３】 ＰＡＲ−４ペプチドのＧＹＰＧＫＦ−ＮＨ₂はラットとヒトの細胞系に対して
無効であったが、我々は、ｔｃ−ＹＧＰＫＦ−ＮＨ₂がヒトとラットのいずれの
ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓも活性化し得ることを見出して驚いた。ｔｃ−ＹＧＰＫＦ−
ＮＨ₂は８００μＭの用量まで野生型ＰＡＲ−２に対して影響を及ぼさなかった
。このことは、ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体に対しては１００μＭの濃度で明らか
な反応を示したことと全く対照的であった。この受容体活性化における野生型と
多型性受容体との間のはっきりした対照性から、この２種の受容体が、少なくと
も作動薬を認識する方法において機能的に非常に異なっていることが確かめられ
る。さらに、それ自身のペプチド作動薬とはほとんど似ていないペプチドにより
活性化され得るＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体の顕著な能力は、ＰＡＲ−２拮抗薬の
開発に種々の困難が生じ得ることを示唆する。さらに、in vivoで見出される他
の低ペプチドがこの受容体を活性化し得て、不適切な炎症反応をもたらすという
可能性も生じる。While the PAR-4 peptide GYPGKF-NH ₂ was ineffective on rat and human cell lines, we found that tc-YGPKF-NH ₂ activated both human and rat PAR ₂ F240S. I was surprised to find it. tc-YGPKF-
NH ₂ had no effect on the wild type PAR-2 at doses up to 800 [mu] M. This was in sharp contrast to the PAR ₂ F240S receptor which had a clear response at a concentration of 100 μM. The clear contrast between wild-type and polymorphic receptors in this receptor activation suggests that the two receptors are functionally very different, at least in the way they recognize agonists. You can be sure. Moreover, remarkable ability of PAR ₂ F240S receptors that can be activated by peptide little resemblance with itself peptide agonists suggests that various difficulties can arise in the development of PAR-2 antagonists. Furthermore, the possibility arises that other low peptides found in vivo can activate this receptor, leading to an inappropriate inflammatory response.

【０１２４】 蓄積している証拠は、ＰＡＲ−２が炎症において重要な役割を担うことを示唆
する（１９，２１，２２，３８）。ＰＡＲ−２は胃腸管において高レベルで発現
され、イオン輸送、腸の運動性、及びプロスタグランジン放出を調節することが
示されている（３９−４２）。興味深いことに、Porphyromonas gingivalis か
ら誘導される細菌性プロテアーゼのジンジパイン（Ｇｉｎｇｉｐａｉｎ）−Ｒは
ＰＡＲ−２を活性化し（４３）、この活性化が病原体侵入の最初の炎症シグナル
の１つを提供する可能性がある。我々の今回の結果に基づけば、ＰＡＲ−２Ｓ多
型性の存在は、ある種の炎症及び腸の障害を予兆するか、又はそれに貢献する可
能性がある。さらに、ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体は、肺において有害な効果を有
する可能性がある。これは、ＰＡＲ−２が、強力な気管支拡張剤のプロスタグラ
ンジンＥ₂の放出を刺激することによって肺において保護的な役割を有すると報
告されているからである（４４）。このように、ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓは喘息のよ
うな気道の疾患に関わる可能性がある。とは言っても、ＰＡＲ−２の病態生理学
的な役割については今のところほとんど知られていないので、理解が進むかどう
かは選択的ＰＡＲ−２拮抗薬の開発によるだろう。最近、ＰＡＲ−２活性化の強
力な炎症効果により、この受容体の疾患における役割とＰＡＲ−２拮抗薬の新規
抗炎症剤としての可能性に異議が唱えられている（４５，４６）。今日まで、Ｐ
ＡＲ−１について真の拮抗薬として開発されたものはただ１つであり（４７）、
ＰＡＲ−２についてはまだ１つも得られていない。このＰＡＲ−２多型性につい
て見出されたＰＡＲ作動薬の異なる活性化を考察すると、ＰＡＲ−２拮抗薬を設
計するときに、我々はこの受容体のことを考慮する必要があるのかどうか疑わし
く思う。この多型性が疾患に関連しているかどうかは今後決定しなければならな
いが、作動薬の効力における有意な変化と対立遺伝子の比較的稀な特性を考慮す
ると、この多型性が疾患に貢献する因子であり得ることはありそうである。[0124] Accumulating evidence suggests that PAR-2 plays an important role in inflammation (19, 21, 22, 38). PAR-2 is expressed at high levels in the gastrointestinal tract and has been shown to regulate ion transport, intestinal motility, and prostaglandin release (39-42). Interestingly, the bacterial protease Gingipain-R derived from Porphyromonas gingivalis activates PAR-2 (43), which may provide one of the first inflammatory signals of pathogen invasion. There is. Based on our present results, the presence of the PAR-2S polymorphism may predict or contribute to certain inflammation and intestinal disorders. In addition, PAR ₂ F240S receptors may have deleterious effects in the lung. This is because the PAR-2 has been reported to have a protective role in lung by stimulating potent bronchodilators release of prostaglandin E ₂ (44). Thus, PAR ₂ F240S may be involved in airway diseases such as asthma. Nevertheless, little is known about the pathophysiological role of PAR-2 at this time, so understanding will likely depend on the development of selective PAR-2 antagonists. Recently, the potent inflammatory effects of PAR-2 activation have challenged the role of this receptor in disease and the potential of PAR-2 antagonists as novel anti-inflammatory agents (45,46). Until today, P
Only one has been developed as a true antagonist for AR-1 (47),
Nothing has yet been obtained for PAR-2. Considering the different activations of PAR agonists found for this PAR-2 polymorphism, it is questionable whether we need to consider this receptor when designing PAR-2 antagonists. think. Whether this polymorphism is associated with the disease must be determined in the future, but given the significant changes in agonist potency and the relatively rare nature of the allele, this polymorphism contributes to the disease It is likely that this could be a factor to do.

【０１２５】 結論を言うと、我々はアミノ酸２４０にＦ（野生型）又はＳを見出し得る、ヒ
トＰＡＲ−２受容体のの多型変異を見出した。この変異は、トリプシンと他の作
動薬による受容体活性化に有意な違いをもたらす。このような変異は、疾患感受
性、表現型又はＰＡＲ−２をターゲットにする治療薬への反応における個体間の
差異の遺伝的基礎となる可能性がある。In conclusion, we found a polymorphic mutation in the human PAR-2 receptor that could find F (wild type) or S at amino acid 240. This mutation makes a significant difference in receptor activation by trypsin and other agonists. Such mutations may be the genetic basis for differences between individuals in disease susceptibility, phenotype, or response to therapeutics that target PAR-2.

