JP2002532117A - Preparations of mammalian cells optionally transfected with genes encoding active substances, and preparations containing them - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は一時的又は永続的な機能障害を生じさせる可能性があるサイズの該細胞の凝集体を含有しないことを特徴とする、任意に活性物質をコードする遺伝子が少なくとも一つ移入されており、患者への全身投与用の哺乳類細胞の調製物を目的とする。また、本発明は、医薬的に許容される運搬体及び該調製物から成る医薬組成物にも関す。   (57) [Summary] The present invention is characterized in that it does not contain aggregates of the cells of a size that may cause temporary or permanent dysfunction, optionally at least one gene encoding an active substance has been transferred. , For the preparation of mammalian cells for systemic administration to a patient. The invention also relates to a pharmaceutically acceptable carrier and a pharmaceutical composition comprising the preparation.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 本発明は、研究用モデルとしても、診断又は遺伝子治療、特に人間における脳
神経系疾患の治療、場合によっては動物における脳神経系疾患の治療にも有用で
ある遺伝子変更した哺乳類細胞に関する。The present invention relates to genetically modified mammalian cells which are also useful as research models, also for diagnosis or gene therapy, in particular for the treatment of cerebral nervous system disorders in humans, and in some cases for the treatment of cerebral nervous system disorders in animals.

【０００２】 人間における疾患の新しい治療法の中では、遺伝子治療、即ち、薬理物質とし
て機能する遺伝子の使用による疾患の表現型の、生体内における修正が発展して
いる。概要的に、遺伝子治療の方法は2種類区別できる： - 生体内戦略と呼ばれ、特定の遺伝子が宿主の細胞内に直接投与される戦略。 - 生体外戦略又は細胞遺伝子治療と呼ばれ、運搬体として選択した細胞を採取
し、培養し、移入遺伝子とも示される1つ又は複数の遺伝子を、管内でこれらの
細胞内に転移し、遺伝子変更した細胞を移植することから成る戦略。Among new treatments for diseases in humans is the development of gene therapy, the in vivo modification of the phenotype of diseases by the use of genes that function as pharmacological agents. In general, there are two types of gene therapy methods:-An in vivo strategy, in which a particular gene is administered directly into the cells of the host. -Harvesting and culturing cells selected as carriers, called in vitro strategies or cell gene therapy, transferring one or more genes, also referred to as transgenes, into these cells in a tube and modifying the genes A strategy consisting of transplanting isolated cells.

【０００３】 細胞遺伝子治療は、移入遺伝子の挿入及び発現が変更細胞の表現型に及ぼす影
響、移入遺伝子の複製数、移入遺伝子の転写率、生成された蛋白質の量及び蛋白
質の生物効果を、移植前に管内で確認できるという可能性等の否定し難い利点が
ある。表現型においても、所望蛋白質の発現においても均一である移植物を提供
するために、移植用の細胞個体群は精製しても良い。[0003] Cellular gene therapy measures the effects of the insertion and expression of a transgene on the phenotype of altered cells, the number of copies of the transgene, the transcription rate of the transgene, the amount of protein produced and the biological effects of the protein. There is an undeniable advantage, such as the possibility that it can be confirmed in the pipe before. The cell population for transplantation may be purified to provide a transplant that is uniform in both phenotype and expression of the desired protein.

【０００４】 細胞遺伝子治療に使用されている細胞の中には、血管形成部位で治療物質を発
現する為に、遺伝子変更された非不死化内皮細胞を静脈経由で投与することが、
PCT国際特許出願WO93/13807号に提案されている。[0004] Some of the cells used in cell gene therapy include administering non-immortalized endothelial cells that have been genetically modified in order to express a therapeutic substance at the site of angiogenesis.
It has been proposed in PCT International Patent Application WO 93/13807.

【０００５】 しかし、全ての内皮細胞が同一であるとは限らないことに注意するべきである
。即ち、成人の内皮細胞は、臓器間のみならず、同一臓器にて各種直径の血管間
でも極めて不均一な細胞個体群となっている。内皮の不均一性は形態差のみなら
ず、一つ又は複数の内皮細胞個体群に対して特異性を有す分子標識を発現するこ
とも特徴となる。例えば、中央神経系において、脳微細血管の内皮細胞は、脳柔
組織の星状細胞と一緒に血液脳関門を形成する。[0005] It should be noted, however, that not all endothelial cells are identical. That is, the endothelial cells of an adult are a very heterogeneous cell population not only between organs but also between blood vessels of various diameters in the same organ. The heterogeneity of the endothelium is characterized not only by morphological differences, but also by the expression of molecular markers having specificity for one or more endothelial cell populations. For example, in the central nervous system, endothelial cells of brain microvessels form the blood-brain barrier together with astrocytes of brain parenchyma.

【０００６】 遺伝子治療用哺乳類細胞の調製物を開発するには、該細胞の均一性及び特徴付
けが問題となる。この問題の効果的な解決法は、細胞を不死化させることにある
。従って従来のものには、腫瘍も含めた神経疾患の治療に有用である移入遺伝子
を場合によっては有する不死化脳内皮細胞株又は網膜の内皮及び上皮細胞株が記
述されてある。特に、出願者のPCT国際特許出願WO96/11278号及び第WO97/40139
号に報告されてある研究が挙げられる。[0006] In developing preparations of mammalian cells for gene therapy, the uniformity and characterization of the cells is problematic. An effective solution to this problem consists in immortalizing the cells. Thus, the prior art describes immortalized brain endothelial cell lines or retinal endothelial and epithelial cell lines, optionally with a transgene that is useful for treating neurological disorders, including tumors. In particular, applicant's PCT International Patent Applications WO 96/11278 and WO 97/40139
Studies reported in this issue.

【０００７】 哺乳類細胞、特に脳内皮細胞に関する出願者の研究により、患者の疾患に対す
る遺伝子治療の効果的な工程の実施を可能とする、大量かつ均一であり完璧に特
徴付けされた移植用又は注射用の資料を得ることが出来た。従って、本発明にお
いて、中央神経系を灌注する血液区画内に注射した後、移入遺伝子を発現しない
RBE4細胞、移入遺伝子を発現するRBEZ及びRBE4／GFP細胞等の遺伝子変更不死化
脳内皮細胞は生き延び、脳微細血管の血管壁及び脳柔組織と統合する能力がある
。このアプローチの利点を確証するには、細胞の調製物及びこれらを含有し、注
射された組成物の開発と注射の手順において技術を極める必要があった。[0007] Applicant's work on mammalian cells, especially brain endothelial cells, has enabled large, uniform and perfectly characterized implants or injections to enable the effective implementation of gene therapy for disease in patients. I was able to get the materials for Thus, in the present invention, the transgene is not expressed after injection into the blood compartment in which the central nervous system is irrigated.
Genetically modified immortalized brain endothelial cells, such as RBE4 cells, RBEZ expressing transgenes and RBE4 / GFP cells, survive and are capable of integrating with the vascular wall of brain microvessels and brain parenchyma. To validate the benefits of this approach, it was necessary to master the art in developing cell preparations and compositions containing and injecting them and in the injection procedure.

【０００８】 即ち、出願者の動物内への細胞の注射に関する研究は、注射された組成物にお
いての細胞凝集体の存在による、例えば脳血管障害又は肺塞栓症等の有毒効果を
明確にした。しかし、意外にも、細胞凝集体が注射時に存在することにより誘導
される有毒効果は、今まで考慮されていなかったようである。しかしながら、従
来の技術において、診断又は治療を実行する為に活性分子と結合した、又は結合
していない粒子を注射することが提案されている。例えば、以下の、サイズが正
確に定義された合成微球体に関して行われた研究が挙げられる： - 75〜150ミクロンの球体を心臓血管内へ注射すると心筋壊死が発生する（Bat
tlerら、1993、J. Am Coll. Cardiol.、22：2001-2006）、 - 7ミクロンの球体を心筋1グラム当り粒子105個の割合で豚の動脈内へ注射し
ても心筋組織における有毒効果は発生しない（Arrasら、1998、Nature Biotechn
ology、16：159-162）、 - 直径48ミクロンの微球体（900個の微球体）を右内頚動脈内に注射すると、
頭頂側頭皮質内で脳梗塞が発生する（Miyakeら、1993、Stroke、24：415-420）
。[0008] Thus, Applicants' study of injection of cells into animals has revealed toxic effects, such as cerebrovascular disorders or pulmonary embolism, due to the presence of cell aggregates in the injected composition. However, surprisingly, the toxic effects induced by the presence of cell aggregates at the time of injection did not appear to have been considered before. However, it has been proposed in the prior art to inject particles bound or unbound with an active molecule in order to carry out a diagnosis or therapy. For example, studies performed on synthetic microspheres of precisely defined size include the following:-Injection of 75-150 micron spheres into cardiovascular vessels results in myocardial necrosis (Bat
tler et al., 1993, J. Am Coll. Cardiol., 22: 2001-2006),-Toxic effects on myocardial tissue when 7 micron spheres are injected into pig arteries at a rate of 105 particles per gram of myocardium. Does not occur (Arras et al., 1998, Nature Biotechn.
ology, 16: 159-162),-When a microsphere with a diameter of 48 microns (900 microspheres) is injected into the right internal carotid artery,
Cerebral infarction occurs in the parietal temporal cortex (Miyake et al., 1993, Stroke, 24: 415-420)
.

【０００９】 更に、断層撮影法により脳の梗塞領域を検出する為に、放射標識されたサイズ
15〜30ミクロンのアルブミン微球体を、人間の総頚動脈内又は内頚動脈内に注射
したことが記述されてある（Verhasら、1976、J. Nucl. Med.、17：170-174）が
、有毒効果は一切報告されていない。Further, in order to detect an infarct region of the brain by tomography, a radiolabeled size
It has been described that 15-30 micron albumin microspheres were injected into human common or internal carotid arteries (Verhas et al., 1976, J. Nucl. Med., 17: 170-174), but were toxic. No effect was reported.

