JP2002533109A - Human Brainiac-5 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｂｒａｉｎｉａｃファミリーのメンバーである新規のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドに関する。特に、ヒトＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドもまた提供され、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞および組換え方法も同様に提供される。本発明は、さらに、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。免疫系関連障害および神経系関連障害を検出するための診断的方法、ならびに免疫系関連障害および神経系関連障害を処置、予防および／または診断するための治療的方法もまた提供される。   (57) [Summary] The present invention relates to novel Brainiac-5 polypeptides that are members of the Brainiac family. In particular, an isolated nucleic acid molecule encoding a human Brainiac-5 polypeptide is provided. Brainiac-5 polypeptides are also provided, as are vectors, host cells and recombinant methods for producing Brainiac-5 polypeptides. The present invention further relates to screening methods for identifying agonists and antagonists of Brainiac-5 activity. Also provided are diagnostic methods for detecting immune system related disorders and nervous system related disorders, and therapeutic methods for treating, preventing and / or diagnosing immune system related disorders and nervous system related disorders.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、Ｎｏｔｃｈファミリーに関係するポリペプチドをコードする新規の
ヒト遺伝子に関する。より詳細には、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５と命名されたヒトポ
リペプチドをコードする、単離された核酸分子が提供される。Ｂｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチドもまた提供され、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを産生す
るためのベクター、宿主細胞および組換え方法も同様に提供される。免疫系およ
び神経系に関連する障害を検出するための診断方法、ならびにこのような障害を
処置および／または予防するための治療的方法もまた提供される。[0001] The present invention relates to novel human genes encoding polypeptides related to the Notch family. More particularly, provided is an isolated nucleic acid molecule encoding a human polypeptide designated Brainiac-5. Brainiac
-5 polypeptides are also provided, as are vectors, host cells and recombinant methods for producing Brainiac-5 polypeptides. Also provided are diagnostic methods for detecting disorders related to the immune and nervous systems, and therapeutic methods for treating and / or preventing such disorders.

【０００２】 本発明は、さらに、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５活性のアゴニストおよびアンタゴニ
ストを同定するためのスクリーニング方法に関する。[0002] The present invention further relates to screening methods for identifying agonists and antagonists of Brainiac-5 activity.

【０００３】 （発明の背景） 細胞***の制御は、プログラムされた一連の事象に依存する、多細胞の生存の
基本的な局面である。細胞の増殖およびその制御における１つの因子は、種々の
ポリペプチド増殖因子の存在である。増殖因子は、インビトロでの細胞培養のた
めの増殖培地の本質的な成分であり、そしてインビボでの細胞の生存に関与する
。現在までに同定された増殖因子の部分的な列挙としては、以下が挙げられる：
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ；インビボでの血管系の修復に関係する）；上皮
増殖因子（ＥＧＦ；外胚葉起源および中胚葉起源の細胞についてのマイトジェン
として作用する）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α（正常細胞を
軟寒天中で増殖させ得ることを除いて、ＥＧＦに類似したマイトジェンとして作
用する）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β（細胞についてのマイ
トジェンでもあれば、細胞についての増殖インヒビターでもある）；ならびに神
経成長因子（ＮＧＦ；交感ニューロンおよび胚性ニューロンの発達および維持に
関与する）（Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｇｅｎｅ、９７５頁；Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ（１９８７）
）。BACKGROUND OF THE INVENTION [0003] Control of cell division is a fundamental aspect of multicellular survival that relies on a programmed sequence of events. One factor in cell growth and its control is the presence of various polypeptide growth factors. Growth factors are an essential component of growth media for cell culture in vitro and are involved in cell survival in vivo. A partial listing of growth factors identified to date includes:
Platelet-derived growth factor (PDGF; involved in vascular repair in vivo); epidermal growth factor (EGF; acts as a mitogen for cells of ectoderm and mesoderm origin); transforming growth factor (TGF)- α (acts as a mitogen similar to EGF, except that normal cells can be grown in soft agar); transforming growth factor (TGF) -β (a mitogen for cells, or a growth inhibitor for cells. And nerve growth factor (NGF; involved in the development and maintenance of sympathetic and embryonic neurons) (Watson et al., Molecular Biology of
he Gene, p. 975; Benjamin / Cummings (1987).
).

【０００４】 特定の細胞型が、正常な増殖および維持のために、特定の増殖因子を必要とす
ることは明らかである。ペプチド増殖因子は、種々の組織から産生され、そして
分泌される。標的細胞は、代表的には、増殖因子の放出部位の近傍に位置する（
傍分泌応答）。増殖促進活性、および分化誘導活性に加えて、増殖因子は、これ
らの標的細胞に対する広範な種々の効果を誘発し、そして炎症、免疫反応および
創傷修復のようなプロセスに関与する（Ｐｉｍｅｎｔｅｌ，Ｅ． Ｈａｎｄｂｏ
ｏｋ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、第１巻：Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｓ
ｉｃｓ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９４）を参照のこと）。It is clear that certain cell types require certain growth factors for normal growth and maintenance. Peptide growth factors are produced and secreted from various tissues. The target cells are typically located near the site of growth factor release (
Paracrine response). In addition to growth-promoting and differentiation-inducing activities, growth factors elicit a wide variety of effects on these target cells and are involved in processes such as inflammation, immune response and wound repair (Pimmentel, E. et al. Handbo
ok of Growth Factors, Volume 1: General Bass
ics (see CRC Press 1994)).

【０００５】 膜貫通レセプタータンパク質のＮｏｔｃｈファミリーは、細胞運命の決定を媒
介することが実証されており、そして、哺乳動物のＮｏｔｃｈ遺伝子における変
異は、白血病、頸部の癌、結腸癌、乳癌、発作および痴呆に関係している。Ｄｒ
ｏｓｏｐｈｉｌａにおいては、３つの遺伝子（ｆｒｉｎｇｅ、Ｓｅｒｒａｔｅお
よびＤｅｌｔａ）が、Ｎｏｔｃｈの活性化を導く細胞の相互作用に関与する。Ｄ
ｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅは、Ｎｏｔｃｈの膜貫通リガンドをコードし、一
方、ｆｒｉｎｇｅは、先駆的な（ｐｉｏｎｅｅｒ）タンパク質をコードする。Ｎ
ｏｔｃｈ、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅのヒトの相同体（「Ｊａｇｇｅｄ」と呼
ばれる）、およびＦｒｉｎｇｅのヒトの相同体（「Ｒａｄｉｃａｌ Ｆｒｉｎｇ
ｅ」および「Ｌｕｎａｔｉｃ Ｆｒｉｎｇｅ」と呼ばれる）が、クローン化され
た。マウスの胚における発現の研究は、Ｎｏｔｃｈのシグナル伝達経路に関与す
る哺乳動物のＦｒｉｎｇｅファミリーのメンバーの、保存された役割を支持する
。[0005] The Notch family of transmembrane receptor proteins has been demonstrated to mediate cell fate decisions, and mutations in the mammalian Notch gene cause leukemia, cervical cancer, colon cancer, breast cancer, stroke. And related to dementia. Dr
In osophila, three genes (fringe, Serrate and Delta) are involved in cellular interactions leading to Notch activation. D
Elta and Serrate encode the Notch transmembrane ligand, while fringe encodes the pioneer protein. N
human homologs of otch, Delta, Serrate (referred to as "Jagged"), and human homologs of Fringe ("Radical Ring").
e "and" Lunatic Ringe ") have been cloned. Studies of expression in mouse embryos support a conserved role for members of the mammalian Fringe family involved in the Notch signaling pathway.

【０００６】 心筋の肥大とは、心臓の病巣拡大または心臓の全体的拡大をいう。正常な肥大
は、心臓のポンピング作用を維持するために機能する、代償的な作用である。異
常な肥大は、高血圧症、心筋梗塞、弁疾患（ｖａｌｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）およ
び心筋症を含む多くの状況において生じる（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｐ．Ｃ．Ｈｅａｒ
ｔ Ｆａｉｌｕｒｅ ５：１１３（１９８９））。心筋細胞に対するペプチド増
殖因子の効果は、遺伝子発現の分化型パターンにおいて反映される。例えば、α
アドレナリン作用性レセプターの刺激は、培養された心筋細胞の肥大を誘導し、
そして、転写レベルでの遺伝子発現における特定の変化を生じる（Ｓｉｍｐｓｏ
ｎ，Ｐ．Ｃ．「Ｃａｒｄｉａｃ Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ」、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕ
ｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．ら（編）：１２５−１３３（１９
９０））。心筋細胞において、増殖因子ＴＧＦ−β１および塩基性ＦＧＦは、同
時に複雑な応答および異種性応答を誘発する：「胎児の」収縮性タンパク質の遺
伝子の上方制御と同時発生の、特定の成熟転写物の選択的な阻害（Ｓｃｈｎｅｉ
ｄｅｒら、「Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ
Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．ら（編）：６３−７１（１９９０））。[0006] Myocardial hypertrophy refers to enlarged lesions of the heart or global enlargement of the heart. Normal hypertrophy is a compensatory effect that functions to maintain the pumping action of the heart. Abnormal hypertrophy occurs in many situations including hypertension, myocardial infarction, valve disease and cardiomyopathy (Simpson, PC Heart).
t Failure 5: 113 (1989)). The effects of peptide growth factors on cardiomyocytes are reflected in the differentiated pattern of gene expression. For example, α
Stimulation of adrenergic receptors induces hypertrophy of cultured cardiomyocytes,
It then causes certain changes in gene expression at the transcriptional level (Simpso
n, P. C. "Cardiac Myocyte Hypertrophy",
Molecular Biology of the Cardiovascu
lar System, Roberts, R.A. (Eds.): 125-133 (19
90)). In cardiomyocytes, growth factor TGF-β1 and basic FGF simultaneously elicit complex and heterologous responses: upregulation of genes for “fetal” contractile proteins and co-generation of specific mature transcripts Selective inhibition (Schnei
der et al., "Oncogenes and Myogenesis", Mole.
cultural Biology of the Cardiovascular
System, Roberts, R.A. (Eds.): 63-71 (1990)).

【０００７】 心筋細胞および心臓の他の細胞（結合組織を含む）における増殖因子の遺伝子
発現をモニターすることは、インビトロおよびインビボの両方での、異常な肥大
の検出および研究において有用である。器官系およびクローン細胞系が、心筋の
分化を分析するために開発されている（例えば、Ｂａｄｅｒ，Ｄ．ら、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ
Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．ら（編）：４１−４９（１９９０）を参照
のこと）。これらの系における分化は、心筋発生およびモノクローナル抗体（筋
特異的タンパク質に対して惹起される）のインビトロでの分析によって、モニタ
ーされ得る。[0007] Monitoring gene expression of growth factors in cardiomyocytes and other cells of the heart, including connective tissue, is useful in detecting and studying abnormal hypertrophy, both in vitro and in vivo. Organ and clonal cell lines have been developed to analyze cardiac differentiation (eg, Bader, D. et al., Mole).
cultural Biology of the Cardiovascular
System, Roberts, R.A. (Ed.): 41-49 (1990)). Differentiation in these systems can be monitored by myocardial development and in vitro analysis of monoclonal antibodies (elicited against muscle-specific proteins).

【０００８】 さらに、ポリペプチド増殖因子は、細胞増殖を刺激するための、およびインビ
トロでの細胞の生存を助けるための非常に重要な細胞培養試薬である。Ｆｒｉｎ
ｇｅファミリーの他のメンバーとの相同性、および哺乳動物のＦｒｉｎｇｅファ
ミリーのメンバーが、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路において進化的に保存された
役割を果たすという徴候は、これらのポリペプチドならびにＢｒａｉｎｉａｃ−
５ポリペプチドが、細胞の運命または分化の障害（例えば、白血病、頸部の癌、
結腸癌、乳癌のような癌性状態）の処置または予防、神経系の障害の処置または
予防、ならびに組織修復の刺激および組織再生の刺激を含む使用を有することを
示唆する。[0008] In addition, polypeptide growth factors are very important cell culture reagents for stimulating cell growth and for helping cells survive in vitro. Frin
Homology with other members of the ge family, and the indication that members of the mammalian Fringe family play an evolutionarily conserved role in the Notch signaling pathway, indicate that these polypeptides as well as Brainiac-
5 polypeptides may interfere with cell fate or differentiation (eg, leukemia, cervical cancer,
It is suggested to have uses including treatment or prevention of cancerous conditions such as colon cancer, breast cancer), treatment or prevention of disorders of the nervous system, and stimulation of tissue repair and stimulation of tissue regeneration.

【０００９】 インビトロでの使用およびインビボでの使用の両方について、特定の細胞の増
殖を刺激および／または阻害するポリペプチドについての探索が存在し続ける。
さらに、新規の組織特異的マーカー（特定の細胞型または組織型の同定を助ける
ために、定性的に利用され得、そして細胞、組織または器官が、特定のポリヌク
レオチドのそれらの発現において異常であるか否かを評価するために定性的に利
用され得る）についての探索が継続する。[0009] For both in vitro and in vivo uses, there continues to be a search for polypeptides that stimulate and / or inhibit the growth of specific cells.
In addition, novel tissue-specific markers (which can be used qualitatively to help identify particular cell types or tissue types, and where cells, tissues or organs are abnormal in their expression of particular polynucleotides) (Which can be used qualitatively to assess whether or not).

【００１０】 （発明の要旨） 本発明は、少なくともＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド（配列番号２におい
て示される完全なアミノ酸配列、または１９９９年１月１１日に、ＡＴＣＣ受託
番号２０３５７２のようなプラスミドＤＮＡとして寄託されたｃＤＮＡクローン
によってコードされる、完全なアミノ酸配列を有する）の一部をコードするポリ
ヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。寄託されたＢｒａｉｎｉ
ａｃ−５クローンの配列決定によって決定されたヌクレオチド配列（図１Ａおよ
び図１Ｂ（配列番号１）において示される）は、２７８アミノ酸残基の明らかに
不完全なポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、１〜
３位のヌクレオチドで、最初のバリンのコドンから開始され、そして推定分子量
は、約３０，４７５ダルトンである。本発明の核酸分子は、配列番号２において
示される完全なアミノ酸配列（Ｎ末端メチオニン残基を除く）、またはＡＴＣＣ
受託番号２０３５７２におけるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なア
ミノ酸配列（Ｎ末端メチオニンを除く）をコードする核酸分子を含み、この分子
はまた、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５アミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に融
合された、さらなるアミノ酸をコードし得る。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to at least the Brainiac-5 polypeptide (the complete amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or deposited on Jan. 11, 1999 as a plasmid DNA such as ATCC Accession No. 203572). An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding a portion of the full amino acid sequence encoded by the isolated cDNA clone). Deposited Braini
The nucleotide sequence determined by sequencing of the ac-5 clone (shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1)) contains an open reading frame encoding a clearly incomplete polypeptide of 278 amino acid residues. , 1
Starting at the first valine codon at nucleotide 3 position, the estimated molecular weight is about 30,475 daltons. The nucleic acid molecule of the present invention has the complete amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (excluding the N-terminal methionine residue), or ATCC
A nucleic acid molecule encoding the complete amino acid sequence (excluding the N-terminal methionine) encoded by the cDNA clone in Accession No. 203572, which is also fused to the N- and / or C-terminus of the Brainiac-5 amino acid sequence. In addition, additional amino acids may be encoded.

【００１１】 従って、本発明の１つの実施形態は、以下からなる群より選択されるヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのポリヌクレオチドか
らなる、単離された核酸分子を提供する：（ａ）配列番号２における完全なアミ
ノ酸配列（すなわち、配列番号２の１〜２７８位）を有するＢｒａｉｎｉａｃ−
５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号２０３
５７２において含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸
配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
；（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２において含まれるｃＤＮＡクローンによ
ってコードされるアミノ酸配列を有する成熟Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列；および（ｄ）上記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ
）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。[0011] Accordingly, one embodiment of the present invention provides an isolated nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide having a nucleotide sequence selected from the group consisting of: a) Brainiac- having the complete amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (ie, positions 1-278 of SEQ ID NO: 2)
(B) ATCC accession number 203
Nucleotide sequence encoding the Brainiac-5 polypeptide having the complete amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in 572; (c) mature Brainiac- having the amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in ATCC accession number 203572. A nucleotide sequence encoding 5 polypeptides; and (d) a), (b) or (c) as described above.
A) a nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences of 1);

【００１２】 本発明のさらなる実施形態は、以下を有する（すなわち、以下を含むか、ある
いは以下からなる）ポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を含む：上記
の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）におけるいずれかのヌクレオチド配列と
、少なくとも９０％同一、そしてより好ましくは、少なくとも９２％、９５％、
９６％、９７％、９８％または９９％同一なヌクレオチド配列、あるいは、上記
の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）におけるポリヌクレオチドに、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみ
からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない。[0012] Further embodiments of the invention include isolated nucleic acid molecules comprising a polynucleotide having (ie comprising or consisting of): (a), (b) above , (C) or (d) at least 90% identical to the nucleotide sequence, and more preferably at least 92%, 95%,
Hybridizes under stringent hybridization conditions to a nucleotide sequence that is 96%, 97%, 98% or 99% identical, or the polynucleotide in (a), (b), (c) or (d) above. Polynucleotide. The polynucleotide that hybridizes does not hybridize under stringent hybridization conditions to a polynucleotide having a nucleotide sequence consisting of only A residues or only T residues.

【００１３】 本発明のさらなる核酸の実施形態は、ポリヌクレオチド（上記の（ａ）、（ｂ
）または（ｃ）におけるアミノ酸配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチ
ドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードする）を含むか、あるいはこの
ポリヌクレオチドからなる、単離された核酸分子に関する。本発明のさらなる核
酸の実施形態は、以下のアミノ酸配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチ
ドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのポリヌ
クレオチドからなる、単離された核酸分子に関する：少なくとも１つの保存的ア
ミノ酸置換を含むが、５０を超える保存的アミノ酸置換を含まず、さらにより好
ましくは、４０を超える保存的アミノ酸置換を含まず、さらにより好ましくは、
３０を超える保存的アミノ酸置換を含まず、そして、さらになおより好ましくは
、２０を超える保存的アミノ酸置換を含まない、アミノ酸配列。当然、好ましさ
の増大する順番に、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのアミノ酸配列をコード
するポリヌクレオチドが、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１を超
えない保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有することが、非常に好ましい
。[0013] Further nucleic acid embodiments of the invention include polynucleotides ((a), (b) above).
) Or (c) encoding the amino acid sequence of the epitope-bearing portion of the Brainiac-5 polypeptide having the amino acid sequence of (c)) or consisting of this polynucleotide. A further nucleic acid embodiment of the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide encoding the amino acid sequence of a Brainiac-5 polypeptide having the following amino acid sequence: But contains no more than 50 conservative amino acid substitutions, even more preferably no more than 40 conservative amino acid substitutions, even more preferably
An amino acid sequence comprising no more than 30 conservative amino acid substitutions, and even more preferably, no more than 20 conservative amino acid substitutions. Of course, in order of increasing preference, the polynucleotide encoding the amino acid sequence of the Brainiac-5 polypeptide is conservative and does not exceed 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 It is highly preferred to have an amino acid sequence containing amino acid substitutions.

【００１４】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびそ
の組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞
を作製するための方法、ならびに組換え技術によるＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペ
プチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５ペプチドの産生のために、このようなベクタ
ーおよび宿主細胞を使用するための方法に関する。The present invention also provides a recombinant vector comprising an isolated nucleic acid molecule of the present invention, and a host cell comprising the recombinant vector, and methods and kits for making such a vector and host cell. It relates to methods for using such vectors and host cells for the production of Brainiac-5 polypeptides or Brainiac-5 peptides by recombinant techniques.

【００１５】 本発明のさらなる実施形態に従って、組換え原核生物宿主細胞および／または
真核生物宿主細胞（ヒトＢｒａｉｎｉａｃ−５核酸配列を含む）を、上記のポリ
ペプチドの発現を促進し、そして上記のポリペプチドの引き続く回収を促進する
条件下で培養する工程を包含する組換え技術によって、このようなポリペプチド
を産生するためのプロセスが提供される。According to a further embodiment of the present invention, a recombinant prokaryotic and / or eukaryotic host cell (comprising a human Brainiac-5 nucleic acid sequence) promotes expression of said polypeptide and Recombinant technology, including culturing under conditions that facilitate subsequent recovery of the polypeptide, provides a process for producing such a polypeptide.

【００１６】 本発明はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるい
はこのアミノ酸配列からなる、単離されたＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを
提供する：（ａ）配列番号２において示される完全なアミノ酸配列（すなわち、
配列番号２の１〜２７８位）を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのアミ
ノ酸配列；（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２において含まれるｃＤＮＡクロ
ーンによってコードされる完全なアミノ酸配列；（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号２０３
５７２において含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、推定成熟Ｂｒ
ａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの完全なアミノ酸配列。The present invention also provides an isolated Brainiac-5 polypeptide comprising or consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of: (a) set forth in SEQ ID NO: 2 Complete amino acid sequence (ie,
(B) the complete amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 203572; (c) the ATCC Accession No. 203
Putative mature Br encoded by the cDNA clone contained in 572
Complete amino acid sequence of the aniac-5 polypeptide.

【００１７】 本発明のポリペプチドはまた、以下を有する（すなわち、以下を含むか、ある
いは以下からなる）ポリペプチドを含む：上記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に
記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％同一、より好ましくは、少なくと
も９０％同一、そしてさらにより好ましくは、９２％、９５％、９６％、９７％
、９８％または９９％同一なアミノ酸配列。[0017] The polypeptides of the invention also include polypeptides having (ie, comprising or consisting of): amino acids as described in (a), (b) or (c) above At least 80% identical to the sequence, more preferably at least 90% identical, and even more preferably 92%, 95%, 96%, 97%
, 98% or 99% identical amino acid sequence.

【００１８】 本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載され
るアミノ酸配列を有する（すなわち、このアミノ酸配列を含むか、あるいはこの
アミノ酸からなる）Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのエピトープ保有部分の
アミノ酸配列を含むか、あるいはこのアミノ酸配列からなる、ペプチドまたはポ
リペプチドに関する。本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのエピトープ
保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも６
または７、好ましくは、少なくとも９、そしてより好ましくは、少なくとも約３
０のアミノ酸から約５０のアミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含
むが、上記の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列全体まで（およびこのアミノ
酸配列全体を含む）の任意の長さのエピトープ保有ポリペプチドもまた、本発明
に含まれる。[0018] A further embodiment of the present invention provides a Brainiac- having an amino acid sequence as described in (a), (b) or (c) above (ie comprising or consisting of this amino acid sequence). 5 relates to a peptide or polypeptide comprising or consisting of the amino acid sequence of the epitope-bearing portion of the polypeptide. The peptide or polypeptide having the amino acid sequence of the epitope-bearing portion of the Brainiac-5 polypeptide of the present invention has at least 6 amino acids.
Or 7, preferably at least 9, and more preferably at least about 3
Includes portions of such polypeptides having from zero amino acids to about 50 amino acids, but possesses an epitope of any length up to (and including) the entire amino acid sequence of the polypeptide of the invention described above. Polypeptides are also included in the present invention.

【００１９】 本発明のさらなる実施形態は、以下のアミノ酸配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、あるいはこのアミノ酸からなる、ペ
プチドまたはポリペプチドに関する：少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含
むが、５０を超える保存的アミノ酸置換を含まず、さらにより好ましくは、４０
を超える保存的アミノ酸置換を含まず、さらにより好ましくは、３０を超える保
存的アミノ酸置換を含まず、そして、さらになおより好ましくは、２０を超える
保存的アミノ酸置換を含まない、アミノ酸配列。当然、好ましさの増大する順番
に、ペプチドまたはポリペプチドが、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのアミ
ノ酸配列（少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含むが、１０、９、８、７、６
、５、４、３、２または１を超える保存的アミノ酸置換を含まない）を含むアミ
ノ酸配列を有することが、非常に好ましい。[0019] A further embodiment of the present invention provides a Brainiac having the following amino acid sequence:
-5 for a peptide or polypeptide comprising or consisting of the amino acid sequence of a polypeptide: comprising at least one conservative amino acid substitution but no more than 50 conservative amino acid substitutions, even more preferably 40
An amino acid sequence comprising no more than 30 conservative amino acid substitutions, even more preferably no more than 30 conservative amino acid substitutions, and even more preferably no more than 20 conservative amino acid substitutions. Of course, in order of increasing preference, the peptide or polypeptide will have the amino acid sequence of the Brainiac-5 polypeptide (including at least one conservative amino acid substitution, but not including 10, 9, 8, 7, 6
It is highly preferred to have an amino acid sequence comprising no more than 5, 5, 3, 3, 2 or 1 conservative amino acid substitutions).

【００２０】 別の実施形態において、本発明は、上記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）におい
て記載されるアミノ酸配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドに特異的
に結合する、単離された抗体を提供する。本発明は、さらに、Ｂｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチド（本明細書において記載されるようなアミノ酸配列を有する）
と特異的に結合する抗体を単離するための方法を提供する。このような抗体は、
以下に記載されるように、診断的または治療的に有用である。In another embodiment, the present invention provides an isolated Brainiac-5 polypeptide, which specifically has the amino acid sequence set forth in (a), (b) or (c) above. Provide an antibody. The present invention further provides Brainiac
-5 polypeptide (having an amino acid sequence as described herein)
Methods for isolating antibodies that specifically bind to are provided. Such antibodies are
As described below, it is diagnostically or therapeutically useful.

【００２１】 本発明はまた、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド、特に、ヒトＢｒａｉｎｉ
ａｃ−５ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供し、これは、例えば、免疫系お
よび／または神経系の疾患および障害を処置、予防および／または診断するため
に使用され得る。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを必要とする個体を処置す
る方法もまた、提供される。[0021] The present invention also provides Brainiac-5 polypeptides, particularly human Brainic.
Provided is a pharmaceutical composition comprising an ac-5 polypeptide, which can be used, for example, to treat, prevent and / or diagnose immune system and / or nervous system diseases and disorders. Also provided are methods of treating an individual in need of a Brainiac-5 polypeptide.

【００２２】 本発明は、さらに、インビトロでの細胞への投与のための、エキソビボでの細
胞への投与のための、およびインビボでの細胞への投与のための、または多細胞
生物への投与のための、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドを含む組成物を提供する。本発明のこの局面の特定の特に好ましい実施形態
において、この組成物は、疾患の処置、予防および／または診断のために、宿主
生物におけるＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの発現のためのＢｒａｉｎｉａ
ｃ−５ポリヌクレオチドを含む。この点で特に好ましいのは、Ｂｒａｉｎｉａｃ
−５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの異常な内因性の活性に関連
する機能不全の処置、予防および／または診断のための、ヒト患者における発現
である。The present invention further provides for administration to cells in vitro, for administration to cells ex vivo, and for administration to cells in vivo, or to a multicellular organism. And a composition comprising a Brainiac-5 polynucleotide or polypeptide. In certain particularly preferred embodiments of this aspect of the invention, the composition comprises a Brainia for Brainiac-5 polypeptide expression in a host organism for the treatment, prevention and / or diagnosis of disease.
c-5 polynucleotide. Particularly preferred in this regard is Brainiac
-5 Expression in a human patient for the treatment, prevention and / or diagnosis of a dysfunction associated with abnormal endogenous activity of a polynucleotide and / or polypeptide.

【００２３】 本発明はまた、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの生物学的活性を増強また
は阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供し、この方法は
、レセプター（この活性が、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドによって阻害さ
れるか、または増強される）を、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの存在下で
、候補化合物と接触させる工程、この候補化合物およびＢｒａｉｎｉａｃ−５ポ
リペプチドの存在下で、このレセプターの細胞***活性をアッセイする工程、な
らびにこのレセプターの活性を、標準レベルの活性と比較する工程（標準は、Ｂ
ｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの存在下、および候補化合物の非存在下におい
てこのレセプターとの間で接触がなされる場合にアッセイされる）を包含する。
このアッセイにおいて、標準を超えるレセプターの活性における増加は、この候
補化合物が、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５活性のアゴニストであることを示し、そして
標準と比較したレセプター活性における減少は、この化合物が、Ｂｒａｉｎｉａ
ｃ−５活性のアンタゴニストであることを示す。The present invention also provides a screening method for identifying a compound capable of enhancing or inhibiting the biological activity of a Brainiac-5 polypeptide, the method comprising: Contacting with a candidate compound in the presence of a Brainiac-5 polypeptide, cell division of the receptor in the presence of the candidate compound and the Brainiac-5 polypeptide. Assaying the activity as well as comparing the activity of this receptor to a standard level of activity (standard is B
(as assayed when contact is made with this receptor in the presence of the S. rainiac-5 polypeptide and in the absence of the candidate compound).
In this assay, an increase in the activity of the receptor above the standard indicates that the candidate compound is an agonist of Brainiac-5 activity, and a decrease in the receptor activity as compared to the standard indicates that the compound is Brainia
4 shows that the compound is an antagonist of c-5 activity.

【００２４】 別の実施形態において、アゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリー
ニングアッセイが提供され、このアッセイは、Ｎｏｔｃｈファミリーの別のメン
バー（例えば、ｆｒｉｎｇｅ、Ｓｅｒｒａｔｅ、Ｄｅｌｔａ、Ｊａｇｇｅｄ、Ｒ
ａｄｉｃａｌ Ｆｒｉｎｇｅ、Ｌｕｎａｔｉｃ ＦｒｉｎｇｅおよびＭａｎｉａ
ｃ Ｆｒｉｎｇｅ）へのＢｒａｉｎｉａｃ−５結合に対する、候補化合物の有す
る効果を決定する工程を包含する。特に、この方法は、Ｎｏｔｃｈファミリーの
メンバーを、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドおよび候補化合物と接触させる
工程、ならびにＮｏｔｃｈファミリーのメンバーへのＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリ
ペプチド結合が、候補化合物の存在に起因して、増加するかまたは減少するかど
うかを決定する工程を包含する。このアッセイにおいて、標準の結合を超えるＢ
ｒａｉｎｉａｃ−５の結合における増加は、この候補化合物が、Ｂｒａｉｎｉａ
ｃ−５の結合活性のアゴニストであることを示し、そして標準と比較したＢｒａ
ｉｎｉａｃ−５の結合における減少は、この化合物が、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５の
結合活性のアンタゴニストであることを示す。アンタゴニストは、以下を含むが
これらに限定されない、疾患、障害または状態を処置および／または予防するた
めに利用され得る：敗血症性ショック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの
活性化、移植片−宿主拒絶反応、骨吸収、慢性関節リウマチ、悪液質（るいそう
または栄養失調）、免疫系機能、リンパ腫および自己免疫障害。In another embodiment, a screening assay for agonists and antagonists is provided, wherein the assay comprises another member of the Notch family (eg, fringe, Serrate, Delta, Jagged, R
adical fringe, lunic fringe and mania
c) determining the effect of the candidate compound on Brainiac-5 binding to Fringe). In particular, the method includes contacting a Notch family member with a Brainiac-5 polypeptide and a candidate compound, and increasing Brainiac-5 polypeptide binding to the Notch family member due to the presence of the candidate compound. Determining whether to reduce or decrease. In this assay, B above standard binding
The increase in binding of rainiac-5 is due to the fact that this candidate compound is Brainia
Bra is shown to be an agonist of c-5 binding activity and compared to a standard
A decrease in iniac-5 binding indicates that the compound is an antagonist of Brainiac-5 binding activity. Antagonists may be utilized to treat and / or prevent a disease, disorder or condition, including but not limited to: septic shock, inflammation, cerebral malaria, activation of HIV virus, graft-host rejection Reactions, bone resorption, rheumatoid arthritis, cachexia (wasting or malnutrition), immune system function, lymphoma and autoimmune disorders.

【００２５】 さらに別の実施形態において、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、細胞表
面ポリペプチド（ウイルスのレセプターまたは補助レセプターとしても機能する
）に結合し得る。従って、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５、またはそのアゴニストもしく
はアンタゴニストは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５のレセプターもしくは補助レセプタ
ーとのウイルスの結合または相互作用のレベルで、あるいはウイルスの内部移行
のプロセスまたは細胞への流入の間に、ウイルスの感染力を調節するために用い
られ得る。In yet another embodiment, the Brainiac-5 polypeptide can bind to a cell surface polypeptide, which also functions as a viral receptor or co-receptor. Thus, Brainiac-5, or agonists or antagonists thereof, may be used at the level of virus binding or interaction with Brainiac-5 receptors or co-receptors, or during the process of viral internalization or entry into cells. Can be used to regulate the infectiousness of E. coli.

【００２６】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５が、卵巣腫瘍においてのみならず、骨髄間質細胞および
滑膜肉腫においても発現することが発見された（ＨＧＳ ＥＳＴデータベースの
ＢＬＡＳＴ分析を用いて）。従って、本発明の核酸は、生物学的サンプル中に存
在する組織または細胞型の示差的同定のためのハイブリダイゼーションプローブ
として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに指向さ
れる抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブを提供す
るために有用である。さらに、上記組織または細胞の多くの障害、特に免疫系の
多くの障害について、「標準的な」Ｂｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子発現レベル、す
なわち、免疫系の障害を有さない個体からの健常組織のＢｒａｉｎｉａｃ−５発
現レベルに対して有意により高いまたはより低いレベルのＢｒａｉｎｉａｃ−５
遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された、特定の組織（例
えば、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液ま
たは髄液）で検出され得る。Brainiac-5 was found to be expressed not only in ovarian tumors but also in bone marrow stromal cells and synovial sarcoma (using BLAST analysis of the HGS EST database). Accordingly, the nucleic acids of the invention are useful as hybridization probes for the differential identification of tissues or cell types present in a biological sample. Similarly, polypeptides and antibodies directed to these polypeptides are useful for providing immunological probes for differential identification of tissues or cell types. In addition, for many disorders of the above tissues or cells, especially many disorders of the immune system, "standard" Brainiac-5 gene expression levels, i.e., Brainiac- in healthy tissues from individuals without immune system disorders. 5 significantly higher or lower levels of Brainiac-5 relative to 5 expression levels
Gene expression is detected in certain tissues (eg, cancerous and wound tissues) or body fluids (eg, serum, plasma, urine, synovial fluid or cerebrospinal fluid) taken from individuals with such disorders obtain.

【００２７】 従って、本発明は、このような障害の診断の間に有用な診断的方法を提供し、
この方法は、以下：（ａ）個体の、細胞または体液におけるＢｒａｉｎｉａｃ−
５遺伝子発現レベルをアッセイする工程；（ｂ）このＢｒａｉｎｉａｃ−５遺伝
子発現レベルを、標準的なＢｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子レベルと比較する工程を
包含し、これによって、標準の発現レベルと比較された、アッセイされたＢｒａ
ｉｎｉａｃ−５遺伝子発現レベルにおける増加または減少が、免疫系における障
害を示す。Thus, the present invention provides diagnostic methods useful during the diagnosis of such disorders,
The method comprises the following steps: (a) Brainiac-in a cell or body fluid of an individual.
Assaying 5 gene expression levels; (b) comparing the Brainiac-5 gene expression level to a standard Brainiac-5 gene level, whereby the assay was compared to a standard expression level. Bra
An increase or decrease in niac-5 gene expression levels indicates a disorder in the immune system.

【００２８】 本発明の別の実施形態は、体内における増加したＢｒａｉｎｉａｃ−５活性レ
ベルを必要とする個体を処置または診断するための方法に関し、この方法は、こ
のような個体に、治療的に有効な量の、本発明の単離されたＢｒａｉｎｉａｃ−
５ポリペプチドまたはそのアゴニストを含む組成物を投与する工程を包含する。Another embodiment of the present invention is directed to a method for treating or diagnosing an individual in need of increased Brainiac-5 activity levels in the body, wherein the method is therapeutically effective in such an individual. Large amounts of the isolated Brainiac-
5) administering a composition comprising the polypeptide or an agonist thereof.

【００２９】 本発明のさらなる実施形態は、体内における減少したＢｒａｉｎｉａｃ−５活
性レベルを必要とする個体を処置または診断するための方法に関し、この方法は
、このような個体に、治療的に有効な量の、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５アンタゴニス
トを含む組成物を投与する工程を包含する。本発明における使用のための好まし
いアンタゴニストは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５特異的抗体である。[0029] A further embodiment of the present invention is directed to a method for treating or diagnosing an individual in need of reduced Brainiac-5 activity levels in the body, the method comprising providing such an individual with a therapeutically effective. Administering an amount of a composition comprising a Brainiac-5 antagonist. A preferred antagonist for use in the present invention is a Brainiac-5 specific antibody.

【００３０】 （詳細な説明） 本発明は、配列番号２において示されるアミノ酸配列を有するＢｒａｉｎｉａ
ｃ−５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（クローン化されたｃＤＮＡ
を配列決定することにより決定された）を含むか、あるいはこのポリヌクレオチ
ドからなる、単離された核酸分子を提供する。図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１
）において示されるヌクレオチド配列を、ＨＯＧＣＣ４５ ｃＤＮＡクローンを
配列決定することにより得た。このｃＤＮＡクローンは、１９９９年１月１１日
に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１
０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖ
ｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に寄託され、そしてＡＴＣＣ登録番号２
０３５７２を与えられた。寄託されたクローンは、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０プ
ラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ、ＭＤ）に含まれる。(Detailed Description) The present invention relates to a Brainia having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
Polynucleotide encoding c-5 polypeptide (cloned cDNA
Or an isolated nucleic acid molecule comprising the polynucleotide of the present invention. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1)
) Was obtained by sequencing the HOGCC45 cDNA clone. This cDNA clone was obtained on January 11, 1999 by the American Type Culture Collection, 1st.
0801 University Boulevard, Manassas, V
irginia 20110-2209 and ATCC accession number 2
03572. The deposited clone was designated pCMVSPORT2.0 plasmid (Life Technologies, Inc., Gaithers).
burg, MD).

【００３１】 本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、Ｂｒａｉｎｉａｃ（図２；配
列番号３）をコードするＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのｍ
ＲＮＡの翻訳産物、ＵＤＰ−ガラクトース−２−アセトアミド−２−デオキシ−
Ｄ−グルコース−３−β−ガラクトシルトランスフェラーゼ（図２；配列番号４
）をコードするヒトｍＲＮＡの翻訳産物と配列相同性を共有する。Ｄｒｏｓｏｐ
ｈｉｌａのＢｒａｉｎｉａｃは、重要な神経原性分泌分子であると考えられてい
る。すなわち、これは、ニューロンへの胚性細胞の分化において役割を果たすと
考えられる。従って、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドおよびＢ
ｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドが、細胞および組織の発生の初期段階において
、細胞の分化に対する効果を発揮し、そして胚性細胞の、樹状細胞もしくは他の
免疫系細胞、またはニューロン、あるいは神経系の他の細胞への分化を手伝うた
めに役立ち得ることが意図される。The Brainiac-5 polypeptide of the present invention comprises a Drosophila melanogaster m encoding Brainiac (FIG. 2; SEQ ID NO: 3).
The translation product of RNA, UDP-galactose-2-acetamido-2-deoxy-
D-glucose-3-β-galactosyltransferase (FIG. 2; SEQ ID NO: 4)
) Shares sequence homology with the translation product of the human mRNA encoding Drosop
Hila Brainiac is believed to be an important neurogenic secretory molecule. That is, it is thought to play a role in the differentiation of embryonic cells into neurons. Accordingly, the Brainiac-5 polynucleotide of the present invention and B
The Rainiac-5 polypeptide exerts effects on cell differentiation in the early stages of cell and tissue development, and may be associated with embryonic cells, dendritic cells or other immune system cells, or neurons, or other components of the nervous system. It is contemplated that this can help to differentiate the cells into cells.

【００３２】 （核酸分子） 特に示されない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することによって決
定された全てのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃ
ＡからのＭｏｄｅｌ ３７３）を使用して決定され、そして本明細書中で決定さ
れたＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、上
記のように決定されたＤＮＡ配列の翻訳によって推定された。従って、この自動
化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野で公知であ
るように、本明細書中で決定された任意のヌクレオチド配列は、いくらかの誤差
を含み得る。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、代表的には、配列
決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９０％
同一であり、より代表的には、少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同
一である。実際の配列は、当該分野で周知の手動ＤＮＡ配列決定法を含む他のア
プローチによって、より正確に決定され得る。同様に当該分野で公知であるよう
に、実際の配列と比較して決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入また
は欠失は、そのヌクレオチド配列の翻訳において、決定されたヌクレオチド配列
によってコードされる推定アミノ酸配列が、配列決定されたＤＮＡ分子によって
実際にコードされるアミノ酸配列とは全く異なるように、そのような挿入または
欠失の位置で始まるフレームシフトを生じる。Nucleic Acid Molecules Unless otherwise indicated, all nucleotide sequences determined by sequencing DNA molecules herein are based on automated DNA sequencers (eg, A
Applied Biosystems, Inc. , Foster City, C
The entire amino acid sequence of the polypeptide determined by using the Model 373) from A and determined by the DNA molecule determined herein is deduced by translation of the DNA sequence determined as described above. Was done. Thus, as is known in the art for any DNA sequence determined by this automated approach, any nucleotide sequence determined herein may contain some errors. The nucleotide sequence determined by the automation is typically at least about 90% relative to the actual nucleotide sequence of the sequenced DNA molecule.
At least about 95% to at least about 99.9% identical. The actual sequence can be more accurately determined by other approaches, including manual DNA sequencing methods well known in the art. As is also known in the art, a single insertion or deletion in a nucleotide sequence determined relative to the actual sequence will result in the translation of that nucleotide sequence into the putative encoded by the determined nucleotide sequence. The amino acid sequence produces a frameshift that begins at the location of such insertions or deletions, much like the amino acid sequence actually encoded by the sequenced DNA molecule.

【００３３】 核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、ＤＮＡ分
子またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列が、そし
てＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについては対応するリボヌクレオチド（Ａ
，Ｇ，ＣおよびＵ）の配列（ここで、特定したデオキシリボヌクレオチド配列中
のそれぞれのチミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）がリボヌクレオチドウリ
ジン（Ｕ）により置換される）が、意図される。[0033] Depending on the "nucleotide sequence" of a nucleic acid molecule or polynucleotide, the sequence of deoxyribonucleotides for DNA molecules or polynucleotides and the corresponding ribonucleotides (A
, G, C and U) are contemplated, wherein each thymidine deoxyribonucleotide (T) in the specified deoxyribonucleotide sequence is replaced by a ribonucleotide uridine (U).

【００３４】 本明細書中に提供した情報、例えば、図１Ａおよび１Ｂのヌクレオチド配列（
配列番号１）を使用して、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードする本発
明の核酸分子は、標準のクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、出発
物質としてｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡをクローン化する手順）を使用して入手
され得る。本発明の例示として、図１Ａおよび１Ｂに記載される核酸分子（配列
番号１）は、卵巣腫瘍細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーにおいて発見された
。同じ遺伝子のさらなるクローンはまた、以下の組織由来のｃＤＮＡライブラリ
ーにおいて同定された：骨髄間質細胞および滑膜肉腫細胞。The information provided herein, such as the nucleotide sequences of FIGS. 1A and 1B (
Using SEQ ID NO: 1), a nucleic acid molecule of the invention encoding a Brainiac-5 polypeptide can be prepared using standard cloning and screening procedures (eg, procedures for cloning cDNA using mRNA as starting material). Can be obtained. As an illustration of the present invention, the nucleic acid molecule described in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1) was found in a cDNA library derived from ovarian tumor cells. Additional clones of the same gene were also identified in cDNA libraries from the following tissues: bone marrow stromal cells and synovial sarcoma cells.

【００３５】 図１Ａおよび１ＢのＢｒａｉｎｉａｃ−５ ｃＤＮＡの決定されたヌクレオチ
ド配列（配列番号１）は、図１Ａおよび１Ｂ中のヌクレオチド配列（配列番号１
）のヌクレオチド位置１〜３のバリンコドンより開始し、かつ約３０，４７５Ｄ
ａの推定分子量を有する、２７８アミノ酸残基のポリペプチドをコードする部分
的なオープンリーディングフレームを含む。配列番号２に示されるＢｒａｉｎｉ
ａｃ−５ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ４１４４９
として入手され得るＢｒａｉｎｉａｃについてのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌ
ａｎｏｇａｓｔｅｒ ｍＲＮＡと約３７．７％同一である（図２）。The determined nucleotide sequence of the Brainiac-5 cDNA of FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1) is the nucleotide sequence in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1).
) Starting from the valine codon at nucleotide positions 1 to 3 and about 30,475 D
Includes a partial open reading frame encoding a 278 amino acid residue polypeptide having the predicted molecular weight of a. Braini shown in SEQ ID NO: 2
The amino acid sequence of ac-5 polypeptide has the GenBank accession number U41449.
Drosophila mel for Brainiac which can be obtained as
Approximately 37.7% identical to the anogaster mRNA (FIG. 2).

【００３６】 当業者に理解されるように、上記で議論した配列決定の誤差の可能性に起因し
て、それぞれの寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされる実際の完全Ｂｒ
ａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは約２７８アミノ酸を含み、幾分より長く、また
はより短くあり得る。より一般には、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５を含む実際のオープ
ンリーディングフレームは、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）において示される
Ｎ末端のバリンコドンから推定される、±２０アミノ酸の範囲内、よりおそらく
は±１０アミノ酸の範囲内における任意の場所であり得る。種々の機能的ドメイ
ンを同定するために使用される分析的な基準に依存して、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５
ポリぺプチドのシグナル配列または特定のドメインの正確な「位置（ａｄｄｒｅ
ｓｓ）」が本明細書中の推定位置とはわずかに異なり得ることが、さらに理解さ
れる。As will be appreciated by those skilled in the art, due to the potential for sequencing errors discussed above, the actual complete Br encoded by each deposited cDNA clone
The Ainiac-5 polypeptide contains about 278 amino acids and may be somewhat longer or shorter. More generally, the actual open reading frame containing Brainiac-5 is within ± 20 amino acids, more likely ± 10 amino acids, deduced from the N-terminal valine codon shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1). It can be anywhere within the range. Depending on the analytical criteria used to identify the various functional domains, Brainiac-5
The exact “position (addre) of the signal sequence or specific domain of the polypeptide
ss) "may be slightly different from the estimated position herein.

【００３７】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えばｍＲＮＡ）で、
またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより入手されるかまたは合成的に
生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。このＤＮＡは二本
鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても知
られるコード鎖であり得、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であり
得る。As indicated, the nucleic acid molecules of the invention may be in the form of RNA (eg, mRNA)
Or in the form of DNA, including, for example, cDNA and genomic DNA obtained by cloning or produced synthetically. The DNA can be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA or RNA can be the coding strand, also known as the sense strand, or the non-coding strand, also called the antisense strand.

【００３８】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１００，０００ｋｂ
、５０，０００ｋｂ、１０，０００ｋｂ、１，０００ｋｂ、５００ｋｂ、４００
ｋｂ、３５０ｋｂ、３００ｋｂ、２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１７５ｋｂ、１５０
ｋｂ、１２５ｋｂ、１００ｋｂ、７５ｋｂ、５０ｋｂ、４０ｋｂ、３０ｋｂ、２
５ｋｂ、２０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、７．５ｋｂまたは５ｋｂの長さ未満で
ある。[0038] In certain embodiments, the polynucleotides of the present invention comprise 100,000 kb.
, 50,000 kb, 10,000 kb, 1,000 kb, 500 kb, 400
kb, 350 kb, 300 kb, 250 kb, 200 kb, 175 kb, 150
kb, 125 kb, 100 kb, 75 kb, 50 kb, 40 kb, 30 kb, 2
It is less than 5 kb, 20 kb, 15 kb, 10 kb, 7.5 kb or 5 kb in length.

【００３９】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１５の
、少なくとも３０の、少なくとも５０の、少なくとも１００の、または少なくと
も２５０の、少なくとも５００の、または少なくとも１０００のＢｒａｉｎｉａ
ｃ−５のコード配列の連続したヌクレオチドを含むが、１０００ｋｂ、５００ｋ
ｂ、２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１５０ｋｂ、１００ｋｂ、７５ｋｂ、５０ｋｂ、
３０ｋｂ、２５ｋｂ、２０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、または５ｋｂ以下のゲノ
ムＤＮＡ（図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示す５’または３’コードヌクレ
オチドに隣接する）からなる。さらなる実施形態では、本発明のポリヌクレオチ
ドは、少なくとも１５の、少なくとも３０の、少なくとも５０の、少なくとも１
００の、または少なくとも２５０の、少なくとも５００の、または少なくとも１
０００のＢｒａｉｎｉａｃ−５のコード配列の連続したヌクレオチドを含むが、
Ｂｒａｉｎｉａｃ−５イントロンのすべてを、または、任意の一部を含まない。
別の実施形態において、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５をコードする配列を含む核酸は、
ゲノムの隣接遺伝子（すなわち、ゲノム中のＢｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子に対し
て５’側または３’側）のコード配列を含まない。他の実施形態では、本発明の
ポリヌクレオチドは、１０００、５００、２５０、１００、５０、２５、２０、
１５、１０、５、４、３、２、または１を超えるゲノム隣接遺伝子のコード配列
を含まない。In a further embodiment, the polynucleotide of the invention comprises at least 15, at least 30, at least 50, at least 100, or at least 250, at least 500, or at least 1000 Brainia
contains contiguous nucleotides of the coding sequence of c-5, but 1000 kb, 500 kb
b, 250 kb, 200 kb, 150 kb, 100 kb, 75 kb, 50 kb,
Consist of no more than 30 kb, 25 kb, 20 kb, 15 kb, 10 kb, or 5 kb of genomic DNA (adjacent to the 5 'or 3' coding nucleotide shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1)). In a further embodiment, the polynucleotides of the present invention comprise at least 15, at least 30, at least 50, at least 1
00, or at least 250, at least 500, or at least 1
Containing 000 consecutive nucleotides of the Brainiac-5 coding sequence,
It does not include all or any part of the Brainiac-5 intron.
In another embodiment, the nucleic acid comprising the sequence encoding Brainiac-5 is:
It does not include the coding sequence of the gene adjacent to the genome (i.e., 5 'or 3' to the Brainiac-5 gene in the genome). In other embodiments, the polynucleotides of the present invention comprise 1000, 500, 250, 100, 50, 25, 20,
Does not include coding sequences for 15, 10, 5, 4, 3, 2, or more than one genomic flanking gene.

【００４０】 「単離された」核酸分子によって、ネイティブな環境から取り出された核酸分
子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換え
ＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離された
ＤＮＡ分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分
子、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単
離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲ
ＮＡ転写物を含む。本発明に従う単離された核酸分子は、合成的に生成されたよ
うな分子をさらに含む。別の実施形態において、「単離された」核酸分子は、細
胞または細胞溶解物（たとえば、核型におけるような「染色体スプレッド」（ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｐｒｅａｄ））より単離された、または取り出された染
色体を含まない。なお別の実施形態において、「単離された」核酸分子は、Ｂｒ
ａｉｎｉａｃ−５をコードする配列を含むｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを
含まない。さらなる実施形態において、「単離された」核酸分子は、Ｂｒａｉｎ
ｉａｃ−５をコードする配列を含む、本明細書中で開示されたＢｒａｉｎｉａｃ
−５配列（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリー、またはＹＡＣもしく
はＢＡＣ人工染色体など）に関して、ベクター（例外的に大きなＤＮＡ、ＲＮＡ
またはｃＤＮＡの挿入物を含む）の集合を含まない。By “isolated” nucleic acid molecule is intended a nucleic acid molecule (DNA or RNA) removed from its native environment. For example, a recombinant DNA molecule contained in a vector is considered isolated for the purposes of the present invention. Further examples of isolated DNA molecules include recombinant DNA molecules that are maintained in a heterologous host cell, or (partially or substantially) purified DNA molecules in solution. The isolated RNA molecule is an in vivo or in vitro R
Contains NA transcripts. An isolated nucleic acid molecule according to the present invention further includes molecules as produced synthetically. In another embodiment, the “isolated” nucleic acid molecule is a cell or cell lysate (eg, a “chromosomal spread” (c in karyotype) (c
chromosomes) or does not include chromosomes isolated or removed from chromosomes. In yet another embodiment, the “isolated” nucleic acid molecule is Br
It does not include a cDNA or genomic library containing the sequence encoding Ainiac-5. In a further embodiment, the "isolated" nucleic acid molecule is Brain
Brainiac disclosed herein comprising a sequence encoding iac-5
-5 sequences (eg, cDNA or genomic libraries, or YAC or BAC artificial chromosomes, etc.) for vectors (exceptionally large DNA, RNA
Or containing cDNA inserts).

【００４１】 本発明の単離された核酸分子としては、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１）に
示されるヌクレオチド配列の１〜３位のバリンコドンより開始するオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）含むか、あるいは、それからなるＤＮＡ分子、また
は部分的なＯＲＦを含むＤＮＡ分子が挙げられる。The isolated nucleic acid molecule of the present invention includes an open reading frame (ORF) starting from the valine codon at positions 1 to 3 of the nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1), or , A DNA molecule comprising the same, or a DNA molecule comprising a partial ORF.

【００４２】 さらに、本発明の単離された核酸分子は、上記の配列とは実質的に異なる配列
を含むか、あるいは、それからなるが、遺伝コードの縮重に起因して、なお本発
明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。特定の
実施形態では、５〜１０、１〜５、または１〜２のアミノ酸が任意の組み合わせ
で置換、欠失、または付加されたＢｒａｉｎｉａｃ−５改変体が調製される。も
ちろん、遺伝コードおよび種特異的なコドンの好ましさは、当該分野で周知であ
る。従って、上記の縮重改変体を生成し、例えば、特定の宿主に対してコドン発
現を最適化する（例えば、ヒトｍＲＮＡ中のコドンをＥ．ｃｏｌｉのような細菌
宿主に好ましいコドンに変化させる）ことは、当業者にとって慣用的である。Furthermore, an isolated nucleic acid molecule of the present invention may comprise or consist of a sequence substantially different from the above-described sequences, but due to the degeneracy of the genetic code, still retain the inventive nucleic acid molecule. Includes a DNA molecule that encodes a Brainiac-5 polypeptide. In certain embodiments, Brainiac-5 variants are prepared in which 5-10, 1-5, or 1-2 amino acids have been substituted, deleted, or added in any combination. Of course, the genetic code and species-specific codon preferences are well known in the art. Accordingly, degenerate variants described above are generated, for example, to optimize codon expression for a particular host (eg, changing codons in human mRNA to codons preferred for bacterial hosts such as E. coli). It is routine for those skilled in the art.

【００４３】 別の実施形態において、本発明は、１９９９年１月１１日にＡＴＣＣ受託番号
２０３５７２として受託されたプラスミド中に含まれるｃＤＮＡクローンにより
コードされるアミノ酸配列を有する（すなわち、含むか、あるいは、それからな
る）Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供
する。好ましくは、この核酸分子は、上記の受託されたｃＤＮＡクローンにより
コードされる成熟ポリペプチドをコードする。In another embodiment, the present invention has the amino acid sequence encoded by (ie, comprises or comprises) the cDNA clone contained in a plasmid deposited as ATCC Accession No. 203572 on January 11, 1999. An isolated nucleic acid molecule encoding a Brainiac-5 polypeptide. Preferably, the nucleic acid molecule encodes the mature polypeptide encoded by the deposited cDNA clone described above.

【００４４】 本発明はさらに、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示されるヌクレオチド配
列または上記の寄託クローン中に含まれるＢｒａｉｎｉａｃ−５ ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列を有する（すなわち、含むか、あるいは、それからなる）単離さ
れた核酸分子、または上記配列の１つに相補的な配列を有する（すなわち、含む
か、あるいは、それからなる）核酸分子を提供する。このように単離された分子
（特にＤＮＡ分子）は、例えば、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーショ
ンによる遺伝子地図のためのプローブ、および例えばノザンブロット分析による
ヒト組織におけるＢｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子の発現を検出するためのプローブ
として有用である。The present invention further comprises (ie comprises or consists of) the nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1) or the Brainiac-5 cDNA contained in the deposited clone described above. C) providing an isolated nucleic acid molecule or a nucleic acid molecule having (ie, comprising or consisting of) a sequence complementary to one of the above sequences. The molecules (especially DNA molecules) thus isolated can be used, for example, for probes for genetic mapping by in situ hybridization with chromosomes and for detecting the expression of the Brainiac-5 gene in human tissues, for example by Northern blot analysis. Useful as a probe.

【００４５】 本発明はさらに、本明細書中に記載のヌクレオチド配列の一部をコードする核
酸分子および本明細書中に記載の単離された核酸分子のフラグメントに関する。
特に、本発明は、配列番号１の１〜９７７位の一部からなる、配列番号１の一部
を提示するヌクレオチド配列を有する（すなわち、含むか、あるいは、それから
なる）ポリヌクレオチドを提供する。さらに、本発明は、配列番号１の位置１〜
９７７（以下の関連ｃＤＮＡクローンの配列を除外する）より配列番号１の少な
くとも約３０ヌクレオチドの、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチドの任意
の一部を含むか、あるいは、それからなるポリヌクレオチド、およびそこに存在
する任意のサブフラグメントを含む：ＨＯＧＣＣ４５ＲＡ（配列番号５）；ＨＴ
ＥＤＭ５６Ｒ（配列番号６）；ＨＳＳＥＴ３６Ｒ（配列番号７）；ＨＳＯＢＤ７
０Ｒ（配列番号８）；Ｈ１８７０１（配列番号９）；および配列番号１０。The invention further relates to nucleic acid molecules that encode portions of the nucleotide sequences described herein and fragments of the isolated nucleic acid molecules described herein.
In particular, the invention provides a polynucleotide having (i.e., comprising or consisting of) a nucleotide sequence presenting a portion of SEQ ID NO: 1, consisting of a portion of positions 1 to 977 of SEQ ID NO: 1. Furthermore, the present invention provides
A polynucleotide comprising or consisting of at least about 30 nucleotides, preferably at least about 50 nucleotides, of any portion of SEQ ID NO: 1 than 977 (excluding the sequence of the related cDNA clones below) and the presence thereof HOGCC45RA (SEQ ID NO: 5); HT
EDM56R (SEQ ID NO: 6); HSSET36R (SEQ ID NO: 7); HSOBD7
OR (SEQ ID NO: 8); H18701 (SEQ ID NO: 9); and SEQ ID NO: 10.

【００４６】 さらに、本発明は、配列番号１の残基１〜６００より、少なくとも約２５ヌク
レオチドの、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチドの、より好ましくは少な
くとも約４０ヌクレオチドの、そしてさらにより好ましくは少なくとも約５０ヌ
クレオチド任意の一部を含むか、あるいは、それからなるポリヌクレオチドを含
む。より好ましくは、本発明は配列番号１の以下のヌクレオチドを含むか、ある
いは、それからなるポリヌクレオチドを含む：Further, the present invention provides a method for treating at least about 25 nucleotides, preferably at least about 30 nucleotides, more preferably at least about 40 nucleotides, and even more preferably at least about nucleotides from residues 1 to 600 of SEQ ID NO: 1. Includes a polynucleotide comprising or consisting of any portion of 50 nucleotides. More preferably, the present invention includes a polynucleotide comprising or consisting of the following nucleotides of SEQ ID NO: 1:

【００４７】[0047]

【化１】 。好ましくは、これらのフラグメントは、生物学的活性、および／またはＢｒａ
ｉｎｉａｃ−５機能的活性を有するポリペプチド（例えば、Ｎｏｔｃｈシグナル
伝達経路の活性化、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、Ｂｒａｉｎｉａ
ｃ−５と、Ｓｕ（Ｈ）またはＳｕ（Ｈ）のヒトホモログの間）の仲介の活性化、
および／またはＢｒａｉｎｉａｃ−５に特異的な抗体の結合の活性化）をコード
する。Embedded image . Preferably, these fragments are biologically active and / or Bra
polypeptides having niac-5 functional activity (eg, activation of Notch signaling pathway, protein-protein interactions (eg, Brainia)
mediated activation of c-5 and Su (H) or the human homologue of Su (H))
And / or activation of binding of an antibody specific for Brainiac-5).

【００４８】 より一般的には、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１Ａ、およ
び１Ｂ（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子
のフラグメントにより、例えば本明細書中に議論されるような診断プローブおよ
びプライマーとして有用である、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは
少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてな
おより好ましくは少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、
１５０、２００、２５０、３００、４００、または５００ｎｔ長のフラグメント
が意図される。もちろん、寄託されたｃＤＮＡの、または図１Ａおよび１Ｂ（配
列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列の全てではないとしても、ほとん
どに対応するフラグメントと同様に、５０〜３００ｎｔ長のより大きなフラグメ
ントもまた、本発明によって有用である。例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフラ
グメントにより、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１Ａおよび１
Ｂ（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列の２０以上の連続した塩基
を含むフラグメントが意図される。「少なくとも約」の句の中において「約（ａ
ｂｏｕｔ）」とは、列挙した値、およびいくらか、２〜３、少数（５、４、３、
２または１）大きいか、または小さい値を意味する。本発明の好ましい核酸フラ
グメントは、図３において同定されかつ以下により詳細に記載されるようなＢｒ
ａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのエピトープ保有部分をコードする核酸分子を含
む。More generally, by the nucleotide sequence of the deposited cDNA or a fragment of the isolated nucleic acid molecule having the nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1), for example, herein At least about 15 nt, and more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least about 30 nt, and even more preferably at least about 40, 50, 60, 70, 80, useful as diagnostic probes and primers as discussed. , 90, 100,
Fragments of 150, 200, 250, 300, 400, or 500 nt length are contemplated. Of course, larger, 50-300 nt long fragments, as well as most, if not all, of the deposited cDNA or nucleotide sequences as shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1). It is also useful according to the present invention. For example, the nucleotide sequence of the deposited cDNA or fragments of FIGS.
A fragment comprising more than 20 contiguous bases of the nucleotide sequence as shown in B (SEQ ID NO: 1) is contemplated. In the phrase "at least about", "about (a
"bout)" means the recited value and some, a few, a few (5, 4, 3,
2 or 1) means a large or small value. Preferred nucleic acid fragments of the invention are Br, as identified in FIG. 3 and described in more detail below.
a nucleic acid molecule encoding an epitope-bearing portion of an Ainiac-5 polypeptide.

【００４９】 「Ｂｒａｉｎｉａｃ−５機能的活性」とは、例えば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達
経路の活性化、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、Ｂｒａｉｎｉａｃ−
５と、Ｓｕ（Ｈ）またはＳｕ（Ｈ）のヒトホモログの間）の仲介の活性化、およ
び／またはＢｒａｉｎｉａｃ−５に特異的な抗体の結合の活性化を意味する。“Brainiac-5 functional activity” refers to, for example, activation of Notch signaling pathway, protein-protein interactions (eg, Brainiac-
5 and Su (H) or human homologues of Su (H)) and / or activation of binding of an antibody specific for Brainiac-5.

【００５０】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、改変体
、誘導体、およびアナログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ得
る。[0050] The functional activity of Brainiac-5 polypeptides, and fragments, variants, derivatives, and analogs thereof, can be assayed by various methods.

【００５１】 例えば、抗Ｂｒａｉｎｉａｃ−５抗体に結合するための全長Ｂｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチドに結合するかまたはそれと競合する能力についてアッセイする
、１つの実施形態では、当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る
。このようなアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合
免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、イムノラジオメトリック
アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（
例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロ
ット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血液凝集アッセイ
）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫
電気泳動アッセイなどのような技術を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げ
られるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、抗体結合が、一次抗体
上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態では、この一次抗体
が、二次抗体またはこの一次抗体に対する試薬の結合を検出することによって検
出される。さらなる実施形態では、この二次抗体が標識される。多くの手段が、
免疫アッセイにおける結合の検出について当該分野で公知であり、そして本発明
の範囲内である。For example, a full-length Brainiac for binding to an anti-Brainiac-5 antibody
In one embodiment, various immunoassays known in the art that assay for the ability to bind to or compete with a -5 polypeptide may be used. Such assays include radioimmunoassays, ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assays), "sandwich" immunoassays, immunoradiometric assays, gel diffusion sedimentation reactions, immunodiffusion assays, in situ immunoassays (
(Eg, using colloidal gold, enzyme or radioisotope labels), Western blots, sedimentation reactions, agglutination assays (eg, gel agglutination assays, blood agglutination assays), complement binding assays, immunofluorescence assays, protein A assays, and immunoassays Competitive and non-competitive assay systems using techniques such as electrophoretic assays, but are not limited to. In one embodiment, antibody binding is detected by detecting a label on the primary antibody. In another embodiment, the primary antibody is detected by detecting binding of a secondary antibody or a reagent to the primary antibody. In a further embodiment, the secondary antibody is labeled. Many means are
The detection of binding in immunoassays is known in the art and is within the scope of the present invention.

【００５２】 別の実施形態では、同定されたＢｒａｉｎｉａｃ−５リガンド、または本発明
のポリペプチドフラグメント、改変体、または誘導体が多量体化する能力が評価
される場合、結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タン
パク質アフィニティークロマトグラフィー、およびアフィニティーブロッティン
グのような当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得る。一般には、Ｐｈ
ｉｚｉｃｋｙ、Ｅ．ら、１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−
１２３を参照のこと。別の実施形態では、その基質へのＢｒａｉｎｉａｃ−５結
合の生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る。In another embodiment, when the ability of the identified Brainiac-5 ligand, or polypeptide fragment, variant, or derivative of the invention to multimerize is assessed, binding can be, for example, reduced and non- Assays can be by means well known in the art, such as reducing gel chromatography, protein affinity chromatography, and affinity blotting. Generally, Ph
izicky, E.I. Et al., 1995, Microbiol. Rev .. 59: 94-
See 123. In another embodiment, the physiological correlation (signaling) of Brainiac-5 binding to its substrate can be assayed.

【００５３】 他の方法が当業者に公知であり、そして本発明の範囲内である。[0053] Other methods are known to those skilled in the art and are within the scope of the present invention.

【００５４】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２のアミ
ノ酸７〜２０、７〜３３、６１〜８３、１０５〜１１９、１３９〜１４８、１６
０〜１７１、１８７〜１９６を含むか、あるいは、それからなるポリペプチドを
コードする。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドはまた
、本発明により包含される。In a further embodiment, the polynucleotide of the present invention comprises amino acids 7-20, 7-33, 61-83, 105-119, 139-148, 16 of SEQ ID NO: 2.
Encodes a polypeptide comprising or consisting of 0-171 or 187-196. The polypeptides encoded by these polynucleotides are also encompassed by the present invention.

【００５５】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１、２、３、４ま
たはそれ以上のＢｒａｉｎｉａｃ−５の機能的特性をコードする。これらの点に
おいて、本発明の好ましい実施形態は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５のα−へリックス
およびα−へリックス形成領域（「α−領域」）、β−シートおよびβ−シート
形成領域（「β−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン−領域」）
、コイルおよびコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域
、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、および高抗原
性指標領域を含むフラグメントを含む。これらのポリヌクレオチドによりコード
されるポリペプチドはまた、本発明により包含される。In a further embodiment, a polynucleotide of the invention encodes one, two, three, four or more Brainiac-5 functional properties. In these respects, preferred embodiments of the present invention relate to the α-helix and α-helix forming region of Brainiac-5 (“α-region”), β-sheet and β-sheet forming region (“β-region”). )), Turns and turn-forming regions ("turn-regions")
, A coil and a coil-forming region ("coil-region"), a hydrophilic region, a hydrophobic region, an alpha amphipathic region, a beta amphipathic region, a flexible region, a surface forming region, and a high antigenic index region. Including fragments. The polypeptides encoded by these polynucleotides are also encompassed by the present invention.

【００５６】 上記のように図３および／または表Ｉに示されるＢｒａｉｎｉａｃ−５の構造
的または機能的特性を表すデータは、デフォルトパラメーターにセットされたＤ
ＮＡ^*ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを用いて生成された。好
ましい実施形態において、表Ｉの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶに
提示されるデータは、抗原性についての可能性の高い程度を示すＢｒａｉｎｉａ
ｃ−５の領域を決定するために使用され得る。高い抗原性の領域は、抗原認識が
免疫応答の開始のプロセスにおいて生じ得る環境中でポリペプチドの表面に曝露
されるようであるポリペプチドの領域を提示する値を選択することによって、欄
ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、および／またはＩＶにおいて提示されるデータから
決定される。As described above, the data representing the structural or functional properties of Brainiac-5 shown in FIG.
Generated using various modules and algorithms of NA ^* STAR. In a preferred embodiment, the data presented in columns VIII, IX, XIII and XIV of Table I show Brainia indicating a likely degree of antigenicity
It can be used to determine the region of c-5. Highly antigenic regions are selected by selecting values that represent regions of the polypeptide that are likely to be exposed to the surface of the polypeptide in an environment where antigen recognition can occur in the process of initiating an immune response, column VIII, Determined from data presented in IX, XIII, and / or IV.

【００５７】 これらの点において特定の好ましい領域は図３に示されるが、この領域は、表
Ｉに示されるように、図３に提示されるデータの表の表示を用いることによって
提示および同定され得る。図３を生成するために使用されるＤＮＡ^*ＳＴＡＲコ
ンピューターアルゴリズム（元々のデフォルトパラメーターでセットされる）は
、表の形式において図３でデータを提示するために使用された（表Ｉを参照のこ
と）。図３におけるデータの表の形式は、好ましい領域の特定の境界を容易に決
定するために使用され得る。Although a particular preferred area in these respects is shown in FIG. 3, this area was presented and identified by using a tabular representation of the data presented in FIG. 3, as shown in Table I. obtain. The DNA ^* STAR computer algorithm used to generate FIG. 3 (set with the original default parameters) was used to present the data in FIG. 3 in the form of a table (see Table I). ). The tabular form of the data in FIG. 3 can be used to easily determine the specific boundaries of the preferred area.

【００５８】 図３および表Ｉに示される上記の好ましい領域は、図１Ａおよび１Ｂに示され
るアミノ酸配列の分析によって同定される上記のタイプの領域を含むが、これら
に限定されない。図３および表Ｉに示されるように、このような好ましい領域と
しては、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−領域、ターン−領域、
およびコイル−領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β−領域、およびコ
イル−領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域、Ｅ
ｉｓｅｎｂｅｒｇのα−およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌ
ｚの可撓性領域、Ｅｍｉｎｉの表面形成領域、およびＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ
の高抗原性指数領域が挙げられるがこれらに限定されない。The preferred regions shown in FIG. 3 and Table I include, but are not limited to, the types of regions identified by analysis of the amino acid sequences shown in FIGS. 1A and 1B. As shown in FIG. 3 and Table I, such preferred regions include the Garnier-Robson α-region, β-region, turn-region,
Coil-region, Chou-Fasman α-region, β-region, and coil-region, Kyte-Doolittle hydrophilic and hydrophobic regions, E
α- and β-amphiphilic regions of isenberg, Karplus-Schul
z flexible region, Emini surface forming region, and Jameson-Wolf
High antigenic index region, but is not limited thereto.

【００５９】[0059]

【表１】 この点において非常に好ましいフラグメントには、上記の特色のいくつかのよ
うな、いくつかの構造的な特徴を組み合わせるＢｒａｉｎｉａｃ−５の領域を含
むか、あるいは、それからなるものがある。[Table 1] Highly preferred fragments in this regard include those that comprise or consist of Brainiac-5 regions that combine several structural features, such as some of the features described above.

【００６０】 別の実施形態において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、本明細書中で記載されるような
、配列番号１（ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２に含まれるＢｒａｉｎｉａｃ−５ ｃＤＮＡクローン）に示したコード配列および／または非コード配列に相補的
な配列、またはこれらの配列のフラグメント（例えば、オープンリーディングフ
レーム、またはそのフラグメントのような））中のポリヌクレオチドの一部にハ
イブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件」によって、以下：５０％ホルム
アミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）
、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸
デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ***ＤＮＡを含む溶液中で
の４２℃での一晩のインキュベーション、続いて約６５℃での０．１×ＳＳＣ中
でのフィルターの洗浄が意図される。In another embodiment, the present invention provides a nucleic acid molecule of the invention described above (eg, SEQ ID NO: 1 (ATCC accession number, as described herein) under stringent hybridization conditions. In the Brainiac-5 cDNA clone contained in US Pat. No. 203572), or in a sequence complementary to the coding and / or non-coding sequences, or a fragment of such a sequence (eg, such as an open reading frame, or a fragment thereof). Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide that hybridizes to a portion of the polynucleotide. Depending on "stringent hybridization conditions": 50% formamide, 5xSSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate)
Overnight at 42 ° C. in a solution containing 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 × Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 μg / ml denatured sheared salmon sperm DNA, followed by about 65 ° C. Washing of the filter in 0.1 × SSC at 0 ° C. is contemplated.

【００６１】 ポリヌクレオチドの「部分（一部）」にハイブリダイズするポリヌクレオチド
によって、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そ
してより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約
３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは約３０〜７０（例えば５０）ｎｔにハイブ
リダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される
。これらは、上記で議論され、そして以下でより詳細に議論されるような診断用
プローブおよびプライマーとして有用である。By a polynucleotide that hybridizes to a “portion” of a polynucleotide, at least about 15 nucleotides (nt) of the reference polynucleotide, and more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least about 30 nt, and Still more preferably, polynucleotides (either DNA or RNA) that hybridize to about 30-70 (eg, 50) nt are contemplated. These are useful as diagnostic probes and primers as discussed above and as discussed in more detail below.

【００６２】 例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの一部により、参照ポ
リヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡ、または図１
Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列）由来の２０以
上の連続したヌクレオチドが意図される。もちろん、ポリＡ配列（例えば図１Ａ
および１Ｂ（配列番号１）に示されるＢｒａｉｎｉａｃ−５ ｃＤＮＡの３’末
端ポリ（Ａ）トラクト（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補
的なストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）のみにハイブリダイズするポリヌクレオチド
は、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌ
クレオチドに含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ
）ストレッチを含む任意の核酸分子またはその相補体（例えば、実際には任意の
二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするからである。For example, a portion of a polynucleotide that is “at least 20 nt long” may cause the nucleotide sequence of the reference polynucleotide (eg, the deposited cDNA, or FIG. 1).
Twenty or more contiguous nucleotides from A and 1B (nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 1) are contemplated. Of course, the poly A sequence (eg, FIG. 1A)
And 1B (SEQ ID NO: 1) hybridizes to the 3 ′ end poly (A) tract of Brainiac-5 cDNA) or only to the complementary stretch of T (or U) residue. Polynucleotides are not included in the polynucleotides of the present invention used to hybridize to a portion of the nucleic acids of the present invention. Because such a polynucleotide is a poly (A
) Because it hybridizes to any nucleic acid molecule containing a stretch or its complement (eg, virtually any double-stranded cDNA clone).

【００６３】 示されるように、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードする本発明の核
酸分子は、それ自体成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子；お
よび成熟ポリペプチドおよびさらなる配列のコード配列、例えばリーダーまたは
分泌配列（例えばプレタンパク質配列、またはプロタンパク質配列もしくはプレ
プロタンパク質配列）をコードするもの；上記のさらなるコード配列を有するか
または有さない成熟ポリペプチドのコード配列を含み得るがこれらに限定されな
い。As indicated, the nucleic acid molecule of the invention encoding a Brainiac-5 polypeptide is a nucleic acid molecule that itself encodes the amino acid sequence of a mature polypeptide; and the coding sequence of the mature polypeptide and additional sequences, eg, a leader Or that encodes a secretory sequence (eg, a pre-protein sequence, or a pro-protein or pre-pro-protein sequence); and may include, but is not limited to, the coding sequence of a mature polypeptide with or without the additional coding sequences described above.

【００６４】 本発明の核酸によって、例えば、イントロンならびに非コード５’配列および
非コード３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割（例えば
、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性）を果たす転写非翻訳配列（スプライ
シングシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む））を含むがこれらに限定
されないさらなる非コード配列；さらなるアミノ酸をコードするさらなるコード
配列（例えば、さらなる機能性を提供するもの）とともに上記のポリペプチド配
列もまたコードされる。The nucleic acids of the invention may, for example, be introns and non-coding 5 ′ and non-coding 3 ′ sequences (eg, transcription, untranslated sequences that play a role in mRNA processing (eg, ribosome binding and stability of mRNA)). Additional non-coding sequences, including but not limited to (including splicing and polyadenylation signals); additional coding sequences encoding additional amino acids (e.g., those that provide additional functionality); Coded.

【００６５】 従って、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合ポリ
ペプチドの精製を容易にするか、または細胞からの融合リペプチドの分泌におい
て機能し得るペプチドをコードする配列）と融合され得る。本発明のこの局面の
特定の好ましい実施形態において、このマーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチ
ジンペプチド、例えば、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，
９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１
）に提供されるタグであり、これらの多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚおよび
共同研究者（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−
８２４（１９８９））に記述されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは融合タ
ンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、Ｗｉｌｓｏｎおよび共同研
究者（Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））によりに記述されているインフル
エンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する、精製に有用な別
のペプチドである。以下に議論するように、他のこのような融合タンパク質は、
Ｎ末端またはＣ末端でＦｃに融合したＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを含む
。Thus, a sequence encoding a polypeptide is fused to a marker sequence (eg, a sequence encoding a peptide that facilitates purification of the fusion polypeptide or can function in secretion of the fusion polypeptide from cells). obtain. In certain preferred embodiments of this aspect of the invention, the marker amino acid sequence is a hexahistidine peptide, for example, a pQE vector (QIAGEN, Inc., inter alia).
9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311.
), And many of these are commercially available. Gentz and coworkers (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-
824 (1989)), for example, hexahistidine provides for convenient purification of the fusion protein. The "HA" tag is another peptide useful for purification, corresponding to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein described by Wilson and coworkers (Cell 37: 767 (1984)). As discussed below, other such fusion proteins are:
Includes Brainiac-5 polypeptide fused to Fc at the N-terminus or C-terminus.

【００６６】 本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関し、これはＢｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチドの一部、アナログまたは誘導体をコードする。改変体は、天然
の対立遺伝子改変体のように天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」により、
生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替形態のひと
つが意図される（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。天然に存在しない改変体
は、当該分野において公知の変異誘発技術（オリゴヌクレオチド媒介変異誘発、
アラニン走査、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら
、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌ
ｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照
のこと）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５
（１９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈ
ｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５
（１９８６）参照のこと）を含むが、これらに限定されない）を使用して産生さ
れ得る。The present invention further relates to variants of the nucleic acid molecules of the invention, which comprise Brainiac
Encodes a part, analog or derivative of a -5 polypeptide. Variants can be naturally occurring, such as naturally occurring allelic variants. By "allelic variant",
One of several alternative forms of the gene occupying a given locus on the chromosome of the organism is contemplated (Genes II, Lewin, B. Ed., John Wile).
y & Sons, New York (1985)). Non-naturally occurring variants can be obtained by mutagenesis techniques known in the art (oligonucleotide-mediated mutagenesis,
Alanine scanning, PCR mutagenesis, site-directed mutagenesis (eg, Carter et al., Nucl. Acids Res. 13: 4331 (1986); and Zol)
ler et al., Nucl. Acids Res. 10: 6487 (1982)), cassette mutagenesis (eg, Wells et al., Gene 34: 315).
(1985)), restriction selection mutagenesis (eg, Wells et al., Ph.
ilos. Trans. R. Soc. London SerA 317: 415
(1986)).

【００６７】 このような改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失または付加により生成した改
変体を含む。置換、欠失または付加は１つ以上のヌクレオチドを含み得る。この
改変体は、コード領域、非コード領域または両方で変更され得る。コード領域で
の変化は、保存性または非保存性のアミノ酸の置換、欠失または付加を生成し得
る。これらの中で特に好ましいものは、サイレントな置換、付加および欠失であ
り、これはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドまたはその一部の特性および活性
を変化させない。この点においてまた特に好ましいものは、保存的置換である。Such variants include those produced by nucleotide substitutions, deletions or additions. Substitutions, deletions or additions may involve one or more nucleotides. The variants can be altered in coding regions, non-coding regions, or both. Changes in the coding region may result in conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions or additions. Especially preferred among these are silent substitutions, additions and deletions, which do not alter the properties and activities of the Brainiac-5 polypeptide or a portion thereof. Also particularly preferred in this regard are conservative substitutions.

【００６８】 本発明のさらなる実施形態は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド（例えば、
本明細書で記載のＢｒａｉｎｉａｃ−５フラグメント）のアミノ酸配列をコード
するポリヌクレオチドを含むか、あるいは、それからなる単離された核酸分子に
関する。ここでＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ
酸置換を含むが、５０以下の保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは４０以
下の保存的アミノ酸置換、なおより好ましくは３０以下の保存的アミノ酸置換、
そしてなおさらに好ましくは２０以下の保存的アミノ酸置換、１０〜２０の保存
的アミノ酸置換、５〜１０の保存的アミノ酸置換、１〜５の保存的アミノ酸置換
、３〜５の保存的アミノ酸置換、１〜３の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配
列を有する。当然のことながら、より優先度が増加する順に、アミノ酸配列（こ
れは、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の保存的なアミノ酸
置換を含む）を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのアミノ酸配列を含む
アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが、非常に好ましい。[0068] A further embodiment of the present invention is a Brainiac-5 polypeptide (eg,
An isolated nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide encoding the amino acid sequence of Brainiac-5 fragment described herein). Wherein the Brainiac-5 polypeptide comprises at least one amino acid substitution, but no more than 50 conservative amino acid substitutions, even more preferably no more than 40 conservative amino acid substitutions, even more preferably no more than 30 conservative amino acid substitutions;
And still more preferably 20 or less conservative amino acid substitutions, 10-20 conservative amino acid substitutions, 5-10 conservative amino acid substitutions, 1-5 conservative amino acid substitutions, 3-5 conservative amino acid substitutions, It has an amino acid sequence containing ~ 3 conservative amino acid substitutions. Of course, in the order of increasing priority, having the amino acid sequence (which includes no more than 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 conservative amino acid substitutions) Polynucleotides encoding amino acid sequences, including the amino acid sequence of Brainiac-5 polypeptide, are highly preferred.

【００６９】 最も好ましいのは、配列番号２に示したアミノ酸配列、または寄託したｃＤＮ
Ａクローンによりコードされる成熟Ｂｒａｉｎｉａｃ−５アミノ酸配列を有する
成熟ポリペプチドをコードする核酸分子である。Most preferably, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or the deposited cDN
A nucleic acid molecule encoding a mature polypeptide having the mature Brainiac-5 amino acid sequence encoded by the A clone.

【００７０】 従って、本発明の１つの実施形態は、以下からなる群より選択されるヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいは、それからなる単離され
た核酸分子を提供する：（ａ）配列番号２（すなわち、配列番号２の１〜２７８
位）の完全なアミノ酸配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコード
する、ヌクレオチド配列；（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２に含まれるｃＤ
ＮＡクローンによりコードされる完全なアミノ酸配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号２
０３５７２に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有す
る成熟Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；お
よび（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかに相
補的なヌクレオチド配列。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチド
もまた本発明によって含まれる。Accordingly, one embodiment of the present invention provides an isolated nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide having a nucleotide sequence selected from the group consisting of: (a) sequence No. 2 (ie, 1 to 278 of SEQ ID NO: 2)
A) a nucleotide sequence encoding a Brainiac-5 polypeptide having the complete amino acid sequence of position (b); (b) cD contained in ATCC accession number 203572;
Brainiac having complete amino acid sequence encoded by NA clone
Nucleotide sequence encoding -5 polypeptide; (c) ATCC accession number 2
A nucleotide sequence encoding a mature Brainiac-5 polypeptide having the amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in Sci. Complementary nucleotide sequence. The polypeptides encoded by these nucleic acid molecules are also included by the present invention.

【００７１】 本発明のさらなる実施形態には、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）
のヌクレオチド配列のいずれかに、少なくとも９０％同一、およびより好ましく
は少なくとも９２％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一のヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ
）または（ｄ）のポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むか、あるいは、それから
なる単離された核酸分子が含まれる。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチド
は、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレ
オチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ
しない。A further embodiment of the present invention includes the above (a), (b), (c) or (d)
A polynucleotide having a nucleotide sequence at least 90% identical, and more preferably at least 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to any of the nucleotide sequences of , (B), (c)
Or) a polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide of (d) under stringent hybridization conditions, or comprises an isolated nucleic acid molecule. The polynucleotide that hybridizes does not hybridize under stringent hybridization conditions to a polynucleotide having a nucleotide sequence consisting of only A residues or only T residues.