【０１２６】 参考文献 1. Dery, O., C.U. Corvera, M. Steinhoff, and N.W. Bunnett. 1998. プロテ
イナーゼ活性化受容体：セリンプロテアーゼによるシグナル伝達の新規な機序.
Ani.J Physiol-Cell Physiol 43:C1429-C1452 2. Vu, T.K., D.T. Hung, V.I. Wheaton, and S.R. Coueffilin. 1991. 機能性
トロンビン受容体の分子クローニングは受容体活性化の新規なタンパク分解機序
を明らかにする. Cell 64:1057-1068. 3. Ishihara, H., A.J. Connolly, D. Zeng, M.L. Kahn, Y.W. Zheng, C. Timmo
ns, T. Tram, and S.R. Coughlin. 1997 プロテアーゼ活性化受容体−３はヒト
における第二のトロンビン受容体である. Nature 386:502-506. 4. Bohm, S.K., W. Kong, D. Bromme, S.P. Smeekens, D.C. Anderson, A. Conn
olly, M. Kahn, N.A. Nelken, S.R. Coughlin, D.G. Payan, and N.W Bunnett.
1996. ヒトプロテイナーゼ活性化受容体−２の分子クローニング、発現及び潜在
機能. Biochem J 314 (Pt 3): 1009-1016. 5. Nystedt, S., K. Emilsson, A.K. LARSSON, B. Strombeck, and J. Sundelin
. 1995. ヒトプロテイナーゼ活性化受容体−２をコードする遺伝子の分子クロー
ニング及び機能発現. Eur J Biochem 232:84-89. 6. Molino, M., E.S. Barnathan, R. Numerof, J. Clark, M. Dreyer, A. Cumas
hi, J.A. Hoxie, N. Schechter, M. Woolkalis, and L.F. Brass. 1997. マスト
細胞トリプターゼのトロンビン受容体及びＰＡＲ−２との相互作用. J Biol Che
m 272:4043-4049. 7. Xu, W.F., H. Andersen, T.E. Whitmore, S.R. Presnell, D.P. Yee, A. Chi
ng, T. Gilbert, E.W. Davie, and D.C. Foster. 1998. ヒトプロテアーゼ活性
化受容体−４のクローニング及び特徴づけ. Proc Natl Acad Sci USA 95:6642-6
646. 8. Al-Ani, B., M. Saifeddine, A. Kawabata, B. Renaux, S. Mokashi, and M.
D. Hollenbere. 1999.プロテイナーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ（２））：ＰＡ
Ｒ（１）−及びＰＡＲ（２）から派生したペプチドリガンドによるＰＡＲ（２）
の活性化に関連するリガンド結合アッセイの開発. J Pharmacol Exp Ther 290:7
53-760. 9. Blackhart, B.D., K. Emilsson, D. Nguyen, W. Teng, A.J. Martelli, S. N
ystedt, J. Sundelin, and R.M. Scarborough. 1996. プロテアーゼ活性化受容
体ファミリー内におけるリガンドの交叉反応性. J Biol Chem 271:16466-16471.
10. Hollenberg, M.D., M. Salfeddine, B. Al-Ani, and A. Kawabata. 1997.
プロテイナーゼ活性化受容体：活性についての構造上の必要条件、受容体の交叉
反応性、及び受容体活性化ペプチドの受容体選択性. Can J Physiol Pharmacol
75:832-841. 11. Bertog, M., B. Letz, W. Kong, M. Steinhoff, M.A. Higgins, A. Bielfel
d-Ackermann, E. Fromter, N.W. Bunnett, and C. Korbmacher. 1999. 基底側部
のプロテイナーゼ活性化受容体（ＰＡＲ−２）は、Ｍ−１マウスの腎皮質内集合
管細胞において塩化物の分泌を誘発する. J Physiol (Lond) 521 Pt 1:3-17. 12. Molino, M., M.J. Woolkalis, J. ReaveyCantwell, D. Pratico, P. Andrad
eGordon, E.S. Barnathan, and L.F. Brass. 1997. 内皮細胞トロンビン受容体
とＰＡＲ−２：単一の細胞環境内に局在化した２種のプロテアーゼ活性化受容体
. J Biol Chem 272:11133-11141. 13. Mirza, H., V. Yatsula, and W.F. Bahou. 1996. プロテイナーゼ活性化受
容体−２（ＰＡＲ−２）は、ヒト血管内皮細胞における***誘発反応に介在する
：トロンビン受容体への機能的カップリングについての分子的特徴づけ及び証拠
. J Clin Invest 97:1705-1714. 14. Al-Ani, B., M. Saifeddine, and M.D. Hollenberg. 1995. ラットの血管及
び胃の平滑筋における、プロテイナーゼ活性化受容体−２−活性化ポリペプチド
、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂に対する機能性受容体の検出. Can J Physiol Pharmacol
73:12033-1207. 15. Steinhoff, M., C.U. Corvera, M.S. Thoma, W. Kong, B.E. McAlpine, G.H
. Caughey, J.C. Ansel, and N.W. Bunnett. 1999. ヒト皮膚におけるプロテイ
ナーゼ活性化受容体−２：組織分布とマスト細胞トリプターゼによる角化細胞の
活性化. Exp Dermatol 8:282-2294. 16. Wakita, H., F. Furukawa, and M. Takigawa. 1997. トロンビンとトリプシ
ンは、培養された正常ヒト角化細胞において顆粒球マクロファージコロニー刺激
因子及びインターロイキン−６の遺伝子発現を誘発する. Proc Assoc Am Physic
ians 109:190-207. 17. Howells, G.L., M.G. Macey, C. Chinni, L. Hou, M.T. Fox, P. Harriott,
and S.R. Stone. 1997. プロテイナーゼ活性化受容体−２：ヒト好中球による
発現. J Cell Sci 110 ( Pt 7):881-887. 18. Mari, B., S. Guerin, D.F. Far, LP. Breitmayer, N. Belhacene, L.F. Pe
yron, B. Rossi, and P. Auberizer. 1996. 様々なプロテアーゼ活性化受容体と
の相互作用を介した、ヒトＴ細胞系におけるトロンビン及びトリプシン誘導性の
Ｃａ²⁺可動化. FASEB J 10:309-316. 19. Nystedt, S., V. Ramakrishnan, and J. Sundelin. 1996. プロテイナーゼ
活性化受容体−２はヒト内皮細胞において炎症メディエーターにより誘発される
。トロンビン受容体との比較. J Biol Chem 271:14910-14915. 20. Veranolle, N. 1999. プロテイナーゼ活性化受容体−２を活性化するペプチ
ドは、in vivoにおいて白血球のローリング、接着及び管外遊出を誘発する. J I
mmunol 163:5064-5069. 21. Veranolle, N., M.D. Hollenberg, K.A. Sharkey, and J.L. Wallace. 1999
. ラット前足におけるプロテイナーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）活性化ペ
プチドに対する炎症反応の特徴づけ. Br J Pharmacol 1227:1083-1090. 22. Steinhoff, M., N. Vemnolle, S.H. Young, M. Tognetto, S. Amadesi, H.S
. Ennes, M. Trevisani, M.D. Hollenberg, J.L. Wallace, G.H. Caughey, S.E.
