JP2002524052A - 環境ストレスに対する耐性に関与する遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
植物の農作物生産性の向上に関する。農作物生産性の主な制約の一つは、植物の
成長及び発育に対する環境ストレス条件の効果である。分子生物学の重要な目標
は、そのようなストレスに対する耐性又は抵抗性を与えることができる遺伝子の
特定及び単離である。農業に関しては、そのような遺伝子を有するトランスジェ
ニック植物の創出は、植物のストレス耐性又は抵抗性を改良する可能性を与える
。
生じるストレスである。これらのストレスに対する生理学的応答は、細胞の遺伝
子発現における変化から発生する。多数の遺伝子の発現が、これらの応答によっ
て誘導されることが立証されている〔Zhu et al., 1997;Shinozaki et al., 19
96;Thomashow, 1994〕。これらの遺伝子の産物は、二つの群:すなわち、環境
ストレスから直接防護するものと、ストレス応答の際に遺伝子発現及びシグナル
変換を調節するものとに分類することができる。第一の群は、脱水から細胞を防
護することによって機能すると思われるタンパク質、例えば様々な浸透圧防護剤
の生合成に必要な酵素、後期胚発生冗多(LEA)タンパク質、凍結防止タンパ
ク質、シャペロン、及び解毒酵素を包含する〔Shinozaki et al., 1997;Ingram
et al., 1996;Bray et al., 1997〕。遺伝子産物の第二の群は、転写因子、タ
ンパク質キナーゼ、及びホスホイノシチド代謝に関与する酵素を包含する〔Shin
ozaki et al., 1997〕。植物のストレス耐性を向上させることが知られている
方法の概観は、Holmberg & Buelow(1998)にも示されている。
究が必要なことは明確である。
関する遺伝的情報は、すべての高等植物に存在するという仮説へと導いている。
非塩性植物では、この情報は、脱水過程を経験する、種子及び花粉粒でのみ発現
されるにすぎないと思われる。
漑下にある国土の30〜50%が、現在、塩分に影響されている。何系統かの証
拠も、成長季全体を通して穏やかな環境ストレス条件でさえ、植物成長及び農作
物生産性に対して否定的な影響力を有することを立証している。例えば、水利用
可能性における僅かな制約でさえ、光合成率の低下を生じることが公知である。
予期し得ない降雨、成長季の開始及び終末での土壌塩分の増加は、しばしば、植
物成長及び農作物生産性の低下を招く。これらの環境的因子は、ストレスの少な
くとも一つの要素を共有し、それが、渇水、又は脱水である。乾燥は、今日の農
業における重大な問題である。例えば、過去40年にわたり、乾燥は、米国のト
ウモロコシの農作物損失全体の74%を占めた。不都合な環境条件下で生産性を
維持するには、例えば、これらの不都合な条件下で成長し、収穫するよう、農作
物に水の保持及び耐性の機序を交配して組み込むことによって、渇水に対抗する
ための遺伝的基盤を農作物に与えることが重要である。
ニングするための、新規な方法を提供することが本発明の一つの目的である。
る潜在的能力を植物に与える、植物遺伝子を提供することも本発明の目的である
。
の目的である。
に基づく植物を生産することは、本発明の更に一つの目的である。
更に一つの目的である。
細胞を提供することは、本発明の更に一つの目的である。
び/又は遺伝子を含むポリ核酸を得る方法であって、コーディング配列を含むc
DNAライブラリーを長角果から調製し、該コーディング配列を酵母細胞に機能
的な形式で導入し、環境ストレス条件に対する耐性又は抵抗性の増強へと導く、
該形質転換された酵母細胞内のポリ核酸についてスクリーニングすることを含む
方法に関する。
等真核生物、例えば酵母及び真菌、詳しくは酵母、特にサッカロミセス属に移転
することは、達成するのが比較的容易であることが見出されていて、そのため、
得られた酵母の、環境条件に対する耐性又は抵抗性についての試験の結果は、挿
入されたコーディング配列又は遺伝子が植物の環境ストレスに対する耐性又は抵
抗性を誘導できる能力の、比較的信頼できる尺度を与えることが示されている。
したがって、環境ストレス条件に対する耐性又は抵抗性の原因となる、遺伝子又
はコーディング配列を含むポリ核酸配列の発現は、それが由来する植物種、又は
他のいかなる植物種でも増強することができる。
部分でのストレス防護と相関する分子のレベルが、非形質転換植物でのレベルよ
り高くなるという意味で、「実質的に高められる」か、若しくは「上昇させされ
る」ことを意味すると解されなければならない。
又は環境ストレスに耐容若しくは抵抗できる能力を招く、異種の情報を植物細胞
に導入するその他の適切ないかなる手段によっても達成してよい。
語「浸透圧ストレス」と大幅に重複する。例えば、Holmbergら(1998)は、非生
物的ストレスを招く異なる環境ストレス因子を定義している。本発明に用いられ
る限りでの用語「環境ストレス」は、細胞、組織、種子、器官又は全植物体の代
謝、成長若しくは生存度に対する、非生物的若しくは非生物学的環境ストレッサ
ーが生成する、不都合ないかなる効果も意味する。より詳しくは、それは、水ス
トレス(冠水、乾燥、脱水)、嫌気性(低レベルの酸素、CO2等々)、好気性
ストレス、浸透ストレス、塩ストレス、温度ストレス(高温/高熱、寒冷、凍結
、降霜)又は栄養素/汚染物ストレスのような環境因子も包含する。
含するストレスを生成するのに充分な、酸素レベルのいかなる低下も意味する。
