JP2002525066A - 核酸の特異的な細胞の局在化のための転写法 - Google Patents

核酸の特異的な細胞の局在化のための転写法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は遺伝の一時変異の新規な方法に関する。そこにおいて、利子の核酸は、横切って生体膜および／または定方向を特異的な位置へ移されるかまたは、合成の運搬実体を用いて、セル、動いている。本発明に従う運搬実体が新規でこのように、バインディング元素（BE）、例えばペプチド核酸、PNAに対する機能上の元素（FE）（例えばメンブレン・トランスロケーションおよび原子核輸送物性から成っているタンパクの核移行シグナル（NLS）、触角ペディアペプチド）がリンカー分子によって、好ましくは切り離した共役によって、生じる。そして、それは、化合はそれからキャリアに存在するBE標的配列に交雑する。そして、それはまた、利子の核酸を含む。利子の現在の核酸は、例えばペプチド（タンパクまたはリボゾームリボ核酸）をコード化しているジーンであってもよいまたは遺伝子の組換事象に役立つ他のいかなる核酸も。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の技術分野 本発明は核酸、導関数または生体膜全体にそれのアナログを転送しておよび／ま
たは特異的な位置にそれを向けるための方法の範囲内で、または、新しい合成の
運搬実体を用いて、細胞上のに関する。
【０００２】 バックグラウンド 遺伝の一時変異のための方法、そこにおいて、外部性遺伝形質は、それについて
機能を提供するセルが導かれる遺伝形質の取込みの速度によって、通常制限され
るホストに導入される細胞。真核細胞の、核の取込みがしばしば極限であること
。直接型注入法がこの文脈において、使われた場合であっても、それらはしかし
極めて遅くて労働集約型である。このように、より大きいスケールために、核酸
を細胞に変形させるための標準分析法は、核酸の異なる化学化合物の間で形成さ
れる複合体の取込みにむしろ基づく。 遺伝形質は、それから受動的に細胞の核に入るのを任せられる。
【０００３】 核移行シグナル（NLS）は、この文脈において、提案された。1つの例、Sebestye
nその他に（1月nat. Biotechnol.（1998）; l6：（l）：80-85）ジギトニンを使
用することはNLS eptideをプラスミドに化学的に連結した後に核転座を可能にす
るために細胞に浸透したことを示唆する。 更に、ヨネダほか、exp. Cell Res. 201：213、1992は、細胞核への970kDaより
大きいタンパクのトランスロケーションを報告した。 より具体的には、核移行シグナル（NLS）を含んでいる融合タンパクは、細胞の
細胞核に輸送される。 ニールセンその他の名において、米国の開出した5番539 082は、ペプチド核酸（
PNAs）として公知の化合物の綱を開示する。 その中で記載されているPNAsは、リガンド（例えば適切なリンカーによるペプチ
ド・バックボーンに対するデオキシリボ核酸塩基、複合化）から成ることができ
る。 米国の5 539 082に従うPNAsは細胞の範囲内で標的特性ジーンおよびウィルスに
例えば利用できる。その一方で、それの性状は電荷および水溶解性の非共存によ
って、特徴を描写される。
【０００４】 更にWO 96/11205また、ニールセンその他の名において、大きい分子数（いずれ
がPNAに所望の性状を供給することを目的とするか全て）のいかなる一つのよう
なも、共役に化学的に結合されるPNAから成るPNA共役を提案する。 したがって、PNAはこのように、例えば症候または治療薬として有効である。 前記PNAはある、上記に対する同様は米国の5 539 082（細胞の範囲内でその有利
な機能を行うことを目的とする）を議論した。
【０００５】 本発明の要約 本発明は、遺伝の一時変異の一般で効率的な方法の提供を目的とする。 そこにおいて、利子の核酸、導関数またはそれのアナログは、横切って生体膜お
よび／または定方向を特異的な位置へ移されるかまたは、新しい合成の運搬実体
によって、セル、動いている。 現在の運搬実体は機能上の実体（FE）を連結することにより提供される本発明に
よって、ある。そして、ペプチド核酸（PNA）のような任意に離れて前記FEおよ
びBEを保つためのリンカー分子および利子の核酸のキャリアに存在するBE標的に
それのハイブリダイゼーションを有する、バインディング元素（BE）にとって、
それはいかなる所望の生物学的性質も表すことができる。 本発明も、このようにそれのさまざまな有利な使用にと同様に新しい運搬実体に
関する。
【０００６】 定義 本願明細書において、以下の学術用語および略記号は、次のように扱われる： ここで使用しているように、学術用語「利子の核酸」は、いかなるデオキシリボ
核酸も、リボゾームリボ核酸または他ヌクレオチドまたはいかなるアナログにも
関する、または、それの、細胞の遺伝の一時変異を実行するために役立つ導関数
。 換言すれば、 細胞または核におよび／または新規なこの種の生育環境の特異的な位置に対す
る直接の前記「利子の核酸」にとって、生体膜全体のこの種の「利子の核酸」を
転送することは、所望でもよい。 「利子の核酸」は、例えばペプチドまたはタンパク（例えばエヌ酵素）をコード
化することは管理している機能（例えば結合部、その他）に提供するジーンであ
ってもよい。
【０００７】 学術用語「機能的元素」（FE）は、それに連結される分子に一つ以上の特異的な
生物学的な機能を授けることができるいかなる部分もまたは性状に関する。 それは、例えば輸送能力を提供できる。 現在の機能上の元素は、以下の発明の詳細な説明において、更に例証される。 「バインディング元素」（BE）は、いかなる自然であるか合成の核酸も、核酸導
関数または、好ましくはハイブリダイゼーションによって、それの指定された標
的に対する特異的で、強くて耐久性があるバインディングができる核酸アナログ
であってもよい。 この種のBEの1つの例は、後述するPNAである。
【０００８】 このように、「PNA」は核酸塩基がメチレン・カルボニル・リンカーを経て取り
付けられるアミノメチル Ｇユニットからなる疑似ペプチド・バックボーンを有
するペプチド核酸およびより詳しくはデオキシリボ核酸擬態者に関連する。 （ニールセン（P.E.：ペプチド核酸（PNA）：「ジーン治療薬のための鉛」）は
、例えば知るDrugディスカバリーおよびDesignのPerspectives、第4巻、pp. 76-
84;、そして、Dueholmその他（New J. Chern.）1997、21、19-31：「化学、性状
およびPNAの適用法」。） PNA分子は、補足性ssDNA、dsDNA、リボゾームリボ核酸およびPNA標的に雑種を産
むことができる。 現在の開出した出願の、学術用語「PNA」が上述したバックボーンおよび核酸塩
基から成るアナログおよび学術用語がそうしなければならないいかなるデオキシ
リボ核酸にも関連すると理解することになっていることこのように、本願明細書
において、与えられる基準において、開示される特異的な構造に、限られていな
い。
【０００９】 「NLS」は核移行シグナルに関連する。そして、それは特定の輸送タンパク質上
の残基を認識して、具体的には、結合するいかなるタンパクも/ペプチドであっ
てもよい。 より具体的には、NLSドメインはポリペチドにおいて、展開したアミノ酸配列で
ある。そして、細胞核に細胞原形質からそれによって、ポリペチドの移動を容易
にする。 NLSドメインを含んでいる指定された核のポリペチドは、細胞核、MattajおよびD
eRobertis、1985に、ポリペチド-リボゾームリボ核酸錯体の運搬を可能にするこ
とを示した。 学術用語「媒介者」は、本願明細書において、プラスミド（オリゴヌクレオチド
）を示すために用いるか他のいかなる分子であるか遺伝の一時変異イベントの間
に停泊させておよび／または核酸を転送できる作成物である。 このように、学術用語「媒介者」は、また、上で例証されるもののいかなるアナ
ログもまたは導関数に関する。
【００１０】 学術用語「細胞壁」本願明細書において、使用する‖生体系（例えば真核細胞膜
、植物細胞を囲んでいるメンブレンまたはバクテリアその他）を囲むのに役立つ
いかなるメンブレンにも関する 培地からの遺伝形質の細胞によるいかなる取込みのためもの一般用語として本願
明細書において、用いられる「トランスフェクション」は、ある。 現在のコンテキストにおいて、「形質転換配列」は宿主細胞の遺伝の一時変異イ
ベントに参加して、例えばタンパク暗号配列、調節性元素、全てのジーンその他
であってもよいいかなる配列にも関する。 細胞に関連することは本願明細書において、単に遺伝の一時変異がその中で起こ
ったことを意味するために用いる学術用語「組換え型」。 より具体的には、それの一時変異が外因の核酸の導入によって、得られた指示に
、それが使われるなまの核酸またはそれの交互、細胞はそれほど修正される細胞
から誘導される。
【００１１】 学術用語「細胞」または「宿主細胞」は、本願明細書において、いかなる細胞も
示すために用いる、そこにおいて、いかなる異なるか外因の遺伝形質も、導かれ
た。 最も広義に、「宿主細胞」は遺伝的に操作された細胞を示すために用いる。 学術用語「ポリマー」（例えば「タンパク」、「ポリペチド」および「ペプチド
」）は本願明細書において、交換可能に扱われる。そして、アミノ酸残基のいか
なるより短いかより長いポリマーにも関する。 自然に起こっているアミノ酸ポリマーに加えて、学術用語もアミノ酸ポリマーに
あてはまる、そこにおいて、一つ以上のアミノ酸残基は、対応する自然に起こっ
ているアミノ酸の人為の化学のアナログである。 更に、コンテキストがまた、理解される現在の学術用語「ポリマー」は、いかな
