JP2002531414A - 卵胞発生の改善 - Google Patents

卵胞発生の改善

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JP2002531414A JP2000584913A JP2000584913A JP2002531414A JP 2002531414 A JP2002531414 A JP 2002531414A JP 2000584913 A JP2000584913 A JP 2000584913A JP 2000584913 A JP2000584913 A JP 2000584913A JP 2002531414 A JP2002531414 A JP 2002531414A
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follicle
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oocytes
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フアン・ダイン，マルセル
ロセ，ウルスラ・マリア
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アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は補助生殖におけるＧＤＦ−９の使用およびＧＤＦ−９を含んでなるキットに関する。方法により卵胞ならびに卵母細胞の発達および成熟が刺激される。方法はＧＤＦ−９をゴナドトロピンと組合わせて投与することからなる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は補助生殖における成長分化因子−９（ＧＤＦ−９）の使用およびＧＤ
Ｆ−９を含んでなるキットに関する。
【０００２】 生殖は受精可能な１個の健常な（高品質の）卵母細胞を***できる卵胞の成長
および選別に関係する。続いて受精した卵母細胞は胚に発達し、受容される子宮
内膜に着床し、胎児に、最終的には健常な乳児に成長する。しかしながら、生殖
能力に問題があるカップルが子供を得るためには処置を行う必要がある。現在、
二つの主要な処置プログラム：女性が無***性サイクルに起因する不妊であるカ
ップルには***誘発（ＯＩ）、および女性または男性のいずれかに生殖能力の問
題があるカップルには体外受精（ＩＶＦ）を利用することができる。ＯＩプロト
コルの場合、単一の卵胞の成長および自然に受精できる１個の卵母細胞の***を
誘起するために低用量のゴナドトロピンを投与する。ＩＶＦの場合、複数の卵胞
を発達させるために比較的高量のゴナドトロピンを投与する。複数の卵胞の成長
を誘導した後、黄体形成ホルモン（ＬＨ）／ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ
）で卵母細胞の成熟を誘起し、卵胞穿刺により成熟卵母細胞を回収する。体外受
精およびインビトロ初期胚分割の後、２ないし３個の胚を子宮に移す。
【０００３】 両方の処置において、単一または複数の卵胞を発達させるためにゴナドトロピ
ン投与を個々の患者に適用しなければならない。これは非常に困難であり、成功
は保証されない。さらに多くの因子、とりわけ卵母細胞の品質および子宮内膜の
受容性に起因して、最終的な妊娠率は比較的低い（〜２０％）。成功率が比較的
低い原因は卵胞発生および卵子発生を誘起する方法にあるかもしれない。
【０００４】 自然な月経周期の間にゴナドトロピンＦＳＨおよびＬＨは卵胞および卵母細胞
の発達を誘起する。最も一般的であるのはまたＦＳＨにより調節される選別によ
り、成長している卵胞プールからの１個の卵胞のみが優勢になり、最終的に***
時に健常な受精可能な卵母細胞を放出する。その他の卵胞は退縮性であり***さ
れずに退化する。
【０００５】 最適な卵胞および卵母細胞の発達にはゴナドトロピンのみならず、成長因子も
必要であることは周知である。ＧＤＦ−９はかかる成長因子である。そのヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列はＩｎｃｅｒｔｉら、（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ，１２２２：１２５−１２８（１９９４））およびＭｃＧｒａｔ
ｈら（Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．，９：１３１−１３６（１９９５））に記載されてい