【００７２】 本発明のさらなる核酸実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミ
ノ酸配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのエピトープ保有部分のア
ミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子に関する
。本発明のさらなる核酸実施形態は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのアミ
ノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。こ
こでＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、少なくとも１つの保存的アミノ酸置
換を含むアミノ酸残基を有するが、５０以下の保存的アミノ酸置換、さらにより
好ましくは４０以下の保存的アミノ酸置換、なおより好ましくは３０以下の保存
的アミノ酸置換、そしてなおさらに好ましくは２０以下の保存的アミノ酸置換を
含むアミノ酸配列を有する。当然のことながら、より優先度が増加する順に、ア
ミノ酸配列（これは、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の保
存的なアミノ酸置換を含む）を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのアミ
ノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが、非常に好ましい。これらの核酸分子
によりコードされるポリペプチドもまた、本発明に含まれる。A further nucleic acid embodiment of the present invention comprises a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the epitope-bearing portion of a Brainiac-5 polypeptide having the amino acid sequence of (a), (b) or (c) above, It relates to an isolated nucleic acid molecule. A further nucleic acid embodiment of the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding the amino acid sequence of a Brainiac-5 polypeptide. Here, the Brainiac-5 polypeptide has an amino acid residue comprising at least one conservative amino acid substitution, but no more than 50 conservative amino acid substitutions, even more preferably no more than 40 conservative amino acid substitutions, even more preferably no more than 30 conservative amino acid substitutions. It has an amino acid sequence comprising the following conservative amino acid substitutions, and even more preferably 20 or less. Of course, in the order of increasing priority, having the amino acid sequence (which includes no more than 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 conservative amino acid substitutions) Polynucleotides encoding the amino acid sequence of Brainiac-5 polypeptide are highly preferred. The polypeptides encoded by these nucleic acid molecules are also included in the present invention.

【００７３】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、および組
換えベクターを含む宿主細胞、ならびに組換え技術によりそのようなベクターお
よび宿主細胞を作製する方法、ならびにＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドまた
はペプチドの生成のためにそれらを使用する方法に関する。The present invention also relates to recombinant vectors comprising the isolated nucleic acid molecules of the present invention, and host cells comprising the recombinant vectors, and methods of making such vectors and host cells by recombinant techniques, and Brainiac-5 polypeptides or methods of using them for the production of peptides.

【００７４】 本発明の一つの実施形態において、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコー
ドする参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド
配列が、このポリヌクレオチド配列がＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリぺプチドをコー
ドする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を
含み得ることを除いて、参照配列に対して同一であることを意図する。換言すれ
ば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までが
、欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配
列中の総ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され
得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末
端位置において、またはこれらの末端位置の間の任意の位置で、参照配列中のヌ
クレオチド間で個々に、もしくは参照配列内の１以上の連続した群においての、
いずれかで散在して生じ得る。In one embodiment of the invention, a polynucleotide having a nucleotide sequence that is, for example, at least 95% “identical” to a reference nucleotide sequence encoding a Brainiac-5 polypeptide is that the nucleotide sequence of the polynucleotide is It is intended that the polynucleotide sequence be identical to the reference sequence except that it may contain up to 5 point mutations per 100 nucleotides of the reference nucleotide sequence encoding the Brainiac-5 polypeptide. In other words, to obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence at least 95% identical to the reference nucleotide sequence, up to 5% of the nucleotides in the reference sequence can be deleted or replaced with another nucleotide. Or as many nucleotides as 5% of the total nucleotides in the reference sequence can be inserted into the reference sequence. These mutations in the reference sequence may be at the 5 'or 3' terminal position of the reference nucleotide sequence, or at any position between these terminal positions, individually between nucleotides in the reference sequence, or by 1 within the reference sequence. In the above continuous group,
It can occur interspersed with either.

【００７５】 実際問題として、任意の特定の核酸分子、またはその一部分もしくはフラグメ
ントが、例えば、図１Ａおよび１Ｂに示されるヌクレオチド配列または寄託され
たｃＤＮＡクローンヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％同一、９２％
同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一で
あるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョ
ン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａ
ｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使
用して従来通りに決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間で相同性の最
も高いセグメントを見出すために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ
ａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４
８９、１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを使用する。特定の配列が本発明
に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定するために、
Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを使用する場合、当然のこ
とながら、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計
算され、そして参照配列内のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギ
ャップが許容されるようにパラメーターを設定する。問い合わせ配列（本発明の
配列）と対象配列との間の最も良好な全体的な適合性（全体的な配列整列ともい
われる）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇおよび共同研究者（
Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴ
リズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る
。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列
である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。この全体
的な配列整列の結果は、同一性パーセントで表される。同一性パーセントを算定
するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメー
ターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃ
ｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏ
ｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ
＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎ
ｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短
い方）である。As a practical matter, any particular nucleic acid molecule, or a portion or fragment thereof, may be at least 90% identical, for example, to the nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and 1B or the deposited cDNA clone nucleotide sequence. %
Whether they are identical, 95% identical, 96% identical, 97% identical, 98% identical, or 99% identical is determined by the Bestfit program (Wisconsin Seque
ns Analysis Package, Version 8 for Unix (registered trademark), Genetics Computer Group, University
y Research Park, 575 Science Drive, Ma
disson, WI 53371) and can be determined conventionally using known computer programs. Bestfit uses Smith and Waterman (Adv) to find the segment of highest homology between the two sequences.
ances in Applied Matrices 2: 482-4
89, 1981). To determine whether a particular sequence is, for example, 95% identical to a reference sequence according to the invention,
When using Bestfit or any other sequence alignment program, it is understood that the percentage of identity is calculated over the entire length of the reference nucleotide sequence, and the gap in homology is up to 5% of the total number of nucleotides in the reference sequence. Set the parameters to allow. A preferred method for determining the best overall match (also called an overall sequence alignment) between a query sequence (sequence of the invention) and a subject sequence is described by Brutlag and co-workers (
Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990)). In sequence alignment, the query and subject sequences are both DNA sequences. RNA sequences can be compared by converting U to T. The result of this global sequence alignment is expressed as percent identity. Preferred parameters used in FASTDB alignment of DNA sequences to calculate percent identity are: Matrix = Unitary, k-tuple = 4, Mismatc
h Penalty = 1, Joining Penalty = 30, Rando
migration Group Length = 0, Cutoff Score
= 1, Gap Penalty = 5, Gap Size Penalty 0.05, Win
dow Size = 500 or the length of the nucleotide sequence of interest (whichever is shorter).

【００７６】 対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失が理由ではなく）、問い
合わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなければならない。
これは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配
列の５’および３’の短縮を考慮しないからである。問い合わせ配列に対して、
５’末端または３’末端で短縮化された対象配列については、同一性パーセント
は、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、一致／整列されない対象配列
の５’および３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正
される。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結
果によって決定される。次いで、このパーセントが、特定のパラメーターを用い
て上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定された同一性パーセントから差し
引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコア
が、本発明の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示される
場合、問い合わせ配列と一致／整列されいていない、対象配列の５’および３’
塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算
定される。If the subject sequence is shorter than the query sequence due to a 5 ′ or 3 ′ deletion (not because of an internal deletion), a manual correction must be made to the result.
This is because the FASTDB program does not consider the 5 'and 3' truncations of the subject sequence when calculating percent identity. For a query array,
For subject sequences truncated at the 5 'or 3' end, percent identity is expressed as the percentage of total bases in the query sequence, of the bases in the query sequence that are 5 'and 3' of the subject sequence that are not matched / aligned. It is corrected by calculating the number. Whether nucleotides are matched / aligned is determined by the result of the FASTDB sequence alignment. This percentage is then subtracted from the percent identity calculated by the FASTDB program above using the specified parameters to arrive at a final percent identity score. This corrected score is used for the purpose of the present invention. 5 'and 3' of the subject sequence, as indicated by FASTDB alignment, not matched / aligned with the query sequence
Only bases outside the base are calculated for the purpose of manually adjusting the percent identity score.

【００７７】 例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に対して整列される。その欠失は、対象配列の５’末端で生
じ、従って、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示
さない。この１０個の不対合塩基は、この配列の１０％（（一致していない５’
および３’末端の塩基の数）／（問い合わせ配列の塩基の総数））を表し、その
ため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントの
スコアから差し引かれる。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同
一性パーセントは９０％である。別の例において、９０塩基の対象配列が、１０
０塩基の問い合わせ配列と比較される。この場合、この欠失は内部欠失であり、
その結果、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’に塩基
が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは
手動で補正されない。再度、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’
および３’の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的の
ためにはなされない。For example, a 90 base subject sequence is aligned to a 100 base query sequence to determine percent identity. The deletion occurs at the 5 'end of the subject sequence, so the FASTDB alignment does not show a match / alignment of the first 10 bases at the 5' end. The 10 unpaired bases account for 10% of this sequence ((5 '
And the number of bases at the 3 'end) / (total number of bases in the query sequence)), so that 10% is subtracted from the percent identity score calculated by the FASTDB program. If the remaining 90 bases match exactly, the final percent identity is 90%. In another example, the 90 base subject sequence is 10
This is compared with the 0 base query sequence. In this case, the deletion is an internal deletion,
As a result, there is no base at 5 ′ or 3 ′ of the target sequence that does not match / align with the query sequence. In this case, the percent identity calculated by FASTDB is not manually corrected. Again, 5 'of the target sequence that does not match / align with the query sequence
And only the 3 'base are manually corrected. No other manual corrections are made for the purposes of the present invention.

【００７８】 本出願は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１）に示された核酸配列に対して、
あるいは寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に対して、それらがＢｒａｉｎｉａｃ−
５活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、少なくとも９０％
同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または
９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはこれらの配列からなる
核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子がＢｒａｉｎｉａｃ−５活性を有す
るポリペプチドをコードしない場合ですら、当業者はどのようにこの核酸分子を
使用するか（例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）プライマーとして）をなお知っているためである。Ｂｒａｉｎｉ
ａｃ−５活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用とし
ては、特に、（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＢｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子また
はその対立遺伝子改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａおよび共同研究者（
Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋ．（
１９８８））に記載されるような、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子の正確な染色体
位置を提供するための、***中期染色体スプレッドに対するインサイチュハイブ
リダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；および（３）特定の組織における
Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析が
挙げられる。The present application relates to the nucleic acid sequences shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1)
Alternatively, against the nucleic acid sequence of the deposited cDNA,
At least 90%, whether or not it encodes a polypeptide having 5 activities
A nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide sequence that is, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical. This is how one of skill in the art would use this nucleic acid molecule even if the particular nucleic acid molecule does not encode a polypeptide having Brainiac-5 activity (eg, a hybridization probe or a polymerase chain reaction (PCR) primer). As) still knows. Braini
Uses of the nucleic acid molecules of the invention that do not encode a polypeptide having ac-5 activity include, among others, (1) isolating the Brainiac-5 gene or allelic variants thereof in a cDNA library; (2) Verma and co-workers (
Human Chromosomes: A Manual of Basic
Techniques, Pergamon Press, New. York. (
1988)), in situ hybridization to metaphase chromosomal spreads (eg, "FISH") to provide the exact chromosomal location of the Brainiac-5 gene; and (3) Brainiac in certain tissues -5 Northern blot analysis to detect mRNA expression.

【００７９】 しかし、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１）に示された核酸配列に対して、ま
たは寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に対して、少なくとも９０％同一、９２％同
一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一または９９％同一な配列
を有する（すなわち、含む）かまたはこれらの配列からなる、核酸分子が好まし
く、これは、事実、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの機能的活性を有するポ
リペプチドをコードする。「Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの機能的活性を
有するポリペプチド」によって、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるよ
うに、本発明の成熟Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの活性と類似する活性（
しかし、同一である必要はない）を示すポリペプチドが意図される。However, at least 90% identity, 92% identity, 95% identity, to the nucleic acid sequence shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1) or to the nucleic acid sequence of the deposited cDNA. Nucleic acid molecules having (ie comprising) or consisting of sequences that are 96% identical, 97% identical, 98% identical or 99% identical, which in fact are functional of Brainiac-5 polypeptides, are preferred. Encodes a polypeptide having activity. By "a polypeptide having a functional activity of a Brainiac-5 polypeptide", an activity similar to that of the mature Brainiac-5 polypeptide of the present invention, as measured in a particular biological assay (
However, they need not be the same).

【００８０】 例えば、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、細胞の増殖および分
化を調節する。従って、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの生物学的活性は、
アガロース培養における器官培養アッセイまたはコロニーアッセイ系において、
試験され得る。細胞増殖の刺激または阻害は、種々のアッセイにより測定され得
る。細胞増殖阻害を観察するために、固体培地または液体培地を使用し得る。固
体培地において、増殖阻害を受ける細胞は、形成されたコロニーの大きさを比較
することにより対象細胞群から容易に選択され得る。液体培地において、増殖阻
害は、培養ブロスの濁度またはＤＮＡにおける標識チミジンの取り込みを測定す
ることによりスクリーニングされ得る。代表的に、新たに合成されたＤＮＡへの
ヌクレオシドアナログの取り込みを使用して、細胞の集団における増殖（すなわ
ち、活性細胞増殖）を測定する。例えば、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）
は、ＤＮＡ標識試薬として使用し得、そして抗ＢｒｄＵマウスモノクロナール抗
体（クローンＢＭＣ９３１８ＩｇＧ₁）は、検出試薬として使用し得る。この抗
体は、ブロモデオキシウリジンを取り込んでいるＤＮＡを含む細胞にのみ結合す
る。多くの検出方法が、免疫蛍光法、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、および比色方
法を含むこのアッセイとを組み合わせて使用され得る。ブロモデオキシウリジン
（ＢｒｄＵ）および抗ＢｒｄＵマウスモノクロナール抗体を含むキットは、Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から
市販されている。For example, Brainiac-5 polypeptides of the invention regulate cell growth and differentiation. Thus, the biological activity of Brainiac-5 polypeptide is
In an organ culture or colony assay system in agarose culture,
Can be tested. Stimulation or inhibition of cell proliferation can be measured by various assays. To observe cell growth inhibition, solid or liquid media may be used. In a solid medium, cells that undergo growth inhibition can be easily selected from a target cell group by comparing the size of the formed colony. In liquid media, growth inhibition can be screened by measuring the turbidity of the culture broth or the incorporation of labeled thymidine in the DNA. Typically, incorporation of nucleoside analogs into newly synthesized DNA is used to measure proliferation in a population of cells (ie, active cell proliferation). For example, bromodeoxyuridine (BrdU)
Is obtained by using as a DNA labeling reagent and anti-BrdU mouse monoclonal antibody (clone BMC9318IgG ₁₎ may be used as a detection reagent. This antibody only binds to cells containing DNA incorporating bromodeoxyuridine. Many detection methods can be used in combination with this assay, including immunofluorescence, immunohistochemistry, ELISA, and colorimetric methods. Kits containing bromodeoxyuridine (BrdU) and anti-BrdU mouse monoclonal antibody are available from Bo
It is commercially available from Ehringer Mannheim (Indianapolis, IN).

【００８１】 細胞分化に対する効果は、胚細胞を種々の量のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプ
チドと接触すること、そして胚細胞の分化に対する効果を観察することにより測
定され得る。組織特異的抗体および顕微鏡を使用して、得られた細胞を同定し得
る。[0081] The effect on cell differentiation can be measured by contacting the embryonic cells with various amounts of Brainiac-5 polypeptide and observing the effect on embryonic cell differentiation. The resulting cells can be identified using tissue specific antibodies and a microscope.

【００８２】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、上記したアッセイにおいて用量依存性
様式で免疫系および／または神経系の細胞増殖および分化を調節する。従って、
「Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド活性を有するポリペプチド」は、用量依存
性様式で上記アッセイにおいて同様の増殖および分化の調節活性のいずれかも示
すポリペプチドを含む。用量依存性活性の程度は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペ
プチドの程度と同一である必要はないが、好ましくは、「Ｂｒａｉｎｉａｃ−５
ポリペプチド活性を有するポリペプチド」は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチ
ドと比較して、所定の活性において実質的に類似の用量依存性を示す（すなわち
、候補ポリペプチドは、参照Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドに対して、より
大きな活性を示すか、または約１／２５以上の活性を示し、そして好ましくは約
１／１０以上の活性を示す）。[0082] Brainiac-5 polypeptides modulate immune and / or nervous system cell proliferation and differentiation in a dose-dependent manner in the assays described above. Therefore,
"Polypeptides having Brainiac-5 polypeptide activity" include polypeptides that also exhibit similar growth and differentiation regulatory activity in the above assays in a dose-dependent manner. The degree of dose-dependent activity need not be the same as that of the Brainiac-5 polypeptide, but is preferably “Brainiac-5”.
A "polypeptide having polypeptide activity" exhibits a substantially similar dose dependence in a given activity as compared to a Brainiac-5 polypeptide (i.e., a candidate polypeptide has a Exhibit more activity, or exhibit about 1/25 or more activity, and preferably exhibit about 1/10 or more activity).

【００８３】 もちろん、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、寄託されたｃＤＮＡの核
酸配列、または図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示された核酸配列に対して、
少なくとも９０％同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９
８％同一または９９％同一な配列を有する多くの核酸分子が「Ｂｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチドの機能的活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ち
に認識する。事実、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体は全て、同じポリペ
プチドをコードするので、これは、上記の比較アッセイを行わなくとも、当業者
に明らかである。縮重改変体ではないこのような核酸分子については、相当な数
がまたＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードす
ることは当該分野においてさらに認識される。このことは、以下にさらに記載さ
れるように、当業者が、ポリペプチド機能に有意に変化をもたらすとさほど思わ
ないか、または全く思われないかのいずれかであるアミノ酸置換（例えば、１つ
の脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸で置換すること）を十分認識するため
である。Of course, due to the degeneracy of the genetic code, one of skill in the art would be able to access the nucleic acid sequence of the deposited cDNA or the nucleic acid sequence shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1)
At least 90% identical, 92% identical, 95% identical, 96% identical, 97% identical, 9
Many nucleic acid molecules having sequences that are 8% or 99% identical are referred to as "Brainiac."
It immediately recognizes that it encodes "a polypeptide having the functional activity of a -5 polypeptide." In fact, all of these degenerate variants of the nucleotide sequence will encode the same polypeptide, which will be apparent to one of skill in the art without performing the above-described comparative assays. For such nucleic acid molecules that are not degenerate variants, it will be further recognized in the art that a significant number will also encode a polypeptide having Brainiac-5 polypeptide activity. This is because, as described further below, one of ordinary skill in the art will recognize that amino acid substitutions (eg, one amino acid substitution) that are less likely or not at all likely to result in a significant change in polypeptide function. (Replacement of an aliphatic amino acid with a second aliphatic amino acid).

【００８４】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、その組換えベ
クターを使用して遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるＢｒａｉ
ｎｉａｃ−５ポリペプチドまたはそのフラグメントの生成に関する。ベクターは
、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または
レトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製能があっ
てよいしまたは複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に
、相補的な宿主細胞においてのみ起こる。Vectors and Host Cells The present invention also relates to vectors comprising the isolated DNA molecules of the present invention, host cells genetically engineered using the recombinant vectors, and Brai by recombinant techniques.
the production of a niac-5 polypeptide or a fragment thereof. The vector can be, for example, a phage vector, a plasmid vector, a viral vector, or a retroviral vector. Retroviral vectors may be replication competent or replication defective. In the latter case, viral propagation generally occurs only in complementary host cells.

【００８５】 そのポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベ
クターに結合され得る。一般に、プラスミドベクターは、沈殿物（例えば、リン
酸カルシウム沈殿物）の状態、または荷電した脂質との複合体の状態で導入され
る。このベクターがウイルスである場合、このベクターは、適切なパッケージン
グ細胞株を使用してインビトロでパッケージングされ得、次いで、宿主細胞に形
質導入され得る。[0085] The polynucleotide can be ligated to a vector containing a selectable marker for propagation in a host. Generally, a plasmid vector is introduced in the form of a precipitate (eg, a calcium phosphate precipitate) or in a complex with a charged lipid. If the vector is a virus, the vector can be packaged in vitro using a suitable packaging cell line and then transduced into host cells.

【００８６】 そのＤＮＡ挿入物は、いくつかの名前を挙げると、λファージＰＬプロモータ
ー、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｐｈｏＡプロモ
ーター、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、な
らびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターのような、適切なプロモーターに作
動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知であ
る。発現構築物は、転写開始のための部位、転写終結のための部位、および転写
された領域において翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。この構築物
によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチ
ドの始めに翻訳開始コドンを、そして翻訳されるポリペプチドの最後に適切に位
置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。[0086] The DNA inserts are, to name a few, phage lambda PL promoter, E. It should be operably linked to a suitable promoter, such as the E. coli lac promoter, the trp promoter, the phoA promoter, and the tac promoter, the SV40 early and late promoters, and the promoter of the retroviral LTR. Other suitable promoters are known to those skilled in the art. The expression construct further comprises a site for transcription initiation, a site for transcription termination, and a ribosome binding site for translation in the transcribed region. The coding portion of the transcript expressed by this construct preferably has a translation initiation codon at the beginning of the translated polypeptide and a stop codon (UAA, UGA or UAG) appropriately located at the end of the translated polypeptide. )including.

【００８７】 示されたように、この発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マ
ーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養については、ジ
ヒドロ葉酸レダクターゼ耐性、Ｇ４１８耐性、またはネオマイシン耐性、ならび
にＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養については、テトラサイクリン耐性
遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる
。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ
受託番号２０１１７８）））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２
細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細
胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細
胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記した宿主細胞についての適切な
培養培地および培養条件は、当該分野で公知である。As indicated, the expression vector preferably contains at least one selectable marker. Such markers include, for eukaryotic cell cultures, dihydrofolate reductase resistance, G418 resistance, or neomycin resistance, and E. coli. For culturing in E. coli and other bacteria, a tetracycline resistance gene, a kanamycin resistance gene, or an ampicillin resistance gene may be mentioned. Representative examples of suitable hosts include bacterial cells (eg, E. coli cells, S.
Treptomyces cells and Salmonella typhimur
fungal cells (eg, yeast cells (eg, Saccharomyc)
es cerevisiae or Pichia pastoris (ATCC
Accession number 2011178))); insect cells (eg, Drosophila S2)
Cells, and Spodoptera Sf9 cells); animal cells (eg, CHO cells, COS cells, 293 cells, and Bowes melanoma cells); and plant cells. Suitable culture media and conditions for the above-described host cells are known in the art.

【００８８】 細菌における使用に好ましいベクターとしては、ｐＨＥ４−５（ＡＴＣＣ受託
番号２０９３１１；およびその改変体）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱ
Ｅ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒ
ｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、
ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ならびにｐｔｒｃ９９
ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）が挙げられる。酵母系での使用に好ましい発現ベクターとしては
、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ
、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、
ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから全て入手可能である）が挙げら
れるが、これらに限定されない。好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮ
ＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。Preferred vectors for use in bacteria include pHE4-5 (ATCC Accession No. 209311; and variants thereof), pQE70, pQE60, and pQ
E-9 (QIAGEN, Inc., supra); pBS vector, Phasescr
ipt vector, Bluescript vector, pNH8A, pNH16a,
pNH18A, pNH46A (Stratagene); and ptrc99
a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pha
rmacia). Preferred expression vectors for use in yeast systems include pYES2, pYD1, pTEF1 / Zeo, pYES2 / GS, pPICZ
, PGAPZ, pGAPZα, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2,
pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K, and PAO815 (In
(all available from Vitrogen, Carlsbad, Calif.). Among preferred eukaryotic vectors are pWLN
EO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG (Stratage
ne); and pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVL (Phar
macia). Other suitable vectors will be readily apparent to one of skill in the art.

【００８９】 適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖に続いて、選
択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度変化または化学誘導）によ
り誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は代表的に、遠心分離
により収集され、物理的手段または化学的手段により破壊され、そして得られた
粗抽出物は、さらなる精製のために保持される。Following transformation of the appropriate host strain and propagation of the host strain to an appropriate cell density, the selected promoter is induced by appropriate means (eg, temperature changes or chemical induction) and the cell Incubate for an additional period. Cells are typically collected by centrifugation, disrupted by physical or chemical means, and the resulting crude extract is retained for further purification.

【００９０】 タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結融解サイクリング、
超音波処理、機械的破壊、または細胞溶剤の使用を含む任意の従来の方法（この
ような方法は、当業者に周知である）により破壊され得る。The microbial cells used in protein expression can be freeze-thaw cycling,
It can be disrupted by any conventional method, including sonication, mechanical disruption, or the use of cell solvents, such methods being well known to those skilled in the art.

【００９１】 １つの実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを使用して、
真核生物系においてＢｒａｉｎｉａｃ−５タンパク質が、発現される。Ｐｉｃｈ
ｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、メチオトローフ酵母であり、その唯一の炭素源とし
てメタノールを代謝し得る。メタノール代謝経路における主な工程は、Ｏ₂を使
用するホルムアルデヒドへのメタノールの酸化である。この反応は、酵素アルコ
ールオキシダーゼにより触媒される。それの唯一の炭素源としてメタノールを代
謝するために、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｏ₂に対するアルコールオ
キシダーゼの比較的低い親和性に一部起因して、アルコールオキシダーゼを高レ
ベルで産生しなければならない。従って、主な炭素源としてメタノールに依存す
る増殖培地において、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のうち
の１つのプロモーター領域は非常に活性型である。メタノールの存在下で、ＡＯ
Ｘ１遺伝子から産生されるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔ
ｏｒｉｓにおいて全可溶性タンパク質の約３０％までを構成する。Ｅｌｌｉｓ，
Ｓ．Ｂら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１−２１（１９８５）；Ｋ
ｏｕｔｚ，Ｐ．Ｊら、Ｙｅａｓｔ ５：１６７−７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏ
ｐｐ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３８５９−７６（１
９８７）を参照のこと。従って、例えば、全てまたは一部のＡＯＸ１調節配列の
転写調節下で、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドのような異種コ
ード配列は、メタノール存在下で生育されたＰｉｃｈｉａ酵母中に例外的に高レ
ベルで発現される。In one embodiment, using the yeast Pichia pastoris,
Brainiac-5 protein is expressed in eukaryotic systems. Pich
ia pastoris is a methiotrophic yeast and can metabolize methanol as its sole carbon source. The main steps in the methanol metabolic pathway is the oxidation of methanol to formaldehyde using O _2. This reaction is catalyzed by the enzyme alcohol oxidase. In order to metabolize methanol as the sole carbon source it, Pichia pastoris, due in part to the relatively low affinity of alcohol oxidase for O _2, shall produce alcohol oxidase at a high level. Thus, in growth media that rely on methanol as the primary carbon source, the promoter region of one of the two alcohol oxidase genes (AOX1) is highly active. AO in the presence of methanol
The alcohol oxidase produced from the X1 gene is Pichia past
It constitutes up to about 30% of the total soluble protein in oris. Ellis,
S. B et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1111-21 (1985); K
outtz, P .; J et al., Yeast 5: 167-77 (1989); Tscho.
pp, J. et al. F. Et al., Nucl. Acids Res. 15: 3859-76 (1
987). Thus, for example, under the transcriptional control of all or some of the AOX1 regulatory sequences, heterologous coding sequences, such as Brainiac-5 polynucleotides of the present invention, have exceptionally high levels in Pichia yeast grown in the presence of methanol. Is expressed in

【００９２】 １つの実施例において、本明細書中に記載されたように、プラスミドベクター
ｐＰＩＣ９Ｋを使用して、Ｐｉｃｈｉａ酵母系（「Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｄ．
Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８に基本的に記載されたように）において本発
明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する。この発
現ベクターは、マルチクローニング部位の上流に位置するＰｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち
、リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモーターの効果により本発明のＢ
ｒａｉｎｉａｃ−５タンパク質の発現および分泌を可能にする。In one example, the Pichia yeast system (“Pichia Protocol”) was performed using the plasmid vector pPIC9K as described herein.
ols: Methods in Molecular Biology ", D.C.
R. Higgins and J.M. Cregg, The Humana Pres
s, Totowa, NJ, 1998) expresses a DNA encoding a Brainiac-5 polypeptide of the invention. This expression vector contains Pichia pas located upstream of the multiple cloning site.
Tori's alkaline phosphatase (PHO) secretion signal peptide (ie, the leader) linked to the strong AOX1 promoter effect of the present invention B
enables expression and secretion of the rainiac-5 protein.

【００９３】 多くの他の酵母ベクターが、当業者が容易に理解するように、提案された発現
構築物が転写、翻訳、分泌（所望の場合）などについての適切に配置されたシグ
ナル（必要な場合インフレームＡＵＧを含む）を提供する限りは、ｐＰＩＣ９Ｋ
の代わりに使用され得、そのようなベクターは、例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１
、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰ
Ｚα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩ
Ｃ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５である。[0093] Many other yeast vectors are available, as will be readily appreciated by those skilled in the art, in which the proposed expression construct is appropriately arranged for transcription, translation, secretion (if desired), and the like (where necessary). (Including in-frame AUG) as long as pPIC9K
And such vectors may be used, for example, pYES2, pYD1
, PTEF1 / Zeo, pYES2 / GS, pPICZ, pGAPZ, pGAP
Zα, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPI
C3.5K, and PAO815.

【００９４】 別の実施形態において、例えば、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオ
チドのような異種コード配列の高レベル発現は、発現ベクター（例えば、ｐＧＡ
ＰＺまたはｐＧＡＰＺαのような）に本発明の異種ポリヌクレオチドをクローニ
ングすることならびにメタノール非存在下での酵母培養物を増殖することにより
達成され得る。In another embodiment, high-level expression of a heterologous coding sequence, such as, for example, a Brainiac-5 polynucleotide of the invention, is expressed in an expression vector (eg, pGA).
This can be achieved by cloning the heterologous polynucleotide of the present invention into PZ or pGAPZα) and growing the yeast culture in the absence of methanol.

【００９５】 高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベク
ターにエンハンサー配列を挿入することにより増加する。エンハンサーは、ＤＮ
Ａのシス作用エレメントであり、プロモーターに対して作用し、その転写を増加
する通常、約１０〜３００ｂｐである。例としては、複製起点の１００〜２７０
塩基対後側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエ
ンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス
エンハンサーが挙げられる。[0095] Transcription of a DNA encoding a polypeptide of the present invention by higher eukaryotes is increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancer is DN
A cis-acting element of A that acts on the promoter and increases its transcription, usually about 10-300 bp. For example, 100 to 270 of the replication origin
The SV40 enhancer behind the base pair, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer behind the origin of replication, and adenovirus enhancers.

【００９６】 種々の動物細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために使用され得
る。動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９
８１））により記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株および適合性ベク
ターを発現できる他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａお
よびＢＨＫ細胞株）が挙げられる。動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロ
モーターおよびエンハンサー、そしてまた必要な任意のリボソーム結合部位、ポ
リアデニル化部位、スプライシングドナー部位およびスプライシングアクセプタ
ー部位、転写終結配列ならびに５’に隣接する非転写配列を含む。ＳＶ４０スプ
ライシング部位、およびポリアデニル化部位から誘導されたＤＮＡ配列を使用し
て、必要な非転写遺伝子エレメントを供給し得る。[0096] Various animal cell culture systems can also be used to express the recombinant protein. Examples of animal expression systems include Gluzman (Cell 23: 175 (19
81)) and other cell lines capable of expressing the compatible vector of monkey kidney fibroblasts, such as C127, 3T3, CHO, HeLa and BHK cell lines. The animal expression vector contains an origin of replication, a suitable promoter and enhancer, and also any necessary ribosome binding, polyadenylation, splicing donor and splicing acceptor sites, transcription termination sequences and non-transcribed sequences adjacent to the 5 '. Including. DNA sequences derived from the SV40 splicing site and the polyadenylation site can be used to supply the necessary non-transcribed genetic elements.

【００９７】 本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次宿主細胞、二次
宿主細胞、および不死化宿主細胞を含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物
質（例えば、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５コード配列）を欠失または置換するように操
作されており、そして／または本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチド
と作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含む
ように操作されており、そして内因性Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドを
活性化、改変、および／または増幅する。例えば、当該分野で公知の技術が、相
同組換えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハ
ンサー）および内因性Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチド配列を作動可能に
連結するために使用され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国
特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第Ｗ
Ｏ ９６／２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ ９
４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと。これら各々の
開示は、それら全体が参考として援用される）。In addition to including host cells containing the vector constructs discussed herein, the present invention also encompasses primary, secondary, and immortal host cells of vertebrate origin, particularly mammalian origin. Host cells. These host cells have been engineered to delete or replace endogenous genetic material (eg, Brainiac-5 coding sequence) and / or are operably linked to a Brainiac-5 polynucleotide of the invention. And has been engineered to contain the genetic material (e.g., a heterologous polynucleotide sequence) and activates, modifies, and / or amplifies endogenous Brainiac-5 polynucleotide. For example, techniques known in the art can be used to operably link a heterologous control region (eg, a promoter and / or enhancer) and an endogenous Brainiac-5 polynucleotide sequence via homologous recombination ( For example, U.S. Patent No. 5,641,670 issued June 24, 1997; International Publication No. W published September 26, 1996.
WO 96/29411; International Publication No. WO 9 published August 4, 1994.
4/12650; Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 86: 8932-8935 (1989); and Zijlstra et al., N.
atature 342: 435-438 (1989). The disclosures of each of these are incorporated by reference in their entirety).

【００９８】 下記された宿主細胞は、従来の様式において使用されて、組換え配列によりコ
ードされる遺伝子産物を産生し得る。あるいは、無細胞翻訳系もまた、使用して
、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用する本発明のポリペプチドを産生し
得る。[0098] The host cells described below may be used in a conventional manner to produce the gene product encoded by the recombinant sequence. Alternatively, a cell-free translation system can also be used to produce a polypeptide of the invention using RNA from a DNA construct of the invention.

【００９９】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
達成され得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載されて
いる（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。The introduction of the construct into the host cell can be performed by calcium phosphate transfection, DE
It can be achieved by AE-dextran mediated transfection, cationic lipid mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals (eg, Davis et al., Basic Methods In Molec).
ullar Biology (1986)).

【０１００】 このポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、
そして分泌シグナルだけでなく、付加的な異種の機能的領域も含み得る。例えば
、付加的なアミノ酸（特に荷電性アミノ酸）の領域が、精製の間、または続く操
作および保存の間の、宿主細胞における安定性および持続性を改善するために、
このポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易
にするためにこのポリペプチドへ付加され得る。このような領域は、このポリペ
プチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため
、安定性を改善するため、および精製を容易にするためにペプチド部分をポリペ
プチドへ付加することは、当該分野でよく知られており、そして慣用的な技術で
ある。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチドの安定化および精製に有用な免
疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（
カナダ国対応出願２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部とと
もに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む、融合タンパク質を開示
する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使
用に十分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（
ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク
質が、記載される有利な様式で、発現、検出、および精製された後にＦｃ部分が
欠失され得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使
用の障害であると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原と
して使用されるべき場合）である。薬物探索において、例えばｈＩＬ−５のよう
なヒトタンパク質が、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能力
スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている（Ｂｅｎｎｅ
ｔｔ，Ｄ．ら、 Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２
−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
０：９４５９−９４７１（１９９５））。The polypeptide may be expressed in a modified form, such as a fusion protein,
And it may contain not only secretion signals but also additional heterologous functional regions. For example, regions of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be used to improve stability and persistence in host cells during purification or during subsequent manipulation and storage.
It can be added to the N-terminus of the polypeptide. Also, a peptide moiety can be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. In particular, the addition of peptide moieties to polypeptides to produce secretion or excretion, improve stability, and to facilitate purification is well known in the art and is well known in the art. is there. Preferred fusion proteins contain heterologous regions from immunoglobulins useful for polypeptide stabilization and purification. For example, EP-A-O 464 533 (
Canadian application 2045869) discloses a fusion protein comprising various portions of the constant region of an immunoglobulin molecule together with another human protein or portion thereof. In many cases, the Fc portion in a fusion protein is sufficiently advantageous for use in therapy and diagnosis, thus resulting in, for example, improved pharmacokinetic properties (
EP-A 0232 262). On the other hand, for some uses, it is desirable that the Fc portion can be deleted after expression, detection, and purification of the fusion protein in the advantageous manner described. This is when the Fc portion proves to be an obstacle for use in therapy and diagnosis (eg, when the fusion protein is to be used as an antigen for immunization). In drug discovery, for example, human proteins such as hIL-5 have been fused with Fc portions for the purpose of high-throughput screening assays to identify antagonists of hIL-5 (Benne
tt, D. J. et al. Molecular Recognition 8:52
-58 (1995); Johanson, K et al. Biol. Chem. 27
0: 9449-9471 (1995)).

【０１０１】 １つの実施形態において、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドは、グラム陰性細菌においてこのようなポリペプチドの
発現および精製の有効性を増加するためにｐｅｌＢペクチン酸リアーゼシグナル
配列に融合され得る。米国特許第５，５７６，１９５号および同第５，８４６，
８１８号を参照のこと、これらの内容は、本明細書中でその全体が参考として援
用される。In one embodiment, a polynucleotide encoding a Brainiac-5 polypeptide of the invention comprises a pelB pectate lyase signal to increase the efficiency of expression and purification of such polypeptides in Gram-negative bacteria. Can be fused to a sequence. U.S. Patent Nos. 5,576,195 and 5,846,
See No. 818, the contents of which are hereby incorporated by reference in their entirety.

【０１０２】 本発明の好ましい融合タンパク質は、タンパク質の安定化および精製に有用な
免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３
（カナダ国対応出願２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部と
ともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む、融合タンパク質を開
示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における
使用に十分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる
（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパ
ク質が、記載される有利な様式で、発現、検出、および精製された後に、Ｆｃ部
分が欠失され得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断におけ
る使用の障害であると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗
原として使用されるべき場合）である。薬物探索において、例えばｈＩＬ−５の
ようなヒトタンパク質が、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理
能力スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている。Ｄ．Ｂ
ｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２
−５８（１９９５）およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。[0102] Preferred fusion proteins of the invention comprise a heterologous region from immunoglobulin useful for protein stabilization and purification. For example, EP-A-O 464 533
(Canadian counterpart 2045869) discloses a fusion protein comprising various portions of the constant region of an immunoglobulin molecule together with another human protein or portion thereof. In many cases, the Fc part in the fusion protein is sufficiently advantageous for use in therapy and diagnosis, thus resulting, for example, in improved pharmacokinetic properties (EP-A 0232 262). On the other hand, for some uses, it is desirable that the Fc portion can be deleted after the fusion protein has been expressed, detected, and purified in the advantageous manner described. This is when the Fc portion proves to be an obstacle for use in therapy and diagnosis (eg, when the fusion protein is to be used as an antigen for immunization). In drug discovery, for example, human proteins such as hIL-5 have been fused with Fc portions for the purpose of high throughput screening assays to identify antagonists of hIL-5. D. B
ennett et al. Molecular Recognition 8:52
-58 (1995) and K.C. Johanson et al. Biol. Chem.
270: 9449-9471 (1995).

【０１０３】 本発明のポリペプチドは、自然に精製された産物、化学的合成手順の産物、な
らびに、例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動
物細胞を含む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術によって産生さ
れた産物を含む。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明の
ポリペプチドは、グリコシル化されてもまたはグリコシル化されていなくてもよ
い。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果として、い
くつかの場合において、最初の修飾されたメチオニン残基を含み得る。The polypeptides of the present invention include naturally purified products, products of chemical synthetic procedures, and prokaryotes, including, for example, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and mammalian cells. Includes products produced by recombinant techniques from a host or eukaryotic host. Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptide of the invention may be glycosylated or non-glycosylated. In addition, the polypeptides of the present invention may also contain an initial modified methionine residue in some cases as a result of a host-mediated process.

【０１０４】 本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成され得る（
例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａ
ｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、本発
明の完全Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのフラグメントに対応するペプチド
は、ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的
アミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのＢｒａｉ
ｎｉａｃ−５ポリペプチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以
下が一般に挙げられるがこれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２
，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミ
ノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ，２−アミノ
イソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、
ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸
、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシ
ルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、
β−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸）、および
一般のアミノ酸アナログ。さらにアミノ酸はＤ（右旋性）であってもまたはＬ（
左旋性）であってよい。The polypeptides of the present invention can be chemically synthesized using techniques known in the art (
For example, Creighton, 1983, Proteins: Structure
es and Molecular Principles, W.C. H. Free
man & Co. , N .; Y. And Hunkapiller, M .; Et al., Na
cure, 310: 105-111 (1984)). For example, a peptide corresponding to a fragment of the complete Brainiac-5 polypeptide of the present invention can be synthesized by use of a peptide synthesizer. In addition, if desired, non-classical amino acids or chemical amino acid analogs may be substituted or added as the Brai.
niac-5 polypeptide sequence. Non-classical amino acids generally include, but are not limited to: the D isomer of a normal amino acid, 2
, 4-diaminobutyric acid, α-aminoisobutyric acid, 4-aminobutyric acid, Abu, 2-aminobutyric acid, g-Abu, e-Ahx, 6-aminohexanoic acid, Aib, 2-aminoisobutyric acid, 3-aminopropionic acid, Ornithine, norleucine, norvaline,
Hydroxyproline, sarcosine, citrulline, homocitrulline, cysteic acid, t-butylglycine, t-butylalanine, phenylglycine, cyclohexylalanine, β-alanine, fluoroamino acid, designer amino acid (for example,
β-methyl amino acids, Ca-methyl amino acids, Na-methyl amino acids), and common amino acid analogs. Further, the amino acids may be D (dextrorotary) or L (
Levorotation).

【０１０５】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解
切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改変さ
れるＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを含む。多数の化学的改変のうちのいず
れをも、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：
臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｎａ
ＢＨ₄による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカ
マイシンの存在下での代謝合成；など。The present invention relates to methods for, for example, glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization with known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, antibody molecules or other cellular forms during or after translation. Brainiac-5 polypeptides that are differentially modified, such as by binding to a ligand. Any of a number of chemical modifications can be performed by known techniques, including but not limited to:
Cyanogen bromide, trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, Na
Specific chemical cleavage by BH _4; acetylation, formylation, oxidation, reduction; metabolic synthesis in the presence of tunicamycin; like.

【０１０６】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシン
グ）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖の化
学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付
加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、酵素標識
、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク質
の検出および単離を可能にし得る。さらに、本発明のポリペプチドは、ヨウ素化
により改変され得る。Additional post-translational modifications included by the present invention include, for example: N-linked or O-linked sugar chains (N- or C-terminal processing), chemical moieties to the amino acid backbone. Chemical modification of linked, N-linked or O-linked sugar chains, and addition or deletion of N-terminal methionine residues as a result of prokaryotic host cell expression. The polypeptide may also be modified with a detectable label (eg, an enzymatic, fluorescent, isotopic or affinity label) to allow for detection and isolation of the protein. Further, the polypeptides of the invention can be modified by iodination.

【０１０７】 １つの実施形態において、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドはまた
、ビオチンを使用して標識化し得る。他の関連した実施形態において、本発明の
ビオチン標識化Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、例えば、イメージング試
薬として、または１つ以上のＢｒａｉｎｉａｃ−５レセプターもしくは他のコレ
セプター分子またはコリガンド分子を同定する手段として、使用され得る。[0107] In one embodiment, Brainiac-5 polypeptides of the invention may also be labeled using biotin. In other related embodiments, a biotin-labeled Brainiac-5 polypeptide of the invention is used, for example, as an imaging reagent or as a means of identifying one or more Brainiac-5 receptors or other co-receptor or co-ligand molecules. , Can be used.

【０１０８】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、Ｂｒｉｎｉ
ａｃ−５の化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参
照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチ
レングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カル
ボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択
され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこの
分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を
含み得る。The present invention may also provide additional advantages, such as increased solubility, stability and circulation time of the polypeptide, or reduced immunogenicity, of a Brini.
A chemically modified derivative of ac-5 is provided (see U.S. Patent No. 4,179,337). The chemical moiety for derivatization can be selected from water-soluble polymers such as polyethylene glycol, ethylene glycol / propylene glycol copolymer, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, and the like. The polypeptide can be modified at random positions within the molecule or at predetermined positions within the molecule, and can include one, two, three or more attached chemical moieties.

【０１０９】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつか
の分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示
す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間
、存在する場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程
度または抗原性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリ
エチレングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る
。The polymer can be of any molecular weight and can be branched or unbranched. For polyethylene glycol, the preferred molecular weight is between about 1 kDa and about 100 kDa for ease of handling and manufacture (the term "about" means that some molecules have been referred to in the preparation of polyethylene glycol). Heavier than the molecular weight, and some are lighter than the indicated molecular weight). The desired therapeutic profile (eg, the desired duration of sustained release, the effect on biological activity, if any), the ease of handling, the degree of or lack of antigenicity, and the Other sizes may be used, depending on other known effects of polyethylene glycol).

【０１１０】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に
結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば
、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦ
にＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２
８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリ
エチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル
基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエ
チレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸
残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカ
ルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン
酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、
ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治
療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン
基での結合である。A polyethylene glycol molecule (or other chemical moiety) should be attached to the protein in view of its effect on the functional or antigenic domain of the protein. There are a number of conjugation methods available to those of skill in the art (eg, EP 0 401 384 (G-CSF, which is incorporated herein by reference).
To PEG), Malik et al., Exp. Hematol. 20: 102
8-1035 (1992) (tresyl chloride)
(See also report PEGylation of GM-CSF). For example, polyethylene glycol can be covalently linked by an amino acid residue via a reactive group (eg, a free amino or carboxyl group). Reactive groups are groups to which activated polyethylene glycol molecules can bind. Amino acid residues having a free amino group may include lysine residues and N-terminal amino acid residues; amino acid residues having a free carboxyl group include aspartic acid residues, glutamic acid residues and C-terminal amino acid residues Residues may be mentioned. Sulfhydryl residues are also
It can be used as a reactive group for attaching polyethylene glycol molecules. Preferred for therapeutic purposes is attachment at an amino group, such as attachment at the N-terminus or lysine group.

【０１１１】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（分子量、分
枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子のタンパク質
（またはポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の型、および
選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端ペグ化調製
物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から分離
すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物質の精製に
より行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、特定のタン
パク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リジン対Ｎ末
端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切な
反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタンパク質の
実質的に選択的な誘導体化が達成される。[0111] Proteins chemically modified at the N-terminus may be particularly desirable. Using polyethylene glycol as an example, from various polyethylene glycol molecules (by molecular weight, branching, etc.), the ratio of polyethylene glycol molecules to protein (or polypeptide) molecules in the reaction mixture, the type of PEGylation reaction to be performed , And the method of obtaining the selected N-terminally pegylated protein. The method of obtaining an N-terminal PEGylated preparation (ie, if necessary, separating this portion from other mono-PEGylated portions) is accomplished by purification of the N-terminal PEGylated material from a population of PEGylated protein molecules. obtain. Selective proteins chemically modified with N-terminal modifications can be obtained by reductive alkylation utilizing the differential reactivity of different types of primary amino groups (lysine vs. N-terminal) available for derivatization in a particular protein. Can be achieved. Under the appropriate reaction conditions, substantially selective derivatization of the protein at the N-terminus with a carbonyl group containing polymer is achieved.

【０１１２】 本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿また
はエタノール沈澱、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交
換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイ
トクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法に
よって、回収および精製され得る。最も好ましくは、精製のために、高性能液体
クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が使用される。本発明のポリペプチドは以
下を含む：直接単離されるかまたは培養されるかにかかわらず、天然の供給源（
体液、組織および細胞を含む）から精製された、産物；化学的合成手順の産物；
ならびに、原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高
等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産
生された産物。組換え産生手順に使用される宿主に依存して、本発明のポリペプ
チドは、グリコシル化されてもまたはグリコシル化されていなくてもよい。さら
に、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果として、いくつかの
場合において、最初の修飾されたメチオニン残基を含み得る。従って、一般に、
翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンが、すべての真核生物細
胞における翻訳後の任意のタンパク質から高い効率で除去されることは当該分野
において周知である。ほとんどのタンパク質上のＮ末端メチオニンはまた、ほと
んどの原核生物において効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質について
、この原核生物除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸
の性質に依存しており、非効率的である。The Brainiac-5 polypeptide of the present invention may be prepared by ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acid extraction, anion exchange chromatography or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite. It can be recovered and purified by well-known methods, including chromatography, and lectin chromatography. Most preferably, high performance liquid chromatography ("HPLC") is used for purification. The polypeptides of the present invention include: natural sources, whether directly isolated or cultured.
Products (including body fluids, tissues and cells); products of chemical synthesis procedures;
And products produced by recombinant techniques from prokaryotic or eukaryotic hosts, including, for example, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and mammalian cells. Depending on the host used for recombinant production procedures, the polypeptides of the invention may be glycosylated or non-glycosylated. In addition, the polypeptides of the present invention may also contain an initial modified methionine residue in some cases as a result of a host-mediated process. Thus, in general,
It is well known in the art that the N-terminal methionine encoded by the translation initiation codon is removed with high efficiency from any protein after translation in all eukaryotic cells. Although the N-terminal methionine on most proteins is also efficiently removed in most prokaryotes, for some proteins this prokaryotic removal process depends on the nature of the amino acid to which the N-terminal methionine is covalently attached. Dependent and inefficient.

【０１１３】 （ポリペプチド） 本発明はさらに、寄託ｃＤＮＡによりコードされたアミノ酸配列、または配列
番号２のアミノ酸配列、あるいは上記ポリペプチドの部分を含むペプチドまたは
ポリペプチドを有する（すなわち、これらを含む、またはあるいは、これらから
なる）単離されたＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを提供する。(Polypeptides) The present invention further comprises a peptide or polypeptide comprising the amino acid sequence encoded by the deposited cDNA, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a portion of the above polypeptide (ie, comprising Or alternatively consisting of) an isolated Brainiac-5 polypeptide.

【０１１４】 本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（
すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であ
り得る。従って、本発明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のＢｒａｉｎｉ
ａｃ−５ポリペプチド、それらの調製物およびそれらを含む組成物（好ましくは
薬学的組成物）に関する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノ
マー、ダイマー、トリマーまたはテトラマーである。さらなる実施形態では、本
発明のマルチマーは、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なく
ともテトラマーである。The Brainiac-5 polypeptides of the present invention may comprise monomers or multimers (
That is, dimers, trimers, tetramers and higher multimers). Accordingly, the present invention relates to the monomeric and multimeric Braini of the present invention.
The present invention relates to ac-5 polypeptides, their preparation and compositions comprising them (preferably pharmaceutical compositions). In certain embodiments, a polypeptide of the invention is a monomer, dimer, trimer or tetramer. In a further embodiment, a multimer of the invention is at least a dimer, at least a trimer, or at least a tetramer.

【０１１５】 本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−
５ポリペプチド（本明細書中に記載されるＢｒａｉｎｉａｃ−５のフラグメント
、改変体および融合タンパク質を含む）のみを含むマルチマーをいう。これらの
ホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリ
ペプチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のアミノ
酸配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのみを含むマルチマーである
。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有する
Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを含むマルチマーである。特定の実施形態で
は、本発明のマルチマーは、ホモダイマー（例えば、同一または異なるアミノ酸
配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを含む）またはホモトリマー（
例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプ
チドを含む）である。好ましい実施形態では、本発明のマルチマーはホモトリマ
ーである。さらなる実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくと
もホモダイマー、少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーであ
る。The multimers encompassed by the present invention can be homomers or heteromers. As used herein, the term homomer refers to the Brainiac- of the present invention.
A multimer comprising only 5 polypeptides (including fragments, variants and fusion proteins of Brainiac-5 described herein). These homomers can include Brainiac-5 polypeptides having the same or different amino acid sequences. In certain embodiments, a homomer of the invention is a multimer that includes only Brainiac-5 polypeptides having the same amino acid sequence. In another specific embodiment, a homomer of the invention is a multimer comprising Brainiac-5 polypeptides having different amino acid sequences. In certain embodiments, the multimers of the invention are homodimers (e.g., including Brainiac-5 polypeptides having the same or different amino acid sequences) or homotrimers (
For example, Brainiac-5 polypeptides having the same or different amino acid sequences). In a preferred embodiment, the multimers of the invention are homotrimers. In a further embodiment, the homomeric multimer of the invention is at least a homodimer, at least a homotrimer or at least a homotetramer.

【０１１６】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のＢｒａｉｎｉａ
ｃ−５ポリペプチドに加えて、異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質
のポリペプチド）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明のマル
チマーは、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さ
らなる実施形態では、本発明のヘテロマー性マルチマーは、少なくともヘテロダ
イマー、少なくともヘテロトリマーまたは少なくともヘテロテトラマーである。As used herein, the term heteromer refers to the Brainia of the present invention.
A multimer comprising a heterologous polypeptide (ie, a polypeptide of a different protein) in addition to a c-5 polypeptide. In certain embodiments, a multimer of the invention is a heterodimer, heterotrimer or heterotetramer. In a further embodiment, the heteromeric multimer of the invention is at least a heterodimer, at least a heterotrimer or at least a heterotetramer.

【０１１７】 本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合
性の結合の結果であり得、ならびに／または例えば、リポソーム形成によって間
接的に連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例え
ば、ホモダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のポリペプチドが溶液中
で互いに接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチ
マー（例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のポリ
ペプチドが、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパ
ク質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触する場合に、形
成される。他の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のＢｒａｉｎｉａ
ｃ−５ポリペプチドとの、および／または本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペ
プチド間での共有結合によって形成される。このような共有結合は、ポリペプチ
ド配列（例えば、配列番号２に記載されるか、または本出願に関連して寄託され
たクローンによってコードされるポリペプチドに含まれる、ポリペプチド配列）
中に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、この共有結合は、ネ
イティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチドにおいて相互作用するポリ
ペプチド配列内に存在するシステイン残基間での架橋である。別の例では、この
共有結合は、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、このような
共有結合は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に
おいて含まれる、１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有結合は、本
発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４
７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（本明細書中
に記載されるような）本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５−Ｆｃ融合タンパク質に含
まれる異種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結
合は、共有結合したマルチマーを形成し得る別のタンパク質（例えば、オステオ
プロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）（例えば、国際公開第ＷＯ ９８／４９３０５号（この内容はその全体が本明細書中で参考として援用され
る）を参照のこと）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある。別の実施形態
では、２以上の本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、合成リンカー（
例えば、ペプチドリンカー、炭化水素リンカーまたは可溶性ポリマーリンカー）
を介して連結される。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書
中に参考として援用される）に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプ
チドリンカーによって隔てられた複数のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを含
むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。The multimers of the present invention may be the result of hydrophobic, hydrophilic, ionic and / or covalent attachments and / or may be indirectly linked, for example, by liposome formation. Thus, in one embodiment, a multimer of the invention, such as a homodimer or homotrimer, is formed when the polypeptides of the invention contact each other in solution. In another embodiment, a heteromultimer of the invention (eg, a heterotrimer or heterotetramer) is an antibody against a polypeptide of the invention (such as a heterologous polymorph in a fusion protein of the invention) in solution. (Including antibodies to peptide sequences). In another embodiment, a multimer of the invention is a Brainia of the invention.
It is formed by a covalent bond with a c-5 polypeptide and / or between Brainiac-5 polypeptides of the invention. Such a covalent bond may be a polypeptide sequence (eg, a polypeptide sequence as set forth in SEQ ID NO: 2 or included in a polypeptide encoded by the clone deposited in connection with the present application).
It may include one or more amino acid residues contained therein. In one example, the covalent bond is a bridge between cysteine residues present in the interacting polypeptide sequence in the native (ie, naturally occurring) polypeptide. In another example, the covalent bond is the result of a chemical or recombinant operation. Alternatively, such a covalent bond may comprise one or more amino acid residues contained in a heterologous polypeptide sequence in a Brainiac-5 fusion protein. In one example, a covalent bond is between heterologous sequences contained in a fusion protein of the invention (eg, US Pat.
78, 925). In certain instances, the covalent bond is between heterologous sequences contained in a Brainiac-5-Fc fusion protein of the invention (as described herein). In another specific example, the covalent linkage of the fusion protein of the invention is such that another protein, such as osteoprotegerin, which can form a covalently linked multimer (e.g., WO 98/49305, The contents are between the heterologous polypeptide sequences derived from the same), which are incorporated herein by reference in their entirety. In another embodiment, two or more Brainiac-5 polypeptides of the invention comprise a synthetic linker (
For example, a peptide linker, a hydrocarbon linker or a soluble polymer linker)
Are connected via. Examples include the peptide linkers described in US Pat. No. 5,073,627, which is incorporated herein by reference. Proteins comprising multiple Brainiac-5 polypeptides separated by a peptide linker can be produced using conventional recombinant DNA techniques.

【０１１８】 本発明のマルチマーＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを調製するための別の
方法は、ロイシンジッパーポリペプチド配列に融合されたＢｒａｉｎｉａｃ−５
ポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、そのドメインが見出
されるタンパク質のマルチマー形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジ
ッパーは元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓ
ｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそ
れ以来、種々の異なるタンパク質において見出されている。公知のロイシンジッ
パーの中でも、ダイマー形成またはトリマー形成をする、天然に存在するペプチ
ドおよびその誘導体がある。可溶性マルチマーＢｒａｉｎｉａｃ−５タンパク質
を生成するための、適切なロイシンジッパードメインの例は、本明細書中に参考
として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０３０８に記載されるロイシンジッ
パードメインである。溶液中でダイマー形成またはトリマー形成をするペプチド
に融合された、可溶性Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを含む組換え融合タン
パク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可溶性マルチマーＢｒ
ａｉｎｉａｃ−５は、当該分野で公知の技術を用いて、培養上清から回収される
。Another method for preparing multimeric Brainiac-5 polypeptides of the present invention is Brainiac-5 fused to a leucine zipper polypeptide sequence.
Including the use of polypeptides. A leucine zipper domain is a polypeptide that promotes multimer formation of the protein in which the domain is found. Leucine zippers were originally identified in several DNA binding proteins (Lands
chulz et al., Science 240: 1759, (1988)), and since then have been found in a variety of different proteins. Among the known leucine zippers are naturally occurring peptides and derivatives thereof that form dimers or trimers. An example of a suitable leucine zipper domain for producing a soluble multimeric Brainiac-5 protein is the leucine zipper domain described in PCT application WO 94/10308, which is incorporated herein by reference. A recombinant fusion protein comprising a soluble Brainiac-5 polypeptide, fused to a peptide that dimerizes or trimers in solution, is expressed in a suitable host cell and the resulting soluble multimeric Br
ainiac-5 is recovered from the culture supernatant using techniques known in the art.

【０１１９】 トリマーＢｒａｉｎｉａｃ−５は、増強された生物学的活性という利点を提供
し得る。好ましいロイシンジッパー部分は、トリマーを優先的に形成する部分で
ある。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１，（１９９４））および米国特許出願第０８／４
４６，９２２号に記載されるような、肺サーファクタントプロテインＤ（ＳＰＤ
）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在するトリマータンパク質由来
の他のペプチドは、トリマーＢｒａｉｎｉａｃ−５の調製において用いられ得る
。[0119] The trimmer Brainiac-5 may offer the advantage of enhanced biological activity. Preferred leucine zipper moieties are those that preferentially form trimers. One example is described in Hoppe et al. (FEBS L), which is incorporated herein by reference.
etters 344: 191, (1994)) and US patent application Ser. No. 08/4.
No. 46,922, pulmonary surfactant protein D (SPD
) Is a leucine zipper. Other peptides derived from the naturally occurring trimeric protein can be used in the preparation of the trimeric Brainiac-5.

【０１２０】 別の例では、本発明のタンパク質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）−Ｂｒａ
ｉｎｉａｃ−５融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配
列間の相互作用によって結合される。さらなる実施形態では、本発明のタンパク
質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）−Ｂｒａｉｎｉａｃ−５融合タンパク質に
含まれる異種ポリペプチド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用
によって結合する。In another example, a protein of the invention is a Flag®-Bra of the invention.
It is bound by an interaction between the Flag® polypeptide sequences contained in the niac-5 fusion protein. In a further embodiment, a protein of the invention binds by an interaction between a heterologous polypeptide sequence contained in a Flag®-Brainiac-5 fusion protein of the invention and an anti-Flag® antibody.

【０１２１】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例
えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分
野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて、化学的に架
橋され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許
第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、当該
分野で公知の技術を用いて生成されて、マルチマーに含まれることが所望される
、ポリペプチドの配列内に存在するシステイン残基間の、１以上の分子間架橋を
形成し得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許
第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポ
リペプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加によって
慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１以上のこれらの改変さ
れたポリペプチドを含むマルチマーを生成するために、適用され得る（例えば、
本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５
号を参照のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明のマルチマーに含
まれることが所望される、ポリペプチド成分を含むリポソームを生成するために
、適用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国
特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。The multimers of the present invention can be produced using chemical techniques known in the art. For example, a polypeptide that is desired to be included in a multimer of the present invention can be chemically cross-linked using linker molecules and linker molecule length optimization techniques known in the art (eg, as described herein). See U.S. Patent No. 5,478,925, which is incorporated by reference in its entirety). In addition, the multimers of the present invention can be produced using techniques known in the art to produce one or more intermolecular cysteine residues between the cysteine residues present in the sequence of the polypeptide that are desired to be included in the multimer. Crosslinks can be formed (see, for example, US Pat. No. 5,478,925, which is incorporated herein by reference in its entirety). Furthermore, the polypeptides of the present invention can be conventionally modified by the addition of cysteine or biotin to the C-terminus or N-terminus of the polypeptide, and techniques known in the art may be used to modify one or more of these modified poly- It can be applied to generate multimers containing peptides (eg,
US Patent No. 5,478,925, which is incorporated herein by reference in its entirety.
No.). In addition, techniques known in the art can be applied to produce liposomes containing polypeptide components, which are desired to be included in the multimers of the invention (see, for example, the entirety herein incorporated by reference). See U.S. Patent No. 5,478,925, which is incorporated by reference herein.

【０１２２】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチ
ドは、本明細書中に記載されるか、さもなくば当該分野で公知の融合タンパク質
技術を用いて組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援
用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態で
は、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする
配列に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペ
プチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に
連結することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として
援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態で
は、本明細書中に記載されるか、さもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用
して、膜貫通ドメインを含み、そして膜再構成技術によってリポソームに取り込
まれ得る、本発明の組換えポリペプチドを生成する（例えば、本明細書中にその
全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）
。Alternatively, the multimers of the present invention can be generated using genetic engineering techniques known in the art. In one embodiment, the polypeptides comprised in the multimers of the invention are recombinantly produced using fusion protein techniques described herein or otherwise known in the art (eg, the present invention). See U.S. Patent No. 5,478,925, which is incorporated by reference in its entirety). In certain embodiments, the polynucleotide encoding a homodimer of the invention comprises a polynucleotide sequence encoding a polypeptide of the invention ligated to a sequence encoding a linker polypeptide, and then further from the original C-terminal to the N-terminal. Produced by linking to a synthetic polynucleotide (lacking the leader sequence) which encodes the translation product of the polypeptide in the opposite direction to that of (e.g., U.S. Pat. See patent 5,478,925). In another embodiment, recombinant membrane techniques described herein or otherwise known in the art can be applied to include a transmembrane domain and be incorporated into liposomes by membrane reconstitution techniques. Produce a recombinant polypeptide of the invention (see, eg, US Pat. No. 5,478,925, incorporated herein by reference in its entirety).
.

【０１２３】 １つの実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ番号２０３５７２に含まれるｃ
ＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列、または図１Ａおよび１Ｂ（配
列番号２）におけるアミノ酸配列、あるいは上記ポリペプチドの部分（すなわち
、フラグメント）を含むペプチドまたはポリペプチドを有する（すなわち、これ
らを含む、またはこれらからなる）単離されたＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチ
ドを提供する。[0123] In one embodiment, the present invention relates to the c-atom included in ATCC number 203572.
Has the amino acid sequence encoded by the DNA clone, or the amino acid sequence in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 2), or a peptide or polypeptide comprising a portion (ie, a fragment) of the above polypeptide (ie, comprising or (Consisting of these) is provided.

【０１２４】 本発明のポリペプチドフラグメントは、配列番号２に含まれるアミノ酸配列、
ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡによりコ
ードされるアミノ酸配列、あるいは寄託クローンに含まれるヌクレオチド配列に
、または図１Ａ〜Ｂ（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の相補鎖にハイ
ブリダイズする（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
）核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなるポリ
ペプチドを含む。The polypeptide fragment of the present invention has the amino acid sequence contained in SEQ ID NO: 2,
Hybridizes to the amino acid sequence encoded by the cDNA contained in the plasmid having ATCC accession number 203572, or to the nucleotide sequence contained in the deposited clone, or to the complement of the nucleotide sequence shown in FIGS. 1A-B (SEQ ID NO: 1) It includes a polypeptide comprising or consisting of an amino acid sequence encoded by a nucleic acid (eg, under stringent hybridization conditions).

【０１２５】 ポリペプチドフラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」
であり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド内（このフラグメントが、部分
または領域を（最も好ましくは単一の連続した領域として）形成する）に含まれ
得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、以下
のおおよそのアミノ酸残基を含むか、あるいは以下からなるフラグメントを含む
：配列番号２に開示のアミノ酸配列の１〜１５、１６〜３０、３１〜４６、４７
〜５５、５６〜７２、７３〜１０４、１０５〜１０４、１０５〜１６３、１６３
〜１８８、１８６〜２１０および２１０〜２７８。さらに、ポリペプチドフラグ
メントは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０
、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５または２００アミ
ノ酸の長さであり得る。この文脈において、「約（およそ）」とは、いくつか、
数個５、４、３、２、または１を意味する。これらのポリペプチドフラグメント
をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。[0125] Polypeptide fragments are known as "free-standing".
Or may be contained within a larger polypeptide, where the fragments form a part or region (most preferably as a single continuous region). Representative examples of polypeptide fragments of the present invention include, for example, those comprising the following approximate amino acid residues or fragments comprising: 1-15, 16- of the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 2 30, 31, 46, 47
~ 55, 56-72, 73-104, 105-104, 105-163, 163
188, 186-210 and 210-278. Further, the polypeptide fragment may have at least 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90
, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175 or 200 amino acids in length. In this context, "about" means:
Several 5, 4, 3, 2, or 1 are meant. Polynucleotides encoding these polypeptide fragments are also included in the present invention.

【０１２６】 本発明のさらなるポリペプチドフラグメントは、配列番号２のアミノ酸７〜２
０、７〜３３、６１〜８３、１０５〜１１９、１３９〜１４８、１６０〜１７１
、１８７〜１９６を含むか、またはそれらからなる。これらポリヌクレオチドに
よりコードされるポリペプチドもまた、本発明に含まれる。A further polypeptide fragment of the invention comprises amino acids 7-2 of SEQ ID NO: 2.
0, 7-33, 61-83, 105-119, 139-148, 160-171
, 187-196 or consist thereof. The polypeptides encoded by these polynucleotides are also included in the present invention.

【０１２７】 さらなる実施形態は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の本発明
のポリペプチドの機能的な領域（例えば、図３および表１ならびに本明細書中に
記載されるような、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα領域、β領域、ターン領
域およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα領域、β領域およびコイル領
域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎ
ｂｅｒｇのα−両親媒性領域およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈ
ｕｌｚの可撓性領域、Ｅｍｉｎｉの表面形成領域およびＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌ
ｆの高い抗原性指標の領域）を含む、またはそれらからなるＢｒａｉｎｉａｃ−
５フラグメントを含む。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドフラグメ
ントは抗原性である。表１のカラムＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶに示
されるデータは、抗原性に対する高い程度の可能性を示すＢｒａｉｎｉａｃ−５
の領域を慣用的に決定するために使用され得る。高い抗原性の領域は、抗原認識
が免疫応答（例えば、配列番号２におけるおよそＶａｌ−１〜およそＶａｌ−１
１のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２におけるおよそＴｈｒ−１４
〜およそＧｌｎ−２２のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における
およそＶａｌ−３４〜およそＨｉｓ−５３のアミノ酸残基を含むポリペプチド；
配列番号２におけるおよそＰｈｅ−９４〜およそＶａｌ−１０８のアミノ酸残基
を含むポリペプチド；配列番号２におけるおよそＡｌａ−１２０〜およそＧｌｎ
−１２６のアミノ酸残基を含むポリペプチド）の開始のプロセスで起こり得る環
境中で、ポリペプチドの表面に露出されるようなポリペプチド（例えば、配列番
号２におけるおよそＡｒｇ−１３８〜およそＩｌｅ−１４９のアミノ酸残基を含
むポリペプチド；配列番号２におけるおよそＬｅｕ−２０２〜およそＡｌａ−２
１１のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２におけるおよそＰｈｅ−２
７４〜およそＳｅｒ−２７８のアミノ酸残基を含むポリペプチド）の領域を示す
値を選択することにより，示されたカラムＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、および／
またはＩＶに示されたデータから決定される。本発明の非常に好ましいフラグメ
ントは、いくつかの構造的特徴（例えば、上記に示されたいくつか（例えば、１
、２、３または４）の特徴）を組み合せたＢｒａｉｎｉａｃ−５の領域を含むフ
ラグメントである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた
、本発明により含まれる。Further embodiments include one, two, three, four, five or more functional regions of a polypeptide of the invention (eg, FIG. 3 and Table 1 and herein). Garnier-Robson α, β, turn and coil regions, Chou-Fasman α, β and coil regions, Kyte-Doolittle hydrophilic and hydrophobic regions, Eisen as described.
Berg α- and β-amphiphilic regions, Karplus-Sch
ulz flexible region, Emini surface forming region and Jameson-Wol
f) or comprising or consisting thereof.
Includes 5 fragments. In a preferred embodiment, the polypeptide fragments of the invention are antigenic. Data shown in columns VIII, IX, XIII and XIV of Table 1 show Brainiac-5 showing a high degree of potential for antigenicity
Can be used to routinely determine the region of Regions of high antigenicity indicate that antigen recognition is associated with an immune response (eg, from about Val-1 to about Val-1 in SEQ ID NO: 2).
A polypeptide comprising one amino acid residue; approximately Thr-14 in SEQ ID NO: 2.
A polypeptide comprising from about Val-34 to about His-53 in SEQ ID NO: 2;
A polypeptide comprising amino acid residues from about Phe-94 to about Val-108 in SEQ ID NO: 2; from about Ala-120 to about Gln in SEQ ID NO: 2
The polypeptide (eg, from about Arg-138 to about Ile-149 in SEQ ID NO: 2) is exposed in a possible environment in the process of initiation of the polypeptide comprising -126 amino acid residues. A polypeptide comprising the following amino acid residues: from about Leu-202 to about Ala-2 in SEQ ID NO: 2.
A polypeptide comprising 11 amino acid residues; approximately Phe-2 in SEQ ID NO: 2;
By selecting a value indicative of the region from 74 to approximately Ser-278 amino acid residues), the indicated columns VIII, IX, XIII, and / or
Or it is determined from the data shown in IV. Highly preferred fragments of the invention are those which have several structural features (eg, some shown above (eg, 1
This is a fragment containing the Brainiac-5 region in which the features (2), (3) or (4) are combined. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included by the present invention.

【０１２８】 別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部
分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピ
トープは、本発明のポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープ
である。「免疫原性エピトープ」とは、その完全ポリペプチドまたはポリペプチ
ド全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発するポリペプチドの一部として定義
される。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピト
ープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原
性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照の
こと。In another embodiment, the invention provides a peptide or polypeptide comprising an epitope-bearing portion of a polypeptide of the invention. The epitope of the polypeptide portion is an immunogenic or antigenic epitope of the polypeptide of the invention. An "immunogenic epitope" is defined as a portion of a polypeptide that elicits an antibody response when the entire polypeptide or the entire polypeptide is an immunogen. On the one hand, the region of the protein molecule to which an antibody can bind is defined as an "antigenic epitope". The number of immunogenic epitopes on a protein is generally less than the number of antigenic epitopes. See, for example, Geysen et al., Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983).

【０１２９】 抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るポリペプチド分子
の領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、ポリペプチド配列
の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたポリペプチド
と反応する抗血清を慣用的に誘発し得ることが、当該分野で周知である（例えば
、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６
（１９８３）を参照のこと）。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、
ポリペプチドの一次配列で頻繁に示され、一連の単純な化学的法則により特徴付
けられ得、そしてインタクトなポリペプチドの免疫優性領域（すなわち、免疫原
性エピトープ）にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。
それゆえ、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発
明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起
するために有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７
７８（１９８４）を参照のこと。For selection of peptides or polypeptides that carry an antigenic epitope (ie, include a region of the polypeptide molecule to which an antibody can bind), a relatively short synthetic peptide that mimics a portion of the polypeptide sequence will It is well known in the art that antisera reactive with chemically mimicked polypeptides can be routinely elicited (eg, Sutcliffe, JG et al., Science 219: 660-666).
(1983)). Peptides that can induce protein-reactive serum are
Frequently shown in the primary sequence of a polypeptide, it can be characterized by a series of simple chemical rules, and also has an amino- or carboxyl-terminus at the immunodominant region (ie, immunogenic epitope) of an intact polypeptide. Nor are they restricted.
Therefore, the antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are useful for raising antibodies (including monoclonal antibodies) that specifically bind to the polypeptides of the present invention. See, eg, Wilson et al., Cell 37: 767-7.
78 (1984).

【０１３０】 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは少なくとも７個、より好まし
くは少なくとも９個、そして最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の
配列を含む。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５特異的抗体を生成するために使用され得る抗
原性ポリぺプチドまたはペプチドの非限定的な例には、以下が含まれる：配列番
号２におけるおよそＶａｌ−１〜およそＶａｌ−１１のアミノ酸残基を含むポリ
ペプチド；配列番号２におけるおよそＴｈｒ−１４〜およそＧｌｎ−２２のアミ
ノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２におけるおよそＶａｌ−３４〜およそ
Ｈｉｓ−５３のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２におけるおよそＰ
ｈｅ−９４〜およそＶａｌ−１０８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番
号２におけるおよそＡｌａ−１２０〜およそＧｌｎ−１２６のアミノ酸残基を含
むポリペプチド；配列番号２におけるおよそＡｒｇ−１３８〜およそＩｌｅ−１
４９のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２におけるおよそＬｅｕ−２
０２〜およそＡｌａ−２１１のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番
号２におけるおよそＰｈｅ−２７４〜およそＳｅｒ−２７８のアミノ酸残基を含
むポリペプチド。これらのポリぺプチドフラグメントは、上記の図３および／ま
たは表１に示すように、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標の分析によりＢｒ
ａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの抗原性エピトープを保有することが、決定され
ている。[0130] The antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are preferably comprised of at least 7, more preferably at least 9, and most preferably about 15 to about Includes sequences of between 30 amino acids. Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate Brainiac-5 specific antibodies include: the amino acids from about Val-1 to about Val-11 in SEQ ID NO: 2. A polypeptide comprising amino acid residues from about Thr-14 to about Gln-22 in SEQ ID NO: 2; a polypeptide comprising amino acid residues from about Val-34 to about His-53 in SEQ ID NO: 2 About P in SEQ ID NO: 2;
a polypeptide comprising amino acid residues from about he-94 to about Val-108; a polypeptide comprising about Ala-120 to about Gln-126 in SEQ ID NO: 2; about Arg-138 to about Ile in SEQ ID NO: 2. -1
A polypeptide comprising 49 amino acid residues; about Leu-2 in SEQ ID NO: 2
A polypeptide comprising amino acid residues from about 02 to about Ala-211; and a polypeptide comprising about Phe-274 to about Ser-278 amino acid residues in SEQ ID NO: 2. These polypeptide fragments were analyzed by the Jameson-Wolf antigenicity index for Br, as shown in FIG. 3 and / or Table 1 above.
It has been determined to carry an antigenic epitope of the Ainiac-5 polypeptide.

【０１３１】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段に
より、産生され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｒ．Ａ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）；およ
び米国特許第４，６３１，２１１号 Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）を参照の
こと）。The epitope-bearing peptides and polypeptides of the invention can be produced by any conventional means. For example, Houghten R. et al. A. Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985); and U.S. Patent No. 4,631,211 Houghten et al. (1986)).

【０１３２】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリぺプチドは、当該分野で周知の方
法に従って、抗体を誘導するために使用される（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら
、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．
ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照の
こと）。本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち、タンパク質全体
が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質のその部分）は、当該分野
で公知の方法に従って同定される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（前出）を参照のこ
と）。さらになお、Ｇｅｙｓｅｎに対して公布された、米国特許第５，１９４，
３９２号は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的であるエ
ピトープ（すなわち、「ミモトープ」）の位相幾何学的等価物であるモノマー（
アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する、一般的な方法を記載
する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎに対して公布された、米国特許第４，４３
３，０９２号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的なリガン
ドの位相幾何学的等価物であるモノマーの配列を、検出または決定する方法を記
載する。同様に、Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉ
ｘｔｕｒｅｓについてＨｏｕｇｈｔｅｎらに対して公布された、米国特許第５，
４８０，９７１号は、直鎖状のＣ１〜Ｃ７アルキルペルアルキル化オリゴペプチ
ド、ならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならびにこのよ
うなオリゴペプチドのセットおよびライブラリーを、目的のアクセプター分子に
優先的に結合するペルアルキル化オリゴペプチドの配列を決定するために、使用
する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドア
ナログもまた、これらの方法によって慣用的に作製され得る。The epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are used to elicit antibodies according to methods well known in the art (eg, Sutcliffe et al., Supra; Wilson et al., Supra; Chow, M. Proc.Natl.Ac.
ad. Sci. USA 82: 910-914; and Bittle, F .; J.
J. et al. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985)). The immunogenic epitope-bearing peptide of the invention (ie, that portion of the protein that elicits an antibody response when the entire protein is an immunogen) is identified according to methods known in the art (eg, Geysen et al. Out)). Still further, US Patent No. 5,194, issued to Geysen,
No. 392 discloses a monomer (e.g., a topological equivalent of an epitope (ie, a "mimotope") that is complementary to a particular paratope (antigen binding site) of an antibody of interest.
General methods for detecting or determining the sequence of amino acids or other compounds) are described. More generally, U.S. Pat. No. 4,43,397 issued to Geysen.
No. 3,092 describes a method for detecting or determining the sequence of a monomer that is the topological equivalent of a ligand that is complementary to the ligand binding site of the particular receptor of interest. Similarly, Personalized Oligopeptide M
US Patent No. 5, issued to Houghten et al. for xtures.
No. 480,971 discloses linear C1-C7 alkyl peralkylated oligopeptides, and sets and libraries of such peptides, and sets of such oligopeptides and libraries over the target acceptor molecule of interest. Disclosed are methods used to determine the sequence of a peralkylated oligopeptide that binds specifically. Thus, non-peptide analogs of the epitope-bearing peptides of the present invention can also be routinely made by these methods.

【０１３３】 本発明における使用のためのＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド特異的抗体は
、インタクトなＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド、またはその抗原性ポリぺプ
チドフラグメントに対して惹起され得、これは、アルブミンのようなキャリアタ
ンパク質とともに、またはそれが十分に長ければ（少なくとも約２５アミノ酸）
、キャリアなしに、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され得
る。[0133] Brainiac-5 polypeptide-specific antibodies for use in the present invention can be raised against an intact Brainiac-5 polypeptide, or an antigenic polypeptide fragment thereof, such as albumin. With the carrier protein or if it is long enough (at least about 25 amino acids)
Can be presented to an animal system (eg, rabbit or mouse) without a carrier.

【０１３４】 本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル
抗体」（Ｍａｂ）は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドに特異的に結合し得る
インタクトな分子ならびに抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’
）２フラグメント）を含むことが意味される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラ
グメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠失し、循環からより迅速
に除去され、そしてインタクトな抗体のより非特異的でない組織結合を有し得る
（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。
従って、これらのフラグメントが好ましい。As used herein, the term “antibody” (Ab) or “monoclonal antibody” (Mab) refers to intact molecules as well as antibody fragments (eg, antibodies) that can specifically bind to Brainiac-5 polypeptide. , Fab and F (ab '
) 2 fragments). Fab and F (ab ') 2 fragments lack the Fc fragment of the intact antibody, are cleared more rapidly from the circulation, and may have less nonspecific tissue binding of the intact antibody (Wahl et al., J. Nucl.Med. 24: 316-325 (1983)).
Therefore, these fragments are preferred.

【０１３５】 本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、Ｂｒａｉ
ｎｉａｃ−５ポリペプチドまたはその抗原性フラグメントを発現する細胞は、ポ
リクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。
好ましい方法において、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの調製物が、天然の
夾雑物を実質的に含まないようにするために調製および精製される。次いで、こ
のような調製物は、より比活性の大きいポリクローナル抗血清を産生するために
動物に導入される。[0135] Antibodies of the present invention can be prepared by any of a variety of methods. For example, Brai
Cells expressing a niac-5 polypeptide or an antigenic fragment thereof can be administered to animals to induce the production of serum containing polyclonal antibodies.
In a preferred method, a preparation of Brainiac-5 polypeptide is prepared and purified to be substantially free of natural contaminants. Such a preparation is then introduced into an animal to produce a higher specific activity polyclonal antiserum.

【０１３６】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（またはそ
のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド結合フラグメント）である。このようなモ
ノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｈｌｅ
ｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８１）、５６３〜６８１頁）。一般
に、このような手順は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド抗原、またはより好
ましくはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド発現細胞を使用した、動物（好まし
くはマウス）の免疫を含む。適切な細胞は、抗Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチ
ド抗体に結合するそれらの能力によって認識され得る。このような細胞は、任意
の適切な組織培養培地において培養され得る；しかし、１０％胎仔ウシ血清（約
５６℃で不活性化した）を補充し、そして約１０μｇ／ｌの非必須アミノ酸、約
１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイ
シンを補充したＥａｒｌｅの改変Ｅａｇｌｅ培地において細胞を培養することが
好ましい。このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切なミエローマ細胞株
と融合する。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って利用され得る；
しかし、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手可能である親ミエローマ細胞株
（ＳＰ２Ｏ）を利用することが好ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞
を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次いで、Ｗａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏ
ｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１））に記載されるよう
に、限界希釈によってクローン化する。次いで、このような選択によって得られ
るハイブリドーマ細胞を、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド抗原に結合し得る
抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイする。In a most preferred method, the antibodies of the present invention are monoclonal antibodies (or Brainiac-5 polypeptide binding fragments thereof). Such monoclonal antibodies can be prepared using hybridoma technology (Kohle
r et al., Nature 256: 495 (1975); Kohler et al., Eur.
J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler et al., Eur. J.
Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling et al., Mono.
Clonal Antibodies and T-Cell Hybrido
mas, Elsevier, N .; Y. (1981), 563-681). In general, such procedures include immunization of an animal, preferably a mouse, with a Brainiac-5 polypeptide antigen, or more preferably, a Brainiac-5 polypeptide-expressing cell. Suitable cells can be recognized by their ability to bind anti-Brainiac-5 polypeptide antibodies. Such cells can be cultured in any suitable tissue culture medium; however, supplemented with 10% fetal calf serum (inactivated at about 56 ° C.) and about 10 μg / l of non-essential amino acids, about 10 μg / l. Preferably, the cells are cultured in Earle's modified Eagle's medium supplemented with 1,000 U / ml penicillin and about 100 μg / ml streptomycin. The splenocytes of such mice are extracted and fused with an appropriate myeloma cell line. Any suitable myeloma cell line can be utilized according to the present invention;
However, the American Type Culture Collection
It is preferred to utilize the parental myeloma cell line (SP2O), available from Manassas, Virginia. After fusion, the resulting hybridoma cells are selectively maintained in HAT medium, and then are compared to Wands et al.
Enterology is cloned by limiting dilution as described in enterology 80: 225-232 (1981)). The hybridoma cells resulting from such a selection are then assayed to identify clones that secrete antibodies capable of binding the Brainiac-5 polypeptide antigen.

【０１３７】 あるいは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド抗原に結合し得るさらなる抗体
を、抗イディオタイプ抗体の使用を介して２工程手順において産生し得る。この
ような方法は、抗体がそれ自体抗原であり、そしてそれゆえ、第２の抗体に結合
する抗体を得ることが可能であるという事実を利用する。この方法に従って、Ｂ
ｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド特異的抗体を、動物（好ましくはマウス）を免
疫するために使用する。次いで、このような動物の脾細胞を、ハイブリドーマ細
胞を産生するために使用し、そしてそのハイブリドーマ細胞を、Ｂｒａｉｎｉａ
ｃ−５ポリペプチド特異的抗体に結合するその能力が、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポ
リペプチド抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するた
めに、スクリーニングする。このような抗体は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプ
チド特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫して、
さらなるＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド特異的抗体の形成を誘導するために
使用され得る。Alternatively, additional antibodies capable of binding to Brainiac-5 polypeptide antigen can be produced in a two-step procedure through the use of anti-idiotypic antibodies. Such methods take advantage of the fact that the antibody is itself an antigen, and thus it is possible to obtain an antibody that binds to a second antibody. According to this method, B
A Rainiac-5 polypeptide-specific antibody is used to immunize an animal, preferably a mouse. The spleen cells of such animals are then used to produce hybridoma cells, and the hybridoma cells are transformed into Brainia
Screen to identify clones that produce antibodies whose ability to bind to c-5 polypeptide-specific antibodies can be blocked by Brainiac-5 polypeptide antigen. Such antibodies include anti-idiotype antibodies to Brainiac-5 polypeptide-specific antibodies, and immunizing animals.
It can be used to induce the formation of additional Brainiac-5 polypeptide-specific antibodies.

【０１３８】 本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに他のフラグメントは、本
明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このような
フラグメントを、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するために
）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するために）のような酵
素を用いる、タンパク質分解的切断によって生成する。あるいは、Ｂｒａｉｎｉ
ａｃ−５ポリペプチド結合フラグメントを、組換えＤＮＡ技術を適用することに
よって、または合成化学によって産生し得る。It is understood that Fab and F (ab ') 2 and other fragments of the antibodies of the invention can be used according to the methods disclosed herein. Such fragments are typically generated by proteolytic cleavage using an enzyme such as papain (to generate Fab fragments) or pepsin (to generate F (ab ') 2 fragments). I do. Or Braini
The ac-5 polypeptide binding fragment may be produced by applying recombinant DNA technology or by synthetic chemistry.

