ES2200579T3 - Mejora de la foliculogenesis. - Google Patents
Mejora de la foliculogenesis.Info
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Abstract
El uso de GDF-9 combinado con gonadotropinas en la preparación de una preparación farmacéutica para la reproducción asistida.
Description
Mejora de la foliculogenesis.
La presente invención se refiere al uso del
Factor de Diferenciación del Crecimiento-9
(GDF-9) combinado con gonadotropinas para preparar
un medicamento para su uso en la reproducción asistida y a estuches
reactivos que comprenden GDF-9 y gonadotropinas.
La reproducción implica el crecimiento y la
selección de folículos ováricos, que conducen a la ovulación de un
oocito sano (de alta calidad) que puede ser fertilizado. Con
posterioridad el oocito fertilizado se desarrolla hasta un embrión,
que se implanta en el endometrio receptivo y crece hasta un feto y
finalmente un bebé sano. Las parejas con problemas de fertilidad,
sin embargo, necesitan someterse a tratamiento para tener niños. En
este momento se encuentran disponibles dos programas de tratamiento
principales: la Inducción de la Ovulación (OI), para parejas con
infertilidad femenina debida a ciclos anovulatorios, y la
Fertilización In Vitro (IVF) para parejas con problemas de
infertilidad femenina o masculina. En el caso de los protocolos de
OI, se administran dosis bajas de gonadotropinas con el fin de
inducir el crecimiento mono-folicular y la ovulación
de un oocito que pueda ser fertilizado naturalmente. En el caso de
la IVF se administran niveles relativamente elevados de
gonadotropinas con el fin de obtener el desarrollo
multi-folicular. Tras la inducción del crecimiento
multi-folicular, se induce la maduración de los
oocitos con Hormona Luteinizante (LH)/Gonadotropina Coriónica humana
(hCG) y los oocitos maduros se recuperan mediante punción folicular.
Tras la feretilización in vitro y la escisión temprana del
embrión in vitro, se transfieren al útero de 2 a 3
embriones.
En ambos tratamientos, la dosificación de
gonadotropina tiene que ser adaptada a los pacientes individuales
con el fin de obtener un desarrollo mono- o
multi-folicular. Esto es extremadamente difícil y el
éxito no está garantizado. Por otra parte, las tasas de resultado de
embarazo final son relativamente bajas (~20%) debido a muchos
factores, entre ellos la calidad del oocito y la receptividad del
endometrio. La causa de las tasas de éxito relativamente bajas puede
atribuirse al modo en el que se inducen la foliculogénesis y la
oogénesis.
Durante el ciclo menstrual natural, las
gonadotropinas FSH y LH inducen el desarrollo de folículos y
oocitos. Debido a la selección, que muy probablemente también está
controlada por la FSH, sólo un folículo de la reserva de folículos
en crecimiento se vuelve dominante y finalmente libera un oocito
sano, fertilizable en la ovulación. Los otros folículos se vuelven
atréticos y nunca ovularán sino que degenerarán.
Es bien sabido que no sólo las gonadotropinas son
necesarias para un desarrollo óptimo del folículo y el oocito, sino
también factores de crecimiento. El GDF-9 es uno de
tales factores. Su secuencia de nucleótidos y aminoácidos ha sido
descrita por Incerti y col. (Biochim. Biophys. Acta (1.994), 1222,
125-128) y McGrath y col. (Mol. Endo. (1.995), 9,
131-136). En ratones knockout para el
GDF-9 se ha demostrado que el desarrollo folicular
cesa en la fase primaria debido a la deficiencia de
GDF-9 (Dong y col., 1.996). Por otra parte se ha
demostrado que el GDF-9 está presente en los
folículos (en los oocitos para ser más específicos) desde los
folículos en la fase primaria hasta la fase preovulatoria totalmente
desarrollada (McGrath y col., 1.995). Estos resultados indican que
el GDF-9 está implicado en el desarrollo de
folículos y oocitos normales.