るグリコプロテインも、脂質、本願明細書において、開示された目的に役立つリ
ポタンパク質その他を含む。
【００１２】 「標識」は、分光学的、写真薬品、生化学であるか、免疫学的であるか化学の手
段による組成検出可能である。 学術用語は、核酸またはペプチド核酸の補足性塩基またはいかなる導関数もの塩
基の対合によって、いかなるバインディングも、デュプレキシングまたはハイブ
リダイゼーションに本願明細書において、参照を「交雑させる」、または、それ
の類似した。 学術用語「特性ハイブリダイゼーション」細胞の生育環境において、バインディ
ング（その配列が複合した混合液またはデオキシリボ核酸に存在する特定のヌク
レオチド配列および／またはリボゾームリボ核酸だけに対する分子のデュプレキ
シングまたはハイブリダイゼーション）に、本願明細書において、参照を使用す
る。 ここで使用しているように、「相同的」配列は配列である。そして、それは同一
であるか十分にターゲッティング配列および細胞のデオキシリボ核酸が特性を経
ることができるようなものは対にすることの基礎を形成する細胞のデオキシリボ
核酸と同様である。 ここで使用しているように、「ターゲッティング配列」は配列である。そして、
それはゲノムであるか染色体外のデオキシリボ核酸の所望の部位または的状赤血
球に含まれるリボゾームリボ核酸配列に利子の核酸を導く。
【００１３】 発明の詳細な説明 第1の見方において、本発明は実体を生体膜全体の利子の核酸を転送しておよび
／または特異的な位置にこの種の核酸を向ける方法に関するかまたは細胞に合成
的を用いて輸送する; 以下の段を含む (a) 利子およびバインディング元素（Be）の核酸から成るキャリア分子に標的配
列（任意に一体となって元素）を提供すること; (b) Beに結合少なくとも一つの機能上の元素（Fe）によって、錯体を提供するこ
と; (c) 前記キャリアのBe標的に前記錯体のBeを交雑させること; そして、 (d) 前記メンブレン全体の利子の核酸の移植を提供する前記生体膜を有する接触
前記運搬実体。
【００１４】 現在の方法の好適な実施例において、バインディング元素（BE）はペプチド核酸
（PNA）または導関数である、または、PNAに対するそれについて特性ができるア
ナログおよび耐久性があるハイブリダイゼーションはシーケンスを目標とする。
生体膜は、例えば、細胞壁または核膜であってもよい。 段（b）において、つくられる錯体は、また、以下を含むことができる： スペーサ元素（例えばリンカー（L）分子）、それはBEをFE.から切り離す 更に詳細に下で議論される特性実施例において、錯体は複数のFEから成る、 そこにおいて、1つのリンカーを超える症例が、分別のために使うことができる
。 段(a)はまた、キャリアの検出可能マーカーまたは標識の基本入を含むことがで
きる。そして、それはこの方法により実行される遺伝の一時変異の効率の次の解
析を容易にする。
【００１５】 このように、現在の方法で、細胞または細胞核への利子の核酸の実際の移植の前
に、バインディング元素（BE）（好ましくはPNAまたはPNAのような分子）の有利
な性状が、主に形質転換の第一段階において、使われる、そこにおいて、利子の
前記核酸の効果は、要求される。 このように、本願明細書の導入において、議論される従来技術特許とは逆に、本
発明による方法の効果は、基礎を形成されないかまたは、細胞または細胞核に入
るPNAのまたは結合する元素の能力に関して、依存していない。 むしろ、PNAまたはいかなる等価のバインディング元素も、提供する本発明によ
れば使われる強い、そして、満足に結合、利子の核酸のキャリアに対するPNAIPN
A標的相互作用を経て、機能上の元素（FE）の。 このように、FEが生体膜全体の全部の移植実体の実際の運搬を提供するために発
明によって、使われる。
【００１６】 現在の方法の好適な実施例において、使用されるPNAは、強くデオキシリボ核酸-
デオキシリボ核酸か、リボゾームリボ核酸-デオキシリボ核酸かリボゾームリボ
核酸-リボゾームリボ核酸バインディングより高い親和性を有するデオキシリボ
核酸およびリボゾームリボ核酸に結合する合成ＤＮＡアナログである。 それの特異的な配列は、それがハイブリダイゼーションによって、縛ることを目
的とする核酸のための特性であるために設計される。 PNAは非常にゆっくり新陳代謝して、また、非毒性であるために示したそれ、明
らかに、大きい効果はある製薬の場において、使われる。加えて、PNAはそれに
対して相補性である核酸の配列に、非常に特異的なバインディングができる。そ
して、それは順番にPNAが形質転換のための現在の方法のBEとして使われる正し
く変わるセルの高周波を提供する。 このように、現在の方法のBEとしてのPNAの使用は、錯体に対する性状および生
物学的製剤安定度が形成した優れたリボゾームリボ核酸およびデオキシリボ核酸
ハイブリダイゼーションを授ける。 PNAが、固相ペプチド合成によって、この場に熟練した誰かによって、容易に生
じる（e.gを参照のことインターナショナルが適用法WO 95/0 1370およびWO 92/2
072およびニールセンの特許権をとること（P.E.：Peptide核酸（PNA）：「ジー
ン治療薬のための鉛」）DrugディスカバリーおよびDesignのPerspectives、第4
巻、pp. 76-84）。
【００１７】 好適な実施例の、上述したリンカー配列が本質的にまたは完全に充電してないこ
と。ln、このコンテキストが「非反動的な」期間リンカーがそれが使われる生育
環境のいかなる望まれていないか有害な化学反応も経ないと説明するために使わ
れる例えば、それはそれがトランスフェクション・プロセスの間、連絡する細胞
および／または細胞核の他のいかなる成分とともにも、化学反応しない。 それは、また、PNAおよび機能上の元素（FE）（キャリアその他）のような、BE
からみてと同様に現在の方法で使用するいかなる試薬に関しても、本質的に非反
動的でなければならない。 所望の結果を妨げることのないスペーサ元素として機能する他のいかなる分子も
使うことができると理解されることになっている場合であっても、現在のリンカ
ーは、例えばアミノ酸残基の適切な数のポリマーから成ることができる。 大きさ、そして、配列が依存しているリンカーの天性それのプライマリ機能が所
望の機能の効果を可能にするために前記元素間の充分な面間隔を提供することに
なっているように周囲の元素。 更に、それはメンブレン全体の移植の後、利子の核酸の所望の効果または形質発
現を妨げてはならない。
【００１８】 特異的な実施例において、細胞のプロテアーゼまたは、細胞表面リセプタに生体
膜および／または粘着全体の運搬を可能にして、ヌクレアーゼのような、現在の
リンカーは、酵素により切断される そうすると、標的（例えば中で細胞原形質または細胞核）の範囲内で、望ましく
ない一部または部分の次の処分。 1つの特定の実施例において、利子の挿入された核酸のより効率的な効果を提供
するために、BEは離れて切断される。 現在の方法の典型的な他の実施例の、リンカーがプロテアーゼによって、本質的
に隠すかまたは例えば望まれていない生物学的劣化から例えば現在の運搬実体を
マスキングすることができること。 加えて、または代わりに、リンカーはいかなる更なる有利な性状も所有できる。
そして、本来例えば生物学的な他の機能的を授ける。
【００１９】 現在の機能上の元素（FEs）はいかなる数の機能（例えば構造機能）を提供でき
る。そして、例えば細胞膜標的分子または酵素機能（例えば転送されたデオキシ
リボ核酸の特定地域向けの基本入を強化するインテグラーゼ活性）に結合する。
本発明の使用に適している有利なFEsの具体例は、例えば細胞付着（例えばバイ
ア・トランスフェリン・リセプタ）の機能である;細胞膜貫入（例えばバイア触
角pediaペプチド）;核輸送（それは、下記のより多くの詳細;核の酸凝縮ペプチ
ドにおいて、後述する）好ましくは強い、ポジの電荷を有する;エンドソーム/ラ
イソソーム逃避（例えばバイア・アデノウィルス・カプシドタンパク質）;そし
て、デオキシリボ核酸組込み、例えばインテグラーゼを経た。1つの特定の実施
例において、発明のFEは、HIVウィルス示されたTATのタンパクである。 現在の
方法の特異的な実施例、FEは成分を***させているエンドソームである。そして
、それはライソソーム減生の細胞過程により転送された生物学的な元素の減生を
防ぐ。
【００２０】 本発明の方法の一実施例において、通される生体膜は、真核または原核細胞を囲
んでいるメンブレンまたは盤である。 追加であるか他の実施例において、現在の方法は、真核細胞の細胞核に利子の核
酸を嵌入するために用いる。 最後の言及された実施例において、効率的な運搬は、BE、例えばFEとしてのPNA
および適切な核移行シグナル、NLSの錯体をつくることによって、またはFEの部
分として提供されることができる。
【００２１】 本発明の方法で、意図された使用および所望の結果に従う適切な目において、BE
および前述のFEsおよびリンカーのうちの1つ以上の中で構成される運搬実体が、
使うことができる。このように、1つの例として、一連のBE-linkerFE-リンカーF
Eその他が、使うことができる。更に、特異的な実施例において、キャリアは複
数のBE標的配列から成る。そして、その上にこのようにさまざまなBE-リンカーF
E複合体のうちの1つ以上のハイブリダイゼーションを可能にする。この特異的な
実施例において、BEsおよび／またはFEsが同一である所要量が、ない。これに反
して、異なるものを含むことは、有利でもよい。このように、特異的な実施例に
おいて、錯体はPNA-リンカー-FEリンカー-FE配列を含むことができる。リンカー
は適切な面間隔を提供するために実行される。そして、例えば元素の大きさおよ
び他性状に依存する。
