JP2002524052A - 環境ストレスに対する耐性に関与する遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物の環境ストレス抵抗性に関与するコーディング配列及び／又は遺伝子を含むポリ核酸を得る方法であって、コーディング配列を含むｃＤＮＡライブラリーを長角果から調製し、該コーディング配列を酵母細胞に機能的な形式で導入し、環境ストレス条件に対する耐性又は抵抗性の増強へと導く、該形質転換された酵母細胞内のポリ核酸についてスクリーニングすることを含む、ポリ核酸を得るための方法に関する。更に、そのような方法によって得られる、表１に列挙されたとおりの単離ポリ核酸はもとより、それを含む組換えポリ核酸にも関する。更に、本発明のポリ核酸がコードしている単離ポリペプチドにも関する。また、環境ストレスに対する増強された耐性又は抵抗性を有する植物を生産する方法であって、植物細胞で発現されたときに、該植物の環境ストレス条件に対する耐性若しくは抵抗性を増強する、定義されたとおりのポリ核酸を含む組換えＤＮＡを、植物に導入することを含む方法にも関する。本発明は、上記に定義されたとおりの組換えポリ核酸で形質転換した、植物細胞、植物体、若しくはその収穫できる部分、又は増殖材料に特に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、分子生物学、特に植物分子生物学に関する。特に、本発明は、有用
植物の農作物生産性の向上に関する。農作物生産性の主な制約の一つは、植物の
成長及び発育に対する環境ストレス条件の効果である。分子生物学の重要な目標
は、そのようなストレスに対する耐性又は抵抗性を与えることができる遺伝子の
特定及び単離である。農業に関しては、そのような遺伝子を有するトランスジェ
ニック植物の創出は、植物のストレス耐性又は抵抗性を改良する可能性を与える
。

【０００２】 乾燥、塩負荷及び凍結は、植物の成長、及び農作物の生産性に不都合な効果を
生じるストレスである。これらのストレスに対する生理学的応答は、細胞の遺伝
子発現における変化から発生する。多数の遺伝子の発現が、これらの応答によっ
て誘導されることが立証されている〔Zhu et al., 1997；Shinozaki et al., 19
96；Thomashow, 1994〕。これらの遺伝子の産物は、二つの群：すなわち、環境
ストレスから直接防護するものと、ストレス応答の際に遺伝子発現及びシグナル
変換を調節するものとに分類することができる。第一の群は、脱水から細胞を防
護することによって機能すると思われるタンパク質、例えば様々な浸透圧防護剤
の生合成に必要な酵素、後期胚発生冗多（ＬＥＡ）タンパク質、凍結防止タンパ
ク質、シャペロン、及び解毒酵素を包含する〔Shinozaki et al., 1997；Ingram
et al., 1996；Bray et al., 1997〕。遺伝子産物の第二の群は、転写因子、タ
ンパク質キナーゼ、及びホスホイノシチド代謝に関与する酵素を包含する〔Shin
ozaki et al., 1997〕。植物のストレス耐性を向上させることが知られている
方法の概観は、Holmberg & Buelow（1998）にも示されている。

【０００３】 環境ストレス条件に対する植物の応答に関与する機序を洞察するには、更に研
究が必要なことは明確である。

【０００４】 極端な脱水に自然に適応した植物の研究は、環境ストレス条件に対する耐性に
関する遺伝的情報は、すべての高等植物に存在するという仮説へと導いている。
非塩性植物では、この情報は、脱水過程を経験する、種子及び花粉粒でのみ発現
されるにすぎないと思われる。

【０００５】 植物における浸透圧耐性の誘導は、農作物生産性には非常に重要であって；潅
漑下にある国土の３０〜５０％が、現在、塩分に影響されている。何系統かの証
拠も、成長季全体を通して穏やかな環境ストレス条件でさえ、植物成長及び農作
物生産性に対して否定的な影響力を有することを立証している。例えば、水利用
可能性における僅かな制約でさえ、光合成率の低下を生じることが公知である。
予期し得ない降雨、成長季の開始及び終末での土壌塩分の増加は、しばしば、植
物成長及び農作物生産性の低下を招く。これらの環境的因子は、ストレスの少な
くとも一つの要素を共有し、それが、渇水、又は脱水である。乾燥は、今日の農
業における重大な問題である。例えば、過去４０年にわたり、乾燥は、米国のト
ウモロコシの農作物損失全体の７４％を占めた。不都合な環境条件下で生産性を
維持するには、例えば、これらの不都合な条件下で成長し、収穫するよう、農作
物に水の保持及び耐性の機序を交配して組み込むことによって、渇水に対抗する
ための遺伝的基盤を農作物に与えることが重要である。

【０００６】 環境ストレスに対する耐性又は抵抗性に関与する植物遺伝子についてスクリー
ニングするための、新規な方法を提供することが本発明の一つの目的である。

【０００７】 新規な植物遺伝子、より詳しくは、環境ストレス条件に対する耐性を向上させ
る潜在的能力を植物に与える、植物遺伝子を提供することも本発明の目的である
。

【０００８】 該新規植物遺伝子によってコードされるポリペプチドを提供することも本発明
の目的である。

【０００９】 環境ストレス条件に対する増強された耐性又は抵抗性を有する、該新規遺伝子
に基づく植物を生産することは、本発明の更に一つの目的である。

【００１０】 該新規遺伝子を含む組換えポリ核酸を提供することも本発明の目的である。

【００１１】 該新規遺伝子で形質転換された植物細胞及び植物を提供することは、本発明の
更に一つの目的である。

【００１２】 環境ストレス条件に対する増強された耐性又は抵抗性を有する、植物及び植物
細胞を提供することは、本発明の更に一つの目的である。

【００１３】 本発明は、より詳しくは、植物の環境ストレスに関与するコーディング配列及
び／又は遺伝子を含むポリ核酸を得る方法であって、コーディング配列を含むｃ
ＤＮＡライブラリーを長角果から調製し、該コーディング配列を酵母細胞に機能
的な形式で導入し、環境ストレス条件に対する耐性又は抵抗性の増強へと導く、
該形質転換された酵母細胞内のポリ核酸についてスクリーニングすることを含む
方法に関する。

【００１４】 一定の特性について検定するのがしばしば困難である植物からの遺伝子を、下
等真核生物、例えば酵母及び真菌、詳しくは酵母、特にサッカロミセス属に移転
することは、達成するのが比較的容易であることが見出されていて、そのため、
得られた酵母の、環境条件に対する耐性又は抵抗性についての試験の結果は、挿
入されたコーディング配列又は遺伝子が植物の環境ストレスに対する耐性又は抵
抗性を誘導できる能力の、比較的信頼できる尺度を与えることが示されている。
したがって、環境ストレス条件に対する耐性又は抵抗性の原因となる、遺伝子又
はコーディング配列を含むポリ核酸配列の発現は、それが由来する植物種、又は
他のいかなる植物種でも増強することができる。

【００１５】 本文脈中、用語「増強する」は、形質転換された植物細胞、植物組織又は植物
部分でのストレス防護と相関する分子のレベルが、非形質転換植物でのレベルよ
り高くなるという意味で、「実質的に高められる」か、若しくは「上昇させされ
る」ことを意味すると解されなければならない。

【００１６】 これは、既に存在する適切な遺伝情報の過剰発現を誘導することによってか、
又は環境ストレスに耐容若しくは抵抗できる能力を招く、異種の情報を植物細胞
に導入するその他の適切ないかなる手段によっても達成してよい。

【００１７】 用語「環境ストレス」は、先行技術において異なる方法で定義されており、用
語「浸透圧ストレス」と大幅に重複する。例えば、Holmbergら（1998）は、非生
物的ストレスを招く異なる環境ストレス因子を定義している。本発明に用いられ
る限りでの用語「環境ストレス」は、細胞、組織、種子、器官又は全植物体の代
謝、成長若しくは生存度に対する、非生物的若しくは非生物学的環境ストレッサ
ーが生成する、不都合ないかなる効果も意味する。より詳しくは、それは、水ス
トレス（冠水、乾燥、脱水）、嫌気性（低レベルの酸素、ＣＯ₂等々）、好気性
ストレス、浸透ストレス、塩ストレス、温度ストレス（高温／高熱、寒冷、凍結
、降霜）又は栄養素／汚染物ストレスのような環境因子も包含する。

【００１８】 用語「嫌気性ストレス」は、上記に定義されたような、低酸素及び無酸素を包
含するストレスを生成するのに充分な、酸素レベルのいかなる低下も意味する。

【００１９】 用語「冠水ストレス」は、モンスーン、雨季、鉄砲水、又は植物の過剰潅漑等
々のような、植物、植物部分、組織又は単離細胞の液体媒体への持続性若しくは
一過性の浸漬に付随するか、若しくは誘導される、いかなるストレスも意味する
。

【００２０】 「寒冷ストレス」及び「熱ストレス」は、特定の植物種のための最適範囲の成
長温度を、それぞれ、下回るか、又は上回る温度によって誘導されるストレスで
ある。そのような最適成長温度範囲は、当業者には容易に決定されるか、又は公
知である。

【００２１】 「脱水ストレス」は、細胞、組織、器官又は全植物体の水の喪失、膨圧の低下
、若しくは含水量の低下に付随するか、若しくは誘導される、いかなるストレス
も意味する。

【００２２】 「乾燥ストレス」は、細胞、組織、器官又は生物の水の枯渇、若しくは給水の
低下に誘導されるか、若しくは付随するいかなるストレスも意味する。

【００２３】 「酸化ストレス」は、反応性酸素種の細胞内レベルを上昇させる、いかなるス
トレスも意味する。

【００２４】 用語「塩分誘導ストレス」、「塩ストレス」又は類似の用語は、上昇した濃度
の塩に付随するか、又は誘導され、細胞の細胞内若しくは細胞外環境の浸透能力
の変動を招く、いかなるストレスも意味する。

【００２５】 該塩は、例えば、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、塩化
ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム等々のような水
溶性無機塩、農用肥料の塩、及びアルカリ性又は酸性の条件に付随する塩である
ことができる。

【００２６】 本発明の方法に従って、該植物に導入されたポリ核酸及び／又は調節配列の存
在の際に得られるトランスジェニック植物は、対応する野生型植物がそれに対し
て感受性であった、環境ストレスに対する抵抗性、耐性、又は向上した耐性若し
くは抵抗性を獲得する。

【００２７】 用語「耐性」及び「抵抗性」は、上記に定義された環境ストレス条件が生起す
る、細胞性代謝の変化、細胞増殖の低下、及び／又は細胞死の遅延から完全な阻
害までの範囲の防護を網羅する。好ましくは、本発明の方法に従って得られたト
ランスジェニック植物は、該植物が、対応する野生型植物が成長、代謝、生存度
、生産性、及び／又は雌雄の稔性の低下を示す環境条件下で、実質的に正常に成
長することができるという意味で、環境ストレス条件に対して耐性若しくは抵抗
性である。植物の成長、又はストレスに対する応答を決定する方法論は、高さの
測定、葉の面積、植物−水関係、開花能力、子孫及び収穫物の生成能力、その他
当業者に公知のいかなる方法論も包含するが、これらに限定されない。

【００２８】 用語「耐性」及び「抵抗性」は、本発明では相互可換的に用い得る。

【００２９】 以下に説明するとおりの本発明による方法は、いかなる高等植物、好ましくは
重要な農作物にも、好ましくは植物のすべての細胞にも適用することができて、
高められた浸透圧その他いかなる形態の環境ストレス耐性にも導く。下記に説明
されるとおりの実施態様によって、ここに、環境ストレス条件下で改良された収
率、成長、発育及び生産性を有する農作物を栽培することができるようになり、
例えば、本発明に従って誘導された浸透圧耐性なしでは栽培できない地域で、農
作物を栽培することさえ可能になり得る。

【００３０】 適切な植物遺伝子及び／又はコーディング配列について完全なスクリーニング
を実施するには、本発明による方法を適用し、それによって該ｃＤＮＡライブラ
リーが該植物細胞の本質的にすべてのｍＲＮＡのコピーを含むのが好ましい。お
そらく、コーディング配列のみでも充分である。環境ストレスに関与する遺伝子
のスクリーニングには、長角果（成熟中の種子を含む果実）、例えば、アラビド
プシス属からのｃＤＮＡライブラリーを用いるのが好ましく、それは、これらの
器官では、例えば浸透圧耐性に関与する遺伝子が優先的に発現されるからである
。

【００３１】 遺伝情報は、環境ストレス条件に対する耐性又は抵抗性について試験するのに
充分長い機能形式である限り、適切ないかなる方法によるスクリーニングのため
にも酵母に導入し得るが、操作を容易にするためには、２μプラスミドのような
周知のベクターを用いるのが好ましい。コーディング配列又は遺伝子を強力な構
成酵母プロモーターの制御下において、問題の遺伝子又はコーディング配列の充
分な発現を増強するのが好ましいと思われる。強力な構成酵母プロモーターは、
当技術に周知であり、酵母ＴＰＩプロモーターを包含するが、これらに限定され
ない。

【００３２】 本明細書に用いられる限りでの用語「遺伝子」は、プロモーター及び５′非翻
訳領域（５′ＵＴＲ）、コーディング領域（タンパク質をコードしていても、い
なくてもよい）、並びにポリアデニル化部位を含む非翻訳３′領域（３′ＵＴＲ
）のような、機能的に結合されたいくつかのＤＮＡフラグメントを含む、いかな
るＤＮＡ配列も意味する。植物細胞で代表的には、５′ＵＴＲ、コーディング領
域及び３′ＵＴＲ（まとめて転写ＤＮＡ領域と呼ばれる）がＲＮＡに転写され、
それが、タンパク質をコードしている遺伝子の場合、タンパク質に翻訳される。
遺伝子は、例えばイントロンのような、追加のＤＮＡフラグメントを含んでもよ
い。本明細書に用いられる限りで、遺伝子座とは、植物のゲノム内での与えられ
た遺伝子の位置である。

【００３３】 本発明は、より詳しくは、コーディング配列を含む上記に説明されたｃＤＮＡ
を長角果から調製し、該コーディング配列を酵母細胞に機能的な形式で導入し、
環境ストレス条件に対する耐性又は抵抗性の増強へと導く、該形質転換された酵
母細胞内のポリ核酸についてスクリーニングすることを含む方法によって得られ
る、単離されたポリ核酸に関する。

【００３４】 用語「ポリ核酸」は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はその増幅されたバージョン
、或いはその相補体を意味する。

【００３５】 本発明は、より詳しくは、表１に列挙されたポリペプチドをコードしている、
上記に定義されたとおりの方法によって得られる、単離ポリ核酸を提供する。

【００３６】 環境ストレス条件に対する耐性又は抵抗性を与える単離ポリ核酸の性能は、例
えば、Grilloら（1996）、Peassarakliら（編者）、Nilsenら（1996）、Shinoza
kiら（1999）、Jonesら（1989）、Fowdenら（1993）、又は付記された実施例に
記載のものを参照されたい、当技術に周知の方法に従って試験することができる
。

【００３７】 本発明は、より詳しくは、 （ａ）配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３
、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７
、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６９、７１、７３
、７５若しくは１２１のいずれか、又はその相補鎖； （ｂ）（ａ）に定義された配列又はそのフラグメントとハイブリダイズする、
ポリ核酸配列； （ｃ）遺伝暗号の結果として（ａ）又は（ｂ）に定義されたポリ核酸配列に縮
重されるポリ核酸配列；或いは （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか一項のポリ核酸にコードされるタンパク質の
フラグメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される、表１に列挙されたとおりのポリペプチドのいずれかの相同体を
コードしている、単離ポリ核酸に関する。

【００３８】 好ましくは、該（ｂ）項による配列は、厳しい条件下で（ａ）項の配列とハイ
ブリダイズする。

【００３９】 上記に定義されたとおりの該フラグメントは、好ましくは、該配列のユニーク
フラグメントである。

【００４０】 用語「ハイブリダイズすること」は、好ましくは特異的又は厳しいハイブリダ
イゼーション条件が目的とされる、Sambrook（1989）に記載されたとおりのハイ
ブリダイズ条件を意味する。

【００４１】 厳しい条件は、配列依存性であり、異なる状況で異なると思われる。一般的に
は、厳しい条件は、規定されたイオン強度及びｐＨで、特定の配列に対する熱的
融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるよう選ばれる。Ｔｍは、完全に適合するプロー
ブと、標的配列の５０％が（規定されたイオン強度及びｐＨ下で）ハイブリダイ
ズする温度である。代表的には、厳しい条件は、塩濃度がｐＨ７で約０．０２M
であり、温度が約６０℃以上である条件である。

【００４２】 本発明では、本発明のポリ核酸を含むゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡは、示された
ｃＤＮＡ配列を用いた厳しい条件下での、標準的なサザンブロット中に特定する
ことができる。ゲノム及びｃＤＮＡライブラリー双方の調製は、当技術の範囲内
にある。ハイブリダイゼーション条件の例は、実施例の項にも示される。

