JP2002541223A - エストロゲンレセプター及び骨 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はエストロゲンレセプター及び骨に関する。特に、本発明はＥＲβ選択的アンタゴニストを含むか又はから成る骨粗しょう症治療又は予防用組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の属する技術分野） 本発明は、代謝性骨疾患のホルモン代替療法でエストロゲンレセプターベータ
（ＥＲβ）に対するモジュレーターを使用することに関する。特に、本発明は皮
質骨ミネラル含有量及び皮質骨強度を高めるためにＥＲβアンタゴニスト及び半
アゴニストを使用することに関する。

【０００２】 エストロゲン欠乏は閉経後女性の骨粗しょう症発症の主要な危険因子である。
特に、この状態は主として卵巣機能停止後に血清エストロゲン値が著しく低下す
ることによって引き起こされる。エストロゲンが存在しないと骨吸収の増加や進
行的な負の改骨性バランスが生じ、これらは小柱骨量及び皮質骨量の減少並びに
骨折危険性の上昇につながっている。

【０００３】 骨粗しょう症は一般的には「骨減少症」と呼ばれる状態によって先行される。
骨減少症は、対象が若い成体平均より１〜２．５標準偏差（Ｓ．Ｄ．）低いＢＭ
Ｄ値を有している状態であると考えられている。骨粗しょう症では、このＢＭＤ
は若い成体平均より２．５ＳＤ以上低い。骨粗しょう症は１カ所又はそれより多
くの骨折が生じたときに確立されると考えられている。本出願では、「骨粗しょ
う症」の「治療」若しくは「予防」又は「の危険性の最小限化」のような用語は
「骨減少症」又は「確立された骨粗しょう症」の治療若しくは予防又は危険性の
最小限化を包含する。

【０００４】 （従来の技術） 閉経後女性におけるエストロゲンの不存在によって、骨損失及び骨折危険性の
増大につながる骨転換の増加（Turner, R. T.等（1994）Endocr Rev 15、275〜3
00）や負の改骨性バランス上昇が生じる。骨量の減少はエストロゲンで治療する
ことによって予防することができる（Lindsay, R.等（1976）Lancet 1、1038〜1
041）。エストロゲン代替による骨保存効果は明白である（上述のTurner等（199
4））が、このホルモン効果の作用に関する細胞メカニズムは不明である。造骨
細胞はエストロゲンレセプターを発現し（Eriksen, E.F.等（1988）Science 241
、84〜86、Komm, B.S.等（1988）Science 241、81〜84）、骨組織に対するエス
トロゲンの直接的な効果を示唆している。しかしながら、骨に対するエストロゲ
ンの他の間接的な効果を無視することはできない。

【０００５】 ＥＲα遺伝子の不活化された点突然変異がホモ接合のヒトは成長板の非融合と
重篤な骨減少症を示したことが報告されている（Smith, E.P.等（1994）N Engl
J Med 331、1056〜1061）。この臨床的所見に基づいて、ＥＲαは少なくともヒ
ト男性では成長板閉鎖や成人骨代謝に重要であると推定された。対照的に、機能
的なＥＲαを欠いているマウスは軽症の骨格異常しか有しておらず（Taki, M.等
（1997）J Bone Miner Res 12、S460）、マウスの骨格成長中にはエストロゲン
作用に対する他のメカニズム又はレセプターが重要である可能性が示唆された。

【０００６】 骨細胞中に両エストロゲンレセプター（ＥＲα及びβ）が存在することは、骨
組織に対して少なくとも幾つかのエストロゲン効果が直接作用していることを示
唆している。

【０００７】 新規なエストロゲンレセプター、ＥＲβのクローニングによって、エストロゲ
ンには代替的な作用メカニズムが存在する可能性が示唆された（Kuiper, G.G.等
（1996）Proc Natl Acad Sci U S A 93、5925〜5930）。本発明者や他の者は、
ＥＲβが成長板軟骨細胞や造骨細胞内で発現され、縦方向の骨成長及び／又は成
体骨代謝の調節におけるＥＲβの役割の可能性を示していることを証明した（On
oe, Y.等（1997）Endocrinology 138、4509〜4512、Arts, J.、Kuiper, G.G.等(
1997）Endocrinology 138、5067〜5070、Vidal, O.等（1999）J Bone Miner Res
14 923〜929、Nilsson, L.O.等（1999）J Clin Endocrinol Metab 84、370〜37
3；Windahl Bone 26 117〜121（2000））。しかしながら、成長や骨代謝の調節
におけるＥＲβの生理学的役割は依然として知られていない。

【０００８】 ＥＲαのＥＲβに対する作用の分子的メカニズムが最近研究されている。ＥＲ
αとＥＲβは殆ど同一のＤＮＡ結合ドメインを有しており、そしてインビトロ（
in vitro）試験で、これら２つのレセプターはエストロゲン化合物に対して類似
の親和性を有していることが証明されている（Kuiper, G.G.等（1996）Proc Nat
l Acad Sci U S A 93、5925〜5930、Kuiper, G.G.等(1997）Endocrinology 138
、863〜870、Tremblay, G.B.等（1997）Mol Endocrinol 11、353〜365）。ＥＲ
βのアミノ酸配列はＮ末端及びＣ末端トランス活性化領域がＥＲαと異なってい
る。それ故、ＥＲβによって介在される転写活性化はＥＲαのそれと異なってい
る可能性がある（Paech, K.等（1997）Science 277、1508〜1510）。リガンド−
及びＤＮＡ−結合特異性が非常に類似していることを考えると、エストロゲンに
対する組織特異的応答を媒介するためにはエストロゲンレセプターの特異な組織
分布が重要であろうと推定されている（Kuiper, G.G.及びGustafsson, J.A.（19
97）FEBS Lett 410、87〜90）。それ故、標的組織におけるエストロゲン応答を
決定するためには、組織内の特異な組織分布又は特異な細胞型分布と共に、これ
ら２つのレセプターサブタイプの固有のトランス活性化ドメインが重要な因子で
あり得よう。

【０００９】 本発明者は最近、機能的なＥＲβタンパク質を有していないマウスを作り、そ
してＥＲβは正常な***効率に必須であるが、雌又は雄の性的発育、生殖能力又
は授乳には必須でないことを報告した（Krege, J.H.等（1998）Proc Natl Acad
Sci U S A 95、15677〜15682。

【００１０】 機能的なＥＲβレセプタータンパク質を欠いているマウスは遺伝子ターゲティ
ングによって作られた（Krege, J.H.等 Proc. Natl Acad. Sci、（1998）、95、
15677〜15682。骨構造及び骨ミネラル含有量に対するＥＲβの生理学的役割を決
定することを目的とした研究は二重Ｘ線吸光光度法（ＤＸＡ）及び末梢性定量的
コンピュータ断層撮影法（Peripheral Quantitative Computerized Tomography
）（ｐＱＣＴ）を使用して行った。これらの測定は、野生型（＋／＋）又は突然
変異（−／−）表現型の４週齢（思春前期）並びに１２週齢（成体）マウスの雄
及び雌に適用した。思春前期マウスでは、体重、長骨の長さ及びミネラル含有量
はどちらの性の野生型と突然変異マウス間でも識別不可能であった。驚いたこと
に、成体雌ＥＲβ−／−マウスでは、同じ年齢の野生型雌マウスと比較して、体
重が増加し、大腿骨はより長く、そして骨ミネラル含有量は増加していた（ＤＸ
Ａ）。実際には、雌ＥＲβ−／−の骨は分析したパラメーターに関して雄性化さ
れていた。この骨の表現型の改変は長骨に限定されず、椎骨及び頭蓋冠骨でも認
められた。思春期開始前に縦方向の成長が殆ど完了している脛長骨では、野生型
雌成体マウスと比較して突然変異体では骨ミネラル含有量の増加を依然として観
察することができ、骨ミネラル含有量の増加が縦方向の骨成長と無関係であるこ
とを示していた。若い成長中の齧歯類における卵巣摘出は小柱骨ミネラル密度を
低下させるが、また皮質骨の放射状成長を高めることも良く知られている。これ
らの影響は共にエストロゲンを使用する治療によって逆転させられる。ＥＲβ（
−／−）雌における骨ミネラル含有量の増加は小柱骨ミネラル密度の増加による
ものではなくて、放射状骨成長に関係のある横断面皮質骨面積の増加によるもの
である。成体雌ＥＲβ−／−マウスの皮質骨は雌性化の喪失を証明しており、Ｅ
Ｒβが雌マウスの皮質骨に対する内在性エストロゲン効果（骨膜成長）に必須で
あることを示しているように思われる。