【０１３９】 ヒトにおける抗Ｂｒａｉｎｉａｃ−５のインビボでの使用のために、「ヒト化
」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗
体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝
子構築物を使用して産生され得る。キメラ抗体を産生する方法は、当該分野で公
知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）
；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌ
ｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７
１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、
ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌ
ｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅ
ｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５））。For in vivo use of anti-Brainiac-5 in humans, it may be preferable to use a “humanized” chimeric monoclonal antibody. Such antibodies can be produced using a genetic construct derived from a hybridoma cell producing the monoclonal antibody described above. Methods for producing chimeric antibodies are known in the art (Morrison, Science 229: 1202 (1985)).
Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Cabil.
ly et al., U.S. Pat. No. 4,816,567; Taniguchi et al., EP 17
1496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al.
WO 8615333; Robinson et al., WO 8702671; Boul
ianne et al., Nature 312: 643 (1984); Neuberge.
r et al., Nature 314: 268 (1985)).

【０１４０】 本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、あ
るいは寄託されたクローン２０３５７２に含まれるポリヌクレオチド配列により
コードされるポリペプチド配列のエピトープ、または前出で定義したような、ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、またはより低いストリンジェ
ンシーハイブリダイゼーション条件下で配列番号１の配列、もしくは寄託された
クローンＨＯＧＣＣ４５に含まれる配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌク
レオチドによりコードされるポリペプチド配列のエピトープを含む、またはそれ
らからなるポリペプチドを含む。本発明は、本発明のポリペプチド配列のエピト
ープをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１に開示されるよう
な配列）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖の、
ポリヌクレオチド配列、および前出で定義される、ストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件下、またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーシ
ョン条件下で、その相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を、さら
に含む。The present invention relates to an epitope of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or an epitope of a polypeptide sequence encoded by the polynucleotide sequence contained in the deposited clone 203572, or as defined above. A polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes to the sequence of SEQ ID NO: 1 or the complement of the sequence contained in the deposited clone HOGCC45 under stringent hybridization conditions or lower stringency hybridization conditions Includes polypeptides comprising or consisting of an epitope of the sequence. The present invention relates to a polynucleotide sequence encoding an epitope of a polypeptide sequence of the invention (eg, a sequence as disclosed in SEQ ID NO: 1), the complement of a polynucleotide sequence encoding an epitope of the invention.
Further comprising a polynucleotide sequence, and a polynucleotide sequence that hybridizes to its complementary strand under stringent hybridization conditions, or lower stringency hybridization conditions, as defined above.

【０１４１】 本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、動物（好ましくは哺乳
動物、および最も好ましくはヒト）において抗原性活性または免疫原性活性を有
するポリペプチドの部分をいう。本発明の好ましい実施形態において、本発明は
、エピトープを含むポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを含む。本明細書中で使用される場合、「免疫原性エピトープ」は、
動物において抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義され、当該分野で
公知の任意の方法（例えば、下記に記載される抗体を産生するための方法（例え
ば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：
３９９８〜４００２（１９８３）を参照のこと））によって決定される。本明細
書中で使用される場合、用語「抗原性エピトープ」は、当該分野で周知の任意の
方法（例えば、本明細書中に記載されるイムノアッセイ）により決定される場合
、抗体がその抗原を免疫特異的に結合し得るタンパク質の一部として定義される
。免疫特異的結合は、非特異的結合を除外するが、他の抗原との交差反応を除外
する必要はない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。As used herein, the term “epitope” refers to that portion of a polypeptide that has antigenic or immunogenic activity in an animal, preferably a mammal, and most preferably a human. In a preferred embodiment of the invention, the invention includes a polypeptide comprising an epitope, and a polynucleotide encoding the polypeptide. As used herein, "immunogenic epitope"
Any method known in the art, defined as a portion of a protein that elicits an antibody response in an animal, such as the method for producing an antibody described below (see, eg, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 81:
3998-4002 (1983))). As used herein, the term "antigenic epitope" refers to an antibody that binds its antigen as determined by any method known in the art (eg, the immunoassays described herein). Defined as part of a protein that can bind immunospecifically. Immunospecific binding excludes non-specific binding, but need not exclude cross-reactivity with other antigens. An antigenic epitope need not be immunogenic.

【０１４２】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来技術により生成され得
る（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）（米国特許第４，６３１，２１１号
にさらに記載される）を参照のこと）。[0142] Fragments that function as epitopes can be generated by any conventional technique (eg, Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 82: 5131-5135 (1985) (further described in U.S. Patent No. 4,631,211).

【０１４３】 本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なくと
も５、少なくとも６、少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、少なくとも
９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、そし
て最も好ましくは約１５〜約３０のアミノ酸の配列を含む。免疫原性エピトープ
または抗原性エピトープを含む好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１５
、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５
、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基長である。例えば、抗原性
エピトープは、このエピトープに対して特異的に結合する抗体（モノクローナル
抗体を含む）を惹起するために有用である。抗原性エピトープは、イムノアッセ
イにおける標的分子として使用され得る（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ
３７：７６７−７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと）。In the present invention, the antigenic epitope is preferably at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, more preferably at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, and most Preferably it comprises a sequence of about 15 to about 30 amino acids. Preferred polypeptides comprising an immunogenic or antigenic epitope are at least 10, 15
, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75
, 80, 85, 90, 95 or 100 amino acid residues in length. For example, antigenic epitopes are useful for raising antibodies (including monoclonal antibodies) that specifically bind to this epitope. Antigenic epitopes can be used as target molecules in immunoassays (eg, Wilson et al., Cell).
37: 767-778 (1984); Sutcliffe et al., Science.
219: 660-666 (1983)).

【０１４４】 同様に、免疫原性エピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に従
う抗体を誘導し得る（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，
前出；Ｃｈｏｗら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９
１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４
７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは、分
泌タンパク質を含む。１以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、抗体
応答を誘導するために、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動
物系（例えば、ウサギまたはマウス）に提示され得るか、このポリペプチドが十
分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）は、このポリペプチドは、キャリア
なしで動物系に提示され得る。しかし、８〜１０程度の少なさのアミノ酸を含む
免疫原性エピトープは、少なくとも変性ポリペプチド中の直鎖状エピトープに結
合し得る抗体を惹起するには十分であることが示されている（例えば、ウェスタ
ンブロッティングにおいて）。Similarly, immunogenic epitopes can be used to induce antibodies, for example, according to methods well known in the art (eg, Sutcliffe et al., Supra; Wilson et al.,
See above; Chow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 9
10-914; and Bittle et al., J. Mol. Gen. Virol. 66: 234
7-2354 (1985)). Preferred immunogenic epitopes include secreted proteins. A polypeptide comprising one or more immunogenic epitopes can be presented to an animal system (eg, rabbit or mouse) along with a carrier protein (eg, albumin) to elicit an antibody response, or the polypeptide can be sufficiently expressed. If long (at least about 25 amino acids), the polypeptide can be presented to animal systems without a carrier. However, immunogenic epitopes containing as few as 8 to 10 amino acids have been shown to be sufficient to elicit antibodies that can bind at least to linear epitopes in modified polypeptides (eg, , In Western blotting).

【０１４５】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、
インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定
されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およ
びＢｉｔｔｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９
８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用い
て免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キー
ホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチド
を結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプ
チドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢ
Ｓ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプチ
ドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに
結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチド
またはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エマルジョン（約１
００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバント、
または免疫応答を刺激することが公知の、他のアジュバントを含む）の腹腔内注
射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブースター注射が、抗
ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で、必要
とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチドを用いる
ＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中の抗ペプチ
ド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方法に従う
固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による）により上
昇し得る。[0145] The epitope-bearing polypeptides of the present invention can be used to elicit antibodies according to methods well known in the art. These well-known methods include in vivo immunization,
These include, but are not limited to, in vitro immunization, and phage display methods. See, for example, Sutcliffe et al., Supra; Wilson et al., Supra; and Bittle et al. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (19
85). When using in vivo immunization, animals can be immunized with the free peptide; however, anti-peptide antibody titers allow binding of the peptide to a macromolecular carrier such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) or tetanus toxoid. Can be boosted. For example, a peptide containing a cysteine residue is a maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MB
It can be attached to the carrier using a linker such as S). On the other hand, other peptides can be conjugated to the carrier using more common binders such as glutaraldehyde. Animals such as rabbits, rats, and mice can be used with either free or carrier-bound peptides, for example, in emulsions (about 1
00 μg peptide or carrier protein and Freund's adjuvant,
Or intraperitoneal and / or intradermal injection of other adjuvants known to stimulate an immune response). Several booster injections may be required, for example, at intervals of about two weeks to provide useful titers of the anti-peptide antibody. This titer can be detected, for example, by an ELISA assay using the free peptide adsorbed on the solid surface. The titer of the anti-peptide antibody in the serum from the immunized animal is determined by the choice of the anti-peptide antibody (eg, by adsorption to the peptide on a solid support and elution of the selected antibody according to methods well known in the art). Can rise.

【０１４６】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、他のポリペプチド
配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、Ｃ
Ｈ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせ、およびそれらの部分）と融合
し得、これがキメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を
容易にし得、そしてインビボにおける半減期を増加し得る。これは、ヒトＣＤ４
ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖ま
たは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を示す。例えば
、ＥＰＡ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：
８４〜８６（１９８８）を参照のこと。ＩｇＧ部分のジスルフィド結合に起因す
る、ジスルフィド架橋ダイマー構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、モノ
マーポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合およ
び中和においてより効果的であることが見出されている。例えば、Ｆｏｕｎｔｏ
ｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８〜３９６４（１９９
５）を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ
（例えば、赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（ｆｌａｇ ｔａ
ｇ））として目的の遺伝子と組換えられ得、発現されたポリペプチドの検出およ
び精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系は、
ヒト細胞株において発現される非変性融合タンパク質の前精製を可能にする（Ｊ
ａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８８：８９７２−８９７）。この系において、目的の遺伝子は、遺伝子のオ
ープンリーディングフレームが、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグ
と翻訳的に融合したようなワクシニア組換えプラスミド中でサブクローン化され
る。このタグは、融合タンパク質に対して膜結合ドメインとして働く。組換えワ
クシニアウイルスに感染した細胞由来の抽出物は、Ｎｉ²⁺ニトリロ酢酸−アガロ
ースカラム上にロードされ、そしてヒスチジンタグ化タンパク質は、イミダゾー
ル含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。As will be appreciated by those of skill in the art, and as discussed above, polypeptides of the invention that include an immunogenic or antigenic epitope can be fused to other polypeptide sequences. For example, a polypeptide of the invention may comprise an immunoglobulin (Ig
A, IgE, IgG, IgM) or their constants (CH1, C
H2, CH3, or any combination thereof, and portions thereof), which results in a chimeric polypeptide. These fusion proteins can facilitate purification and increase half-life in vivo. This is human CD4
1 shows a chimeric protein consisting of the first two domains of a polypeptide and various domains of the constant region of a heavy or light chain of a mammalian immunoglobulin. See, for example, EPA 394,827; Traunecker et al., Nature, 331:
84-86 (1988). IgG fusion proteins with a disulfide bridged dimer structure, due to the disulfide bonds of the IgG moiety, have also been found to be more effective at binding and neutralizing other molecules than monomeric polypeptides or fragments thereof alone. Have been. For example, Foundo
ulakis et al. Biochem. , 270: 3958-3964 (199).
See 5). Nucleic acids encoding the above-described epitopes may also be epitope tags (eg, hemagglutinin ("HA") tags or flag tags).
g)) can be recombined with the gene of interest to aid in the detection and purification of the expressed polypeptide. For example, the system described by Janknecht et al.
Allows for pre-purification of non-denatured fusion proteins expressed in human cell lines (J
anknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 88: 8972-897). In this system, the gene of interest is subcloned in a vaccinia recombination plasmid such that the gene's open reading frame is translationally fused to an amino-terminal tag consisting of six histidine residues. This tag serves as a membrane binding domain for the fusion protein. Extracts from cells infected with the recombinant vaccinia virus are loaded onto a Ni2 ⁺ nitriloacetic acid-agarose column, and histidine-tagged proteins can be selectively eluted using imidazole-containing buffers.

【０１４７】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて産生され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを使用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、その
ような方法は変化した活性を有するポリペプチド、ならびにこのポリペプチドの
アゴニストおよびアンタゴニストを産生するために使用され得る。一般には、米
国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，
７２１号、同第５，８３４，２５２号および同第５，８３７，４５８号、ならび
にＰａｔｔｅｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７
２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよび
Ｂｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９
９８）（これらの特許および刊行物の各々の全体が本明細書により参考として援
用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号１に対応するポリ
ヌクレオチド、およびそれらポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
の改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは
、ポリヌクレオチド配列において改変を産生するための相同組換えまたは部位特
異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグメントを構築することを含む。別の実
施形態において、本発明のポリヌクレオチドまはたコードされるポリペプチドは
、組換え前に誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオ
チド挿入または他の方法により、ランダムな変異誘発に供されることによって改
変され得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドの１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ド
メイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ
、区切り、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。Additional fusion proteins of the invention can be produced through the techniques of gene shuffling, motif shuffling, exon shuffling, and / or codon shuffling (collectively referred to as "DNA shuffling"). D
NA shuffling can be used to modulate the activity of a polypeptide of the invention, and such methods can be used to produce polypeptides with altered activity, as well as agonists and antagonists of the polypeptide. In general, U.S. Patent Nos. 5,605,793, 5,811,238, and 5,830,
Nos. 721, 5,834,252 and 5,837,458, and Patten et al., Curr. Opinion Biotechnol. 8: 7
24-33 (1997); Harayama, Trends Biotechn.
ol. 16 (2): 76-82 (1998); Hansson et al. Mol.
Biol. 287: 265-76 (1999); and Lorenzo and Blasco, Biotechniques 24 (2): 308-13 (19).
98), each of which is hereby incorporated by reference in its entirety. In one embodiment, modification of the polynucleotides corresponding to SEQ ID NO: 1 and the polypeptides encoded by those polynucleotides can be achieved by DNA shuffling. DNA shuffling involves constructing two or more DNA segments by homologous recombination or site-specific recombination to produce an alteration in a polynucleotide sequence. In another embodiment, the polynucleotides or encoded polypeptides of the present invention are subjected to random mutagenesis prior to recombination by error-prone PCR, random nucleotide insertion or other methods. Can be modified. In another embodiment, one or more components, motifs, sections, portions, domains, fragments, etc., of a polynucleotide encoding a polypeptide of the invention are one or more components of one or more heterologous molecules. , Motifs, breaks, parts, domains, fragments and the like.

【０１４８】 別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部
分を含む、またはエピトープ保有部分からなるペプチドまたはポリペプチドを提
供する。これらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはま
た、本発明に含まれる。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペ
プチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープである。「免疫原性エピト
ープ」とは、全体としてのタンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発する
タンパク質の一部として定義される。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分
子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピト
ープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓ
ｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４
００２（１９８３）を参照のこと。In another embodiment, the invention provides a peptide or polypeptide comprising or consisting of an epitope-bearing portion of a polypeptide of the invention. Polynucleotides encoding these peptides or polypeptides are also included in the present invention. The epitope of the polypeptide portion is an immunogenic or antigenic epitope of the polypeptide of the invention. An "immunogenic epitope" is defined as a portion of a protein that elicits an antibody response when the protein as a whole is an immunogen. On the one hand, the region of the protein molecule to which an antibody can bind is defined as an "antigenic epitope". The number of immunogenic epitopes on a protein is generally less than the number of antigenic epitopes. For example, Geys
en et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4.
002 (1983).

【０１４９】 抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の
領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の部
分を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を慣用的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔ
ｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．、Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．およ
びＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ
ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６を参照のこと。タンパ
ク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列で頻繁に示され
、一連の単純な化学的法則により特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク
質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ末端またはカ
ルボキシル末端にも、制限されない。それゆえ、本発明の抗原性エピトープ保有
ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体
（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために有用である。例えば、Ｗｉｌｓ
ｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）の７７７頁を参照のこと
。For the selection of peptides or polypeptides that carry an antigenic epitope (ie, include a region of the protein molecule to which an antibody can bind), a relatively short synthetic peptide that mimics a portion of the protein sequence will partially mimic It is well known in the art that antisera reactive with a given protein can be routinely induced. For example, Sut
Cliffe, J.M. G. FIG. Shinnick, T .; M. Green, N .; And Learner, R .; A. (1983) "Antibodies that
react with predetermined sites on pr
oteins "Science 219: 660-666. Peptides that can elicit protein-reactive sera are frequently shown in the primary sequence of proteins, can be characterized by a series of simple chemical rules, and are immunodominant regions of intact proteins (ie, immunogenic epitopes). Nor the amino or carboxyl terminus. Therefore, the antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are useful for raising antibodies (including monoclonal antibodies) that specifically bind to the polypeptides of the present invention. For example, Wils
See, et al., Cell 37: 767-778 (1984) at page 777.

【０１５０】 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは、
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、少なくとも６つ、少なくと
も７つ、少なくとも８つ、より好ましくは少なくとも９つ、少なくとも１０、少
なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも
５０、少なくとも７５、そして最も好ましくは約１５〜約３０のアミノ酸の配列
を含む。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５特異的な抗体を生成するために使用され得る抗原
性のポリペプチドまたはペプチドの非限定的な例としては、以下が挙げられる：
配列番号２のおよそＶａｌ−１からおよそＶａｌ−１１までのアミノ酸残基を含
むか、またはその代わりに配列番号２のおよそＶａｌ−１からおよそＶａｌ−１
１までのアミノ酸残基からなるポリペプチド；配列番号２のおよそＴｈｒ−１４
からおよそＧｌｎ−２２までのアミノ酸残基を含むか、またはその代わりに配列
番号２のおよそＴｈｒ−１４からおよそＧｌｎ−２２までのアミノ酸残基からな
るポリペプチド；配列番号２のおよそＶａｌ−３４からおよそＨｉｓ−５３まで
のアミノ酸残基を含むか、またはその代わりに配列番号２のおよそＶａｌ−３４
からおよそＨｉｓ−５３までのアミノ酸残基からなるポリペプチド；配列番号２
のおよそＰｈｅ−９４からおよそＶａｌ−１０８までのアミノ酸残基を含むか、
またはその代わりに配列番号２のおよそＰｈｅ−９４からおよそＶａｌ−１０８
までのアミノ酸残基からなるポリペプチド；配列番号２のおよそＡｌａ−１２０
からおよそＧｌｎ−１２６までのアミノ酸残基を含むか、またはその代わりに配
列番号２のおよそＡｌａ−１２０からおよそＧｌｎ−１２６までのアミノ酸残基
からなるポリペプチド；配列番号２のおよそＡｒｇ−１３８からおよそＩｌｅ−
１４９までのアミノ酸残基を含むか、またはその代わりに配列番号２のおよそＡ
ｒｇ−１３８からおよそＩｌｅ−１４９までのアミノ酸残基からなるポリペプチ
ド；配列番号２のおよそＬｅｕ−２０２からおよそＡｌａ−２１１までのアミノ
酸残基を含むか、またはその代わりに配列番号２のおよそＬｅｕ−２０２からお
よそＡｌａ−２１１までのアミノ酸残基からなるポリペプチド；および配列番号
２のおよそＰｈｅ−２７４からおよそＳｅｒ−２７８までのアミノ酸残基を含む
か、またはその代わりに配列番号２のおよそＰｈｅ−２７４からおよそＳｅｒ−
２７８までのアミノ酸残基からなるポリペプチド。これらのポリペプチドフラグ
メントは、上記の図３および表１に示されるように、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ
抗原性指数の分析によって、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの抗原性エピト
ープを有すると決定された。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドもまた、本発明に含まれる。「およそ」とは、特に列挙された範囲ならびにい
くつかの残基、少しの残基、５残基、４残基、３残基、２残基または１残基だけ
Ｎ末端および／またはＣ末端が長いかまたは短い範囲を意味する。The antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are preferably
At least 6, at least 7, at least 8, more preferably at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 30, at least 40, at least 50, at least 6, contained within the amino acid sequence of the polypeptide of the invention. It comprises a sequence of at least 75, and most preferably about 15 to about 30 amino acids. Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate Brainiac-5 specific antibodies include the following:
Comprising about amino acid residues from about Val-1 to about Val-11 of SEQ ID NO: 2, or alternatively, from about Val-1 to about Val-1 of SEQ ID NO: 2
A polypeptide consisting of up to 1 amino acid residue; approximately Thr-14 of SEQ ID NO: 2
A polypeptide comprising amino acid residues from about Thr-14 to about Gln-22 of SEQ ID NO: 2; or alternatively from about Val-34 of SEQ ID NO: 2 to about Gln-22. Comprising amino acid residues up to about His-53, or alternatively about Val-34 of SEQ ID NO: 2.
A polypeptide consisting of amino acid residues from to approximately His-53; SEQ ID NO: 2
Comprises about amino acid residues from about Phe-94 to about Val-108,
Alternatively, from about Phe-94 to about Val-108 of SEQ ID NO: 2.
A polypeptide consisting of up to about Ala-120 of SEQ ID NO: 2
A polypeptide comprising from about Ala-120 to about Gln-126 of SEQ ID NO: 2; or alternatively comprising from about Arg-138 of SEQ ID NO: 2 to about Gln-126; About Ile-
Comprising up to 149 amino acid residues or, alternatively, approximately A
a polypeptide consisting of amino acid residues from about rg-138 to about Ile-149; comprising about amino acid residues from about Leu-202 to about Ala-211 of SEQ ID NO: 2, or alternatively, about Leu of SEQ ID NO: 2 A polypeptide consisting of amino acid residues from -202 to about Ala-211; and comprising about amino acid residues from about Phe-274 to about Ser-278 of SEQ ID NO: 2, or alternatively about Phe of SEQ ID NO: 2 From -274 to Ser-
A polypeptide consisting of up to 278 amino acid residues. These polypeptide fragments were, as shown in FIG. 3 and Table 1 above, Jameson-Wolf.
Analysis of the antigenicity index determined that it had an antigenic epitope of the Brainiac-5 polypeptide. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention. "Approximately" refers to the specifically recited ranges and only a few residues, few residues, five residues, four residues, three residues, two residues or one residue N-terminal and / or C-terminal Means a long or short range.

【０１５１】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段に
よって産生され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｒ．Ａ．（１９８５）Ｇｅｎ
ｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓ
ｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄ
ｕａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８２：５１３１−５１３５；この「同時多重ペプチド合成（Ｓｉｍｕｌｔ
ａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｓ
ＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）に対する米国特許第４
，６３１，２１１号にさらに記載される。The epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention can be produced by any conventional means. See, for example, Houghten, R.A. A. (1985) Gen
eral method for the rapid solid-phas
e synthesis of large numbers of pept
ides: specificity of antigen-antibody
interaction at the level of individ
ual amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 82: 5131-5135; this "Simultaneous Multiple Peptide Synthesis (Simult
anneous Multiple Peptide Synthesis) (S
MPS) "process is described in U.S. Pat. No. 4 to Houghten et al.
, 631, 211.

【０１５２】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドを当該分野で周知の方法
に従って、抗体を誘導するために使用する。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前
出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ、Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと
。本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち、そのタンパク質全体が
免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質のその部分）は、当該分野で
公知の方法に従って同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（前出）を参照のこと
。さらになお、Ｇｅｙｓｅｎに対する米国特許第５，１９４，３９２号（１９９
０）は、モノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列（これは、目的の抗体の
特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的なエピトープの位相学的等価物（す
なわち、「ミモトープ」）である）を検出または決定する一般的な方法を記載す
る。より一般には、Ｇｅｙｓｅｎに対する米国特許第４，４３３，０９２号（１
９８９）は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的なリガンドの
位相学的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同
様に、過アルキル過されたオリゴペプチドの混合物（Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ
Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｘｔｕｒｅ）についてのＨｏｕｇｈｔｏｎ．
Ｒ．Ａ．らに対する米国特許第５，４８０，９７１号（１９９６）は、直鎖状の
Ｃ１−Ｃ７−アルキルの過アルキル化されたオリゴペプチドならびにそのような
ペプチドのセットおよびライブラリー、ならびに目的のアクセプター分子に優先
的に結合する過アルキル化されたオリゴペプチドの配列を決定するためにそのよ
うなオリゴペプチドセットおよびライブラリーを用いるための方法を開示する。
したがって、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログもまた、こ
れらの方法によって慣用的に作製され得る。The epitope-bearing peptides and polypeptides of the invention are used to elicit antibodies according to methods well known in the art. See, e.g., Sutcliffe et al., Supra; Wilson et al., Supra; Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 82: 910-914; and Bittle, F .; J. Et al.,
J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985). The immunogenic epitope-bearing peptide of the invention (ie, that portion of the protein that elicits an antibody response when the entire protein is an immunogen) is identified according to methods known in the art. See, for example, Geysen et al., Supra. Still further, US Pat. No. 5,194,392 to Geysen (199)
0) is the sequence of monomers (amino acids or other compounds), which is the topological equivalent of the epitope complementary to the particular paratope (antigen binding site) of the antibody of interest (ie, the “mimotope”) ) Is described below. More generally, U.S. Pat. No. 4,433,092 to Geysen (1
989) describes a method for detecting or determining the sequence of a monomer that is a topological equivalent of a ligand that is complementary to the ligand binding site of the particular receptor of interest. Similarly, mixtures of peralkylated oligopeptides (Peralkylated)
Houghton. For Oligopeptide Mixture).
R. A. No. 5,480,971 (1996) to Linear et al. Describes linear C1-C7-alkyl peralkylated oligopeptides and sets and libraries of such peptides, and acceptor molecules of interest. Disclosed are methods for using such oligopeptide sets and libraries to determine the sequence of preferentially binding peralkylated oligopeptides.
Thus, non-peptide analogs of the epitope-bearing peptides of the present invention can also be routinely made by these methods.

【０１５３】 当業者が理解するように、上記の本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド
およびそのエピトープ保有フラグメントは、異種ポリペプチド配列と組み合わせ
得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはその部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およ
びそれらの任意の組み合わせ（ドメイン全体およびそれらの部分の両方を含む）
）と融合させられ得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は
、精製を容易にし、そしてインビボでの半減期の延長を示す。これは、例えば、
ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリン
の重鎖もしくは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質につ
いて示されている（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分に起因するジスルフ
ィド結合したダイマー構造を有する融合タンパク質はまた、モノマー性Ｂｒａｉ
ｎｉａｃ−５ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメント単独以外の分子を結
合および中和する際により効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。As those skilled in the art will appreciate, the Brainiac-5 polypeptides of the invention described above and epitope-bearing fragments thereof can be combined with heterologous polypeptide sequences. For example, the polypeptides of the present invention may comprise immunoglobulins (IgA, IgE, Ig).
gG, IgM) constant domains or portions thereof (CH1, CH2, CH3, and any combination thereof, including both entire domains and portions thereof)
) To produce a chimeric polypeptide. These fusion proteins facilitate purification and exhibit an increased half-life in vivo. This is, for example,
A chimeric protein consisting of the first two domains of the human CD4 polypeptide and various domains of the constant region of the heavy or light chain of a mammalian immunoglobulin has been shown (EP A 394,827; Traunecker et al., Na.
cure 331: 84-86 (1988)). Fusion proteins having a disulfide-linked dimer structure due to the IgG moiety are also known as monomeric Brai
It may be more efficient in binding and neutralizing molecules other than niac-5 polypeptides or polypeptide fragments alone (Funtoulakis et al., J.
. Biochem. 270: 3958-3964 (1995)).

【０１５４】 当業者が理解するように、上記の本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド
およびそのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ド
メインの部分と組み合わせられ得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合
タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボでの半減期の延長を示す。これ
は、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免
疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタ
ンパク質について示されている（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋ
ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分に起因
するジスルフィド結合したダイマー構造を有する融合タンパク質はまた、モノマ
ー性Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメント単独以
外の他の分子を結合および中和するにおいてより効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔ
ｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９
５））。As will be appreciated by those skilled in the art, the Brainiac-5 polypeptide of the present invention and the epitope-bearing fragments thereof described above can be combined with portions of the constant domain of an immunoglobulin (IgG) to yield a chimeric polypeptide. These fusion proteins facilitate purification and exhibit an increased half-life in vivo. This has been shown, for example, for chimeric proteins consisting of the first two domains of the human CD4 polypeptide and various domains of the constant region of the heavy or light chain of a mammalian immunoglobulin (EPA 394,827; Trauneck).
er et al., Nature 331: 84-86 (1988)). Fusion proteins with a disulfide-linked dimer structure due to the IgG moiety may also be more efficient at binding and neutralizing other molecules than the monomeric Brainiac-5 polypeptide or polypeptide fragment alone (Found
oulakis et al. Biochem. 270: 3958-3964 (199
5)).

【０１５５】 別の実施形態において、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドおよびそ
のエピトープ保有フラグメントは、異種抗原（例えば、ポリペプチド、炭水化物
、リン脂質または核酸）と融合される。特定の実施形態において、異種抗原は、
免疫原である。In another embodiment, Brainiac-5 polypeptides and epitope-bearing fragments thereof of the invention are fused to a heterologous antigen (eg, a polypeptide, carbohydrate, phospholipid or nucleic acid). In certain embodiments, the heterologous antigen is
It is an immunogen.

【０１５６】 遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、
および／またはコドンシャッフリング（総称的に「ＤＮＡシャッフリング」とい
われる）の技術が、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５の活性を調節するために使用され得、
これによって、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５のアゴニストおよびアンタゴニストを効率
的に生成している。一般的に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１
１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および
同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ．Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏ
ｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒ
ａｙａｍａ，Ｓ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｌｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８
２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７
：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａ
ｓｃｏ，Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９
８）（これら特許および刊行物のそれぞれは本明細書により参考として援用され
る）を参照のこと。１つの実施形態において、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレ
オチドおよび対応するポリペプチドの変更は、ＤＮＡシャッフリングにより達成
され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同的または部位特異的な組換えにより、
所望のＢｒａｉｎｉａｃ−５分子の中に、２以上のＤＮＡセグメントの集合体を
含む。別の実施形態では、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドおよび対応す
るポリペプチドは、組換え前の、間違いがちなＰＣＲの無作為なヌクレオチド挿
入または他の方法による無作為な変異誘発を受けることにより、改変され得る。
別の実施形態においては、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５の、１以上の構成要素、モチー
フ、断片、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１以上の相同分子の１以上の
構成要素、モチーフ、断片、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得
る。好ましい実施形態において、異種の分子は、例えば、ＴＮＦ−α、リンホト
キシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（ＬＴ−α２−β
異種三量体の複合体中に見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ
３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際
公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８
９９）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１１）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）：１１８５−１１９０）、ｅｎｄｏｋｉｎｅ−
α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＯＰＧ，ＯＸ４０および神経増殖因
子（ＮＧＦ）、および可溶型のＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４
−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番
号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、Ｔ
Ｒ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／
３０６９４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、Ｔ
Ｒ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８
／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、ＴＲ１２
、ＣＡＤおよびｖ−ＦＬＩＰである。さらに好ましい実施形態において、異種分
子は、ＴＮＦファミリーの任意のメンバーである。Gene shuffling, motif shuffling, exon shuffling,
And / or the technique of codon shuffling (collectively referred to as "DNA shuffling") can be used to modulate the activity of Brainiac-5;
Thus, Brainiac-5 agonists and antagonists are efficiently produced. Generally, U.S. Patent Nos. 5,605,793 and 5,81
Nos. 1,238, 5,830,721, 5,834,252, and 5,837,458, and Patten. P. A. Et al., Curr. O
pinion Biotechnol. 8: 724-33 (1997); Har.
ayama, S, Trends Biotechnol. 16 (2): 76-8
Hansson L. 2 (1998); O. J. et al. Mol. Biol. 287
: 265-76 (1999); and Lorenzo, M .; M. And Bla
sco, R .; Biotechniques 24 (2): 308-13 (199
8) (each of these patents and publications is hereby incorporated by reference). In one embodiment, altering the Brainiac-5 polynucleotide and the corresponding polypeptide can be achieved by DNA shuffling. DNA shuffling is achieved by homologous or site-specific recombination.
The desired Brainiac-5 molecule contains an aggregate of two or more DNA segments. In another embodiment, Brainiac-5 polynucleotides and corresponding polypeptides are modified by undergoing random mutagenesis, prior to recombination, by error-prone PCR random nucleotide insertion or other methods. obtain.
In another embodiment, the one or more components, motifs, fragments, portions, domains, fragments, etc. of Brainiac-5 are one or more components, motifs, fragments, portions, domains, of one or more homologous molecules. It can be recombined with a fragment or the like. In a preferred embodiment, the heterologous molecule is, for example, TNF-α, lymphotoxin-α (also known as LT-α, TNF-β), LT-β (LT-α2-β
Found in a complex of heterotrimers), OPGL, FasL, CD27L, CD
30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-γ (International Publication No. WO96 / 14328), AIM-I (International Publication No. WO97 / 338)
99), AIM-II (International Publication Number WO97 / 34911), APRIL (J
. Exp. Med. 188 (6): 1185-1190), endokine-
α (WO98 / 07880), OPG, OX40 and nerve growth factor (NGF), and soluble forms of Fas, CD30, CD27, CD40 and 4
-IBB, TR2 (International Publication No. WO96 / 34095), DR3 (International Publication No. WO97 / 33904), DR4 (International Publication No. WO98 / 32856), T
R5 (International Publication Number WO98 / 30693), TR6 (International Publication Number WO98 / 30693)
30694), TR7 (International Publication No. WO 98/41629), TRANS, T
R9 (International publication number WO98 / 56892), TR10 (International publication number WO98
/ 54202), 312C2 (International Publication Number WO98 / 06842), TR12
, CAD and v-FLIP. In a further preferred embodiment, the heterologous molecule is any member of the TNF family.

【０１５７】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの特徴を改善または変化させるためには、
タンパク質操作が、使用され得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術が、新規変
異ポリペプチド、あるいは単一または多重のアミノ酸置換、欠失、付加または融
合ポリペプチドを含むムテインを作製するために使用され得る。そのような改変
されたポリペプチドは、例えば、増強された活性または上昇した安定性を示し得
る。さらに、これらは高収率で精製され得、そして少なくともある精製および貯
蔵条件下において、対応する天然のポリペプチドよりもより良い可溶度を示す。
例えば、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは成熟型の分泌タンパク質を含
む多くのタンパク質について、生物学的な機能の実質的な損失なしにＮ末端また
はＣ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失させ得ることが、当該分野において公知
である。例えば、Ｒｏｎおよび同僚（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８
４−２９８８（１９９３））は、３、８、または２７個のＮ末端アミノ酸残基が
欠失した場合でさえ、ヘパリン結合活性を有した改変ＫＧＦタンパク質を報告し
た。To improve or alter the characteristics of a Brainiac-5 polypeptide,
Protein engineering can be used. Recombinant DNA techniques known to those of skill in the art can be used to generate novel mutant polypeptides or muteins containing single or multiple amino acid substitutions, deletions, additions or fusion polypeptides. Such modified polypeptides can exhibit, for example, enhanced activity or increased stability. In addition, they can be purified in high yields and show, at least under certain purification and storage conditions, better solubility than the corresponding native polypeptide.
For example, for many proteins, including the extracellular domain of a membrane-bound protein or the secreted protein in the mature form, one or more amino acids may be deleted from the N- or C-terminus without substantial loss of biological function Is known in the art. For example, Ron and colleagues (J. Biol. Chem. 268: 298).
4-2988 (1993)) reported a modified KGF protein that had heparin binding activity even when 3, 8, or 27 N-terminal amino acid residues were deleted.

【０１５８】 今回の場合、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドがＢｒａｉｎｉａｃ
ポリペプチドファミリーのメンバーであるので、配列番号２の８位のアルギニン
残基までのＮ末端アミノ酸の欠失は、細胞の増殖および分化を調節する能力のよ
うな、いくらかの生物学的活性を保持し得る。配列番号２のアルギニン−８残基
を含むさらなるＮ末端の欠失を有するポリペプチドは、このような生物学的活性
を保持しなくてもよか、または変化した生物学的活性を示し得る。なぜなら、Ｂ
ｒａｉｎｉａｃ関連ポリペプチドにおけるこの残基は、生物学的活性に必要とさ
れると考えられている保存ドメインの始まりであることが、公知であるからであ
る。In this case, the Brainiac-5 polypeptide of the invention is Brainiac
Being a member of the polypeptide family, deletion of the N-terminal amino acid up to the arginine residue at position 8 of SEQ ID NO: 2 retains some biological activity, such as the ability to regulate cell growth and differentiation I can do it. A polypeptide having an additional N-terminal deletion comprising the arginine-8 residue of SEQ ID NO: 2 may not retain such biological activity or may exhibit altered biological activity. Because B
This residue in the rainiac-related polypeptide is known to be the beginning of a conserved domain that is believed to be required for biological activity.

【０１５９】 しかし、たとえタンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、その
タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じるとしても、他の
生物学的活性はなお保持され得る。従って、短縮化されたポリペプチドが、その
ポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導する能力および／
またはその抗体に結合する能力は、そのポリペプチドの完全形態または成熟形態
の残基の大部分より少ない残基がＮ末端から除去された場合には、一般的に保持
される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのよう
な免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、お
よびそうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって、容易に決定
され得る。However, even though deletion of one or more amino acids from the N-terminus of a protein results in alteration or loss of one or more biological functions of the protein, other biological activities still remain. Can be retained. Thus, the ability of the truncated polypeptide to induce antibodies that recognize the complete or mature form of the polypeptide and / or
Alternatively, the ability to bind to the antibody is generally retained when fewer than most of the residues in the complete or mature form of the polypeptide have been removed from the N-terminus. Whether a particular polypeptide lacking the N-terminal residue of an intact polypeptide retains such immunological activity can be determined by conventional methods described herein, It can be readily determined by conventional methods known in the art.

【０１６０】 従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペ
プチドのアミノ酸配列のアミノ末端から８位のアルギニン残基まで１つ以上の欠
失した残基を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを提供する。特に、特に本発明は、配列番号２の残基ｎ¹〜２
７８のアミノ酸配列を含むか、またはその代わりにこのアミノ酸配列からなるポ
リペプチドを提供し、ここでｎ¹は１〜８の範囲の整数であり、そして９は、Ｂ
ｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの細胞増殖および分化活性の調節のために必要
であると考えられている完全なＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド（配列番号２
に示される）のＮ末端からの最初の残基の位置である。Accordingly, the present invention further provides a polypeptide having one or more deleted residues from the amino terminus to the arginine residue at position 8 of the amino acid sequence of the Brainiac-5 polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2, and Polynucleotides encoding such polypeptides are provided. In particular, In particular, the present invention, the SEQ ID NO: 2 residues n ¹ to 2
There is provided a polypeptide comprising or alternatively consisting of 78 amino acid sequences, wherein n ¹ is an integer in the range of 1-8 and 9 is B
The complete Brainiac-5 polypeptide (SEQ ID NO: 2) which is believed to be necessary for the regulation of cell growth and differentiation activity of the Rainiac-5 polypeptide
) Is the position of the first residue from the N-terminus.

【０１６１】 より詳細には、本発明は、残基１〜２７８；２〜２７８；３〜２７８；４〜２
７８；５〜２７８；６〜２７８；７〜２７８または８〜２７８として配列番号２
に示されたアミノ酸配列を有する（すなわち、このアミノ酸配列を含むか、また
はその代わりにこのアミノ酸配列からなる）ポリペプチドをコードする核酸分子
を提供する。本願はまた、上記のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％
または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはその代わりにこ
のポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌ
クレオチド配列に融合した上記の核酸分子配列を含む。これらの核酸分子によっ
てコードされるポリペプチドもまた提供される。More particularly, the present invention provides a method for treating residues 1-278; 2-278; 3-278;
78; 5-278; 6-278; 7-278 or 8-278 as SEQ ID NO: 2
A nucleic acid molecule encoding a polypeptide having the amino acid sequence shown in (i.e., comprising or alternatively consisting of this amino acid sequence). The present application also provides that the polynucleotide sequence encoding the Brainiac-5 polypeptide described above contains at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%
Or a nucleic acid molecule comprising or alternatively consisting of a polynucleotide sequence that is 99% identical. The invention also includes the nucleic acid molecule sequences described above fused to a heterologous polynucleotide sequence. Polypeptides encoded by these nucleic acid molecules are also provided.

【０１６２】 同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失ムテインの多くの例が公知である。例
えば、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個
のアミノ酸残基を欠失することによって、１０倍までのより高い活性を示す（Ｄ
ｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８
８））。[0162] Similarly, many examples of biologically functional C-terminally deleted muteins are known. For example, interferon gamma shows up to 10-fold higher activity by deleting 8-10 amino acid residues from the carboxy terminus of this protein (D
obeli et al. Biotechnology 7: 199-216 (198
8)).

【０１６３】 この場合、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドがＢｒａｉｎｉａｃポ
リペプチドファミリーのメンバーであるので、配列番号２の２６３位のシステイ
ンまでのＣ末端アミノ酸の欠失は、いくらかの生物学的活性（例えば、細胞増殖
および分化を調節し得る能力）を保持し得る。配列番号２の２６３位のシステイ
ン残基を含む、さらなるＣ末端欠失を有するポリペプチドは、このような生物学
的活性を保持しないかもしれない。なぜなら、この残基は、生物学的活性のため
に必要な保存ドメインの始まりだからである。In this case, since the Brainiac-5 polypeptide of the invention is a member of the Brainiac polypeptide family, deletion of the C-terminal amino acid up to cysteine at position 263 of SEQ ID NO: 2 may result in some biological activity ( For example, the ability to regulate cell growth and differentiation). A polypeptide having an additional C-terminal deletion comprising a cysteine residue at position 263 of SEQ ID NO: 2 may not retain such biological activity. Because this residue is the beginning of a conserved domain required for biological activity.

【０１６４】 しかし、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質
の１つ以上の生物学的機能の損失である改変を生じるとしても、他の生物学的活
性はなお保持され得る。従って、短縮化されたタンパク質が、完全形態または成
熟形態のポリペプチドを認識する抗体を誘導する能力、および／またはその抗体
に結合する能力は、完全形態または成熟形態のポリペプチドの大部分より少ない
残基が、Ｃ末端から除去された場合には、一般的に保持される。完全なタンパク
質のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫原性活性を保持す
るかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法およびそうでなければ当該
分野において公知の方法によって、容易に決定され得る。However, even though deletion of one or more amino acids from the C-terminus of the protein results in a modification that is a loss of one or more biological functions of the protein, other biological activities are still retained. Can be done. Accordingly, the ability of the truncated protein to induce and / or bind to an antibody that recognizes the intact or mature form of the polypeptide is less than most of the intact or mature form of the polypeptide. If the residue is removed from the C-terminus, it will generally be retained. Whether a particular polypeptide lacking the C-terminal residue of an intact protein retains such immunogenic activity will depend on conventional methods described herein and otherwise in the art. It can be easily determined by known methods.

【０１６５】 従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペ
プチドのカルボキシ末端から配列番号２の２６３位のシステイン残基までの、１
つ以上の残基を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを提供する。特に本発明は、配列番号２におけるアミノ酸配
列の残基１〜ｍ¹のアミノ酸配列を有する（すなわち、このアミノ酸配列を含む
か、またはその代わりにこのアミノ酸配列からなる）ポリペプチドを提供し、こ
こでｍ¹は２６３〜２７８の範囲の任意の整数であり、そして残基２６２は、Ｂ
ｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの細胞増殖および分化調節的活性のために必要
とされると考えられる、完全Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド（配列番号２に
示される）のＣ末端からの最初の残基の位置である。Accordingly, the present invention further provides a 1-amino acid sequence from the carboxy terminus of the Brainiac-5 polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2 to the cysteine residue at position 263 of SEQ ID NO: 2.
Provided are polypeptides having one or more residues, and polynucleotides encoding such polypeptides. In particular, the present invention provides a polypeptide having the amino acid sequence of residues ¹ to m1 of the amino acid sequence in SEQ ID NO: 2 (ie, comprising or alternatively consisting of this amino acid sequence), wherein Where m ¹ is any integer in the range of 263 to 278, and residue 262 is B
At the position of the first residue from the C-terminus of the complete Brainiac-5 polypeptide (shown in SEQ ID NO: 2), which is thought to be required for the cell growth and differentiation regulatory activity of the rainiac-5 polypeptide is there.

【０１６６】 より詳細には、本発明は、残基１〜２７８；１〜２７７；１〜２７６；１〜２
７５；１〜２７４；１〜２７３；１〜２７２；１〜２７１；１〜２７０；１〜２
６９；１〜２６８；１〜２６７；１〜２６６；１〜２６５；１〜２６４；または
１〜２６３として配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する（すなわち、この
アミノ酸配列を含むか、またはその代わりにこのアミノ酸配列からなる）ポリペ
プチドをコードする核酸分子を提供する。本願はまた、上記のＢｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９５
％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含
むか、またはその代わりにこのポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する
。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合した上記のポリヌクレオチド
配列も含む。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた提供さ
れる。More particularly, the present invention provides a method comprising the steps of: residues 1-278; 1-277; 1-276; 1-2.
75; 1-274; 1-273; 1-272; 1-271; 1-270; 1-2
Or 263; 1-265; 1-265; 1-264; or 1-263 (i.e., including or comprising this amino acid sequence). Alternatively, a nucleic acid molecule encoding the polypeptide (consisting of this amino acid sequence) is provided. The present application also relates to the above Brainiac.
At least 90%, 95% in the polynucleotide sequence encoding the -5 polypeptide;
%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to a polynucleotide sequence comprising, or alternatively consisting of, a polynucleotide sequence. The invention also includes the above polynucleotide sequences fused to a heterologous polynucleotide sequence. Polypeptides encoded by these nucleic acid molecules are also provided.

【０１６７】 本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１つ以上のアミノ
酸欠失を有する（すなわち、このアミノ酸欠失を含むか、またはその代わりにこ
のアミノ酸欠失からなる）ポリペプチドをコードする核酸分子を提供し、これは
、配列番号２の残基ｎ¹−ｍ²（ここで、ｎ¹およびｍ²は、上記のような整数であ
る）を有するとして一般的に記載され得る（例えば、配列番号２のアミノ酸８〜
２６３を含むか、またはその代わりに配列番号２のアミノ酸８〜２６３からなる
ポリペプチド）。本願はまた、上記のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９
８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはその代わり
にこのポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポ
リヌクレオチド配列に融合した上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらの核
酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって含まれる。The present invention also provides polypeptides having one or more amino acid deletions from both the amino and carboxy termini (ie comprising or alternatively consisting of the amino acid deletion). providing a nucleic acid molecule encoding, which is (here, n ¹ and m ² are integers which as described above) SEQ ID NO: 2 residues n ¹ -m ² may be generally described as having a (For example, amino acids 8 to
A polypeptide comprising or alternatively consisting of amino acids 8-263 of SEQ ID NO: 2). The present application also provides that the polynucleotide sequence encoding a Brainiac-5 polypeptide described above contains at least 90%, 95%, 96%, 97%, 9%
A nucleic acid molecule comprising, or alternatively consisting of, a polynucleotide sequence that is 8% or 99% identical. The invention also includes the above polynucleotide sequences fused to a heterologous polynucleotide sequence. The polypeptides encoded by these nucleic acid molecules are also included by the present invention.

【０１６８】 ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされ
る完全Ｂｒａｉｎｉａｃ−５アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列もまた含まれ、ここで、この部分は、ＡＴＣＣ受託番号２
０３５７２に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる完全アミノ酸配列の
アミノ末端から１〜約７の任意の整数のアミノ酸を除外するか、またはＡＴＣＣ
受託番号２０３５７２に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる完全アミ
ノ酸配列のカルボキシ末端から１〜約１５の任意の整数のアミノ酸を除外するか
、またはＡＴＣＣ受託番号２０３５７２に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
ドされる完全アミノ酸配列の上記アミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任
意の組合せを除外する。この文脈において「約」は、列挙された値ならびにいく
つかの数、少しの数、小さい数、５、４、３、２または１だけ、長いかまたは短
い値のことを意味する。Also included is a nucleotide sequence that encodes a polypeptide consisting of a portion of the complete Brainiac-5 amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 203572, wherein this portion comprises ATCC Accession No. 2
03572, by removing any integer from 1 to about 7 amino acids from the amino terminus of the complete amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in ATCC
Either remove any integer from 1 to about 15 amino acids from the carboxy terminus of the complete amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in Accession No. 203572, or the complete amino acid encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 203572 Any combination of the above amino and carboxy terminal deletions of the sequence is excluded. "About" in this context means the recited value as well as some numbers, small numbers, small numbers, 5, 4, 3, 2, or 1, long or short values.

【０１６９】 上記で言及したように、タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、タンパク質の１つ以上の機能的活性の損失である改変を生じるとしても（例
えば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化、タンパク質−タンパク質相互作用
の媒介（例えば、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５とＳｕ（Ｈ）もしくはＳｕ（Ｈ）のヒト
ホモログとの間）、および／またはＢｒａｉｎｉａｃ−５に対して特異的な抗体
の結合）、他の機能的活性および／または生物学的活性はなお保持され得る。従
って、短縮化されたＢｒａｉｎｉａｃ−５ムテインが完全形態または成熟形態の
ポリペプチドを認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、完全または
成熟なポリペプチドの残基の大部分より少ない残基が、Ｎ末端から除去された場
合には、一般的に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポ
リペプチドが、このような免疫性活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載
される慣用的な方法およびそうでなければ当該分野において公知の方法によって
、容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有するＢｒａｉｎ
ｉａｃ−５ムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得
るようである。実際、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５の６アミノ酸残基と同じくらいわず
かなアミノ酸残基からなるペプチドが、しばしば、免疫応答を引き起こし得る。As mentioned above, even though deletion of one or more amino acids from the N-terminus of a protein results in an alteration that is a loss of one or more functional activities of the protein (eg, Notch signaling) Activation of the pathway, mediating protein-protein interactions (eg, between Brainiac-5 and Su (H) or a human homolog of Su (H)), and / or binding of antibodies specific for Brainiac-5 ), Other functional and / or biological activities may still be retained. Thus, the ability of a truncated Brainiac-5 mutein to induce and / or bind an antibody that recognizes the full or mature form of the polypeptide is less than most of the residues of the full or mature polypeptide. , Is generally retained when removed from the N-terminus. Whether a particular polypeptide lacking the N-terminal residue of an intact polypeptide will retain such immunological activity will depend on routine methods described herein and otherwise in the art. It can be easily determined by known methods. Brain with multiple deleted N-terminal amino acid residues
Iac-5 muteins appear to be able to retain some biological or immunogenic activity. In fact, peptides consisting of as few as six amino acid residues of Brainiac-5 can often elicit an immune response.

【０１７０】 従って、本発明はさらに、図１Ａおよび図１Ｂ（すなわち、配列番号２）に示
されるＢｒａｉｎｉａｃ−５のアミノ酸配列のアミノ末端から２７３位のプロリ
ン残基までの、１つ以上の欠失した残基を有するポリペプチド、およびこのよう
なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に本発明は、図１
Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の残基ｎ²〜２７８のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドを提供し、ここでｎ²は２〜２７３の範囲の整数であり、そして２７３は、
Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの少なくとも免疫原性活性に必要とされると
考えられる、完全Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのＮ末端からの最初の残基
の位置である。Thus, the present invention further provides one or more deletions from the amino terminus of the amino acid sequence of Brainiac-5 to the proline residue at position 273 shown in FIGS. 1A and 1B (ie, SEQ ID NO: 2). Provided are polypeptides having the defined residues, and polynucleotides encoding such polypeptides. In particular, the present invention is illustrated in FIG.
A polypeptide comprising the amino acid sequence of residues n ^{2 to} 278 of A and 1B (SEQ ID NO: 2), wherein n ² is an integer in the range of 2-273, and 273 is
The position of the first residue from the N-terminus of the complete Brainiac-5 polypeptide, which is considered to be required for at least the immunogenic activity of the Brainiac-5 polypeptide.

【０１７１】 より詳細には、本発明は、図Ａおよび図Ｂ（配列番号２）に示されるＢｒａｉ
ｎｉａｃ−５配列の以下の残基：More particularly, the present invention relates to the Brai shown in FIGS. A and B (SEQ ID NO: 2).
The following residues of the niac-5 sequence:

【０１７２】[0172]

【化２】 のアミノ酸配列を含むか、またはその代わりにこのアミノ酸配列からなるポリペ
プチドをコードする核酸分子を提供する。本願はまた、上記のＢｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９２
％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド
配列を含むか、またはその代わりにこのポリヌクレオチド配列からなる核酸分子
に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合した上記のポリヌク
レオチド配列を含む。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもま
た、本発明によって含まれる。Embedded image Or a nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising or alternatively consisting of the amino acid sequence of The present application also relates to the above Brainiac.
At least 90%, 92% in the polynucleotide sequence encoding the -5 polypeptide;
%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to a polynucleotide sequence comprising, or alternatively consisting of, a polynucleotide sequence. The invention also includes the above polynucleotide sequences fused to a heterologous polynucleotide sequence. The polypeptides encoded by these nucleic acid molecules are also included by the present invention.

【０１７３】 また、上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が
、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失である改変を生じるとしても、他
の生物学的活性はなお保持され得る。従って、短縮化されたＢｒａｉｎｉａｃ−
５ムテインがポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導する
能力および／またはこの抗体に結合する能力は、完全ポリペプチドまたは成熟ポ
リペプチドの残基の大部分より少ない残基が、Ｃ末端から除去された場合には、
一般的に保持される。完全なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチ
ドが、このような免疫性活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される慣
用的な方法およびそうでなければ当該分野において公知の方法によって、容易に
決定され得る。多数の欠失したＣ末端アミノ酸残基を有するＢｒａｉｎｉａｃ−
５ムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得るようで
ある。実際、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５の６アミノ酸残基と同じくらいわずかなアミ
ノ酸残基からなるペプチドが、しばしば、免疫応答を引き起こし得る。Also, as described above, the deletion of one or more amino acids from the C-terminus of a protein results in an alteration that results in a loss of one or more biological functions of the protein, but not other biological Activity can still be retained. Therefore, shortened Brainiac-
The ability of a 5 mutein to induce and / or bind to an antibody that recognizes the complete or mature form of the polypeptide is less than most of the residues of the complete or mature polypeptide, If removed from the end,
Generally retained. Whether a particular polypeptide lacking the C-terminal residue of an intact polypeptide retains such immunological activity will depend on conventional methods described herein and otherwise in the art. It can be easily determined by known methods. Brainiac- having a number of deleted C-terminal amino acid residues
5 muteins appear to be able to retain some biological or immunogenic activity. In fact, peptides consisting of as few as six amino acid residues of Brainiac-5 can often elicit an immune response.

【０１７４】 従って、本発明はさらに、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）に示されるＢｒ
ａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのアミノ酸配列のカルボキシ末端から６位のグル
タミン残基までの、１つ以上の欠失した残基を有するポリペプチド、およびこの
ようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に本発明は、
図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の残基１〜ｍ²のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドを提供し、ここでｍ²は６〜２７８の範囲の整数であり、そして６は、Ｂｒ
ａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの免疫原性活性に少なくとも必要とされると考え
られる、完全Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのＣ末端からの最初の残基の位
置である。Thus, the present invention further relates to the Br shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 2).
Polypeptides having one or more deleted residues from the carboxy terminus of the amino acid-5 polypeptide to the glutamine residue at position 6 and polynucleotides encoding such polypeptides are provided. In particular, the present invention
Providing a polypeptide comprising an amino acid sequence of residues 1 to m ² of Figure 1A and 1B (SEQ ID NO: 2), where m ² is an integer in the range of 6-278, and 6, Br
The position of the first residue from the C-terminus of the complete Brainiac-5 polypeptide, which is thought to be at least required for the immunogenic activity of the ainiac-5 polypeptide.

【０１７５】 より詳細には、本発明は、図Ａおよび図Ｂ（配列番号２）に示されるＢｒａｉ
ｎｉａｃ−５の配列の以下の残基：More particularly, the present invention relates to the Brai shown in FIGS. A and B (SEQ ID NO: 2).
The following residues in the sequence of niac-5:

【０１７６】[0176]

【化３】 のアミノ酸配列を含むか、またはその代わりにこのアミノ酸配列からなるポリペ
プチドをコードする核酸分子を提供する。本願はまた、上記のＢｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９２
％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド
配列を含むか、またはその代わりにこのポリヌクレオチド配列からなる核酸分子
に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合した上記のポリヌク
レオチド配列を含む。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもま
た、提供される。Embedded image Or a nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising or alternatively consisting of the amino acid sequence of The present application also relates to the above Brainiac.
At least 90%, 92% in the polynucleotide sequence encoding the -5 polypeptide;
%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to a polynucleotide sequence comprising, or alternatively consisting of, a polynucleotide sequence. The invention also includes the above polynucleotide sequences fused to a heterologous polynucleotide sequence. Polypeptides encoded by these nucleic acid molecules are also provided.

【０１７７】 本発明はまた、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのアミノ末端およびカルボ
キシ末端の両方から１つ以上のアミノ酸欠失を有する（すなわち、このアミノ酸
欠失を含むか、またはその代わりにこのアミノ酸欠失からなる）ポリペプチドを
コードする核酸分子を提供し、これは、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）の残
基ｎ²−ｍ²（ここで、ｎ²およびｍ²は、上記のような整数）を有するとして一般
的に記載され得る。本願はまた、上記のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、
９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、または
このその代わりにポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はま
た、異種ポリヌクレオチド配列に融合した上記のポリヌクレオチド配列を含む。
これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって提
供される。The present invention also has one or more amino acid deletions from both the amino and carboxy termini of the Brainiac-5 polypeptide (ie, includes or instead includes this amino acid deletion). A nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the residues n ² -m ^{2 of} FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 2), wherein n ² and m ² are as defined above. (Integer). The present application also provides that the polynucleotide sequence encoding the Brainiac-5 polypeptide described above has at least 90%, 92%, 95%, 96%,
A nucleic acid molecule comprising a polynucleotide sequence that is 97%, 98% or 99% identical, or alternatively consisting of a polynucleotide sequence. The invention also includes the above polynucleotide sequences fused to a heterologous polynucleotide sequence.
The polypeptides encoded by these nucleic acid molecules are also provided by the present invention.

【０１７８】 上記で考察したタンパク質の末端欠失形態に加えて、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポ
リペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能の有意な
影響を伴わずに変動され得ることもまた、当業者によって認識される。配列にお
けるそのような差異が意図される場合には、活性を決定する重要な領域がタンパ
ク質上に存在することを記憶すべきである。In addition to the truncated forms of the proteins discussed above, it is also noted that some amino acid sequences of Brainiac-5 polypeptides can be varied without significant effect on protein structure or function. Recognized by those skilled in the art. If such differences in sequence are intended, it should be remembered that the critical regions determining activity are present on the protein.

【０１７９】 従って、本発明はさらに、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリぺプチドの変異体（ｖａ
ｒｉａｔｉｏｎ）を含み、これらのポリぺプチドの変異体は、実質的なＢｒａｉ
ｎｉａｃ−５ポリペプチド活性を示すか、または以下に考察されるポリペプチド
の部分のようなＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの領域を含む。このような変
異体としては、活性に対してほとんど影響を有さないように当該分野において公
知の通則に従って選択される欠失、挿入、逆位、反復、および型置換（ｔｙｐｅ
ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）が挙げられる。例えば、表現型的にサイレントな
アミノ酸置換を作製する方法に関する手引きが提供され、ここで筆者らは、変換
に対するアミノ酸配列の許容性を研究するために、２つの主なアプローチが存在
することを示している（Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１
３０６−１３１０（１９９０））。第１の方法は、進化のプロセスに依存し、こ
のプロセスにおいて変異は、自然選択によって受容されるかまたは拒絶されるか
のいずれかである。第２のアプローチは、クローン化された遺伝子の特定の位置
でアミノ酸変換を導入するための遺伝子操作、および機能性を維持する配列を同
定するための選択またはスクリーニングを使用する。Thus, the present invention further provides variants of Brainiac-5 polypeptides (va
mutations of these polypeptides are substantially Brai
It includes a region of the Brainiac-5 polypeptide that exhibits niac-5 polypeptide activity or such a portion of the polypeptide discussed below. Such variants include deletions, insertions, inversions, repeats, and type substitutions (types) that are selected according to conventions known in the art such that they have little effect on activity.
Substitution). For example, guidance is provided on how to make phenotypically silent amino acid substitutions, where we show that there are two main approaches to study the permissiveness of amino acid sequences for conversion. (Bowie, JU et al., Science 247: 1).
306-1310 (1990)). The first method relies on the process of evolution, in which mutations are either accepted or rejected by natural selection. The second approach uses genetic engineering to introduce amino acid changes at specific positions in the cloned gene, and selection or screening to identify sequences that maintain functionality.

【０１８０】 その筆者らが述べているように、これらの研究により、驚くほどにタンパク質
がアミノ酸置換に許容性であることが明らかにされた。この著者らはさらに、ど
のアミノ酸変換が、タンパク質の特定のアミノ酸位置で許容性であるようである
かを示している。例えば、最も埋没したアミノ酸残基は非極性の側鎖を必要とす
るが、表面の側鎖の特徴は一般的にほとんど保存されない。他のこのような表現
型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅおよび共同研究者（前出）およびその中
で引用された参考文献に記載されている。保存的置換として代表的にみなされて
いるのは、脂肪族アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間での
互いの置換；ヒドロキシル残基であるＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基であ
るＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基であるＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、
塩基性残基のＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基であるＰｈｅ、Ｔ
ｙｒの間の置換である。As the authors state, these studies have revealed that proteins are surprisingly tolerant of amino acid substitutions. The authors further indicate which amino acid changes appear to be permissive at particular amino acid positions in the protein. For example, the most buried amino acid residues require non-polar side chains, but surface side chain characteristics are generally poorly preserved. Other such phenotypically silent substitutions are described in Bowie and co-workers (supra) and the references cited therein. Typically regarded as conservative substitutions are substitutions between the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu and Ile; exchanges of the hydroxyl residues Ser and Thr, acidic residues. Exchange of Asp and Glu, substitution between the amide residues Asn and Gln,
Exchange of Lys and Arg for basic residues and aromatic residues Phe, T
substitution between yr.

【０１８１】 従って、配列番号２のポリペプチドのフラグメント、誘導体、もしくはアナロ
グ、または寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体、もしくはアナログは、以下であり得る：（ｉ）１つ以上のアミノ酸
残基が、保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基
）で置換されているものであり、そしてこのような置換アミノ酸残基は、遺伝暗
号によりコードされるものであってもそうでなくてもよいもの、または（ｉｉ）
１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）その上、Ｂｒａ
ｉｎｉａｃ−５成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させるための
化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合されてい
るもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域のペプチド
配列またはリーダー配列または分泌配列あるいはポリペプチドまたはプロタンパ
ク質配列の上記の形態の精製に使用される配列のようなポリペプチドの上記の形
態に融合されているもの。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは
、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。Accordingly, a fragment, derivative, or analog of the polypeptide of SEQ ID NO: 2, or a fragment, derivative, or analog of the polypeptide encoded by the deposited cDNA may be: (i) one or more Has been replaced with a conservative or non-conservative amino acid residue (preferably a conservative amino acid residue), and such a substituted amino acid residue is encoded by the genetic code. Or not, or (ii)
Wherein one or more of the amino acid residues comprises a substituent, or (iii)
The iniac-5 mature polypeptide is fused to another compound, such as a compound to increase the half-life of the polypeptide (eg, polyethylene glycol), or (iv) an additional amino acid is an IgG Fc fusion region. Fused to the above-mentioned form of a polypeptide, such as a peptide sequence or leader sequence or secretory sequence or a sequence used for purification of the above-mentioned form of a polypeptide or proprotein sequence. Such fragments, derivatives, and analogs are considered to be within the skill of the art in light of the teachings herein.

【０１８２】 従って、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、天然の変異または人
為的操作のいずれかに由来する、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加
を含み得る。示されるように、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意に影響し
ない保存性アミノ酸置換のような、小さな性質の変化が好ましい（表ＩＩを参照
のこと）。Accordingly, Brainiac-5 polypeptides of the invention may contain one or more amino acid substitutions, deletions or additions, either from natural mutations or manipulations. As shown, changes in small properties are preferred, such as conservative amino acid substitutions that do not significantly affect the folding or activity of the protein (see Table II).

【０１８３】[0183]

【表２】 機能に必須である、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドにおけるアミ
ノ酸を、当該分野において公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラ
ニンスキャニング変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ）（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
４：１０８１−１０８５（１９８９）））により同定し得る。後者の手順は、分
子内の全ての残基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、生じた変異分子を
、生物学的活性（例えば、レセプター結合活性またはインビトロ増殖活性）につ
いて試験する。[Table 2] Amino acids in the Brainiac-5 polypeptides of the invention, which are essential for function, can be substituted by methods known in the art (eg, site-directed mutagenesis or alanine-scanning mutation).
ess) (Cunningham and Wells, Science 24)
4: 1081-1085 (1989))). The latter procedure introduces a single alanine mutation at every residue in the molecule. The resulting mutant molecules are then tested for biological activity (eg, receptor binding activity or in vitro proliferative activity).

【０１８４】 特に興味深いものは、荷電アミノ酸の他の荷電アミノ酸または中性アミノ酸で
の置換である。これは、非常に所望される改善された特徴（例えば、凝集化の低
減）を有するタンパク質を産生し得る。凝集化は、活性を低減させ得るだけでな
く、薬学的処方物を調製する場合にも問題であり得る。なぜなら、凝集体は、免
疫原性であり得るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． ２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅ
ｔｅｓ ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒ
ｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ
１０：３０７−３７７（１９９３））。Of particular interest is the substitution of charged amino acids for other charged or neutral amino acids. This can produce a protein with highly desirable improved characteristics (eg, reduced aggregation). Aggregation can not only reduce activity, but can also be a problem when preparing pharmaceutical formulations. Because aggregates can be immunogenic (Pinkard et al., Clin. Exp. Imm.
unol. 2: 331-340 (1967); Robbins et al., Diabe.
tes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. R
ev. Therapeutic Drug Carrier Systems
10: 307-377 (1993)).

【０１８５】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへのリガンドの結合の選択性を変
化させ得る（例えば、Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２６８
（１９９３）は、２つの既知の型のＴＮＦレセプターのうちの１つのみへのＴＮ
Ｆ−αの選択的結合を生じる特定の変異を記載している）。リガンド−レセプタ
ー結合のために重要な部位をまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識の
ような構造分析により決定し得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２
２４：８９９−９０４（１９９２）；ｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５
：３０６−３１２（１９９２））。[0185] Amino acid substitutions can also alter the selectivity of binding of a ligand to a cell surface receptor (eg, Ostade et al., Nature 361: 266-268).
(1993) describe TN access to only one of the two known types of TNF receptors.
Specific mutations resulting in selective binding of F-α have been described). Sites important for ligand-receptor binding may also be determined by structural analysis such as crystallization, nuclear magnetic resonance, or photoaffinity labeling (Smith et al., J. Mol. Biol. 2
24: 899-904 (1992); de Vos et al., Science 255.
: 306-312 (1992)).

【０１８６】 従って、本発明はまた、選択された宿主細胞における、発現、スケールアップ
などのためにより良く適合されたＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを産生する
ために欠失、付加、または置換された１つ以上のアミノ酸残基を有するＢｒａｉ
ｎｉａｃ−５の誘導体およびアナログを含む。例えば、ジスルフィド架橋を排除
するために、システイン残基を欠失させ得るか、または別のアミノ酸残基と置換
し得；Ｎ結合型グリコシル化部位は、例えば、Ｎ結合部位を高グリコシル化する
ことが公知である酵母宿主からより容易に回収および精製される均質な生成物の
発現を達成するために、改変または排除され得る。この目的のために、本発明の
Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドにおける任意の１つ以上のグリコシル化認識
配列上の第１アミノ酸位置または第３アミノ酸位置の１つまたは両方での種々の
アミノ酸置換、および／または任意の１つ以上のこのような認識配列の第２の位
置でのアミノ酸欠失は、改変されたトリペプチド配列でＢｒａｉｎｉａｃ−５の
グリコシル化を防止する（例えば、Ｍｉｙａｊｉｍｏら、ＥＭＢＯ Ｊ ５（６
）：１１９３−１１９７を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドの１つ
以上のアミノ酸残基（例えば、アルギニン残基およびリジン残基）は、プロテア
ーゼ（例えば、フューリンまたはケキシンのような）による所望しないプロセシ
ングを排除するために、欠失され得るかまたは別の残基と置換され得る。Thus, the present invention also provides a method for producing a Brainiac-5 polypeptide that has been deleted, added, or substituted in a selected host cell to produce a Brainiac-5 polypeptide that is better adapted for expression, scale-up, etc. Brai having the above amino acid residues
Includes derivatives and analogs of niac-5. For example, a cysteine residue may be deleted or replaced with another amino acid residue to eliminate disulfide bridges; an N-linked glycosylation site may be, for example, hyperglycosylated at the N-linked site. Can be modified or eliminated to achieve expression of a homogenous product that is more easily recovered and purified from yeast hosts in which it is known. To this end, various amino acid substitutions at one or both of the first or third amino acid positions on any one or more of the glycosylation recognition sequences in the Brainiac-5 polypeptide of the invention, and / or Alternatively, the amino acid deletion at the second position of any one or more of such recognition sequences prevents the glycosylation of Brainiac-5 at the modified tripeptide sequence (eg, Miyajimo et al., EMBO J5 ( 6
): 1193-1197). In addition, one or more amino acid residues (eg, arginine and lysine residues) of a polypeptide of the invention may be missing in order to eliminate unwanted processing by a protease (eg, furin or kexin). It can be lost or replaced with another residue.

【０１８７】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好
ましくは、実質的に精製される。組換え的に産生されたＢｒａｉｎｉａｃ−５ポ
リペプチドのバージョンを、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（Ｇｅｎｅ ６７
：３１−４０（１９８８））によって記載される一工程方法により実質的に精製
し得る。本発明のポリペプチドをまた、タンパク質精製の当該分野において周知
である方法において本発明の抗Ｂｒａｉｎｉａｃ−５抗体を用いて、天然の供給
源または組換え供給源から精製し得る。[0187] The polypeptides of the present invention are preferably provided in an isolated form, and preferably are substantially purified. Recombinantly produced Brainiac-5 polypeptide versions were purchased from Smith and Johnson (Gene 67).
: 31-40 (1988)). Polypeptides of the invention can also be purified from natural or recombinant sources using the anti-Brainiac-5 antibodies of the invention in methods well known in the art of protein purification.

【０１８８】 当業者に公知の組換えＤＮＡ技術（例えば、ＤＮＡシャッフリング（前述）を
参照のこと）は、１個または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加または融合タン
パク質を含む、新規の変異タンパク質またはムテインを生成するために使用され
得る。このような改変ポリペプチドは、例えば、増大した活性または増加した安
定性を示し得る。さらに、これらは、高収率で精製され得、そして、少なくとも
特定の精製および貯蔵条件下では、対応する天然のポリペプチドよりも向上した
溶解度を示し得る。Recombinant DNA techniques known to those of skill in the art (see, eg, DNA shuffling (supra)) are novel muteins, including one or more amino acid substitutions, deletions, additions or fusion proteins. Or it can be used to produce muteins. Such modified polypeptides can exhibit, for example, increased activity or increased stability. In addition, they can be purified in high yield and, at least under certain purification and storage conditions, exhibit improved solubility over the corresponding native polypeptide.

【０１８９】 本発明はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または
これらからなる、単離されたＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを提供する：（
ａ）配列番号２に示される完全なアミノ酸配列（すなわち、配列番号２の１〜２
７８位）を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）Ａ
ＴＣＣ受託番号２０３５７２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコード化され
る、完全なアミノ酸配列；（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２に含まれるｃＤ
ＮＡクローンによってコードされる、推定成熟Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチ
ドの完全なアミノ酸配列。本発明のこのポリペプチドはまた、上記の（ａ）、（
ｂ）または（ｃ）に記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％同一、より好
ましくは、少なくとも９０％同一、そしてさらにより好ましくは、９２％、９５
％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、ならびに上記のアミノ酸と少なくとも９０％の類似性、そしてより好
ましくは、少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドを含む。The present invention also provides an isolated Brainiac-5 polypeptide comprising or consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of:
a) the complete amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (ie, 1-2 of SEQ ID NO: 2)
Amino acid sequence of Brainiac-5 polypeptide having position (78); (b) A
Complete amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in TCC Accession No. 203572; (c) cD contained in ATCC Accession No. 203572
Complete amino acid sequence of predicted mature Brainiac-5 polypeptide, encoded by NA clone. This polypeptide of the present invention also comprises the above (a), (
at least 80% identical to the amino acid sequence described in b) or (c), more preferably at least 90% identical, and even more preferably 92%, 95%
Polypeptides having an amino acid sequence that is at least 96%, 96%, 97%, 98% or 99% identical, and amino acid sequences having at least 90% similarity to the above amino acids, and more preferably at least 95% similarity And a polypeptide having the formula:

【０１９０】 さらに、本発明のポリペプチドは、上記のポリペプチドと、少なくとも９０％
の類似性、より好ましくは少なくとも９２％の類似性、より好ましくは少なくと
も９５％の類似性、そしてさらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９
８％または９９％の類似性を有する（すなわち、含むか、またはこれらからなる
）ポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドはまた、寄託されたｃＤＮＡによ
ってコードされたポリペプチドに対して、または配列番号２のポリペプチドに対
して、少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、９２％または
９５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９
９％同一であるポリペプチドを含み、そしてまた、少なくとも１５個のアミノ酸
、より好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくと
も４０個のアミノ酸、なおさらにより好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸、
なおより好ましくは少なくとも６０個のアミノ酸、なおさらにより好ましくは少
なくとも７５個のアミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。In addition, the polypeptides of the present invention may have at least 90%
, More preferably at least 92% similarity, more preferably at least 95% similarity, and even more preferably at least 96%, 97%, 9%
Include polypeptides having (ie, comprising or consisting of) 8% or 99% similarity. The polypeptide of the present invention may also be at least 80% identical to the polypeptide encoded by the deposited cDNA or to the polypeptide of SEQ ID NO: 2, more preferably at least 90%, 92% or 95%. Identical, even more preferably at least 96%, 97%, 98% or 9
A polypeptide comprising 9% identical, and also at least 15 amino acids, more preferably at least 30 amino acids, even more preferably at least 40 amino acids, even more preferably at least 50 amino acids,
Even more preferably, it comprises a portion of such a polypeptide having at least 60 amino acids, even more preferably at least 75 amino acids.

【０１９１】 本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むが
、５０個以下の保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは、４０個以下の保存
的アミノ酸置換、なおより好ましくは、３０個以下の保存的アミノ酸置換、そし
てなおさらにより好ましくは、２０個以下の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸
配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、ペプチ
ドまたはポリペプチドに関する。当然、増え続ける優先度の順で、少なくとも１
つ、ただし１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以
下、２以下または１以下の保存的アミノ酸置換を含むＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することが、ペプチドまたはポ
リペプチドにとって非常に好ましい。Further embodiments of the invention comprise at least one conservative amino acid substitution, but no more than 50 conservative amino acid substitutions, even more preferably, no more than 40 conservative amino acid substitutions, even more preferably, It relates to a peptide or polypeptide comprising the amino acid sequence of a Brainiac-5 polypeptide having an amino acid sequence comprising no more than 30 conservative amino acid substitutions, and even more preferably, no more than 20 conservative amino acid substitutions. Of course, in order of increasing priority, at least one
An amino acid comprising an amino acid sequence of a Brainiac-5 polypeptide comprising 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, 2 or less or 1 or less conservative amino acid substitution Having a sequence is highly preferred for peptides or polypeptides.

【０１９２】 本発明のポリペプチドフラグメントの代表例としては、例えば、およそのアミ
ノ酸番号１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０
１〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２０
０、２０１〜２２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２７８または
２６１から配列番号２のコード領域の最後まで、またはＢｒａｉｎｉａｃ−５を
発現する寄託されたｃＤＮＡクローンから発現されるポリペプチドまでのフラグ
メントが挙げられる。さらに、ポリペプチドフラグメントは、約２０、約３０、
約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１
２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９
０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０
または約２７０個のアミノ酸長であり得る。この状況において、「約」は、具体
的に列挙される範囲または値、およびいずれかの末端または両方の末端で、いく
つか（５、４、３、２、または１個）のアミノ酸より大きなまたはより小さな範
囲または値を含む。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列における少なくと
も約１０、約３０または約１００個の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９０
％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。Representative examples of the polypeptide fragment of the present invention include, for example, approximate amino acid numbers 1 to 20, 21 to 40, 41 to 60, 61 to 80, 81 to 100,
1-120, 121-140, 141-160, 161-180, 181-20
0, 201-220, 221-240, 241-260, 261-278 or 261 to the end of the coding region of SEQ ID NO: 2, or a polypeptide expressed from a deposited cDNA clone expressing Brainiac-5. Fragments. Further, the polypeptide fragment may comprise about 20, about 30,
About 40, about 50, about 60, about 70, about 80, about 90, about 100, about 110, about 1
20, about 130, about 140, about 150, about 160, about 170, about 180, about 19
0, about 200, about 210, about 220, about 230, about 240, about 250, about 260
Or it may be about 270 amino acids long. In this context, "about" refers to a specifically recited range or value, and greater or less than several (5, 4, 3, 2, or 1) amino acids at either or both termini Including smaller ranges or values. The present invention also relates to a sequence of at least about 10, about 30, or about 100 contiguous amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
Provided is an isolated polypeptide comprising a% identical amino acid sequence.

【０１９３】 ２つのポリペプチドについての「類似性％」とは、類似性決定について、Ｂｅ
ｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｕｎｉｘ（登録商標）バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７
１１）およびデフォルト設定を用いて、２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比
較することにより生成される類似性スコアを意図する。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍ
ｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍ
ａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９、１９８１）の局所相同性アルゴリ
ズムを用いて、２つの配列の間の類似性の最適セグメントを見出す。“% Similarity” for two polypeptides refers to Be for similarity determination.
stfit program (Wisconsin Sequence Analysis)
is Package, Unix® Version 8, Genetics
Computer Group, University Research
Park, 575 Science Drive, Madison, WI537
Using 11) and the default settings, we intend the similarity score generated by comparing the amino acid sequences of the two polypeptides. Bestfit is Sm
it and Waterman (Advances in Applied M
athematics 2: 482-489, 1981) to find the optimal segment of similarity between two sequences.

【０１９４】 本発明の１つの実施形態において、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの参照
アミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有す
るポリぺプチドとは、このポリペプチド配列がＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチ
ドの参照アミノ酸の各１００個のアミノ酸あたり５つまでのアミノ酸の変更を含
み得ることを除いて、このポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列に同一である
ことを意図する。換言すれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一である
アミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、この参照配列におけるアミノ
酸残基の５％までが、欠失または別のアミノ酸配列で置換され得るか、あるいは
参照配列における全アミノ酸残基の５％までの多くのアミノ酸が、参照配列に挿
入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしく
はカルボキシ末端の位置で生じ得るか、またはそれらの末端の位置の間のどこに
でも生じ得、参照配列中の残基間の個々に、または参照配列内の１つ以上の連続
する群においてのいずれかに、散在する。In one embodiment of the invention, a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95% “identical” to a reference amino acid sequence of a Brainiac-5 polypeptide, for example, is that the polypeptide sequence of the Brainiac-5 polypeptide is It is contemplated that the amino acid sequence of the polypeptide is identical to the reference sequence, except that it may include up to 5 amino acid changes for each 100 amino acids of the 5 polypeptide reference amino acids. In other words, to obtain a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95% identical to a reference amino acid sequence, up to 5% of the amino acid residues in the reference sequence can be deleted or replaced with another amino acid sequence. Alternatively, as many as 5% of all amino acid residues in the reference sequence can be inserted into the reference sequence. These alterations in the reference sequence can occur at amino- or carboxy-terminal positions of the reference amino acid sequence, or can occur anywhere between those terminal positions, individually between residues in the reference sequence, or Scattered anywhere in one or more contiguous groups within the reference sequence.

【０１９５】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、図１Ａおよび１Ｂ（
配列番号２）に示されるアミノ酸配列、寄託されたｃＤＮＡクローンＨＯＧＣＣ
４５、またはそのれらフラグメントによってコードされるアミノ酸配列に対して
、少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同
一であるか否かは、従来通りに、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂ
ｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｕｎｉｘ（登録商標）バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３
７１１））を使用して決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他の任意の配列整列
プログラムを用いて、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列に９５％同
一であるか否かを決定する場合、このパラメーターは、当然、同一性のパーセン
テージが、参照アミノ酸配列の全長にわたって算出され、そして参照配列におけ
るアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように
設定される。As a practical matter, any particular polypeptide can be used, for example, in FIGS. 1A and 1B (
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2), and the deposited cDNA clone HOGCC
45, or at least 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the amino acid sequence encoded by these fragments, Known computer programs (for example, B
estfit program (Wisconsin Sequence Analysis)
sis Package, Unix® version 8, Genetic
s Computer Group, University Research
Park, 575 Science Drive, Madison, WI53
711)). When using Bestfit or any other sequence alignment program to determine whether a particular sequence is 95% identical to, for example, a reference sequence according to the present invention, this parameter will, of course, be a percentage of identity. , Calculated over the entire length of the reference amino acid sequence, and set to allow for gaps in homology of up to 5% of the total number of amino acid residues in the reference sequence.

【０１９６】 特定の実施形態において、参照（問い合わせ）配列（本発明の配列）と対象配
列との間の同一性（全体的配列整列としても参照される）は、Ｂｒｕｔｌａｇら
（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアル
ゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される
。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは、Ｍａｔｒｉ
ｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１
、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒ
ｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓ
ｉｚｅ＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎ
ａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列
の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従って、対象配列が、内
部の欠失のためではなく、Ｎ末端欠失またはＣ末端欠失によって問い合わせ配列
よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定
する場合に、対象配列のＮ末端短縮およびＣ末端短縮を計算しないことを考慮す
るために、手動の補正が結果に対してなされる。問い合わせ配列に対して、Ｎ末
端およびＣ末端で短縮化される対象配列について、同一性パーセントは、問い合
わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列しない対
象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することに
よって補正される。残基が一致／整列されているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ
配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセンテージは、同一性パ
ーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメ
ーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。こ
の最終的な同一性パーセントのスコアは、この実施形態の目的に使用されるもの
である。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端
の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で考慮される。
すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最も遠いＮ末端残基およびＣ末端
残基の外側に位置する。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセ
ントを決定するために１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失は対象配
列のＮ末端で生じ、そしてそのためＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０
残基の一致／整列を示さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致して
いないＮ末端およびＣ末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表
し、その結果ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのス
コアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的
な同一性パーセントは９０％である。別の実施例において、９０残基の対象配列
が、１００残基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失で
あり、そのため問い合わせと一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端に
て残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセ
ントは、手動で補正されない。再度、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い
合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置の
みが手動で補正される。他の手動の補正は、この実施形態の目的のためにはなさ
れない。In certain embodiments, the identity (also referred to as an overall sequence alignment) between a reference (query) sequence (sequence of the invention) and a subject sequence is determined by Brutlag et al. (Comp. App. Biosci). .6: 237-245 (1990)). Preferred parameters used for FASTDB amino acid alignment are Matri
x = PAM 0, k-tuple = 2, Mismatch Penalty = 1
, Joining Penalty = 20, Randomization Gr
up Length = 0, Cutoff Score = 1, Window S
size = array length, Gap Penalty = 5, Gap Size Pen
alty = 0.05, Window Size = 500, or the length of the amino acid sequence of interest (whichever is shorter). According to this embodiment, if the subject sequence is shorter than the query sequence due to N-terminal or C-terminal deletions, rather than due to internal deletions, the FASTDB program will calculate the overall percent identity Manual corrections are made to the results to take into account not calculating the N-terminal and C-terminal truncations of the subject sequence. For subject sequences that are truncated at the N-terminus and C-terminus relative to the query sequence, the percent identity is expressed as the percentage of total bases in the query sequence as the percent of N-terminus and It is corrected by calculating the number of residues in the query sequence that are C-terminal. The determination of whether residues are matched / aligned is determined by FASTDB
Determined by the result of the sequence alignment. This percentage is then subtracted from the percent identity and calculated by the FASTDB program described above using the specified parameters to arrive at a final percent identity score. This final percent identity score is what is used for the purposes of this embodiment. Only N-terminal and C-terminal residues of the subject sequence that are not matched / aligned with the query sequence are considered for the purpose of manually adjusting the percent identity score.
That is, only the query residues are located outside the farthest N- and C-terminal residues of the subject sequence. For example, a 90 amino acid residue subject sequence is aligned with a 100 residue query sequence to determine percent identity. The deletion occurs at the N-terminus of the subject sequence, and so the FASTDB alignment is the first 10
No residue match / alignment is shown. The 10 unpaired residues represent 10% of the sequence (number of unmatched N- and C-terminal residues / total number of residues in the query sequence) and are therefore calculated by the FASTDB program. 10% is subtracted from the percent identity score. If the remaining 90 residues match exactly, the final percent identity is 90%. In another embodiment, a 90 residue subject sequence is compared to a 100 residue query sequence. In this case, the deletion is an internal deletion, so that there are no residues at the N-terminus or C-terminus of the subject sequence that do not match / align with the query. In this case, the percent identity calculated by FASTDB is not manually corrected. Again, only the residue positions outside the N- and C-termini of the subject sequence that do not match / align with the query sequence, as shown in the FASTDB alignment, are manually corrected. No other manual corrections are made for the purposes of this embodiment.