る。ＧＤＦ−９ノックアウトマウスではＧＤＦ−９欠乏のために初期段階で卵胞
の発達が停止する（Ｄｏｎｇら（１９９６））。さらにＧＤＦ−９は初期段階か
ら充分成長した***前段階の卵胞までの卵胞（より具体的には卵母細胞）に存在
することが示されている（ＭｃＧｒａｔｈら（１９９５））。これらの結果はＧ
ＤＦ−９が正常な卵胞および卵母細胞の発達に関与していることを示している。
【０００６】 選別メカニズムにより、原始プールに残った卵胞群から１個の卵胞のみが***
前段階に到達する、すなわち優勢な卵胞であり、健常で受精可能な卵母細胞を提
供する。その他のものは退縮性であり退化する。優勢な卵胞の選別を調節するメ
カニズムは充分には理解されていないが、ＦＳＨに最も感受性の高い卵胞が優勢
になる卵胞であるという仮説がある。
【０００７】 このように卵胞の成長は例えばＩＧＦ−１、ＧＤＦ−９により、後にはゴナド
トロピンＦＳＨおよびＬＨにより、並びにエストロゲンにより調節されている。
成長の間にいくつかの段階：初期段階、胞状前および胞状段階、並びに最終的な
***前段階が決定されている。
【０００８】 不妊処置プロトコルと自然な受胎との主要な差異は関係する卵胞および卵母細
胞の数である。
【０００９】 補助生殖技術（Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ：ＡＲＴ）処置では、受精し着床胚に発達する１個の健常な卵母細胞を
***させる選別メカニズムは比較的高用量のゴナドトロピン（主にＦＳＨ）の投
与により支配される。このプロトコルでは多くの卵胞および卵母細胞が成長し、
最終的にこれらの卵胞から多くの卵母細胞が得られる。しかしながら、ＬＨ／Ｃ
Ｇで卵母細胞の成熟が誘起されるが、回収時に全ての卵母細胞が実際に成熟して
いるわけではないか、または卵母細胞は成熟しているが、適切に発達しない。続
いてインビトロで卵母細胞の成熟を誘起できる場合もあるが、このインビトロ成
熟方法では成功が限定的である。結果的に、実際に子宮内膜に着床する胚にまで
発達するのは卵胞から得られた全卵母細胞のうち相対的に極低率である。これに
よりＡＲＴ成功率が相対的に低くなる。
【００１０】 本発明はＧＤＦ−９をゴナドトロピンと組合わせて投与することにより卵胞お
よび卵母細胞の発達および成熟の刺激を改善する。これにより受精率、分割およ
び着床能力がより高い高品質の卵母細胞を回収できるようになり、最終的にＡＲ
Ｔ成功率が高くなる。このように、本発明によりＧＤＦ−９を治療に使用できる
。とりわけＧＤＦ−９を補助生殖に使用できる。
【００１１】 このように、ＧＤＦ−９の投与により、アポプトシスに至るように予定されて
いない、より小型の卵胞が成長プールに入るように選別され、健常な***前期の
卵胞に成長する。加えて成長している卵胞がＧＤＦ−９により救われ、高品質の
卵母細胞を有する充分に成長した卵胞にまで発達し、最終的に成功するすなわち
妊娠に至る率を高める。
【００１２】 成長因子ＧＤＦ−９およびゴナドトロピンの組合わせにより卵胞の成長が誘起
され、卵胞がより自然に発達し、それと共に卵母細胞の品質および最終的な成功
率が改善される。
【００１３】 本発明によれば、ＧＤＦ−９を女性患者に投与して卵胞および卵母細胞の発達
および成熟を改善することができる。既存の卵巣刺激および体外受精のための処
置プロトコルに投与を含めることができる。別法として、ＧＤＦ−９の存在下、
好ましくはＦＳＨに加えて、適当な培養培地中インビトロでインキュベートする
ことにより、単離された卵胞および／または卵母細胞を発達させるためにＧＤＦ
−９を用いることもできる。
【００１４】 真核宿主細胞中組換えＤＮＡ技術によりＧＤＦ−９を調製するのが好ましい。
ＧＤＦ−９をコードするＤＮＡを単離し、特徴づけし、適当なベクター系の調製
に用いることができる。ＧＤＦ−９は哺乳動物由来のＤＮＡ、より好ましくはヒ
トＤＮＡによりコードされるのが好ましい。
【００１５】 ある種のＧＤＦ−９のヌクレオチド酸配列をプローブとして、または別の種の
完全遺伝子の単離および同定を可能にするＤＮＡ増幅反応におけるプライマーと
して用いられる合成オリゴヌクレオチドを調製するための供給源として用いるこ
とができる。その配列情報を用いて周知の方法で別の供給源からのｃＤＮＡまた
はゲノムＤＮＡから完全遺伝子を誘導するか、または合成することができる。
【００１６】 ゴナドトロピンに属すると理解されているＦＳＨはヒト供給源例えば月経閉止
期の尿から単離される。別法では、真核宿主細胞で生成することにより組換えＦ