【００１１】 ＥＲβ枯渇の観察された影響が小柱骨又は皮質骨ミネラル密度のどちらに影響
を与えていたのかどうかを識別するためにｐＱＣＴ分析を使用したとき、これら
の結果は、驚いたことに、骨ミネラル密度の上昇が皮質骨に限定され、そして小
柱容量骨ミネラル密度は影響を受けなかったことを示した。これは、小柱骨ミネ
ラル密度に対して圧倒的な影響がある閉経中又は卵巣摘出後のエストロゲン枯渇
の影響と異なっているように思われる。皮質骨パラメーターの測定によって、雌
ＥＲβ−／−マウスの骨は、これらの野生型同腹子と比較して、皮質骨面積の増
加につながる骨膜並びに骨内膜周経の増加を示した。この皮質横断面骨面積の増
加をコンピュータ処理した結果、骨強度パラメーター、即ち皮質横断面慣性モー
メント及び皮質抵抗モーメントは対応して３０％増加していた。ＥＲβ−／−雌
の骨の生物力学的特性は、例えば曲げ及びねじれ試験を使用して更に証明するこ
とができる。

【００１２】 ＷＯ９７／０９３４８（Karo Bio AB）は、上記のKuiper, G.１９９６に記載
されているＥＲβレセプターのクローニングを開示している。ＷＯ９９／０５７
１０（イェール大学）はＥＲβ遺伝子のもう１つの形態のアミノ酸配列とヌクレ
オチド配列及び関連タンパク質配列を開示している。ＷＯ９８／５６８１２（Ka
ro Bio AB）は或るＥＲα及びＥＲβ選択的リガンドを開示している。Barkhem,
T.等、Molecular Pharmacology ５４ １０５〜１１２（１９９８）は異なる形態
のエストロゲンレセプターに対する或る化合物の選択性を開示している。ＷＯ９
９／１１７６０（カリフォルニア大学運営理事）はＡＰ１部位のＥＲα及びＥＲ
βの特異なリガンド活性化用試験化合物のスクリーニング方法を開示している。

【００１３】 本発明の１つの態様により、ＥＲβアンタゴニスト又は半アゴニストを含む骨
粗しょう症治療用組成物が提供される。

【００１４】 好ましくは、骨粗しょう症治療用組成物はＥＲβ選択的アンタゴニスト又は半
アゴニストを含む。好ましくは、上記ＥＲβアンタゴニスト又は半アゴニストは
全く有していないか又はごくわずかなＥＲαアンタゴニスト活性しか有していな
い。好ましいアンタゴニストは、ＥＲβに対して８０ｎＭ未満、更に好ましくは
１０ｎＭ未満の結合親和性を有している。最も好ましくは、上記ＥＲβアンタゴ
ニストはＥＲβに対して０．００１〜１０ｎＭの結合親和性を有している。ごく
わずかなＥＲαアンタゴニスト活性はエストラジオール（Ｅ２）を参照して決定
することができる。Ｅ２と比較して５０％以上のアゴニズム(agonism)はごくわ
ずかなＥＲαアンタゴニスト活性と考えることができる。

【００１５】 本発明の骨粗しょう症治療用組成物はまたエストロゲン、エストロゲンアゴニ
スト、又はタモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン及びタモキシフ
ェンメチオダイドのようなＳＥＲＭ（選択的エストロゲンレセプターモデュレー
ター）を含有することも可能であり、そしてこのようなＳＥＲＭは骨組織や血清
脂質に対してエストロゲンアゴニスト様活性を示すが、***や子宮ではエストロ
ゲンアンタゴニストである。本発明の組成物は、上記ＥＲβアンタゴニストに加
えて、慣用の骨粗しょう症又は骨減少症活性剤を含有し得る。例えば、或る実施
態様では、本発明の方法及び組成物はビスホスホン酸塩を使用する／含み得る。
適当なビスホスホン酸塩は次の化学式に相当する：

【００１６】

【化１】 上記式中、ｎは０から約７までの整数であり、そしてＡ及びＸは独立して、Ｈ、
ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＳＨ、フェニル、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ３〜Ｃ３
０分枝又はシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル
置換ＮＨ２、Ｃ３〜Ｃ１０分枝又はシクロアルキル置換ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ１０ジ
アルキル置換ＮＨ２、Ｃ３〜Ｃ１０分枝又はシクロアルキルジ置換ＮＨ２、Ｃ１
〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換チオ、チオフェニル、ハロフェ
ニルチオ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換フェニル、ピリジル、フラニル、ピロリジ
ニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニル及びベンジルからなる群から選択され
、ここでｎが０のときにはＡとＸが共にＨ若しくはＯＨから選択されることはな
いか、又はＡとＸはこれらが結合している１個又は複数の炭素原子と一緒になっ
てＣ３〜Ｃ１０環を形成する。

【００１７】 上記化学式において、上記アルキル基は、該化学式に十分な原子が供給される
という条件で、直鎖、分枝状又は環状であり得る。上記Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキ
ル基は多種多様な置換基を含むことができ、そしてこれらの非限定的な例にはフ
ェニル、ピリジル、フラニル、ピロリジニル、イミダゾニル、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ
１０アルキル又はジアルキル置換ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ及びＣ１〜Ｃ１０アルコキ
シからなる群から選択されるものが含まれる。

【００１８】 上記化学式はまた、Ａ及び／又はＸ置換基に関して複雑な炭素環式、芳香族及
びヘテロ原子構造を包含することも意味しており、そしてこれらの非限定的な例
にはナフチル、キノリル、イソキノリル、アダマンチル及びクロロフェニルチオ
が含まれる。

【００１９】 有用な構造の１つのクラスには、ＡがＨ、ＯＨ及びハロゲンからなる群から選
択されるもの、ＸがＣ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、ハロゲ
ン及びＣ１〜Ｃ１０アルキル又はフェニル置換チオからなる群から選択されるも
の、そしてｎが０であるものが含まれる。

【００２０】 構造のサブクラスには、ＡがＨ、ＯＨ及びＣｌからなる群から選択されるもの
、ＸがＣ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、Ｃｌ及びクロロフェ
ニルチオからなる群から選択されるもの、そしてｎが０であるものが含まれる。
このサブクラスの１つの例はＡがＯＨでありそしてＸが３−アミノプロピル部分
でありそしてｎが０であるときであり、その結果得られる化合物は４−アミノ−
１，−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸塩、即ちアレンドロネー
トである。