【００４３】 本発明は、表１に示したポリペプチドの相同体であるポリペプチドをコードし
ている、環境ストレス条件に対して耐性又は抵抗性である植物の生産に役立つ単
離ポリ核酸にも関する。

【００４４】 本発明は、配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、
２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、
４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、
７１、７３、７５、７７若しくは１２１のいずれかの少なくとも一部、又は配列
番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７
、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１
、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５
、７７若しくは１２１のいずれかと５０％以上同一であり、優先的には５５％、
６０％、６５％若しくは７０％以上同一であり、より好ましくは７５％、８０％
若しくは８５％以上同一であり、最も好ましくは９０％若しくは９５％以上同一
である遺伝子の少なくとも一部を含むポリ核酸にも関する。好ましくは、該遺伝
子は、配列番号２、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４
、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８
、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２
、７４、７６又は７８の配列を有するタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を
有するタンパク質をコードしている。該遺伝子の該一部は、好ましくは、ユニー
ク部分である。

【００４５】 本発明は、好ましくは、配列番号１、３、５、９、１１、１３、１５、１７、
１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、
４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、
６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、
９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１
１１、１１３、１１５、１１７、１１９若しくは１２１のいずれかの少なくとも
一部、又は配列番号１、３、５、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２
３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４
７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７
１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９
５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、
１１５、１１７、１１９若しくは１２１のいずれかと５０％以上同一であり、優
先的には５５％、６０％、６５％若しくは７０％以上同一であり、より好ましく
は７５％、８０％若しくは８５％以上同一であり、最も好ましくは９０％若しく
は９５％以上同一である遺伝子の少なくとも一部を含むポリ核酸の、環境ストレ
ス条件に対する増強された耐性又は抵抗性を有するトランスジェニック植物を生
産するための用途に関する。

【００４６】 好ましくは、該遺伝子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６
、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０
、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４
、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８
、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、
１１０、１１２、１１４、１１６、１１８又は１２０の配列を有するタンパク質
と実質的に同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードしている。該遺伝子の
該一部は、好ましくは、ユニーク部分である。

【００４７】 本発明は、特に、酵母ＤＢＦ２キナーゼの植物相同体、より詳しくは、シロイ
ヌナズナArabidopsis thalianaからの、Ａｔ−ＤＢＦ２と呼ばれるＤＢＦ２キナ
ーゼ相同体をコードしている、少なくとも、植物及び酵母に対する増強された環
境ストレス耐性又は抵抗性を与えるために用いることができる、上記に定義され
たとおりの単離ポリ核酸に関する。

【００４８】 より詳しくは、本発明は、 （ａ）配列番号１、若しくはその相補鎖； （ｂ）（ａ）に定義された配列、若しくはそのフラグメントとハイブリダイズ
する、ポリ核酸配列； （ｅ）遺伝暗号の結果として（ａ）若しくは（ｂ）に定義されたポリ核酸配列
に縮重されるポリ核酸配列；又は （ｃ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか一項のポリ核酸にコードされるタンパク質の
フラグメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される、植物ＤＦＢ２キナーゼをコードしている単離ポリ核酸に関する
。

【００４９】 好ましくは、（ｂ）による該配列は、厳しい条件下で（ａ）の配列とハイブリ
ダイズする。

【００５０】 これに代えて、本発明は、配列番号１の少なくとも一部、又は配列番号１と５
０％以上同一であり、優先的には５５％、６０％、６５％若しくは７０％以上同
一であり、より好ましくは７５％、８０％若しくは８５％以上同一であり、最も
好ましくは９０％若しくは９５％以上同一である配列を有する遺伝子の少なくと
も一部を含む、植物に由来するポリ核酸に関する。好ましくは、該遺伝子は、配
列番号２の配列を有するタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するタンパ
ク質をコードしている。

【００５１】 本発明は、トランスジェニック植物、より詳しくはシロイヌナズナからの相同
体を生産するための、少なくとも植物及び酵母に増強された環境ストレス耐性又
は抵抗性を与えることができる、植物ＨＳＰ １７．６Ａタンパク質をコードし
ている、上記に定義されたとおりの単離ポリ核酸の用途にも関する。

【００５２】 より好ましくは、本発明は、 （ａ）配列番号３、若しくはその相補鎖； （ｂ）（ａ）に定義された配列、若しくはそのフラグメントとハイブリダイズ
するポリ核酸配列； （ｃ）遺伝暗号の結果として（ａ）若しくは（ｂ）に定義されるポリ核酸配列
に縮重されるポリ核酸配列；又は （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか一項のポリ核酸にコードされるタンパク質の
フラグメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される、上記に定義されたとおりの単離ポリ核酸の、環境ストレス条件
に対する増強された耐性又は抵抗性を有するトランスジェニック植物を生産する
ための使用に関する。

【００５３】 好ましくは、（ｂ）項による該配列は、厳しい条件下で（ａ）項の配列とハイ
ブリダイズする。

【００５４】 本発明は、配列番号３の少なくとも一部、又は配列番号３と５０％以上同一で
あり、優先的には５５％、６０％、６５％若しくは７０％以上同一であり、より
好ましくは７５％、８０％若しくは８５％以上同一であり、最も好ましくは９０
％若しくは９５％以上同一である配列を有する遺伝子の少なくとも一部を含む、
ポリ核酸の用途にも関する。好ましくは、該遺伝子は、環境ストレス条件に対す
る増強された耐性又は抵抗性を有するトランスジェニック植物を生産するために
、配列番号４の配列を有するタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有する、
タンパク質をコードしている。

【００５５】 より好ましくは、本発明は、 （ａ）配列番号７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９
７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５
、１１７若しくは１１９、又はその相補鎖； （ｂ）（ａ）に定義された配列又はそのフラグメントとハイブリダイズする、
ポリ核酸配列； （ｃ）遺伝暗号の結果として（ａ）又は（ｂ）に定義されたポリ核酸配列に縮
重されるポリ核酸配列；或いは （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか一項のポリ核酸にコードされるタンパク質の
フラグメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される上記に定義された単離ポリ核酸の、環境ストレス条件に対する増
強された耐性又は抵抗性を有するトランスジェニック植物を生産するための使用
に関する。

【００５６】 本発明は、好ましくは、配列番号７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１
、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１
、１１３、１１５、１１７若しくは１１９のいずれかの少なくとも一部、又は配
列番号７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、
１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７若
しくは１１９のいずれかと５０％以上同一であり、優先的には５５％、６０％、
６５％若しくは７０％以上同一であり、より好ましくは７５％、８０％若しくは
８５％以上同一であり、最も好ましくは９０％若しくは９５％以上同一である配
列を有する遺伝子の少なくとも一部の、環境ストレス条件に対する増強された耐
性又は抵抗性を有するトランスジェニック植物を生産するための使用に関する。

【００５７】 好ましくは、該遺伝子は、配列番号８０、８２、８４、８６、８８、９０、９
２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１
１２、１１４、１１６、１１８又は１２０の配列を有するタンパク質と実質的に
同じ生物学的活性を有する、タンパク質をコードしている。

【００５８】 もう一つの好適実施態様によれば、本発明は、増強された環境ストレス耐性を
植物及び酵母に与えるのに少なくとも用いることができる、ｃ７４と呼ばれるタ
ンパク質、より詳しくはｃ７４の植物相同体、はるかに好ましくはシロイヌナズ
ナからのｃ７４をコードしている、上記に定義されたとおりの単離ポリ核酸に関
する。

【００５９】 より詳しくは、本発明は、 （ａ）配列番号５、若しくはその相補鎖； （ｂ）（ａ）に定義された配列、若しくはそのフラグメントとハイブリダイズ
する、ポリ核酸配列； （ｃ）遺伝暗号の結果として（ａ）若しくは（ｂ）に定義されたポリ核酸配列
に縮重されるポリ核酸配列；又は （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか一項のポリ核酸にコードされるタンパク質の
フラグメントをコードしているポリ核酸配列 から選ばれる、上記に定義されたとおりの単離ポリ核酸に関する。

【００６０】 好ましくは、（ｂ）項による該配列は、（ａ）項の配列と厳しい条件下でハイ
ブリダイズする。

【００６１】 本発明は、配列番号５の少なくとも一部、又は配列番号５と５０％以上同一で
あり、優先的には５５％、６０％、６５％若しくは７０％以上同一であり、より
好ましくは７５％、８０％若しくは８５％以上同一であり、最も好ましくは９０
％若しくは９５％以上同一である配列を有する遺伝子の少なくとも一部を含む、
ポリ核酸にも関する。好ましくは、該遺伝子は、配列番号６の配列を有するタン
パク質と実質的に同じ生物学的活性を有する、タンパク質をコードしている。

【００６２】 二つの核酸配列又はポリペプチドは、下記に説明するような最高対応度で整列
させたとき、二つの配列中の、それぞれ、ヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列
が同じであるならば、本発明によれば「同一」であると言われる。用語「相補的
」は、本明細書では、相補的配列が、与えられたポリヌクレオチド配列の全部又
は一部とハイブリダイズすることを意味する。

【００６３】 二つ（又はそれ以上）のポリ核酸又はポリペプチド配列間の配列比較は、代表
的には、「比較ウィンドウ」越しに二配列の配列を比較して、配列が類似する局
所的領域を特定かつ比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」は、
本明細書に用いられる限りで、ある配列と、隣接する位置の数が同じである参照
配列とを、最も適切に整列させた後に比較し得る、約２０以上の、普通は約５０
〜約２００の、より普通には約１００〜約１５０の隣接位置のセグメントを意味
する。

【００６４】 比較のための配列の最適の整列は、Smith及びWaterman（1981）の局所相同性
アルゴリズムによってか、Needleman及びWunsch（1970）の相同性整列アルゴリ
ズムによってか、Pearson及びLipman（1988）の類似性検索法によってか、これ
らのアルゴリズム〔Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer
Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、Ｂ
ＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ〕のコンピュータによる実行によってか
、又は視覚的検分によって実施してよい。

【００６５】 「配列同一性の百分率」は、最も適切に整列させた二つの配列を比較ウィンド
ウ越しに比較することによって決定されるが、ここで、比較ウィンドウ内のポリ
核酸又はポリペプチドの配列の部分は、二配列の最適な整列のために、（付加又
は欠失を含まない）参照配列と比較しての付加又は欠失（すなわち間隙）を含ん
でよい。この百分率は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両配列中に出現する
位置の数を決定して、対合する位置の数を数え、対合する位置の数を、比較ウィ
ンドウ内の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて、配列同一性の百分率を得
ることによって算出される。

【００６６】 ポリ核酸又はポリペプチド配列の「実質的な同一性」という用語は、ポリヌク
レオチド配列が、標準的なパラメータを用いた上記のプログラム（好ましくはＢ
ＬＡＳＴ）を用い、参照配列と比較して、６０％、６５％、７０％又は７５％以
上、好ましくは８０％又は８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好まし
くは９５％以上の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、こ
れらの数値を適切に調整して、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、読み枠の位置
取りなどを斟酌することによって、二つのヌクレオチド配列がコードしているタ
ンパク質の対応する同一性が決定できることを認識するものと思われる。その目
的でのアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、４０％、４５％、５０％又は５
５％以上、好ましくは６０％、６５％、７０％、７５％、８０％又は８５％以上
、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列同一性を意味す
る。「実質的に類似する」ポリペプチドは、同一でない残基の位置が、同類アミ
ノ酸変化によって異なり得ること以外は、上記のような配列を共有する。同類ア
ミノ酸置換とは、類似する側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪
族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイ
ソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及
びトレオニンであり；含アミド側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及び
グルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チ
ロシン及びトリプトファンであり；塩基側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、
アルギニン及びヒスチジンであり；含硫黄側鎖を有するアミノ酸の群は、システ
イン及びメチオニンである。好適な同類アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−
イソロイシン、フェニルアリニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−
バリン及びアスパラギン−グルタミンである。

【００６７】 ヌクレオチド配列が実質的に同一であることのもう一つの指標は、二つの分子
が、厳しい条件下で互いにか、又は第三の核酸とハイブリダイズするか否かであ
る。

【００６８】 より詳しくは、本明細書に用いられるようなポリ核酸は、本明細書に開示され
た配列番号１〜１２１に相当するヌクレオチド若しくはアミノ酸配列、より具体
的には、それぞれのタンパク質若しくはポリペプチドの「活性ドメイン」をコー
ドしているヌクレオチド配列、又はそれに相当するアミノ酸配列中のそれの一方
又は双方に基本的に類似するか、又は優先的には基本的に同一、若しくは同一で
ある、ＤＮＡ配列の少なくとも一部を含むことになる。

【００６９】 本発明によるポリ核酸配列は、ＰＣＲ、又は慣用の化学的合成のような、当技
術に公知のいかなる核酸増幅手法によっても生成することができる。

【００７０】 ＰＣＲの全般的な概観については、PCR Protocols〔Innis et al. (1990)〕を
参照されたい。

【００７１】 ポリヌクレオチドは、技術文献に記載されたような周知の手法によって合成し
てもよい。例えば、Carruthersら（1982）及びAdamsら（1983）を参照されたい
。そうして、適切な条件下で、相補鎖を合成するか、若しくは鎖を一緒にアニー
リングするか、又は適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを用いて
、相補鎖を付加するかのいずれかによって、二本鎖ＤＮＡフラグメントを得てよ
い。

【００７２】 本発明は、より詳しくは、上記に定義されたとおりのポリ核酸のいずれかによ
るポリ核酸、又はその機能的フラグメントによってコードされる単離ポリペプチ
ドに関する。

【００７３】 本発明は、好ましくは、表１に列挙されたとおりの単離ポリペプチド、又は上
記に定義されたとおりに単離されたポリ核酸がコードしている単離ポリペプチド
に関する。好ましくは、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４
、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８
、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２
、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６
、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１
０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８若しくは１２０のいずれかの配
列の少なくとも一部を有する、ポリペプチド又はペプチドに関する。好ましくは
、該一部は、ユニーク部分であり、好ましくは、該ポリペプチドの活性ドメイン
を含む。好ましくは、該ポリペプチドは、組換えポリペプチドである。

【００７４】 用語「単離（された）」は、本発明によるタンパク質又はポリ核酸を、天然に
産するそれから区別する。

【００７５】 本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、
２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、
４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、
７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、
９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２
、１１４、１１６、１１８又は１２０のいずれかと、５０％、５５％、６０％、
６５％以上同一であり、優先的には７０％、７５％以上同一であり、より好まし
くは８０％若しくは８５％以上同一であり、最も好ましくは９０％若しくは９５
％以上同一であるポリペプチドの少なくとも一部を含む、、ポリペプチドにも関
する。

【００７６】 用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書の説明全体を通じて相
互可換的に用いられる。

【００７７】 該ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも植物体、植物部分、植物組織、植
物細胞、植物カルス又は酵母に環境ストレス条件に対する耐性若しくは抵抗性を
与え得る能力を有する。

【００７８】 用語「機能的フラグメント」は、それが由来するタンパク質の生物学的活性を
実質的に有するフラグメントを意味する。

【００７９】 本発明のポリペプチドは、細菌、酵母又は真菌のような、原核及び真核の加工
された細胞での組換え発現によって生成してよい。

【００８０】 本発明は、より詳しくは、増強された環境ストレス耐性又は抵抗性を有する植
物を生産する方法であって、植物細胞内で（過剰）発現されたとき、該植物の環
境ストレスに対する耐性又は抵抗性を増強する、上記に定義されたとおりのポリ
核酸のいずれかを含む組換えＤＮＡを、該植物細胞に一時的に導入することを含
む方法に関する。

【００８１】 上記に定義された限りでの用語「植物細胞」は、植物組織、又は全体としての
植物体も含む。本発明は、より詳しくは、増強された環境ストレス耐性又は抵抗
性を有する植物を生産する方法であって、植物細胞内で（過剰）発現されたとき
、該植物の環境ストレスに対する耐性又は抵抗性を増強する、表１に列挙された
とおりのタンパク質をコードしているポリ核酸のいずれかを含む組換えＤＮＡを
、該植物細胞に一時的に導入することを含む方法に関する。

【００８２】 用語「（過剰）発現」は、該ポリ核酸にコードされる本発明のポリペプチドが
、好ましくは、形質転換された植物に、対応する非形質転換植物の成長を阻害す
る、ある量の塩、熱、低温（その他のストレス因子）に対する耐性又は抵抗性を
与えるのに充分な量で発現されることを意味する。

【００８３】 植物における組換えＤＮＡの一時的な導入及び発現を得るためのいくつかの方
法が、当技術に公知である。例えば、植物ウイルスベクターは、そのような目的
を達成するのに用いることができる。植物ウイルスベクターの利用を与える例は
、Porta及びLomonossoff（1996）、国際公開特許第９３２０２１７号公報、及び
米国特許第５，５８９，３６７号明細書に記載されている。

