DE19900674A1 - Binding partner for 5-HT5 receptors for migraine treatment - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Bindungspartner für 5-HT5-Re zeptoren, Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung solcher Bindungspartner, sowie diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen und deren Verwendung zur Behandlung cerebrovas kulärer Erkrankungen wie Migräne.The present invention relates to binding partners for 5-HT5-Re receptors, identification and characterization methods such binding partner, as well as pharmaceutical containing them Compositions and their use in the treatment of cerebrovas culinary disorders such as migraines.
Wenigstens sieben verschiedene Rezeptorklassen vermitteln die mannigfaltigen physiologischen Aktivitäten, die einer Beteiligung des Neurotransmitters Serotonin (5-Hydroxytryptamin, kurz 5-HT) zugeschrieben werden. Sie werden entsprechend einer international anerkannten Klassifikation mit 5-HT1, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT5, 5-HT6 und 5-HT7 bezeichnet. Die meisten dieser Klassen umfassen darüber hinaus weitere unterscheidbare Rezeptortypen. So gehören zur 5-HT1-Klasse Rezeptoren, welche sich in wenigstens fünf Un terklassen einteilen lassen, die mit 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1C, 5-HT1D und 5-HT1E bezeichnet werden (Boess F. G. und Martin I. L., Neuropharmacology 33: 275-317 (1994)).At least seven different receptor classes mediate the diverse physiological activities that involve participation of the neurotransmitter serotonin (5-hydroxytryptamine, short 5-HT) be attributed. You will become one internationally recognized classification with 5-HT1, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT5, 5-HT6 and 5-HT7 designated. Most of these classes include in addition, other distinguishable receptor types. So belong to the 5-HT1 class receptors, which can be found in at least five Un categorize with 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1C, 5-HT1D and 5-HT1E (Boess F. G. and Martin I. L., Neuropharmacology 33: 275-317 (1994)).
Die 5-HT5-Klasse wurde erstmals beschrieben von Plassat et al., The EMBO Journal Bd. 11 Nr. 13, S. 4779-4786 (1992). Man unter scheidet 5-HT5A- und 5-HT5B-Rezeptoren (Erlander et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3452-3456 (1993)). Es bestehen nur ge ringe Sequenzhomologien zwischen 5-HT5 und anderen 5-HT-Rezepto ren. Das pharmakologische Profil dieser Rezeptoren unterscheidet sich deutlich. Mit molekularbiologischen Techniken gelang die Lo kalisierung von 5-HT5-Rezeptoren im Riechkolben, im Hippocampus, im Cortex, in den Zerebralventrikeln, im Corpus Callosum und im Kleinhirn. Mittels immunhistochemischer Methoden konnte gezeigt werden, daß 5-HT5-Rezeptoren vornehmlich auf Astrocyten expri miert werden (Carson et al., GLIA 17: 317-326 (1996)). Astrocyten liegen direkt an der Basalmembran von Gehirnkapillaren der Blu thirnschranke an. Eine anormale Astrocyten-Endothelium-Struktur geht mit einem Verlust der Bluthirnschranke einher. Die genaue Bedeutung der Astocyten ist unklar. Sie scheinen Transportaufga ben und konnektive Funktionen wahrzunehmen. Reaktive Astrocyten wurden in Zusammenhang mit reaktiver Gliosis bei einer Reihe von pathologischen Gehirnveränderungen und neuropsychiatrischen Er krankungen beobachtet. Infolge von Gehirnverletzungen verändern sie ihre Morphologie. Das Proteinexpressionsmuster ändert sich und Wachstumsfaktoren werden produziert. In vitro-Untersuchungen an kultivierten Astrocyten haben 5-HT5-Rezeptor-vermittelte Ant worten erkennen lassen. So wird einerseits vermutet, daß sie an Erholungsprozessen des Gehirns nach Störungen beteiligt sind, an dererseits ist aber auch nicht auszuschließen, daß sie zur Scha densentstehung oder sogar zu einer Schadensvermehrung beitragen.The 5-HT5 class was first described by Plassat et al., The EMBO Journal Vol. 11 No. 13, pp. 4779-4786 (1992). One under secretes 5-HT5A and 5-HT5B receptors (Erlander et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3452-3456 (1993)). There are only ge ring sequence homologies between 5-HT5 and other 5-HT receptors ren. The pharmacological profile of these receptors differs themselves clearly. The Lo calibration of 5-HT5 receptors in the olfactory bulb, in the hippocampus, in the cortex, in the cerebral ventricles, in the corpus callosum and in the Cerebellum. Using immunohistochemical methods it was possible to show be that 5-HT5 receptors primarily on astrocytes expri be lubricated (Carson et al., GLIA 17: 317-326 (1996)). Astrocytes lie directly on the basement membrane of brain capillaries of the Blu brain barrier. An abnormal astrocyte endothelium structure is associated with a loss of the blood brain barrier. The exact Meaning of astocytes is unclear. They seem to be transport tasks and perform connective functions. Reactive astrocytes have been associated with reactive gliosis in a number of pathological brain changes and neuropsychiatric Er diseases observed. Change as a result of brain injuries their morphology. The protein expression pattern changes and growth factors are produced. In vitro studies on cultured astrocytes, 5-HT5 receptor-mediated Ant let words recognize. On the one hand, it is suspected that it is Brain recovery processes after disorders are involved on the other hand, it can not be ruled out that they are to the Scha emergence or even contribute to an increase in damage.
Migräne ist eine ZNS-Erkrankung, die große Bevölkerungsteile be trifft. Sie äußert sich in den meisten Fällen durch immer wieder kehrende Kopfschmerzen, von denen schätzungsweise 8 Mio Personen, d. h. 3-5% aller Kinder, 7% aller Männer und 14% aller Frauen, betroffen sind. Wenngleich eine genetische Prädisposition propa giert wird, scheinen die Ursachen doch vielschichtig zu sein (Diener H. C. et al., Arzneimitteltherapie 15: 387-394 (1997)).Migraine is a CNS disease that affects large sections of the population meets. In most cases, it manifests itself again and again sweeping headache, of which an estimated 8 million people d. H. 3-5% of all children, 7% of all men and 14% of all women, are affected. Although a genetic predisposition propa The causes seem to be complex (Diener H.C. et al., Drug Therapy 15: 387-394 (1997)).
Es dominieren zwei Hypothesen. Die schon seit langem bekannte Ge fäß-Theorie schlägt als Ursache einen Dilatationsvorgang des in neren und äußeren zerebralen Gefäßsystems vor. Die neurogene Theorie stützt sich auf eine Ausschüttung vasoaktiver Neurotrans mitter, vornehmlich Neuropeptide, wie Substanz P and Neurokinin, aus Axonen der Vaskulatur infolge einer Stimulierung bestimmter Gehirngewebe innervierender Ganglien, was zu entzündlichen Reak tionen und somit zu Schmerz führen soll.Two hypotheses dominate. The long-known Ge barrel theory suggests a dilation process of the in inner and outer cerebral vasculature. The neurogenic Theory is based on the release of vasoactive neurotrans middle, mainly neuropeptides, like substance P and neurokinin, from axons of the vasculature as a result of stimulation of certain Brain tissue innervating ganglia, leading to inflammatory reak tion and thus lead to pain.
Eine Kausaltherapie zur Behandlung von Migräne gibt es derzeit noch nicht. Zwei verschiedene Behandlungsmethoden kommen momentan zur Anwendung. Eine erste, prophylaktische, Therapie zur Vorbeu gung gegen wiederkehrende Migräneattacken und eine zweite, sym ptomatische, Therapie zur Unterdrückung akuter Symptome bei At tacken. Prophylaktisch werden migränespezifische Wirkstoffe, wie Sanmigran®, Nocerton®, Desernil® und Vidora®, aber auch gewöhnlich für andere Indikation verwendete Wirkstoffe, wie Beta-Blocker, antiemetische Wirkstoffe wie Sibelium®, Antidepressiva wie Laro xyl®, oder antiepileptische Wirkstoffe wie Depakin®, verabreicht. Im Rahmen der Akuttherapie gibt man Analgetika, wie Aspirin®, Pa racetamol oder Optalidon®, nichtsteriodale Antiinflammatika, wie Cebutid®, Voltaren®, Brufen®, Ponstyl®, Profenid®, Apranx® und Na prosin® gegen den Schmerz und Entzündungen, Ergotalkaloide, wie Ergotamin, Dihydroergotamin, die eine Vasokonstriktion auslösen können, oder Substanzen der Triptan-Familie, wie Sumatriptan, Na ramig®, und AscoTop® mit hoher Affinität für 5-HT1D-Rezeptoren. Letztere Substanzen wirken als Agonist und blockieren die Vasodi latation.There is currently a causal therapy for the treatment of migraines not yet. Two different treatment methods are currently coming to use. A first, prophylactic, preventive therapy against recurring migraine attacks and a second, sym ptomatic, therapy to suppress acute symptoms in At tack. Prophylactic migraine-specific active ingredients, such as Sanmigran®, Nocerton®, Desernil® and Vidora®, but also usually active ingredients used for other indications, such as beta-blockers, antiemetic agents like Sibelium®, antidepressants like Laro xyl®, or anti-epileptic agents such as Depakin®. In the context of acute therapy, analgesics such as Aspirin®, Pa racetamol or Optalidon®, non-steroidal anti-inflammatory drugs, such as Cebutid®, Voltaren®, Brufen®, Ponstyl®, Profenid®, Apranx® and Na prosin® for pain and inflammation, ergot alkaloids, such as Ergotamine, dihydroergotamine, which cause vasoconstriction can, or substances of the triptan family, such as sumatriptan, Na ramig®, and AscoTop® with high affinity for 5-HT1D receptors. The latter substances act as an agonist and block the vasodi latation.