【００２１】 ビスホスホン酸塩の薬学的に許容可能な塩及び誘導体も本発明で有用である。
塩の非限定的な例にはアルカリ金属、アルカリ金属、アンモニウム及びモノ−、
ジ、トリ−又はテトラ−Ｃ１〜Ｃ３０−アルキル−置換アンモニウムからなる群
から選択されるものが含まれる。好ましい塩はナトリウム、カリウム、カルシウ
ム、マグネシウム及びアンモニウム塩からなる群から選択されるものである。モ
ノ及びジ並びにこれらより多い他のナトリウム塩を含むナトリウム塩が更に好ま
しい。誘導体の非限定的な例にはエステル、水和物及びアミドからなる群から選
択されるものが含まれる。水和物は全ての数の水和物、即ち一水和物、二水和物
、三水和物等、並びに部分的水和物、例えば、ヘミ−ペンタ水和物（即ち、２．
５水和物）を含み得る。ビスホスホン酸塩の無水形態も本発明の範囲内であるよ
うに意図されている。

【００２２】 本明細書で使用するとき、「薬学的に許容可能な」は本発明のビスホスホン酸
塩の塩及び誘導体が、これらが誘導された遊離酸形態と同一の一般的な薬理学的
特性を有しておりそして毒性の観点から許容可能であることを意味する。

【００２３】 本明細書で本発明の治療剤に言及して使用するとき、用語「ビスホスホン酸塩
」はジホスホン酸塩、ビホスホン酸及びジホスホン酸並びにこれら物質の塩及び
誘導体も包含するように意味されていることに注意すべきである。１個又は複数
個のビスホスホン酸塩に言及する際に特定の名称を使用しても、特に指示しない
限り、本発明の範囲を限定するようには意味されていない。当該技術分野におい
て通常の技術を有する者によって現在使用されている名称が混合しているために
、本発明のビスホスホン酸塩化合物の、特定の重量又はパーセントへの言及は、
本明細書で他に指示されていない限り、酸の活性重量に基づいている。例えば、
句「アレンドロン酸活性重量に基づく、アレンドロネート、薬学的に許容可能な
塩及びこれらの混合物からなる群から選択される約７０ｍｇの骨吸収阻害ビスホ
スホン酸塩」は、選択されるビスホスホン酸塩化合物の量が７０ｍｇのアレンド
ロン酸に基づいて計算されていることを意味する。

【００２４】 本発明で有用なビスホスホン酸塩の非限定的な例には次のものが含まれる： アレンドロン酸、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホス
ホン酸。

【００２５】 アレンドロネート（アレンドロン酸ナトリウム又はモノナトリウム三水和物と
しても知られている）、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビス
ホスホン酸モノナトリウム三水和物。

【００２６】 アレンドロン酸及びアレンドロネートは、１９９０年５月１日に発行されKiec
zykowski等に付与された米国特許４，９２２，００７及び１９９１年５月２８日
に発行されkieczykowskiに付与された５，０１９，６５１（これらは共にそれら
の全体を本明細書で引用する）中に記載されている。

【００２７】 １，１−ジクロロメチレン−１，１−ジホスホン酸（クロドロン酸）及びジナ
トリウム塩（クロドロネート、Procter and Gamble）はベルギー特許６７２，２
０５（１９６６）及びJ. Org. Chem ３２、４１１１（１９６７）（これらは共
にそれらの全体を本明細書で引用する）中に記載されている。

【００２８】 １−ヒドロキシ−３−（１−ピロリジニル）−プロピリデン−１，１−ビスホ
スホン酸（ＥＢ−１０５３）。

【００２９】 １−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸（エチドロン酸） １−ヒドロキシ−３−（Ｎ−メチル−Ｎ−ペンチルアミノ）プロピリデン−１
，１−ビスホスホン酸、これはベーリンガー−マンハイム（Boehringer-Mannhei
m）のＢＭ−２１０９５５（イバンドロネート）としても知られており、１９９
０年５月２２日に発行された米国特許第４，９２７，８１４号（これはその全体
を本明細書で引用する）中に記載されている。

【００３０】 シクロヘプチルアミノメチレン−１，１−ビスホスホン酸、即ち、１９９０年
１１月１３日に発行されIsomura等に付与された米国特許４，９７０，３３５（
これはその全体を本明細書で引用する）中に記載されているYamanouchiのＹＭ１
７５（インカドロネート、以前にはシマドロネートとして知られていた）。

【００３１】 １−ヒドロキシ−２−イミダゾ−（１，２−ａ）ピリジン−３−イエチリデン
（ミノドロネート）。

【００３２】 ６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン−１，１−ビスホスホン酸（ネリド
ロネート）。

【００３３】 ３−（ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホ
ン酸（オルパドロネート）。

【００３４】 ３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（パミド
ロネート）。

【００３５】 ［２−（２−ピリジニル）エチリデン］−１，１−ビスホスホン酸（ピリドロ
ネート）は米国特許第４，７６１，４０６号（これはその全体を本明細書で引用
する）中に記載されている。

【００３６】 １−ヒドロキシ−２−（３−ピリジニル）−エチリデン−１，１−ビスホスホ
ン酸（リセドロネート）。

【００３７】 （４−クロロフェニル）チオメタン−１，１−ビスホスホン酸（チルドロネー
ト）、これは１９８９年１０月２４日にBreliere等に付与された米国特許４，８
７６，２４８（これはその全体を本明細書で引用する）中に記載されている。

【００３８】 １−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）エチリデン−１，１
−ビスホスホン酸（ゾレンドロネート）。

【００３９】 好ましくはアレンドロネート、クロドロネート、エチドロネート、イバンドロ
ネート、インカドロネート、ミノドロネート、ネリドロネート、リセドロネート
、ピリドロネート、パミドロネート、チルドロネート、ゾレドロネート、これら
の薬学的に許容可能な塩又はエステル及びこれらの混合物から選択されるビスホ
スホン酸塩である。

【００４０】 更に好ましくはアレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート、これ
らの薬学的に許容可能な塩又はエステル及びこれらの混合物である。

【００４１】 更に好ましくはアレンドロネート、その薬学的に許容可能な塩及びこれらの混
合物である。

【００４２】 最も好ましくはアレンドロン酸モノナトリウム三水和物である。

【００４３】 他の実施態様においては、他の好ましい塩はイバンドロネートのナトリウム塩
及びリセドロン酸モノナトリウムヘミ−ペンタ水和物（即ち、モノナトリウム塩
の２．５水和物）である。

【００４４】 ２つ又はそれより多くのビスホスホン酸塩活性物質の混合物を使用できること
が認められる。

【００４５】 ビスホスホン酸塩の正確な投与量は投与スケジュール、選択される特定のビス
ホスホン酸塩、哺乳動物の、又はヒトの年齢、体格、性別及び状態、治療される
疾患の性質及び重篤度、並びに他の関連のある医学的及び肉体的因子と共に変動
するであろう。それ故、正確な治療的有効量を予め特定することはできないが、
治療提供者又は臨床医は容易に決定することができる。適切な量は、動物モデル
による定型的な実験及びヒト臨床試験で決定することができる。一般的に、ビス
ホスホン酸塩の適切な量は、骨吸収阻害効果を得るように選択される、即ち、窒
素含有ビスホスホン酸塩の骨吸収阻害量が投与される。ヒトでは。窒素含有ビス
ホスホン酸塩の有効経口投与量は典型的には約１．５から約６０００μｇ／体重
ｋｇまで、そして好ましくは約１０から約２０００μｇ／体重ｋｇまでである。

【００４６】 ビスホスホン酸塩アレンドロン酸モノナトリウム三水和物に関しては、投与さ
れる通常のヒト投与量は一般的には約２ｍｇ／日〜約４０ｍｇ／日、好ましくは
約５ｍｇ／日〜約４０ｍｇ／日の範囲内である。米国では、アレンドロン酸モノ
ナトリウム三水和物について現在承認されている投与量は、骨粗しょう症を予防
するためには５ｍｇ／日、骨粗しょう症を治療するためには１０ｍｇ／日、そし
てパジェット病を治療するためには４０ｍｇ／日である。