【００１０】 生成した粒子が生体に有毒効果を及ぼす可能性がある対外循環の分野では、潜
在的に有毒な粒子の数を90％低下させる為に、20ミクロンのフィルターを使用す
ることが提案されている（Loopら、1976、Ann. Thorac. Surg.、21：412-420）
。In the field of extracorporeal circulation, where the particles produced can have toxic effects on living organisms, it has been proposed to use a 20 micron filter to reduce the number of potentially toxic particles by 90%. (Loop et al., 1976, Ann. Thorac. Surg., 21: 412-420)
.

【００１１】 しかしながら上記の如く、数少ない従来の技術における細胞、特に内皮細胞の
注射に関する研究は、細胞凝集体の存在に起因する、注射された細胞組成物の有
毒効果は報告していない。従って、PCT国際特許出願WO93/13807号は、2 x 10⁶の
非不死化内皮細胞のマウス尾の静脈を介した静脈注射を記述し、細胞凝集体の形
成に関連する有毒効果の観察は挙げていない（Ojeifoら、1995、Cancer Res.、5
5：2240-2244）。実際に、有毒効果が一切観察されなかったことを仮定した場合
、30gのマウスに注射した細胞数が2 x 10⁶程度の少数、即ち、本発明において30
0gのラットで実行されたよりも2倍少ない数では、細胞凝集体が形成されても有
毒効果が誘導されない可能性がある。[0011] However, as noted above, studies on the injection of cells, particularly endothelial cells, in a few prior art have not reported the toxic effects of the injected cell composition due to the presence of cell aggregates. Thus, PCT International Patent Application WO 93/13807 describes intravenous injection of 2 x 10 ⁶ non-immortalized endothelial cells via the mouse tail vein, citing the observation of toxic effects associated with the formation of cell aggregates. (Ojeifo et al., 1995, Cancer Res., 5
5: 2240-2244). Indeed, if the toxic effect was assumed that was not observed at all, the number of cells injected into mice 30g is about 2 x 10 ⁶ small, i.e., in the present invention 30
At twice the number as performed in the 0 g rat, the formation of cell aggregates may not induce a toxic effect.

【００１２】 同じく、2 x 10⁶の非不死化細胞をラットの下肢内に（大腿内的に）動脈注射
した研究の著者は、有毒効果を報告せず、細胞凝集体形成による問題も全く報告
していない（Messinaら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci.、89：12018-12022）。
これらの研究は、注射に起因する有毒効果に関するものではないが、注射された
細胞の数が本発明で実行される際のものよりも50倍少ないことに注意するべきで
ある。更に、これらの研究の対象となる標的は、虚血に対する耐性が他の臓器よ
りも高い下肢の血管である。尚、実験者が、大腿動脈を一時間鉗子で締め付けた
ことにより血流の減少を可能とし、これにより細胞の血管障壁での接着が有利に
なったことが示されている。[0012] Similarly, the authors of the study, in which 2 x 10 ⁶ non-immortalized cells were injected intraarterially (intrafemorally) into the lower limbs of rats, reported no toxic effects and no problems with cell aggregate formation (Messina et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 12018-12022).
It should be noted that these studies are not related to the toxic effects due to the injection, but that the number of cells injected is 50 times less than that performed in the present invention. Furthermore, the targets of interest in these studies are lower limb vessels that are more resistant to ischemia than other organs. It has been shown that the experimenter clamped the femoral artery with forceps for one hour, which allowed blood flow to be reduced, thereby favoring cell adhesion at the vascular barrier.

【００１３】 従って、本発明の目的は、細胞調製物の注射による有毒効果を妨害することを
可能とする効果的で簡単な解決法を提供し、これにより細胞調製物の人間医学上
での適用を発展させることである。[0013] It is therefore an object of the present invention to provide an effective and simple solution which makes it possible to counteract the toxic effects of injection of a cell preparation, whereby the human preparation of the cell preparation is applied in human medicine. It is to develop.

【００１４】 全身投与するための、任意に活性物質をコードする遺伝子を少なくとも一つ移
入した、不死化哺乳類細胞の調製物であり、一時的又は永続的な機能障害を生じ
させる可能性があるサイズの該細胞の凝集体を含有しないことを特徴とする調製
物によりこの目的を達する。A preparation of immortalized mammalian cells, optionally transfected with at least one gene encoding an active substance, for systemic administration, the size of which may cause temporary or permanent dysfunction To this end, a preparation characterized in that it does not contain aggregates of said cells.

【００１５】 好ましくは不死化細胞は非腫瘍形成性のものである。[0015] Preferably, the immortalized cells are non-tumorigenic.

【００１６】 従って、本発明の調製物は、1マイクロリットル当り細胞1000〜300000個程度
の大数の細胞を含有でき、肺塞栓症、脳虚血傷害、末梢性虚血、更に死亡のよう
な、一時的又は永続的な臓器の血液供給の減少を引き起こすような有毒効果を誘
導せずに、診断又は治療において効果的な生物効果を得ることができる。Thus, the preparations of the present invention can contain large numbers of cells, on the order of 1000-300,000 cells per microliter, such as pulmonary embolism, cerebral ischemic injury, peripheral ischemia, and even death. An effective biological effect in diagnosis or therapy can be obtained without inducing toxic effects that cause a temporary or permanent decrease in the blood supply of the organ.

【００１７】 本発明において実行された実験により、細胞を含有する調製物の全身注射時に
、有毒効果を誘導する可能性がある凝集体のサイズを特徴付けできた。従って本
発明の調製物は、有利的にはサイズが約200ミクロン以上、好ましくは50ミクロ
ン以上、特に好ましくは30ミクロン以上の細胞凝集体は含有しない。[0017] Experiments performed in the present invention have allowed the characterization of the size of aggregates that could induce a toxic effect upon systemic injection of a preparation containing cells. The preparations according to the invention are therefore advantageously free of cell aggregates of a size of at least about 200 microns, preferably of at least 50 microns, particularly preferably of at least 30 microns.

【００１８】 脳内皮細胞又は末梢性内皮細胞及びそれらの前駆体等の内胚葉細胞、表皮細胞
又は中胚葉細胞、脈絡叢細胞、上皮細胞、網膜色素細胞、上衣細胞、第三脳室の
上衣細胞（tanycyte）、神経幹細胞及び神経前駆細胞、更に胚性幹細胞等いずれ
の種類の不死化又は非不死化の細胞が、本発明の調製物の成分として含むことが
できる。Endoderm cells, epidermal cells or mesoderm cells such as brain endothelial cells or peripheral endothelial cells and their precursors, choroid plexus cells, epithelial cells, retinal pigment cells, ependymal cells, ependymal cells of the third ventricle Any type of immortalized or non-immortalized cells, such as (tanycyte), neural stem cells and neural progenitor cells, as well as embryonic stem cells, can be included as components of the preparations of the invention.

【００１９】 中でも本発明は、特に哺乳類の内皮細胞及び上皮細胞、好ましくは脳又は網膜
の内皮細胞及び上皮細胞に関する。Among other things, the present invention relates to mammalian endothelial cells and epithelial cells, preferably brain or retinal endothelial cells and epithelial cells.

【００２０】 細胞の不死化は、WO96/11278号及びWO97/40139号として公開されたPCT特許出
願に記述されている如く、当業者に既知のいかなる方法によって実行しても良い
。不死化細胞が大量生成に際して、高度な資質の規準化を示すという利点がある
ため、本発明において特に好ましいのは不死化細胞である。不死化細胞は、上記
PCT出願に記述の如く、当業者に既知のあらゆる方法によって得られた非腫瘍形
成的特性を有す。[0020] Immortalization of the cells may be performed by any method known to those skilled in the art, as described in the PCT patent applications published as WO 96/11278 and WO 97/40139. Particularly preferred in the present invention are immortalized cells, as they have the advantage of exhibiting a high level of quality normalization during immortalization. Immortalized cells are
Has non-tumorigenic properties obtained by any method known to those skilled in the art, as described in the PCT application.

【００２１】 本発明の調製物を投与された患者において、一時的又は永続的な機能障害を引
き起こす可能性のある細胞凝集体の非存在は、あらゆる生物的、化学的又は物理
的な細胞処理により、凝集体の形成を妨害する、又はサイズが約200ミクロン以
上、好ましくは50ミクロン以上、特に好ましくは30ミクロン以上の該細胞の凝集
体を特異的に除去する処理によって達成できる。この処理後、好ましくは細胞は
、これらの生存を可能とし、該細胞の再凝集を促進させない倍液で懸濁する。こ
のような倍液の例としてカルシウムもマグネシウムも含まないグルコース含有PB
S等のいかなる凝集をも促進させない栄養倍液が挙げられる。In patients receiving the preparations of the present invention, the absence of cell aggregates that can cause temporary or permanent dysfunction is due to any biological, chemical or physical cell treatment. Can be achieved by a treatment that prevents the formation of aggregates or specifically removes aggregates of the cells having a size of about 200 microns or more, preferably 50 microns or more, particularly preferably 30 microns or more. After this treatment, the cells are preferably suspended in a concentrate that allows their survival and does not promote reaggregation of the cells. An example of such a double solution is glucose-containing PB without calcium or magnesium.
A nutrient solution that does not promote any aggregation such as S is mentioned.