Mitchell, L.M. Williams, P. Geppetti, E.A. Maver, and N.W. Bunnett. 200
0. プロテイナーゼ活性化受容体−２の作動薬は神経性の機序により炎症を誘発
する. Nat Med 6:151-158. 23. Compton, S.L., J.A. Cairns, S.T. Holgate, and A.F. Walls. 1998. 内皮
細胞の増殖、サイトカインの放出、及び接着分子の発現を調節することにおける
マスト細胞トリプターゼの役割：トリプターゼは、ＩＬ−１β及びＩＬ−８のｍ
ＲＮＡの発現を誘発し、ヒト臍静脈内皮細胞からのＩＬ−８の選択的放出を刺激
する. J Immunol 161:1939-1946. 24. Cairns, L.A. and A.F. Walls. 1996. マスト細胞トリプターゼは上皮細胞
のマイトジェンである。ＩＬ−８の産生と細胞内接着分子−１の発現の促進. J
Immunol 156:275-283. 25. He, S. and. A.F. Walls. 1997. ヒトマスト細胞トリプターゼ：微小血管漏
出及びマスト細胞活性化の刺激. Eur J Pharmacol 328:89-97. 26. He, S., Q. Peng, and A.F. Walls. 1997. ヒトマスト細胞トリプターゼに
よる、好中球及び好酸球リッチな浸潤液のin vivoにおける強力な誘発：ヒスタ
ミンによる好酸球動員の選択的亢進. J Immunol 159:6216-6225. 27. Nanevicz, T., M. Ishii, L. Wane, M. Chen, J. Chen, C.W. Turck, F.E.
Cohen, and S.R. Coughlin. 1995. トロンビン受容体の作動薬特異性の機序。キ
メラ受容体と相補性突然変異は作動薬の認識部位を同定する. J Biol Chem 270:
2 1619-21625. 28. Chen, L., M. Ishii, L. Wang, K. Ishii, and S.R. Coughlin. 1994. トロ
ンビン受容体の活性化。分子内鎖付きリガンド結合仮説の確認と他の分子間リガ
ンド結合様式の発見. J Biol Chem 269:16041-16045. 29. Nanevicz, T., L. Wang, M. Chen, M. Ishii, and S.R. Coughlin. 1996.
トロンビン受容体を活性化する突然変異：細胞外作動薬認識ドメインの変化は構
成的なシグナル伝達を引き起こす. J Biol Chem 271:702-706. 30. Lerner, D.J., M. Chen, T. Tram, and S.R. Coughlin. 1996. プロテイナ
ーゼ活性化受容体−２及びトロンビン受容体による作動薬の認識：受容体機能に
対する細胞外ループ相互作用の重要性. J Biol Chem 271:13943-13947. 31. Al-Ani, B., M. Saifeddine, A. Kawabata, and M.D. Hollenberg. 1999.
プロテイナーゼ活性化受容体−２：リガンド介在性の活性化に対する細胞外ルー
プ−２の役割. Br J Pharmacol 128:1105-1113. 32. Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson. 1977. 鎖終止阻害剤を用いた
ＤＮＡの配列決定. Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467. 33. Jones, A.S. 1963 ). Nature 199:280-282. 34. Corvera, C.U., O. Dery, K. McConalogue, P. Gamp, M. Thoma, B. Al-Ani
, G.H. Caughey, M.D. Hollenberg, and N.W..Bunnett. 1999. トロンビンとマ
スト細胞トリプターゼは、プロテイナーゼ活性化受容体−１及び−２を介してモ
ルモット腸筋のニューロンを調節する. J Physiol (Lond) 517 (Pt 3):741-756.
35. Kawabata, A., M. Saifeddine, B. AI-Ani, L. Leblond, and M.D. Hollenb
erg. 1999. 培養細胞受容体脱感作アッセイを使用する、プロテイナーゼ活性化
受容体−１（ＰＡＲ−１）作動薬及び拮抗薬の評価：ＰＡＲ−１ターゲットリガ
ンドによるＰＡＲ−２の活性化. J Pharmacol Exp Ther 288:358-370. 36. Saifeddine, M., B. Al-Ani, C.H. Cheng, L. Wane, and M.D. Hollenberg,
1996. ラットプロテイナーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）：受容体誘導ペ
プチドのｃＤＮＡ配列と胃及び血管組織における活性. Br J Pharmacol 118:521
-530. 37. Nystedt, S., A.K. LARSSON, H. ABERG, and J. Sundelin. 1995. マウスプ
ロテイナーゼ活性化受容体−２のｃＤＮＡ及び遺伝子。分子クローニングと機能
の発現. J Biol Chem 270:5950-5955. 38. Brain, S.D. 2000.炎症における感覚神経の役割についての新たな考え方（
速報）. Nat Med 6:134-135. 39. D'Andrea, M.R., C.K. Derian, D. Leturcq, S.M. Baker, A. Brunmark, P.
Ling, A.L. Darrow, R.J. Santulli, L.F. Brass, and P. Andrade-Gordon. 19
98. 正常ヒト組織におけるプロテアーゼ活性化受容体−２免疫反応性の特徴づけ
. J Histochem Cytochem 46:157-164. 40. Kong, W., K. McConalogue, L.M. Khitin, M.D. Hollenberg, D.G. Payan,
S.K. Bohm, and N.W. Bunnett. 1997. 内腔のトリプシンはプロテーナーゼ活性
化受容体を介して小腸上皮細胞を調節し得る. Proc Natl Acad Sci USA 94:8884
-8889. 41. Corvera, C.U., O. Dery, K. McConaloeue, S.K. Bohm, L.M. Khitin, G.H.
