JP2002540063A - Binding partner for 5-HT5 receptor for migraine treatment - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、５−ＨＴ５受容体に対する選択的結合パートナー、かかる結合パートナーの同定及び特徴付けのための方法、特にスクリーニング法、並びに前記の結合パートナーを含有する医薬品組成物及び脳血管障害、例えば偏頭痛の治療におけるその使用に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to selective binding partners for the 5-HT5 receptor, methods for the identification and characterization of such binding partners, in particular screening methods, and pharmaceutical compositions and cerebrovascular disorders containing said binding partners, for example, It relates to its use in treating headache.
Description
【０００１】 本発明は５−ＨＴ５受容体に対する結合パートナー、このタイプの結合パート
ナーの同定及び特徴付けのための方法、並びにまたこれらを含有する医薬品組成
物及び脳血管障害、例えば偏頭痛の治療のためのその使用に関する。The present invention relates to a binding partner for the 5-HT5 receptor, a method for the identification and characterization of this type of binding partner, and also pharmaceutical compositions containing them and for the treatment of cerebrovascular disorders such as migraine. Regarding its use for.
【０００２】 少なくとも７種の異なる受容体クラスが神経伝達物質のセロトニン（５−ヒド
ロキシトリプタミン、略して５−ＨＴ）の関連に起因する多様な生理学的活性を
媒介する。国際的に認められた分類によれば、これらは５−ＨＴ１、５−ＨＴ２
、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５、５−ＨＴ６及び５−ＨＴ７で表される
。更にこれらのクラスの殆どは更に分類できる受容体型を含む。このように５−
ＨＴ１クラスは少なくとも５種のサブクラスに分けられる受容体を含み、これら
は５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｃ、５−ＨＴ１Ｄ及び５−ＨＴ１Ｅ
で表される（Boess F. G. and Martin I. L., Neuropharmacology 33:275-317 1
994）。[0002] At least seven different receptor classes mediate a variety of physiological activities due to the involvement of the neurotransmitter serotonin (5-hydroxytryptamine, abbreviated 5-HT). According to internationally accepted classifications, these are 5-HT1, 5-HT2
, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT5, 5-HT6 and 5-HT7. Furthermore, most of these classes contain receptor types that can be further classified. Thus, 5-
The HT1 class contains receptors divided into at least five subclasses, which are 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1C, 5-HT1D and 5-HT1E.
(Boess FG and Martin IL, Neuropharmacology 33: 275-317 1
994).
【０００３】 ５−ＨＴ５クラスはプラサット他（Plassat et al）によって初めて記載され
た（The EMBO Journal Vol. 11 No. 13, pp. 4779-4786 (1992)）。５−ＨＴ５
Ａ受容体及び５−ＨＴ５Ｂ受容体が区別されている（Erlander et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 90:3452-3456 (1993)）。５−ＨＴ５受容体と他の５−Ｈ
Ｔ受容体との間には僅かな配列ホモロジーしか存在しない。これらの受容体の薬
理学的プロフィールは著しく異なる。分子生物学的な技術を使用して、５−ＨＴ
５受容体の所在を嗅球、海馬、コルテックス、脳室、脳梁及び小脳に突き止める
ことができた。免疫組織学的手法によって、５−ＨＴ５受容体は原則的に星状細
胞で発現されることを示すことができた（Carson et al., GLIA 17:317-326 (19
96)）。星状細胞は、血液脳関門の脳毛細血管の基底膜に直接隣接している。異
常な星状細胞の内皮構造は血液脳関門の損失を伴う。星状細胞の厳密な意味は明
らかでない。これらは輸送作業及び結合機能を行うと考えられている。反応性の
星状細胞はかなりの病理学的な脳の変化及び神経精神障害において反応性グリオ
ーシスに関連して観察された。脳の損傷の結果として、これらはその形態を変化
させる。タンパク質発現パターンが変化し、かつ成長因子が産生される。培養し
た星状細胞におけるインビトロの調査において、５−ＨＴ５受容体に媒介される
応答を検出することができた。こうして一方ではこれらが障害後の脳の回復プロ
セスに関連することを推測すべきであるが、他方ではこれらは損傷を引き起こし
、損傷を増やす一因となることも無視すべきでない。The 5-HT5 class was first described by Prasat et al. (The EMBO Journal Vol. 11 No. 13, pp. 4779-4786 (1992)). 5-HT5
A receptor and 5-HT5B receptor have been distinguished (Erlander et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 90: 3452-3456 (1993)). 5-HT5 receptor and other 5-H
There is little sequence homology with the T receptor. The pharmacological profiles of these receptors differ markedly. Using molecular biology techniques, 5-HT
The location of the 5 receptors could be located in the olfactory bulb, hippocampus, cortex, ventricle, corpus callosum and cerebellum. Immunohistological techniques could show that the 5-HT5 receptor was expressed in principle in astrocytes (Carson et al., GLIA 17: 317-326 (19
96)). Astrocytes are directly adjacent to the basement membrane of the brain capillaries of the blood-brain barrier. Abnormal astrocyte endothelial structure is associated with loss of the blood-brain barrier. The exact meaning of astrocytes is not clear. They are believed to perform transport operations and coupling functions. Reactive astrocytes have been observed in association with reactive gliosis in considerable pathological brain changes and neuropsychiatric disorders. As a result of brain damage, they change their morphology. The protein expression pattern changes and growth factors are produced. In vitro studies on cultured astrocytes were able to detect 5-HT5 receptor mediated responses. Thus, on the one hand, it should be speculated that they are involved in the brain recovery process after the injury, but on the other hand, it should not be ignored that they cause damage and contribute to increasing damage.
【０００４】 偏頭痛は大部分の人口が患うＣＮＳ障害である。殆どの場合、何度も繰り返さ
れる頭痛が現れ、それに大雑把に見積もっても８百万人、すなわち全子供の３〜
５％、全男性の７％及び全女性の１４％が患っている。遺伝的素質も伝わるが、
原因は複雑であると考えられている（Diener H.C. et al., Arzneimitteltherap
ie 15:387-394 (1997)）。[0004] Migraine is a CNS disorder that affects most populations. In most cases, headaches are repeated over and over, and a rough estimate is 8 million, or 3 to 3 of all children.
It affects 5%, 7% of all men and 14% of all women. Genetic disposition is transmitted,
The cause is thought to be complex (Diener HC et al., Arzneimitteltherap
ie 15: 387-394 (1997)).
【０００５】 ２つの仮説が有力である。既に長く知られた血管理論（vascular theory）は
原因として内脳血管系及び外脳血管系の拡張プロセスを提案している。神経原説
は脳組織を刺激し、炎症反応に導き、こうして痛みを引き起こすであろう一定の
神経節の刺激の結果として血管作動性の神経伝達物質、原則的に神経ペプチド、
例えばサブスタンスＰ及びニューロキニンの脈管構造の軸索からの分泌に基づく
。[0005] Two hypotheses are influential. The vascular theory, which has been known for a long time, has proposed a dilation process of the inner cerebral vasculature and the outer cerebral vasculature as a cause. Neurogenesis evokes vasoactive neurotransmitters, essentially neuropeptides, as a result of the stimulation of certain ganglia that stimulate brain tissue and lead to an inflammatory response, thus causing pain.
For example, it is based on the secretion of substance P and neurokinin from the axons of the vasculature.
【０００６】 現在、依然として偏頭痛の治療のための原因治療は存在しない。現在、２種の
治療法として第一に偏頭痛発作の再発防止のための予防的治療、及び第二に発作
の間の急性症状の抑制のための対症治療が存在する。偏頭痛特異的な有効化合物
、例えばＳａｎｍｉｇｒａｎ（Ｒ）、Ｎｏｃｅｒｔｏｎ（Ｒ）、Ｄｅｓｅｒｎｉ
ｌ（Ｒ）及びＶｉｄｏｒａ（Ｒ）、また他の指標のために通常使用される有効化
合物、例えばβ−遮断薬、制吐性の有効化合物、例えばＳｉｂｅｌｉｕｍ（Ｒ） 、抗鬱薬、例えばＬａｒｏｘｙｌ（Ｒ）、又は抗てんかん性有効化合物、例えば
Ｄｅｐａｋｉｎ（Ｒ）を予防的に投与する。急性治療の過程においては、鎮痛薬
、例えばアスピリン、パラセタモール又はＯｐｔａｌｉｄｏｎ（Ｒ）、非ステロ
イド性抗炎症薬、例えばＣｅｂｕｔｉｄ（Ｒ）、Ｖｏｌｔａｒｅｎ（Ｒ）、Ｂｒ
ｕｆｅｎ（Ｒ）、Ｐｏｎｓｔｙｌ（Ｒ）、Ｐｒｏｆｅｎｉｄ（Ｒ）、Ａｐｒａｎ
ｘ（Ｒ）及びＮａｐｒｏｓｉｎ（Ｒ）が痛み及び炎症に対して投与され、かつ麦
角アルカロイド、例えば血管狭窄を誘導できるエルゴタミン、ジヒドロエルゴタ
ミン、又は５−ＨＴ１Ｄ受容体に高い親和性を有するトリプタンファミリーの物
質、例えばスマトリプタン、Ｎａｒａｍｉｇ（Ｒ）及びＡｓｃｏＴｏｐ（Ｒ）が
投与される。後者の物質はアゴニストとして作用し、血管拡張をブロックする。[0006] Currently, there is still no causal treatment for the treatment of migraine. Currently, there are two types of treatment, firstly prophylactic treatment to prevent recurrence of migraine attacks and secondly symptomatic treatment to control acute symptoms during attacks. Migraine-specific active compounds, for example Sanmigran (R), Nocerton (R ), Deserni
l (R) and Vidora (R), also active compounds normally used for other indicators, for example, β- blockers, active compounds of the braking吐性, e.g. Sibelium (R), antidepressants, for example Laroxyl (R ), or anti-epileptic active compound administered, for example Depakin the (R) prophylactically. In the course of acute treatment, analgesics, such as aspirin, paracetamol or Optalidon (R), non-steroidal anti-inflammatory drugs, for example Cebutid (R), Voltaren (R ), Br
ufen (R) , Ponstyl (R) , Profenid (R) , Apran
x (R) and Naprosin (R) are administered for pain and inflammation, and substances of the ergot alkaloids, such as ergotamine, dihydroergotamine, which are capable of inducing vascular stenosis, or a triptan family having a high affinity for the 5-HT1D receptor, For example sumatriptan, Naramig (R) and AscoTop (R) is administered. The latter act as agonists and block vasodilation.
【０００７】 しかしながら挙げられる有効化合物は偏頭痛の治療のために最適ではない。非
オピオイド鎮痛薬はしばしば副作用を有する。強力な末梢血管拡張の結果として
、麦角アルカロイドの作用の複雑なメカニズムが副作用、例えば高血圧及び壊疽
を引き起こす。トリプタンファミリーに属する化合物は完全に満足のいくような
ものではない（Pfaffenrath V., Muench. med. Wschr. 625-626 (1998)）。However, the active compounds mentioned are not optimal for the treatment of migraine. Non-opioid analgesics often have side effects. As a result of strong peripheral vasodilation, a complex mechanism of action of ergot alkaloids causes side effects such as hypertension and gangrene. Compounds belonging to the triptan family are not entirely satisfactory (Pfaffenrath V., Muench. Med. Wschr. 625-626 (1998)).
【０００８】 スマトリプタン（Ｉｍｉｇｒａｎ（Ｒ））、急性偏頭痛発作に対する最も効果
的かつ頻繁に使用される有効化合物は顕著な親水性のため血管脳関門を通過しな
い。患者の２８％においては、この有効化合物は効果的でなく、かつ５０〜１０
０ｍｇの経口用量は非常に多い。知られている禁忌は冠状血管痙攣、高血圧、腎
疾患及び肝疾患である。[0008] Sumatriptan (Imigran (R)), the most effective and active compound which is frequently used for acute migraine attacks does not pass through the blood-brain barrier for the outstanding hydrophilicity. In 28% of patients, the active compound is not effective and 50 to 10
The 0 mg oral dose is very high. Known contraindications are coronary vasospasm, hypertension, kidney disease and liver disease.
【０００９】 今に至るまで、５−ＨＴ１受容体に対する選択的な親和性を有する化合物は偏
頭痛の治療のために考慮されてきた（Goadsby P.J., CNS Drugs 10:271-286 (19
98); Saxena P. R., Exp. Opin. Invest. Drugs 581-593 (1996)）。例えばスマ
トリプタンは５−ＨＴ１Ｄ受容体に対する非常に選択的なリガンドとして数えら
れ、そのため、業界ではこれらの結合特性及びそれによって媒介される血管収縮
活性を最適化させることに時間が費やされている。その幾つかは５−ＨＴ１Ｂ受
容体リガンド及び５−ＨＴ１Ｆ受容体リガンドに当てはまる。こうして一連の有
効化合物が開発されたが、概説した問題を改善することは不可能であった。To date, compounds with a selective affinity for the 5-HT1 receptor have been considered for the treatment of migraine (Goadsby PJ, CNS Drugs 10: 271-286 (19
98); Saxena PR, Exp. Opin. Invest. Drugs 581-593 (1996)). For example, sumatriptan is counted as a very selective ligand for the 5-HT1D receptor, so the industry spends time optimizing these binding properties and the vasoconstrictor activity mediated thereby. . Some of them apply to 5-HT1B receptor ligands and 5-HT1F receptor ligands. A series of active compounds has thus been developed, but it has not been possible to ameliorate the problems outlined.