Die genannten Wirkstoffe sind allerdings nicht optimal für die Behandlung von Migräne geeignet. Nichtopioide Analgetika haben häufig Nebenwirkungen. Der komplexe Wirkungsmechanismus der Ergo talkaloide führt infolge der starken peripheren Vasokonstriktion zu Nebenwirkungen wie Hypertonie and Gangrän. Zu der Triptan-Fa milie gehörende Verbindungen sind ebenfalls nicht völlig zufrie denstellend (Pfaffenrath V. Münch. med. Wschr. 625-626 (1998)). However, the active ingredients mentioned are not optimal for the Suitable for treating migraines. Have non-opioid analgesics often side effects. The complex mechanism of action of the Ergo talcaloids result from the strong peripheral vasoconstriction to side effects such as hypertension and gangrene. To the Triptan Fa connections belonging to milie are also not entirely satisfied providing (Pfaffenrath V. Münch. med. Wschr. 625-626 (1998)).
Sumatriptan (Imigran®), einer der effektivsten und am häufigsten eingesetzten Wirkstoffe gegen akute Migräneattacken, passiert aufgrund ausgeprägter Hydrophilie die Bluthirnschranke nicht. In 28% der Patienten ist dieser Wirkstoff wirkungslos, die oralen Dosen liegen mit 50-100 mg recht hoch. Als Gegenanzeigen sind ko ronare Vasopasmen, Hypertonie, Nieren- und Leberstörungen bekannt geworden.Sumatriptan (Imigran®), one of the most effective and most common active ingredients used against acute migraine attacks happens due to pronounced hydrophilicity, the blood-brain barrier does not. In 28% of patients find this drug ineffective, the oral one Doses are quite high at 50-100 mg. As contraindications are ko known ronar vasopasms, hypertension, kidney and liver disorders become.
Bislang hat man Verbindungen mit selektiver Affinität für 5-HT1-Rezeptoren zur Behandlung von Migräne in Betracht gezogen (Goadsby P. J. CNS Drugs 10: 271-286 (1998); Saxena P. R. Exp. Opin. Invest. Drugs 581-593 (1996)). Beispielsweise gilt Sumatriptan als ausgesprochen selektiver Ligand für 5-HT1D-Rezeptoren, wes halb die Fachwelt bemüht war, diese Bindungseigenschaften und die dadurch vermittelten vasokonstriktiven Aktivitäten zu optimieren. Ähnliches gilt für 5-HT1B- und 5-HT1F-Rezeptorliganden. So wurden Serien von Wirkstoffen entwickelt, die den geschilderten Proble men allerdings auch nicht abhelfen konnten.So far, one has connections with selective affinity for 5-HT1 receptors considered for the treatment of migraines (Goadsby P.J. CNS Drugs 10: 271-286 (1998); Saxena P.R. Exp. Opin. Invest. Drugs 581-593 (1996)). For example, sumatriptan applies as a very selective ligand for 5-HT1D receptors, wes half of the experts were concerned with these binding properties and the thereby optimizing mediated vasoconstrictive activities. The same applies to 5-HT1B and 5-HT1F receptor ligands. So were Series of active ingredients developed that the described problem but could not help either.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die, vorzugs weise akute, Behandlung migräneartiger cerebrovaskulärer Erkran kungen mit ausreichender Wirksamkeit und geringen Nebenwirkungen zu ermöglichen.The object of the present invention is therefore, the preferred wise acute, treatment of migraine-like cerebrovascular disease with sufficient effectiveness and few side effects to enable.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Substanzen mit ver gleichsweise hoher Bindungsaffinität für 5-HT5-Rezeptoren die ge wünschten Wirkungen vermitteln können.Surprisingly, it has now been found that substances with ver equally high binding affinity for 5-HT5 receptors can convey desired effects.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher selektive Bindungspartner für 5-HT5-Rezeptoren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß deren Bindungsaffinität für 5-HT5-Rezeptoren größer ist als für einen oder mehrere von 5-HT5 verschiedene 5-HT-Rezepto ren.An object of the present invention are therefore selective Binding partner for 5-HT5 receptors, which are characterized are that their binding affinity for 5-HT5 receptors is greater than for one or more 5-HT5 receptors other than 5-HT5 ren.
Erfindungsgemäße Bindungspartner binden daher bevorzugt an 5-HT5-Rezeptoren. Unter Bindung versteht man jede molekulare Wechselwirkung zwischen dem Bindungspartner und dem Rezeptor, insbesondere unter physiologischen Bedingungen. Dies sind in der Regel klassische Wechselwirkungen, zu denen elektrostatische An ziehung, Wasserstoffbrücken-Bindung, hydrophobe Bindungen, van der-Waals-Kräfte oder metallkomplexartige koordinative Bindungen gehören. Zusätzlich zu den vorstehend genannten, reversiblen mo lekularen Wechselwirkungen können auch irreversible Wechselwir kungen zwischen Bindungspartner und Rezeptor in Betracht kommen, wie kovalente Bindungen. Binding partners according to the invention therefore bind preferentially 5-HT5 receptors. Binding means any molecular Interaction between the binding partner and the receptor, especially under physiological conditions. These are in the Usually classic interactions, to which electrostatic an drawing, hydrogen bonding, hydrophobic bonds, van der Waals forces or metal complex-like coordinative bonds belong. In addition to the reversible mo lecular interactions can also cause irreversible interactions considerations between binding partner and receptor, like covalent bonds.
Unter Selektivität versteht man die Eigenschaft eines Bindungs partners, vorzugsweise an 5-HT5-Rezeptoren zu binden.Selectivity is the property of a bond partners, preferably to bind to 5-HT5 receptors.
So besitzen Bindungspartner Bindungsaffinitäten für 5-HT5-Rezep toren, die größer sind als für einen oder mehrere von 5-HT5 ver schiedene 5-HT-Rezeptoren, also insbesondere den obengenannten 5-HT-Rezeptorklassen 5-HT1, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT6 und 5-HT7 zuzuordnenden Rezeptoren. Ist die Bindungsaffinität für 5-HT5-Re zeptoren eines Bindungspartners größer als die eines von 5-HT5 verschiedenen 5-HT-Rezeptors, so spricht man von einer in Bezug auf den von 5-HT5 verschiedenen 5-HT-Rezeptor selektiveren Bin dung dieser Bindungspartner an 5-HT5-Rezeptoren. Besondere Bin dungspartner sind diejenigen, deren Bindungsaffinität für 5-HT5-Rezeptoren größer ist als für 5-HT1-Rezeptoren, insbeson dere für 5-HT1D- und/oder 5-HT1B-Rezeptoren. Bindungspartner, de ren Bindungsaffinität für 5-HT5-Rezeptoren größer ist als für sämtliche von 5-HT5 verschiedene 5-HT-Rezeptoren, stellen eine weitere besondere Klasse von Bindungspartnern dar.For example, binding partners have binding affinities for 5-HT5 recipes gates that are larger than one or more of 5-HT5 ver different 5-HT receptors, in particular those mentioned above 5-HT receptor classes 5-HT1, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT6 and 5-HT7 assignable receptors. Is the binding affinity for 5-HT5-Re binding partner receptors larger than that of 5-HT5 different 5-HT receptor, one speaks of one in relation on the 5-HT receptor that is more selective than 5-HT5 extension of these binding partners to 5-HT5 receptors. Special bin End partners are those whose binding affinity for 5-HT5 receptors is larger than for 5-HT1 receptors, in particular for 5-HT1D and / or 5-HT1B receptors. Attachment partner, de binding affinity for 5-HT5 receptors is greater than for all 5-HT5 receptors other than 5-HT5 represent one represents another special class of attachment partners.
Für die vorstehend geschilderte Selektivität ist maßgebend, daß sich die Bindungsaffinitäten für 5-HT5-Rezeptoren einerseits und für einen oder mehrere von 5-HT5 verschiedene 5-HT-Rezeptoren an dererseits hinreichend unterscheiden. Bevorzugt sind Affinitäts unterschiede, wonach Bindungsaffinitäts-Verhältnisse von wenig stens 2, vorteilhafter von wenigstens 5, besonders vorteilhaft von wenigstens 10, vorzugsweise von wenigstens 20, besonders be vorzugt von wenigstens 50 und insbesondere von wenigstens 100 vorliegen.For the selectivity described above it is decisive that the binding affinities for 5-HT5 receptors on the one hand and for one or more 5-HT5 receptors other than 5-HT5 on the other hand make a sufficient distinction. Affinity is preferred distinguished, according to which binding affinity ratios of little least 2, more advantageous of at least 5, particularly advantageous of at least 10, preferably at least 20, especially be preferably at least 50 and in particular at least 100 available.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform hemmen erfindungsgemäße Bindungspartner die Bindung von Vergleichsbindungspartnern, wie 5-HT (5-Hydroxytryptamin) oder 5-CT (5-Carboxamidotryptamin), an 5-HT5-Rezeptoren kompetitiv.According to a preferred embodiment, inhibit according to the invention Binding partner the binding of comparative binding partners, such as 5-HT (5-hydroxytryptamine) or 5-CT (5-carboxamidotryptamine) 5-HT5 receptors competitive.
Unter kompetitiver Hemmung versteht man, daß erfindungsgemäße Bindungspartner mit einem Vergleichsbindungspartner, im vorlie genden Fall vorzugsweise 5-CT, um die Bindung an den Rezeptor konkurrieren, d. h. die Bindung des einen behindert die Bindung des anderen.Competitive inhibition means that the invention Binding partner with a comparison binding partner, in the present preferably 5-CT to bind to the receptor compete, d. H. the bond of one hinders the bond of the other.