Debido a los mecanismos de selección sólo un
folículo del grupo de folículos que dejaron la reserva primordial,
alcanza la fase preovulatoria, es decir el folículo dominante, y
proporciona un oocito sano, fertilizable. Los otros se vuelven
atréticos y degeneran. Los mecanismos que controlan la selección de
un folículo dominante no se entienden completamente, pero la
hipótesis es que el folículo que es más sensible a la FSH, es el que
se vuelve dominante.
El crecimiento folicular está controlado de este
modo por factores de crecimiento tales como por ejemplo
IGF-1, GDF-9, y más tarde por las
gonadotropinas FSH y LH, y por los estrógenos. Durante las diversas
fases de crecimiento se pueden identificar: la fase primaria, la
fase preantral y antral, y finalmente la fase preovulatoria.
Una diferencia principal entre los protocolos de
tratamiento de infertilidad y la concepción natural es el número de
folículos y oocitos que están implicados.
Durante el tratamiento de Técnicas de
Reproducción Asistida (ART), el mecanismo de selección que conduce a
la ovulación de un oocito sano que será fertilizado y se
desarrollará hasta un embrión implantado, está
sobre-regulado por la administración de dosis de
gonadotropina relativamente altas (principalmente FSH). Este
protocolo hace que muchos folículos y oocitos crezcan y finalmente
se obtienen muchos oocitos a partir de estos folículos. Sin embargo,
aunque la maduración de los oocitos está inducida con LH/CG, no
todos los oocitos han madurado realmente en el momento de la
recuperación, o los oocitos han madurado pero no se han desarrollado
apropiadamente. En algunos casos, la maduración de los oocitos puede
ser inducida con posterioridad in vitro, pero este
procedimiento de maduración in vitro tiene un éxito limitado.
Como resultado solo una proporción relativamente pequeña de todos
los oocitos obtenidos de los folículos se desarrollará eventualmente
hasta un embrión que se implanta en el endometrio. Esto conduce a un
éxito de las ART relativamente bajo.
La presente invención proporciona una mejora de
la estimulación del desarrollo y la maduración del folículo y el
oocito mediante la administración de GDF-9 combinado
con gonadotropinas. Esto conducirá a la recuperación de oocitos de
mayor calidad con unas capacidades de fertilización, escisión e
implantación superiores y de ese modo finalmente a tasas de éxito en
la ART superiores. De este modo, según la presente invención el
GDF-9 podría ser utilizado en terapia.
Especialmente, podría ser utilizado para la reproducción
asistida.
Así, debido a la administración de
GDF-9, se seleccionarán folículos más pequeños, que
no están destinados a volverse apoptóticos, en la reserva en
crecimiento, y crecerán hasta folículos preovulatorios sanos.
Además, los folículos en crecimiento podrían ser rescatados por el
GDF-9 y se desarrollarían hasta un folículo
totalmente desarrollado con un oocito de alta calidad, conduciendo a
un incremento en las tasas de éxito finales, es decir, resultados de
embarazo.
La inducción del crecimiento folicular por medio
de una combinación del factor de crecimiento GDF-9 y
gonadotropinas podría conducir a un desarrollo folicular más
natural, y con ello podría mejorar la calidad del oocito y de este
modo la tasa de éxito final.
Según la presente invención se puede administrar
GDF-9 combinado con gonadotropinas a pacientes
hembra con el fin de mejorar el desarrollo y la maduración de
folículos y oocitos. La administración puede estar incluida en
protocolos de tratamiento existentes para la estimulación ovárica y
la fertilización in vitro. Alternativamente, también se puede
utilizar GDF-9 para desarrollar folículos aislados
y/o oocitos mediante incubación in vitro en un medio de
cultivo adecuado en presencia de GDF-9 y
gonadotropinas, preferiblemente FSH.
Preferiblemente el GDF-9 se
prepara mediante tecnología de ADN recombinante en células huésped
eucariotas. El ADN que codifica GDF-9 ha sido
aislado y caracterizado y puede ser utilizado para la preparación de
un sistema vector adecuado. GDF-9 es codificado
preferiblemente por ADN de origen mamífero, más preferiblemente por
ADN humano.