【００１０】 従って、本発明の課題は、適当な効率をもって、かつ副作用を殆ど有さずに偏
頭痛様の脳血管障害を急性治療（acute treatment）することを可能にすること
である。[0010] It is therefore an object of the present invention to make it possible to acutely treat migraine-like cerebrovascular disorders with adequate efficiency and with few side effects.
【００１１】 意想外にも、５−ＨＴ５受容体に対して比較的高い結合親和性を有する物質が
所望の効果を提供できることが判明した。It has surprisingly been found that substances having a relatively high binding affinity for the 5-HT5 receptor can provide the desired effect.
【００１２】 従って、本発明は５−ＨＴ５受容体に対する選択的結合パートナーに関し、そ
の５−ＨＴ５受容体に対する結合親和性は５−ＨＴ５以外の１種以上の５−ＨＴ
受容体に対するものよりも大きい。[0012] Accordingly, the present invention relates to a selective binding partner for the 5-HT5 receptor, wherein the binding affinity for the 5-HT5 receptor is one or more of 5-HT5 other than 5-HT5.
Larger than for the receptor.
【００１３】 用語“５−ＨＴ５受容体に対する結合パートナー”は５−ＨＴ５受容体に結合
する物質を記載しており、従って５−ＨＴ５受容体リガンドとも呼ぶことができ
る。The term “binding partner for the 5-HT5 receptor” describes a substance that binds to the 5-HT5 receptor, and thus can also be called a 5-HT5 receptor ligand.
【００１４】 または金属錯体のような配位結合を有する。前記の可逆的な分子相互作用の他
に、結合パートナーと受容体間の不可逆的な相互作用、例えば共有結合も可能で
ある。Alternatively, it has a coordination bond such as a metal complex. In addition to the reversible molecular interactions described above, irreversible interactions between the binding partner and the receptor, such as covalent bonds, are also possible.
【００１５】 選択性は、結合パートナーの、有利には５−ＨＴ５受容体に結合する特性と解
されるべきである。[0015] Selectivity is to be understood as the property of a binding partner, advantageously binding to the 5-HT5 receptor.
【００１６】 このように、結合パートナーは５−ＨＴ５受容体に対して結合親和性を有し、
これらは５−ＨＴ５以外の１種以上の５−ＨＴ受容体、すなわち前記の５−ＨＴ
受容体クラス、５−ＨＴ１、５−ＨＴ２、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、５−ＨＴ６
及び５−ＨＴ７に割り当てられるべき受容体に対するよりも大きい。５−ＨＴ５
受容体に対する結合パートナーの結合親和性が５−ＨＴ５以外の５−ＨＴ受容体
のそれよりも高い場合、５−ＨＴ５以外の５−ＨＴ受容体に対して、これらの結
合パートナーが５−ＨＴ５受容体により選択的に結合するといえる。特定の結合
パートナーは、５−ＨＴ５受容体に対する結合親和性が少なくとも１種及び、特
に全ての５−ＨＴ１受容体、特に５−ＨＴ１Ｄ受容体および／または５−ＨＴ１
Ｂ受容体に対するより大きいものである。５−ＨＴ５受容体に対する結合親和性
が５−ＨＴ５以外の全ての５ＨＴ受容体に対するよりも大きい結合パートナーは
本発明による他の特定の結合パートナーのクラスである。Thus, the binding partner has a binding affinity for the 5-HT5 receptor,
These are one or more 5-HT receptors other than 5-HT5, ie, the aforementioned 5-HT receptors.
Receptor class, 5-HT1, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT6
And 5-HT7 for the receptor to be assigned. 5-HT5
If the binding affinity of the binding partners for the receptor is higher than that of the 5-HT receptors other than 5-HT5, then for those 5-HT receptors other than 5-HT5, these binding partners will It can be said that it is selectively bound by the body. Particular binding partners have at least one binding affinity for the 5-HT5 receptor and in particular all 5-HT1 receptors, in particular the 5-HT1D receptor and / or 5-HT1
Greater for the B receptor. Binding partners whose binding affinity for the 5-HT5 receptor is greater than for all 5HT receptors other than 5-HT5 are another particular class of binding partners according to the invention.
【００１７】 前記に概説した選択性に関しては、一方では５−ＨＴ５受容体に対する及び他
方では５−ＨＴ５以外の１種以上の５−ＨＴ受容体に対する結合親和性が十分に
異なることが重要である。親和性の差異は、少なくとも２、より有利には少なく
とも５，特に有利には少なくとも１０、有利には少なくとも２０、特に有利には
少なくとも５０及び特に少なくとも１００の結合親和性比が存在すると有利であ
る。With regard to the selectivities outlined above, it is important that the binding affinities on the one hand to the 5-HT5 receptor and on the other hand to one or more 5-HT receptors other than 5-HT5 are sufficiently different. . The affinity difference is advantageously such that a binding affinity ratio of at least 2, more advantageously at least 5, particularly advantageously at least 10, advantageously at least 20, particularly advantageously at least 50 and especially at least 100 is present. .
【００１８】 １つの態様によれば、本発明による結合パートナーは比較結合パートナー、例
えば５−ＨＴ（５−ヒドロキシトリプタミン）又は５−ＣＴ（５−カルボキシア
ミドトリプタミン）が５−ＨＴ５受容体に結合するのを競合的に阻害する。According to one embodiment, the binding partner according to the invention is a comparative binding partner, for example 5-HT (5-hydroxytryptamine) or 5-CT (5-carboxamidotryptamine) binds to the 5-HT5 receptor. Competitively.
【００１９】 競合阻害とは本発明による結合パートナーが比較結合パートナー、有利には５
−ＨＴ又は５−ＣＴと、受容体への結合に関して競合する、すなわち１つが結合
するとその他の結合が妨害されると解されるべきである。Competition inhibition means that the binding partner according to the invention is a comparative binding partner, preferably 5
It should be understood that -HT or 5-CT compete for binding to the receptor, i.e., binding of one interferes with the other.
【００２０】 他の態様によれば、本発明による結合パートナーは比較結合パートナー、例え
ば５−ＨＴ（５−ヒドロキシトリプタミン）又は５−ＣＴ（５−カルボキシアミ
ドトリプタミン）が５−ＨＴ５受容体に結合するのを非競合的に阻害する。According to another aspect, the binding partner according to the invention is a comparative binding partner, for example 5-HT (5-hydroxytryptamine) or 5-CT (5-carboxamidotryptamine) binds to the 5-HT5 receptor. Non-competitively.
【００２１】 非競合阻害は、本発明による結合パートナーが比較結合パートナー、有利には
例えば５−ＨＴまたは５−ＣＴの結合を変え、特にその結合親和性をその受容体
への結合を介して低減させることを意味すると解されるべきである。Non-competitive inhibition means that the binding partner according to the invention alters the binding of a comparative binding partner, advantageously for example 5-HT or 5-CT, and in particular reduces its binding affinity via its binding to its receptor Should be understood to mean
【００２２】 少なくとも競合阻害、すなわち可逆的結合の場合には、１つの結合パートナー
の他のものへの置き換えが受容体に関して、一方の結合親和性が低減するか、ま
たは他方の結合親和性が増加するのに伴い増大するという原理を利用している。
。更に適当には、従って本発明により使用できる結合パートナーは５−ＨＴ５受
容体に対して高い結合親和性を有する。このタイプの結合親和性は一方では５−
ＨＴ５受容体に対する天然産生結合パートナー、例えばセロトニン（５−ヒドロ
キシトリプタミン、５−ＨＴ）それ自体の効果的な置き換えを可能にし、その際
、本発明により使用できる結合パートナーの、この結合パートナーの一定の量が
５−ＨＴ５受容体に結合するために必要な濃度は結合親和性の増加とともに減少
する。医療での使用に関しては、結合パートナーは従って有利であり、その結合
親和性はこれらを有効化合物として効果的な医学的治療の過程で調節可能な量で
投与できることが優れている。本発明による結合パートナーは従って有利には約
０．０１〜１００ｍｇ／体重のｋｇ及び、特に非経口投与の場合は０．１〜１５
ｍｇ／体重のｋｇ及び経口投与の場合には１〜３０ｍｇ／体重のｋｇの日用量で
投与される。[0022] At least in the case of competitive inhibition, ie reversible binding, replacement of one binding partner by another reduces the binding affinity of one for the receptor or increases the binding affinity of the other It utilizes the principle that it increases as you do.
. More suitably, therefore, the binding partners which can be used according to the invention have a high binding affinity for the 5-HT5 receptor. This type of binding affinity on the other hand is 5-
It allows the efficient replacement of naturally occurring binding partners for the HT5 receptor, such as serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) itself, whereby certain of the binding partners which can be used according to the invention The concentration required for the amount to bind to the 5-HT5 receptor decreases with increasing binding affinity. For use in medicine, the binding partners are therefore advantageous, and their binding affinity is excellent in that they can be administered as active compounds in an amount which can be adjusted in the course of an effective medical treatment. The binding partner according to the invention is therefore advantageously of about 0.01 to 100 mg / kg of body weight and in particular for parenteral administration 0.1 to 15
The daily dose of mg / kg of body weight and 1 to 30 mg / kg of body weight in case of oral administration.
【００２３】 ５０％の別の比較結合パートナーを受容体結合部位から追い出す本発明による
結合パートナーの濃度（ＩＣ５０値）をインビトロで測定する前記に参照した競
合試験は結合親和性を表現する１つの可能性を提供する。こうして５−ＣＴの５
−ＨＴ５受容体への結合の競合阻害を、有利には本発明により使用できる結合パ
ートナーが１０- ７Ｍ未満、有利には１０- ８Ｍ未満、特に１０- ９Ｍ未満の半最
大阻害定数（half-maximal inhibition）ＩＣ５０を有するという趣旨で評価す
ることができる。The competition test referred to above, which measures in vitro the concentration (IC 50 value) of a binding partner according to the invention, which drives off 50% of another comparative binding partner from the receptor binding site, is one of the ones that express binding affinity. Offer the possibility. Thus, 5-CT5
-HT5 binding of competitive inhibition to the receptor, preferably binding partner 10 which can be used according to the invention - less than 7 M, preferably 10 - 8 M less, particularly 10 - 9 M less than half maximal inhibition constant ( can be evaluated the effect that with a half-maximal inhibition) IC 50.
【００２４】 本発明による結合パートナーの結合親和性を阻害定数Ｋｉによって表現でき、
これは一般に競合試験を使用して同様に測定される。５−ＨＴ５受容体の結合の
ために、本発明による結合パートナーは、有利には１０- ８Ｍ未満、有利には１
０- ９Ｍ未満及び、特に１０- １０Ｍ未満のＫｉ値を有する。本発明による化合物
のＫｉ値は、例えば１・１０- ７Ｍ〜７・１０- ７Ｍの範囲であるか、又は１・１
０- ８Ｍ〜１・１０- ７Ｍの範囲内である。The binding affinity of the binding partner according to the invention can be expressed by an inhibition constant K i ,
This is generally measured similarly using competition tests. For 5-HT5 receptor binding, binding partners according to the invention is advantageously 10 - less than 8 M, preferably 1
0 - less than 9 M and, in particular, 10 - with a 10 K i value of less than M. K i values for the compounds according to the invention, for example, 1 · 10 - 7 M~7 · 10 - or in the range of 7 M, or 1-1
0 - 8 M~1 · 10 - 7 are within the scope of the M.
【００２５】 更なる態様によれば、本発明による結合パートナーは、５−ＨＴ５以外の１種
以上の５−ＨＴ受容体に対して、前記の有利な結合親和性を有する５−ＨＴ５受
容体により選択的に結合する。According to a further aspect, the binding partner according to the invention is provided by a 5-HT5 receptor having an advantageous binding affinity as described above for one or more 5-HT receptors other than 5-HT5. Selectively combine.
【００２６】 更なる態様によれば、本発明による結合パートナーは５−ＨＴ５以外の全ての
５−ＨＴ受容体に対して、前記の有利な結合親和性を有する５−ＨＴ５受容体に
より選択的に結合する。According to a further aspect, the binding partner according to the invention is selective for all 5-HT receptors other than 5-HT5 by means of a 5-HT5 receptor having said favorable binding affinity. Join.