【００８４】 本発明は、増強された環境ストレス耐性又は抵抗性を有する植物を生産する方
法であって、植物細胞内で（過剰）発現されたとき、該植物の環境ストレス耐性
又は抵抗性を増強する、上記に定義されたとおりのポリ核酸のいずれかを含む組
換えＤＮＡを、該植物細胞のゲノムに安定的に導入することを含む方法にも関す
る。

【００８５】 本発明は、環境ストレス条件に対する増強された耐性又は抵抗性を有する植物
を生産する方法であって、植物細胞内で（過剰）発現されたとき、該植物の環境
ストレス耐性を増強する、表１に列挙されたとおりのタンパク質をコードしてい
るポリ核酸のいずれかを含む組換えＤＮＡを、該植物のゲノムに導入することを
含む方法にも関する。

【００８６】 好適実施態様によれば、本発明は、環境ストレス条件に対する増強された耐性
又は抵抗性を有する植物を生産する方法であって、ＤＢＦ２キナーゼ、好ましく
は植物ＤＢＦ２キナーゼ、最も好ましくはアラビドプシス属ＤＢＦ２キナーゼを
コードしている、上記に定義されたとおりのポリ核酸を該植物に導入することを
含む方法に関する。

【００８７】 もう一つの好適実施態様によれば、本発明は、環境ストレス条件に対する増強
された耐性又は抵抗性を有する植物を生産する、上記に定義されたとおりの方法
であって、ＨＳＰ １７．６Ａタンパク質、好ましくは植物ＨＳＰ １７．６Ａタ
ンパク質、最も好ましくはアラビドプシス属ＨＳＰ １７．６Ａタンパク質をコ
ードしている、上記に定義されたとおりのポリ核酸を該植物に導入することを含
む方法に関する。

【００８８】 好適実施態様によれば、本発明は、環境ストレス条件に対する増強された耐性
又は抵抗性を有する植物を生産する、上記に定義されたとおりの方法であって、
ｃ７４タンパク質、好ましくは植物ｃ７４タンパク質、最も好ましくはアラビド
プシス属ｃ７４タンパク質をコードしている、上記に定義されたとおりのポリ核
酸を該植物に導入することを含む方法に関する。

【００８９】 好ましくは、本発明は、上記に定義されたとおりの方法であって、 （ａ）植物細胞のゲノムに、 上記に定義されたとおりのポリ核酸、及び それにより、該ポリ核酸が、同じ転写単位内になり、かつ該植物発現可能プロ
モーターの制御下になる植物発現可能プロモーターを含む、 １種類若しくはそれ以上の組換えＤＮＡ分子を導入することと、 （ｂ）該植物を該植物細胞から再生させることと を含む方法にも関する。

【００９０】 本発明は、環境ストレス条件に対する増強された耐性又は抵抗性を有する植物
を生産する方法であって、上記に定義されたとおりのポリ核酸内に含まれた内因
性遺伝子の該植物での発現を間接的に増強若しくは誘導すること、又は上記に定
義されたとおりのタンパク質の活性を間接的に増強若しくは誘導することを含む
方法にも関する。

【００９１】 本発明は、上記に定義されたとおりの方法であって、 （ａ）植物細胞のゲノムに、 該植物細胞で有効量で発現されたとき、内因性ポリ核酸の発現を間接的に増強
若しくは誘導するか、又は本発明の該ポリ核酸がコードしているタンパク質のタ
ンパク質活性を間接的に増強若しくは誘導するタンパク質をコードしているＤＮ
Ａ、及び 植物発現可能プロモーターであって、それにより、該ＤＮＡが、同じ転写単位
内になり、かつ該植物発現可能プロモーターの制御下になる植物発現可能プロモ
ーターを含む、 １種類若しくはそれ以上の組換えＤＮＡ分子を導入することと、 （ｂ）該植物を該植物細胞から再生させることと を含む方法にも関する。

【００９２】 「組換え」ＤＮＡ分子は、「異型配列」を含んで、該組換えＤＮＡ分子が、異
なる種に由来する配列を含むことになるか、同じ種に由来するならば、その本来
の形態から実質的に修飾されていてよいことを意味することになる。例えば、そ
れが由来するのとは異なる種からの構造遺伝子に、機能的に結合されたプロモー
ターは、その本来の形態から実質的に修飾されていてよい。

【００９３】 本発明は、環境ストレス条件に対する増強された耐性又は抵抗性を有する植物
を生産する、上記に定義されたとおりの方法であって、上記に定義されたとおり
のポリ核酸内に含まれた内因性遺伝子の該植物での発現を間接的に増強若しくは
誘導すること、又は上記に定義されたとおりの本発明のタンパク質の活性を間接
的に増強若しくは誘導することを含む方法にも関する。この実施態様によれば、
本発明によるタンパク質の発現又は活性を調節するその他のポリ核酸を、該植物
のゲノムに一時的にか、又は安定的に導入してよい。用語「調節する」とは、増
強、誘導、増大、減少又は阻害することを意味する。

【００９４】 発現の増大若しくは誘導、又はタンパク質活性の誘導若しくは増大は、該調節
タンパク質が、本発明のポリ核酸又はタンパク質の少なくとも一方の発現若しく
は活性の正の調節因子であるときに、必要とされる。

【００９５】 発現の低下若しくは阻害、又はタンパク質活性の低下若しくは阻害は、該調節
タンパク質が、本発明のポリ核酸又はタンパク質の少なくとも一方の発現若しく
は活性の負の調節因子であるときに、必要とされる。

【００９６】 本発明による該ポリペプチドの活性の増大は、本発明の一実施態様によれば、
植物内の内因性遺伝子の発現に影響を与えることによって達成される。これは、
好ましくは、本発明による一つ又はそれ以上のポリ核酸配列を植物ゲノムに、遺
伝子発現に適した形で（例えば、植物発現可能プロモーターの制御下で）導入す
ることによって達成される。その結果、植物細胞内のタンパク質の、増強若しく
は誘導された発現（過剰発現）、又は増強若しくは誘導された活性、或いは、適
切な基質の存在下での、トランスジェニック植物又は植物細胞における環境スト
レス条件に対する耐性若しくは抵抗性の、非トランスジェニック植物又は植物細
胞に比しての増大を招くことになる。耐性のこの増大は、ｍＲＮＡレベル、又は
適切な場合、それぞれのタンパク質の活性レベルの（例えばＥＬＩＳＡ、当技術
に公知のいかなる手法によって測定されるような酵素活性による）測定によって
測定することができる。内因性遺伝子の発現とは、問題の植物、植物部分又は植
物細胞内に天然に見出されるタンパク質の発現を意味する。

【００９７】 これに代えて、環境ストレス条件に対する該増強された耐性又は抵抗性は、植
物のゲノムに、本発明による内因性遺伝子（ポリ核酸）の発現と、アンチセンス
ＲＮＡによってか、本発明のポリ核酸の発現を通常は阻害する、遺伝子の共抑制
若しくはリボザイム抑制によってか、又は上記に定義されたとおりの本発明のポ
リペプチドの活性を通常は阻害する、遺伝子の抑制によって作用し合う、１種類
又はそれ以上のトランス遺伝子を導入することによって達成してもよい。

【００９８】 発現を阻害するには、導入しようとする核酸セグメントは、一般的には、抑制
しようとする単数若しくは複数の内因性遺伝子の、少なくとも一部と実質的に同
一であると思われる。しかし、配列は、発現を阻害するために完全に同一である
必要はない。本発明のベクターは、阻害効果が、標的遺伝子との相同性又は実質
的相同性を示す、遺伝子の群内のその他の遺伝子にも該当するように設計するこ
とができる。

【００９９】 アンチセンス抑制のためには、導入される配列も、一次転写産物、又は完全に
プロセシングされたｍＲＮＡのいずれかと対比して、完全長である必要はない。

【０１００】 一般に、より高度な相同性を用いて、より短い配列の使用を償うことができる
。

【０１０１】 更に、導入される配列は、同じイントロン又はエキソンのパターンを有する必
要はなく、非コーディングセグメントの相同性は、等しく効果的であり得る。通
常、約３０〜４０ヌクレオチドから完全長配列までの配列を用いなければならな
いが、約１００ヌクレオチド以上の配列が好ましく、約２００ヌクレオチド以上
の配列は、更に好ましく、約５００〜約１，７００ヌクレオチドの配列は、特に
好ましい。

【０１０２】 上記に説明したような遺伝子の発現を阻害するのに、触媒性のＲＮＡ分子又は
リボザイムも用いることができる。事実上いかなる標的ＲＮＡとも特異的に対合
し、特定の位置でホスホジエステル骨格を切断して、それによって標的ＲＮＡを
機能的に不活性化する、リボザイムを設計することが可能である。この切断を実
施する際に、リボザイムは、それ自体は変更されず、そのため再循環させ、他の
分子を切断し、それによって真の酵素となることができる。リボザイム配列をア
ンチセンスＲＮＡ内に含めることは、それらにＲＮＡ切断活性を与えて、それに
よって構成物の活性を増大させる。

【０１０３】 リボザイムの数多くの群が特定されている。リボザイムの一群は、自己切断、
及び植物内での複製ができる、数多くの小さい環状ＲＮＡから誘導される。これ
らのＲＮＡは、単独でか（ウイルス様ＲＮＡ）、又はヘルパーウイルスとともに
か（サテライトＲＮＡ）のいずれかで複製する。例は、アボカドサンブロッチウ
イロイドからのＲＮＡ、並びにタバコ輪紋病ウイルス、アルファルファ一過性条
斑病ウイルス、ビロードタバコ斑紋病ウイルス、ナス斑紋病ウイルス及び地中ク
ローバー斑紋病ウイルスからのサテライトＲＮＡを包含する。標的ＲＮＡ特異的
リボザイムの設計及び利用は、Haseloffら（1988）に記載されている。

【０１０４】 遺伝子発現の抑制のもう一つの方法は、センス抑制である。センス配向に形作
られた核酸の導入は、標的遺伝子の転写を遮断するための効果的な手段であるこ
とが示されている。内因性遺伝子の発現を調節するこの方法の使用例については
、Napoliら（1990）、並びに米国特許第５，０３４，３２３号、第５，２３１，
０２０号及び第５，２８３，１８４号明細書を参照されたい。

【０１０５】 抑制効果は、導入された配列が、コーディング配列自体は含まないが、内因性
配列の一次転写体中に存在する配列と相同なイントロン又は非翻訳配列のみを含
むにすぎない場合に、発生する。導入配列は、一般的には、抑制しようとする内
因性配列と実質的に同一であることになる。この最小限の同一性は、代表的には
、約６５％より高いが、より高度の同一性は、内因性配列の発現の、より効果的
な抑制をもたらす。約８０％より実質的に高い同一性が好ましいが、約９５％な
いし完全な同一性は、最も好適であると思われる。アンチセンス調節によるのと
同様に、効果は、相同性、又は実質的な相同性を示す遺伝子の類似の群内のその
他のいかなるタンパク質にも該当するはずである。

【０１０６】 センス抑制のためには、導入される配列は、完全であるより低い同一性を必要
とするが、やはり、一次転写産物、又は完全にプロセシングされたｍＲＮＡのい
ずれかと対比して、完全長である必要はない。これは、過剰発現物である何らか
の植物の同時生産を回避するのに好適であり得る。完全長より短い配列中の、よ
り高い同一性は、より長い、より同一性の低い配列の代償となる。更に、導入さ
れる配列は、同じイントロン又はエキソンのパターンを有する必要はなく、非コ
ーディングセグメントの同一性は、等しく効果的であることになる。通常、アン
チセンス調節についての上記の大きさの範囲の配列が用いられる。

【０１０７】 遺伝子を変更又は置換するための、当技術に公知のその他の方法も、遺伝子の
発現を阻害するのに用いることができる。例えば、Ｔ−ＤＮＡ又はトランスポゾ
ンを用いる挿入突然変異体を、発生させることができる。例えば、Haringら（19
91）及びWalbot（1992）を参照されたい。植物及び動物の遺伝子工学におけるも
う一つの方策が、遺伝子の置換に照準されている。相同的組換えは、代表的には
、この目的に用いられている〔Capecchi (1989)を参照されたい〕。

【０１０８】 これに代えて、本発明は、該ＤＮＡが、上記に定義されたとおりの本発明によ
る内因性ポリ核酸配列の発現を、間接的に増強若しくは誘導できるか、又は上記
に定義されたとおりの本発明のタンパク質の活性を増強若しくは誘導できる、セ
ンス若しくはアンチセンスＲＮＡ又はリボザイムをコードしている、上記に定義
されたとおりの方法にも関する。好ましくは、該内因性ポリ核酸は、表１に列挙
されたとおりのタンパク質をコードしている。

【０１０９】 本発明は、上記に定義されたとおりのポリ核酸、及び植物発現可能プロモータ
ーであって、それにより、該ポリ核酸が、同じ転写単位内になり、かつ該植物発
現可能プロモーターの制御下になる植物発現可能プロモーターを含む、組換えポ
リ核酸にも関する。

【０１１０】 本発明は、 （ａ）該植物で有効量で発現されたとき、上記に定義されたとおりの内因性ポ
リ核酸の発現を間接的に増強若しくは誘導するか、又は上記に定義されたとおり
のポリペプチドのタンパク質活性を間接的に増強若しくは誘導する、タンパク質
をコードしているＤＮＡ、及び （ｂ）植物発現可能プロモーターであって、それにより、該ＤＮＡが、同じ転
写単位内になり、かつ該植物発現可能プロモーターの制御下になる植物発現可能
プロモーターを含む、 組換えポリ核酸にも関する。

【０１１１】 「内因性」ポリ核酸は、形質転換以前に植物種内に既に存在するポリ核酸を意
味する。

【０１１２】 本明細書で上記に記載された限りでの、該組換えポリ核酸は、一般的には、「
組換えベクター」又は「発現カセット」とも呼ばれる。本発明の発現カセットは
、標準的な方法によって、発現ベクター内にクローニングすることができる。次
いで、発現ベクターを、現在利用できるＤＮＡ移転方法によって宿主細胞に導入
することができる。

【０１１３】 本発明は、該細胞内で、上記に定義されたとおりのタンパク質の活性を増強又
は誘導する、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム若しくはセンスＲＮＡを含む、上
記に定義されたとおりの組換えポリ核酸にも関する。好ましくは、該タンパク質
は、表１に列挙されている。

【０１１４】 より詳しくは、本発明は、配列番号１、３、５、９、１１、１３、１５、１７
、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１
、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５
、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９
、９０、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１
０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９又は１２１のいずれかのヌクレ
オチド配列の、少なくとも一部を含む組換えポリ核酸にも関する。

【０１１５】 好ましくは、本発明は、表１に列挙されたタンパク質をコードしている遺伝子
のコーディング配列の、少なくとも一部を含む組換えポリ核酸に関する。好まし
くは、該「一部」は、該ヌクレオチド配列のいずれかのユニーク部分である。（
２６〜２８）。本明細書に用いられる限りで、用語「植物発現可能プロモーター
」は、植物細胞における転写を作動させ得るプロモーターを意味する。これは、
転写ＤＮＡ配列の天然のプロモーターを包含する、植物起源のいかなるプロモー
ターも包含するが、植物における転写を指図できる、非植物起源のいかなるプロ
モーターも包含する。このプロモーターは、人工的又は合成のプロモーターであ
ってもよい。用語「植物発現可能プロモーター」は、構成的な、誘導できる、器
官−組織特異的、又は発生上調節されるプロモーターを包含するが、これらに限
定されない。

【０１１６】 本発明によれば、本発明によるポリペプチドの植物若しくは植物部分での生産
及び／又は活性は、植物のゲノムに本発明による１種類又はそれ以上のポリ核酸
を導入することによって増強される。より具体的には、該構成プロモーターは、
下記：すなわち、３５Ｓプロモーター〔Odell et al. (1985)〕、３５Ｓ′３プ
ロモーター〔Hull & Howell (1987)〕、Ｔｉプラスミドのノパリンシンターゼ遺
伝子のプロモーター〔「ＰＮＯＳ」、Herrera-Estrella (1983)〕、又はオクト
ピンシンターゼ遺伝子のプロモーター〔「ＰＯＣＳ」、De Greve et al. (1982)
〕のうち一つであり得るが、これらに限定されない。その他の構成プロモーター
を用いて、類似の効果を達成できることは、明らかである。本発明に従って用い
ることができる、植物発現可能プロモーターのリストを、表２に示す。

【０１１７】 本発明の特定の実施態様については、誘導できるプロモーターの利用は、一定
の利点を与えることができる。タンパク質レベル又はタンパク質活性の調節は、
植物の一定の部分で必要とされることがあって、調節を、植物の培養又は発生段
階の一定の時期に限定することを可能にする。