Cauahey, D.G. Payan, and N.W. Bunnett. 1997. マスト細胞のトリプターゼは
プロテイナーゼ活性化受容体−２を介してラット結腸筋細胞を調節する. J Clin
Invest 100:1383-1393. 42. Nguyen, T.D., M.W. Moody, M. Steinhoff, C. Okolo, D.S. Koh, and N.W.
Bunnett. 1999. トリプシンはプロテイナーゼ活性化受容体−２を介して膵管上
皮細胞のイオンチャンネルを活性化する. J Clin Invest 103:261-269. 43. Lourbakos, A., C. Chinni, P. Thompson, J. Potempa, J. Travis, E.J. M
ackie, and R.N. Pike. 1998. Porphyromonas gingivalis 由来のジンジパイン
−Ｒによる、ヒト好中球におけるプロテイナーゼ活性化受容体−２の開裂及び活
性化. FEBS Lett 435:45-48. 44. Cocks, T.M., B. Fong, J.M. Chow, G.P. Anderson, A.G. Frauman, R.G. G
oldie, P.J. Henry, M.J. Carr, J.R. Hamilton, and J.D. Moffatt. 1999. プ
ロテアーゼ活性化受容体についての気道における保護的な役割. Nature 398:156
-160. 45. Vergnolle, N. 2000. 概説：プロテイナーゼ活性化受容体−胃腸の病態生理
の新規シグナル. Aliment Pharmacol Ther 14:257-266. 46. Berger, A. 2000. ＰＡＲ−２拮抗薬は、次世代の抗炎症薬たり得るか？ BM
J 320:334. 47. Andrade-Gordon, P., B.E. Maryanoff, C.K. Derian, H.C. Zhang, M.F. Ad
do, A.L. Darrow, A.J. Eckardt. W.J. Hoekstra, D.F. McComsey, D. Oksenber
g, E.E. Reynolds, R.J. Santulli, R.M. Scarborough, C.E. Smith, and K.B.
White. 1999. 鎖付きリガンド受容体のペプチド模擬拮抗薬の設計、合成及び生
物学的特徴づけ. Proc Natl Acad Sci USA 96:12257-12262.References 1. Dery, O., CU Corvera, M. Steinhoff, and NW Bunnett. 1998. Proteinase-activated receptor: a novel mechanism of signal transduction by serine proteases.
Ani.J Physiol-Cell Physiol 43: C1429-C1452 2. Vu, TK, DT Hung, VI Wheaton, and SR Coueffilin. 1991. Molecular cloning of functional thrombin receptor is a novel proteolytic mechanism of receptor activation Cell 64: 1057-1068. 3. Ishihara, H., AJ Connolly, D. Zeng, ML Kahn, YW Zheng, C. Timmo
ns, T. Tram, and SR Coughlin. 1997 Protease-activated receptor-3 is the second thrombin receptor in humans. Nature 386: 502-506. 4. Bohm, SK, W. Kong, D. Bromme , SP Smeekens, DC Anderson, A. Conn
olly, M. Kahn, NA Nelken, SR Coughlin, DG Payan, and NW Bunnett.
1996. Molecular cloning, expression and potential function of human proteinase-activated receptor-2. Biochem J 314 (Pt 3): 1009-1016. 5. Nystedt, S., K. Emilsson, AK LARSSON, B. Strombeck, and J. Sundelin
1995. Molecular cloning and functional expression of the gene encoding human proteinase-activated receptor-2. Eur J Biochem 232: 84-89. 6. Molino, M., ES Barnathan, R. Numerof, J. Clark, M. . Dreyer, A. Cumas
hi, JA Hoxie, N. Schechter, M. Woolkalis, and LF Brass. 1997. Interaction of mast cell tryptase with thrombin receptor and PAR-2. J Biol Che
m 272: 4043-4049. 7. Xu, WF, H. Andersen, TE Whitmore, SR Presnell, DP Yee, A. Chi
ng, T. Gilbert, EW Davie, and DC Foster. 1998. Cloning and characterization of human protease-activated receptor-4. Proc Natl Acad Sci USA 95: 6642-6.
646. 8. Al-Ani, B., M. Saifeddine, A. Kawabata, B. Renaux, S. Mokashi, and M.
D. Hollenbere. 1999. Proteinase-activated receptor-2 (PAR (2)): PA
PAR (2) with peptide ligand derived from R (1)-and PAR (2)
Of a Ligand Binding Assay Related to the Activation of ATP. J Pharmacol Exp Ther 290: 7
53-760. 9. Blackhart, BD, K. Emilsson, D. Nguyen, W. Teng, AJ Martelli, S. N
ystedt, J. Sundelin, and RM Scarborough. 1996. Cross-reactivity of ligands within the protease-activated receptor family. J Biol Chem 271: 16466-16471.
10. Hollenberg, MD, M. Salfeddine, B. Al-Ani, and A. Kawabata. 1997.
Proteinase-activated receptors: Structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can J Physiol Pharmacol
75: 832-841. 11.Bertog, M., B. Letz, W. Kong, M. Steinhoff, MA Higgins, A. Bielfel
d-Ackermann, E. Fromter, NW Bunnett, and C. Korbmacher. 1999. Basal proteinase-activated receptor (PAR-2) secretes chloride in collecting duct cells in the renal cortex of M-1 mice. J Physiol (Lond) 521 Pt 1: 3-17. 12. Molino, M., MJ Woolkalis, J. ReaveyCantwell, D. Pratico, P. Andrad
eGordon, ES Barnathan, and LF Brass. 1997. Endothelial cell thrombin receptor and PAR-2: two protease-activated receptors localized in a single cellular environment
J Biol Chem 272: 11133-11141. 13. Mirza, H., V. Yatsula, and WF Bahou. 1996. Proteinase-activated receptor-2 (PAR-2) is involved in the mitogenic response in human vascular endothelial cells. Mediates: molecular characterization and evidence for functional coupling to the thrombin receptor
J Clin Invest 97: 1705-1714. 14. Al-Ani, B., M. Saifeddine, and MD Hollenberg. 1995. Proteinase-activated receptor-2-activated poly in rat vascular and gastric smooth muscle. peptide, detection of the functional receptor for _{SLIGRL-NH 2. Can J Physiol} Pharmacol
73: 12033-1207. 15. Steinhoff, M., CU Corvera, MS Thoma, W. Kong, BE McAlpine, GH
Caughey, JC Ansel, and NW Bunnett. 1999. Proteinase-activated receptor-2 in human skin: tissue distribution and activation of keratinocytes by mast cell tryptase. Exp Dermatol 8: 282-2294. 16. Wakita, H. ., F. Furukawa, and M. Takigawa. 1997. Thrombin and trypsin induce gene expression of granulocyte macrophage colony stimulating factor and interleukin-6 in cultured normal human keratinocytes. Proc Assoc Am Physic.