Zumindest für den Fall der reversiblen Bindung gilt der Grund satz, daß die Verdrängung eines Bindungspartners durch einen an deren mit abnehmender Bindungsaffinität des einen bzw. zunehmen der Bindungsaffinität des anderen im Hinblick auf den Rezeptor zunimmt. Zweckmäßigerweise besitzen daher erfindungsgemäße Bin dungspartner eine hohe Bindungsaffinität für 5-HT5-Rezeptoren. Eine derartige Bindungsaffinität gestattet einerseits eine wirk same Verdrängung natürlich vorkommender Bindungspartner für 5-HT5-Rezeptoren, wie beispielsweise Serotonin (5-Hydroxytrypta min. 5-HT) selbst, wobei die erforderliche Konzentration an er findungsgemäßem Bindungspartner zur Bindung einer bestimmten Menge dieses Bindungspartners an 5-HT5-Rezeptoren mit zunehmender Bindungsaffinität abnimmt. Im Hinblick auf die medizinische An wendung werden daher Bindungspartner bevorzugt, deren Bindungsaf finität so groß ist, daß diese als Wirkstoff im Rahmen einer wirksamen medizinischen Behandlung in vertretbaren Mengen verab reicht werden können. Erfindungsgemäße Bindungspartner werden da her vorzugsweise in Tagesdosen von etwa 0,01 bis 100 mg/kg Kör pergewicht und insbesondere von etwa 0,1 bis 15 mg/kg Körperge wicht bei parenteraler Gabe und etwa 1 bis 30 mg/kg Körpergewicht bei oraler Gabe verabreicht.The reason applies at least in the case of reversible binding sentence that the displacement of a binding partner by one which increase or decrease with decreasing binding affinity of the one the binding affinity of the other with respect to the receptor increases. Appropriately therefore have bin according to the invention partner a high binding affinity for 5-HT5 receptors. On the one hand, such a binding affinity allows an effective same displacement of naturally occurring binding partners for 5-HT5 receptors, such as, for example, serotonin (5-hydroxytrypta min. 5-HT) itself, taking the required concentration of it binding partner according to the invention for binding a specific Amount of this binding partner to 5-HT5 receptors with increasing Attachment affinity decreases. With regard to medical an Therefore binding partners are preferred whose binding aff is so great that it acts as an active ingredient in a effective medical treatment in acceptable amounts can be enough. Binding partners according to the invention are there forth preferably in daily doses of about 0.01 to 100 mg / kg body perweight and in particular from about 0.1 to 15 mg / kg body weight important for parenteral administration and about 1 to 30 mg / kg body weight administered by oral administration.
Eine Möglichkeit, die Bindungsaffinität auszudrücken, bieten die oben angesprochenen Kompetitionsexperimente, mit denen man dieje nige Konzentration an erfindungsgemäßem Bindungspartner ermittelt, die einen anderen Vergleichsbindungspartner zu 50% von der Rezep torbindungsstelle verdrängt (IC50-Werte). So läßt sich auch die kompetitive Hemmung der Bindung von 5-CT an 5-HT5-Rezeptoren da hingehend auswerten, daß erfindungsgemäß bevorzugte Bindungspart ner halbmaximale Hemmkonstanten IC50 von weniger als 10-7 M, vor zugweise von weniger als 10-8 M und insbesondere von weniger als 10-9 M aufweisen.One way of expressing the binding affinity is provided by the competition experiments mentioned above, with which the concentration of binding partner according to the invention is determined which displaces another comparative binding partner by 50% from the receptor binding site (IC 50 values). Thus, the competitive inhibition of the binding of 5-CT to 5-HT5 receptors can be evaluated in such a way that binding partners preferred according to the invention have half-maximal inhibitory constants IC 50 of less than 10 -7 M, preferably less than 10 -8 M and have in particular less than 10 -9 M.
Die Bindungsaffinität erfindungsgemäßer Bindungspartner kann auch über die Hemmkonstante Ki ausgedrückt werden, die man im allgemei nen ebenfalls mit Kompetitionsexperimenten bestimmt. Für die Bin dung an 5-HT5-Rezeptoren weisen erfindungsgemäße Bindungspartner vorzugsweise Kl-Werte von weniger als 10-8 M, vorteilhafterweise von weniger als 10-9 M und insbesondere bevorzugt von weniger als 10-10 M auf.The binding affinity of binding partners according to the invention can also be expressed via the inhibition constant K i , which is also generally determined using competition experiments. For the binding to 5-HT5 receptors, binding partners according to the invention preferably have Kl values of less than 10 -8 M, advantageously less than 10 -9 M and particularly preferably less than 10 -10 M.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform binden erfindungsgemäße Bin dungspartner in Bezug auf einen oder mehrere von 5-HT5 verschie dene 5-HT-Rezeptoren selektiver an 5-HT5-Rezeptoren mit den oben beschriebenen vorteilhaften Bindungsaffinitäten.According to a further embodiment, bin according to the invention bind partner in relation to one or more of 5-HT5 den 5-HT receptors more selective to 5-HT5 receptors with the above described advantageous binding affinities.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform binden erfindungsgemäße Bin dungspartner in Bezug auf alle von 5-HT5 verschiedenen 5-HT-Re zeptoren selektiver an 5-HT5-Rezeptoren mit den oben beschriebe nen vorteilhaften Bindungsaffinitäten. According to a further embodiment, bin according to the invention bind partner for all 5-HT-Re different from 5-HT5 receptors more selective at 5-HT5 receptors with the above described beneficial binding affinities.
Besonders vorteilhaft sind Bindungspartner, die mit den vorste hend beschriebenen Affinitäten und Selektivitäten an 5-HT5-Rezep toren binden, die von Gliazellen und insbesondere von Astrocyten exprimiert werden.Binding partners with the first one are particularly advantageous affinities and selectivities described for 5-HT5 recipe bind gates from glial cells and especially from astrocytes be expressed.
Erfindungsgemäß ist die humane Rezeptorvariante bevorzugtes Tar get für die eingesetzten Bindungspartner.According to the invention, the human receptor variant is the preferred tar get for the binding partner used.
Die Bindung erfindungsgemäßer Bindungspartner an 5-HT5-Rezeptoren ist an eine Effektorfunktion gekoppelt. Bindungspartner können agonistisch oder antagonistisch sowie teilagonistisch und/oder teilantagonistisch wirken.The binding of binding partners according to the invention to 5-HT5 receptors is linked to an effector function. Binding partners can agonistic or antagonistic as well as partially agonistic and / or partially antagonistic.
Als Agonisten werden erfindungsgemäß Verbindungen bezeichnet, die ganz oder teilweise die Aktivität von 5-HT an 5-HT5-Rezeptoren nachahmen.According to the invention, agonists are compounds which all or part of the activity of 5-HT at 5-HT5 receptors imitate.
Als Antagonisten werden erfindungsgemäß Verbindungen bezeichnet, welche die agonistische Aktivität von 5-HT an 5-HT5-Rezeptoren blockieren können.According to the invention, compounds are referred to as antagonists which shows the agonistic activity of 5-HT on 5-HT5 receptors can block.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden als Bindungspartner 5-HT5-Agonisten bereitgestellt. Der Ausdruck "5-HT5-Agonist" bezeichnet Bindungspartner, die eine teil- bis vollagonistische Wirkung auslösen. Ein Bindungspartner, der eine teilagonistische Wirkung am 5-HT5-Rezeptor auslöst, be sitzt erfindungsgemäß ausreichend agonistische Aktivität, um im Rahmen einer wirksamen medizinischen Behandlung in vertretbaren Mengen verabreicht werden zu können. Bevorzugt werden Bindungs partner mit wenigstens 50%-iger agonistischer Wirkung. Besonders bevorzugt sind diejenigen Bindungspartner mit wenigstens 80%-iger agonistischer Wirkung und insbesondere diejenigen mit im wesent lichen vollagonistischer Wirkung (Emax).According to a particular embodiment of the present invention, 5-HT5 agonists are provided as binding partners. The expression "5-HT5 agonist" denotes binding partners which trigger a partially to fully agonistic effect. According to the invention, a binding partner which triggers a partially agonistic effect on the 5-HT5 receptor has sufficient agonistic activity in order to be able to be administered in an acceptable amount as part of an effective medical treatment. Binding partners with at least 50% agonistic activity are preferred. Particularly preferred are those binding partners with at least 80% agonistic activity and especially those with essentially fully agonistic activity (E max ).
Im Rahmen dieser besonderen Ausführungsform werden insbesondere Bindungspartner zur Verfügung gestellt, deren Bindung an 5-HT5-Rezeptoren eine Stimulierung der GTP-Bindung an membrange bundene G-Proteine, eine Agonist-induzierte Veränderung intrazel lulärer Calcium-Spiegel, eine Induktion der Phospholipase C-Akti vität und/oder eine Agonist-induzierte Veränderung der cAMP-Pro duktion bewirkt.Within this particular embodiment, in particular Provided binding partners, their binding to 5-HT5 receptors stimulate GTP binding to membranes bound G proteins, an agonist-induced change intracelally lular calcium level, an induction of phospholipase C-Akti vity and / or an agonist-induced change in cAMP-Pro production causes.
Zu dieser Ausführungsform gehören auch Bindungspartner, die in bekannten Tiermodellen für cerebrovaskuläre Erkrankungen, insbe sondere für Migräne, wirksam sind, und/oder die bestimmte in vi vo-Wirkungen in Gehirnbereichen induzieren, insbesondere genomi sche Antworten im Gehirn hervorrufen, beispielsweise die Expres sion von Transkriptionsfaktoren wie c-fos, c-jun, zif268 oder Ho mergen-Isoformen (Brakeman P. R. et al., Nature 386: 284-288 (1997)).This embodiment also includes binding partners that are in known animal models for cerebrovascular diseases, esp especially for migraines, are effective, and / or the specific in vi induce vo effects in brain areas, especially genomi Cause responses in the brain, such as the expresses sion of transcription factors such as c-fos, c-jun, zif268 or Ho mergen isoforms (Brakeman P.R. et al., Nature 386: 284-288 (1997)).
Bevorzugt sind Bindungspartner, die auch in Bezug auf ihre Effek torfunktion im oben beschriebenen Sinn selektiver für 5-HT5-Re zeptoren sind.Binding partners are preferred which also relate to their effect gate function in the sense described above is more selective for 5-HT5-Re are receptors.