【０１９７】 本発明のポリペプチドは、例えば当業者に周知の方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲル上、または分子ふるいゲル濾過カラム上での分子量マーカーとして使用
され得る。The polypeptides of the present invention can be prepared, for example, using methods well known to those of skill in the art using SDS-PA.
It can be used as a molecular weight marker on GE gels or on molecular sieve gel filtration columns.

【０１９８】 以下に詳述される様に、本発明のポリペプチドはまた、ポリクローナル抗体お
よびモノクローナル抗体を惹起するために使用され得る。これらのポリクローナ
ル抗体およびモノクローナル抗体は、以下に記載のようにか、またはＢｒａｉｎ
ｉａｃ−５ポリペプチド機能を増強するかもしくは阻害し得るアゴニストおよび
アンタゴニストとして、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド発現の検出のための
アッセイとして有用である。さらに、このようなポリペプチドは、酵母ツーハイ
ブリッド系において使用され、本発明によるアゴニストおよびアンタゴニストの
候補でもあるＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド結合ポリペプチドを「捕獲」し
得る。この酵母ツーハイブリッド系はＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４０：２４５〜２４６（１９８９））に記載されている。As described in detail below, the polypeptides of the present invention can also be used to raise polyclonal and monoclonal antibodies. These polyclonal and monoclonal antibodies can be obtained as described below or
As agonists and antagonists that can enhance or inhibit iac-5 polypeptide function, they are useful as assays for detection of Brainiac-5 polypeptide expression. Further, such polypeptides can be used in a yeast two-hybrid system to "capture" Brainiac-5 polypeptide binding polypeptides that are also candidate agonists and antagonists according to the invention. This yeast two-hybrid system is described in Fields and Song (Natur
e 340: 245-246 (1989)).

【０１９９】 （トランスジェニックおよび「ノックアウト」） 本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され得る
。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃ
ｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、
サルおよびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は、ト
ランスジェニック動物を作製するために用いられ得る。特定の実施形態において
、本明細書に記載されるかまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺伝子
治療プロトコルの一部として、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のため
に用いられる。Transgenics and “knockouts” The polypeptides of the present invention can also be expressed in transgenic animals. Mouse, rat, rabbit, hamster, guinea pig, pig, mini pig (mic
ro-pig), goats, sheep, cattle and non-human primates (eg, baboons,
Animals of any species, including but not limited to monkeys and chimpanzees, can be used to make transgenic animals. In certain embodiments, the techniques described herein or otherwise known in the art are used for expression of a polypeptide of the invention in humans as part of a gene therapy protocol.

【０２００】 当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕ
ｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェ
クション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；お
よびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖系列
（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚盤胞または胚へのレトロ
ウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ
ら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレクト
ロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３
−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入
（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参
照のこと）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物の
導入および胚盤胞へのこの幹細胞の再移入；ならびに***媒介遺伝子移入（Ｌａ
ｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含
むがこれらに限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にそ
の全体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎ
ｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９
８９）を参照のこと。また、米国特許第５，４６４，７６４号（Ｃａｐｅｃｃｈ
ｉら、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ）；米国特許第５，６３１，１５３号（Ｃａｐｅ
ｃｃｈｉら、Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ
Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｏｄ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｅｌ
ｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎ
ｇ Ｓａｍｅ）；米国特許第４，７３６，８６６号（Ｌｅｄｅｒら、Ｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃ Ｎｏｎ−Ｈｕｍｎａｎ Ａｎｉｍａｌｓ）；および米国特許第４，
８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｚｙｇｏｔｅｓ）を参照のこと（これらの各々は、本明細書中に
その全体が参考として援用される）。[0200] Any technique known in the art for introducing a transgene (ie, a polynucleotide of the present invention) into an animal can be used to create a transgenic animal founder (fou).
ndr line). Such techniques are described in Pronuclear Microinjection (Paterson et al., Appl. Microbiol. Biotec).
hnol. 40: 691-698 (1994); Carver et al., Biotec.
hnology (NY) 11: 1263-1270 (1993); Wright
Biotechnology (NY) 9: 830-834 (1991); and Hoppe et al., U.S. Patent No. 4,873,191 (1989); germline (Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82: 6148-6152 (1985)), retrovirus-mediated gene transfer into blastocysts or embryos; gene targeting in embryonic stem cells (Thompson
Et al., Cell 56: 313-321 (1989)); Electroporation of cells or embryos (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3: 1803).
-1814 (1983)); introduction of a polynucleotide of the present invention using a gene gun (see, for example, Ulmer et al., Science 259: 1745 (1993)); nucleic acid into embryonic pluripotent stem cells Introduction of the construct and retransfer of this stem cell into the blastocyst; and sperm-mediated gene transfer (La
vitrano et al., Cell 57: 717-723 (1989)); and the like. For a review of such techniques, Gordon, "Transgenic An," incorporated herein by reference in its entirety.
imals ", Intl. Rev .. Cytol. 115: 171-229 (19
89). No. 5,464,764 (Capecch)
i et al., Positive-Negative Selection Metho
ds and Vectors); U.S. Patent No. 5,631,153 (Cape)
cchi et al., Cells and Non-Human Organisms.
Containing Predetermined Genomic Mod
Features and Positive-Negative Sel
Action Methods and Vectors for Makin
g Same); U.S. Patent No. 4,736,866 (Leder et al., Trans).
genetic Non-Human Animals); and U.S. Pat.
No. 873,191 (Wagner et al., Genetic Transformat.
ion of Zygotes), each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

【０２０１】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された胚細胞、胎児細胞ま
たは静止状態に誘導された成体の細胞由来の除核した卵母細胞の核への核移入（
Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌｍ
ｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）））。Any technique known in the art can be used to generate transgenic clones containing the polynucleotides of the invention (eg, cultured embryonic cells, fetal cells, or quiescently induced adult cells). Nuclear transfer of enucleated oocytes from the nucleus to the nucleus (
Campell et al., Nature 380: 64-66 (1996); Wilm.
ut et al., Nature 385: 810-813 (1997)).

【０２０２】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ動物）を提供する。導入遺伝子は、
１つの導入遺伝子として、またはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型また
は頭−尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺
伝子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従っ
て特定の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞
型特異的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そし
てそれらは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内因性遺伝
子の染色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好まし
い。手短に言えば、このような技術が利用される場合、内因性遺伝子に対して相
同ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同組換え
を介して内因性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列
の機能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞
型に選択的に導入され得、それにより、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型
においてのみ内因性遺伝子が不活化される。このような細胞型特異的不活化に必
要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に
明らかである。トランスジェニック動物において遍在性または組織特異的な様式
での、本発明のポリペプチドの発現に加えて、他の種々の手段によるポリペプチ
ドの発現（例えば、発生的に、または化学的に調節された発現）を調節する構築
物を作製することもまた、当業者にとって慣用的である。The present invention relates to transgenic animals having a transgene in all of their cells, as well as animals having a transgene in some (but not all) cells (ie, mosaic animals or chimeric animals). provide. The transgene is
It can be integrated as one transgene or as multiple copies, such as a concatemer (eg, head-to-head or head-to-tail tandem). This transgene can also be obtained, for example, from the teachings of Lasko et al. (Lasko et al., Proc. Natl.
. Acad. Sci. USA 89: 6322-2236 (1992)) and can be selectively introduced into specific cell types and activated. The regulatory sequences required for such cell type-specific activation will depend on the particular cell type of interest, and they will be apparent to those skilled in the art. If it is desired that the polynucleotide transgene be integrated into the chromosomal site of the endogenous gene, gene targeting is preferred. In short, when such a technique is used, a vector containing several nucleotide sequences homologous to the endogenous gene is converted into the nucleotide sequence of the endogenous gene through homologous recombination with a chromosomal sequence. It is designed to be incorporated and disrupt the function of its nucleotide sequence. The transgene can also be selectively introduced into a particular cell type, such that, for example, Gu et al. (Gu et al., Science
e 265: 103-106 (1994)), the endogenous gene is inactivated only in the introduced cell type. The regulatory sequences required for such cell type-specific inactivation will depend on the particular cell type of interest, and they will be apparent to those skilled in the art. In addition to expression of a polypeptide of the invention in a ubiquitous or tissue-specific manner in the transgenic animal, expression of the polypeptide by various other means (eg, developmentally or chemically regulated) It is also routine for one of skill in the art to create constructs that regulate expression.

【０２０３】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。[0203] Once the transgenic animal is created, the expression of the recombinant gene can be assayed using standard techniques. Initial screening can be accomplished by Southern blot analysis or PCR techniques, and analysis of animal tissue can confirm that transgene integration has occurred. Transgene mRNA expression levels in tissues of transgenic animals can also be determined by Northern blot analysis, in situ hybridization analysis and reverse transcriptase P analysis of tissue samples obtained from the animals.
It can be assessed using techniques including, but not limited to, CR (rt-PCR). Samples of the transgenic gene-expressing tissue can also be assessed immunocytochemically or immunohistochemically using antibodies specific for the transgene product.

【０２０４】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配されるか、同系交配されるか
、異系交配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そ
のような交配戦略の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立
するための１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺
伝子の相加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合ト
ランスジェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤ
ＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組
み込み部位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニッ
ク動物の交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々の
ホモ接合系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウン
ド上に導入遺伝子を配置するための交配。Once founders have been generated, they can be crossed, inbred, outbred or crossed to produce colonies of a particular animal. Examples of such mating strategies include, but are not limited to: outcrossing of founders with more than one integration site to establish another lineage; additive expression of each transgene By effect, inbred separate strains to produce complex transgenics expressing higher levels of the transgene; enhanced expression and D
Hybridization of heterozygous transgenic animals that produce animals homozygous for a given integration site, both to eliminate the need for screening the animals by NA analysis; compound heterozygous or homozygous strains A separate homozygous line to produce a transgene; and a cross to place the transgene on a different background appropriate to the experimental model of interest.

【０２０５】 本発明のトランスジェニック動物および「ノックアウト」動物は、Ｂｒａｉｎ
ｉａｃ−５ポリペプチドの生物学的機能の詳述、異常なＢｒａｉｎｉａｃ−５発
現に関連する状態および／または障害の研究、ならびにこのような状態および／
または障害の改善に有効な化合物についてのスクリーニングに有用な動物モデル
系を含むがこれらに限定されない用途を有する。The transgenic and “knockout” animals of the present invention are Brain
A detailed description of the biological function of the iac-5 polypeptide, studies of conditions and / or disorders associated with abnormal Brainiac-5 expression, and such conditions and / or
Alternatively, it has uses including, but not limited to, animal model systems useful for screening for compounds that are effective in ameliorating the disorder.

【０２０６】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するように
遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。こ
のような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナー
から入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂
肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞
を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入
遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プ
ラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソー
ムなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポ
リペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／ま
たは本発明のポリペプチドに関連している内因性の調節配列を破壊するために、
組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチ
ドのコード配列を、強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまた
はプロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現
および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好まし
くは分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中
へ全身的に導入し得る。In a further embodiment of the present invention, cells that are engineered to express a polypeptide of the invention or cells that are engineered to not express a polypeptide of the invention (eg, knockouts) Administered to the patient in vivo. Such cells can be obtained from patients (ie, animals including humans) or MHC compatible donors, and include fibroblasts, bone marrow cells, blood cells (eg, lymphocytes), adipocytes, muscle cells, endothelial cells, and the like. But not limited to them. The cells can be transformed, for example, by transduction (using viral vectors and preferably vectors that incorporate the transgene into the cell genome) or transfection procedures (plasmids, cosmids, YACs, naked DNA, electroporation, liposomes, etc.). (Including but not limited to use) to introduce a coding sequence for a polypeptide of the invention into a cell, or to an endogenous regulation associated with the coding sequence and / or a polypeptide of the invention. To destroy the array,
Genetically engineered in vitro using recombinant DNA technology. The coding sequence of a polypeptide of the invention may be placed under the control of a strong constitutive or inducible promoter or promoter / enhancer to achieve expression and preferably secretion of the polypeptide of the invention. Engineered cells that express and preferably secrete a polypeptide of the present invention can be introduced systemically into a patient, for example, in the circulation or intraperitoneally.

【０２０７】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺
伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号；ならびにＭ
ｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照の
こと。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。Alternatively, the cells can be incorporated into a matrix and transplanted into the body (
For example, genetically engineered fibroblasts can be transplanted as part of a skin graft); genetically engineered endothelial cells can be transplanted as part of a lymphatic or vascular graft (eg, Anderson et al., US Pat. No. 5,399,349; and M
See Ulligan and Wilson, U.S. Patent No. 5,460,959. Each of these is hereby incorporated by reference in its entirety).

【０２０８】 投与される細胞が非自己細胞または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを
、この導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投
与し得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成
成分と細胞のすぐ外の環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によ
って認識されることを可能にしない。If the cells to be administered are non-autologous or non-MHC compatible cells, they may be administered using well-known techniques that would prevent the generation of a host immune response against the transduced cells. For example, the cells can be introduced in a capsular form, which does not allow the introduced cells to be recognized by the host immune system, while allowing for the exchange of components with the environment just outside the cell. .

【０２０９】 （抗体） 本発明はさらに、本発明のポリペプチド、好ましくはエピトープに免疫特異的
に結合する（特異的な抗原−抗体結合のアッセイのための、当該分野で周知のイ
ムノアッセイによって決定される）、抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ
）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重
特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグ
メント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生され
るフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に
対する抗−Ｉｄ抗体を含む）、および上記の任意のエピトープ結合フラグメント
を含むが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」
は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、す
なわち、抗原を免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の
免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、Ｉｇ
Ｅ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、Ｉｇ
Ｇ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり
得る。Antibodies The present invention further provides for immunospecifically binding to a polypeptide, preferably an epitope, of the present invention (determined by immunoassays well known in the art for assays for specific antigen-antibody binding). ), Antibodies and T cell antigen receptor (TCR
). The antibodies of the present invention may be polyclonal, monoclonal, multispecific, human, humanized or chimeric, single chain, Fab fragments, F (ab ') fragments, fragments produced by a Fab expression library. , Anti-idiotype (anti-Id) antibodies (including, for example, anti-Id antibodies to the antibodies of the invention), and any epitope binding fragments described above. As used herein, the term "antibody"
Refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, ie, molecules that include an antigen binding site that immunospecifically binds an antigen. The immunoglobulin molecules of the present invention can be of any type (eg, IgG, Ig)
E, IgM, IgD, IgA and IgY), classes (eg, IgG1, Ig
G2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) or subclass.

【０２１０】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、そしてこれには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（
ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬドメイ
ンまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるが、これらに
限定されない。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で
、または以下の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１
、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン。可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２および
ＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗原結合フラグメントもまた、
本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源
由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、マウス、ロバ、船ウサギ（ｓ
ｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリで
ある。本明細書で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミ
ノ酸配列を有する抗体を含み、そしてこれは、ヒト免疫グロブリンライブラリー
から、または１つ以上のヒト免疫グロブリンに対してトランスジェニックな動物
から単離される、以下および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特
許第５，９３９，５９８号に記載されるように、内因性免疫グロブリンを発現し
ない抗体を含む。Most preferably, the antibody is a human antigen binding antibody fragment of the invention, including Fab, Fab ′ and F (ab ′) 2, Fd, single chain Fv (
scFv), single-chain antibodies, disulfide-linked Fvs (sdFv) and fragments containing either the VL or VH domains. Antigen-binding antibody fragments, including single-chain antibodies, can include the variable region alone or in combination with all or part of the following: hinge region, CH1
, CH2 and CH3 domains. Antigen binding fragments also comprising any combination of the variable region with the hinge region, CH1, CH2 and CH3 domains,
Included in the present invention. The antibodies of the present invention can be from any animal origin, including birds and mammals. Preferably, the antibodies are human, mouse, donkey, ship rabbit (s
hip rabbit, goat, guinea pig, camel, horse, or chicken. As used herein, a "human" antibody includes an antibody having the amino acid sequence of a human immunoglobulin, which is transfected from a human immunoglobulin library or against one or more human immunoglobulins. And antibodies that do not express endogenous immunoglobulins, as described below and, for example, in U.S. Patent No. 5,939,598 to Kucherlapati et al.

【０２１１】 本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはより多重の多重
特異性であり得る。多重特異性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトー
プに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種エピト
ープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）の両方に特異的であ
り得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；Ｗ
Ｏ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４
，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；
同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８
：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。[0211] Antibodies of the present invention can be monospecific, bispecific, trispecific or more multispecific. Multispecific antibodies can be specific for different epitopes of a polypeptide of the invention, or can be specific for both a polypeptide of the invention and a heterologous epitope (eg, a heterologous polypeptide or a solid support material). Can be For example, PCT Publication WO93 / 17715; WO92 / 08802; W
WO 91/05793; Tutt et al. Immunol
. 147: 60-69 (1991); U.S. Patent No. 4,474,893;
Nos. 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920;
No. 5,601,819; Kostelny et al. Immunol. 148
: 1547-1553 (1992).

【０２１２】 本発明の抗体は、この抗体により認識されるかまたは特異的に結合される本発
明のポリペプチドのエピトープまたは部分に関して記載されるかまたは特定され
得る。このエピトープまたはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端位置および
Ｃ末端位置により、連続するアミノ酸残基のサイズにより、または表および図に
列挙されて、本明細書中に記載される様に特定され得る。本発明の任意のエピト
ープまたはポリペプチドを特異的に結合する抗体もまた、排除され得る。従って
、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そしてこれの排除を可能
にする抗体を含む。An antibody of the invention can be described or specified in terms of an epitope or portion of a polypeptide of the invention that is recognized or specifically bound by the antibody. The portion of the epitope or polypeptide is identified as described herein, e.g., by N- and C-terminal positions, by the size of contiguous amino acid residues, or listed in the tables and figures. obtain. Antibodies that specifically bind any epitope or polypeptide of the present invention may also be excluded. Accordingly, the present invention includes antibodies that specifically bind a polypeptide of the present invention and allow for its elimination.

【０２１３】 本発明の抗体はまた、その交差反応性に関して記載または特定され得る。本発
明のポリペプチドの他のアナログ、オーソログまたはホモログのいずれをも結合
しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少
なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少
なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％およ
び少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書において記
載された方法を用いて計算される）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた
、本発明に含まれる。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、
８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、
５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書に
おいて記載された方法を用いて計算される）を有するポリペプチドを結合しない
抗体もまた、本発明に含まれる。さらに本発明には、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下（本明細書において記載される）で本発明のポリヌクレ
オチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
を結合する抗体が含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドへのそ
の結合親和性に関して記載または特定され得る。好ましい結合親和性としては、
５×１０^-2Ｍ、１０^-2Ｍ、５×１０^-3Ｍ、１０^-3Ｍ、５×１０^-4Ｍ、１０^-4Ｍ、
５×１０^-5Ｍ、１０^-5Ｍ、５×１０^-6Ｍ、１０^-6Ｍ、５×１０^-7Ｍ、１０^-7Ｍ、
５×１０^-8Ｍ、１０^-8Ｍ、５×１０^-9Ｍ、１０^-9Ｍ、５×１０^-10Ｍ、１０^-10Ｍ
、５×１０^-11Ｍ、１０^-11Ｍ、５×１０^-12Ｍ、１０^-12Ｍ、５×１０^-13Ｍ、１
０^-13Ｍ、５×１０^-14Ｍ、１０^-14Ｍ、５×１０^-15Ｍ、および１０^-15Ｍよりも
小さな解離定数すなわちＫｄの親和性が挙げられる。[0213] The antibodies of the present invention may also be described or specified in terms of their cross-reactivity. Antibodies that do not bind any other analog, ortholog or homolog of the polypeptides of the invention are included. At least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 75%, at least 70%, at least 65%, at least 60%, at least 55% and at least 50% identity to a polypeptide of the invention Antibodies that bind a polypeptide having (calculated using methods known in the art and described herein) are also included in the invention. Less than 95%, less than 90% relative to the polypeptide of the invention,
Less than 85%, less than 80%, less than 75%, less than 70%, less than 65%, less than 60%,
Antibodies that do not bind polypeptides having an identity of less than 55% and less than 50% (calculated using methods known in the art and described herein) are also included in the invention. The invention further includes an antibody that binds a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide of the invention under stringent hybridization conditions (as described herein). Antibodies of the invention can also be described or specified in terms of their binding affinity to a polypeptide of the invention. Preferred binding affinities include
5 × 10 ⁻² M, 10 ⁻² M, 5 × 10 ⁻³ M, 10 ⁻³ M, 5 × 10 ⁻⁴ M, 10 ⁻⁴ M,
5 × 10 ⁻⁵ M, 10 ⁻⁵ M, 5 × 10 ⁻⁶ M, 10 ⁻⁶ M, 5 × 10 ⁻⁷ M, 10 ⁻⁷ M,
5 × 10 ⁻⁸ M, 10 ⁻⁸ M, 5 × 10 ⁻⁹ M, 10 ⁻⁹ M, 5 × 10 ⁻¹⁰ M, 10 ⁻¹⁰ M
5 × 10 ⁻¹¹ M, 10 ⁻¹¹ M, 5 × 10 ⁻¹² M, 10 ⁻¹² M, 5 × 10 ⁻¹³ M, 1
Dissociation constants smaller than 0 ^-13 M, 5 × 10 ^-14 M, 10 ^-14 M, 5 × 10 ^-15 M, and 10 ^-15 M, ie, affinity for Kd, are mentioned.

【０２１４】 本発明はまた、競合的結合の決定のための当該分野で公知の任意の方法（例え
ば、本明細書に記載されるイムノアッセイ）によって決定されるように、抗体の
、本発明のエピトープへの結合を競合阻害する抗体を提供する。好ましい実施形
態において、この抗体は、エピトープへの結合を、少なくとも９０％、少なくと
も８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、競
合阻害する。The present invention also provides epitopes of the invention of an antibody, as determined by any method known in the art for determining competitive binding (eg, the immunoassays described herein). An antibody that competitively inhibits the binding to the antibody. In a preferred embodiment, the antibody competitively inhibits binding to the epitope by at least 90%, at least 80%, at least 70%, at least 60%, or at least 50%.

【０２１５】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、部分的または完全にかのいずれかで本発明
のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を破壊する抗体を含む。本発
明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方の特徴を有する。
本発明はまた、リガンド結合を妨害しないが、レセプター活性化を妨害するレセ
プター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達
）は、本明細書中に記載の技術、またはそうでなければ、当該分野で公知の技術
により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、免疫沈降およびそれに続く
ウエスタンブロット分析（例えば、上記）による、このレセプターまたはその基
質のリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／スレオニン）の検出によって、
決定され得る。特定の実施形態において、リガンドまたはレセプターの活性を、
この抗体が存在しない場合の活性の少なくとも９０％、少なくとも８０％、少な
くとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提供
される。[0215] The antibodies of the present invention can act as agonists or antagonists of the polypeptides of the present invention. For example, the invention includes antibodies that disrupt receptor / ligand interactions, either partially or completely, with a polypeptide of the invention. The invention has the characteristics of both receptor-specific and ligand-specific antibodies.
The invention also features receptor-specific antibodies that do not interfere with ligand binding, but which interfere with receptor activation. Receptor activation (ie, signal transduction) can be determined by techniques described herein or otherwise known in the art. For example, receptor activation is determined by detection of phosphorylation of the receptor or its substrate (eg, tyrosine or serine / threonine) by immunoprecipitation and subsequent Western blot analysis (eg, as described above).
Can be determined. In certain embodiments, the activity of the ligand or receptor is
Antibodies are provided that inhibit at least 90%, at least 80%, at least 70%, at least 60%, or at least 50% of the activity in the absence of the antibody.

【０２１６】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨害するレセプ
ター特異的抗体、ならびにレセプター−リガンド複合体を認識する抗体の特徴を
有し、そして、好ましくは、非結合レセプターまたは非結合リガンドを特異的に
認識しない。同様に、リガンドを結合し、そしてリガンドのレセプターへの結合
を妨害する中和抗体、ならびに、リガンドを結合し、それによってレセプター活
性化を妨害するが、リガンドがレセプターに結合することは妨害しない抗体も、
本発明に含まれる。レセプターを活性化する抗体が、本発明にさらに含まれる。
これらの抗体は、レセプターアゴニスト（すなわち、リガンド媒介レセプター活
性化の生物学的活性の全てまたはサブセットのいずれかの増強または活性化する
）として作用し得る。この抗体は、本明細書中に開示された本発明のペプチドの
特異的な生物学的活性を含む生物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニス
トまたは逆アゴニスト（ｉｎｖｅｒｓ ａｇｏｎｉｓｔ）として特定され得る。
上記の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を使用して作製され得る。例え
ば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅ
ｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎ
ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；
Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１
９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１
４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−
３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）
：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、
Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９
７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９
５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７（
１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（
１９９６）（これらは、その全体が参考として本明細書中に全て援用される）を
参照のこと。The present invention also features receptor-specific antibodies that interfere with both ligand binding and receptor activation, as well as antibodies that recognize receptor-ligand complexes, and preferably have unbound receptors or non-bound receptors. Does not specifically recognize the binding ligand. Similarly, neutralizing antibodies that bind ligand and prevent ligand binding to receptor, as well as antibodies that bind ligand and thereby prevent receptor activation, but do not prevent ligand from binding to receptor Also,
Included in the present invention. Antibodies that activate the receptor are further included in the present invention.
These antibodies can act as receptor agonists (ie, enhance or activate any or all of the biological activities of ligand-mediated receptor activation). The antibodies can be identified as agonists, antagonists or inverse agonists for biological activities, including the specific biological activities of the peptides of the invention disclosed herein.
The above antibody agonists can be made using methods known in the art. See, for example, PCT Publication WO 96/40281; U.S. Pat. No. 5,811,097; De.
ng et al., Blood 92 (6): 1981-1988 (1998); Chen.
Et al., Cancer Res. 58 (16): 3668-3678 (1998);
Harrop et al. Immunol. 161 (4): 1786-1794 (1
998); Zhu et al., Cancer Res: 58 (15): 3209-321.
4 (1998); Yoon et al. Immunol. 160 (7): 3170-
3179 (1998); Prat et al. Cell. Sci. 111 (Pt2)
: 237-247 (1998); Pitard et al. Immunol. Met
hods 205 (2): 177-190 (1997); Lioutard et al.,
Cytokine 9 (4): 233-241 (1997); Carlson et al. Biol. Chem. 272 (17): 11295-11301 (199
7); Taryman et al., Neuron 14 (4): 755-762 (199).
5); Muller et al., Structure 6 (9): 1153-1167 (
1998); Bartunek et al., Cytokine 8 (1): 14-20 (
1996), which are incorporated herein by reference in their entirety.

【０２１７】 本発明の抗体は、例えば、インビトロおよびインビボの両方における診断方法
および治療方法を含む、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化するた
めに使用され得るが、これらに限定されない。例えば、この抗体は、生物学的サ
ンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定する
ためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９８
８）（その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。The antibodies of the invention can be used to purify, detect and target polypeptides of the invention, including but not limited to, for example, both in vitro and in vivo diagnostic and therapeutic methods. For example, the antibodies have use in immunoassays for qualitatively and quantitatively measuring levels of a polypeptide of the invention in biological samples. See, for example, Harlow et al., Ant.
ibodies: A Laboratory Manual, (Cold Sp.
ring Harbor Laboratory Press, 2nd edition, 198
8), which is incorporated herein by reference in its entirety.

【０２１８】 以下により詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独、または他の組成
物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端もし
くはＣ末端で異種のポリペプチドに組換え的に融合され得るか、またはポリペプ
チドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）さ
れ得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子
およびエフェクター分子（例えば、異種のポリペプチド、薬物または毒素）に組
換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５；
ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５
号；およびＥＰ ３９６，３８７を参照のこと。As discussed in more detail below, the antibodies of the invention can be used either alone or in combination with other compositions. The antibody can be further recombinantly fused at the N-terminus or C-terminus to a heterologous polypeptide, or chemically conjugated (including covalent and non-covalent) to the polypeptide or other composition. obtain. For example, the antibodies of the invention can be recombinantly fused or conjugated to molecules and effector molecules useful as labels in detection assays (eg, heterologous polypeptides, drugs or toxins). For example, PCT Publication WO92 / 08495;
WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. Patent No. 5,314,995
No .; and EP 396,387.

【０２１９】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合がこの抗体の抗イディオタ
イプ応答の精製を妨害しないように、この抗体に任意の型の分子を共有結合させ
た）誘導体を含む。限定のためではないが、例えば、この抗体誘導体には、例え
ば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／
ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他
のタンパク質への結合などによって改変された抗体が挙げられる。多数の化学的
改変のいずれかが、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施
され得る：特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝
合成など。さらに、これらの誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る
。The antibodies of the present invention include modified (ie, covalently attached to the antibody any type of molecule such that the covalent attachment does not interfere with the purification of the antibody's anti-idiotypic response). . For example, but not by way of limitation, this antibody derivative may include, for example, glycosylations, acetylations, PEGylations, phosphorylations, amidations, known protecting groups /
Antibodies modified by derivatization with blocking groups, proteolytic cleavage, binding to cellular ligands or other proteins, and the like. Any of a number of chemical modifications can be performed by known techniques, including but not limited to: specific chemical cleavage, acetylation, formylation, metabolic synthesis of tunicamycin, and the like. In addition, these derivatives may contain one or more non-classical amino acids.

【０２２０】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって作製され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、この抗原に対して特異的な
ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために、ウサギ、マウス、ラッ
トなどを含むがこれらに限定されない種々の宿主動物に投与され得る。種々のア
ジュバントが、宿主種に依存して免疫学的応答を増加させるために使用され得、
そしてフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラル
ゲル（ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロ
ニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、
キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カ
ルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ
のような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。こ
のようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。[0220] The antibodies of the present invention can be made by any suitable method known in the art.
Polyclonal antibodies to an antigen of interest can be produced by various procedures well known in the art. For example, the polypeptides of the present invention may be administered to various host animals, including but not limited to rabbits, mice, rats, etc., to induce the production of serum containing polyclonal antibodies specific for this antigen. obtain. Various adjuvants can be used to increase the immunological response depending on the host species,
And Freund (complete and incomplete), mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions,
Keyhole limpet hemocyanin, dinitrophenol, and BCG (bacilli Calmette-Guerin) and corynebacterium parvum
Including but not limited to potentially useful human adjuvants. Such adjuvants are also well-known in the art.

【０２２１】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
であり、そして例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら
：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（
上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）に教示される技術を含む
ハイブリドーマ技術を使用して産生され得る。本明細書中で使用される場合、用
語「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して産生された抗体に
限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物クローン、原
核生物クローン、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体
をいい、そしてモノクローナル抗体が生成される方法ではない。[0221] Monoclonal antibodies can be prepared using a wide variety of techniques known in the art, including the use of hybridoma, recombinant, and phage display technologies, or a combination thereof. For example, monoclonal antibodies are known in the art, and are described, for example, in Harlow et al., Antibodies: A Labo.
rattro Manual, (Cold Spring Harbor La
(Hormanling et al .: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hy).
bridomas 563-681 (Elsevier, NY 1981) (
The above references can be produced using hybridoma technology, including the technology taught in U.S. Pat. As used herein, the term "monoclonal antibody" is not limited to antibodies produced through hybridoma technology. The term "monoclonal antibody" refers to an antibody derived from a single clone, including any eukaryotic, prokaryotic, or phage clone, and is not the method by which the monoclonal antibody is produced.

【０２２２】 ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、慣用的であり、そして当該分野で周知であり、そして実施例５に詳細に議論
される。手短に言えば、マウスは、本発明のポリペプチドまたはそのようなペプ
チドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦、免疫応答が検出される（例え
ば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウスの脾臓を収
集しそして脾細胞を単離する。次に、脾細胞を周知の技術によって任意の適切な
骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に融
合させる。ハイブリドーマを限定希釈によって選択およびクローン化する。次に
、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドを結合し得る抗体を分泌す
る細胞について当該分野で公知の方法によってアッセイする。一般的に高いレベ
ルの抗体を含む腹水液が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫す
ることによって、生成され得る。Methods for producing and screening for particular antibodies using hybridoma technology are conventional and well known in the art, and are discussed in detail in Example 5. Briefly, mice can be immunized with a polypeptide of the invention or cells expressing such a peptide. Once an immune response is detected (eg, an antibody specific for the antigen is detected in the serum of the mouse), the spleen of the mouse is collected and splenocytes are isolated. The splenocytes are then fused by well known techniques to any suitable myeloma cells (eg, cells from cell line SP20 available from the ATCC). Hybridomas are selected and cloned by limiting dilution. The hybridoma clones are then assayed for cells secreting antibodies capable of binding a polypeptide of the invention by methods known in the art. Ascites fluid, which generally contains high levels of antibodies, can be generated by immunizing mice with a positive hybridoma clone.

【０２２３】 従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、産生す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と、
本発明の抗原で免疫させたマウスから単離された脾細胞とを融合させることによ
って、次いで本発明のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマ
クローンについての融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすること
によって産生される。Accordingly, the present invention provides a method for producing an antibody produced by a method comprising the step of culturing a monoclonal antibody and a hybridoma cell secreting the antibody of the present invention, preferably Hybridomas are composed of myeloma cells,
Screening hybridomas resulting from the fusion for hybridoma clones secreting antibodies capable of binding to a polypeptide of the present invention by fusing splenocytes isolated from mice immunized with an antigen of the present invention Produced by

【０２２４】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって産生さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ）’２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを産生するための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するための）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。[0224] Antibody fragments that recognize a particular epitope can be produced by known techniques. For example, Fab and F (ab) '2 fragments of the present invention comprise (Fa
It can be produced by proteolytic cleavage of immunoglobulin molecules using an enzyme such as papain (to produce the b-fragment) or pepsin (to produce the F (ab ') 2 fragment). The F (ab ') 2 fragment contains the variable region, the light chain constant region and the CH1 domain of the heavy chain.

【０２２５】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野において公知の種々のファージディス
プレイ技術を用いて調製され得る。ファージディスプレイ方法においては、機能
的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファー
ジ粒子の表面にディスプレイされる。特に、このようなファージは、レパートリ
ーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウスの）か
ら発現される抗原結合ドメインをディスプレイするために利用され得る。目的の
抗原を結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて（例えば
、標識化抗原あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を用い
て）選択または同定され得る。これらの方法に使用されるファージは代表的に、
ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかと組換え的に
融合される、Ｆａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有する
ファージから発現される、ｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む、繊維状ファー
ジである。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方
法の例としては、以下に開示されるものが挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅ
ｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９
５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９
５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７：９−１８（１
９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１
３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０
１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８
２；ＷＯ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５
，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、
同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４
７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６
，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，
７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明細書
中に参考としてそれら全体が援用される）。For example, the antibodies of the present invention can also be prepared using various phage display techniques known in the art. In phage display methods, functional antibody domains are displayed on the surface of phage particles that carry the polynucleotide sequences that encode them. In particular, such phage can be utilized to display an antigen binding domain expressed from a repertoire or combinatorial antibody library (eg, human or mouse). Phage expressing an antigen binding domain that binds the antigen of interest can be selected or identified using the antigen (eg, using a labeled antigen or an antigen bound or captured to a solid surface or beads). The phage used in these methods is typically
Filamentous phage containing fd and M13 binding domains, expressed from phage with Fab, Fv or disulfide stabilized Fv antibody domains, recombinantly fused to either phage gene III or gene VIII protein. Examples of phage display methods that can be used to make the antibodies of the invention include those disclosed below: Brinkman et al.
. Immunol. Methods 182: 41-50 (1995); Ame.
s et al. Immunol. Methods 184: 177-186 (199
5); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 9
52-958 (1994); Persic et al., Gene 187: 9-18 (1
997); Burton et al., Advances in Immunology.
57: 191-280 (1994); PCT Application No. PCT / GB91 / 011.
34; PCT Publication WO90 / 02809; WO91 / 10737; WO92 / 0
1047; WO92 / 18619; WO93 / 11236; WO95 / 1598
2; WO95 / 20401; and U.S. Patent Nos. 5,698,426 and 5
No. 5,223,409, No. 5,403,484, No. 5,580,717,
No. 5,427,908, No. 5,750,753, No. 5,821,04
No. 7, No. 5,571,698, No. 5,427,908, No. 5,516
No. 5,637, No. 5,780,225, No. 5,658,727, No. 5,
Nos. 733,743 and 5,969,108, each of which is hereby incorporated by reference in its entirety.

【０２２６】 上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の領域
をコードする抗体は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結
合フラグメントを作製するために単離されそして用いられ得、そして哺乳動物細
胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現
され得る（例えば、以下に詳細に記載されるように）。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ
’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に作製するための技術はまた、
当該分野で公知の以下に開示される方法のような方法を用いて使用され得る：Ｐ
ＣＴ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ １２（６）：８６４〜８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪ
ＲＩ ３４：２６〜３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１０４１〜１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が
参考として援用される）。As described in the above references, after phage selection, antibodies encoding phage-derived regions can be used to generate whole antibodies, including human antibodies, or any other desired antigen-binding fragment. It can be isolated and used, and expressed in any desired host, including mammalian cells, insect cells, plant cells, yeast and bacteria (eg, as described in detail below). For example, Fab, Fab
Techniques for recombinantly producing 'and F (ab') 2 fragments also include
It can be used using methods known in the art, such as those disclosed below: P
CT Publication WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniq.
es 12 (6): 864-869 (1992); and Sawai et al., AJ.
RI 34: 26-34 (1995); and Better et al., Science.
240: 1041-1043 (1998) (these references are incorporated by reference in their entirety).

【０２２７】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を作製するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６〜８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５〜７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８〜１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を作製するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７
号を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される
）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）および
ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結
合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域
内のフレームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合
を変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応
残基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によ
って同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するための
ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置
における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば
、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ．ら、
Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと。これらはそれらの全
体が参考として本明細書中に援用される）。抗体は、以下を含む当該分野で公知
の種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３
９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５
３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤ
リング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉ
ｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８
（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ
９１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａ
ｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。Examples of techniques that can be used to make single chain Fvs and antibodies include US Pat. Nos. 4,946,778 and 5,258,498; Huston.
Et al., Methods in Enzymology 203: 46-88 (19
91); Shu et al., PNAS 90: 7995-7999 (1993); and Skerra et al., Science 240: 1038-1040 (1988). For some uses, including in vivo use of antibodies in humans and in vitro detection assays, the use of chimeric, humanized or human antibodies may be preferred. A chimeric antibody is a molecule in which different portions of the antibody are derived from different animal species (eg, an antibody having a variable region derived from a mouse monoclonal antibody and a human immunoglobulin constant region). Methods for making chimeric antibodies are known in the art. For example, Morris
on, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTec.
hniques 4: 214 (1986); Gillies et al., (1989) J.
. Immunol. Methods 125: 191-202; U.S. Pat.
Nos. 807,715; 4,816,567; and 4,816,397.
(These are hereby incorporated by reference in their entirety). A humanized antibody is an antibody molecule from a non-human species antibody that binds to a desired antigen having one or more complementarity determining regions (CDRs) from a non-human species and framework regions from a human immunoglobulin molecule. . Often, framework residues within the human framework regions are replaced with corresponding residues from a CDR donor antibody to alter (preferably improve) antigen binding. These framework substitutions are identified by methods well known in the art, for example, modeling the interaction of CDR and framework residues to identify framework residues important for antigen binding, and at specific positions. By sequence comparison to identify abnormal framework residues. (See, for example, Queen et al., US Patent No. 5,585,089; Riechmann. Et al.,
Nature 332: 323 (1988). These are incorporated herein by reference in their entirety). Antibodies can be humanized using various techniques known in the art, including: for example, CDR-grafting (European Patent No.
No. 9,400; PCT Publication WO 91/09967; US Pat. No. 5,225,5.
39; 5,530,101 and 5,585,089), veneering or resurfacing.
ng) (European Patents 592,106; 519,596; Padlan,
Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498
(1991); Studnicka et al., Protein Engineeri.
ng 7 (6): 805-814 (1994); Roguska et al., PNAS.
91: 969-973 (1994)), and chain shuffling (cha).
in shuffling (U.S. Pat. No. 5,565,332).

【０２２８】 完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公
開ＷＯ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３
、ＷＯ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５
、およびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明
細書中に援用される）もまた参照のこと。[0228] Fully human antibodies are particularly desirable for therapeutic treatment of human patients. Human antibodies can be produced by various methods known in the art, including the phage display method described above using an antibody library derived from human immunoglobulin sequences. U.S. Patent Nos. 4,444,887 and 4,716,111; and PCT publications WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893.
, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735
And WO 91/10741; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

【０２２９】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を発展させ、そしてキメラマウ
スを産生するために未分化胚芽細胞中に微量注入する。次に、キメラマウスを、
ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジ
ェニックマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体また
は部分）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対して指向されるモノクローナ
ル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウ
スから得られ得る。ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、トランスジェニックマウ
スの再編成によってＢ細胞分化の間かくまわれ、そしてクラススイッチングおよ
び体細胞変異が引き続いて起こる。従って、そのような技術の使用によって、治
療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可
能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒ
ｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６
５−９３）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するた
めのこの技術のならびにそのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な
議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９８／２４８９３；ＷＯ ９６／３
４０９６；ＷＯ ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５
，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；
同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１
８号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が本明
細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅ
ｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のよう
な企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択した抗原に対して指向される
ヒト抗体を提供することに従事し得る。[0229] Human antibodies can also be produced using transgenic mice, which are unable to express functional endogenous immunoglobulin, but are capable of expressing human immunoglobulin genes. For example, a complex of a human heavy chain immunoglobulin gene and a human light chain immunoglobulin gene can be introduced randomly or by homologous recombination into mouse embryonic stem cells. Alternatively, the human variable region, constant region, and diversity region (diversity)
region) can be introduced into mouse embryonic stem cells in addition to the human heavy and light chain genes. The mouse heavy and light immunoglobulin genes can be rendered non-functional separately or simultaneously with the introduction of a human immunoglobulin locus by homologous recombination. In particular, homozygous deletion of the JH region prevents endogenous antibody production. The modified embryonic stem cells are developed and microinjected into undifferentiated germinal cells to produce chimeric mice. Next, the chimeric mouse
Breed to produce homozygous offspring that express human antibodies. The transgenic mice are immunized in the normal fashion with a selected antigen (eg, all or a portion of a polypeptide of the invention). Monoclonal antibodies directed against the antigen can be obtained from the immunized, transgenic mouse using conventional hybridoma technology. The human immunoglobulin transgene is shed during B cell differentiation by rearrangement of transgenic mice, and class switching and somatic mutations follow. Thus, the use of such techniques allows for the production of therapeutically useful IgG, IgA, IgM and IgE antibodies. For an overview of this technology for producing human antibodies, see Lonber.
g and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13: 6).
See 5-93). For a detailed discussion of this technology for producing human and human monoclonal antibodies and protocols for producing such antibodies, see, for example, PCT Publication WO 98/24893; WO 96/3.
WO 96/33735; U.S. Patent No. 5,413,923;
No. 5,633,425; No. 5,569,825;
5,661,016; 5,545,806; 5,814,31
No. 8; and 5,939,598, which are incorporated herein by reference in their entirety. Further, Abgenix, Inc. (Fre
Companies such as Emmont, Calif. and Genpharm (San Jose, Calif.) may be engaged in providing human antibodies directed against a selected antigen using techniques similar to those described above.

【０２３０】 選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択をガイドするために使用される（Ｊｅｓｐｅ
ｒｓら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））
。Human antibodies that fully recognize the selected epitope were identified as “guided (gui
ded) selection ". In this approach,
Selected non-human monoclonal antibodies (eg, mouse antibodies) are used to guide the selection of human antibodies that fully recognize the same epitope (Jespe).
rs et al., Bio / technology 12: 899-903 (1988)).
.

【０２３１】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、次いで、当業者に周知である
技術を用いて、本発明のポリペプチドを「模倣」する抗イディオタイプ抗体を作
製するために、利用され得る（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ Ｂｏｎａ、Ｆ
ＡＳＥＢ Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏ
ｆｆ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を
参照のこと）。例えば、リガンドに結合し、そしてポリペプチドの多量体化およ
び／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗
体は、ポリペプチドの多量体化および／または結合ドメインを「模倣」する抗イ
ディオタイプを生成するために用いられ得、そして結果として、ポリペプチドお
よび／またはそのリガンドに結合し、それらを中和する。このような中和抗イデ
ィオタイプまたはこのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントは、ポリペ
プチドリガンドを中和するための治療レジメにおいて使用され得る。例えば、こ
のような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチドに結合するため、およ
び／またはそのリガンド／レセプターに結合し、そしてそれにより、その生物学
的活性をブロックするために使用され得る。In addition, antibodies to the polypeptides of the present invention can then be utilized to generate anti-idiotype antibodies that "mimic" the polypeptides of the present invention, using techniques well known to those of skill in the art. (For example, Greenspan & Bona, F
ASEB J.S. 7 (5): 437-444; (1989) and Nissino.
ff. J. Immunol. 147 (8): 2429-2438 (1991)). For example, an antibody that binds to a ligand and competitively inhibits multimerization of the polypeptide and / or binding of the polypeptide of the invention to the ligand will “mimic” the multimerization and / or binding domain of the polypeptide. And binds to and neutralizes the polypeptide and / or its ligand as a result. Such neutralizing anti-idiotypes or Fab fragments of such anti-idiotypes can be used in therapeutic regimes to neutralize polypeptide ligand. For example, such anti-idiotype antibodies can be used to bind to a polypeptide of the invention and / or bind to its ligand / receptor and thereby block its biological activity.

【０２３２】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、または低いストリジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で（例えば、
上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異的に
結合する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合
する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドを含む。(Polynucleotide encoding antibody) The present invention further provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the antibody of the present invention and a fragment thereof. The present invention also provides for hybridization under stringent or low stringency hybridization conditions (eg,
Hybridizes to a polynucleotide encoding an antibody (as defined above), preferably an antibody that binds specifically to a polypeptide of the invention, and preferably binds to a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Soybean containing polynucleotides.

【０２３３】 ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定され得る。例えば、抗体のヌクレオ
チド配列が知られている場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に
合成されたオリゴヌクレオチドから集められ得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、
ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるような）
、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：抗体をコードする配列の部分
を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、アニーリングおよびこれ
らのオリゴヌクレオチドの連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリゴヌクレオ
チドの増幅。[0233] A polynucleotide can be obtained by any method known in the art, and the nucleotide sequence of the polynucleotide can be determined. For example, if the nucleotide sequence of the antibody is known, the polynucleotide encoding the antibody can be assembled from chemically synthesized oligonucleotides (eg, Kutmier et al.,
BioTechniques 17: 242 (1994)).
This, in brief, involves the following steps: synthesis of overlapping oligonucleotides containing portions of the sequence encoding the antibody, annealing and ligation of these oligonucleotides, then the ligated oligonucleotides by PCR Amplification.

【０２３４】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら作製され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、
適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意
の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体の発現のために選択されたハイブリ
ドーマ細胞）から作製されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された
核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡ
ライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、配列の３’末端もしく
は５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によっ
て、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用する
クローニングによって得られ得る。ＰＣＲによって作製された増幅された核酸は
、次いで、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベク
ターにクローニングされ得る。Alternatively, a polynucleotide encoding an antibody can be made from nucleic acid from a suitable source. No clone is available containing the nucleic acid encoding a particular antibody, but if the sequence of the antibody molecule is known, the nucleic acid encoding the immunoglobulin can be:
A cDNA library made from a suitable source (eg, an antibody cDNA library, or any tissue or cell expressing the antibody (eg, a hybridoma cell selected for expression of an antibody of the invention), or From the isolated nucleic acid (preferably poly A + RNA), for example, a cDNA encoding an antibody
To identify cDNA clones from the library, by PCR amplification using synthetic primers that can hybridize to the 3 'or 5' end of the sequence, or using oligonucleotide probes specific for a particular gene sequence It can be obtained by cloning. The amplified nucleic acid generated by PCR can then be cloned into a replicable cloning vector using any method known in the art.

【０２３５】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製
し得る。Once the nucleotide sequence and the corresponding amino acid sequence of the antibody have been determined,
The nucleotide sequence of an antibody can be determined by methods known in the art for manipulating nucleotide sequences (eg, recombinant DNA technology, site-directed mutagenesis, PCR, etc. (eg,
Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, AL.
laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
And Ausubel et al., Eds. 1998, Current Protocols.
in Molecular Biology, John Wiley & Sons
, NY. These are both incorporated herein by reference in their entirety. )) To produce antibodies having different amino acid sequences to generate, for example, amino acid substitutions, deletions, and / or insertions.

【０２３６】 特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は自然発生し得るか
、またはコンセンサスフレームワーク領域、および好ましくはヒトフレームワー
ク領域であり得る（例えば、ヒトフレームワーク領域の列挙については、Ｃｈｏ
ｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参
照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによっ
て作製されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗
体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上のアミノ酸置
換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸置
換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法は、１つ以
上の鎖内のジスルフィド結合が欠如した抗体分子を作製するように、鎖内ジスル
フィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換また
は欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発
明によって、および当該分野の技術において包含される。In certain embodiments, the amino acid sequences of the heavy and / or light chain variable domains are identified by methods well known in the art for identification of the sequences of the complementarity determining regions (CDRs), eg, To determine the region of hypervariability, other heavy chains,
And by comparing the variable region of the light chain with the known amino acid sequence). Using conventional recombinant DNA techniques, one or more CDRs can be inserted into a framework region as described above (eg, into a human framework region to humanize a non-human antibody). . The framework region can be naturally occurring or a consensus framework region, and preferably a human framework region (eg, for a listing of human framework regions, see Cho.
thia et al. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998)). Preferably, the polynucleotide generated by the combination of the framework regions and the CDRs encodes an antibody that specifically binds a polypeptide of the invention. Preferably, as discussed above, one or more amino acid substitutions can be made within the framework regions, and preferably, the amino acid substitutions improve the binding of the antibody to its antigen. In addition, such methods may include amino acid substitutions or deletions of cysteine residues in one or more of the variable regions involved in intrachain disulfide bonds, such as to create antibody molecules lacking one or more intrachain disulfide bonds. Can be used to create loss. Other changes to polynucleotides are encompassed by the present invention and in the art.

【０２３７】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによる、「キ
メラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５；Ｎｅｕｂｅｒ
ｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら
、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４）が使用され得る。上記の
ように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種から誘導される分子であり、
このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域から誘導
された可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。In addition, genes have been developed to produce “chimeric antibodies” by splicing genes from mouse antibody molecules of appropriate antigen specificity with genes from human antibody molecules of appropriate biological activity. Technology (Morrison et al., 1984,
Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855; Neuber
ger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454) may be used. As described above, a chimeric antibody is a molecule in which different parts are derived from different animal species,
Such molecules have variable regions derived from mouse mAb and human immunoglobulin constant regions (eg, humanized antibodies).

【０２３８】 あるいは、単鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４，６９４，
７７８号；Ｂｉｒｄ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２；Ｈｕ
ｓｔｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５
：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：
５４４−５４）が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重
鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されること
によって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能性Ｆ
ｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋｅｒｒａ
ら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１）。Alternatively, the techniques described for the production of single chain antibodies (US Pat. No. 4,694,941)
No. 778; Bird, 1988, Science 242: 423-42; Hu
Stone et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85
: 5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334:
544-54) can be adapted for the production of single chain antibodies. Single chain antibodies are formed by linking the heavy and light chain fragments of the Fv region via an amino acid bridge, resulting in a single chain polypeptide. E. FIG. E. coli functional F
Techniques for assembly of v-fragments may also be used (Skerra
Et al., 1988, Science 242: 1038-1041).

【０２３９】 （抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え体発現技術によって産
生され得る。Methods for Producing Antibodies The antibodies of the invention can be produced by any method known in the art for synthesizing antibodies, particularly by chemical synthesis, or preferably, by recombinant expression techniques. Can be done.

【０２４０】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖）の組換え体発現は、抗体をコードするポリヌ
クレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。一旦、本発明の抗体分
子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分（好ましくは、重鎖ま
たは軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られる
と、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を用いる組換え
ＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、ヌクレオチド配列をコードする抗体
を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は
、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列ならび
に適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの構
築のために使用され得る。これらの方法には、例えば、インビトロの組換えＤＮ
Ａ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発
明は、プロモーターに作動可能に連結した、本発明の抗体分子、あるいはその重
鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオ
チド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分
子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開ＷＯ
８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）をコ
ードするヌクレオチド配列ならびに重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのよ
うなベクターにクローニングされ得る抗体の可変ドメインを含み得る。The antibodies of the invention, or fragments, derivatives or analogs thereof (eg,
Recombinant expression of the antibody (heavy or light chain) of the present invention requires the construction of an expression vector containing a polynucleotide encoding the antibody. Once a polynucleotide encoding the antibody molecule or antibody heavy or light chain, or portions thereof, (preferably containing the heavy or light chain variable domains) of the invention is obtained, the production of the antibody molecule is Can be produced by recombinant DNA technology using techniques well known in the art. Thus, methods for preparing a protein by expression of a polynucleotide containing an antibody encoding a nucleotide sequence are described herein. Methods well known to those skilled in the art can be used for the construction of expression vectors containing antibody-encoding sequences and appropriate transcriptional and translational control signals. These methods include, for example, in vitro recombinant DN.
A technology, synthetic technology, and in vivo genetic recombination. Accordingly, the present invention provides a replicable vector comprising a nucleotide sequence encoding an antibody molecule of the present invention, or a heavy or light chain, or a variable domain of a heavy or light chain, operably linked to a promoter. I do. Such vectors contain the constant region of the antibody molecule (eg, PCT Publication WO 86/05807; PCT Publication WO
89/01036; and U.S. Patent No. 5,122,464) and the variable domains of an antibody that can be cloned into such a vector for expression of an entire heavy or light chain. May be included.

【０２４１】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
した、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオ
チドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態にお
いて、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように
、免疫グロブリン分子の全体の発現のために宿主細胞において同時発現され得る
。[0241] The expression vector is transferred to a host cell by conventional techniques, and the transfected cells are then cultured by conventional techniques to produce an antibody of the present invention. Accordingly, the invention includes a host cell comprising a polynucleotide encoding an antibody of the invention, or a heavy or light chain thereof, operably linked to a heterologous promoter. In a preferred embodiment for the expression of a double-chain antibody, the vector encoding both the heavy and light chains is co-expressed in a host cell for total expression of the immunoglobulin molecule, as detailed below. Can be done.

【０２４２】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現するために利用され得
る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され得、そして後に精製
され得るビヒクルを示すが、適切なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換ま
たはトランスフェクトされる場合、インサイチュで本発明の抗体分子を発現し得
る細胞もまた示す。これらとしては、微生物（例えば、組換えバクテリオファー
ジＤＮＡを用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）、抗体コード配列を含むプラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミド
ＤＮＡ発現発現ベクター；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターを用い
て形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）
；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイル
ス）を用いて感染された昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カ
リフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を
用いて感染された植物細胞系または抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現
ベクター（例えば、Ｔｉ プラスミド）を用いて形質転換された植物細胞系；ま
たは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネイン
プロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデ
ノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含
む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨ
Ｋ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、およびより好ましくは、特
に組換え抗体分子全体の発現のために、真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現
のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺
伝子プロモーターエレメントのようなベクターと結合体化したチャイニーズハム
スター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞は、抗体のための効果的な発現
系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、１９８６、Ｇｅｎｅ ４５：１０１；Ｃｏｃｋ
ｅｔｔら、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２）。A variety of host expression vector systems can be utilized to express the antibody molecules of the present invention. Such host expression systems show vehicles in which the coding sequence of interest can be produced and subsequently purified, but when transformed or transfected with the appropriate nucleotide coding sequence, the antibody of the invention in situ Cells that can express the molecule are also shown. These include microorganisms (eg, bacteria transformed with recombinant bacteriophage DNA (eg, E. coli, B. subti).
lis), a plasmid DNA expression vector or a cosmid DNA expression vector containing an antibody coding sequence; yeast transformed with a recombinant yeast expression vector containing an antibody coding sequence (eg, Saccharomyces, Pichia)
An insect cell line infected with a recombinant virus expression vector containing the antibody coding sequence (eg, baculovirus); using a recombinant virus expression vector (eg, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) Infected plant cell lines or plant cell lines transformed with a recombinant plasmid expression vector (eg, a Ti plasmid) containing the antibody coding sequence; or a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg, a metallothionein promoter) Alternatively, a mammalian cell line (eg, COS, CHO, BH) carrying a recombinant expression construct containing a promoter derived from a mammalian virus (eg, adenovirus late promoter; vaccinia virus 7.5K promoter)
K, 293, 3T3 cells). Preferably,
Bacterial cells, such as Escherichia coli, and more preferably, eukaryotic cells are used for expression of recombinant antibody molecules, especially for the expression of whole recombinant antibody molecules. For example, mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells (CHO) conjugated to a vector such as the major intermediate early gene promoter element from human cytomegalovirus are an effective expression system for antibodies ( Foecking et al., 1986, Gene 45: 101; Cock.
ett et al., 1990, Bio / Technology 8: 2).

【０２４３】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
べき場合、抗体分子の薬学組成物の作製のために、容易に精製される融合タンパ
ク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベク
ターには、抗体をコードする配列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターに
インフレームで個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．
ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３、ＥＭＢＯ Ｊ
．２：１７９１）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、１９８５、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ Ｈ
ｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５
０３−５５０９）などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクタ
ーもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質
として、外来性ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、このよ
うな融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞から、マトリックスグ
ルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グルタチオ
ン存在下での溶出によって容易に精製され得る。このｐＧＥＸベクターは、トロ
ンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果
、このクローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から放出され得る。[0243] In bacterial systems, a number of expression vectors may be advantageously selected depending upon the use intended for the expression of the antibody molecule. For example, if large quantities of such a protein are to be produced, a vector that directs high-level expression of a fusion protein product that is easily purified may be desirable for the production of a pharmaceutical composition of the antibody molecule. In such a vector, the sequence encoding the antibody can be individually ligated in frame with the vector along with the region encoding lacZ, resulting in the production of a fusion protein.
coli expression vector pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J
. 2: 1791); pIN vector (Inouye & Inouye, 1985,
Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van H
eeke & Schuster, 1989, J. Am. Biol. Chem. 24:55
03-5509) and the like, but are not limited thereto. The pGEX vector can also be used as a fusion protein with glutathione S-transferase (GST) to express foreign polypeptides. Generally, such fusion proteins are soluble and can be readily purified from lysed cells by adsorption and binding to matrix glutathione-agarose beads, followed by elution in the presence of free glutathione. The pGEX vector is designed to include a thrombin or factor Xa protease cleavage site so that the cloned target gene product can be released from the GST moiety.

【０２４４】 昆虫系において、オートグラファカリフォルニカ核多核体病ウイルス（Ａｕｔ
ｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒ
ｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、外来性遺伝子を発現させるためのベ
クターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉ
ｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。この抗体をコードする配列は、ウイルスの非必須
領域（例えば、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）に個々にクロー
ニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモー
ター）の制御下に配置され得る。In an insect system, the autographa californica nuclear polynucleosis virus (Aut)
Ographa California nuclear polyhedr
Osis virus (AcNPV) is used as a vector for expressing a foreign gene. The virus is Spodoptera frugi
Proliferate in perda cells. Sequences encoding this antibody can be cloned individually into non-essential regions of the virus, such as the polyhedrin gene, and placed under the control of an AcNPV promoter, such as the polyhedrin promoter.

【０２４５】 哺乳動物の宿主細胞において、多くのウイルスに基づいた発現系が利用され得
る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、抗体をコードする目
的の配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーター
および３部からなるリーダー配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子
は、インビトロまたはインビボの組換えによって、アデノウイルスゲノム中に挿
入され得る。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）へ
の挿入は、感染した宿主において生存し、かつ抗体分子を発現し得る組換えウイ
ルスを生じる。（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９を参照のこと）。特定
の開始シグナルもまた、挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳のため
に必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列
を含む。さらに、この開始コドンは、挿入物全体の翻訳を保証するように、所望
のコード配列のリーディングフレームと同調でなければならない。これらの外因
性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源の
であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネ
ーターなどの封入体によって増大され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４を参照のこと）。In mammalian host cells, a number of viral-based expression systems may be utilized. If an adenovirus is used as the expression vector, the sequence of interest encoding the antibody may be ligated to an adenovirus transcription / translation control complex (eg, the late promoter and tripartite leader sequence). This chimeric gene can then be inserted into the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. Insertion into a non-essential region of the viral genome (eg, region E1 or E3) results in a recombinant virus that survives in the infected host and can express the antibody molecule. (See, e.g., Logan & Shenk, 1984, Proc. Na.
tl. Acad. Sci. ScL USA 81: 355-359). Certain initiation signals may also be required for efficient translation of the inserted antibody-encoding sequence. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences. In addition, this initiation codon must be in phase with the reading frame of the desired coding sequence to ensure translation of the entire insert. These exogenous translational control signals and initiation codons can be of various origins, both natural and synthetic. The efficiency of expression can be increased by inclusion bodies such as appropriate transcription enhancer elements, transcription terminators, etc. (Bittner et al., 1987, Me
foods in Enzymol. 153: 51-544).

【０２４６】 さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特定
の様式に改変およびプロセスする宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質産物
のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断
）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク
質産物および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変について特徴的かつ特
有の機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現した外来性タンパク質の
正確な改変およびプロセシングを保証するように選択され得る。この目的のため
に、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン
酸化のための細胞の機構を有する真核生物の宿主細胞が使用され得る。このよう
な哺乳動物の宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、Ｍ
ＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および、特に、乳癌細胞株（例えば、ＢＴ
４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄなど）、ならびに正
常な乳腺細胞株（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなど）が挙げ
られるが、これらに限定されない。In addition, a host cell strain may be chosen which modulates the expression of the inserted sequences, or modifies and processes the gene product in the specific fashion desired. Such modifications (eg, glycosylation) and processing (eg, cleavage) of protein products may be important for the function of the protein. Different host cells have characteristic and unique mechanisms for the post-translational processing and modification of protein and gene products. Appropriate cell lines or host systems can be chosen to ensure the correct modification and processing of the foreign protein expressed. To this end, eukaryotic host cells that have the cellular machinery for proper processing of the primary transcript, glycosylation of the gene product, and phosphorylation can be used. Such mammalian host cells include CHO, VERY, BHK, Hela, COS, M
DCK, 293, 3T3, WI38, and especially breast cancer cell lines (eg, BT
483, Hs578T, HTB2, BT20 and T47D) and normal mammary gland cell lines (such as CRL7030 and Hs578Bst).

【０２４７】 組換えタンパク質の長期の高収率の産生のために、安定した発現が好ましい。
例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起
点を含む発現ベクターの使用よりも、むしろ宿主細胞は、適切な発現制御エレメ
ント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリ
アデニル化部位など）、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転
換され得る。外来性ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、濃縮された培地
中で１〜２日間増殖され得、次いで選択培地に切り換えられる。組換えプラスミ
ド中の選択マーカーは、選択への耐性を与え、そして細胞がプラスミドをそれら
の染色体に安定に組み込むことを可能とし、そして増殖し、次いで細胞株にクロ
ーニングおよび増殖され得る病巣を形成する。この方法は、抗体分子を発現する
細胞株を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、
抗体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評
価において特に有用であり得る。For long-term, high-yield production of recombinant proteins, stable expression is preferred.
For example, cell lines that stably express the antibody molecule can be engineered. Rather than using an expression vector that contains the viral origin of replication, the host cell is prepared with appropriate expression control elements (eg, promoters, enhancers, sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.), and DNA controlled by a selectable marker. Can be transformed. Following the introduction of the exogenous DNA, the engineered cells can be grown for 1-2 days in a concentrated medium and then switched to a selective medium. The selectable marker in the recombinant plasmid confers resistance to selection and allows cells to stably integrate the plasmid into their chromosomes, and grow, forming foci that can then be cloned and propagated into cell lines. . This method can be advantageously used to engineer cell lines that express the antibody molecule. Such engineered cell lines
It may be particularly useful in screening and evaluating compounds that interact directly or indirectly with the antibody molecule.

【０２４８】 多くの選択系が使用され得、それらには、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、ま
たはａｐｒｔ−細胞において使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナ
ーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳ
ｚｙｂａｌｓｋｉ、１９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
４８：２０２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ
ら、１９８０、Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子が挙げられるが、これらに限定
されない。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用さ
れ得る：メトトレキサートへの耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９８
０、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７）；Ｏ’Ｈａｒｅら、
１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７；
ミコフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、
１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２）
；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐ
ｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ、１９９１、Ｂｉｏｔ
ｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２；ならびにＭｏ
ｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．６２：１９１−２１７（１９９３）；１９９３年５月，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １
１（５）：１５５−２１５）；ならびにハイグロマイシンへの耐性を与えるｈｙ
ｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４、Ｇｅｎｅ ３０：１４７）。使用され
得る当該分野で一般に公知である組換えＤＮＡ技術の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら
（編）、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｋｒｉｅｇ
ｌｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ；ならびに１２および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、１９９４、
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら
、１９８１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載され、これ
らはその全体が本明細書において参考として援用される。A number of selection systems can be used, including herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al., Cell 11: 223 (1977)), which can be used in tk-, hgprt-, or aprt- cells, respectively. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Szybalska and S
zybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
48: 202), and adenine phosphoribosyltransferase (Lowy
Et al., 1980, Cell 22: 817) gene. Also, antimetabolite resistance can be used as a basis for selection of the following genes: dhfr (Wigler et al., 198), which confers resistance to methotrexate.
0, Natl. Acad. Sci. ScL USA 77: 357); O'Hare et al.,
1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527;
Gpt conferring resistance to mycophenolic acid (Mulligan and Berg,
1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072)
Neo (Clinical P) which confers resistance to aminoglycoside G-418;
Pharmacy 12: 488-505; Wu and Wu, 1991, Biot.
herapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. R
ev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mull
igan, 1993, Science 260: 926-932; and Mo.
rgan and Anderson, 1993, Ann. Rev .. Biochem
. 62: 191-217 (1993); May 1993, TIB TECH 1
1 (5): 155-215); and hy that confers resistance to hygromycin
gro (Santere et al., 1984, Gene 30: 147). Methods of recombinant DNA technology generally known in the art that can be used are described in Ausubel et al. (Eds.), 1993, Current Protocols in Molecu.
lar Biology, John Wiley & Sons, NY; Krieg
ler, 1990, Gene Transfer and Expressio
n, A Laboratory Manual, Stockton Press
And NY; and chapters 12 and 13, Dracopoli et al.
Current Protocols in Human Genetics,
John Wiley & Sons, NY; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Am. Mol. Biol. 150: 1 (1981), which are incorporated herein by reference in their entirety.

【０２４９】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加され得る（総説について
は、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ
ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉ
ｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，第３巻
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。抗体を発
現するベクター系においてマーカーが増幅できる場合、宿主細胞の培養液におい
て存在するインヒビターのレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加
する。この増幅された領域が抗体遺伝子と結合しているために、この抗体の産生
もまた、増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
３：２５７）。The expression level of an antibody molecule may be increased by vector amplification (for a review, see Bebbington and Hentschel, The use of
vectors based on gene amplification
for the expression of cloned genes i
n mammarian cells in DNA cloning, Volume 3 (Academic Press, New York, 1987). If the marker can be amplified in a vector system expressing the antibody, increasing the level of inhibitor present in the culture of the host cell will increase the number of copies of the marker gene. Because the amplified region is associated with the antibody gene, production of the antibody is also increased (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol.
3: 257).

【０２５０】 その宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター（重鎖から誘導されるポリペプ
チドをコードする第１のベクターおよび軽鎖から誘導されるポリペプチドをコー
ドする第２のベクター）で同時トランスフェクトされ得る。この２つのベクター
は、重鎖および軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能とする同一の選択マーカ
ーを含み得る。あるいは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの両方をコードする単
一のベクターが使用され得る。このような状況において、この軽鎖は、過剰の有
毒な遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆ
ｏｏｔ、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２；Ｋｏｈｌｅｒ、１９８０、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７）。重鎖および
軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。The host cells may be co-expressed with two expression vectors of the present invention (a first vector encoding a polypeptide derived from the heavy chain and a second vector encoding a polypeptide derived from the light chain). Can be transfected. The two vectors may contain the same selectable marker that allows for equal expression of the heavy and light chain polypeptides. Alternatively, a single vector encoding both heavy and light chain polypeptides can be used. In such situations, the light chain should be placed before the heavy chain to avoid excess toxic free heavy chains (Proudf
oot, 1986, Nature 322: 52; Kohler, 1980, P.
rc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 77: 2197). The heavy and light chain coding sequences can include cDNA or genomic DNA.

【０２５１】 一旦、本発明の抗体分子が、組換え発現されると、免疫グロブリン分子の精製
についての当該分野で公知の任意の方法によって（例えば、クロマトグラフィー
（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー（特にプロテインＡ
の後の特異的抗原へのアフィニティーによる）クロマトグラフィー、およびサイ
ジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差示的溶解度によって、または
タンパク質の精製についての他の任意の標準的な技術によって）精製され得る。Once an antibody molecule of the present invention has been recombinantly expressed, it can be purified by any method known in the art for the purification of immunoglobulin molecules (eg, by chromatography (eg, ion exchange chromatography, affinity ( Especially protein A
Chromatography by affinity to specific antigens and sizing column chromatography), centrifugation, differential solubility, or by any other standard technique for protein purification).

【０２５２】 （抗体結合体） 本発明は、融合タンパク質を作製するために、本発明のポリペプチド（または
それらの一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、２０、もしくは５
０個のアミノ酸）と組換え的に融合したか、あるいは化学的に結合（共有結合お
よび非共有結合の両方を含む）した抗体を含む。この融合は、必ずしも直接的で
ある必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。この抗体は、本発明のポ
リペプチド（またはそれらの一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０
、２０、もしくは５０個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例えば、
抗体は、本発明のポリペプチドを、インビトロまたはインビボのいずれかで、特
定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合させるかまたは結合させることに
よって、本発明のポリペプチドを特定の細胞型に標的化するために使用され得る
。本発明のポリペプチドに融合されたかまたは結合された抗体はまた、当該分野
で公知の方法を使用してインビトロイムノアッセイおよび精製方法にて使用され
得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出およびＰＣＴ公開ＷＯ ９３／２１２３２
；ＥＰ ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３
９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅ
ｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）（これらは、それらの
全体において参考として援用される）を参照のこと。Antibody Conjugates The present invention relates to polypeptides of the present invention (or portions thereof, preferably at least 10, 20, or 5 of a polypeptide) for making fusion proteins.
0 amino acids) or chemically bound (including both covalent and non-covalent) antibodies. The fusion need not be direct, but can occur through a linker sequence. The antibody may be a polypeptide of the invention (or a portion thereof, preferably at least 10% of the polypeptide).
, 20, or 50 amino acids). For example,
Antibodies target polypeptides of the invention to particular cell types by fusing or binding the polypeptides of the invention, either in vitro or in vivo, to antibodies specific for particular cell surface receptors. Can be used to transform Antibodies fused or conjugated to a polypeptide of the invention can also be used in in vitro immunoassays and purification methods using methods known in the art. See, for example, Harbor et al., Supra and PCT Publication WO 93/21232.
EP 439,095; Naramura et al., Immunol. Lett. 3
9: 91-99 (1994); U.S. Patent No. 5,474,981; Gillie.
s et al., PNAS 89: 1428-1432 (1992); I
mmunol. 146: 2446-2452 (1991), which are incorporated by reference in their entirety.

【０２５３】 本発明はさらに、可変領域以外の抗体のドメインに融合されたかまたは結合さ
れた本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチド
を、抗体のＦｃ領域、あるいはその一部に融合または結合され得る。本発明のポ
リペプチドに融合された抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、
ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、あるいはそれらのドメイン全体または
部分の任意の組合せを含み得る。このポリペプチドはまた、上記の抗体部分に融
合または結合体化し、マルチマーを形成し得る。例えば、本発明のポリペプチド
と融合したＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合を介してダイマーを形成
し得る。より高次なマルチマー形態は、このポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭ
の部分に融合することにより作製され得る。本発明のポリペプチドを抗体部分に
融合または結合するための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国
特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０
４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１
２，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ
９６／０４３８８；ＷＯ ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１
９９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０〜５６００（
１９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９；１１３３７〜１１３４１（１９９２）（上記の参考文献は、それらの全
体が参考として援用される）を参照のこと。The present invention further includes compositions comprising a polypeptide of the present invention fused or conjugated to a domain of an antibody other than the variable region. For example, a polypeptide of the invention can be fused or conjugated to the Fc region of an antibody, or a portion thereof. The antibody portion fused to the polypeptide of the present invention comprises a constant region, a hinge region, a CH1 domain,
It may comprise a CH2 domain, and a CH3 domain, or any combination of all or part of those domains. The polypeptide can also be fused or conjugated to the antibody portion described above to form a multimer. For example, an Fc portion fused to a polypeptide of the invention can form a dimer via a disulfide bond between the Fc portions. Higher order multimeric forms convert this polypeptide to IgA and IgM
By fusing to a portion of Methods for fusing or linking a polypeptide of the invention to an antibody moiety are known in the art. For example, U.S. Patent Nos. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,0.
No. 46; No. 5,349,053; No. 5,447,851; No. 5,11
No. 2,946; EP 307,434; EP 367,166; WO published by PCT
96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi et al., Pro.
c. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10538 (1
991); Zheng et al. Immunol. 154: 5590-5600 (
1995); and Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89; 11337-11341 (1992) (the above references are incorporated by reference in their entirety).

【０２５４】 上記で議論されたように、本発明のポリペプチドは、上記の抗体部分と融合ま
たは結合され得、このポリペプチドのインビボの半減期を増加するか、または当
該分野で公知の方法を使用するイムノアッセイにおいて使用される。さらに、本
発明のポリペプチドは、精製を容易にするために、上記の抗体部分に融合または
結合され得る。１つの報告された実施例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの第１の２
つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の種
々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する。（ＥＰ ３９４，８２７；
Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。
ジスルフィド連結したダイマー構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合ま
たは結合体化した本発明のポリペプチドはまた、単量体分泌タンパク質またはタ
ンパク質フラグメント単独よりも、他の分子との結合および中和においてより効
率的であり得る。（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０
：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合において、融合タンパク質の
Ｆｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、例えば、改良された
薬物動態学的な特性を生じ得る。（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるいは、融
合タンパク質が発現、検出、および精製された後のＦｃ部分の欠損は、好ましい
。例えば、この融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、こ
のＦｃ部分は、治療および診断を妨げ得る。薬物の開発において、例えば、ヒト
タンパク質（例えばｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するた
めのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のために、Ｆｃタンパク質
と融合された。（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇ
ｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。As discussed above, the polypeptides of the present invention can be fused or conjugated to the antibody portions described above to increase the in vivo half-life of the polypeptide or to use methods known in the art. Used in the immunoassay used. Further, the polypeptides of the present invention can be fused or conjugated to the antibody portions described above to facilitate purification. One reported example is that the first two of the human CD4 polypeptides were
A chimeric protein comprising one domain and various domains of a heavy or light chain constant region of a mammalian immunoglobulin is described. (EP 394,827;
Traunecker et al., Nature 331: 84-86 (1988)).
The polypeptides of the invention fused or conjugated to an antibody having a disulfide-linked dimer structure (due to IgG) also bind and neutralize other molecules than monomeric secreted proteins or protein fragments alone. May be more efficient. (Funtoulakis et al., J. Biochem. 270)
: 3958-3964 (1995)). In many cases, the Fc portion of the fusion protein is advantageous in therapy and diagnosis, and thus may result, for example, in improved pharmacokinetic properties. (EP A 232,262). Alternatively, deletion of the Fc portion after the fusion protein has been expressed, detected, and purified is preferred. For example, if the fusion protein is used as an antigen for immunization, the Fc portion can interfere with therapy and diagnosis. In drug development, for example, human proteins (eg, hIL-5) have been fused with Fc proteins for the purpose of high-throughput screening assays to identify antagonists of hIL-5. (D. Bennett et al., J. Molecular Recog.
Nation 8: 52-58 (1995); Johanson et al. Bio
l. Chem. 270: 9449-9471 (1995)).

【０２５５】 さらに、本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、精製を容易にするペプ
チドのような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において、この
マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．
，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１
１）において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、それ
らの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８４）に記載されるように
、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用
な他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピト
ープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９
８４））および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。Further, the antibodies or fragments thereof of the present invention can be fused to a marker sequence, such as a peptide to facilitate purification. In a preferred embodiment, the marker amino acid sequence is, inter alia, a pQE vector (QIAGEN, Inc.).
, 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 9131.
Hex-histidine peptides such as the tags provided in 1), many of which are commercially available. See, for example, Gentz et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 86: 821-824 (1984), hexa-histidine provides for convenient purification of the fusion protein. Other peptide tags useful for purification include the “HA” tag corresponding to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein (Wilson et al., Cell 37: 767 (19).
84)) and the "flag" tag.

【０２５６】 本発明は、診断薬剤または治療薬剤に結合体化されている抗体またはそれらの
フラグメントをさらに包含する。例えば、抗体は、例えば所定の処理レジメンの
有効性を決定する診断的試験手順の一部として腫瘍の発症または進行をモニター
するのに診断的に用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質と結合させること
によって容易にされ得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族
、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、種々の陽電子射出断層撮影
法を用いた陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。例
えば、本発明に従って診断としての用途のために抗体に結合体化され得る金属イ
オンについて、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素の例
としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子
族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチ
ンが挙げられる；適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセ
イン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニル
アミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンが挙げられ
る；発光材料の例としてはルミノールが挙げられる；生物発光材料の例としては
ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして適切な放
射性材料の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げら
れる。The present invention further encompasses antibodies or fragments thereof conjugated to a diagnostic or therapeutic agent. For example, the antibodies can be used diagnostically to monitor tumor development or progression, for example, as part of a diagnostic test procedure to determine the efficacy of a given treatment regimen. Detection can be facilitated by coupling the antibody to a detectable substance. Examples of detectable substances include various enzymes, prosthetic groups, fluorescent materials, luminescent materials, bioluminescent materials, radioactive materials, positron emitting metals using various positron emission tomography methods, and non-radioactive paramagnetic metal ions Is mentioned. See, for example, US Pat. No. 4,741,900 for metal ions that can be conjugated to antibodies for diagnostic use according to the present invention. Examples of suitable enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, or acetylcholinesterase; examples of suitable prosthetic group complexes include streptavidin / biotin and avidin / biotin; Examples of suitable fluorescent materials include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride or phycoerythrin; examples of luminescent materials include luminol; Examples include luciferase, luciferin and aequorin; and examples of suitable radioactive materials include 125I, 131I, 111In or 99Tc.

【０２５７】 さらに、抗体またはそれらのフラグメントは、細胞毒（例えば、細胞増殖抑制
剤または殺細胞剤）のような治療的部分、治療的薬剤または放射性金属イオンに
結合体化され得る。細胞毒または細胞傷害剤は、細胞に有害である任意の薬剤を
含む。例としては、パクタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ
、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、
テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、
ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、ミトラマ
イシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイ
ド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロパノロールおよびピューロマ
イシンならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療的薬剤とし
ては、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−
チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化
剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ ｃｈ
ｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロム
スチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ
）、ブサルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシ
ンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、
アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）および
ドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシ
ン））、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））
、および抗有糸***剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げ
られるがこれらに限定されない。In addition, the antibodies or fragments thereof can be conjugated to a therapeutic moiety, such as a cytotoxin (eg, a cytostatic or cytocidal), a therapeutic agent, or a radiometal ion. Cytotoxic or cytotoxic agents include any agent that is harmful to cells. Examples are paclitaxol, cytochalasin B
, Gramicidin D, ethidium bromide, methine, mitomycin, etoposide,
Tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin,
Daunorubicin, dihydroxyanthracindione, mitozantrone, mitramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoid, procaine, tetracaine, lidocaine, propanolol and puromycin and analogs or homologs thereof. Therapeutic agents include antimetabolites (eg, methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-
Thioguanine, cytarabine, 5-fluorouracil decarbazine), alkylating agents (for example, mechlorethamine, thioepachlorambucil (thioepach)
lorambucil), melphalan, carmustine (BSNU) and lomustine (CCNU), cyclophosphamide (cyclophosphamide)
), Busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, mitomycin C, and cis-dichlorodiamineplatinum (II) (DDP) cisplatin),
Anthracyclines (eg, daunorubicin (formerly daunomycin) and doxorubicin), antibiotics (eg, dactinomycin (formerly actinomycin)), bleomycin, mitramycin, and anthramycin (AMC)
And antimitotic agents (eg, vincristine and vinblastine).

【０２５８】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために用いられ得、治療薬
剤または薬物部分は、古典的な化学治療薬剤に限定されると解釈されるべきでは
ない。例えば、薬物部分は所定の生物学的活性を有する、タンパク質またはポリ
ペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス体外毒素、またはジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死
因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由
来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血栓薬剤または抗脈管形成
薬剤（例えば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン）のようなタンパク質；
あるいは例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、イン
ターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー
刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）または他の増殖因子のような生物的応答改変因子（
ｍｏｄｉｆｉｅｒ）が挙げられ得る。The conjugates of the present invention can be used to modify a given biological response, and the therapeutic agent or drug moiety should not be construed as limited to classical chemotherapeutic agents. For example, a drug moiety can be a protein or polypeptide having a given biological activity. Such proteins include, for example, toxins such as abrin, ricin A, pseudomonas exotoxin, or diphtheria toxin; tumor necrosis factor, α-interferon, β-interferon, nerve growth factor, platelet-derived growth factor, tissue plasminol Proteins such as gen activators, thrombotic agents or anti-angiogenic agents (eg, angiostatin or endostatin);
Alternatively, for example, lymphokines, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"),
Biological response modifiers such as granulocyte macrophage colony stimulating factor ("GM-CSF"), granulocyte colony stimulating factor ("G-CSF") or other growth factors (
modifier).

【０２５９】 抗体はまた、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用である固体支持
体に付着され得る。このような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリ
アクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロライドまたはポリプ
ロピレンが挙げられるがこれらに限定されない。Antibodies can also be attached to a solid support that is particularly useful for immunoassays or purification of the target antigen. Such solid supports include, but are not limited to, glass, cellulose, polyacrylamide, nylon, polystyrene, polyvinyl chloride or polypropylene.

【０２６０】 このような治療部分を抗体に対して結合体化する技術は、周知である（例えば
、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉ
ｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａ
ｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編），６２３−
５３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「
Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔ
ｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７
５−５０６頁（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆ
ｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄ
ｗｉｎら（編）３０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）お
よびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔ
ｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２
）を参照のこと。Techniques for conjugating such therapeutic moieties to antibodies are well known (eg, Arnon et al., Monoclonal Antibodies For I).
mmunotargeting Of Drugs In Cancer Th
erapy ", Monoclonal Antibodies And Can
cer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pages 243-56 (Ala
nR. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antib.
Odies For Drug Delivery ", Controlled
Drug Delivery (second edition), Robinson et al. (Eds.), 623-
53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "
Antibody Carriers Of Cytotoxic Agent
s In Cancer Therapy: A Review ", Monocl
onal Antibodies '84: Biological And C
linear Applications, Pinchera et al. (eds.), 47
5-506 (1985); "Analysis, Results, And F.
true Prospective Of The Therapeutic
Use Of Radiolabeled Antibody In Can
cer Therapy ", Monoclonal Antibodies F
or Cancer Detection And Therapy, Bald
Win et al. (eds.) pages 303-16 (Academic Press 1985) and Thorpe et al., "The Preparation And Cytot."
oxyProperties Of Antibody-Toxin Co
njugates ", Immunol. Rev .. 62: 119-58 (1982
)checking.

【０２６１】 あるいは、抗体は、本明細書にその全てが参考として援用される米国特許第４
，６７６，９８０号においてＳｅｇａｌにより記載されるように、第二抗体と結
合体化して抗体ヘテロ結合体を形成し得る。[0261] Alternatively, the antibodies are disclosed in US Pat.
, 676,980, can be conjugated to a second antibody to form an antibody heteroconjugate.

【０２６２】 抗体に結合体化した治療部分を伴って、または伴わずに、抗体は、単独でまた
は治療用として用いられ得る細胞傷害性因子および／またはサイトカインと結合
されて投与される。Antibodies, with or without a therapeutic moiety conjugated to the antibody, are administered alone or in combination with a cytotoxic factor and / or cytokine that can be used for therapeutic use.