々のような、植物、植物部分、組織又は単離細胞の液体媒体への持続性若しくは
一過性の浸漬に付随するか、若しくは誘導される、いかなるストレスも意味する
。
長温度を、それぞれ、下回るか、又は上回る温度によって誘導されるストレスで
ある。そのような最適成長温度範囲は、当業者には容易に決定されるか、又は公
知である。
、若しくは含水量の低下に付随するか、若しくは誘導される、いかなるストレス
も意味する。
低下に誘導されるか、若しくは付随するいかなるストレスも意味する。
トレスも意味する。
の塩に付随するか、又は誘導され、細胞の細胞内若しくは細胞外環境の浸透能力
の変動を招く、いかなるストレスも意味する。
ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム等々のような水
溶性無機塩、農用肥料の塩、及びアルカリ性又は酸性の条件に付随する塩である
ことができる。
在の際に得られるトランスジェニック植物は、対応する野生型植物がそれに対し
て感受性であった、環境ストレスに対する抵抗性、耐性、又は向上した耐性若し
くは抵抗性を獲得する。
る、細胞性代謝の変化、細胞増殖の低下、及び/又は細胞死の遅延から完全な阻
害までの範囲の防護を網羅する。好ましくは、本発明の方法に従って得られたト
ランスジェニック植物は、該植物が、対応する野生型植物が成長、代謝、生存度
、生産性、及び/又は雌雄の稔性の低下を示す環境条件下で、実質的に正常に成
長することができるという意味で、環境ストレス条件に対して耐性若しくは抵抗
性である。植物の成長、又はストレスに対する応答を決定する方法論は、高さの
測定、葉の面積、植物−水関係、開花能力、子孫及び収穫物の生成能力、その他
当業者に公知のいかなる方法論も包含するが、これらに限定されない。
重要な農作物にも、好ましくは植物のすべての細胞にも適用することができて、
高められた浸透圧その他いかなる形態の環境ストレス耐性にも導く。下記に説明
されるとおりの実施態様によって、ここに、環境ストレス条件下で改良された収
率、成長、発育及び生産性を有する農作物を栽培することができるようになり、
例えば、本発明に従って誘導された浸透圧耐性なしでは栽培できない地域で、農
作物を栽培することさえ可能になり得る。
を実施するには、本発明による方法を適用し、それによって該cDNAライブラ
リーが該植物細胞の本質的にすべてのmRNAのコピーを含むのが好ましい。お
そらく、コーディング配列のみでも充分である。環境ストレスに関与する遺伝子
のスクリーニングには、長角果(成熟中の種子を含む果実)、例えば、アラビド
プシス属からのcDNAライブラリーを用いるのが好ましく、それは、これらの
器官では、例えば浸透圧耐性に関与する遺伝子が優先的に発現されるからである
。
充分長い機能形式である限り、適切ないかなる方法によるスクリーニングのため
にも酵母に導入し得るが、操作を容易にするためには、2μプラスミドのような
周知のベクターを用いるのが好ましい。コーディング配列又は遺伝子を強力な構
成酵母プロモーターの制御下において、問題の遺伝子又はコーディング配列の充
分な発現を増強するのが好ましいと思われる。強力な構成酵母プロモーターは、
当技術に周知であり、酵母TPIプロモーターを包含するが、これらに限定され
ない。
訳領域(5′UTR)、コーディング領域(タンパク質をコードしていても、い
なくてもよい)、並びにポリアデニル化部位を含む非翻訳3′領域(3′UTR
)のような、機能的に結合されたいくつかのDNAフラグメントを含む、いかな
るDNA配列も意味する。植物細胞で代表的には、5′UTR、コーディング領
域及び3′UTR(まとめて転写DNA領域と呼ばれる)がRNAに転写され、
それが、タンパク質をコードしている遺伝子の場合、タンパク質に翻訳される。
遺伝子は、例えばイントロンのような、追加のDNAフラグメントを含んでもよ
い。本明細書に用いられる限りで、遺伝子座とは、植物のゲノム内での与えられ
た遺伝子の位置である。
を長角果から調製し、該コーディング配列を酵母細胞に機能的な形式で導入し、
環境ストレス条件に対する耐性又は抵抗性の増強へと導く、該形質転換された酵
母細胞内のポリ核酸についてスクリーニングすることを含む方法によって得られ
る、単離されたポリ核酸に関する。
、或いはその相補体を意味する。
上記に定義されたとおりの方法によって得られる、単離ポリ核酸を提供する。
えば、Grilloら(1996)、Peassarakliら(編者)、Nilsenら(1996)、Shinoza
kiら(1999)、Jonesら(1989)、Fowdenら(1993)、又は付記された実施例に
記載のものを参照されたい、当技術に周知の方法に従って試験することができる
。
、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47
、49、51、53、55、57、59、61、63、65、69、71、73
、75若しくは121のいずれか、又はその相補鎖; (b)(a)に定義された配列又はそのフラグメントとハイブリダイズする、
ポリ核酸配列; (c)遺伝暗号の結果として(a)又は(b)に定義されたポリ核酸配列に縮
重されるポリ核酸配列;或いは (d)(a)〜(c)のいずれか一項のポリ核酸にコードされるタンパク質の
フラグメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される、表1に列挙されたとおりのポリペプチドのいずれかの相同体を
コードしている、単離ポリ核酸に関する。
ブリダイズする。
フラグメントである。
イゼーション条件が目的とされる、Sambrook(1989)に記載されたとおりのハイ