ＳＨを調製できる。さらに現行の補助生殖プロトコル処置のようにＬＨまたはｈ
ＣＧの投与により成熟を誘導できる。しかしながら、その上ＧｎＲＨアンタゴニ
ストおよび／またはアゴニストなどの変種をも用いることができる。
【００１７】 本発明により用いられるタンパク質は適切な脊椎動物組織から単離されるよう
なアミノ酸配列を有するそのタンパク質であり、これらの周知の配列そのもの、
またはそのアレル変種を有する。
【００１８】 配列に生じ得る変種を全配列におけるアミノ酸の差異により、または該配列に
おけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、転位または付加により表すことができる。
生物学的および免疫学的活性を本質的には変化しないと予測されるアミノ酸置換
について報告されている。関連するアミノ酸間のアミノ酸置換または進化におい
てしばしば生じる置換はとりわけＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇ
ｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．、タン
パク質配列および構造の地図、Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ、ワ
シントンＤ．Ｃ．５巻、補遺３（１９７８））。
【００１９】 本発明によれば、タンパク質の必須部分が無傷である限り、すなわち変種タン
パク質が卵胞および卵母細胞の発達において依然機能する限り、ＧＤＦ−９のフ
ラグメントまたはスプライシング変種もまた用いることができる。卵胞および卵
母細胞の発達はマウスインビトロ卵胞培養系を用いてインビトロで擬似できる。
その系では胞状前卵胞が***前段階まで成長できる。
【００２０】 本発明によりＧＤＦ−９と組合わせて用いられるゴナドトロピンを二量体にで
きる、すなわち２個の非共有結合サブユニットからなることができる。しかしな
がら、当該分野で一般的に周知である修飾を含んでなることができる。
【００２１】 ゴナドトロピンのかかる修飾の一つでは、１個のサブユニットのアミノ酸配列
のＣ末端を所望によりリンカー部分を介して別のサブユニットのアミノ酸配列の
Ｎ末端に結合させる。好ましくは、リンカー部分は完全または部分的ＣＴＰユニ
ットまたはその変種、または反復ヌクレオチド例えば５回反復Ｓｅｒ−Ｇｌｙペ
プチドである。
【００２２】 別の修飾は完全または部分的ＣＴＰユニットまたはその変種を有する各々のＮ
またはＣ末端でのαおよび／またはβサブユニットの伸長である。伸長は単一ま
たは複数の形態の各ＣＴＰユニットを含んでなってよい。別法として、完全ＣＴ
Ｐユニットまたは部分的ＣＴＰユニットまたはその複数の形態を該サブユニット
のＮまたはＣ末端に挿入できる。また別の修飾は一つまたはそれ以上の元来のも
のではないジスルフィドブリッジの導入である。またタンパク質の半減期を改変
するためにかかる伸長をＧＦＦ−９に加えてもよい。
【００２３】 さらにタンパク質をグリコシル化または部分的グリコシル化のいずれかにでき
る。本発明により用いられる部分的グリコシル化タンパク質を位置指定変異誘発
により得ることができ、それにより一つまたはそれ以上のグリコシル化認識部位
が除去される。別法として、さらなるグリコシル化認識部位の導入、所望により
一つまたはそれ以上のグリコシル化認識部位の除去によりグリコシル化パターン
を改変でき、その結果該タンパク質を修飾グリコシル化できる。本明細書におい
て用いられるグリコシル化認識部位はアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ
（ここでＸはいずれかのアミノ酸でよい）からなる。
【００２４】 本明細書で用いる「ＣＴＰユニット」はＣ末端でアミノ酸１１２ないし１１８
から残基１４５またはその一部に広がるｈＣＧのβサブユニットのカルボキシ末
端で見出されるアミノ酸配列を意味する。「完全」ＣＴＰユニットはＣＴＰのＮ
末端に依存して２８ないし３４個のアミノ酸を含有する。「部分的」ＣＴＰユニ
ットは１１２ないし１１８から１４５の全てを含めてその間に生じるアミノ酸配
列であるが、最も短い可能な完全ＣＴＰユニットから少なくとも１個のアミノ酸
が欠失している（アミノ酸１１８ないし１４５）。「複数の」ＣＴＰユニットは
完全ＣＴＰユニットまたは部分的ＣＴＰユニットまたはその両方の組合わせのタ
ンデムアレイを包含すると理解される。
【００２５】 ＧＤＦ−９およびゴナドトロピンを構築する方法は当該分野で周知である（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス、コールド・スプリング・ハーバー、最新版）。最も実際的な研究法は望まし