【０２６３】 （抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、いくつかのも
のについてだけ名称を挙げると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免
疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセ
イ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテイン
Ａ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が
挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そ
して当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として
援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免
疫アッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが
意図されない）。Assays for Antibody Binding Antibodies of the invention can be assayed for immunospecific binding by any method known in the art. Immunoassays that can be used include Western blots, radioimmunoassays,
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), "sandwich" immunoassay, immunoprecipitation assay, sedimentation reaction, gel diffusion sedimentation reaction, immunodiffusion assay, agglutination assay, complement binding assay, immunoradiometric assay, fluorescent immunoassay, protein A Examples include, but are not limited to, competitive and non-competitive assay systems that use techniques such as immunoassays. Such assays are conventional and well known in the art (eg, Ausubel et al., Eds., 1994, Current Protocol, which is incorporated by reference herein in its entirety).
ls in Molecular Biology, Volume 1, John Wil
eye & Sons, Inc. , New York). Exemplary immunoassays are briefly described below (although these are not intended to be limiting).

【０２６４】 免疫沈降プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロ
テアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン
酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２での０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、１％ Ｔｒ
ａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体
を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間）４℃でインキュ
ベートする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズ
を細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４℃でインキュベートする工程、溶
解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およびＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズ
を再懸濁する工程を含む。目的の抗体の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例
えば、ウェスタンブロット分析により評価され得る。当業者は、抗体の抗原への
結合を増加させるように、そしてバックグラウンドを減少させるように改変され
得るパラメータ（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれ
いにする工程）に関して、認め得る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察
については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を
参照のこと。The immunoprecipitation protocol generally involves a RIPA buffer (1% NP-40 or Trito) supplemented with protein phosphatase and / or protease inhibitors (eg, EDTA, PMSF, aprotinin, sodium vanadate).
nX-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.1%
0.01 M sodium phosphate at 15 M NaCl, pH 7.2, 1% Tr
lysing a population of cells in a lysis buffer, such as asylol, adding the antibody of interest to the cell lysate, incubating at 4 ° C. for a period of time (eg, 1-4 hours), protein A and Adding protein G sepharose beads to the cell lysate, incubating at 4 ° C. for at least about 1 hour, washing the beads in lysis buffer, and resuspending the beads in SDS / sample buffer The step of performing The ability of the antibody of interest to immunoprecipitate a particular antigen can be assessed, for example, by Western blot analysis. One of skill in the art can appreciate for parameters that can be modified to increase the binding of the antibody to the antigen and reduce the background (eg, the step of pre-clearing the cell lysate using Sepharose beads). . For further discussion on immunoprecipitation protocols, see, for example, Ausubel et al., Eds., 1994, Current Pro.
tocols in Molecular Biology, Volume 1, John
Wiley & Sons, Inc. , New York, 10.16.1.

【０２６５】 ウェスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、タ
ンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８
％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中での電気泳動の工程、タンパク質サンプルをそ
のポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのよ
うな膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉乳を
有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、その膜を洗浄緩衝液（例えば、
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈さ
れた一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、その膜を洗浄
緩衝液中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質（例えば
、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるいは放射性
分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（これは、一次抗体
を認識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄緩
衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を含む
。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウンド
ノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、認め得る。ウェス
タンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。Western blot analysis generally involves the steps of preparing a protein sample, a polyacrylamide gel of the protein sample (eg, 8 depending on the molecular weight of the antigen).
% -20% SDS-PAGE), transferring the protein sample from its polyacrylamide gel to a membrane such as nitrocellulose, PVDF or nylon, blocking solution (eg, 3% BSA or skim milk). Blocking the membrane in PBS with PBS, washing the membrane with a wash buffer (eg,
Washing in PBS-Tween 20), blocking the membrane with a primary antibody (antibody of interest) diluted in blocking buffer, washing the membrane in washing buffer, blocking buffer A secondary antibody (which recognizes the primary antibody, eg, an anti-human antibody) conjugated to an enzyme substrate (eg, horseradish peroxidase or alkaline phosphatase) or a radioactive molecule (eg, 32P or 125I) diluted in solution Blocking the membrane with, washing the membrane in a wash buffer, and detecting the presence of the antigen. One skilled in the art will be aware of parameters that can be modified to increase the signal detected and reduce background noise. For further discussion on Western blot protocols, see, for example, Ausub
el et al., 1994, Current Protocols in Molec.
ullar Biology, Volume 1, John Wiley & Sons, I
nc. , New York, 10.8.1.

【０２６６】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスフォターゼ）のような検出可能な化合物に結合
体化した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする
工程、およびその抗原の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的
の抗体は、検出可能な化合物に結合体化されている必要はない；その代わり、検
出可能な化合物に結合体化された第二の抗体（これは、目的の抗体を認識する）
がウェルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、
抗体がウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合体化
された第二の抗体が、コーティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて
、添加され得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得
るパラメータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーション
に関して、認め得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａ
ｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏ
ｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。ELISA comprises preparing an antigen, coating the wells of a 96-well microtiter plate with the antigen, binding to a detectable compound such as an enzyme substrate (eg, horseradish peroxidase or alkaline phosphatase). Adding the embodied antibody of interest to the wells and incubating for a period of time; and detecting the presence of the antigen. In an ELISA, the antibody of interest need not be conjugated to a detectable compound; instead, a second antibody conjugated to the detectable compound, which recognizes the antibody of interest, )
Can be added to the wells. In addition, instead of coating the wells with antigen,
Antibodies can be coated on the wells. In this case, a second antibody conjugated to a detectable compound can be added following addition of the antigen of interest to the coated wells. One skilled in the art will be aware of parameters that can be modified to increase the signal detected, and other variations of ELISAs known in the art. For further discussion on ELISA, see, for example, A
Ussubel et al., eds., 1994, Current Protocols in M
olecular Biology, Volume 1, John Wiley & So
ns, Inc. , New York, 11.2.1.

【０２６７】 抗体の抗原に対する結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識した
抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での目的
の抗体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含
む。目的の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフレートは、スキ
ャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合
はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増
量の非標識第二抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ
）に結合体化した目的の抗体とともにインキュベートされる。The binding affinity of the antibody to the antigen and the off-rate of the antibody-antigen interaction (of
f-rate) can be determined by competitive binding assays. One example of a competitive binding assay is a radioimmunoassay, which involves incubation of a labeled antigen (eg, 3H or 125I) with an antibody of interest in the presence of increasing amounts of unlabeled antigen, and labeling. Detection of antibodies bound to the identified antigen. The affinity of the antibody of interest for a particular antigen, and the binding off-rate, can be determined from data by Scatchard plot analysis. Competition with the second antibody can also be determined using a radioimmunoassay. In this case, the antigen is labeled with a labeled compound (eg, 3H or 125I) in the presence of increasing amounts of unlabeled second antibody.
) And incubated with the desired antibody.

【０２６８】 （治療用途） 本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を
、１つ以上の記載された障害を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そ
して最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を含む。本発明の治療化合物とし
ては、本発明の抗体（本明細書中に記載するような、それらのフラグメント、ア
ナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコードする核酸（本明細書
中に記載するような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）が
挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの
異常な発現および／または活性に関連した疾患および障害（［疾患および障害を
挿入］を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害または予防するために使用
され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患および障害の処置および／または予防は、それらの疾患および障害に関連した
症状を緩和する工程を含むがこれに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で
公知であるか、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成
物中に提供され得る。Therapeutic Uses The present invention further relates to antibody-based therapies, wherein the antibodies are used to treat one or more of the described disorders in an animal, preferably a mammal. , And most preferably, to a human patient. Therapeutic compounds of the invention include antibodies of the invention (including fragments, analogs and derivatives thereof, as described herein) and nucleic acids encoding the antibodies of the invention (described herein). Including, but not limited to, fragments, analogs and derivatives thereof). The antibodies of the invention may be used to treat, inhibit or prevent diseases and disorders associated with abnormal expression and / or activity of the polypeptides of the invention, including but not limited to [insert disease and disorder]. Can be used. Treatment and / or prevention of diseases and disorders associated with aberrant expression and / or activity of the polypeptides of the invention include, but are not limited to, alleviating the symptoms associated with those diseases and disorders. Antibodies of the invention can be provided in pharmaceutically acceptable compositions, as known in the art or as described herein.

【０２６９】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の１つの要約は、身体内で局所的に
または全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクタ
ー細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これら
のアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供さ
れる教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタ
リングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわ
かる。One summary of how the antibodies of the invention may be used therapeutically is to treat them locally or systemically in the body, or (eg, by complement (CDC) or by effector cells (ADCC). Due to the direct cytotoxicity of the antibody (as mediated)
And binding the polynucleotide or polypeptide of the invention. Some of these approaches are described in more detail below. Given the teachings provided herein, one of skill in the art would recognize, without undue experimentation, how to use the antibodies of the present invention for diagnostic, monitoring, or therapeutic purposes. Understand.

【０２７０】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７など）と組み合わせて有利に利用され得る。The antibodies of the present invention can be used, for example, to increase the number or activity of effector cells that interact with the antibody, other monoclonal or chimeric antibodies, or lymphokines or hematopoietic growth factors (eg, IL-2, IL-3 and IL
-7, etc.).

【０２７１】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、患者の種と同じ種である種起源または（抗体の場合には）種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。The antibodies of the invention can be administered alone or in combination with other types of treatment, such as radiation therapy, chemotherapy, hormonal therapy, immunotherapy and anti-tumor agents.
Generally, administration of a species source or species reactive product (in the case of antibodies) that is the same species as the patient's species is preferred. Thus, in a preferred embodiment, a human antibody,
Fragment derivatives, analogs, or nucleic acids are administered to a human patient for treatment or prevention.

【０２７２】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本
発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または
強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、そのフラグメント、ま
たはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント、また
は領域は、好ましくは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメン
トを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性としては、５×１０^-2 Ｍ、１０^-2Ｍ、５×１０^-3Ｍ、１０^-3Ｍ、５×１０^-4Ｍ、１０^-4Ｍ、５×１０^-5 Ｍ、１０^-5Ｍ、５×１０^-6Ｍ、１０^-6Ｍ、５×１０^-7Ｍ、１０^-7Ｍ、５×１０^-8 Ｍ、１０^-8Ｍ、５×１０^-9Ｍ、１０^-9Ｍ、５×１０^-10Ｍ、１０^-10Ｍ、５×１０ ^-11 Ｍ、１０^-11Ｍ、５×１０^-12Ｍ、１０^-12Ｍ、５×１０^-13Ｍ、１０^-13Ｍ、５
×１０^-14Ｍ、１０^-14Ｍ、５×１０^-15Ｍ、および１０^-15Ｍより小さい解離定数
すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。The polynucleotides or polypeptides (including fragments thereof) of the present invention
This book is for both immunoassays related to
High affinity for the polypeptide or polynucleotide of the invention and / or
Strong, in vivo inhibitory and / or neutralizing antibodies, fragments thereof, or even
Alternatively, it is preferable to use that region. Such antibodies, fragments,
The region is preferably a polynucleotide or polypeptide (fragment thereof).
Have an affinity for Preferred binding affinity is 5 × 10^-2 M, 10^-2M, 5 × 10^-3M, 10^-3M, 5 × 10^-FourM, 10^-FourM, 5 × 10^-Five M, 10^-FiveM, 5 × 10^-6M, 10^-6M, 5 × 10^-7M, 10^-7M, 5 × 10^-8 M, 10^-8M, 5 × 10^-9M, 10^-9M, 5 × 10^-TenM, 10^-TenM, 5 × 10 ^-11 M, 10^-11M, 5 × 10^-12M, 10^-12M, 5 × 10^-13M, 10^-13M, 5
× 10^-14M, 10^-14M, 5 × 10^-15M, and 10^-15Dissociation constant smaller than M
That is, a binding affinity having Kd can be mentioned.

【０２７３】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードするタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。Gene Therapy In certain embodiments, a nucleic acid comprising a sequence encoding an antibody or a functional derivative thereof treats a disease or disorder associated with abnormal expression and / or activity of a polypeptide of the invention. Administered for gene therapy purposes to inhibit or prevent. Gene therapy refers to therapy performed by the administration of an expressed or expressible nucleic acid to a subject. In this embodiment of the invention, the nucleic acids produce their encoded proteins, which mediate a therapeutic effect.

【０２７４】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。Any of the methods for gene therapy available in the art can be used according to the present invention. An exemplary method is described below.

【０２７５】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，１９９
３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；Ｗｕおよび
Ｗｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅ
ｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：
５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２
６−９３２；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５を参照のこと。使用され得る、組換えＤ
ＮＡ技術の分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），
１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ；およびＫｒｉｅ
ｇｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓ
ｓ，ＮＹに記載される。For a general review of methods for gene therapy, see Goldspiel et al., 199.
3, Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshhe.
v, 1993, Ann. Rev .. Pharmacol. Toxicol. 32:
573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 92.
6-932; and Morgan and Anderson, 1993, Ann.
. Rev .. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB.
TECH 11 (5): 155-215. Recombinant D that can be used
Methods generally known in the field of NA technology are described in Ausubel et al.
1993, Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, NY; and Krie
gler, 1990, Gene Transfer and Expressi.
on, A Laboratory Manual, Stockton Pres
s, NY.

【０２７６】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って抗体をコードする核酸の染
色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５；Ｚ
ｉｊｌｓｔｒａら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）。特定
の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの核酸
配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方またはそのフラグメントをコードする
配列を含む。In a preferred aspect, the compound comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody, wherein the nucleic acid sequence is an expression vector that expresses the antibody, or a fragment or chimeric protein thereof, or a heavy or light chain thereof, in a suitable host. Part of. In particular, such nucleic acid sequences have a promoter operably linked to the antibody coding region, wherein the promoter is inducible or constitutive, and optionally tissue-specific. In another particular embodiment, a nucleic acid molecule is used in which the sequence encoding the antibody and any other desired sequences are flanked by regions that promote homologous recombination at the desired site in the genome, thus rendering the antibody Provides intrachromosomal expression of the encoding nucleic acid (Koller and Smithies, 1989, p.
rc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Z
ijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438). In certain embodiments, the expressed antibody molecule is a single-chain antibody; or the nucleic acid sequence comprises a sequence encoding both the heavy and light chains of the antibody or a fragment thereof.

【０２７７】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロでそ
の核酸により形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。
これらの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺
伝子治療としてそれぞれ公知である。Delivery of a nucleic acid to a patient can be direct (where the patient is directly exposed to the nucleic acid or nucleic acid-bearing vector) or indirect (where the cells are first transformed in vitro with the nucleic acid). And then implanted into the patient).
These two approaches are known, respectively, as in vivo gene therapy or as ex vivo gene therapy.

【０２７８】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた産物を産生する。これは、当該分野で公知の
多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し、
そしてそれを細胞内になるように投与することにより（例えば、欠損性または弱
毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国特許第４，９８０，
２８６号を参照のこと）を用いた感染により、あるいは、裸のＤＮＡの直接注射
により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面のレセプタ
ーまたはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、あるいは、リポソ
ーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化により、あるいは、そ
れらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与することにより、レ
セプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合させて投与すること
により（例えば、ＷｕおよびＷｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２
：４４２９−４４３２を参照のこと）（これは、レセプターを特異的に発現する
細胞の型を標的にするために用いられ得る）など）のいずれかにより達成され得
る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで、リガ
ンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルス
性ペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避するようにする。さらに別の実
施形態において、核酸は、特異的なレセプターを標的とすることにより、細胞特
異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的とされ得る（例えば、１９９
２年４月１６日付のＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号（Ｗｕら）；１９９２
年１２月２３日付の同第ＷＯ９２／２２６３５号（Ｗｉｌｓｏｎら）；１９９２
年１１月２６日付の同第ＷＯ９２／２０３１６号（Ｆｉｎｄｅｉｓら）；１９９
３年７月２２日付の同第ＷＯ９３／１４１８８号（Ｃｌａｒｋｅら）、１９９３
年１０月１４日付の同第ＷＯ９３／２０２２１号（Ｙｏｕｎｇら）を参照のこと
）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得、そして相同組換えにより、発現
のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉ
ｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９
３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３
５−４３８）。In certain embodiments, a nucleic acid sequence is administered directly in vivo, where the nucleic acid sequence is expressed to produce an encoded product. This involves a number of methods known in the art, such as constructing them as part of a suitable nucleic acid expression vector,
And by administering it intracellularly (eg, a defective or attenuated retrovirus or other viral vector (US Pat. No. 4,980,
286), or by direct injection of naked DNA, or by microparticle bombardment (eg, a gene gun; Biolis).
tic, Dupont), or by coating with lipids or cell surface receptors or transfectants, or by encapsulation in liposomes, microparticles, or microcapsules, or by allowing them to enter the nucleus. By binding and administering a known peptide, and by binding to a ligand that undergoes receptor-mediated endocytosis (eg, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262).
: 4429-4432), which can be used to target cell types that specifically express the receptor. In another embodiment, a nucleic acid-ligand complex may be formed, wherein the ligand comprises a fusogenic viral peptide that disrupts endosomes, such that the nucleic acid avoids lysosomal degradation. In yet another embodiment, nucleic acids can be targeted in vivo for cell-specific uptake and expression by targeting specific receptors (eg, 199).
PCT Publication No. WO 92/06180 dated April 16, 2002 (Wu et al.); 1992.
No. WO 92/22635 (Wilson et al.) Dated December 23, 1992;
No. WO92 / 20316 (Findeis et al.) Dated Nov. 26, 1999;
WO 93/14188 (Clarke et al.), Jul. 22, 1993, 1993.
No. WO 93/20221 (Young et al.) Dated October 14, 2008). Alternatively, the nucleic acid can be introduced inside the cell and integrated into host cell DNA for expression by homologous recombination (Koller and Smithi).
es, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:89
32-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 43.
5-438).

【０２７９】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９を
参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムのパッケ
ージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要でないレトロウイルス配
列を欠失している。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は
、一つ以上のベクター中にクローン化され、これは、患者内への遺伝子の送達を
容易にする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら
，１９９４，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（これは、造血性幹細
胞を化学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒＩ遺伝子をこの幹細胞に送
達するための、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺
伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以
下である：Ｃｌｏｗｅｓら，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６
４４−６５１；Ｋｉｅｍら，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３
；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，１９９３，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌ
ｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄ
ｅｖｅｌ．３：１１０−１１４。In certain embodiments, a viral vector is used that contains a nucleic acid sequence encoding an antibody of the invention. For example, retroviral vectors can be used (Mi
ller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599). These retroviral vectors lack retroviral sequences that are not required for packaging of the viral genome and integration into host cell DNA. Nucleic acid sequences encoding antibodies used in gene therapy are cloned into one or more vectors, which facilitates delivery of the gene into a patient. Further details on retroviral vectors can be found in Boesen et al., 1994, Biotherapy 6: 291-302, which is used to deliver the mdrI gene to hematopoietic stem cells to make them more resistant to chemotherapy. Which describes the use of retroviral vectors). Other references describing the use of retroviral vectors in gene therapy are: Clowes et al., 1994, J. Am. Clin. Invest. 93: 6
44-651; Kiem et al., 1994, Blood 83: 1467-1473.
Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene;
Therapy 4: 129-141; and Grossman and Wil
son, 1993, Curr. Opin. in Genetics and D
evel. 3: 110-114.

【０２８０】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスに基づく送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系
、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非***細胞に感染すること
ができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，１９９３
，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療
の概説を示す。Ｂｏｕｔら，１９９４，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
５：３−１０は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイルス
ベクターの使用を証明した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例
は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３
４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，１９９２，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５；Ｍａ
ｓｔｒａｎｇｅｌｉら，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５
−２３４；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，１９９５
，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３に見出され得る。好ましい実
施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。[0280] Adenoviruses are other viral vectors that can be used in gene therapy. Adenoviruses are particularly attractive vehicles for delivering genes to the respiratory epithelium. Adenoviruses naturally infect respiratory epithelia where they cause a mild disease. Other targets for adenovirus-based delivery systems are the liver, central nervous system, endothelial cells, and muscle. Adenovirus has the advantage that it can infect non-dividing cells. Kozarsky and Wilson, 1993
, Current Opinion in Genetics and Dev
element 3: 499-503 provides an overview of adenovirus-based gene therapy. Bout et al., 1994, Human Gene Therapy.
5: 3-10 demonstrated the use of adenovirus vectors to transfer genes to the airway epithelium of rhesus monkeys. Other examples of the use of adenoviruses in gene therapy are described in Rosenfeld et al., 1991, Science 252: 431-43.
4; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143-155; Ma.
strangeli et al., 1993, J. Am. Clin. Invest. 91: 225
-234; PCT Publication No. WO 94/12649; and Wang et al., 1995.
, Gene Therapy 2: 775-783. In a preferred embodiment, an adenovirus vector is used.

【０２８１】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ
．２０４：２８９−３００；米国特許第５，４３６，１４６号）。Adeno-associated virus (AAV) has also been proposed for use in gene therapy (Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med.
. 204: 289-300; U.S. Patent No. 5,436,146).

【０２８２】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を含む。通常、移入の方
法は、選択マーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入された遺伝子
を取り込みそして発現する細胞を単離するために選沢下に置かれる。それらの細
胞は次いで、患者に送達される。Another approach to gene therapy involves transferring the gene to cells in tissue culture by such methods as electroporation, lipofection, calcium phosphate mediated transfection, or viral infection. Usually, the method of transfer involves the transfer of a selectable marker to the cells. The cells are then placed under selection to isolate cells that take up and express the transferred gene. The cells are then delivered to the patient.

【０２８３】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるがこれらに限定されない
：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染
、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフェ
ロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野において
多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，１９９３
，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８；Ｃｏｈｅｎら，１９９
３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４；Ｃｌｉｎｅ，１９８
５，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２を参照のこと）、そしてレシ
ピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないならば、本発明
に従って使用され得る。この技術は、核酸の細胞への安定した移入を提供するべ
きであり、その結果、核酸は、細胞により発現可能であり、好ましくは、その細
胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。In this embodiment, the nucleic acid is introduced into the cells prior to in vivo administration of the resulting recombinant cells. Such introduction can be performed by any method known in the art, including but not limited to: transfection, electroporation, microinjection, viral vectors containing nucleic acid sequences. Or bacteriophage vector infection, cell fusion, chromosome-mediated gene transfer, microcell-mediated gene transfer, spheroplast fusion, and the like. Numerous techniques are known in the art for introducing foreign genes into cells (eg, Loeffler and Behr, 1993).
, Meth. Enzymol. 217: 599-618; Cohen et al., 199.
3, Meth. Enzymol. 217: 618-644; Cine, 198.
5, Pharmac. Ther. 29: 69-92), and may be used in accordance with the invention provided that the necessary developmental and physiological functions of the recipient cells are not disrupted. This technique should provide for a stable transfer of the nucleic acid into the cell, so that the nucleic acid is expressible by the cell, and preferably is inherited and expressible by the progeny of the cell.

【０２８４】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。[0284] The resulting recombinant cells can be delivered to a patient by various methods known in the art. Recombinant blood cells (eg, hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells) are preferably administered intravenously. The amount of cells contemplated for use depends on the desired effect, patient condition, etc., and can be determined by one skilled in the art.

【０２８５】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、
ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単
球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹
細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍
帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。Cells into which nucleic acid can be introduced for purposes of gene therapy include any desired available cell types, including but not limited to: epithelial cells, endothelial cells,
Keratinocytes, fibroblasts, muscle cells, hepatocytes; blood cells such as T lymphocytes, B lymphocytes, monocytes, macrophages, neutrophils, eosinophils, megakaryocytes, granulocytes; various stem or progenitor cells; In particular, hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells (eg, cells obtained from bone marrow, umbilical cord blood, peripheral blood, fetal liver, etc.).

【０２８６】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。In a preferred embodiment, the cells used for gene therapy are autologous to the patient.

【０２８７】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、そして次いで組換え細胞は、治療的効果のためにインビボで
投与される。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。イ
ンビトロで単離され得、そしてインビトロで保存され得る任意の幹細胞および／
または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例え
ば、１９９４年４月２８日付のＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：Ｓｔｅｍ
ｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５；
Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，１９８０，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９
；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，１９８６，Ｍａｙｏ Ｃｌｉ
ｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１を参照のこと）。In embodiments where recombinant cells are used in gene therapy, the nucleic acid sequence encoding the antibody is introduced into the cell such that the nucleic acid sequence is expressible by the cell or progeny thereof, and then the recombinant cell Is administered in vivo for a therapeutic effect. In certain embodiments, stem cells or progenitor cells are used. Any stem cells and / or that can be isolated in vitro and stored in vitro
Alternatively, progenitor cells can potentially be used according to this embodiment of the invention (eg, PCT Publication No. WO 94/08598, April 28, 1994: Stem).
ple and Anderson, 1992, Cell 71: 973-985;
Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A: 229
And Pittelkov and Scott, 1986, Mayo Cli;
nic Proc. 61: 771).

【０２８８】 特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コード
領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、この核酸
の発現は、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可能
である。In certain embodiments, the nucleic acid to be introduced for gene therapy purposes contains an inducible promoter operably linked to the coding region, such that expression of the nucleic acid is controlled by appropriate transcriptional induction. It can be controlled by controlling the presence or absence of the factor.

【０２８９】 （治療活性または予防活性の証明） 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試
験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性
を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプル
に対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対す
る化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセ
イおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決
定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるかどうかを決定す
るために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセ
イが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養において増殖し、そ
して化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サン
プルに対するそのような化合物の効果が観察される。Demonstration of therapeutic or prophylactic activity Compounds or pharmaceutical compositions of the invention are preferably tested in vitro prior to use in humans and then in vivo for the desired therapeutic or prophylactic activity. Is done. For example, in vitro assays to demonstrate the therapeutic or prophylactic utility of a compound or pharmaceutical composition include the effect of the compound on a cell line or patient tissue sample. The effect of a compound or composition on a cell line and / or tissue sample can be determined utilizing techniques known to those of skill in the art, including, but not limited to, rosette formation assays and cell lysis assays. In vitro assays that can be used to determine whether administration of a particular compound is indicated, in accordance with the present invention, include in vitro cell culture assays, in which a patient tissue sample grows in culture and the compound Or the compound is administered otherwise, and the effect of such compound on the tissue sample is observed.

【０２９０】 （治療的／予防的な投与および組成物） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、効果を制限するかまたは
望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体としては好ましくは
、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに
限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好まし
くはヒトである。Therapeutic / Prophylactic Administration and Compositions The present invention provides for treatment, inhibition and prevention by administering to a subject an effective amount of a compound or pharmaceutical composition of the invention, preferably an antibody of the invention. Provide a way. In a preferred aspect, the compound is substantially purified (eg, substantially free of substances that limit its effect or produce undesired side effects). The subject is preferably an animal, including but not limited to animals such as cows, pigs, horses, chickens, cats, dogs, and the like, and is preferably a mammal, and most preferably a human.

【０２９１】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。The formulations and methods of administration that can be used when the compound comprises a nucleic acid or an immunoglobulin are described above; further suitable formulations and routes of administration are selected from those described herein below. Can be done.

【０２９２】 様々な送達システムが公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用
いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発
現が可能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（
例えば、ＷｕおよびＷｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２
９−４４３２を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部として
の核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、
鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物
または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射
により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）
を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に
投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学
的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包
含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付
けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入する
ことが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤
を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。A variety of delivery systems are known and can be used to administer the compounds of the invention (eg, liposomes, microparticles, microcapsules, encapsulation in recombinant cells capable of expressing the compounds). , Receptor-mediated endocytosis (
See, for example, Wu and Wu, 1987, J. Am. Biol. Chem. 262: 442
9-4432), construction of nucleic acids as part of retroviruses or other vectors, etc.). The method of introduction is intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous,
Including but not limited to intranasal, epidural, and oral routes. The compound or composition may be administered by any convenient route (eg, by infusion or bolus injection, by epithelial or mucosal lining (eg, oral, rectal and intestinal mucosa).
And by co-administration with other biologically active agents. Administration can be systemic or local. In addition, the pharmaceutical compounds or compositions of the present invention can be administered by any suitable route, including intraventricular and intrathecal injections; intraventricular injection can be, for example, an intraventricularly attached reservoir such as an Ommaya reservoir. It may be desirable to introduce it into the central nervous system (which can be facilitated by a catheter). Pulmonary administration may also be used, for example, with the use of an inhaler or nebulizer, and formulation with an aerosolizing agent.

【０２９３】 特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成
され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク
質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。In certain embodiments, it may be desirable to administer the pharmaceutical compounds or compositions of the invention locally to the area in need of treatment; this is not a limitation, but includes, for example, surgery. By local injection, topical application (eg, in combination with a post-operative wound dressing), by injection, by catheter, by suppository, or by an implant (this implant may be a membrane such as a sialastic membrane or (Including porous, non-porous, or glue-like materials, including fibers). Preferably, when administering a protein of the invention, including an antibody, care must be taken to use materials to which the protein does not absorb.

【０２９４】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−
１５３３；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏ
ｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同
書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。In another embodiment, the compound or composition can be delivered into vesicles, especially liposomes (Langer, 1990, Science 249: 1527-).
1533; Treat et al., Liposomes in the Therapy.
of Infectious Disease and Cancer, Lo
pez-Berstein and Fidler (eds.), Liss, New Y
ork, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berstein, ibid., p. 317-327; see broadly ibid.).

【０２９５】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム
中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ
８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１
：５７４を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（
Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒ
ｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏ
ｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒ
ｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉ
ｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），
Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ
，Ｊ．１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３：６１を参照のこと；Ｌｅｖｙら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２
８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１
；Ｈｏｗａｒｄら，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５もまた参
照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出システムは、治療標
的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例
えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（
１９８４）を参照のこと）。[0295] In yet another embodiment, the compound or composition can be delivered in a controlled release system. In one embodiment, a pump may be used (Lang
er, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biome
d. Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980, Surgery.
88: 507; Saudek et al., 1989, N.M. Engl. J. Med. 321
: 574). In another embodiment, a polymeric material may be used (
Medical Applications of Controlled R
release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres. , Bo
ca Raton, Florida (1974); Controlled Dr
ug Bioavailability, Drug Product Design
gn and Performance, Smolen and Ball (eds.),
Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas.
, J. et al. 1983, Macromol. Sci. Rev .. Macromol. Ch
em. 23:61; Levy et al., 1985, Science 22.
8: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351
Howard et al., 1989, J .; Neurosurg. 71: 105). In yet another embodiment, the controlled release system can be placed near the therapeutic target, ie, the brain, and thus requires only a portion of the systemic dose (eg, Goodson, Medical Applications of C).
Controlled Release, (supra), Volume 2, pp. 115-138 (
1984)).

【０２９６】 他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒによる総説において議論される
（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）。Other controlled release systems are discussed in the review by Langer (1990, Science 249: 1527-1533).

【０２９７】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、特定の実施形態におい
て、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そしてそ
れが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクター
の使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注
射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔ
ｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプターも
しくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入ること
が公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、Ｊ
ｏｌｉｏｔら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
８：１８６４−１８６８を参照のこと）など）により、そのコードされたタンパ
ク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞
内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組
み込まれ得る。In certain embodiments, where the compound of the invention is a nucleic acid encoding a protein, the nucleic acid comprises it as part of a suitable nucleic acid expression vector and is administered such that it is intracellular. (Eg, by using retroviral vectors (see US Pat. No. 4,980,286)) or by direct injection, or by microparticle bombardment (eg, a gene gun; Biolist).
ic, Dupont) or by coating with lipids or cell surface receptors or transfectants, or in conjunction with a homeobox-like peptide known to enter the nucleus (eg, J
oliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
8: 1864-1868), etc.) to enhance the expression of the encoded protein. Alternatively, the nucleic acid can be introduced intracellularly and integrated into host cell DNA by homologous recombination for expression.

【０２９８】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。特定の実施形態において、
用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおけ
る使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または米
国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。用
語「キャリア」とは、治療剤がともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形
剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石油
起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆
油、鉱油、ごま油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬学
的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶
液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能
な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤として
は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、
小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グ
リセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グ
リコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるならば
、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物
は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物など
の形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのような
キャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級のマン
ニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナト
リウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得る。
適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。こ
のような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切
な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する。
処方物は、投与形態に適するべきである。[0298] The present invention also provides pharmaceutical compositions. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the compound, and a pharmaceutically acceptable carrier. In certain embodiments,
The term "pharmaceutically acceptable" refers to compounds approved by the Federal Regulatory Authority or the United States Government for use in animals, and more particularly in humans, or in the United States Pharmacopeia or other generally accepted pharmacopoeias. It means that it was listed. The term "carrier" refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic is administered. Such pharmaceutical carriers include sterile liquids such as water and oils, including oils of petroleum, animal, plant, or synthetic origin (eg, peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like). Can be Water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice,
Flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skim milk powder, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol and the like. The composition may also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents, if desired. These compositions may take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release formulations and the like. The composition can be formulated as a suppository, with traditional binders and carriers such as triglycerides. Oral formulations can include standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharine, cellulose, magnesium carbonate, and the like.
Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in W. "Remingto by Martin
n's Pharmaceutical Sciences ". Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the compound, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier to provide a form for proper administration to the patient.
The formulation should suit the mode of administration.

【０２９９】 好ましい実施形態においては、この組成物は、ヒトへの静脈投与のために適応
される薬学的組成物として、慣用的な手順に従って処方される。典型的には、静
脈投与のための組成物は、滅菌された等張緩衝液の水溶液である。必要な場合、
この組成物はまた、可溶化剤および注射の部位の痛みを和らげるためのリグノカ
インなどの局所麻酔薬を含み得る。一般的に、これらの成分は、別々に供給され
るかまたは一緒に混合されて単位用量形態（例えば、凍結乾燥粉末または無水濃
縮物として）で、活性な薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器に
入って供給されるかのいずれかである。この組成物が注入により投与される場合
、それは、滅菌された薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入瓶を用いて調
合され得る。この組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合さ
れ得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。In a preferred embodiment, the composition is formulated according to conventional procedures, as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to humans. Typically, compositions for intravenous administration are aqueous solutions of sterile isotonic buffer. if necessary,
The composition may also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lignocaine to ease pain at the site of the injection. Generally, these components are supplied separately or mixed together in unit dosage form (for example, as a lyophilized powder or anhydrous concentrate) to indicate the amount of active agent, such as an ampoule or sachet. It is either supplied in a sealed container. When the composition is administered by infusion, it can be dispensed with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. When the composition is administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline can be provided so that the ingredients may be mixed prior to administration.

【０３００】 本発明の化合物は、中性または塩形態として処方され得る。薬学的に受容可能
な塩は、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるよ
うなアニオンと形成される塩、および例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニ
ウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エ
チルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるようなカチ
オンと形成される塩を含む。The compounds of the present invention may be formulated as neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include, for example, salts formed with anions, such as those derived from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids, and the like, and, for example, sodium, potassium, ammonium, calcium, iron hydroxide And cations such as those derived from isopropylamine, triethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine, and the like.

【０３０１】 本発明のポリペプチドの異常発現および／または異常活性に関連する疾患また
は障害の処置、阻害および予防に有効な本発明の化合物の量は、標準的な臨床技
術により決定され得る。さらに、最適な用量範囲を同定するのを補助するために
、インビトロアッセイが必要に応じて使用され得る。処方物中に使用される正確
な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤度に依存し、そして医
師の判断およびそれぞれの患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量
は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導される用量応答曲線より外挿さ
れ得る。The amount of a compound of the present invention that is effective in treating, inhibiting and preventing a disease or disorder associated with abnormal expression and / or abnormal activity of a polypeptide of the present invention can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro assays may optionally be employed to help identify optimal dosage ranges. The precise dose to be used in the formulation will also depend on the route of administration, and the seriousness of the disease or disorder, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient's circumstances. Effective doses can be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model test systems.

【０３０２】 抗体については、患者に投与される用量は、典型的には、患者体重の０．１ｍ
ｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、患者に投与される用量は、患
者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間、より好ましくは、患者の
体重の１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。一般的に、ヒト抗体は、外来のポ
リペプチドに対する免疫応答に帰因する他の種由来の抗体よりも長いヒト身体中
での半減期を有する。従って、ヒト抗体のより少ない用量、およびより少ない頻
度の投与がしばしば可能である。さらに、本発明の抗体の用量および投与の頻度
は、改変（例えば、脂質化など）により、抗体の取り込みおよび細胞貫入（例え
ば脳の中への）を増強することにより減少され得る。For antibodies, the dosage administered to a patient is typically 0.1 m of patient weight.
g / kg to 100 mg / kg. Preferably, the dose administered to a patient is between 0.1 mg / kg and 20 mg / kg of the patient's body weight, more preferably 1 mg / kg to 10 mg / kg of the patient's body weight. Generally, human antibodies have a longer half-life in the human body than antibodies from other species that are attributable to the immune response to the foreign polypeptide. Thus, lower doses and less frequent administration of human antibodies is often possible. In addition, the dose and frequency of administration of the antibodies of the invention can be reduced by modification (eg, lipidation, etc.) to enhance antibody uptake and cell penetration (eg, into the brain).

【０３０３】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を充填した１つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような
容器に必要に応じて付属し得、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用ま
たは販売に関する政府機関による承認を反映する。診断および画像化。The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the present invention. A notice in the form of a government agency that regulates the manufacture, use or sale of pharmaceuticals or biological products may optionally accompany such containers, and may include a notice of manufacture for human administration. , Reflect government approval for use or sale. Diagnosis and imaging.

【０３０４】 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識された抗体、ならびにそれらの誘
導体およびアナログは、本発明のポリペプチドの異常発現および／または異常活
性に関連する疾患および／または障害を検出、診断またはモニターする診断目的
のために用いられ得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常発現の検出を提供
し、これは以下の工程を含む：（ａ）目的のポリペプチドに対して特異的な１以
上の抗体を用いて、個体の細胞または体液における目的のポリペプチドの発現を
アッセイする工程および（ｂ）遺伝子発現のレベルを標準の遺伝子発現レベルと
比較し、それによって標準の発現レベルと比較してアッセイされたポリペプチド
遺伝子発現レベルにおける増加または減少が異常発現を示す工程。Labeled antibodies that specifically bind to a polypeptide of interest, and derivatives and analogs thereof, detect diseases and / or disorders associated with abnormal expression and / or activity of the polypeptides of the invention, It can be used for diagnostic purposes to diagnose or monitor. The present invention provides for the detection of abnormal expression of a polypeptide of interest, comprising the following steps: (a) using one or more antibodies specific for the polypeptide of interest, the cells of an individual or Assaying the expression of the polypeptide of interest in a body fluid; and (b) comparing the level of gene expression to a standard gene expression level, thereby increasing the assayed polypeptide gene expression level relative to the standard expression level Or a step in which the decrease indicates abnormal expression.

【０３０５】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、これは以下を含む：
（ａ）目的のポリペプチドに対して特異的な１以上の抗体を用いて、個体の細胞
または体液における目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程および（ｂ）
遺伝子発現のレベルを標準の遺伝子発現レベルと比較し、それによって標準の発
現レベルと比較してアッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルにおける増加
または減少が特定の障害を示す工程。癌に関しては、個体由来の生検された組織
中の相対的に高い量の転写物の存在は、疾患の発症の素因を示し得るか、または
実際の臨床的な症状が明らかとなる前に疾患を検出するための手段を提供し得る
。より決定的なこのタイプの診断は、保健専門家が早く予防策または積極的な処
置を使用し、それによって癌の発症またはさらなる進行を防ぐことを可能にし得
る。The present invention provides diagnostic assays for diagnosing a disorder, including:
(A) assaying the expression of the polypeptide of interest in cells or body fluids of the individual using one or more antibodies specific for the polypeptide of interest; and (b)
Comparing the level of gene expression to a standard gene expression level, whereby an increase or decrease in the polypeptide gene expression level assayed relative to the standard expression level indicates a particular disorder. With respect to cancer, the presence of relatively high amounts of transcripts in biopsied tissue from an individual may be predisposed to the onset of the disease, or the disease may be preceded by actual clinical symptoms. Can be provided. A more conclusive diagnosis of this type may allow health professionals to use precautionary measures or aggressive treatment early, thereby preventing the onset or further progression of cancer.

【０３０６】 本発明の抗体は、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を用いて、生物学
的なサンプルにおけるタンパク質レベルをアッセイするために用いられ得る（例
えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−
９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質の遺伝子発
現を検出するのに有用な、他の抗体に基づく方法には、イムノアッセイ（例えば
、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ））が含まれる。適切な抗体アッセイの標識は、当該分野で公知であり
、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；ラジオアイソトープ（
例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、ト
リチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ
））；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレ
セインおよびローダミン）およびビオチンが挙げられる。The antibodies of the present invention can be used to assay protein levels in biological samples using classical immunohistological methods known to those of skill in the art (eg, Jalkanen, M., et al.). J. Cell. Biol.
985 (1985); Jalkanen, M .; J. et al. Cell. Biol. 1
05: 3087-3096 (1987)). Other antibody-based methods useful for detecting gene expression of a protein include immunoassays such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) and radioimmunoassays (RIAs). Suitable antibody assay labels are known in the art and include enzyme labels (eg, glucose oxidase); radioisotopes (
For example, iodine (125I, 121I), carbon (14C), sulfur (35S), tritium (3H), indium (112In), and technetium (99Tc
)); Luminescent labels (eg, luminol); and fluorescent labels (eg, fluorescein and rhodamine) and biotin.

【０３０７】 本発明の１つの局面は、動物（好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒト
）における、目的のポリペプチドの異常な発現に関連する疾患または障害の、検
出および診断である。１つの実施形態においては、診断は、以下を含む：ａ）被
験体に、目的のポリペプチドに特異的に結合する有効量の標識分子を投与する（
例えば、非経口的投与、皮下投与、または腹腔内投与）工程；ｂ）投与後に、標
識分子が、被験体におけるこのポリペプチドが発現される部位に、優先的に濃縮
させるため（そして非結合標識分子が、バックグラウンドレベルまで清澄化され
るため）の時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；
およびｄ）バックグラウンドレベルを超える標識分子の検出が、この被験体が目
的のポリペプチドの異常な発現に関連する特定の疾患または障害を有することを
示すように、この被験体中の標識分子を検出する工程。バックグラウンドレベル
は、検出された標識分子の量と、特定の系について予め決定された標準値を比較
する方法を含む、種々の方法により決定され得る。One aspect of the present invention is the detection and diagnosis of a disease or disorder associated with aberrant expression of a polypeptide of interest in an animal, preferably a mammal, most preferably a human. In one embodiment, the diagnosis comprises: a) administering to the subject an effective amount of a labeled molecule that specifically binds the polypeptide of interest (
E.g., parenteral, subcutaneous, or intraperitoneal administration) steps; b) after administration, the labeled molecule is preferentially concentrated (and unbound labeled) at the site where the polypeptide is expressed in the subject. Waiting for a time interval (because the molecule is clarified to the background level); c) determining the background level;
And d) labeling the labeled molecule in the subject such that detection of the labeled molecule above background levels indicates that the subject has a particular disease or disorder associated with abnormal expression of the polypeptide of interest. The step of detecting. Background levels can be determined by a variety of methods, including methods that compare the amount of labeled molecule detected to a standard value predetermined for a particular system.

【０３０８】 被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するため
に必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体
部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、^99mＴ
ｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体
フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。イ
ンビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ
ａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉ
ｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ
ｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編
、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される
。It will be understood in the art that the size of the subject and the imaging system used will determine the amount of imaging moiety required to generate a diagnostic image. In the case of a radioisotope moiety, for a human subject, the amount of radioactivity injected is usually ^99mT
c ranges from about 5 to 20 millicuries. The labeled antibody or antibody fragment is then preferentially accumulated at locations in the cell that contain the particular protein. In vivo tumor imaging is described by S.D. W. Burchiel et al., Immunopharm.
acokinetics of Radiolabeled Antibodi
es and Their Fragments. (Tumor Image
ng: The Radiochemical Detection of Ca
Chapter 13, S.Ncer. W. Burchiel and B.A. A. Rhodes, Masson Publishing Inc. (1982)).

【０３０９】 用いられる標識の型および投与の様式を含む、いくつかの可変要素に依存して
、標識分子が被験体の部位に優先的に濃縮し、そして非結合性の標識分子がバッ
クグラウンドレベルまで清澄化されることを可能にする、投与後の時間間隔は、
６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態にお
いては、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間である。Depending on a number of variables, including the type of label used and the mode of administration, the label molecule will preferentially concentrate at the site of the subject, and the unbound label molecule will remain at background levels The time interval after administration, allowing to be clarified to
6 to 48 hours or 6 to 24 hours or 6 to 12 hours. In another embodiment, the time interval after administration is 5-20 days or 5-10 days.

【０３１０】 １つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、疾患または障
害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最初の
診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。In one embodiment, monitoring of the disease or disorder comprises repeating the method for diagnosing the disease or disorder (eg, 1 month after first diagnosis, 6 months after first diagnosis, after 1st diagnosis, 1 year).

【０３１１】 標識分子の存在は、当該分野において公知のインビボ走査の方法を用いて、患
者から検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に依存する。当業者
は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明の診断方法に
おいて用いられ得る方法およびデバイスとしては、限定はされないが、コンピュ
ーター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影法（ＰＥＴ）
のような全身走査、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、および超音波診断法が挙げられる。[0311] The presence of a labeled molecule can be detected from a patient using in vivo scanning methods known in the art. These methods depend on the type of label used. One of skill in the art can determine the appropriate method for detecting a particular label. Methods and devices that can be used in the diagnostic methods of the present invention include, but are not limited to, computed tomography (CT), proton emission tomography (PET).
Whole body scanning, magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound diagnostics.

【０３１２】 特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射
線反応性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合
物で標識され、そして蛍光反応性の走査機器を用いて患者から検出される。別の
実施形態においては、この分子は陽電子放出金属で標識され、そして陽子射出断
層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）から検出される。さらに別の実施形態に
おいては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴像（ＭＲＩ）を用
いて患者から検出される。In certain embodiments, the molecule is labeled with a radioisotope and detected from the patient using a radioactive surgical instrument (Thurston et al., US Pat. No. 5,441,050). . In another embodiment, the molecule is labeled with a fluorescent compound and detected from the patient using a fluorescently responsive scanning device. In another embodiment, the molecule is labeled with a positron emitting metal and is detected from the patient using proton emission tomography. In yet another embodiment, the molecule is labeled with a paramagnetic label and detected from the patient using magnetic resonance imaging (MRI).

【０３１３】 （キット） 本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。１つの実施形
態においては、キットは、１以上の容器に入った本発明の抗体（好ましくは精製
された抗体）を含む。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキッ
トに含まれる抗体に対して特異的に免疫反応性のエピトープを含む、実質的に単
離されたポリペプチドを含む。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプ
チドと反応しないコントロール抗体を、さらに含む。別の特定の実施形態におい
ては、本発明のキットは、抗体と目的のポリペプチドとの結合を検出するための
手段（例えば、検出可能な基質（例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物
または発光化合物）と結合し得る抗体、または検出可能な基質と結合し得る一次
抗体を認識する二次抗体）を含む。(Kit) The present invention provides a kit that can be used in the above method. In one embodiment, the kit comprises an antibody of the invention (preferably a purified antibody) in one or more containers. In certain embodiments, the kits of the invention comprise a substantially isolated polypeptide comprising an epitope specifically immunoreactive with the antibodies contained in the kit. Preferably, the kit of the present invention further comprises a control antibody that does not react with the polypeptide of interest. In another specific embodiment, the kit of the invention comprises a means for detecting the binding of the antibody to the polypeptide of interest (eg, a detectable substrate (eg, a fluorescent compound, an enzyme substrate, a radioactive compound or a luminescent compound). Compound) or a secondary antibody that recognizes a primary antibody that can bind to a detectable substrate).

【０３１４】 別の特定の本発明の実施形態においては、このキットは、増殖性および／また
は癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清
をスクリーニングする際に用いる診断用キットである。このようなキットは、目
的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を含み得る。このようなキット
は、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体に対して特異的に免疫反応性のエ
ピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を含み得る。さらに、こ
のようなキットは、この抗体の抗原への結合を検出するための手段（例えば、フ
ローサイトメトリーにより検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのよ
うな蛍光化合物と結合し得る抗体）を含む。特定の実施形態においては、このキ
ットは、組み換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に合成されたポ
リペプチド抗原を含み得る。このキットのポリペプチド抗原はまた、固体支持体
に付着され得る。In another particular embodiment of the invention, the kit is a diagnostic kit for use in screening serum containing antibodies specific for proliferative and / or cancerous polynucleotides and polypeptides. It is a kit. Such a kit can include a control antibody that does not react with the polypeptide of interest. Such a kit may include a substantially isolated polypeptide antigen comprising an epitope specifically immunoreactive with at least one anti-polypeptide antigen antibody. Further, such kits include means for detecting the binding of the antibody to the antigen (eg, an antibody capable of binding to a fluorescent compound such as fluorescein or rhodamine, which can be detected by flow cytometry). In certain embodiments, the kit may include a recombinantly produced polypeptide antigen or a chemically synthesized polypeptide antigen. The polypeptide antigens of the kit can also be attached to a solid support.

【０３１５】 より特定の実施形態においては、上記のキットの検出手段は、このポリペプチ
ド抗原が付着される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識抗ヒト抗体を含む。この実施形態においては、抗体とポリペプチド抗原
との結合はこのレポーター標識抗体の結合により検出され得る。In a more particular embodiment, the detection means of the above kit comprises a solid support to which the polypeptide antigen is attached. Such kits also include a non-attached reporter-labeled anti-human antibody. In this embodiment, binding of the antibody to the polypeptide antigen can be detected by binding of the reporter-labeled antibody.

【０３１６】 さらなる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む
血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットを含む。この診断用キットは
、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性の実質的に単
離された抗体、およびポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原と抗体との結合
を検出する手段を含む。１つの実施形態においては、抗体は、固体支持体に付着
される。特定の実施形態においては、その抗体は、モノクロナール抗体であり得
る。このキットの検出手段は、第二の標識モノクロナール抗体を含み得る。ある
いは、またはさらに、この検出手段は、標識された競合抗原を含み得る。In a further embodiment, the present invention includes a diagnostic kit for use in screening serum containing an antigen of the polypeptide of the present invention. The diagnostic kit includes a substantially isolated antibody specifically immunoreactive with a polypeptide or polynucleotide antigen, and means for detecting binding of the polynucleotide or polypeptide antigen to the antibody. In one embodiment, the antibodies are attached to a solid support. In certain embodiments, the antibodies can be monoclonal antibodies. The detection means of the kit may include a second labeled monoclonal antibody. Alternatively or additionally, the detection means may include a labeled competitor antigen.

【０３１７】 １つの診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法により得られる表面
結合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ
、そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合す
る抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、この試
薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。この試薬は、結合されない標識抗
体を除去するため、再度洗浄され、そしてこの試薬と会合したレポーターの量が
決定される。代表的には、レポーターは、適切な蛍光定量的基質、発光基質また
は比色基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、この固相をイ
ンキュベートすることにより検出される酵素である。In one diagnostic configuration, a test serum is reacted with a solid phase reagent having a surface-bound antigen obtained by a method of the invention. After binding specific antigen-antibody to the reagent and removing unbound serum components by washing, depending on the amount of anti-antigen antibody bound on the solid support, to bind the reporter to the reagent, This reagent is reacted with a reporter-labeled anti-human antibody. The reagent is washed again to remove unbound labeled antibody, and the amount of reporter associated with the reagent is determined. Typically, a reporter is an enzyme that is detected by incubating this solid phase in the presence of a suitable fluorometric, luminescent or colorimetric substrate (Sigma, St. Louis, MO).

【０３１８】 上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（
例えば、高分子ビーズ、ディップスティック、９６ウェルプレートまたは濾過材
料）に付着させるための公知の技術により調製される。これらの付着方法として
は、一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化
学的に反応性の基（例えば、活性なカルボキシル基、ヒドロキシル基、またはア
ルデヒド基）とのタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅ
ｎｔ）（代表的には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレ
プトアビジンでコートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され
得る。[0318] The solid surface reagents in the assays described above were prepared by converting the protein material to a solid support material (
For example, prepared by known techniques for attaching to polymer beads, dipsticks, 96-well plates or filtration materials). These methods of attachment generally include non-specific adsorption of proteins to the support or chemically reactive groups on the solid support (eg, active carboxyl, hydroxyl, or aldehyde groups). Covalent bond of protein with
nt) (typically via a free amine group). Alternatively, streptavidin-coated plates can be used with biotinylated antigen.

【０３１９】 従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供
する。このキットは、一般的に、表面結合された組み換え抗原を有する支持体、
および表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒ
ト抗体を含む。Thus, the present invention provides an assay system or kit for performing this diagnostic method. The kit generally comprises a support having the surface-attached recombinant antigen,
And a reporter-labeled anti-human antibody for detecting surface-bound anti-antigen antibodies.

【０３２０】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用する抗体に関する。例えば、本発明は、部分的または完全にかのいずれ
かで本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を破壊する抗体を
含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。リガ
ンド結合を妨害しないが、レセプター活性化を妨害するレセプター特異的抗体が
含まれる。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載
の技術、そうでなければ、当該分野で公知の技術により決定され得る。リガンド
結合およびレセプター活性化を両方とも妨害するレセプター特異的抗体もまた含
まれる。同様に、リガンドを結合し、そしてレセプターへのリガンドの結合を妨
害する中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによってレセプター活性化を
妨害するが、リガンドがレセプターに結合することを妨害しない抗体が含まれる
。レセプターを活性化する抗体がさらに含まれる。これらの抗体は、リガンド媒
介レセプター活性化により影響を及ぼされる全てまたは全てよりは少ないのいず
れかの生物学的活性についてのアゴニストとして作用し得る。この抗体は、本明
細書中に開示された比活性を含む生物学的活性についてのアゴニストまたはアン
タゴニストとして特定され得る。さらに、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５がＢｒａｉｎｉ
ａｃ−５レセプターと結合するか否かとは無関係に、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５と結
合する抗体が含まれる。これらの抗体は、これらの抗体の存在下でのＢｒａｉｎ
ｉａｃ−５のＢｒａｉｎｉａｃ−５レセプターとの結合に応答した細胞増殖の増
加に反映されるように、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５アゴニストとして作用する。上記
の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を使用して作製され得る。例えば、
ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら、
Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら
、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈ
ａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７
９４（１９９８）；Ｚｈｕ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３
２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄ
，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９
０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ ９（４）：
２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａ
ｎ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍ
ｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７
（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋ，Ｐ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４
−２０（１９９６）を参照のこと（上記の文献は、その全体が参考として援用さ
れる）。[0320] The present invention further relates to antibodies that act as agonists or antagonists of the polypeptides of the present invention. For example, the invention includes antibodies that disrupt receptor / ligand interactions, either partially or completely, with a polypeptide of the invention. Both receptor-specific and ligand-specific antibodies are included. Receptor-specific antibodies which do not interfere with ligand binding but which interfere with receptor activation are included. Receptor activation (ie, signal transduction) can be determined by techniques described herein or otherwise known in the art. Receptor-specific antibodies that both interfere with ligand binding and receptor activation are also included. Similarly, neutralizing antibodies that bind ligand and prevent binding of the ligand to the receptor, as well as antibodies that bind the ligand and thereby prevent receptor activation, but do not prevent the ligand from binding to the receptor, included. Antibodies that activate the receptor are further included. These antibodies may act as agonists for any or all of the biological activities affected by ligand-mediated receptor activation. The antibodies can be identified as agonists or antagonists for biological activities, including the specific activities disclosed herein. In addition, Brainiac-5 is Brainiac-5.
Antibodies that bind to Brainiac-5, whether or not they bind to the ac-5 receptor, are included. These antibodies are known as Brain in the presence of these antibodies.
Acts as a Brainiac-5 agonist, as reflected in increased cell proliferation in response to binding of iac-5 to the Brainiac-5 receptor. The above antibody agonists can be made using methods known in the art. For example,
WO 96/40281; U.S. Patent No. 5,811,097; Deng, B .; Et al.,
Blood 92 (6): 1981-1988 (1998); Chen, Z. et al. Et al., Cancer Res. 58 (16): 3668-3678 (1998); H
arrop, J .; A. J. et al. Immunol. 161 (4): 1786-17
94 (1998); Zhu, Z .; Et al., Cancer Res: 58 (15): 3
209-3214 (1998); Y. J. et al. Immunol.
160 (7): 3170-3179 (1998); Prat, M .; J. et al. Ce
ll. Sci. 111 (Pt2): 237-247 (1998); Pitard
, V. et al. J. et al. Immunol. Methods 205 (2): 177-19
0 (1997); Liauard, J. et al. Et al., Cytokinde 9 (4):
233-241 (1997); Carlson, N .; G. FIG. J. et al. Biol. C
hem. 272 (17): 11295-11301 (1997); Taryma.
n, R. E. FIG. Et al., Neuron 14 (4): 755-762 (1995); M
uller, Y .; A. Et al., Structure 6 (9): 1153-1167.
(1998); Bartunek, P .; Et al., Cytokine 8 (1): 14
-20 (1996) (the above references are incorporated by reference in their entirety).

【０３２１】 特定の実施形態においては、本発明の抗体は、補体を固定する。本明細書中に
さらに記載されるように、他の特定の実施形態においては、本発明の抗体（また
はそのフラグメント）は、異種ポリペプチドまたは異種核酸（例えば、内在性の
細胞傷害性エフェクター系と結合し、そして活性化する化合物および放射性同位
体のような毒素；ならびに細胞傷害性プロドラッグ）と結合する。[0321] In certain embodiments, the antibodies of the invention fix complement. As described further herein, in certain other embodiments, the antibodies (or fragments thereof) of the invention are derived from a heterologous polypeptide or nucleic acid (eg, an endogenous cytotoxic effector system). Binding and activating compounds and toxins such as radioisotopes; and cytotoxic prodrugs).

【０３２２】 次いで、上記で議論されるように、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチ
ドに対する抗体は、当業者に周知の技術を使用して、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５を「
模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するために利用され得る（例えば、Ｇｒ
ｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５）：４３７−４４４（
１９８９）ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：
２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこと）。例えば、Ｂｒａｉｎｉａｃ−
５に結合し、そしてＢｒａｉｎｉａｃ−５多量体化および／またはリガンドへの
結合を競合的に阻害する抗体を使用して、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５の多量体化ドメ
インおよび／または結合ドメインを「模倣する」、そして結果として、Ｂｒａｉ
ｎｉａｃ−５ならびに／またはそれらのリガンドに結合し、そしてそれらを中和
する、抗イディオタイプを生成し得る。このような中和抗イディオタイプまたは
このような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５の
リガンドを中和する治療レジメンにおいて使用され得る。例えば、このような抗
イディオタイプ抗体は、細胞の表面でＢｒａｉｎｉａｃ−５に結合し、これによ
りＢｒａｉｎｉａｃ−５に媒介される細胞の活性化、増殖、および／または分化
をブロックするために使用され得る。Then, as discussed above, antibodies to Brainiac-5 polypeptides of the invention can be used to raise Brainiac-5 to “Brainiac-5” using techniques well known to those of skill in the art.
Can be utilized to generate “mimic” anti-idiotype antibodies (eg, Gr
eenspan and Bona, FASEB J .; 7 (5): 437-444 (
1989) and Nissinoff, J. et al. Immunol. 147 (8):
2429-2438 (1991)). For example, Brainiac-
5, "mimicking" the multimerization and / or binding domain of Brainiac-5 using an antibody that binds to and competitively inhibits Brainiac-5 multimerization and / or binding to a ligand; And as a result, Brai
It can generate anti-idiotypes that bind to and neutralize niac-5 and / or their ligands. Such neutralizing anti-idiotypes or Fab fragments of such anti-idiotypes can be used in therapeutic regimens to neutralize Brainiac-5 ligand. For example, such anti-idiotype antibodies can be used to bind Brainiac-5 at the surface of cells, thereby blocking Brainiac-5 mediated cell activation, proliferation, and / or differentiation. .

【０３２３】 （免疫系および神経系に関連する障害） （診断） 本発明者らは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５が、卵巣腫瘍細胞だけでなく、（ＨＧＳ ＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴ分析を用いて）骨髄間質細胞および滑膜肉腫
細胞においても発現されることを発見した。多くの免疫系および／もしくは神経
系に関連する障害ならびに／または発生障害については、実質的に変更された（
増加または減少した）レベルのＢｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子発現は、このような
障害を有する個体から取り出された免疫系組織および／もしくは神経系組織また
は他の細胞もしくは体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液または髄液）において
検出され得、「標準的な」Ｂｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子発現のレベル（すなわち
、免疫系障害および／または神経系障害を有さない個体由来の、免疫系組織およ
び／もしくは神経系組織または体液におけるＢｒａｉｎｉａｃ−５発現のレベル
）と相関する。従って、本発明は、免疫系障害および／または神経系障害の診断
の間に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体由来の免疫系組織および／も
しくは神経系組織または他の細胞もしくは体液における、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５
ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、および測定され
た遺伝子発現レベルを標準的なＢｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子発現レベルと比較す
る工程を包含し、ここで、標準と比較した遺伝子発現レベルの増加または減少は
、免疫系障害および／または神経系障害を示す。Disorders Related to the Immune and Nervous Systems Diagnosis We have determined that Brainiac-5 is not only a candidate for ovarian tumor cells, but also for bone marrow stromal cells (using BLAST analysis of the HGS EST database). And also found to be expressed in synovial sarcoma cells. Many immune and / or nervous system related disorders and / or developmental disorders have been substantially modified (
Increased or decreased) levels of Brainiac-5 gene expression may be associated with immune and / or nervous system tissues or other cells or fluids (eg, serum, plasma, urine, lubrication) removed from individuals with such disorders. Fluid or cerebrospinal fluid) and the level of "standard" Brainiac-5 gene expression (i.e., immune system tissue and / or nervous system from an individual without immune and / or nervous system disorders). (The level of Brainiac-5 expression in tissues or body fluids). Accordingly, the present invention provides a diagnostic method useful during the diagnosis of an immune system disorder and / or a nervous system disorder, wherein the method comprises an immune system tissue and / or nervous system tissue or other cell or body fluid from an individual. Brainiac-5
Measuring the expression level of the gene encoding the polypeptide, and comparing the measured gene expression level to a standard Brainiac-5 gene expression level, wherein the gene expression level relative to the standard is determined. An increase or decrease indicates an immune system disorder and / or a nervous system disorder.

【０３２４】 特に、免疫系および神経系の癌を保有する哺乳動物の特定の組織は、対応する
「標準的な」レベルと比較する場合に、顕著に増強されたかまたは減少されたレ
ベルのＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドおよびＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡを発現すると考えられる。さらに、増強されたレベル
のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、癌を保有しない同じ種の哺乳動物由来
の血清と比較した場合、このような癌を保有する哺乳動物由来の特定の体液（例
えば、血清、血漿、尿、および髄液）において検出され得る。In particular, certain tissues of mammals bearing cancers of the immune and nervous systems have significantly enhanced or reduced levels of Brainiac- when compared to the corresponding "standard" levels. 5 and mRNA that encodes the Brainiac-5 polypeptide. In addition, enhanced levels of Brainiac-5 polypeptide may be associated with certain bodily fluids from mammals bearing such cancers (eg, serum, Plasma, urine, and cerebrospinal fluid).

【０３２５】 特定の実施形態においては、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチド
、ポリペプチド、ならびに／またはアゴニストおよび／もしくはアンタゴニスト
を用いて処置され、予防され、および／または診断され得る癌としては、以下が
挙げられるが、これらに限定されない：白血病；急性白血病（例えば、急性リン
パ性白血病、急性骨髄性白血病（これらの特定の例としては、骨髄芽球性白血病
、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病が挙げ
られる））；慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、および慢性
リンパ球性白血病）；真性赤血球増加症；リンパ腫（例えば、ホジキン病、およ
び非ホジキン病）；多発性骨髄腫；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症
；Ｈ鎖病；および／または固形腫瘍（例えば、肉腫および癌（これらの特定の例
としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索種、血
管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイン
グ肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、
扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌（ａｄｅｎｏｍｃａｒｃｉｎｏｍａ）、汗腺癌、
皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌
、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、
精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞
腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起
神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網
膜芽細胞腫が挙げられる））。In certain embodiments, cancers that can be treated, prevented, and / or diagnosed with a Brainiac-5 polynucleotide, polypeptide, and / or agonist and / or antagonist of the invention include: But not limited to: leukemia; acute leukemias (eg, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia (eg, myeloblastic leukemia, promyelocytic leukemia, myeloid monocytes) Chronic leukemia (eg, chronic myeloid (granulocytic) leukemia, and chronic lymphocytic leukemia); polycythemia vera; lymphomas (eg, Hodgkin's) Disease and non-Hodgkin's disease); multiple myeloma; Waldenstrom's macroglobulinemia; heavy chain disease And / or solid tumors (eg, sarcomas and cancers (of which specific examples are fibrosarcomas, myxosarcomas, liposarcomas, chondrosarcomas, osteogenic sarcomas, chordomas, hemangiosarcomas, endothelial sarcomas, lymphatic sarcomas) , Lymphatic endothelioma, synovial tumor, mesothelioma, Ewing sarcoma, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer,
Squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma,
Sebaceous carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinoma, cystic adenocarcinoma, medullary carcinoma, bronchial progenitor carcinoma, renal cell carcinoma, hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma, choriocarcinoma, seminoma, fetal carcinoma, Wilms tumor, child Cervix cancer,
Testicular cancer, lung cancer, small cell lung cancer, bladder cancer, epithelial cancer, glioma, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharyngioma, ependymoma, pinealoma, hemangioblastoma, auditory nerve Tumors, oligodendrogliomas, meningiomas, melanomas, neuroblastomas, and retinoblastomas).

【０３２６】 従って、本発明は、免疫系障害および／または神経系障害（これらの系の癌を
含む）を診断する間に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体由来の免疫系
組織および／もしくは神経系組織または他の細胞もしくは体液における、Ｂｒａ
ｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、
および測定した遺伝子発現レベルを、標準的なＢｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子発現
レベルと比較する工程を包含し、それによって、標準と比較した遺伝子発現レベ
ルの増加または減少は、免疫系障害および／または神経系障害を示す。Accordingly, the present invention provides diagnostic methods useful during diagnosing immune system disorders and / or nervous system disorders (including cancers of these systems), comprising the steps of providing an immune system tissue from an individual. And / or in nervous system tissue or other cells or body fluids
measuring the expression level of the gene encoding the niac-5 polypeptide;
And comparing the measured gene expression level to a standard Brainiac-5 gene expression level, whereby an increase or decrease in the gene expression level relative to the standard is indicative of an immune system disorder and / or a nervous system disorder. Is shown.

【０３２７】 腫瘍の診断を含む、免疫系および／または神経系における障害の診断は、従来
の方法に従って既になされているが、本発明は、予後の指標として有用であり、
これによって、増強されたかまたは抑制されたＢｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子発現
を提示している患者は、標準的なレベルに近いレベルでこの遺伝子を発現する患
者と比較して、より悪い臨床結果を受ける。Although the diagnosis of disorders in the immune and / or nervous system, including the diagnosis of tumors, has already been made according to conventional methods, the present invention is useful as a prognostic indicator,
Thereby, patients presenting with enhanced or repressed Brainiac-5 gene expression will receive worse clinical results as compared to patients expressing this gene at levels close to standard levels.

【０３２８】 「Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルをアッ
セイすること」は、第一の生物学的サンプルにおけるＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリ
ペプチドのレベルまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードするｍＲＮ
Ａのレベルを、直接的（例えば、絶対的なタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベ
ルを決定または推定することにより）または相対的（例えば、第二の生物学的サ
ンプルにおけるＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベル
と比較することにより）のいずれかで、定性的または定量的に測定または推定す
ることを意図する。好ましくは、第一の生物学的サンプルにおけるＢｒａｉｎｉ
ａｃ−５ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルは、測定または推定され、そ
して標準的なＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルと
比較される。ここで、この標準は、障害を有さない個体から得られた、第二の生
物学的サンプルから得られるか、または免疫系および／または神経系の障害を有
さない個体の集団のレベルを平均することにより決定される。当該分野において
理解されるように、一旦、標準的なＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドレベルま
たはｍＲＮＡレベルが分かれば、それは、比較のための標準として繰り返し使用
され得る。“Assaying the level of expression of a gene encoding Brainiac-5 polypeptide” refers to the level of Brainiac-5 polypeptide or mRN encoding Brainiac-5 polypeptide in a first biological sample.
A levels can be determined directly (eg, by determining or estimating absolute protein or mRNA levels) or relative (eg, Brainiac-5 polypeptide levels or mRNA levels in a second biological sample). By comparison), either qualitatively or quantitatively. Preferably, Braini in the first biological sample
ac-5 polypeptide or mRNA levels are measured or estimated and compared to standard Brainiac-5 polypeptide or mRNA levels. Here, the standard is obtained from a second biological sample, obtained from an individual without a disorder, or the level of a population of individuals without a disorder of the immune and / or nervous system. Determined by averaging. As will be understood in the art, once a standard Brainiac-5 polypeptide level or mRNA level is known, it can be used repeatedly as a standard for comparison.

【０３２９】 「生物学的サンプル」は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドまたはｍＲＮＡ
を含む個体、体液、細胞株、組織培養物、または他の供給源から得られる任意の
生化学的サンプルを意図する。示されるように、生物学的サンプルは、遊離のＢ
ｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを含む体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液お
よび髄液）、免疫系組織および／または神経系組織、ならびに、完全もしくは成
熟したＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５レセプタ
ーを発現することが見出された他の組織供給源を含む。哺乳動物由来の組織生検
および体液を得るための方法は、当該分野において周知である。生物学的サンプ
ルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。A “biological sample” is a Brainiac-5 polypeptide or mRNA.
Any biochemical sample obtained from an individual, body fluid, cell line, tissue culture, or other source comprising is contemplated. As shown, the biological sample contains free B
body fluids (e.g., serum, plasma, urine, synovial fluid and cerebrospinal fluid), immune system tissue and / or nervous system tissue, and complete or mature Brainiac-5 polypeptide or Brainiac-5 receptor comprising the rainiac-5 polypeptide And other tissue sources found to express. Methods for obtaining tissue biopsies and body fluids from mammals are well known in the art. If the biological sample contains mRNA, a tissue biopsy is the preferred source.

【０３３０】 本発明は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）における、種々の免疫系および／ま
たは神経系に関連する障害を処置し、予防し、および／または診断するために有
用である。好ましい哺乳動物の非排他的なリストは、サル、無尾猿、ネコ、イヌ
、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、およびヒトを含む。ヒトは、特に好ましい哺乳動
物である。このような障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されな
い免疫系および／もしくは神経系の細胞の機能ならびに／または組織の機能の任
意の調節不全を含む：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病
、ツレット症候群、てんかん、精神***病、躁病、痴呆、パラノイア、強迫性障
害、恐慌性障害、学習障害、ＡＬＳ、精神病、自閉症、および行動変化（摂食、
睡眠パターン、平衡、および知覚の障害を含む）、神経生存；シナプス形成；コ
ンダクタンス；神経分化、自己免疫、関節炎、白血病、リンパ腫、免疫抑制、免
疫、体液性免疫、炎症性腸疾患、骨髄抑制、リンパ球増殖性障害、初期の造血幹
細胞由来の種々の造血系統および方向付けられた前駆細胞の維持および分化にお
いて、貧血、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、または白血病、骨髄
細胞エキソビボ培養、骨髄移植、骨髄再構成、新形成の放射線療法または化学療
法、喘息、ＡＩＤＳなどの免疫不全疾患、慢性関節リウマチ、敗血症、挫瘡、乾
癬、グレーヴズ病、リンパ球性甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症
、対宿主性移植片反応、対宿主性移植片病、移植拒絶反応、骨髄性白血病、骨髄
線維症、および骨髄増殖性疾患、ハンティングトン病遺伝子および他の神経変性
疾患（Ｉ型およびＩＩＩ型脊髄小脳性運動失調、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症
、およびらせん球筋萎縮症を含む）など。The present invention is useful for treating, preventing, and / or diagnosing various immune and / or nervous system related disorders in mammals, preferably humans. A non-exclusive list of preferred mammals includes monkeys, anuras, cats, dogs, cows, pigs, horses, rabbits, and humans. Humans are particularly preferred mammals. Such disorders include, but are not limited to, any dysregulation of cellular and / or tissue function of the immune and / or nervous system: Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington Disease, Tourette syndrome, epilepsy, schizophrenia, mania, dementia, paranoia, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, learning disability, ALS, psychosis, autism, and behavioral changes (eating,
Impaired sleep patterns, balance, and sensation), neural survival; synapse formation; conductance; neuronal differentiation, autoimmunity, arthritis, leukemia, lymphoma, immunosuppression, immunity, humoral immunity, inflammatory bowel disease, myelosuppression, In the maintenance and differentiation of lymphoproliferative disorders, various hematopoietic lineages and committed progenitors derived from early hematopoietic stem cells, anemia, pancytopenia, leukopenia, thrombocytopenia, or leukemia, myeloid cell ex vivo Culture, bone marrow transplantation, bone marrow reconstitution, neoplastic radiotherapy or chemotherapy, asthma, immunodeficiency diseases such as AIDS, rheumatoid arthritis, sepsis, acne, psoriasis, Graves' disease, lymphocytic thyroiditis, hyperthyroidism Disease, hypothyroidism, graft-versus-host reaction, graft-versus-host disease, transplant rejection, myeloid leukemia, myelofibrosis, and bone marrow Pollinating disease, Huntington's disease gene, and other neurodegenerative disorders (I and III type spinocerebellar ataxia, dentatorubral pallidoluysian atrophy, and a helical Tamasuji atrophy) and the like.

【０３３１】 全細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７））により記載される、一工
程グアニジニウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム方法などの適切
な任意の技術を使用して、生物学的サンプルから単離され得る。次いで、Ｂｒａ
ｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルは、適切な任意の方
法を使用してアッセイされる。これらの方法としては、ノーザンブロット分析、
Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ
連鎖反応との組み合わせにおける逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖
反応との組み合わせにおける逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）が挙げられる。[0331] Total cellular RNA was obtained from Chomczynski and Sacchi (Anal. B.
iochem. 162: 156-159 (1987)), and may be isolated from biological samples using any suitable technique, such as the one-step guanidinium-thiocyanate-phenol-chloroform method. Then, Bra
The level of mRNA encoding an niac-5 polypeptide is assayed using any suitable method. These methods include Northern blot analysis,
S1 nuclease mapping, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription in combination with the polymerase chain reaction (RT-PCR), and reverse transcription in combination with the ligase chain reaction (RT-LCR).

【０３３２】 生物学的サンプル中のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドレベルのアッセイは
、抗体に基づく技術を用いてなされ得る。例えば、組織におけるＢｒａｉｎｉａ
ｃ−５ポリペプチドの発現は、古典的な免疫組織学的な方法を用いて研究され得
る（Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９
８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０
５：３０８７−３０９６（１９８７））。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５の遺伝子発現を
検出するのに有用な、他の抗体に基づく方法には、イムノアッセイ（例えば、酵
素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ））が含まれる。適切な抗体アッセイの標識は、当該分野で公知であり、そ
して酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）およびラジオアイソトープ（
例えば、ヨウ素（¹²⁵Ｉ、¹²¹Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（³⁵Ｓ）、トリチウム（ ³ Ｈ）、インジウム（¹¹²Ｉｎ）、およびテクネチウム（^99mＴｃ））ならびに蛍
光標識（例えば、フルオレセイン、およびローダミン）およびビオチンが挙げら
れる。Assaying Brainiac-5 polypeptide levels in biological samples
, Using antibody-based techniques. For example, Brainia in an organization
Expression of c-5 polypeptide can be studied using classical immunohistological methods.
(Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976-1).
85 (1985); Jalkanen, M .; J. et al. Cell. Biol. 10
5: 3087-3096 (1987)). Brainiac-5 gene expression
Other antibody-based methods useful for detection include immunoassays (eg, enzymes).
Element binding immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (R
IA)). Suitable antibody assay labels are known in the art and are
Enzyme label (eg, glucose oxidase) and radioisotope (eg,
For example, iodine (¹²⁵I,¹²¹I), carbon (¹⁴C), sulfur (³⁵S), tritium ( ^Three H), indium (¹¹²In) and technetium (^99mTc)) and fireflies
Light labels (eg, fluorescein, and rhodamine) and biotin include
It is.

【０３３３】 個体から得られた生物学的サンプル中のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの
レベルをアッセイすることに加えて、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをまた
画像化によりインビボで検出し得る。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのイン
ビボ画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、または
ＥＳＲにより検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法のために適切な標識は、ラジオ
アイソトープ（例えば、バリウム、またはセシウム）を含み、これは検出可能な
放射線を放射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。ＮＭＲおよびＥＳ
Ｒのための適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例
えば、重水素）を含み、これは、関連するハイブリドーマのための栄養分を標識
することにより抗体中に取り込まれ得る。In addition to assaying the level of Brainiac-5 polypeptide in a biological sample obtained from an individual, Brainiac-5 polypeptide can also be detected in vivo by imaging. Antibody labels or markers for in vivo imaging of Brainiac-5 polypeptide include those detectable by radiography, NMR, or ESR. Labels suitable for radiography include radioisotopes (eg, barium or cesium), which emit detectable radiation but are clearly not harmful to the subject. NMR and ES
Suitable markers for R include markers with a detectable characteristic spin (eg, deuterium), which can be incorporated into antibodies by labeling nutrients for the relevant hybridoma.

【０３３４】 放射性同位体（例えば、¹³¹Ｉ、¹¹²Ｉｎ、^99mＴｃ）、放射線不透過性物質、
または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像化部分で
標識された、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５特異的抗体または抗体フラグメントは、免疫
系障害を試験されるべき哺乳動物に（例えば、非経口的、皮下または腹腔内に）
導入される。被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生
成するために必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放
射性同位体部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通
常、^99mＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体
または抗体フラグメントは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを含む細胞の位
置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像化は、Ｂｕｒｃｈｉｅｌおよび共同
研究者ら（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１３章、Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ
．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ，Ｂ．Ａ．編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。Radioisotopes (eg, ¹³¹ I, ¹¹² In, ^99m Tc), radiopaque substances,
Alternatively, a Brainiac-5-specific antibody or antibody fragment, labeled with a suitable detectable imaging moiety, such as a material detectable by nuclear magnetic resonance, can be used in a mammal to be tested for an immune system disorder (eg, Parenteral, subcutaneous or intraperitoneal)
be introduced. It is understood in the art that the size of the subject and the imaging system used will determine the amount of imaging moiety required to generate a diagnostic image. In the case of a radioisotope moiety, for a human subject, the amount of radioactivity injected is usually in the range of about 5-20 millicuries of ^99m Tc. The labeled antibody or antibody fragment then accumulates preferentially at locations in the cell that contain the Brainiac-5 polypeptide. In vivo tumor imaging is described by Burchiel and co-workers (Tumor Imaging: The Radiochemical).
Chapter 13 of the Detection of Cancer, Burchiel, S
. W. And Rhodes, B .; A. Hen, Masson Publishing
Inc. (1982)).

【０３３５】 （処置） 上記のように、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドおよびＢｒａｉｎｉａ
ｃ−５ポリペプチドは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５活性の異常に高い発現または異常
に低い発現に関与する状態の診断に有用である。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプ
チドが発現される細胞および組織、ならびにＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド
によって調節される活性を考慮すると、標準すなわち「正常」レベルと比較した
個体中の実質的に変更された（増加された、または減少された）レベルのＢｒａ
ｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの発現は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドが発
現され、そして／または活性である身体系に関連する病理学的状態を生じること
が容易に明らかである。(Treatment) As described above, Brainiac-5 polynucleotide and Brainia
c-5 polypeptides are useful in diagnosing conditions involving abnormally high or abnormally low expression of Brainiac-5 activity. Given the cells and tissues in which the Brainiac-5 polypeptide is expressed, and the activity regulated by the Brainiac-5 polypeptide, there is a substantially altered (increased) in the individual compared to standard or "normal" levels. , Or reduced) level of Bra
It is readily apparent that expression of the iniac-5 polypeptide results in a pathological condition associated with the bodily system in which the Brainiac-5 polypeptide is expressed and / or active.

【０３３６】 特定の細胞機能に加え、細胞レセプター分子はまた、潜在的な宿主細胞への侵
入を開始させる手段として、しばしばウイルスにより利用され得ることは、当該
分野において周知である。例えば、細胞ケモカインレセプターＣＣＲ５は、細胞
ケモカインレセプターとしてのみならず、マクロファージ向性ヒト免疫不全ウイ
ルス（ＨＩＶ）−１のレセプターとしても機能することが、Ｗｕおよび共同研究
者らにより近年発見された（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１６８１−１６９１
（１９９７））。さらに、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１ａ、およびＭＩＰ−１ｂ（
これらは、細胞ケモカインレセプターＣＣＲ５のアゴニストである）は、ＨＩＶ
−１の種々の菌株の感受性細胞株への侵入を阻害する（Ｃｏｃｃｈｉ，Ｆ．ら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１８１１−１８１５（１９９５））。従って、本発明
はまた、ウイルス粒子とＢｒａｉｎｉａｃ−５レセプターとの相互作用をブロッ
クまたは中断させ、そして結果としてウイルス感染の開始または継続をブロック
するための、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド、またはそのアゴニストもしく
はアンタゴニストの予防的または治療的投与を通して、ウイルスに曝されたかま
たは感染した個体を治療し、予防し、および／または診断する方法を提供する。It is well known in the art that, in addition to certain cellular functions, cellular receptor molecules can also often be utilized by viruses as a means to initiate entry into potential host cells. For example, it has recently been discovered by Wu and coworkers that the cellular chemokine receptor CCR5 functions not only as a cellular chemokine receptor, but also as a receptor for macrophage tropic human immunodeficiency virus (HIV) -1 (J Exp.Med.185: 1681-1691.
(1997)). Further, RANTES, MIP-1a, and MIP-1b (
These are agonists of the cellular chemokine receptor CCR5), HIV
-1 inhibits the entry of various strains into sensitive cell lines (Cocchi, F. et al.
Science 270: 1811-1815 (1995)). Accordingly, the present invention also provides Brainiac-5 polypeptides, or agonists or antagonists thereof, for blocking or interrupting the interaction of a viral particle with the Brainiac-5 receptor, and consequently blocking the onset or continuation of a viral infection. Methods for treating, preventing, and / or diagnosing individuals exposed or infected with a virus through prophylactic or therapeutic administration of

【０３３７】 本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５レセプ
ターと結合し、そしてそれ自体、免疫向性のウイルス感染をブロックするようで
ある。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５／Ｂｒａｉｎｉａｃ−５レセプター相互作用のアゴ
ニストおよびアンタゴニストはまた、免疫向性のウイルス感染を妨害するようで
ある。結果として、このような相互作用は、１以上の免疫向性のウイルス（例え
ば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２など
）の感染生活環を妨害するようである。The Brainiac-5 polypeptides of the present invention bind to the Brainiac-5 receptor and appear to block immunogenic viral infections as such. Agonists and antagonists of Brainiac-5 / Brainiac-5 receptor interaction also appear to interfere with immunotropic viral infection. As a result, such interactions may disrupt the infection life cycle of one or more immunotropic viruses (eg, HIV-1, HIV-2, HTLV-III, HSV-1, HSV-2, etc.). It is.

【０３３８】 本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド、またはそのアゴニストもしくは
アンタゴニストが、予防的または治療的にウイルス感染をブロックする能力は、
当業者により容易に試験され得る。例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓおよび共同研究者ら
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：２７６−２７９（１９９７））ならびにＡｒｅｎｚ
ａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓおよび共同研究者ら（Ｎａｔｕｒｅ ３８３：４０
０（１９９６））は、培養された末梢血単核細胞において、ＣＣＲ５ケモカイン
レセプターのアンタゴニストおよびＣＣケモカインＲＡＮＴＥＳのアンタゴニス
トそれぞれによる、ＨＩＶ−１感染の抑制を観察する方法を、それぞれ概説する
。上記の両方の場合において、細胞を培養し、そしてウイルス（ＨＩＶ−１）に
感染させる。次いで、ＣＣケモカインまたはそのレセプターのアゴニストまたは
アンタゴニストは、すぐに培養培地に添加される。ケモカインまたは細胞レセプ
ターのアゴニストまたはアンタゴニストの能力の証明は、感染後３日目、６日目
、および９日目に、ウイルス感染の相対的な成功を評価することにより決定され
る。The ability of a Brainiac-5 polypeptide of the invention, or an agonist or antagonist thereof, to block a viral infection, either prophylactically or therapeutically, is
It can be easily tested by one skilled in the art. See, for example, Simmons and co-workers (Science 276: 276-279 (1997)) and Arenz.
ana-Seisedodos and coworkers (Nature 383: 40
0 (1996)) outlines a method for observing suppression of HIV-1 infection by a CCR5 chemokine receptor antagonist and a CC chemokine RANTES antagonist, respectively, in cultured peripheral blood mononuclear cells. In both cases above, the cells are cultured and infected with the virus (HIV-1). The agonist or antagonist of the CC chemokine or its receptor is then immediately added to the culture medium. Evidence of the ability of a chemokine or cell receptor agonist or antagonist is determined by assessing the relative success of the viral infection on days 3, 6, and 9 post-infection.

【０３３９】 単離された本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド、またはそのアゴニス
トもしくはアンタゴニストの一定量を含む薬学的組成物の、ウイルスに感染した
かまたはウイルスでの感染の危険性があるかのいずれかの個体への投与は、以下
に記載されるように行われる。A pharmaceutical composition comprising an isolated amount of the Brainiac-5 polypeptide of the invention, or an agonist or antagonist thereof, is either infected with, or at risk of being infected by, a virus. Administration to the individual is performed as described below.