【０１１８】 本発明の特定の実施態様については、器官若しくは組織特異的又は化学的な誘
導できるプロモーターの利用は、一定の利点を与えることができる。そのため、
本発明の特定の実施態様では、単数若しくは複数の遺伝子、又はその部分を、特
定の植物組織又は器官、例えば根、葉、収穫できる部分等々での発現を指図する
プロモーターの制御下に置く。

【０１１９】 環境ストレス条件の際に誘導され得るプロモーターを用いることも可能である
。そのようなプロモーターは、例えば、植物細胞における環境的な、すなわち好
ましくは非生物的なストレスによって直接調節される、それに対して発現が増強
、軽減又は別途変更される遺伝子を包含する、ストレス関連遺伝子から採取する
ことができる。これらのストレス関連遺伝子は、その発現が、嫌気性ストレス、
冠水ストレス、寒冷ストレス、脱水ストレス、乾燥ストレス、熱ストレス又は塩
分によって、誘導されるか、若しくは抑制される、遺伝子を含む。そのようなプ
ロモーターの例示的リストを、表３に示す。

【０１２０】 本発明による組換えポリ核酸は、他の遺伝子からの調節その他の配列、例えば
リーダー配列（例えば、ペチュニアからのｃａｂ２２リーダー）、３′転写終結
及びポリアデニル化シグナル（例えば、オクトピンシンターゼ遺伝子又はノパリ
ンシンターゼ遺伝子）、植物翻訳開始共通配列、イントロン、転写エンハンサー
その他の、ａｄｈイントロン１のような調節要素等々を更に包含してよく、これ
らは、遺伝子又はそのフラグメントに機能的に結合されている。加えて、該組換
えポリ核酸は、本発明のポリ核酸の遺伝子産物を、植物細胞内の特定の細胞内区
画へと照準し、更にタンパク質を細胞外環境へと仕向けるために構成かつ利用す
ることができる。これは、一般的には、通過又はシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を、該組換えポリ核酸に機能的に結合することによって得ることがで
きる。

【０１２１】 本発明による１種類又はそれ以上のポリ核酸を含む組換えＤＮＡは、キメラマ
ーカー遺伝子を伴ってよい〔Hansen et al., 1999、及びその中の引用文献〕。
キメラマーカー遺伝子は、植物発現可能プロモーター、好ましくは構成プロモー
ター、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、又は光誘導性プロモーター、例えば
Rubiscoの小副単位をコードしている遺伝子のプロモーターにその５′末端が機
能的に結合され、適切な植物転写３′末端形成及びポリアデニル化のシグナルに
その３′末端が機能的に結合されている、マーカーＤＮＡを含むことができる。
マーカーＤＮＡの選択は、決定的に重要ではなく、適切ないかなるマーカーＤＮ
Ａも用いることができると予測される。例えば、マーカーＤＮＡは、Ａ１遺伝子
〔Meyer et al., (1987)〕のように、形質転換された植物細胞に区別できる色彩
を与える、タンパク質をコードすることができるか、ホスフィノトリシンに対す
る抵抗性をコードしている、bar遺伝子（ヨーロッパ特許第0 242 246号公報）の
ように、形質転換された植物細胞に除草剤耐性を与えることができるか、又はゲ
ンタマイシンに対する耐性をコードしている、aac（６′）遺伝子のように（国
際公開特許第９４／０１５６０号公報）、形質転換された細胞に抗生物質耐性を
与えることができる。

【０１２２】 もう一つの実施態様によれば、本発明は、選別できるマーカー遺伝子としての
上記ポリ核酸の用途に関する。より好ましくは、本発明は、選別できるマーカー
遺伝子としての上記に定義されたとおりの植物ＤＢＦ２遺伝子の用途にも関し、
選別は、ストレス条件による処理で実施される。

【０１２３】 本発明の遺伝子からの配列を含む、本発明による組換えベクターは、代表的に
は、植物細胞に選別できる表現型を与える、マーカー遺伝子も含むことになる。
例えば、該マーカーは、殺生物剤耐性、特に抗生物質耐性、例えばカナマイシン
、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシンに対する耐性、又は除草剤耐性、
例えばクロロスルホロン若しくはBastaに対する耐性をコードしていてよい。

【０１２４】 本発明は、上記に定義されたとおりの単離ポリ核酸で形質転換された、組換え
宿主細胞にも関する。該宿主は、当技術に公知のいかなる宿主であることもでき
る。好ましくは、該組換え宿主細胞は、植物細胞、酵母、真菌、昆虫細胞等々で
ある。該宿主で効率的に発現させるために、該ポリ核酸は、該宿主系で機能する
ことが公知である、いかなる宿主と組み合せることもできる。該宿主細胞を形質
転換する方法も、当技術に周知である。

【０１２５】 本発明は、特に、上記に定義されたとおりの少なくとも１種類の組換えポリ核
酸で形質転換された植物細胞にも関する。

【０１２６】 本発明は、上記に定義されたとおりの少なくとも１種類の組換えポリ核酸で形
質転換された植物細胞より基本的になる植物にも関する。

【０１２７】 「トランスジェニック植物」は、その細胞の基本的にすべてのゲノムにトラン
スジーンを含む植物を意味する。

【０１２８】 本発明のＤＮＡ構築物は、慣用の様々な手法によって、望みの植物宿主のゲノ
ムに導入してよい〔例えば、総説についてはHansen et al., 1999、及び国際公
開特許第９９／０５９０２号公報を参照されたい〕。例えば、本発明のＤＮＡ構
成体は、プロトプラスト形質転換、バイオリスティックスbiolistics若しくは微
量注入衝撃、又はアグロバクテリアを介する形質転換のような手法を用いること
によって、望みの植物宿主のゲノムに導入してよい。

【０１２９】 マイクロインジェクション法は、当技術に公知であり、学術及び特許文献に充
分に記載されている。ポリエチレングリコール沈降を用いたＤＮＡ構築物の導入
は、Paszkowskiら（1984）に記載されている。

【０１３０】 電気穿孔法は、Frommら（1985）に記載されている。バイオリスティック形質
転換法は、Kleinら（1987）に記載されている。

【０１３１】 これに代えて、ＤＮＡ構築物は、適切なＴ−ＤＮＡフランキング領域と組み合
せ、慣用のアグロバクテリアの宿主ベクターに導入してよい。アグロバクテリア
という宿主の毒性の機能は、細胞をこの細菌に感染させたとき、植物細胞ＤＮＡ
への構築物及び隣接マーカーの挿入へと向かわせることになる。バイナリーベク
ターの無害化及び利用は、学術文献に充分に記載されている。例えば、Horschら
（1984）、及びFraleyら（1983）を参照されたい。

【０１３２】 上記の形質転換手法のいずれかによって誘導される、形質転換された植物細胞
は、形質転換された遺伝子型と、したがって望みの表現型も保有する全植物体を
再生するよう、培養することができる。そのような再生手法は、組織培養成長培
地中での一定の植物ホルモンの操作に依拠する。培養されたプロトプラストから
の植物の再生は、Evansら（1983）、及びBinding（1985）に記載されている。再
生は、植物のカルス、外植体、器官、又はその部分から達成することもできる。
そのような再生手法は、Kleeら（1987）に全般的に記載されている。

【０１３３】 本発明のポリ核酸及びポリペプチドは、単子葉又は双子葉植物、好ましくは、
農業、林業又は園芸に利害を有する植物種に属するもの、例えば、農作物、根菜
植物、採油植物、果樹、牧草及び飼草用マメ科植物、愛玩若しくは鑑賞又は園芸
用植物を包含する、広範囲の植物に望みの形質を与えるのに用いることができる
。これらの植物は、サルナシActinidia、セロリーApium、ネギAllium、パイナッ
プルAnanas、ナンキンマメArachis、テンナンショウArisaema、クサスギカズラA
sparagus、ベラドンナAtropa、カラスムギAvena、フダンソウBeta、アブラナBra
ssica、パパイヤCarica、チコリーCichorium、レモンCitrus、スイカCitrullus
、トウガラシCapsicum、キウリCucumis、カボチャCucurbita、シドニアCydonia
、ニンジンDaucus、カキDiospyros、オランダイチゴFragaria、ダイズGlycine、
ワタGossypium、ヒマワリHelianthus、ヘテロカリスHeterocallis、オオムギHor
deum、ヒヨスHyoscyamus、サツマイモIpomoea、アキノノゲシLactuca、アマLinu
m、ドクムギLolium、トマトLycopersicon、リンゴMalus、マンゴーMangifera、
キャッサバManihot、マヨラナMajorana、ウマゴヤシMedicago、バショウMusa、
タバコNicotiana、イネOryza、キビPanicum、パンネセツムPannesetum、アボカ
ドPersea、ペトロセリヌムPetroselinum、インゲンマメPhaseolus、エンドウPis
um、ナシPyrus、サクラPrunus、ダイコンRaphanus、ダイオウRheum、スグリRibe
s、アカネRubia、サトウキビSaccharum、ライムギSecale、ハンゴンソウSenecio
、カラシSinapis、ナスSolanum、モロコシSorghum、ホウレンソウSpinacia、ト
リゴネラTrigonella、コムギTriticum、コケモモVaccinium、ブドウVitis、ソラ
マメVicia、トウモロコシZea及びショウガZingiberの属からの種を包含すること
ができる。追加的な種は、除外されない。地下水による潅漑が必要とされる、乾
燥又は半乾燥地域の耕作地で栽培される農作物は、好都合にも、本発明からの恩
恵を受けてよい。

【０１３４】 当業者は、組換えポリ核酸が、トランスジェニック植物に安定的に組み込まれ
、機能できると確認された後は、有***配によって他の植物にも導入できること
を認識すると思われる。交配しようとする種に応じて、数多くの標準的な育種手
法のいずれを用いることもできる。前記のとおり、本発明の植物細胞、植物組織
、特にトランスジェニック植物は、環境ストレス条件に対して、対応する野生型
植物に比して、より高度な、又は増強された一定程度の耐性（又は抵抗性でさえ
）を示す。「環境ストレス」の意味については、上記を参照されたい。本発明の
好適実施態様では、該トランスジェニック植物は、浸透圧ストレス、塩ストレス
、寒冷及び／又は熱ストレスに対する増強された耐性を示す。そのような環境ス
トレスに対する耐性の増大は、当技術に公知の方法論によって決定される限りで
の、対応する非形質転換植物の成長及び生産性を阻害する、そのようなあるレベ
ルのストレスに対する耐性を意味すると解される。トランスジェニック植物にお
ける増強された耐性は、該トランスジェニック植物、又はその部分における、本
発明の１種類若しくはそれ以上のポリ核酸の発現レベルの上昇、及び／又は当技
術に公知の方法論によって決定される限りでの、該ポリ核酸がコードしているポ
リペプチドの活性レベルの上昇に関連付けられる。それらの形質転換されていな
い相手と比較し、かつ当技術に公知の方法論に従って決定されて、本発明による
トランスジェニック植物は、穏やかな環境ストレス条件下で、成長、生存度、代
謝、稔性及び／又は生産性の増大を示す。代替策では、本発明によるトランスジ
ェニック植物は、形質転換されていないその相手が成長できない、環境ストレス
条件下で成長することができる。塩ストレスに対する耐性の増大は、トランスジ
ェニック植物が、該ストレス耐性トランスジェニック植物がそれから誘導された
、ストレス耐性でない親植物の９５％以上の成長を阻害するストレス条件下で、
成長できる能力を意味すると解される。代表的には、本発明のストレス耐性植物
の成長率は、ストレス耐性でない親植物の９５％以上の成長を阻害する成長条件
によって、５０％未満、好ましくは３０％未満だけ阻害されると思われ、最も好
ましくは、有意には阻害されない成長率を有すると思われる。代替例では、穏や
かな環境ストレス条件下で、トランスジェニック植物の成長及び／又は生産性は
、統計的に、それらの形質転換されていない相手より１％以上高く、好ましくは
５％より高く、最も好ましくは１０％より高い。

【０１３５】 本発明に従って得られるいかなる形質転換植物も、慣用の育種体制にか、若し
くはin vitroでの植物繁殖に用いて、同じ特性を有する、より多くの形質転換植
物を生産することができ、及び／又は同じ特性を、他の様々な同じか、若しくは
関連する種に導入するのに用いることができる。

【０１３６】 更に、環境ストレス条件下で正常な／迅速な／高い成長率を維持するための、
本発明のトランスジェニック植物の特性は、他のストレス耐性遺伝子を用いて、
環境ストレス耐性を与えるための様々な取組み方と組み合せることができる。そ
のようなストレス耐性遺伝子のいくつかの例は、Holmberg及びBuelow（1998）に
与えられている。様々なストレス耐性遺伝子の導入を包含する、先行技術による
殆どの取組み方は、正常な、ストレスのない条件下では、（トランスジェニック
でない対照に比して）低下したか、又は異常な成長を招く、すなわち、ストレス
耐性は、成長及び生産性と引き換えに得られる〔Kasuga et al., 1999〕。スト
レス応答遺伝子の構成的発現と、正常な成長条件下での低下した成長率との間の
この相関関係は、ストレス応答制御と成長制御との間の双方向性機序の存在を示
す。

【０１３７】 更に、環境ストレス条件に対する耐性を示す、本発明のトランスジェニック植
物の特性は、他のストレス耐性、例えば、マンニトール、プロリン、グリシン−
ベタイン、水チャンネルタンパク質等々のような浸透圧防護剤を植物に与える、
様々な取組み方と組み合せることができる。したがって、環境ストレス条件に対
する耐性を植物に与える、本発明の取組み方は、様々なストレス耐性遺伝子の導
入を包含する、先行技術による取組み方と組み合せることができる。これらの取
組み方の組合せは、環境ストレスに対する耐性又は抵抗性を増強するのに追加的
な、及び／又は相乗的な効果を有する可能性がある。

【０１３８】 そのため、当業者には、本発明の方法は、それ以上の何らかの望みの形質を有
する、トランスジェニックストレス耐性植物を生産するために用いることができ
ることが直ちに明らかであり〔総説については、TIPTEC Plant Product & Crop
Biotechnology 13 (1995), 312-397〕、含まれるものは、下記のとおりである。 （i）除草剤耐性〔ドイツ国特許第３７０１６２３号公報；Stalker (1988)〕
、 （ii）昆虫耐性〔Vaek (1987)〕、 （iii）ウイルス耐性〔Powell (1986)、Pappu (1995)、Lawson (1996)〕、 （iv）オゾン耐性〔Van Camp (1994)〕、 （ｖ）果実保存の改良〔Oeller (1991)〕、 （vi）澱粉の組成及び／又は生産の改良〔Stark (1992)、Visser (1991)〕、 （vii）脂質組成の変更〔Voelker (1992)〕、 （ix）例えばアントシアニン及びフラボノイド生合成経路の操作による、花色
の変更〔Meyer (1987)、国際公開特許第９０／１２０８４号公報〕、 （ｘ）細菌、昆虫及び真菌に対する耐性〔Duering (1996)、Strittmatter (19
95)、Estruch (1997)〕、 （xi）アルカロイド及び／又は強心配糖体組成の変更、 （xii）雄及び／又は雌性不稔性の維持の誘導〔ヨーロッパ特許Ａ１第０ ４１
２ ００６号；同第０ ２２３ ３９９号公報；国際公開特許第９３／２５６９５
号公報〕、 （xiii）花序／花の寿命の延長、並びに （xiv）ストレス耐性。

【０１３９】 そのため、本発明は、本発明の方法に従って得られ、上記のものの一つのよう
な、新規な表現型を植物に与える核酸分子を更に含む、環境ストレスに対する増
強された耐性又は抵抗性を、遺伝子工学によって示す、いかなる植物細胞、植物
組織若しくは植物に関する。

【０１４０】 本発明は、本質的に本明細書に上記に定義されたとおりの植物細胞からなる、
単数又は複数のカルスにも関する。そのようなトランスジェニックカルスは、好
ましくは、植物細胞の懸濁培養での二次代謝物の生産に用いることができる。

【０１４１】 本発明は、本明細書に上記に定義されたとおりの、植物のその他いかなる収穫
できる部分、器官若しくは組織、又は増殖材料にも関する。

【０１４２】 本発明は、該組換えＤＮＡを含む、本明細書に上記に定義されたとおりの、ト
ランスジェニック植物の種子にも関する。

【０１４３】 本発明は、上記に定義されたとおりのいかなる単離ポリ核酸の、トランスジェ
ニック植物を生産するための用途にも関する。

【０１４４】 本発明は、上記に定義されたとおりの組換えポリ核酸の、トランスジェニック
植物、好ましくは環境ストレス条件に対する増強された耐性又は抵抗性を有する
トランスジェニック植物を生産するための使用にも関する。好ましくは、該ポリ
核酸は、表１に列挙されたようなポリペプチドをコードしている。

【０１４５】 本発明は、上記に定義されたとおりの組換えポリ核酸の、環境ストレス条件に
対する増強された耐性又は抵抗性を有するカルスを生産するための使用にも関す
る。好ましくは、該ポリ核酸は、表１に列挙されたようなポリペプチドをコード
している。