【００２７】 前記の親和性及び選択性を伴ってグリア細胞及び特に星状細胞で発現される５
−ＨＴ５受容体に結合する結合パートナーが特に有利である。5 expressed in glial cells and especially astrocytes with the affinity and selectivity described above
Particularly preferred are binding partners that bind to the -HT5 receptor.
【００２８】 本発明よれば、ヒトの受容体の変異体は、本発明により使用される結合パート
ナーのための有利なターゲットである。According to the invention, variants of the human receptor are advantageous targets for the binding partners used according to the invention.
【００２９】 本発明による結合パートナーの５−ＨＴ５受容体への結合はエフェクター機能
に結びつくものである。結合パートナーはアゴニスト的又はアンタゴニスト的に
、かつ部分的にアゴニスト的に又は部分的にアンタゴニスト的に作用する。The binding of the binding partner according to the invention to the 5-HT5 receptor is linked to effector functions. The binding partner acts agonistically or antagonistically and partially agonistically or partially antagonistically.
【００３０】 アゴニストは、完全に又は部分的に５−ＨＴ５受容体での５−ＨＴ活性に似て
いる本発明による化合物とする。Agonists are compounds according to the invention that mimic wholly or partly 5-HT activity at the 5-HT5 receptor.
【００３１】 アンタゴニストは５−ＨＴ５受容体での５−ＨＴのアゴニスト活性をブロック
することができる本発明による化合物とする。An antagonist is a compound according to the invention capable of blocking the agonist activity of 5-HT at the 5-HT5 receptor.
【００３２】 本発明の特定の態様によれば、５−ＨＴ５アゴニストは結合パートナーとして
提供される。表現“５−ＨＴ５アゴニスト”は部分的ないし完全にアゴニスト作
用を誘導する結合パートナーを示す。５−ＨＴ５受容体で部分的にアゴニスト作
用を誘導する結合パートナーは本発明による十分なアゴニスト活性を有するので
、効果的な医学的治療の過程において調節可能な量で投与するのを可能にする。
この態様に関連する有利な結合パートナーは少なくとも５０％のアゴニスト作用
を有するものである。特に有利な結合パートナーは少なくとも８０％のアゴニス
ト作用を有するものであり、かつ特に実質的に完全なアゴニスト作用を有する（
Ｅｍａｘ）ものである。According to a particular aspect of the present invention, a 5-HT5 agonist is provided as a binding partner. The expression "5-HT5 agonist" denotes a binding partner that induces a partial or complete agonist effect. A binding partner that induces partial agonist action at the 5-HT5 receptor has sufficient agonist activity according to the present invention, allowing it to be administered in an adjustable amount in the course of an effective medical treatment.
Advantageous binding partners associated with this embodiment are those that have at least 50% agonistic effect. Particularly advantageous binding partners are those that have at least 80% of agonistic activity, and in particular have substantially complete agonistic activity (
E max ).
【００３３】 本発明の特定の態様によれば、少なくともｈ５−ＨＴ５をトランスフェクショ
ンさせたＣＨＯ細胞の５−ＨＴ５受容体への結合が膜結合Ｇタンパク質に結合す
るＧＴＰの刺激、細胞内カルシウム濃度のアゴニストに誘導される変化、ホスホ
リパーゼＣ活性の誘導および／またはｃＡＭＰ産生のアゴニストに誘導される変
化をもたらす結合パートナーを得ることを可能にする。細胞内のカルシウム濃度
の変化が考慮される限り、細胞内カルシウム濃度の増大をもたらす結合パートナ
ーの使用は本発明の特定の態様である。According to a particular aspect of the present invention, the binding of at least h5-HT5 transfected CHO cells to the 5-HT5 receptor stimulates GTP binding to membrane-bound G protein, reducing intracellular calcium concentration. It makes it possible to obtain a binding partner which results in an agonist-induced change, an induction of phospholipase C activity and / or an agonist-induced change in cAMP production. The use of a binding partner that results in an increase in intracellular calcium concentration is a particular aspect of the invention, as long as changes in intracellular calcium concentration are considered.
【００３４】 また本態様は脳血管障害の公知の動物モデル、特に偏頭痛のための動物モデル
において活性であり、かつ／又は脳領域で一定のインビボ作用、特に脳内のゲノ
ム応答、例えば転写因子、例えばｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｚｉｆ２６９又はＨ
ｏｍｅｒ遺伝子のイソ型（Brakeman P.R. et al., Nature 386:284-288 (1997)
）の発現を誘導する結合パートナーを含む。The present embodiments are also active in known animal models of cerebrovascular disorders, especially for migraine, and / or have certain in vivo effects in brain regions, especially genomic responses in the brain, such as transcription factors. E.g., c-fos, c-jun, zif269 or H
isoform of the omer gene (Brakeman PR et al., Nature 386: 284-288 (1997)
)).
【００３５】 有利な結合パートナーは、そのエフェクター機能に関しても前記の認識で５−
ＨＴ５受容体に選択的なものである。[0035] Advantageous binding partners are also known from the above recognition as to their effector functions.
It is selective for the HT5 receptor.
【００３６】 １つの態様によれば、５−ＨＴ５結合パートナーは低分子量であり、通常は合
成化合物である。According to one embodiment, the 5-HT5 binding partner is of low molecular weight, usually a synthetic compound.
【００３７】 更なる態様によれば、本発明による５−ＨＴ５結合パートナーは５−ＨＴ５特
異抗体である。これらはポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、抗体断片
、例えばＦ（ａｂ）、Ｆｃなど、キメラ抗体及び組み換え抗体である。かかる抗
体は自体公知の方法で製造できる。使用される免疫原は５−ＨＴ５受容体自体又
は抗原断片、一般に慣用の担体タンパク質にカップリングされた断片であってよ
い。According to a further aspect, the 5-HT5 binding partner according to the invention is a 5-HT5 specific antibody. These are polyclonal antisera, monoclonal antibodies, antibody fragments, such as F (ab), Fc, etc., chimeric antibodies and recombinant antibodies. Such an antibody can be produced by a method known per se. The immunogen used may be the 5-HT5 receptor itself or an antigenic fragment, generally a fragment coupled to a conventional carrier protein.
【００３８】 更なる態様によれば、本発明による５−ＨＴ５結合パートナーはアプタマー、
すなわち５−ＨＴ５受容体に対して十分な親和性を有する核酸、一般にはオリゴ
ヌクレオチドである。According to a further aspect, the 5-HT5 binding partner according to the invention is an aptamer,
That is, it is a nucleic acid having a sufficient affinity for the 5-HT5 receptor, generally an oligonucleotide.
【００３９】 本発明による結合パートナーの５−ＨＴ５受容体への結合親和性の測定のため
のアッセイは原則的に公知である。これは、例えば比較結合パートナーの５−Ｈ
Ｔ５受容体への結合の、調査されるべき物質による競合阻害を評価することによ
って実施できる。適当な結合パートナーは５−ＨＴ受容体に対する公知のリガン
ド、例えば５−ＨＴ又は５−ＣＴ又はＬＳＤである。これらは適宜に、これらの
５−ＨＴ受容体への結合を標準的な方法を使用して分析的にモニターできるよう
に標識する。５−ＨＴ５受容体での結合研究の場合には、５−ＣＴ又はＬＳＤ、
特に［３Ｈ］−ＬＳＤを本発明によれば使用する。結合親和性は半最大阻害定数
ＩＣ５０又は阻害定数Ｋｉとして表現できる。この方法は、有利には一次スクリ
ーニングのために使用される。ＳＰＡ又はフラッシュプレート技術（FlashPlate
technology）が有利には使用される。Assays for measuring the binding affinity of a binding partner according to the invention to the 5-HT5 receptor are known in principle. This is for example the comparative binding partner 5-H
This can be done by assessing the competitive inhibition of binding to the T5 receptor by the substance to be investigated. Suitable binding partners are known ligands for the 5-HT receptor, for example 5-HT or 5-CT or LSD. They are suitably labeled so that their binding to the 5-HT receptor can be monitored analytically using standard methods. For binding studies at the 5-HT5 receptor, 5-CT or LSD,
In particular, [ 3 H] -LSD is used according to the invention. Binding affinity can be expressed as a half-maximal inhibition constant IC 50 or inhibition constant K i. This method is advantageously used for primary screening. SPA or FlashPlate technology
technology) is advantageously used.
【００４０】 調査されるべき結合パートナーへの結合を５−ＨＴ受容体上で直接測定するこ
ともできる。結合親和性を表現する阻害定数Ｋｉは、例えば測熱的に、すなわち
放出される結合エネルギーの測定によって決定できる。The binding to the binding partner to be investigated can also be measured directly on the 5-HT receptor. The inhibition constant K i describing the binding affinity can be determined, for example, thermometrically, ie by measuring the released binding energy.
【００４１】 選択性の測定のために、他の５−ＨＴ受容体に関して調査されるべき結合パー
トナーの結合親和性を同様に（所望であればそれぞれの受容体に特異的なリガン
ドを使用して）測定し、かつ得られた値を比較する。For the determination of selectivity, the binding affinities of the binding partners to be investigated for the other 5-HT receptors can likewise be determined (if desired using ligands specific for the respective receptor). ) Measure and compare the values obtained.
【００４２】 またエフェクター機能を、公知の機能的アッセイを使用してインビトロ及びイ
ンビボの両者で定性的又は定量的に評価することもできる。[0042] Effector function can also be assessed qualitatively or quantitatively, both in vitro and in vivo, using known functional assays.
【００４３】 アゴニスト活性の評価は、５−ＨＴの５−ＨＴ５受容体への結合によって惹起
される全ての前記の効果に基づいてよい。本発明によれば細胞内カルシウム濃度
、ホスホリパーゼＣ活性および／またはｃＡＭＰ産生におけるＧＴＰのＧタンパ
ク質への結合の作用を評価することが有利である。これらの方法は、有利には二
次スクリーニングのために使用される。また本願でもＳＰＡ又はフラッシュ技術
が有利に使用される。Evaluation of agonist activity may be based on any of the aforementioned effects elicited by the binding of 5-HT to the 5-HT5 receptor. According to the present invention, it is advantageous to assess the effect of GTP binding to G protein on intracellular calcium concentration, phospholipase C activity and / or cAMP production. These methods are advantageously used for secondary screening. Also in this application, SPA or flash technology is advantageously used.
【００４４】 Ｇタンパク質に結合するＧＴＰはＧＴＰの加水分解不可能な類似体、例えば［ ３５ Ｓ］ＧＴＰγＳを使用することによって調査でき、その結合は放射線学的に
調査できる。この調査は有利には５−ＨＴ５受容体を有する膜上で実施される。GTP binding to G proteins is a non-hydrolysable analog of GTP, such as [ 35 [S] GTPγS and its binding can be determined radiologically.
Can investigate. The investigation is advantageously performed on a membrane having the 5-HT5 receptor.
【００４５】 細胞内カルシウム濃度の測定のために、適当なカルシウムプローブ、一般にカ
ルシウムキレート、例えば蛍光性化合物、例えばＦｕｒａ ２−アセチルメチル
エステル又はＦｌｕｏ−３−ＡＭを使用できる、この調査は有利には５−ＨＴ５
受容体を有する細胞培養中、特に個々の細胞中で実施できる。For the measurement of intracellular calcium concentration, a suitable calcium probe, generally a calcium chelate, such as a fluorescent compound, such as Fura 2-acetylmethyl ester or Fluo-3-AM, can be used. 5-HT5
It can be carried out in cell culture with the receptor, in particular in individual cells.
【００４６】 ホスホリパーゼＣ活性はその触媒反応、例えば検出目的のために有利には［３ Ｈ］−ミオイノシトールとして放射線標識されたミオイノシトールの混入又はＰ
ＰＩＰ２のＩＰ３への反応によって測定でき、その際、有利にはＰＰＩＰ２は［ ３２ Ｐ］ＰＩＰ２として放射線標識されている。これらの調査は、有利には５−
ＨＴ５受容体を有する個々の細胞で実施する。The phospholipase C activity is preferably determined for its catalytic reaction, eg for detection purposes [3 H] -contamination of myo-inositol radiolabeled as myo-inositol or P
PIP2IP3To PPIP, preferably with PPIP2Is [ 32 P] PIP2As a radiolabel. These studies are advantageously
Performed on individual cells with the HT5 receptor.
【００４７】 ｃＡＭＰ産生はｃＡＭＰ結合タンパク質を使用して測定できる。この調査は有
利には５−ＨＴ５受容体を有する個々の細胞で実施される。[0047] cAMP production can be measured using a cAMP binding protein. This investigation is advantageously performed on individual cells having the 5-HT5 receptor.