Derartige Effektorfunktionen können mit Hilfe bekannter funktio neller Assays sowohl in vitro als auch in vivo qualitativ oder quantitativ bewertet werden.Such effector functions can be performed using known functions qualitative assays both in vitro and in vivo or be assessed quantitatively.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung erfindungsgemäßer Bin dungspartner. Diese Verfahren können die Grundlage bilden für in vitro-Screening-Verfahren, mit denen man aus einer Vielzahl ver schiedener Verbindungen diejenigen auslesen kann, die im Hinblick auf eine künftige Anwendung am aussichtsreichsten zu sein schei nen. Beispielsweise können mittels kombinatorischer Chemie um fangreiche Stoffbanken angelegt werden, die Myriaden potentieller Wirkstoffe umfassen. Das Durchmustern kombinatorischer Substanz bibliotheken nach Stoffen mit gewünschter Aktivität ist automati sierbar. Screening-Roboter dienen der effizienten Auswertung der vorzugsweise auf Mikrotiterplatten angeordneten Einzelassays. So betrifft die vorliegende Erfindung auch Screening-Verfahren, d. h. sowohl Primär- als auch Sekundärscreening-Verfahren, bei denen vorzugsweise wenigstens eines der nachfolgend beschriebenen Ver fahren zur Anwendung kommt. Kommen mehrere Verfahren zur Anwen dung, so kann das zeitlich versetzt oder gleichzeitig an ein und derselben Probe oder an verschiedenen Proben einer zu untersu chenden Substanz geschehen.The present invention therefore also relates to methods for identifying and characterizing bin according to the invention partner. These procedures can form the basis for in vitro screening method, with which one ver from a variety different connections can read out those that are in view Seems to be the most promising for a future application nen. For example, using combinatorial chemistry catchy fabric banks are created, the myriads of potential Active ingredients include. Screening combinatorial substance libraries by substance with the desired activity is automatic sizable. Screening robots are used for the efficient evaluation of preferably individual assays arranged on microtiter plates. So the present invention also relates to screening methods, i. H. both primary and secondary screening procedures where preferably at least one of the ver described below driving comes into play. Several procedures are used dung, it can be staggered or at the same time to one and the same sample or on different samples to be examined happening substance.
Eine besonders effektive Technologie zur Durchführung derartiger Verfahren ist der im Bereich des Wirkstoffscreenings bekannte Scintillation Proximity Assay, kurz SPA genannt. Kits und Kompo nenten zur Durchführung dieses Assays können kommerziell bezogen werden, beispielweise bei Amersham Pharmacia Biotech. Im Prinzip werden solubilisierte oder membrangebundene Rezeptoren auf Scin tillationssubstanz enthaltenden, kleinen Fluoromikrosphären immo bilisiert. Bindet beispielsweise ein Radioligand an die immobili sierten Rezeptoren, so wird die Scintillationssubstanz zur Lich temission angeregt, da die räumliche Nähe zwischen Scintillati onssubstanz und Radioligand gegeben ist.A particularly effective technology for performing such The method is the one known in the field of active substance screening Scintillation Proximity Assay, SPA for short. Kits and compo Components for performing this assay can be obtained commercially at Amersham Pharmacia Biotech. Basically become solubilized or membrane bound receptors on Scin small fluoromicrospheres containing tillation substance immo bilizes. For example, binds a radioligand to the immobili based receptors, the scintillation substance becomes Lich temission stimulated because of the spatial proximity between Scintillati substance and radio ligand is given.
Eine weitere besonders effektive Technologie zur Durchführung derartiger Verfahren ist die im Bereich des Wirkstoffscreenings bekannte FlashPlate®-Technologie. Kits und Komponenten zur Durch führung dieses Assays können kommerziell bezogen werden, bei spielweise bei NENR Life Science Products. Dieses Prinzip basiert ebenfalls auf Mikrotiterplatten (96er oder 384er), die mit Scin tillationssubstanz beschichtet sind.Another particularly effective technology for carrying out such processes is the FlashPlate® technology known in the field of active substance screening. Kits and components for performing this assay can be obtained commercially, for example from NEN R Life Science Products. This principle is also based on microtiter plates (96 or 384), which are coated with scintillation substance.
Ein erstes erfindungsgemäßes Verfahren dient zur Bestimmung der Affinität und/oder Selektivität von Bindungspartnern für 5-HT5-Rezeptoren. Zu diesem Zweck bringt man den Bindungspartner mit 5-HT5-Rezeptoren in Kontakt und bestimmt die Bindungsaffini tät. Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, daß man die kom petitive Hemmung der Bindung eines Vergleichsbindungspartner an 5-HT5-Rezeptoren durch die zu untersuchende Substanz bewertet. Als Vergleichsbindungspartner eignen sich bekannte Liganden für 5-HT-Rezeptoren, wie 5-HT oder 5-CT. Diese werden zweckmäßiger weise so markiert, daß sich deren Bindung an 5-HT-Rezeptoren ana lytisch mit Standardmethoden verfolgen läßt. Bevorzugt sind ra dioaktive und optische Markierungen. Bei Bindungsstudien an 5-HT5-Rezeptoren wird erfindungsgemäß 5-CT insbesondere in Form von [3H]-5-CT verwendet. Die Bindungsaffinitäten können als halb maximale Hemmungkonstante IC50 oder als Hemmkonstante Ki ausge drückt werden. Dieses Verfahren dient vorzugsweise zum primären Screening. Die SPA-Technologie kommt bevorzugt zur Anwendung.A first method according to the invention serves to determine the affinity and / or selectivity of binding partners for 5-HT5 receptors. For this purpose, the binding partner is brought into contact with 5-HT5 receptors and the binding affinity is determined. This can be done, for example, by evaluating the com petitive inhibition of the binding of a comparative binding partner to 5-HT5 receptors by the substance to be examined. Known ligands for 5-HT receptors, such as 5-HT or 5-CT, are suitable as comparison binding partners. These are appropriately marked so that their binding to 5-HT receptors can be analyzed analytically using standard methods. Radioactive and optical markings are preferred. In binding studies on 5-HT5 receptors, 5-CT is used according to the invention, in particular in the form of [ 3 H] -5-CT. The binding affinities can be expressed as a half maximum inhibition constant IC 50 or as an inhibition constant K i . This method is used primarily for primary screening. SPA technology is preferred.
Die Bindung zu untersuchender Bindungspartner kann man auch an 5-HT-Rezeptoren direkt bestimmen. Die Bindungsaffinität ausdrückende Hemmkonstanten Ki können beispielsweise kalorimetrisch, d. h. durch Messung der freigesetzten Bindungsenergie, bestimmt werden.The binding partner to be examined can also be determined directly on 5-HT receptors. Inhibitory constants K i expressing the binding affinity can be determined, for example, calorimetrically, ie by measuring the released binding energy.
Zur Bestimmung von Selektivitäten bestimmt man in gleicher Weise - gegebenenfalls unter Verwendung der für den jeweiligen Rezeptor spezifischen Liganden - die Bindungsaffinität der zu untersuchen den Bindungspartner für andere 5-HT-Rezeptoren und vergleicht die erhaltenen Werte.Selectivity is determined in the same way - If necessary, using that for the respective receptor specific ligands - to examine the binding affinity of the the binding partner for other 5-HT receptors and compares them received values.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren betrifft die Bestimmung der Aktivität von Bindungspartnern für 5-HT5-Rezeptoren, d. h. die Bestimmung agonistischer, teilagonistischer, antagonistischer und/oder teilantagonistischer Wirkung. Zu diesem Zweck bringt man den Bindungspartner mit 5-HT5-Rezeptoren in Kontakt und bewertet die durch die Bindung hervorgerufenen Effekte. Der Beurteilung einer agonistischen Aktivität können all diejenigen Effekte zu grundegelegt werden, die durch die Bindung von 5-HT an 5-HT5-Re zeptoren hervorgerufen werden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, die Auswirkungen auf die Bindung von GTP an G-Proteine, auf in terzelluläre Calcium-Spiegel, auf die Phospholipase C-Aktivität und/oder auf die cAMP-Produktion zu bewerten. Diese Verfahren dienen vorzugsweise zum sekundären Screening. Auch hier kommt die SPA-Technologie vorteilhaft zur Anwendung.Another method according to the invention relates to the determination the activity of binding partners for 5-HT5 receptors, d. H. the Determination of agonistic, partially agonistic, antagonistic and / or partially antagonistic effect. For this purpose you bring the binding partner in contact with 5-HT5 receptors and evaluated the effects caused by the bond. The assessment An agonistic activity can have all those effects be determined by the binding of 5-HT to 5-HT5-Re receptors are caused. According to the invention, it is preferred the effects on the binding of GTP to G proteins on in tercellular calcium levels, on phospholipase C activity and / or to evaluate cAMP production. This procedure are used primarily for secondary screening. Here too comes the SPA technology beneficial to use.
Die GTP-Bindung an G-Proteine kann untersucht werden, indem man ein nicht hydrolysierbares Analogon von GTP verwendet, beispiels weise [35S]GTPγS, dessen Bindung radiologisch untersucht werden kann. Diese Untersuchung wird vorzugsweise an 5-HT5-Rezeptor auf weisenden Membranen durchgeführt.GTP binding to G proteins can be examined using a non-hydrolyzable analog of GTP, for example [ 35 S] GTPγS, the binding of which can be examined radiologically. This investigation is preferably carried out on 5-HT5 receptor on pointing membranes.
Zur Messung intrazellulärer Calcium-Spiegel kann man geeignete Calcium-Sonden, in der Regel Calcium-Chelatoren, beispielsweise fluoreszierende Verbindungen, wie Fura-2-acetylmethylester, ein setzen. Diese Untersuchung wird vorzugsweise an 5-HT5-Rezeptor aufweisenden Einzelzellen durchgeführt.Suitable for measuring intracellular calcium levels Calcium probes, usually calcium chelators, for example fluorescent compounds such as fura-2-acetylmethyl ester put. This test is preferably done on 5-HT5 receptor having single cells performed.
Die Phospholipase C-Aktivität läßt sich anhand der von ihr kataly sierten Reaktionen bestimmen, beispielsweise dem Einbau von Myo- Inositol, das zu Nachweiszwecken vorzugsweise als [3H]-Myo-Inosi tol radioaktiv markiert ist, oder die Umsetzung von PPIP2 zu IP3, wobei auch das PPIP2 vorzugsweise als [32P]PIP2 radioaktiv mar kiert ist. Diese Untersuchungen werden vorzugsweise an 5-HT5-Re zeptor aufweisenden Einzelzellen durchgeführt.The phospholipase C activity can be determined on the basis of the reactions catalyzed by it, for example the incorporation of myo-inositol, which is preferably radioactively labeled as [ 3 H] -myo-inosol for detection purposes, or the conversion of PPIP 2 to IP 3 , the PPIP 2 also preferably being radioactively labeled as [ 32 P] PIP 2 . These investigations are preferably carried out on single cells having 5-HT5 receptors.