【０１４６】 本発明は、配列番号１、３、５、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、
２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、
４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、
７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９０、９１、
９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、
１１３、１１５、１１７、１１９又は１２１のいずれかに類似するが、それらと
は異なり、かつ配列番号２〜１２０（ただし偶数）のいずれかのアミノ酸配列を
有するタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードして
いる配列を有する、追加の遺伝子の、例えば、当技術に公知の手法、例えばＰＣ
Ｒによる単離に役立つ、本発明の遺伝子から誘導されるプローブ及びプライマー
にも関する。もう一つの植物種における相同遺伝子の存在は、例えば、ノーザン
又はサザンブロット分析の実験によって確認することができる。

【０１４７】 本発明は、配列番号１、３、５、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、
２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、
４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、
７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９０、９１、
９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、
１１３、１１５、１１７、１１９又は１２１に表わされるようなｃＤＮＡ配列の
いずれかの、ゲノム上の相手のクローニングにも関する。これらのゲノム上の相
手は、これらのｃＤＮＡ配列をプローブとして用いて、ゲノムライブラリーから
選ぶことができる。本発明は、該ゲノムクローンのいずれかのコーディング領域
はもとより、プロモーター領域にも関する。

【０１４８】 本発明による用語「プローブ」は、本発明のポリ核酸のいずれかと特異的にハ
イブリダイズするよう設計された、一本鎖オリゴヌクレオチドの「配列」を意味
する。

【０１４９】 用語「プライマー」は、コピーしようとする核酸鎖に相補的である、プライマ
ー伸長産物の合成開始点として作用できる、一本鎖オリゴヌクレオチド配列を意
味する。好ましくは、該プライマーは、約５〜５０ヌクレオチド長である。本発
明によるプローブ又はプライマーの用語「標的領域」は、該プローブ又はプライ
マーがそれに完全に相補的であるか、又は部分的に相補的である（すなわち多少
の程度の食違いを有する）、ポリ核酸内の配列である。該標的配列の相補体も、
ある場合には、適合する標的配列である。

【０１５０】 ポリ核酸の標的領域とのプローブの「特異的ハイブリダイゼーション」は、該
プローブが、用いられた実験条件下で、この領域の一部、又は領域全体と二本鎖
を形成すること、及びこれらの条件下で、このプローブが、分析しようとするサ
ンプル中に存在するポリ核酸のその他の領域とは二本鎖を実質的に形成しないこ
とを意味する。

【０１５１】 ポリ核酸の標的領域とのプライマーの「特異的ハイブリダイゼーション」は、
増幅工程の際、該プライマーが、用いられた実験条件下で、この領域の一部、又
は領域全体と二本鎖を形成すること、及びこれらの条件下で、該プライマーが、
分析しようとするサンプル中に存在するポリ核酸のその他の領域とは二本鎖を形
成しないことを意味する。本明細書によって用いられる限りでの「二本鎖」は、
特異的増幅へと導くような二本鎖を意味すると解されなければならない。

【０１５２】 好ましくは、本発明のプローブは、約５ヌクレオチド〜約１kb長、より好まし
くは約１０〜２５ヌクレオチド長である。本発明に用いられる限りでのヌクレオ
チドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及びイノシンのような
修飾されたヌクレオチド、又はそのハイブリダイゼーション特性を基本的に変え
ない、修飾された基を有するヌクレオチドであってよい。本発明によるプローブ
は、好ましくは、上記に定義されたとおりのポリ核酸のいずれかの、ｃＤＮＡ配
列の部分を含む。

【０１５３】 本発明は、上記に定義されたとおりのポリ核酸配列、上記に定義されたとおり
のポリペプチド、上記に定義されたとおりのプローブ、又は上記に定義されたと
おりのプライマーを含む組成物にも関する。

【０１５４】 本発明は、該ポリ核酸、上記に定義されたとおりの本発明のポリペプチドを含
む、製剤又は農薬組成物にも関する。

【０１５５】 本発明は、本発明によるタンパク質又はポリペプチドと特異的に反応する抗体
にも関する。

【０１５６】 下記の実施例は、本発明によるポリ核酸のいくつかを過剰発現するトランスジ
ェニック植物及び酵母について観察される、いくつかの環境ストレス条件に対す
る耐性及び／又は抵抗性を、例示のために説明する。実施例中に別途指示されな
い限り、すべての組換えＤＮＡ手法は、Sambrookら（1989）、およびAusubelら
（1994）の第１及び２巻に記載のような標準的プロトコルに従って実施されてい
る。植物の分子的研究の標準的材料及び方法は、BIOS Scientific Publications
Ltd. (UK)とBlackwell Scientific Publications, UKとによって共同出版され
た、R.D.D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax (1993)に記載されてい
る。

【０１５７】 これらの実施例及び図面は、上記に説明された本発明の実施態様のいずれをも
限定すると解されてはならない。本明細書に引用された参考文献はすべて、引用
により組み込まれる。

【０１５８】 表１ 実施例２で単離された、シロイヌナズナのクローンの分類。実施例２の
説明に従って単離されたクローンを、それらが耐性を与えられる能力について分
析した。実施例２に記載した方法によれば、アラビドプシス属ｃＤＮＡを発現す
る異なる酵母形質転換体の、浸透圧ストレス及び塩ストレスに対する耐性を、Ｄ
Ｙ野生型細胞の耐性と比較した。 ＋ ：ＤＹ野生型細胞と類似する成長； ＋＋ ：形質転換体の成長は、対照（１：１）より１０倍高い希釈（１：１
０）で視認することができる。 ＋＋＋ ：形質転換体の成長は、対照（１：１）より１００倍高い希釈（１：
１００）で視認することができる。 ＋＋＋＋ ：形質転換体の成長は、対照（１：１）より１，０００倍高い希釈（
１：１，０００）で視認することができる。 表２ 本発明の実施に用いるための植物発現可能プロモーターの例。 表３ 本発明の実施に用いるためのストレス誘導性プロモーターの例。

【０１５９】

【実施例】

実施例１．ｃＤＮＡライブラリーの構築 シロイヌナズナArabidopsis thalianaからの緑色長角果から、全ＲＮＡを、長
角果１gを抽出緩衝液（１００mMトリスＨＣｌ、ｐＨ８、１０mMのＥＤＴＡ、１
００mMのＬｉＣｌ）４ml中で４℃で粉砕し、次いでフェノールで処理し、クロロ
ホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出することによって単離した。
水相に、ＬｉＣｌを２Mの最終濃度まで加え、全ＲＮＡを４℃で一晩沈澱させた
。遠心分離した後、ペレットを、Ｈ₂Ｏ４００μlに再溶解し、エタノールで再沈
殿させた。この全ＲＮＡから、ポリ（Ａ）メッセンジャーＲＮＡを、オリゴｄＴ
セルローススパンカラム（Pharmacia）にこれを結合させ、カラムを１０mMトリ
スＨＣｌ、ｐＨ７．５、１mMのＥＤＴＡ、０．５MのＮａＣｌで３回洗浄し、１
０mMトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１mMのＥＤＴＡで６５℃でｍＲＮＡを溶離させ
ることによって単離した。

【０１６０】 溶出液をエタノールで沈澱させ、ｃＤＮＡを、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Pharmaci
a）、及び第一鎖に対してｄ（Ｔ）₁₄−ＸｈｏＩプライマーを、かつ第二鎖に対
して大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（Pharmacia）を用いて合成した。

【０１６１】 実施例２．酵母の形質転換、及び浸透圧耐性についての選別 このｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを用いて、ＥｃｏＲＩ−Ｘ
ｈｏＩフラグメントとしてｐＹＸベクター（Ingenius, R&D Systems；バンク１
に対して２μベースのｐＹＸ２１２、バンク２に対してＡＲＳ／ＣＥＮベースの
ｐＹＸ１１２）にクローニングした。

【０１６２】 これらの構築物では、ｃＤＮＡは、強い構成ＴＰＩプロモーターの制御下にあ
る。酢酸リチウム形質転換の手順〔Gietz & Schietsl, 1995〕を用いて、酵母の
ＤＹ株（MATa, his3, can1-100, ade2, leu2, trp1, ura3::3xSV40AP1-lacZ; N.
Jones, Imperial Cancer Research Fund, London, UKの好意により提供）を、
これらのｃＤＮＡで形質転換した。アラビドプシス属ｃＤＮＡバンクによる形質
転換の後、形質転換体を、１００mMのＬｉＣｌの存在下で成長できる能力につい
て段階的選別〔Lee et al., 1999〕で選別した。ＬｉＣｌは、酵母における塩耐
性スクリーニング〔Haro et al., 1991〕に共通して用いた。酵母に浸透圧耐性
を与える、いくつかのシロイヌナズナの遺伝子を単離した（表１）。選別された
アラビドプシス属ｃＤＮＡが、酵母に環境ストレスに対する耐性を与える能力を
更に分析するため、そのような選別されたアラビドプシス属ｃＤＮＡを発現する
それぞれの酵母形質転換体を、浸透圧ストレス及び塩ストレスに接触させた。そ
のため、各形質転換体を、ＹＰＤ（富裕培地）中で１６時間成長させ、細胞密度
を２でＯＤ₆₀₀に調整した。連続する３段階で、１：１０の連続希釈を実施した
。各希釈１０μlを２Mのソルビトール（浸透圧ストレス）、又は１．２MのＮａ
Ｃｌ（塩ストレス）を補った固体ＹＰＤ培地（対照）にスポットし、２８℃で３
日間温置した。この液滴成長試験〔Lee et al., 1999も参照されたい〕の結果を
、表１に示す。

【０１６３】 実施例３．Ａｔ−ＤＢＦ２の特性記述 このスクリーニングで、１．８kbのｃＤＮＡであるＡｔ−ＤＢＦ２（配列番号
１）を、酵母Ｄｂｆ２転写調節因子との８１％の類似性を示す、予測された６０
．２kDaのタンパク質をコードするとして特定した。相同性（４０％未満の類似
性）は、ヒト、Ｃ．エレガンス及びショウジョウバエの推定されるＤｂｆ２相同
体についても見出された〔関連する核Ｄｂｆ２に対してＮｄｒと命名、Millward
et al., 1995〕。Ａｔ−ＢＢＦ２の推論されたタンパク質配列（配列番号２）
は、タンパク質キナーゼの１１ドメインを含む（図１Ａ）。ドメインVIの非変異
残基であるＤとＮとの間にあるアミノ酸は、Hanksら（1988）が定義したセリン
／トレオニン特異性（ＬＫＰＥ）の特徴に合致しないが、ドメインVIIIのＧＳＰ
ＤＹＩＡＬＥというペプチドは、充分にセリン／トレオニン特異性を示し、Ａｔ
−ＤＢＦ２は、酵母ｄｂｆ２突然変異株と相補結合することができる（図１Ｂ）
。

【０１６４】 成熟したアラビドプシス属の植物体では、Ａｔ−ＤＢＦ２は、試験したすべて
の器官で発現された。転写体の最高の冗多性は、長角果で特定された。アラビド
プシス属、タバコ及びトマトのサザンブロット分析は、ＤＢＦ２が、植物で保存
されていると思われることを明らかにした（下記の実施例１３を参照されたい）
。ＡＴ−ＤＢＦ２が、ＬｉＣｌ耐性についてのスクリーニングで特定されたため
、他のストレス状況でのその効果を、酵母で試験した（図２）。

【０１６５】 実施例４．アラビドプシス属及びサッカロミセス・セレビシエSaccaromyces cer
evisiaeのＤＢＦ２の過剰発現は、酵母における寒冷、熱、塩及び乾燥耐性を増
強する この効果が、植物遺伝子に特異的であるか否かを試験するため、酵母DBF2遺伝
子を同じベクター中で過剰発現させた。液滴成長試験〔図２、及びLee et al.,
1999〕による。酵母における、浸透圧ストレス（ソルビトール）の間と、塩及び
寒冷処理の後とに、ストレス耐性の顕著な増強を４２℃で認めることができた。
植物又は酵母遺伝子が与えたストレス耐性の間には、全く差がなかった。Ａｔ−
ＤＢＦ２又はＤＢＦ２の過剰発現によるストレス耐性の増強は、ストレス状況で
のこれらの遺伝子についての役割を反映する。そのため、酵母及びアラビドプシ
ス属の植物を、ソルビトール及びＰＥＧで誘導した浸透圧ストレスに接触させた
。Ａｔ−ＤＢＦ２はもとよりＤＢＦ２も、浸透圧ストレスの際に急速に（１〜２
時間）、かつ一時的に誘導された（図３Ａ）。図３Ａで認められた最高の誘導に
相当する時間後の、アラビドプシス属植物及び酵母細胞におけるその他の環境ス
トレスの際に、Ａｔ−ＤＢＦ２及びＤＢＦ２の発現を解析した（図３Ｂ）。酵母
と同様に植物でも、高熱、塩、浸透圧の後、及びより少ない程度に寒冷の後に、
明確な誘導が存在し、それは、過剰発現が耐性を増強する対象となるストレスと
完全に相関した。しかし、多くの遺伝子は、転写後の機序がその後の翻訳を阻害
するため、とりわけて関連する適応の役割なしに誘導された。ここで、Ａｔ−Ｄ
ＢＦ２タンパク質の量は、抗Ｄｂｆ２抗体によって検出した限り、ストレスの際
に明確に増大した（図３Ｃ）。

【０１６６】 実施例５．Ａｔ−ＤＢＦ２及びＤＢＦ２は、ともに、hog1突然変異を機能的に補
うことができる ストレスシグナリング経路間のあり得る相互作用を調べるため、塩感受性のｈ
ｏｇ１突然変異株をＡｔ−ＤＢＦ２及びＤＢＦ２で形質転換した。ＨＯＧ１とい
うＭＡＰキナーゼ経路は、酵母における転写の浸透圧誘導を調節する〔Schuller
et al., 1994〕。この突然変異株の浸透圧感受性は、Ａｔ−ＤＢＦ２及びＤＢ
Ｆ２の双方の過剰発現によって回復させることができる（図４）。

【０１６７】 実施例６．Ａｔ−ＤＢＦ２は、細胞周期で調節される ＤＢＦ２の発現は、ＤＮＡ合成阻害以外にも、核***に役割を果たす場合に、
ＣＣＲ４複合体との関連を通じて、細胞周期で調節される〔Komarnitsky et al.
, 1998；Johnston et al., 1990〕。この調節を植物で調べた。他の植物細胞系
に比して、最高レベルの培養同調が現在までに達成されている〔Shaul et al.,
1996；Reicheld et al., 1995〕、タバコＢＹ−２細胞を用いた。定常期の細胞
を、新鮮な培地に希釈し、アフィジコリン（Ｓ期の開始時に細胞を遮断する）で
２４時間処理し、次いで洗浄した。アフィジコリン遮断から解放した後の同調有
糸***の百分率は、約６５％であった（図５Ａ〜Ｂ）。プローブとしてのＡｔ−
ＤＢＦ２によるノーザンブロット分析で、１．６kbのタバコＤＢＦ２相同体（Ｔ
−ＤＢＦ２）を検出することができた。Ｔ−ＤＢＦ２の定常状態転写レベルは、
細胞周期の間明確に変動し、主にＳ期の間存在し、Ｇ２からＭ後期まで低下し、
それから、Ｓ期でのピークまで上昇した。Ｔ−ＤＢＦ２の発現は、ＣＹＣＢ１．
２（Ｇ２〜Ｍ期のマーカー）の前に明確に出現するが、Ｔ−ＤＢＦ２転写体がよ
り早期に減少するＳ／Ｇ２移行の際、及びＴ−ＤＢＦ２発現がより早期に増大す
るＭ／Ｇ１移行の際以外はＨ４（Ｓ期のマーカー）と平行する。細胞周期マーカ
ーのＣＹＣＢ１．２及びＨ４の使用は、Reicheldらに記載されている。

【０１６８】 撹乱されないＧ１及びＳ期を追跡するため、ＢＹ２の細胞懸濁を、二重遮断の
手順〔Nagata et al., 1992〕を用いて同調させた。アフィジコリン遮断からの
解放後、最初期の開始時にプロピザミドで細胞を４時間処理した。プロピザミド
遮断からの解放後の有糸***の百分率は、７５％より高かった。Ｔ−ＢＤＦ２は
、Ｍの後期までは検出できない発現、Ｇ１では急激な上昇、及びＳ中期でのピー
クを示して（図５Ｃ〜Ｄ）、定期的に発現され、図５Ａ〜Ｂの結果が確認された
。しかし、細胞周期における植物ＤＢＦ２についての機能は、このキナーゼ活性
の測定によってのみ想定されたにすぎない。酵母では、ＤＢＦ２転写体レベルは
、脱リン酸化によって生じるキナーゼ活性化と相関しない〔Toyn & Johnston, 1
994〕。細胞周期の調節におけるＤｂｆ２の正確な機能は、知られていない。本
質的な役割は、後期及び終期の間に提唱されている。ＤＮＡ合成の開始における
Ｄｂｆ２についての役割の証拠はあるが、Ｇ１での活性は、全く測定されなかっ
た。