ブリダイズ条件を意味する。
は、厳しい条件は、規定されたイオン強度及びpHで、特定の配列に対する熱的
融点(Tm)より約5℃低くなるよう選ばれる。Tmは、完全に適合するプロー
ブと、標的配列の50%が(規定されたイオン強度及びpH下で)ハイブリダイ
ズする温度である。代表的には、厳しい条件は、塩濃度がpH7で約0.02M
であり、温度が約60℃以上である条件である。
cDNA配列を用いた厳しい条件下での、標準的なサザンブロット中に特定する
ことができる。ゲノム及びcDNAライブラリー双方の調製は、当技術の範囲内
にある。ハイブリダイゼーション条件の例は、実施例の項にも示される。
ている、環境ストレス条件に対して耐性又は抵抗性である植物の生産に役立つ単
離ポリ核酸にも関する。
23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、
47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、
71、73、75、77若しくは121のいずれかの少なくとも一部、又は配列
番号1、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27
、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51
、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75
、77若しくは121のいずれかと50%以上同一であり、優先的には55%、
60%、65%若しくは70%以上同一であり、より好ましくは75%、80%
若しくは85%以上同一であり、最も好ましくは90%若しくは95%以上同一
である遺伝子の少なくとも一部を含むポリ核酸にも関する。好ましくは、該遺伝
子は、配列番号2、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24
、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48
、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72
、74、76又は78の配列を有するタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を
有するタンパク質をコードしている。該遺伝子の該一部は、好ましくは、ユニー
ク部分である。
19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、
43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、
67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、
91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、1
11、113、115、117、119若しくは121のいずれかの少なくとも
一部、又は配列番号1、3、5、9、11、13、15、17、19、21、2
3、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、4
7、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、7
1、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、9
5、97、99、101、103、105、107、109、111、113、
115、117、119若しくは121のいずれかと50%以上同一であり、優
先的には55%、60%、65%若しくは70%以上同一であり、より好ましく
は75%、80%若しくは85%以上同一であり、最も好ましくは90%若しく
は95%以上同一である遺伝子の少なくとも一部を含むポリ核酸の、環境ストレ
ス条件に対する増強された耐性又は抵抗性を有するトランスジェニック植物を生
産するための用途に関する。
、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40
、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64
、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88
、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、
110、112、114、116、118又は120の配列を有するタンパク質
と実質的に同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードしている。該遺伝子の
該一部は、好ましくは、ユニーク部分である。
ヌナズナArabidopsis thalianaからの、At−DBF2と呼ばれるDBF2キナ
ーゼ相同体をコードしている、少なくとも、植物及び酵母に対する増強された環
境ストレス耐性又は抵抗性を与えるために用いることができる、上記に定義され
たとおりの単離ポリ核酸に関する。
する、ポリ核酸配列; (e)遺伝暗号の結果として(a)若しくは(b)に定義されたポリ核酸配列
に縮重されるポリ核酸配列;又は (c)(a)〜(c)のいずれか一項のポリ核酸にコードされるタンパク質の
フラグメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される、植物DFB2キナーゼをコードしている単離ポリ核酸に関する
。
ダイズする。
0%以上同一であり、優先的には55%、60%、65%若しくは70%以上同
一であり、より好ましくは75%、80%若しくは85%以上同一であり、最も
好ましくは90%若しくは95%以上同一である配列を有する遺伝子の少なくと
も一部を含む、植物に由来するポリ核酸に関する。好ましくは、該遺伝子は、配
列番号2の配列を有するタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するタンパ
ク質をコードしている。
体を生産するための、少なくとも植物及び酵母に増強された環境ストレス耐性又
は抵抗性を与えることができる、植物HSP 17.6Aタンパク質をコードし
ている、上記に定義されたとおりの単離ポリ核酸の用途にも関する。
するポリ核酸配列; (c)遺伝暗号の結果として(a)若しくは(b)に定義されるポリ核酸配列
に縮重されるポリ核酸配列;又は (d)(a)〜(c)のいずれか一項のポリ核酸にコードされるタンパク質の
フラグメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される、上記に定義されたとおりの単離ポリ核酸の、環境ストレス条件
に対する増強された耐性又は抵抗性を有するトランスジェニック植物を生産する
ための使用に関する。
ブリダイズする。
あり、優先的には55%、60%、65%若しくは70%以上同一であり、より
好ましくは75%、80%若しくは85%以上同一であり、最も好ましくは90
%若しくは95%以上同一である配列を有する遺伝子の少なくとも一部を含む、
ポリ核酸の用途にも関する。好ましくは、該遺伝子は、環境ストレス条件に対す
る増強された耐性又は抵抗性を有するトランスジェニック植物を生産するために
、配列番号4の配列を有するタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有する、
タンパク質をコードしている。
7、99、101、103、105、107、109、111、113、115
、117若しくは119、又はその相補鎖; (b)(a)に定義された配列又はそのフラグメントとハイブリダイズする、
ポリ核酸配列; (c)遺伝暗号の結果として(a)又は(b)に定義されたポリ核酸配列に縮
重されるポリ核酸配列;或いは (d)(a)〜(c)のいずれか一項のポリ核酸にコードされるタンパク質の
フラグメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される上記に定義された単離ポリ核酸の、環境ストレス条件に対する増
強された耐性又は抵抗性を有するトランスジェニック植物を生産するための使用
に関する。
、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111
、113、115、117若しくは119のいずれかの少なくとも一部、又は配
列番号79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、
101、103、105、107、109、111、113、115、117若
しくは119のいずれかと50%以上同一であり、優先的には55%、60%、
65%若しくは70%以上同一であり、より好ましくは75%、80%若しくは
85%以上同一であり、最も好ましくは90%若しくは95%以上同一である配
列を有する遺伝子の少なくとも一部の、環境ストレス条件に対する増強された耐
性又は抵抗性を有するトランスジェニック植物を生産するための使用に関する。
2、94、96、98、100、102、104、106、108、110、1
12、114、116、118又は120の配列を有するタンパク質と実質的に
同じ生物学的活性を有する、タンパク質をコードしている。
植物及び酵母に与えるのに少なくとも用いることができる、c74と呼ばれるタ
ンパク質、より詳しくはc74の植物相同体、はるかに好ましくはシロイヌナズ
ナからのc74をコードしている、上記に定義されたとおりの単離ポリ核酸に関
する。
する、ポリ核酸配列; (c)遺伝暗号の結果として(a)若しくは(b)に定義されたポリ核酸配列
に縮重されるポリ核酸配列;又は (d)(a)〜(c)のいずれか一項のポリ核酸にコードされるタンパク質の
フラグメントをコードしているポリ核酸配列 から選ばれる、上記に定義されたとおりの単離ポリ核酸に関する。
ブリダイズする。
あり、優先的には55%、60%、65%若しくは70%以上同一であり、より
好ましくは75%、80%若しくは85%以上同一であり、最も好ましくは90
%若しくは95%以上同一である配列を有する遺伝子の少なくとも一部を含む、
ポリ核酸にも関する。好ましくは、該遺伝子は、配列番号6の配列を有するタン
パク質と実質的に同じ生物学的活性を有する、タンパク質をコードしている。
させたとき、二つの配列中の、それぞれ、ヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列
が同じであるならば、本発明によれば「同一」であると言われる。用語「相補的
」は、本明細書では、相補的配列が、与えられたポリヌクレオチド配列の全部又
は一部とハイブリダイズすることを意味する。
的には、「比較ウィンドウ」越しに二配列の配列を比較して、配列が類似する局
所的領域を特定かつ比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」は、
本明細書に用いられる限りで、ある配列と、隣接する位置の数が同じである参照
配列とを、最も適切に整列させた後に比較し得る、約20以上の、普通は約50
〜約200の、より普通には約100〜約150の隣接位置のセグメントを意味
する。
アルゴリズムによってか、Needleman及びWunsch(1970)の相同性整列アルゴリ
ズムによってか、Pearson及びLipman(1988)の類似性検索法によってか、これ
らのアルゴリズム〔Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer
Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI中のGAP、BESTFIT、B
LAST、FASTA及びTFASTA〕のコンピュータによる実行によってか
、又は視覚的検分によって実施してよい。
ウ越しに比較することによって決定されるが、ここで、比較ウィンドウ内のポリ
核酸又はポリペプチドの配列の部分は、二配列の最適な整列のために、(付加又
は欠失を含まない)参照配列と比較しての付加又は欠失(すなわち間隙)を含ん
でよい。この百分率は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両配列中に出現する
位置の数を決定して、対合する位置の数を数え、対合する位置の数を、比較ウィ
ンドウ内の位置の総数で除し、結果に100を乗じて、配列同一性の百分率を得
ることによって算出される。
レオチド配列が、標準的なパラメータを用いた上記のプログラム(好ましくはB
LAST)を用い、参照配列と比較して、60%、65%、70%又は75%以
上、好ましくは80%又は85%以上、より好ましくは90%以上、最も好まし
くは95%以上の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、こ
れらの数値を適切に調整して、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、読み枠の位置
取りなどを斟酌することによって、二つのヌクレオチド配列がコードしているタ
ンパク質の対応する同一性が決定できることを認識するものと思われる。その目
的でのアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、40%、45%、50%又は5
5%以上、好ましくは60%、65%、70%、75%、80%又は85%以上
、より好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の配列同一性を意味す
る。「実質的に類似する」ポリペプチドは、同一でない残基の位置が、同類アミ
ノ酸変化によって異なり得ること以外は、上記のような配列を共有する。同類ア
ミノ酸置換とは、類似する側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪
族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイ
ソロイシンであり;脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及
びトレオニンであり;含アミド側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及び
グルタミンであり;芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チ
ロシン及びトリプトファンであり;塩基側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、
アルギニン及びヒスチジンであり;含硫黄側鎖を有するアミノ酸の群は、システ
イン及びメチオニンである。好適な同類アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−
イソロイシン、フェニルアリニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−
バリン及びアスパラギン−グルタミンである。
が、厳しい条件下で互いにか、又は第三の核酸とハイブリダイズするか否かであ
る。
た配列番号1〜121に相当するヌクレオチド若しくはアミノ酸配列、より具体
的には、それぞれのタンパク質若しくはポリペプチドの「活性ドメイン」をコー
ドしているヌクレオチド配列、又はそれに相当するアミノ酸配列中のそれの一方
又は双方に基本的に類似するか、又は優先的には基本的に同一、若しくは同一で
ある、DNA配列の少なくとも一部を含むことになる。
術に公知のいかなる核酸増幅手法によっても生成することができる。
参照されたい。
てもよい。例えば、Carruthersら(1982)及びAdamsら(1983)を参照されたい
。そうして、適切な条件下で、相補鎖を合成するか、若しくは鎖を一緒にアニー
リングするか、又は適切なプライマー配列とともにDNAポリメラーゼを用いて
、相補鎖を付加するかのいずれかによって、二本鎖DNAフラグメントを得てよ
い。
るポリ核酸、又はその機能的フラグメントによってコードされる単離ポリペプチ
ドに関する。
記に定義されたとおりに単離されたポリ核酸がコードしている単離ポリペプチド
に関する。好ましくは、本発明は、配列番号2、4、6、8、10、12、14
、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38
、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62