【００２２】 更に、現在のキャリアは、BE（例えばPNA）のための複数の標的を含むことがで
きる。 したがって、この種のキャリアは、本願明細書において、例証された複合体のう
ちの1つ以上まで、ハイブリダイゼーションができる。 更に、本発明は診断目的のために使用する開示された上記として、方法に関する
。 このように、利子の核酸は診断のマーカーまたは標識をコード化することができ
る。そして、それの必要の被検者の次の鑑別を可能にするために、方法は生体内
に動作できる。
【００２３】 加えて、本発明も本願明細書において、開示される方法のいかなる一つも実行す
ることに適しているキットに関する。この種のキットは、バインディング元素（
BE）（例えばPNAまたはそれの機能的フラグメント）を含むことができる;機能上
の元素（FE）;例えば核移行シグナル（NLS）または触角ペディアペプチド;前記B
E（例えばPNA標的配列）のための標的部位から成る重複の要素をもつオリゴヌク
レオチド。 現在のキットの一実施例において、FEは運搬実体の移植および／または方針を可
能にする。別の実施例において、発明のキットも、この種の移植および／または
方針のための適切な試薬から成る。発明のキットは適切な容器において、示され
る。そして、適切な方法でそれの使用を容易にするために任意に規定を含む。
【００２４】 第2の見方において、本発明はこのように新しい合成の運搬実体に関する。そし
て、それは、運搬実体は上記の議論された方法のいかなる一つにも役立つ。 現在のBE-FE錯体は、一般式Iにより記載されていることができる： .BE-L FE ...(Ｉ), そこにおいて、 BEは、バインディング元素を示す; Lはリンカーを示す。そして、それはしかし任意の元素である; そして、FEは機能上の元素を示す。
【００２５】 前記錯体は、それからキャリアに存在するBE標的に、配列特性ハイブリダイゼー
ションができるそれに加えて、または、部にの（現在のBE）利子の封じ込め一つ
以上核酸。 キャリアは、例えば以下を含むことができる：プラスミドまたはそれの機能部分
（例えばジーン、オリゴヌクレオチドまたはキメラプラスト.）（コール・シュ
トラウス、A.、その他を参照のこと例えば、1996年9月サイエンス（vol 273）：
「リボゾームリボ核酸-デオキシリボ核酸OligonucleotideによるSickle Cell An
emiaのためのMutation Responsibleの修正」の）。BEは、上記したように好まし
くはPNAであってもよい。 本発明に従うリンカーの使用は任意である、しかし、好む、そして、それは本発
明の第１の態様に関してより上に詳述する。
【００２６】 したがって、この第2の見方の一実施例は、生体膜（例えば細胞壁）全体の利子
の核酸を輸送しておよび／または特異的な位置に前記核酸を向けることに適して
いる合成の運搬実体であるの範囲内で、または、セル、動いている。
【００２７】 この本発明の第二態様において、もっと先に、意図された使用および所望の結果
に従ういかなる適切な目にもおいて、運搬実体が前述のFEsおよびリンカーのう
ちの1つ以上を含むことができると理解されることになっている。 このように、特異的な実施例において、錯体はBE-リンカー-FEリンカー-FE配列
を含むことができる。 使用するキャリアは、好ましくは利子の一つ以上の核酸と同様に一つ以上のBE標
的から成るプラスミドまたはオリゴヌクレオチドである。 BE/BE標的の強い配列特性ハイブリダイゼーションはこのように錯体をキャリア
に取り付ける。そして、FEは好ましくは問題のメンブレン全体の移植を提供する
。 適当な様に、リンカー分子は含まれる。
【００２８】 更に、この第2の見方の他の実施例において、本発明は特に真核細胞（それはBE
から成る）の核膜全体の利子の一つ以上の核酸を輸送することに適している運搬
実体に関する。そして、この場合以下を含むFEによって、ペプチド核酸（PNA）
が好ましくは複雑になる：核移行シグナル（NLS）。 このように、現在の運搬実体は、特に真核細胞をトランスフェクションさせて、
細胞の細胞核に利子の核酸を導くことを目的とするいかなる方法ために、も適切
である。 しかし、特定のBEs、FEsおよび各々の症例において、選ばれる核酸に従い、現在
の運搬実体は、いかなるジーンもまたは遺伝の元素を有するいかなる細胞核もの
効果的で特異的なトランスフォーメーションを可能にするように設計されていて
もよい。
【００２９】 このように、より詳しくは、第2の見方の有利な実施例は本発明に従うPNA-NLS錯
体である。そして、それは一般式により記載されている ..BE-L FE .. (ＩＩ)、 そこにおいて、 BEは、一連の1つ以上のPNA塩基類である; Lは、リンカー配列を示す; そして、FEはNLS配列である。
【００３０】 前記PNA-NLS錯体は、それからPNA標的を含んでいるプラスミドおよび利子（例え
ばペプチドをコード化しているジーン、タンパクまたはリボゾームリボ核酸）の
核酸に交雑する。前記リボゾームリボ核酸は、例えばリボザイム（すなわち酵素
機能を有するリボゾームリボ核酸）であってもよい。特異的な実施例において、
NLS配列はSV40大きいＴ抗原タンパクまたはそれのフラグメントである。そして
、それはシグナル性状を局所化している所望の原子核を呈する。しかし、適切な
NLS配列の選択は、意図された将来使用に依存する。と、これに熟練したものと
して、場が理解する。 このように、それが運搬実体をメンブレン全体の本発明によれば、そして、宿主
細胞の細胞核に変形させる所望の機能を果たす限り、現在のNLSは、他のいかな
るオリジンもまたは組成の中でありえる。
【００３１】 1つの特異的で例示している実施例において、発明のPNA-NLS錯体は、式IIIによ
り記載されている： GCG CTC GGC CCT TTC L Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val（III）、 そこにおいて、 Lは、式(ＩＶ)により記載されている： ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ (ＩＶ)、
【００３２】 しかし、熟練した人類が従来技術において、容易に現金化するように、添付の請
求項に記載の本発明の範囲内で、有利な合成の運搬実体をさらに提供すると共に
、変異はこれらの配列に作られることが可能である。 本発明を使用することによって、核酸または他のいかなる生体分子にも異なる直
接機能を取り付けることによるウィルスおよび微生物の機能および／または細胞
へ移される錯体を模倣することが可能である。 同時に、なまのウイルスの媒介者の有害な性状は、現在の移植実体の使用によっ
て、避けられる。
【００３３】 このように、本発明を例示するとして使用する錯体から成るPNAが、優れたリボ
ゾームリボ核酸およびデオキシリボ核酸ハイブリダイゼーションに性状および生
物学的製剤安定度を提供して、固相ペプチド合成によって、容易に生じる。 （国際特許出願公開第WO 95/01370およびWO 92/2072およびニールセンを参照の
こと例えばP.E.：ペプチド核酸（PNA）：「ジーン治療薬のための鉛」、Drugデ
ィスカバリーおよびDesignのPerspectives、第4巻、pp. 76-84）。
【００３４】 より具体的には、本発明に従う移植実体の建設において、現在の錯体およびキャ
リアは、媒介者のBE標的に、錯体のBEのハイブリダイゼーションによって、各々
に取り付けられる。このように、特定の実施例において、PNAはPNA標的配列に交
雑する。 この種の配列特性ハイブリダイゼーションは、この場に熟練した誰かによって、
容易に実行される。（ハイブリダイゼーション・テクニックは、例えば現実には
一般に「核のAcid Hybridisation（A Practical Approach）」、Ed. Hames、B.D
.およびヒギンズ（B.D.）に記載されているプレス（1985）;ガル、そして、Pard
ue;会報NaiL Acad科学USA 63：378-383（1969）;、そして、ジョンその他、ネイ
チャー223：582-587、1969）。 オリゴヌクレオチドは、直接型化学合成、例えばNarangその他のホスフォトリエ
ステル法、メソジストEnzymol. 68によって、例えばこの場に熟練したものにと
って公知のいかなる適切な方法にもよって調製されることができる; 90-99（197
9）に：ブラウンciのりん酸ジエステル法で（メソジストEnzymol. 68：109-151
（1979）; Beaucage ciの全くdiethylphosphoramidite方法）Tetra.会報、22：1
859-1862（1981）;、そして、米国特許4番458 066の固体担体方法。
【００３５】 キャリアの建設に用いられる異なる媒介者および核酸は、公知技術で、熟練した
誰かによって、容易に選ばれる。 （使うことができる検査法に対する一般の基準のための、例えばSambrookその他
を見ること（CloningしているMolecular）A Laboratory Manual、第2の編集、vo
l 1-3、コールドスプリングハーバーLaboratory、コールドスプリングハーバー
、NY、1989。）
【００３６】 発明の移植実体の特異的な実施例において、キャリアはまた、以下を含む： マーカーまたは標識（例えば実体を含んだ細胞の検出および確認を可能にする蛍
光性標識、その他）。プラスミド・キャリアの場合には、標識は例えば蛍光性タ
ンパク、例えば緑の蛍光性タンパク、GFPをコード化しているジーンであっても
よい。オリゴヌクレオチド・キャリアの場合には、マーカーは例えば蛍光性マー
カー（例えばCy-3）である。 標識化およびそれの検出は、この場に熟練したものにとって周知で、米特許no.