ians 109: 190-207. 17. Howells, GL, MG Macey, C. Chinni, L. Hou, MT Fox, P. Harriott,
and SR Stone. 1997. Proteinase-activated receptor-2: expression by human neutrophils. J Cell Sci 110 (Pt 7): 881-887. 18. Mari, B., S. Guerin, DF Far, LP. Breitmayer, N. Belhacene, LF Pe
yron, B. Rossi, and P. Auberizer. 1996. Thrombin and trypsin-induced Ca2 ⁺ mobilization in human T cell lines through interaction with various protease-activated receptors. FASEB J 10: 309. -316. 19. Nystedt, S., V. Ramakrishnan, and J. Sundelin. 1996. Proteinase-activated receptor-2 is induced by inflammatory mediators in human endothelial cells. Comparison with thrombin receptor. J Biol Chem 271: 14910-14915. 20. Veranolle, N. 1999. Peptides that activate proteinase-activated receptor-2 are capable of in vivo rolling, adhesion and extravasation of leukocytes. Induces. JI
mmunol 163: 5064-5069. 21. Veranolle, N., MD Hollenberg, KA Sharkey, and JL Wallace. 1999
Characterization of the inflammatory response to proteinase-activated receptor-2 (PAR-2) activating peptide in rat forepaws. Br J Pharmacol 1227: 1083-1090. 22. Steinhoff, M., N. Vemnolle, SH Young, M. . Tognetto, S. Amadesi, HS
Ennes, M. Trevisani, MD Hollenberg, JL Wallace, GH Caughey, SE
Mitchell, LM Williams, P. Geppetti, EA Maver, and NW Bunnett. 200
0. Agonists of proteinase-activated receptor-2 induce inflammation by neural mechanisms. Nat Med 6: 151-158. 23. Compton, SL, JA Cairns, ST Holgate, and AF Walls. 1998. The role of mast cell tryptase in regulating endothelial cell proliferation, cytokine release, and expression of adhesion molecules: Tryptase is the IL-1β and IL-8 mRNA.
Induces RNA expression and stimulates selective release of IL-8 from human umbilical vein endothelial cells. J Immunol 161: 1939-1946. 24. Cairns, LA and AF Walls. 1996. Mast cell tryptase is an epithelial cell. Is a mitogen. Promotion of IL-8 production and expression of intracellular adhesion molecule-1.
Immunol 156: 275-283. 25. He, S. and. AF Walls. 1997. Human mast cell tryptase: Stimulation of microvascular leakage and mast cell activation. Eur J Pharmacol 328: 89-97. 26. He, S. 1997. Potent induction of neutrophil and eosinophil-rich infiltrates in vivo by human mast cell tryptase: Selective enhancement of eosinophil recruitment by histamine. J Immunol 159: 6216-6225.27.Nanevicz, T., M. Ishii, L. Wane, M. Chen, J. Chen, CW Turck, FE
Cohen, and SR Coughlin. 1995. Mechanism of agonist specificity of the thrombin receptor. Chimeric receptors and complementary mutations identify agonist recognition sites. J Biol Chem 270:
2 1619-21625. 28. Chen, L., M. Ishii, L. Wang, K. Ishii, and SR Coughlin. 1994. Activation of thrombin receptor. Confirmation of the ligand binding hypothesis with an intramolecular chain and discovery of other intermolecular ligand binding modes. J Biol Chem 269: 16041-16045. 29. Nanevicz, T., L. Wang, M. Chen, M. Ishii, and SR Coughlin. 1996.
Mutations activating the thrombin receptor: Changes in the extracellular agonist recognition domain cause constitutive signaling. J Biol Chem 271: 702-706. 30. Lerner, DJ, M. Chen, T. Tram, and SR Coughlin. 1996. Agonist recognition by proteinase-activated receptor-2 and thrombin receptors: Importance of extracellular loop interactions for receptor function. J Biol Chem 271: 13943-13947. 31. Al-Ani , B., M. Saifeddine, A. Kawabata, and MD Hollenberg. 1999.
Proteinase-activated receptor-2: role of extracellular loop-2 on ligand-mediated activation. Br J Pharmacol 128: 1105-1113. 32. Sanger, F., S. Nicklen, and AR Coulson. 1977. DNA sequencing with termination inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467. 33. Jones, AS 1963). Nature 199: 280-282. 34. Corvera, CU, O. Dery, K. McConalogue. , P. Gamp, M. Thoma, B. Al-Ani
GH Caughey, MD Hollenberg, and NW. Bunnett. 1999. Thrombin and mast cell tryptase regulate neurons in guinea-pig intestinal muscle via proteinase-activated receptors-1 and -2. J Physiol (Lond) 517 ( Pt 3): 741-756.
35.Kawabata, A., M. Saifeddine, B. AI-Ani, L. Leblond, and MD Hollenb
erg. 1999. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR-1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: PAR-2 activation by PAR-1 target ligand. Pharmacol Exp Ther 288: 358-370.36.Saifeddine, M., B. Al-Ani, CH Cheng, L. Wane, and MD Hollenberg,
1996. Rat proteinase-activated receptor-2 (PAR-2): cDNA sequence of receptor-derived peptide and activity in gastric and vascular tissues. Br J Pharmacol 118: 521.
-530. 37. Nystedt, S., AK LARSSON, H. ABERG, and J. Sundelin. 1995. cDNA and gene for mouse proteinase-activated receptor-2. Molecular cloning and functional expression. J Biol Chem 270: 5950-5955. 38. Brain, SD 2000. A new perspective on the role of sensory nerves in inflammation
Nat Med 6: 134-135. 39. D'Andrea, MR, CK Derian, D. Leturcq, SM Baker, A. Brunmark, P.