La secuencia de nucleótidos de
GDF-9 de una especie puede ser utilizada como sonda
o como fuente para preparar oligonucleótidos sintéticos que van a
ser utilizados como cebadores en las reacciones de amplificación de
ADN que permiten el aislamiento y la identificación del gen completo
de otras especies. Utilizando la información de esa secuencia, se
puede derivar el gen completo de ADNc o ADN genómico a partir de
otras fuentes o se puede sintetizar utilizando métodos
conocidos.
Como gonadotropinas se debe entender FSH aislada
de fuentes humanas, tales como orina menopáusica. Alternativamente,
se podría preparar FSH recombinante mediante su producción en
células huésped eucariotas. Además, como en los tratamientos con
protocolo de reproducción asistida actuales, la maduración puede ser
inducida mediante la administración de LH o hCG. No obstante,
también se pueden utilizar variaciones incluyendo por consiguiente
antagonistas y/o agonistas de GnRH.
Las proteínas que van a ser utilizadas según la
invención son aquellas proteínas que tienen las secuencias de
aminoácidos aisladas del tejido de vertebrados relevante, y tienen
estas secuencias conocidas per se, o variantes alélicas de las
mismas.
Las variaciones que se pueden producir en una
secuencia pueden ser demostradas por una o varias diferencias de
aminoácidos en la secuencia global o mediante deleciones,
sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o varios
aminoácidos en dicha secuencia. Se han descrito sustituciones de
aminoácidos que se espera que no alteren esencialmente las
actividades biológicas e inmunológicas. Las reposiciones de
aminoácidos entre aminoácidos afines o las reposiciones que se han
producido frecuentemente en la evolución son, inter alia, Ser/Ala,
Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val, (ver Dayhof, M.D., Atlas of
protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington
D.C., 1.978, vol. 5, suppl. 3).
Se debe entender que según la presente invención
también se pueden utilizar fragmentos de GDF-9 o
variantes de empalme con tal que la parte esencial de la proteína
esté todavía intacta, esto es con tal que la proteína variante
todavía ejerza su función en el desarrollo de folículos y oocitos.
El desarrollo de folículos y oocitos puede ser imitado in
vitro utilizando un sistema de cultivo de folículos de ratón
in vitro. En ese sistema se pueden hacer crecer folículos
pre-antrales hasta la fase
pre-ovulatoria.
Las gonadotropinas que se van a utilizar
combinadas con GDF-9 según la invención pueden ser
diméricas es decir compuestas por dos subunidades unidas no
covalentemente. Sin embargo, pueden comprender modificaciones
conocidas generalmente en la técnica.
En una de tales modificaciones de las
gonadotropinas, el extremo C de la secuencia de aminoácidos de una
de las subunidades está conectado, opcionalmente a través de un
radical conector, al extremo N de la secuencia de aminoácidos de la
otra subunidad. Preferiblemente el radical conector es una unidad
CTP completa o parcial o una variante de la misma, o un oligopéptido
repetido v.g. un péptido Ser-Gly repetido cinco
veces.
Otra modificación puede ser una prolongación de
la subunidad \alpha y/o \beta en su extremo N o C respectivo con
una unidad CTP completa o parcial o una variante de la misma. La
prolongación puede comprender las respectivas unidades CTP en una
única o en múltiples formas. Alternativamente, se puede insertar una
unidad CTP completa o una unidad CTP parcial o múltiples formas de
las mismas en el extremo N o C de dichas subunidades. De nuevo otra
modificación es la introducción de uno o más puentes disulfuro no
nativos. Tales prolongaciones también pueden ser añadidas a
GDF-9 con el fin de modificar la vida media de la
proteína.