3 817 837; 3において、例えば開示される850 752; 3 939 350; 3 996 345; 4 2
77 437; 4 274 149;、そして、4 366 241。
【００３７】 本発明の最後の言及された実施例に従う新しい移植実体を使用することによって
、利子（例えばジーン）のいかなる核酸一次構造も、細胞核に入るNLS能力のた
めに、能率的に宿主細胞に導入されることができる。 遺伝の元素の効率的で特異的な移植その有利な結合の能力を有する発明のトラン
スフェクション実体は多くの異なる適用法の大きい値の中である。そして、その
幾つかは更に詳細に下で開示される。
【００３８】 本発明を例示するように、細胞を変える方法は以下の段により記載されているこ
とができる： (i) PNA-NLS共役のPNAドメインに、少なくとも一つのPNA標的から成るキャリア
を交雑させることによって、発明の錯体を提供すること; (ii) トランスフェクション試薬がある場合には、トランスフェクションする細
胞を有する段(a)において、形成される錯体に連絡すること; (iii) 入る錯体をできる細胞の細胞核; そして、 (iv) 形質転換が起こることができること、 そこにおいて、PNA錯体が、使われる核転座イニシエータ。このように、いかな
る形質転換配列（それは以前に要求性位置上の媒介者に含まれた）も、具体的に
は、以下を含む媒介者上のPNA標的に結合するために細胞およびPNA機能の細胞核
に入るNLS能力のために、能率的に転送されることができる：利子の核酸一次構
造。
【００３９】 段(ｉ)に関しては、ハイブリダイゼーション・フォーマットの品種は、この場（
例えばサンドイッチ・アッセイおよび競合または置換アッセイ）に熟練したそれ
らにとって公知である。 ハイブリダイゼーション・テクニックは、例えば現実には一般に「核のAcid Hyb
ridisation（A Practical Approach）」、Ed. Hames、B.D.およびヒギンズ（B.D
.）に記載されているプレス（1985）;ガル、そして、Pardue;会報Natl Acad.科
学USA 63：378-383（1969）;、そして、ジョンciすべてのもの、ネイチャー223
：582-587、1969。
【００４０】 したがって、第１に、現在の方法は、NLS運搬能力を利用する、それによって、
それは、それに対して結合されるいかなる元素と共にも宿主細胞の細胞核に持っ
てこられる。 細胞核内部で、NLS-タンパク錯体は溶かされることができる。そして、FE（NLS
）に対するタンパク・パートナーは細胞核を出ることができる。その一方で、輸
送されたキャリア・プラスミドはその中で残る。このように、第２に、キャリア
に存在する利子の核酸は、的状赤血球内部で形質転換を実行するために利用でき
る。一方、FE（NLS）に対するタンパク・パートナーは細胞核に追加の実体を伴
うことによって、その機能を繰り返すことが可能である。そして、このように本
発明によって、得られる驚くほど高いトランスフォーメーション頻繁に貢献する
。
【００４１】 このように、上記したように、Sebestyenその他は、細胞の遺伝の一時変異の方
法のプラスミドに、核移行シグナルの化学の共役を使用した、そこにおいて、PN
Aが、使われない。しかし、それらの方法がプラスミド機能をまた、悪くする重
篤欠点を含むように見える。このように、Sebestyenその他間の方法および本発
明の必須相違がある。そして、それは得られた形質転換率の実質的な相違に対す
る可能な説明であってもよい。
【００４２】 このように、特異的な実施例において、トランスフェクション試薬は、ポリマー
・トランスフェクション試薬、例えばPEI、ポリエチレン=イミンである。PEIが
、遺伝子治療実験的配列において、以前に使われて、高いトランスフェクション
効率を提供できるのと同様に関連した供与量において、非中毒性であると報告さ
れた。PEIトランスフェクションのための経路は、ベースのトランスフェクショ
ン試薬が今日共通に使用した標準脂質と異なる。ポリマーはプロトン受容体とし
て機能して、浸透圧ストレスによって、エンドソームを***させると考えられる
。そして、このように核酸をリリースする。 この文脈において、他の特異的な機能上の元素を用いて本発明の他実施例におい
て、PEI（脂質その他）がそうすることができるようなトランスフェクション作
因が除外される点に留意する必要がある。これは、運搬実体に含まれる機能上の
元素が所望のメンブレン全体の運搬を提供できるか否か、に依存する。本発明の
特異的な実施例において、本発明による方法は、更に以下を含む：追加の段（v
）、そこにおいて、結果として生じるトランスフォーメーションは、以前に含ま
れた標識またはマーカーを測定することによって、確かめられる。この種の標識
およびマーカーの天性および一致性は、本出願のまた、議論されたどこか他の所
である。
【００４３】 本発明による上記の開示された方法の1つの有利な実施例において、段（iv）に
おいて、定義されるトランスフォーメーションは、プラスミドベクトルを用いて
一つ以上のタンパク暗号配列を導く。このことにより、例えば外部性を表してい
る宿主細胞を生んでいる効率的なトランスフォーメーション、または、非本来の
、タンパクまたはポリペチドは、得られる。本発明の別の実施例、一致している
トランスフォーメーション、段（iv）がそうすることができるlnが、宿主細胞の
一つ以上のジーン調節配列を導くために使われる、それによって別沈黙ジーンは
、表されることができる。この後者実施例は遺伝子活性化として公知のテクニッ
クを使用する。そして、それは例えば米開出した5番641 670で詳述する。現在の
方法の2つの上記の開示された実施例のいずれの一つにもおいて、結果として生
じる悪性変換細胞は、薬物として有効なタンパクのような物質を生産するために
用いてもよい。
【００４４】 現在の方法の更なる実施例において、段（iv）において、定義されるトランスフ
ォーメーションは宿主細胞の突然変異を修復することを目的とする。そして、そ
れは基礎の特異的なDNA修復によって、例えば得られることが可能である。別の
実施例において、前記トランスフォーメーションは、宿主細胞の突然変異を導く
ことを目的とする。これを、要求できる、例えば、ジーンの形質発現がそうな場
合、発現産物のまたは動物の生産の天性に対する所望の料金はさまざまな遺伝病
の研究のために模型を作らない。
【００４５】 本発明の更なる効果は例示しているPNA-NLS錯体が広い適応性を有するというこ
とである、したがって、本発明は世界的に研究室の日常的な基本に従来は、使用
される全てのプラスミドの90%以上を運搬するために用いてもよい。
【００４６】 したがって、本発明の別の態様は開示された上記として方法により生産される組
換え型細胞である。本発明も動物モデル（例えばハツカネズミ）に関する。そし
て、特定のゲノム欠損の研究のために、特に設計される本発明による方法によっ
て、生じる。一般のクローン化テクニックおよび細胞を培養する方法は、この場
に熟練した誰かにとって周知である。（Sambrookその他は、例えば知る（Clonin
gしているMolecular）A Laboratory Manual、第2の編集、vol 1-3、コールドス
プリングハーバーLaboratory、コールドスプリングハーバー、NY、1989; Freshn
ey：Animal Cells、BasicなTechniqueのA Manual、第3の編集、ワイリー-Liss、
ニューヨーク、NY（1994）のCulture）。1つの特に有利な本発明の態様はPNANLS
錯体の使用である。そして、トランスフェクション方法は遺伝子治療の上記を開
示した。この種の適用法のために、共役はオリゴヌクレオチド媒介者（例えばデ
オキシリボ核酸-リボゾームリボ核酸の空想的な作成物、PNA-デオキシリボ核酸
または他のいかなる化合も）に交雑できる。遺伝子治療手順は、多くのコンテキ
ストの獲得性で遺伝された遺伝子欠損を修正するために用いた。人間またはアニ
マル（例えば哺乳類）の人工遺伝子を表す能力は、多くの重要な疾患（しばしば
他治療を有する処理に快く従わない）の保全および／または治癒を容易にする。
しかし、遺伝子治療に対する現在利用できるアプローチは感染力をもつ媒介者（
例えばレトロウイルスの媒介者）を、利用する。そして、それは表される遺伝形
質を含む。この種のアプローチは、限界（例えば媒介者生産の間、複製-コンピ
テント・ウィルスを生成するポテンシャル）を有する;治療のウィルスおよび、
潜在的に新しい細胞特異性を有する感染因子を生成して、内因性のレトロウイル
スの元素間の遺伝子組換え;ホストは、変動するかまたはビルレンスおよび細胞
毒性を増やした;腫瘍形成性の基本入イベントのリスクを増やして、大量の細胞
への独立組込み;レトロウィルス（それは、治療の適応性を制限する）の限られ
たクローン化容量および利子の産物の短命な生体内の形質発現。このように、本
発明に一致している使用そこにおいて、本発明によるPNA-NLS共役または複合体
が使われる、従来技術のウィルス方法と関連する限界およびリスクを避ける。例
えば、以前に、嚢胞性繊維症のコンテキストにおいて、アデノウィルス媒介者が
、遺伝子治療の媒介者として使われた。この種の媒介者は望まれていなくて有害