【００２２】 本発明による細胞の生物的処理は、例えば内皮細胞を特殊な基準の接着性のた
めに選択したり、凝集体の形成を妨害する物質、又は該細胞の凝集を促進させる
物質の発現を抑制する物質を発現する核酸配列により、該細胞を遺伝子的に変更
することから成る。The biological treatment of the cells according to the invention may be, for example, the selection of endothelial cells for a particular standard of adhesion, the expression of substances which interfere with the formation of aggregates or which promote the aggregation of said cells. Genetically altering the cells with a nucleic acid sequence expressing a substance that suppresses

【００２３】 即ち、二つのアプローチが実施できる： - ZO1、ZO2、E-セレクチン、V.E. カドヘリン、ICAM-1、オクルディン、P-CAM
等の接着分子をコードする配列の削除、又は - 上記接着分子の優性陰性のもの等、凝集体の形成を妨害する分子をコードす
る配列、又は擬似蛋白質をコードする配列の挿入。Thus, two approaches can be implemented: ZO1, ZO2, E-selectin, VE cadherin, ICAM-1, occludin, P-CAM
Deletion of a sequence encoding an adhesion molecule such as, or-insertion of a sequence encoding a molecule that interferes with the formation of aggregates, such as the dominant negative of the adhesion molecule, or a sequence encoding a pseudoprotein.

【００２４】 本発明による細胞の物理的処理は、例えば、ろ過又は篩分けから成る。このろ
過又は篩分けは、凝集体の排除の他に、サイズが均一の細胞個体群が得られると
いう利点を提供する。このろ過又は篩分けは、次の手順で行われる：細胞は、好
ましくは30ミクロンの篩い分け用フィルターによりろ過され、例えば多数のピペ
ット操作により希釈して緩やかに解離し、次に細胞の懸濁液を注射器により吸引
させる。フィルターは予め無菌生理食塩水で浸しておき、100度のアルコールで
殺菌し、空気乾燥し、無菌生理食塩水で再度浸した。次にフィルターを針と細胞
を含有する注射器の先端の間に配置する。ピストンは、希釈した細胞の流動が一
滴ずつになるように注意深く押す。The physical treatment of the cells according to the invention comprises, for example, filtration or sieving. This filtration or sieving offers, besides the elimination of aggregates, the advantage of obtaining a cell population of uniform size. This filtration or sieving is carried out in the following procedure: The cells are filtered, preferably through a 30 micron sieving filter, for example by dilution with a number of pipettes to dissociate slowly and then suspend the cells. The liquid is aspirated with a syringe. The filter was previously soaked in sterile saline, sterilized with 100 ° alcohol, air-dried, and soaked again in sterile saline. The filter is then placed between the needle and the tip of the syringe containing the cells. The piston carefully pushes the flow of the diluted cells into drops.

【００２５】 しかし、物理的処理は「Fluorescent Analysis Cell Sorting（蛍光活性化細
胞分類法）」FACS型の分類法から成ってもよい。However, the physical treatment may consist of a “Fluorescent Analysis Cell Sorting” FACS type classification.

【００２６】 本発明による細胞の化学的処理は、例えば、細胞をトリプシン処理したり、他
の蛋白質分解酵素で処理することから成る。The chemical treatment of cells according to the invention comprises, for example, trypsinization of the cells or treatment with other proteolytic enzymes.

【００２７】 本発明の調製物の細胞は、治療又は診断に有用な活性物質をコードする遺伝子
を一つ又は複数移入したもの、又はしていないものでも良い。本発明において、
活性物質をコードする遺伝子を一つ又は複数移入することとは、ゲノムと統合し
た、又は細胞の細胞質内に存在し、直接に或いは間接的に活性物質と成るウィル
ス・ベクター、ポリペプチド、又は蛋白質を発現できることを可能とする発現用
ベクター等の核酸断片を細胞に移入することを意味する。例として、内容を参考
として本出願に含めたPCT特許出願第WO96/11278号に記述された、調製物の活性
物質をコードする遺伝子を移入した不死化脳内皮細胞が挙げられる。The cells of the preparations of the present invention may or may not have one or more genes encoding active substances useful for therapy or diagnosis. In the present invention,
Transferring one or more genes encoding an active substance refers to a virus vector, polypeptide, or protein integrated with the genome or present in the cytoplasm of a cell, which directly or indirectly becomes the active substance. This means that a nucleic acid fragment such as an expression vector that enables expression of a nucleic acid can be transferred into cells. Examples include immortalized brain endothelial cells into which a gene encoding the active substance of the preparation has been transferred, as described in PCT Patent Application No. WO 96/11278, the contents of which are incorporated herein by reference.

【００２８】 本発明は更に、医薬品の調製における前記細胞調製物の使用に関し、該医薬品
は、患者に対して十分な量の該細胞を全身投与する遺伝子治療による疾患の診断
、又は治療に使用するものである。The present invention further relates to the use of said cell preparation in the preparation of a medicament, wherein said medicament is for use in the diagnosis or treatment of a disease by gene therapy in which a sufficient amount of said cells is administered systemically to a patient. Things.

【００２９】 従って発明は更に、患者において全身投与する医薬組成物であり、上記と同様
の細胞調製物を、医薬的に妥当であり、該細胞の生存を可能とし、これらの再凝
集を促進させない運搬体と結合して該組成物内に含むことを特徴とする医薬組成
物を目的とする。医薬組成物とは、治療用及び診断用組成物の両方を意味する。The invention therefore furthermore relates to a pharmaceutical composition for systemic administration in a patient, wherein a similar cell preparation as described above is pharmaceutically relevant, allows the cells to survive and does not promote their reaggregation A pharmaceutical composition characterized by being included in the composition in association with a carrier. Pharmaceutical composition means both therapeutic and diagnostic compositions.

【００３０】 本発明の調製物を患者に注射したとき、一時的又は永続的な機能障害を生じさ
せる可能性がない凝集体のサイズは、投与経路に基づく。即ち、臓器選択的動脈
注射物質は、予め肺等のろ過性臓器を通過することなく該臓器内に到達する。従
って、動脈注射用の妥当な凝集体のサイズは、静脈注射用のものよりも小さい。
即ち、肘静脈に注射した後、肺のろ過器が機能し、他の臓器内に凝集体が存在す
ることを制限できる。しかし、予めろ過処理を受けていない内皮細胞を注射した
時、恐らく肺塞栓症による動物の死亡を出願者が観察していることから、静脈注
射に際しての有毒効果の危険は存在する。The size of aggregates that are not likely to cause temporary or permanent impairment when a preparation of the present invention is injected into a patient is based on the route of administration. That is, the organ-selective arterial injection substance reaches the organ without passing through a filterable organ such as the lung in advance. Thus, a reasonable aggregate size for arterial injection is smaller than that for intravenous injection.
That is, after injection into the cubital vein, the pulmonary filter functions and can limit the presence of aggregates in other organs. However, there is a danger of toxic effects upon intravenous injection, as the applicant has observed death of the animal, presumably due to pulmonary embolism, when injecting endothelial cells that have not been previously filtered.

【００３１】 更に、従来の技術におけるデータの分析、及び出願者により実行された実験は
、サイズが40ミクロン以上の球体が、動脈経路で標的細胞に有毒効果を及ぼす可
能性があることを示している。従って、例えば内皮細胞の細胞群が、球体と同様
に作用すると考えると、本発明において30ミクロン以上の凝集体を除去すること
が望ましい。しかし、微少血管内における細胞の変形性の物理的基準は、合成粒
子のものと異なり、このパラメータは細胞処理時に考慮する必要がある。細胞処
理は、例えばろ過であり、30ミクロンのフィルターの使用により最高で30ミクロ
ン以上の凝集体を除去でき、従って、最低90％残った細胞は個別した細胞であり
、その平均直径は、例えば内皮細胞の場合10ミクロンである。In addition, analysis of the data in the prior art, and experiments performed by the applicant, have shown that spheres greater than 40 microns in size can have toxic effects on target cells in the arterial pathway. I have. Therefore, for example, considering that a cell group of endothelial cells acts similarly to a sphere, it is desirable to remove aggregates of 30 μm or more in the present invention. However, the physical criterion of cell deformability in microvessels is different from that of synthetic particles, and this parameter needs to be considered during cell processing. Cell treatment is, for example, filtration, the use of a 30 micron filter can remove aggregates up to 30 microns or more, so that the lowest 90% of the cells are individual cells whose average diameter is 10 micron for cells.

【００３２】 従って、本発明は特に、 - 一方では、サイズが50ミクロン以上、好ましくは30ミクロン以上の細胞の凝
集体を含まない細胞調製物を含有することを特徴とする、患者に動脈内経路、好
ましくは頚動脈内経路で投与するための調製物、及び - 他方では、サイズが200ミクロン以上、好ましくは100ミクロン以上の細胞凝
集体を含まない細胞調製物を含むことを特徴とする、患者に静脈内経路で投与す
るための調製物に関する。The invention therefore particularly provides:-an intra-arterial route to a patient, characterized in that it comprises, on the one hand, a cell preparation which is free of aggregates of cells having a size of more than 50 microns, preferably more than 30 microns. A preparation, preferably for administration by the intra-carotid route, and-on the other hand, comprising a cell preparation free of cell aggregates of size 200 microns or more, preferably 100 microns or more. Preparations for administration by the intravenous route.

【００３３】 標的となる臓器又は組織に注射する細胞の選択に際して、これら二つの投与経
路を考慮するべきである。即ち、標的となる臓器を直接に灌注する動脈に本発明
の調製物を注射して、臓器を標的化することが好ましい。In selecting cells for injection into a target organ or tissue, these two routes of administration should be considered. That is, it is preferable to target the organ by injecting the preparation of the present invention into an artery directly irrigating the target organ.

【００３４】 逆に、該調製物の静脈内経路の注射において、標的となる臓器又は組織に対し
て、特異性を有す細胞を選択する又は該特異性を細胞に与えることが必要となる
。例えば、特異的接着性を有す内皮細胞の選択、又は標的臓器で要求される特性
を該細胞に与える遺伝子変更が挙げられる。Conversely, for intravenous injection of the preparation, it is necessary to select cells having specificity for the target organ or tissue or to confer such specificity on the cells. For example, selection of endothelial cells having specific adhesiveness, or genetic modification that gives the cells the properties required in the target organ.