Además, las proteínas pueden estar o bien
glicosiladas o bien parcialmente glicosiladas. Las proteínas
parcialmente glicosiladas que se van a utilizar según la invención
pueden ser obtenidas mediante mutagénesis dirigida al sitio con lo
que se eliminan uno o más de los sitios de reconocimiento de la
glicosilación. Alternativamente, el patrón de glicosilación puede
ser modificado mediante la introducción de sitios de reconocimiento
de glicosilación adicionales y, opcionalmente, la eliminación de uno
o más sitios de reconocimiento de glicosilación, dando como
resultado una glicosilación modificada de dichas proteínas. Un sitio
de reconocimiento de glicosilación según se utiliza aquí consta de
la secuencia de aminoácidos
Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser
cualquier aminoácido.
Utilizada aquí, la "unidad CTP" hace
referencia a la secuencia de aminoácidos encontrada en el extremo
carboxi de la subunidad \beta de hCG que se prolonga desde el
aminoácido 112-118 hasta el resto 145 en el extremo
C o hasta una porción del mismo. Una unidad CTP "completa"
contiene 28-34 aminoácidos, dependiendo del extremo
N de la CTP. Una unidad CTP "parcial" es una secuencia de
aminoácidos que se encuentra entre las posiciones
112-118 a 145 inclusive, pero que tiene al menos un
aminoácido suprimido de la unidad CTP completa más corta posible
(aminoácido 118-145). Se entiende que las unidades
CTP "múltiples" abarcan disposiciones en tándem de la unidad
CTP completa o la unidad CTP parcial o combinaciones de ambas.
Los métodos para construir el
GDF-9 y las gonadotropinas son bien conocidos en la
técnica (Sambrook y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, última
edición). El enfoque más práctico es producir estas proteínas
mediante la expresión del ADN que codifica la proteína deseada. Los
mecanismos para la mutagénesis dirigida al sitio, la ligadura de
secuencias adicionales, la PCR, y la construcción de sistemas de
expresión adecuados son todos, por ahora, bien conocidos en la
técnica. Se pueden construir sintéticamente porciones o todo el ADN
que codifica las proteínas deseadas utilizando mecanismos en fase
sólida normalizados, preferiblemente para incluir sitios de
restricción para facilitar la ligadura. Se pueden proporcionar
elementos de control adecuados para la transcripción y la traducción
de las secuencias codificadoras incluidas a las secuencias
codificadoras de ADN. Como es bien sabido, se encuentran disponibles
ahora sistemas de expresión que son compatibles con una amplia
variedad de huéspedes, incluyendo huéspedes procariotas tales como
bacterias y huéspedes eucariotas tales como levadura, células
vegetales, células de insectos, células de mamíferos, células de
aves y similares. La elección del huésped es concretamente para los
eventos post-traduccionales, incluyendo muy
particularmente la glicosilación. La localización de la
glicosilación está controlada en su mayor parte por la naturaleza
del sitio de glicosilación dentro de la molécula. Sin embargo, la
naturaleza de los azúcares que ocupan el sitio es controlada en gran
parte por la naturaleza del huésped. Los huéspedes más preferidos
son de origen mamífero. Muy preferiblemente la célula es una línea
celular CHO. Las células de Ovario de Hámster Chino (CHO) han sido
transfectadas con genes subunitarios de gonadotropina humana y se ha
demostrado que estas células son capaces de secretar dímeros
intactos (v.g. Keene y col. (1.989), J. Biol. Chem., 264,
4769-4775; Van Wezenbeek y col. (1.990), en From
clone to Clinic (eds. Crommelin D.J.A. y Schellekens H.),
245-251).
Se pueden aplicar diversos protocolos de
estimulación. Existen grandes variaciones inter- e
intra-individuales en la respuesta de los ovarios a
las proteínas exógenas. Esto hace imposible ajustar un esquema de
dosificación uniforme. La dosificación se deberá ajustar, por lo
tanto, individualmente dependiendo de la respuesta del ovario. Esto
requiere ultrasonografía y control de los niveles de estradiol. Los
protocolos que se van a utilizar para la anovulación y la
hiperestimulación del ovario controlada son generalmente conocidos.