Die cAMP-Produktion kann mit Hilfe des cAMP-Bindungsproteins be stimmt werden. Diese Untersuchung wird vorzugsweise an 5-HT5-Re zeptor aufweisenden Einzelzellen durchgeführt.The cAMP production can be with the help of the cAMP binding protein be true. This test is preferably carried out on 5-HT5-Re single cells having zeptor performed.
Gegebenfalls bestimmt man auch die Effektorfunktion, d. h. die Ak tivität von erfindungsgemäßen Bindungspartnern für andere 5-HT- Rezeptoren. Dies geschieht zweckmäßigerweise unter Berücksichti gung der für 5-HT5 und andere 5-HT-Rezeptoren ermittelten Bin dungsaffinitäten, also insbesondere unter Berücksichtigung der Selektivität.If necessary, one also determines the effector function, i. H. the Ak activity of binding partners according to the invention for other 5-HT Receptors. This is expediently taken into account of the bin determined for 5-HT5 and other 5-HT receptors affinity, especially taking into account the Selectivity.
Die vorstehend genannten Verfahren sind dem Fachmann im Prinzip bekannt.The above-mentioned methods are in principle a person skilled in the art known.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden Bindungspartner einem primären Screening unterzogen, indem man ihre Bindungsaffi nität zu 5-HT5-Rezeptoren mit dem oben beschriebenen [3H]-5-CT- Kompetitionsexperiment bestimmt. Diejenigen Bindungspartner, die eine Hemmkonstante IC50 im Bereich von 10-6 M oder weniger aufwei sen, werden dann einem sekundären Screening unterzogen, indem man ihre Effektorfunktion insbesondere im Hinblick auf die GTP-Bin dung und die intrazellulären Calcium-Spiegel in der oben be schriebenen Weise bewertet. Schließlich werden die so ausgewähl ten Bindungspartner zur Selektivitätbestimmung einem Gegen-Scree ning unterzogen, indem man ihre Bindungsaffinität zu weiteren 5-HT-Rezeptoren im wesentlichen in der vorstehend beschriebenen Art und Weise - gegebenenfalls unter Verwendung der für den je weiligen Rezeptor spezifischen Liganden - bestimmt. Beispiels weise kann man [3H]-8-Hydroxy-di-propylaminotetralin [3H]-8-DPAT für Bindungsstudien an 5-HT1A-Rezeptoren verwenden, während 5-HT1B- und 5-HT1D-Rezeptoren mit [3H]-5-CT-Kompetitionsexperimen ten untersucht werden können.In a preferred embodiment, binding partners are subjected to primary screening by determining their binding affinity for 5-HT5 receptors with the [ 3 H] -5-CT competition experiment described above. Those binding partners that have an inhibitory constant IC 50 in the range of 10 -6 M or less are then subjected to secondary screening by examining their effector function, particularly with regard to GTP binding and intracellular calcium levels written way. Finally, the binding partners selected in this way are subjected to counter-screening for the determination of selectivity by determining their binding affinity for further 5-HT receptors essentially in the manner described above - if appropriate using the ligands specific for the particular receptor . For example, [ 3 H] -8-hydroxy-di-propylaminotetralin [ 3 H] -8-DPAT can be used for binding studies on 5-HT1A receptors, while 5-HT1B and 5-HT1D receptors with [ 3 H] -5-CT competition experiments can be examined.
5-HT5-Rezeptoren werden vorzugsweise in Form zellulärer Systeme zur Verfügung gestellt, d. h. in Form von Membranen, Zellen, Zell verbänden, Geweben oder Organen, die 5-HT5-Rezeptoren tragen. Derartige zelluläre Systeme können 5-HT5-Rezeptoren von Natur aus exprimieren, sie können aber auch durch geeignete genetische Ma nipulation, z. B. durch Transfektion, zur 5-HT5-Expression veran laßt sein. Humane Gliom-Zellinien werden als natürliche, 5-HT5-Rezeptoren aufweisende zelluläre Systeme bevorzugt. Von den h5-HT5-transfizierten heterologen Zellinien werden diejenigen be vorzugt, die das h5-HT5-Gen stabil exprimieren. Zu nennen sind beispielsweise h5-HT5-transfizierte CHO-Zellen, h5-HT5-transfi zierte humane Nierenzellen, insbesondere h5-HT5-transfizierte HEK293-Zellen, oder h5HT5-transfizierte C-6-Gliomzellen.5-HT5 receptors are preferably in the form of cellular systems provided, d. H. in the form of membranes, cells, cells associations, tissues or organs that carry 5-HT5 receptors. Such cellular systems can inherently 5-HT5 receptors express, but they can also by appropriate genetic Ma nipulation, e.g. B. by transfection to 5-HT5 expression let it be. Human glioma cell lines are considered natural, Cellular systems having 5-HT5 receptors are preferred. Of the h5-HT5 transfected heterologous cell lines will be those preferred that stably express the h5-HT5 gene. To be mentioned for example h5-HT5 transfected CHO cells, h5-HT5 transfi graced human kidney cells, especially h5-HT5 transfected HEK293 cells, or h5HT5 transfected C-6 glioma cells.
Zur Bestimmung von Selektivität, Affinität und Aktivität erfin dungsgemäßer Bindungspartner können auch Gehirngewebeschnitte und native Membranen aus Gehirnteilen verwendet werden. Werden radio aktive Marker eingesetzt, so erfolgt die Auswertung von Gewebe schnitten vorzugsweise autoradiographisch.To determine selectivity, affinity and activity invented According to the binding partner can also brain tissue sections and native membranes from brain parts are used. Be radio If active markers are used, tissue is evaluated cut preferably autoradiographically.
Die erfindungsgemäßen Bindungspartner werden gewöhnlich in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht, die einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten mit wenigstens einem er findungsgemäßen Bindungspartner und gegebenenfalls weiteren Wirk stoffen umfassen. Diese Zusammensetzungen können beispielsweise auf oralem, rektalem, transdermalem, subkutanem, intravenösem, intramuskulärem oder intranasalem Weg verabreicht werden.The binding partners of the invention are usually in the form of pharmaceutical compositions administered a pharmaceutically acceptable excipients with at least one he binding partner according to the invention and optionally further active ingredient include fabrics. These compositions can, for example on oral, rectal, transdermal, subcutaneous, intravenous, administered intramuscularly or intranasally.
Beispiele geeigneter pharmazeutischer Formulierungen sind feste Arzneiformen, wie Pulver, Puder, Granulate, Tabletten, Pastillen, Sachets, Cachets, Dragees, Kapseln wie Hart- und Weichgelatine kapseln, Suppositorien oder vaginale Arzneiformen, halbfeste Arz neiformen, wie Salben, Cremes, Hydrogele, Pasten oder Pflaster, sowie flüssige Arzneiformen, wie Lösungen, Emulsionen, insbeson dere Öl-in-Wasser-Emulsionen, Suspensionen, beispielsweise Lotio nen, Injektions- und Infusionszubereitungen, Augen- und Ohren tropfen. Auch implantierte Abgabevorrichtungen können zur Verab reichung erfindungsgemäßer Bindungspartner verwendet werden. Fer ner können auch Liposomen, Mikroshären oder Polymermatrizes zur Anwendung kommen.Examples of suitable pharmaceutical formulations are solid Pharmaceutical forms, such as powder, powder, granules, tablets, lozenges, Sachets, cachets, coated tablets, capsules such as hard and soft gelatin capsules, suppositories or vaginal dosage forms, semi-solid medic neiforms, such as ointments, creams, hydrogels, pastes or plasters, as well as liquid pharmaceutical forms, such as solutions, emulsions, in particular other oil-in-water emulsions, suspensions, for example Lotio NEN, injection and infusion preparations, eyes and ears drops. Implanted delivery devices can also be used for administration range of binding partners according to the invention can be used. Fer ner can also liposomes, micro-spheres or polymer matrices Application come.
Bei der Herstellung der Zusammensetzungen werden erfindungsgemäße Bindungspartner gewöhnlich mit einem Exzipienten vermischt oder verdünnt. Exzipienten können feste, halbfeste oder flüssige Mate rialien sein, die als Vehikel, Träger oder Medium für den Wirk stoff dienen.In the preparation of the compositions according to the invention Binding partners are usually mixed with an excipient or diluted. Excipients can be solid, semi-solid or liquid mate rialien, as a vehicle, carrier or medium for the active serve fabric.