【００３５】 動脈内の注射経路、中央神経系に関する適用で好ましくは頚動脈内経路は、本
発明の組成物の好ましい実施様態である。即ち、最も幅広い生体分布を可能とす
る全身注射の方が最適であるようだが、本発明の組成物を実施する遺伝子治療の
工程を最適化するための出願者によるこのパラメータの分析により、特に好まし
くは、中央神経系に最も近接な血路である頚動脈血管網を選ぶことにした。この
血管網は、人間の中央神経系の正常な機能に必要な脳血流の80％を供給し、人間
の臨床のみならず、動物に対しての実験者にも利用可能である。The intra-arterial injection route, preferably for applications involving the central nervous system, is preferably the intra-carotid route, which is a preferred embodiment of the composition according to the invention. That is, systemic injection, which allows the broadest biodistribution, appears to be optimal, but analysis of this parameter by the applicant to optimize the gene therapy process of practicing the compositions of the present invention is particularly preferred. Chose the carotid vascular network, which is the blood circuit closest to the central nervous system. This vascular network supplies 80% of the cerebral blood flow required for the normal functioning of the human central nervous system and is available to human clinical as well as animal experimenters.

【００３６】 即ち、本発明において発明者は、血流に影響を及ぼさない内皮細胞の頚動脈内
への注射が実行可能であることを示した。この投与経路を選択したことにより、
脳血流の変動を最小限にすることが可能である。即ち、この手順を実行中、内頚
動脈の血流は全く中断されない。更に、対照動物において行った分析によると、
実質性影響は全く認められなかった。ラットにおいて、注射は一般的頚動脈循環
で行われ、対象の領域全体に分布される。人間においては、介入性神経放射線学
の手法により、カテーテルを用いて、中大脳動脈、前大脳動脈又は後大脳動脈、
更にこれらの動脈枝等のより小さい血管に注射することは、従って潜在的により
優れた標的化及びより少ない有毒効果を得ることが可能である。これらの手法は
、当然浸襲性法であるが、同様の手順を必要とする動脈造影法よりも、浸襲性が
高度であるという訳ではない。逆に、遺伝子治療用の生成物を送達するための脳
室内注射、又は脳内注射における操作よりもはるかに浸襲性が低い。That is, in the present invention, the present inventors have shown that it is feasible to inject endothelial cells into the carotid artery without affecting blood flow. By choosing this route of administration,
It is possible to minimize fluctuations in cerebral blood flow. That is, during this procedure, the blood flow in the internal carotid artery is not interrupted at all. Further, according to analysis performed on control animals,
No substantive effect was observed. In rats, injections are made in the general carotid circulation and are distributed throughout the area of interest. In humans, by means of interventional neuroradiology, using a catheter, the middle cerebral artery, anterior cerebral artery or posterior cerebral artery,
Furthermore, injecting into smaller vessels such as these arterial branches can thus potentially achieve better targeting and less toxic effects. These techniques are, of course, invasive, but are not more invasive than arteriography, which requires a similar procedure. Conversely, it is much less invasive than procedures in intraventricular or intracerebral injection to deliver products for gene therapy.

【００３７】 ある条件において、頚動脈注射は、死亡及び実質傷害を引き起こした。死亡は
一般的に即時的であり、大半が呼吸困難に関連するものであった。最も可能性の
高い原因は、細胞の注射が致命的な肺塞栓症を引き起こしていたことである。実
質傷害は、内皮細胞の数が高かった場合、及び細胞懸濁液がろ過されていなかっ
た場合に発生した。これらのデータは、脳実質傷害及び死亡がろ過後に最小化さ
れることから、細胞凝集体が脳実質傷害及び死亡の原因であるという本発明の概
念を確証するものである。脳実質傷害は、T2にて高信号として表示され、かつ内
頚動脈の血管領域に配置されていることから、脳梗塞に相当する可能性が最も高
い。ろ過により、これらの有毒効果をほぼ完全に除去することができた。注射側
の側脳室の膨張が観察されたこともあったが、少なかった。Under certain conditions, carotid artery injection caused death and parenchymal injury. Deaths were generally immediate and mostly related to dyspnea. The most likely cause is that the injection of cells caused fatal pulmonary embolism. Parenchymal injury occurred when the number of endothelial cells was high and when the cell suspension was not filtered. These data confirm the concept of the present invention that cell aggregates are responsible for brain parenchymal injury and death, since brain parenchyma and death are minimized after filtration. Brain parenchyma is most likely to correspond to cerebral infarction because it is displayed as a high signal at T2 and is located in the vascular region of the internal carotid artery. By filtration, these toxic effects could be almost completely eliminated. In some cases, dilatation of the lateral ventricle on the injection side was observed, but it was small.

【００３８】 前記の如く、本発明の組成物内における凝集体の非存在は、従来の技術による
ものより、大量の細胞を含む組成物を得ることができる。即ち、本発明の組成物
は組成物1マイクロリットル当り1,000〜300,000個の細胞を含む。As described above, the absence of aggregates in the composition of the present invention makes it possible to obtain a composition containing a larger amount of cells than in the prior art. That is, the composition of the present invention contains 1,000 to 300,000 cells per microliter of the composition.

【００３９】 本発明の組成物は、特に遺伝子治療の領域で有用であるが、診断においての使
用も考慮できる。Although the compositions of the present invention are particularly useful in the area of gene therapy, their use in diagnosis is also contemplated.

【００４０】 本発明の組成物の治療適用例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハ
ンチントン舞踏病等の神経変性疾患、脳血管障害、癌、眼球の疾患、リウマチ性
多発関節炎等の炎症性疾患、免疫疾患の、動脈又は静脈の奇形治療及び／又は予
防が挙げられる。Examples of therapeutic applications of the composition of the present invention include neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease and Huntington's disease, cerebrovascular disorders, cancer, eye diseases, inflammatory diseases such as rheumatoid polyarthritis, and immunity. Arterial or venous malformation treatment and / or prevention of the disease.

【００４１】 上記治療適用の中から、本発明は特に、患者の中央神経系疾患の遺伝子治療法
において、全身経投与、好ましくは動脈投与するための医薬組成物であり、該組
成物に含まれる調製物の細胞が、神経疾患の治療又は予防において活性を有す物
質をコードする遺伝子を、少なくとも一つ移入したものであることを特徴とする
医薬組成物に関する。Among the above therapeutic applications, the present invention is especially a pharmaceutical composition for systemic administration, preferably arterial administration, in a gene therapy method for central nervous system disease of a patient, which is included in said composition The present invention relates to a pharmaceutical composition, characterized in that the cells of the preparation have been transferred with at least one gene encoding a substance having activity in treating or preventing a neurological disease.

【００４２】 中央神経系疾患とは、中央神経系そのもの、眼球、特に網膜、及び中央神経系
を構成する又は灌注する血管を示す。中央神経系疾患の例としては、脳腫瘍、脳
梗塞、前記同様の神経変性疾患、動脈瘤又は単なる静脈瘤等の動静脈奇形又は単
なる動脈奇形、眼疾患、特に網膜変性疾患が挙げられる。Central nervous system disease refers to the central nervous system itself, the eyeballs, especially the retina, and the blood vessels that make up or irrigate the central nervous system. Examples of central nervous system diseases include brain tumors, cerebral infarction, neurodegenerative diseases as described above, arteriovenous malformations or simple arterial malformations such as aneurysms or simple varicose veins, eye diseases, especially retinal degenerative diseases.

【００４３】 従って、本発明の組成物の細胞は、以下の病状の治療及び／又は予防において
活性を有す物質をコードする遺伝子を移入したものである。Therefore, the cells of the composition of the present invention are those into which a gene encoding a substance having activity in the treatment and / or prevention of the following pathologies has been transferred.

【００４４】 細胞に移入した遺伝子によりコードされる物質は、直接又は間接的に活性化、
即ち： - 第一の物質或いはそれをコードする遺伝子と相互作用する第二の物質を患者
に投与すること、又は - エネルギー源に曝露すること、又は - 自然に生体内に存在する物質により変形することを、 治療効果を実施する為に必要とするものでも良い。The substance encoded by the gene transferred to the cell can be directly or indirectly activated,
That is:-administering to the patient a first substance or a second substance that interacts with the gene encoding it, or-exposing to an energy source, or-being deformed by substances naturally present in the body. This may be what is needed to achieve a therapeutic effect.

【００４５】 物質及び遺伝子は、特に次の中から選ばれるものが挙げられる：成長因子、抗
アポトーシス剤、キラー遺伝子、抗蛋白分解酵素、免疫調整剤、腫瘍抑制剤、細
胞周期を遮断する遺伝子、又は当業者に既知の中央神経系疾患の予防又は治療に
有用な、いかなる遺伝子又は活性物質。Substances and genes include, in particular, those selected from the following: growth factors, antiapoptotic agents, killer genes, antiprotease, immunomodulators, tumor suppressors, cell cycle blocking genes, Or any gene or active substance useful for the prevention or treatment of central nervous system diseases known to those skilled in the art.

【００４６】 中央神経系疾患の治療に有用な本発明の組成物は、例えば、細胞を治療する患
者の体重1キログラム当り100万〜2億個投与できるように用量調節してある。Compositions of the invention useful for treating central nervous system disorders are, for example, dose-adjusted to allow administration of 1 to 200 million per kilogram of body weight of the patient whose cells are to be treated.

【００４７】 本発明では特に、この中央神経系での適用において、好ましくは不死化した脳
内皮細胞を考慮している。The present invention particularly contemplates preferably immortalized brain endothelial cells in this central nervous system application.