Dependiendo del tratamiento, la administración de FSH comienza el
día 1, 2 o 3 y puede continuar hasta durante 5-12
días. La administración de GDF-9 puede comenzar
simultáneamente a la de FSH o 1-3 días antes de la
administración de FSH. La administración de GDF-9 se
puede interrumpir después o puede continuar combinada con FSH. La
ovulación y/o la maduración del oocito pueden ser inducidas mediante
la administración de hCG o LH. Para evitar la luteinización
prematura se pueden administrar también además de FSH agonistas de
GnRH. En pacientes que experimentan COH también se pueden evitar las
oleadas de LH prematuras mediante la administración de antagonistas
de GnRH.
En los casos en los que se administran
conjuntamente GDF-9 y FSH, se puede mezclar
GDF-9 con FSH, sin embargo, también podría ser
administrado por separado aproximadamente al mismo tiempo.
La respuesta ovárica es controlada por
ultrasonografía y medida de los niveles de estradiol en plasma. Esto
se realiza para la inducción de la ovulación así como para la COH.
Típicamente, en el caso de la COH, cuando la evaluación
ultrasonográfica indica la presencia de al menos tres folículos de
16-20 mm, y existe evidencia de una buena respuesta
al estradiol (niveles en plasma de aproximadamente
300-400 pg/ml (1.000-1.300
pmoles/litro) para cada folículo con un diámetro mayor de 18 mm), se
puede inducir la fase final de la maduración de los folículos
mediante la administración de hCG. La recuperación del oocito se
realiza 34-35 horas más tarde.
Se debe entender que las variaciones del esquema
de estimulación general incluyendo los usos de FSH, hCG, LH,
antagonistas de GnRH y agonistas de GnRH o similares son todos parte
de esta invención con tal que la administración de
GDF-9 esté integrada en semejante protocolo.
De este modo, según la presente invención se ha
encontrado que los protocolos de tratamiento de la infertilidad
actuales pueden ser optimizados mediante la administración combinada
in vivo de GDF-9 y gonadotropinas. Además, el
inicio del crecimiento folicular con GDF-9, seguido
de tratamiento con gonadotropina, optimiza el desarrollo folicular y
junto con ello la calidad del oocito.
La iniciación del crecimiento folicular con
GDF-9 también podría estar seguida de la
administración combinada de GDF-9 y
gonadotropinas.
Según otro aspecto de la invención se pueden
desarrollar folículos y oocitos in vitro mediante incubación
en un medio de cultivo definido químicamente que comprenda
GDF-9 y gonadotropinas.
Según otro aspecto de la invención se proporciona
un estuche para estimular el desarrollo y la maduración de folículos
y oocitos. Semejante estuche puede comprender diversas unidades
envasadas. Tales unidades pueden comprender GDF-9
mezclado con gonadotropinas. Alternativamente también se podrían
envasar por separado el GDF-9 y las gonadotropinas.
Como gonadotropinas se debe entender FSH. Opcionalmente también
podrían estar presentes unidades envasadas separadas conteniendo hCG
o LH.
La cantidad de GDF-9 por ampolla
podría cambiar entre 10 ng - 500 \mug, preferiblemente de 200 ng -
200 \mug. El intervalo de FSH se encuentra normalmente entre 50 -
500 UI.
Para el desarrollo in vitro una cantidad
adecuada de GDF-9 es una cantidad de 2 - 500 ng/ml,
mientras la FSH se utiliza en un intervalo de 50 mUI - 1 UI.
Las preparaciones farmacéuticas para su uso según
la invención pueden ser preparadas según los mecanismos normalizados
tales como los descritos por ejemplo en la referencia patrón,
Gennaro y col. (Ed.), Remmington's Pharmaceutical Sciences, (18a ed.
Mack Publishing Company, 1.990, v.g. Parte 8: Pharmaceutical
Preparations And Their Manufacture). Con el fin de elaborar las
preparaciones farmacéuticas según la invención, la sustancia activa
se mezcla o se disuelve con un portador farmacéutico aceptable.
En las preparaciones según la invención se puede
utilizar cualquier portador farmacéutico convencional que no
interfiera en el funcionamiento del ingrediente activo.