な免疫応答を引き起こすことができる。そして、それはしたがって、発明の新し
いPNA-NLS共役の有利な使用によって、避けられる。
【００４７】 従って、本発明もこのように遺伝子治療方法に関する、そこにおいて、少なくと
も一つのトランスフェクション試薬、例えば上記したポリエチレン=イミン、PEI
と特定の適用法において、本発明による共役または複合体が、使われる。この種
の方法は、しばしば変化する欠損ジーンを修復することを目的とするが、また、
例えば望まれていないタンパクの形質発現を防ぐかまたは特定の欠損の研究のた
めの動物モデルを生産するために、突然変異を導くために利用できる。遺伝子治
療により処理されることができる疾患の1つの例は嚢胞性繊維症（CF）である。
そして、それは多数の患者を悩ます。標的器官がかなりアクセスできる肺臓であ
るように、CFはプラスミド調停された遺伝子導入に快く従ってもよい。しかし、
遺伝子欠損が着実に識別される疾患の数が増加するように、将来、多数の追加の
ジーンが条件を話したと予測される、または、処理に非常に適している様に本発
明の遺伝子治療によって、疾患は識別される。（遺伝子治療方法の一般のレビュ
ーのための、例えばアンダーソンを見ること、サイエンス（1992の）256。35-36
; KremerてPerricaudet英国のMedical Bulletin 5つの1(1) 3つの（1995の）1-4
4; Haddadaその他に：211-217;三谷てCaskey（1993の）TIBTECH 11：162-166;マ
リガン（1993の）サイエンス926-932;ディロン（1993の）TIBTECH 11：167-175;
ミラー（1992の）ネイチャー357：455-460; Van Brundt（1988の）Biotechnolog
y 6(10)：1149-1154; Vigne（1995の）Restorative NeurologyおよびNeuroscien
ce 8に：808-813; NabelおよびよりFeignerな（1993の）TIBTECH 11に：Microbi
ologyおよびImmunologyのCurrent Topicsの（1995）;、そして、Yuその他.,Gene
Therapy（1994の）1：13-26。
【００４８】 類似した本発明の態様は、遺伝的に細胞療法において、使用される細胞を改質す
る発明の運搬実体または錯体の使用である。（細胞療法方法の基本の告知のため
に、1998年4月30日、例えばGage、F.H.、ネイチャー、第392巻を参照のこと。）
従って、本発明も細胞に関する穴が、そこにおいて、それを使用したような細胞
療法方法に関する、本発明の方法によって、遺伝子が組み替えられていた。
【００４９】 したがって、最後の見方において、本発明も処理の方法を含む。そこにおいて、
現在の運搬実体の有効量は、遺伝子治療によって、処理を必要とする被検者に与
えられる。 前記処理は予防的でもよくておよび／または治療でもよい、そして、それはいか
なる疾患もまたは条件に対する定方向であってもよい。この種の条件は、さまざ
まな遺伝子欠損を含むが、それに対して制限されない。むしろ、更なる条件は、
また、熟慮されることができる、そこにおいて、それは、遺伝の生育環境（例え
ばそばに所望の治療の機能をコード化しているジーンを含んでいるプラスミドの
基本入）の変化を達成するのを要求される。この種の処理シェーマに関する詳細
は、処理される条件のような因子、加齢および忍耐強いその他の重量に従い各々
の症例の主治医により決定される。 この種の方法ために、適切な製剤は、また、本発明の範囲内である。
【００５０】 図面の詳細な説明 図1は、発明の感覚PNA-NLS二重機能ペプチドに交雑しているアンチセンスのCy-5
つのオリゴヌクレオチドの標的部位を示している概略図である。PNA-NLS/オリゴ
ヌクレオチド複合体は、核フェリンタンパクに結合する。錯体は、それから細胞
核に輸送される。 同様に、PNA標的部位は、核輸送次のtp PNA-NLSハイブリダイゼーションを許し
ているEGFPプラスミドにクローンをつくられた。：AS（アンチセンス; 5）が検
出する略記号; SV40 NLS、Simianウィルス40の核移行は、シグナルを出す;、そ
して、PNA（ペプチド核酸）。 図2(a)は、オリゴヌクレオチドとラベルをつけられる蛍光の核転座を例示する。
矢印は、核を示すどこでCy-5オリゴ濃縮する。 図2(b)は、Cy-5つのAS-オリゴヌクレオチドの位置を示しているCy-5つのチャネ
ルを例示する。 図2(c)は、Cy-3つの5-オリゴヌクレオチドの位置を示しているCy-3つのチャネル
を例示する。 図3は、Cy-5/Cy-3つの蛍光の核で、細胞質でゴルジのような比を示す。 (a) アンチセンス・オリゴ（細胞核）;(b) アンチセンス・オリゴ（ゴルジのよ
うな）; (c) アンチセンス・オリゴ（細胞原形質）;(d) 感覚オリゴ、細胞核（e）は検出
するオリゴ（ゴルジのような）;そして、(f) 感覚オリゴ、細胞原形質。 図4は、発明のPNA-NLS二重機能ペプチドを有するアンチセンスおよび感覚オリゴ
ヌクレオチドの転位アッセイである。(a) PNAのための標的配列（AS）を有する
オリゴヌクレオチド;(b) (a)の、1:10のハイブリダイゼーションのより弱い転位
を示す遷延被曝については以外;(c) PNA.のための標的配列（S）のないオリゴヌ
クレオチド オリゴヌクレオチド濃縮は、全てのレーンの2.64pmolであった。PN
ANLSは、異なるモル比で5'.-ラベルをつけられたオリゴヌクレオチドに添加され
た。1:1レーン1（1:10; lane2）; lane3（10:1; lane4）100：1; lane5、l000：
1;、そして、lane6,0：1。 図5は、発明の運搬実体の効果を例示する： PNA-NLSの効果トランスフェクション混合物から過剰なPNA-NLS分子を除去するプ
ラスミドおよび効果が見せられるEGFPを含んでいるPNA標的に雑種を作られる。
(a) PNA-NLSなしでトランスフェクションするEGFPプラスミドを含んでいるPNA標
的部位;(b) EGFPプラスミドを含んでいるPNA標的部位は、1：100の比のPNA-NLS
に交雑した;(c) 1：100の比の、そして、過剰なPNA-NLSを有するPNA-NLSに交雑
するEGFPプラスミドを含んでいるPNA標的部位は、トランスフェクションの前に
移動した。 図6は、PNANLSの添加の有無にかかわらずlacZおよびEGFPトランスフェクション
を示す。EGFPトランスフェクションは、解放されたPNANLS（精製された）のまた
、周到な以下の収奪であった。
【００５１】 実験的 下で、本発明は例として更に開示される。例が単に本発明を例示していて、添付
の請求項に記載の本発明の範囲を制限することと、して解釈されることになって
いるだけではないと理解されることになっている。この出願の下記の全ての基準
およびどこか他の所は、ここにてこれによって、含まれる。
【００５２】 材料および方法： 細胞系および培地 COS-7、3T3およびヒーラー細胞が、トランスフェクションのために使われて、DM
EM、4500のmg/iグルコース、10mMのL-グルタミン、10%のウシ胎仔血清および50
グラム/ミリリットル・ゲンタミシンにおいて、培養された。
【００５３】 PNA-NLSペプチド核酸（PNA）は、Perspective Bio Synthesis社で合成された。P
NAの配列は、可能な非特異的バインディングを避ける周知の真核性のDNAの塩基
配列からと同様にプラスミドから締め出されるクライテリアによって、選ばれた
。PNAペプチドは、アミノ酸残基、PKKKRKV、SV4OコアNLSの範囲に、親水性スペ
ーサFmoc-NC603H1 1-OH（Fmoc-AEEA OH）によって、取り付けられた。完全な配
列は、GCGCTCGGCCCTTCC-リンカーPKKKRKVである。ペプチドのように、PNAはペプ
チド・アミド・リンカー（終末産物（http://www.pbio.com/cat/synth/pna/pnac
ycle.htm）の開裂に、PNAアミドを生んでいるリンカー）を有するポリエチレン
グリコール-ポリスチレン（PEG-PS）支持体に合成される。
【００５４】 オリゴヌクレオチドとラベルをつけられる蛍光色素 オリゴヌクレオチドとラベルをつけられる2つの蛍光色素は、Cybergene社、ラベ
ルをつけられるAS-Cy-5、PNA-NLS二重機能ペプチドに対するアンチセンスおよび
ラベルをつけられるS-Cy-3で合成された、PNA-NLS二重機能ペプチドに対する感
覚。オリゴヌクレオチドは、浄化されるHPLCであった。オリゴヌクレオチドに対
する結鎖のためのCy-3およびCy-5つの蛍光色素サブユニットは、Perkin-エルマ
ーから購入された。
【００５５】 低いイオン強度ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用している移動度転位デオ
キシリボ核酸-結合実験 アンチセンスおよび感覚-オリゴヌクレオチドは、y-32P-ATP（>5000 mCi/mmol）
を使用しているT4-γ３２ポリヌクレオチドキナーゼによって、端のラベルが付