【００４７】 代替的な投与方式においては、ビスホスホン酸塩は毎日ではない、例えば１週
間に１回の投与、１週間に２回の投与、２週間に１回の投与及び１ヶ月に２回の
投与で投与することができる。このような投与方式では、適切な多数回のビスホ
スホン酸塩投与量が投与されよう。例えば、１週間に１回の投与方式では、アレ
ンドロン酸モノナトリウム三水和物は、５ｍｇ又は１０ｍｇの毎日連続７回の投
与量の代わりに３５ｍｇ／週又は７０ｍｇ／週の投与量で投与されよう。

【００４８】 イバンドロネートに関しては、単位投与量は、イバンドロン酸活性重量に基づ
いて、即ち対応する酸に基づいて計算して約２．５ｍｇから約２００ｍｇまでを
含み得る。１日経口投与量の例は、約２．５ｍｇ、３．５ｍｇ、５ｍｇ、７．５
ｍｇ及び１０ｍｇを含む。週１回の経口投与量の例には、約２５ｍｇ、３０ｍｇ
、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ又は５０ｍｇからなる群から選択される、骨吸
収を阻害しそして骨粗しょう症を治療しそして予防するのに有用な単位投与量が
含まれる。

【００４９】 リセドロネートに関しては、単位投与量は、リセドロン酸活性重量に基づいて
、即ち対応する酸に基づいて計算して約２．５ｍｇから約２００ｍｇまでを含み
得る。１日経口投与量の例は約２．５ｍｇ、３．５ｍｇ、５ｍｇ（代表的な骨粗
しょう症１日投与量）、７．５ｍｇ及び１０ｍｇ及び３０ｍｇ（代表的なパジェ
ット病１日投与量）を含む。週１回の経口投与量の例には、約２５ｍｇ、３０ｍ
ｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ又は５０ｍｇからなる群から選択される、骨
吸収を阻害し、そして骨粗しょう症を治療しそして予防するのに有用な単位投与
量が含まれる。

【００５０】 本発明の薬剤組成物は、ビスホスホン酸に基づいて約１ｍｇから約１００ｍｇ
まで、好ましくは約２ｍｇから７０ｍｇまで、そして更に好ましくは約５ｍｇか
ら約７０ｍｇまでのビスホスホン酸塩を含み得る。ビスホスホン酸塩アレンドロ
ン酸モノナトリウム三水和物に関しては、本発明で有用な薬剤組成物は、アレン
ドロン酸活性重量に基づいて約２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、３５ｍｇ、４０
ｍｇ又は７０ｍｇの活性物を含み得る。

【００５１】 １９８６年１１月４日に発行されRosini等に付与された米国特許４，６１０，
０７７；１９９４年１０月２５日に発行されBechard等に付与された米国特許５
，３５８，９４１；及び１９９９年２月４日に公開されたDaifotis等のＰＣＴ出
願番号ＷＯ ９９／０４７７３（これらは全てそれらの全体を本明細書で引用す
る）も参照されたい。

【００５２】 本発明の方法及び組成物の更なる実施態様は、骨吸収を阻害しそして本発明の
所望の治療的利益を提供するのに有用な追加的な骨作用剤を含み得る。このよう
な作用剤の例には、カルシトニン、エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲ
ン、カルシウムサプリメント、フッ化物、成長ホルモン分泌促進剤、ビタミンＤ
類似体及び選択的エストロゲンレセプターモデュレーターからなる群から選択さ
れるものが含まれる。本発明で有用なカルシトニンはヒト又は非ヒト由来である
、例えば鮭カルシトニンであることができる。エストロゲンの非限定的な例には
エストラジオールが含まれる。選択的なエストロゲンレセプターモデュレーター
の非限定的な例にはラロキシフェン、イオドキシフェン及びタモキシフェンが含
まれる。成長ホルモン分泌促進剤は１９９６年７月１６日に発行されChen等に付
与された米国特許第５，５３６，７１６号（これはその全体を本明細書で引用す
る）中に記載されている。

【００５３】 本発明のもう１つの態様に従って、骨粗しょう症を治療し、成体哺乳動物の骨
吸収を減少させ、成体哺乳動物の皮質骨量を安定化させるか若しくは増加させ、
又は成体哺乳動物の骨折の危険性を低下させるための医薬品の製造におけるＥＲ
βアンタゴニストの使用が提供される。

【００５４】 本発明の更なる態様によって、骨粗しょう症を治療し、骨吸収を減少させ、小
柱骨量を増加させるか若しくは安定化させ、又は成体哺乳動物の皮質骨量を増加
させるか若しくは安定化させる方法が提供され、このような方法はいずれも上記
哺乳動物にＥＲβアンタゴニストを提供することを含む。

【００５５】 本発明の更なる態様によって、骨粗しょう症を治療するための化合物を選択す
る方法が提供され、この方法はアゴニスト依存性ＥＲβ活性に拮抗する能力に基
づいて化合物を選択することを含む。それ故、好ましくは、骨粗しょう症を治療
するための化合物を選択する方法は、骨吸収小柱量、皮質量及び骨折危険性の減
少から選択される骨関連パラメーターに関連して、上記化合物を試験する更なる
段階を含む。本発明はまた、このような化合物選択方法によって決定される骨粗
しょう症の治療に有用な化合物も提供する。

【００５６】 本発明の薬剤組成物は、任意の薬学的に許容可能な担体、アジュバント又は媒
体と共に本発明化合物及びその薬学的に許容可能な塩の任意のものを含む。本発
明の薬剤組成物中で使用できる薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び媒体
には、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タ
ンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシ
ン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合
物、水、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン
酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネ
シウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコ
ール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、
ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコ
ール及び羊毛脂が含まれるが、これらに限定されない。

【００５７】 本発明の薬剤組成物は経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的
に、直腸的に、経鼻的に、口腔的に、膣的に又は移植貯蔵器によって投与するこ
とができる。本発明の薬剤組成物は任意の慣用の非毒性で薬学的に許容可能な担
体、アジュバント又は媒体を含有し得る。本明細書で使用するとき非経口的の用
語には皮下、皮内、静脈内、筋肉内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、鞘内、病巣内
及び頭蓋内注射又は注入技術が含まれる。

【００５８】 本発明の薬剤組成物は無菌の注射用製剤の形態、例えば、無菌の注射用水性又
は油性懸濁液であり得る。この懸濁液は、適当な分散剤又は湿潤剤（例えば、ト
ウィーン８０のような）及び懸濁剤を使用して当業者に知られている技術に従っ
て処方化することができる。無菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容可
能な希釈剤又は溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁液、例えば１，３−ブタンジオ
ール中の溶液であり得る。使用できる許容可能な媒体及び溶媒のなかにはマンニ
トール、水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、溶媒又は
懸濁化媒体として無菌の脂肪油が慣用的に使用される。この目的で、合成モノ−
又はジグリセリドを含む任意の無刺激性脂肪油を使用することができる。脂肪酸
、例えばオレイン酸やそのグリセリド誘導体、特にポリオキシエチル化されてい
るものは、天然の薬学的に許容可能な油、例えばオリーブ油又はヒマシ油と同様
に注射剤の製造で有用である。これらの油溶液又は懸濁液はまた長鎖アルコール
希釈剤又は分散剤、例えばピーエイチ．ヘルブ（Ｐｈ．Ｈｅｌｖ）又は同様なア
ルコールを含有し得る。