【０３４０】 本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、Ｂｒａｉｎｉａｃファミリー
のメンバーであるので、このポリペプチドの成熟分泌形態は、タンパク分解性の
切断により、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを発現する細胞から可溶形態で
放出され得ることもまた、当業者により認識される。従って、Ｂｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチドの成熟形態が、外来性の供給源から個体の細胞、組織または身
体に加えられる場合、このポリペプチドは、その個体のその標的細胞に対するそ
の生理的活性を発揮する。Since the Brainiac-5 polypeptide of the present invention is a member of the Brainiac family, the mature secreted form of this polypeptide is a soluble form from cells that express Brainiac-5 polypeptide by proteolytic cleavage. It will also be recognized by those skilled in the art that Therefore, Brainiac
When a mature form of a -5 polypeptide is added to a cell, tissue or body of an individual from an exogenous source, the polypeptide exerts its physiological activities on the individual's target cells.

【０３４１】 従って、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの投与により（好ましくはポリペ
プチドの成熟形態の形をとって）、個体におけるＢｒａｉｎｉａｃ−５活性の標
準レベルまたは正常レベルでの減少により引き起こされる状態、特に免疫系およ
び／または神経系の障害が処置、予防および／または診断され得ることが認識さ
れる。従って、本発明はまた、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５活性レベルの増大が必要な
個体の処置、予防および／または診断の方法を提供する。この方法は、大量の単
離された本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド（このような個体において
Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド活性レベルを増加させるのに効果的である、
特に本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの成熟形態）を含む薬学的組成
物をこのような個体に投与する工程を包含する。Thus, administration of a Brainiac-5 polypeptide (preferably in the form of a mature form of the polypeptide) results in a condition caused by a decrease in Brainiac-5 activity in the individual at a normal or normal level, particularly an immune condition. It is recognized that disorders of the system and / or nervous system can be treated, prevented and / or diagnosed. Accordingly, the present invention also provides a method of treating, preventing and / or diagnosing an individual in need of an increased level of Brainiac-5 activity. The method is effective for increasing the level of isolated Brainiac-5 polypeptides of the invention (such as increasing Brainiac-5 polypeptide activity levels in such individuals,
In particular, administering to such an individual a pharmaceutical composition comprising the Brainiac-5 polypeptide of the present invention).

【０３４２】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、細胞、細胞株、組織、組織培養物また
は患者に対する任意の遺伝子型、表現型および／または形態の変化を含む強力な
細胞応答を誘発すると考えられる。記載されるように、このような細胞応答は、
Ｂｒａｉｎｉａｃ−５に対する正常な生理学的応答のみならず、アポトーシスの
増大またはアポトーシスの阻害に関連する疾患をも含む。アポトーシスをプログ
ラムされた細胞死は、免疫系の末梢Ｂリンパ球および／または末梢Ｔリンパ球の
欠失に関する生理学的機構であり、その制御不全（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
）は、多くの異なる病原性プロセスを誘導し得る（Ｊ．Ｃ．Ａｍｅｉｓｅｎ，Ａ
ＩＤＳ ８：１１９７−１２１３（１９９４）；Ｐ．Ｈ．Ｋｒａｍｍｅｒら、Ｃ
ｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２７９−２８９（１９９４））。Brainiac-5 polypeptides are believed to elicit strong cellular responses, including any genotypic, phenotypic and / or morphological changes, to cells, cell lines, tissues, tissue cultures or patients. As described, such a cellular response is
It includes not only normal physiological responses to Brainiac-5, but also diseases associated with increased apoptosis or inhibition of apoptosis. Apoptosis programmed cell death is a physiological mechanism for the loss of peripheral B lymphocytes and / or peripheral T lymphocytes of the immune system and its disregulation.
) Can induce many different pathogenic processes (JC Ameisen, A
IDS 8: 1197-1213 (1994); H. Krammer et al., C
urr. Opin. Immunol. 6: 279-289 (1994)).

【０３４３】 細胞生存の増大、またはアポトーシスの阻害に関連する疾患、および本発明の
ポリヌクレオチド、ポリペプチドならびに／あるいはアゴニストまたはアンタゴ
ニストで処置または予防され得る疾患としては、以下が挙げられるがこれらに限
定されない：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌腫、およびホ
ルモン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓性腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜
芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液
腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺
腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を含むが、これらに限定されな
い）；自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎
炎、慢性関節リウマチ）；ウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックス
ウイルスおよびアデノウイルス）；炎症；対宿主性移植片病；急性移植片拒絶、
および慢性移植片拒絶、が挙げられる。従って、好ましい実施形態において、本
発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリ
ペプチドは、自己免疫疾患を処置、予防および／または診断するため、および／
または癌（本明細書中に開示されるこれらの癌：例えば、リンパ性白血病（例え
ば、ＭＬＬおよび慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む）および濾胞性リンパ腫
を含むが、これらに限定されない）の増殖、生殖および／または転移を阻害する
ために使用される。別の実施形態では、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌク
レオチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、癌性細胞または癌性組織
（例えば、Ｂ細胞系列癌（例えば、ＣＬＬおよびＭＬＬ）、リンパ性白血病また
はリンパ腫）を活性化、分化または増殖するために使用され、これにより細胞を
癌治療（例えば、化学治療または放射線治療）に対して、より傷つきやすくする
。Diseases associated with increased cell survival or inhibition of apoptosis, and diseases that can be treated or prevented with the polynucleotides, polypeptides and / or agonists or antagonists of the invention include, but are not limited to: Not: cancers (eg, follicular lymphomas, carcinomas with p53 mutations, and hormone-dependent tumors; these include: colon cancer, cardiac tumor, pancreatic cancer, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, Lung cancer, intestinal cancer, testicular cancer, gastric cancer, neuroblastoma, myxoma, fibroid, lymphoma, endothelioma, osteoblastoma, bone giant cell tumor, osteosarcoma, chondrosarcoma, adenoma, breast cancer, prostate cancer, capoge Autoimmune disorders (eg, systemic lupus erythematosus and immune-associated glomerulonephritis, chronic, including but not limited to sarcoma and ovarian cancer) Rheumatoid arthritis); viral infections (eg, herpes virus, poxvirus and adenovirus); inflammation; graft versus host disease; acute graft rejection;
And chronic graft rejection. Thus, in a preferred embodiment, a Brainiac-5 polynucleotide or Brainiac-5 polypeptide of the invention is for treating, preventing and / or diagnosing an autoimmune disease, and / or
Or the growth of cancers (these cancers disclosed herein: including, but not limited to, lymphocytic leukemia (eg, including MLL and chronic lymphocytic leukemia (CLL)) and follicular lymphoma) , Used to inhibit reproduction and / or metastasis. In another embodiment, a Brainiac-5 polynucleotide or Brainiac-5 polypeptide of the invention is a cancerous cell or tissue (eg, a B cell lineage cancer (eg, CLL and MLL), lymphocytic leukemia or lymphoma). Are used to activate, differentiate or proliferate, thereby making the cells more vulnerable to cancer treatment (eg, chemotherapy or radiation treatment).

【０３４４】 さらに、他の実施形態では、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチド
またはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、悪性腫瘍および以下のような関連
の障害の増殖、進行および／または転移を阻害するために使用される：そして白
血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球
性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに
慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血
病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病
）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、なら
びに固形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨
肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒ
ｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍
、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平
上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺
癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノー
マ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣の腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱
癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣
細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎ
ａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、こ
れらに限定されない）。Further, in other embodiments, Brainiac-5 polynucleotides or polypeptides of the invention are used to inhibit the growth, progression and / or metastasis of malignant tumors and related disorders such as: Used: and leukemias (including acute leukemias (including, for example, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia (including myeloblastic, promyelocytic, myelomonocytic, monocytic and erythroleukemia)) and Chronic leukemia (eg, chronic myeloid (granulocytic) leukemia and chronic lymphocytic leukemia), polycythemia vera, lymphoma (eg, Hodgkin's disease and non-Hodgkin's disease), multiple myeloma, Waldenstrom macro Globulinemia, heavy chain disease, and solid tumors (sarcomas and carcinomas such as fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, bone Primary sarcoma, chordoma, hemangiosarcoma, endothelial sarcoma (endotheliosar)
coma), lymphatic sarcoma, lymphatic endothelioma, periosteoma, mesothelioma, Ewing tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon carcinoma, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell carcinoma, basal Cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous carcinoma, papillary carcinoma, papillary carcinoma, cystic carcinoma, medullary carcinoma, bronchogenic carcinoma, renal cell carcinoma, hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma, choriocarcinoma, seminoma, embryo Stage cancer, Wilms tumor, cervical cancer, testicular tumor, lung cancer, small cell lung cancer, bladder cancer, epithelial cancer, glioma, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharyngioma, ependymoma Tumor, pinealoma, hemangioblastoma, acoustic neuroma, oligodendroglioma, meningioma (men
angiomas), melanomas, neuroblastomas, and retinoblastomas).

【０３４５】 アポトーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経
変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、
色素性網膜炎、小脳変性）；脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、
虚血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害によって生じるようなもの）、毒
物誘導性肝臓疾患（アルコールによって生じるようなもの）、敗血症性ショック
、悪液質ならびに食欲不振。従って、好ましい実施形態では、本発明のＢｒａｉ
ｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、上
に列挙される疾患および障害を処置、予防および／または診断するために利用さ
れる。Diseases associated with increased apoptosis include the following: AIDS; neurodegenerative disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis,
Retinitis pigmentosa, cerebellar degeneration); myelodysplastic syndrome (eg, aplastic anemia);
Ischemic injury (such as caused by myocardial infarction, stroke and reperfusion injury), toxic induced liver disease (such as caused by alcohol), septic shock, cachexia and anorexia. Thus, in a preferred embodiment, the Brai of the present invention
The niac-5 polynucleotide or Brainiac-5 polypeptide is utilized for treating, preventing, and / or diagnosing the diseases and disorders listed above.

【０３４６】 好ましい実施形態では、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、ヒト
組織球リンパ腫Ｕ−９３７細胞の増殖を用量依存様式で阻害する。さらに好まし
い実施形態では、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、ＰＣ−３細胞
、ＨＴ−２９細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ−７細胞およびＡ２９３細胞の増殖を
阻害する。非常に好ましい実施形態では、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌ
クレオチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、前立腺癌、結腸癌、頸
部の癌および胸部の癌の増殖、進行および／または転移を阻害するために使用さ
れる。In a preferred embodiment, Brainiac-5 polypeptides of the invention inhibit the growth of human histiocytic lymphoma U-937 cells in a dose-dependent manner. In a further preferred embodiment, the Brainiac-5 polypeptide of the invention inhibits the growth of PC-3, HT-29, HeLa, MCF-7 and A293 cells. In a highly preferred embodiment, the Brainiac-5 polynucleotide or Brainiac-5 polypeptide of the invention is for inhibiting the growth, progression and / or metastasis of prostate, colon, cervical and thoracic cancer. used.

【０３４７】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５は、Ｂｒａｉｎｉａｃファミリーに属するので、このポ
リペプチドはまた、血管形成を調節する。さらに、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５は、免
疫細胞機能を阻害するので、このポリペプチドは、広範な抗炎症活性を有する。
Ｂｒａｉｎｉａｃ−５は、宿主防御細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞およびマク
ロファージ）の侵襲および活性化を刺激することにより、そして腫瘍の血管形成
を阻害することにより、固形腫瘍を処置、予防および／または診断するための抗
心血管形成剤として使用され得る。当業者は、血管増殖が望まれない他の非癌徴
候を認識する。それらはまた、殺菌性白血球の誘引および活性化を介して、耐性
慢性感染および急性感染（例えば、ミオバクテリア（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉａｌ
）感染）に対する宿主防御を増強するために使用され得る。Ｂｒａｉｎｉａｃ−
５はまた、Ｔ細胞が媒介する自己免疫疾患およびリンパ性白血病（例えば、慢性
リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む）の処置のために、ＩＬ−２生合成の阻害によ
りＴ細胞の増殖を阻害するために使用され得る。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５はまた、
壊死組織片洗浄および炎症性細胞を促進する結合性組織の補充の両方を介して、
創傷治癒を刺激するために使用され得る。これと同じ様式で、Ｂｒａｉｎｉａｃ
−５はまた、肝硬変、骨関節炎および肺線維症を含む他の繊維性障害を処置、予
防および／または診断するために使用され得る。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５はまた、
住血吸虫症、旋毛虫症および回虫症におけるように、この組織を侵襲する寄生虫
の幼生を殺生する特有の機能を有する好酸球の存在を増加させる。それはまた、
種々の造血先駆細胞の活性化および分化を調節すること（例えば、化学治療後に
骨髄から成熟白血球を放出すること、すなわち、肝細胞の動員）により、造血を
調節するために使用され得る。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５はまた、敗血症を処置、予
防および／または診断するために使用され得る。Since Brainiac-5 belongs to the Brainiac family, this polypeptide also regulates angiogenesis. In addition, since Brainiac-5 inhibits immune cell function, this polypeptide has broad anti-inflammatory activity.
Brainiac-5 treats, prevents, and / or treats solid tumors by stimulating invasion and activation of host defense cells (eg, cytotoxic T cells and macrophages) and by inhibiting tumor angiogenesis. It can be used as an anti-cardiovascular agent for diagnosis. One skilled in the art will recognize other non-cancerous signs where vascular growth is not desired. They also provide resistant chronic and acute infections (eg, myobacteria) through the attraction and activation of bactericidal leukocytes.
) Can be used to enhance host defense against infection). Brainiac-
5 also inhibits T-cell proliferation by inhibiting IL-2 biosynthesis for the treatment of T-cell mediated autoimmune diseases and lymphocytic leukemia, including, for example, chronic lymphocytic leukemia (CLL). Can be used for Brainiac-5 also
Through both necrotic debris washing and recruitment of connective tissue that promotes inflammatory cells,
Can be used to stimulate wound healing. In the same manner, Brainiac
-5 can also be used to treat, prevent and / or diagnose other fibrotic disorders, including cirrhosis, osteoarthritis and pulmonary fibrosis. Brainiac-5 also
As in schistosomiasis, trichinosis and ascariasis, it increases the presence of eosinophils, which have the unique function of killing larvae of parasites that invade this tissue. It also
It can be used to regulate hematopoiesis by modulating the activation and differentiation of various hematopoietic progenitor cells (eg, releasing mature leukocytes from the bone marrow after chemotherapy, ie, recruiting hepatocytes). Brainiac-5 may also be used to treat, prevent and / or diagnose sepsis.

【０３４８】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプ
チドあるいはＢｒａｉｎｉａｃ−５のアゴニストは、感染剤の処理において使用
され得る。例えば、免疫応答の増大（特にＢ細胞の増殖および分化の増大）によ
り、感染性疾患は処置され得る。この免疫応答は、現存の免疫反応の増強するこ
とか、または新たな免疫反応を開始することのどちらかにより、増大し得る。あ
るいは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポ
リペプチド、あるいはＢｒａｉｎｉａｃ−５のアゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、免疫応答を必ずしも誘発することなく、感染剤を直接的に阻害し得る。[0348] Brainiac-5 polynucleotides or Brainiac-5 polypeptides or agonists of Brainiac-5 can be used in the treatment of infectious agents. For example, an infectious disease can be treated by increasing the immune response, particularly by increasing the proliferation and differentiation of B cells. This immune response can be increased either by enhancing an existing immune response or by initiating a new immune response. Alternatively, Brainiac-5 polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of Brainiac-5, can also directly inhibit infectious agents without necessarily eliciting an immune response.

【０３４９】 ウイルスは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチド、あるいはＢｒａｉｎｉａｃ−５のアゴニストにより処置され
得る疾患または症状を引き起こし得る感染剤の１つの例である。ウイルスの例と
しては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるが
それらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科
、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科
、サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング
、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペス
ウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、帯状ヘルペス）、
モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイル
ス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、
インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピロー
マウイルス（Ｐａｐｉｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、パポバウイルス科、パルボウイ
ルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡またはワクシ
ニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬ
Ｖ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、
ルビウイルス）。これらの科内に入るウイルスは、以下を含むがこれらに限定さ
れない種々の疾患または症状を引き起こし得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎ
ｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸器合胞体ウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、
結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動
性、デルタ）、日本脳炎、フニン、チクングニヤ、リフトバレー熱、黄熱病、髄
膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、
出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、
白血病、風疹、性感染病、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス
血症。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドもしくはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポ
リペプチド、またはＢｒａｉｎｉａｃ−５のアゴニストもしくはアンタゴニスト
は、任意のこれらの症状または疾患の処置、予防、診断および／または検出に使
用され得る。特定の実施形態において、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチド
もしくはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド、またはＢｒａｉｎｉａｃ−５のア
ゴニストは、以下を処置、予防および／または診断するために使用される：髄膜
炎、デング、ＥＢＶ、および／または肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。特定のさらな
る実施形態において、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチド、Ｂｒａｉｎｉａ
ｃ−５ポリペプチド、またはアゴニストは、１以上の他の市販の肝炎ワクチンに
対して非応答性の患者を処置するために使用される。さらなる特定の実施形態に
おいて、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニ
ストは、ＡＩＤＳを処置、予防および／または診断するために使用される。さら
なる特定の実施形態において、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド、アゴニスト
および／またはアンタゴニストは、クリプトスポリジウム症患者を処置、予防お
よび／または診断するために使用される。The virus may be Brainiac-5 polynucleotide or Brainiac.
-5 is an example of an infectious agent that can cause a disease or condition that can be treated by a polypeptide, or an agonist of Brainiac-5. Examples of viruses include, but are not limited to, the following DNA and RNA viruses and virions: arbovirus, adenoviridae, arenaviridae, arterivirus, birnaviridae, bunyaviridae, calcivirus. Family, sarcoviridae, coronaviridae, dengue, EBV, HIV, flaviviridae, hepadnaviridae (hepatitis), herpesviridae (eg, cytomegalovirus, herpes simplex, herpes zoster),
Mononegavirus (for example, Paramyxoviridae, Measles virus, Rhabdoviridae), Orthomyxoviridae (for example,
Influenza A, influenza B, and parainfluenza, Papillomavirus, Papovaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae (eg, smallpox or vaccinia), Reoviridae (eg, rotavirus) , Retroviridae (HTL
VI, HTLV-II, lentivirus), and Togaviridae (e.g.,
Rubivirus). Viruses that fall within these families can cause a variety of diseases or conditions, including but not limited to: arthritis, bronchiolitis (bron).
chiollitis), respiratory syncytial virus, encephalitis, ocular infections (eg,
Conjunctivitis, keratitis), chronic fatigue syndrome, hepatitis (A, B, C, E, chronic activity, delta), Japanese encephalitis, Junin, Chikungunya, Rift Valley fever, yellow fever, meningitis, opportunistic Infections (eg, AIDS), pneumonia, Burkitt's lymphoma, chickenpox,
Hemorrhagic fever, measles, mumps, parainfluenza, rabies, cold, polio,
Leukemia, rubella, sexually transmitted diseases, skin diseases (eg, caposities, warts), and viremia. Brainiac-5 polynucleotides or polypeptides, or Brainiac-5 agonists or antagonists, can be used for the treatment, prevention, diagnosis and / or detection of any of these conditions or diseases. In certain embodiments, Brainiac-5 polynucleotides or Brainiac-5 polypeptides, or agonists of Brainiac-5, are used to treat, prevent, and / or diagnose the following: meningitis, dengue, EBV, And / or hepatitis (eg, hepatitis B). In certain further embodiments, Brainiac-5 polynucleotide, Brainia
The c-5 polypeptide, or agonist, is used to treat patients that are non-responsive to one or more other commercially available hepatitis vaccines. In further specific embodiments, Brainiac-5 polynucleotides, polypeptides, or agonists are used to treat, prevent, and / or diagnose AIDS. In a further particular embodiment, Brainiac-5 polypeptides, agonists and / or antagonists are used to treat, prevent and / or diagnose a patient with cryptosporidiosis.

【０３５０】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、そしてＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌ
クレオチドもしくはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド、またはＢｒａｉｎｉａ
ｃ−５のアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置され得る細菌性因子あ
るいは真菌性因子は、以下のグラム陰性およびグラム陽性の細菌および細菌科お
よび真菌類を含むがこれらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（
例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏ
ｒｃａｒｄｉａ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃ
ｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉ
ａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉ
ｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃ
ｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（
例えば、エンテロトキシン産生性（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ）Ｅ．ｃｏ
ｌｉ、および腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ ｔｙｐｈｉ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒ
ｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃ
ｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、
Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃ
ｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉ
ｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓ
ｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈ
ｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、ＨｅａｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザＢ型）
、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ
ｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ
ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃａｌ、
ＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ（例えば、Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ）。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない
以下の疾患または症状を引き起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎
、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感
染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（例えば、
百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス
熱、食中毒、肺腸チフス、淋病、髄膜炎（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、ク
ラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒
、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂
巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、***症、
創傷感染症。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドもしくはＢｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチド、またはＢｒａｉｎｉａｃ−５のアゴニストもしくはアンタゴ
ニストは、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置、予防、診断および／または
検出するために使用され得る。特定の実施形態において、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５
ポリヌクレオチドもしくはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド、またはそのアゴ
ニストは、以下を処置、予防および／または検出するために使用される：破傷風
、ジフテリア、ボツリヌス中毒および／または髄膜炎Ｂ型。Similarly, it may cause a disease or condition, and may comprise Brainiac-5 polynucleotide or Brainiac-5 polypeptide, or Brainia
Bacterial or fungal factors that can be treated by c-5 agonists or antagonists include, but are not limited to, the following Gram-negative and Gram-positive bacteria and bacteria and fungi: Actinomycetales (
For example, Corynebacterium, Mycobacterium, No
rcardia), Cryptococcus neoformans, Asp
ergillosis, Bacillaceae (eg, Anthrax, C
Lostium), Bacteroidaceae, Blastomyc
osis, Bordetella, Borrelia (eg, Borreli)
a burgdorferi, Brucellosis, Candidiasi
s, Campylobacter, Coccidioidomycosis, C
ryptococsis, Dermatocycoses, E. et al. coli (
For example, enterotoxinogenic E. coli. co
li and enterohemorrhagic E. coli. coli), Enterobacteriaceae
(Klebsiella, Salmonella (eg, Salmonell
a typhi, and Salmonella paratyphi), Ser
ratia, Yersinia), Erysipelothrix, Helic
obactor, Legionellosis, Leptospirosis,
Listeria, Mycoplasmatales, Mycobacteri
um leprae, Vibrio cholerae, Neisseriac
eae (eg, Acinetobacter, Gonorrhea, Mini
gococcal), Meisseria meningitidis, Pas
teurellaea infections (eg, Actinobacillus, H
emophilus (eg, Heamophilus influenza B)
, Pasteurella), Pseudomonas, Rickettsia
ceae, Chlamydiaceae, Syphilis, Shigella
spp. , Staphylococcal, Meningiococcal,
Pneumococcal and Streptococcal (eg, Str
eptococcus pneumoniae and group B Streptococ
cus). These bacterial or fungal families can cause the following diseases or conditions, including but not limited to: bacteremia, endocarditis, ocular infections (conjunctivitis, tuberculosis, uveitis), gingivitis , Opportunistic infections (eg, AIDS-related infections), periungualitis, prosthesis-related infections, Reiter's disease, respiratory tract infections (eg,
Pertussis or pyometra), sepsis, Lyme disease, cat scratch disease, dysentery, paratyphoid fever, food poisoning, typhoid fever, gonorrhea, meningitis (eg, meningitis A and B), chlamydia, syphilis, diphtheria, reye disease Paratuberculosis, tuberculosis, tuberculosis, lupus, botulism, gangrene, tetanus, impetigo, rheumatic fever, scarlet fever, sexually transmitted diseases, skin diseases (e.g., cellulitis, dermatocycoses), toxicemia, urinary tract infection Disease,
Wound infection. Brainiac-5 polynucleotide or Brainiac
The -5 polypeptide, or an agonist or antagonist of Brainiac-5, can be used to treat, prevent, diagnose and / or detect any of these conditions or diseases. In certain embodiments, Brainiac-5
The polynucleotide or Brainiac-5 polypeptide, or agonist thereof, is used to treat, prevent, and / or detect the following: tetanus, diphtheria, botulism, and / or meningitis B.

【０３５１】 さらに、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドもしくはＢｒａｉｎｉａｃ−
５ポリペプチド、またはＢｒａｉｎｉａｃ−５のアゴニストにより処置され得る
疾患または症状を引き起こす寄生生物性因子としては、以下のファミリーまたは
クラスが挙げられるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシ
ジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉ
ａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物症（Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃ）、ジアルジ
ア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、ト
リパノソーマ症、ならびにトリコモナスおよび胞子虫（例えば、三日熱マラリア
原虫、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫および卵形マラリア原虫）。こ
れらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を
引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジ
アルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連
）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポ
リヌクレオチドもしくはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド、またはＢｒａｉｎ
ｉａｃ−５のアゴニストもしくはアンタゴニストは、任意のこれらの症状または
疾患を処置、予防、診断および／または検出するために使用され得る。特定の実
施形態において、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチド、Ｂｒａｉｎｉａｃ−
５ポリペプチド、またはそれらのアゴニストは、マラリアを処置、予防および／
または診断するために使用される。In addition, Brainiac-5 polynucleotide or Brainiac-
Parasite factors that cause a disease or condition that can be treated by an A5 polypeptide, or an agonist of Brainiac-5 include, but are not limited to, the following families or classes: amoebiasis, babesiosis, coccidiosis, chestnut disease Putosporidiosis, binuclear amoebiasis (Dientamoebi)
sis), copulation, ectoparasitic, giardiasis, helminthiasis, leishmaniasis, theileriasis, toxoplasmosis, trypanosomiasis, and Trichomonas and sporeworms (eg, Plasmodium vivax, tropical Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax and Oval malaria parasite). These parasites can cause a variety of diseases or conditions, including but not limited to: scabies, tsutsugamushi disease, ocular infections, bowel disease (eg, dysentery, giardiasis), liver disease, lung Diseases, opportunistic infections (eg, AIDS-related), malaria, pregnancy complications, and toxoplasmosis. Brainiac-5 polynucleotide or Brainiac-5 polypeptide, or Brain
An agonist or antagonist of iac-5 may be used to treat, prevent, diagnose and / or detect any of these conditions or diseases. In certain embodiments, the Brainiac-5 polynucleotide, Brainiac-
5 polypeptides, or agonists thereof, treat, prevent and / or treat malaria.
Or used to diagnose.

【０３５２】 別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、異種ポリ
ペプチド、異種核酸、トキシンまたはプロドラッグに関連するＢｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチドまたは抗Ｂｒａｉｎｉａｃ−５抗体）を含む組成物を、例えば
、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５レセプターを発現する標的とされた細胞に送達する方法
を提供する。本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドまたは抗Ｂｒａｉｎｉ
ａｃ−５抗体は、異種ポリペプチド、異種核酸、トキシンまたはプロドラッグと
、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合的な相互作用を介して会合
し得る。In another embodiment, the invention relates to a polypeptide of the invention (eg, a Brainiac associated with a heterologous polypeptide, heterologous nucleic acid, toxin or prodrug).
A method for delivering a composition comprising (e.g., a Brainiac-5 antibody or an anti-Brainiac-5 antibody) to, for example, targeted cells that express the Brainiac-5 receptor. Brainiac-5 polypeptides or anti-Brainini of the invention
The ac-5 antibody can associate with a heterologous polypeptide, heterologous nucleic acid, toxin or prodrug via hydrophobic, hydrophilic, ionic and / or covalent interactions.

【０３５３】 １つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する
本発明のポリペプチド（例えば、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドまたは抗Ｂ
ｒａｉｎｉａｃ−５抗体）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特
定の送達のための方法を提供する。１つの実施例において、本発明は、治療タン
パク質を標的細胞中へ送達するための方法を提供する。別の実施例において、本
発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本鎖核
酸（例えば、細胞のゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得
、そして転写され得るＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する
。In one embodiment, the invention relates to a polypeptide of the invention (eg, a Brainiac-5 polypeptide or anti-B) that associates with a heterologous polypeptide or nucleic acid.
The present invention provides a method for the specific delivery of a composition of the present invention to cells by administering a S. rainiac-5 antibody). In one embodiment, the invention provides a method for delivering a therapeutic protein into a target cell. In another embodiment, the invention is directed to a single-stranded nucleic acid (eg, an antisense or ribozyme) or a double-stranded nucleic acid (eg, capable of integrating into the genome of a cell or replicating episomally and transcribed. The resulting DNA) to targeted cells.

【０３５４】 別の実施形態において、本発明は、トキシンまたは細胞傷害性プロドラッグに
関連する本発明のポリペプチド（例えば、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドま
たは抗Ｂｒａｉｎｉａｃ−５抗体）を投与することによる細胞の特定の破壊（例
えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。In another embodiment, the invention relates to the use of a polypeptide of the invention (eg, a Brainiac-5 polypeptide or an anti-Brainiac-5 antibody) for administering a cell associated with a toxin or a cytotoxic prodrug. Methods are provided for specific destruction (eg, destruction of tumor cells).

【０３５５】 「トキシン」とは、内因性の細胞傷害性エフェクタ系、ラジオアイソトープ、
ホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型トキシン、トキシンの触媒サブユ
ニット、または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には
通常存在しない任意の分子もしくは酵素を結合および活性化する化合物を意味す
る。本発明の方法に従って使用され得るトキシンとしては、以下が挙げられるが
、これらに限定されない：当該分野で公知のラジオアイソトープ、固有のまたは
誘導された内因性の細胞傷害性エフェクタ系に結合する化合物（例えば、抗体（
またはその一部を含む補体固定）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、Ｒ
ＮＡｓｅ、αトキシン、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ、
ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅ
ｌｏｎｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）
およびコレラ毒素。「トキシン」はまた、細胞***停止剤または細胞破壊剤、治
療薬または放射活性金属イオン（例えば、α−放射体（例えば、²¹³Ｂｉ））を
含む。細胞毒素または細胞障害性薬剤は、細胞に対して有害である任意の薬剤を
含む。例としては、以下が挙げられる：パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グ
ラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、
テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コル
ヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビジン、ジヒドロキシルアントラシンジオン
、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテス
トステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プ
ロプラノロール、ならびにプロマイシンおよびそれらのアナログまたはホモログ
。治療薬としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗代謝物（例
えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビ
ン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタ
ミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムス
チン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃ
ｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレ
プトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ
）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（
前ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイ
シン（前アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラ
マイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸***剤（例えば、ビンクリスチンおよび
ビンブラスチン）。“Toxin” refers to an endogenous cytotoxic effector system, a radioisotope,
Means holotoxin, modified toxin, catalytic subunit of toxin, or a compound that binds and activates any molecule or enzyme that is not normally present in or on the cell causing cell death under defined conditions . Toxins that can be used in accordance with the methods of the invention include, but are not limited to, radioisotopes known in the art, compounds that bind to an intrinsic or induced endogenous cytotoxic effector system ( For example, an antibody (
Or a part thereof, complement fixation), thymidine kinase, endonuclease, R
NAse, α-toxin, ricin, abrin, Pseudomonas endotoxin A,
Diphtheria toxin, saporin, momordin, gelonin (ge
lonin), pokeweed antiviral protein, α-sarcin
And cholera toxin. “Toxin” also includes cytostatic or cytocidal agents, therapeutic agents or radioactive metal ions (eg, α-emitters (eg, ²¹³ Bi)). A cytotoxin or cytotoxic agent includes any agent that is harmful to cells. Examples include: paclitaxel, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetin, mitomycin, etoposide,
Tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubidine, dihydroxyanthracindione, mitoxantrone, mitramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoid, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, and Puromycin and their analogs or homologs. Therapeutic agents include, but are not limited to: antimetabolites (eg, methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, 5-fluorouracil decarbazine), alkylating agents (eg, mechlorethamine, Thioepa, chlorambucil, melphalan, carmustine (BSNU) and lomustine (CCNU), cyclotosfamide (cyc)
lotosphamide), busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, mitomycin C and cis-dichlorodiamine platinum (II)
) (DDP) cisplatin), anthracyclines (eg, daunorubicin (
Predaunomycin) and doxorubicin), antibiotics (eg, dactinomycin (preactinomycin), bleomycin, mithramycin and anthramycin (AMC)), and antimitotic agents (eg, vincristine and vinblastine).

【０３５６】 「細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞
傷害性化合物に変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使
用し得る細胞傷害性プロドラッグには、安息香酸マスタードアルキル化剤のグル
タミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンア
ラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド
誘導体が含まれるが、これらに限定されない。“Cytotoxic prodrug” refers to a non-toxic compound that is converted to a cytotoxic compound by an enzyme normally present in the cell. Cytotoxic prodrugs that can be used in accordance with the methods of the present invention include glutamyl derivatives of benzoic acid mustard alkylating agents, phosphate derivatives of etoposide or mitomycin C, cytosine arabinoside, daunorubicin, and phenoxyacetamide derivatives of doxorubicin. But not limited to these.

【０３５７】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプ
チドあるいはＢｒａｉｎｉａｃ−５のアゴニストにより処置、予防および／また
は診断され得る、さらなる状態、疾患または症状は、骨髄炎である。An additional condition, disease or condition that can be treated, prevented and / or diagnosed with a Brainiac-5 polynucleotide or Brainiac-5 polypeptide or agonist of Brainiac-5 is osteomyelitis.

【０３５８】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプ
チドあるいはＢｒａｉｎｉａｃ−５のアゴニストにより処置、予防および／また
は診断され得る、さらなる状態、疾患または症状は、心内膜炎である。An additional condition, disease or condition that can be treated, prevented and / or diagnosed with a Brainiac-5 polynucleotide or Brainiac-5 polypeptide or an agonist of Brainiac-5 is endocarditis.

【０３５９】 好ましくは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドもしくはＢｒａｉｎｉａｃ−
５ポリヌクレオチド、またはＢｒａｉｎｉａｃ−５のアゴニストを用いる処置は
、患者に有効量のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを投与するか、または患者
から細胞を取り出して、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドをこの細胞に供
給し、そして患者に操作した細胞を戻す（エキソビボ治療）かのいずれかによる
ものであり得る。さらに、本明細書中でさらに議論されるように、Ｂｒａｉｎｉ
ａｃ−５ポリペプチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドは、感染性
疾患に対する免疫応答を惹起するワクチン中のアジュバントとして使用され得る
。Preferably, Brainiac-5 polypeptide or Brainiac-
Treatment with a 5 polynucleotide, or an agonist of Brainiac-5, comprises administering to the patient an effective amount of Brainiac-5 polypeptide or removing cells from the patient and providing the cells with Brainiac-5 polynucleotide; And then returning the engineered cells to the patient (ex vivo treatment). Further, as discussed further herein, Braini
The ac-5 polypeptide or Brainiac-5 polynucleotide can be used as an adjuvant in a vaccine to elicit an immune response against an infectious disease.

【０３６０】 本発明のさらなる好ましい実施形態としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：以下の適用におけるＢｒａｉｎｉａｃ−５およびそれらの機能的
アゴニストの使用： 免疫系へのブーストして、１以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭお
よびＩｇＥ）の増加した量を産生するため、より高い親和性抗体産物（例えば、
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を誘導するため、および／または免疫応
答を増大するための、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モ
ルモット、ブタ、ミクロピッグ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｇ）、ニワトリ、ラクダ、ヤ
ギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類およびヒト、最も好ましく
はヒト）への投与。Further preferred embodiments of the present invention include, but are not limited to: Use of Brainiac-5 and their functional agonists in the following applications: Boosting the immune system to one or more To produce increased amounts of antibodies (eg, IgG, IgA, IgM, and IgE) of higher affinity antibody products (eg,
Animals (eg, mice, rats, rabbits, hamsters, guinea pigs, pigs, micro pigs, chickens, camels) for inducing IgG, IgA, IgM and IgE and / or for increasing the immune response. , Goats, horses, cows, sheep, dogs, cats, non-human primates and humans, most preferably humans).

【０３６１】 機能的な内在性抗体分子を産生することが不可能であるか、または別の易感染
性の内在性免疫系を有するが、これは別の動物からの再構築または部分的に再構
築される免疫系の手段により、ヒト免疫グロブリン分子を産生することが可能で
ある動物（上に列挙される動物を含むが、これらに限定されず、遺伝子組換え動
物をも含む）への投与。（例えば、公開公報ＰＣＴ出願第ＷＯ ９８／２４８９
３号、同第ＷＯ／９６３４０９６号、同第ＷＯ／９６３３７３５号、および同第
ＷＯ／９１１０７４１号を参照のこと）。It is not possible to produce a functional endogenous antibody molecule or has another compromised endogenous immune system, which can be reconstituted or partially reconstituted from another animal. Administration to animals capable of producing human immunoglobulin molecules by means of the immune system being constructed, including but not limited to the animals listed above, including transgenic animals . (See, for example, PCT Application No. WO 98/2489.
3, WO / 9634096, WO / 9633735, and WO / 9110741).

【０３６２】 アンタゴニストは、例えば、特定の自己免疫性および慢性炎症性および感染性
疾患における、マクロファージおよびその前駆体、ならびに好中球、好塩基球、
Ｂリンパ球およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、活性化およびＣＤ８細
胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞）のＢｒａｉｎｉａｃ−５を媒介す
る走化性および活性化を阻害するために使用され得る。自己免疫疾患の例として
は、多発性硬化症、およびインスリン依存性糖尿病が挙げられる。アンタゴニス
トはまた、単核食細胞の補充および活性化を防ぐことによる、珪肺症、サルコイ
ドーシス、特発性肺線維症を含む感染性疾患の処置、予防および／または診断に
使用され得る。アンタゴニストはまた、好酸球産生および移動を妨げることによ
って、特発性好酸球増多症候群を処置、予防および／または診断するために使用
され得る。エンドトキシンショックもまた、アンタゴニストによって、マクロフ
ァージの移動および本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの産生を妨害す
ることにより処置され得る。このアンタゴニストはまた、動脈壁において単球侵
襲を妨害することによってアテローム性硬化症を処置するために使用され得る。
このアンタゴニストはまた、ヒスタミン媒介性アレルギー反応および後期アレル
ギー反応、慢性蕁麻疹、およびアトピー性皮膚炎を含む免疫学的障害を、ケモカ
イン誘導マスト細胞および好塩基球分解およびヒスタミンの放出を阻害すること
によって処置、予防および／または診断するために用いられ得る。ＩｇＥ媒介性
アレルギー反応（例えば、アレルギー性喘息、鼻炎、および湿疹）もまた処置さ
れ得る。アンタゴニストはまた、創傷領域への単球の誘引を妨害することによっ
て慢性炎症および急性炎症を処置、予防および／または診断するために使用され
得る。アンタゴニストはまた、正常な肺マクロファージ集団を調節するために使
用され得る。なぜなら、慢性炎症性肺疾患および急性炎症性肺疾患は、肺におけ
る単核食細胞の分離と関連するからである。アンタゴニストはまた、患者の関節
における滑液への単球の誘引を妨害することによって慢性関節リウマチを処置、
予防および／または診断するために使用され得る。単球流入および活性化は、変
性関節症および炎症性関節症の両方の病因において重要な役割を果たしている。
このアンタゴニストは、ＩＬ−１およびＴＮＦへ主に寄与する有害なカスケード
を妨害するために使用され得る。これは、他の炎症性ケモカインの生合成を妨げ
る。このようにして、このアンタゴニストは、炎症を予防するために使用され得
る。このアンタゴニストはまた、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５によって誘発されるプロ
スタグランジン非依存性の発熱を阻害するために使用され得る。このアンタゴニ
ストはまた、骨髄不全（例えば、再生不良性貧血および骨髄形成異常症候群）の
症例を処置、予防および／または診断するために使用され得る。このアンタゴニ
ストはまた、肺における好酸球蓄積を妨げることによって喘息およびアレルギー
を処置、予防および／または診断するために使用され得る。このアンタゴニスト
はまた、喘息肺の顕著な特徴である上皮下基底膜線維症を処置、予防および／ま
たは診断するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、リンパ腫（例え
ば、本明細書中に提供されるリンパ腫の一覧の広範な、しかし限定されない、１
以上）を処置、予防および／または診断するために使用され得る。Antagonists include, for example, macrophages and their precursors, and neutrophils, basophils, in certain autoimmune and chronic inflammatory and infectious diseases.
It can be used to inhibit Brainiac-5 mediated chemotaxis and activation of B lymphocytes and some T cell subsets (eg, activated and CD8 cytotoxic T cells and natural killer cells). Examples of autoimmune diseases include multiple sclerosis, and insulin-dependent diabetes. Antagonists can also be used to treat, prevent and / or diagnose infectious diseases including silicosis, sarcoidosis, idiopathic pulmonary fibrosis by preventing mononuclear phagocyte recruitment and activation. Antagonists can also be used to treat, prevent and / or diagnose idiopathic eosinophilia syndrome by interfering with eosinophil production and migration. Endotoxin shock can also be treated by antagonists by preventing macrophage migration and production of Brainiac-5 polypeptides of the invention. This antagonist can also be used to treat atherosclerosis by preventing monocyte invasion in the arterial wall.
The antagonists also inhibit immunological disorders, including histamine-mediated and late allergic reactions, chronic urticaria, and atopic dermatitis, by inhibiting chemokine-induced mast cell and basophil degradation and histamine release. It can be used for treatment, prevention and / or diagnosis. IgE-mediated allergic reactions such as allergic asthma, rhinitis, and eczema can also be treated. Antagonists can also be used to treat, prevent and / or diagnose chronic and acute inflammation by preventing the attraction of monocytes to the wound area. Antagonists can also be used to regulate normal lung macrophage populations. Chronic inflammatory lung disease and acute inflammatory lung disease are associated with segregation of mononuclear phagocytes in the lung. The antagonist also treats rheumatoid arthritis by preventing the attraction of monocytes to synovial fluid in the patient's joints,
It can be used for prevention and / or diagnosis. Monocyte influx and activation plays an important role in the pathogenesis of both osteoarthritis and inflammatory arthropathy.
This antagonist can be used to disrupt a deleterious cascade that primarily contributes to IL-1 and TNF. This prevents the biosynthesis of other inflammatory chemokines. In this way, the antagonist can be used to prevent inflammation. This antagonist can also be used to inhibit prostaglandin-independent fever induced by Brainiac-5. The antagonist may also be used to treat, prevent and / or diagnose cases of bone marrow failure, such as aplastic anemia and myelodysplastic syndrome. The antagonist may also be used to treat, prevent and / or diagnose asthma and allergy by preventing eosinophil accumulation in the lung. The antagonist may also be used to treat, prevent and / or diagnose subepithelial basement membrane fibrosis, a hallmark of asthmatic lungs. The antagonist may also include lymphomas, such as, but not limited to, the extensive, but non-limiting, list of lymphomas provided herein.
Above) can be used to treat, prevent, and / or diagnose.

【０３６３】 上記のすべての適用は、そのまま獣医薬に適用し得る。さらに、本明細書で記
載される全ての応用もまた獣医薬に適用し得る。All of the above applications may be directly applied to veterinary medicine. Further, all applications described herein may also be applicable to veterinary medicine.

【０３６４】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５に対する抗体は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５に結合し、そし
てＢｒａｉｎｉａｃ活性を阻害して、損傷後の肺への好中球の侵襲を予防するこ
とによって、ＡＲＤＳを処置、予防および／または診断するために使用され得る
。アンタゴニストおよび上記のアンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア
（例えば、本明細書以下に記載されるようなもの）との組成物中で使用され得る
。Antibodies to Brainiac-5 treat, prevent, and / or treat ARDS by binding to Brainiac-5 and inhibiting Brainiac activity to prevent neutrophil invasion of the lung following injury. Can be used to diagnose. Antagonists and the antagonists described above may be used in compositions with a pharmaceutically acceptable carrier, such as those described herein below.

【０３６５】 本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５
ポリペプチド、ならびに／あるいはこれらのアゴニストおよび／またはアンタゴ
ニストは、哺乳動物（好ましくはヒト）において、これらの障害と関連する種々
の免疫系関連障害および／または状態を処置、予防および／または診断するため
に使用され得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞による外来性物質としての不
適切な自己の認識から生じる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊を誘導する
免疫応答を生じる。従って、免疫応答（特にＴ細胞の増殖、分化または走化）を
阻害し得る本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはＢｒａｉｎｉ
ａｃ−５ポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／または
アンタゴニストの投与は、自己免疫障害の処置および／または予防において、効
果的な治療であり得る。従って、好ましい実施形態において、本発明のＢｒａｉ
ｎｉａｃ−５アンタゴニスト（例えば、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５のポリペプチドフ
ラグメントおよび抗Ｂｒａｉｎｉａｃ−５抗体）は、自己免疫障害を処置、予防
および／または診断のために使用される。A Brainiac-5 polynucleotide or Brainiac-5 of the present invention
The polypeptides, and / or agonists and / or antagonists thereof, may be used to treat, prevent and / or diagnose various immune system-related disorders and / or conditions associated with these disorders in mammals, preferably humans. Can be used for Many autoimmune disorders result from inappropriate self-recognition of immune cells by foreign cells. This inappropriate recognition results in an immune response that induces destruction of host tissues. Thus, Brainiac-5 polynucleotides or Braini of the invention that can inhibit an immune response, particularly T cell proliferation, differentiation or chemotaxis.
Administration of ac-5 polypeptides, and / or agonists and / or antagonists thereof, can be an effective therapy in treating and / or preventing an autoimmune disorder. Thus, in a preferred embodiment, the Brai of the present invention
Niac-5 antagonists (eg, Brainiac-5 polypeptide fragments and anti-Brainiac-5 antibodies) are used for treating, preventing, and / or diagnosing an autoimmune disorder.

【０３６６】 このような自己免疫障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：例えば、自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血小板減少症、自己免疫性血
球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸
球体腎炎、多発性硬化症、神経炎、結膜炎、多発性内分泌腺症、紫斑病、ライタ
ー病、スティッフマン症候群、自己免疫肺炎、ギヤン−バレー症候群、インシュ
リン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性の眼疾患のような自己免疫疾患。Such autoimmune disorders include, but are not limited to, for example, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune neonatal thrombocytopenia, autoimmune cytopenia, hemolytic anemia, anti- Phospholipid syndrome, dermatitis, allergic encephalomyelitis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, neuritis, conjunctivitis, multiple endocrine disease, purpura, Reiter's disease, Stiffman syndrome, autoimmune pneumonia, Guillain-Valley Autoimmune diseases such as the syndrome, insulin-dependent diabetes, and autoimmune inflammatory eye diseases.

【０３６７】 （高い可能性のある）さらなる自己免疫障害としては、以下が挙げられるが、
これらに限定されない：自己免疫甲状腺炎（すなわち、橋本甲状腺炎）（しばし
ば、例えば、細胞媒介性細胞傷害および液性甲状腺細胞傷害により特徴づけられ
る）全身性エリテマトーデス（しばしば、例えば、循環的および局所的に生じる
免疫複合体により特徴づけられる）、グッドパスチャー症候群（しばしば、例え
ば、抗基底膜抗体により特徴づけられる）、天疱瘡（しばしば、例えば、上皮性
棘融解抗体により特徴づけられる）レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グレー
ブス病（しばしば、例えば、ＴＳＨレセプター抗体により特徴づけられる）、（
ｂ）重症筋無力症（しばしば、例えば、アセチルコリンレセプター抗体により特
徴づけられる）、および（ｃ）インシュリン耐性（しばしば、例えば、インシュ
リンレセプター抗体により特徴づけられる）、自己免疫糖尿病（しばしば、例え
ば、抗体−感作ＲＢＣの食作用により特徴づけられる）のような）、自己免疫特
発性血小板減少性紫斑病（しばしば、例えば、抗体−感作血小板の食作用により
特徴づけられる）自己免疫性血小板減少性紫斑病（しばしば、例えば、抗体−感
作血小板の食作用により特徴づけられる）。Additional (possibly high) autoimmune disorders include the following:
Without limitation: autoimmune thyroiditis (ie, Hashimoto's thyroiditis) (often characterized by, for example, cell-mediated and humoral thyroid cytotoxicity) systemic lupus erythematosus (often, for example, circulatory and local) ), Goodpasture's syndrome (often characterized by, for example, anti-basement membrane antibodies), pemphigus (often characterized by, for example, epithelial axolytic antibodies) receptor autoimmunity ( For example, (a) Graves' disease (often characterized by, for example, TSH receptor antibodies), (
b) myasthenia gravis (often characterized by, for example, acetylcholine receptor antibodies); and (c) insulin resistance (often characterized by, for example, insulin receptor antibodies), autoimmune diabetes (often, eg, antibody- Autoimmune idiopathic thrombocytopenic purpura (often characterized by phagocytosis of sensitized RBCs), often characterized by phagocytosis of antibody-sensitized platelets) Disease (often characterized by, for example, phagocytosis of antibody-sensitized platelets).

【０３６８】 （可能性のある）さらなる自己免疫障害としては、以下が挙げられるが、これ
らに限定されない：リウマチ様関節炎（しばしば、例えば、関節の免疫複合体に
より特徴づけられる）、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（しばしば、例えば、核
小体抗体および他の核抗体により特徴づけられる）、混合結合組織疾患（しばし
ば、例えば、抽出可能な核抗原（例えば、リボ核タンパク質）に対する抗体によ
り特徴づけられる）、多発性筋炎（しばしば、例えば、非ヒストンＡＮＡにより
特徴づけられる）、悪性貧血（しばしば、例えば、抗壁細胞抗体、ミクロソーム
抗体および内因子抗体により特徴づけられる）、突発性アディソン病（しばしば
、例えば、体液性および細胞−媒介性アドレナリン細胞傷害により特徴づけられ
る）、不妊症（しばしば、例えば、抗***抗体により特徴づけられる）、糸球体
腎炎（しばしば、例えば、糸球基底膜抗体または免疫複合体により特徴づけられ
る）、水疱性類天疱瘡（しばしば、例えば、ＩｇＧおよび基底膜の補体により特
徴づけられる）、シェーグレン症候群（しばしば、例えば、複数の組織抗体およ
び／または特異的な非ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）により特徴づけられる）、糖
尿病（しばしば、例えば、細胞−媒介性島細胞抗体および体液性島細胞抗体によ
り特徴づけられる）、およびアドレナリン性薬物耐性（喘息または嚢胞性線維症
を併発する、アドレナリン性薬物耐性を含む）（しばしば、例えば、β−アドレ
ナリンレセプター抗体により特徴づけられる）。Additional (possible) autoimmune disorders include, but are not limited to: rheumatoid arthritis (often characterized by immune complexes in the joints), anti-collagen antibodies, Associated scleroderma (often characterized by, eg, nucleoli antibodies and other nuclear antibodies), mixed connective tissue disease (often, eg, characterized by antibodies to extractable nuclear antigens (eg, ribonucleoproteins)) ), Polymyositis (often characterized by non-histone ANA), pernicious anemia (often characterized by anti-mural cell antibodies, microsomal antibodies and intrinsic factor antibodies), idiopathic Addison's disease (often For example, characterized by humoral and cell-mediated adrenergic cytotoxicity), Pregnancy (often characterized by, eg, anti-sperm antibodies), glomerulonephritis (often, eg, by glomerular basement membrane antibodies or immune complexes), bullous pemphigoid (often, eg, IgG) And Sjogren's syndrome (often characterized, for example, by multiple tissue antibodies and / or specific non-histone ANAs (SS-B)), diabetes (often, eg, cells -Characterized by mediated islet cell antibodies and humoral islet cell antibodies), and adrenergic drug resistance (including adrenergic drug resistance associated with asthma or cystic fibrosis) (often, for example, β-adrenergic receptor Characterized by antibodies).

【０３６９】 （可能性のある）さらなる自己免疫障害としては、以下が挙げられるが、これ
らに限定されない：慢性活性肝炎（しばしば、例えば、平滑筋抗体により特徴づ
けられる）、原発性胆汁性肝硬変（しばしば、例えば、ミトコンドリア抗体によ
り特徴づけられる）、他の内分泌腺不全（しばしば、例えば、いくつかの場合、
特異的組織抗体により特徴づけられる）、白斑（しばしば、例えば、メラノサイ
ト抗体により特徴づけられる）、脈管炎（しばしば、例えば、Ｉｇおよび管壁の
補体および／または低血清補体により特徴づけられる）、心筋梗塞後（Ｐｏｓｔ
−ＭＩ）（しばしば、例えば、心筋抗体により特徴づけられる）、心臓切開症候
群（しばしば、例えば、心筋抗体により特徴づけられる）、じんま疹（しばしば
、例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体により特徴づけられる）、ア
トピー性皮膚炎（しばしば、例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体に
より特徴づけられる）、喘息（しばしば、例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよび
ＩｇＭ抗体により特徴づけられる）、および多くの他の炎症性障害、肉芽腫性障
害、変性障害および萎縮性障害。Additional (possible) autoimmune disorders include, but are not limited to: chronic active hepatitis (often characterized by, for example, smooth muscle antibodies), primary biliary cirrhosis ( Often, eg, characterized by mitochondrial antibodies), other endocrine gland deficiencies (often, eg, in some cases,
Vitiligo (often characterized by, for example, melanocyte antibodies), vasculitis (often characterized by, for example, Ig and vessel wall complement and / or low serum complement) ), After myocardial infarction (Post
-MI) (often characterized by, for example, myocardial antibodies), open heart syndrome (often characterized by, for example, myocardial antibodies), hives (often characterized by, for example, IgG and IgM antibodies to IgE) Atopic dermatitis (often characterized by IgG and IgM antibodies to IgE), asthma (often characterized by IgG and IgM antibodies to IgE), and many other inflammatory disorders, Granulomatous, degenerative and atrophic disorders.

【０３７０】 好ましい実施形態において、自己免疫疾患および自己免疫疾患障害、および／
または上記の疾患および障害と関連する状態が、抗Ｂｒａｉｎｉａｃ−５抗体を
使用して、処置、予防および／または診断される。In a preferred embodiment, an autoimmune disease and an autoimmune disease disorder, and / or
Alternatively, conditions associated with the above diseases and disorders are treated, prevented and / or diagnosed using an anti-Brainiac-5 antibody.

【０３７１】 同様に、例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸問題のような
アレルギー性反応および状態はまた、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレ
オチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド、ならびに／あるいはこれらの
アゴニストおよび／またはアンタゴニストにより、処置され得る。さらに、これ
らの分子は、アナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏症、もしくは血液型不
適合性を処置、予防および／または診断するために使用され得る。Similarly, allergic reactions and conditions, such as, for example, asthma (particularly allergic asthma) or other respiratory problems, may also affect Brainiac-5 polynucleotides or Brainiac-5 polypeptides of the invention, and / or Can be treated with agonists and / or antagonists of In addition, these molecules can be used to treat, prevent, and / or diagnose anaphylaxis, hypersensitivity to antigenic molecules, or blood group incompatibility.

【０３７２】 本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５
ポリペプチド、ならびに／あるいはこれらのアゴニストおよび／またはアンタゴ
ニストはまた、器官拒絶もしくは対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）および／または
それらと関連する症状を処置、予防および／または診断するために使用され得る
。器官拒絶は、免疫応答を介する移植片組織の宿主免疫細胞破壊により起こる。
同様に、免疫応答はまた、ＧＶＨＤに関するが、しかしこの場合、外来性の移植
免疫細胞は、宿主組織を破壊する。免疫応答（特にＴ細胞の増殖、分化または走
化性）を阻害する、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはＢｒ
ａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド、ならびに／あるいはこれらのアゴニストおよび
／またはアンタゴニストの投与は、器官拒絶またはＧＶＨＤの予防において、効
果的な治療であり得る。The Brainiac-5 polynucleotide or Brainiac-5 of the present invention
The polypeptides, and / or their agonists and / or antagonists, can also be used to treat, prevent and / or diagnose organ rejection or graft versus host disease (GVHD) and / or conditions associated therewith. . Organ rejection results from host immune cell destruction of graft tissue via an immune response.
Similarly, the immune response also involves GVHD, but in this case, the exogenous transplanted immune cells destroy host tissues. A Brainiac-5 polynucleotide or Br of the invention that inhibits an immune response, particularly T cell proliferation, differentiation or chemotaxis.
Administration of the aniac-5 polypeptide, and / or agonists and / or antagonists thereof, can be an effective treatment in preventing organ rejection or GVHD.

【０３７３】 同様に、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはＢｒａｉｎｉ
ａｃ−５ポリペプチド、ならびに／あるいはこれらのアゴニストおよび／または
アンタゴニストはまた、炎症を調節するために使用され得る。例えば、本発明の
Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリヌクレオチドまたはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチ
ド、ならびに／あるいはこれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、
炎症性応答に関する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子は、以下
を含む炎症状態（慢性および急性の両方の状態）を処置、予防および／または診
断するために使用され得る：慢性前立腺炎、肉芽腫性前立腺炎、およびマラコプ
ラキア感染に関連した炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性
炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血性再灌流障害、内毒素死亡、関節炎、補体
媒介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺傷害、炎症性
腸疾患、クローン病、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の
過剰産生からもたらされる状態。Similarly, Brainiac-5 polynucleotides or Brainiac of the present invention.
ac-5 polypeptides, and / or agonists and / or antagonists thereof, may also be used to modulate inflammation. For example, a Brainiac-5 polynucleotide or Brainiac-5 polypeptide of the present invention, and / or an agonist and / or antagonist thereof,
It can inhibit cell proliferation and differentiation for inflammatory responses. These molecules can be used to treat, prevent and / or diagnose inflammatory conditions (both chronic and acute conditions), including: those associated with chronic prostatitis, granulomatous prostatitis, and malakoplacia infection Inflammation (eg, septic shock, sepsis, or systemic inflammatory response syndrome (SIRS)), ischemic reperfusion injury, endotoxin death, arthritis, complement-mediated hyperacute rejection, nephritis, cytokine or chemokine-induced lung injury Inflammatory bowel disease, Crohn's disease, or a condition resulting from overproduction of cytokines (eg, TNF or IL-1).

【０３７４】 さらなる好ましい実施形態では、本発明は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチ
ドにより誘導されるアポトーシスを増強するための方法に関し、この方法は、Ｂ
ｒａｉｎｉａｃ−５レセプターを発現する細胞に、有効量のＢｒａｉｎｉａｃ−
５、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５−媒介性シグナル伝達を増加させることが可能なアナ
ログまたはアゴニストを投与する工程を含む。好ましくは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−
５−媒介性シグナル伝達は、疾患を処置、予防および／または診断するために増
加させられ、ここで、減少させられるアポトーシスまたは減少させられるサイト
カインおよび接着分子発現が、示される。アゴニストは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５
の可溶性形態およびＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドに対するモノクローナル
抗体を含み得る。In a further preferred embodiment, the present invention relates to a method for enhancing apoptosis induced by Brainiac-5 polypeptide, said method comprising the steps of:
An effective amount of Brainiac-5 receptor is added to cells expressing the Rainiac-5 receptor.
5. Administering an analog or agonist capable of increasing Brainiac-5-mediated signaling. Preferably, Brainiac-
5-mediated signaling is increased to treat, prevent and / or diagnose a disease, where reduced apoptosis or decreased cytokine and adhesion molecule expression is indicated. The agonist is Brainiac-5
And monoclonal antibodies against Brainiac-5 polypeptide.

【０３７５】 さらなる実施形態において、本発明は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドに
よって誘導されるアポトーシスを阻害するための方法に対して指向され、この方
法は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５媒介シグナル伝達を減少させ得るアンタゴニストの
有効量を、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５レセプターを発現する細胞へ投薬することを包
含する。好適には、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５媒介シグナル伝達は、疾患を処置し、
予防し、および／または診断するために減少され、ここで増加された、アポトー
シスまたはＮＦ−κＢ発現が、示される。アンタゴニストとしては、Ｂｒａｉｎ
ｉａｃ−５の可溶形態およびＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドに対して指向さ
れたモノクローナル抗体、が挙げられ得る。In a further embodiment, the present invention is directed to a method for inhibiting apoptosis induced by a Brainiac-5 polypeptide, the method comprising an antagonist of Brainiac-5-mediated signaling It involves administering an effective amount to cells expressing the Brainiac-5 receptor. Suitably, Brainiac-5 mediated signaling treats a disease,
Apoptosis or NF-κB expression that is reduced to prevent and / or diagnose, where increased, is indicated. As an antagonist, Brain
Soluble forms of iac-5 and monoclonal antibodies directed against Brainiac-5 polypeptide may be mentioned.

【０３７６】 本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそ
のアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、広範囲の疾患および／または
状態の診断および処置または予防において、有用である。このような疾患および
状態は、癌（例えば、免疫細胞に関連した癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、濾胞性
リンパ腫、ｐ５３の変異または改変に付随する癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頚部癌
、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、など）リンパ球増殖
性の疾患（例えば、リンパ節症）、微生物（例えば、ウィルス、細菌、など）の
感染（例えば、ＨＩＶ−１感染、ＨＩＶ−２感染、ヘルペスウィルス感染（ＨＳ
Ｖ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＥＢＶを含む
がこれらに限定されない）、アデノウィルス感染、ポックスウィルス感染、ヒト
パピローマウィルス感染、肝炎感染（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、など）
、ヘリコバクターピロリ感染、侵襲性ブドウ球菌感染、など）、寄生虫感染、腎
炎、骨の疾患（例えば、骨粗しょう症）、アテローム性動脈硬化症、疼痛、心臓
血管障害（例えば、新生血管形成、新生血管形成低下または循環低下（例えば、
虚血性の疾患（例えば、心筋梗塞、発作、など）））、ＡＩＤＳ、アレルギー、
炎症、神経変性疾患、（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性
側索硬化症、色素性網膜症、小脳変質、など）、移植片拒絶（急性および慢性）
、対宿主移植片病、骨髄形成異常による疾患（例えば、再生不良性貧血、など）
、リウマチにおける関節組織破壊、肝臓病（例えば、急性肝炎および慢性肝炎、
肝損傷、ならびに肝硬変）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、リウマチ様
動脈炎、全身性エリテマトーデス、免疫複合体糸球体腎炎、自己免疫性糖尿病、
自己免疫性血小板減少性紫斑病、グレイブ（Ｇｒａｖｅ）病、橋本甲状腺炎、な
ど）、心筋症（例えば、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病性合併症（例えば、糖
尿病性腎症、糖尿病性ミエロパシー、糖尿病性網膜症）、インフルエンザ、ぜん
息、乾癬、糸球体腎炎、敗血症性ショック、および潰瘍性大腸炎を含むが、限定
されない。The polynucleotides and / or polypeptides of the invention and / or agonists and / or antagonists thereof are useful in diagnosing and treating or preventing a wide range of diseases and / or conditions. Such diseases and conditions include cancers such as cancers associated with immune cells, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, follicular lymphoma, cancers associated with p53 mutations or alterations, brain tumors, bladder cancers, cervical cancers, Colon cancer, colorectal cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, gastric cancer, etc.) lymphoproliferative disease (eg, lymphadenopathy), infection of microorganisms (eg, virus, bacteria, etc.) (eg, HIV) -1 infection, HIV-2 infection, herpes virus infection (HS
V-1, HSV-2, CMV, VZV, HHV-6, HHV-7, EBV, adenovirus infection, poxvirus infection, human papillomavirus infection, hepatitis infection (eg, HAV, HBV, HCV, etc.)
, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, etc.), parasite infection, nephritis, bone disease (eg, osteoporosis), atherosclerosis, pain, cardiovascular disorders (eg, neovascularization, neogenesis) Hypovascularization or hypocirculation (eg,
Ischemic disease (eg, myocardial infarction, stroke, etc.))), AIDS, allergies,
Inflammation, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, pigmentary retinopathy, cerebellar alteration, etc.), transplant rejection (acute and chronic)
, Graft-versus-host disease, diseases caused by myelodysplasia (eg, aplastic anemia)
, Joint tissue destruction in rheumatism, liver disease (eg, acute and chronic hepatitis,
Liver injury, as well as cirrhosis), autoimmune diseases (eg, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, immune complex glomerulonephritis, autoimmune diabetes,
Autoimmune thrombocytopenic purpura, Grave's disease, Hashimoto's thyroiditis, etc., cardiomyopathy (eg, dilated cardiomyopathy), diabetes, diabetic complications (eg, diabetic nephropathy, diabetic myelopathy) Diabetic retinopathy), influenza, asthma, psoriasis, glomerulonephritis, septic shock, and ulcerative colitis.

【０３７７】 本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチド、ならびに／または
そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、新脈管形成、創傷（例えば
、創傷、やけど、および骨折）治癒を促進することにおいて有用である。本発明
のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチド、ならびに／またはそのアゴ
ニストおよび／もしくはアンタゴニストはまた、特定の抗原、抗ウィルス免疫応
答に対して免疫応答性を増強するためのアジュバンドとして、有用である。The polynucleotides and / or polypeptides of the invention, and / or agonists and / or antagonists thereof, are useful in promoting angiogenesis, wound (eg, wound, burn, and fracture) healing. . The polynucleotides and / or polypeptides of the invention, and / or agonists and / or antagonists thereof, are also useful as adjuvants to enhance immune responsiveness to certain antigens, antiviral immune responses.

【０３７８】 さらに一般的に、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドな
らびに／またはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、免疫応答を
調製する（すなわち、上昇および減少する）ことにおいて有用である。例えば、
本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、手術、外傷、放射線
療法、化学療法、および移植の準備または回復において有用であり得、あるいは
高齢者および免疫無防備状態の個体において免疫応答および／または回復を高め
るために使用され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくは
ポリペプチド、ならびに／またはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニス
トは、例えば、自己免疫疾患の処置または予防において、免疫抑制薬として有用
である。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポ
リペプチドは、本明細書中に記載されるような、または当該分野において既知で
ある、慢性炎症、アレルギーまたは自己免疫状態を、処置または予防するために
使用される。More generally, the polynucleotides and / or polypeptides of the invention and / or agonists and / or antagonists thereof are useful in preparing (ie, raising and decreasing) an immune response. For example,
Polynucleotides and / or polypeptides of the invention may be useful in the preparation or recovery of surgery, trauma, radiation therapy, chemotherapy, and transplantation, or immune response and / or recovery in elderly and immunocompromised individuals Can be used to enhance Alternatively, the polynucleotides and / or polypeptides of the invention, and / or agonists and / or antagonists thereof, are useful as immunosuppressants, for example, in treating or preventing an autoimmune disease. In certain embodiments, the polynucleotides and / or polypeptides of the invention treat or prevent a chronic inflammatory, allergic or autoimmune condition as described herein or known in the art. Used to

【０３７９】 （処方） Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド組成物を、個々の患者の臨床状態（特に、
Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド単独を用いる、処置、防止、および／または
診断の副作用）、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド組成物の送達部位、投与方
法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏ
ｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬す
る。従って、本明細書において目的とするＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの
「有効量」は、このような考慮を行って決定される。Formulation The Brainiac-5 polypeptide composition is administered to the individual patient's clinical condition,
Taking into account the side effects of treatment, prevention, and / or diagnosis using the Brainiac-5 polypeptide alone), the site of delivery of the Brainiac-5 polypeptide composition, the method of administration, the dosage regime and other factors known to those skilled in the art. , Medical practice standards (go
prescription and dosing in a manner that complies with the relevant medical practices. Accordingly, an "effective amount" of a Brainiac-5 polypeptide of interest herein is determined in light of such considerations.

【０３８０】 一般的提案として、用量あたり、非経口的に投与されるＢｒａｉｎｉａｃ−５
ポリペプチドの合計の薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０
ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。
さらに好ましくは、このホルモンについて、この用量は、少なくとも０．０１ｍ
ｇ／ｋｇ／日、そして最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と
約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、Ｂｒａｉｎ
ｉａｃ−５ポリペプチドを約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投
薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポンプを用い
る）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を
観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果
に応じて変化するようである。As a general suggestion, Brainiac-5 administered parenterally per dose
The total pharmaceutically effective amount of polypeptide is from about 1 μg / kg / day to 10% of the patient's body weight.
Although in the mg / kg / day range, as noted above, this is left to therapeutic discretion.
More preferably, for this hormone, the dose is at least 0.01 m
g / kg / day, and most preferably between about 0.01 mg / kg / day and about 1 mg / kg / day for humans. When administered continuously, typically Brain
The iac-5 polypeptide is administered at a dosage rate of about 1 μg / kg / hr to about 50 μg / kg / hr, either by injection 1 to 4 times daily or by continuous subcutaneous infusion (eg using a minipump). Intravenous bag solutions may also be used. The duration of treatment needed to observe the changes and the post-treatment interval at which the response occurs appear to vary depending on the desired effect.

【０３８１】 本発明の組成物の、投与されるべき有効量は、当業者に周知である手順を介し
て決定され得、この手順は、生物学的半減期、生物学的利用能、および毒性とし
てこのようなパラメータを提案する。このような決定は、特に本明細書中で提供
される詳細な開示を鑑みて、当業者の能力内である。The effective amount of a composition of the present invention to be administered can be determined via procedures that are well known to those skilled in the art, which procedures include As such a parameter. Such a determination is within the capabilities of those skilled in the art, especially in light of the detailed disclosure provided herein.

【０３８２】 治療の間のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドに対する生物体の生体暴露はま
た、治療的有効量養成法および／または薬学的有効量養成法を決定することにお
いて重要な役割を果たす。相対的に長期間での、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプ
チドの相対的少用量の反復投与のような種々の用量は、相対的に短期間でＢｒａ
ｉｎｉａｃ−５の相対的高用量の反復投与を用いて達成された用量と、治療的お
よび／または薬学的に識別可能な効果を有する。例えば、実施例６に示される血
清免疫グロブリンレベル実験を参照のこと。In vivo exposure of an organism to Brainiac-5 polypeptide during treatment also plays an important role in determining a therapeutically effective dosage regimen and / or a pharmaceutically effective dosage regimen. Various doses, such as repeated, relatively small doses of Brainiac-5 polypeptide over a relatively long period of time,
It has a therapeutically and / or pharmacologically identifiable effect with the dose achieved with relatively high doses of repeated administration of niac-5. See, for example, the serum immunoglobulin level experiment shown in Example 6.

【０３８３】 Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｊ．ら、（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ
ｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５０（４）：２１９−４４（１９６６））によって供給さ
れる等表面投薬転換係数（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ
ｄｏｓａｇｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）は、所与の実験系におけ
るＢｒａｉｎｉａｃ−５の使用により得られるデータを、別の実験系において１
用量あたり投与されるＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの正確な推定値の薬学
的有効量に転換し得る。マウス中へのＢｒａｉｎｉａｃ−５の投与を介して得ら
れた実験データは、ラット、サル、イヌ、およびヒトにおけるＢｒａｉｎｉａｃ
−５の薬学的有効量を正確な見積るために、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈらによって供給
される転換係数を介して転換され得る。以下の転換表（表ＩＩＩ）はＦｒｅｉｒ
ｅｉｃｈらにより提供されたデータの概要である。表ＩＩＩは、ある種の、ｍｇ
／ｋｇにより表現される用量を、表にした別の種において、ｍｇ／ｋｇとして表
現される等表面積用量へ転換するためにおよその係数を所与する。Freireich, E. et al. J. Et al., (Cancer Chemotherap)
y Reports 50 (4): 219-44 (1966)), equivalent surface area conversion factor.
The dose conversion factor is the data obtained from the use of Brainiac-5 in a given experimental system,
An accurate estimate of the amount of Brainiac-5 polypeptide administered per dose can be converted into a pharmaceutically effective amount. Experimental data obtained through the administration of Brainiac-5 into mice show that Brainiac in rats, monkeys, dogs, and humans.
To accurately estimate a pharmaceutically effective amount of -5, it can be converted through the conversion factor supplied by Freireich et al. The conversion table below (Table III) is Freir
1 is a summary of data provided by Eich et al. Table III shows certain mg
An approximate factor is given to convert the dose expressed in / kg to an equal surface area dose expressed as mg / kg in another tabulated species.

【０３８４】[0384]

【表３】 従って、例えば、表ＩＩＩに示される転換係数を用いて、マウスにおける５０
ｍｇ／ｋｇの用量は、（５０ｍｇ／ｋｇ）×（１／４）＝１２．５ｍｇ／ｋｇに
より、サルにおいて適切な用量の１２．５ｍｇ／ｋｇへ転換する。さらなる実施
例のように、マウスにおける０．０２、０．０８、０．８、２および８ｍｇ／ｋ
ｇの用量は、ヒトにおいて、それぞれ１．６６７μｇ／ｋｇ、６．６７μｇ／ｋ
ｇ、６６．７μｇ／ｋｇ、１６６．７μｇ／ｋｇおよび０．６６７ｍｇ／ｋｇの
有効量に等しい。[Table 3] Thus, for example, using the conversion factor shown in Table III, 50
The dose of mg / kg is converted to the appropriate dose of 12.5 mg / kg in monkeys by (50 mg / kg) x (1/4) = 12.5 mg / kg. As further examples, 0.02, 0.08, 0.8, 2 and 8 mg / k in mice
g doses in humans are 1.667 μg / kg and 6.67 μg / k, respectively.
g, equivalent to 66.7 μg / kg, 166.7 μg / kg and an effective amount of 0.667 mg / kg.

【０３８５】 本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを含む薬学的組成物を、経口的、
直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、
局所的（粉剤、軟膏、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経
口または鼻腔スプレーとして投与し得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは
、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の
製剤補助剤を意味する。１つの実施形態において、「薬学的に受容可能なキャリ
ア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任
意の型の製剤補助剤を意味する。特定の実施形態において、「薬学的に受容可能
」とは、合衆国もしくは州政府の管理機関により認可されている、または米国薬
局方においてもしくは動物、およびさらに好適にはヒトにおいて使用するために
一般的に認識されている他の薬局方において収載されていることを意味する。本
実施形態に従う適切な薬学的キャリアの非限定な例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに
よる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ」により提供され、そして水および油のような、石油、動物、野菜、または
合成起源（例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ごま油など）を含む、無菌
（ｓｔｅｒｉｌｅ）液を含む。薬学的組成物を静脈内に投与する場合、水が好ま
しいキャリアである。生理食塩水および水溶性ブドウ糖ならびにグリセロール溶
液を、液体キャリアとして、特に注入溶液のために使用し得る。所望される場合
、この組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得
る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、
徐放性処方などの形態を取り得る。本明細書中で使用される用語「非経口的」と
は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含
む投与の様式をいう。A pharmaceutical composition comprising a Brainiac-5 polypeptide of the invention can be administered orally,
Rectal, parenteral, intracistemally, vaginal, intraperitoneal,
It may be administered topically (such as by a powder, ointment, drop or transdermal patch), buccally or orally or as a nasal spray. "Pharmaceutically acceptable carrier" means a non-toxic solid, semi-solid or liquid filler, diluent, encapsulating material or any type of formulation auxiliary. In one embodiment, "pharmaceutically acceptable carrier" means a non-toxic solid, semi-solid or liquid filler, diluent, encapsulating material, or any type of formulation auxiliary. In certain embodiments, "pharmaceutically acceptable" is approved by a U.S. or state government authority or commonly used for use in the United States Pharmacopeia or in animals, and more preferably in humans. Listed in other pharmacopeias known to Non-limiting examples of suitable pharmaceutical carriers according to this embodiment are described in E.I. W. "Remington's Pharmaceutical Science" by Martin
and sterile fluids, such as water and oils, and include petroleum, animal, vegetable, or synthetic sources (eg, peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, etc.). Water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline and aqueous dextrose and glycerol solutions can be employed as liquid carriers, particularly for infusion solutions. If desired, the composition may also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents. These compositions include solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders,
It may take the form of a sustained release formulation or the like. The term "parenteral" as used herein refers to modes of administration including intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intraarticular injection and infusion.

【０３８６】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドはまた、徐放性システムにより適切に投与
される。徐放性組成物の適切な例は、例えば、フィルムまたはマイクロカプセル
の成形品の形態の半透過性ポリマーマトリックスを包含する。徐放性マトリック
スとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８
１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓ
ｉｄｍａｎ，Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８
３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ら、
Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）お
よびＬａｎｇｅｒ，Ｒ．，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２
））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ら同上）またはポリ−Ｄ
−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。徐放性Ｂ
ｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド組成物はまた、リポソームに封入されたＢｒａ
ｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを包含する。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを
含有するリポソームは、当該分野において公知である方法により調製される（Ｄ
Ｅ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１
９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４
３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米
国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ
１０２，３２４）。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラ
メラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多
く、選択された比率が、最適Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド治療のために調
整される。[0386] Brainiac-5 polypeptides are also suitably administered by sustained release systems. Suitable examples of sustained release compositions include, for example, semipermeable polymer matrices in the form of films or microcapsule shaped articles. As a sustained release matrix, polylactide (US Pat. No. 3,773,919, EP 58,48)
1), a copolymer of L-glutamic acid and γ-ethyl-L-glutamate (S
idman, U.S.A. Et al., Biopolymers 22: 547-556 (198).
3)), poly (2-hydroxyethyl methacrylate); Langer, R. et al.
J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981) and Langer, R.A. Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)
)), Ethylene vinyl acetate (Langer, R. et al., Supra) or poly-D
-(-)-3-hydroxybutyric acid (EP133,988). Sustained release B
The Rainiac-5 polypeptide composition can also include Brass encapsulated in liposomes.
niac-5 polypeptide. Liposomes containing Brainiac-5 polypeptide are prepared by methods known in the art (D
E3, 218, 121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. (USA) 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Pr.
oc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4030-4034 (1
980); EP52,322; EP36,676; EP88,046; EP14
3,949; EP 142,641; Japanese Patent Application No. 83-118008; U.S. Patent Nos. 4,485,045 and 4,544,545;
102, 324). Normally, liposomes are in the small (about 200-800 °) unilamellar form, where the lipid content is greater than about 30 mol% cholesterol and the selected ratio may be lower for optimal Brainiac-5 polypeptide treatment. Adjusted.

【０３８７】 非経口投与のために、１つの実施形態において、一般的に、Ｂｒａｉｎｉａｃ
−５ポリペプチドは、所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すな
わち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の
他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または
乳濁液）において、それを混合することにより処方される。例えば、この処方物
は、好ましくは、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であることが公知で
ある他の化合物を含まない。For parenteral administration, in one embodiment, generally Brainiac
-5 polypeptide with a desired degree of purity, a pharmaceutically acceptable carrier, i.e., one that is non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and is compatible with the other components of the formulation; It is formulated by mixing it in unit dosage injectable form (solution, suspension or emulsion). For example, the formulation is preferably free of oxidizing agents and other compounds known to be harmful to polypeptides.

【０３８８】 一般的に、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを液体キャリアまたは微細分割
固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する
。次いで、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャ
リアは、非経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶
液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲ
ル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エ
チルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用
である。Generally, formulations are prepared by contacting the Brainiac-5 polypeptide with a liquid carrier or a finely divided solid carrier, or both, in uniform and intimate contact. The product is then, if necessary, shaped into the desired formulation. Preferably, the carrier is a parenteral carrier, more preferably a solution that is isotonic with the blood of the recipient. Examples of such carrier vehicles include water, saline, Ringer's solution and dextrose solution. Non-aqueous vehicles such as fixed oils and ethyl oleate are also useful herein, as are liposomes.

【０３８９】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、ホスフェート、シトレート、サクシ
ネート、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩類のような緩衝剤；アスコルビ
ン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例え
ば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免
疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマ
ー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ
酸；セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを
含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マ
ンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イ
オン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非
イオン性界面活性剤が挙げられる。The carrier suitably contains minor amounts of additives such as substances that enhance isotonicity and chemical stability. Such substances are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include buffering agents such as phosphates, citrates, succinates, acetic acid and other organic acids or salts thereof; Antioxidants, such as ascorbic acid; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides (eg, polyarginine or tripeptide); proteins, such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; hydrophilic, such as polyvinylpyrrolidone Polymers; amino acids such as glycine, glutamic acid, aspartic acid or arginine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including cellulose or derivatives thereof, glucose, mannose or dextrin; chelating agents such as EDTA; mannitol or sorbitol; Yo A sugar alcohol; counterions such as sodium; and / or polysorbate include nonionic surfactants such as poloxamers or PEG.

【０３９０】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０
０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、こ
のようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化
剤を使用することにより、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド塩が形成されるこ
とが理解される。[0390] Brainiac-5 polypeptides are typically from about 0.1 mg / ml to 10 mg / ml.
Formulated in such vehicles at a concentration of 0 mg / ml, preferably 1-10 mg / ml, at a pH of about 3-8. It is understood that the use of the specific excipients, carriers or stabilizers described above results in the formation of Brainiac-5 polypeptide salts.

【０３９１】 治療的投与に用いられるＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは無菌状態で存在
せねばならない。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロン膜）を通して濾過すること
により無菌状態は容易に達成される。一般に、治療用Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリ
ペプチド組成物は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で
穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。[0391] Brainiac-5 polypeptides used for therapeutic administration must be sterile. Sterility is readily achieved by filtration through sterile filtration membranes (eg, a 0.2 micron membrane). Generally, therapeutic Brainiac-5 polypeptide compositions are placed in a container having a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle.

【０３９２】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドは、通常、単位用量容器または複数用量容
器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍
結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイア
ルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド水溶液５
ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。注射用静菌水（ＷＦＩ）
を用いて凍結乾燥したＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを再構成して注入溶液
を調製する。The Brainiac-5 polypeptide is typically stored in unit dose or multi-dose containers, for example, sealed ampules or vials, as an aqueous solution or a lyophilized formulation for reconstitution. As an example of a lyophilized formulation, sterile-filtered 1% (w / v) aqueous Brainiac-5 polypeptide solution 5 in a 10 ml vial
ml and freeze-dry the resulting mixture. Bacteriostatic water for injection (WFI)
Reconstitute the lyophilized Brainiac-5 polypeptide using to prepare an injection solution.

【０３９３】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を充填した一つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような
容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売に関
する政府機関による承認を反映する。さらに、本発明のポリペプチドを他の治療
用化合物と組み合わせて使用し得る。The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the present invention. A notice in the form of a government agency regulating the manufacture, use, or sale of pharmaceuticals or biological products may accompany such containers, and may include such notice for manufacture, use, or sale for human administration. To reflect government approvals. Further, the polypeptides of the present invention may be used in combination with other therapeutic compounds.

【０３９４】 本発明の組成物を単独でまたは他の補助剤と組み合わせて投与し得る。本発明
の組成物と共に投与され得る補助剤は、ミョウバン、ミョウバンおよびデオキシ
コール酸（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ Ｃｏｒｐ．）
、ＱＳ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、およびＭＰＬを含み得
るが、限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物をミョウバンと
組み合わせて投与する。他の特定の実施形態において、本発明の組成物をＱＳ−
２１と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得るさらなる補助
剤は、モノホスホリル液体免疫調節物質、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２
１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒ
ｏｓｏｍａｌアジュバント技術を含むが、これらに限定されない。本発明の組成
物と共に投与され得るワクチンは、ＭＭＲ（はしか、おたふくかぜ、風疹）に対
する保護へ指向されるワクチン、ポリオ、水痘、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎
、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ菌、百日咳、肺炎、インフルエンザ、ライム病
、ロタウイルス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、ポリオ、狂犬病、腸チフス、およ
び百日咳、を含むが限定されない。同時に（例えば、混合剤として）、別々であ
るが同時もしくは並行して；または経時的にのいずれかの配合物を投与し得る。
これは、組み合わせた薬剤を治療混合剤として共に投与する提示、さらに組み合
わせ剤を別々であるが、同時に（例えば、別々の静脈内ラインを個々の同じ静脈
ラインへ通すように）投与する手順を含む。さらに、「組み合わせての」投与は
、化合物の１つの別々の投与または、所与の第１の、続いて第２の薬剤の投与を
含む。The compositions of the present invention may be administered alone or in combination with other auxiliaries. Adjuvants that can be administered with the composition of the present invention include alum, alum and deoxycholic acid (ImmunoAg), MTP-PE (Biocine Corp.).
, QS21 (Genentech, Inc.), BCG, and MPL. In certain embodiments, a composition of the present invention is administered in combination with alum. In another specific embodiment, the composition of the present invention is QS-
Administered in combination with 21. Additional adjuvants that may be administered with the compositions of the present invention include the monophosphoryl liquid immunomodulator, AdjuVax 100a, QS-2.
1, QS-18, CRL1005, aluminum salt, MF-59, and Vir
Osmal adjuvant technology, including but not limited to. Vaccines that can be administered with the compositions of the present invention include vaccines directed to protection against MMR (measles, mumps, rubella), polio, varicella, tetanus / diphtheria, hepatitis A, hepatitis B, influenza B, Includes but is not limited to pertussis, pneumonia, influenza, Lyme disease, rotavirus, cholera, yellow fever, Japanese encephalitis, polio, rabies, typhoid fever, and whooping cough. Any of the formulations may be administered simultaneously (eg, as a mixture), separately but simultaneously or concurrently; or over time.
This includes the presentation of administering the combined agents together as a therapeutic admixture, as well as procedures for administering the combination separately but simultaneously (eg, passing separate intravenous lines to the same individual intravenous line). . Further, “in combination” administration includes the separate administration of a compound or the administration of a given first and then second agent.