いていた。ラベルをつけられたオリゴヌクレオチドは、PNA-NLSの量を変化させ
ることに関する室温で培養された。オリゴヌクレオチド/PNA-NLS複合体、15%、
低いイオン強度の分別のために、非変性ポリアクリルアミドゲルが、使われた。
（「低イオン強度ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用している移動度転位ア
ッセイ」、分子生物学のショート・プロトコール、フレデリックM. Ausbel.ロジ
ャー・ブレント、ロバートE.キングストン、デイビッドD.ムーア、J.G. Seidman
、ジョンA.スミス、ケビンStruhi、第2の編集、1992による）。
【００５６】 PNA-NLSを有するトランスフェクションおよびオリゴヌクレオチドと分類される
蛍光色素 トランスフェクションは、次のように25kDa PEIによって、作られた。PNA-NLS：
AS：Sは、1:1:1のモル比で混ぜられて、90℃に加熱された。混合物は、AS-オリ
ゴにPNA-NLSの最適のハイブリダイゼーションのための条件を得るために室温に
ゆっくり冷えることができた。混合物は、0,05μg/μlの濃縮に、水で薄められ
た。オリゴヌクレオチドおよびPNA-NLSの混合物にとって、0.1M25kDa PEI溶液の
1.44μｌは、2μgヌクレオチドにつき加えられた。トランスフェクション溶液は
、10分のための室温で複合体を形成することができて、その後10%のウシ血清お
よび100のμg/mlゲンタミシンを有する1mlのDMEMを混ぜ合わせられた。培地/ト
ランスフェクション錯体混合物は、それから細胞に添加された。トランスフェク
ションのために、１０５ＣＯＳ-7細胞は、細胞付着性を考慮に入れるためにトラ
ンスフェクションの前に8時間、6穴プレートの中間の2mlのペル穴において、塗
布された。オリゴヌクレオチド・トランスフェクションのためのインキュベーシ
ョン時間は、10時間であった。全てのインキュベーションは、5%のＣＯ２の37℃
で作られた。
【００５７】 PNA-NLS、EGFPおよびlacZ プラスミドを有するトランスフェクション プラスミドEGFP-N3、強化された緑の蛍光性タンパク、クローン技術は、PNA-NLS
ハイブリッドのための標的配列を含むために修正された。EGFP-N3プラスミドは
、AfilIにより消化されて、Afl II部位が側面に並んでいるPNA標的配列を含んで
いるオリゴヌクレオチド・フラグメントによって、結さつされた。フラグメント
は、EGFP遺伝子機能またはプラスミド機能のための必須であることは公知のいか
なる配列の外側でも、分類学的位置にクローンをつくられた。作成物の異なるク
ローンは、PNA標的部位の異なる数を含んで単離された。陽性細胞の数を直接記
録することによって、測られるように、EGFPおよびlacZジーンの形質発現はリポ
ータ・ジーンの官能性に関してプラスミドの状態について情報を与えた。トラン
スフェクションは、次のように25kDa PEIによって、作られた。PNA-NLS：プラス
ミド製法は、100：1のモル比で混ぜられて、90℃まで加熱された。混合物は、プ
ラスミド標的部位に発明のPNA-NLSの最適のハイブリダイゼーションを考慮に入
れるために室温にゆっくり冷やされた。混合物は、0.05のμg/μｌの濃縮に薄め
られた。混合物にとって、0.1M２５のkDa PEI溶液の1.44μ1は、プラスミドの加
算ペル2μgであった。 トランスフェクション溶液は、10分のための室温の複合
体を形成することができて、その後10%のウシ血清および100のμg/mlのゲンタミ
シンで補充される1mlのDMEMを混ぜ合わせられた。トランスフェクション混合物
は、それから的状赤血球に添加された。lacZプラスミドのための手順は、上記と
してあった。 トランスフェクションのために、１０５ COS-7つの細胞は、6穴プレートの中間
の2mlのペル穴において、塗布された。これは、細胞付着性を考慮に入れるため
にトランスフェクションの前に8時間をされた。インキュベーション時間は、最
高遺伝子形質発現を考慮に入れる48時間であった。 全てのインキュベーション
は、5%のＣＯ２の37℃で作られた。
【００５８】 LacZ染色 トランスフェクション細胞は、2%のパラホルムアルデヒド（1xPBSの0.2%のグル
タールアルデヒド）を据えられた。 染色溶液（A）は、5mMのフェリシアン化カ
リウム、5mMのフェロシアン化カリウムおよび2mMのにがりを含んだ。X-ガルは、
40mg/mlの濃縮で、DMSOに溶かされた。溶液Aは、1:1にX-gal/DMSO溶液を混ぜ合
わせられた比、予め37℃に暖めて、そして、固定細胞に添加される。細胞は、そ
れから37℃での夜にわたって培養されて、光学顕微鏡において、下線を引いた。
【００５９】 蛍光顕微鏡法および画像分析 蛍光顕微鏡法は、冷やされた肋骨CCD（被結合装置に充電する）を有するライカD
MRXA顕微鏡の生活細胞に実行されたカメラ。次の画像分析は、Intelligent Imag
ing Innovations LtdからソフトウェアSlidebook 2.1.4により実行された。増加
する核の取込みは、Cy-5（図2b）および、それぞれ、Cy-3つの（図2c）スペクト
ルからの蛍光の細胞核およびそれから度量衡単位をマスキングして、バックグラ
ウンド蛍光のために引き算することにより算出された。
【００６０】 結果： PNA-NLS交雑するオリゴヌクレオチドの核転座 実験、Cy-3およびCy-5の蛍光色素の第1のセットにおいて、ラベルをつけられた1
5merオリゴヌクレオチドは、1:1のモル比でPNA-NLSに交雑した。このテクニック
の原理は、図1において、図式的に概説される。PEIがトランスフェクションを調
停したあと、200-800%（図2,3）によるオリゴヌクレオチドPNA-NLS錯体とラベル
をつけられるCy-5つの蛍光色素の増加する核転座はオリゴヌクレオチドとラベル
をつけられるコントロールCy-3の蛍光色素と比べて、観察された。分析されると
きに、細胞は異なる細胞のコンパートメントの蛍光の異なるレベルを含んだ。蛍
光のレベルは、全ての陽性細胞の核の同様であった。細胞質の蛍光はローから変
化した。そして、非常に激しい。PNA-NLSがオリゴヌクレオチドの同族配列に結
合することを確かめるために、放射能のようにラベルをつけられたオリゴヌクレ
オチドは、PNA-NLSにより培養されて、低イオン力価（非変性ポリアクリルアミ
ドゲル）に分かれた。 図4で分かるように、転位がPNA-NLSおよび対応するオリ
ゴヌクレオチドのうちの10４:1の比が影響をしなかったのに対して１：10のモル
比を使用しているのに気がつかれたように、結合しているPNA-NLSが特性であっ
たことオリゴ標的部位を欠いている。
【００６１】 PNA-NLS交雑するプラスミドの核転座 PNA-NLS分子は、プラスミドを含んでいるPNA標的配列に交雑した。 LacZまたは
EGFPリポータ作成物が、使われた。遺伝子導入の効率は、lacZ活性のための染色
の後、細胞を表しているEGFPまたは青細胞の数の振動数として測定された。lacZ
またはEGFPプラスミドのPEI調停されたトランスフェクションは、添加によって
、3-8-ひだを強化された100：１の比のPNA-NLSペプチド（図5,6）。両方の含ま
れた11の連結的なPNAターゲットが据え付けるプラスミドは、周知の機能（リポ
ータ・ジーンのポリアデニル化シグナルの3'の位置を決めた）のない領域にクロ
ーンをつくった。 まず最初に、用量反応解析は、それを示して、実行された10
0：１の比のPNA-NLS：プラスミドが、最適であった（示されないデータ）。 2
つの連結的なPNA標的部位を含んでいるlacZプラスミドは、野生型効能（示され
ないデータ）と、異ならなくて、更に研究されなかった。 プラスミド-PNA NLS
錯体がEGFPプラスミド（図5,6）の容易さで示す自由なPNA-NLSから浄化されると
きに、トランスフェクション効能は強化された（コントロールと比較した8つの
ひだ）。これは、自由なPNA-NLSが核転座をこのように悪くしているプラスミド/
PNA-NLS錯体の核輸送を遮断したことを示す。コントロール・プラスミドとPNA-N
LSを混ぜ合わせるときに、効果はトランスフェクション効能に見られてはならな
い。プラスミド/PNANLS相互作用は、lacZかEGFPプラスミドを含んでいる複合体
のリポータ・ジーンの形質発現で示すように、マーカー遺伝子の正常な機能を乱
すようでない。さらに、100倍のより自由なNLSペプチド（比10 ４：１のNLS：プ
ラスミドのうちの1つ）の添加は、著しくPNA部位（図示せず）を含んでいるプラ
スミドのトランスフェクション効能を減らした。
【００６２】 討論 本発明は、オリゴヌクレオチドとラベルをつけられる蛍光性にまたはリポータ・
ジーンを含んでいるプラスミドに雑種を作られるときに、SV4O NLSペプチドに連
結されるPNA分子が核のターゲッティング・シグナルとして働くことができるこ
とを証明する。 同様結果はHeLa、NIH3T3またはCOS-7つの細胞のトランスフェクション試薬とし
て、DOTAPまたは25kD PEIを使用して得られた。そして、テクニック（示されな