【００５９】 本発明の薬剤組成物は、カプセル、錠剤並びに水性懸濁液及び溶液を含むがこ
れらに限定されない任意の経口的に投与可能な投与形態で経口的に投与すること
ができる。経口使用用の錠剤の場合には、通常使用される担体にはラクトース及
びコーンスターチが含まれる。滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムも典型
的に添加される。カプセル形態の経口投与では、有用な希釈剤にはラクトース及
び乾燥コーンスターチが含まれる。水性懸濁液を経口的に投与するとき、本発明
の活性成分は乳化剤及び懸濁剤と組み合わされる。所望の場合には、或る種の甘
味剤及び／又は風味剤及び／又は着色剤を添加することもできる。

【００６０】 熟練者が認めるように、上記した投与量より低いか又は高い投与量が必要なこ
とがある。任意の特定の患者用の特定の投与量及び治療方式は、使用される特定
の化合物の活性、年齢、体重、全身的な健康状態、性別、食事、投与時間、***
速度、医薬品の組合せ、当該疾病の重篤度及び経過、当該疾病に対する患者の素
因、並びに治療医の判断を含む多様なファクターに依存するであろう。

【００６１】 本発明に従う方法及び組成物をここで、添付した図面、図１〜２を参照して記
載し、そしてこれら図中では、 図１は摘出した脛骨の骨パラメーターのＤＸＡ測定を示し、そして 図２はＥＲβ−／−及び野生型（ＷＴ）マウスから得られた雌（上部）脛骨（
中央）及び椎骨（下部）のＤＸＡスキャンである。

【００６２】 以下の実施例では、以下に記載する方法を使用した。

【００６３】 動物 動物は標準化した環境条件下で維持し、食物と水は自由に与えた。Ｃ末端ＤＮ
Ａの遺伝子型の決定は、以前に記載された（Krege, J.H.等（1998）上述）と部
分的に異なるプライマーによるＰＣＲを使用して４〜５週齢で行った。使用した
プライマーはイントロン２中の１つのプライマー（βＮＨＤ４−２５；５，−Ａ
ＧＡＡＴＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣ−３，）、イントロン３中の
１つ（Ｃｌｗｔ−２７；５−ＧＧＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＡＡＴＣＣＡＧＡ
ＣＡＴＣ−３，）及びＮｅｏカセット中の１つ（Ｎｅｏ−２５；５，−ＧＣＡＧ
ＣＣＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＴＡＣＡＣＴＴＣ−３，）であった。使用したＰＣ
Ｒプログラムは、９５℃で２分、（９５℃で３０秒、６４℃で１分、７２℃で１
分）を３０サイクル、及び７２℃で７分であった。ホモ接合野生型（＋／＋）マ
ウスで６５０ｂｐの産生物（βＮＨＤ４−２５及びＣｌｗｔ−２７）が増幅し、
ホモ接合突然変異（−／−）マウスで４５０ｂｐ（βＮＨＤ４−２５及びＮｅｏ
−２５）産生物が増幅し、そしてヘテロ接合（＋／−）マウスでは両方のバンド
が増幅した。

【００６４】 組織学的検査 右大腿骨を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンに包埋し、切片
化し、そしてアルシアンブルー／ファンギーソン（Van Gieson）で染色した。成
長板の幅は顕微鏡に連結した画像処理システム（Easy Image、Bergstroms Instr
ument、スウェーデン国ストックホルム）を使用して測定した。３０回の成長板
測定（３個の切片、１０回の測定／切片）の平均を各大腿骨で計算した。

【００６５】 二重Ｘ線吸収光度測定法（ＤＸＡ） 骨ミネラル平面密度（面積ＢＭＤ；ＢＭＣ／ｃｍ²）及び骨ミネラル含有量（
ＢＭＣ）はノーランドｐＤＥＸＡサブレ（Norland pDEXA Sabre）（ウィスコン
シン州フォートアトキンソン）及びサブレ・リサーチ（Sabre Research）ソフト
ウエア（３．６）で測定した。

【００６６】 全身、背骨及び頭蓋骨ＢＭＣを測定するために動物のインビボ（in vivo）測
定を実施した（線間隔を０．０５ｃｍにセットした中間解像スキャン）。３匹の
マウスを一度に分析した。実験開始時に屠殺したマウスは、スキャン間変動を回
避するために内部標準として全てのスキャンに含めた。

【００６７】 左大腿骨及び脛骨並びに椎骨Ｌ５のエクスビボ(ex vivo)測定は、１ｃｍ厚さ
のプレキシグラス（Plexiglas）テーブル上に置いた摘出骨で実施した。比較し
た骨は全て同一スキャンで測定した（線間隔を０．０１ｃｍにセットした高解像
スキャン）。

【００６８】 末梢性定量的コンピュータ断層撮影法（ｐＱＣＴ） コンピュータ断層撮影法は、ストラテックｐＱＣＴ ＸＣＴリサーチＭ（Strat
ec pQCT XCT Research M）（Norland、ソフトウエアバージョン５．４Ｂ）を使
用して７０μｍの解像度で操作して実施した（Rosen, H.N.等（1995）Calcif Ti
ssue Int 57、35〜39）。

【００６９】 大腿骨及び脛骨の骨幹中央部ｐＱＣＴスキャンを実施して、皮質容量骨ミネラ
ル密度（容量ＢＭＤ）、皮質横断面面積、骨膜周経、骨内膜周経、抵抗モーメン
ト及び横断面慣性モーメントを測定した。マウスの大腿骨と脛骨の骨幹中央部領
域は皮質骨だけを含有している。

【００７０】 左大腿骨及び脛骨の骨幹端ｐＱＣＴスキャンを実施して、小柱骨容量ＢＭＤを
測定した。スキャンは、大腿骨の総長の４％に相当する、遠位成長板から離れた
位置の骨幹端（皮質骨並びに小柱骨を含有する領域）内に位置させた。小柱骨領
域は内部閾値を４００ｍｇ／ｍｍ³にセットすることにより特定された。ｐＱＣ
Ｔのアッセイ間変動係数（ＣＶ）は２％未満であった。

【００７１】 ＤＸＡ技術により面積ＢＭＤを得、一方ｐＱＣＴにより真の／容量ＢＭＤを得
ることを強調しなければならない。つまり、ＤＸＡ技術により、容量当たりでは
なくて面積当たりのミネラル含有量が得られる。それ故、骨の外部寸法を調節す
る因子は面積ＢＭＤ（ＤＸＡ）に影響を与えるが、容量ＢＭＤ（ｐＱＣＴ）には
影響を与えない。

【００７２】 体重及び骨の寸法 ＥＲβ−／−及び野生型マウスは４（思春前期）及び１１（成体）週齢で分析
した。体重及び長骨の長さは、ｗｔマウスと比較して思春前期ＥＲβ−／−マウ
スでは変化しなかった。思春前期ｗｔ雌とｗｔ雄間では有意な性差は見られなか
った（ｔ検定）。しかしながら、成体雄マウスは、予期されたように、成体雌マ
ウスより重くそしてより長い脛骨及び大腿骨を有していた（これらの結果は表１
及び図１に示す、ｔ検定）。

【００７３】

【表１】 ４週齢のマウスは思春前期マウスとして示されている（雌ＷＴ及びＥＲ−／−
マウスについてはｎ＝６、雄ＷＴ及びＥＲβ−／−マウスについてはｎ＝７）。 １１週齢のマウスは成体マウスとして示されている（雌ＷＴ及びＥＲβ−／−
マウスについてはｎ＝６／７、雄ＷＴ及びＥＲβ−／−マウスについてはｎ＝５
）。大腿骨成長板の幅は遠位大腿骨で測定した。値は平均±ＳＥＭとして示され
ている。 野生型（ＷＴ）に対して、^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１。