【０１６９】 最近特定されたその他のタンパク質と同様に、Ｄｂｆ２は、酵母における主要
な細胞周期移行である、Ｍ／Ｇ１移行を制御する〔Aerne et al., 1998〕。Ｍ／
Ｇ１制御の関門の存在は、植物細胞で示唆されているが〔Hemmerlin & Bach 199
8〕、Ｇ１／Ｓ及びＧ２／Ｍに比してのその重要性は、調査されていない。

【０１７０】 酵母におけるＤＢＦ２の過剰発現は、細胞周期全体を通じてのキナーゼ活性を
招くが、それは、翻訳後失活の機序の飽和によると思われる〔Toyn & Johnston,
1994〕。機能的に保存されたＡｔ−ＤＢＦ２の過剰発現は、同じ効果を有する
可能性が最も高い。しかし、細胞周期の不適当な時期でのＤｂｆ２活性の存在は
、見かけ上は、その進行に影響しない。著しく対照的に、構成活性は、ストレス
耐性に対して顕著な効果を有する。ストレスの際にＡｔ−ＤＢＦ２又はＤＢＦ２
が果たす役割は、細胞***周期とは無関係である可能性が最も高い。Ａｔ−ＤＢ
Ｆ２発現は、すべての植物器官に存在し（冗多発現は、１〜２％の細胞のみが有
糸***活性を有するにすぎない、幹で観察される）、ストレスの際に急速に誘導
されることができる。しかし、細胞周期との関連は、除外されない。酵母では、
ＤＢＦ２又はＡｔ−ＤＢＦ２の過剰発現は、酵母細胞がストレスに特に敏感であ
る場合の、Ｇ１におけるキナーゼの過剰生産と相関している可能性がある。ほと
んどの植物細胞も、Ｇ１で遮断されると考えられるが、ストレス応答との関連性
は、僅かにしか知られていない。

【０１７１】 実施例７．タバコ細胞の形質転換、及び組換えＴ−ＤＮＡベクターの構築 ＢＹ２細胞を、記載されたとおり〔Shaul et al., 1996〕、ｐＢＩＮ−３５Ｓ
−Ａｔ−ＤＢＦ２又はｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＡＳＡｔ−ＤＢＦ２の組換えバイナリ
ーベクターを有する、アグロバクテリウム・ツメファシエンスAgrobacterium tu
mefaciensのＣ５８ｃ１Ｒｉｆ^R（ｐＧＶ２２６０）株〔Deblaere et al., 1985
〕によって安定的に形質転換した。ｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２は、ｇｆ
ｐリポーター遺伝子を有するＢａｍＨＩ−ＳａｃＩフラグメントが、ｐＹＸ−Ａ
ｔ−ＤＢＦ２からのＡｔ−ＤＢＦ２ ｃＤＮＡを有するＢａｍＨＩ−ＳａｃＩフ
ラグメントい置き換えられた、植物バイナリーベクターｐＢＩＮ ｍ−ｇｆｐ４
である。ｐ−Ｂｉｎ−３５Ｓ−ＣａＭＶｔｅｒは、そのＨｉｎｄIII−ＳａｃＩ
制限部位に、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５ＳＲＮＡプロモ
ーター及びターミネーターを有するｐＤＨ５１のＨｉｎｄIII-SacIフラグメント
がクローニングされた、植物バイナリーベクターｐＢＩＮ１９である。ｐＢＩＮ
−３５Ｓ−ＡＳＡｔ−ＤＢＦ２は、Ａｔ−ＤＢＦ２ ｃＤＮＡが、ＣａＭＶ３５
ＳＲＮＡプロモーターとターミネーターとの間で、ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ制限部
位に、ｐＹＸ−Ａｔ−ＤＢＦ２からアンチセンスの配向でクローニングされた、
ｐＢｉｎ−３５Ｓ−ＣａＭＶｔｅｒベクターである。より詳しくは、Lee ら（19
99）に記載されている。

【０１７２】 実施例８．植物細胞におけるＡｔ−ＤＢＦ２センス及びアンチセンスＲＮＡの過
剰発現 Ａｔ−ＤＢＦ２を過剰発現するトランスジェニック植物細胞を生成して、スト
レス耐性におけるこのタンパク質の役割をin plantaで試験した。タバコＢＹ２
細胞を、強い構成的ＣａＭＶ３５ＳＲＮＡによって作動されるＡｔ−ＤＢＦ２
ｃＤＮＡを有する、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによって安定的に形
質転換した。アンチセンスＡｔ−ＤＢＦ２ＲＮＡも、同じプロモーターの制御下
で過剰発現させた。対照系統は、タバコＢＹ２細胞をｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＣａＭ
Ｖｔｅｒで形質転換することによって得た。独立に得られたＡｔ−ＤＢＦ２を過
剰発現する三つのタバコトランスジェニック細胞系統を、高度な、類似するＡｔ
−ＤＢＦ２発現で選別し、更に解析した。検出できないタバコＤＢＦ２転写体レ
ベルを示した、アンチセンスＡｔ−ＤＢＦ２を過剰発現する、三つのタバコトラ
ンスジェニック細胞系統を選んだ。アンチセンスという方策によるＡｔ−ＤＢＦ
２の過剰発現と、内因性遺伝子のダウンレギュレーションとは、２週間後も成長
の有意差を招かなかった（図１２Ａ及び１２Ｂ）。対照的に、ＮａＣｌ、ＰＥＧ
誘導乾燥、寒冷又は高温による２週間の処理後は、成長の顕著な差が観察された
。Ａｔ−ＤＢＦ２を過剰発現したトランスジェニック系統は、対照系統より明確
に耐性であった。内因性ＤＢＦ２発現の阻害は、これらのストレスに対する、よ
り高い感受性と相関した。Ａｔ−ＤＢＦ２を過剰発現する植物細胞におけるスト
レス耐性の基盤を理解するため、ストレス誘導遺伝子の発現を、対照及びストレ
ス条件で追跡した（図１２Ｃ）。タバコｋｉｎ１及びＨＳＰ１７．６Ａ相同体は
、既に、対照条件でのＡｔ−ＤＢＦ２過剰発現タバコ細胞で、ストレス条件（Ｐ
ＥＧ誘導ストレス）の間に観察されたのに類似するレベルまで誘導されていて、
Ａｔ−ＤＢＦ２の過剰発現が、ストレスシグナルを模倣し得ることが示唆される
。

【０１７３】 実施例９．環境ストレスに対する耐性を与える遺伝子による、アラビドプシス属
の形質転換、及び組換えＴ−ＤＮＡベクターの構築 Clarke、Wei及びLindsey（1992）に記載されたとおり、アグロバクテリウム・
ツメファシエンスのｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａ
ｔ−ＨＳＰ１７．６Ａ、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ｃ７４の組換えバイナリーベ
クターを有するＣ５８Ｃ１ＲｉｆＲ（ｐＧＶ２２６０）株によって、アラビドプ
シス属を安定的に形質転換した。ｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ＨＳＰ１７．６Ａ組
換えバイナリーベクターは、下記のとおりに構成した：初めに、ｐＹＸ−ＨＳＰ
１７．６Ａ（組換えｐＹＸ２１２）中にＡｔ−ＨＳＰ１７．６Ａｃ ＤＮＡを含
むＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＹＥＳ２（Invitrogen）にクローニ
ングして、ｐＹＥＳ−ＨＳＰ１７．６Ａを得た。次いで、Ａｔ−ＨＳＰ１７．６
Ａ ｃＤＮＡを含むｐＹＥＳ−ＨＳＰ１７．６ＡのＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩフラグ
メントを、植物バイナリーベクターのｐＢＩＮｍ−ｇｆｐ４にクローニングし、
ここで、ｇｆｐ受容体遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩフラグメントを削除し
、Ａｔ−ＨＳＰ１７．６Ａ ｃＤＮＡと置き換えた。ＳａｃＩ及びＳｐｈＩが形
成した３′突出末端を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端化した。ｐＢ
ＩＮ−３５Ｓ−ｃ７４は、中間的なｐＹＥＳ−Ａｔｃ７４ベクターにより、ｐＢ
ＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ＨＳＰ１７．６Ａと類似の方策で構成した。初めに、Ａｔ
−ｃ７４ｃＤＮＡを、プライマーの５′ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＡＣ ＡＴＡ Ｃ
ＡＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ３′（配列番号１２２）及び５′ ＡＧＴ ＴＡＧ Ｃ
ＴＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ３′（配列番号）を用いたＰＣＲで増
幅し、次いで、ベクターｐＹＥＳ２に「平滑末端化しつつ」クローニングし、Ｎ
ｏｔＩ及びＢｓｔＸＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。そ
の後、ｐＹＥＳ−ｃ７４のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩフラグメントを、上記に説明し
たとおり、ｐＢＩＮ−ｇｆｐ４にクローニングした。

【０１７４】 実施例１０．植物細胞の環境ストレスに対する耐性 Ａｔ−ＤＢＦ２、Ａｔ−ＨＳＰ１７．６Ａ及びＡｔ−ｃ７４で形質転換したト
ランスジェニックアラビドプシス属系統の各々から、トランスジェニックカルス
を単離した。塩ストレスの際のこれらのトランスジェニックカルスの成長を、測
定し、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＣａＭＶｔｅｒで形質転換したトランスジェニックア
ラビドプシス属系統から誘導した、対照カルスと比較した。類似する生重量（５
０〜１００mg）のカルス小片（各トランスジェニック系統につき２５個）を、そ
れのために、２００mM ＮａＣｌを補ったカルス誘導培地〔Clarke et al., 1992
〕上で成長させた。２週間後、肉眼検査から、Ａｔ−ＤＢＦ２、Ａｔ−ＨＳＰ１
７．６Ａ又はＡｔ−ｃ７４で形質転換したトランスジェニックカルスが、ｐＢＩ
Ｎ−３５Ｓ−ＣａＭＶｔｅｒで形質転換した対照トランスジェニックカルスより
はるかに良好に見えることは明確であった。後者のカルスは、黄変し、死に始め
ていた。この所見を確かめるため、カルスの生重量を測定した。対照トランスジ
ェニックカルスと比較して、トランスジェニックカルスの生重量は、３系統のそ
れぞれについて、対照トランスジェニックカルスの生重量より少なくとも５倍多
かった。

【０１７５】 実施例１１．植物の環境ストレスに対する耐性 ｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ｃ７４又はｐ
ＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ＨＳＰ１７．６Ａで形質転換したトランスジェニックな
アラビドプシス属植物体からの種子を、カナマイシン（７５μg/ml）を補った固
体のＫ１培地に載せたナイロンフィルター〔Verbruggenら（1993）に記載のとお
り〕上にばら撒き播種した。各組換えｐＢＩＮバイナリーベクターに対して、少
なくとも５系統の無関係のトランスジェニック系統をストレス耐性について試験
した。これらの系統のそれぞれで、トランス遺伝子の過剰発現を、ノーザンハイ
ブリダイゼーションの実験で確認した。対照植物は、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＣａＭ
Ｖｔｅｒで形質転換したもの、及びｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＡＳ＋Ａｔ−ＤＢＦ２で
形質転換したトランスジェニック植物であった。播種の後、種子を４℃に一晩保
った（発芽を促進するため）。成長は、２２℃、湿度６０％、１６時間の明／８
時間の暗、７０μeinsteinで行なわせた。成長の９日後、フィルターを、２００
mM ＮａＣｌを補った液体のＫ１培地に移し、一晩インキュベーションした。フ
ィルターを固体のＫ１培地に移すことによって、植物を５〜６日回復させた。こ
れらの条件下で、対照トランスジェニック植物は、黄変し、その成長は、阻害さ
れ、結果的に死亡した。対照的に、Ａｔ−ＤＢＦ２、Ａｔ−ＨＳＰ１７．６Ａ又
はＡｔ−ｃ７４で形質転換したトランスジェニック系統は、非常に好成績で生存
した（図６及び１１）。

【０１７６】 環境ストレスに対する防護の範囲を更に評価するため、トランスジェニック植
物を浸透圧ストレスに接触させた。そのためには、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−Ｄ
ＢＦ２、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ｃ７４又はｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ＨＳＰ
１７．６Ａで形質転換したトランスジェニックアラビドプシス属植物体からの種
子を、カナマイシン（７５μg/ml）を補った固体のＫ１培地に載せたナイロンフ
ィルター〔Verbruggenら（1993）に記載のとおり〕上にばら撒き播種した。各組
換えｐＢＩＮバイナリーベクターに対して、少なくとも５系統の無関係のトラン
スジェニック系統をストレス耐性について試験した。これらの系統のそれぞれで
、トランス遺伝子の過剰発現を、ノーザンハイブリダイゼーションの実験で確認
した。対照植物は、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＣａＭＶｔｅｒで形質転換したもの、及
びｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＡＳＡｔ−ＤＢＦ２で形質転換したトランスジェニック植
物であった。播種の後、種子を４℃に終夜保った（発芽を促進するため）。成長
は、２２℃、湿度６０％、１６時間の明／８時間の暗、７０μeinsteinで行なわ
せた。成長の９日後、フィルターを、２０％ポリエチレングリコールを補った液
体のＫ１培地に移し、一晩インキュベーションした。フィルターを固体のＫ１培
地に移すことによって、植物を５〜６日回復させた。これらの条件下で、対照ト
ランスジェニック植物は、黄変し、その成長は、阻害され、結果的に死亡した。
対照的に、Ａｔ−ＤＢＦ２、Ａｔ−ＨＳＰ１７．６Ａ又はＡｔ−ｃ７４で形質転
換したトランスジェニック系統は、非常に好成績で生存した（図７及び１３）。
それらの成長は、ポリエチレングリコールなしの対照培地での成長に匹敵した。

【０１７７】 環境ストレスに対する防護の範囲を更に解析するため、トランスジェニック植
物を高温及び低温に接触させた。そのためには、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢ
Ｆ２又はｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ｃ７４で形質転換したトランスジェニックな
アラビドプシス属植物体からの種子を、カナマイシン（７５μg/ml）を補った固
体のＫ１培地に載せたナイロンフィルター〔Verbruggenら（1993）に記載のとお
り〕上にばら撒き播種した。各組換えｐＢＩＮバイナリーベクターに対して、少
なくとも５系統の無関係のトランスジェニック系統をストレス耐性について試験
した。これらの系統のそれぞれで、トランス遺伝子の過剰発現を、ノーザンハイ
ブリダイゼーションの実験で確認した。対照植物は、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＣａＭ
Ｖｔｅｒで形質転換したもの、及びｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＡＳＡｔ−ＤＢＦ２で形
質転換したトランスジェニック植物であった。播種の後、種子を４℃に終夜保っ
た（発芽を促進するため）。成長は、２２℃、湿度６０％、１６時間の明／８時
間の暗、７０μeinsteinで行なわせた。成長の９日後、高温ストレスによる実験
のため、植物を４８℃に２時間接触させた。低温による実験のためには、−７℃
まで徐々に低下する温度に、植物を接触させた。フィルターを固体のＫ１培地に
移すことによって、植物を５〜６日回復させた。

【０１７８】 低温及び高温双方のストレス下で、対照トランスジェニック植物の成長は阻害
され、結果的に、それらは死亡した。Ａｔ−ＤＢＦ２又はＡｔ−ｃ７４で形質転
換したトランスジェニック系統は、非常に好成績で生存した。それらの成長は、
正常温度による対照条件下での成長に匹敵した（図８及び９を参照されたい）。

【０１７９】 環境ストレスに対する防護の範囲を更に解析するため、トランスジェニック植
物を、発芽の際に塩ストレスに接触させた。ｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２
又はｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ｃ７４で形質転換したトランスジェニック植物体
からの滅菌した成熟種子を、０．８％寒天、及び３０g/lのショ糖とともにＭＳ
〔Murashige & Skoog〕培地を含むペトリ皿の上に載せた。対照植物は、ｐＢＩ
Ｎ−３５Ｓ−ＣａＭＶｔｅｒで形質転換したものであった。発芽、及びｐＨ５．
７の調整の前に、ＮａＣｌを、１２５mMの最終濃度まで加えた。１皿あたり平均
４０〜５０粒の種子を有するこれらのペトリ皿３枚を、各実験での処理ごとに用
いた。完全な実験は、２回反復した。２２℃での種子の発芽を追跡した。種子は
、緑色の根子葉の出現が生じた後に、発芽すると思われた。