いタンパク質をコードするＤＮＡの発現によりこれらのタンパク質を製造するこ
とである。位置指定変異、付加配列のライゲーション、ＰＣＲ、および適当な発
現系の構築の技術は全て現在当該分野で周知である。望ましいタンパク質をコー
ドするＤＮＡの一部または全てを標準固相技術を用いて合成的に構築でき、好ま
しくはライゲーションの場合のための制限部位を含むことができる。含まれるコ
ーディング配列の転写および翻訳のための適当な調節エレメントをＤＮＡコーデ
ィング配列に提供できる。周知のように、多様な宿主と適合できる発現系、細菌
のごとき原核生物宿主および酵母、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細
胞等のごとき真核生物宿主が現在利用可能である。宿主の選択はとりわけ翻訳後
事象、特にグリコシル化に関係する。グリコシル化の位置はたいてい分子内のグ
リコシル化部位の特性により調節される。しかしながらこの部位を占めている糖
の特性はほとんど宿主の特性により調節される。最も好ましい宿主は哺乳動物由
来のものである。最も好ましくは、細胞はＣＨＯ細胞系である。チャイニーズ・
ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞がヒトゴナドトロピンサブユニット遺伝子でトラ
ンスフェクトされており、これらの細胞が無傷の二量体を分泌するできることが
示されている（例えばＫｅｅｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：４７
６９−４７７５（１９８９）；Ｖａｎ Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋら、Ｆｒｏｍ ｃｌ
ｏｎｅ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｄ．Ｊ．Ａ．およびＳｃｈ
ｅｌｌｅｋｅｎｓ，Ｈ編）、２４５−２５１）。
【００２６】 種々の刺激プロトコルを適用できる。外来性タンパク質に対する卵巣の応答に
おいて個体内および個体間に大きな変化がある。これにより単一の投与スキーム
の設定が不可能になっている。従って、卵巣の応答に依存して投与を個々に調整
すべきである。そのために超音波検査法およびエストラジオール濃度のモニター
観察が必要とされる。無***および卵巣の過剰刺激の調節のために用いるプロト
コルは概して周知である。処置に応じてＦＳＨ投与を１、２または３日に開始し
、５ないし１２日まで続けることができる。ＧＤＦ−９投与をＦＳＨと同時にま
たはＦＳＨ投与の１ないし３日前に開始できる。次いでＧＤＦ−９投与を停止す
るかまたはＦＳＨと組合わせて続けることができる。ｈＣＧまたはＬＨの投与に
より***および／または卵母細胞の成熟を誘起できる。早熟な黄体形成を防ぐた
めにＦＳＨに加えてＧｎＲＨアゴニストをも投与できる。ＣＯＨを行っている患
者ではＧｎＲＨアンタゴニストの投与により早熟ＬＨの増加をも防ぐことができ
る。
【００２７】 ＧＤＦ−９およびＦＳＨを一緒に投与する場合、ＧＤＦ−９をＦＳＨと混合で
きるが、ほぼ同時に別個に投与することもできる。
【００２８】 超音波検査法および血漿エストラジオール濃度の測定により卵巣の応答をモニ
ター観察する。***誘発およびＣＯＨに関してこれを実施する。典型的にはＣＯ
Ｈの場合、超音波検査法の評価が１６ないし２０ｍｍの少なくとも３個の卵胞の
存在を示す場合、および良好なエストラジオール応答が明らかである場合（直径
１８ｍｍ以上の各卵胞に対して血漿濃度が約３００ないし４００ｐｇ／ｍｌ（１
０００ないし１３００ｐｍｏｌ／ｌ））、卵胞の成熟の最終相をｈＣＧの投与に
より誘起できる。３４ないし３５時間後に卵母細胞の回収を実施する。
【００２９】 ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ、ＧｎＲＨアンタゴニストおよびＧｎＲＨアゴニスト等
の使用を含む一般的な刺激スキームの変更はＧＤＦ−９投与がかかるプロトコル
に組み込まれている限り全て本発明の一部であることは理解されよう。
【００３０】 従って、本発明により現行の不妊処置プロトコルをＧＤＦ−９およびゴナドト
ロピンの組合わせインビボ投与により最適化できる。さらにＧＤＦ−９での卵胞
成長を開始させ、続いてゴナドトロピン処置を行うことにより卵胞の発達を最適
化し、それに伴い卵母細胞の品質を最適化する。