【００７４】 特に、図１で示した実験では、摘出した脛骨（Ａ〜Ｃ）及び椎骨Ｌ５（Ｄ〜Ｆ
）の面積ＢＭＤ（Ａ、Ｄ）、骨面積（Ｂ、Ｅ）及びＢＭＣ（Ｃ、Ｆ）は、方法の
項で記載されているＤＸＡ技術を使用して測定した。４週齢のマウスは思春前期
１マウスとして示されている（雌ＷＴ及びＥＲβ−／−マウスについてはｎ＝６
、雄ＷＴ及びＥＲβ−／−マウスについてはｎ＝７）。１１週齢のマウスは成体
マウスとして示されている（雌ＷＴ及びＥＲβ−／−マウスについてはｎ＝７、
雄ＷＴ及びＥＲβ−／−マウスについてはｎ＝５）。値は平均±ＳＥＭとして示
されている。野生型（ＷＴ）に対して、^*ｐ＜０，０５、^**ｐ＜０，０１。

【００７５】 驚いたことに、成体雌ＥＲβ−／−マウスは成体雌ｗｔマウスより重くそして
より長い大腿骨を有していた（表１）。

【００７６】 脛骨の長さが４％増えそして大腿骨の長さが３０％増えている不均衡な縦方向
の長骨成長は、雌ｗｔマウスの４週齢から１１週齢に見られた（表１）。この差
異は、大部分の脛骨成長が思春期前に生じ、一方大腿骨は顕著な思春期／成体急
成長を示すためであることで、ほぼ間違いはないと思われる。この観察は、ＥＲ
β欠失雌マウスでは大腿骨の長さは増えるが脛骨の長さは増えないというこの試
験の所見に対する可能性のある説明を提供し、そして更にＥＲβがマウス雌の思
春期成長中に抑止的な役割を果たすことを示唆している。

【００７７】 総骨ミネラル含有量及び個々の骨の骨ミネラル含量 ＥＲβ−／−マウスから得られた骨は、ＤＸＡ及びｐＱＣＴ技術を使用して詳
細に分析した。全身ＢＭＣは、ＤＸＡを使用して測定したとき、ｗｔマウスと比
較して成体雌で増加したが、成体雄ＥＲβ−／−マウスでは増加しなかった。こ
れらの結果は表２に示す。

【００７８】

【表２】 ４週齢のマウスは思春前期マウスとして示されている（雌ＷＴ及びＥＲβ−／
−マウスについてはｎ＝６、雄ＷＴ及びＥＲβ−／−マウスについてはｎ＝７）
。 １１週齢のマウスは成体マウスとして示されている（雌ＷＴ及びＥＲβ−／−
マウスについてはｎ＝７、雄ＷＴ及びＥＲβ−／−マウスについてはｎ＝５）。 値は平均±ＳＥＭとして示されている。 野生型（ＷＴ）に対して、^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１。

【００７９】 実際には、成体ｗｔマウスで見られた性差（雄では雌と比較して総ＢＭＣがよ
り高かった）は成体ＥＲβ−／−マウスでは見られなかった（ｔ検定）。個々の
骨に与える影響もＤＸＡ技術を使用して試験した。頭蓋骨、背骨、椎骨Ｌ５、脛
骨及び大腿骨のＢＭＣは、成体雌ＥＲβ−／−マウスではＷＴマウスと比較して
増加していた（ｗｔより頭蓋骨で１６％、背骨で３１％、椎骨Ｌ５で２４％、脛
骨で２０％及び大腿骨で２７％増加。表２、図１〜２）。図２では、相対的な面
積ＢＭＤが示されている。（下部；Ｈ＝高密度及びＬ＝低密度）。ＷＴ雄マウス
は背骨、椎骨Ｌ５及び脛骨ではｗｔ雌より高いＢＭＣを有していた（図１及び表
２、ｔ検定）。この性差はＥＲβ−／−マウスでは見られなかった。思春前期雄
及び雌マウス又は成体雄マウスにおいては、ＥＲβ−／−とｗｔ間で総−、背骨
−、脛骨−及び椎骨−ＢＭＣに差異は見られなかった。

【００８０】 成体雌ＥＲβ−／−マウスにおける脛骨（ｗｔより２０％増加）及び椎骨（ｗ
ｔより２４％増加）ＢＭＣの増加は、骨面積の増加（ｗｔより脛骨で８％、椎骨
Ｌ５で１１％増加）と面積ＢＭＤの増加（ｗｔより脛骨で１１％、椎骨Ｌ５で１
６％増加；図１）の両方の結果によるものであった。

【００８１】 小柱骨ミネラル密度 小柱容量ＢＭＤは、ｐＱＣＴ技術を使用して遠位大腿骨及び基部脛骨の骨幹端
で測定した。表３に見られるように、成体雌マウスは雄マウスより有意に低い小
柱容量ＢＭＤを有していたが、思春前期雌マウスはそうではなかった。

【００８２】

【表３】 ４週齢のマウスは思春前期マウスとして示されている（雌ＷＴ及びＥＲβ−／
−マウスについてはｎ＝６、雄ＷＴ及びＥＲβ−／−マウスについてはｎ＝７）
。 １１週齢のマウスは成体マウスとして示されている（雌ＷＴ及びＥＲβ−／−
マウスについてはｎ＝７、雄ＷＴ及びＥＲβ−／−マウスについてはｎ＝５）。 値は平均±ＳＥＭとして示されている。 野生型（ＷＴ）に対して、^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１。

【００８３】 脛骨及び大腿骨の総ＢＭＣとは対照的に、ｗｔマウスと比較して成体雌ＥＲβ
−／−マウスでは小柱容量ＢＭＤに対する影響は見られなかった。それ故、雌Ｅ
Ｒβ−／−マウスにおけるＢＭＣの増加は小柱容量ＢＭＤの増加によって引き起
こされたものではなかった。

【００８４】 皮質骨パラメーター 小柱容量ＢＭＤは変化しなかったので、皮質骨パラメーターを詳細に試験した
。皮質骨パラメーターは骨幹中央部のｐＱＣＴ切片で調査した。脛骨及び大腿骨
の骨幹中央部切片の皮質ＢＭＣは、ｗｔと比較して成体雌ＥＲβ−／−マウスで
増加し（ｗｔより脛骨で１９％、大腿骨で１８％増加）、そしてこの増加は主と
して横断面骨面積の増加（ｗｔより脛骨で１３％、大腿骨で１４％増加）と容量
ＢＭＤのより少ない程度の増加（ｗｔより脛骨で４％、大腿骨で３％増加；表３
）によるものであった。表４から分かるように、横断面面積の増加は骨膜周経並
びに骨内膜周経の増加に関係があった。

【００８５】

【表４】 雌ＷＴ及びＥＲβ−／−マウスについてはｎ＝７、雄ＷＴ及びＥＲβ−／−マ
ウスについてはｎ＝５。値は平均±ＳＥＭとして示されている。 野生型（ＷＴ）に対して、 ^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１。

【００８６】 成体雌ＥＲβ−／−マウスにおける横断面皮質骨面積の大きさ及び位置の変化
によって、皮質横断面慣性モーメント（ｗｔより脛骨で４１％、大腿骨で３９％
の増加）及び皮質抵抗モーメント（ｗｔより脛骨で２６％、大腿骨で２８％の増
加；表４）が共に大きく増加した。成体雌ｗｔと雄ｗｔマウス間の皮質骨パラメ
ーターの全てについて性差があった。しかしながら、雌ＥＲβ−／−マウスと雄
ＥＲβ−／−マウス間ではこれらのパラメーターに性差は見られなかった。