【００４８】 実際に、中央神経系の限られた領域における障害に起因する神経欠損に適用す
る遺伝子変更細胞の脳内移植による遺伝子治療が知られている。この治療法では
、小さい移植体が量の治療分子を生成することにより、正常な機能を回復させる
ことが可能である。脳実質内での直接的な機械的直移植により、届く範囲よりも
幅広い領域を対象とするには、全身経路による注射が最適と思われる。即ち、血
路は従来の治療物質の投与経路であり、最も幅広い生体分布を可能とする。この
注射のアプローチを細胞遺伝子治療に拡張するためには、脳内皮細胞が現在最適
の手段と思われる。Indeed, gene therapy by intracerebral transplantation of genetically modified cells for neurological deficits caused by disorders in a limited area of the central nervous system is known. In this therapy, small implants can restore normal function by producing large amounts of therapeutic molecules. Injection by the systemic route may be optimal for targeting an area wider than reach by direct mechanical direct transplantation in the brain parenchyma. That is, the blood passage is the conventional route of administration of therapeutic substances and allows the broadest biodistribution. To extend this injection approach to cellular gene therapy, brain endothelial cells currently appear to be the optimal means.

【００４９】 しかしながら、中央神経の遺伝子治療は、中央神経を構成する各種細胞の型数
、そして特にそれらの結合の数及び複雑性という一部の問題に衝突する。更に、
中央神経系の特徴である血液脳関門の存在により、中央神経系の治療において、
脳に到達することが困難であり、新しい治療物質の開発が複雑になり、従ってこ
れらの物質の使用が頭蓋内注射及び眼内注射に制限されている。However, gene therapy of central nerves conflicts with some issues of the number of types of various cells that make up the central nerve, and in particular the number and complexity of their connections. Furthermore,
In the treatment of the central nervous system, due to the presence of the blood-brain barrier,
Difficulties in reaching the brain complicate the development of new therapeutic substances, thus limiting their use to intracranial and intraocular injections.

【００５０】 出願者は、脳内皮細胞が中央神経系の遺伝子治療において、優れた運搬体とし
ての可能性を有することを明らかにした。即ち、血管網を構成している脳内皮細
胞は、血液と脳実質の境目に存在し、中央神経系の特徴である血液脳関門を形成
している。更に、脳内移植後、これらの脳内皮細胞が中央神経系にて生存し、植
込まれる能力があることが解明された（Quinoneroら、Gene therapy、1997、4、
111-119）。The applicant has shown that brain endothelial cells have potential as excellent carriers in gene therapy of the central nervous system. That is, the brain endothelial cells constituting the vascular network exist at the boundary between blood and the brain parenchyma, and form the blood-brain barrier which is a characteristic of the central nervous system. Furthermore, after intracerebral transplantation, it was revealed that these brain endothelial cells survive in the central nervous system and are capable of being implanted (Quinonero et al., Gene therapy, 1997, 4,
111-119).

【００５１】 本発明に関する研究は、異なった３つの技法、ビスベンズイミド染色及びレポ
ーター遺伝子（ベータガラクトシダーゼ及びGFP）により、内皮細胞が、一方で
は血管と統合し、他方では血管の管空外で実質内にて生存できることを解明した
。即ちこれらの結果は、脳内にて移入遺伝子を発現できることを示す。本発明の
組成物の治療潜在性は、特に中央神経系疾患を目的とする。特にこのアプローチ
の対象となる疾患は、脳腫瘍及び脳梗塞である。神経変性疾患特にパーキンソン
病、アルツハイマー病、ハンチントン病も対象になる。Research on the present invention has shown that three different techniques, bisbenzimide staining and reporter genes (beta-galactosidase and GFP), allow endothelial cells to integrate with blood vessels on the one hand and into the parenchyma outside the blood vessels of the blood vessel on the other hand. I found out that I could survive. That is, these results indicate that the transgene can be expressed in the brain. The therapeutic potential of the compositions of the present invention is particularly aimed at central nervous system disorders. Diseases specifically targeted by this approach are brain tumors and cerebral infarcts. Neurodegenerative diseases, particularly Parkinson's disease, Alzheimer's disease and Huntington's disease are also of interest.

【００５２】 従って本発明は、特に、場合によっては活性物質をコードする遺伝子を移入し
た不死化脳内皮細胞の、十分な量の該細胞を患者に動脈投与（頚動脈投与）する
ことにより、中央神経系に該活性物質を送達する中央神経系疾患の遺伝子治療に
よる治療又は予防用の医薬調製での使用を目的とする。The present invention is thus particularly directed to the administration of a sufficient amount of immortalized brain endothelial cells, optionally transfected with a gene encoding an active substance, to a patient by arterial administration (carotid administration) to the central nervous system. It is intended for use in the preparation of a medicament for treating or preventing central nervous system disease by gene therapy, which delivers the active substance to the system.

【００５３】 I 資料及び方法 次の3つの細胞株を使用した：親株であるRBE4、及びRBE4由来の株であるRBEZ
株及びRBE4/GFP株。RBEZ株及びRBE4/GFP株は国際特許出願WO96/11278号に記述さ
れてある。[0053]I Materials and Methods  Three cell lines were used: RBE4, the parent strain, and RBEZ, a strain derived from RBE4.
Strain and RBE4 / GFP strain. The RBEZ and RBE4 / GFP strains are described in International Patent Application WO 96/11278.
There is.

【００５４】 アデノウィルス2型のE1A配列を含む不死化プラスミドを、初代培養のルイスラ
ット脳内皮細胞に移入して、RBE4株を得た。RBE4細胞及びRBE4由来の細胞の培養
条件は、既に記述されてある（Durieu-Trautmannら、Frontiers in CVB、1993、
331：205-210）。The immortalized plasmid containing the E1A sequence of adenovirus type 2 was transferred into primary cultured Lewis rat brain endothelial cells to obtain the RBE4 strain. Culture conditions for RBE4 cells and cells derived from RBE4 have been described previously (Durieu-Trautmann et al., Frontiers in CVB, 1993,
331: 205-210).

【００５５】 RBE4細胞を、核局在配列（nls）に結合したE. coliのベータガラクトシダーゼ
をコードするLacZ遺伝子を含有する非複製的MFG-NBレトロウィルスベクターと接
触させて、RBEZ細胞を得た（Lalら、PNAS、1944、91：9695-9699）。次に、RBEZ
細胞をベータガラクトシダーゼの蛍光基質であるフルオロセイン・ジ・ベータガ
ラクトピラノシドを用いて、FACS法（fluorescent-activted cell sorting）に
より選択した（Lalら、PNAS、1944、91：9695-9699）。[0055] RBE4 cells were contacted with a non-replicating MFG-NB retroviral vector containing a LacZ gene encoding E. coli beta-galactosidase linked to a nuclear localization sequence (nls) to obtain RBEZ cells. (Lal et al., PNAS, 1944, 91: 9695-9699). Next, RBEZ
Cells were selected by FACS (fluorescent-activted cell sorting) using fluorescein di-beta-galactopyranoside, a fluorescent substrate for beta-galactosidase (Lal et al., PNAS, 1944, 91: 9695-9699).

【００５６】 ユビキチン・プロモータの制御下のGFP配列を含有する構成物をRBE4細胞に移
入し、GFP（Green Fluorescent Protein）を発現するRBE4/GFP株を得た。The construct containing the GFP sequence under the control of the ubiquitin promoter was transferred to RBE4 cells to obtain an RBE4 / GFP strain expressing GFP (Green Fluorescent Protein).

【００５７】 II 細胞の調製及び標識化 培養中の細胞は、トリプシンにより分離し、数回濯ぎ、1マイクロリットル当
り細胞30万の初期濃度で溶液にて懸濁した。希釈液は、カルシウム及びマグネシ
ウムを含んだグルコース（10 mMol）含有PBS、又はカルシウムもマグネシウムも
含まないグルコース含有PBS。注射には、様々な濃度の細胞を使用した。これら
の細胞の最終濃度は1ミクロリットル当り1万〜30万の細胞であった。注射した全
体積は500〜1000ミクロリットルであった。[0057]II Cell preparation and labeling  Cells in culture are separated with trypsin, rinsed several times, and
Cells were suspended in the solution at an initial concentration of 300,000. Diluents include calcium and magnesium
PBS containing calcium (10 mMol) containing calcium or magnesium or calcium
PBS without glucose. Various concentrations of cells were used for injection. these
The final concentration of cells was 10,000 to 300,000 cells per microliter. All injected
The volume was between 500 and 1000 microliters.

【００５８】 培養中のRBE4細胞を、予め7.5 mg/mlのビスベンズイミド（Hoechst 33342、シ
グマ社）で15分間、37℃で標識化した。この核染色剤は、蛍光顕微鏡の紫外線下
青色に蛍光するものである。The RBE4 cells in the culture were previously labeled with 7.5 mg / ml bisbenzimide (Hoechst 33342, Sigma) at 37 ° C. for 15 minutes. This nuclear stain fluoresces blue under the ultraviolet light of a fluorescence microscope.