【０１８０】 対照培地（１２５mM ＮａＣｌなし）では、すべてのトランスジェニック系統
の発芽は、互いに、及び野生型植物に非常に類似した。１２５mM ＮａＣｌを補
った培地では、Ａｔ−ＤＢＦ２又はＡｔ−ｃ７４を過剰発現するトランスジェニ
ック系統からの種子は、対照トランスジェニック系統より有意に好成績で発芽し
た。ｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＣａＭＶｔｅｒで形質転換したトランスジェニック系統
からの種子の１０％未満が、これらの条件下で発芽した。対照的に、Ａｔ−ＤＢ
Ｆ２又はＡｔ−ｃ７４を過剰発現するトランスジェニック系統からの種子の７０
％より多くが、１２５mM ＮａＣｌを含む培地で発芽した。

【０１８１】 実施例１２．他の植物におけるＡｔ−ＤＢＦ２遺伝子のサザンハイブリダイゼー
ション ＤＢＦ２相同体が他の植物種にも存在するか否かを調べるために、完全長Ａｔ
−ＤＢＦ２をプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーション解析を実施
した。ゲノムＤＮＡを、Dellaportaら（1983）に従ってタバコ、トマト及びイネ
から抽出し、フェノール：クロロホルム抽出によって更に精製した。ＤＮＡ（１
０μg）を、制限酵素で消化し、ＨｉｎｄIIIで消化したラムダＤＮＡを分子サイ
ズ標準として用いて、１％（w/v）アガロースゲルで分離した。ＤＮＡは、０．
４規定のＮａＯＨ中で、ナイロン膜（Hybond N; Amersham, Little Chalfont、
英国）に形質転換した。フィルターを、３０秒間ＵＶ架橋結合させ、ハイブリダ
イゼーション液（２ｘ ＳＳＰＥ、０．１％（w/v）ＳＤＳ、５ｘデンハート液）
中で、２００g/m³のサケ***変性ＤＮＡを用いて、５６℃で３時間プレハイブリ
ダイズさせ、放射線標識下プローブと終夜ハイブリダイズさせた。１Ｘ ＳＳＰ
Ｅは、０．１５M ＮａＣｌ／０．０１Mリン酸二水素ナトリウム／１mM ＥＤＴＡ
である。

【０１８２】 フィルターを、５６℃で、２ｘ ＳＳＰＥ、０．１％（w/v）ＳＤＳ中で２０分
間、次いで、１ｘ ＳＳＰＥ、０．１％（w/v）ＳＤＳ中で２０分間、最後に０．
１ｘ ＳＳＰＥ、０．１％（w/v）ＳＤＳ中で２０分間、洗浄した。フィルターを
、補力スクリーンの存在下で、２４時間Ｘ線フィルム（Kodak X-AR; Kodak, NY
、米国）に露出させた。

【０１８３】 ハイブリダイゼーション実験の結果は、タバコ、トマト及びイネは、Ａｔ−Ｄ
ＢＦ２との少なくとも１種類の相同体を有することを示す。

【０１８４】

【表１】

【０１８５】

【表２】

【０１８６】

【表３】

【０１８７】

【表４】

【０１８８】

【表５】

【０１８９】

【表６】

【０１９０】 参考文献 Adams et al. (1983), J. Am. Chem. Soc. 105:661 Aerne et al. (1998). Molecular Biology of the Celi, vol 9, 945-956. Bray et al. (1997), Plant responses to water deficit. Trends Plant Sci 2
, 48-54 Carruthers et al. (1982), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-4
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【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 Ａｔ−ＤＢＦ２が、酵母Ｄｂｆ２の機能的相同体をコードしていること示す図
である。（Ａ）は、Ａｔ−ＤＢＦ２の推定されるアミノ酸配列と、酵母ＤＢＦ２
のそれとの比較を示し、整列を最適化するために、間隙を導入した。Ａｔ−ＤＢ
Ｆ２配列の上のローマ数字は、Hanksら（1988）によって定義された、タンパク
質キナーゼ触媒性サブドメインを示す。（Ｂ）は、ｄｂｆ２の補完を示す。ｄｂ
ｆ２突然変異体のＳ７−４Ａ〔ＭＡＴａ ｄｂｆ２Δ：：ＵＲＡ３ ｕｒａ３ ｌ
ｅｕ２ ａｄｅ５ ｔｒｐ１ ｈｉｓ７；Toyn & Johnston, 1994〕（Ｂ１）は、制
限温度（３７℃）で膨潤した対の娘細胞（ダンベル）を形成する。ｄｂｆ２の欠
陥のある形態学は、Ａｔ−ＤＢＦ２ｃＤＮＡ（Ｂ２）またはＤＢＦ２（Ｂ３）；
野生型〔ＣＧ３７８株、ＭＡＴ１ ａｄｅ５ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３〕（Ｂ
４）を有するｐＹＸ１１２動原体プラスミド（Ingenius, R&D system）での形質
転換によって補完することができる。対数期培養物を２８℃から３７℃に写し、
１６時間後に写真撮影した。１６時間後には、Ｓ７−４Ａ細胞の９７％がダンベ
ルの形態学で捕捉された（Ｂ１）のに対し、Ｂ１、Ｂ３及びＢ４では、６．１及
び０％のダンベルが観察された。菌株は、Dr. Lindl（Max Planck Institut fue
r Zuchtungsforschung, Koeln、ドイツ国）の好意によって提供された。

【図１Ｂ】 Ａｔ−ＤＢＦ２が、酵母Ｄｂｆ２の機能的相同体をコードしていること示す図
である。（Ａ）は、Ａｔ−ＤＢＦ２の推定されるアミノ酸配列と、酵母ＤＢＦ２
のそれとの比較を示し、整列を最適化するために、間隙を導入した。Ａｔ−ＤＢ
Ｆ２配列の上のローマ数字は、Hanksら（1988）によって定義された、タンパク
質キナーゼ触媒性サブドメインを示す。（Ｂ）は、ｄｂｆ２の補完を示す。ｄｂ
ｆ２突然変異体のＳ７−４Ａ〔ＭＡＴａ ｄｂｆ２Δ：：ＵＲＡ３ ｕｒａ３ ｌ
ｅｕ２ ａｄｅ５ ｔｒｐ１ ｈｉｓ７；Toyn & Johnston, 1994〕（Ｂ１）は、制
限温度（３７℃）で膨潤した対の娘細胞（ダンベル）を形成する。ｄｂｆ２の欠
陥のある形態学は、Ａｔ−ＤＢＦ２ｃＤＮＡ（Ｂ２）またはＤＢＦ２（Ｂ３）；
野生型〔ＣＧ３７８株、ＭＡＴ１ ａｄｅ５ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３〕（Ｂ
４）を有するｐＹＸ１１２動原体プラスミド（Ingenius, R&D system）での形質
転換によって補完することができる。対数期培養物を２８℃から３７℃に写し、
１６時間後に写真撮影した。１６時間後には、Ｓ７−４Ａ細胞の９７％がダンベ
ルの形態学で捕捉された（Ｂ１）のに対し、Ｂ１、Ｂ３及びＢ４では、６．１及
び０％のダンベルが観察された。菌株は、Dr. Lindl（Max Planck Institut fue
r Zuchtungsforschung, Koeln、ドイツ国）の好意によって提供された。

【図２】 ＤＢＦ２又はＡｔ−ＤＢＦ２の過剰発現が、浸透圧、塩、熱及び寒冷ストレス
に対する耐性を増強することを示す図である。酵母細胞をＹＰＤ中で増殖させ、
細胞密度を２でＯＤ₆₀₀に調整した。（１）ＤＹ、（２）ＤＢＦ２、ｐＹＸ−Ｙ
ＤＢＦ２を含むｐＹＸ２１２で形質転換したＤＹ、（３）ベクターのみでか、又
は（４）Ａｔ−ＤＢＦ２、ｐＹＸ−ＡｔＤＢＦ２を含むベクターで形質転換した
ＤＹ株を用いた。連続希釈は、１：１０の段階で実施。各希釈１０μlを２Mのソ
ルビトール（浸透圧ストレス）、又は１．２MのＮａＣｌ（塩ストレス）、又は
Ｈ₂Ｏ₂（酸化ストレス）を補った固体ＹＰＤ培地（対照）にスポットし、２８℃
又は４２℃（高熱ストレス）又は４℃（寒冷ストレス）で３日間温置した。

【図３】 ＤＢＦ２及びＡｔ−ＤＢＦ２をストレスによって誘導した結果を示す。（ａ）
示された時間、２０％ＰＥＧ６０００で処理した植物におけるＡｔ−ＤＢＦ２誘
導の動態、及び２Mのソルビトールで処理した酵母におけるＤＢＦ２のそれを示
すノーザン分析。（ｂ）対照条件〔Verbruggenら（1993）に記載のとおり〕で（
１）、３７℃で（２）、２０％ＰＥＤ６０００とともに（３）、１％ ＮａＣｌ
とともに（４）、４℃で（５）、又は０．４mM Ｈ₂Ｏ₂とともに（６）、５時間
成長させた１０日齢の植物におけるＡｔ−ＤＢＦ２のノーザン分析；及びＹＰＤ
中で（１）、３７℃で（２）、２Mソルビトールとともに（３）、１．２M Ｎａ
Ｃｌとともに（４）、４℃で（５）、又は０．４mM Ｈ₂Ｏ₂とともに（６）、１
１／２時間増殖させた酵母細胞におけるＤＢＦ２のそれを示す。負荷の対照は、
ＥｔＢｒ染色で実施し、各ノーザン分析の下に示す。（ｃ）は、アラビドプシス
属におけるＡｔ−ＤＢＦ２のウエスタン分析である。サンプルは、（ｂ）で分析
したのと類似する。用いた抗体は、酵母Ｄｂｆ２に対して形成させ、Dr. Leindl
（Max Planck Institut fuer Zuchtungsforschung, Koeln、ドイツ国）の好意に
よって提供された。

【図４】 ＤＢＦ２の過剰発現は、ｈｏｇ１の浸透圧感受性を抑制できることを示す。ｈ
ｏｇ１突然変異株（４）〔Ｗ３０３−１Ａ，ＭＡＴａ，ｈｏｇ１Δ：：ＴＲＰ１
〕及び野生型（Ｗ３０３）は、Dr. Thevelein（Katholieke Universiteit, Leuv
en、ベルギー国）の好意によって提供された。hog1突然変異株を、ｐＹＸ−ＹＤ
ＢＦ２（２）又はｐＹＸ−ＡｔＤＢＦ２（３）で形質転換した。４株を、それぞ
れ、ＹＰＤ（富裕培地）中で１６時間成長させ、細胞密度を２でＯＤ₆₀₀に調整
した。連続希釈は、１：１０で、連続する５段階で実施。各希釈１０μlを、固
体ＹＰＤ培地（対照）、又は０．９M ＮａＣｌを補った固体ＹＰＤ培地にスポッ
トし、２８℃で３日間温置した。

【図５】 Ｔ−ＤＢＦ２（タバコNicotiana tabacumのＤＢＦ２）を、植物細胞周期の間
に定期的に発現させた。タバコＤＢＦ２の発現は、Ａｔ−ＤＢＦ２をプローブと
して用い、アフィジコリン（ａ及びｂ）又はプウロピザミド（ｃ及びｄ）で同調
させたＢＹ２細胞について追跡。ＤＮＡ合成、及び有糸***指数の相対速度の測
定、細胞周期マーカーＣＹＣＢ１．２及びＨ４マーカーの使用は、以前に記載さ
れている〔Reicheld et al., 1995〕。Ｔ−ＤＢＦ２転写体レベルは、PhosphorI
mager（Molecular Dynamics）を用いて、ｂ及びｃに示されたブロットから定量
した。

【図６】 下記の構築物：すなわち、Ｐ３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２（左上及び右下の区画）
、Ｐ３５Ｓの対照（右上の区画）、及びＰ３５Ｓ−アンチセンスＡｔ−ＤＢＦ２
（左下の区画）で形質転換したシロイヌナズナの植物体の、終夜の２００mM Ｎ
ａＣｌの塩ストレスを与えた際の成長の比較の結果を示す。

【図７】 下記の構築物：すなわち、Ｐ３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２（左上及び右下の区画）
、Ｐ３５Ｓの対照（右上の区画）、及びＰ３５Ｓ−アンチセンスＡｔ−ＤＢＦ２
（左下の区画）で形質転換したシロイヌナズナの植物体の、終夜の２０％ＰＥＧ
によって誘導した、浸透圧ストレスを与えた際の成長の比較の結果を示す。

【図８】 下記の構築物：すなわち、Ｐ３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２（左上及び右下の区画）
、Ｐ３５Ｓの対照（右上の区画）、及びＰ３５Ｓ−アンチセンスＡｔ−ＤＢＦ２
（左下の区画）で形質転換したシロイヌナズナの植物体の、温度を７℃まで徐々
に降下させることによって寒冷ストレスを与えた際の成長の比較の結果を示す。

【図９】 下記の構築物：すなわち、Ｐ３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２（左上及び右下の区画）
、Ｐ３５Ｓの対照（右上の区画）、及びＰ３５Ｓ−アンチセンスＡｔ−ＤＢＦ２
（左下の区画）で形質転換したシロイヌナズナの植物体の、４８℃で２時間の高
熱ストレスを与えた際の成長の比較の結果を示す。

【図１０】 下記の構築物：すなわち、Ｐ３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２（左上及び右下の区画）
、Ｐ３５Ｓの対照（右上の区画）、及びＰ３５Ｓ−アンチセンスＡｔ−ＤＢＦ２
（左下の区画）で形質転換したシロイヌナズナの植物体の成長の比較の結果を示
す。Ｐ３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２で形質転換した植物は、対照トランスジェニック
植物に比して、形態学的異常を示さないと結論付けることができる。

【図１１】 ＨＳＰ１７．６Ａ（Ａ）又はｃ７４（Ｂ）を過剰発現するトランスジェニック
シロイヌナズナでの、塩ストレス耐性試験の結果を示す。対照植物（Ａ及びＢの
左下）は、ｐＢｉｎ−３５Ｓ−ＣａＭＶｔｅｒで形質転換したトランスジェニッ
ク系統である。Ａのその他の区画は、ＨＳＰ １７．６Ａを過剰発現する５系統
の無関係に得られたトランスジェニック系統である。Ｂのその他の区画は、ｃ７
４を過剰発現する５系統の無関係に得られたトランスジェニック系統である。

【図１２Ａ】 ストレス耐性に対するセンス及びアンチセンス配向でのＡｔ−ＤＢＦ２発現の
影響を示す。ＢＹ２細胞を、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡプロモーターによって作動
されるＡｔ−ＤＢＦ２を有する組換えＴ−ＤＮＡベクターである、ｐＢＩＮ−３
５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２（Ａの上左及び右の区画、又はＢの菱形）、ＣａＭＶの３
５Ｓプロモーター及びターミネーターである、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＣａＭＶｔｅ
ｒ（Ａの下左の区画、又はＢの三角形）、又はＣａＭＶの３５Ｓプロモーターｐ
ＢＩＮ−３５Ｓ−ＡＳＡｔ−ＤＢＦ２の制御下にあるアンチセンスＡｔ−ＤＢＦ
２（Ａの下右の区画、又はＢの円形）で、シロイヌナズナによって形質転換した
。（Ａ）３００mM ＮａＣｌ、２５％ＰＥＧ、２mM Ｈ₂Ｏ₂を補ったか、又は４７
℃での（高熱）固体培地での成長の３週間後の、同じ量のトランスジェニック細
胞の様態。（Ｂ）液体培地中の懸濁細胞の増殖。ストレスに際しては、増殖を、
生重量として測定し、ストレスを受けない増殖（対照）（ａ）の百分率として表
わした。ストレスは、継代した後に（＝０日目）、示された温度（ｅ）、及びＮ
ａＣｌ（ｂ）、ＰＥＧ（ｃ）、及びＨ₂Ｏ₂（ｆ）の濃度で加えた。寒冷ショック
（ｄ）については、細胞を、０℃で２日間保ってから、２２℃で２週間培養した
。各構築物について、３系統の無関係のトランスジェニック系統のデータを蓄え
た。図面に過大な負担を与えないため、標準偏差は示さなかった（最大値：測定
値の１５％）。（Ｃ）Ａｔ−ＤＢＦ２＋ＴＤＢＦ２、ｋｉｎ１及びＨＳＰ１７．
６。ｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２（１）及び（２）、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−
ＣａＭＶｔｅｒ（３）、及びｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＡＳＡｔ−ＤＢＦ２（４）で形
質転換した無関係の系統から、全ＲＮＡを抽出した。浸透圧ストレスは、１０％
ＰＥＧの５時間の処理で誘導した（stressed）。