Ling, AL Darrow, RJ Santulli, LF Brass, and P. Andrade-Gordon. 19
98. Characterization of protease-activated receptor-2 immunoreactivity in normal human tissues
J Histochem Cytochem 46: 157-164. 40. Kong, W., K. McConalogue, LM Khitin, MD Hollenberg, DG Payan,
SK Bohm, and NW Bunnett. 1997. Luminous trypsin can regulate small intestinal epithelial cells via proteinase-activated receptors. Proc Natl Acad Sci USA 94: 8884
-8889. 41. Corvera, CU, O. Dery, K. McConaloeue, SK Bohm, LM Khitin, GH
Cauahey, DG Payan, and NW Bunnett. 1997. Mast cell tryptase regulates rat colon muscle cells via proteinase-activated receptor-2. J Clin
Invest 100: 1383-1393. 42.Nguyen, TD, MW Moody, M. Steinhoff, C. Okolo, DS Koh, and NW
Bunnett. 1999. Trypsin activates ion channels in pancreatic duct epithelial cells via proteinase-activated receptor-2. J Clin Invest 103: 261-269. 43. Lourbakos, A., C. Chinni, P. Thompson , J. Potempa, J. Travis, EJ M
ackie, and RN Pike. 1998. Cleavage and activation of proteinase-activated receptor-2 in human neutrophils by gingipain-R from Porphyromonas gingivalis. FEBS Lett 435: 45-48. 44. Cocks, TM, B Fong, JM Chow, GP Anderson, AG Frauman, RG G
oldie, PJ Henry, MJ Carr, JR Hamilton, and JD Moffatt. 1999. Protective role in the respiratory tract for protease-activated receptors. Nature 398: 156
-160. 45. Vergnolle, N. 2000. Review: Proteinase Activated Receptors-A Novel Signal for Gastrointestinal Pathophysiology. Aliment Pharmacol Ther 14: 257-266. 46. Berger, A. 2000. PAR-2 Antagonists The next generation of anti-inflammatory drugs? BM
J 320: 334. 47. Andrade-Gordon, P., BE Maryanoff, CK Derian, HC Zhang, MF Ad
do, AL Darrow, AJ Eckardt. WJ Hoekstra, DF McComsey, D. Oksenber
g, EE Reynolds, RJ Santulli, RM Scarborough, CE Smith, and KB
White. 1999. Design, synthesis and biological characterization of peptidomimetic antagonists of chained ligand receptors. Proc Natl Acad Sci USA 96: 12257-12262.

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 ２種のヒトＰＡＲ−２対立遺伝子のヌクレオチド配列比較。配列分析を白色人
種被検者のコホートに対して実施し、２種のＰＡＲ−２形態の存在を確かめた。
（ａ）７１９−Ｔにつきホモ接合であるか、又は（ｂ）７１９−Ｃにつきホモ接
合である被検者、及び７１９−Ｔ／Ｃ（ここで、Ｙ＝Ｔ又はＣである）被検者を
示す。突然変異により修飾されたアミノ酸２４０のコドンを、下線を施して表す
。FIG. 1. Nucleotide sequence comparison of two human PAR-2 alleles. Sequence analysis was performed on a cohort of Caucasian subjects to confirm the presence of two forms of PAR-2.
(A) Subjects homozygous for 719-T, or (b) Subjects homozygous for 719-C, and subjects 719-T / C, where Y = T or C Is shown. The codon for amino acid 240 modified by mutation is underlined.

【図２】 多型性の位置づけと、マウス、ラット及びヒトＰＡＲ−２由来のＥＣＬ−２ア
ミノ酸残基の並置。Ｐｈｅ２４０と隣接アミノ酸残基の位置における保存に注目
すること。アミノ酸の数はヒト受容体からのものである。FIG. 2. Positioning of the polymorphism and juxtaposition of ECL-2 amino acid residues from mouse, rat and human PAR-2. Note the conservation at Phe240 and adjacent amino acid residue positions. The number of amino acids is from the human receptor.

【図３】 トリプシン及びＰＡＲ２−ＡＰ群に反応したヒト野生型及びＰＡＲ₂Ｆ２４０
Ｓ受容体でのカルシウムシグナル伝達。（ａ）トリプシン；（ｂ）ＳＬＩＧＫＶ
−ＮＨ₂；（ｃ）ｔｃ−ＮＨ₂；及び（ｄ）ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂。野生型の反応
を−◆−により示し、ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓの反応を−△−により示す。非酵素的
細胞解離液を用いて細胞を浮上させ、Ｆｌｕｏ−３（２２μＭ）を負荷してから
、室温で３５分インキュベーションした。様々な濃度の作動薬で細胞にチャレン
ジし、蛍光分光光度法（励起４８０ｎｍ、発光５３０ｎｍ）により反応をモニタ
ーした。反応を、２μＭのカルシウムイオノホアで得られるピーク高さに対して
正規化した（％ Ａ２３１８７）。各データ点は、それぞれ同一２検体で実施し
た３〜４回の個別実験の平均±ＳＥＭを表す。FIG. 3. Human wild-type and PAR ₂ F240 in response to trypsin and PAR2-AP groups
Calcium signaling at the S receptor. (A) trypsin; (b) SLIGKV
_{-NH 2; (c) tc-} NH 2; and (d) SLIGRL-NH _2. The wild-type reaction is indicated by-◆-, and the reaction of PAR ₂ F240S is indicated by-△-. Cells were floated using a non-enzymatic cell dissociator, loaded with Fluo-3 (22 μM), and incubated at room temperature for 35 minutes. Cells were challenged with various concentrations of agonist and the reaction was monitored by fluorescence spectroscopy (excitation 480 nm, emission 530 nm). Reactions were normalized to the peak height obtained with 2 μM calcium ionophore (% A23187). Each data point represents the mean ± SEM of three to four individual experiments performed on two identical samples.