【００３１】 ＧＤＦ−９で卵胞成長を開始させ、続いてＧＤＦ−９およびゴナドトロピンの
組合わせ投与を行うこともできる。
【００３２】 本発明の別の態様によれば、ＧＤＦ−９およびゴナドトロピンを含んでなる化
学的に規定された培地中でインキュベートすることにより卵胞および卵母細胞を
インビトロで発達させることができる。
【００３３】 本発明の別の態様によれば、卵胞および卵母細胞の発達および成熟を刺激する
ためのキットが提供される。かかるキットはいくつかの包装ユニットを含んでな
ってよい。かかるユニットはゴナドトロピンと混合したＧＤＦ−９を含んでなっ
てよい。別法として、ＧＤＦ−９およびゴナドトロピンを別個に包装することも
できる。ＦＳＨはゴナドトロピンに属すると理解される。所望により別個の包装
ユニットがｈＣＧまたはＬＨを含有していてもよい。
【００３４】 アンプルあたりのＧＤＦ−９の量は１０ｎｇないし５００μｇ、好ましくは２
００ｎｇないし２００μｇの間で変化できる。ＦＳＨの範囲は通常５０ないし５
００ＩＵの間である。
【００３５】 インビトロで発達させるのに適当なＧＤＦ−９の量は２ないし５００ｎｇ／ｍ
ｌの量であり、一方ＦＳＨは５０ｍＩＵないし１ＩＵの範囲で用いられる。
【００３６】 本発明により使用するための医薬用調製物を例えば標準的な参考文献、Ｇｅｎ
ｎａｒｏら（編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、マック・パブリッシング・カンパニー（１９９０）
、例えばパート８：医薬用調製物およびその製造）に記載されるような標準的な
技術に従って調製できる。本発明による医薬用調製物を製造する目的で、活性物
質を医薬的に許容される担体と混合するかまたはそれに溶解させる。
【００３７】 活性成分の作用を干渉しないいずれかの慣用される医薬用担体を本発明による
調製に用いることができる。
【００３８】 医薬的に許容される担体は当業者に周知であり、例えば無菌セイライン、ラク
トース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペク
チン、ピーナッツ油、ゴマ油および水などが含まれる。
【００３９】 さらに本発明による医薬用組成物は一つまたはそれ以上の安定剤例えばソルビ
トール、マンニトール、デンプン、スクロースデキストリンおよびグルコースな
どの炭水化物、アルブミンまたはカゼインのごときタンパク質およびアルカリ性
リン酸塩のようなバッファーを含んでなってよい。
【００４０】 安定な投与経路は筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射または腹腔内投与、経口
および鼻腔内投与である。
【００４１】 図面の説明 図１ マウス卵胞の成長に及ぼすゴナドトロピンおよびＧＤＦ−９の影響。
【００４２】 実施例 実施例１ インビトロ卵胞培養におけるＧＤＦ−９の試験 卵胞が成長する間に、原始、初期、胞状前、胞状および最終的な***前段階に
わたる種々発達段階が経過する。増殖および分化の過程は最適な卵胞の発達が必
要とされ、ゴナドトロピン、ステロイドおよび成長因子により調節される。不妊
処置の間、初期胞状段階の卵胞の成長がゴナドトロピンで誘起される。この過程
をマウスインビトロ卵胞培養系を用いてインビトロで擬似できる。加えて、より
早い段階：胞状前すなわち二次卵胞段階でインビトロ卵胞発生を開始できる。
【００４３】 インビトロ卵胞培養の材料および方法 卵胞培養 雌未成熟マウス（Ｆ１：Ｂ６ＢＣＡ；２１ないし２３日齢）をエーテル麻酔し
、眼からの採取により血液を収集する。凝固後、血液を４０００ｇで１５分間遠
心し、血清を収集し、用時まで−２０℃で保存する。
【００４４】 卵巣を除去し、３７℃でグルタミン（２ｍＭ；ギブコ、＃１５０３９−０１９
）、トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ：シグマ、セントルイス、ミズーリー州
、米国；Ｔ−５３９１）、インスリン（５μｇ／ｍｌ：シグマ、Ｉ−１８８２）
、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ：シグマ、Ａ−４０３４）、セレニウム（２
ｎｇ／ｍｌ：シグマ、Ｓ−９１３３）およびウシ血清アルブミン（０．３％ＢＳ
Ａ：シグマ、Ａ−９６４７）を補充したレイボビッツ−Ｌ１５培地（ギブコ、ペ
イスレイ、英国；＃１１４１５−０４９）中に配置した。直径１５０ないし１８
０μｍの胞状前卵胞を１ｍｌシリンジに取り付けた２個のゴージｘ１／２針で単
離し、αＭＥＭ培地（ギブコ、＃２２５７１−０２０）にグルタミン（２ｍＭ）
、トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、アスコ
ルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、セレニウム（２ｎｇ／ｍｌ）を補充し（すなわち
αＭＥＭ培養培地）およびＢＳＡ（０．３％）を補充した培地に収集した。単離
した卵胞を空気中５％ＣＯ２でガス供給し、加湿したインキュベーター内で３７
℃で培養用に充分な卵胞が単離されるまでインキュベートする。収集した卵胞か
ら正常な形態学的様相すなわち中心球形卵母細胞、高密度顆粒膜細胞および卵胞
全体を封入する卵胞膜細胞層を有する卵胞を選別し、ミリセル・ＣＭ培養プレー
ト・インサート（ミリポア、ベッドフォード、米国；＃ＰＩＣＭ ０１２５０）
でヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞培養上澄を含有するＧＤＦ−９と共にまたはこれを
伴わずに、５％未成熟マウス血清を補充したαＭＥＭ培養培地２５０μｌで別個
に培養する。対照として卵胞をＧＤＦ−９を発現しない２９３Ｔ細胞培養上澄で
培養する。続いて卵胞を空気中５％ＣＯ２でガス供給し、加湿したインキュベー
ター内で３７℃で培養する。２０時間の培養の後、培地２００μｌを卵胞の成長
を誘起するために１００ｍＵ／ｍｌ組換えヒト卵胞刺激ホルモン（ｒｅｃＦＳＨ
：エヌブイ・オルガノン、オス、オランダ）を添加した、または依然ｒｅｃＦＳ
Ｈを含まない新鮮培地と交換する。１日おきに培養培地を交換し、１００倍拡大
およびマイクロメーター換算を用いて卵胞の直径を毎日測定する。
【００４５】 卵胞の成長 ５％未成熟マウス血清（ＩＭＳ）および組換えラットＧＤＦ−９でトランスフ
ェクトされたヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞の上澄（２００ｎｇ／ｍｌ ｒＧＤＦ−
９）を含む培地中でおよそ１７０μｍのマウス卵胞を培養する。最初の２４時間
培養の後、培地を新鮮なものと交換し、組換えヒトＦＳＨ（ｒｅｃＦＳＨ）の存
在下（＋１００ｍＩＵ／ｍｌ ＦＳＨ）または不在下（−ＦＳＨ）で卵胞をさら
に培養した。対照としてトランスフェクトされていない２９３Ｔ細胞の２０容量
／容量％上澄と共に、またｒｅｃＦＳＨの存在下または不在下で卵胞を培養した
。
【００４６】 未成熟マウス血清およびｒｅｃＦＳＨの影響下でマウス卵胞は５日以内で３５
０μｍまで成長する。ｒｅｃＦＳＨ培養へのＧＤＦ−９の添加により卵胞の成長
速度が上昇し、卵胞は３日以内に３５０μｍに至る。５日間の培養の後、卵胞の
大きさは４５０μｍに至る。またｒｅｃＦＳＨの不在下でＧＤＦ−９は卵胞の成
長をＧＤＦ−９の不在下で到達したレベル以上に増強する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 マウス卵胞の成長に及ぼすゴナドトロピンおよびＧＤＦ−９の影響を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，Ｉ Ｌ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 医薬品として使用するためのＧＤＦ−９。
  2. 【請求項２】 補助生殖のための医薬用調製物の調製におけるＧＤＦ−９の
    使用。
  3. 【請求項３】 卵胞および卵母細胞の発達および成熟を刺激する方法であっ
    て、ＧＤＦ−９をゴナドトロピンと組み合わせて投与することからなる方法。
  4. 【請求項４】 女性患者の卵胞および卵母細胞の発達および成熟を刺激する
    方法において、ＧＤＦ−９をゴナドトロピンと組み合わせて投与することからな
    る改良。
  5. 【請求項５】 卵胞および卵母細胞の発達および成熟を刺激するためのキッ
    トであって、各ユニットがゴナドトロピンおよびＧＤＦ−９の混合物を含んでな
    る複数の包装ユニットを含んでなるキット。
  6. 【請求項６】 卵胞および卵母細胞の発達および成熟を刺激するためのキッ
    トであって、ゴナドトロピンおよびＧＤＦ−９の別個の包装ユニットからなるキ
    ット。
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JPN6009067799, Ｊｉｎｗｅｎ Ｄｏｎｇ, Ｎａｔｕｒｅ, 1996, Ｖｏｌ．３８３, Ｐａｇｅｓ ５３１−５３５ *

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