Zu geeigneten Exzipienten gehören beispielsweise Lactose, Dex trose, Succrose, Sorbitol, Manitol, Stärken, Akaziengummi, Calci umphosphat, Alginate, Traganth, Gelantine, Calciumsilikat, mikro kristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Wasser, Sirup und Methylcellulose. Ferner können die Formulierungen phar mazeutisch akzeptable Träger oder übliche Hilfsstoffe, wie Gleit mittel, beispielsweise Talg, Magnesiumstearat und Mineralöl; Netzmittel; emulgierende und suspendierende Mittel; konservie rende Mittel, wie Methyl- und Propylhydroxybenzoate; Antioxidan tien; Antireizstoffe; Chelatbildner; Dragierhilfsmittel; Emul sionsstabilisatoren Filmbildner; Gelbildner; Geruchsmaskierungs mittel; Geschmackskorrigentien; Harze; Hydrokolloide; Lösemittel; Lösungsvermittler; Neutralisierungsmittel; Permeationsbeschleuni ger; Pigmente; quaternäre Ammoniumverbindungen; Rückfettungs- und Überfettungsmittel; Salben-, Creme- oder Öl-Grundstoffe; Silikon- Derivate; Spreithilfsmittel; Stabilisatoren; Sterilanzien; Suppo sitoriengrundlagen; Tabletten-Hilfsstoffe, wie Bindemittel, Füll stoffe, Gleitmittel, Sprengmittel oder Überzüge; Treibmittel; Trocknungsmittel; Trübungsmittel; Verdickungsmittel; Wachse; Weichmacher; Weißöle umfassen. Eine diesbezügliche Ausgestaltung beruht auf fachmännischem Wissen, wie beispielsweise in Fiedler, H. P., Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angren zende Gebiete, 4. Auflage, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996, dargestellt ist.Suitable excipients include, for example, lactose, dex trose, succrose, sorbitol, manitol, starches, acacia, calci umphosphate, alginates, tragacanth, gelatin, calcium silicate, micro crystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, Syrup and methyl cellulose. Furthermore, the formulations can be phar pharmaceutically acceptable carriers or conventional excipients such as glide medium, for example tallow, magnesium stearate and mineral oil; Wetting agents; emulsifying and suspending agents; conserve agents such as methyl and propyl hydroxybenzoates; Antioxidant tien; Anti-irritants; Chelating agents; Coating aids; Emul ion stabilizers film formers; Gelling agent; Odor masking medium; Taste corrections; Resins; Hydrocolloids; Solvents; Solubilizer; Neutralizing agents; Permeation acceleration ger; Pigments; quaternary ammonium compounds; Regreasing and Superfatting agents; Ointment, cream or oil base materials; Silicone- Derivatives; Spreading aids; Stabilizers; Sterilizers; Suppo territorial foundations; Tablet excipients, such as binders, fillers fabrics, lubricants, disintegrants or coatings; Blowing agent; Desiccants; Opacifiers; Thickeners; Waxes; Plasticizers; Include white oils. A design in this regard is based on professional knowledge, such as in Fiedler, H. P., Lexicon of excipients for pharmacy, cosmetics and angren zende areas, 4th edition, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung ei nes Bindungspartner für 5HT-5-Rezeptoren und insbesondere der vorstehend genannten besonderen und bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Bindungspartner zur Behandlung migräneartiger cerebrovasculärer Erkrankungen, vor allem zur Behandlung von Mi gräne und anderen vaskulär bedingten Kopfschmerzen, insbesondere anfallartigen Kopfschmerzen vom Migränetyp. Hierzu gehören die als einfache und als klassische Migräne bezeichneten Erkrankungen ohne bzw. mit begleitenden neurologischen Funktionsstörungen, echte und atypische Migräne, und auch speziellere Erkrankungen dieses Typs, beispielsweise Migraine accompagnée, sogenannte Mi gräneäquivalente, Digestivmigräne, Migraine ophtalmique, ophtal mophlegische Migräne, Migraine rouge, auch als Cluster-Kopf schmerz (Horton-Syndrom) bezeichnet, Zervikalmigräne. Unter Be handlung wird sowohl eine prophylaktische Therapie, insbesondere die Vorbeugung gegen wiederkehrende Attacken, beispielsweise als Intervallbehandlung, als auch die Behandlung bei akuten Sympto men, insbesondere während der Kopfschmerzphasen, verstanden. Eine erfolgreiche Behandlung führt zu einer Minderung der Intensität der Symptome, insbesondere des Kopfschmerzes, neurologischer Funktionsstörungen, z. B. visueller, sensorischer, motorischer Störungen und Srachstörungen, Übelkeit und Brechreiz, und/oder der Anfallhäufigkeit. Eine akute Behandlung von Migräne mit Bin dungspartnern ist bevorzugt. Gegenstand der Erfindung ist insbe sondere auch die Verwendung der genannten Bindungspartner für die Behandlung solcher Formen oben aufgeführter Erkrankungen, an de ren Entstehung und/oder Verlauf 5-HT5-Rezeptoren beteiligt sind, d. h. Erkrankungen, die durch eine 5-HT5-Rezeptoraktivität modu liert werden.The present invention also relates to the use of egg Nes binding partner for 5HT-5 receptors and especially the above-mentioned special and preferred embodiments binding partner according to the invention for the treatment of migraine-like cerebrovascular diseases, especially for the treatment of Mi tears and other vascular headaches, in particular seizure-like headache of the migraine type. These include the diseases known as simple and classic migraines without or with accompanying neurological dysfunction, real and atypical migraines, and also more specific diseases of this type, for example Migraine accompagnée, so-called Mi equine equivalent, digestive migraine, migraine ophtalmique, ophthalmic mophlegic migraine, migraine rouge, also as a cluster head pain (Horton syndrome), cervical migraine. Under Be act becomes both a prophylactic therapy, in particular the prevention of recurring attacks, for example as Interval treatment, as well as treatment for acute symptoms men, especially during the headache phases. A successful treatment leads to a reduction in intensity symptoms, especially headache, neurological Malfunctions, e.g. B. visual, sensory, motor Disorders and speech disorders, nausea and nausea, and / or the frequency of attacks. An acute treatment for migraines with bin partner is preferred. The invention relates in particular special also the use of the binding partners mentioned for the Treatment of such forms of the diseases listed above, de their formation and / or course 5-HT5 receptors are involved, d. H. Diseases caused by 5-HT5 receptor activity be lated.
Zu Bindungspartnern für 5-HT5-Rezeptoren gehören im Hinblick auf die erfindungsgemäße Verwendung auch insbesondere diejenigen, de ren Bindungsaffinität zu 5-HT5-Rezeptoren verglichen mit der Af finität zu 5-HT1-Rezeptoren, insbesondere 5-HT1B und/oder 5-HT1D, so hoch ist, daß sie für die erfindungsgemäße Verwendung in vor teilhafter Weise geeignet sind. Dies setzt nicht notwendigerweise eine vergleichsweise selektivere Bindung an 5-HT5-Rezptoren vor aus, wenngleich selektive Bindungspartner für 5-HT5-Rezptoren eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind.Binding partners for 5-HT5 receptors include with regard to the use according to the invention in particular those de their binding affinity for 5-HT5 receptors compared to the Af 5-HT1 receptors, especially 5-HT1B and / or 5-HT1D, is so high that it is suitable for use in accordance with the invention are suitably suitable. This does not necessarily mean comparatively more selective binding to 5-HT5 receptors from, albeit selective binding partners for 5-HT5 receptors are a particular embodiment of the present invention.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein.The present invention is illustrated by the following examples explained in more detail without being limited thereto.
Das für den humanen 5-HT5-Rezeptor kodierende Gen wurde in an sich bekannter Weise über 3'-5'-RT-PCR (RACE-System, Boehringer Mannheim) aus menschlichen Geweben isoliert. Die Gensequenz wurde dann in ein das Neomycinresistenz-Gen tragendes Plasmid inser tiert (pcDNA3; Invitrogen, Deutschland) und in E. coli den Her stellerhinweisen entsprechend amplifiziert. Eine Präparation des resultierenden Plasmids wurde mit Lipofectamin® (Gibco Life-Scien ces, Deutschland) vermischt, und HEK293-Zellen wurden in Petri schalen (2,5 cm) mit einer dünnen Schicht dieses Transfektionsge misches inkubiert. Danach wurde das Transfektionsgemisch durch Neomycin-haltiges Kulturmedium ersetzt. Überlebende Zellen wurden weiter in DMEM-F12-Medium kultiviert, das mit 10% fötalem Kälber serum, 2 mM Glutamin und Antibiotika (90 mg Streptomycin, 90 mg Penicillin) ergänzt war. Die Zellen wurden bei 5% CO2, 95% Luft feuchtigkeit und 37°C bis zur Konfluenz aufgezogen.The gene coding for the human 5-HT5 receptor was isolated from human tissues in a manner known per se using 3'-5'-RT-PCR (RACE system, Boehringer Mannheim). The gene sequence was then inserted into a plasmid carrying the neomycin resistance gene (pcDNA3; Invitrogen, Germany) and amplified in accordance with the manufacturer's instructions in E. coli. A preparation of the resulting plasmid was mixed with Lipofectamin® (Gibco Life Science, Germany) and HEK293 cells were incubated in Petri dishes (2.5 cm) with a thin layer of this transfection mixture. The transfection mixture was then replaced by culture medium containing neomycin. Surviving cells were further cultured in DMEM-F12 medium supplemented with 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine and antibiotics (90 mg streptomycin, 90 mg penicillin). The cells were grown to confluence at 5% CO 2 , 95% atmospheric humidity and 37 ° C.
Die hier verwendete Methode lehnt sich im wesentlichen an be kannte Methoden zur Präparation von Zellmembranen aus Zellen an (Findlay J. B. C. und Evans W. H. Biological Membranes, Practical Approach (1987). Die gemäß Referenzbeispiel 1 kultivierte Zellen wurden vorsichtig von der Oberfläche des Kulturgefäßes abgeschabt und 10 min bei 180 × g in DMEM-F12-Medium zentrifugiert. Die gewon nenen Zellpellets wurden in 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 0,1 mM PMSF und 3 mM Benzamidin enthaltendem 5 mM Tris-HCl-Puffer (pH: 7,6; Puf fer A) resuspendiert und 15 min bei 4°C inkubiert. Die Zellsuspen sion wurde in einem Ultraturrax® (15.000 UPM) homogenisiert (6 × 3 s) und 1 min bei 1000 × g und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in Puffer A resuspendiert und, wie vorstehend beschrieben, homogeni siert und zentrifugiert. Die Überstände aus beiden Schritten wur den gesammelt und 20 min bei 40.000 × g und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in Puffer A resuspendiert und homogenisiert (1 × 15 s). Die Membransuspension wurde 20 min bei 40.000 × g und 4°C zentrifu giert. Das resultierende Pellet wurde in 10% Glycerin und 1% Rin derserumalbumin enthaltendem Puffer A resuspendiert. Es wurden Aliquots eingefroren und bei -80°C bis zum Gebrauch aufbewahrt.The method used here is essentially based on Known methods for the preparation of cell membranes from cells (Findlay J.B.C. and Evans W.H. Biological Membranes, Practical Approach (1987). The cells cultured according to Reference Example 1 were carefully scraped off the surface of the culture vessel and centrifuged for 10 min at 180 x g in DMEM-F12 medium. The won The cell pellets were in 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 0.1 mM PMSF and 3 mM Tris-HCl buffer containing 3 mM benzamidine (pH: 7.6; Puf fer A) resuspended and incubated for 15 min at 4 ° C. The cell suspensions sion was homogenized in an Ultraturrax® (15,000 rpm) (6 × 3 s) and centrifuged for 1 min at 1000 x g and 4 ° C. The pellet was in Buffer A resuspended and, as described above, homogeneous centrifuged and centrifuged. The supernatants from both steps were the collected and centrifuged for 20 min at 40,000 × g and 4 ° C. The The pellet was resuspended in buffer A and homogenized (1 × 15 s). The membrane suspension was centrifuged at 40,000 × g and 4 ° C. for 20 min yaws. The resulting pellet was in 10% glycerin and 1% Rin buffer A containing serum albumin resuspended. There were Frozen aliquots and stored at -80 ° C until use.