【００４８】 適当であれば、エフェクター機能、すなわち本発明による結合パートナーの、
他の５−ＨＴ受容体に対する活性を測定する。これは適宜に５−ＨＴ５と他の５
−ＨＴ受容体に関して測定される結合親和性を考慮して、すなわち選択性を考慮
して実施される。If appropriate, the effector function, ie of the binding partner according to the invention,
Activity on other 5-HT receptors is measured. This can be done with 5-HT5 and other 5
-Is performed taking into account the binding affinity measured for the HT receptor, ie taking into account the selectivity.
【００４９】 従って本発明は本発明による結合パートナーの同定及び特徴付けのための方法
に関する。前記の、かつ他の同様に適当な方法はインビトロスクリーニング法の
ための基礎を形成してよく、該方法によって多くの種々の化合物から、将来の使
用に関して最も有望だと思われるものを選択することができる。例えば組合せ化
学によって無数の潜在的な有効化合物からなる大規模な物質バンクを作成するこ
とができる。所望の活性を有する物質に関する組合せ物質ライブラリーの構築は
自動化できる。スクリーニングロボットを個々のアッセイの効率的な分析のため
に使用でき、これらは有利にはマイクロタイタープレート上で編成される。こう
して本発明はスクリーニング法、すなわち一次スクリーニング法及び二次スクリ
ーニング法の両者に関し、該方法においては、有利には前記の方法の少なくとも
１つが使用される。幾つかの方法を使用する場合、異なる時間で、又は１つの同
じ試料において同時にか、又は調査されるべき物質の異なる試料で実施できる。The invention therefore relates to a method for the identification and characterization of a binding partner according to the invention. These and other equally suitable methods may form the basis for in vitro screening methods by which to select from a number of different compounds that are likely to be most promising for future use. Can be. For example, combinatorial chemistry can create large substance banks of countless potential active compounds. Construction of a combinatorial substance library for substances having the desired activity can be automated. Screening robots can be used for efficient analysis of individual assays, which are advantageously organized on microtiter plates. The invention thus relates to screening methods, both primary and secondary screening methods, wherein at least one of the above-mentioned methods is advantageously used. If several methods are used, they can be performed at different times or simultaneously in one and the same sample or with different samples of the substance to be investigated.
【００５０】 この種の方法を実施するために特に有用な技術は、シンチレーション近接アッ
セイ（sintillation Proximity Assay）、略してＳＰＡであり、これは有効化合
物スクリーニングの分野では公知である。このアッセイを実施するためのキット
及び構成材料は、例えばアマシャム ファルマシア バイオテク（Amersham Pharm
acia Biotech）から市販されている。原則的に可溶化または膜結合された受容体
はシンチレーターを有する小さな微小球上に固定される。例えばラジオリガンド
が、固定化された受容体に結合する場合、シンチレーターが励起されて発光し、
シンチレーターとラジオリガンド間の空間的近接（spatial proximity）が与え
られる。A particularly useful technique for performing such methods is the Scintillation Proximity Assay, or SPA for short, which is known in the field of active compound screening. Kits and components for performing this assay are available, for example, from Amersham Pharmacia Biotech.
acia Biotech). In principle, the solubilized or membrane-bound receptor is immobilized on small microspheres with scintillators. For example, when a radioligand binds to an immobilized receptor, the scintillator is excited to emit light,
Spatial proximity between the scintillator and the radioligand is provided.
【００５１】 前記のタイプの方法を実施するための他の特に効果的な技術は有効化合物スク
リーニングの分野で公知のＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（Ｒ）技術である。このアッセ
イを実施するためのキット及び構成材料は、例えばＮＥＮ（Ｒ）ライフサイエン
スプロダクツ（Life Science Products）から市販されている。この原理は同様
にシンチレーターで被覆されたマイクロタイタープレート（９６ウェル又は３８
４ウェル）をベースとしている。[0051] Another particularly effective technique for implementing the types of methods are known in FlashPlate (R) technology in the field of active compound screening. Kits and construction materials for carrying out this assay is commercially available for example from NEN (R) Life Science Products (Life Science Products). This principle also applies to microtiter plates (96 wells or 38 wells) coated with scintillators.
4 wells).
【００５２】 前記のアッセイは原則的に当業者に公知である。The above assays are known in principle to the person skilled in the art.
【００５３】 本発明による第一の方法は、５−ＨＴ５受容体に対する結合パートナーの親和
性および／または選択性の測定のために使用される。この目的のために結合パー
トナーを５−ＨＴ５受容体に接触させ、結合親和性を測定する。The first method according to the invention is used for measuring the affinity and / or selectivity of a binding partner for the 5-HT5 receptor. For this purpose, the binding partner is contacted with the 5-HT5 receptor and the binding affinity is determined.
【００５４】 本発明による他の方法は５−ＨＴ５受容体に対する結合パートナーの活性、す
なわちアゴニスト作用、部分的なアゴニスト作用、アンタゴニスト作用および／
または部分的なアンタゴニスト作用の測定に関する。この目的のために結合パー
トナーを５−ＨＴ５受容体に接触させ、結合によってもたらされる効果を評価す
る。Another method according to the present invention relates to the activity of a binding partner for the 5-HT5 receptor, ie agonistic, partial agonistic, antagonistic and / or
Or for the measurement of partial antagonism. For this purpose, the binding partner is contacted with the 5-HT5 receptor and the effect produced by the binding is evaluated.
【００５５】 有利な態様によれば、結合パートナーに、前記の［３Ｈ］−５−ＣＴ又は［３ Ｈ］−ＬＳＤ競合試験を使用してそれらの５−ＨＴ５受容体への結合親和性を測
定することによって一次スクリーニングを実施する。１０- ６Ｍ未満の範囲内の
阻害定数ＩＣ５０を有する結合パートナーに、次いで前記のようにそのエフェク
ター機能を評価することによって、特にＧＴＰ結合および／または細胞内カルシ
ウム濃度に関して二次スクリーニングを実施する。最後に、前記のようにして選
択された結合パートナーに、実質的に前記のように（場合によりそれぞれの受容
体に特異的なリガンドを使用して）他の５−ＨＴ受容体へのそれらの結合親和性
を測定することによって選択性の測定のために対向スクリーニング（counter-sc
reening）を実施する。例えば［３Ｈ］−８−ヒドロキシジプロピルアミノテト
ラリン（［３Ｈ］−８−ＤＰＡＴ）を５−ＨＴ１Ａ受容体への結合研究のために
使用でき、一方５−ＨＴ１Ｂ及び５−ＨＴ１Ｄ受容体は［３Ｈ］−５−ＣＴを使
用して調査できる。According to an advantageous embodiment, the binding partners have their binding affinity to the 5-HT5 receptor using the [ 3 H] -5-CT or [ 3 H] -LSD competition test described above. Primary screening is performed by measuring. 10 - 6 binding partner having an inhibition constant IC 50 of the range of less than M, by evaluating its effector function as described above is then carried out secondary screening for particular GTP binding and / or intracellular calcium concentration . Finally, the binding partners selected in the manner described above are provided with their binding to other 5-HT receptors substantially as described above (optionally using ligands specific for the respective receptor). Counter-screen (counter-sc) for determination of selectivity by measuring binding affinity
reening). For example, [ 3 H] -8-hydroxydipropylaminotetralin ([ 3 H] -8-DPAT) can be used for binding studies to the 5-HT1A receptor, while the 5-HT1B and 5-HT1D receptors are [ 3 H] -5-CT can be used to investigate.
【００５６】 ５−ＨＴ５受容体は、有利には細胞系の形において、すなわち５−ＨＴ５受容
体を有する膜、細胞、細胞コロニー、組織又は器官の形で得ることを可能にする
。この種の細胞系は元々５−ＨＴ５受容体を発現できるが、これらは適当な遺伝
子操作、例えばトランスフェクションによって５−ＨＴ５を発現するように誘導
することもできる。ｈ５−ＨＴ５に関する本発明の有利な態様に関しては、Ｒｅ
ｅｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３３５：２４２-２４６（１９
９４）に記載されるコーディング配列を特にこのために使用できる（アクセッシ
ョン番号Ｘ８１４１１）。ヒトのグリオーマ細胞系統は５−ＨＴ５受容体を有す
る天然細胞系として有利である。ｈ５−ＨＴ５をトランスフェクションさせた異
種細胞系統のうち、ｈ５−ＨＴ５遺伝子を発現するものが有利である。例えばｈ
５−ＨＴ５をトランスフェクションさせたＣＨＯ細胞、ｈ５−ＨＴ５をトランス
フェクションされたヒトの腎臓細胞、特にｈ５−ＨＴ５をトランスフェクション
されたＨＥＫ２９３細胞又はｈ５−ＨＴ５をトランスフェクションされたＣ−６
グリオーマ細胞が挙げられる。The 5-HT5 receptor advantageously makes it possible to obtain it in the form of a cell line, ie in the form of a membrane, a cell, a cell colony, a tissue or an organ having the 5-HT5 receptor. Although such cell lines are naturally capable of expressing the 5-HT5 receptor, they can also be induced to express 5-HT5 by appropriate genetic manipulation, such as transfection. For an advantageous embodiment of the invention relating to h5-HT5, see Re.
es S.S. et al, FEBS Letters 335: 242-246 (19
94) can be used especially for this (accession number X81411). The human glioma cell line is advantageous as a natural cell line with the 5-HT5 receptor. Of the heterologous cell lines transfected with h5-HT5, those expressing the h5-HT5 gene are advantageous. For example, h
5-HT5 transfected CHO cells, h5-HT5 transfected human kidney cells, especially h5-HT5 transfected HEK293 cells or h5-HT5 transfected C-6
Glioma cells.
【００５７】 本発明による結合パートナーの選択性、親和性及び活性を測定するために、ま
た脳組織切片及び脳の一部からの自生の膜を使用してもよい。ラジオラベルを使
用する場合、組織切片の評価は有利にはオートラジオグラフィーによって行う。To determine the selectivity, affinity and activity of a binding partner according to the invention, brain tissue sections and native membranes from parts of the brain may also be used. If radiolabels are used, the evaluation of the tissue sections is advantageously performed by autoradiography.
【００５８】 本発明による結合パートナーの偏頭痛の治療に関する有効性は有利には、偏頭
痛の形成の根底であり得るメカニズムをベースとする動物モデルで測定される。The efficacy of a binding partner according to the invention for treating migraine is advantageously measured in animal models based on mechanisms that may underlie the formation of migraine.
【００５９】 例えば本発明による結合パートナーによって誘導されるタンパク質溢出を測定
することができる。このアッセイは自体公知のように、例えば蛍光染色（Johnso
n K. W. and Phebus L.A. (1998) J. Neurosci. Methods 81: 19-24）又はアイ
ソトープ標識したアルブミン（Petty M. A. et al., (1997) Eur. J. Pharmacol
. 336: 127-136）を使用することによって実施できる。このために、前記の動物
を連続的に試験化合物及び［１２５Ｉ］−アルブミン又は蛍光色素で処理する。
次いで三叉神経節を電気的に刺激する。脳硬膜中に蓄積した放射活性又は蛍光を
測定する。本発明による結合パートナーの抗偏頭痛活性を三叉神経節の刺激によ
って誘導されるタンパク質溢出で判断する。For example, protein extravasation induced by a binding partner according to the invention can be measured. This assay is known per se, for example by fluorescent staining (Johnso
n KW and Phebus LA (1998) J. Neurosci. Methods 81: 19-24) or isotope-labeled albumin (Petty MA et al., (1997) Eur. J. Pharmacol
336: 127-136). For this, the animals are treated successively with a test compound and [ 125 I] -albumin or a fluorescent dye.
The trigeminal ganglia are then electrically stimulated. The radioactivity or fluorescence accumulated in the dura is measured. The antimigraine activity of the binding partner according to the invention is determined by protein extravasation induced by stimulation of the trigeminal ganglion.
【００６０】 他のモデルは、頸動脈血流の分布に基づく（Saxena P. R. et al., (1998) Eu
r. J. Pharmacol. 351: 329-339）。このために、放射活性の微小球を頸動脈中
に注入する。安定期（stabilization phase）の後に、動物を試験化合物で処理
し、かつ脳内に蓄積される放射活性をマイクロ−β−カウンター（micro-β-cou
nter）中で測定する。Another model is based on the distribution of carotid blood flow (Saxena PR et al., (1998) Eu
r. J. Pharmacol. 351: 329-339). For this, radioactive microspheres are injected into the carotid artery. After the stabilization phase, the animals are treated with the test compound and the radioactivity accumulated in the brain is measured using a micro-β-couper.
nter).
【００６１】 ニトログリセリンで誘導されるｃ−ｆｏｓ遺伝子発現及びトランスロケーショ
ンの測定も適当である。このために、動物をニトログリセリン及び試験されるべ
き化合物で処理する。ｃ−ｆｏｓ遺伝子発現及び核内でのタンパク質トランスロ
ケーションはインサイチュー・ハイブリダイゼーションを使用するか、又は免疫
組織化学的に測定する（Garcia-Ladona F. J. et al., (1994) Mol. Brain Res.