【０３９５】 本発明の組成物を、単独または他の治療剤と組み合わせて投与し得、この治療
剤は、化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤、ステロイド性および非ステロイド
性の抗炎症、従来の免疫療法剤およびサイトカインを含むが、限定されない。付
随して（例えば、混合剤として）、別々であるが同時もしくは並行して、；また
は経時的にのいずれかで組み合わせ剤を投与し得る。これは、組み合わせ剤を治
療混合剤として共に投与する提示、さらに組み合わせ剤を別々であるが、同時に
（例えば、別々の静脈内ラインを個々の同じ静脈ラインへ通すように）投与する
手順を含む。さらに、「組み合わせの」投与は、化合物の１つの別々の投与また
は、所与の第１の、続いて第２の薬剤の投与を含む。The compositions of the present invention can be administered alone or in combination with other therapeutic agents, which include chemotherapeutic agents, antibiotics, antivirals, steroidal and non-steroidal anti-inflammatory, conventional But not limited to immunotherapeutic agents and cytokines. The combination may be administered concomitantly (eg, as a mixture), either separately but simultaneously or concurrently; or over time. This includes the presentation of administering the combination together as a therapeutic admixture, as well as procedures for administering the combination separately but simultaneously (eg, passing separate intravenous lines to the same individual intravenous line). Further, “combination” administration includes the administration of one separate or the administration of a given first and then second agent of the compound.

【０３９６】 １つの実施形態において、本発明の組成物を、ＴＮＦファミリーのメンバーと
組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る、ＴＮＦ、ＴＮＦ関
連またはＴＮＦ様の分子は、以下を含むが、これらに限定されない：可溶形態の
ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても知られる）、
ＬＴ−β（ＬＴ−α２−βのヘテロトリマー複合体において見出される）、ＯＰ
ＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ
３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開第ＷＯ ９６／１４３２８号）、ＡＩＭ
−Ｉ（国際公開第ＷＯ ９７／３３８９９号）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公開第ＷＯ
９７／３４９１１号）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）：１
１８５−１１９０）、エンドカイン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開第ＷＯ
９８／０７８８０号）、ＴＲ６（国際公開第ＷＯ ９８／３０６９４号）、Ｏ
ＰＧおよびニュートロカイン（ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ）−α（国際公開第ＷＯ
９８／１８９２１号）、ＯＸ４０および神経成長因子（ＮＧＦ）およびＦａｓの
可溶形態、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開
第ＷＯ ９６／３４０９５号）、ＤＲ３（国際公開第ＷＯ ９７／３３９０４号
）、ＤＲ４（国際公開第ＷＯ ９８／３２８５６号）、ＴＲ５（国際公開第ＷＯ
９８／３０６９３号）、ＴＲ６（国際公開第ＷＯ ９８／３０６９４号）、Ｔ
Ｒ７（国際公開第ＷＯ ９８／４１６２９号）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開
第ＷＯ ９８／５６８９２号）、ＴＲ１０（国際公開第ＷＯ ９８／５４２０２
号）、３１２Ｃ２（国際公開第ＷＯ ９８／０６８４２号）、およびＴＲ１２。In one embodiment, a composition of the invention is administered in combination with a member of the TNF family. TNF, TNF-related or TNF-like molecules that can be administered with the compositions of the present invention include, but are not limited to: soluble forms of TNF-α, lymphotoxin-α (LT-α, TNF-β Also known as),
LT-β (found in the heterotrimeric complex of LT-α2-β), OP
GL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR
3, OX40L, TNF-γ (International Publication No. WO 96/14328), AIM
-I (International Publication WO 97/33899), AIM-II (International Publication WO 97/33899)
97/34911), APRIL (J. Exp. Med. 188 (6): 1).
185-1190), endokine-α (International Publication No. WO
98/07880), TR6 (International Publication No. WO 98/30694), O
PG and neutrokine-α (WO WO
98/18921), OX40 and soluble forms of nerve growth factor (NGF) and Fas, CD30, CD27, CD40 and 4-IBB, TR2 (WO 96/34095), DR3 (WO 97). / 33904), DR4 (International Publication No. WO 98/32856), TR5 (International Publication No. WO 98/32856)
98/30693), TR6 (International Publication No. WO 98/30694), T
R7 (International Publication WO 98/41629), TRANK, TR9 (International Publication WO 98/56892), TR10 (International Publication WO 98/54202)
No. 312C2 (WO 98/06842), and TR12.

【０３９７】 特定の実施形態において、本発明の組成物を、抗レトロウイルス剤、ヌクレオ
シド逆転写阻害剤、非ヌクレオシド逆転写阻害剤、および／またはプロテアーゼ
阻害剤と共に投与する。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るヌクレオシ
ド逆転写阻害剤は、ＲＥＴＲＯＶＩＲ^TM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸ^TM （ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤ^TM（ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎ
ｅ／ｄｄＣ）／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴ^TM（スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）／
ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲ^TM（ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）／３ＴＣ）、
およびＣＯＭＢＩＶＩＲ^TM（ジドブジン／ラミブジン）を含むが、限定されない
。本発明の組成物と組み合わされて投与し得る非ヌクレオシド逆転写阻害剤は、
ＶＩＲＡＭＵＮＥ^TM（ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎ））、ＲＥＳＣＲＩＰＴ
ＯＲ^TM（デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ））、およびＳＵＳＴＩＶＡ^TM （エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ））を含むが、これらに限定されない。
本発明の組成物と組み合わせて投与され得るタンパク質阻害剤は、ＣＲＩＸＩＶ
ＡＮ^TM（インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ））、ＮＯＲＶＩＲ^TM（リトナビル
（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ））、ＩＮＶＩＲＡＳＥ^TM（サキナビル（ｓａｑｕｉｎａ
ｖｉｒ）、およびＶＩＲＡＣＥＰＴ^TM（ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ
））を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、抗レトロウイ
ルス剤、ヌクレオシド逆転写阻害剤、非ヌクレオシド逆転写阻害剤、および／ま
たはプロテアーゼ阻害剤は、本発明の組成物と任意に組み合わせて、使用され、
ＡＩＤＳを処置、防止、および／もしくは診断し得、ならびに／またはＨＩＶ感
染を処置、防止、および／もしくは診断し得る。In certain embodiments, a composition of the present invention is administered with an antiretroviral agent, a nucleoside reverse transcription inhibitor, a non-nucleoside reverse transcription inhibitor, and / or a protease inhibitor. Nucleoside reverse transcription inhibitors that can be administered in combination with the compositions of the present invention include RETROVIR ^™ (Zidovudine / AZT), VIDEX ^™ (Zidanosin / ddI), HIVID ^™ (Zalcitabine
e / ddC) / ddC), ZERIT ^™ (stavudine /
d4T), EPIVIR ^™ (lamivudine / 3TC),
And COMBIVIR ^™ (zidovudine / lamivudine). Non-nucleoside reverse transcription inhibitors that can be administered in combination with the compositions of the present invention include:
VIRAMUNE ^™ (nevirapin), RESCRIPT
OR ^™ (delavirdine), and SUSTIVA ^™ (efavirenz).
Protein inhibitors that can be administered in combination with the compositions of the present invention are CRIXIV
AN ^™ (indinavir), NORVIR ^™ (ritonavir), INVIRASE ^™ (saquinavir)
vir), and VIRACEPT ^™ (nelfinavir
)), But is not limited thereto. In certain embodiments, an antiretroviral agent, a nucleoside reverse transcription inhibitor, a non-nucleoside reverse transcription inhibitor, and / or a protease inhibitor is used, optionally in combination with a composition of the present invention;
AIDS may be treated, prevented, and / or diagnosed, and / or HIV infection may be treated, prevented, and / or diagnosed.

【０３９８】 他の実施形態において、本発明の組成物を抗日和見性感染剤と組み合わせて使
用し得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗日和見性剤は、ＴＲＩ
ＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ^TM、ＤＡＰＳＯＮＥ^TM 、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥ^TM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ^TM、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ^TM 、ＲＩＦＡＭＰＩＮ^TM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ^TM、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ^TM 、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ^TM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、ＡＺＩＴＨＲＯＭ
ＹＣＩＮ^TM、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ^TM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ^TM、ＣＩＤＯＦＯ
ＶＩＲ^TM、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＫＥＴＯ
ＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ^TM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ^TM、ＰＹ
ＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥ^TM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TM、ＮＥＵＰＯＧＥＮ^TM（フ
ィルグラスティム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥ^TM（サーグラモスティ
ム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ／ＧＭ−ＣＳＦ）を含むが、これらに限定されな
い。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−
ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ^TM、ＤＡＰＳＯＮＥ^TM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩ
ＮＥ^TM、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ^TMと任意に組み合わせて使用され
、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置し、予防
し、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物
は、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ^TM、ＲＩＦＡＭＰＩＮ^TM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ^TM 、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ^TMと任意に組み合わせて使用され、日和
見性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ菌複合感染を予防的に処置し、予
防し、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成
物は、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ^TM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、および／また
はＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、と任意に組み合わせて使用され、日和見性Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的に処置、予防
、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は
、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ^TM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ^TM、および／またはＣＩＤＯ
ＦＯＶＩＲ^TMと任意に組み合わせて使用され、日和見性サイトメガロウイルス感
染を予防的に処置、予防、および／または診断し得る。別の実施形態において、
本発明の組成物は、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、
および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥ^TMと任意に組み合わせて使用され、日
和見性真菌感染を予防的に処置、予防、および／または診断し得る。他の実施形
態において、本発明の組成物は、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ^TM、および／またはＦＡＭ
ＣＩＣＯＬＶＩＲ^TMと任意に組み合わせて使用され、日和見性単純ヘルペスウイ
ルス型Ｉ感染および／または単純ヘルペスウイルス型ＩＩ感染を予防的に処置、
予防、および／または診断し得る。別の実施形態において、本発明の組成物は、
ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥ^TMおよび／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TMと任意に
組み合わせて使用され、日和見性Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ感染を予
防的に処置し、予防し、および／または診断し得る。別の実施形態において、本
発明の組成物は、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TMおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮ^TMと
任意に組み合わせて使用され、日和見性細菌感染を予防的に処置し、予防し、お
よび／または診断し得る。In another embodiment, the compositions of the present invention may be used in combination with an anti-opportunistic infectious agent. Anti-opportunistic agents that can be administered in combination with the compositions of the present invention include TRI
METHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE ^™ , DAPSONE ^™ , PENTAMIDINE ^™ , ATOVAQONE ^™ , ISONIAZID ^™ , RIFAMPIN ^™ , PYRAZINAMIDE ^™ , ETHAMBUTOL ^™ , RIFABUTINROM ^™ , RFABUTINROM ^™ , RFABUTIN ^™ ROMY
YCIN ^™ , GANIC CLOVIR ^™ , FOSCARNET ^™ , CIDOFO
VIR ^™ , FLUCONAZOLE ^™ , ITRACONAZOLE ^™ , KETO
CONAZOLE ^™ , ACYCLOVIR ^™ , FAMCICOLVIR ^™ , PY
Including, but not limited to, RIMETHAMINE ^™ , LEUCOVORIN ^™ , NEUPOGEN ^™ (filgrastim / G-CSF), and LEUKINE ^™ (sargramostim / GM-CSF). The composition is TRIMETHOPRIM-
SULFAMETHOXAZOLE ^™ , DAPSONE ^™ , PENTAMIDI
Used in any combination with NE ^™ and / or ATOVAQONE ^™ to prophylactically treat, prevent, and / or diagnose Pneumocystis carinii pneumonia infection. In another specific embodiment, the compositions of the present invention are used in any combination with ISONIAZID ^™ , RIFAMPIN ^™ , PYRAZINAMIDE ^™ , and / or ETHAMBUUTOL ^™ to prevent opportunistic Mycobacterium avium complex infection. , Prevent, and / or diagnose. In another specific embodiment, the composition of the present invention is used in any combination with RIFABUTIN ^™ , CLARITROMYCIN ^™ , and / or AZITHROMYCIN ^™ , and comprises an opportunistic My.
cobacterium tuberculosis infection may be treated, prevented, and / or diagnosed prophylactically. In another particular embodiment, the composition of the present invention comprises GANICLOVIR ^™ , FOSCARNET ^™ , and / or CIDO.
It can be used in any combination with FOVIR ^™ to prophylactically treat, prevent, and / or diagnose opportunistic cytomegalovirus infections. In another embodiment,
The composition of the present invention comprises FLUCONAZOLE ^™ , ITRACONAZOLE ^™ ,
And / or used in any combination with KETOCONAZOLE ^™ to prophylactically treat, prevent, and / or diagnose opportunistic fungal infections. In other embodiments, the compositions of the present invention comprise ACYCLOVIR ^™ , and / or FAM
Used in combination with CICOLVIR ^™ to preventively treat opportunistic herpes simplex virus type I and / or herpes simplex virus type II infections,
It can be preventive and / or diagnostic. In another embodiment, the composition of the present invention comprises:
It can be used in any combination with PYRIMETHAMINE ^™ and / or LEUCOVORIN ^™ to prophylactically treat, prevent, and / or diagnose opportunistic Toxoplasma gondii infections. In another embodiment, the compositions of the present invention can be used in any combination with LEUCOVORIN ^™ and / or NEUPOGEN ^™ to prophylactically treat, prevent, and / or diagnose opportunistic bacterial infections.

【０３９９】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を、抗ウイルス剤と組み合わせて
投与する。本発明の組成物と共に投与され得る抗ウイルス剤は、アシクロビル、
リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎｔｉｄｉｎｅ）を
含むが、これらに限定されない。In a further embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with an antiviral agent. Antiviral agents that can be administered with the compositions of the present invention include acyclovir,
Including but not limited to ribavirin, amantadine, and remantidine.

【０４００】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を抗生物質剤と組み合わせて投与
する。本発明の組成物と共に投与され得る抗生物質剤は、アモキシリン、アミノ
酸糖体、β−ラクタム（糖ペプチド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマイシン、
クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、エリトロマイ
シン、フルオロキノロン類、マクロライド系抗生物質、メトロニダゾル、ペニシ
リン類、キノロン類、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テ
トラサイクリン、トリペトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、
およびバンコマイシンを含むが、これらに限定されない。In a further embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with an antibiotic. Antibiotic agents that can be administered with the composition of the present invention include amoxicillin, amino acid saccharide, β-lactam (glycopeptide), β-lactamase, clindamycin,
Chloramphenicol, cephalosporin, ciprofloxacin, erythromycin, fluoroquinolones, macrolide antibiotics, metronidazole, penicillins, quinolones, rifampin, streptomycin, sulfonamide, tetracycline, tripetprim, trimethoprim-sul Famethoxazole,
And vancomycin.

【０４０１】 本発明の組成物と組み合わせて投与され得る、従来の非特定の免疫抑制剤は、
ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミドメ
チルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオ
キシスパーグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、およびＴ細胞に応答
する機能を抑制することにより作用する他の免疫抑制剤を含むが、これらに限定
されない。Conventional non-specific immunosuppressants that can be administered in combination with the compositions of the present invention include:
Steroids, cyclosporins, cyclosporin analogs, cyclophosphamide methylprednisone, prednisone, azathioprine, FK-506, 15-deoxyspergualin, and other immunosuppressions that act by suppressing the ability to respond to T cells Including but not limited to agents.

【０４０２】 特定の実施形態において、本発明の組成物を、免疫抑制薬と組み合わせて投与
する。本発明の組成物と共に投与され得る免疫抑制薬製剤は、ＯＲＴＨＯＣＬＯ
ＮＥ^TM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ^TM／ＮＥＯＲＡＬ^TM／ＳＡＮＧＤＹ
Ａ^TM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦ^TM（タクロリムス）、ＣＥＬＬＣＥＰ
Ｔ^TM（マイコフェノレート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ））、アザチオプリン
、グルコルチコステロイド（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、および
ＲＡＰＡＭＵＮＥ^TM（シロリマス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））を含むが、これらに
限定されない。特定の実施形態において、免疫抑制剤は、器官または骨髄移植の
拒絶を妨ぐために使用され得る。[0402] In certain embodiments, a composition of the present invention is administered in combination with an immunosuppressive drug. Immunosuppressant formulations that can be administered with the compositions of the present invention include ORTHOCLO
NE ^™ (OKT3), SANDIMMUNE ^™ / NEORAL ^™ / SANGDY
A ^™ (cyclosporine), PROGRAF ^™ (tacrolimus), CELLCEP
Including but not limited to T ^™ (mycophenolate), azathioprine, glucoticosteroids, and RAPAMUNE ^™ (sirolimus). In certain embodiments, immunosuppressive agents can be used to prevent rejection of organ or bone marrow transplants.

【０４０３】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を、単独または１つ以上の静脈免
疫グロブミン製剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る
静脈内免疫グロブミン製剤は、ＧＡＭＭＡＲ^TM、ＩＶＥＥＧＡＭ^TM、ＳＡＮＤＯ
ＧＬＯＢＵＬＩＮ^TM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／Ｄ^TM、およびＧＡＭＩＭＵＮＥ ^TM を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物
を移植療法（例えば、骨髄移植）において、静脈免疫グロブミン製剤と組み合わ
せて投与する。In a further embodiment, a composition of the present invention is administered alone or with one or more vein immunizations.
It is administered in combination with a globulin preparation. Can be administered with the composition of the present invention
Intravenous immunoglobulin preparation^TM, IVEEGAM^TM, SANDO
GLOBULIN^TM, GAMMAGARD S / D^TM, And GAMIMUNE ^TM Including, but not limited to. In certain embodiments, compositions of the present invention
Combined with intravenous immunoglobulin in transplantation therapy (eg, bone marrow transplantation)
To be administered.

【０４０４】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を、単独または抗炎症剤と組み合
わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る抗炎症剤は、糖質コルチコ
イドおよび非ステロイド性抗炎症薬、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリー
ル酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン
酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキシア
ミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−
４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、ブコロー
ム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメ
トン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロル、パラリニン、ペリソキサー
ル、ピフォキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプを含むが、限
定されない。[0404] In a further embodiment, a composition of the present invention is administered alone or in combination with an anti-inflammatory agent. Anti-inflammatory agents that can be administered with the compositions of the present invention include glucocorticoid and non-steroidal anti-inflammatory drugs, aminoaryl carboxylic acid derivatives, aryl acetic acid derivatives, aryl butyric acid derivatives, aryl carboxylic acid, aryl propionic acid derivatives, pyrazoles, Pyrazolone, salicylic acid derivative, thiazinecarboxamide, e-acetamidocaproic acid, S-adenosylmethionine, 3-amino-
4-hydroxybutyric acid, amixetrine, bendazac, benzidamine, bucolome, difenpyramide, ditazole, emorphazone, guaiazulene, nabumetone, nimesulide, orgothein, oxaceprol, paralinine, perisoxal, pipoxime, procazone, proxazole, and but not limited to tenidap .

【０４０５】 別の実施形態において、本発明の組成物を、化学療法剤と組み合わせて投与す
る。本発明の組成物と共に投与され得る化学療法剤は、抗生物質誘導体（例えば
、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン
）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；代謝拮抗剤（例えば、フルオ
ロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキセート、フロクシウリジン、インターフェロ
ンαー２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、および６−チ
オグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、Ｃ
ＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒド
ロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シス−プラチ
ン（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎ）、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン（例えば
、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エチニルエ
ストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロ
ン、二リン酸ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、およびテスト
ラクトン）；窒素マスタード（ｍｕｓｔａｒｄ）誘導体（例えば、メファレン（
ｍｅｐｈａｌｅｎ）、チョランブシル、メクロレタミン（窒素マスタード）およ
びチオテパ）；ステロイドおよび組合せ（例えば、リン酸ベタメタソンナトリウ
ム；およびその他（例えば、ジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトタン、硫酸
ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）を含むが、これらに
限定されない。In another embodiment, a composition of the invention is administered in combination with a chemotherapeutic agent. Chemotherapeutic agents that may be administered with the compositions of the present invention include antibiotic derivatives (eg, doxorubicin, bleomycin, daunorubicin, and dactinomycin); anti-estrogens (eg, tamoxifen); antimetabolites (eg, fluorouracil, 5- FU, methotrexate, floxiuridine, interferon α-2b, glutamic acid, plicamycin, mercaptopurine, and 6-thioguanine; cytotoxic agents (eg, carmustine, BCNU, lomustine, C)
CNU, cytosine arabinoside, cyclophosphamide, estramustine, hydroxyurea, procarbazine, mitomycin, busulfan, cis-platin, and vincristine sulfate); hormones (eg, medroxyprogesterone, estramustine) Sodium phosphate, ethinylestradiol, estradiol, megestrol acetate, methyltestosterone, diethylstilbestrol diphosphate, chlorotrianisene, and testlactone); nitrogen mustard derivatives (eg, mephalen (
steroids and combinations (eg, betamethasone sodium phosphate; and others (eg, dicarbazine, asparaginase, mitotane, vincristine sulfate, vinblastine sulfate, and etoposide); However, the present invention is not limited to these.

【０４０６】 特定の実施形態において、本発明の組成物を、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド
、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）またはＣＨＯＰ化合
物の任意の組合せ剤と組合せて投与する。別の実施形態において、本発明の組成
物をＲｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与する。さらなる実施形態において、
本発明の組成物を、ＲｉｔｕｘｉｍａｂおよびＣＨＯＰ、またはＲｉｔｕｘｍａ
ｂおよびＣＨＯＰの成分の任意の組合せと共に投与する。In certain embodiments, the compositions of the present invention are administered in combination with CHOP (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone) or any combination of CHOP compounds. In another embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with Rituximab. In a further embodiment,
The composition of the present invention may be prepared using Rituximab and CHOP, or Rituxmab.
Administered with any combination of components of b and CHOP.

【０４０７】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を、サイトカインと組み合わせて
投与する。本発明の組成物と共に投与され得るサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、
Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、Ｉ
Ｌ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗−ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ
−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βを含むが、これらに限定され
ない。さらなる実施形態において、本発明の組成物を任意のインターロイキンと
共に投与し、このインターロイキンは、ＩＬ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ２、ＩＬ３
、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、Ｉ
Ｌ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ
１９、ＩＬ２０、ＩＬ２１、およびＩＬ２２を含むが、限定されない。In a further embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with a cytokine. Cytokines that can be administered with the compositions of the present invention include GM-CSF,
G-CSF, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, I
L12, IL13, IL15, anti-CD40, CD40L, IFN-α, IFN
-Β, IFN-γ, TNF-α, and TNF-β, but are not limited thereto. In a further embodiment, a composition of the present invention is administered with any interleukin, wherein the interleukin is IL-α, IL-1β, IL2, IL3
, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, I
L12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL
19, including, but not limited to, IL20, IL21, and IL22.

【０４０８】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を、ケモカインと共に投与する。
別の実施形態において、本発明の組成物を、ケモカインβ−８、ケモカインβ−
１、および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−４と共に投与する。好ま
しい実施形態において、本発明の組成物を、ケモカインβー８と共に投与する。In a further embodiment, a composition of the present invention is administered with a chemokine.
In another embodiment, the composition of the present invention comprises chemokine β-8, chemokine β-
1, and / or administered with macrophage inflammatory protein-4. In a preferred embodiment, the compositions of the present invention are administered with the chemokine β-8.

【０４０９】 さらなる実施形態において、本発明の組成物をＩＬ−４アンタゴニストと組み
合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得るＩＬ−４アンタゴニスト
は、可溶性ＩＬ−４レセプターポリペプチド、可溶性ＩＬ−４レセプターポリペ
プチドの多量体の形態；ＩＬ−４により誘発される生物学的シグナルを形質導入
することなしに、ＩＬ−４レセプターに結合する抗ＩＬ−４レセプター抗体、１
つ以上のＩＬ−４レセプターへＩＬ−４を結合させることをブロックする抗ＩＬ
−４抗体、およびＩＬ−４レセプターを結合するがＩＬ−４により誘発される生
物学的シグナルを形質転換しないＩＬ−４のムテインを含むが、これらに限定さ
れない。好適には、この方法に従って使用される抗体は、モノクロ−ナル抗体（
例えば、本明細書中に記載される抗体フラグメントのような抗体フラグメントを
含む）である。In a further embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with an IL-4 antagonist. IL-4 antagonists that can be administered with the compositions of the present invention transduce soluble IL-4 receptor polypeptide, multimeric forms of soluble IL-4 receptor polypeptide; biological signals induced by IL-4. Anti-IL-4 receptor antibodies that bind to the IL-4 receptor without
Anti-IL that blocks binding of IL-4 to one or more IL-4 receptors
-4 antibodies, and muteins of IL-4 that bind the IL-4 receptor but do not transduce a biological signal elicited by IL-4. Preferably, the antibody used according to this method is a monoclonal antibody (
For example, antibody fragments such as those described herein).

【０４１０】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を造血増殖因子と組み合わせて投
与する。本発明の組成物と共に投与され得る造血増殖因子は、ＬＥＵＫＩＮＥ^TM （ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭ^TM）およびＮＥＵＰＯＧＥＮ^TM（ＦＩＬＧＲＡＳＴ
ＩＭ^TM）を含むが、これらに限定されない。In a further embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with a hematopoietic growth factor. Hematopoietic growth factors that can be administered with the compositions of the present invention include LEUKINE ^™ (SARGRAMOSTIM ^™ ) and NEUPOGEN ^™ (FILGLAST).
IM ^™ )).

【０４１１】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を線維芽細胞増殖因子と組み合わ
せて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る線維芽細胞増殖因子は、ＦＧ
Ｆ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧ
Ｆ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２
、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５を含むが、これらに限定さ
れない。In a further embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with a fibroblast growth factor. Fibroblast growth factor that can be administered with the compositions of the present invention is FG
F-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FG
F-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12
, FGF-13, FGF-14, and FGF-15.

【０４１２】 さらに、本発明の組成物を、単独または他の治療養生法と組み合わせて投与し
得、この治療養生法は放射療法を含むが、これに限定されない。このような組合
せ療法を経時的におよび／または同時に行い得る。Further, the compositions of the present invention can be administered alone or in combination with other treatment regimens, including, but not limited to, radiation therapy. Such combination therapy may be given over time and / or simultaneously.

【０４１３】 （アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセイならびに分子） 本発明は、細胞に対するＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの作用（例えば、
レセプター分子のようなＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド結合分子との相互作
用）を増強し、またはブロックする化合物を同定するために化合物をスクリーニ
ングする方法を提供する。アゴニストは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの
天然の生物学的機能を増加させるか、またはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド
と類似の様式で機能する化合物であり、一方、アンタゴニストはこのような機能
を減少または除去する。Agonists and Antagonists-Assays and Molecules The present invention relates to the effects of Brainiac-5 polypeptides on cells (eg,
Methods for screening compounds to identify compounds that enhance or block interaction with a Brainiac-5 polypeptide binding molecule, such as a receptor molecule. An agonist is a compound that increases the natural biological function of a Brainiac-5 polypeptide, or that functions in a manner similar to a Brainiac-5 polypeptide, while an antagonist reduces or eliminates such function. .

【０４１４】 この実施形態の別の局面において、本発明は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプ
チドへ特異的に結合する、レセプタータンパク質または他のリガンド結合タンパ
ク質を同定するための方法を提供する。例えば、細胞のコンパートメント（例え
ば、その膜または調製物）をＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドに結合する分子
を発現する細胞から調製し得る。この調製を、標識したＢｒａｉｎｉａｃ−５ポ
リペプチドを用いてインキュベートし、そしてレセプターまたは他の結合タンパ
ク質に結合したＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド複合体を慣用的な当業者に公
知の方法により、単離し、そして特徴づける。あるいは、細胞から可溶化された
結合分子をカラムへ結合させ、次いで慣用的な方法に従って溶出しそして特徴付
けるためにＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを、固体支持体へ結合させ得る。[0414] In another aspect of this embodiment, the invention provides a method for identifying a receptor protein or other ligand binding protein that specifically binds to a Brainiac-5 polypeptide. For example, a compartment of a cell (eg, a membrane or preparation thereof) can be prepared from a cell that expresses a molecule that binds a Brainiac-5 polypeptide. The preparation is incubated with the labeled Brainiac-5 polypeptide, and the Brainiac-5 polypeptide complex bound to the receptor or other binding protein is isolated by routine methods known to those of skill in the art, and Characterize. Alternatively, the solubilized binding molecule from the cells can be bound to a column, and then the Brainiac-5 polypeptide can be bound to a solid support for elution and characterization according to conventional methods.

【０４１５】 アゴニストまたはアンタゴニストについての本発明のアッセイにおいて、細胞
区画（例えば、膜または膜の調製物）は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドに
結合する分子（例えば、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドによって調節される
シグナル経路または調節経路の分子）を発現する細胞から調製され得る。その調
製物は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドアゴニストもしくはＢｒａｉｎｉａ
ｃ−５ポリペプチドアンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下
で、標識されたＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドと共にインキュベートされる
。候補分子の、結合分子に結合する能力は、標識されたリガンド結合の減少に反
映される。無償で（ｇｒａｔｕｉｔｏｕｓｌｙ）結合する分子、すなわち、Ｂｒ
ａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド結合分子に結合する場合にＢｒａｉｎｉａｃ−５
ポリペプチドの効果を誘導することを伴わない分子は、最も、優良なアンタゴニ
ストである可能性が高い。うまく結合し、そしてＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプ
チドと同じまたは密接に関連した効果を誘発する分子は、アゴニストである。In an assay of the invention for an agonist or antagonist, a cellular compartment (eg, a membrane or a preparation of a membrane) is a molecule that binds to a Brainiac-5 polypeptide (eg, a signal regulated by a Brainiac-5 polypeptide). Pathway or regulatory pathway molecule). The preparation comprises a Brainiac-5 polypeptide agonist or Brainia.
Incubate with labeled Brainiac-5 polypeptide in the absence or presence of a candidate molecule that may be a c-5 polypeptide antagonist. The ability of the candidate molecule to bind to the binding molecule is reflected in reduced labeled ligand binding. A gratuitously binding molecule, ie Br
Brainiac-5 when bound to an Ainiac-5 polypeptide binding molecule
Molecules that do not induce the effects of the polypeptide are most likely to be good antagonists. Molecules that bind well and elicit the same or closely related effects as the Brainiac-5 polypeptide are agonists.

【０４１６】 潜在的アゴニストおよびアンタゴニストのＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド
様の効果は、例えば、細胞または適切な細胞調製物との候補分子の相互作用に続
くセカンドメッセンジャー系の活性を決定することにより、およびその効果をＢ
ｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの効果もしくはＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプ
チドと同じような効果を誘発する分子の効果と比較することにより測定され得る
。これに関して有用であり得るセカンドメッセンジャー系としては、ＡＭＰグア
ニル酸シクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホイノシチド加水分解セカンド
メッセンジャー系が挙げられるが、これらに限定されない。[0416] Brainiac-5 polypeptide-like effects of potential agonists and antagonists can be determined, for example, by determining the activity of a second messenger system following the interaction of a candidate molecule with a cell or appropriate cell preparation, and B effect
It can be measured by comparing to the effect of a rainiac-5 polypeptide or a molecule that elicits a similar effect as the Brainiac-5 polypeptide. Second messenger systems that may be useful in this regard include, but are not limited to, AMP guanylate cyclase, ion channels, or phosphoinositide hydrolyzing second messenger systems.

【０４１７】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドアンタゴニストについてのアッセイの別の
例は、競合アッセイである。このアッセイは、競合的阻害アッセイについての適
切な条件下で、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドおよび潜在的アンタゴニスト
と、膜結合Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドレセプター分子または組換えＢｒ
ａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドレセプター分子を組み合わせる。Ｂｒａｉｎｉａ
ｃ−５ポリペプチドは、例えば、放射性標識によって標識され得、その結果、レ
セプター分子に結合したＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド分子の数が、潜在的
アンタゴニストの有効性を評価するために正確に決定され得る。Another example of an assay for Brainiac-5 polypeptide antagonists is a competition assay. This assay combines Brainiac-5 polypeptide and a potential antagonist with a membrane-bound Brainiac-5 polypeptide receptor molecule or recombinant Br under the appropriate conditions for a competitive inhibition assay.
combine the niaiac-5 polypeptide receptor molecule. Brainia
The c-5 polypeptide can be labeled, for example, with a radiolabel, such that the number of Brainiac-5 polypeptide molecules bound to the receptor molecule can be accurately determined to assess the efficacy of a potential antagonist. .

【０４１８】 潜在的アンタゴニストとしては、本発明のポリペプチドに結合し、そしてそれ
によってその活性を阻害または無効にする有機低分子、ペプチド、ポリペプチド
および抗体が挙げられる。潜在的アンタゴニストはまた、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５
ポリペプチド誘導性活性を誘導することなく、結合分子（例えば、レセプター分
子）上の同じ部位に結合し、それによって結合からＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペ
プチドを除外することによりＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの作用を妨げる
、密接に関連したタンパク質または抗体のような有機低分子、ペプチド、ポリペ
プチドであり得る。[0418] Potential antagonists include small organic molecules, peptides, polypeptides and antibodies that bind to a polypeptide of the invention and thereby inhibit or abolish its activity. Potential antagonists also include Brainiac-5
Binds to the same site on the binding molecule (eg, a receptor molecule) without inducing the polypeptide-inducing activity, thereby preventing the action of the Brainiac-5 polypeptide by excluding the Brainiac-5 polypeptide from binding. Can be small organic molecules, peptides, polypeptides, such as closely related proteins or antibodies.

【０４１９】 他の潜在的アンタゴニストとしては、アンチセンス分子が挙げられる。アンチ
センス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して、または三重鎖ヘリ
ックス形成を通して遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技
術は、多くの研究（例えば、Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６
０（１９９１）；「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎ
ｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒｏｔａｎ、ＦＬ（１９８８））におい
て議論される。三重鎖ヘリックス形成は、多くの研究（例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏ
ｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａ
ｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１））において議論される。
この方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。
例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード
部分は、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを
設計するために使用され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺
伝子の領域に相補的であるように設計され、それによって転写およびＢｒａｉｎ
ｉａｃ−５ポリペプチドの産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチ
ドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＢｒａｉ
ｎｉａｃ−５ポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチド
はまた、細胞に送達され得、その結果アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡは、Ｂｒ
ａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの産生を阻害するようにインビボで発現され得る
。[0419] Other potential antagonists include antisense molecules. Antisense technology can be used to control gene expression through antisense DNA or RNA or through triple helix formation. Antisense technology has been described in many studies (eg, Okano, J. Neurochem. 56:56).
0 (1991); “Oligodeoxynucleotides as An”
Tisense Inhibitors of Gene Expressio
n ", CRC Press, Boca Rotan, FL (1988)). Triple helix formation has been described in many studies (eg, Lee et al., Nu.
cleic Acids Research 6: 3073 (1979); Co.
oney et al., Science 241: 456 (1988); and Derva
n et al., Science 251: 1360 (1991)).
This method is based on binding of the polynucleotide to complementary DNA or RNA.
For example, the 5 'coding portion of a polynucleotide encoding a mature polypeptide of the present invention can be used to design antisense RNA oligonucleotides of about 10-40 base pairs in length. DNA oligonucleotides are designed to be complementary to the region of the gene involved in transcription, thereby allowing transcription and Brain
Prevents production of iac-5 polypeptide. The antisense RNA oligonucleotide hybridizes to the mRNA in vivo and the mRNA molecule Brai
Block translation into niac-5 polypeptide. The oligonucleotides described above can also be delivered to cells so that the antisense RNA or DNA is Br Br
Ainiac-5 polypeptide can be expressed in vivo to inhibit production.

【０４２０】 １つの実施形態において、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５アンチセンス核酸は
、外因性配列からの転写によって細胞内で産生される。例えば、ベクターまたは
その部分は、転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生じる。このよ
うなベクターは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５アンチセンス核酸をコードする配列を含
む。このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するように転写さ
れ得る限り、エピソーム性のままであり得るか、または染色体に組み込まれ得る
。このようなベクターは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ技術方法によって構
築され得る。ベクターは、脊椎動物細胞における複製および発現に使用される、
プラスミド、ウイルスまたは当該分野において公知の他の物であり得る。Ｂｒａ
ｉｎｉａｃ−５をコードする配列、またはそのフラグメントの発現は、脊椎動物
細胞（好ましくは、ヒト細胞）において作用する、当該分野において公知の任意
のプロモーターによってであり得る。このようなプロモーターは、誘導性または
構成的であり得る。このようなプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領
域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０４〜３
１０（１９８１）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモータ
ー（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７〜７９７（１９８０）、ヘル
ペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、７８：１４４１〜１４４５（１９８１）、メタロチオネイン
遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９〜４２（
１９８２））などが挙げられるがこれらに限定されない。[0420] In one embodiment, Brainiac-5 antisense nucleic acids of the invention are produced intracellularly by transcription from an exogenous sequence. For example, a vector or a portion thereof is transcribed, resulting in an antisense nucleic acid (RNA) of the invention. Such a vector contains a sequence encoding a Brainiac-5 antisense nucleic acid. Such vectors can remain episomal or can integrate chromosomally, as long as they can be transcribed to produce the desired antisense RNA. Such vectors can be constructed by recombinant DNA technology methods standard in the art. The vector is used for replication and expression in vertebrate cells,
It may be a plasmid, a virus or other known in the art. Bra
Expression of the sequence encoding niac-5, or a fragment thereof, may be by any promoter known in the art to act in vertebrate cells, preferably human cells. Such a promoter can be inducible or constitutive. Such promoters include the SV40 early promoter region (Bernoist and Chambon, Nature, 29: 304-3).
10 (1981), a promoter contained in the 3 'long terminal repeat of Rous sarcoma virus (Yamamoto et al., Cell, 22: 787-797 (1980)), a herpes thymidine promoter (Wagner et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. , 78: 1441-1445 (1981), the regulatory sequence of the metallothionein gene (Brinster et al., Nature, 296: 39-42 (
1982)), but are not limited thereto.

【０４２１】 本発明のアンチセンス核酸は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子のＲＮＡ転写物の
少なくとも一部に相補的な配列を含む。しかし、完全な相補性が好まれるが、必
要とはされない。本明細書中でいわれる「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」
配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズし、安定な二重鎖を形成し得るに十分な相補
性を有する配列を意味する；二本鎖Ｂｒａｉｎｉａｃ−５アンチセンス核酸の場
合、従って、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が、試験され得るか、または三重鎖形成がア
ッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性および
長さの両方の程度に依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、核
酸が含み得、そしてさらに安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を形成
し得るＢｒａｉｎｉａｃ−５ＲＮＡとの塩基のミスマッチがより多い。当業者は
、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的な手順の使用によっ
て、ミスマッチの耐容可能な程度を確認し得る。[0421] The antisense nucleic acids of the present invention include a sequence that is complementary to at least a portion of the RNA transcript of the Brainiac-5 gene. However, although perfect complementarity is preferred, it is not required. As used herein, "complementary to at least a portion of RNA"
By sequence is meant a sequence that has sufficient complementarity to hybridize to RNA and form a stable duplex; in the case of double-stranded Brainiac-5 antisense nucleic acid, and therefore of double-stranded DNA. Single strands can be tested or triplex formation can be assayed. The ability to hybridize depends on both the degree of complementarity and the length of the antisense nucleic acid. In general, the longer the hybridizing nucleic acid, the more base mismatches with the Brainiac-5 RNA that the nucleic acid can contain and that can form a more stable duplex (or in some cases a triplex). One of skill in the art can ascertain the tolerable degree of mismatch by using standard procedures to determine the melting point of the hybridized complex.

【０４２２】 メッセージの５’末端（例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの、およびこれを含む
５’非翻訳配列）に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害する際に最も効
率的に作用するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列
も同様に、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に効果的であることが示されている。一
般的には、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３７２：３３３〜３
３５を参照のこと。従って、図１Ａ〜Ｂに示されるＢｒａｉｎｉａｃ−５の５’
または３’の翻訳されない非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチ
ドは、アンチセンスアプローチにおいて内因性Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ｍＲＮＡの
翻訳を阻害するために使用され得る。このｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的な
オリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含むはずである。ｍＲＮＡ
コード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳のより非効率的
なインヒビターであるが、本発明に従って使用され得る。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５
ｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域にハイブリダイズするように設
計されるにせよ、アンチセンス核酸は、少なくとも６個のヌクレオチドの長さで
あるべきであり、そして好ましくは、６〜約５０個のヌクレオチドの長さの範囲
のオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、このオリゴヌクレオチドは
、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なく
とも２５個のヌクレオチドまたは少なくとも５０個のヌクレオチドである。Oligonucleotides complementary to the 5 'end of the message (eg, the 5' untranslated sequence up to and including the AUG start codon) should work most efficiently at inhibiting translation. . However, sequences complementary to the 3 'untranslated sequence of the mRNA have also been shown to be effective in inhibiting translation of the mRNA. Generally, Wagner, R.A. , 1994, Nature, 372: 333-3.
See 35. Therefore, 5 ′ of Brainiac-5 shown in FIGS.
Alternatively, oligonucleotides complementary to any of the 3 'untranslated non-coding regions can be used to inhibit the translation of endogenous Brainiac-5 mRNA in an antisense approach. Oligonucleotides complementary to the 5 'untranslated region of this mRNA should include the complement of the AUG start codon. mRNA
Antisense oligonucleotides complementary to the coding region are less efficient inhibitors of translation, but can be used in accordance with the present invention. Brainiac-5
Whether designed to hybridize to the 5 ', 3' or coding region of the mRNA, the antisense nucleic acid should be at least 6 nucleotides in length, and preferably from 6 to about Oligonucleotides in the range of 50 nucleotides in length. In certain aspects, the oligonucleotide is at least 10 nucleotides, at least 17 nucleotides, at least 25 nucleotides, or at least 50 nucleotides.

【０４２３】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらのキメラ混
合物または誘導体または改変バージョンの一本鎖または二本鎖であり得る。この
オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを
改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格にて改変され得る。この
オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加された基（例えば、インビボ
で宿主細胞のレセプターを標的とするため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓ
ｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６
５５３〜６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２（１９８７）；ＰＣＴ公開番号：ＷＯ８
８／０９８１０（１９８８年１２月１５日に公開）を参照のこと）もしくは血液
脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ８９／１０１３４（１９８８年４月２５
日に公開）を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤、ハイブリダイゼーシ
ョン誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９５
８〜９７６（１９８８）を参照のこと）またはインターカレート剤（例えば、Ｚ
ｏｎ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９（１９８８）を参照のこと）を
含み得る。この目的のために、このオリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、
ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーショ
ン誘発（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）切断剤など）に結合体化され得る。A polynucleotide of the present invention can be single-stranded or double-stranded DNA or RNA or chimeric mixtures or derivatives or modified versions thereof. The oligonucleotide can be modified at the base moiety, sugar moiety, or phosphate backbone, for example, to improve molecular stability, hybridization, and the like. The oligonucleotide can be attached to other attached groups such as peptides (eg, to target host cell receptors in vivo), or cell membranes (eg, Lets
inger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 6
553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. 84: 648-652 (1987); PCT Publication No .: WO8
8/09810 (published December 15, 1988)) or the blood-brain barrier (see, eg, PCT Publication No. WO 89/10134 (April 25, 1988).
Agents that facilitate transport across hybridization, hybridization-triggered cleavage agents (eg, Krol et al., BioTechniques, 6:95).
8-976 (1988)) or intercalating agents (eg, Z
on, Pharm. Res. 5: 539-549 (1988)). For this purpose, the oligonucleotide comprises another molecule (eg,
(Eg, peptides, hybridization triggered cross-linking agents, transport agents, hybridization triggered cleavage agents, etc.).

【０４２４】 このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含むがこれらに限定されない
群から選択される、少なくとも１つの改変された塩基部分を含み得る：５−フル
オロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル
、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒド
ロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリ
ジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ
−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メ
チルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルア
デニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６
−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メト
キシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５−メ
トキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ
６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソ
シン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏ
ｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラ
シル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチ
ルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル
、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３
）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。The antisense oligonucleotide can include at least one modified base moiety selected from the group including, but not limited to: 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, β-D
-Galactosyl eosin, inosine, N6-isopentenyl adenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6
-Adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D-mannosyl eosin, 5-methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N
6-isopentenyl adenine, uracil-5-oxyacetic acid (v), wybutoxosine, pseudouracil, queosin (queo)
sine), 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid (v), 5-methyl -2-thiouracil, 3- (3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil, (acp3
) W, and 2,6-diaminopurine.

【０４２５】 このアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、少なくとも１つの改変糖部分を
含み得る。この糖部分は、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロ
ース、およびヘキソースを含むが、これらに限定されない群から選択される。[0425] The antisense oligonucleotide can also include at least one modified sugar moiety. The sugar moiety is selected from the group including, but not limited to, arabinose, 2-fluoroarabinose, xylulose, and hexose.

【０４２６】 なお別の実施形態では、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも
１つの改変リン酸骨格を含む。この改変リン酸骨格は、ホスホロチオエート、ホ
スホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホ
ルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホ
ルムアセタール、またはそれらのアナログを含むが、これらに限定されない群か
ら選択される。In yet another embodiment, the antisense oligonucleotide comprises at least one modified phosphate backbone. The modified phosphate backbone includes phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoramidothioate, phosphoramidate, phosphordiamidate, methylphosphonate, alkyl phosphotriester, and formacetal, or analogs thereof, It is selected from a group not limited to these.

【０４２７】 なお別の実施形態では、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノマ
ーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲ
ＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここでは、通常のｂ−単位とは反
対に、鎖は、互いに対して平行に進行する（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。このオリゴヌクレ
オチドは、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮ
Ａ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２１５：３２７−
３３０（１９８７））である。In yet another embodiment, the antisense oligonucleotide is an a-anomeric oligonucleotide. The a-anomeric oligonucleotide has a complementary R
Form specific double-stranded hybrids with NA, where the strands run parallel to each other, as opposed to normal b-units (Gautier et al., Nucl. Ac
ids Res. 15: 6625-6641 (1987)). This oligonucleotide is a 2-O-methylribonucleotide (Inoue et al., Nucl. Aci.
ds Res. , 15: 6131-6148 (1987)), or chimeric RN.
A-DNA analogs (Inoue et al., FEBS Lett., 215: 327-
330 (1987)).

【０４２８】 本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動
化ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓなどから市販される）の使用による）によって合成され得る。例えば
、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドがＳｔｅｉｎらの方法によって合成さ
れ得（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：３２０９（１９８８））、メチ
ルホスホネートオリゴヌクレオチドが制御孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−
７４５１（１９８８））などの使用によって調製され得る。A polynucleotide of the present invention can be prepared by standard methods known in the art (eg, an automated DNA synthesizer (eg, Biosearch, Applied Biosy).
(commercially available from Stems et al.). For example, phosphorothioate oligonucleotides can be synthesized by the method of Stein et al. (Nucl. Acids Res., 16: 3209 (1988)), and methylphosphonate oligonucleotides are controlled pore glass polymer supports (Sarin).
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 85: 7448-
7451 (1988)).

【０４２９】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが
使用され得るが、転写された非翻訳領域に対して相補的なアンチセンスヌクレオ
チドが最も好ましい。Although antisense nucleotides complementary to the Brainiac-5 coding region sequence can be used, antisense nucleotides complementary to the transcribed untranslated region are most preferred.

【０４３０】 本発明による可能なアンタゴニストはまた、触媒性ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４（１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムが
Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ｍＲＮＡを破壊するために使用され得るが、ハンマーヘッ
ドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーへッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと
相補的塩基対を形成する隣接領域によって決定される位置でｍＲＮＡを切断する
。ただ１つの要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２塩基配列５’−ＵＧ−３’を有す
ることである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および生成は、当該分野で周知
であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４
：５８５−５９１（１９８８）においてより十分に記載されている。Ｂｒａｉｎ
ｉａｃ−５のヌクレオチド配列中には、多数の可能なハンマーヘッドリボザイム
切断部位が存在する（図１Ａ〜Ｂ）。好ましくは、このリボザイムは、切断認識
部位がＢｒａｉｎｉａｃ−５ｍＲＮＡの５’末端近傍に位置するように、すなわ
ち、効率を増大させ、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化する
ように、操作される。Possible antagonists according to the present invention also include catalytic RNAs, ie, ribozymes (see, eg, PCT Publication WO 90/11364 (October 4, 1990)
Sunver et al., Science, 247: 1222-1225 (19
90)). Although ribozymes that cleave mRNA at a site-specific recognition sequence can be used to destroy Brainiac-5 mRNA, the use of a hammerhead ribozyme is preferred. Hammerhead ribozymes cleave mRNAs at locations determined by flanking regions that form complementary base pairs with the target mRNA. The only requirement is that the target mRNA has the following two base sequence 5'-UG-3 '. The construction and production of hammerhead ribozymes is well known in the art and haseloff and Gerlach, Nature, 334.
: 585-591 (1988). Brain
There are a number of possible hammerhead ribozyme cleavage sites in the nucleotide sequence of iac-5 (FIGS. 1A-B). Preferably, the ribozyme is such that the cleavage recognition site is located near the 5 ′ end of the Brainiac-5 mRNA, ie, to increase efficiency and minimize intracellular accumulation of non-functional mRNA transcripts. Operated.

【０４３１】 アンチセンスアプローチにおけるように、本発明のリボザイムは、改変オリゴ
ヌクレオチド（例えば、安定性の改善、標的化などのため）で構成され得、そし
てインビボでＢｒａｉｎｉａｃ−５を発現する細胞に送達されるはずである。こ
のリボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの
導入について上述したのと同じ様式で、細胞に導入され得る。好ましい送達方法
は、強い構成的プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはｐｏ
ｌ ＩＩプロモーターのような）の制御下で、このリボザイムを「コードする」
ＤＮＡ構築物を使用し、トランスフェクト細胞が、内因性のＢｒａｉｎｉａｃ−
５メッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを生成
することを包含する。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり触媒性である
ので、より低い細胞内濃度が効率化のために必要とされる。As in the antisense approach, ribozymes of the invention can be comprised of modified oligonucleotides (eg, for improved stability, targeting, etc.) and delivered to cells expressing Brainiac-5 in vivo. Should be done. The ribozyme-encoding DNA construct can be introduced into cells in the same manner as described above for the introduction of antisense encoding DNA. A preferred method of delivery is a strong constitutive promoter (eg, a pol III promoter or a po
under control of the ribozyme (such as the II promoter).
Using the DNA constructs, the transfected cells are transformed into endogenous Brainiac-
5 producing ribozymes in amounts sufficient to disrupt the message and inhibit translation. Since ribozymes, unlike antisense molecules, are catalytic, lower intracellular concentrations are required for efficiency.

【０４３２】 内因性遺伝子発現はまた、標的化された相同組換えを用いてＢｒａｉｎｉａｃ
−５遺伝子および／またはそのプロモーターを不活化するか、または「ノックア
ウトする」ことにより減少され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１７：２３０〜２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈ
ｉ，Ｃｅｌｌ ５１：５０３〜５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅ
ｌｌ ５：３１３〜３２１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、その全
体が本明細書中に参考として援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配
列（遺伝子のコード領域もしくは調節領域のいずれか）に相同なＤＮＡに隣接す
る本発明の変異ポリヌクレオチド、非機能的ポリヌクレオチド（または完全に関
連しないＤＮＡ配列）を選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーあ
りもしくはなしで使用して、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞に
トランスフェクトし得る。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を使用
して、目的の遺伝子を含むが、これを発現しない細胞中でノックアウトを生成す
る。ＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された相同組換えを介して、標的化された遺
伝子の不活化を生じる。このようなアプローチは、研究分野および圃場において
個々に合わせられ、ここで、胚幹細胞に対する改変を用いて、不活性な標的化遺
伝子を有する動物子孫を生成する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈ
ｉ １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９（前出）を参照のこと）。しか
し、このアプローチは、ヒトにおける使用については慣用的に適合され得る（但
し、組換えＤＮＡ構築物が、当業者に明らかな適切なウイルスベクターを用いて
インビボで必要な部位に直接投与されるか、または標的化される条件で）。この
段落に記載される文書の各内容は、その全体が本明細書中に参考として援用され
る。[0432] Endogenous gene expression can also be achieved using targeted homologous recombination and Brainiac
-5 gene and / or its promoter may be reduced by inactivating or "knocking out" (eg, Smithies et al., Nature
e 317: 230-234 (1985); Thomas and Capecch.
i, Cell 51: 503-512 (1987); Thompson et al., Ce.
11: 313-321 (1989); each of which is incorporated herein by reference in its entirety). For example, a mutated polynucleotide of the invention, a non-functional polynucleotide (or a completely unrelated DNA sequence) flanking DNA homologous to an endogenous polynucleotide sequence (either the coding or regulatory region of the gene) may be a selectable marker. And / or with or without a negative selectable marker, can be used to transfect cells expressing a polypeptide of the invention in vivo. In another embodiment, knockouts are generated in cells that contain the gene of interest but do not express it, using techniques known in the art. Insertion of the DNA construct results in inactivation of the targeted gene via targeted homologous recombination. Such approaches have been tailored individually in the field of research and in the field, where modifications to embryonic stem cells are used to generate animal progeny with inactive targeting genes (eg, Thomas and Capechch).
i 1987 and Thompson 1989, supra)). However, this approach can be routinely adapted for use in humans, provided that the recombinant DNA construct is administered directly to the required site in vivo using appropriate viral vectors apparent to those of skill in the art, Or under conditions that are targeted). The contents of each of the documents described in this paragraph are hereby incorporated by reference in their entirety.

【０４３３】 他の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−
５の可溶性形態を含む。このようなＢｒａｉｎｉａｃ−５の可溶性形態は、天然
に存在するか、または合成であり得、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５レセプターに結合す
るための天然のＢｒａｉｎｉａｃ−５と競合することにより、および／またはレ
セプターと結合し得るかまたは結合し得ないが、シグナル導入を誘発し得ないマ
ルチマーを形成することによって、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５媒介シグナル伝達と拮
抗する。好ましくは、これらのアンタゴニストは、リンパ球（例えば、樹状細胞
、単核白血球、マクロファージ、Ｔ細胞、および／またはＢ細胞）の増殖、分化
、および／または活性化の、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５媒介刺激を阻害する。本発明
のアンタゴニストはまた、ＴＮＦ−系統リガンド（例えば、ＣＤ３０）およびＢ
ｒａｉｎｉａｃ−５−Ｆｃ融合タンパク質に対して特異的な抗体を含む。In another embodiment, the antagonist according to the invention is a Brainiac-
5 soluble forms. Such soluble forms of Brainiac-5 can be naturally occurring or synthetic, and compete with native Brainiac-5 for binding to the Brainiac-5 receptor and / or bind to the receptor. It antagonizes Brainiac-5-mediated signaling by forming multimers that are unable to bind or bind, but cannot trigger signal transduction. Preferably, these antagonists stimulate Brainiac-5-mediated stimulation of proliferation, differentiation, and / or activation of lymphocytes (eg, dendritic cells, mononuclear leukocytes, macrophages, T cells, and / or B cells). Inhibit. The antagonists of the present invention also include TNF-series ligands (eg, CD30) and B
Includes antibodies specific for the Rainiac-5-Fc fusion protein.

【０４３４】 本発明によるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のアゴニストまた
はアンタゴニストは、ＴａｒｔａｇｌｉａおよびＧｏｅｄｄｅｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４−４３０７（１９９２）；Ｔａｒｔａｇｌ
ｉａら、Ｃｅｌｌ ７３：２１３−２１６（１９９３）、ならびにＰＣＴ出願第
ＷＯ９４／０９１３７に開示される方法に従って、惹起され得、好ましくは、配
列番号２のアミノ酸配列を有する本発明のポリぺプチドに対して特異的（すなわ
ち唯一それに結合する）である。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（
Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、抗原に結合し得る、インタ
クトな分子ならびにそのフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（
ａｂ’）フラグメント）を含むことを意味する。Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’ フラグメントおよびＦ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆｃフラグメントのインタ
クトな抗体を欠き、循環からより速く無くなり、そしてインタクトな抗体のより
少ない非特異的な組織結合性を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．
、２４：３１６−３２５（１９８３））。Agonists or antagonists of polyclonal and monoclonal antibodies according to the invention are described in Tartaglia and Goeddel, J. Mol. Biol
. Chem. 267 (7): 4304-4307 (1992); Tartagl
ia, et al., Cell 73: 213-216 (1993), as well as to the polypeptides of the invention having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, which can be raised according to the methods disclosed in PCT Application No. WO 94/09137. And specific (ie, uniquely binds to it). As used herein, the term “antibody” (
Ab) or "monoclonal antibodies" (mAbs) are intact molecules and fragments thereof (eg, Fab fragments and F (
ab ′) fragment). Fab fragments, Fab 'fragments and F (ab') fragments lack the intact antibody of the Fc fragment, disappear faster from circulation, and have less nonspecific tissue binding of the intact antibody (Wahl) Et al., J. Nucl.
24: 316-325 (1983)).

【０４３５】 好ましい方法では、本発明に従う抗体は、ｍＡｂである。このようなｍＡｂは
、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５−４９７（１９７５）および米国特許第４，３７６，１１０号；
Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９８；Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ
Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｐｌ
ｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８０；Ｃａｍｂｅｌｌ、
「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」：Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａ
ｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ１３（Ｂｕｒｄｏｎ
ら、編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４））、を使用して
調製され得る。In a preferred method, the antibodies according to the invention are mAbs. Such mAbs are available from hybridoma technology (Kohler and Millstein, Nature).
256: 495-497 (1975) and U.S. Pat. No. 4,376,110;
Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manu.
al, Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbor, NY, 1998; Monocl.
onal Antibodies and Hybridomas: A New
Dimension in Biological Analysis, Pl
enum Press, New York, NY, 1980;
"Monoclonal Antibody Technology": Lab
oratory Technologies in Biochemistry a
nd Molecular Biology, Volume 13 (Burdon
Et al., Eds., Elsevier, Amsterdam (1984)).

【０４３６】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ドメインに結合するタンパク質およびその他の化合物は
また、本発明による候補アゴニストおよびアンタゴニストでもある。このような
結合化合物は、酵母ツーハイブリッド系を使用し、「捕捉」され得る（Ｆｉｅｌ
ｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５〜２４６（１９８９））。
この酵母ツーハイブリッド系の改変された説明が、Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔおよ
びその共同研究者らによって記載されている（Ｇｙｕｒｉｓ、Ｃｅｌｌ ７５：
７９１−８０３（１９９３）；Ｚｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３
２（１９９３））。このような化合物は、本発明の良好な候補アゴニストおよび
アンタゴニストである。[0436] Proteins and other compounds that bind to the Brainiac-5 domain are also candidate agonists and antagonists according to the present invention. Such binding compounds can be "captured" using the yeast two-hybrid system (Field
ds and Song, Nature 340: 245-246 (1989)).
A modified description of this yeast two-hybrid system has been described by Roger Brent and coworkers (Gyuris, Cell 75:
791-803 (1993); Zervos et al., Cell 72: 223-23.
2 (1993)). Such compounds are good candidate agonists and antagonists of the present invention.

【０４３７】 その他のスクリーニング技術は、レセプター活性化によって引き起こされる細
胞外ｐＨ変化を測定するシステム（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１８１−
２９６（１９８９）に記載されるような）において、本発明のポリぺプチドを発
現する細胞（例えば、トランスフェクトＣＨＯ細胞）の使用を含む。別の実施例
では、潜在的アゴニストまたはアンタゴニストが、本発明のポリぺプチドを発現
する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応答（例えば、シグナル
伝達）が、潜在的アンタゴニストまたはアゴニストが有効か否かを決定するため
に測定され得る。Other screening techniques include systems that measure extracellular pH changes caused by receptor activation (eg, Science, 246: 181-).
296 (1989)), including the use of cells expressing the polypeptides of the invention (eg, transfected CHO cells). In another example, a potential agonist or antagonist can be contacted with a cell that expresses a polypeptide of the invention, and a second messenger response (eg, signaling) determines whether the potential antagonist or agonist is effective. Can be measured to determine

【０４３８】 本発明によるアゴニストは、天然に存在する化合物および合成化合物（例えば
、ＴＮＦファミリーリガンドペプチドフラグメント、形質転換増殖因子、神経伝
達物質（例えばグルタメート、ドーパミン、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート）
、腫瘍サプレッサー（ｐ５３）、細胞融解Ｔ細胞および代謝拮抗物質のような）
を含む。好ましいアゴニストは、化学療法薬（例えば、シスプラチン、ドキソル
ビシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、ナイトロジェンマスタード、
メトトレキセートおよびビンクリスチン）を含む。その他のものとしては、エタ
ノールおよび−アミロイドペプチドが挙げられる（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１
４５７−１４５８（１９９５））。Agonists according to the present invention include naturally occurring and synthetic compounds (eg, TNF family ligand peptide fragments, transforming growth factors, neurotransmitters (eg, glutamate, dopamine, N-methyl-D-aspartate)).
, Tumor suppressors (p53), cytolytic T cells and antimetabolites)
including. Preferred agonists include chemotherapeutic agents (eg, cisplatin, doxorubicin, bleomycin, cytosine arabinoside, nitrogen mustard,
Methotrexate and vincristine). Others include ethanol and amyloid peptides (Science 267: 1).
457-1458 (1995)).

【０４３９】 好ましいアゴニストは、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリぺプチドのフラグ
メントであり、これは、リンパ球（例えばＢ細胞）の増殖、分化および／または
活性化を刺激する。さらなる好ましいアゴニストは、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ
−５ポリぺプチドに対して惹起されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体
、またはそのフラグメントを含む。ＴＮＦ−ファミリーレセプターに対して惹起
されたこのようなアゴニスト抗体は、以下に開示される：Ｔａｒｔａｇｌｉａら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９２９２−９２９６
（１９９１）；およびＴａｒｔａｇｌｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７
：４３０４−４３０７（１９９２）。また、ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０９１３７
号も参照のこと。A preferred agonist is a fragment of the Brainiac-5 polypeptide of the invention, which stimulates the proliferation, differentiation and / or activation of lymphocytes (eg, B cells). Further preferred agonists are Brainiac of the present invention.
-5, including polyclonal and monoclonal antibodies raised against the polypeptide, or fragments thereof. Such agonistic antibodies raised against the TNF-family receptor are disclosed below: Tartaglia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9292-9296.
(1991); and Tartaglia et al. Biol. Chem. 267
: 4304-4307 (1992). Also, PCT Application No. WO 94/09137
See also issue.

【０４４０】 さらなる実施形態では、免役調節分子（例えば、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、Ｉ
Ｌ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗−ＣＤ４
０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのような）が、本発明のＢｒａｉ
ｎｉａｃ−５ポリぺプチドのアゴニストとして使用され得、このアゴニストはリ
ンパ球の増殖、分化および／または活性化を刺激する。In a further embodiment, the immunomodulatory molecule (eg, IL2, IL3, IL4, I
L5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, anti-CD4
0, CD40L, IFN- [gamma] and TNF- [alpha]) according to the invention.
It can be used as an agonist of niac-5 polypeptide, which agonist stimulates lymphocyte proliferation, differentiation and / or activation.

【０４４１】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリぺプチドを発現するように
遺伝子操作される細胞、あるいは、本発明のタンパク質を発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）が、インビボで患者に投与される。
このような細胞は患者（すなわち、動物（ヒトを含む））またはＭＨＣ適合性ド
ナーから得られ得、そして、線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）
、脂肪細胞、筋肉細胞、内皮細胞などを含み得るが、これらに限定されない。こ
れらの細胞は、本発明のポリペプチドのコード配列をこれらの細胞に導入するた
めに、または、あるいは、コード配列および／または本発明のポリペプチドに関
連する内因性の調節配列を破壊するために（例えば、形質導入（ウイルスベクタ
ー、および好ましくは細胞ゲノムに導入遺伝子を組み込むベクターを使用する）
、またはトランスフェクション手順（プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮ
Ａ、エレクトロポレーション、リポソームなどの使用を含むがこれらに限定され
ない）によって）、組換えＤＮＡ技術を用いてインビトロで遺伝子操作される。
本発明のポリペプチドのコード配列は、強力な構成プロモーターまたは誘導プロ
モーターまたはプロモーター／エンハンサーの制御下に配置されて、本発明のポ
リペプチドの発現、および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチド
を発現および好ましくは分泌するこの操作された細胞は、例えば循環中で、また
は腹腔内で、全身的に患者に導入され得る。In a further embodiment of the present invention, a cell engineered to express a polypeptide of the present invention or a cell (eg, knockout) engineered to not express a protein of the present invention. Administered to a patient in vivo.
Such cells may be obtained from a patient (ie, an animal (including a human)) or an MHC compatible donor, and may include fibroblasts, bone marrow cells, blood cells (eg, lymphocytes)
, Adipocytes, muscle cells, endothelial cells, and the like, but are not limited thereto. These cells may be used to introduce a coding sequence for a polypeptide of the invention into these cells, or to disrupt the coding sequence and / or endogenous regulatory sequences associated with the polypeptide of the invention. (Eg, transduction (using viral vectors, and preferably vectors that incorporate the transgene into the cell genome)
Or transfection procedures (plasmid, cosmid, YAC, naked DN)
A, genetically engineered in vitro using recombinant DNA technology (including but not limited to the use of electroporation, liposomes, etc.).
A coding sequence for a polypeptide of the present invention may be placed under the control of a strong constitutive or inducible promoter or promoter / enhancer to achieve expression, and preferably secretion, of the polypeptide of the present invention. The engineered cells that express and preferably secrete a polypeptide of the invention can be introduced into a patient systemically, for example, in the circulation or intraperitoneally.

【０４４２】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る；遺伝
子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る）
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号；およびＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と：これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。Alternatively, the cells can be incorporated into a matrix and transplanted into the body (
For example, genetically engineered fibroblasts can be transplanted as part of a skin graft; genetically engineered endothelial cells can be transplanted as part of a lymphatic or vascular graft)
(See, eg, Anderson et al., US Patent No. 5,399,349; and Mu.
See lligan and Wilson, US Patent No. 5,460,959, each of which is incorporated herein by reference in its entirety).

【０４４３】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞を被包性の形態で導入し得、この形態は、構成成分の即
時の細胞外環境との交換が可能である間は、導入細胞が宿主免疫系によって認識
され得ない。If the cells to be administered are non-autologous or non-MHC compatible cells, they may be administered using well-known techniques that would prevent the generation of a host immune response against the transduced cells. For example, the cells may be introduced in an encapsulated form, which does not allow the introduced cells to be recognized by the host immune system while allowing the components to be exchanged with the immediate extracellular environment.

【０４４４】 本発明のさらに別の実施形態では、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリぺプチドの活性
は、「ドミナントネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ）」を使用
して減少させられ得る。この目的のために、欠損Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリぺプ
チド（例えば、保存ドメインの全てまたは一部を欠く変異体のような）をコード
する構築物は、適切な標的細胞に対するＢｒａｉｎｉａｃ−５の活性を減少させ
るための遺伝子治療アプローチにおいて使用され得る。例えば、Ｂｒａｉｎｉａ
ｃ−５ポリぺプチド（保存ドメインの全てまたは一部が改変されるかまたは欠け
ている）の宿主細胞発現を導くヌクレオチド配列は、単球細胞もしくはその他の
細胞または組織内に導入され得る（本明細書中に記載されるかまたは別に当該分
野で公知の、インビボまたはエキソビボの遺伝子治療の方法のいずれかによって
）。あるいは、標的相同組換えは、このような欠失または変異を、単球中の被験
体の内因性Ｂｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子に導入するために使用され得る。この操
作された細胞は、非機能性Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリぺプチド（すなわち、結合
し得るが、シグナル伝達を誘発し得ないリガンド（例えばマルチマー））を発現
する。In yet another embodiment of the present invention, the activity of Brainiac-5 polypeptide can be reduced using “dominant negative”. To this end, a construct encoding a defective Brainiac-5 polypeptide (such as a mutant lacking all or part of a conserved domain) will reduce the activity of Brainiac-5 on appropriate target cells. For use in gene therapy approaches. For example, Brainia
Nucleotide sequences that direct host cell expression of the c-5 polypeptide (all or part of the conserved domain has been modified or lacked) can be introduced into monocyte cells or other cells or tissues. By any of the methods for in vivo or ex vivo gene therapy described herein or otherwise known in the art). Alternatively, targeted homologous recombination can be used to introduce such deletions or mutations into the subject's endogenous Brainiac-5 gene in monocytes. The engineered cells express a non-functional Brainiac-5 polypeptide (ie, a ligand (eg, a multimer) that can bind but cannot trigger signal transduction).

【０４４５】 このアゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、上記のように、薬学的に受
容可能なキャリアを有する組成物において使用され得る。The agonists and antagonists may be used, for example, in a composition with a pharmaceutically acceptable carrier, as described above.

【０４４６】 （遺伝子マッピング） 本発明の核酸分子はまた、染色体同定のために役立つ。配列は、個々のヒト染
色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得る
。さらに、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要性が存在する。実際の配
列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在、染色***置をマ
ークすることについてほとんど利用可能ではない。本発明による、ＤＮＡの染色
体へのマッピングは、これらの配列を、疾患に関連する遺伝子に相関させること
における重要な最初の工程である。Gene Mapping The nucleic acid molecules of the invention are also useful for chromosome identification. Sequences can be specifically targeted to and hybridize to specific locations on individual human chromosomes. In addition, there is currently a need to identify specific sites on the chromosome. Chromosome marking reagents based on actual sequence data (repetitive polymorphisms) are currently hardly available for marking chromosomal locations. The mapping of DNA to chromosomes according to the present invention is an important first step in correlating these sequences with genes associated with disease.

【０４４７】 これに関しての特定の好ましい実施形態において、本明細書中に開示されるｃ
ＤＮＡは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５の遺伝子のゲノムＤＮＡをクローン化するため
に使用される。これは、種々の周知の技術およびライブラリー（これは一般に市
販されている）を使用して達成され得る。次いで、ゲノムＤＮＡは、インサイチ
ュ染色体マッピングのために、この目的のために周知の技術を使用して、用いら
れる。In certain preferred embodiments in this regard, c disclosed herein.
The DNA is used to clone the genomic DNA of the Brainiac-5 gene. This can be accomplished using a variety of well-known techniques and libraries, which are generally commercially available. The genomic DNA is then used for in situ chromosome mapping, using techniques well known for this purpose.

【０４４８】 さらに、いくつかの場合には、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ま
しくは１５〜２５ ｂｐ）を調製することによって、染色体にマッピングされ得
る。この遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡにおい
て１つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑にしないプラ
イマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個
々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用
される。ｃＤＮＡクローンの***中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブ
リダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）は、１工程で正確な染色***置を提供するた
めに使用され得る。この技術は、５０または６０ ｂｐほど短いｃＤＮＡ由来の
プローブとともに使用され得る（この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈ
ｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８８）を参照のこと）。In addition, in some cases, sequences can be mapped to chromosomes by preparing PCR primers (preferably 15-25 bp) from the cDNA. Computer analysis of the 3 'untranslated region of this gene is used to rapidly select primers that do not span more than one exon in the genomic DNA and therefore do not complicate the amplification process. These primers are then used for PCR screening of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes. Fluorescence in situ hybridization ("FISH") of a cDNA clone to a metaphase chromosomal spread can be used to provide a precise chromosomal location in one step. This technique can be used with probes from cDNA as short as 50 or 60 bp (for a review of this technique, see Verma et al., H.
uman Chromosomes: A Manual Of Basic
Techniques, Pergamon Press, New York
(1988)).

【０４４９】 一旦配列が正確な染色***置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的
位置は、遺伝子地図データと相関付けられ得る。そのようなデータは、例えば、
Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ上（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ， Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンライン
で利用可能であるＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｖ． Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉ
ｔａｎｃｅ Ｉｎ Ｍａｎ）に見出される。次いで、遺伝子と、同じ染色体領域
にマッピングされている疾患との間の関係は、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝
子の同時遺伝）を通して同定される。Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical location of the sequence on the chromosome can be correlated with genetic map data. Such data, for example,
On the World Wide Web (Johns Hopkins University)
McKusick, V.C., available online through Welch Medical Library. Mendelian Inheri
(Trance In Man). The relationship between the gene and the disease mapped to the same chromosomal region is then identified through linkage analysis (simultaneous inheritance of physically adjacent genes).

【０４５０】 次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列における差異
を決定することが必要である。変異が、いくらかのまたは全ての罹患個体におい
ては観察されるが、いかなる正常個体においても観察されない場合、変異は、疾
患の原因である可能性が高い。Next, it is necessary to determine the differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals. If the mutation is observed in some or all affected individuals, but not in any normal individuals, then the mutation is likely to be the cause of the disease.

【０４５１】 本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することに
よってより容易に理解される。これらは、説明のために提供されるものであり、
限定することを意図しない。While the invention has been described generally, the invention can be more readily understood by reference to the following examples. These are provided for illustration,
Not intended to be limiting.

【０４５２】 （実施例） （実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおける「Ｈｉｓタグ化」Ｂｒａｉｎｉａｃ−５の
発現および精製） 細菌発現ベクターである新規なｐＨＥ４系列、特にｐＨＥ４−５ベクターを、
本実施例における細菌発現に用い得る（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅ
ｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＨＥ４
−５／ＭＰＩＦＤ２３ベクタープラスミドＤＮＡは、別のＯＲＦをコードする導
入部を含む。構成物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍ
ａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に、１９９７年９月
３０日に寄託され、受託番号第２０９３１１号を与えられた。関連のないＭＰＩ
Ｆ ＯＲＦ導入部の側面に位置する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ＮｄｅＩおよびＡｓｐ
７１８制限部位を使用して、当業者は、ｐＨＥ４−５ベクターにおける関連のな
いＯＲＦを、本発明のＢｒａｉｎｉａｃ−５ＯＲＦと置換するための、現在の分
子生物学技術を容易に使用し得る。EXAMPLES Example 1 Expression and Purification of “His-Tagged” Brainiac-5 in E. coli A novel pHE4 series of bacterial expression vectors, in particular the pHE4-5 vector,
It can be used for bacterial expression in this example (QIAGEN, Inc., 9259E).
ton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). pHE4
The -5 / MPIFD23 vector plasmid DNA contains an introducer encoding another ORF. The composition is American Type Culture Col
selection, 10801 University Boulevard, M
anassas, Virginia 20110-2209, deposited on September 30, 1997 and given accession number 209311. Unrelated MPI
NdeI and Asp on the side of the F ORF introduction
Using the 718 restriction site, one skilled in the art can readily use current molecular biology techniques to replace the unrelated ORF in the pHE4-5 vector with the Brainiac-5 ORF of the present invention.

【０４５３】 ｐＨＥ４−５細菌発現ベクターは、選択のためのネオマイシンホスホトランス
フェラーゼ遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、Ｔ５ファージプロモーター配列、２
つのｌａｃオペレーター配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列、およびラク
トースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）を含む。これらのエレメント
を配置し、その結果、ポリペプチドをコードする挿入されたＤＮＡフラグメント
が、このポリペプチドのアミノ末端に共有結合された６個のＨｉｓ残基（すなわ
ち、「６×Ｈｉｓタグ」）を有するこのポリペプチドを発現する。ｐＨＥ４−５
ベクターのプロモーターおよびオペレーター配列は、合成的に作製された。核酸
配列の合成生成物は、当該分野で周知である（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ９５／９６Ｃ
ａｔａｌｏｇ、２１５−２１６頁、ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ、１０２０Ｅａｓｔ Ｍ
ｅａｄｏｗ Ｃｉｒｃｌｅ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ９４３０３）。The pHE4-5 bacterial expression vector contains the neomycin phosphotransferase gene, E. coli for selection. coli origin of replication, T5 phage promoter sequence, 2
It contains two lac operator sequences, a Shine-Delgarno sequence, and a lactose operon repressor gene (lacIq). These elements are placed so that the inserted DNA fragment encoding the polypeptide has six His residues covalently linked to the amino terminus of the polypeptide (ie, a “6 × His tag”). Has this polypeptide expressed. pHE4-5
The promoter and operator sequences of the vector were made synthetically. Synthetic products of nucleic acid sequences are well known in the art (CLONETECH 95 / 96C
datalog, pp. 215-216, CLONETECH, 1020 East M
eadow Circle, Palo Alto, CA 94303).

【０４５４】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、
寄託されたｃＤＮＡクローンから、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの所望の
部分のアミノ末端配列にアニーリングするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー
、およびこの寄託構築物中のｃＤＮＡコード配列の３’側の配列にアニーリング
するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、増幅する。ｐＨＥ４−５ベ
クターへのクローニングを容易にするための制限部位を含む、さらなるヌクレオ
チドを、５’プライマー配列および３’プライマー配列にそれぞれ付加する。A DNA sequence encoding a desired portion of a Brainiac-5 polypeptide may be
A PCR oligonucleotide primer that anneals from the deposited cDNA clone to the amino terminal sequence of the desired portion of the Brainiac-5 polypeptide, and a PCR oligonucleotide primer that anneals to the sequence 3 'of the cDNA coding sequence in the deposited construct. Amplify using Additional nucleotides are added to the 5 'and 3' primer sequences, respectively, including restriction sites to facilitate cloning into the pHE4-5 vector.

【０４５５】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをクローニングするために、５’プライマ
ーは、配列５’ＣＡＡ ＴＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＧＧ ＣＡＧ ＡＧＧ Ａ
ＣＴ ＴＣＧ ＡＧＣ ３’（配列番号１１）を有し、この配列は、下線部のＢ
ａｍＨＩ制限部位に続いて、配列番号２中のＢｒａｉｎｉａｃ−５配列のアミノ
末端コード配列の１８ヌクレオチドを含む。もちろん、当業者は、５’プライマ
ーが開始するタンパク質コード配列の点が、図１Ａおよび図１Ｂまたは配列番号
２に示されるポリペプチドの完全配列よりも、より短いかまたはより長い完全Ｂ
ｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの任意の所望の部分をコードするＤＮＡセグメ
ントを増幅するように改変され得る、ことを理解する。３’プライマーは、配列
５’ＧＴＡ ＣＧＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＴＣ ＣＣＡ ＴＴＧ ＧＡ
Ａ ＧＧＧ ３’（配列番号１２）を有し、この配列は、下線部のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ制限部位に続いて、図１Ａおよび図１Ｂに示されるＢｒａｉｎｉａｃ−５ＤＮ
Ａ配列（配列番号１）のコード配列の３’末端に相補的な１８ヌクレオチドを含
む。For cloning Brainiac-5 polypeptide, the 5 ′ primer had the sequence 5 ′ CAA TT G GAT CC G TGG CAG AGG A
CT TCG AGC 3 '(SEQ ID NO: 11), the sequence of which is underlined by B
Following the amHI restriction site, it contains the 18 nucleotides of the amino-terminal coding sequence of the Brainiac-5 sequence in SEQ ID NO: 2. Of course, those skilled in the art will recognize that the point in the protein coding sequence at which the 5 ′ primer begins is shorter or longer than the complete sequence of the polypeptide shown in FIGS. 1A and 1B or SEQ ID NO: 2.
It will be appreciated that the DNA fragment encoding any desired portion of the rainiac-5 polypeptide can be modified to amplify it. The 3 'primer has the sequence 5' GTA CGC AAG CTT GGA GTC CCA TTG GA
A GGG 3 '(SEQ ID NO: 12), which has the underlined HindII
Following the I restriction site, the Brainiac-5DN shown in FIGS. 1A and 1B.
It contains 18 nucleotides complementary to the 3 'end of the coding sequence of the A sequence (SEQ ID NO: 1).

【０４５６】 増幅したＢｒａｉｎｉａｃ−５ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＨＥ４−
５を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、次いで消化したＤＮＡ
を互いに連結する。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ＤＮＡの制限ｐＨＥ４−５ベクターへ
の挿入は、ＩＰＴＧ誘導プロモーターから下流にかつ開始ＡＵＧおよび６つのヒ
スチジンコドンとインフレームに、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドコード領
域を配置する。Amplified Brainiac-5 DNA fragment and vector pHE4-
5 was digested with BamHI and HindIII followed by digested DNA
Are connected to each other. Insertion of Brainiac-5 DNA into the restricted pHE4-5 vector places the Brainiac-5 polypeptide coding region downstream from the IPTG-inducible promoter and in frame with the initiation AUG and the six histidine codons.

【０４５７】 この連結混合物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋおよび共同研究者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））によって記載されるような
標準的手順を用いて、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。プラスミ
ドｐＲＥＰ４（ｌａｃリプレッサーを発現しそしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎ
ｒ」）を与える）の複数のコピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、
本明細書中に記載される例証的な実施例を実行するのに用いる。この株（これは
、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを発現するのに適している多くの１つにす
ぎない）は、市販されている（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出）。形質転換体を
、アンピシリンおよびカナマイシン存在下のＬＢプレート上で増殖する能力によ
って同定する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローニン
グしたＤＮＡの正体を、制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって確認す
る。The ligation mixture was used with Sambrook and coworkers (Molecular
Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition; Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Using standard procedures as described by Spring Harbor, NY (1989)), the competent E.C. E. coli cells. Plasmid pREP4 (expressing the lac repressor and resistant to kanamycin ("Kan
r)), including multiple copies of E. coli strain M15 / rep4,
Used to perform the illustrative examples described herein. This strain, which is only one of many suitable for expressing Brainiac-5 polypeptide, is commercially available (QIAGEN, Inc., supra). Transformants are identified by their ability to grow on LB plates in the presence of ampicillin and kanamycin. Plasmid DNA is isolated from resistant colonies and the identity of the cloned DNA is confirmed by restriction analysis, PCR and DNA sequencing.

【０４５８】 所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカ
ナマイシン（２５μｌ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中の液体培養物におい
て一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖する。Ｏ／Ｎ培養物を用いて、約１：２５から１：２
５０の希釈度で、大規模培養に接種する。細胞を、６００ｎｍ（「ＯＤ６００」
）で０．４〜０．６の光学濃度まで増殖させる。次いで、イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、１ｍＭの最終濃度まで添加し、
ｌａｃＩリプレッサーを不活性にすることによって、ｌａｃリプレッサー感受性
プロモーターからの転写を誘発する。続いて、細胞を、さらに３〜４時間インキ
ュベートする。次いで、細胞を遠心分離によって収集する。Clones containing the desired construct are grown overnight (“O / N”) in liquid culture in LB medium supplemented with both ampicillin (100 μg / ml) and kanamycin (25 μl / ml). Approximately 1:25 to 1: 2 using O / N culture.
Inoculate a large culture at a dilution of 50. Cells were grown at 600 nm ("OD600").
) To grow to an optical density of 0.4-0.6. Then, isopropyl-β-D
-Add thiogalactopyranoside ("IPTG") to a final concentration of 1 mM,
Inactivating the lacI repressor induces transcription from a lac repressor-sensitive promoter. Subsequently, the cells are incubated for a further 3-4 hours. The cells are then collected by centrifugation.

【０４５９】 次いで、この細胞を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）中で、４℃にて３〜
４時間攪拌する。その細胞破片を遠心分離によって取り除き、そしてＢｒａｉｎ
ｉａｃ−５ポリペプチドを含有する上清を、ニッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎ
ｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、前出）に
ロードする。６×Ｈｉｓ ｔａｇを有するタンパク質は、高親和性でＮｉ−ＴＮ
Ａ樹脂に結合し、そして単純な一工程手順で精製し得る（詳細については、Ｔｈ
ｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ，１９９５、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（
前出）を参照のこと）。簡単に述べると、この上清を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（
ｐＨ８）中のカラムにロードし、このカラムをまず１０容量の６Ｍグアニジン−
ＨＣｌ（ｐＨ８）で洗浄し、次いで、１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ
６）で洗浄し、そして最後に、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを、６Ｍグア
ニジン−ＨＣｌ（ｐＨ５）で溶出する。The cells were then plated in 6M guanidine-HCl (pH 8) at 4 ° C. for 3 to 3 hours.
Stir for 4 hours. The cell debris is removed by centrifugation and Brain
The supernatant containing the iac-5 polypeptide was washed with nickel-nitrilo-triacetic acid ("N
i-NTA ") affinity resin column (QIAGEN, Inc., supra). The protein having 6 × His tag has high affinity with Ni-TN.
A resin and can be purified by a simple one-step procedure (see Th
e QIAexpressionistist, 1995, QIAGEN, Inc. (
See above))). Briefly, this supernatant was treated with 6M guanidine-HCl (
Load the column in pH 8) and load the column first with 10 volumes of 6M guanidine-
HCl (pH 8), then 10 volumes of 6 M guanidine-HCl (pH
Wash with 6) and finally elute the Brainiac-5 polypeptide with 6M guanidine-HCl (pH 5).