【図１２Ｂ】 ストレス耐性に対するセンス及びアンチセンス配向でのＡｔ−ＤＢＦ２発現の
影響を示す。ＢＹ２細胞を、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡプロモーターによって作動
されるＡｔ−ＤＢＦ２を有する組換えＴ−ＤＮＡベクターである、ｐＢＩＮ−３
５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２（Ａの上左及び右の区画、又はＢの菱形）、ＣａＭＶの３
５Ｓプロモーター及びターミネーターである、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＣａＭＶｔｅ
ｒ（Ａの下左の区画、又はＢの三角形）、又はＣａＭＶの３５Ｓプロモーターｐ
ＢＩＮ−３５Ｓ−ＡＳＡｔ−ＤＢＦ２の制御下にあるアンチセンスＡｔ−ＤＢＦ
２（Ａの下右の区画、又はＢの円形）で、シロイヌナズナによって形質転換した
。（Ａ）３００mM ＮａＣｌ、２５％ＰＥＧ、２mM Ｈ₂Ｏ₂を補ったか、又は４７
℃での（高熱）固体培地での成長の３週間後の、同じ量のトランスジェニック細
胞の様態。（Ｂ）液体培地中の懸濁細胞の増殖。ストレスに際しては、増殖を、
生重量として測定し、ストレスを受けない増殖（対照）（ａ）の百分率として表
わした。ストレスは、継代した後に（＝０日目）、示された温度（ｅ）、及びＮ
ａＣｌ（ｂ）、ＰＥＧ（ｃ）、及びＨ₂Ｏ₂（ｆ）の濃度で加えた。寒冷ショック
（ｄ）については、細胞を、０℃で２日間保ってから、２２℃で２週間培養した
。各構築物について、３系統の無関係のトランスジェニック系統のデータを蓄え
た。図面に過大な負担を与えないため、標準偏差は示さなかった（最大値：測定
値の１５％）。（Ｃ）Ａｔ−ＤＢＦ２＋ＴＤＢＦ２、ｋｉｎ１及びＨＳＰ１７．
６。ｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２（１）及び（２）、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−
ＣａＭＶｔｅｒ（３）、及びｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＡＳＡｔ−ＤＢＦ２（４）で形
質転換した無関係の系統から、全ＲＮＡを抽出した。浸透圧ストレスは、１０％
ＰＥＧの５時間の処理で誘導した（stressed）。

【図１２Ｃ】 ストレス耐性に対するセンス及びアンチセンス配向でのＡｔ−ＤＢＦ２発現の
影響を示す。ＢＹ２細胞を、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡプロモーターによって作動
されるＡｔ−ＤＢＦ２を有する組換えＴ−ＤＮＡベクターである、ｐＢＩＮ−３
５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２（Ａの上左及び右の区画、又はＢの菱形）、ＣａＭＶの３
５Ｓプロモーター及びターミネーターである、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＣａＭＶｔｅ
ｒ（Ａの下左の区画、又はＢの三角形）、又はＣａＭＶの３５Ｓプロモーターｐ
ＢＩＮ−３５Ｓ−ＡＳＡｔ−ＤＢＦ２の制御下にあるアンチセンスＡｔ−ＤＢＦ
２（Ａの下右の区画、又はＢの円形）で、シロイヌナズナによって形質転換した
。（Ａ）３００mM ＮａＣｌ、２５％ＰＥＧ、２mM Ｈ₂Ｏ₂を補ったか、又は４７
℃での（高熱）固体培地での成長の３週間後の、同じ量のトランスジェニック細
胞の様態。（Ｂ）液体培地中の懸濁細胞の増殖。ストレスに際しては、増殖を、
生重量として測定し、ストレスを受けない増殖（対照）（ａ）の百分率として表
わした。ストレスは、継代した後に（＝０日目）、示された温度（ｅ）、及びＮ
ａＣｌ（ｂ）、ＰＥＧ（ｃ）、及びＨ₂Ｏ₂（ｆ）の濃度で加えた。寒冷ショック
（ｄ）については、細胞を、０℃で２日間保ってから、２２℃で２週間培養した
。各構築物について、３系統の無関係のトランスジェニック系統のデータを蓄え
た。図面に過大な負担を与えないため、標準偏差は示さなかった（最大値：測定
値の１５％）。（Ｃ）Ａｔ−ＤＢＦ２＋ＴＤＢＦ２、ｋｉｎ１及びＨＳＰ１７．
６。ｐＢＩＮ−３５Ｓ−Ａｔ−ＤＢＦ２（１）及び（２）、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−
ＣａＭＶｔｅｒ（３）、及びｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＡＳＡｔ−ＤＢＦ２（４）で形
質転換した無関係の系統から、全ＲＮＡを抽出した。浸透圧ストレスは、１０％
ＰＥＧの５時間の処理で誘導した（stressed）。

【図１３】 ｐ３５Ｓ−ＡｔＨＳＰ１７．６Ａ、及びＰ３５Ｓの対照（上右の区画）で形質
転換したシロイヌナズナの、終夜の２０％ＰＥＧによって誘導した浸透圧ストレ
スを加えた際の成長の結果を示す。二つの無関係の実験の結果を示し、それぞれ
は、At-HSP17.6Aを過剰発現する無関係に得られた３系統のトランスジェニック
系統で実施した（上左、並びに下左及び右）。

【図１４】 ｐ３５Ｓ−Ａｔｃ７４及びＰ３５Ｓの対照（下の区画）で形質転換したシロイ
ヌナズナの、１２５mM ＮａＣｌを補った無機培地での発芽の結果を示す。二つ
の無関係の実験の結果を示し、それぞれは、Ａｔｃ７４を過剰発現する無関係に
得られた２系統のトランスジェニック系統で実施した（上二つの区画）。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年６月１日（２００１．６．１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AB03 AD04 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD13 CD17 4B024 AA08 BA80 CA04 CA12 DA01 DA12 4B050 CC03 DD09 LL05 4B065 AA72X AA88X AA88Y AB01 BA01 CA24 CA29 CA53 4H045 AA10 AA30 BA10 CA30 EA05 FA74

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 植物の環境ストレスに関与するコーディング配列及び／又は
   遺伝子を含むポリ核酸を得る方法であって、コーディング配列を含むｃＤＮＡラ
   イブラリーを長角果から調製し、該コーディング配列を酵母細胞に機能的な形式
   で導入し、環境ストレス条件に対する耐性又は抵抗性の増強へと導く、該形質転
   換された酵母細胞内のポリ核酸についてスクリーニングすることを含む、ポリ核
   酸を得る方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の方法によって得られる単離されたポリ核酸。
3. 【請求項３】 表１に列挙されたとおりのポリペプチドをコードする、請求
   項２記載の単離されたポリ核酸。
4. 【請求項４】 （ａ）配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、
   １９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、
   ４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、
   ６７、６９、７１、７３、７５、７７若しくは１２１のいずれか１つ、又はその
   相補鎖； （ｂ）（ａ）に定義された配列、又はそのフラグメントとハイブリダイズする
   ポリ核酸配列； （ｃ）遺伝暗号の結果として（ａ）又は（ｂ）に定義されたポリ核酸配列に縮
   重されるポリ核酸配列；或いは （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリ核酸にコードされるタンパク質のフラ
   グメントをコードしているポリ核酸配列 から選ばれる請求項３記載の単離されたポリ核酸。
5. 【請求項５】 酵母ＤＢＦ２キナーゼの植物相同体をコードしている請求項
   ２〜４のいずれかに記載の単離ポリ核酸。
6. 【請求項６】 （ａ）配列番号１、若しくはその相補鎖； （ｂ）（ａ）に定義された配列、若しくはそのフラグメントとハイブリダイズ
   する、ポリ核酸配列； （ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）に定義されたポリ核酸配列に対する遺伝暗号の結
   果として縮重されたポリ核酸配列；又は （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリ核酸によってコードされるタンパク質
   のフラグメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される請求項５記載の単離ポリ核酸。
7. 【請求項７】 環境ストレス条件に対する増強された耐性又は抵抗性を有す
   るトランスジェニック植物を生産するための、ＨＳＰ １７．６Ａタンパク質を
   コードしている請求項２又は３記載の単離ポリ核酸の使用。
8. 【請求項８】 ポリ核酸が （ａ）配列番号３、若しくはその相補鎖； （ｂ）（ａ）に定義された配列、若しくはそのフラグメントとハイブリダイズ
   するポリ核酸配列； （ｃ）遺伝暗号の結果として（ａ）若しくは（ｂ）に定義されたポリ核酸配列
   に縮重されるポリ核酸配列；又は （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリ核酸にコードされるタンパク質のフラ
   グメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される、それによりコードされるタンパク質の植物細胞における発現の
   ための、請求項７記載の単離ポリ核酸の使用。
9. 【請求項９】 環境ストレス条件に対する増強された耐性又は抵抗性を有す
   るトランスジェニック植物を生産するための、 （ａ）配列番号７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９
   ７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５
   、１１７若しくは１１９、又はその相補鎖； （ｂ）（ａ）に定義された配列又はそのフラグメントとハイブリダイズするポ
   リ核酸配列； （ｃ）遺伝暗号の結果として（ａ）又は（ｂ）に定義されたポリ核酸配列に縮
   重されるポリ核酸配列；或いは （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリ核酸にコードされるタンパク質のフラ
   グメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される、上記に定義された単離ポリ核酸の使用。
10. 【請求項１０】 （ａ）配列番号５、若しくはその相補鎖； （ｂ）（ａ）に定義された配列、若しくはそのフラグメントとハイブリダイズ
    するポリ核酸配列； （ｃ）遺伝暗号の結果として（ａ）若しくは（ｂ）に定義されたポリ核酸配列
    に縮重されるポリ核酸配列；又は （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリ核酸にコードされるタンパク質のフラ
    グメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される、ｃ７４タンパク質をコードする、請求項２〜４のいずれかに記
    載の単離ポリ核酸。
11. 【請求項１１】 請求項２〜１０のいずれか１項に記載若しくは定義された
    ポリ核酸にコードされる、単離されたポリペプチド、又はその機能性フラグメン
    ト。
12. 【請求項１２】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
    、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２
    、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６
    、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０
    、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０
    、１１２、１１４、１１６、１１８又は１２０のいずれかの配列の少なくとも一
    部を有する、請求項１１記載の単離ポリペプチド。
13. 【請求項１３】 環境ストレスに対する増強された耐性又は抵抗性を有する
    植物を生産する方法であって、請求項２〜１０のいずれか１項に記載又は定義さ
    れたポリ核酸を含む組換えＤＮＡを、環境ストレスに対する増強された耐性又は
    抵抗性を付与するのに充分な量で発現する植物細胞に、一時的に導入することを
    含む方法。
14. 【請求項１４】 環境ストレスに対する増強された耐性又は抵抗性を有する
    植物を生産する方法であって、請求項２〜１０のいずれか１項に記載又は定義さ
    れたポリ核酸を含む組換えＤＮＡを、環境ストレスに対する増強された耐性又は
    抵抗性を付与するのに充分な量で発現する植物細胞に、安定的に導入することを
    含む方法。
15. 【請求項１５】 植物ＤＢＦ２キナーゼをコードしている請求項５又は６記
    載のポリ核酸を該植物に導入することを含む、環境ストレスに対する増強された
    耐性又は抵抗性を有する植物を生産するための、請求項１３又は１４記載の方法
    。
16. 【請求項１６】 ＨＳＰ １７．６Ａタンパク質をコードしている請求項７
    又は８記載のポリ核酸を該植物に導入することを含む、環境ストレスに対する増
    強された耐性又は抵抗性を有する植物を生産するための、請求項１６記載の方法
    。
17. 【請求項１７】 ｃ７４タンパク質をコードしている請求項１０記載のポリ
    核酸を該植物に導入することを含む、環境ストレスに対する増強された耐性又は
    抵抗性を有する植物を生産するための、請求項１３又は１４記載の方法。
18. 【請求項１８】 １種類以上の組換えＤＮＡ分子を植物細胞のゲノムに導入
    することを含み、該組換えＤＮＡ分子が、 請求項２〜１０のいずれか１項に記載又は定義されたポリ核酸と、 植物発現可能プロモーターであって、それによって、該ポリ核酸が、同じ転写
    単位内になり、かつ該植物発現可能プロモーターの制御下になる植物発現可能プ
    ロモーター を含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 【請求項１９】 環境ストレスに対する増強された耐性又は抵抗性を有する
    植物を生産する方法であって、１種類以上の組換えＤＮＡ分子を植物細胞のゲノ
    ムに導入することを含み、該組換えＤＮＡ分子が、 該植物細胞内で有効量で発現されたときに、請求項２〜１０のいずれか１項に
    記載又は定義された、内因性ポリ核酸の発現を間接的に増大させるか、若しくは
    誘導するか、又は請求項１１若しくは１２のポリペプチドの活性を間接的に高め
    るか又は誘導するタンパク質をコードしているＤＮＡと、 植物発現可能プロモーターであって、それによって、該ＤＮＡが、同じ転写単
    位内になり、かつ該植物発現可能プロモーターの制御下になる植物発現可能プロ
    モーター を含む方法。
20. 【請求項２０】 該ＤＮＡが、請求項２〜１０のいずれか１項に記載又は定
    義された該内因性ポリ核酸配列の発現を増大させるか、若しくは誘導することが
    できるセンス若しくはアンチセンスＲＮＡ分子、又はリボザイムをコードする、
    請求項１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 請求項２〜１０のいずれか１項に記載又は定義されたポリ
    核酸と、植物発現可能プロモーターであって、それによって、該ポリ核酸が、同
    じ転写単位内になり、かつ該植物発現可能プロモーターの制御下になる植物発現
    可能プロモーターとを含む、組換えポリ核酸。
22. 【請求項２２】 （ａ）植物細胞内で発現されたときに、請求項２〜１０の
    いずれか１項に記載又は定義された、内因性ポリ核酸の発現を高めるか、若しく
    は誘導するか、或いは請求項１１又は１２のポリペプチドの活性を上昇させるか
    、若しくは誘導するタンパク質をコードしているＤＮＡと、 （ｂ）植物発現可能プロモーターであって、それによって、該ＤＮＡが、同じ
    転写単位内になり、かつ該植物発現可能プロモーターの制御下になる植物発現可
    能プロモーターとを含む、組換えポリ核酸。
23. 【請求項２３】 該ＤＮＡが、植物細胞内で有効量で発現されたときに、請
    求項２〜１０のいずれか１項に記載又は定義された内因性ポリ核酸の発現を増大
    させるか、若しくは誘導するか、又は請求項１１若しくは１２のタンパク質の活
    性を誘導するか、若しくは高める、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム若しくはセ
    ンスＲＮＡをコードしている請求項２２記載の組換えポリ核酸。
24. 【請求項２４】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、
    １９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、
    ４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、
    ６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、
    ９０、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０
    ９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９若しくは１２１のいずれかのヌク
    レオチド配列の少なくとも一部を含む請求項２１記載の組換えポリ核酸、又はそ
    の一部。
25. 【請求項２５】 表１に列挙されたタンパク質をコードしている遺伝子のコ
    ーディング配列の少なくとも一部を含む請求項２１〜２４のいずれかに記載の組
    換えポリ核酸。
26. 【請求項２６】 該植物発現可能プロモーターが、構成プロモーターである
    請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の組換えポリ核酸。
27. 【請求項２７】 該植物発現可能プロモーターが、ストレス誘導性、又は器
    官若しくは組織特異的プロモーターである、請求項２１〜２５のいずれか１項に
    記載された組換えポリ核酸。
28. 【請求項２８】 該植物発現可能プロモーターが、ＣａＭＶの３５Ｓプロモ
    ーターである請求項２１〜２６のいずれか１項に記載された組換えポリ核酸。
29. 【請求項２９】 請求項２〜１０のいずれか１項に記載又は定義された少な
    くとも１種類の単離されたポリ核酸で形質転換された組換え宿主細胞。
30. 【請求項３０】 請求項２１〜２８のいずれか一項に記載された組換えポリ
    核酸で形質転換された植物細胞。
31. 【請求項３１】 本質的に請求項３０記載の植物細胞からなる植物。
32. 【請求項３２】 本質的に請求項３０記載の植物細胞からなるカルス。
33. 【請求項３３】 該組換えＤＮＡを含む、請求項３１記載の植物の収穫でき
    る部分、器官、組織、又は増殖材料。
34. 【請求項３４】 トランスジェニック植物を生産するための、請求項２１〜
    ２８のいずれか１項に記載の組換えポリ核酸の使用。
35. 【請求項３５】 請求項２〜１０のいずれか１項に記載又は定義されたポリ
    核酸配列の一部であり、かつ該ポリ核酸又はその相補体と特異的にハイブリダイ
    ズするプローブ。
36. 【請求項３６】 請求項２〜１０のいずれか１項に記載又は定義されたポリ
    核酸配列の一部であり、かつ該ポリ核酸又はその相補体を特異的に増幅するプラ
    イマー。
37. 【請求項３７】 請求項２〜１０のいずれか１項に記載若しくは定義された
    ポリ核酸配列、請求項１１若しくは１２に記載されたポリペプチド、請求項３５
    記載のプローブ、又は請求項３６に記載のプライマーを含む組成物。