21: 75-84; Garcia-Ladona F. J. et al (1997) J. Neurosci. Res 50: 50-61
）。Measurement of nitroglycerin-induced c-fos gene expression and translocation is also appropriate. For this, the animals are treated with nitroglycerin and the compound to be tested. c-fos gene expression and protein translocation in the nucleus are measured using in situ hybridization or immunohistochemically (Garcia-Ladona FJ et al., (1994) Mol. Brain Res.
21: 75-84; Garcia-Ladona FJ et al (1997) J. Neurosci. Res 50: 50-61
).
【００６２】 他のモデルは、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｄｅ Ｌｉｍａ Ｖ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（
１９９３） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６１４：４４５−５１（網膜拡延性抑圧（Reti
nal Spreading depression））及びＫａｗａｈａｒａ Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９
９） Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０８：２７−３６（皮質拡延性抑圧（Cortical
Spreading Depression））から公知である。Other models are described in Fernandes de Lima V. M. et al. (
1993) Brain Res. 614: 445-51 (Retinal Spreading Depression (Reti
nal Spreading depression)) and Kawahara N. et al. et al. (199
9) Exp. Neurol. 108: 27-36 (Cortical spreading depression)
Spreading Depression)).
【００６３】 ５−ＨＴ５結合パートナーの本発明による使用は、治療に関して１つのプロセ
スを有する。このプロセスにおいて、概して製薬学的かつ獣医学的な実施によっ
て配合される１種以上の５−ＨＴ５結合パートナーの有効量を治療されるべき個
体、有利にはホニュウ類、特にヒト、有用動物又はペットに投与する。かかる治
療を指示し、その形で実施するかどうかは、個々のケースに依存し、かつ医学的
評価（診断）、徴候、症状および／または機能不全の提示、一定の徴候、症状お
よび／または機能不全の発生の危険に依存し、かつ更に他の要素を含む。The use of a 5-HT5 binding partner according to the invention has one process for treatment. In this process, an individual to be treated, preferably a frog, especially a human, useful animal or pet, is to be treated with an effective amount of one or more 5-HT5 binding partners, generally formulated by pharmaceutical and veterinary practice. To be administered. Whether such treatment is indicated and performed in that manner depends on the individual case and on the medical evaluation (diagnosis), presentation of signs, symptoms and / or dysfunction, certain signs, symptoms and / or functions. Depends on the risk of failure to occur and also includes other factors.
【００６４】 一般に、治療は１回の投与又は繰り返しの毎日の投与によって、適当であれば
一緒に又は他の有効化合物又は有効化合物含有調剤と交互に、約０．００１ｇ〜
１０ｇ、有利には約０．００１ｇ〜約１ｇの日用量が治療されるべき個体に投与
されるように実施する。In general, treatment will be from about 0.001 g to a single dose or repeated daily doses, if appropriate together or alternating with other active compounds or active compound-containing preparations.
The practice is such that a daily dose of 10 g, advantageously from about 0.001 g to about 1 g, is administered to the individual to be treated.
【００６５】 また本発明は個体、有利にはホニュウ類、特にヒト、有用動物又はペットの治
療のための薬剤の製造に関する。The present invention also relates to the manufacture of a medicament for the treatment of an individual, advantageously a flies, especially humans, useful animals or pets.
【００６６】 本発明による結合パートナーは通常、製薬学的に認容性の添加剤を少なくとも
１種の本発明による結合パートナー及び、適当であれば他の有効化合物と一緒に
含有する医薬品組成物の形で投与する。これらの組成物は、例えば経口、直腸内
、経皮的、皮下的、静脈内、筋内又は鼻腔内の経路で適用できる。The binding partners according to the invention are usually in the form of pharmaceutical compositions containing a pharmaceutically acceptable excipient together with at least one binding partner according to the invention and, if appropriate, other active compounds. To be administered. These compositions can be applied, for example, by the oral, rectal, transdermal, subcutaneous, intravenous, intramuscular, or intranasal routes.
【００６７】 適当な医薬品製剤の例は固体の医薬品形、例えば粉剤、顆粒剤、錠剤、香錠、
サッシェ、カシェ剤、コーティング剤、カプセル剤、例えば硬質ゼラチンカプセ
ル剤及び軟質ゼラチンカプセル剤、坐剤又は経膣製剤形、半固体の医薬品形、例
えば軟膏剤、クリーム剤、ヒドロゲル剤、ペースト剤又は貼付剤、並びに液体医
薬品形、例えば液剤、エマルジョン、特に水中油エマルジョン、懸濁液、例えば
ローション剤、注入剤及び輸注調剤、点眼剤及び点耳剤である。埋植された送出
装置を本発明による結合パートナーの投与のために使用してもよい。更にリポソ
ーム、微小球またはポリマーマトリクスを使用してもよい。Examples of suitable pharmaceutical formulations are solid pharmaceutical forms such as powders, granules, tablets, lozenges,
Sachets, cachets, coatings, capsules such as hard and soft gelatin capsules, suppositories or vaginal preparations, semisolid pharmaceutical forms such as ointments, creams, hydrogels, pastes or patches And liquid pharmaceutical forms, such as solutions, emulsions, especially oil-in-water emulsions, suspensions, such as lotions, injection and infusion preparations, eye drops and ear drops. An implanted delivery device may be used for administration of a binding partner according to the invention. In addition, liposomes, microspheres or polymer matrices may be used.
【００６８】 組成物の製造において、本発明による結合パートナーを通常、添加剤と混合す
るか、又は添加剤で希釈する。添加剤は、固体、半固体又は液体の材料であって
よく、これらは有効化合物のための賦形剤又は媒体として使用される。In the preparation of the compositions, the binding partners according to the invention are usually mixed with or diluted with additives. Additives may be solid, semi-solid or liquid materials, which are used as excipients or vehicles for the active compound.
【００６９】 適当な添加剤は、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビト
ール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネー
ト、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニ
ルピロリドン、セルロース、水、糖蜜及びメチルセルロースである。更に、製剤
は製薬学的に認容性の賦形剤又は慣用の添加剤、例えば滑沢剤、例えば獣脂、ス
テアリン酸マグネシウム及び鉱油；湿潤剤；乳化剤及び懸濁剤；保存剤、例えば
ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピル；酸化防止剤；抗刺激薬（antistimulan
t）；キレート剤；被覆助剤；エマルジョン安定剤；皮膜形成剤；ゲル化剤；フ
レーバーマスキング剤（flavor-masking agent）；フレーバー改善剤（flavor c
orrigent）；樹脂；ヒドロコロイド；溶剤；可溶化剤；中和剤；浸透促進剤（pe
rmeation accelerator）；顔料；第４級アンモニウム化合物；加脂剤（refattin
g agent）及び過脂剤（superfatting agent）；軟膏；クリーム又はオイルベー
ス；シリコーン誘導体：拡散助剤；安定化剤；滅菌剤；坐剤基剤；錠剤添加剤、
例えば結合剤、増量剤、滑沢剤、崩壊剤又はコーティング；噴射剤；乾燥剤；乳
白剤；増粘剤；ワックス；可塑剤；ホワイトオイルを含む。関連の態様はFiedle
r, H.P., Lexikon der Hilfsstoffe fuer Pharmazie, Kosmetik und angrenzend
e gebiete[Encyclopedia of excipients for pharmacy, cosmetics and related
areas], 4th Edition, Aulendorf:ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996に表されて
いるような専門知識に基づくものである。Suitable additives include, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, tragacanth, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, molasses and Methyl cellulose. In addition, the formulation may be a pharmaceutically acceptable excipient or a conventional additive such as a lubricant such as tallow, magnesium stearate and mineral oil; a wetting agent; an emulsifying and suspending agent; a preservative such as hydroxybenzoic acid. Methyl and propyl; antioxidants; antistimulans
chelating agents; coating aids; emulsion stabilizers; film-forming agents; gelling agents; flavor-masking agents;
orrigent); resin; hydrocolloid; solvent; solubilizer; neutralizing agent;
rmeation accelerator); pigment; quaternary ammonium compound;
ointments; cream or oil bases; silicone derivatives: diffusion aids; stabilizers; sterilants; suppository bases;
For example, binders, fillers, lubricants, disintegrants or coatings; propellants; desiccants; opacifiers; thickeners; waxes; Related aspects are Fiedle
r, HP, Lexikon der Hilfsstoffe fuer Pharmazie, Kosmetik und angrenzend
e gebiete [Encyclopedia of excipients for pharmacy, cosmetics and related
areas], 4th Edition, Aulendorf: Based on expertise as expressed in ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996.
【００７０】 また本発明は５−ＨＴ５受容体のための結合パートナーの、かつ特に前記の特
定かつ有利な本発明による結合パートナーの態様の偏頭痛性脳血管障害の治療、
特に偏頭痛及び他の血管に関連する頭痛、特に偏頭痛型の発作性の頭痛のための
使用に関する。これらは神経学的な機能障害を併発するか、又は併発しない単純
な偏頭痛及び典型的な偏頭痛、真性偏頭痛及び普通型偏頭痛、及びこの種のより
特異的な障害、例えば関連偏頭痛（associated migraine）、いわゆる偏頭痛代
理症、消化性偏頭痛（digestive migraine）、眼性偏頭痛、眼筋麻痺性偏頭痛、
赤色偏頭痛（migraine rouge）として記載される障害、群発頭痛（ホートン症候
群）及び頸性偏頭痛として記載される疾患を含む。治療とは、予防的治療、特に
発作の再発防止、例えば区間治療（interval treatment）及び急性症状、特に頭
痛相の間の治療の両者を意味すると解されるべきである。優れた治療は症状、特
に頭痛、神経学的機能障害、例えば視力障害、知覚障害、運動不全及び言語障害
、悪心及びむかつきおよび／または発作の頻度の低減をもたらす。偏頭痛の、結
合パートナーによる急性治療が有利である。特に本発明は前記の結合パートナー
を、その形成および／または経路において５−ＨＴ５受容体が関連する前記の障
害の形、すなわち５−ＨＴ５受容体活性によって調節される障害の治療のための
使用に関する。The present invention also relates to the treatment of migraine cerebrovascular disorders of the binding partner for the 5-HT5 receptor, and in particular of the specific and advantageous embodiments of the binding partner according to the invention as defined above.
It particularly relates to the use for migraine and other blood vessel related headaches, especially migraine-type paroxysmal headaches. These are simple and typical migraines with or without neurological dysfunction, true and common migraines, and more specific disorders of this type, such as associated migraines (Associated migraine), so-called migraine surrogate, digestive migraine, ocular migraine, ophthalmoplegic migraine,
Includes disorders described as migraine rouge, cluster headaches (Houghton's syndrome), and diseases described as cervical migraines. Treatment is to be taken to mean both prophylactic treatment, in particular prevention of seizure recurrence, for example interval treatment and treatment during acute symptoms, especially during the headache phase. Good treatment results in a reduction in the frequency of symptoms, in particular headaches, neurological dysfunctions, such as impaired vision, dysesthesia, dyskinesia and speech disorders, nausea and upset and / or seizures. Acute treatment of migraine with a binding partner is advantageous. In particular, the present invention relates to the use of said binding partners for the treatment of the above-mentioned forms of disorders in which 5-HT5 receptors are involved in their formation and / or pathway, ie disorders which are modulated by 5-HT5 receptor activity. .
【００７１】 用語“障害”は本発明による意味においては一般に病理学的状態とされる異常
を表しており、かつ一定の徴候、症状および／または機能不全の形で明らかにす
ることができる。本発明による治療は個々の障害、すなわち異常又は病理学的状
態に向けられるが、原因的に互いに関連する幾つかの異常をまとめて、本発明に
より治療できるパターン、すなわち症候群を提供しうる。The term “disorder”, in the sense of the present invention, refers to an abnormality generally referred to as a pathological condition and can be manifested in the form of certain signs, symptoms and / or dysfunctions. Although treatment according to the present invention is directed to individual disorders, ie abnormalities or pathological conditions, several abnormalities that are causally related to one another may be combined to provide a pattern, ie, a syndrome, treatable by the present invention.
【００７２】 本発明による意味の範囲内の治療とは急性または慢性の徴候、症状および／ま
たは機能不全の治療だけでなく、特に再発防止又は相防止（phase prophylaxis
）としての予防的治療（予防）を含む。治療は症候的に、例えば症状の抑制とし
て達成できる。これは短時間で実施でき、中期間で達成され、又は、例えば持続
的治療に関して長期治療であってよい。The treatment within the meaning according to the invention includes not only the treatment of acute or chronic signs, symptoms and / or dysfunctions but also, in particular, prevention of relapse or phase prophylaxis.
)). Treatment can be achieved symptomatically, for example, as suppression of symptoms. This can be performed in a short period of time, achieved in a medium period, or can be a long-term treatment, for example for a continuous treatment.