いデータ）の可転性を示した。本発明による方法は、一般にトランスフェクショ
ンのためのポテンシャル値の中であって、また、遺伝子治療またはデオキシリボ
核酸-ワクチン接種のコンテキストにおいて、適用されることができる。アンチ
センス作成物または突然変異-誘導しているオリゴヌクレオチドの出産に関して
の穴として、的状赤血球への核酸の増加する取込みは、遺伝子形質発現のために
生活でもよい。アンチセンス活性のコンテキストにおいて、また、単独でPNA-NL
S作成物を適用することが可能でなければならない。 本発明によれば、PNA標的配列（CGCGAGCCGGGAAGG）が使われた。そして、それは
研究された変更されていないEGFPまたはlacZプラスミドの中に存在しない。その
標的配列を有するPNAの相互作用は非常に特異的でPNAである。そして、かけ合せ
は非関連した配列に交雑しない。デオキシリボ核酸およびPNA間もの強い相互作
用は、錯体が分離するのを防止する（クヌーセンH.、PNAsを形成している二重螺
旋および三重式のニールセンP.E.：アンチセンス性状）Nucleic Acids Research
24(3)494-500、（1996））
【００６３】 本発明が進行中であった一方、レポートはどのジギトニン浸透するヒーラー細胞
が化学的にNLSペプチドをプラスミドに連結して、細胞原形質にそれを注射した
後に核転座を研究するために用いるかについて載った。（Sebestyen M.G、ラッ
ドキーJ.J.、Bassik M,C.、チャンG.、Budker V.、Lukhtanov E.A.、Hagstrom J
.E.、ウルフJ.A.、ＤＮＡベクトル化学：プラスミドＤＮＡに対するシグナルペ
プチドのコバレント付着、ネイチャーBiotechnology 16(1)：80-5（1998）。Seb
estyenその他によって、得られる結果も、NLSを使用することはプラスミドを連
結したことを増加する核内移行に明らかにする。 しかし、このテクニックに固有の化学修飾のために、改質プラスミドのリポータ
・ジーンからの形質発現は、遮断された。対照的に、PNANLSペプチド形質発現を
使用することは、維持された。このために、おそらく非生活の領域のPNA標的部
位の位置は、決定的かもしれない。プラスミドのために、2つのPNA標的部位がト
ランスフェクション効能に対する影響を有しない点に注意されたのに、11の部位
は著しく効能を増やした。 本発明の発明者がそうした場合であっても、プラスミドの同じ領域に全ての標的
部位を局所化することは重要であるかどうか、勉強しない、または、彼らが結局
広げられることができたかどうか、両方の選択肢は添付の請求項に記載の回復の
範囲内である。 さらにSebestyenその他（1998）のデータから推論する本発明によれば強化され
た取込みが11のPNA-NLS標的部位を停泊させている連結的な250bp範囲を使用して
いるのを見られたのに対して、これらの著者が効果がプラスミドにつき_l 15のN
LS配列を使用しているのを見なかったように、高い局所のNLS濃縮が必須である
ことを提案する。 しかし、PNA-NLS配列が各々の標的部位に結合するか否か、は現在完全に明白で
ない、そして、したがって、これは本発明による方法を使用するこの場に熟練し
たものにより試験されなければならない。SV4OコアNLSは実際的理由の中で選ば
れた。−その理由は、次のことにある。それは最も周到なNLS配列のうちの1つで
ある。SV40は、970kDaが細胞核にトランスロケーションの中で報告されたより、
大きいタンパクを連結した。 （ヨネダY.、船場T.、カネダY.、Noble R.L.、マツオカY.、栗原T.、オカダY.、
Imainoto N.：「SV40 Ｔ抗原の核移行シグナルおよびその隣接配列を含んでいる
長い合成ペプチドは、能率的に細胞核に免疫グロブリンMの運搬を導く」、Exper
imental Cell Research 201(2)：3つの13-20、1992）。これは、2800kDaのEGFP
プラスミドを含んでいるPNA標的配列の分子量と比較されなければならない。さ
らに、Zantaその他（Zanta M.A.、Belguise-Valladier P.、Behr J.、ジーン出
産：「単一の核移行シグナルペプチドは、デオキシリボ核酸を核へ運ぶのに十分
である」（アメリカ合衆国の国立科学院のProceedings）1999 96：91-96）、現
在の特許出願の最も初期の優先日以後、精製されたリポータ遺伝子フラグメント
に対するNLSDNAハイブリッドのライゲーションが使用された(8)である面白いペ
ーパーは、明らかにした。著者は、明らかにNLSアプローチの実施可能性を示す
。しかし、Zantaによって、使用する方法その他（以前に）は現在の方法より扱
いにくい。−その理由は、次のことにある。それはオリゴヌクレオチドをリポー
タ遺伝子フラグメントへ運んでいるNLSのプラスミドおよび次のライゲーション
の限定酵素開裂を含む。
【００６４】 現在の方法および運搬実体（例えばPNA-NLS系）は、回復作成物が突然変異回復
のための細胞核に往復される系において、と同様に一過性トランスフェクション
を含んでいるアッセイおよび治療において、効率的である。原子核蛍光のプラト
ーにオリゴヌクレオチドとラベルをつけられる蛍光色素を使用して達したように
、SV4０コアNLSに基づく核転座のための系は飽和するようだった。これはオリゴ
ヌクレオチド蒸留器の異なる細胞質のレベルが目標とされたオリゴヌクレオチド
の同様核準位を引き起こしたという事実により示される。その一方で、非目標と
されたオリゴヌクレオチドは比較的広い変異（図3b）を示す。Cy-5のラベルをつ
けられたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの核転
座の中で下線を引くことは、Cy-5つの蛍光団の赤外線の発光を原因として生じる
ので、客観性を考慮に入れた。 SV4O NLSのバインディング・パートナーは、その後錯体をカリョフェリン-αに
より形成するカリョフェリン-βである。（ミヤモトY.、Imanioto N.、Sekimoto
T.、タチバナT.、関T.、タダS.、エノモトT.、ヨネダY.、NLSリセプタ、Biolog
ical Chemistryジャーナル、272(42)の3つのはっきりした綱：26375-8l（1997）
による核移行信号の（NLS）認識のDifferentialモード）。NLSの総量は、重要で
、現在の方法を利用しているこの場にこの輸送機構が飽和できるように、熟練し
たものにより決定される（モスト核タンパク質が輸入されるMichaud N.（Goldfa
rb D.S.）単一の経路、Experimental Cell Research、208(1)：128-36（1993）
。核内移行系の飽和は、また、自由なNLSの添加が核輸送を悪くする本発明の所
見のためのありそうな説明である。更にオリゴヌクレオチドの核内移行を強化す
るために、異なるNLS経路を目標としている一組のNLS配列を含んでいるPNA-NLS
ペプチドの混合液は、使用されてもよい（以前に、Michaudその他）。これは、1
つの経路の飽和がトランスフェクションする生体分子の核転座を制限しないこと
を確実にする。このために、以下により例証されるように、少なくとも3つの異
なるNLSリセプタ科は報告された：Qipl、Rch 1およびNPI-1（以前に、ミヤモト
ほか）。本発明によれば、レンチウイルス原子核侵入機構を模倣する方法がPNA-
NLSペプチドを経た核酸作成物に、HIV-1 Matrix連合（MA）タンパクを結合する
ことになっていることを示唆される。錯体は、それからVprを結合して、その後
処理されるかもしれないプレ組込み錯体。（Bukrinsky M.I.Haffar O.K.、HIV-1
核内移行：Matrixタンパクは、中央段階、Vpr. Molecular Medicineとこの時間
、4(3)上の背である：13 8-43（1998の）。MA-Vpr錯体の機能は、Xiaoその他（1
997）により記載されている拡張SV4O NLS配列に対する類似したであることを提
案される。（Xiao C.Y.、Hubner S.、Jans D.A.、SV4Oラージしゅよう抗原核内
移行が、核移行配列、Biological Chemistryジャーナル、272(35)の側面に位置
している二本鎖ＤＮＡに依存するプロテインキナーゼ部位（セリン120）：22191
-8（1997）により管理される）。従来技術において、核酸出産のさまざまな見方
を強化しているタンパクは、研究された。 （Boussif 0.、Lezoualch F.、Zanta M.A.、Mergny M.D.、Scherman D.、Demene
ix B.、Behr J.P.、培養の細胞への生体内でおよびジーンおよびオリゴヌクレオ
チド移植：ポリエチレンイミンのためのA鋭敏な因子、アメリカ合衆国92(16)：7
297-301（1995）の国立科学院のProceedings）。 本発明によれば、NLSにより媒介される移植に加えて、この種の機能がPNAアプロ
ーチを使用している核酸に、直接目標とされてもよいことを示唆される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Cy-5つのオリゴヌクレオチドが発明の感覚PNA-NLS二重機能ペプチドに交雑した