【００８７】 成体雌マウスにおける卵巣摘出の影響 雌ＥＲβ−／−マウスは１３週齢で卵巣摘出（ｏｖｘ）した。これらの動物の
骨は８週後に分析した。ｏｖｘはＥＲβ−／−とｗｔマウスの両方で子宮重量を
減少させ、ｏｖｘが完了したことを示した（表５）。ｏｖｘは、ＥＲβ−／−マ
ウスにおいてｗｔマウスと同じ程度にＢＭＣを減少させた（表５）。ＢＭＣのこ
の減少は小柱容量ＢＭＤの大きな減少及び皮質ＢＭＣの小さな減少と関係があっ
た。

【００８８】

【表５】 雌ＷＴ及びＥＲβ−／−マウスについてはｎ＝７；雄ＷＴ及びＥＲβ−／−マ
ウスについてはｎ＝５。値は平均±ＳＥＭとして示されている。 野生型（ＷＴ）に対して、 ^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１。

【００８９】 造骨細胞−及び破骨細胞関連遺伝子の発現 成体雌ＥＲβ−／−マウスにおける骨表現型改変の背後にある分子メカニズム
を調査するために、造骨細胞−α１（Ｉ）コラーゲン（Ｃｏｌ．Ｉ）、アルカリ
ホスファターゼ（ＡＬＰ）、オステオカルシン（ＯＣ））及び破骨細胞−（ター
トレート−抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）、カテプシンＫ（ｃａｔＫ））
−関連ｍＲＮＡの発現を、野生型（ｗｔ）及びＥＲβ−／−マウスから得られた
長骨から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって評価した（図３）。これらの遺
伝子の発現値は、成体ｗｔマウスと比較して思春前期ｗｔマウスでは一般的によ
り高く、そして性的に差異がなく、急速な出生後成長中の骨代謝上昇及び代謝回
転の増加とも合致している。しかしながら、雌成体ＥＲβ−／−マウスでは、造
骨細胞関連遺伝子の発現は年齢が同じｗｔ雌マウスと比較して増加した。発現値
は成体雄と比較して成体雌ではより高かったにもかかわらず、破骨細胞関連遺伝
子に関しては、成体ＥＲβ−／−雌マウスとｗｔ雌マウス間に差異を観察するこ
とはできなかった。

【００９０】 成体（１１週）と初老（１年）マウス間の比較 種々の骨パラメーターは、上記した技術や普通に用いられる組織形態学試験を
含む技術を使用して１１週齢（即ち、成体）と１年齢のより老齢のマウスで測定
した。これらの結果は表６に示す。

【００９１】

【表６】 これらの結果から、野生型雌マウスと比較して、より老齢のマウスの小柱骨量
の喪失が雌ベルコマウス（BELKO mice）では低下していることを理解することが
できる。組織形態学的分析と他の測定技術間には良好な相関関係も存在し、後者
の技術の信頼性を示している。従って、ＥＲβアンタゴニストを使用して、ヒト
のような加齢雌哺乳動物の小柱骨量の自然的減少を低下させることができる。

【００９２】 この試験によって、成体雌ＥＲβ−／−マウスは皮質ＢＭＣの増加によって引
き起こされる総ＢＭＣの増加を有しているが、小柱容量ＢＭＤは変化していない
ことが証明された。皮質ＢＭＣのこの増加は主として、骨の放射状皮質成長（骨
膜周経の増加）と関係のある皮質横断面面積の増加によって生じた。雄ＥＲβ−
／−マウスではこの影響は見られなかった。実際に、雌と比較して雄でのより高
い総ＢＭＣ、横断面皮質面積の増加及び骨膜周経の増加によって成体ｗｔマウス
で見られた性差は成体ＥＲβ−／−マウスでは見られなかった。それ故、雌ＥＲ
β−／−マウスの皮質骨は雌性化の喪失を示しているように思われる。若いラッ
トの性腺摘出によって、雄では放射状皮質骨成長が低下し、そして雌では放射状
成長が増加し、その結果性差はかなり消失することがこれまでに証明されている
。この性差は、エストロゲンを雌に投与することによって卵巣摘出（Ｏｖｘ）ラ
ットで再び確立される（Turner等（1994）上述、Turner, R.T.等（1987）J Bone
Miner Res 2、115〜122）。この所見は、成体雌ＥＲβ−／−マウスの皮質骨の
明白な雌性化喪失という本発明者の現在の結果と一緒になって、齧歯類の皮質骨
の雌性化にＥＲβが関与している可能性を示している。皮質骨量に対するＥＲβ
の影響には骨組織に対する直接的な影響又は全身的ホルモンの調節を含む間接的
な影響が含まれると思われる。骨組織に対する直接的な影響は、ＥＲβが造骨細
胞内で発現されるという最近の所見によって支持されている（Onoe, Y.等（1997
）Endocrinology 138、4509〜4512、Arts, J.、Kuiper, G.G.等（1997）Endocri
nology 138、5067〜5070、Vidal, O.等（1999）J Bone Miner Res 上述）。思春
期開始前に縦方向の成長を殆ど完了している脛長骨では、ｗｔマウスと比較して
成体雌ＥＲβ−／−マウスではＢＭＣの増加が見られたが、骨の長さの増加は見
られなかった。この所見は、成体雌ＥＲβ−／−マウスにおけるＢＭＣの増加が
縦方向の骨成長の刺激だけによって引き起こされたのではなかったことを証明し
ている。

【００９３】 ＯｖｘによってＢＭＣが減少しそしてこの減少が主として小柱容量ＢＭＤの減
少によって引き起こされることは臨床試験やラット試験から良く知られている（
Turner, R.T.等（1994）上述）。Ｏｖｘマウスモデルはあまり良好には特徴が分
析されていない。しかしながら、マウスの卵巣摘出によっても小柱容量ＢＭＤが
大いに減少することが最近証明された（Andersson, A.等（1998）Bone 23、S631
）。興味深いことに、本発明の試験では、ＥＲβ−／−雌ではｗｔマウスと比較
して小柱容量ＢＭＤの減少は全く見られなかった。これらの所見は一緒になって
、小柱容量ＢＭＤにおけるＯｖｘで誘導された減少は単にＥＲβだけに依存する
ものではないことを示している。それ故、ＥＲα自体か又は冗長な態様のＥＲα
とＥＲβのどちらかがＯｖｘで誘導される小柱骨喪失から保護すると推測するこ
とができる。ＥＲα、ＥＲβ及びＥＲαβダブルノックアウトマウスのＯｖｘに
よる将来の実験によって、骨量に関するエストロゲンのレセプター特異性に対す
る更なる洞察が提供されよう。心血管ホメオスタシスにおけるＥＲα対ＥＲβの
機能的なレセプターの特異性が最近記載されている（Iafrati, M.D.等（1997）N
at Med 3、545〜548）。エストロゲンがＥＲαとは無関係なメカニズムによって
血管損傷応答を阻害することが証明され、ＥＲβがこの応答に関与していること
が示唆された。それ故、ＥＲαとＥＲβは、正常な生理状態でも病的な生理状態
と同様に、独立した機能と共通の機能の両方を有していると思われる。

【００９４】 結論として、ＥＲβ−／−マウスでは小柱ＢＭＤは変化していない。対照的に
、ＥＲβを欠いている成体雌マウスは、横断面骨面積の増加によって引き起こさ
れる皮質骨ミネラル含有量の増加を有しており、その結果皮質骨の雌性化が明ら
かに喪失している。この所見は、ＥＲβが、雌マウスの皮質骨に対する内在性エ
ストロゲン効果に必須であることを示している。皮質骨に対するＥＲβの影響に
関する作用メカニズム（単数又は複数）は依然として解明されていない。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は摘出した脛骨の骨パラメーターのＤＸＡ測定を示す。