【００７３】 偏頭痛の治療のために使用できる結合パートナーは、５−ＨＴ５とは異なる特
異的受容体に対するよりも低い親和性、実質的に同じ親和性又は高い親和性で５
−ＨＴに結合できる。[0073] Binding partners that can be used for the treatment of migraine include those with lower, substantially the same, or higher affinity than 5-HT5 for specific receptors that are different.
-Can bind to HT.
【００７４】 本発明による使用に関する５−ＨＴ５受容体のための結合パートナーはこのよ
うに、特に５−ＨＴ１受容体、特に５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ１Ｄに
対する親和性に匹敵する５−ＨＴ５受容体に対する結合親和性が、これらが本発
明による使用のために有利には適当であるほど高い。このことは必要に応じて５
−ＨＴ５受容体のために選択的な結合パートナーが本発明の特定の態様であって
も５−ＨＴ５受容体への比較的より選択的な結合を前提としていない。The binding partner for the 5-HT5 receptor for use according to the invention is thus especially a 5-HT5 receptor which is comparable in affinity to the 5-HT1 receptor, in particular to 5-HT1B and / or 5-HT1D. The binding affinity for the body is so high that they are advantageously suitable for use according to the invention. This may be 5 if necessary.
A selective binding partner for the -HT5 receptor does not presuppose relatively more selective binding to the 5-HT5 receptor, even in certain embodiments of the invention.
【００７５】 例えば特に５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ１Ｄのために５−ＨＴ５受容
体及び５−ＨＴ１受容体の両者に対して高い親和性を有する結合パートナーを使
用してよい。本願での高い親和性は一般に１・１０- ９Ｍ〜１・１０- ６Ｍの範囲
内のＫｉ値を意味する。特定の態様によれば、その高い親和性範囲で使用可能な
結合パートナーは、５−ＨＴ受容体に対して５−ＨＴ５への結合親和性によって
顕著な結合プロフィールを有し、これは、前記の範囲の他の結合親和性と比較し
て実質的に同じであるか、又はほんの僅かに低いだけである。１０倍以下が有利
であってよい。For example, a binding partner with high affinity for both the 5-HT5 and 5-HT1 receptors may be used, especially for 5-HT1B and / or 5-HT1D. High affinity herein generally 1 - 10 - means K i values within the range of 6 M - 9 M~1 · 10. According to a particular aspect, the binding partners usable in its high affinity range have a pronounced binding profile due to the binding affinity to 5-HT5 for the 5-HT receptor, It is substantially the same or only slightly lower compared to the other binding affinities of the range. A factor of 10 or less may be advantageous.
【００７６】 本発明の他の態様によれば、前記の選択的な５−ＨＴ５結合パートナーが使用
される。According to another aspect of the present invention, a selective 5-HT5 binding partner as described above is used.
【００７７】 本発明の特定の態様によれば、ｈ５−ＨＴ５をトランスフェクションされたＣ
ＨＯ細胞の少なくとも５−ＨＴ５受容体への結合は膜結合Ｇタンパク質に結合す
るＧＴＰ結合のアゴニストに誘導される刺激の変化、細胞内カルシウム濃度の変
化、ホスホリパーゼＣ活性のアゴニストに誘導される誘導の変化および／または
ｃＡＭＰ産生の変化をもたらす。細胞内カルシウム濃度を考慮する限り、細胞内
カルシウム濃度の増大をもたらす結合パートナーの使用は本発明の特定の態様で
ある。According to a particular aspect of the invention, h5-HT5 transfected C
The binding of HO cells to at least the 5-HT5 receptor is induced by an agonist-induced change in GTP binding to a membrane-bound G protein, a change in intracellular calcium concentration, or an agonist-induced induction of phospholipase C activity. Resulting in altered and / or altered cAMP production. As far as intracellular calcium concentration is considered, the use of a binding partner that results in an increase in intracellular calcium concentration is a particular aspect of the present invention.
【００７８】 本発明を以下の実施例によってより詳細に説明するが、これは本発明を制限す
るものではない。The present invention is described in more detail by the following examples, which do not limit the invention.
【００７９】 参照例１ ｈ５−ＨＴ５受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞 ヒトの５−ＨＴ５受容体をコードする遺伝子をヒトの組織から公知のように３
′−５′−ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＡＣＥシステム、ベーリンガー・マンハイム）によ
って単離した。次いでその遺伝子配列をネオマイシン耐性遺伝子を有するプラス
ミド（ｐｃＤＮＡ３；インビトロジェン、ドイツ）中に挿入し、製造者の指示に
従ってＥ．ｃｏｌｉ中で増幅させた。得られたプラスミドの調製物をＬｉｐｏｆ
ｅｃｔａｍｉｎ（Ｒ）（ギブコ ライフ−サイエンシズ、ドイツ）と混合し、Ｈ
ＥＫ２９３細胞をペトリ皿（２．５ｃｍ）中でトランスフェクション混合物を薄
層にしてインキュベートした。次いでトランスフェクション混合物をネオマイシ
ン含有培養培地に取り換えた。生存している細胞を更に１０％のウシ胎仔血清、
２ｍＭのグルタミン及び抗生物質（９０ｍｇのストレプトマイシン、９０ｍｇの
ペニシリン）を補ったＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で培養した。細胞を５％ＣＯ２、
９５％の大気湿度及び３７℃で集密状態まで増殖させた。Reference Example 1 HEK293 Cells and CHO Cells Expressing h5-HT5 Receptor The gene encoding the human 5-HT5 receptor was cloned from a human tissue as described in US Pat.
Isolated by '-5'-RT-PCR (RACE system, Boehringer Mannheim). The gene sequence was then inserted into a plasmid carrying the neomycin resistance gene (pcDNA3; Invitrogen, Germany) and E. coli was used according to the manufacturer's instructions. E. coli. The resulting plasmid preparation is transferred to Lipof
ectamin® ( Gibco Life Sciences, Germany)
EK293 cells were incubated in a thin layer of transfection mixture in Petri dishes (2.5 cm). The transfection mixture was then replaced with a culture medium containing neomycin. Surviving cells were further supplemented with 10% fetal bovine serum,
Cultures were performed in DMEM-F12 medium supplemented with 2 mM glutamine and antibiotics (90 mg streptomycin, 90 mg penicillin). Cells are 5% CO 2 ,
Grow to confluence at 95% atmospheric humidity and 37 ° C.
【００８０】 ｈ５−ＨＴ５受容体を発現するＣＨＯ細胞を同様に得る。[0080] CHO cells expressing the h5-HT5 receptor are similarly obtained.
【００８１】 参照例２ 細胞膜の調製 ここで使用される方法は、実質的に細胞から細胞膜を調製するための公知の方
法に従うものである（Findlay J.B.C. and Evans W.H., Biological Membranes,
Practical Approach (1987)）。参照例１によって培養された細胞を培養容器の
表面から慎重に剥離し、１８０×ｇで１０分間ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で遠心分
離した。得られる細胞ペレットを５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＥＧＴＡ、０．１
ｍＭのＰＭＳＦ及び３ｍＭのベンズアミジンを含有する５ｍＭのトリスＨＣｌバ
ッファー（ｐＨ：７．６；バッファーＡ）中に再懸濁し、４℃で１５分間インキ
ュベートした。細胞懸濁液をＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（Ｒ）（１５０００ｒｐｍ
）中で均質化（６×３秒）し、１０００×ｇ及び４℃で１分間遠心分離した。ペ
レットをバッファーＡ中に再懸濁し、かつ前記のように均質化及び遠心分離した
。両工程からの上清を回収し、４００００×ｇ及び４℃で２０分間遠心分離した
。ペレットをバッファーＡ中に再懸濁し、均質化した（１×１５秒）。膜懸濁液
を４００００×ｇ及び４℃で２０分間遠心分離した。得られたペレットを１０％
のグリセロール及び１％のウシ血清アルブミンを含有するバッファーＡ中に再懸
濁した。アリコートを凍結させ、−８０℃で使用するまで貯蔵した。Reference Example 2 Preparation of Cell Membrane The method used here substantially follows the known method for preparing cell membranes from cells (Findlay JBC and Evans WH, Biological Membranes,
Practical Approach (1987)). The cells cultured according to Reference Example 1 were carefully detached from the surface of the culture vessel and centrifuged at 180 × g for 10 minutes in DMEM-F12 medium. The resulting cell pellet was treated with 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 0.1
Resuspended in 5 mM Tris HCl buffer (pH: 7.6; buffer A) containing mM PMSF and 3 mM benzamidine and incubated at 4 ° C. for 15 minutes. The cell suspension was treated with Ultraturrax® (15000 rpm ).
)), And centrifuged at 1000 × g and 4 ° C. for 1 minute. The pellet was resuspended in buffer A and homogenized and centrifuged as described above. Supernatants from both steps were collected and centrifuged at 40000 × g and 4 ° C. for 20 minutes. The pellet was resuspended in buffer A and homogenized (1 × 15 seconds). The membrane suspension was centrifuged at 40000 × g and 4 ° C. for 20 minutes. 10% of the obtained pellets
Glycerol and 1% bovine serum albumin. Aliquots were frozen and stored at -80 C until use.
【００８２】 参照例３ ［３Ｈ］−５−ＣＴの飽和結合のキネティクス 方法論は実質的に公知である（Ress S. et al., FEBS Letter 335:242-246(19
94)）。参照例２により得られる膜（２００μｌ）を全容量６００μｌで１ｍＭ
のＥＤＴＡを含有する１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ：７．７；バッファーＢ
）中で［３Ｈ］−５−ＣＴ（９６Ｃｉ／ミリモル）の濃度を増大させてインキュ
ベートし、その際、１０μＭのメチオテピンを特異的結合の測定のために添加し
、一方でメチオテピンを全結合の測定のために添加しなかった。混合物を３０℃
で９０分間インキュベートした。次いで試料を、Ｓｋａｔｒｏｎ（Ｒ）濾過シス
テム及び０．３％ポリエチレンイミド中に埋め込まれたＧＦ／Ｂフィルタを使用
して濾過した。フィルターを４℃で９ｍｌのバッファーＢを使用して洗浄した。
フィルター中に残留する放射活性を液体シンチレーション計数によって測定した
。その際５ｍｌのＵｌｔｉｍａ−Ｇｏｌｄ（パッカード）を使用した。Reference Example 3 Kinetics of Saturated Binding of [ 3 H] -5-CT The methodology is substantially known (Ress S. et al., FEBS Letter 335: 242-246 (19
94)). The membrane (200 μl) obtained according to Reference Example 2 was diluted with 1 mM
100 mM Tris HCl (pH: 7.7; buffer B)
)) And incubated with increasing concentrations of [< 3 > H] -5-CT (96 Ci / mmol), with the addition of 10 [mu] M methiothepin for measuring specific binding, while adding methiothepin to total binding. Not added for measurement. 30 ° C the mixture
For 90 minutes. Then sample was filtered using a Skatron (R) GF / B filters embedded in the filter system and 0.3% polyethylene imide. The filters were washed at 4 ° C. using 9 ml of buffer B.
Radioactivity remaining in the filters was measured by liquid scintillation counting. At that time, 5 ml of Ultima-Gold (Packard) was used.
【００８３】 参照例４ ［３Ｈ］−５−ＣＴ結合の競合 結合の競合についての実験を実質的に公知の研究に従って実施した（Rees et
al., 1994）。例２によって得られる膜（２００μｌ）を２ｎＭの［３Ｈ］−５
−ＣＴの存在下にバッファーＢ中の６００μｌの全容量で選択された化合物の濃
度を増大させてインキュベートした。３０℃で７５分間のインキュベート後に、
これらの試料を４℃でポリエチレンイミド中に埋め込まれたＧＦ／Ｂフィルター
を通してバッファーＢを使用して濾過した。フィルターを９ｍｌのバッファーＢ
で洗浄した。フィルター上に残留する放射活性を参照例３でのように測定した。
全結合は、他の化合物を添加しないで観察されるラジオリガンドの結合として定
義した。この非特異的結合を、１０μＭのメチオテピンの存在下に観察される［ ３ Ｈ］−５−ＣＴの結合として定義した。またマイクロタイタープレートの使用
の結果として高い試料処理量及び二次スクリーニングを可能にする類似のシステ
ムを使用してもよい。Reference Example 43H] -5-CT Binding Competition Experiments on binding competition were performed substantially according to known studies (Rees et al.
al., 1994). The membrane (200 μl) obtained according to Example 2 was added at 2 nM [3H] -5
-Concentration of selected compounds in a total volume of 600 μl in buffer B in the presence of CT
Incubate at increasing degrees. After incubation at 30 ° C. for 75 minutes,
GF / B filters embedded in polyethylene imide at 4 ° C.
And filtered using buffer B. Filter with 9 ml buffer B
And washed. The radioactivity remaining on the filter was measured as in Reference Example 3.
Total binding is defined as radioligand binding observed without the addition of other compounds.