ことをアンチセンスの標的部位に明らかにしている概略図である。
【図２】 オリゴヌクレオチドとラベルをつけられる蛍光の核転座を例示する。
【図３】 Cy-5/Cy-3つの蛍光の核で、細胞質でゴルジのような比を示す。
【図４】 発明のPNA-NLS二重機能ペプチドを有するアンチセンスおよび感覚オリゴヌクレ
オチドの転位アッセイである。
【図５】 発明の運搬実体の効果を例示する：PNA-NLSの効果トランスフェクション混合物
から過剰なPNA-NLS分子を除去するプラスミドおよび効果が見せられるEGFPを含
んでいるPNA標的に雑種を作られる。
【図６】 PNANLSの添加の有無にかかわらず、そして、過剰PNA-NLSの純化の後、lacZおよ
びEGFPトランスフェクションを示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１１月２２日（２０００．１１．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ｗ (72)発明者 スミス、シー．，アイ．，エドワード スウェーデン国、エス−129 38 エーゲ ルスタン、ナウマンスベ−ゲン 23 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA32 BA35 CA04 DA02 EA04 FA10 FA18 FA20 GA11 HA01 HA17 4B065 AA90X AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 4C085 AA02 DD62

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 特異的な位置に生体膜および／またはそれの方針全体の利子
    の核酸を転送する方法の範囲内で、または、細胞に関して、合成的を用いて、実
    体を輸送する; 以下の段を含む： (a) 利子およびバインディング元素（Be）の核酸から成るキャリア分子に標的配
    列を提供すること; (b) バインディング元素（Be）に結合少なくとも一つの機能上の元素（Fe）によ
    って、錯体を提供すること; (c) 前記キャリアのBe標的に前記錯体のBeを交雑させること; そして、 (d) 前記メンブレン全体の利子の核酸の移植を提供する前記生体膜を有する接触
    前記運搬実体。
  2. 【請求項２】 BEは、ペプチド核酸（PNA）または導関数である、または、それ
    のアナログである請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】前記段（b）において、錯体は提供され、 そこにおいて、 前記BEおよびFEsは、リンカー元素によって、切り離される請求項１又は２記載
    の方法。
  4. 【請求項４】 前記段(a)において、提供されるキャリアは、利子および少なく
    とも一つのBE標的配列の前記核酸から成っているプラスミドまたはオリゴヌクレ
    オチド媒介者である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】前記段(a)において、検出可能なマーカー元素は、また、前記キ
    ャリアに嵌入される請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】利子の核酸は、ペプチド、タンパクまたはリボゾームリボ核酸を
    コード化しているジーンである請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】生体膜は、細胞壁である請求項１から６のいずれかに記載の方法
    。
  8. 【請求項８】前記段（b）において、触角ペディアペプチドから成るFEは前記
    錯体において、提供される。そして、それは細胞壁全体の利子の核酸の前記移植
    を可能にする請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】生体膜は、核膜である請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記段（b）において、核移行シグナルから成るFEは前記錯体
    において、提供される。そして、それは核膜全体の利子の核酸の前記移植を可能
    にする請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記段（b）において、タンパク（例えばHIVタンパク）から成
    るFE（例えばTAT）は前記錯体において、提供される。そして、それは利子の核
    酸のメンブレン・トランスロケーションおよび核輸送を可能にする請求項１から
    ６のいずれかに記載の方法。
  12. 【請求項１２】能力がある運搬実体を作るための成分から成るキットの特異的な
    位置に生体膜および／またはそれの方針全体の利子の核酸を転送するためのの範
    囲内で細胞上の、または。そして、それは、キット以下を含む： バインディング元素（BE）; 機能上の元素（FE）; 利子の前記核酸を含んでいる所望のプラスミドのクローン化に適している前記BE
    のための標的から成るオリゴヌクレオチド; そして、任意にこの種の移植および／または方針に適している試薬。
  13. 【請求項１３】バインディング元素はPNAである。そして、標的はPNA標的配列で
    ある請求項１２記載のキット。
  14. 【請求項１４】機能上の元素（FE）は、触角ペディアペプチドである請求項１２
    または１３記載のキット。
  15. 【請求項１５】機能上の元素（FE）は、核の局在化シグナル（NLS）（例えばSV4
    O大きいＴ抗原タンパクまたはシグナル性状を局所化している原子核を呈してそ
    れのフラグメント）である請求項１２または１３記載のキット。
  16. 【請求項１６】機能上の元素（FE）は、メンブレン・トランスロケーションおよ
    び核輸送を可能にしているタンパクである請求項１２または１３記載のキット。
    。
  17. 【請求項１７】請求項1から1 1（それは、穏やかな（FE）少なくとも一つの機能
    的から成る。そして、それはバインディング元素（BE）および核酸キャリアに複
    雑になる）のいかなる一つにもよる方法ために、適切な合成の運搬実体、それは
    媒介者の利子の少なくとも一つのBE標的配列および核酸から成る;BE-BE標的相互
    作用を使用している前記キャリアに交雑している前記錯体。
  18. 【請求項１８】BEは、ペプチド核酸（PNA）または導関数である、または、それ
    のアナログである請求項１７記載の運搬実体。
  19. 【請求項１９】前記媒介者は、プラスミドまたはオリゴヌクレオチドである請求
    項１７または１８記載の運搬実体。
  20. 【請求項２０】キャリアは、検出可能なマーカー元素を含む請求項１７から１９
    のいずれかに記載の運搬実体。
  21. 【請求項２１】利子の核酸は、ペプチド、タンパクまたはリボゾームリボ核酸を
    コード化しているジーンである請求項１７から２０のいずれかに記載の運搬実体
    。
  22. 【請求項２２】前記BEおよびFEsは、リンカー元素によって、切り離される請求
    項１７から２１のいずれかに記載の運搬実体。
  23. 【請求項２３】請求項17から22（それは、複数のFE-BE錯体から成る）のいかな
    る一つにも一致して、各々、いずれが分離したBE標的配列に交雑するか1つが、
    同じキャリアに現れる前記運搬実体。
  24. 【請求項２４】各々のFE-BE錯体は2つ以上のFEsから成る。そして、リンカーに
    よって、好ましくは間隔を置かれる請求項２３記載の運搬実体。
  25. 【請求項２５】 FEは、触角ペディアペプチドである請求項１７から２４のいず
    れかに記載の運搬実体。
  26. 【請求項２６】FEは、核移行シグナル（NLS）（例えばSV4O大きいＴ抗原タンパ
    クまたはシグナル性状を局所化している原子核を呈してそれのフラグメント）で
    ある請求項１７から２４のいずれかに記載の運搬実体。
  27. 【請求項２７】FEはタンパクである。そして、HIVタンパク（例えばTAT）が例え
    ばメンブレン・トランスロケーションおよび核輸送を可能にしている性状を呈す
    る請求項１７から２４のいずれかに記載の運搬実体。
  28. 【請求項２８】請求項1から11のいずれかに記載の方法または請求項17から27の
    いずれかにおいて、定義した運搬実体を用いて提供される一つ以上の遺伝の一時
    変異から成る組換え型細胞。
  29. 【請求項２９】請求項17から27のいずれかの運搬実体または遺伝子治療の請求項
    28記載の細胞の使用。
  30. 【請求項３０】請求項17から27のいずれかに記載の運搬実体またはデオキシリボ
    核酸-ワクチン接種の請求項29に記載細胞の使用。
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