Los portadores farmacéuticos aceptables son bien
conocidos por los expertos en la técnica y se incluyen, por ejemplo,
solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio,
gelatina, dextrina, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de
oliva, aceite de sésamo y agua.
Además la composición farmacéutica según la
invención puede comprender uno o más estabilizadores tales como, por
ejemplo, carbohidratos incluyendo sorbitol, manitol, almidón,
sacarosa, dextrina y glucosa, proteínas tales como albúmina o
caseína, y tampones tales como fosfatos alcalinos.
Las rutas de administración adecuadas son las
inyecciones intramusculares, las inyecciones subcutáneas, las
inyección intravenosas o las inyecciones intraperitoneales, la
administración oral e intranasal.
El efecto de las gonadotropinas y el
GDF-9 sobre el crecimiento folicular de ratón.
Durante el crecimiento folicular, se pasa por
diversas fases evolutivas que oscilan entre la fase primordial,
primaria, pre-antral, antral y finalmente
preovulatoria. Los procedimientos de proliferación y diferenciación
necesarios para un desarrrollo folicular óptimo, son controlados por
gonadotropinas, esteroides y factores de crecimiento. Durante el
tratamiento de la infertilidad, se induce el crecimiento de los
folículos de la fase antral temprana con gonadotropinas. Este
procedimiento puede ser imitado in vitro utilizando un
sistema de cultivo de folículos in vitro. Además es posible
iniciar la foliculogénesis in vitro en una fase temprana: la
fase preantral o secundaria.
Se anestesian ratones inmaduros femeninos (F1:
B6BCA; 21-23 días de edad) con éter y se recoge
sangre por medio de la extracción del ojo. Tras la coagulación, la
sangre se centrifuga durante 15 minutos a 4.000 g y se recoge el
suero y se almacena a -20ºC hasta su uso.
Se separan los ovarios y se colocan en medio de
Leibovitz-L15 (Gibco, Paisley, UK;
#11415-049) suplementado con glutamina (2 mM; Gibco,
#15039-019), transferrina (10 \mug/ml; Sigma, St.
Louis, MO, USA; T-5391), insulina (5 \mug/ml;
Sigma, I-1882), ácido ascórbico (50 \mug/ml;
Sigma, A-4034), selenio
(2 ng/ml; Sigma, S-9133) y Seralbúmina Bovina (0,3%, BSA; Sigma, A-9647), a 37ºC. Se aíslan los folículos preantrales con un diámetro de 150 a
180 \mum con dos agujas de Calibre 30 x 1/2 ancladas a dos jeringas de 1 ml y se recogen en medio \alphaMEM (Gibco, #22571-020) suplementado con glutamina
(2 mM), transferrina (10 \mug/ml), insulina (5 \mug/ml), ácido ascórbico (50\mug/ml), selenio (2 ng/ml) (esto es un medio \alphaMEM) y BSA (0,3%). Los folículos aislados se incuban en una incubadora humidificada con gas CO_{2} al 5% en aire a 37ºC hasta que se aíslan suficientes folículos del cultivo. A partir de los folículos recogidos, se seleccionan los folículos con una apariencia morfológica normal es decir un oocito esférico central, alta densidad de células granulosas y una capa de células tecales que engloba el folículo completo, y se cultivan individualmente en insertos de placas de cultivo Millicell-CM (Millipore, Bedford, USA; #PICM 01250) con 250 \mul de medio de cultivo \alphaMEM suplementado con suero de ratón inmaduro al 5% con o sin GDF-9 conteniendo sobrenadante de cultivo celular de riñón embrionario humano 293T. Como control, los folículos se cultivan con sobrenadante de cultivo celular 293T que no expresa GDF-9. Los folículos son cultivados con posterioridad en una incubadora humidificada con gas CO_{2} al 5% en aire a 37ºC. Al cabo de 20 horas de cultivo, se cambian 200 \mul de medio por medio fresco además de 100 mU/ml de Hormona Estimuladora del Folículo humana recombinante (recFSH: NV Organon, Oss, Holanda) para inducir el crecimiento folicular, o sin recFSH. El medio de cultivo se cambia un día si y otro no y se mide el diámetro de los folículos cada día utilizando un aumento de 100x y un micrómetro calibrado.
(2 ng/ml; Sigma, S-9133) y Seralbúmina Bovina (0,3%, BSA; Sigma, A-9647), a 37ºC. Se aíslan los folículos preantrales con un diámetro de 150 a
180 \mum con dos agujas de Calibre 30 x 1/2 ancladas a dos jeringas de 1 ml y se recogen en medio \alphaMEM (Gibco, #22571-020) suplementado con glutamina
(2 mM), transferrina (10 \mug/ml), insulina (5 \mug/ml), ácido ascórbico (50\mug/ml), selenio (2 ng/ml) (esto es un medio \alphaMEM) y BSA (0,3%). Los folículos aislados se incuban en una incubadora humidificada con gas CO_{2} al 5% en aire a 37ºC hasta que se aíslan suficientes folículos del cultivo. A partir de los folículos recogidos, se seleccionan los folículos con una apariencia morfológica normal es decir un oocito esférico central, alta densidad de células granulosas y una capa de células tecales que engloba el folículo completo, y se cultivan individualmente en insertos de placas de cultivo Millicell-CM (Millipore, Bedford, USA; #PICM 01250) con 250 \mul de medio de cultivo \alphaMEM suplementado con suero de ratón inmaduro al 5% con o sin GDF-9 conteniendo sobrenadante de cultivo celular de riñón embrionario humano 293T. Como control, los folículos se cultivan con sobrenadante de cultivo celular 293T que no expresa GDF-9. Los folículos son cultivados con posterioridad en una incubadora humidificada con gas CO_{2} al 5% en aire a 37ºC. Al cabo de 20 horas de cultivo, se cambian 200 \mul de medio por medio fresco además de 100 mU/ml de Hormona Estimuladora del Folículo humana recombinante (recFSH: NV Organon, Oss, Holanda) para inducir el crecimiento folicular, o sin recFSH. El medio de cultivo se cambia un día si y otro no y se mide el diámetro de los folículos cada día utilizando un aumento de 100x y un micrómetro calibrado.
Se cultivan folículos de ratón de aproximadamente
170\mum en medio con suero de ratón inmaduro al 5% (IMS) y
sobrenadante de células 293T de riñón embrionario humano
transfectado con GDF-9 de rata recombinante (200
ng/ml de rGDF-9). Al cabo de las 24 primeras horas
de cultivo, el medio fue refrescado y los folículos fueron
cultivados adicionalmente en presencia (+100 mUI/ml FSH) o ausencia
(-FSH) de FSH humano recombinante (recFSH). Como control, se
cultivaron los folículos con sobrenadante al 20% (v/v) de células
293T no transfectadas, también en presencia o ausencia de
recFSH.
Bajo la influencia de suero de ratón inmaduro y
recFSH, los folículos de ratón crecían hasta 350 \mum en 5 días.
La adición de GDF-9 a los cultivos recFSH, aumenta
la velocidad de crecimiento folicular y los folículos alcanzan 350
\mum en 3 días. Al cabo de 5 días de cultivo, los folículos
alcanzan un tamaño de
450 \mum. También en ausencia de recFSH GDF-9 aumenta el crecimiento folicular por encima de los niveles alcanzados en ausencia de GDF-9.
450 \mum. También en ausencia de recFSH GDF-9 aumenta el crecimiento folicular por encima de los niveles alcanzados en ausencia de GDF-9.
Claims (3)
1. El uso de GDF-9 combinado con
gonadotropinas en la preparación de una preparación farmacéutica
para la reproducción asistida.
2. Un estuche para estimular el desarrollo y la
maduración de folículos y oocitos, comprendiendo el estuche una
pluralidad de unidades envasadas comprendiendo cada unidad una
mezcla de gonadotropinas y GDF-9.
3. Un estuche para estimular el desarrollo y la
maduración de folículos y oocitos, comprendiendo el estuche en
envases separados gonadotropinas y
GDF-9.
GDF-9.
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