Justified. This non-specific binding is observed in the presence of 10 μM methiothepin [ 3 H] -5-CT. Use of microtiter plates
A similar system that allows high sample throughput and secondary screening as a result of
May be used.
【００８４】 ［３Ｈ］−５−ＣＴ結合の飽和パラメーターを非線形回帰分析及びＳｉｇｍａ
Ｐｌｏｔソフトウェア（Jandel Scientific, Germany）を使用する線形プロット
の両方から測定した。放射活性結合を全結合のパーセンテージ割合として表現す
る競合曲線を作成した。半最大阻害定数ＩＣ５０及びヒル係数（ｎＨ）を非線形
回帰分析によって測定した。The saturation parameters of [ 3 H] -5-CT binding were determined by nonlinear regression analysis and Sigma.
Measured from both linear plots using Plot software (Jandel Scientific, Germany). A competition curve expressing radioactive binding as a percentage of total binding was generated. The half-maximal inhibition constant IC 50 and Hill coefficient (n H ) were determined by non-linear regression analysis.
【００８５】 ｂ）ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ技術を使用するＨＴＳによるｈ５−ＨＴ５受容体リ
ガンドの同定 ｈ５−ＨＴ５膜で被覆された９６ウェルのフラッシュプレートをＢｉｏ Ｓｉ
ｇｎａｌ Ｉｎｃ（カナダ）から入手した。［３Ｈ］−ＬＳＤを１０ｍＭのＭｇ
Ｃｌ２、０．５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％のＢＳＡを含有するトリスＨＣｌバ
ッファー中で適当な濃度に希釈した。ラジオリガンド溶液をウェル（２５ｍｌ）
に添加した。これらはそれぞれ試験化合物を含有させるか、または試験化合物を
含有させていなかった。プレートを室温で１８０分間インキュベートし、放射活
性シグナルをマイクロ β−カウンター（Ｗａｌｌａｃ）を使用して測定した。
非特異的結合をメチオテピンを使用して測定した。［３Ｈ］−ＬＳＤは１２ｎＭ
の親和性を有していた。試験化合物の結合親和性が増大すると、［３Ｈ］−ＬＳ
Ｄの放射活性シグナルが減少した。B) Identification of h5-HT5 Receptor Ligands by HTS Using FlashPlate Technology A 96-well flash plate coated with an h5-HT5 membrane was placed on a Bio Si
gnal Inc (Canada). [ 3 H] -LSD was added to 10 mM Mg.
Cl 2, and diluted to an appropriate concentration in Tris HCl buffer containing 0.5mM EDTA and 0.5% BSA. Radioligand solution (25 ml)
Was added. These each contained the test compound or no test compound. The plates were incubated at room temperature for 180 minutes and the radioactivity signal was measured using a micro β-counter (Wallac).
Non-specific binding was measured using methiothepin. [ 3 H] -LSD is 12 nM
Had an affinity of As the binding affinity of the test compound increases, [ 3 H] -LS
The radioactivity signal of D decreased.
【００８６】 参照例５ ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合のアゴニストに誘導される刺激の測定 ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイは公知である。本アッセイは従来記載され
ているヒルフ及びヤコブ（Hilf, G. and Jakobs, K. H.）の方法（Eur. J. Mol.
Pharmacol. 225:245-252(1992)）に従って実施した。ｈ５−ＨＴ５受容体遺伝
子を安定トランスフェクションさせたＨＥＫ２９３細胞の膜への［３５Ｓ］ＧＴ
ＰγＳ結合における有効化合物に誘導される変化を測定した（参照例１及び参照
例２を参照のこと）。細胞膜（１２μｇ）を６．７５ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０
ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０μＭのＧＤＰ及び［ ３５ Ｓ］ＧＴＰγＳを含有する５０ｍＭのトリエタノールアミンＨＣｌバッファ
ー（ｐＨ：７．５）とインキュベートした。試験されるべき有効化合物を添加す
るか、又は添加せずに３０℃で６０分間インキュベートした後に、試験混合物（
１００μｌ）を迅速にＧＦ−Ｂフィルターを通してＳｋａｔｒｏｎ（Ｒ）濾過装
置を使用して濾過した。フィルターを迅速に、１００ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭ
のＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのトリスＨＣｌバッファー（９ｍｌ；ｐＨ：７
．５；４℃）で洗浄した。フィルター上に残留している放射活性を、Ｕｌｔｉｍ
ａ Ｇｏｌｄシンチレーション液を使用してシンチレーション分光法（sintillat
ion spectrometry）によって測定した。マイクロタイタープレートの使用の結果
として高い処理量及び二次スクリーニングを可能にする類似のシステムを同様に
使用してよい。Reference Example 5 [35S] Measurement of stimulation induced by agonists of GTPγS binding [35[S] GTPγS binding assays are known. This assay has been described previously.
Hilf, G. and Jakobs, K. H. (Eur. J. Mol.
Pharmacol. 225: 245-252 (1992)). h5-HT5 receptor inheritance
HEK293 cells stably transfected with35S] GT
Active compound-induced changes in PγS binding were measured (see Reference Example 1 and Reference Example 1).
See Example 2). Cell membrane (12 μg) was washed with 6.75 mM MgCl2, 150
mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 10 μM GDP and [ 35 S] 50 mM triethanolamine HCl buffer containing GTPγS
(PH: 7.5). Add active compound to be tested
After incubation at 30 ° C. for 60 minutes with or without addition, the test mixture (
100 μl) was quickly passed through a GF-B filter to Skatron.(R)Filtration equipment
And filtered. Filter quickly with 100 mM NaCl and 5 mM
MgCl250 mM Tris HCl buffer (9 ml; pH: 7
. 5; 4 ° C). The radioactivity remaining on the filter is determined by Ultim
a Scintillation spectroscopy using Gold scintillation fluid (sintillat
ion spectrometry). Results of using microtiter plates
As well as similar systems that allow high throughput and secondary screening
May be used.
【００８７】 有効化合物活性を有効化合物の不在下に測定した基本結合のパーセンテージ割
合として表現した。曲線の整合を非線形回帰分析のためのソフトウェア（SigmaP
lot, Jandel Scientific, Germany）を使用して、一般式 Ｅ＝（Ｌ×Ｅｍａｘ）／（Ｌ＋ＥＣ５０） ［式中、Ｅは効力、Ｌはリガンド濃度、Ｅｍａｘは最大効力及びＥＣ５０は最大
効力の５０％を誘導するその濃度である］に従って実施した。Active compound activity was expressed as a percentage of basal binding measured in the absence of active compound. Software for nonlinear regression analysis of curve matching (SigmaP
lot, Jandel Scientific, Germany) using the general formula E = (L × E max ) / (L + EC 50 ) where E is potency, L is ligand concentration, E max is max potency and EC 50 is max Its concentration that induces 50% of potency].
【００８８】 参照例６ 細胞内カルシウム濃度におけるアゴニストに誘導される変化の測定 該方法は公知である（Kao J. P. Y., Methods in Cell Biology 40:155-181(1
994)）。参照例１に記載のように、ｈ５−ＨＴ５受容体を発現するＨＥＫ２９３
細胞を培養容器中で増殖させた。これらの細胞を、これらが集密状態になる前に
慎重に剥離した。これらの細胞を、Ｆｕｒａ ２−アセチルメチルエステル（シ
グマ）と室温においてインキュベートすることによってＦｕｒａ２で標識した。
これらの細胞を１８０×ｇで１０分間遠心分離し、血清を含有しないＤＭＥＭ−
Ｆ１２培地中に再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２及び９５％の大気湿度において４
５分間インキュベートした。Reference Example 6 Measurement of Agonist-Induced Change in Intracellular Calcium Concentration The method is known (Kao JPY, Methods in Cell Biology 40: 155-181 (1
994)). HEK293 expressing h5-HT5 receptor as described in Reference Example 1
Cells were grown in culture vessels. The cells were carefully detached before they became confluent. These cells were labeled with Fura2 by incubating with Fura 2-acetylmethyl ester (Sigma) at room temperature.
These cells were centrifuged at 180 xg for 10 minutes, and serum-free DMEM-
Resuspend in F12 medium and add 4% at 37 ° C., 5% CO 2 and 95% atmospheric humidity.
Incubated for 5 minutes.
【００８９】 細胞内カルシウム濃度を適当なフィルタ交換システム（オリンパス／ハママツ
）を備えている蛍光顕微鏡を使用して測定した。蛍光比（３４０ｎｍ／３８０ｎ
ｍ）をＡｒｇｕｓ（Ｒ）ソフトウェアを使用して測定した。細胞内カルシウム濃
度を個々の細胞中で有効化合物を添加せずに短時間観察し、次いで試験されるべ
き有効化合物の添加の３０分後に観察した。マイクロタイタープレートの使用の
結果として高い処理量及び二次スクリーニングを可能にする類似のシステムを同
様に使用してよい。Intracellular calcium concentration was measured using a fluorescence microscope equipped with a suitable filter exchange system (Olympus / Hamamatsu). Fluorescence ratio (340 nm / 380n
m) was measured using the Argus (R) software. The intracellular calcium concentration was observed briefly in individual cells without addition of the active compound, and then 30 minutes after addition of the active compound to be tested. Similar systems that allow high throughput and secondary screening as a result of the use of microtiter plates may be used as well.
【００９０】 同様に、細胞内Ｃａ２＋濃度の調節をＨＴＳで評価した。このために、ｈ５−
ＨＴ５受容体を発現するＣＨＯ細胞を９６ウェルプレート中で一晩培養した（３
０００００〜８００００細胞／ウェル）。細胞を、１ｍＭのＦｌｕｏ−３−ＡＭ
、１０％のプルロニック酸（pluronic acid）及び２．５ｍＭのプロベネシド（p
robencid）を含有するＨＥＰＥＳバッファーを使用して１時間標識した。試験化
合物をそれぞれのウェルに添加した。カルシウム濃度の測定のために、蛍光強度
を、蛍光測定作業をするプレートリーダー（Fluorometric Imaging Plate Reade
r;FLIPR）を使用して読みとった。Similarly, regulation of intracellular Ca 2+ concentration was assessed by HTS. For this, h5-
CHO cells expressing the HT5 receptor were cultured overnight in 96-well plates (3
0000-80000 cells / well). Cells were treated with 1 mM Fluo-3-AM.
10% pluronic acid and 2.5 mM probenecid (p
robencid) using HEPES buffer for 1 hour. Test compounds were added to each well. To measure the calcium concentration, the fluorescence intensity is measured using a plate reader (Fluorometric Imaging Plate Reade).
r; FLIPR).
【００９１】 参照例７ アゴニストに誘導されるホスホリパーゼＣ活性の測定 該方法は実質的に公知である（Garcia-Ladona F. J. et al., Neuroreport 4:
691-694 (1993)）。これらの細胞を０．１２５μＭの［３Ｈ］ミオイノシトール
と２４時間インキュベートした。導入されない［３Ｈ］ミオイノシトールを培地
から除去し、１０ｍＭのＬｉＣｌを含有するクレブス−ヘンゼライトバッファー
に取り換えた。１０分間のインキュベート後に、試験されるべき有効化合物を添
加した。４５分後に反応を、刺激培地を蒸留水に取り換えることによって停止さ
せた。組織試料を使用する場合、同様の手順が使用される（Garcia-Ladona et a
l., 1993）。細胞を凍結させ、−８０℃で貯蔵した。［３Ｈ］イノシトール一リ
ン酸の産生を公知のクロマトグラフィー法によって測定した。組織ミニプリズム
（tissue miniprism）に関しては同様の方法を使用してよい。同様に、ホスホリ
パーゼＣ刺激の測定は参照例２に記載のように膜フラクションを調製し、かつ［ ３２ Ｐ］ＰＩＰ２及び有効化合物とインキュベートすることによって同様に実施
した。この場合、ＩＰ３の産生が測定された。また公知の方法を最適化して、マ
イクロタイタープレートをベースとするシステムを使用してもよい。市販の材料
によって高い処理量及び二次スクリーニングの実施を伴う分析に拡張できる。Reference Example 7 Determination of Agonist-Induced Phospholipase C Activity The method is substantially known (Garcia-Ladona F.J. et al., Neuroreport 4:
691-694 (1993)). These cells were treated with 0.125 μM [3H] Myo-inositol
For 24 hours. Not introduced [3H] Myo-inositol as a medium
Krebs-Henseleit buffer containing 10 mM LiCl
Was replaced. After a 10-minute incubation, the active compound to be tested is added.
Added. After 45 minutes the reaction was stopped by replacing the stimulation medium with distilled water.
I let you. A similar procedure is used when using tissue samples (Garcia-Ladona et a
l., 1993). Cells were frozen and stored at -80C. [3H] Inositol
Acid production was measured by known chromatographic methods. Tissue mini prism
A similar method may be used for (tissue miniprism). Similarly, phosphorylation
Measurement of Pase C stimulation was performed by preparing a membrane fraction as described in Reference Example 2 and [ 32 P] PIP2And also by incubating with the active compound
did. In this case, IP3Production was measured. Also, by optimizing known methods,
A system based on the microtiter plate may be used. Commercial materials
This can be extended to analysis involving high throughput and performing secondary screening.