【０４６０】 次いで、この精製したポリペプチドを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）ま
たは５０ｍＭ Ｎａ−酢酸塩（ｐＨ６）緩衝液＋２００ｍＭ ＮａＣｌに対して
透析することによって再生させる。あるいは、このタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ
カラムに固定化する間に、首尾良く再折り畳みさせ得る。推奨される条件は、以
下の通りである：プロテアーゼインヒビターを含有する、５００ｍＭ ＮａＣｌ
、２０％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７，４）中の、６Ｍ
〜１Ｍ尿素直線勾配を使用する再生。この再生は、１．５時間以上かけて行われ
るべきである。再生の後、このタンパク質を、２５０ｍＭ イミダゾールの添加
によって溶出し得る。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ 酢酸ナトリウム
（ｐＨ６）緩衝液＋２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終透析工程によって取り除
く。この精製したタンパク質を、４℃で保存するか、または−８０℃で凍結させ
る。The purified polypeptide is then regenerated by dialysis against phosphate buffered saline (PBS) or 50 mM Na-acetate (pH 6) buffer + 200 mM NaCl. Alternatively, this protein is converted to Ni-NTA
While immobilized on the column, it can be successfully refolded. The recommended conditions are as follows: 500 mM NaCl containing protease inhibitors
6M in 20% glycerol, 20 mM Tris / HCl (pH 7.4)
Regeneration using a １1 M urea linear gradient. This regeneration should take more than 1.5 hours. After regeneration, the protein can be eluted by the addition of 250 mM imidazole. The imidazole is removed by a final dialysis step against PBS or 50 mM sodium acetate (pH 6) buffer + 200 mM NaCl. The purified protein is stored at 4 ° C or frozen at -80 ° C.

【０４６１】 以下の代替方法を使用して、Ｂｒｉａｎｉａｃ−５ ポリペプチドが封入体の
形態で存在する場合に、Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現したＢｒａｉｎｉａｃ−５ ポリ
ペプチドを精製し得る。他に具体的に示さない限りは、以下の工程の全てを、４
〜１０℃にて行う。Using the following alternative method, when the Brianiac-5 polypeptide is present in the form of inclusion bodies, E. coli The Brainiac-5 polypeptide expressed in E. coli can be purified. Unless otherwise indicated, all of the following steps were performed in 4
Perform at -10 ° C.

【０４６２】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の産生期の完了の際に、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、
そしてこの細胞を、１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅ
ｐａｔｅｃｈ）によって収集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質
の予想収率および精製タンパク質の必要量に基づき、適切な量（重量で）の細胞
ペーストを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝溶液（
ｐＨ７．４）に懸濁する。この細胞を、高剪断ミキサーを用いて、均質な懸濁物
まで分散させる。E. Upon completion of the production phase of the E. coli fermentation, the cell culture is cooled to 4-10 ° C,
The cells were then centrifuged at 15,000 rpm (Heraeus Se).
(p.technique). Based on the expected yield of protein per unit weight of cell paste and the required amount of purified protein, an appropriate amount (by weight) of cell paste was added to a buffer solution containing 100 mM Tris, 50 mM EDTA (
pH 7.4). The cells are dispersed using a high shear mixer to a homogeneous suspension.

【０４６３】 次いで、この細胞を、溶液をマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｕｉｄｉ
ｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．）に４０００〜６００
０ｐｓｉにて２回通過させることにより、溶解させた。次いで、このホモジネー
トを、０．５Ｍ ＮａＣｌの最終濃度にまでＮａＣｌ溶液と混合し、続いて、７
０００×ｇにて１５分間遠心分離する。得られたペレットを、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を用いて再度洗
浄する。Next, the cells were washed with a microfluidizer (Microfluidizer).
cs, Corp. Or APV Gaulin, Inc. ) To 4000 to 600
Dissolution was achieved by two passes at 0 psi. The homogenate is then mixed with a NaCl solution to a final concentration of 0.5 M NaCl, followed by 7
Centrifuge at 000 × g for 15 minutes. The obtained pellets are mixed with 0.5M NaC
l, wash again with 100 mM Tris, 50 mM EDTA (pH 7.4).

【０４６４】 得られた洗浄封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）を用いて２
〜４時間可溶化する。７０００×ｇにて１５分間の遠心分離の後、そのペレット
を破棄し、そしてＢｒａｉｎｉａｃ−５ ポリペプチドポリペプチド含有上清を
、４℃にて一晩インキュベートして、さらなるＧｕＨＣｌ抽出を可能にする。The obtained washed inclusion body was washed with 1.5 M guanidine hydrochloride (GuHCl) for 2 hours.
Solubilize for ~ 4 hours. After centrifugation at 7000 × g for 15 minutes, the pellet is discarded and the Brainiac-5 polypeptide polypeptide-containing supernatant is incubated at 4 ° C. overnight to allow further GuHCl extraction.

【０４６５】 高速遠心分離（３０，０００×ｇ）して、不溶性粒子を除去した後、５０ｍＭ ナトリウム（ｐＨ４．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有
する２０倍容の緩衝液を用いて、強く攪拌することによりＧｕＨＣｌ抽出物を迅
速に混合することによって、ＧｕＨＣｌ可溶化タンパク質を再折り畳みさせる。
再折り畳みした希釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前に、１２時間混合
せずに４℃にて保存する。After high-speed centrifugation (30,000 × g) to remove insoluble particles, the mixture was vigorously concentrated using a 20-fold buffer containing 50 mM sodium (pH 4.5), 150 mM NaCl, and 2 mM EDTA. The GuHCl solubilized protein is refolded by rapidly mixing the GuHCl extract by stirring.
The refolded diluted protein solution is stored at 4 ° C. without mixing for 12 hours before further purification steps.

【０４６６】 再折り畳みしたＢｒａｉｎｉａｃ−５ ポリペプチド溶液を明澄化するために
、適切な表面積を有する０．１６μｍメンブレンフィルタ（例えば、Ｆｉｌｔｏ
ｎ）を取り付け、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化した、以前
に準備した接線方向濾過ユニット（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏ
ｎ ｕｎｉｔ）を、使用する。その濾過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例
えば、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ−５０、Ｐｒｅｓｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
にロードする。このカラムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で洗浄
し、そして同じ緩衝液中２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭおよび１５００
ｍＭ ＮａＣｌを段階的な様式で用いて、溶出する。その溶出物の２８０ｍｍの
吸光度を、連続的にモニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
ってさらに分析する。To clarify the refolded Brainiac-5 polypeptide solution, a 0.16 μm membrane filter with an appropriate surface area (eg, Filto
n) and equilibrated with 40 mM sodium acetate, pH 6.0, previously prepared tangential filtration unit.
n unit) is used. The filtered sample is subjected to a cation exchange resin (for example, Poros HS-50, Prespective Biosystems).
To load. The column is washed with 40 mM sodium acetate (pH 6.0) and 250 mM, 500 mM, 1000 mM and 1500 mM in the same buffer.
Elute using mM NaCl in a stepwise fashion. The absorbance at 280 mm of the eluate is monitored continuously. Fractions are collected and further analyzed by SDS-PAGE.

【０４６７】 次いで、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ ポリペプチドを含有する画分をプールし、そ
して４倍容の水と混合する。次いで、この希釈したサンプルを、以前に準備した
セットの強アニオン交換樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ−５０、Ｐｒｅｓｐｔｉｖｅ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および弱アニオン交換樹脂（Ｐｏｒｏｓ、ＣＭ−２０、
Ｐｒｅｓｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の直列カラムにロードする。これ
らのカラムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を用いて平衡化する。
両方のカラムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌを用いて洗浄する。次いで、ＣＭ−２０カラムを、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５
０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）から、１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ
酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）までの範囲の、カラムの１０倍容の直線勾配を用
いて溶出する。画分を、この溶出物の一定のＡ₂₈₀モニタリングのもとで収集す
る。次いで、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ ポリペプチドを含有する画分（例えば、１
６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した）をプールする。The fractions containing Brainiac-5 polypeptide are then pooled and mixed with 4 volumes of water. The diluted sample was then combined with a previously prepared set of strong anion exchange resins (Poros HQ-50, Prespective).
Biosystems) and a weak anion exchange resin (Poros, CM-20,
Load into a serial column of Prespective Biosystems). The columns are equilibrated with 40 mM sodium acetate, pH 6.0.
Both columns were washed with 40 mM sodium acetate (pH 6.0), 200 mM Na
Wash with Cl. Then, the CM-20 column was loaded with 0.2 M NaCl,
From 0 mM sodium acetate (pH 6.0), 1.0 M NaCl, 50 mM
Elute using a 10 column volume linear gradient ranging up to sodium acetate (pH 6.5). Fractions are collected under constant _A280 monitoring of the eluate. The fraction containing Brainiac-5 polypeptide (eg, 1
6% SDS-PAGE).

【０４６８】 得られたＢｒａｉｎｉａｃ−５ ポリペプチドは、上記の再折り畳みおよび精
製工程後に、９５％を超える純度を示す。５μｇの精製タンパク質をロードした
場合には、主な混入物のバンドは、クマシーブルーで染色した１６％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルからは観察されない。この精製タンパク質もまた、エンドトキシン／
ＬＰＳ夾雑について試験し、代表的には、ＬＰＳ含量は、ＬＡＬアッセイに従っ
て、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。[0468] The resulting Brainiac-5 polypeptide shows greater than 95% purity after the above refolding and purification steps. When 5 μg of purified protein was loaded, the major contaminant band was 16% SDS-P stained with Coomassie blue.
Not observed from the AGE gel. This purified protein is also endotoxin /
Tested for LPS contamination, typically the LPS content is less than 0.1 ng / ml according to the LAL assay.

【０４６９】 （実施例２：バキュロウイルス発現系におけるＢｒａｉｎｉａｃ−５ ポリペ
プチドのクローニングおよび発現） この例示的な実施例において、これは、バキュロウイルスリーダーならびにプ
ラスミドシャトルベクターｐＡ２ＧＰを使用して、成熟タンパク質をコードする
クローン化ＤＮＡ（その天然で会合した分泌シグナル（リーダー）配列を欠く）
をバキュロウイルスに挿入して、Ｂｒａｉｎｉｃ−５ ポリペプチドを発現させ
る。Ｓｕｍｍｅｒｓおよび共同研究者（Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ
Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｅｄｕｒｅｓ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔ
ｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７））によって記載されるような標準的な方法を
用いる。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ
核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いて
バキュロウイルスｇｐ６７の分泌シグナルペプチド（リーダー）ならびに簡便な
制限部位（例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８）を含む。シミア
ンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効果的なポリアデニ
ル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、プラスミドは、
弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、同じ配向でＥ．ｃｏｌｉ由
来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル
化シグナルを含む。この挿入遺伝子を、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性相
同組換えのためのウイルス配列によって、両側に隣接させて、クローン化ポリヌ
クレオチドを発現する生存可能ウイルスを生成する。Example 2 Cloning and Expression of Brainiac-5 Polypeptide in a Baculovirus Expression System In this exemplary example, this uses the baculovirus leader and the plasmid shuttle vector pA2GP to transfer the mature protein. Encoding cloned DNA (lacking its naturally associated secretion signal (leader) sequence)
Is inserted into the baculovirus to express the Brainic-5 polypeptide. Summers and co-workers (A Manual of Method)
s for Baculovirus Vectors and Insect
Cell Culture Procedures, Texas Agri
cultural Experimental Station Bullet
in No. 1555 (1987)). This expression vector is Autographa californica.
It contains the strong polyhedrin promoter of nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), followed by the secretion signal peptide of baculovirus gp67 (leader) and convenient restriction sites (eg, BamHI, XbaI and Asp718). The simian virus 40 ("SV40") polyadenylation site is used for effective polyadenylation. For easy selection of recombinant virus, the plasmid is
Under the control of the weak Drosophila promoter, the E. coli It contains the β-galactosidase gene from E. coli, followed by the polyadenylation signal of the polyhedrin gene. This inserted gene is flanked by viral sequences for cell-mediated homologous recombination with wild-type viral DNA to produce a viable virus expressing the cloned polynucleotide.

【０４７０】 当業者が容易に理解するように、その構築物が転写、翻訳、分泌などのために
適切に配置されたシグナル（シグナルペプチドおよび必要な場合はインフレーム
ＡＵＧを含む）を提供する限りは、多くの他のバキュロウイルスベクターは、上
記のベクター（例えば、ｐＡ２、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ
Ｉ）の代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗお
よび共同研究者（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９））によっ
て記載される。As the skilled artisan will readily appreciate, as long as the construct provides signals (including signal peptides and, if necessary, in-frame AUGs) that are appropriately arranged for transcription, translation, secretion, etc. Many other baculovirus vectors are those described above (eg, pA2, pAc373, pVL941 and pAcIM).
Can be used instead of I). Such vectors are described, for example, by Luckow and coworkers (Virology 170: 31-39 (1989)).

【０４７１】 寄託されたクローンにおけるＢｒａｉｎｉａｃ−５ ポリペプチドをコードす
るｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。この５’プライマーは、配列５
’−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＣＡ ＧＡ
Ｇ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＡＧ Ｃ−３’（配列番号１３）を有し、下線を付した
ＢａｍＨＩ制限酵素部位、続いて、配列番号２に示されるＢｒａｉｎｉａｃ−５ ポリペプチドの配列の１９ヌクレオチド（現在公知のＮ末端で開始する）を含
む。この３’プライマーは、配列５’−ＣＡＣ ＴＴＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＧ
Ａ ＧＴＣ ＣＣＡ ＴＴＧ ＧＡＡ ＧＧＧ−３’（配列番号１４）を有し、
下線を付したＡｓｐ７１８制限部位、続いて図１Ａおよび１Ｂ中のカルボキシ末
端配列に相補的な１８ヌクレオチドを含む。The cDNA sequence encoding the Brainiac-5 polypeptide in the deposited clone is amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of this gene. This 5 'primer has the sequence 5
'-CGC GGA TCC GCC ATC ATG GTG GCA GA
The BamHI restriction enzyme site having the G GAC TTC GAG C-3 ′ (SEQ ID NO: 13) and underlined, followed by the 19 nucleotides of the sequence of the Brainiac-5 polypeptide shown in SEQ ID NO: 2 (the currently known N Starting at the end). This 3 'primer has the sequence 5'-CAC TTA GGT ACC GG
A GTC CCA TTG GAA GGG-3 ′ (SEQ ID NO: 14),
Contains the underlined Asp718 restriction site, followed by 18 nucleotides complementary to the carboxy-terminal sequence in FIGS. 1A and 1B.

【０４７２】 増幅したフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲ
ルから単離する。次いで、このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８
で消化し、そして再度、１％アガロースゲル上で精製する。このフラグメントを
、本明細書中でＦ１と称す。The amplified fragment was prepared using a commercially available kit (“Geneclean”, BIO
101 Inc. , La Jolla, Ca. ) Using a 1% agarose gel. This fragment was then converted to BamHI and Asp718.
And purified again on a 1% agarose gel. This fragment is referred to herein as F1.

【０４７３】 このプラスミドを、当該分野で公知の慣用的な手順を使用して、制限酵素Ｂａ
ｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、そして必要に応じて、ウシ腸ホスファター
ゼを使用して脱リン酸化し得る。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅ
ｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を
使用して、１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを、本明細書
中で「Ｖ１」と称す。The plasmid is then transferred to the restriction enzyme Ba using conventional procedures known in the art.
It can be digested with mHI and Asp718 and optionally dephosphorylated using bovine intestinal phosphatase. This DNA was then converted to a commercially available kit ("Ge
neclean ", BIO 101 Inc. , La Jolla, Ca. ) Using a 1% agarose gel. This vector DNA is referred to herein as "V1".

【０４７４】 フラグメントＦ１および脱リン酸化プラスミドＶ１を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
でともに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１または他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿
主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）細胞）を、連結混合物で形質転換し、そ
して培養プレートに塗布する。ヒトＢｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子を有するプラス
ミドを含む細菌を、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８を用いて個々のコロニーから
のＤＮＡを消化し、次いでゲル電気泳動によって消化産物を分析することによっ
て同定する。このクローン化フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確
認する。このプラスミドを、本明細書中でｐＡ２ＧＰＢｒａｉｎｉａｃ−５と称
す。The fragment F1 and the dephosphorylated plasmid V1 are ligated together with T4 DNA ligase. E. FIG. E. coli HB101 or other suitable E. coli. coli host (eg, XL-1 Blue (Statage Cloning Sy)
stems, La Jolla, CA) cells) are transformed with the ligation mixture and plated on culture plates. Bacteria containing the plasmid with the human Brainiac-5 gene are identified by digesting DNA from individual colonies with BamHI and Asp718, and then analyzing the digestion product by gel electrophoresis. The sequence of this cloned fragment is confirmed by DNA sequencing. This plasmid is designated herein as pA2GPBrainiac-5.

【０４７５】 ５μｇのプラスミドｐＡ２ＧＰＢｒａｉｎｉａｃ−５を、Ｆｅｌｇｎｅｒおよ
び共同研究者（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１
３−７４１７（１９８７））によって記載されるリポフェクチン法を使用して、
１．０μｇの市販の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TM バキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
）と同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TMウイルスＤＮ
Ａおよび５μｇのプラスミドｐＡ２Ｂｒａｉｎｉａｃ−５を、５０μｌの無血清
グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合す
る。その後、１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ＋９０μｌのグレース培地を添加
し、混合し、そして１５分間室温にてインキュベートする。次いで、トランスフ
ェクション混合物を、Ｓｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下し
て添加し、１ｍｌのグレース培地（血清なし）を含む３５ｍｍ組織培養プレート
に播種する。次いで、このプレートを２７℃にて５時間インキュベートする。次
いで、このトランスフェクション溶液を、プレートから除去し、そして１０％仔
ウシ血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。次いで、培養を、２
７℃にて４日間続ける。5 μg of plasmid pA2GPBrainiac-5 was transferred to Felgner and coworkers (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 741).
3-7417 (1987)), using the lipofectin method.
1.0 μg of commercially available linearized baculovirus DNA (“BaculoGold ^™ baculovirus DNA”, Pharmingen, San Diego, CA)
) And co-transfected. 1 μg of BaculoGold ^™ virus DN
A and 5 μg of plasmid pA2Brainiac-5 were added to 50 μl of serum-free Grace's medium (Life Technologies Inc., Gaithe).
(rsburg, MD) in a sterile well of a microtiter plate. Thereafter, 10 μl Lipofectin + 90 μl Grace's medium is added, mixed and incubated for 15 minutes at room temperature. The transfection mixture is then added dropwise to Sf9 insect cells (ATCC CRL 1711) and seeded on 35 mm tissue culture plates containing 1 ml Grace's medium (without serum). The plate is then incubated at 27 ° C. for 5 hours. The transfection solution is then removed from the plate and 1 ml of Grace's insect medium supplemented with 10% calf serum is added. The culture is then
Continue at 7 ° C. for 4 days.

【０４７６】 ４日後に、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によって記載されると通
りに、その上清を回収し、プラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を
含むアガロースゲルを使用して、ｇａｌ発現クローン（これは、青色に染まった
プラークを産生する）の容易な同定および単離を可能にする。（このタイプの「
プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇによって配布される昆虫細胞培養および
バキュロウイルス学のための使用者ガイドの９〜１０頁に見出され得る）。適切
なインキュベーションの後、青色に染まったプラークを、マイクロピペット（例
えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含有す
る寒天を、２００μｌのグレース培地を含む微量遠心分離管中に再懸濁し、そし
てこの組換えバキュロウイルスを含有する懸濁物を使用して、３５ｍｍディッシ
ュに播種したＳｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの懸濁
物を収集し、次いでそれらを４℃にて保存する。この組換えウイルスを、Ｖ−Ｂ
ｒａｉｎｉａｃ−５と呼ぶ。After 4 days, the supernatant is collected and plaque assay performed as described by Summers and Smith (supra). "Blue Gal" (L
if Technologies Inc. Using an agarose gel containing G.I., Gaithersburg, allows easy identification and isolation of gal-expressing clones, which produce blue-stained plaques. (This type of "
A detailed description of the “plaque assay” is also available at Life Technologies
Inc. , Pages 9-10 of the User's Guide for Insect Cell Culture and Baculovirology distributed by Gaithersburg). After appropriate incubation, the plaque that has stained blue is picked up with the tip of a micropipette (eg, Eppendorf). The agar containing the recombinant virus was then resuspended in a microcentrifuge tube containing 200 μl of Grace's medium, and the suspension containing the recombinant baculovirus was used to seed Sf9 seeded on a 35 mm dish. Infect cells. After 4 days, the suspensions of these culture dishes are collected and then they are stored at 4 ° C. This recombinant virus was designated as VB
It is called rainiac-5.

【０４７７】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５遺伝子の発現を確認するために、Ｓｆ９細胞を、１０％
熱非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖させる。この細胞を、約２の感
染多重度（「ＭＯＩ」）で、組換えバキュロウイルスＶ−Ｂｒａｉｎｉａｃ−５
に感染させる。放射性標識したポリペプチドが所望される場合、６時間後に、こ
の培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ＩＩ
培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，
ＭＤより入手可能）と置き換える。４２時間後、５μＣｉの³⁵Ｓ−メチオニンお
よび５μＣｉの³⁵Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍより入手可能）を添加する
。この細胞を、１６時間さらにインキュベートし、次いで遠心分離によって収集
する。上清中のポリペプチドおよび細胞内ポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、
続いてオートラジオグラフィー（放射性標識した場合）によって分析する。To confirm the expression of the Brainiac-5 gene, Sf9 cells were transformed with 10%
Grow in Grace's medium supplemented with heat inactivated FBS. The cells were transformed at a multiplicity of infection ("MOI") of about 2 with the recombinant baculovirus V-Brainiac-5.
Infect. If a radiolabeled polypeptide is desired, after 6 hours the medium is removed and SF900II free of methionine and cysteine.
Medium (Life Technologies Inc., Rockville,
(Available from MD). After 42 hours, 5 μCi of ³⁵ S-methionine and 5 μCi of ³⁵ S-cysteine (available from Amersham) are added. The cells are further incubated for 16 hours and then harvested by centrifugation. The polypeptide in the supernatant and the intracellular polypeptide were subjected to SDS-PAGE,
Subsequently, analysis is performed by autoradiography (when radiolabeled).

【０４７８】 （実施例３：哺乳動物細胞におけるＢｒａｉｎｉａｃ−５のクローニングおよ
び発現） 代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（これは、ｍＲＮ
Ａの転写の開始を媒介する）、ポリペプチドコード配列、ならびに転写の終結お
よび転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとし
ては、エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、ならびにＲＮＡスプライミングのための
ドナー部位およびアクセプター部位に隣接する介在配列が挙げられる。非常に有
効な転写を、ＳＶ４０由来の初期プロモーターおよび後期プロモーター、レトロ
ウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＩＶ−１）由来の長末端反復（Ｌ
ＴＲ）ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターで達成し得
る。しかし、細胞エレメントもまた使用され得る（例えば、ヒトアクチンプロモ
ーター）。本発明の実施における使用に適切な発現ベクターとしては、例えば、
ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ
）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ
３７１４６）、ならびにｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベク
ターが挙げられる。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトＨｅｌａ細胞
、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およ
びＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１細胞、Ｃｏｓ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１
−３細胞、マウスＬ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が
挙げられる。Example 3 Cloning and Expression of Brainiac-5 in Mammalian Cells A representative mammalian expression vector contains a promoter element, which is an mRN
A, which mediates the initiation of transcription), the polypeptide coding sequence, and signals necessary for termination of transcription and polyadenylation of the transcript. Additional elements include enhancers, Kozak sequences, and intervening sequences flanking donor and acceptor sites for RNA priming. Very efficient transcription is performed by the early and late promoters from SV40, the long terminal repeat (L) from retroviruses (eg, RSV, HTLV-I, HIV-1).
TR) as well as the cytomegalovirus (CMV) early promoter. However, cellular elements can also be used (eg, the human actin promoter). Expression vectors suitable for use in the practice of the present invention include, for example,
pSVL and pMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden)
), PRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC
37146), as well as vectors such as pBC12MI (ATCC 67109). Mammalian host cells that can be used include human Hela cells, 293 cells, H9 cells and Jurkat cells, mouse NIH3T3 cells and C127 cells, Cos1 cells, Cos7 cells and CV1 cells, quail QC1
-3 cells, mouse L cells, and Chinese hamster ovary (CHO) cells.

【０４７９】 あるいは、遺伝子は、染色体に取り込まれるその遺伝子を含む安定な細胞株に
おいて発現され得る。選択可能なマーカー（例えば、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマ
イシン、ハイグロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェク
トされた細胞の同定および単離を可能にする。Alternatively, the gene may be expressed in a stable cell line that contains the gene for integration into the chromosome. Co-transfection with a selectable marker (eg, dhfr, gpt, neomycin, hygromycin) allows identification and isolation of the transfected cells.

【０４８０】 トランスフェクトされた遺伝子はまた増幅されて、大量のコードされるポリペ
プチドを発現し得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的
の遺伝子の数百または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用ある。
別の有用な選択可能なマーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（
Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；
Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７
５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地にお
いて増殖させ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は
染色体に取り込まれる増幅遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ
）細胞およびＮＳＯ細胞は、ポリペプチドの産生にしばしば使用される。The transfected gene can also be amplified to express large amounts of the encoded polypeptide. DHFR (dihydrofolate reductase) markers are useful for developing cell lines with hundreds or thousands of copies of the gene of interest.
Another useful selectable marker is the enzyme glutamine synthase (GS) (
Murphy et al., Biochem J. Biol. 227: 277-279 (1991);
Bebbington et al., Bio / Technology 10: 169-17.
5 (1992)). Using these markers, mammalian cells are grown in selective media and cells with the highest resistance are selected. These cell lines contain an amplified gene that is integrated into the chromosome. Chinese Hamster Ovary (CHO
) Cells and NSO cells are often used for the production of polypeptides.

【０４８１】 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモータ
ー（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４
４７（１９８５））＋ＣＭＶ−エンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら
、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。複数のクローニング
部位（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８を
有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに、ラ
ットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化シグナル、
および終結シグナルを含む。The expression vectors pC1 and pC4 are compatible with the Rous sarcoma virus strong promoter (LTR) (Cullen et al., Mol. Cell. Biol. 5: 438-4).
47 (1985)) + a fragment of the CMV-enhancer (Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985)). Multiple cloning sites (eg, having restriction sites BamHI, XbaI, and Asp718) facilitate cloning of the gene of interest. The vector further comprises a 3 'intron of the rat preproinsulin gene, a polyadenylation signal,
And a termination signal.

【０４８２】 （実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現） 発現プラスミドｐＢｒａｉｎｉａｃ−５ＨＡを、発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／
ＡｍｐまたはｐｃＤＮＡＩＩＩ（これらは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．か
ら得られ得る）内へＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの成熟形態をコードする
ｃＤＮＡの一部をクローニングすることによって作製する。Example 3 (a): Cloning and Expression in COS Cells The expression plasmid pBrainiac-5HA was replaced with the expression vector pcDNAI /
It is made by cloning a portion of the cDNA encoding the mature form of the Brainiac-5 polypeptide into Amp or pcDNA III, which may be obtained from Invitrogen, Inc.

【０４８３】 発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは以下：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の原
核生物細胞における増殖に効果的なＥ．ｃｏｌｉ複製起点；（２）プラスミド含
有原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核生物細胞に
おける増殖のためのＳＶ４０複製起点；（４）ＣＭＶプロモーター、ポリリンカ
ー、ＳＶ４０イントロン；（５）血球凝集素フラグメント（すなわち、精製を容
易にするための「ＨＡ」タグ）をコードするいくつかのコドン、続いて終止コド
ン、およびポリアデニル化シグナルを含み、これらは、ｃＤＮＡが、都合良くＣ
ＭＶプロモーターの発現制御下におかれ、そしてポリリンカーにおける制限部位
によってＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結し
得るように配列される。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎおよび共同研究者（Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））によって記載されるインフルエンザ赤血球凝集素
タンパク質由来のエピトープに対応する。標的ポリペプチドへのＨＡタグの融合
は、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いる組換えポリペプチドの簡単な検出お
よび回収を可能にする。さらに、ｐｃＤＮＡＩＩＩは、選択可能なネオマイシン
マーカーを含む。The expression vector pcDNAI / amp is as follows: E. coli effective for growth in E. coli and other prokaryotic cells. (2) ampicillin resistance gene for selection of plasmid-containing prokaryotic cells; (3) SV40 origin of replication for growth in eukaryotic cells; (4) CMV promoter, polylinker, SV40 intron; ( 5) It contains several codons encoding the hemagglutinin fragment (ie, the “HA” tag to facilitate purification), followed by a stop codon, and a polyadenylation signal, which allows the cDNA to
It is placed under expression control of the MV promoter and is operably linked to the SV40 intron and polyadenylation signal by restriction sites in the polylinker. The HA tag corresponds to an epitope from the influenza hemagglutinin protein described by Wilson and coworkers (Cell 37: 767 (1984)). Fusion of an HA tag to a target polypeptide allows for simple detection and recovery of the recombinant polypeptide using an antibody that recognizes the HA epitope. In addition, pcDNAIII contains a selectable neomycin marker.

【０４８４】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを、ベク
ターのポリリンカー領域にクローン化し、その結果、組み換えポリペプチド発現
がＣＭＶプロモーターによって指向される。プラスミド構築ストラテジーは以下
の通りである。寄託されたクローンのＢｒａｉｎｉａｃ−５ ｃＤＮＡを、Ｅ．
ｃｏｌｉにおけるＢｒａｉｎｉａｃ−５の発現のためのベクターの構築について
上記されるのとほとんど同じように、都合良い制限部位を含むプライマーを用い
て増幅する。本実施例において使用される適切なプライマーは、以下を含む。５
’プライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ部位、Ｋｏｚａｋ配列（イタリックで
）、ＡＵＧ開始コドンおよびＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの５’コード領
域の１６ヌクレオチドを含み、以下の配列を有する：５’−ＧＣＣ ＧＧＡ Ｔ ＣＣ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＣＡ ＧＡＧ ＧＡＣ ＴＴＣ Ｇ
ＡＧ Ｃ−３’（配列番号１５）。３’プライマーは、下線を付したＡｓｐ７１
８および停止コドンの直前の３‘コード配列に相補的な１７のヌクレオチドを含
み、以下の配列を有する：５’−ＣＡＣ ＴＴＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＧＡ Ｇ
ＴＣ ＣＣＡ ＴＴＧ ＧＡＡ ＧＧＧ−３’（配列番号１６）。A DNA fragment encoding a Brainiac-5 polypeptide is cloned into the polylinker region of the vector, such that the recombinant polypeptide expression is driven by the CMV promoter. The plasmid construction strategy is as follows. The Brainiac-5 cDNA of the deposited clone was purchased from E. coli.
Amplification is performed using primers containing convenient restriction sites, much as described above for the construction of vectors for the expression of Brainiac-5 in E. coli. Suitable primers used in this example include: 5
The 'primer' contains the underlined BamHI site, Kozak sequence (in italics), the AUG start codon and 16 nucleotides of the 5 'coding region of the Brainiac-5 polypeptide, and has the following sequence: 5'-GCC GGA T CC GCC ATC ATG GTG GCA GAG GAC TTC G
AG C-3 '(SEQ ID NO: 15). The 3 'primer was Asp71 underlined
It contains 8 nucleotides and 17 nucleotides complementary to the 3 'coding sequence immediately before the stop codon and has the following sequence: 5'-CAC TTA GGT ACC GGA G
TC CCA TTG GAA GGG-3 '(SEQ ID NO: 16).

【０４８５】 ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＢａｍ
ＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、次いで連結する。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ株ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７）へ形質転換し、そして形質転換培養物を、ア
ンピシリン培地プレートへプレーティングし、次いで、プレートをインキュベー
トしてアンピシリン耐性コロニーの増殖を可能にする。プラスミドＤＮＡを耐性
コロニーから単離し、完全なＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードするフ
ラグメントの存在について制限分析または他の手段によって試験する。The PCR amplified DNA fragment and the vector pcDNAI / Amp were
Digest with HI and Asp718 and then ligate. The ligation mixture is col
i SURE (Stratagene Cloning Systems, La
(Jolla, CA 92037) and the transformed cultures are plated on ampicillin medium plates, and the plates are then incubated to allow the growth of ampicillin-resistant colonies. Plasmid DNA is isolated from resistant colonies and tested by restriction analysis or other means for the presence of the fragment encoding the entire Brainiac-5 polypeptide.

【０４８６】 組換えＢｒａｉｎｉａｃ−５の発現のために、ＣＯＳ細胞を、例えば、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋおよび共同研究者による（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ（１９８９））に記載のようにＤＥＡＥ−デキストランを用いて、上記の
ような発現ベクターでトランスフェクトする。細胞をベクターによるＢｒａｉｎ
ｉａｃ−５の発現のための条件下でインキュベートする。For expression of recombinant Brainiac-5, COS cells were isolated, for example, from Sam.
Brook and co-workers (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Labor
Attribute Press, Cold Spring Harbor, New Y
transfection with an expression vector as described above using DEAE-dextran as described in Ork (1989)). Cells are transformed into Brain by vector
Incubate under conditions for expression of iac-5.

【０４８７】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５−ＨＡ融合ポリペプチドの発現を、例えば、Ｈａｒｌｏ
ｗおよび共同研究者（Ａｎｉｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ（１９８８））に記載の方法を用いて、放射標識化および免疫沈降法によって
検出する。この目的を達するため、トランスフェクションの２日後に、細胞を、 ³⁵ Ｓ−システインを含む培地中で８時間インキュベートすることによって標識す
る。この細胞およびこの培地を回収し、そしてこの細胞を洗浄し、そしてＷｉｌ
ｓｏｎおよび共同研究者（前出）によって記載されるように、界面活性剤含有Ｒ
ＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、
１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ ７．５で溶
解する。ポリペプチドを、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物お
よび培養培地から沈澱させる。次いで、沈澱されたポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析する。期待されるサイズの発現
産物が細胞溶解物において観察され、これはネガティブコントロールにおいては
観察されない。[0487] Expression of the Brainiac-5-HA fusion polypeptide is determined, for example, by Harlo.
w and co-workers (Anibodies: A Laboratory M)
annual, 2nd edition; Cold Spring Harbor Laboratory
ory Press, Cold Spring Harbor, New York
k (1988)) by radiolabeling and immunoprecipitation.
To detect. To this end, two days after transfection, cells are ³⁵ Label by incubating for 8 hours in medium containing S-cysteine
You. The cells and the medium are collected and the cells are washed and
surfactant and R as described by Son and co-workers (supra).
IPA buffer: 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS,
Dissolved in 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM TRIS, pH 7.5
Understand. Polypeptides can be lysed using an HA-specific monoclonal antibody.
And precipitate from the culture medium. Then, the precipitated polypeptide was subjected to SDS-PA.
Analyze by GE and autoradiography. Expression of expected size
The product is observed in the cell lysate, which is
Not observed.

【０４８８】 （実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現） ベクターｐＣ４を、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの発現のために使用す
る。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３
７１４６）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制
御下で、マウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクト
されるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の
細胞は、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択可能な培地（αマイナスＭ
ＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖させることによっ
て選択され得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦ
Ｒ遺伝子の増幅は、よく考証されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，
Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，
１０９７：１０７−１４３（１９９０）；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎ
ｈａｍ，Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を
参照のこと）。漸増濃度のＭＴＸにおいて増殖した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増
幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することによって薬物への耐性を
発達する。第二の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結される場合、通常、同時増幅さ
れ、そして過剰発現される。このアプローチを使用して、増幅遺伝子の１，００
０を超えるコピーを有する細胞株を開発し得ることは当該分野で公知である。続
いて、メトトレキサートが取り除かれる場合、宿主細胞の１以上の染色体に取り
込まれた増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。Example 3 (b): Cloning and Expression in CHO Cells The vector pC4 is used for the expression of Brainiac-5 polypeptide. Plasmid pC4 is a plasmid pSV2-dhfr (ATCC Accession No. 3).
7146). This plasmid contains the mouse DHFR gene under the control of the SV40 early promoter. Chinese hamster ovary cells or other cells lacking dihydrofolate activity transfected with these plasmids are selected from a selectable medium (α minus M) supplemented with the chemotherapeutic agent methotrexate.
(EM, Life Technologies). DHF in cells that are resistant to methotrexate (MTX)
Amplification of the R gene has been well documented (eg, Alt, FW et al., JB).
iol. Chem. 253: 1357-1370 (1978); Hamlin,
J. L. And Ma, C.I. Biochem. et Biophys. Acta,
1097: 107-143 (1990); Page, M .; J. And Syden
ham, M .; A. Biotechnology 9: 64-68 (1991)). Cells grown in increasing concentrations of MTX develop resistance to the drug by overproducing the target enzyme DHFR as a result of amplification of the DHFR gene. When a second gene is linked to a DHFR gene, it is usually co-amplified and overexpressed. Using this approach, 1.00 of the amplified gene
It is known in the art that cell lines with more than zero copies can be developed. Subsequently, when methotrexate is removed, a cell line is obtained that contains the amplified gene integrated into one or more chromosomes of the host cell.

【０４８９】 プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス（Ｃ
ｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７（１９８５）
）の長末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーターに加えてヒトサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８
５））の最初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントを含む。プロ
モーターの下流は、遺伝子の取り込みを可能にする、単一の制限酵素切断部位が
続く：ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８。これらのクローニング部位の
後ろに、このプラスミドは、ラットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロ
ンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーターもまた、発現のた
めに使用され得る（例えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期プロモ
ーターもしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ
およびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−Ｏｆｆお
よびＴｅｔ−Ｏｎの遺伝子発現システムならびに類似のシステムを使用して、哺
乳動物細胞中に調節された方法でＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを発現し得
る（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１（１９９２））。ｍＲＮＡのポ
リアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビ
ン遺伝子由来）も同様に使用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有
する安定な細胞株もまた、選択可能なマーカー（例えば、ｇｐｔ、Ｇ４１８、ま
たはハイグロマイシン）での同時トランスフェクトの際に選択され得る。初めに
１より多い選択可能なマーカー（例えば、Ｇ４１８に加えてメトトレキサート）
を使用することが有用である。The plasmid pC4 contains the Rous sarcoma virus (C
ullen et al., Mol. Cell. Biol. 5: 438-47 (1985)
) In addition to the strong promoter of the long terminal repeat (LTR) plus human cytomegalovirus (CMV) (Boshart et al., Cell 41: 521-530 (198).
5) The fragment isolated from the enhancer of the immediate-early gene is included. Downstream of the promoter is followed by a single restriction enzyme cleavage site that allows for gene uptake: BamHI, XbaI and Asp718. Behind these cloning sites, this plasmid contains the 3 'intron and polyadenylation site of the rat preproinsulin gene. Other high efficiency promoters can also be used for expression (eg, the human β-actin promoter, the SV40 early or late promoter, or other retroviruses, such as HIV
And HTLVI)). The Clontech Tet-Off and Tet-On gene expression systems and similar systems can be used to express Brainiac-5 polypeptide in a regulated manner in mammalian cells (Gossen, M. and Bujard, H.). Proc.Natl.Aca
d. Sci. ScL USA 89: 5547-5551 (1992)). For polyadenylation of mRNA, other signals, such as from the human growth hormone or globin gene, can be used as well. Stable cell lines with the gene of interest integrated into the chromosome can also be selected for co-transfection with a selectable marker (eg, gpt, G418, or hygromycin). Initially more than one selectable marker (eg, G418 plus methotrexate)
It is useful to use

【０４９０】 プラスミドｐＣ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、次いで
仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を用いて、当該分野で公知の手
順によって脱リン酸化する。次いで、ベクターを、１％アガロースゲルから単離
する。The plasmid pC4 is digested with the restriction enzymes BamHI and Asp718 and then dephosphorylated using calf intestinal phosphatase by procedures known in the art. The vector is then isolated from a 1% agarose gel.

【０４９１】 完全なＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、遺伝子
の所望の部分の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて増幅する。５’プライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位、Ｋｏｚａ
ｋ配列、ＡＵＧ開始コドンおよびＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの５’コー
ド領域の１６ヌクレオチドを含み、配列番号１５に示される。３’プライマーは
、Ａｓｐ７１８制限部位および停止コドンの直前の３‘コード配列に相補的な１
７のヌクレオチドを含み、配列番号１６に示される。A DNA sequence encoding the entire Brainiac-5 polypeptide is amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of the desired portion of the gene. The 5 'primer is a BamHI restriction site, Koza
It contains the k sequence, the AUG start codon and 16 nucleotides of the 5 'coding region of the Brainiac-5 polypeptide and is shown in SEQ ID NO: 15. The 3 'primer had a 1' complementary to the Asp718 restriction site and the 3 'coding sequence immediately before the stop codon.
SEQ ID NO: 16 comprising 7 nucleotides.

【０４９２】 増幅フラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消
化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製する。次いで、単離フラグメントお
よび脱リン酸化ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転
換し、そしてプラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌を、例えば
、制限酵素分析を用いて同定する。The amplified fragment is digested with the endonucleases BamHI and Asp718 and then purified again on a 1% agarose gel. The isolated fragment and the dephosphorylated vector are then ligated with T4 DNA ligase. Then, E. c
oli HB101 cells or E. coli. E. coli XL-1 Blue cells are transformed and bacteria containing the fragment inserted into plasmid pC4 are identified using, for example, restriction enzyme analysis.

【０４９３】 活性なＤＨＦＲ酵素を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランス
フェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェク
チン（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅ
ｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは優性選択
可能なマーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質への耐性を与える酵素をコード
するＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。この細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８
を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、１
０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートに加えて１ｍｇ／ｍｌのＧ
４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート（
Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日後、単一クロー
ンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１０
０ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウェルペトリ皿ま
たは１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖
するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、
１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、１０
０〜２００μＭの濃度で増殖するクローンを得るまで繰り返す。所望の遺伝子産
物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットまたは逆相Ｈ
ＰＬＣ分析によって分析する。[0493] Chinese hamster ovary cells lacking the active DHFR enzyme are used for transfection. 5 μg of expression plasmid pC4 was ligated with 0.5 μg of plasmid pSVne using lipofectin (Felgner et al., Supra).
Co-transfect with o. Plasmid pSV2-neo contains a dominant selectable marker (the neo gene from Tn5 encoding an enzyme that confers resistance to a group of antibiotics, including G418). The cells were treated with 1 mg / ml G418
Seed in α minus MEM supplemented with. Two days later, the cells were trypsinized and
0, 25, or 50 ng / ml methotrexate plus 1 mg / ml G
Hybridoma cloning plate in α minus MEM supplemented with 418 (
(Greiner, Germany). After about 10-14 days, the single clones were trypsinized and then different concentrations of methotrexate (50 nM, 10 nM,
(0 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) into 6-well petri dishes or 10 ml flasks. The clones growing at the highest concentration of methotrexate were then replaced with higher concentrations of methotrexate (1 μM, 2 μM, 5 μM,
(10 mM, 20 mM). Do the same for 10
Repeat until obtaining a clone that grows at a concentration of 0-200 μM. Expression of the desired gene product is determined, for example, by SDS-PAGE and Western blot or reverse phase H.
Analyze by PLC analysis.

【０４９４】 （実施例４：Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ ｍＲＮＡ発現の組織分布） ノーザンブロット分析を行って、とりわけＳａｍｂｒｏｏｋおよび共同研究者
（前出）によって記載される方法を用いて、ヒト組織におけるＢｒａｉｎｉａｃ
−５遺伝子発現を調べる。Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドの全ヌクレオチド
配列（配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブを、製造者の説明書に従って、ｒｅ
ｄｉｐｒｉｍｅ^TM ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）を用いて³²Ｐで標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰ
ＩＮ−１００^TMカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ
．）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って用いて精製する。次い
で、精製した標識プローブを用いて、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ ｍＲＮＡについて
種々のヒト組織を調べる。Example 4: Tissue Distribution of Brainiac-5 mRNA Expression Northern blot analysis was performed, especially using the method described by Sambrook and co-workers (supra), to make Brainiac in human tissue.
Check -5 gene expression. A cDNA probe containing the entire nucleotide sequence of the Brainiac-5 polypeptide (SEQ ID NO: 1) was prepared according to the manufacturer's instructions.
diprime ^™ DNA labeling system (Amersham Life Sci)
with ³² P labeled using ence). After labeling, the probe was replaced with CHROMA SP
IN-100 ^™ column (Clontech Laboratories, Inc.)
. ) Is purified according to the manufacturer's protocol number PT1200-1. Various human tissues are then examined for Brainiac-5 mRNA using the purified labeled probe.

【０４９５】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む複数組織のノーザ
ン（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そして製造者のプロト
コル番号ＰＴ１１９０−１に従ってＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ^TMハイブリダイゼーシ
ョン溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて標識プローブについて調べる。ハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄後、ブロットをマウントし、そして−７０℃にて一晩
フィルムに曝露し、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。[0495] Northern (MTN) blots of multiple tissues, including various human tissues (H) or human immune system tissues (IM), were obtained from Clontech and ExpressHyb ^™ hybridization solution according to the manufacturer's protocol number PT1190-1. Check for labeled probes using (Clontech). After hybridization and washing, the blot is mounted and exposed to film overnight at -70 ° C, and the film is developed according to standard procedures.

【０４９６】 （実施例５：抗体の産生） （ａ）ハイブリドーマ技術 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の一つの実施例として
、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５を発現する細胞を、ポリクローナル抗体を含む血清の産
生を誘導するために動物に投与する。好ましい方法において、Ｂｒａｉｎｉａｃ
−５タンパク質の調製物を調製し、そして精製し、天然の夾雑物を実質的に含ま
ないようにする。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成する
ために、このような調製物を、動物に導入する。Example 5 Production of Antibodies (a) Hybridoma Technology The antibodies of the present invention can be prepared by various methods. (Current Pr
otocols, see Chapter 2). In one example of such a method, cells expressing Brainiac-5 are administered to an animal to induce the production of serum containing polyclonal antibodies. In a preferred method, Brainiac
A preparation of the -5 protein is prepared and purified to be substantially free of natural contaminants. Such a preparation is then introduced into an animal to produce a higher specific activity polyclonal antiserum.

【０４９７】 タンパク質Ｂｒａｉｎｉａｃ−５に特異的なモノクローナル抗体を、ハイブリ
ドーマ技術を使用して調製する（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９
５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（
１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９
７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ
．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくは、マウス）を
Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドで免疫する、またはより好ましくは、分泌Ｂ
ｒａｉｎｉａｃ−５ポリぺプチド発現細胞で免疫する。このようなポリペプチド
発現細胞を、任意の適切な組織培養培地において、好ましくは、１０％ウシ胎仔
血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸
、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプト
マイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地において培養する。A monoclonal antibody specific for the protein Brainiac-5 is prepared using hybridoma technology (Kohler et al., Nature 256: 49).
5 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (
1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (19
76); Hammerling et al .: Monoclonal Antibody
s and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.W. Y
. 563-681 (1981)). Generally, an animal (preferably a mouse) is immunized with a Brainiac-5 polypeptide, or more preferably, secreted B
Immunize with cells expressing the Rainiac-5 polypeptide. Such polypeptide-expressing cells are supplemented in any suitable tissue culture medium, preferably with 10% fetal calf serum (inactivated at about 56 ° C.) and containing about 10 g / l of non-essential amino acids, about 10 g / l. Culture in Earle's modified Eagle's medium supplemented with 1,000 U / ml penicillin and about 100 μg / ml streptomycin.

【０４９８】 このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切なミエローマ細胞株と融合す
る。任意の適切なミエローマ細胞株を、本発明に従って用い得る；しかし、ＡＴ
ＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。
融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、
次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３
２（１９８１））によって記載されるような限界希釈によってクローニングする
。このような選択を通して得られるハイブリドーマ細胞を、次いでＢｒａｉｎｉ
ａｃ−５ポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにア
ッセイする。The spleen cells of such mice are extracted and fused with a suitable myeloma cell line. Any suitable myeloma cell line may be used in accordance with the present invention;
It is preferred to use the parental myeloma cell line (SP2O) available from CC.
After fusion, the resulting hybridoma cells are selectively maintained in HAT medium,
Then Wands et al. (Gastroenterology 80: 225-23).
2 (1981)) by cloning by limiting dilution. The hybridoma cells obtained through such a selection are then
Assays are performed to identify clones secreting antibodies capable of binding to the ac-5 polypeptide.

【０４９９】 あるいは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、
抗イディオタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このよ
うな方法は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を
得ることが可能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特
異的抗体を使用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このよ
うな動物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハ
イブリドーマ細胞を、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５タンパク質特異的抗体に結合する能
力がＢｒａｉｎｉａｃ−５によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを
同定するためにスクリーニングする。このような抗体は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５
タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫
してさらなるＢｒａｉｎｉａｃ−５タンパク質特異的抗体の形成を誘導するため
に使用される。Alternatively, additional antibodies capable of binding to Brainiac-5 polypeptide are
It can be produced in a two step process using anti-idiotypic antibodies. Such methods take advantage of the fact that antibodies are themselves antigens, and thus it is possible to obtain antibodies that bind to a second antibody. According to this method, an animal, preferably a mouse, is immunized using a protein-specific antibody. The spleen cells of such animals are then used to produce hybridoma cells. The hybridoma cells are then screened to identify clones that produce antibodies that can be blocked by Brainiac-5 in their ability to bind to Brainiac-5 protein-specific antibodies. Such an antibody is known as Brainiac-5.
Contains anti-idiotypic antibodies to protein-specific antibodies and is used to immunize animals to induce the formation of additional Brainiac-5 protein-specific antibodies.

【０５００】 ヒトにおける抗体のインビボでの使用のために、抗体を「ヒト化」する。この
ような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来
する遺伝的構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト
化抗体を産生するための方法は、当該分野で公知であり、以下に記載される（総
説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８
５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂ
ｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、欧州特
許第１７１４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許第１７３４９４号；Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２
６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；
Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこ
と）。An antibody is “humanized” for in vivo use of the antibody in humans. Such antibodies can be produced by using a genetic construct derived from a hybridoma cell producing the monoclonal antibody described above. Methods for producing chimeric and humanized antibodies are known in the art and are described below (for a review, see Morrison, Science 229: 1202 (198
5); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Cab.
Illy et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neu.
Berger et al., WO 8615333; Robinson et al., WO 8702.
671; Boulianne et al., Nature 312: 643 (1984);
Neuberger et al., Nature 314: 268 (1985)).

【０５０１】 （ｂ）ｓｃＦｖｓのライブラリーからのＢｒａｉｎｉａｃ−５に対する抗体フ
ラグメントの単離 ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝露されていて
もよいし、曝露されていなくてもよいＢｒａｉｎｉａｃ−５に対する反応性を含
む抗体フラグメントのライブラリー中に構築する（例えば、米国特許第５，８８
５，７９３号（その全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。(B) Isolation of antibody fragments against Brainiac-5 from a library of scFvs. Constructed in a library of antibody fragments that contain reactivity to Brainiac-5 (see, eg, US Pat. No. 5,884).
No. 5,793, which is incorporated herein by reference in its entirety).

【０５０２】 （ライブラリーのレスキュー） ＰＣＴ公開 ＷＯ９２／０１０４７に記載のように、ｓｃＦｖｓのライブラリ
ーを、ヒトＰＢＬのＲＮＡから構築する。抗体フラグメントを提示するファージ
をレスキューするため、ファージミドを保有する約１０⁹（１０９）個のＥ．ｃ
ｏｌｉを用いて、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種し、そして振
盪しながら０．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０
ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵを接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｅ）し、２×１０ ⁸ （１０８）ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そして培養物を振盪なしで３７
℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃で４５分間インキュ
ベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そして
ペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μ
ｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そして一晩増殖させる。ファ
ージをＰＣＴ公開 ＷＯ９２／０１０４７に記載のように調製する。(Library Rescue) PCF Publication As described in WO 92/01047, a library of scFvs
Is constructed from human PBL RNA. Phage displaying antibody fragments
Approximately 10 carrying the phagemid to rescue⁹(109) E. coli c
Using oli, 50 ml of 2 × TY (1% glucose and 100 μg / ml
(2xTY-AMP-GLU) and shake.
0.8 with shaking. D. Propagate to growth. Using 5 ml of this culture, 50
inoculate with 2 ml of 2xTY-AMP-GLU and 2x10 ⁸ (108) TU Δgene 3 helper (M13Δgene III, PCT published W
O 92/01047), and the culture is shaken without shaking at 37 ° C.
Incubate for 45 minutes at 37 ° C, then incubate for 45 minutes at 37 ° C with shaking.
Beate. The culture is incubated at 4000 r. p. m. Centrifuge at
Pellet 2 liters of 2 × TY (100 μg / ml ampicillin and 50 μl
g / ml kanamycin) and grown overnight. Fa
Are prepared as described in PCT Publication WO 92/01047.

【０５０３】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を
供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖させ
ることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪なし
で３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時間
インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ ｒ
．ｐ．ｍ．で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３
００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ
粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地か
ら精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィル
ター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０¹³ （１０１３）形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得
る。The M13Δ gene III is prepared as follows: M13Δ gene III helper phage does not encode the gene III protein. Thus, phage displaying antibody fragments (phagemids) have a greater binding avidity for the antigen. During phage morphogenesis, infectious M13Δgene III particles are generated by growing helper phage in cells carrying a pUC19 derivative that supplies the wild-type gene III protein. The culture is incubated for 1 hour at 37 ° C. without shaking, then for another hour at 37 ° C. with shaking. Centrifuge cells (IEC-Centra 8,400 r)
. p. m. For 10 minutes), 100 μg / ml ampicillin and 25 μg / ml
2 x TY broth containing 2 ml of kanamycin (2 x TY-AMP-KAN) 3
Resuspended in 00 ml and grown overnight at 37 ° C. with shaking. The phage particles were purified and concentrated from the culture medium by two PEG precipitations (Sambrook et al., 1990), resuspended in 2 ml PBS and passed through a 0.45 μm filter (Minisart NML; Sartorius) to about 10 ¹³ (1013) Obtain the final concentration of transduction units / ml (ampicillin resistant clone).

【０５０４】 （ライブラリーパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリペプチドの１００μｇ
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜す
る。チューブを２％ Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし
、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０¹³（１０１３）ＴＵのファージをチュ
ーブに適用し、そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベー
トし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ ０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭ
トリエチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることに
よりファージを溶出し、その後この溶液を、０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌ととも
に３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍ
ｌの対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ
を１％ グルコースおよび１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含有するＴＹＥプ
レート上にプレートする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のように
Δ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを
調製する。次いで、このプロセスを、全４回のアフィニティー精製の間反復し、
３回目および４回目には、チューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で
２０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。(Library Panning) Immunotubes (Nunc) was used to prepare 100 μg of the polypeptide of the present invention.
Coat overnight in PBS with 4 ml of either 10 / ml or 10 μg / ml. Tubes are blocked with 2% Marvel-PBS at 37 ° C. for 2 hours, then washed three times in PBS. Apply about 10 ¹³ (1013) TU of phage to the tube and incubate at room temperature for 30 minutes while tilting up and down on a rotating wheel, then let sit for an additional 1.5 hours. Tube is PBS 0.1% Tw
Wash 10 times with een-20 and 10 times with PBS. 1 ml of 100 mM
The phage was eluted by adding triethylamine and spinning up and down on a turntable for 15 minutes, after which 0.5 ml of 1.0 M Tris-
Neutralize immediately with HCl, pH 7.4. The eluted phage was then incubated with the bacteria for 30 minutes at 37 ° C., so that
mid-logarithmic growth of E. l. E. coli TG1. Then, E. coli
Is plated on a TYE plate containing 1% glucose and 100 μg / ml ampicillin. The resulting bacterial library is then rescued with the Δ gene 3 helper phage as described above to prepare phage for the next round of selection. This process is then repeated for a total of four affinity purifications,
On the third and fourth rounds, increase the tube washes to 20 with PBS, 0.1% Tween-20 and 20 with PBS.

【０５０５】 （結合剤の特徴付け） 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ 炭酸水素塩（ｐＨ９
．６）中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイク
ロタイタープレートを用いて、ＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クロ
ーンを、ＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ９２／０
１０４７を参照のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。Characterization of Binders Using phage eluted from the third and fourth rounds of selection, E. coli was used. coli
HB 2151 is infected and soluble scFv is generated from a single colony for the assay (Marks et al., 1991). 50 mM bicarbonate (pH 9
. An ELISA is performed using microtiter plates coated with any of the polypeptides of the invention in 6) at 10 pg / ml. Positive clones in the ELISA were identified by PCR fingerprinting (eg, PCT Publication WO92 / 0).
1047) and then further characterized by sequencing.

【０５０６】 本発明は、前述の詳細な説明および実施例に特に記載されたものとは別の方法
で実施され得ることが明らかである。本発明の多数の改変および変更は、上述の
教示に照らして可能であり、それゆえ添付の請求の範囲の範囲内である。It will be apparent that the present invention may be practiced otherwise than as specifically described in the foregoing detailed description and examples. Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings and, therefore, are within the scope of the appended claims.

【０５０７】 本明細書中に引用した全ての刊行物（特許、特許出願、雑誌論文、実験室マニ
ュアル、本、または他の文書を含む）の全ての開示は、本明細書中に参考として
援用される。All disclosures of all publications (including patents, patent applications, journal articles, laboratory manuals, books, or other documents) cited herein are hereby incorporated by reference. Is done.

【０５０８】 さらに、本明細書と共に提出された配列表、および１９９８年１２月２３日に
出願された同時係属出願系列第６０／１１３，８０４号において提出された配列
表は、コンピューター読み出し形式および紙面形式の両方において（それぞれの
場合において）、本明細書中にその全体が参考として援用される。In addition, the Sequence Listing filed with this specification, and the Sequence Listing filed in co-pending application Ser. No. 60 / 113,804, filed Dec. 23, 1998, are in computer-readable form and In both forms (in each case), the entirety is incorporated herein by reference.

【０５０９】[0509]

【表４】 （ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。[Table 4] (ATCC Accession Number 203572) (Canada) Applicant will file a Canadian Patent until the Canadian Patent is issued based on the application or until the application is rejected or abandoned and cannot be reinstated or withdrawn. of Patents) authorizes the grant of samples of the deposited biological material referred to in the application only to an independent expert nominated by the Commissioner, Before the regulatory preparations for publication have been completed, they must be informed in writing to the International Bureau.

【０５１０】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。(Norway) The applicant hereby assumes that, until the application has been published (by the Norwegian Patent Office) or has not been published and has been decided by the Norwegian Patent Office, the donation of samples will be Request that it be done only for the house. A request to this effect shall be filed by the applicant with the Norwegian Patent Office before the time when the application is made publicly available under sections 22 and 33 (3) of the Norwegian Patent Act. If such a request is made by the applicant, any request for the provision of a sample by a third party shall indicate the expert employed. The expert is a list of certified experts prepared by the Norwegian Patent Office (list of
Recognized experts), or
In each case, it can be any person approved by the applicant.

【０５１１】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。(Australia) The applicant hereby gives the sample of the microorganism, prior to the grant of the patent,
Alternatively, prior to lapsing, rejection or withdrawal of the application, the subject is a skilled adder who has no interest in the invention.
ssee) (Australia Patent Law 3.25 (3)).

【０５１２】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。(Finland) The applicant hereby filed an application (patent and control committee (National
Until published (by the Board of Patents and Regulations) or without publication and subject to a decision by the National Patent and Legislative Commission, the sample will be provided only to experts in the art. ,Claim.

【０５１３】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。(UK) Applicants hereby request that the donation of a sample of microorganisms be made available only to experts. Such a request must be made by the applicant to the International Bureau before the regulatory preparations for international publication of the application have been completed.

【０５１４】 （ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。(ATCC Accession No. 203572) (Denmark) The applicant hereby submits a sample of the sample until the application has been published (by the Danish Patent Office) or has not been published and has been decided by the Danish Patent Office. Request that the grant be made only to experts in the technology. A request to this effect shall be made by the applicant to the Danish Patent Office prior to the time the application is made publicly available under sections 22 and 33 (3) of the Danish Patent Act. If such a request is made by the applicant, any request for the provision of a sample by a third party shall indicate the expert employed. The expert is a list of certified experts prepared by the Danish Patent Office (list of
Recognized experts), or
In each case, it can be any person approved by the applicant.

【０５１５】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。(Sweden) The applicant hereby assumes that, until the application has been published (by the Swedish Patent Office) or has not been published and has been decided by the Swedish Patent Office, the donation of samples will be Request that it be done only for the house. A request to this effect shall be made by the applicant to the International Bureau prior to the expiration of 16 months from the priority date (preferably PCT Application's Gui).
Format PCT / RO / 13 described in annex Z of Volume I of de
4). If such a request is made by the applicant, any request for the provision of a sample by a third party shall indicate the expert employed. The expert is a list of accredited experts created by the Swedish Patent Office (list
to any of the recognized experts), or
Alternatively, it may be any person approved by the applicant in each case.

【０５１６】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。(Netherlands) The applicant hereby states that until the date of issuance of the Dutch patent or until the date the application is rejected, withdrawn or abandoned (lapped), the micro-organisms are subject to the provisions of patent law 31F (1). Request that this be done only in the form of sample donation to the house. The request to this effect shall be filed by the applicant prior to the date on which the application is made publicly available under section 22C or 25 of the Dutch Patent Law, whichever comes first. Shall be submitted to the Bureau.

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

以下の図面は、本発明の実施形態の例示であり、そして特許請求の範囲によっ
て含まれるような本発明の範囲を限定することを意味するものではない。The following drawings are illustrative of embodiments of the present invention, and are not meant to limit the scope of the invention, as covered by the claims.

【図１】 図１Ａおよび図１Ｂは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５のヌクレオチド配列（配列番号
１）およびＢｒａｉｎｉａｃ−５の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。１
つの、潜在的アスパラギン結合性グリコシル化部位を、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５の
アミノ酸配列中で印を付ける。潜在的グリコシル化部位は、図１Ａおよび図１Ｂ
（配列番号２）におけるアスパラギン−７９で開始する。潜在的なグリコシル化
部位は、図１Ａおよび図１Ｂにおけるアミノ酸配列中の、アスパラギン（Ｎ）に
ついての太字の１文字略語につながるヌクレオチド配列の上に、太字の柵記号（
ｐｏｕｎｄ ｓｙｍｂｏｌ）（＃）を用いて、印を付ける。 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５と、密接に関連したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｂｒａｉｎ
ｉａｃと、密接に関連したヒトＵＤＰ−ガラクトース−２−アセトアミド−２−
デオキシ−Ｄ−グルコース−３−β−ガラクトシルトランスフェラーゼ（これら
の配列の整列は、図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃにおいて示される）との間の高い
同一性の領域は、図１Ａおよび図１Ｂにおいて下線を付される。これらの領域は
制限されておらず、そして、図１Ａおよび図１Ｂにおいて、保存ドメイン（ＣＤ
）−Ｉ、ＣＤ−ＩＩ、ＣＤ−ＩＩＩ、ＣＤ−ＩＶ、ＣＤ−Ｖ、ＣＤ−ＶＩ、ＣＤ
−ＶＩＩ、ＣＤ−ＶＩＩＩ、ＣＤ−ＩＸ、ＣＤ−ＸおよびＣＤ−ＸＩとして表示
される。1A and 1B show the nucleotide sequence of Brainiac-5 (SEQ ID NO: 1) and the deduced amino acid sequence of Brainiac-5 (SEQ ID NO: 2). 1
Two potential asparagine-binding glycosylation sites are marked in the Brainiac-5 amino acid sequence. Potential glycosylation sites are shown in FIGS. 1A and 1B.
Starting with asparagine-79 in (SEQ ID NO: 2). Potential glycosylation sites are indicated in the amino acid sequence in FIGS. 1A and 1B by a bold bar symbol (above the nucleotide sequence leading to the bold single letter abbreviation for asparagine (N)).
Mark using pound symbol (#). Drosophila Brain, closely related to Brainiac-5
human UDP-galactose-2-acetamido-2- closely related to iac
The region of high identity between deoxy-D-glucose-3-β-galactosyltransferase (the alignment of these sequences is shown in FIGS. 2A, 2B and 2C) is underlined in FIGS. 1A and 1B. Is attached. These regions are not restricted, and in FIGS. 1A and 1B, the conserved domains (CD
) -I, CD-II, CD-III, CD-IV, CD-V, CD-VI, CD
-VII, CD-VIII, CD-IX, CD-X and CD-XI.

【図２】 図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃは、デフォルトのパラメーターを用いて、コンピ
ュータプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ（ＤＮＡ^*ＳＴＡＲヌクレオチド配列および
アミノ酸配列分析パッケージ）により決定されるような、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５
アミノ酸配列とＢｒａｉｎｉａｃのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓ
ｔｅｒのｍＲＮＡの翻訳産物（配列番号３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ４１４４
９）と、ヒトＵＤＰ−ガラクトース−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グ
ルコース−３−β−ガラクトシルトランスフェラーゼ（配列番号４；ＧｅｎＢａ
ｎｋ登録番号Ｙ１５０１４）との間の同一性の領域を示す。FIGS. 2A, 2B and 2C show Brainiac-5 as determined by the computer program MegAlign (DNA ^* STAR nucleotide sequence and amino acid sequence analysis package) using default parameters.
Amino acid sequence and Brainiac's Drosophila melangas
ter mRNA translation product (SEQ ID NO: 3; GenBank accession number U4144)
9) and human UDP-galactose-2-acetamido-2-deoxy-D-glucose-3-β-galactosyltransferase (SEQ ID NO: 4; GenBa)
nk registration number Y15014).

【図３】 図３は、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５アミノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域、
ターン領域およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域
；抗原性指標および表面確率が示される。「抗原性指標またはＪａｍｅｓｏｎ−
Ｗｏｌｆ」グラフにおいて、正のピークは、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド
の高度に抗原性の領域（すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドが得られ得
る領域）の位置を示す。 図３において示されるデータはまた、表Ｉで、表形態において示される。表Ｉ
中の縦列は、見出し「Ｒｅｓ」、「Ｐｏｓｉｔｉｏｎ」およびローマ数字Ｉ〜Ｘ
ＩＶを用いて表示される。縦列の見出しは、図３および表Ｉにおいて示されるア
ミノ酸配列の以下の特徴をいう：「Ｒｅｓ」：配列番号２ならびに図１Ａおよび
図１Ｂのアミノ酸残基；「Ｐｏｓｉｔｉｏｎ」：配列番号２ならびに図１Ａおよ
び図１Ｂ中の対応する残基の位置；Ｉ：α、領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏ
ｎ；ＩＩ：α、領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；ＩＩＩ：β、領域−Ｇａｒｎｉ
ｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＩＶ：β、領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；Ｖ：ターン、
領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＶＩ：ターン、領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓ
ｍａｎ；ＶＩＩ：コイル、領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＶＩＩＩ：親
水性プロット−Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ；ＩＸ：疎水性プロット−Ｈｏｐ
ｐ−Ｗｏｏｄｓ；Ｘ：α、両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；ＸＩ：β、両親
媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；ＸＩＩ：可撓性領域−Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈ
ｕｌｚ；ＸＩＩＩ：抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ；およびＸＩＶ：表
面確率プロット−Ｅｍｉｎｉ。FIG. 3 shows an analysis of Brainiac-5 amino acid sequence. α region, β region,
Turn and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability are indicated. "Antigenicity index or Jameson-
In the "Wolf" graph, the positive peak indicates the location of the highly antigenic region of Brainiac-5 polypeptide (i.e., the region from which the epitope-bearing peptide of the present invention can be obtained). The data shown in FIG. 3 is also shown in Table I, in tabular form. Table I
The middle columns are headings "Res", "Position" and Roman numerals I-X.
Displayed using IV. The column headings refer to the following features of the amino acid sequence shown in FIG. 3 and Table I: "Res": SEQ ID NO: 2 and the amino acid residues of FIGS. 1A and 1B; "Position": SEQ ID NO: 2 and FIG. 1A. And the position of the corresponding residue in FIG. 1B; I: α, region-Garnier-Robso
n; II: α, region-Chou-Fasman; III: β, region-Garni
er-Robson; IV: β, region-Chou-Fasman; V: turn,
Region-Garnier-Robson; VI: Turn, Region-Chou-Fas
man; VII: coil, region-Garnier-Robson; VIII: hydrophilicity plot-Kyte-Doolittle; IX: hydrophobicity plot-Hop.
p-Woods; X: α, amphipathic region—Eisenberg; XI: β, amphipathic region—Eisenberg; XII: flexible region—Karplus-Sch
ulz; XIII: antigenic index-Jameson-Wolf; and XIV: surface probability plot-Emini.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８６ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/00 ４Ｃ０８７ 48/00 7/00 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｐ 1/00 7/06 7/00 19/02 7/06 25/08 19/02 25/16 25/08 25/18 25/16 25/24 25/18 25/28 25/24 29/00 25/28 35/02 29/00 37/00 35/02 37/06 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 37/06 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ルーベン， スティーブン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ヘリテージ ヒルズ ドライブ 18528 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA04 CA06 DA02 DA06 EA02 EA04 FA18 GA11 HA01 4B064 AG20 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA02 BA22 CA53 NA14 ZA022 ZA062 ZA122 ZA152 ZA162 ZA182 ZA512 ZA532 ZA552 ZA592 ZA662 ZA892 ZA962 ZB052 ZB072 ZB082 ZB112 ZB272 ZB352 ZC032 ZC062 ZC552 4C085 AA13 AA14 DD62 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA02 ZA05 ZA06 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA51 ZA53 ZA55 ZA59 ZA89 ZA96 ZB05 ZB07 ZB08 ZB11 ZB15 ZB27 ZB33 ZB35 ZC03 ZC06 ZC55 4C087 AA02 AA04 BC83 CA12 NA14 ZA02 ZA06 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA51 ZA53 ZA55 ZA59 ZA89 ZA96 ZB05 ZB07 ZB08 ZB11 ZB15 ZB27 ZB33 ZB35 ZC03 ZC06 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 DA50 EA28 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 39/395 A61K 48/00 4C086 45/00 A61P 1/00 4C087 48/00 7/00 4H045 A61P 1 / 00 7/06 7/00 19/02 7/06 25/08 19/02 25/16 25/08 25/18 25/16 25/24 25/18 25/28 25/24 29/00 25/28 35 / 02 29/00 37/00 35/02 37/06 37/00 C07K 14/705 37/06 16/28 C07K 14/705 C12N 1/15 16/28 1/19 C12N 1/15 1/21 1 / 19 C12P 21/02 C 1/21 C12N 15/00 ZNAA 5/10 5/00 A C12P 21/02 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA , GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS , LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (71) Applicant 9410 Key West Avenue, Rockville, Maryland 20850, United States of America (72) Inventor Leuven, Steven M. United States Maryland 20882, Laytonsville, Heritage Hills Drive 18528 F-term (reference) 4B024 AA01 BA63 CA04 CA06 DA02 DA06 EA02 EA04 FA18 GA11 HA01 4B064 AG20 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA90X AA99A AB4 A02A24 CA03 AA07 AA13 AA17 BA01 BA02 BA22 CA53 NA14 ZA022 ZA062 ZA122 ZA152 ZA162 ZA182 ZA512 ZA532 ZA552 ZA592 ZA662 ZA892 ZA962 ZB052 ZB072 ZB082 ZB112 ZB272 ZB352 ZC032 ZC062 ZC552 4C085 AA13 AA14 DD62 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA02 ZA05 ZA06 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA51 ZA53 ZA55 ZA59 ZA89 ZA96 ZB05 ZB07 ZB08 ZB11 ZB15 ZB27 ZB33 ZB35 ZC03 ZC06 ZC55 4C087 AA02 AA04 BC83 CA12 NA14 ZA02 ZA06 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA51 ZA53 ZA55 ZAZ ZB Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z CA40 DA50 EA28 FA74

Claims (22)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号２の１〜２７８位でアミノ酸配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ−
５ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２において含まれるｃＤＮＡクローンによ
ってコードされるようなヌクレオチド配列；および （ｃ）上記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）におけるいずれかのヌクレオチド配
列に相補的な、ヌクレオチド配列、 からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。1. An isolated nucleic acid molecule, comprising: (a) a Brainiac- having the amino acid sequence at positions 1-278 of SEQ ID NO: 2;
(B) a nucleotide sequence as encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 203572; and (c) any of (a), (b) or (c) above. An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% identical to a sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence complementary to said nucleotide sequence. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドが、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１
）における完全なヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。2. The polynucleotide as shown in FIG. 1A and FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).
2.) The nucleic acid molecule according to claim 1, having the complete nucleotide sequence in). 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドが、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１
）におけるヌクレオチド配列を有し、該ヌクレオチド配列が、配列番号２の１〜
２７８位においてアミノ酸配列を有する前記Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド
をコードする、請求項１に記載の核酸分子。3. The polynucleotide of FIG. 1A and FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).
) Has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
2. The nucleic acid molecule of claim 1, wherein said nucleic acid molecule encodes said Brainiac-5 polypeptide having an amino acid sequence at position 278. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドが、図１（配列番号１）におけるヌク
レオチド配列を有し、該ヌクレオチド配列が、配列番号２の約８〜約２７８のア
ミノ酸配列を有する前記Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードする、請求
項１に記載の核酸分子。4. The polynucleotide has the nucleotide sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1), wherein the nucleotide sequence has the amino acid sequence of about 8 to about 278 of SEQ ID NO: 2. The nucleic acid molecule of claim 1, which encodes. 【請求項５】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号２の残基ｎ¹−２７８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｎ¹が、１〜８の範囲の整数であ
る、ヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２の残基１−ｍ¹のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列であって、ここで、ｍ¹が、２６３〜２７８の範囲の整数
である、ヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号２の残基ｎ¹−ｍ¹からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｎ¹およびｍ¹が、それぞれ、
上記の（ａ）および（ｂ）において定義されたような整数である、ヌクレオチド
配列；ならびに （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２において含まれるｃＤＮＡクローンによ
ってコードされる、前記Ｂｒａｉｎｉａｃ−５のアミノ酸配列の一部分からなる
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該一部分が、Ａ
ＴＣＣ受託番号２０３５７２において含まれるｃＤＮＡクローンによってコード
される、前記完全なアミノ酸配列のアミノ末端から１〜約８のアミノ酸を排除す
る、ヌクレオチド配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２において含まれるｃＤＮＡクローンによ
ってコードされる、該Ｂｒａｉｎｉａｃ−５のアミノ酸配列の一部分からなるポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該一部分が、ＡＴ
ＣＣ受託番号２０３５７２において含まれるｃＤＮＡクローンによってコードさ
れる、該完全なアミノ酸配列のカルボキシ末端から１〜約１５のアミノ酸を排除
する、ヌクレオチド配列；ならびに （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２において含まれるｃＤＮＡクローンによ
ってコードされる、該Ｂｒａｉｎｉａｃ−５のアミノ酸配列の一部分からなるポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該一部分が、上記
の（ｄ）および（ｅ）におけるいずれかのアミノ末端欠失およびカルボキシ末端
欠失の組み合わせを含む、ヌクレオチド配列、 からなる群より選択される配列に、少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。5. An isolated nucleic acid molecule, comprising: (a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of residues n ^{1 to} 278 of SEQ ID NO: 2, wherein n ¹ is an integer ranging from 1 to 8, the nucleotide sequence; a nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising (b) an amino acid sequence of residues 1-m ¹ of SEQ ID NO: 2, wherein, m ¹ Is an integer in the range of 263 to 278; (c) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having an amino acid sequence consisting of residues n ¹ -m ¹ of SEQ ID NO: 2, wherein n ¹ and m ¹ are
A nucleotide sequence that is an integer as defined in (a) and (b) above; and (d) from a portion of the Brainiac-5 amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 203572. A nucleotide sequence encoding a polypeptide, wherein said portion comprises A
A nucleotide sequence that eliminates from 1 to about 8 amino acids from the amino terminus of the complete amino acid sequence, encoded by the cDNA clone contained in TCC Accession No. 203572; (e) encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 203572 A nucleotide sequence encoding a polypeptide consisting of a portion of the amino acid sequence of Brainiac-5, wherein the portion comprises AT
A nucleotide sequence encoded by the cDNA clone contained in CC Accession No. 203572, excluding from 1 to about 15 amino acids from the carboxy terminus of the complete amino acid sequence; and (f) by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 203572. A nucleotide sequence that encodes a polypeptide consisting of a portion of the Brainiac-5 amino acid sequence, wherein said portion comprises any of the amino terminal deletions in (d) and (e) above. An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence at least 95% identical to a sequence selected from the group consisting of: and a nucleotide sequence comprising a combination of carboxy-terminal deletions. 【請求項６】 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２に
おいて含まれるｃＤＮＡクローンの前記完全なヌクレオチド配列を有する、請求
項１に記載の核酸分子。6. The nucleic acid molecule of claim 1, wherein the polynucleotide has the complete nucleotide sequence of a cDNA clone contained in ATCC Accession No. 203572. 【請求項７】 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２に
おいて含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる前記完全なアミノ酸配列
を有する、前記Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチ
ド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。7. The method of claim 1, wherein the polynucleotide has the nucleotide sequence encoding the Brainiac-5 polypeptide, having the complete amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 203572. A nucleic acid molecule as described. 【請求項８】 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号２０３５７２に
おいて含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる前記アミノ酸配列を有す
る、活性なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１に記
載の核酸分子。8. The nucleic acid molecule of claim 1, wherein the polynucleotide has a nucleotide sequence encoding an active polypeptide having the amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 203572. 【請求項９】 単離された核酸分子であって、請求項１に記載の（ａ）、（
ｂ）または（ｃ）におけるヌクレオチド配列に同一なヌクレオチド配列を有する
ポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイ
ブリダイズする、ポリヌクレオチドを含み、ここで、該ハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハ
イブリダイズしない、単離された核酸分子。9. An isolated nucleic acid molecule according to claim 1, wherein (a) or (
a polynucleotide that hybridizes under stringent hybridization conditions to a polynucleotide having a nucleotide sequence identical to the nucleotide sequence in b) or (c), wherein the hybridizing polynucleotide comprises A residue An isolated nucleic acid molecule that does not hybridize under stringent hybridization conditions to a polynucleotide having a nucleotide sequence consisting only of groups or T residues. 【請求項１０】 単離された核酸分子であって、請求項１に記載の（ａ）ま
たは（ｂ）におけるアミノ酸配列を有する、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド
のエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単
離された核酸分子。10. An isolated nucleic acid molecule having the amino acid sequence of (a) or (b) according to claim 1, which encodes the amino acid sequence of the epitope-bearing portion of the Brainiac-5 polypeptide. An isolated nucleic acid molecule comprising nucleotides. 【請求項１１】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドのエピトープ保有部分
をコードする、請求項１０に記載の単離された核酸分子であって、ここで、該部
分のアミノ酸配列が、以下：およそＶａｌ−１〜およそＶａｌ−１１；およそＴ
ｈｒ−１４〜およそＧｌｎ−２２；およそＶａｌ−３４〜およそＨｉｓ−５３；
およそＰｈｅ−９４〜およそＶａｌ−１０８；およそＡｌａ−１２０〜およそＧ
ｌｎ−１２６；およそＡｒｇ−１３８〜およそＩｌｅ−１４９；およそＬｅｕ−
２０２〜およそＡｌａ−２１１；およびおよそＰｈｅ−２７４〜およそＳｅｒ−
２７８、からなる配列番号２の配列の群より選択される、単離された核酸分子。11. The isolated nucleic acid molecule of claim 10, which encodes an epitope-bearing portion of a Brainiac-5 polypeptide, wherein the amino acid sequence of the portion is as follows: approximately Val-1. ~ Val-11; T
hr-14 to about Gln-22; about Val-34 to about His-53;
About Phe-94 to about Val-108; about Ala-120 to about G
ln-126; approximately Arg-138 to approximately Ile-149; approximately Leu-
202 to about Ala-211; and about Phe-274 to about Ser-.
278. An isolated nucleic acid molecule selected from the group of the sequences of SEQ ID NO: 2 consisting of: 【請求項１２】 組換えベクターを作製するための方法であって、請求項１
に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入する工程を包含する、方法。12. A method for producing a recombinant vector, comprising the steps of:
A method comprising inserting the isolated nucleic acid molecule of claim 1 into a vector. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法によって産生される組換えベクタ
ー。13. A recombinant vector produced by the method according to claim 12. 【請求項１４】 組換え宿主細胞を作製する方法であって、請求項１３に記
載の組換えベクターを、宿主細胞へ導入する工程を包含する、方法。14. A method for producing a recombinant host cell, comprising introducing the recombinant vector according to claim 13 into a host cell. 【請求項１５】 請求項１４に記載の方法によって産生される組換え宿主細
胞。15. A recombinant host cell produced by the method of claim 14. 【請求項１６】 Ｂｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドを産生するための組換
え方法であって、該ポリペプチドが発現され、そして該ポリペプチドを回収する
ような条件下で、請求項１５に記載の組換え宿主細胞を培養する工程を包含する
、方法。16. A recombinant method for producing a Brainiac-5 polypeptide, wherein said recombinant is under conditions such that said polypeptide is expressed and said polypeptide is recovered. A method comprising culturing a host cell. 【請求項１７】 単離されたＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドであって、
以下： （ａ）配列番号２の１〜２７８位のアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２
０３５７２において含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、完全なＢ
ｒａｉｎｉａｃ−５のアミノ酸配列；および （ｂ）配列番号２の８〜２７８位のアミノ酸配列を有するＢｒａｉｎｉａｃ−
５ポリペプチドのアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０３５７２において
含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるようなアミノ酸配列、 からなる群より選択される配列に、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む
、単離されたＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド。17. An isolated Brainiac-5 polypeptide, comprising:
The following: (a) the amino acid sequence at positions 1 to 278 of SEQ ID NO: 2, or ATCC Accession No. 2
Complete B encoded by the cDNA clone contained in
(b) Brainiac- having the amino acid sequence of positions 8 to 278 of SEQ ID NO: 2;
An amino acid sequence that is at least 95% identical to a sequence selected from the group consisting of: the amino acid sequence of the 5 polypeptides or the amino acid sequence as encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 203572. Brainiac-5 polypeptide. 【請求項１８】 単離されたポリペプチドであって、Ｂｒａｉｎｉａｃ−５
ポリペプチドのエピトープ保有部分を含み、ここで、該部分が、以下：配列番号
２のおよそＶａｌ−１〜およそＶａｌ−１１；配列番号２のおよそＴｈｒ−１４
〜およそＧｌｎ−２２；配列番号２のおよそＶａｌ−３４〜およそＨｉｓ−５３
；配列番号２のおよそＰｈｅ−９４〜およそＶａｌ−１０８；配列番号２のおよ
そＡｌａ−１２０〜およそＧｌｎ−１２６；配列番号２のおよそＡｒｇ−１３８
〜およそＩｌｅ−１４９；配列番号２のおよそＬｅｕ−２０２〜およそＡｌａ−
２１１；配列番号２のおよそＰｈｅ−２７４〜およそＳｅｒ−２７８のアミノ酸
残基を含むポリペプチド、からなる群より選択される、単離されたポリペプチド
。18. An isolated polypeptide, comprising Brainiac-5.
Comprises an epitope bearing portion of the polypeptide, wherein the portion comprises the following: about Val-1 to about Val-11 of SEQ ID NO: 2; about Thr-14 of SEQ ID NO: 2.
To about Gln-22; about Val-34 to about His-53 of SEQ ID NO: 2.
From about Phe-94 to about Val-108 of SEQ ID NO: 2; from about Ala-120 to about Gln-126 of SEQ ID NO: 2; about Arg-138 of SEQ ID NO: 2;
To about Ile-149; about Leu-202 to about Ala- of SEQ ID NO: 2.
211; an isolated polypeptide selected from the group consisting of: a polypeptide comprising amino acid residues from about Phe-274 to about Ser-278 of SEQ ID NO: 2. 【請求項１９】 請求項１７に記載のＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドに
特異的に結合する、単離された抗体。19. An isolated antibody that specifically binds to the Brainiac-5 polypeptide of claim 17. 【請求項２０】 改変されたＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドをコードす
る単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、少なくとも１つの保存的アミ
ノ酸置換を除いて、該改変されたペプチドが、配列番号２のアミノ酸１〜２７８
に同一なアミノ酸配列を有する、単離されたポリヌクレオチド。20. An isolated polynucleotide encoding a modified Brainiac-5 polypeptide, wherein, except for at least one conservative amino acid substitution, the modified peptide comprises SEQ ID NO: 2. Amino acids 1-278 of
An isolated polynucleotide having an amino acid sequence that is identical to 【請求項２１】 改変されたＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチドであって、
ここで、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を除いて、該改変されたポリペプ
チドが、配列番号２のアミノ酸１〜２７８に同一なアミノ酸配列を有する、改変
されたＢｒａｉｎｉａｃ−５ポリペプチド。21. A modified Brainiac-5 polypeptide, which comprises:
Wherein the modified Brainiac-5 polypeptide has the same amino acid sequence as amino acids 1-278 of SEQ ID NO: 2, except for at least one conservative amino acid substitution. 【請求項２２】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号５のヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号６のヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号７のヌクレオチド配列； （ｄ）配列番号８のヌクレオチド配列； （ｅ）配列番号９のヌクレオチド配列； （ｆ）配列番号１０のヌクレオチド配列； （ｇ）図１（配列番号１）において示される配列の一部分のヌクレオチド配列
であって、ここで、該一部分が、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド６００の少なく
とも５０の連続するヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列；および （ｈ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）
におけるいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、 からなる群より選択される配列に、少なくとも９５％同一な配列を有するポリヌ
クレオチドを含む、単離された核酸分子。22. An isolated nucleic acid molecule comprising: (a) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5; (b) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6; (c) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7; (E) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; (f) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; (g) the nucleotide sequence of a portion of the sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1), Wherein said portion comprises at least 50 contiguous nucleotides from nucleotide 1 to nucleotide 600; and (h) (a), (b), (c), (d), (e) above. , (F) or (g)
An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide having a sequence at least 95% identical to a sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences in