JP2002530059A - 輸送ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、膜移行ベクター・ペネトラチンの改変形および末端切除形に関する。該末端切除形は、自体が更なる変異を含み得る７量体ペプチドを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、薬剤の標的細胞への配送を改善するために使用する、新規の膜移行
ペプチド担体部分、および新規のペプチド担体分子を貨物体部分とともに含む膜
移行ベクターに関する。

【０００２】 医薬業界は薬剤の効率的な配送に関心を永年持ち続けている。この問題は、人
体内における薬剤の短いクリアランス時間(短い半減期)、作用部位の局在化、あ
るいは、事によると薬剤それ自体の特質、例えば、溶解性、疎水性などに関する
。そのために、多くの開発と方策が採られており、それには、作用部位に達する
までの間の不良環境から薬剤を保護するために、例えば、腸溶性錠剤や放出制御
手段などによって製剤化にすることが含まれる。

【０００３】 ペプチド誘導薬剤の開発により、それらの薬剤がGI管のみならず血流内におい
て酵素分解の影響を受けやすいと言う問題がさらに提起された。この問題を処理
した例は、リポゾームまたは重合体極小球へのペプチドの取込みであって、ペプ
チドをリンパ系に対する標的にする。

【０００４】 さらに、細胞間で機能する薬剤に関する問題は、細胞膜によって生ずる関門で
ある。薬剤の半減期を増大すること、あるいは、薬剤が変性を受けることなしに
人体を通過することを確実にするのは、可能であろう。多数の薬剤が実際に細胞
内に入って治療効果を発揮しているに違いない。

【０００５】 ホメオタンパク質は、多重の形態的プロセスに関与するトランス活性化因子で
ある。このタンパク質は、６０のアミノ酸残基の配列、いわゆるホメオドメイン
を介してＤＮＡに結合する。このドメインの構造は、ヘリックス２と３との間の
βターンによりさえぎられた３つのαヘリックスからなる（Gehring, W. J. et
al., (1990) Trends Genet 6, 323-9)。多数のホメオタンパク質の間での系統発
生的関係は、ホメオドメインのレベルで、特に第３αヘリックス内で顕著である
。このヘリックスは、ＤＮＡとの相互作用と、細胞膜を越えて細胞核に移行する
ホメオタンパク質の能力との両方を、非特異的に担う。

【０００６】 欧州特許485578は、ホメオドメイン、特にホメオボックスペプチドのヘリック
ス３、とりわけDrosophila Antennapedia から誘導されたものが、細胞内輸送ベ
クターとして有用であることを開示している。この開示によると、Drosophila A
ntennapedia ホメオペプチド(pAntp ペプチドと呼ぶ)の特異的５７アミノ酸配列
が、線維芽細胞および胚細胞(in vivo)を貫通し得た。強調されているのは、配
列の最後２７番目のアミノ酸であり、この配列はヘリックス３および４に対応す
る。pAntp ペプチドが他のペプチドまたは薬剤と結合しているかどうかについて
は記述がない。

【０００７】 上記に続く開示(Derossi D et al., J Biol Chem (1994)269, 10444-10450, J
oliot AH et al., (1991)The New Biol 3, 1121-1134 and PNAS (1991)88, 1864
-1868, Perez F et al., J Cell Sci (1992)102, 712-722)はすべて、Antennape
dia ホメオドメインの第３ヘリックスから誘導された１６アミノ酸合成ペプチド
を、生物活性産物およびアンチセンス・オリゴヌクレオチドの細胞内配送に使用
する方法に関する。このペプチドのアミノ酸配列は、ペネトラチンとしても知ら
れるRQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号1)である。この研究過程において、同著者は、
この配列についてのいくつかの変異体、ｐＡｎｔｐペプチドの残基４１−６０、
４１−５５、４６−６０に対応する変異体を合成しており、すべての場合で、細
胞中に取り込まれるペプチドのみが、残基４３−５８を含むペプチドであったこ
とを報告している（Derossi D et al.、前出)。

【０００８】 このペプチドの酵母による開裂を防ぐために、Brugidou J et al.,(Biochem B
iophys Res Comm (1995)214(2), 685-693)は、ペネトラチンの３および５位に存
在する２つのイソロイシンをバリンで置換し、Ｃ端末にグリシン残基を加えて、
レトロまたは逆型(逆順のＤアミノ酸、配列番号１)を調製し、樹脂との結合を容
易にした。余分のグリシンを、メルカプト・リンカー基を介し結合するコレステ
ロール部分で置換して、さらに別のレトロまたは逆型を調製した。コレステロー
ル部分を加えることで、分子の疎水性増大に起因する貫通の問題を改善した。

【０００９】 ペネトラチンのレトロまたは逆型のこの開発に基づくWO 97/12912は、１６ア
ミノ酸のペプチドが６〜１０疎水性アミノ酸を含み、いずれかの末端から第６番
目のアミノ酸がトリプトファンであることを開示する。この開示は、内在化ベク
ターとして作用し得る配列の最低限の特徴を明確にすることを意図している。ア
ミノ酸末端から第６位でトリプトファン残基が保持され、ペプチドが６〜１０の
疎水性アミノ酸残基を含有している（WO 97/12912での疎水性アミノ酸残基の分
類は、一般に認められている分類に合致していない)。

【００１０】 WO 97/12912が要約するような上記の開示からの結論によると、ホメオドメイ
ン・ペプチドの膜移行性に必須なのは、アミノ酸末端から第６番目のアミノ酸と
してのトリプトファンの存在である。この要件に適合するのは、移行能を有する
とされている式(KWKK)₄のペネトラチン変異体であった（Maruta H el al. Cytos
keletal numour suppressors that block ongogenic RAS signalling. Presente
d at Anti-Cancer Proteins and Drugs: Structure, Function and Design; 6-9
November 1998, New York Academy of Sciences. Poster/abstract No. 11)。P
lank C et al. (Human Gene Therapy, (1998) 10, 319-332)は、(KWKK)₄KGGCな
どの多数の分枝された膜移行ペプチドを開示している。各KWKKは続くリシン残基
に結合している。

【００１１】 本発明は、ペネトラチンを基とする広範な膜移行ペプチドを提供しようとする
。ペプチドには、アミノ酸の末端から第６残基としてトリプトファン残基を含有
しないペプチド、およびペネトラチンより小さいペプチドが含まれる。この小さ
いまたは末端切除の型のペネトラチンは、利点があって、医薬産業に配送担体部
分としてさらに受け入れられる。これは、有益な免疫原性、安定性、クリアラン
スを有し、ある場合には、完全長のペネトラチン（配列番号１）を含むコンジュ
ゲートの使用に比して有益な効力を有する担体−貨物体分子コンジュゲートによ
る。従って、本発明の第１態様は末端切除ペネトラチン誘導体に関し、第２態様
は改変型のペネトラチンに関する。これらの第１および第２態様を詳しく下記す
るが、両者は以下では貨物体配送系の「担体部分」を意味する。

【００１２】 つまり、本発明の第１態様は、下記式の膜移行ペプチド担体部分に関する。 RQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号１） 1 16 式中、アミノ末端から少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失している。または、
その変異体である。驚くべきことに、先行技術の教示と異なり、細胞膜に移行す
る能力はｐＡｎｔｐペプチドの残基４３−５８の全体を含有していない配列でも
って、保持されることがわかった。

【００１３】 本発明によると、９個までのアミノ酸がアミノ末端から欠失できる。好ましく
は、６〜９個のアミノ酸を欠失する。

【００１４】 好ましい実施態様において、本発明のペプチド担体部分は表１に示す化合物２
−２０を含む。その下に、生化学アッセイの目的で使用されたビオチニルβＡｌ
ａハンドルをともに示す。さらに好ましい実施態様において、ペプチドは化合物
１６、１７、１８、１９である。

【００１５】 つまり、好ましい実施態様において、担体部分は、ペプチド配列 RRMKWKK ま
たはその変異体を含んでいて、１５個までのアミノ酸残基および少なくとも下記
式： RRMKWKK （Ｉ） 1 7 を含む膜移行ペプチド担体部分またはその変異体と好ましくは定義し得る。第１
態様に関して説明する好ましい実施態様は、式（Ｉ）のペプチドに全体的に適用
する。ある実施態様において、式（Ｉ）のペプチドに加えられるアミノ酸残基は
、ペネトラチンまたはその変異体中の残基に対応するものである。

【００１６】 この配列（式（Ｉ）の）およびその変異体は、膜移行を容易にするのに必要な
ペネトラチン分子の最小配列とみられる。従って、上記の実施態様は、ペプチド
のいずれかの端から第６位でのトリプトファンの存在が膜移行にとって必須でな
いとの見解を支持する。

【００１７】 本発明のペプチド担体部分についての上記定義の範囲内で、ペプチドの具体的
なアミノ酸残基を、移行能力を保持しながら、改変できる。この改変ペプチドを
「変異体」と呼ぶ。

【００１８】 上記に定義した担体部分の変異体は、以下のいかなる改変も含む。（ａ）１以
上のアミノ酸残基が自然界に存在または不存在のアミノ酸残基で置換される、（
ｂ）２以上のアミノ酸の順序が入れかえられる、（ｃ）（ａ）と（ｂ）が同時に
存在する、（ｄ）スペース基が２つのアミノ酸残基の間に存在する、（ｅ）１以
上のアミノ酸残基がペプトイド形態である、（ｆ）ペプチドの１以上のアミノ酸
残基の（Ｎ−Ｃ−Ｃ）骨格が改変されているか、（ａ）−（ｆ）の組み合わせで
ある。好ましくは、変異体は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の１つから生じる。

【００１９】 このように、相同性置換（置換および置き換えは、存在するアミノ酸残基と別
の残基との相互変換を意味するのに使用する）は、塩基性と塩基性、酸性と酸性
、極性と極性などの同じ同士の置換を起こし得る。非相同性置換も１つのクラス
の残基から別の残基へと起こし得る。これには、自然界に存在しないアミノ酸、
例えば、オルニチン（以下、Ｚという）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと
いう）、ノルロイシン・オルニチン（以下、Ｏという）、ピリイルアラニン、チ
エニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシンの導入を含む。詳細なリ
ストは下記する。各ペプチド担体の内部で２以上のアミノ酸残基を同時に改変し
得る。

【００２０】 本明細書で使用するように、アミノ酸は下記のクラスに従って分類する。 塩基性；Ｈ、Ｋ、Ｒ 酸性；Ｄ、Ｅ 非極性；Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ 極性；Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ （国際的に認められている単一文字のアミノ酸略記を使用） これらのクラスを用いて、相同性置換および非相同性置換を定義する。すなわち
、相同性置換は同じクラス内での置換を意味し、非相同性置換は相違するクラス
内での置換または自然界に存在しないアミノ酸による置換を意味する。

【００２１】 担体部分の２つのアミノ酸残基の間に挿入できる適当なスペーサー基には、グ
リシンやβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチル
、プロピルなどのアルキル基がある。変異の別の形態、型（ｅ）は、ペプトイド
形態における１以上のアミノ酸残基の存在を含み、当業者によく知られている。
疑義を避けるために、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素でなく
残基の窒素原子上にある変異アミノ酸残基を意味するのに使用する。ペプトイド
形態におけるペプチドの製造方法は既知である。例えば、Simon RJ et al ., PN
AS (1992) 89(20), 9367-9371 および Horwell DC, Trends Biotechnol.(1995)
13(4), 132-134。型（ｆ）改変は、国際出願 PCT/GB99/01855 に記載の方法など
により生じ得る。

【００２２】 式（Ｉ）の定義において示したように、アミノ酸変異、好ましくは型（ａ）ま
たは（ｂ）が位置１、２、３、５、６のいずれでも独立的に起きることが好まし
い。さらに好ましくは、アミノ酸変異は、位置３または７、特に３で起きる。相
同性置換は、位置１および２が好ましいことがわかり、一方、驚くべきことに、
位置３、４、５、６が非相同性置換を受け入れることが観察された。上記によう
に、２以上の相同性または非相同性の置換が同時に、例えば、位置２と３、４と
５、５と６で起こり得る。さらなる変異が、配列内のいくつかのアミノ酸の配列
を変換することで起こり得る。例えば、ペプチド配列 RRMKWKK おいて、リシン
とトリプトファン残基を変換すると、ペプチド RRMWKKK を得る。この改変は、
相同性または非相同性の置換を組み合わせて追加的に生じ、例えば、配列 RROKW
KK が RROWKKK になる。

【００２３】 担体部分はアミノ末端にアミノ酸残基をさらに含み得る。より好ましくは、１
から３個のアミノ酸残基の付加による。このように、本発明のさらなる実施態様
は、RRMKWKK、NRRMKWKK、QNRRMKWKK、FQNRRMKWKK から選択されたペプチドに関
する。

【００２４】 本発明の第１態様の最も好ましい実施態様において、ペネトラチンの末端切除
形は、上記の式（Ｉ）またはKRMKWKK、RKMKWKK、RREKWKK、RRQKWKK、RROKWKK、R
RMKQKK、RRMKWFK、RORKWKK、RRMWKKK、RROWKKK、RRMKKWK、RROKKWKから選択され
た７個のアミノ酸ペプチドであり、さらに好ましくは、ペプチド担体部分は RRM
KWKK である。

【００２５】 本発明の第２態様は、下記式の膜移行ペプチド担体部分に関する。 RQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号１） 1 16 式中、少なくとも１つのアミノ酸が別の自然界に存在または非存在の置換アミノ
酸残基で置換されている。

【００２６】 本発明の第２態様の好ましい実施態様において、ペプチドのアミノ末端からの
第６アミノ酸残基はトリプトファンではない。下記するように、この位置にトリ
プトファンが存在しなければならないとする以前に認められていた原則を見出し
得ないことを明かにし、広範な膜移行ペプチドを同定した。

【００２７】 好ましい実施態様において、本発明のペプチド担体部分は、表３に示す配列番
号における化合物２１から３６を含む。この表の下に、これらの化合物は、生化
学アッセイの目的で使用するビオチン−βＡｌａハンドルとともに示す。さらに
好ましい実施態様において、ペプチドは化合物２６などの化合物であり、ペプチ
ドのアミノ末端からの第６アミノ酸残基はトリプトファンではない。

【００２８】 ある実施態様において、置換アミノ酸残基は、アラニン、アルギニン、アスパ
ラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、
ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン
、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンの残基か
ら選択する。置換アミノ酸残基は、自然界に存在しないアミノ酸から追加的に選
択し得る。本発明のペプチド担体部分についての上記定義の範囲内で、ペプチド
の具体的なアミノ酸残基を、移行能力を保持しながら、改変できる。この改変ペ
プチドを「変異体」と呼ぶ。

【００２９】 上記に定義した担体部分の変異体は、以下のいかなる改変も含む。（ａ）１以
上のアミノ酸残基が自然界に存在または不存在のアミノ酸残基で置換される、（
ｂ）２以上のアミノ酸の順序が入れかえられる、（ｃ）（ａ）と（ｂ）が同時に
存在する、（ｄ）スペース基が２つのアミノ酸残基の間に存在する、（ｅ）１以
上のアミノ酸残基がペプトイド形態である、（ｆ）ペプチドの１以上のアミノ酸
残基の（Ｎ−Ｃ−Ｃ）骨格が改変されているか、（ａ）−（ｆ）の組み合わせで
ある。好ましくは、変異体は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の１つから生じる。

【００３０】 このように、相同性置換（置換および置き換えは、存在するアミノ酸残基と別
の残基との相互変換を意味するのに使用する）は、塩基性と塩基性、酸性と酸性
、極性と極性などの同じ同士の置換を起こし得る。非相同性置換も１つのクラス
の残基から別の残基へと起こし得る。これには、自然界に存在しないアミノ酸、
例えば、オルニチン（以下、Ｚという）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと
いう）、ノルロイシン・オルニチン（以下、Ｏという）、ピリイルアラニン、チ
エニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシンの導入を含む。各ペプチ
ド担体の内部で１以上のアミノ酸残基を同時に改変し得る。

【００３１】 本明細書で使用するように、アミノ酸は下記のクラスに従って分類する。 塩基性；Ｈ、Ｋ、Ｒ 酸性；Ｄ、Ｅ 非極性；Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ 極性；Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ （国際的に認められている単一文字のアミノ酸略記を使用） これらのクラスを用いて、相同性置換および非相同性置換を定義する。すなわち
、相同性置換は同じクラス内での置換を意味し、非相同性置換は相違するクラス
内での置換または自然界に存在しないアミノ酸による置換を意味する。

【００３２】 担体部分の２つのアミノ酸残基の間に挿入できる適当なスペーサー基には、グ
リシンやβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチル
、プロピルなどのアルキル基がある。変異の別の形態、型（ｅ）は、ペプトイド
形態における１以上のアミノ酸残基の存在を含み、当業者によく知られている。
疑義を避けるために、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素でなく
残基の窒素原子上にある変異アミノ酸残基を意味するのに使用する。ペプトイド
形態におけるペプチドの製造方法は既知である。例えば、Simon RJ et al ., PN
AS (1992) 89(20), 9367-9371 および Horwell DC, Trends Biotechnol.(1995)
13(4), 132-134。

【００３３】 本発明の第１または第２態様にいずれかで使用し得る自然界に存在しないアミ
ノ酸は次のものを含む。アルファ^＊およびアルファ−ジ置換^＊アミノ酸、Ｎ−ア
ルキルアミノ酸^＊、乳酸^＊、天然型アミノ酸の塩化誘導体、例えば、トリフルオ
ロチロシン^＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン^＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン^＊ 、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン^＊、Ｌ−アリルグリシン^＊、β−アラニン^＊、Ｌ−
α−アミノ酪酸^＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸^＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸^＊、Ｌ−ε
−アミノカプロン酸^＃、７−アミノヘプタン酸^＊、Ｌ−メチオニンスルフォン^{＃ ＊} 、Ｌ−ノルロイシン^＊、Ｌ−ノルバリン^＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニ
ン^＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン^＃、Ｌ−チオプロリン^＊、フェニルアラニン（Ｐ
ｈｅ）のメチル誘導体、例えば、４−メチルＰｈｅ^＊、ペンタメチルＰｈｅ^＊、
Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）^＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）^＊、ＬＰｈｅ（４−イソプ
ロピル）^＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１,２,３,４−テトラヒドロイソキノリン−３−カル
ボン酸）^＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸^＃、Ｌ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）^＊。上
記の目的に用いて、記号^＊は誘導体の疎水性を示し、^＃は誘導体の親水性を示し
、^＃＊は両性を示す。

【００３４】 本発明のペプチド担体部分は、Ｌ型またはＤ型のアミノ酸を含み得る。すなわ
ち、１以上の残基、好ましくはすべての残基がＬ型またはＤ型であり得る。この
実施態様において、ペプチドはレトロ型、例えば、ペプチド KKWKORR であり得
る。

【００３５】 本発明の好ましい実施態様において、ペプチドのアミノ末端からの第６アミノ
酸残基はトリプトファンではない。

【００３６】 本発明の膜移行ペプチドは細胞膜に移行し得る。好ましい実施態様において、
核膜に移行し得る。ペプチドが細胞／核の外部から、または内部から移行したか
、すなわち、ペプチドが細胞質または核内で生じ（例えば、そこで合成されたか
、その区画に挿入されたかによって）、そして生じた細胞区画の外部に移行され
たかは、関係がない。一般的に、ペプチドは、細胞の外側でつくられ、外の位置
から細胞質に、次いで選択的に核に移行する。

【００３７】 本明細書で用いられるように、「細胞膜移行」は、細胞膜を通って細胞基質／
細胞質に入るか、または細胞基質／細胞質から外部、細胞外または間質空間へ通
るペプチドの能力を意味する。

【００３８】 図１は、本発明の第１態様に従ってつくられたペプチド担体部分のいくつかに
ついてのＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。

【００３９】 図２は、本発明の第１態様に従ってつくられたペプチド担体部分を用いて行っ
た細胞内在化アッセイの結果を示す。

【００４０】 図３は、化合物３９（フルオレノン標識ペネトラチン）を用いて行った細胞内
在化アッセイの結果を示す。

【００４１】 図４（Ａ、Ｂ、Ｃ）は、化合物３９を用いて行った細胞内在化アッセイの実時
間の視覚化を示す。

【００４２】 図５は、本発明の第２態様に従ってつくられたペプチド担体部分を用いて行っ
た細胞内在化アッセイの結果を示す。

【００４３】 本発明のさらなる態様において、ペプチド担体部分（第１または第２態様に従
って末端切除または改変された形のペネトラチン）を貨物体部分に結合して、細
胞移行ベクターをつくる。貨物体部分は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、
タンパク質、ペプチド、生物学的に活性の化合物、診断剤、これらの組合せを含
む。

【００４４】 好ましい実施態様において、貨物体部分はタンパク質またはペプチドであり、
さらに好ましい実施態様において、貨物体部分は薬剤などの生物学的に活性の物
質である。

【００４５】 貨物体部分は担体部分に直接または間接に結合し得る。貨物体部分が担体部分
に間接に結合する実施態様において、結合は、介在結合基、例えば、フルフィド
リルやカルボキシルなどの基またはさらに大きい基によってなされ得る。このよ
うな基すべてを、下記ではリンカー部分と呼ぶ。好ましくは、担体部分および貨
物体部分は直接に結合している。

【００４６】 適当なオリゴヌクレオチド貨物体部分の例として、遺伝子、遺伝子断片、ＤＮ
Ａ配列、ｃＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ヌクレオチド、ヌクレオシド、合成または
非合成の異項環基、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ヌクレアー
ゼ耐性骨格を有するものを含む）などがあり、いずれも放射活性標識を包含し得
る。これらは、細胞へ配送するのに、または細胞から外部へ配送するのに望まし
い。好ましくは、オリゴヌクレオチド貨物体部分は遺伝子またはその断片である
。

【００４７】 適当なタンパク質またはペプチドの貨物体部分の例には次のものがある。タン
パク質、ペプチド、これらの誘導体、例えば、抗体およびその断片；サイトカイ
ンおよびその誘導体または断片、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、特にその
サブタイプ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、
ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；コロニ
ー刺激因子、例えば、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子、顆粒球−コ
ロニー刺激因子（アルファおよびベータ型）、マクロファージ・コロニー刺激因
子（ＣＳＦ−１としても知られる）；ヘマトポイエチン、例えば、エリスロポイ
エチン、ヘマトポイエチン−α、キット−リガンド（幹細胞因子すなわち Steel
因子としても知られる）；インターフェロン（ＩＦＮＳ）、例えば、ＩＦＮ−
α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ；生長因子および二重機能性モジュレーター、例え
ば、表皮生長因子、血小板誘導生長因子、形質転換生長因子（アルファおよびベ
ータ型）、アンフィレグリン、ソマトメジン−Ｃ、骨生長因子、線維芽細胞生長
因子、インスリン様生長因子、ヘパリン結合生長因子、腫瘍生長因子；分化因子
など、例えば、マクロファージ分化因子、分化誘発因子（ＤＩＦ）、白血病阻害
因子；活性化因子、例えば、血小板活性化因子、マクロファージ活性化因子；凝
固因子、例えば、ヘパリン、プロテアーゼおよびそのプロ因子を含む線維素溶解
／抗凝固物質、例えば、凝血因子VII、VIII、IX、X、XI、XII、アンチトロンビ
ンIII、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プ
ロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン・アクチベーター、フィブリノーゲン、
ヒルジン；ペプチドホルモン、例えば、インスリン、生長ホルモン、ゴナンドト
ロピン、卵胞刺激ホルモン、leutenishing ホルモン、生長ホルモン放出ホルモ
ン、カルシトニン；酵素、例えば、スーパーオキシド・ジスムターゼ、グルコセ
レブロシダーゼ、アスパラギナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ；ワクチンまた
はその抗原、例えば、肝炎Ｂワクチン、マラリア・ワクチン、黒色腫ワクチン、
ＨＩＶ−１ワクチン；転写因子および転写モジュレーター。さらに好ましくは、
貨物体は細胞周期を妨害するタンパク質またはペプチドから選択されたタンパク
質またはペプチドであり得る。例えば、ｐ５３ペプチドまたはその断片、ｐ２１ ^WAF ペプチドまたはその断片、例えば、WO 96/14334 および WO 97/42222 に記載
のもの、Ｆｅｎｌペプチドまたはその断片、例えば、WO 96/35715 に記載のもの
、ｐ１６ペプチドまたはその断片、例えば、WO 97/11174 に記載のもの、および
その断片および誘導体がある。

【００４８】 適切な非ヌクレオチド／タンパク性生物学的に活性な貨物体部分の例は、下記
から選択される薬剤部分である。すなわち、薬剤部分は、細胞毒性剤、抗腫瘍剤
、抗高血圧剤、心臓保護剤、抗不整脈剤、ＡＣＥ阻害剤、抗炎症剤、利尿剤、筋
弛緩剤、局所麻酔剤、ホルモン剤、コレステロール降下剤、抗凝固剤、抗抑うつ
剤、鎮静剤、神経弛緩剤、麻薬または解熱鎮痛剤のような鎮痛剤、抗ウイルス剤
、抗菌剤、抗真菌剤、静菌剤、ＣＮＳ活性剤、抗痙攣剤、抗不安剤、制酸剤、睡
眠剤、抗生物質、呼吸器剤、抗ヒスタミン剤、免疫抑制剤、免疫活性剤、栄養添
加剤、鎮咳剤、診断薬、催吐および抗嘔吐剤、炭水化物、グリコソアミノグリカ
ン、糖タンパク質、ポリサッカライド；脂質、例えば、ホスファチジル−エタノ
ールアミン、ホスファチジルセリンおよびその誘導体；スフィンゴシン；ステロ
イド；ビタミン；ランチビオティックを含む抗生物質；静菌および殺菌剤；単一
細胞病原体を含む感染物に効果的な駆虫剤などの物質；小さいエフェクター分子
、例えば、ノルアドレナリン、アルファ・アドレナリン性受容体リガンド、ドパ
ミン受容体リガンド、ヒスタミン受容体リガンド、ＧＡＰＡ／ベンゾジアピン受
容体リガンド、セロトニン受容体リガンド、ロイコトリエン、トリオドチロニン
；細胞毒性剤、例えば、ドキソルビチン、メトトレキセートおよびその誘導体で
ある。

【００４９】 薬剤部分は、細胞毒性剤または抗腫瘍薬剤、特に癌治療に用いる薬剤またはそ
の光活性形の薬剤であるのが好ましい。そのような薬剤は一般的に、ＤＮＡ障害
剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、天然産物およびその類似物、ジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ阻害剤、ピリミジン類似物、プリン類似物、サイクリン依存性キナー
ゼ阻害剤、チミジル酸シンターゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡク
リーバー、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリン類、ニチニチソウ薬剤
、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジン薬剤、
ジイネン類、ポドフィロトキシン、白金含有薬剤、分化誘導物質、タキサン類を
含む。特に有用なこのクラスの薬剤は、例えば、メトトレキサート、メトプテリ
ン、ジクロロメトトレキサート、5-フルオロウラシル、6-メルカプトプリン、オ
ロムシン、レスコビチン、ボヘミン、プパラノールのような3-置換プリン、フラ
ボピリドル、スタウロスポリン、シトシン・アビノシド、メルファラン、ロイロ
シン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシン D
、マイトマイシン A、カルニノマイシン、アミノプテリン、タリノマイシン、ポ
ドフィロトキシン、エトポシド、シスプラチン、カルボプラチニウム、ビンブラ
スチン、ビンクリスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタクセル、タキソ
エール・レチオニル酸、酪酸、アセチル・スペルミジン、タモキシフェン、イリ
ノテカン、カンプトデシンを含む。最も好ましい薬剤部分は、オロムシン、ロス
コビチン、ボヘミン、フラボピリドル、スタウロスポリン、ポドフィロトキシン
、エトポシド、プルバラノル誘導体、タキソル、パクリタキセル、カンプトテシ
ンから選択する。

【００５０】 上記のごとく、薬剤部分と担体部分とは、直接あるいはリンカー部分を介して
間接に結合し得る。直接結合は、薬剤部分上のヒドロキシ、カルボキシまたはア
ミノ基のような、適切なすべての官能基によって生じる。好ましい間接結合は結
合化部分によって生じる。適切な結合化部分は、二官能基および多官能基のアル
キル、アリール、アラルキルまたはペプチド部分、アルキル、アリール、アラル
キルのアルデヒド酸エステルおよび無水物、マレイミド安息香酸誘導体、アレイ
ミドプロピオン酸誘導体、スクシニミド誘導体のようなメルカプトまたはカルボ
キシル基を含み、あるいは、シアヌル臭化物または塩化物からの誘導体、カルボ
ニルジイミダゾール、スクシニミジル・エステルまたはスルホン・ハロゲン化物
などを含む。一方でリンカーと薬剤の共有結合形成に、片方でリンカーと担体部
分の共有結合形成に使われるリンカー部分上の官能基は、２個以上の、例えば、
アミノ、ヒドラジド、ヒドロキシル、チオール、マレイミド、カルボニル、カル
ボキシル基などであり得る。リンカー部分は、１〜４個のアミノ酸残基の短い配
列を含む。この配列は、リンカー部分が担体部分に結合するのを仲介するシステ
イン残基を場合により含む。

【００５１】 本発明にしたがえば、各担体部分は少なくとも１個の薬剤部分と結合している
。別の態様において、担体部分は、２個以上の貨物体部分と容易に結合するよう
に調製する。各貨物体部分は同一または相違のものである。例えば、担体部分は
、天然のアミノ酸の誘導体などの貨物体部分の接着または多価合成アミノ酸の挿
入を容易にする成分を含み得る。あるいは、結合などを容易にするための具体的
な適応は、例えば、結合化部分として担体部分に結合させ得る分枝リシン残基の
ネットワークによる。各リシン残基が貨物体部分に結合する。この方法において
、単一の担体部分が３２個までの貨物体部分、好ましくは２〜１０個、さらに好
ましくは４〜５個の貨物体部分を保持し得る。このさらなる態様において、各薬
剤部分は担体部分と、直接に、または同一または相違のリンカー部分を介して間
接に、結合している。２以上の異なる種類の貨物体部分が結合する場合、個々の
薬剤の割合と投与量を合わせて調整し、具体的な貨物体組合せの投与を容易にし
得る。

【００５２】 この態様の好ましい例において、担体部分が、３２個までの貨物体部分との結
合が容易である少なくとも１個の端末に結合したリシン残基のネットワークを有
するペプチド担体部分である。

【００５３】 本発明のさらに別の態様において、移行ベクターは標的化部分をさらに含む。
標的化部分は、担体部分を貨物体部分の機能にとって好ましい特別な細胞型に誘
導できる。そうすると、標的化部分は、アドレス・システムとして作用し、体内
の薬剤分布を偏らせ、配送システムを特定の細胞に偏向させる。標的化部分は、
貨物体部分に、またはより好ましくは担体部分に結合せしめ得る。到達すると、
そこで担体部分は貨物体の細胞内在化を容易にする。

【００５４】 適切な標的化部分は、E Ruoslahti et al.(US特許5,622,699; Pasqualini, R,
Ruoslahti, E. Nature(London)(1996),380, 364-366,Ruoslahti, E. Ann. Rev.
Cell Dev.Biol.(1996),12,697-715; Arap, W, Pasqualini, R, Ruoslahti, E, S
cience (1998), 279, 377-380) に同定されているペプチド配列を含む。これら
の開示（出典明示により本明細書の一部とする）は、あるペプチドがある型の細
胞に対してアドレス・ラベルとして作用することを記述している。

【００５５】 本発明の上記の実施態様に従って、ペプチド担体部分を含むアミノ酸（そのい
ずれの数の、好ましくは、そのすべて）は、ＬまたはＤ（または逆）形であり得
る。さらに好ましくは、Ｌ形である。

【００５６】 さらなる実施態様において、上記の担体部分はレトロ形であり得る。この実施
態様において、ペプチド担体部分を含むアミノ酸（そのいずれの数の、好ましく
は、そのすべて）は、ＬまたはＤ（または逆）形であり得る。

【００５７】 貨物体部分がタンパク質またはペプチド自体であるとき、担体および貨物体の
部分は、両者ともＬまたはＤ形であり得、あるいは、担体がＬ形で貨物体がＤ形
、または担体がＤ形で貨物体がＬ形であり得る。

【００５８】 ペネトラチンまたはその誘導体として定義された担体部分において、本発明の
明細で利点がある更なる改変は、カルボキシ末端アミノ酸残基の遊離カルボキシ
基の、カルボキサミド基への転換である。例として、担体部分が式Ｉ（RRMKWKK
）であるとき、カルボキシ末端リシン残基は、カルボキサミド基に転換されたカ
ルボキシル基を有し得る。この改変は、全体として、担体部分の安定性および配
送システムを高めると考えられる。このように、Ｃ末端アミノ酸残基は-C(O)-NR
R'であり得る。なお、R および R'は、水素、C1-6 アルキル、C1-6 アルキレン
、C1-6 アルキニル（合わせて、「alk」とする）ベンジルまたはアルカリールな
どのアリール、各々がＯ、Ｓ、Ｎなどのヘテロ原子により選択的に置換されてい
るものから選択される。好ましくは、R または R'の少なくとも１つが水素であ
り、さらに好ましくは両者とも水素である。

【００５９】 このように、最も好ましい実施態様において、本発明は、選択的にアミデート
化された末端リシン残基を有する担体部分 RRMKWKK に関する。この残基は、ｐ
２１^WAF誘導ペプチド、ｐ１６誘導ペプチド、薬剤、レスコビチン、タキソル、
ポドフィロトキシンから選択された貨物体部分に直接働く。

【００６０】 本明細書に記述する配送システムは、新規の化学的存在である。ここに開示す
る具体的な化学的存在は次の内容を含む；

【表２】

【００６１】 配送システムの投与の結果得られる治療効果は、無活化配送システムあるいは
その解離成分から生じる。このものは、貨物体部分、すなわち単独またはリンカ
ーと結合の貨物体部分、リンカーの部分またはリンカー、または担体の部分を含
む。かくして、本明細書における「配送システム」なる用語は、その通常の意味
、すなわち、貨物体部分などのものを配送するシステムなる意味で用いる。それ
に加えて、その無活化状態において活性を示すようなシステムあるいはそのすべ
ての構成部分を含む意味でもある。かくして、上記で検討したシステムが提供す
る利点は、貨物体および配送システムに適用できる。

【００６２】 配送ベクターは、業界既知のいかなる方法でも調製できる。例えば、担体部分
ペプチドの会合は、溶液または固体のペプチド合成法で行うことができ、脱保護
反応形態の末端アミノ基のみを有する完全保護の先駆物質を得る。この機能体は
貨物体部分またはその適切な活性誘導体と直接に反応させ得る。あるいは、この
アミノ基は、貨物体部分またはリンカーとの反応に適した別の官能基に転換でき
る。かくして、例えば、アミノ基とコハク酸無水物との反応が選択的に処理でき
るカルボキシル基を提供し、一方、さらにシステイン誘導体によるペプチド鎖伸
長が選択的に処理できるチオール基をもたらす。ひとたび適切な選択的に処理で
きる官能基が配送ベクター前駆体中で得られると、貨物体部分またはその誘導体
は、例えば、アミド、エステルまたは二硫化物の結合形成を通じて結合する。あ
るいは、リンカー基、例えば、m-マレイミドベンゾイルは、リンカー基前駆体と
配送ベクター前駆体の選択的に処理できる機能体との反応により導入され、つい
でリンカー基と貨物体部分間の共役結合形成が生じる。多価貨物体配送ベクター
構造物は、なかでも、三価化学基を有する選択的に処理できる配送ベクター前駆
体の連続的伸長によって得られる。例えば、N^α,ε-Fmoc-保護リシン誘導体によ
るペプチド鎖伸長が、2価、4価、8価の構造物前駆体を、１個、２個、３個の結
合/Fmoc-脱保護サイクルの後に生ずる。

【００６３】 これらの方法を使って、当業者は、さまざまなリンカー部分を利用していろい
ろな貨物体-担体の共役体を調製できる。下記に例示するように、貨物体部分上
の適切な基を、担体部分への連結のために、それに、所望により貨物体部分ある
いは担体部分またはその両方に連結するリンカーのために選択し得る。

【００６４】 本発明の化合物は、生理的に許容し得る希釈剤または担体によって、哺乳動物
などに対する獣医用と、特にヒト用の医薬としての使用のために、いろいろな方
法で製剤できる。例えば、これらの化合物は、実例をあげれば、液体の希釈剤あ
るいは担体を含有する組成物として使用できる。例えば、水性または油性の溶液
、懸濁液または乳濁液がある。非経口投与のために注射形態でしばしば用いるこ
とができ、このものは、好都合には無菌であって発熱物質を含まない。経口投与
もまた行うことができる。この目的には組成物は液体の希釈剤または担体を含有
し得るが、通常の固形担体用材、例えば、デンプン、ラクトーゼ、デキストリン
、ステアリン酸マグネシウムを使用するのが普通である。そのような固形組成物
は、粉末の形をとり得るが、より都合のよい形態としては、例えば、錠剤、カシ
ェ剤、カプセル(スパンスルを含む)がある。あるいは、より特殊な製剤形として
リポソームおよび微細粒がある。

【００６５】 注射あるいは経口型投与の他には、ヒトおよび獣医関係の両方に使用する投与
方法として座剤あるいはペッサリーを含む。その他の医薬組成物の形態には、口
腔あるいは鼻腔投与、肺胞組織のような気道投与がある。その他、局所投与用の
製剤は、ローション、軟膏剤、クリーム、ゲル、スプレイを含む。

【００６６】 組成物は、単位用量形態、すなわち、単位用量あるいは単位用量の多重または
サブ単位を含む個別分離形態で製剤し得る。

【００６７】 本発明の移行ベクター配送は、既存の配送システムに優れる多数の利点を提供
する。これらの利点は、従来の治療と比較すると、改善された効力、薬剤の細胞
摂取の改善、水溶性の改善、副作用の軽減および細胞内生物学的利用能、薬剤耐
性発生の減少を含む。

【００６８】 [実施例] 実施例１：ペネトラチン(配列番号１)の末端切除形である一連のペプチド（ペ
プチド１-２０）の調製 略語 アミノ酸およびペプチド命名法はＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ法(Eur. J. Biochem. 198
4, 138, 9-37)に従っている。その他の略語：Ａｈｘ、６-アミノヘキサノイル；
ＡＰａｓｅ、アルカリホスファタ-ゼ； ＤＥ ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ、遅延抽
出マトリックス補助レーザーデソ-プションイオン化飛行時間型質量分析法；Ｄ
ＩＥＡ、Ｎ,Ｎジイソプロピルエチルアミン；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水（
１０ ｍＭ ホスフェート、１５０ ｍＭ、ＮａＣｌ、ｐＨ ７.４）;ＰｙＢＯＰ、
ベンゾトリアゾール-１-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフ
ルオロホスフェート；ＲＰ-ＨＰＬＣ、逆相高性能液体クロマトグラフィー；Ｔ
ＦＡ、トリフルオロ酢酸。

【００６９】 １．１：試料および方法 概要 全体を通じて用いたペプチドの脱保護／切断混合物は以下である：０.７５:０
.５:０.５:０.２５:１０ (w/v/v/v/v) フェノ-ル、水、チオアニソール(PhSMe)
、１,２-エタンジチオール、ＴＦＡ(Beavis, R. C.ら,. (1992) Orgaruc Mass S
pectrometry 27, 156-158)。分析および分取ＲＰ-ＨＰＬＣは、Vydac 218TP54(4
.6×250mm)および218TP1022(22×250mm)の各カラムを用いて行った。分析には流
速１ｍＬ/分また調製には流速９ｍＬ/分を用いた（２５℃）。２０分（分析）お
よび４０分 (分取)にわたって、水溶液中のＭｅＣＮを増加しながら勾配溶出を
行った。溶出物をλ＝２００〜３００ｎｍでモニターした。ペプチドサンプルも
また、ＤＥ ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ（Thermo Bio分析, Hemel Hempstaed, England)
分光光度計を用いて分析した。α-シアノ-４-ヒドロキシ桂皮酸マトリックス(Be
avis, RC.ら, (1992) 有機マススペクトル 27, 156-158)を用い、質量範囲１,０
００ないし２,６００の範囲にある標準ペプチドを用いて較正した。

【００７０】 １.２：ペプチド１-２０の同時多重合成 ペプチドを、マルチプチオン(Multiptin)・ペプチド・合成キット(Chiron Tec
hnologies Pty, Ltd., Clayton, VIC, Australia)を用いて合成した。ペプチド
鎖を、Ｆｍｏｃ 酸(ＤＭＦ中で１００ｍＭ)およびＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔ／ＨＯ
Ｂｔ／ＤＩＥＡ(１:１:１.５)カップリング化学を用いて、「マクロ・クラウン
」(SynPhase HM Series I, Rink Amide Linker; 5.3 μmol/クラウン)上に集め
た。アミノ酸側鎖保護基は、２,２,５,７,８-ペンタメチルクロマン-６-スルホ
ニル（Ａｒｇ）、トリチル(ＡｓｎおよびＧｌｎ)およびｔ-ブチロキシカルボル(
ＬｙｓおよびＴｒｐ)であった。活性化したアミノ酸溶液を、ＰｉｎＡＩＤ装置
（Chiron Technology）を用いて分配した。カップリング反応は、最小４時間、
進行した。反復脱保護反応（ＤＭＦ中２０％ピペラジン）および洗浄サイクル（
ＤＭＦおよびＭｅＯＨ）を含む、他の全ての鎖の組立て操作は、キットマニュア
ルに設定された方法に従って行った。Ｎ末端βＡｌａ残基のカップリングおよび
脱保護の後、（+）ビオチン（ＤＭＦ中で３００ｍＭ）を４時間カップリングし
た（アミノ酸に関して上記のような性質）。洗浄および乾燥の後、「マクロ・ク
ラウン」を、合成装置から取出し、１０ｍＬのキャップ付ポリプロピレンチュー
ブ中に入れた。各チューブに、１.５ｍＬの切断／脱保護混合物を添加した。２
時間後、「マクロ・クラウン」を取出し、各々正味０.５ｍＬのＴＦＡで洗浄し
た。切断混合物および洗浄液の組合せ物を含む各チューブにＥｔ_２Ｏ(８ｍＬ)を
添加した。４℃に冷却した後、沈殿したペプチドを遠心分離（５,０００ｒ.ｐ.
ｍ.で４分間）および傾倒して収集した。残渣をＥｔ₂Ｏ中（５ｍＬ/チュ-ブ）に
再懸濁した。かかる懸濁液を再び冷却し、このペプチドを前記のように単離した
。この洗浄工程を再度くりかえし、粗ペプチドを真空で乾燥した。

【００７１】 超音波処理を用いて、粗ペプチドを０.１％ＴＦＡ水溶液（２ｍＬ/サンプル）
に再溶解し、最初の固相抽出カートリッジ(Merck LiChrolut RP-18, 500mg) （
ＭｅＯＨの後に０.１％ＴＦＡ水溶液）に充填した。このカートリッジを連続洗
浄（２×０.１％ＴＦＡ水溶液(２ｍＬ)）し、溶出した（０.１％ＴＦＡ水溶液(
２ｍＬ)で６:４ ＭｅＣＮ/Ｈ₂Ｏ）。溶出物を蒸発し、真空遠心分離によって乾
燥した。標題化合物に関する収率および分析データを表２にまとめた。

【表３】 表２：ペプチド１−２０についてのクロマトグラフィーおよびマススペクトル分
析

【表４】 ※ ^ａDE MALDI-TOF MSを用いる ^ｂ 固相抽出および真空遠心分離の後^Ｃ 合成「クラウン」５.３μｍｏｌ付加に対する比率^ｄ ２０分にわたる０.１％ＴＦＡ水溶液中５〜３５ ％の勾配(ペプチド１−２０)
^ｅクロマトグラム由来の調整(λ=２１４nm)

【００７２】 還元型鎖状および酸化型環状ペプチド３７および３８の調製 ペプチド配列を、ABI 433A ペプチド合成装置(Perkin-Elmer Applied Biosyst
ems)および標準的な"0.２５ ｍｍｏｌ ＦａｓｔＭｏｃ ＭｏｎＰｒｅｖＰｋ"性
質を用いて、Fmoc-Cys(Trt)樹脂(p-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸、０.５０
ｍｍｏｌ/ｇ相関性、０.５０ｇ、０.２５ｍｍｏｌ; ABI 401418)で合成した。
最終のＦｍｏｃ脱保護および洗浄（Ｅｔ_２Ｏ）の後、かかるポリペプチド樹脂を
、真空で乾燥した（１.４３ｇ、９１％）。この物質のアリコート（２８５g、約
０.０５ ｍｍｏｌ）をＤＭＦに再懸濁し、排液し、ビオチンアミドカプロエート
‐Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(１３７ｍｇ、０.３ｍｍｏｌ)、ＨＯＢ
ｔ(５０ｍｇ、０.３ｍｍｏｌ)およびＤＭＦ(３ｍＬ)中のＤＩＥＡ(０.１４ｍＬ
０.８ｍｍｏｌ)と、１８時間窒素下で反応させた。次いで、該樹脂を、ＤＭＦ、
ＣＨ_２Ｃｌ_２およびＥｔ_２Ｏで連続的に洗浄し、真空で乾燥した。

【００７３】 上記ビオチン化ペプチジル樹脂（２９０ｍｇ、約０.０５ｍｍｏｌ）を、切断
／脱保護混合物(５ｍＬ)で、２.５時間処理した。次いで、樹脂残渣を濾過した
。濾過物をＥｔ_２Ｏ（４５ｍＬ）で処理し、この混合物を冷却し、沈殿ペプチド
を遠心分離で収集した（２分、４,０００ ｒ.ｐ.ｍ.）。上記ビオチン化ペプチ
ド(１４１ma、約４量体)を、同様にしてＥｔ₂Ｏで２回以上洗浄し、真空で乾燥
した。このサンプル(２０ｍｇ)を０.１％ ＴＦＡ水溶液 (２ｍＬ)で洗浄し、該
溶液を濾過し、分取ＲＰ-ＨＰＬＣによって分画した。純粋な物質を含む分画(分
析ＲＰ‐ＨＰＬＣによる)をプールし、凍結乾燥し、純粋なペプチド３７（１２.
１ｍｇ）を得た（分析RP-HPLC:t_Ｒ=20.8分、純度＞99％、λ= 214nm (20〜30% M
eCN勾配). DE MALDI-TOF MS: [M+H]^＋=2776, [2M＋H]^２＋=1389 (C₁₂₇H₂0₅N₃₉O ₂₅ S₃₃=2774.43)。

【００７４】 粗ペプチド３７ (分取ＲＰ-ＨＰＬＣ前、 ３５ｍｇ)を炭酸アンモニム水溶液
に溶解した(０.１Ｍ、７０ｍＬ)。 キャップされていない混合物を１８時間、室
温で撹拌した。次いで、得られた懸濁液を、ＡｃＯＨ(約２ｍＬ)でｐＨ４まで酸
性にして透明な溶液を得、それを真空乾燥で１８時間、乾燥するまで蒸発した。
残渣を、０.１％ 水性ＴＥＡ (２ｍＬ)に再溶解し、勾配を２０〜３０％ＭｅＣ
Ｎから展開したことを除いて、上記の還元された前駆体３７と同様の方法で、分
取ＲＰ-ＨＰＬＣによって精製した。凍結乾燥後、純粋なペプチド３８(４.５ｍ
ｇ)を得た。分析RP-HPLC:t_Ｒ=15.7分、λ=214nm（20〜30%勾配で純度＞99 %、DE
MALDI-TOF MS:[M+H]^＋=2774,[2M+H]^２＋=1388(C₁₂₇H₂0₃N₃₉O₂₅S₃=2772.42)。

【００７５】 フルオレセイン標識ペネトラチン３９の調製 この配列は、ペプチド３７で記載した同様の手法でFmoc-Lys(Boc)-樹脂(０.５
ｍｍｏｌ/ｇ付加;ABI 401425)を使用する以外は、ペプチド３７に対する記載と
同様に構築した。H-βAla-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-IlＥｔrp-Phe-Gln(
Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-MＥｔ-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)樹脂
(３００mg、約０.０５５ｍｍｏｌ)を、ＤＭＦ中(５ｍＬ)の５-カルボキシフル
オレセイン (１０３ｍｇ、０.２７ｍｍｏｌ; Sigma C 0537)、 ＰｙＢＯＰ(１４
２ｍｇ, ０.２７ｍｍｏｌ)、 ＨＯＢｔ(３７ｍｇ、０.２７ｍｍｏｌ)およびＤＩ
ＥＡ(７１ｍＬ、０.４１μｍｏｌ)と、窒素下、暗所で１８時間反応させた。次
いで、これを洗浄し（ＤＭＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２およびＥｔ_２Ｏ）、真空下で乾燥し
た。切断／脱保護剤 (１２ｍＬ)を用いて、暗所で２時間処理し、上記のように
操作した後、粗ペプチド (１８３ｍｇ) を得た。アリコート(９０ｍｇ)を分取Ｒ
Ｐ-ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥の後、純粋なペプチドを得た(３８ｍｇ)。分析R
P-HPLC:t_Ｒ=15.7分、λ= 214mn(22.5〜39.5%勾配)で純度＞99 %. DE MALDI-TOF
MS:[M+H]^＋=2677, [2M+H]2+=5359 (C₁₂₈H₁₈₃N₃₅O₂₇S=2676.11)。

【００７６】 １.３：ペプチド内在化アッセイ ＨａＣａＴ細胞(固定化した「正常」ヒト線維芽細胞系)を、１０％の胎児ウシ
血清と抗生物質を含む媒体（ＤＭＥＭ）中へ、１ウェルあたり５０,０００細胞
づつ、９６ウェルプレートへ播種した。一晩インキュベーションした後、ペプチ
ドを細胞培養液中に希釈系として調製し、細胞に添加した。インキュベーション
時間の終点（通常、１０および６０分）で、該細胞を３回ＰＢＳですすぎ、２０
分間、−２０℃、ＥｔＯＨ/ＡｃＯＨ(９５:５)中で固定した。固定化後、該細胞
を３％のTween-20を含むＰＢＳで１０分間処理することによって、浸透性とした
。内生のアルカリホスファターゼ活性を６５℃、６０分間、インキュベートして
中和した。細胞を、室温で３０分間、アルカリホスファターゼ・ストレプタビジ
ン（Pierce Chemical Co., Rockford, IL,USA）と共に０.１％ ＢＳＡを含むＰ
ＢＳでインキュベートし、ＰＢＳで充分洗い流した。新規に調製した基質溶液(
ｌｍｇ/ｍＬのｐ-ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム(Pierce Chemical C
o.)、０.５ｍＭ ＭｇＣｌを含む１０ｍＭ ジエタノールアミン(ｐＨ ９.５)を各
ウェルに添加し、十分に染色が進行するまでインキュベートした(約３０分)。酵
素反応を、２Ｍ ＮａＯＨ水溶液(５０μＬ)を各ウェルに添加して停止した。ア
ルカリホスファターゼ活性を４０５ｎｍでの吸光度で測定した。

【００７７】 １．４：結果 １．４．１：ペプチド合成 ペプチド１−２０を、いわゆるMultipin（商標）方法を用いて同時に調製した
(Valerio, R.M.ら(1993)International Journal of Peptide and Protein Resea
rch 42, 1-9)。１日あたり、平均２回のカップリング／脱保護サイクルを行い、
ビオチン化、分解／脱保護、固相抽出による精製を含む全ての合成を、２週間中
に完了した。ペプチドの単離および精製収率は約４０〜８１％の範囲であり、純
度は７５−９６％（表２)であった。該ペプチドの卓越した品質は、図１に示し
た。観察された主要な不純物（ＭＳ、データは示していない）は、Ｍｅｔ(Ｏ)含
有ペプチドであった(図１においてピークをトレースする)。メチオニンスルホキ
シドの形成は、Multipin方法に伴う一般的な問題であるようで、おそらく、アシ
ル化および脱保護工程後の長期空気乾燥サイクル中の酸化によるものであろう。
基本的には、ペプチドにおけるＭｅｔ(Ｏ)再還元し得る；例えば、ＴＦＡにおい
てＮＨ_４Ｉ/Ｍｅ_２Ｓを用いてＭｅｔ(Ｏ)含有不純物をはっきりとペプチド１へ
転換し得た(Nicolasら, (1995)Tetrahedron 51, 57013)(結果は示していない)。

【００７８】 １．４．２：最小活性配列の決定 上記で明かにしたように、アンテナペディア（Antennapedia）ホメオドメイン
の１６量体ペプチド対応残基４３-５８は、残基４１-６０、４３-５８、４１-５
５および４６-６０に対応するペプチドを用いて、十分な移行特性を保持する最
小配列として最初に同定した。結果（図２）によると、ペプチド１のＣ末端切除
は、内在化の程度が低下したが、末端切除ペプチドは依然細胞膜移行能を有して
いた。しかし、ペプチド１のＮ末端からの継続的な切除は、ペプチド１それ自身
によって到達したレベルに匹敵する多くの事例において、末端切除ペプチドで有
意レベルの移行が保持されることを示す。最初の３つの末端切除(１１−１３)に
おいて、活性は少ししか消失しなかったが、もとのシグナルの約半分のみが誘導
体１４および１５では残っていた。しかし、１０量体から７量体への(１６-１９
)段階では、Ｃ末端の６量体ペプチド２０で顕著な低下が観察される前に、対照
ペプチド１に比較してほぼ完全な膜移行効力を回復した。この効果は、数回の独
立した実験において再現し得た。１つのペプチド濃度のみの値を図２に示すが、
各々の独立したペプチドに対する用量作用曲線は、ペプチド濃度にかかわらず同
じパターンを示していた。細胞の非存在下における非特異的結合は、画一的かつ
無視できるものであった（結果は、示していない）。

【００７９】 １．４．３：フルオレセイン標識ペネトラチン３９のペプチド内在化アッセイ このアッセイは、ビオチン化したペプチドを用いる場合に必要な細胞操作から
生じる人工産物を観測する可能性なしに、細胞の内在化の実験および測定ができ
る。図４は、生存細胞中のペプチド内在化の直接測定を示す（ｔ=１０分間の場
合は四角、ｔ=６０分間の場合は菱形）。図４からわかるように、ビオチン化ペ
ネトラチン１は、細胞核内には優勢的に局在し、仁に蓄積し、細胞質基質では低
い濃度であった。明らかに、この分布は、直接的な蛍光プローブ３９を用いた場
合と酷似する。従って、間接的なビオチン−アビジン視覚化アプローチを正当化
する。ペネトラチンが、主に核に局在するように見えるという事実は、このペプ
チドが実は原形質および核膜双方を横切って移行できるということを示している
。核での蓄積は、ＤＮＡに対する陽性電荷を帯びたペプチドの結合によるのであ
ろう。

【００８０】 実施例２：さらに末端切除されたペネトラチン誘導体 ２．１：上記のセクション１．１および１．２に従って、下記のペプチドを調
製した。

【表５】 これらペプチドは、セクション１.３で記載したペプチド内在化アッセイで使
用し、細胞中に内在化されたことが分かった。

【００８１】 実施例３：順番に核残基がアラニンによって置換された一連の完全長ペプチド
(２１−３６)の調製 ３.１：ペプチド２１−３６の同時多重合成 ペプチドを、上記セクション１.１および１.２に記載の方法において調製した
。標題化合物の収率および分析データを表３にまとめた。 表３：

【表６】 表４：ペプチド１および２１−３６についてのクロマトグラフィーおよびマスス
ペクトル分析

【表７】 ※ ^ａDE MALDI-TOF MSを用いる ^ｂ 固相抽出および真空遠心分離の後^Ｃ 合成「クラウン」５.３μｍｏｌ付加に対する比率^ｄ ２０分にわたる０.１％ＴＦＡ水溶液中１５-３５%アセトニトリルの勾配(ペプ
チド２１−３６)^ｅ クロマトグラム由来の調整(λ=214nm)

【００８２】 ３．２ ペプチド内在化アッセイをセクション１．３に従い行った

【００８３】 ３．３ 結果 ３．３．１：ペプチド合成 ペプチド２１−３６を、いわゆるMultipin（商標）法を用いて、同時に調製し
た(Valerio, R.M.ら(1993)Internatuonal Journal of Peptide and protein Res
earch 42,1-9)。１日あたり、平均２回のカップリング／脱保護サイクルを行い
、ビオチン化、分解／脱保護、固相抽出による精製を含む全ての合成を、２週間
中に完了した。ペプチドの単離および精製収率は、約４３〜７６％の範囲であり
、純度は６６−９６％（表２）であった。観察される主要な不純物は、Ｍｅｔ(
Ｏ)含有ペプチドであった（ＭＳ、データは示していない）。メチオニンスルホ
キシドの形成は、Multipin方法に伴う一般的な問題である。おそらく、アシル化
および脱保護工程後の長期空気乾燥サイクル中の酸化によるものであろう。基本
的には、ペプチドにおけるＭｅｔ(Ｏ)を再還元し得る；例えば、分析スケールに
関して、ＮＨ_４Ｉ/Ｍｅ_２Ｓを含むＴＦＡを用いると、Ｍｅｔ(Ｏ)含有不純物を
はっきりとペプチド１へ転換し得た(Nicolas, ら, (1995)Tetrahedron 51, 5701
3)(結果は示していない)。

【００８４】 ３．３．２：残基置換効果 Ａｌａによって順番に各残基が置換された一組のペプチド(ペプチド２１−３
６)を用いた結果を図５に示した。この結果は、任意の特別な疎水性残基に対す
る緊縮要件が全くないことを示している。例えば、両方のＩｌｅ残基が、見かけ
上活性を失わずにＶａｌで置換され得ることは、他の文献でも報告されている(B
rugidou,Jら., (1995) Biochemical and Biophysical Research Communications
214, 685-693)。さらに、Ｍｅｔ^１２は、ＬｅｕまたはＮｌｅによって自由に交
換し得る（結果は、示していない）。これら結果から明らかに示されることは、
先行技術における一般的な意見とは対照的に、Trp^６の必要がないことである。

【００８５】 実施例４：さらに改変されたペネトラチン誘導体 上記セクション１．１および１．２に記載の方法を用いて、さらに配列番号１
の改変ペプチドを、太線で示されたアラニン残基を何らかの別のアミノ酸によっ
て置換して、調製した。これは上記セクション１．３に記載の細胞の内在化アッ
セイの際に全て活性であった下記ペプチドを含む。

【表８】 ^※番号はアンテナペディアで見られるような対応する残基を示し、ここでペネト
ラチンをＡｎｔＰ(４３-５８)として表示した。

【００８６】 実施例５-１７：上記方法を用いて、貨物体に結合した担体部分を含む移行ベ
クターを記載したように調製した。

【００８７】 実施例５： H-Cys-βAla-Arg-Arg-MＥｔ-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_２ Rink Amide AM 樹脂(０.６９ｍｍｏｌ/ｇ, Novabiochem)から、H-Cys(Trt)-β
Ala-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-樹脂を構築した。脱
保護(1.5時間)した後に、Ｅｔ₂Ｏで沈殿し、遠心分離し、デカンテーションし、
乾燥することにより粗ペプチドを得た。アリコート(全２４６ｍｇ)を、分取ＲＰ
-ＨＰＬＣ (６.５〜１６.５％ＭｅＣＮ勾配)により精製し、純粋な標題化合物を
得た(１０６.４ｍｇ)。分析RP-HPLC: t_Ｒ = 15.8分(6.5〜16.5 % MeCN勾配、純
度＞95 %,λ=214nm)。DE MALDI-TOF MS:[M+H]^＋ =1205.4(C_５２H_９２N_２０O_９S
_２=1205.55)。

【００８８】 ２'-[スクシンイミドプロピオニル(H-Cys-pAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-N
H_２]パクリタキセル

【化１】 ＤＭＦ(１ｍＬ)中の２'-(マレイミドプロピオノイル)パクリタキセル(１７μ
ｍｏｌ, １７.４ｍｇ)およびH-Cys-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH₂(１
５μｍｏｌ、１８.１ｍｇ)の溶液にＥｔ₃Ｎ(２.０μＬ)を加えた。この混合物を
１時間攪拌し、濾過し、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(１０〜７０％ＭｅＣＮ勾配)により
精製した。無色の固体として純粋な標題化合物を得た(９.４ｍｇ)。分析RP-HPLC
: t_R=17.2分(0〜60% MeCN勾配; 純度＞97%)。DE MALDI-TOF MS: [M+H]⁺=2211.7(
C₁₀₆H₁₄₈N₂₂O₂₆S₂=2210.57)。

【００８９】 実施例６ ４-(マレイミドプロピオノイル)ポドフィロトキシン

【化２】 ＣＨ₂Ｃｌ₂(２ｍＬ)中のポドフィロトキシン(６０μｍｏｌ、２５.６ｍｇ)、
３-マレイミドプロピルオン酸(０.３１ｍｍｏｌ、５２.４ｍｇ)、ＤＩＣ(０.１
７ｍｍｏｌ、２１.５ｍｇ)およびＤＭＡＰ(８０μｍｏｌ、１０ｍｇ)の溶液を１
時間攪拌した。溶媒を真空蒸発し、残渣をＤＭＦ/ＭｅＯＨ(１ｍＬ)に再溶解し
、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(２０〜７０％ＭｅＣＮ勾配)により精製し、無色の固体と
して純粋な標題の化合物を得た(７.３ｍｇ)。分析RP-HPLC: t_R=20.1分(0〜60% M
eCN勾配; 純度＞95%)。¹H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ: 2.66-2.71 (t, J=6.3Hz, 2
H, CH₂), 2.82-2.84 (m, 2H, H2 および H3), 3.69 (s, 6H, OCH₃x2), 3.75 (s,
3H, OCH₃), 3.83 (t, J=6.3Hz, 2H, CH₂), 4.12 (t, J=9.92Hz, 1H, H11), 4.3
1 (m, 1H, H11), 4.53 (d, J=11.4Hz, 1H, H1), 5.80 (d, J=8.7Hz, 1H, H4), 5
.92 (dd, J=5.49, 1.17Hz, 2H, OCH₂O), 6.32 (s, 2H, H2'6'), 6.47 (s, 1H, H
8), 6.66 (s, 2H, CH=CH), 6.74 (s, 1H, H5)。

【００９０】 ４-[スクシンイミドプロピオノイル-(H-Cys-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Ly
s-NH_２)]ポドフィロトキシン

【化３】 ＤＭＦ(1.5ｍＬ)中の４-(マレイミドプロピオノイル)ポドフィロトキシン(１
７.７μmol、１０ｍｇ)およびH-Cys-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH₂(
２５μｍｏｌ、３０.４ｍｇ)の溶液にＥｔ_３Ｎ(３.５μL)を加えた。この混合物
を４０分間攪拌し、濾過し、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(０〜６０％ＭｅＣＮ勾配)によ
り精製した。無色の固体として純粋な標題の化合物を得た(１７.８ｍｇ、５７％
)。分析RP-HPLC: t_R=14.8分(0〜60% MeCN勾配; 純度＞98%)。DE MALDI-TOF MS:
[M+H]⁺=1772.3(C₈₁H₁₁₉N₂₁O₂₀S₂=1771.07)。

【００９１】 実施例７： H-Cys-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_２ Rink Amide AM 樹脂(０.６９ｍｍｏｌ/ｇ, Novabiochem)から、H-Cys(Trt)-β
Ala-D−Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-D-Met-D-Lys(Boc)-D-Trp-D-Lys(Boc)-D-Lys(Boc)-
樹脂を構築した。脱保護(１.５時間)後に、Ｅｔ₂Ｏで沈殿し、遠心分離／デカン
テーションし、乾燥することにより粗ペプチドを得た。アリコート(全２３７ｍ
ｇ)を、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ (８〜１８％ＭｅＣＮ勾配)により精製し、純粋な標
題化合物を得た(６６ｍｇ)。分析RP-HPLC: t_Ｒ = 12.9分(9〜19% MeCN勾配, 純
度＞99 %,λ=214nm)。DE MALDI-TOF MS:[M+H]^＋ =1207.2(C_５２H_９２N_２０O_９S
_２=1205.55)。

【００９２】 ４-[スクシンイミドプロピオノイル-(H-Cys-β-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Met-D-Lys
-D-Trp-D-Lys-D-Lys-NH₂)]ポドフィロトキシン

【化４】 ＤＭＦ(１.５ｍＬ)中の４-(マレイミドプロピオノイル)ポドフィロトキシン(
１８.９μｍｏｌ、１０.７ｍｇ)およびH-Cys-βAla-D-Arg-D-Arg-D-Met-D-Lys-D
-Trp-D-Lys-D-Lys-NH₂ (２８μｍｏｌ、３３.８ｍｇ)の溶液にＥｔ₃Ｎ(１.５μ
Ｌ)を加えた。この混合物を４０分間攪拌し、濾過し、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(０〜
６０％ＭｅＣＮ勾配)により精製した。無色の固体として純粋な標題の化合物を
得た(６.９ｍｇ、２１％)。分析RP-HPLC: t_R=14.8分(0〜60% MeCN勾配; 純度＞9
8%)。DE MALDI-TOF MS: [M+H]⁺=1771.5(C₈₁H₁₁₉N₂₁O₂₀S₂=1771.07)。

【００９３】 実施例８： ４'-(マレイミドプロピオノイル)エピポドフィロトキシン

【化５】 ピリジン(１ｍＬ)中の４'-デメチルエピポドフィロトキシン(１２ｍｍｏｌ、
５ｍｇ)、３-マレイミドプロピオン酸(５０μｍｏｌ、１２.２ｍｇ)およびＤＩ
Ｃ(２８μｍｏｌ、３.４７ｍｇ)の溶液を３０分間攪拌した。ＭｅＯＨ(０.５ｍ
Ｌ)を加え、この混合物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(０〜６０％ＭｅＣＮ勾配)により精
製し、無色の固体として純粋な標題の化合物を得た(４.２ｍｇ、６２％)。分析R
P-HPLC: t_R=17.6分(0〜60% MeCN勾配; 純度＞95%)。¹H-NMR (300MHz, CDCl₃)δ:
2.84 (m, 1H, H3), 2.99 (t, J=7.44Hz, 2H, CH₂-Mim), 3.32 (dd, J=14.04, 5
.07Hz, 1H, H2), 3.69 (s, 6H, OCH₃x2), 3.95 (t, J=7.44Hz, 2H, CH₂-Mim), 4
.39 (dd, J=8.13, 4.28Hz, 2H, H11), 4.66 (d, J=5.00Hz, 1H, H1), 4.89 (d,
J=3.32Hz, 1H, H4), 6.01 (d, J=6.42Hz, 2H, OCH₂O), 6.32 (s, 2H, H2'6'), 6
.57 (s, 1H, H8), 6.74 (s, 2H, CH=CH), 6.90 (s, 1H, H5)。 ¹³C-NMR (75MHz,
CDC1₃) δ: 28.64, 31.02, 32.55, 37.33, 39.53, 42.99, 55.15, 65.78, 66.5
6, 100.65, 106.54, 107.97, 109.65, 130.68, 130.92, 133.21, 136.96, 146.6
2, 147.61, 150.39, 167.36, 169.30, 173.89。

【００９４】 ４'-[スクシンイミドプロピオノイル-(H-Cys-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys
-Lys-NH_２)]エピポドフィロトキシン

【化６】 ＤＭＦ(１.５ｍＬ)中の４'-(マレイミドプロピオノイル)エピポドフィロトキ
シン(１４μｍｏｌ、７.９ｍｇ)およびH-Cys-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-L
ys-NH_２(２６μｍｏｌ、３１.５ｍｇ)の溶液にＥｔ₃Ｎ(１.９１μＬ)を加えた。
この混合物を４０分間攪拌した後、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(０〜６０％ＭｅＣＮ勾配
)により精製し、無色の固体として純粋な標題の化合物を得た(１５.８ｍｇ、６
３％)。分析RP-HPLC: t_R=13.3分(0〜60% MeCN勾配; 純度＞98%)。DE MALDI-TOF
MS: [M+H]⁺=1757.2(C₈₀H₁₁₇N₂₁O₂₀S₂=1757.05)。

【００９５】 実施例９： ４-(ヨードアセチル)ポドフィロトキシン

【化７】 乾燥ＣＨ_２Ｃｌ中でポドフィロトキシン(０.４９ｍｍｏｌ、２０４ｍｇ)、ヨ
ード酢酸(０.１６４ｍｇ、２０ｍｇ) およびＤＩＣ(０.５５２ｍｍｏｌ、０.９
７ｍｇ）およびＤＭＡＰ(０.１６４ｍｍｏｌ、２０ｍｇ）の混合物を０℃に冷却
した。ピリジン(０.２ｍＬ)を添加し、上記反応混合物を０℃、１時間撹拌した
。該混合物を蒸発して乾燥した。得られた淡黄色残渣をＭｅＣＮに再溶解し、分
取ＲＰ-ＨＰＬＣ(２０〜７０％ＭｅＣＮ勾配)により精製し、無色固体として純
粋な標題の化合物を得た(89.7mg)。分析RP-HPLC: t_R=22.3分(0〜60% MeCN勾配、
純度＞95%)。¹H-NMR (300 MHz, CDC1₃) δ: 2.85 (m, 2H, H2,3), 3.70 (s, 6H,
OCH₃x2), 3.72 (s, 2H, CH₂I), 3.74 (s, 3H, OCH₃), 4.13 (m, 1H, H11), 4.3
4(ｍＬH, H11), 4.53(d, lH, J=3.60Hz, H1), 5.83(d, lH, J=8.43Hz, H4), 5.9
3 (dd, 2H, J=4.35, 1.17Hz, OCH_２0), 6.31 (s, 2H, H2'6'), 6.48 (s, 1H, H8
), 6.77 (s, 1H, H5)。

【００９６】 ４-[アセチル-(H-Cys-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_２)]ポドフィロ
トキシン

【化８】 ＤＭＦ(1ｍＬ)中の４-(ヨードアセチル)ポドフィロトキシン(１７μｍｏｌ、
１０ｍｇ)およびH-Cys-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH₂(２３μｍｏｌ
、２８.６ｍｇ)の溶液にＥｔ₃Ｎ(２.４μL、１７μｍｏｌ)を加えた。１時間攪
拌した後、ＭｅＣＮ(０.５ｍＬ)を加え、混合物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(０〜６０
％ＭｅＣＮ勾配)により精製し、無色の固体として純粋な標題の化合物を得た(２
９.４ｍｇ、１００％)。分析RP-HPLC: t_R=14.1分(O〜60% MeCN勾配、純度＞98%)
。DE MALDI-TOF MS: [M+H]⁺=1661.0(C₇₆H₁₁₄N₂₀O₁₈S₂=1659.97)。

【００９７】 実施例１０： ４'-デメチル-４-(ヨードアセチル)エピポドフィロトキシン

【化９】 ０℃で、ＣＨ₂Ｃ１_２(２ｍＬ)中の４'-デメチルエピポドフィロトキシン(０.
２６ｍｍｏｌ、１０４ｍｇ)、ヨード酢酸(０.５３ｍｍｏｌ、９８.８ｍｇ)およ
びＤＩＣ(０.３２ｍｍｏｌ、４０.１ｍｇ)の溶液にピリジン(５０μＬ)およびＤ
ＭＡＰ(０.１ｍｍｏｌ、１２.８ｍｇ)を加えた。１時間攪拌した後、溶媒を蒸発
した。残渣をＤＭＦ(１ｍＬ)に再溶解し、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(２０〜６０％Ｍｅ
ＣＮ勾配)により精製し、無色の固体として純粋な標題の化合物を得た(35.7mg,
24%)。分析RP-HPLC: t_R=20.3分(0〜60% MeCN勾配、純度＞96%)。¹H-NMR (300 MH
z, CDC1_３) δ: 3.02 (m, 1H, H3), 3.20 (m, 1H, H2), 3.71 (s, 6H, OCH₃x2),
3.63 (s, 2H, CH₂I), 3.74 (s, 3H, OCH₃), 4.05 (m, 1H, H11), 4.27(ｍＬH,
H11), 4.60(d, lH, J=4.94Hz, H1), 6.06(d, lH, J=3.41Hz, H4), 5.92 (m, 2H,
OCH₂O), 6.21 (s, 2H, H2'6'), 6.49 (s, 1H, H8), 6.80 (s, 1H, H5)。

【００９８】 ４'-ジメチル-４-[アセチル-(Ｈ-Cys-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Lys-NH_２)]エピ
ドフィロトキシン

【化１０】 ＤＭＦ(１ｍＬ)中の４'-デメチル-４-(ヨードアセチル)エピポドフィロトキシ
ン(１７.６μｍｏｌ、１０ｍｇ)およびH-Cys-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-L
ys-NH₂(１４.９μｍｏｌ、１８ｍｇ)の溶液にＥｔ₃Ｎ(２.１μＬ、１５μｍｏｌ
)を加えた。１時間攪拌した後、反応混合物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(０〜６０％Ｍ
ｅＣＮ勾配)により精製し、無色の固体として純粋な標題の化合物を得た(１１.
２ｍｇ、４６％)。分析RP-HPLC: t_R=12.8分(0〜60% MeCN勾配、純度＞98%)。DE
MALDI-TOF MS: [M+H]⁺=1647.2(C₇₅H₁₁₂N₂₀O₁₈S₂=1645.95)。

【００９９】 実施例１１： ４-(Boc-Gly)ポドフィロトキシン

【化１１】 ＣＨ₂Ｃｌ₂(５ｍＬ)中のポドフィロトキシン(４００ｍｇ、０.９７ｍｍｏｌ)
、Boc-Gly-OH(５１０ｍｇ、２.９１ｍｍｏｌ)、ＤＩＣ(１.７３ｍｍｏｌ、２７
３μＬ)、ＤＭＡＰ(０.４１ｍｍｏｌ、５０ｍｇ)およびピリジン(１７３μＬ)の
混合物を１時間攪拌した。溶媒を蒸発した。この残渣をＤＭＦ(１.５ｍＬ)に再
溶解し、ＲＰ-ＨＰＬＣ(２０〜７０％ＭｅＣＮ勾配)により精製し、無色の固体
として純粋な標題の化合物を得た(５０２.６ｍｇ、９１％)。分析RP-HPLC: t_R=2
2.1分(0〜60% MeCN勾配、純度＞97%)。

【０１００】 ４-(H-Gly)ポドフィロトキシン

【化１２】 ＣＨ₂Ｃｌ₂(８ｍＬ)中の４-(Boc-Gly)ポドフィロトキシン(０.２４ｍｍｏｌ、
１３７ｍｇ)の溶液にＴＦＡ(０.５ｍＬ)を添加した。１時間攪拌した後、溶媒を
蒸発した。得られた淡黄色の固体残渣を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(１０〜７０％ＭｅＣ
Ｎ勾配)により精製し、無色の固体として純粋な標題の化合物を得た(41.7mg, 37
%)。分析RP-HPLC: t_R=15.2分(0〜60% MeCN勾配、純度＞97%)。

【０１０１】 ４-(マレイミドプロピオノイル-Gly)ポドフィロトキシン

【化１３】 ＤＭＦ(１ｍＬ)中の３-マレイミドプロピオン酸(７０μｍｏｌ、１１.８ｍｇ)
およびＤＩＣ(３８μｍｏｌ、４.８３ｍｇ)の溶液に４-(H-Gly)ポドフィロトキ
シン(１７μｍｏｌ、８ｍｇ)、ＤＭＡＰ(１０μｍｏｌ、１.２ｍｇ)およびピリ
ジン(２０μＬ)を加えた。１時間攪拌した後、混合物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(０〜
６０％ＭｅＣＮ勾配)により精製し、無色の固体として純粋な標題の化合物を得
た(１.１ｍｇ)。分析RP-HPLC: t_R=18.2分(0〜60% MeCN勾配、純度＞97%)。

【０１０２】 ４-[(スクシンイミドプロピオノイル-Gly)-(H-Cys-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Tr
p-Lys-Lys-NH₂)] ポドフィロトキシン

【化１４】 ＤＭＦ(１ｍＬ)中の４-マレイミドプロピオノイル-Gly)ポドフィロトキシン(
１.８μmol、１.１ｍｇ)およびH-Cys-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH₂(
４μｍｏｌ、５ｍｇ)の溶液にＥｔ₃Ｎ(０.５μＬ、４μｍｏｌ)を加えた。混合
物を１時間攪拌した。これをＭｅＣＮ(０.５ｍＬ)で希釈し、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ
(０〜６０％ＭｅＣＮ勾配)により精製し、無色の固体として標題の化合物を得た
(１.１ｍｇ、３３％)。分析RP-HPLC: t_R=14.7分(0〜60% MeCN勾配、純度＞97%)
。DE MALDI-TOF MS: [M+H]⁺=1829.8(C₈₃H₁₂₂N₂₂O₂₁S₂=1828.12)。

【０１０３】 実施例１２： H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_２ Rink Amide AM樹脂(0.69mmol/g, Novabiochem)から開始して、H-Cys(Trt)-Arg
(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-樹脂を構築し
た。脱保護(１.５時間)の後、Ｅｔ₂Ｏから沈殿させ、遠心分離／デカンテーショ
ン、および乾燥により粗ペプチドを得た。アリコート(全量２５８ｍｇ)を分取Ｒ
Ｐ-ＨＰＬＣ(９〜１９％ＭｅＣＮ勾配)により精製し、純粋な標題化合物を得た(
１３２.４ｍｇ)。分析RP-HPLC: t_R=20.3分(8〜18% MeCN勾配、純度＞99%、λ=21
4nm)。DE MALDI-TOF MS: [M+H]⁺=1238.6(C₅₂H₉₂N₂₀O₉S₃=1237.63)。

【０１０４】 Bis-[4-(スクシンイミドプロピオノイル)ポドフィロトキシン-(H-Cys-Arg-Arg-M
et-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH₂)

【化１５】 ＤＭＦ(１ｍＬ)中の４-(マレイミドプロピオノイル)ポドフィロトキシン(１９
μｍｏｌ、１１ｍｇ)およびH-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH₂(１２
μｍｏｌ、１５ｍｇ)の溶液にＥｔ₃Ｎ(２.８μＬ)を添加した。１時間攪拌した
後、混合物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(１０〜７０％ＭｅＣＮ勾配)により精製し、無
色の固体として純粋な標題の化合物を得た(９.０ｍｇ、３２％)。分析RP-HPLC:
t_R=17.4分(0〜60% MeCN勾配、純度＞98%)。DE MALDI-TOF MS: [M+H]⁺=2369.7(C_{1 10} H₁₄₆N₂₂O₃₁S₃=2368.66)。

【０１０５】 実施例１３： ４'-(スクシンイミドプロピオニル)エピドフィロトキシン-(H-Cys-Arg-Arg-Me
t-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH₂)-１０-Ｏ-(スクシンイミドプロピオニル)カンプト
テシン

【化１６】 ＤＭＦ(１.５ｍＬ)中の１０-Ｏ-(マレイミドプロピオニル)カンプトテシン(０
.００５ｍｍｏｌ、２.６ｍｇ)、４'-(マレイミドプロピオノイル)エピポドフィ
ロトキシン(１１μｍｏｌ、１３ｍｇ) の溶液に、Ｅｔ₃Ｎ(１.５μＬ)を加えた
。１.５時間攪拌した後、混合物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(１０〜７０％ＭｅＣＮ勾
配)により精製し、無色の固体として純粋な標題の化合物を得た(１.９ｍｇ)。分
析RP-HPLC: t_R=14.8分(0〜60% MeCN勾配、純度＞96%)。DE MALDI-TOF MS: [M+H] ⁺ =2304.6(C₁₀₇H₁₃₈N₂₄O₂₈S₃=2304.58)。

【０１０６】 実施例１４： ４'-(スクシンイミドプロピオノイル)エピポドフィロトキシン-(H-Cys-Arg-Ar
g-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_２)-２'-(スクシンイミドプロピオノイル) パク
リタキセル

【化１７】 ＤＭＦ(１ｍＬ)中の４'-[スクシンイミドプロピオノイル-(H-Cys-Arg-Arg-Met
-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_２)]エピポドフィロトキシン(２μmol、３.５ｍｇ)、
２'-(マレイミドプロピオノイル) パクリタキセル(２μｍｏｌ、２ｍｇ)の溶液
にＥｔ_３Ｎ(０.３μＬ)を加えた。１.５時間攪拌した後、反応混合物を分取ＲＰ
-ＨＰＬＣ(１０〜７０％ＭｅＣＮ勾配)により精製し、無色の固体として純粋な
標題の化合物を得た(１.５ｍｇ)。分析RP-HPLC: t_Ｒ=17.8分(0〜60% MeCN勾配、
純度＞98%)。DE MALDI-TOF MS: [M+H]+=2794.5(C_１３４H_１７３N_２３O_３７S_３=2
794.14)。

【０１０７】 実施例１５： ４'-メトキシ-４-[４''-アミノアニリノ-(スクシンイミドプロピオニル)-(H-C
ys-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_２)]エピポドフィロトキシン

【化１８】 ＤＭＦ(１ｍＬ)中の４'-メトキシ-４-[４"-アミノアニリノ (マレイミドプロ
ピオノイル)] エピポドフィロトキシン(７μｍｏｌ、４.６ｍｇ)およびH-Cys-β
Ala-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH₂(１４μｍｏｌ、１６.３ ｍｇ)の溶液に
Ｅｔ₃Ｎ(１μＬ)を加えた。１時間攪拌した後、混合物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(０
〜６０％ＭｅＣＮ勾配)により精製し、無色の固体として純粋な標題の化合物を
得た(６.４ｍｇ、４９％)。分析RP-HPLC: t_R=15.2分(0〜60% MeCN、純度＞98%)
。DE MALDI-TOF MS: [M+H]⁺=1861.6(C₈₇H₁₂₅N₂₃O₁₉S₂=1861.20)。

【０１０８】 実施例１６： ４'-デメチル-４-[４"-アミノアニリノ-(マレイミドプロピオノイル)]エピポ
ドフィロトキシン

【化１９】 １:１ ＤＭＦ/ＣＨ_２Ｃｌ_２(２ｍＬ)中の４'-デメチル-４-(４"-アミノアニリ
ノ)エピポドフィロトキシン(２４μｍｏｌ、１２ｍｇ)、-マレイミドプロピオン
酸(４９μｍｏｌ、８.３ｍｇ)およびＤＩＣ(２７μｍｏｌ、３.４ｍｇ)の溶液に
ピリジン(１０μＬ)を加えた。１時間攪拌した後、反応混合物を蒸発した。得ら
れた淡黄色の固体を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(１０〜７０％ＭｅＣＮ勾配)により精製
し、無色の固体として純粋な標題の化合物を得た(５.３ｍｇ、３４％)。分析RP-
HPLC: t_R=19.5分(0〜60% MeCN勾配、純度＞96%)。¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ:
2.65 (t, 2H, J=7.3Hz, CH₂), 2.98 (m, 1H, H3), 3.17 (m, 1H, H2), 3.79 (s
, 6H, OCH₃), 3.93 (t, 2H, J=7.0Hz, CH₂), 3.99 (ｍＬH, H5, H11), 4.38 (m,
1H, H11), 4.58(d, 1H, J=4.95Hz, H1), 4.64 (d, 1H, J=3.95Hz, H4), 5.96 (
m, 2H, OCH₂O), 6.33 (s, 2H, H2'6'), 6.49-6.53 (m, 3H, H8, Ar), 6.74 (s,
2H, CH=CH), 6.75 (s, 1H, H5), 7.33 (m, 2H, Ar)。

【０１０９】 4'-デメチル-4-[4"-アミノアニリノ-(スクシンイミドプロピオノイル)-(H-Cys
-βAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_２)]エピポドフィロトキシン

【化２０】 ＤＭＦ(１.５ｍＬ)中の４'-デメチル-[４"-アミノアニリノ(マレイミドプロピ
オノイル)]エピポドフィロトキシン(８.３μｍｏｌ、５.３ｍｇ)およびH-Cys-β
Ala-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH₂(１３μｍｏｌ、１５.６ｍｇ)の溶液にＥ
ｔ₃Ｎ(２μＬ)を加えた。１時間攪拌した後、この混合物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ(
０〜６０％ＭｅＣＮ勾配)により精製し、無色の固体として純粋な標題の化合物
を得た(１４.９ｍｇ、９７％)。分析RP-HPLC: t_R=13.7分(0〜60% MeCN勾配、純
度＞98%)。DE MALDI-TOF MS: [M+H]⁺=1847.1(C₈₆H₁₂₃N₂₃O₁₉S₂=1847.17)。

【０１１０】 実施例１７：トポイソメラーゼII阻害アッセイにおけるエトポシドおよびポド
フィロトキシン誘導体の評価 トポイソメラーゼIIアッセイ−プラスミドＤＮＡ(０.３μg)を、３７℃、切断
緩衝液(３０ｍＭ Tris-HCl ｐＨ ７.６、６０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＡＴＰ、
１５ｍＭメルカプトエタノール、８ｍＭ ＭｇＣｌ₂)中、試験化合物(終濃度ｌｍ
Ｍ、１００μＭまたは１０μＭ)を添加、または添加せずに、４単位の精製組換
えヒトトポイソメラーゼIIとともにインキュベートした。反応はＳＤＳ(最終濃
度１％ｗ/ｖ)を迅速に加えて停止した。サンプルをプロテイナーゼＫで処理し(
３７℃で３０分間)、同量の４２:１ ＣＨＣｌ₃/i-アミルアルコールで２回抽出
した。負荷色素を添加した後、サンプルを４ x ＴＡＥ、０.５ｍｇ/ｍＬ臭化エ
チジウムを含む１％アガロースゲルに添加し、１６〜２４時間電気泳動を行った
。トポイソメラーゼIIの阻害は、捕捉された切断中間体を表す線状プラスミドＤ
ＮＡの生成により、また生成物(弛緩ＤＮＡ)に対する基質(スーパーコイルＤＮ
Ａ)の比により判定した。反応緩衝液を切断よりむしろ触媒作用の検出のために
至適化したこと、すなわちサンプル当たり２単位の酵素しか用いなかったこと以
外は同様にして、弛緩化アッセイを行った。この反応緩衝液は５０ｍＭ Tris-HC
I、ｐＨ８、１２０ｍＭ ＫＣｌ、０.５ｍＭ ＡＴＰ、０.５ｍＭジチオトレイト
ール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂であった。トポイソメラーゼIIの阻害は、生成物(弛
緩ＤＮＡ)に対する基質(スーパーコイルＤＮＡ)の比により判定した。

【表９】 a) ＩはトポイソメラーゼIIによるスーパーコイルプラスミドの弛緩化の阻害を
示し、ＣはトポイソメラーゼII反応中間体の集積を示す。

【０１１１】 実施例１８：薬物部分に関するベクターとしての完全長および末端切除のペネ
トラチンの比較 完全長および末端切除のペネトラチン担体部分を用いて適用された薬剤部分の
癌細胞(表９に記載の細胞系)に対する細胞毒性の生物学的効果を比較するために
適当なポドフィロトキシン共役体(ポドフェロトキシン-１９量体ベクター)、４-
[サクシンイミドプロピオノイル-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-IlＥｔrp-Phe-Gln-As
n-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-NH_２)]ポドフィロトキシン；ポドフィロト
キシン７量体ベクター、4-[スクシンイミドプロピオノイル-(H-Cys-βAla-Arg-A
rg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_２)]ポドフィロトキシンを適切な濃度で細胞に曝露
した。試験化合物の連続希釈物を細胞系に適用した。９６時間インキュベーショ
ンの後、細胞毒性を標準スルホドダミンＢ(ＳＲＢ)細胞増殖アッセイを用いて評
価した。ＩＣ_５０値は表９に示した。

【表１０】 １．イオン・マウス(iron mice)へのiv投与による最大耐性用量は、約４０ｍｇ/
ｋｇ(xマウス)である。 ２．イオン・マウスへのiv投与による最大耐性用量は、約７５ｍｇ/ｋｇ(xマウ
ス)である。 表から分かるように、末端切除ペネトラチン-ポドフィロトキシン共役体は、比
較的低い一般的な毒性を示すが、癌細胞に対する抗増殖活性に関してはより有効
であった。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、同時に合成したペプチド担体部分についてのＲＰ−ＨＰ
ＬＣ分析を示す。

【図２】 図２は、末端切除ペネトラチン類似体の細胞内在化アッセイを示
す。

【図３】 図３は、 ペプチドの生細胞への内在化についての直接測定の結
果である。

【図４】 図４は、 蛍光顕微鏡によるペネトラチン細胞内在化の撮影であ
る。

【図５】 図５は、 改変ペネトラチン類似体の細胞内在化である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９９０２５２５．６ (32)優先日 平成11年２月４日(1999．2．4) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９９０２５２２．３ (32)優先日 平成11年２月４日(1999．2．4) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９９１４５７８．１ (32)優先日 平成11年６月22日(1999．6．22) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ニコライ・ゼレフ イギリス、ディディ６・８エヌアール、ニ ューポート−オン−テイ、ウエスト・エイ カーズ・ドライブ28番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA01 EA10 FA18 GA30 HA20 4C076 AA95 BB13 CC27 EE41N EE59 FF32 FF67 FF68 4H045 AA10 AA30 BA14 BA15 BA16 BA17 BA41 BA72 EA20 FA34 GA21

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式： RQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号１） 1 16 （式中、アミノ末端から少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失している）または
   その変異体を含む膜移行ペプチド担体部分。
2. 【請求項２】 ９個までのアミノ酸が欠失している、請求項１の担体部分。
3. 【請求項３】 ６〜９個のアミノ酸が欠失している、請求項２の担体部分。
4. 【請求項４】 ９個のアミノ酸が欠失している、請求項３の担体部分。
5. 【請求項５】 RRMKWKK、NRRMKWKK、QNRRMKWKK、FQNRRMKWKK から選択され
   る、請求項３の担体部分。
6. 【請求項６】 （ａ）１以上のアミノ酸残基が自然界に存在または不存在の
   アミノ酸残基で置換され、（ｂ）１以上のアミノ酸の順序が入れかえられ、（ｃ
   ）（ａ）と（ｂ）が同時に存在し、（ｄ）スペース基が２つのアミノ酸残基の間
   に存在し、（ｅ）１以上のアミノ酸残基がペプトイド形態であり、（ｆ）ペプチ
   ドの１以上のアミノ酸残基の（Ｎ−Ｃ−Ｃ）骨格が改変され、または（ａ）−（
   ｆ）の組み合わせである、請求項１−５に定義された担体部分の変異体。
7. 【請求項７】 KRMKWKK、RKMKWKK、RREKWKK、RRQKWKK、RROKWKK、RRMKQKK、
   RRMKWFK、RORKWKK、RRMWKKK、RROWKKK、RRMKKWK、RROKKWKから選択される、請求
   項６の担体部分。
8. 【請求項８】 化合物２−２０のいずれかにより提示される、請求項１の担
   体部分。
9. 【請求項９】 下記式： RQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号１） 1 16 （式中、少なくとも１つのアミノ酸が別の自然界に存在または非存在の置換α−
   アミノ酸残基で置換されている）を含む膜移行ペプチド担体部分。
10. 【請求項１０】 アミノ末端から第６番目のアミノ酸がトリプトファンでな
    い、請求項９の担体部分。
11. 【請求項１１】 置換α−アミノ酸残基が、アラニン、アルギニン、アスパ
    ラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、
    ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン
    、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンの残基か
    ら選択される、請求項９または１０の担体部分。
12. 【請求項１２】 化合物２１−３６のいずれかにより提示される、請求項１
    １の担体部分。
13. 【請求項１３】 カルボキシ末端アミノ酸残基の遊離カルボキシ基が、-C(O
    )-NRR'（式中、R および R'は、水素、C1-6 アルキル、C1-6 アルキレン、C1-6
    アルキニル、アリール、各々がＯ、Ｓ、Ｎなどのヘテロ原子により選択的に置換
    されているものから選択される）の形態にある、請求項１−１２の担体部分。
14. 【請求項１４】 カルボキシ末端アミノ酸残基の遊離カルボキシ基が、カル
    ボキサミド基である、請求項１３の担体部分。
15. 【請求項１５】 式 RRMKWKK-NH₂ の、請求項１４の担体部分。
16. 【請求項１６】 ペプチドがＬ型でアミノ酸残基を含む、請求項１−１５の
    担体部分。
17. 【請求項１７】 ペプチドがＤ型でアミノ酸残基を含む、請求項１−１５の
    担体部分。
18. 【請求項１８】 ペプチドがレトロ型である、請求項１６または１７の担体
    部分。
19. 【請求項１９】 貨物体部分に結合した請求項１−１８の膜移行ペプチド担
    体部分を含む膜移行ベクター。
20. 【請求項２０】 貨物体部分が、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、タン
    パク質、ペプチド、生物学的に活性の化合物または診断剤である、請求項１９の
    移行ベクター。
21. 【請求項２１】 貨物体部分が、遺伝子、遺伝子断片、ＤＮＡ配列、ｃＤＮ
    Ａ配列、ＲＮＡ配列、ヌクレオチド、ヌクレオシド、合成または非合成の異項環
    基、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択されたオリゴヌクレ
    オチドまたはヌクレオチドである、請求項２０の移行ベクター。
22. 【請求項２２】 貨物体部分が、細胞周期を妨害するタンパク質またはペプ
    チドである、請求項２０の移行ベクター。
23. 【請求項２３】 貨物体部分が、ｐ５３ペプチド断片、ｐ２１^WAFペプチド
    断片、Ｆｅｎｌペプチド断片、ｐ１６ペプチド断片から選択される、請求項２２
    の移行ベクター。
24. 【請求項２４】 貨物体部分が薬剤である、請求項２０の移行ベクター。
25. 【請求項２５】 貨物体部分が細胞毒性剤である、請求項２４の移行ベクタ
    ー。
26. 【請求項２６】 貨物体部分が、ＤＮＡ障害剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物
    質、天然産物およびその類似物、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、ピリミジン
    類似物、プリン類似物、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、チミジル酸シンター
    ゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡクリーバー、トポイソメラーゼ阻
    害剤、アントラサイクリン類、ニチニチソウ薬剤、マイトマイシン、ブレオマイ
    シン、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジン薬剤、ジイネン類、ポドフィロトキシ
    ン、白金含有薬剤、分化誘導物質、タキサン類から選択される、請求項２５の移
    行ベクター。
27. 【請求項２７】 貨物体部分が、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロ
    ロメトトレキサート、5-フルオロウラシル、6-メルカプトプリン、オロムシン、
    レスコビチン、ボヘミン、プパラノールのような3-置換プリン、フラボピリドル
    、スタウロスポリン、シトシン・アビノシド、メルファラン、ロイロシン、アク
    チノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシン D、マイトマ
    イシン A、カルニノマイシン、アミノプテリン、タリノマイシン、ポドフィロト
    キシン、エトポシド、シスプラチン、カルボプラチニウム、ビンブラスチン、ビ
    ンクリスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタクセル、タキソエール・レ
    チオニル酸、酪酸、アセチル・スペルミジン、タモキシフェン、イリノテカン、
    カンプトデシンから選択される、請求項２６の移行ベクター。
28. 【請求項２８】 貨物体部分が担体部分に直接結合している、請求項１９−
    ２７の移行ベクター。
29. 【請求項２９】 貨物体部分が担体部分にリンカー部分によって間接結合し
    ている、請求項１９−２７の移行ベクター。
30. 【請求項３０】 標的化部分をさらに含む、請求項１９−２９の移行ベクタ
    ー。
31. 【請求項３１】 標的化部分が担体部分に接着している、請求項３０の移行
    ベクター。
32. 【請求項３２】 標的化部分が貨物体部分に接着している、請求項３０の移
    行ベクター。
33. 【請求項３３】 各担体部分が２以上の貨物体部分を担っている、請求項１
    ９−３２の移行ベクター。
34. 【請求項３４】 貨物体部分が相違する、請求項３３の移行ベクター。
35. 【請求項３５】 貨物体部分が担体部分にリシン残基ネットワークによって
    接着している、請求項３３または３４の移行ベクター。
36. 【請求項３６】 担体部分ペプチドがＬ型でアミノ酸残基を含む、請求項１
    ９−２５の移行ベクター。
37. 【請求項３７】 担体部分ペプチドがＤ型でアミノ酸残基を含む、請求項１
    ９−２５の移行ベクター。
38. 【請求項３８】 担体部分ペプチドがレトロ型である、請求項１９−３７の
    移行ベクター。
39. 【請求項３９】 担体部分ペプチドおよび貨物体部分の両方がＬ型である、
    請求項２３または２４の移行ベクター。
40. 【請求項４０】 担体部分ペプチドおよび貨物体部分の両方がＤ型である、
    請求項２３または２４の移行ベクター。
41. 【請求項４１】 担体部分ペプチドがＤ型であり、貨物体部分がＬ型である
    、請求項２３または２４の移行ベクター。
42. 【請求項４２】 担体部分ペプチドがＬ型であり、貨物体部分がＤ型である
    、請求項２３または２４の移行ベクター。
43. 【請求項４３】 細胞膜に移行し、細胞質基質に留まる、請求項１９−４２
    のベクター。
44. 【請求項４４】 細胞膜および核膜に移行する、請求項１９−４２のベクタ
    ー。
45. 【請求項４５】 １５個までのアミノ酸残基および少なくとも式： RRMKWKK （Ｉ） またはその変異体を含む膜移行ペプチド担体部分。
46. 【請求項４６】 下記： 【表１】 から選択される配送システム。