Die Methodik ist im wesentlichen bekannt (Ress S. et al., FEBS Letters 335: 242-246 (1994)). Gemäß Referenzbeispiel 2 gewonnene Membranen (200 µl) wurden bei einem Gesamtvolumen von 600 µl in 1 mM EDTA enthaltendem 100 mM Tris-HCl (pH: 7,7; Puffer B) mit an steigenden Konzentrationen an [3H]-5-CT (96 Ci/mmol) inkubiert, wobei zur Bestimmung der spezifischen Bindung 10 µM Methiothepin zugesetzt wurde, während zur Bestimmung der Gesamtbindung Methio thepin nicht zugesetzt wurde. Es wurde 90 min bei 30°C inkubiert. Danach wurden die Proben filtriert, wobei man ein Skatron®-Filtra tionssystem und in 0,3% Polyethylenimid eingebettete GF/B-Filter verwendete. Die Filter wurden mit 9 ml Puffer B bei 4°C gewaschen. Die auf den Filtern zurückgehaltene Radioaktivität wurde mittels Flüssigscintillationszählung gemessen, wobei man 5 ml Ultima-Gold (Packard) verwendete. The methodology is essentially known (Ress S. et al., FEBS Letters 335: 242-246 (1994)). Membranes obtained according to Reference Example 2 (200 µl) were mixed with a total volume of 600 µl in 100 mM Tris-HCl (pH: 7.7; buffer B) containing 1 mM EDTA with increasing concentrations of [ 3 H] -5-CT 96 Ci / mmol), with 10 µM methiothepin being added to determine the specific binding, while methio thepin was not added to determine the total binding. It was incubated at 30 ° C. for 90 min. The samples were then filtered using a Skatron® filtration system and GF / B filters embedded in 0.3% polyethyleneimide. The filters were washed with 9 ml buffer B at 4 ° C. Radioactivity retained on the filters was measured by liquid scintillation counting using 5 ml Ultima Gold (Packard).
Die Experimente zur Bindungskompetition erfolgten im wesentlichen in Anlehnung an bekannte Untersuchungen (Rees et al., 1994). Ge mäß Beispiel 2 gewonnene Membranen (200 µl) wurden in einem Ge samtvolumen von 600 µl in Puffer B mit ansteigenden Konzentratio nen ausgewählter Verbindungen in Gegenwart von 2 nM [3H]-5-CT in kubiert. Nach einer Inkubationszeit von 75 min bei 30°C wurden die Proben mit Puffer B bei 4°C über in 0,3% Polyethylenimid eingebet teten GF/B-Filtern filtriert. Die Filter wurden mit 9 ml Puffer B gewaschen. Die auf den Filtern zurückgehaltene Radioaktivität wurde wie in Referenzbeispiel 3 bestimmt. Die Gesamtbindung wurde definiert als diejenige Bindung des Radioliganden, die ohne Zu satz weiterer Verbindungen beobachtet wurde. Die nicht-spezifi sche Bindung wurde definiert als diejenige Bindung von [3H]-5-CT, die in Gegenwart von 10 µM Methiothepin beobachtet wurde. Es kön nen auch ähnliche Systeme verwendet werden, die durch Verwendung von Mikrotiterplatten einen hohen Probendurchsatz und ein Sekun därscreening gestatten.The experiments on binding competition were essentially based on known studies (Rees et al., 1994). Ge membranes obtained according to Example 2 (200 μl) were incubated in a total volume of 600 μl in buffer B with increasing concentrations of selected compounds in the presence of 2 nM [ 3 H] -5-CT. After an incubation period of 75 min at 30 ° C., the samples were filtered with buffer B at 4 ° C. over GF / B filters embedded in 0.3% polyethyleneimide. The filters were washed with 9 ml of Buffer B. The radioactivity retained on the filters was determined as in Reference Example 3. The total binding was defined as the binding of the radioligand that was observed without the addition of further compounds. The non-specific binding was defined as that binding of [ 3 H] -5-CT that was observed in the presence of 10 μM methiothepin. Similar systems can also be used which, through the use of microtiter plates, permit high sample throughput and secondary screening.
Die Sättigungsparameter der [3H]-5-CT-Bindung wurden sowohl durch nicht-lineare Regressionsanalyse als auch aus linearen Auftragun gen bei Verwendung der SigmaPlot-Software (Jandel Scientific, Germany) bestimmt. Es wurden Kompetitionskurven aufgestellt, in denen die radioaktive Bindung als prozentualer Anteil der Gesamt bindung ausgedrückt ist. Halbmaximale Hemmkonstanten IC50 und Hill-Koeffizienten (nH) wurden mittels nicht-linearer Regres sionsanalyse ermittelt.The saturation parameters of the [ 3 H] -5-CT binding were determined both by non-linear regression analysis and from linear plots using the SigmaPlot software (Jandel Scientific, Germany). Competition curves were drawn up in which the radioactive binding is expressed as a percentage of the total binding. Half-maximum inhibition constants IC 50 and Hill coefficients (n H ) were determined by means of non-linear regression analysis.
[35S]GTPγS-Bindungsassays sind bekannt. Der vorliegende Assay wurde in Anlehnung an die zuvor beschriebene Methode von Hilf, G. und Jakobs, K. H. (Eur. J. Mol. Pharmacol. 225: 245-252 (1992)) durchgeführt. Es wurden Wirkstoff-induzierte Veränderungen der [35S]GTPγS-Bindung an Membranen aus stabil mit dem h5HT5-Rezeptor gen transfizierten HEK293-Zellen gemessen (siehe Referenzbei spiele 1 und 2). Die Zellmembranen (12 µg) wurden mit 6,75 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 10 µM GDP und [35S]GTPγS enthaltendem 50 mM Triethanolamin-HCl-Puffer (pH: 7.5) inkubiert. Im Anschluß an eine 60-minütige Inkubation bei 30°C mit oder ohne Zusatz der zu testenden Wirkstoffe wurde das Testgemisch (100 µl) rasch über GF-B-Filtern bei Verwendung einer Skatron®-Filtrations vorrichtung filtriert. Die Filter wurden rasch mit 100 mM NaCl und 5 mM MgCl2 enthaltendem 50 mM Tris-HCl-Puffer (9 ml; pH: 7,5; 4°C) gewaschen. Die auf den Filtern zurückgehaltene Radioaktivität wurde mittels Scintillationsspektrometrie bestimmt, wobei man Ul tima Gold-Scintillationsflüssigkeit verwendete. Ebenfalls verwen det werden können ähnliche Systeme, die durch Verwendung von Mi krotiterplatten einen hohen Durchsatz und ein Sekundärscreening gestatten.[ 35 S] GTPγS binding assays are known. The present assay was carried out based on the previously described method by Hilf, G. and Jakobs, KH (Eur. J. Mol. Pharmacol. 225: 245-252 (1992)). Drug-induced changes in the [ 35 S] GTPγS binding to membranes from HEK293 cells stably transfected with the h5HT5 receptor were measured (see reference examples 1 and 2). The cell membranes (12 μg) were incubated with 6.75 mM MgCl 2 , 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 10 μM GDP and [ 35 S] GTPγS containing 50 mM triethanolamine-HCl buffer (pH: 7.5) . Following a 60-minute incubation at 30 ° C. with or without the addition of the active substances to be tested, the test mixture (100 μl) was quickly filtered through GF-B filters using a Skatron® filtration device. The filters were quickly washed with 50 mM Tris-HCl buffer (9 ml; pH: 7.5; 4 ° C) containing 100 mM NaCl and 5 mM MgCl 2 . The radioactivity retained on the filters was determined by scintillation spectrometry using Ulima Gold scintillation fluid. Similar systems can also be used, which allow high throughput and secondary screening through the use of microtiter plates.
Die Wirkstoffaktivitäten wurden als prozentualer Anteil der in Abwesenheit des Wirkstoffes gemessenen Grundbindung ausgedrückt. Die Anpassung der Kurven erfolgte mit einer Software zur nicht- linearen Regressionsanalyse (SigmaPlot, Jandel Scientific, Deutschland) gemäß der allgemeinen Gleichung E = (L.Emax)/(L+EC50), worin E die Wirkung, L die Ligandkonzentration, Emax die Maximal wirkung und EC50 diejenige Konzentration, die 50% der Maximalwir kung induziert, bedeutet.The drug activities were expressed as a percentage of the basic bond measured in the absence of the drug. The curves were adjusted using software for non-linear regression analysis (SigmaPlot, Jandel Scientific, Germany) according to the general equation E = (LE max ) / (L + EC 50 ), in which E is the effect, L the ligand concentration, E max the maximum effect and EC 50 means the concentration that induces 50% of the maximum effect.
Die Methode ist bekannt (Kao J. P. Y. Methods in Cell Biology 40: 155-181 (1994)). Wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben, wurden h5HT5-Rezeptor exprimierende HEK293-Zellen in Kulturgefäßen auf gezogen. Die Zellen wurden vorsichtig abgeschabt, bevor sie kon fluent waren. Die Zellen wurden mit Fura-2 markiert, indem man mit Fura-2-acetylmethylester (Sigma) bei Raumtemperatur inku bierte. Die Zellen wurden bei 180 × g 10 min zentrifugiert und in DMEM-F12-Medium ohne Serum resuspendiert und bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit 45 min inkubiert.The method is known (Kao JPY Methods in Cell Biology 40: 155-181 (1994)). As described in reference example 1, HEK293 cells expressing h5HT5 receptor were grown in culture vessels. The cells were carefully scraped off before they were confluent. The cells were labeled with Fura-2 by incubating with Fura-2-acetyl methyl ester (Sigma) at room temperature. The cells were centrifuged at 180 × g for 10 min and resuspended in DMEM-F12 medium without serum and incubated at 37 ° C., 5% CO 2 and 95% atmospheric humidity for 45 min.