、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86
、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、1
08、110、112、114、116、118若しくは120のいずれかの配
列の少なくとも一部を有する、ポリペプチド又はペプチドに関する。好ましくは
、該一部は、ユニーク部分であり、好ましくは、該ポリペプチドの活性ドメイン
を含む。好ましくは、該ポリペプチドは、組換えポリペプチドである。
産するそれから区別する。
22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、
46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、
70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、
94、96、98、100、102、104、106、108、110、112
、114、116、118又は120のいずれかと、50%、55%、60%、
65%以上同一であり、優先的には70%、75%以上同一であり、より好まし
くは80%若しくは85%以上同一であり、最も好ましくは90%若しくは95
%以上同一であるポリペプチドの少なくとも一部を含む、、ポリペプチドにも関
する。
互可換的に用いられる。
物細胞、植物カルス又は酵母に環境ストレス条件に対する耐性若しくは抵抗性を
与え得る能力を有する。
実質的に有するフラグメントを意味する。
された細胞での組換え発現によって生成してよい。
物を生産する方法であって、植物細胞内で(過剰)発現されたとき、該植物の環
境ストレスに対する耐性又は抵抗性を増強する、上記に定義されたとおりのポリ
核酸のいずれかを含む組換えDNAを、該植物細胞に一時的に導入することを含
む方法に関する。
植物体も含む。本発明は、より詳しくは、増強された環境ストレス耐性又は抵抗
性を有する植物を生産する方法であって、植物細胞内で(過剰)発現されたとき
、該植物の環境ストレスに対する耐性又は抵抗性を増強する、表1に列挙された
とおりのタンパク質をコードしているポリ核酸のいずれかを含む組換えDNAを
、該植物細胞に一時的に導入することを含む方法に関する。
、好ましくは、形質転換された植物に、対応する非形質転換植物の成長を阻害す
る、ある量の塩、熱、低温(その他のストレス因子)に対する耐性又は抵抗性を
与えるのに充分な量で発現されることを意味する。
法が、当技術に公知である。例えば、植物ウイルスベクターは、そのような目的
を達成するのに用いることができる。植物ウイルスベクターの利用を与える例は
、Porta及びLomonossoff(1996)、国際公開特許第9320217号公報、及び
米国特許第5,589,367号明細書に記載されている。
法であって、植物細胞内で(過剰)発現されたとき、該植物の環境ストレス耐性
又は抵抗性を増強する、上記に定義されたとおりのポリ核酸のいずれかを含む組
換えDNAを、該植物細胞のゲノムに安定的に導入することを含む方法にも関す
る。
を生産する方法であって、植物細胞内で(過剰)発現されたとき、該植物の環境
ストレス耐性を増強する、表1に列挙されたとおりのタンパク質をコードしてい
るポリ核酸のいずれかを含む組換えDNAを、該植物のゲノムに導入することを
含む方法にも関する。
又は抵抗性を有する植物を生産する方法であって、DBF2キナーゼ、好ましく
は植物DBF2キナーゼ、最も好ましくはアラビドプシス属DBF2キナーゼを
コードしている、上記に定義されたとおりのポリ核酸を該植物に導入することを
含む方法に関する。
された耐性又は抵抗性を有する植物を生産する、上記に定義されたとおりの方法
であって、HSP 17.6Aタンパク質、好ましくは植物HSP 17.6Aタ
ンパク質、最も好ましくはアラビドプシス属HSP 17.6Aタンパク質をコ
ードしている、上記に定義されたとおりのポリ核酸を該植物に導入することを含
む方法に関する。
又は抵抗性を有する植物を生産する、上記に定義されたとおりの方法であって、
c74タンパク質、好ましくは植物c74タンパク質、最も好ましくはアラビド
プシス属c74タンパク質をコードしている、上記に定義されたとおりのポリ核
酸を該植物に導入することを含む方法に関する。
モーターの制御下になる植物発現可能プロモーターを含む、 1種類若しくはそれ以上の組換えDNA分子を導入することと、 (b)該植物を該植物細胞から再生させることと を含む方法にも関する。
を生産する方法であって、上記に定義されたとおりのポリ核酸内に含まれた内因
性遺伝子の該植物での発現を間接的に増強若しくは誘導すること、又は上記に定
義されたとおりのタンパク質の活性を間接的に増強若しくは誘導することを含む
方法にも関する。
若しくは誘導するか、又は本発明の該ポリ核酸がコードしているタンパク質のタ
ンパク質活性を間接的に増強若しくは誘導するタンパク質をコードしているDN
A、及び 植物発現可能プロモーターであって、それにより、該DNAが、同じ転写単位
内になり、かつ該植物発現可能プロモーターの制御下になる植物発現可能プロモ
ーターを含む、 1種類若しくはそれ以上の組換えDNA分子を導入することと、 (b)該植物を該植物細胞から再生させることと を含む方法にも関する。
なる種に由来する配列を含むことになるか、同じ種に由来するならば、その本来
の形態から実質的に修飾されていてよいことを意味することになる。例えば、そ