【００５９】 III 細胞ろ過 場合によっては、最終溶液は30ミクロンの篩用フィルター（篩用ナイロンフィ
ルター#87404 NY 30 HC、ポリラボ社）で、次の手順に従ってろ過した：初期濃
度の細胞を希釈液に入れ希釈するために、P200ピペットの黄色チップを用いて吸
引した。次に細胞は、P1000ピペット及び相当する青色チップの使用により、調
製物を多数のピペット操作で処理することで希釈し、緩やかに解離した。次に細
胞の懸濁液を18ゲージのピンク色注射針を備えた1 mlの注射器により吸引した。
30ミクロンのフィルターは予め無菌生理食塩水で浸しておき、100度のアルコー
ルで殺菌し、空気乾燥し、無菌生理食塩水で再度浸した。次にフィルターは、注
射針と細胞を含有する注射器の先端の間に配置する。ピストンは、希釈した細胞
の流動が一滴ずつになるように注意深く押される。ピストンの押し込みが困難で
ある場合、フィルターを交換する。この交換作業は1 ml当り2回まで可能である
。細胞の生存率は、ろ過前及びろ過後に、トリパンブルーによる染色後、Malass
ez式セルで読み取り、測定した。[0059]III Cell filtration  In some cases, the final solution may be a 30 micron sieve filter (a sieve nylon filter).
(Luter # 87404 NY 30 HC, Polylab) according to the following procedure: initial concentration
Use the yellow tip of a P200 pipette to aspirate the cells in the diluent.
I pulled. The cells are then prepared using a P1000 pipette and the corresponding blue tip.
The product was diluted by multiple pipetting and slowly dissociated. Next
The vesicle suspension was aspirated with a 1 ml syringe equipped with an 18 gauge pink needle.
Pre-soak the 30-micron filter with sterile physiological saline, and
Sterilized, air-dried and re-soaked in sterile saline. Then filter
It is located between the shooting needle and the tip of the syringe containing the cells. The piston is the diluted cells
Is carefully pushed so that the flow is drop by drop. It is difficult to push the piston
If so, replace the filter. This exchange can be done up to 2 times per ml
. Cell viability was measured before and after filtration, after staining with trypan blue, Malass
It was read and measured with an ez-type cell.

【００６０】 IV 頚動脈注射 揮発性吸入麻酔薬（イソフルラン）含有の酸素と亜酸化窒素の混合ガスにより
体重平均300gの成人雄ルイスラット（Iffa-Credo）に麻酔をかけた。イソフルラ
ン5％による誘導後、通常30〜40分かかる手術の間1％の濃度を保持した。皮膚及
び皮下切開は単極の電気メスを用いて行った。次に筋肉組織を開いて総頚動脈の
左側に頚動脈枝、外頚動脈及び内頚動脈を十分に露出した。注意深く頚動脈枝を
切開した後、外頚動脈の側副枝を2極式熱凝固装置を用いて焼灼した。更に外頚
動脈の頭部側末端を熱凝固処理し、出来るだけ長いカテーテル処置可能の断端を
得た。次に、予め希釈したへパリンに浸けた血管用クリップ（動静脈奇形用のSU
NDT型）を外頚動脈上、頚動脈枝近接に配置する。動脈循環から除かれた断端の
カテーテル処置は、予め希釈したへパリンで洗浄した小翼付きビアロン（Vialon
）製カテーテルを用いて行う。カテーテルと断端を一体化する為に、カテーテル
周辺の動脈の縁に強力接着剤（Loctite）を一滴着ける。クリップを開くことに
より、動脈血液をカテーテル内に逆流させ、場合により生じた凝血を排出させる
。細胞を含めた注射器をカテーテルの開口に設置する為に、再度血流を遮断する
。次に血流を再現させ、手動で、又は総頚動脈からの血液とカテーテルからの溶
液の液流が平衡になるようにその速度を予め調節した注射器用電動ポンプで注射
する。注射は手術用ルーペ（Leica）で確認しながら行う。注射終了後、総頚動
脈及び内頚動脈の血流が確実に保持されていることを確認しながら断端を焼灼す
る。参考動物は上記同様の手術を受けたが、細胞培養の希釈用緩衝液のみ、即ち
細胞を含まないものを注射した。[0060]IV carotid artery injection  With a mixed gas of oxygen and nitrous oxide containing volatile inhalation anesthetic (isoflurane)
Adult male Lewis rats (Iffa-Credo) weighing an average of 300 g were anesthetized. Isoflura
After induction with 5%, the concentration of 1% was maintained during the operation, which usually took 30-40 minutes. Skin
Subcutaneous incision was performed using a monopolar electric scalpel. Next, open the muscle tissue
On the left side, the carotid artery, external carotid artery and internal carotid artery were fully exposed. Carefully remove the carotid branch
After the incision, the collaterals of the external carotid artery were cauterized using a bipolar thermocoagulator. Further outer cervix
Heat-coagulate the head end of the artery to create a catheter-friendly stump as long as possible.
Obtained. Next, a blood vessel clip (SU for arteriovenous malformation) soaked in pre-diluted heparin
NDT type) is placed on the external carotid artery near the carotid branch. Of the stump removed from the arterial circulation
Catheterization was performed using pre-diluted heparin-washed winged Vialon (Vialon
) Using a catheter. In order to integrate the catheter and the stump, the catheter
Apply a drop of strong glue (Loctite) to the edge of the surrounding artery. To open the clip
Better to allow arterial blood to flow back into the catheter and drain out any clots that may have formed
. Block blood flow again to place a syringe containing cells at the catheter opening
. The blood flow is then recreated and the blood from the common carotid artery and the catheter
Inject with an electric syringe pump whose speed has been adjusted in advance so that the liquid flow is balanced.
I do. Injections are made with a surgical loupe (Leica). After injection, total neck movement
Cauterize the stump while ensuring that the blood flow of the pulse and internal carotid artery is maintained
You. The reference animal underwent the same operation as above, but only the cell culture dilution buffer, that is,
Injections without cells were injected.

【００６１】 V 画像による組織の研究 ラットの一部では、7テスラの装置（Varian装置）による脳MRI、更には分光分
析を行った。大脳全部の1 mmの連続冠状断面、及び前大脳（嗅球を除く端脳及び
間脳）を中心とした500ミクロンの連続冠状断面でMRI画像を作成した。大半の場
合、T2により加重したシーケンスを用いた。まれに24時間以前にMRIを実行した
場合には、T2のシーケンスでは観られない可能性がある傷害を確認するために、
拡散シーケンスを追加した。MRIにより、脳に実質的な異常が観られなかった場
合、分光法により、同じ動物において右左の分光プロフィールを比較した。[0061]V Study of organization by image  In some rats, brain MRI using a 7 Tesla device (Varian device) and spectroscopy
The analysis was performed. 1 mm continuous coronal section of the entire cerebrum and the anterior cerebrum
An MRI image was created using a continuous coronal section of 500 microns centered on the diencephalon. Most places
In this case, a sequence weighted by T2 was used. Rarely performed MRI 24 hours ago
In some cases, to identify injuries that might not be seen in the T2 sequence,
Added spreading sequence. If no substantial abnormalities were observed in the brain by MRI
In this case, the right and left spectral profiles were compared in the same animal by spectroscopy.

【００６２】 VI 組織的研究 注射後それぞれの時間を置いて動物を屠殺した。即時に屠殺した場合、各種臓
器（脳、心臓、肝臓、腎臓、眼球、脾臓、精巣、左頚動脈）を採取し、液体窒素
により冷却されたイソペンタン内で即時に凍結した。時間を置いて屠殺した動物
の場合は、まずPBS 100 mlで、続いて4% PFA 500 mlで、経心臓の潅流をした。
採取した脳は、2〜4時間4% PFA内で後固定し、48時間ショ糖（20〜30％）内で凍
結保護した。その後、脳はイソペンタン内で凍結した。全ての組織は、スライド
に固定された厚さ30ミクロン（全臓器）の切片、又は厚さ40ミクロン（脳）の浮
遊切片を得るためにクリオスタットで薄切した。次に、RBEZ細胞を使用した場合
、浮遊切片はWeisらにより記述された技法（1991）に従い、X-galを含有する溶
液で3時間半インキュベートした。参考組織は常に同時に処理した。[0062]VI Organizational research  Animals were sacrificed at various times after injection. If slaughtered immediately, various offal
Organs (brain, heart, liver, kidney, eyeball, spleen, testis, left carotid artery)
And immediately frozen in isopentane. Animals slaughtered after a while
In the case of (1), transcardiac perfusion was first performed with 100 ml of PBS, followed by 500 ml of 4% PFA.
The collected brain is post-fixed in 4% PFA for 2-4 hours and frozen in sucrose (20-30%) for 48 hours.
Protected. Thereafter, the brain was frozen in isopentane. All tissues are slides
30 micron thick (all organs) section fixed on a plate or 40 micron thick (brain)
The sections were cut with a cryostat to obtain free sections. Next, when using RBEZ cells
Suspended sections were prepared according to the technique described by Weis et al.
The solution was incubated for 3.5 hours. The reference organization was always processed at the same time.

【００６３】 VII 結果 48匹のラットを手術、注射の対象とした。9匹が手動の注射を受け、39匹が、
発明者がデザインした携帯電気モーターによる低速で安定した注射を受けた。最
初の手術では、総頚動脈及び内頚動脈での注射において、血栓症の非存在が認め
られた。[0063]VII results  Forty-eight rats were subjected to surgery and injection. 9 received manual injections and 39
Received a slow and stable injection by a portable electric motor designed by the inventor. Most
In the first operation, thrombosis was absent in injections into the common and internal carotid arteries
Was done.

【００６４】 1) 死亡率 7匹のラットが早期死亡し、その内5匹が注射後数分で死亡し、呼吸混乱らしき
問題（n＝3）、痙攣を含めた神経障害（n＝1）が観られ、又は一見確かな原因が
観られなかった（n＝1）。全ての場合、これらの死亡はフィルターの使用前に発
生したものである。ラット7匹中6匹に注射した投与量は細胞5千万個であった。
参考群で死亡は全く認められなかった。[0064]1) Mortality  Seven rats died prematurely, five of which died within minutes after injection, causing respiratory confusion.
Problems (n = 3), neuropathy including convulsions (n = 1), or apparent cause
Not observed (n = 1). In all cases, these deaths occur prior to use of the filter.
It was born. The dose injected into six of the seven rats was 50 million cells.
No death was observed in the reference group.