【図２】 図２はＥＲβ−／−及び野生型（ＷＴ）マウスから得られた雌（上
部）脛骨（中央）及び椎骨（下部）のＤＸＡスキャンである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｉ Ｌ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 オールソン，クラエス スウェーデン エス−413 45 イェーテ ボリ サルグレンスカ ユニバーシティ ホスピタル ディビジョン オブ エンド クリノロジー デパートメント オブ イ ンターナル メディシン (72)発明者 グスタフソン，ジャン アケ スウェーデン エス−141 57 フディン ゲ ノヴム カロリンスカ インスティチ ュート デパートメント オブ メディカ ル ニュートリション Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA17 DB25 DB26 NA14 ZA972

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＥＲβ選択的アンタゴニストを含むか又は該アンタゴニスト
   からなる骨粗しょう症治療用又は予防用組成物。
2. 【請求項２】 ＥＲβアンタゴニストを含むか又は該アンタゴニストからな
   る骨粗しょう症治療用又は予防用組成物。
3. 【請求項３】 ＥＲβ選択的アンタゴニストを含むか又は該アンタゴニスト
   からなる、骨粗しょう症を治療するか又は予防するのに有用な薬剤組成物。
4. 【請求項４】 前記ＥＲβアンタゴニストがＥＲαアンタゴニスト活性を全
   く有していないか又はごくわずかしか有していない請求項２に記載の骨粗しょう
   症治療用又は予防用組成物。
5. 【請求項５】 前記ＥＲβアンタゴニストがＥＲβに対して８０ｎＭ未満の
   結合親和性を有している請求項１、２、３又は４に記載の骨粗しょう症治療用又
   は予防用組成物。
6. 【請求項６】 前記ＥＲβアンタゴニストがＥＲβに対して１０ｎＭ未満の
   結合親和性を有している請求項５に記載の骨粗しょう症治療用又は予防用組成物
   。
7. 【請求項７】 前記ＥＲβアンタゴニストがＥＲβに対して０．００１〜１
   ０ｎＭの結合親和性を有している請求項６に記載の骨粗しょう症治療用又は予防
   用組成物。
8. 【請求項８】 エストロゲン、エストロゲンアゴニスト又はＳＥＲＭを含む
   請求項１〜７のいずれか１項に記載の骨粗しょう症治療用又は予防用組成物。
9. 【請求項９】 骨粗しょう症を治療又は予防するための薬剤組成物の製造に
   おけるＥＲβアンタゴニストの使用。
10. 【請求項１０】 成体哺乳動物の骨吸収を阻害するための薬剤組成物の製造
    におけるＥＲβアンタゴニストの使用。
11. 【請求項１１】 成体哺乳動物の骨吸収を減少させるための薬剤組成物の製
    造におけるＥＲβアンタゴニストの使用。
12. 【請求項１２】 成体哺乳動物の皮質骨量の減少を遅らせるか、又は該皮質
    骨量を安定化させるか若しくは増加させるための薬剤組成物の製造におけるＥＲ
    βアンタゴニストの使用。
13. 【請求項１３】 成体哺乳動物の小柱骨量の減少を遅らせるか、又は該小柱
    骨量を安定化させるか若しくは増加させるための薬剤組成物の製造におけるＥＲ
    βアンタゴニストの使用。
14. 【請求項１４】 成体哺乳動物の骨折の危険性を減少させるための薬剤組成
    物の製造におけるＥＲβアンタゴニストの使用。
15. 【請求項１５】 前記ＥＲβアンタゴニストがＥＲαアンタゴニスト活性を
    全く有していないか又はごくわずかしか有していない請求項９〜１４のいずれか
    １項に記載の使用。
16. 【請求項１６】 前記ＥＲβアンタゴニストがＥＲβに対して８０ｎＭ未満
    の結合親和性を有している請求項９〜１５のいずれか１項に記載の使用。
17. 【請求項１７】 前記ＥＲβアンタゴニストがＥＲβに対して１０ｎＭ未満
    の結合親和性を有している請求項１６に記載の使用。
18. 【請求項１８】 前記ＥＲβアンタゴニストがＥＲβに対して０．００１〜
    １０ｎＭの結合親和性を有している請求項１７に記載の使用。
19. 【請求項１９】 哺乳動物にＥＲβアンタゴニストを提供することを含む、
    該哺乳動物の骨粗しょう症を予防するか若しくは治療するか又は骨粗しょう症発
    症の危険性を最小限にする方法。
20. 【請求項２０】 ＥＲβアンタゴニストを提供することを含む、成体哺乳動
    物の骨吸収を阻害する方法。
21. 【請求項２１】 ＥＲβアンタゴニストを提供することを含む、成体哺乳動
    物の骨吸収を減少させる方法。
22. 【請求項２２】 前記骨吸収が少なくとも１０％減少させられる請求項２１
    に記載の方法。
23. 【請求項２３】 成体哺乳動物の小柱骨量の減少を遅らせるか、又は該小柱
    骨量を増加させるか若しくは安定化させる方法であり、前記哺乳動物にＥＲβア
    ンタゴニストを提供することを含む方法。
24. 【請求項２４】 前記哺乳動物の小柱骨量を少なくとも３％増加させる請求
    項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 成体哺乳動物の皮質骨量を増加させるか又は安定化させる
    方法であり、前記哺乳動物にＥＲβアンタゴニストを提供することを含む方法。
26. 【請求項２６】 前記哺乳動物の皮質骨量を少なくとも３％増加させる請求
    項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記哺乳動物が雌である請求項１９〜２６のいずれか１項
    に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記哺乳動物が家畜動物及びヒトから選択される請求項１
    ９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記ＥＲβアンタゴニストがＥＲαアンタゴニストでない
    か又はごくわずかなＥＲαアンタゴニスト活性しか有していない請求項１９〜２
    ８のいずれか１項に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記ＥＲβアンタゴニストがＥＲβに対して８０ｎＭ未満
    の結合親和性を有している請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記ＥＲβアンタゴニストがＥＲβに対して１０ｎＭ又は
    それ未満の結合親和性を有している請求項３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記ＥＲβアンタゴニストがＥＲβに対して０．００１〜
    １０ｎＭの結合親和性を有している請求項３１に記載の方法。
33. 【請求項３３】 骨粗しょう症を治療又は予防するための化合物を選択する
    方法であり、アゴニスト依存性ＥＲβ活性に拮抗する化合物の能力に基づいて化
    合物を選択することを含む方法。
34. 【請求項３４】 哺乳動物の骨関連パラメーターに与える前記化合物の効果
    も測定する請求項３３に記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記骨関連パラメーターが骨吸収、小柱量、皮質量、骨折
    危険性の減少から選択される請求項３４に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記骨関連パラメーターが骨吸収でありそして化合物が骨
    吸収を少なくとも１０％減少させる能力に基づいて選択される請求項３５に記載
    の方法。
37. 【請求項３７】 前記骨関連パラメーターが骨吸収でありそして化合物が小
    柱量を少なくとも３％増加させる能力に基づいて選択される請求項３５に記載の
    方法。
38. 【請求項３８】 前記骨関連パラメーターが骨吸収でありそして化合物が皮
    質量を少なくとも３％増加させる能力に基づいて選択される請求項３５に記載の
    方法。
39. 【請求項３９】 前記骨関連パラメーターが骨吸収でありそして化合物が骨
    折の危険性を少なくとも１５％低下させる能力に基づいて選択される請求項３５
    に記載の方法。
40. 【請求項４０】 前記哺乳動物がマウスである請求項３４〜３９のいずれか
    １項に記載の方法。
41. 【請求項４１】 野生型マウスの骨関連パラメーターに与える前記化合物の
    効果がＥＲβ−／−マウスの前記と同じパラメーターに与える効果と比較される
    請求項４０に記載の方法。
42. 【請求項４２】 請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の方法によって決
    定される化合物。