れが由来するのとは異なる種からの構造遺伝子に、機能的に結合されたプロモー
ターは、その本来の形態から実質的に修飾されていてよい。
を生産する、上記に定義されたとおりの方法であって、上記に定義されたとおり
のポリ核酸内に含まれた内因性遺伝子の該植物での発現を間接的に増強若しくは
誘導すること、又は上記に定義されたとおりの本発明のタンパク質の活性を間接
的に増強若しくは誘導することを含む方法にも関する。この実施態様によれば、
本発明によるタンパク質の発現又は活性を調節するその他のポリ核酸を、該植物
のゲノムに一時的にか、又は安定的に導入してよい。用語「調節する」とは、増
強、誘導、増大、減少又は阻害することを意味する。
タンパク質が、本発明のポリ核酸又はタンパク質の少なくとも一方の発現若しく
は活性の正の調節因子であるときに、必要とされる。
タンパク質が、本発明のポリ核酸又はタンパク質の少なくとも一方の発現若しく
は活性の負の調節因子であるときに、必要とされる。
植物内の内因性遺伝子の発現に影響を与えることによって達成される。これは、
好ましくは、本発明による一つ又はそれ以上のポリ核酸配列を植物ゲノムに、遺
伝子発現に適した形で(例えば、植物発現可能プロモーターの制御下で)導入す
ることによって達成される。その結果、植物細胞内のタンパク質の、増強若しく
は誘導された発現(過剰発現)、又は増強若しくは誘導された活性、或いは、適
切な基質の存在下での、トランスジェニック植物又は植物細胞における環境スト
レス条件に対する耐性若しくは抵抗性の、非トランスジェニック植物又は植物細
胞に比しての増大を招くことになる。耐性のこの増大は、mRNAレベル、又は
適切な場合、それぞれのタンパク質の活性レベルの(例えばELISA、当技術
に公知のいかなる手法によって測定されるような酵素活性による)測定によって
測定することができる。内因性遺伝子の発現とは、問題の植物、植物部分又は植
物細胞内に天然に見出されるタンパク質の発現を意味する。
物のゲノムに、本発明による内因性遺伝子(ポリ核酸)の発現と、アンチセンス
RNAによってか、本発明のポリ核酸の発現を通常は阻害する、遺伝子の共抑制
若しくはリボザイム抑制によってか、又は上記に定義されたとおりの本発明のポ
リペプチドの活性を通常は阻害する、遺伝子の抑制によって作用し合う、1種類
又はそれ以上のトランス遺伝子を導入することによって達成してもよい。
しようとする単数若しくは複数の内因性遺伝子の、少なくとも一部と実質的に同
一であると思われる。しかし、配列は、発現を阻害するために完全に同一である
必要はない。本発明のベクターは、阻害効果が、標的遺伝子との相同性又は実質
的相同性を示す、遺伝子の群内のその他の遺伝子にも該当するように設計するこ
とができる。
プロセシングされたmRNAのいずれかと対比して、完全長である必要はない。
。
要はなく、非コーディングセグメントの相同性は、等しく効果的であり得る。通
常、約30〜40ヌクレオチドから完全長配列までの配列を用いなければならな
いが、約100ヌクレオチド以上の配列が好ましく、約200ヌクレオチド以上
の配列は、更に好ましく、約500〜約1,700ヌクレオチドの配列は、特に
好ましい。
リボザイムも用いることができる。事実上いかなる標的RNAとも特異的に対合
し、特定の位置でホスホジエステル骨格を切断して、それによって標的RNAを
機能的に不活性化する、リボザイムを設計することが可能である。この切断を実
施する際に、リボザイムは、それ自体は変更されず、そのため再循環させ、他の
分子を切断し、それによって真の酵素となることができる。リボザイム配列をア
ンチセンスRNA内に含めることは、それらにRNA切断活性を与えて、それに
よって構成物の活性を増大させる。
及び植物内での複製ができる、数多くの小さい環状RNAから誘導される。これ
らのRNAは、単独でか(ウイルス様RNA)、又はヘルパーウイルスとともに
か(サテライトRNA)のいずれかで複製する。例は、アボカドサンブロッチウ
イロイドからのRNA、並びにタバコ輪紋病ウイルス、アルファルファ一過性条
斑病ウイルス、ビロードタバコ斑紋病ウイルス、ナス斑紋病ウイルス及び地中ク
ローバー斑紋病ウイルスからのサテライトRNAを包含する。標的RNA特異的
リボザイムの設計及び利用は、Haseloffら(1988)に記載されている。
られた核酸の導入は、標的遺伝子の転写を遮断するための効果的な手段であるこ
とが示されている。内因性遺伝子の発現を調節するこの方法の使用例については
、Napoliら(1990)、並びに米国特許第5,034,323号、第5,231,
020号及び第5,283,184号明細書を参照されたい。
配列の一次転写体中に存在する配列と相同なイントロン又は非翻訳配列のみを含
むにすぎない場合に、発生する。導入配列は、一般的には、抑制しようとする内
因性配列と実質的に同一であることになる。この最小限の同一性は、代表的には
、約65%より高いが、より高度の同一性は、内因性配列の発現の、より効果的
な抑制をもたらす。約80%より実質的に高い同一性が好ましいが、約95%な
いし完全な同一性は、最も好適であると思われる。アンチセンス調節によるのと
同様に、効果は、相同性、又は実質的な相同性を示す遺伝子の類似の群内のその
他のいかなるタンパク質にも該当するはずである。
とするが、やはり、一次転写産物、又は完全にプロセシングされたmRNAのい
ずれかと対比して、完全長である必要はない。これは、過剰発現物である何らか
の植物の同時生産を回避するのに好適であり得る。完全長より短い配列中の、よ
り高い同一性は、より長い、より同一性の低い配列の代償となる。更に、導入さ