【００６５】 2）組織的有毒効果 a）MRI及び分光法 遺伝子変更した内皮細胞の頚動脈注射による組織傷害を研究するために脳MRI
及び分光学的研究を行った。付録の図1及び図2に示す脳MRIは形態的データをを
提供し、分光法は化学的データを提供する。分光法は特にMRIが正常であった場
合に実行した。20件のMRI（ラット第17号、第18号、第20号、第22号、第23号、
第24号、第25号、第26号、第27号、第29号、第30号（2回）、第31号、第32号、
第33号、第34号、第35号、第37号、第38号、第39号）及び6件の分光を行った。
これらは参考動物では常に正常であった（n＝3）。[0065]2) Systematic toxic effects a) MRI and spectroscopy  Brain MRI to study tissue injury due to carotid artery injection of genetically modified endothelial cells
And spectroscopic studies. Brain MRI shown in Figures 1 and 2 in the Appendix
Provide and spectroscopy provide chemical data. Spectroscopy is especially useful when MRI is normal.
It was executed when. 20 MRIs (Rat No. 17, No. 18, No. 20, No. 22, No. 23,
No. 24, No. 25, No. 26, No. 27, No. 29, No. 30 (twice), No. 31, No. 32,
No. 33, No. 34, No. 35, No. 37, No. 38, No. 39) and six spectroscopy were performed.
These were always normal in the reference animals (n = 3).

【００６６】 図1の写真には、T2により加重したシーケンスの1 mmの連続MRI冠状断面が観れ
る。A、B、C：非ろ過RBEZ細胞２千５百万個注射；D、E、F：ろ過済みRBEZ細胞２
千５百万個注射。A、B、Cでは：注射と同側の皮質及び左被殻にて高シグナルが
観られ、これは脳梗塞の徴候である；左右の側脳室（高シグナルが傷害のものよ
りも強度かつ均一である）が膨張している；更に傷害は、中線の移動を含める質
量効果を引き起している。D、E、Fでは実質の高シグナル、脳室の膨張及び質量
効果の非存在が観られる。The photograph of FIG. 1 shows a 1 mm continuous MRI coronal section of the sequence weighted by T2. A, B, C: Injection of 25 million unfiltered RBEZ cells; D, E, F: Filtered RBEZ cells 2
15 million injections. In A, B, and C: high signals are seen in the cortex and left putamen ipsilateral to the injection, which is a sign of cerebral infarction; left and right lateral ventricles (high signals are more intense than injured ones). In addition, the injury is causing mass effects, including movement of the midline. D, E, F show substantial high signal, ventricular dilatation and absence of mass effect.

【００６７】 図2では、予めビスベンズイミドで標識化し、紫外線内での放射による落射蛍
光法で視覚化したRBE4細胞の認識を可能とする脳の組織的冠状断面が観られる。
A〜Dは、頚動脈注射数分後の脳実質の観察である。F、Gは7日後の観察である。B
及びCにおける矢印は、標識化した細胞を脳内微細血管において識別するもので
ある。標識化した細胞の脈絡叢内の存在をEにおいて示す。Fにおける矢印は、ポ
ジティブ細胞を発現する血管を示すものである。Gにおける矢印は、脈絡叢内の
標識化細胞を示す。FIG. 2 shows a tissue coronal section of the brain, which is pre-labeled with bisbenzimide and allows recognition of RBE4 cells visualized by epi-fluorescence with emission in ultraviolet light.
AD are observations of brain parenchyma several minutes after carotid artery injection. F and G are observations after 7 days. B
Arrows in C and C identify labeled cells in brain microvessels. The presence of labeled cells in the choroid plexus is indicated at E. Arrows in F indicate blood vessels expressing positive cells. Arrows in G indicate labeled cells within the choroid plexus.

【００６８】 2匹のラットにおいて、MRIを細胞の注射後約15時間後に行い、この内一匹の場
合、実質的変化を確実に可視化するために、T2シーケンスの他に拡散シーケンス
を行った。他の場合、MRIは注射後4〜7日後に行った。ろ過の手順前は13件のMRI
、その後は7件のMRIを行った。ろ過前は、千万個の細胞を注射したラット（n＝3
）では、MRI及び分光により実質的傷害は検出されなかったが、3匹中2匹におい
ても、注射した頚動脈に相当する左側の脳室に膨張が観られた。２千５百万個の
細胞を注射したラット（n＝4）においては、3匹に脳室膨張が観られたが、実質
の異常は無く、ラットの一匹は実質の高シグナルを示した。In two rats, MRI was performed about 15 hours after injection of the cells, one of which underwent a diffusion sequence in addition to the T2 sequence to ensure visualization of substantial changes. In other cases, MRI was performed 4-7 days after injection. 13 MRIs before the filtration procedure
, Followed by seven MRIs. Before filtration, rats injected with 10 million cells (n = 3
In (2), no substantial injury was detected by MRI and spectroscopy, but in 2 out of 3 animals, dilatation was observed in the left ventricle corresponding to the injected carotid artery. In rats injected with 25 million cells (n = 4), 3 had ventricular dilatation, but no parenchymal abnormalities, and one rat showed a substantially high signal. .

【００６９】 ろ過の手順を適用した後では、２千５百万個の細胞を注射したラット（n＝2）
の脳には実質的高シグナルは観られなかったが、一匹においては脳室の膨張が認
められた。5千百万個の細胞を注射したラット（n＝4）中、一匹のみの脳に左皮
質に高シグナルが観られた。しかしながらこのラットは、血液脳関門を開くため
に予めマンニトールによる処理を受けていた。残った3匹中別の１匹は、注射と
同側の脳室の膨張を示した。After applying the filtration procedure, rats injected with 25 million cells (n = 2)
Although no substantial high signal was observed in the brain of the mouse, ventricular dilation was observed in one animal. Among rats injected with 50 million cells (n = 4), only one brain showed a high signal in the left cortex in the brain. However, the rats had previously been treated with mannitol to open the blood-brain barrier. Another one of the remaining three exhibited ventricular distension ipsilateral to the injection.

【００７０】 b）注射を受けた組織の組織学 ろ過済みの細胞を注射した後、ニッスル色素（クレシルバイオレット）では、
確実な実質の傷害は示されなかった。反対に、ろ過前では、細胞の注射は組織的
異常を引き起こした。これらの異常は、一方では、脳における各種層の積層の領
域的損失と伴う細胞の損失、他方ではミクログリア及び星状細胞の炎症反応の徴
候である細胞過多であった。[0070]b) Histology of the injected tissue  After injection of the filtered cells, the Nissl dye (cresyl violet)
No solid real injury was shown. Conversely, prior to filtration, the injection of cells is systematic
Caused an anomaly. These abnormalities, on the one hand, can be attributed to the area of stacking of various layers in the brain.
Loss of cells with regional loss, on the other hand signs of inflammatory response of microglia and astrocytes
There were too many cells, which is the weather.

【００７１】 3）細胞の位置付け a）予めビスベンズイミドで標識化したRBE4細胞の同定 ビスベンズイミドで標識化したRBE4内皮細胞を注射した後、図3に示す如く、
細胞は脳内微細血管において明確に確認された。注射7日後、幾つかの細胞が未
だ血管と一体して観れるが、実質内においても同様である。[0071]3) Positioning of cells a) Identification of RBE4 cells previously labeled with bisbenzimide  After injection of RBE4 endothelial cells labeled with bisbenzimide, as shown in FIG. 3,
Cells were clearly identified in brain microvessels. 7 days after injection, some cells are not
It can be seen integrally with the blood vessels, but also in the parenchyma.

【００７２】 図3は、Aにおいて脳内血管の内腔と一体化したRBEZ細胞を示す。Bでは、実質
内かつ内腔外に位置されたRBEZを示す。C（Bの拡大）では血管の縁（黒矢印）に
注意すべきである。FIG. 3 shows the RBEZ cells integrated in A with the lumen of the intracerebral blood vessels. B shows a RBEZ located in the parenchyma and outside the lumen. At C (magnification of B), the edge of the blood vessel (black arrow) should be noted.

【００７３】 b）X-gal染色によるRBEZ細胞の同定 RBEZ細胞の全身移植は、注射7日後、血管と一体化した又は血管壁から距離を
置いた実質内にて、核が青色の細胞を認識することが可能である。X-gal標識の
核における配置は、核用染色であるビスベンズイミド（Hoechst）による切片の
標識化により確認した。標識が確かに核におけるものであった場合、Hoechstの
蛍光標識は、X-gal染色によりマスクされた。逆に、標識が細胞質におけるもの
であった場合、核における標識は確かに観察可能であり、マクロファージ細胞の
特徴である内因性ベータガラクトシダーゼの発現の徴候である。B)Identification of RBEZ cells by X-gal staining  For systemic transplantation of RBEZ cells, 7 days after injection, the RBEZ cells are integrated with the blood vessel or moved away from the blood vessel wall.
Within the placed parenchyma it is possible to recognize cells whose nucleus is blue. X-gal sign
The arrangement in the nucleus is based on the nuclear stain, bisbenzimide (Hoechst).
Confirmed by labeling. If the sign was indeed in the nucleus, Hoechst's
The fluorescent label was masked by X-gal staining. Conversely, if the label is in the cytoplasm
If so, labeling in the nucleus is indeed observable and macrophage cell
Characteristic signs of expression of endogenous beta-galactosidase.