Intrazelluläre Calciumspiegel wurden mit einem Fluoreszenzmikros kop bestimmt, das mit einem geeigneten Filteraustauschsystem aus gestattet war (Olympus/Hamamatsu). Es wurde das Fluoreszenzver hältnis (340 nm/380 nm) mit der Argus®-Software bestimmt. Die intrazellulären Calciumspiegel wurden über kurze Zeit in einzel nen Zellen ohne den Zusatz von Wirkstoffen und dann 30 min nach Zugabe des zu testenden Wirkstoffs beobachtet. Ebenfalls verwen det werden können ähnliche Systeme, die durch die Verwendung von Mikrotiterplatten einen hohen Durchsatz und ein Sekundärscreening gestatten. Intracellular calcium levels were measured using a fluorescence microscope Kop determines that with a suitable filter exchange system was allowed (Olympus / Hamamatsu). It was the fluorescence ver Ratio (340 nm / 380 nm) determined with the Argus® software. The intracellular calcium levels were measured briefly in single NEN cells without the addition of active ingredients and then after 30 min Addition of the drug to be tested observed. Also use Similar systems can be detected by using Microtiter plates have a high throughput and secondary screening allow.
Die Methode ist im wesentlichen bekannt (Garcia-Ladona F. J. et al., Neuroreport 4: 691-694 (1993)). Die Zellen wurden 24 h mit 0,125 µM [3H]Myo-Inositol inkubiert. Nicht eingebautes [3H]Myo-In ositol wurde aus dem Medium entfernt und durch 10 mM LiCl enthal tendem Krebs-Henseleit-Puffer ersetzt. Nach 10-minütiger Inkuba tion wurde der zu testende Wirkstoff zugesetzt. Nach 45 min wurde die Reaktion gestoppt, indem man das Stimulationsmedium durch de stilliertes Wasser ersetzte. Verwendet man Gewebeproben, geht man in ähnlicher Weise vor (Garcia-Ladona et al., 1993). Die Zellen wurden eingefroren und bei -80°C gelagert. Es wurde die Produktion von [3H]Inositolmonophosphat mittels bekannter chromatographischer Methoden bestimmt. Eine ähnliche Methode kann mit Gewebe-Mini prismen zur Anwendung kommen. Die Bestimmung der Phospholipase C- Stimulierung wurde ebenfalls in ähnlicher Weise durchgeführt, in dem man Membranfraktionen, wie in Referenzbeispiel 2 beschrieben, präparierte und mit [32P]PIP2 und Wirkstoffen inkubiert. In diesem Fall wurde die Produktion von IP3 bestimmt. Es wurden auch be kannte Verfahren optimiert, um auf Mikrotiterplatten basierende Systeme zu verwenden. Kommerziell erhältliche Materialien gestat ten die Ausdehnung auf Analysen mit hohem Durchsatz und die Durchführung eines Sekundärscreenings.The method is essentially known (Garcia-Ladona FJ et al., Neuroreport 4: 691-694 (1993)). The cells were incubated with 0.125 μM [ 3 H] myo-inositol for 24 h. Unincorporated [ 3 H] myo-in ositol was removed from the medium and replaced by Krebs-Henseleit buffer containing 10 mM LiCl. After 10 minutes of incubation, the active ingredient to be tested was added. After 45 minutes the reaction was stopped by replacing the stimulation medium with distilled water. A similar procedure is used when using tissue samples (Garcia-Ladona et al., 1993). The cells were frozen and stored at -80 ° C. The production of [ 3 H] inositol monophosphate was determined using known chromatographic methods. A similar method can be used with tissue mini prisms. The determination of the phospholipase C stimulation was also carried out in a similar manner by preparing membrane fractions as described in reference example 2 and incubating them with [ 32 P] PIP 2 and active substances. In this case, the production of IP3 was determined. Known methods have also been optimized in order to use systems based on microtiter plates. Commercially available materials allow expansion to high throughput analysis and secondary screening.
Die verwendete Methode ist im wesentlichen bekannt (Strada S. S. et al., Methods in Neurotransmission receptor analysis: 89-110 (1990)). Zellen wurden 10 min in Kulturmedium ohne Serum und An tibiotika inkubiert. Es wurde 15 min auf 95°C erwärmt, um die Re aktion zu stoppen. Die Zellproben wurden eingefroren und bei -80°C gelagert. cAMP-Spiegel wurden mit kommerziell erhältlichen Kits bestimmt, die das cAMP-Bindungsprotein verwenden. Es wurden auch bekannte Verfahren optimiert, um auf Mikrotiterplatten basierende Systeme zu verwenden. Kommerziell erhältliche Materialien gestat ten die Ausdehnung auf Analysen mit hohem Durchsatz und die Durchführung eines Sekundärscreenings. The method used is essentially known (Strada S. S. et al., Methods in Neurotransmission receptor analysis: 89-110 (1990)). Cells were grown in culture medium without serum and AN for 10 min incubated tibiotics. The mixture was heated to 95 ° C. for 15 min in order to remove the Re stop action. The cell samples were frozen and at -80 ° C stored. cAMP levels were measured using commercially available kits who use the cAMP binding protein. It was too known methods optimized to be based on microtiter plates Systems to use. Commercially available materials allowed extension to high throughput analysis and Implementation of a secondary screening.
90 min nach Verabreichung des Wirkstoffs (oral, intraperitoneal, intravenös oder intracerebroventriculär) wurden die Versuchstiere enthauptet. Das gesamte Gehirn wurde rasch aus dem Schädel ent fernt, auf Trockeneis gefroren und bei -80°C gelagert. Rattenhirn schnitte (15 µm) wurden bei -20°C in einem Cryostat erhalten, auf Gelatine-beschichtete Objektträger aufgebracht und bei -30°C bis zum Gebrauch gelagert.90 min after administration of the active ingredient (oral, intraperitoneal, intravenous or intracerebroventricular) were the experimental animals beheaded. The entire brain was quickly removed from the skull distant, frozen on dry ice and stored at -80 ° C. Rat brain Sections (15 µm) were obtained in a cryostat at -20 ° C Gelatin-coated slides applied and at -30 ° C to stored for use.
Gemäß Referenzbeispiel 3 wurde die Bindungsaffinität von [3H]-5-CT an 5-HT5-Rezeptoren bestimmt. Fig. 1 zeigt eine Auftragung von gebundenem [3H]-5-CT in Abhängigkeit der [3H]-5-CT-Konzentration. Es wurde eine Dissoziationskonstante von Kd = 0.570 nM bestimmt. Die Rezeptorbindungsdichte (B) variierte je nach klonaler Zelli nie in einem Bereich von 900-28.000 fmol/mg Protein.The binding affinity of [ 3 H] -5-CT to 5-HT5 receptors was determined according to reference example 3. Fig. 1 shows a plot of bound [3 H] -5-CT as a function of [3 H] -5-CT concentration. A dissociation constant of K d = 0.570 nM was determined. Depending on the clonal cell, the receptor binding density (B) never varied in a range of 900-28,000 fmol / mg protein.
Gemäß Referenzbeispiel 4 wurden die Bindungsaffinitäten serotoni
nerger Verbindungen anhand der [3H]-5-CT-Bindungskompetition be
stimmt. Folgende IC50-Werte wurden erhalten:
According to reference example 4, the binding affinities of serotoninergic compounds were determined using the [ 3 H] -5-CT binding competition. The following IC 50 values were obtained:
In einer weiteren Testreihe wurden auch die Hemmkonstanten Ki fol
gender Verbindungen bestimmt (Ki = IC50/(1+C/Kd)), wobei C die
Konzentration an [3H]-5-CT ist und Kd gemäß Beispiel 1 bestimmt
wurde):
In a further series of tests, the inhibition constants K i following compounds were determined (K i = IC 50 / (1 + C / K d )), where C is the concentration of [ 3 H] -5-CT and K d according to the example 1 was determined):
Gemäß Referenzbeispiel 5 wurde die Wirkstoff-induzierte Bindung von GTP an G-Proteine untersucht. Die Kopplung von 5-HT5-Rezepto ren an G-Proteine in HEK293-Zellen war evident. Die typischen se rotoninergen Agonisten 5-HT und 5-CT induzierten einen Anstieg der [35S]GTPγS-Bindung an die Zellmembranen von über 40% über dem Grundwert (siehe Fig. 2). Der 5-HT5-Rezeptor benötigt GDP für die durch Agonisten vermittelte Kopplung an G-Proteine (siehe Fig. 3A). Der 5-HT-Effekt war dosisabhängig (siehe Fig. 4) mit einer EC50 von 2,6 µM.According to reference example 5, the drug-induced binding of GTP to G proteins was investigated. The coupling of 5-HT5 receptors to G proteins in HEK293 cells was evident. The typical se rotoninergic agonists 5-HT and 5-CT induced an increase in [ 35 S] GTPγS binding to the cell membranes of more than 40% above the basic value (see FIG. 2). The 5-HT5 receptor requires GDP for agonist-mediated coupling to G proteins (see Figure 3A). The 5-HT effect was dose-dependent (see FIG. 4) with an EC 50 of 2.6 μM.
Gemäß Referenzbeispiel 6 wurde die Wirkstoff-induzierte Auswir kung auf intrazelluläre Calcium-Spiegel untersucht. Die Stimulie rung der 5-HT5-Rezeptoren mit R(+)-Lisurid (1 µM) in HEK293-Zellen induzierte einen Anstieg von intrazellulärem Ca2+ (siehe Fig. 5).According to reference example 6, the drug-induced effect on intracellular calcium levels was examined. The stimulation of the 5-HT5 receptors with R (+) - lisuride (1 μM) in HEK293 cells induced an increase in intracellular Ca 2+ (see FIG. 5).
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