【図４】 ＰＡＲ１−ＡＰであるＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂、Ｃｉｔ−ＮＨ₂及びＴＦＬＬＲ−Ｎ
Ｈ₂に反応したヒト野生型及びＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体のカルシウムシグナル伝
達。 （ａ）ＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂及びＣｉｔ−ＮＨ₂に対する濃度効果曲線；ＳＦＬＬ
Ｒ−ＮＨ₂に対する野生型の反応、−◆−；ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓの反応、−△−。
Ｃｉｔ−ＮＨ₂に対する野生型の反応、−★−；及びＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓの反応、
−−◎−−。 （ｂ）ＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂に対する濃度効果曲線。ＴＦＬＬＲ−ＮＨ₂に対する野
生型の反応、−◆−；及び、ＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓの反応、−△−。非酵素的細胞
解離液を用いて細胞を浮上させ、Ｆｌｕｏ−３（２２μＭ）を負荷してから、室
温で３５分インキュベーションした。様々な濃度のＰＡＲ−１ＡＰで細胞にチャ
レンジし、蛍光分光光度法（励起４８０ｎｍ、発光５３０ｎｍ）により反応をモ
ニターした。反応を、２μＭのカルシウムイオノホアで得られるピーク高さに対
して正規化した（％ Ａ２３１８７）。各データ点は、個別に増殖させた細胞収
穫物から増殖させ、同一２検体で実施した３〜４回の個別実験の平均±ＳＥＭを
表す。FIG. 4. PAR1-APs SFLLR-NH ₂ , Cit-NH ₂ and TFLLR-N
Calcium signaling of human wild-type and PAR ₂ F240S receptors in response to H ₂ . (A) Concentration effect curves for SFLLR-NH ₂ and Cit-NH ₂ ; SFLL
Wild-type response to _{R-NH 2, - ◆ -} ; PAR 2 F240S reaction, - △ -.
Wild-type reaction to Cit-NH ₂ ,-★-; and PAR ₂ F240S reaction,
−− ◎ −−. (B) Concentration effect curves for TFLLR-NH _2. Wild-type response to _{TFLLR-NH 2, - ◆ -} ; and, PAR ₂ F240S reaction, - △ -. Cells were floated using a non-enzymatic cell dissociator, loaded with Fluo-3 (22 μM), and incubated at room temperature for 35 minutes. Cells were challenged with various concentrations of PAR-1AP and the reaction was monitored by fluorescence spectroscopy (excitation 480 nm, emission 530 nm). Reactions were normalized to the peak height obtained with 2 μM calcium ionophore (% A23187). Each data point represents the mean ± SEM of three to four individual experiments grown from individually grown cell harvests and performed on the same two specimens.

【図５】 ＴＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂及びｔｃ−ＹＧＰＫＦ−ＮＨ₂に反応したヒト及びラット
の野生型及びＰＡＲ₂Ｆ２４０Ｓ受容体におけるカルシウムシグナル伝達。非酵
素的細胞解離液を用いて細胞を浮上させ、Ｆｌｕｏ−３（２２μＭ）を負荷して
から、室温で３５分インキュベーションした。示した作動薬で細胞にチャレンジ
し、蛍光分光光度法（励起４８０ｎｍ、発光５３０ｎｍ）により反応をモニター
した。反応を、ＳＦＬＬＲ−ＮＨ₂（５０μＭ）で得られるピーク高さに対して
正規化した。FIG. 5. Calcium signaling at human and rat wild type and PAR ₂ F240S receptors in response to TLIGL-NH ₂ and tc-YGPKF-NH ₂ . Cells were floated using a non-enzymatic cell dissociator, loaded with Fluo-3 (22 μM), and incubated at room temperature for 35 minutes. Cells were challenged with the indicated agonist and the reaction was monitored by fluorescence spectroscopy (excitation 480 nm, emission 530 nm). Reactions were normalized to the peak height obtained with SFLLR-NH ₂ (50 μM).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/566 33/53 Ａ６１Ｐ 1/04 33/566 9/12 // Ａ６１Ｐ 1/04 11/00 9/12 11/06 11/00 17/00 11/06 17/06 17/00 19/02 17/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 19/02 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 コンプトン，スティーブン・ジョン カナダ国ティー３ビー・４ダブリューア イ，アルバータ，ノース・ウエスト・カル ガリー，ポイント・ドライブ 145，1107 (72)発明者 ケアンズ，ジェニファー・アン イギリス国エセックス エスエス15・４イ ーエヌ，バシルドン，ウォッシュ・ロード 35，メンデルス・ファーム・ハウス (72)発明者 グーフ，アラン・チャールズ イギリス国ビーエイ21・４ディーダブリュ ー，サマーセット，ヨーヴィル，キング・ ストリート 34 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 BB50 CB01 DA80 FB02 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 HA14 4B063 QA01 QQ42 QR32 QR62 QS25 QS34 4B065 AA90X AA99Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA16 NA14 ZA422 ZA592 ZA682 ZA892 ZA962 ZB112 ZC412 ZC422 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 EA22 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 1/19 C12N 1/21 4H045 1/21 C12Q 1/68 A 5/10 G01N 33/15 Z C12Q 1 / 68 33/50 Z G01N 33/15 33/53 D 33/50 33/566 33/53 A61P 1/04 33/566 9/12 // A61P 1/04 11/00 9/12 11/06 11 / 00 17/00 11/06 17/06 17/00 19/02 17/06 C12N 15/00 A 19/02 5/00 A (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, Z, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS , JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Compton, Steven・ John Tea 3B ・ 4 W Su West Calgary, Point Drive 145, 1107 (72) Inventor Cairns, Jennifer Anne Essex S.S.15.4, UK, Basildon, Wash Road 35, Mendels Farm House (72) Inventor Goof, Alan Charles B.A.21.4 B.D.D., Somerset, Yeoville, King Street 34 F-term (reference) 2G045 AA40 BB20 BB50 CB01 DA80 FB02 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 HA14 4B063 QA01 QQ42 QR62 QS25 QS34 4B065 AA90X AA99Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA16 NA14 ZA422 ZA592 ZA682 ZA892 ZA962 ZB112 ZC412 ZC422 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 EA22 FA74

Claims (16)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 変異プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ−２）ポリペプチ
ド又はそのフラグメントであって、 （ｉ）野生型ＰＡＲ−２に比較してトリプシンに対する低下した感受性を有し；
（ｉｉ）野生型ＰＡＲ−２に比較してｔｒａｎｓ−シンナモイル−ＬＩＧＲＬＯ
−ＮＨ₂に対する高まった感受性を有し；及び （ｉｉｉ）ＴＬＩＧＲＬ−ＮＨ₂により活性化され、 野生型ポリペプチドの対応する細胞外ループ２（ＥＣＬ−２）アミノ酸配列から
少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するＥＣＬ−２を含む、前記ポリペプチド
又はそのフラグメント。1. A mutant protease-activated receptor 2 (PAR-2) polypeptide or fragment thereof, comprising: (i) reduced sensitivity to trypsin compared to wild-type PAR-2;
(Ii) trans-cinnamoyl-LIGRLO compared to wild-type PAR-2
Has a heightened sensitivity to -NH _2; and (iii) by TLIGRL-NH ₂ is activated, the difference of at least one amino acid from the wild-type polypeptide corresponding extracellular loop 2 (ECL-2) the amino acid sequence The polypeptide or a fragment thereof comprising ECL-2. 【請求項２】 野生型ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるア
ミノ酸配列を有するヒトＰＡＲ−２である、請求項１に記載のポリペプチド。2. The method of claim 1, wherein the wild-type polypeptide is SEQ ID No. 2. The polypeptide according to claim 1, which is human PAR-2 having the amino acid sequence shown in 2. 【請求項３】 少なくとも１つのアミノ酸の違いがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２
に示されるアミノ酸配列の残基２４０、又はその同等物における修飾を包含する
、請求項１又は２に記載のポリペプチド。3. The method of claim 3, wherein the difference of at least one amino acid is SEQ ID No. 2
3. The polypeptide according to claim 1 or 2, which comprises a modification at residue 240 of the amino acid sequence shown in, or an equivalent thereof. 【請求項４】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるアミノ酸配列の残基２４
０、又はその同等物における置換を含んでなる、請求項３に記載のポリペプチド
。4. The method according to claim 1, wherein the SEQ ID No. Residue 24 of the amino acid sequence shown in 2
4. The polypeptide of claim 3, comprising a substitution at zero or an equivalent thereof. 【請求項５】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるアミノ酸配列の残基２４
０、又はその同等物におけるフェニルアラニンからセリンへの置換を含んでなる
、請求項４に記載のポリペプチド。5. The method according to claim 1, wherein the SEQ ID No. Residue 24 of the amino acid sequence shown in 2
5. The polypeptide of claim 4, comprising a phenylalanine to serine substitution at zero, or an equivalent thereof. 【請求項６】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるアミノ酸配列の位置２４
０、又はその同等物においてフェニルアラニン残基を欠くＰＡＲ−２ポリペプチ
ド又はそのフラグメント。6. SEQ ID No. Position 24 of the amino acid sequence shown in FIG.
A PAR-2 polypeptide or a fragment thereof that lacks a phenylalanine residue at 0 or its equivalent. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコード
するヌクレオチド。7. A nucleotide encoding the polypeptide according to any one of claims 1 to 6. 【請求項８】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの宿主細
胞における発現を指令し得る転写調節配列と機能可能的に連結される請求項７に
記載のヌクレオチドをそのなかに含んでなる宿主細胞。8. The nucleotide according to claim 7, which is operably linked to a transcription regulatory sequence capable of directing the expression of the polypeptide according to any one of claims 1 to 6 in a host cell. A host cell comprising 【請求項９】 オリゴヌクレオチドプライマーの対であって、請求項７に記
載のポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドをそれぞれ含
んでなり、ＰＡＲ−２遺伝子のＥＣＬ−２領域を増幅するポリメラーゼ連鎖反応
における使用に適している、前記プライマー。9. A polymerase chain pair of oligonucleotide primers, each comprising at least 10 contiguous nucleotides of the polynucleotide according to claim 7, for amplifying the ECL-2 region of the PAR-2 gene. Such a primer, which is suitable for use in a reaction. 【請求項１０】 片方又は両方のＰＡＲ−２対立遺伝子の多型性をＥＣＬ−
２領域に有する個体を同定する方法における、請求項９に記載のプライマーの使
用。10. The polymorphism of one or both PAR-2 alleles is determined by ECL-
Use of the primer according to claim 9 in a method for identifying an individual having two regions. 【請求項１１】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの活性
をモジュレートする化合物を同定する方法であって、前記ポリペプチドを候補化
合物と接触させること、及びこの候補化合物が前記ポリペプチドの活性をモジュ
レートするかどうかを決定することを含む、前記方法。11. A method for identifying a compound that modulates the activity of a polypeptide according to any one of claims 1 to 6, wherein the polypeptide is contacted with a candidate compound, and the candidate compound is Modulating the activity of said polypeptide. 【請求項１２】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドを選択
的に阻害する化合物を同定する方法であって： （ｉ）前記ポリペプチドをＰＡＲ−２作動薬の存在及び不在下で候補化合物と接
触させること； （ｉｉ）このポリペプチドの作動薬介在性の活性化を阻害するか又は低下させる
候補化合物群を選択すること； （ｉｉｉ）野生型ＰＡＲ−２ポリペプチドをＰＡＲ−２作動薬の存在及び不在下
で、工程（ｉｉ）において選択される候補化合物と接触させること；及び （ｉｖ）野生型ＰＡＲ−２ポリペプチドの作動薬介在性の活性化を有意には阻害
しない候補化合物を選択することを含む、前記方法。12. A method for identifying a compound that selectively inhibits a polypeptide according to any one of claims 1 to 6, comprising: (i) determining the presence of the PAR-2 agonist in the presence of a PAR-2 agonist; Contacting the candidate compound in the absence; (ii) selecting a group of candidate compounds that inhibit or reduce agonist-mediated activation of the polypeptide; (iii) converting the wild-type PAR-2 polypeptide Contacting with a candidate compound selected in step (ii) in the presence and absence of a PAR-2 agonist; and (iv) significantly reducing agonist-mediated activation of wild-type PAR-2 polypeptide Such a method, comprising selecting a candidate compound that does not inhibit. 【請求項１３】 請求項１１又は１２に記載の方法により同定される化合物
。13. A compound identified by the method according to claim 11 or 12. 【請求項１４】 炎症性障害の増加したリスクを有する患者を同定する方法
であって、前記患者から得られる生物学的サンプルにおいて、請求項１〜６のい
ずれか１項に記載のポリペプチド、又は請求項７に記載のポリヌクレオチドの存
在又は不在を決定することを含む、前記方法。14. A method for identifying a patient having an increased risk of an inflammatory disorder, wherein the polypeptide according to any one of claims 1 to 6, in a biological sample obtained from said patient. Or a method comprising determining the presence or absence of the polynucleotide of claim 7. 【請求項１５】 炎症により特徴づけられる病態を治療する方法に使用する
、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの活性をモジュレートする
化合物。15. A compound that modulates the activity of a polypeptide according to any one of claims 1 to 6, for use in a method of treating a condition characterized by inflammation. 【請求項１６】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの活性
を阻害する、請求項１５に記載の化合物。16. The compound according to claim 15, which inhibits the activity of the polypeptide according to any one of claims 1 to 6.