【００７４】 c）落射蛍光法によるGFP細胞の同定 GFPを発現する細胞は、GFP内皮細胞の注射後、1、3、5日後に、緑色の蛍光染
色として観察可能であった。ビスベンズイミドによる核の対比染色 が裏付した
と同様に、GFPの緑色の標識は、細胞の細胞質及び核内両方において観察可能で
あった。2種類の形態の内皮細胞が観られた。一方は、単離した丸型の細胞であ
り血管内に位置した様子であるもの、他方は細長い細胞であり、実質内にて頻繁
に2個の群としたものである。[0074]c) Identification of GFP cells by epifluorescence  Cells expressing GFP were stained with green fluorescent dye 1, 3, and 5 days after injection of GFP endothelial cells.
It was observable as a color. Counterstaining of nuclei with bisbenzimide is supported
As with, green labeling of GFP is observable both in the cytoplasm and in the nucleus of the cell.
there were. Two types of endothelial cells were observed. One is an isolated round cell.
Appear to be located inside the blood vessel, while the other is an elongated cell,
And two groups.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

本発明の他の利点及び特徴は、以下の、活性物質をコードする遺伝子を移入し
た不死化脳内皮細胞、及びそれらを患者に動脈投与する中央神経系疾患の遺伝子
治療による治療の医薬調製での使用の例により明らかになる。これらの例は付録
の図面を参考とするものであり、Other advantages and features of the present invention include the following, in the preparation of a medicament for the treatment of central nervous system disease by gene therapy of immortalized brain endothelial cells transfected with a gene encoding an active substance and administering them to a patient. Clarification by example of use. These examples are based on the drawings in the appendix,

【図１】 内皮細胞の注射による実質傷害を表示する。FIG. 1 shows parenchymal injury due to endothelial cell injection.

【図２】 予め標識化したRBE4細胞の脳においての確認を表示する。FIG. 2 shows the confirmation of prelabeled RBE4 cells in the brain.

【図３】 X-Galによる核内ベータガラクトシダーゼの現像後のRBEZ細胞の脳においての
確認を表示する。FIG. 3 shows confirmation of RBEZ cells in the brain after development of nuclear beta-galactosidase by X-Gal.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｂａｔｉｍｅｎｔ Ｇｅｎｏｐｏｌｅ−Ｉ ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、４、ｒｕｅ Ｐｉｅ ｒｒｅ Ｆｏｎｔａｉｎｅ、Ｆ−91000 ＥＶＲＹ、Ｆｒａｎｃｅ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 CA02 DA02 DA03 GA11 HA17 4B065 AA90X AA93X AC20 CA24 CA44 4C084 AA13 CA25 CA53 CA56 MA66 NA10 ZA02 4C087 AA01 BB63 BB64 BB65 CA12 NA10 ZA02 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID , IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (71 ) Applicant Batiment Genopole-Industries, 4, rue Pierere Fontaine, F-91000 EVRY, France F term (reference) AA01 BB63 BB64 BB65 CA12 NA10 ZA02

Claims (16)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】任意に活性物質をコードする遺伝子が少なくとも一つ移入され
ており、患者への全身投与用の哺乳類細胞の調製物であって、一時的又は永続的
な機能障害を生じさせる可能性があるサイズの該細胞の凝集体を含有しないこと
を特徴とする哺乳類細胞の調製物。A preparation of mammalian cells for systemic administration to a patient, optionally with at least one gene encoding an active substance, wherein said preparation can cause temporary or permanent dysfunction. A preparation of mammalian cells, characterized in that they do not contain aggregates of said cells of sexual size. 【請求項２】サイズが約200ミクロン以上、好ましくは50ミクロン以上、更
に好ましくは30ミクロン以上の該細胞の凝集体を含有しないことを特徴とする請
求項1記載の哺乳類細胞の調製物。2. The preparation of mammalian cells according to claim 1, characterized in that they do not contain aggregates of said cells having a size of more than about 200 microns, preferably more than 50 microns, more preferably more than 30 microns. 【請求項３】該細胞が不死化細胞であることを特徴とする請求項１ないし請
求項2記載の哺乳類細胞の調製物。3. The preparation of a mammalian cell according to claim 1, wherein the cell is an immortalized cell. 【請求項４】細胞が非腫瘍形成性のものである請求項１ないし請求項3記載
のいずれかの哺乳類細胞の調製物。4. The preparation of a mammalian cell according to claim 1, wherein the cell is non-tumorigenic. 【請求項５】該細胞が哺乳類の内皮細胞及び上皮細胞を含む群から選ばれた
ものであることを特徴とする請求項１ないし請求項4記載のいずれかの哺乳類細
胞の調製物。5. The preparation according to claim 1, wherein said cells are selected from the group comprising mammalian endothelial cells and epithelial cells. 【請求項６】該細胞が脳細胞及び網膜細胞を含む群から選ばれたものである
ことを特徴とする請求項１ないし請求項5記載のいずれかの哺乳類細胞の調製物
。6. The preparation of a mammalian cell according to claim 1, wherein said cell is selected from the group comprising brain cells and retinal cells. 【請求項７】該細胞が、凝集体の形成を妨害する、又はサイズが約200ミク
ロン以上、好ましくは50ミクロン以上、特に好ましくは30ミクロン以上の該細胞
の凝集体を特異的に除去する、生物的、化学的又は物理的な細胞処理をして、そ
の後該細胞の生存を可能とし、再凝集を促進させない倍液で懸濁することを特徴
とする請求項１ないし請求項6記載のいずれかの哺乳類細胞の調製物。7. The method according to claim 6, wherein the cells interfere with the formation of aggregates or specifically remove aggregates of the cells having a size of about 200 microns or more, preferably 50 microns or more, particularly preferably 30 microns or more. 7. The method according to claim 1, wherein the cells are treated with a biological, chemical or physical treatment, and then suspended in a double solution that allows the cells to survive and does not promote reaggregation. Preparation of mammalian cells. 【請求項８】生物的処理が、凝集体の形成を妨害する物質を発現する、又は
該細胞の凝集を促進させる物質の発現を抑制する、核酸配列により該細胞を遺伝
子的に変更することから成ることを特徴とする請求項7記載の哺乳類細胞の調製
物。8. The method according to claim 1, wherein the biological treatment expresses a substance that interferes with the formation of aggregates, or suppresses the expression of a substance that promotes aggregation of the cells, or genetically alters the cells with a nucleic acid sequence. 8. The preparation of a mammalian cell according to claim 7, wherein the preparation comprises: 【請求項９】物理的処理が、ろ過又は篩分けから成ることを特徴とする請求
項7記載の哺乳類細胞の調製物。9. The preparation of mammalian cells according to claim 7, wherein the physical treatment comprises filtration or sieving. 【請求項１０】患者において全身投与用の医薬組成物であって、該組成物内
、医薬的に許容され、該細胞の生存を可能とし、これらの再凝集を促進させない
運搬体と結合された請求項１ないし請求項９記載のいずれかの哺乳類細胞の調製
物を含まれていることを特徴とする医薬組成物。10. A pharmaceutical composition for systemic administration in a patient, wherein the composition is combined with a pharmaceutically acceptable carrier which allows the cells to survive and does not promote their reaggregation within the composition. A pharmaceutical composition comprising the mammalian cell preparation according to any one of claims 1 to 9. 【請求項１１】患者において、動脈内経路、好ましくは頚動脈内経路で投与
用の組成物であって、サイズが50ミクロン以上、好ましくは30ミクロン以上の細
胞の凝集体を含まない細胞調製物を含むことを特徴とする請求項10記載の組成物
。11. A composition for administration in a patient by the intra-arterial route, preferably the intra-carotid route, wherein the cell preparation is free of aggregates of cells having a size of 50 microns or more, preferably 30 microns or more. 11. The composition according to claim 10, comprising: 【請求項１２】患者において静脈内経路での投与用の組成物であって、サイ
ズが200ミクロン以上、好ましくは100ミクロン以上の細胞凝集体を含まない細胞
調製物を含有することを特徴とする請求項10記載の組成物。12. A composition for intravenous administration in a patient, characterized in that it comprises a cell preparation free of cell aggregates having a size of more than 200 microns, preferably more than 100 microns. A composition according to claim 10. 【請求項１３】組成物1マイクロリットル当り約1千〜30万個の細胞を含むこ
とを特徴とする請求項１0ないし請求項12記載のいずれかの組成物。13. The composition according to claim 10, wherein the composition contains about 1,000 to 300,000 cells per microliter of the composition. 【請求項１４】患者の中央神経系疾患の遺伝子治療法において、全身経投与
用の医薬組成物であって、細胞が、神経疾患の治療又は予防において活性を有す
物質をコードする遺伝子を少なくとも一つ移入したものであることを特徴とする
請求項１0ないし請求項13記載のいずれかの医薬組成物。14. A method for gene therapy of a central nervous system disease in a patient, which is a pharmaceutical composition for systemic administration, wherein the cell contains at least a gene encoding a substance having an activity in treating or preventing a neurological disease. 14. The pharmaceutical composition according to any one of claims 10 to 13, wherein the composition has been transferred into one. 【請求項１５】中央神経系疾患の予防又は治療に有用な物質及び遺伝子が、
成長因子、抗アポトーシス剤、キラー遺伝子、抗蛋白分解酵素、免疫調整剤、腫
瘍抑制遺伝子、細胞周期を停止する遺伝子の中から選ばれることを特徴とする請
求項14に記載の組成物。15. A substance and a gene useful for prevention or treatment of a central nervous system disease,
15. The composition according to claim 14, wherein the composition is selected from a growth factor, an anti-apoptotic agent, a killer gene, an antiprotease, an immunomodulator, a tumor suppressor gene, and a cell cycle arrest gene. 【請求項１６】活性物質をコードする遺伝子が、少なくとも一つ移入されて
ある哺乳類の不死化細胞を、治療する患者の体重1キログラム当り100万〜2億個
を投与できるように用量調節してあることを特徴とする請求項１4ないし請求項1
5記載のいずれかの組成物。16. Immortalized mammalian cells into which at least one gene encoding the active substance has been transferred are dose-adjusted so that 1 to 200 million can be administered per kilogram of body weight of the patient to be treated. Claims 14 to 1 characterized in that
5. The composition according to any one of claims 5