【００９２】 参照例８ ｃＡＭＰ産生におけるアゴニストに誘導される変化の測定 使用される方法は実質的に公知である（Strada S. S. et al., Methods in Ne
urotransmission receptor analysis: 89-110(1990)）。これらの細胞を血清及
び抗生物質を含有しない培地中で１０分間インキュベートした。培地を９５℃で
１５分間加熱して、反応を停止させた。細胞試料を凍結させて、−８０℃で貯蔵
した。ｃＡＭＰ濃度を、ｃＡＭＰ結合タンパク質を使用する市販のキットを使用
して測定した。公知の方法を最適化して、マイクロタイタープレートをベースと
するシステムを使用した。市販の材料によって、高い処理量及び二次スクリーニ
ングの実施を伴う分析に拡張できる。Reference Example 8 Determination of Agonist-Induced Changes in cAMP Production The methods used are substantially known (Strada SS et al., Methods in Neighborhood).
urotransmission receptor analysis: 89-110 (1990)). The cells were incubated for 10 minutes in medium without serum and antibiotics. The reaction was stopped by heating the medium at 95 ° C. for 15 minutes. Cell samples were frozen and stored at -80 <0> C. The cAMP concentration was measured using a commercially available kit using cAMP binding protein. The known method was optimized to use a microtiter plate based system. Commercial materials can be extended to analyzes involving high throughput and performing secondary screening.
【００９３】 参照例９ 組織調製 有効化合物の投与（経口、腹腔内、静脈内又は脳室内）の９０分後に、試験動
物を断頭した。全脳を迅速に頭蓋から取り出し、ドライアイス上で凍結させ、−
８０℃で貯蔵した。ラットの脳切片（１５μｍ）をクリオスタット中で−２０℃
で得て、ゼラチン被覆したスライドガラスに適用し、かつ−３０℃で使用するま
で貯蔵した。Reference Example 9 Tissue Preparation The test animals were decapitated 90 minutes after administration of the active compound (oral, intraperitoneal, intravenous or intraventricular). The whole brain is quickly removed from the skull, frozen on dry ice,
Stored at 80 ° C. Rat brain sections (15 μm) were placed in a cryostat at −20 ° C.
And applied to gelatin-coated glass slides and stored at -30 ° C until use.
【００９４】 例１ 参照例３により、５−ＨＴ５受容体への［３Ｈ］−５−ＣＴの結合親和性を測
定した。図１は結合した［３Ｈ］−５−ＣＴのプロットを［３Ｈ］−５−ＣＴ濃
度の関数として示している。Ｋｄ＝０．５７０の解離定数が測定された。クロー
ン細胞系統に依存して、受容体結合密度（Ｂ）は９００〜２８０００ｆｍｏｌ／
タンパク質のｍｇの範囲で変化した。Example 1 According to Reference Example 3, the binding affinity of [ 3 H] -5-CT to the 5-HT5 receptor was determined. FIG. 1 shows a plot of bound [ 3 H] -5-CT as a function of [ 3 H] -5-CT concentration. A dissociation constant of K d = 0.570 was measured. Depending on the clonal cell line, the receptor binding density (B) is 900-28000 fmol /
It varied in the mg protein range.
【００９５】 例２ 参照例４により、セロトニン作動性化合物の結合親和性を［３Ｈ］−５−ＣＴ
結合競合によって測定した。以下のＩＣ５０値が得られた：Example 2 According to Reference Example 4, the binding affinity of serotonergic compounds was determined by [ 3 H] -5-CT
It was determined by binding competition. The following IC 50 values were obtained:
【００９６】[0096]
【表１】 [Table 1]
【００９７】 更なる試験列において、以下の化合物の阻害定数Ｋｉを測定した（Ｋｉ＝ＩＣ ５０ ／（１＋Ｃ／Ｋｄ）。その際、Ｃは［３Ｈ］−５−ＣＴの濃度であり、Ｋｄ は例１により測定された）：In a further test series, the inhibition constants K of the following compoundsiWas measured (Ki= IC 50 / (1 + C / Kd). At that time, C3H] -5-CT.d Was measured according to Example 1):
【００９８】[0098]
【表２】 [Table 2]
【００９９】 例３ 参照例５により、Ｇタンパク質へのＧＴＰの、有効化合物に誘導される結合を
調査した。ＨＥＫ２９３細胞中でのＧタンパク質への５−ＨＴ５受容体のカップ
リングは顕著であった。典型的なセロトニン作動性のアゴニスト５−ＨＴ及び５
−ＣＴは、基本値の４０％を上回る細胞膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の増大
を誘導した（図２参照）。５−ＨＴ５受容体はＧＤＰをＧタンパク質へのカップ
リングのために必要であり、これはアゴニストによって媒介される（図３Ａ参照
）。５−ＨＴ効果は用量依存性であり（図４参照）、ＥＣ５０は２．６μＭであ
った。Example 3 Reference example 5 investigated the active compound-induced binding of GTP to G proteins. Coupling of the 5-HT5 receptor to the G protein in HEK293 cells was prominent. Typical serotonergic agonists 5-HT and 5
-CT induced an increase in [ 35 S] GTPγS binding to cell membranes above 40% of the basal value (see FIG. 2). The 5-HT5 receptor is required for coupling GDP to G proteins, which is mediated by agonists (see FIG. 3A). The 5-HT effect was dose-dependent (see FIG. 4), with an EC 50 of 2.6 μM.
【０１００】 例４ 細胞内カルシウム濃度についての有効化合物に誘導される効果を、参照例６に
従って調査した。ＨＥＫ２９３細胞における５−ＨＴ５受容体のＲ（＋）−リス
リド（１μＭ）での刺激は細胞内Ｃａ２＋に増大をもたらした（図５参照）。Example 4 The effect induced by active compounds on intracellular calcium concentration was investigated according to Reference Example 6. Stimulation of the 5-HT5 receptor with R (+)-lisuride (1 μM) in HEK293 cells resulted in an increase in intracellular Ca 2+ (see FIG. 5).
【図１】 図１は結合した［３Ｈ］−５−ＣＴのプロットを［３Ｈ］−５−ＣＴ濃度の関
数として示している。FIG. 1 shows a plot of bound [ 3 H] -5-CT as a function of [ 3 H] -5-CT concentration.
【図２】 図２は典型的なセロトニン作動性のアゴニスト５−ＨＴ及び５−ＣＴによる基
本値に対する細胞膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の誘導を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the induction of [ 35 S] GTPγS binding to cell membranes against basal values by typical serotonergic agonists 5-HT and 5-CT.
【図３】 図３はアゴニストによって媒介されるＧＤＰのＧタンパク質へのカップリング
を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing agonist-mediated coupling of GDP to G protein.
【図４】 図４は用量に依存する５−ＨＴ効果を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the dose-dependent 5-HT effect.
【図５】 ＨＥＫ２９３細胞における５−ＨＴ５受容体のＲ（＋）−リスリド（１μＭ）
での刺激による細胞内Ｃａ２＋の変化を表すグラフである。FIG. 5: R (+)-lisuride of 5-HT5 receptor in HEK293 cells (1 μM)
4 is a graph showing changes in intracellular Ca 2+ due to stimulation in Example 1.
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書[Procedural Amendment] Submission of translation of Article 34 Amendment
【提出日】平成１３年５月３１日（２００１．５．３１）[Submission date] May 31, 2001 (2001.5.31)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正の内容】[Contents of correction]
【特許請求の範囲】[Claims]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/44 1/44 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 BB10 BB14 BB46 BB50 BB51 CB01 FB08 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ08 QQ13 QQ20 QQ32 QQ63 QQ89 QR48 QR51 QR77 QR80 QS36 QX02 QX07 4C084 AA17 ZA08 ZA36 ZC41 4C086 AA01 AA02 BC13 CB22 MA02 MA05 NA14 ZA08 ZA36 ZC42──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI Theme coat ゛ (Reference) C12Q 1/02 C12Q 1/02 1/44 1/44 G01N 33/15 G01N 33/15 Z 33/50 33 / 50 Z (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA ( BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, H, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG , KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZWF terms (reference) 2G045 BB10 BB14 BB46 BB50 BB51 CB01 FB08 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ08 QQ13 QQ20 QQ32 QQ63 QQ89 QR48 QR51 QR77 QR80 QS36 QX02 QX07 4C084 AA17 ZA08 ZA36 ZC41 4C086 AA01 AA02 BC13 CB22 MA02 MA05 NA14 ZA08 ZA36 ZC42
Claims (18)
種以上の５−ＨＴ受容体に対するよりも大きい、５−ＨＴ５受容体に対する選択
的結合パートナー。1. A binding affinity for a 5-HT5 receptor other than 5-HT5.
A selective binding partner for the 5-HT5 receptor that is greater than for more than one species of the 5-HT receptor.
および／または５−ＨＴ１Ｂ受容体に対するよりも大きい、請求項１記載の結合
パートナー。2. The binding partner according to claim 1, wherein the binding affinity for the 5-HT5 receptor is greater than for the 5-HT1D and / or 5-HT1B receptors.
請求項１又は２記載の結合パートナー。3. Competitively inhibiting the binding of 5-CT to the 5-HT5 receptor.
A binding partner according to claim 1.
未満、有利には１０- ９Ｍ未満、特に１０- １０Ｍ未満である、請求項１から３ま
でのいずれか１項記載の結合パートナー。4. A 5-HT5 K i value of 10 for that binding to the receptor - 8 M
Less, advantageously 10 - less than 9 M, in particular 10 - less than 10 M, binding partner of any one of claims 1 to 3.
結合を刺激する、請求項１から４までのいずれか１項記載の結合パートナー。5. The binding partner according to claim 1, wherein its binding to the 5-HT5 receptor stimulates the binding of GTP to G proteins.
大をもたらす、請求項１から５までのいずれか１項記載の結合パートナー。6. The binding partner according to claim 1, wherein its binding to the 5-HT5 receptor results in an increase in intracellular calcium concentration.
導をもたらす、請求項１から６までのいずれか１項記載の結合パートナー。7. The binding partner according to claim 1, wherein its binding to the 5-HT5 receptor results in the induction of phospholipase C activity.
らす、請求項１から７までのいずれか１項記載の結合パートナー。8. The binding partner according to any one of claims 1 to 7, wherein its binding to the 5-HT5 receptor results in the induction of cAMP production.
結合パートナー及び製薬学的に認容性の添加剤、及び場合により他の有効化合物
を含有する医薬品組成物。9. A pharmaceutical composition comprising at least one binding partner according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable excipient, and optionally other active compounds.
５受容体に対する結合パートナーの使用。10. A 5-HT for producing a medicament for treating a cerebrovascular disorder.
Use of binding partners for 5 receptors.
１０記載の使用。11. Use according to claim 10, for the treatment of migraine, especially for the acute treatment of migraine.
の請求項１０又は１１記載の使用。12. Use according to claim 10 or 11, of a binding partner according to any one of claims 1 to 8.
触させ、かつ結合親和性を測定して、５−ＨＴ５受容体に対する結合パートナー
の親和性を測定するための方法。13. A method for measuring the affinity of a binding partner for the 5-HT5 receptor by contacting the binding partner with a cell line having a 5-HT5 receptor and measuring the binding affinity.
触させ、少なくとも１つの結合パートナーに誘導されるアゴニスト作用を測定し
て、５−ＨＴ５受容体に対する結合パートナーの活性を測定するための方法。14. The activity of a binding partner at the 5-HT5 receptor is determined by contacting the binding partner with a cell line having a 5-HT5 receptor and measuring the agonistic activity induced by at least one binding partner. Way to do.
ホスホリパーゼＣ活性および／またはｃＡＭＰ産生を測定する、請求項１４記載
の方法。15. GTP binding to G protein, intracellular calcium concentration,
15. The method according to claim 14, wherein phospholipase C activity and / or cAMP production is measured.
ェクションさせた異種細胞系統を使用する、請求項１４又は１５記載の方法。16. The method according to claim 14, wherein a human glioma cell line or a heterologous cell line transfected with h5-HT5 is used.
ｈ５−ＨＴ５をトランスフェクションさせたヒトの腎臓細胞又はｈ５−ＨＴ５を
トランスフェクションさせたＣ−６グリオーマ細胞を使用する、請求項１６記載
の方法。17. CHO cells transfected with h5-HT5,
17. The method according to claim 16, wherein human kidney cells transfected with h5-HT5 or C-6 glioma cells transfected with h5-HT5 are used.
する、５−ＨＴ５受容体結合パートナーの同定のためのインビトロスクリーニン
グ法。18. An in vitro screening method for identifying a 5-HT5 receptor binding partner using the method of any one of claims 13 to 17.
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