れる配列は、同じイントロン又はエキソンのパターンを有する必要はなく、非コ
ーディングセグメントの同一性は、等しく効果的であることになる。通常、アン
チセンス調節についての上記の大きさの範囲の配列が用いられる。
発現を阻害するのに用いることができる。例えば、T−DNA又はトランスポゾ
ンを用いる挿入突然変異体を、発生させることができる。例えば、Haringら(19
91)及びWalbot(1992)を参照されたい。植物及び動物の遺伝子工学におけるも
う一つの方策が、遺伝子の置換に照準されている。相同的組換えは、代表的には
、この目的に用いられている〔Capecchi (1989)を参照されたい〕。
る内因性ポリ核酸配列の発現を、間接的に増強若しくは誘導できるか、又は上記
に定義されたとおりの本発明のタンパク質の活性を増強若しくは誘導できる、セ
ンス若しくはアンチセンスRNA又はリボザイムをコードしている、上記に定義
されたとおりの方法にも関する。好ましくは、該内因性ポリ核酸は、表1に列挙
されたとおりのタンパク質をコードしている。
ーであって、それにより、該ポリ核酸が、同じ転写単位内になり、かつ該植物発
現可能プロモーターの制御下になる植物発現可能プロモーターを含む、組換えポ
リ核酸にも関する。
リ核酸の発現を間接的に増強若しくは誘導するか、又は上記に定義されたとおり
のポリペプチドのタンパク質活性を間接的に増強若しくは誘導する、タンパク質
をコードしているDNA、及び (b)植物発現可能プロモーターであって、それにより、該DNAが、同じ転
写単位内になり、かつ該植物発現可能プロモーターの制御下になる植物発現可能
プロモーターを含む、 組換えポリ核酸にも関する。
味する。
組換えベクター」又は「発現カセット」とも呼ばれる。本発明の発現カセットは
、標準的な方法によって、発現ベクター内にクローニングすることができる。次
いで、発現ベクターを、現在利用できるDNA移転方法によって宿主細胞に導入
することができる。
は誘導する、アンチセンスRNA、リボザイム若しくはセンスRNAを含む、上
記に定義されたとおりの組換えポリ核酸にも関する。好ましくは、該タンパク質
は、表1に列挙されている。
、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41
、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65
、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89
、90、91、93、95、97、99、101、103、105、107、1
09、111、113、115、117、119又は121のいずれかのヌクレ
オチド配列の、少なくとも一部を含む組換えポリ核酸にも関する。
のコーディング配列の、少なくとも一部を含む組換えポリ核酸に関する。好まし
くは、該「一部」は、該ヌクレオチド配列のいずれかのユニーク部分である。(
26〜28)。本明細書に用いられる限りで、用語「植物発現可能プロモーター
」は、植物細胞における転写を作動させ得るプロモーターを意味する。これは、
転写DNA配列の天然のプロモーターを包含する、植物起源のいかなるプロモー
ターも包含するが、植物における転写を指図できる、非植物起源のいかなるプロ
モーターも包含する。このプロモーターは、人工的又は合成のプロモーターであ
ってもよい。用語「植物発現可能プロモーター」は、構成的な、誘導できる、器
官−組織特異的、又は発生上調節されるプロモーターを包含するが、これらに限
定されない。
及び/又は活性は、植物のゲノムに本発明による1種類又はそれ以上のポリ核酸
を導入することによって増強される。より具体的には、該構成プロモーターは、
下記:すなわち、35Sプロモーター〔Odell et al. (1985)〕、35S′3プ
ロモーター〔Hull & Howell (1987)〕、Tiプラスミドのノパリンシンターゼ遺
伝子のプロモーター〔「PNOS」、Herrera-Estrella (1983)〕、又はオクト
ピンシンターゼ遺伝子のプロモーター〔「POCS」、De Greve et al. (1982)
〕のうち一つであり得るが、これらに限定されない。その他の構成プロモーター
を用いて、類似の効果を達成できることは、明らかである。本発明に従って用い
ることができる、植物発現可能プロモーターのリストを、表2に示す。
の利点を与えることができる。タンパク質レベル又はタンパク質活性の調節は、
植物の一定の部分で必要とされることがあって、調節を、植物の培養又は発生段
階の一定の時期に限定することを可能にする。
導できるプロモーターの利用は、一定の利点を与えることができる。そのため、
本発明の特定の実施態様では、単数若しくは複数の遺伝子、又はその部分を、特
定の植物組織又は器官、例えば根、葉、収穫できる部分等々での発現を指図する
プロモーターの制御下に置く。
。そのようなプロモーターは、例えば、植物細胞における環境的な、すなわち好
ましくは非生物的なストレスによって直接調節される、それに対して発現が増強
、軽減又は別途変更される遺伝子を包含する、ストレス関連遺伝子から採取する
ことができる。これらのストレス関連遺伝子は、その発現が、嫌気性ストレス、
冠水ストレス、寒冷ストレス、脱水ストレス、乾燥ストレス、熱ストレス又は塩
分によって、誘導されるか、若しくは抑制される、遺伝子を含む。そのようなプ
ロモーターの例示的リストを、表3に示す。
リーダー配列(例えば、ペチュニアからのcab22リーダー)、3′転写終結
及びポリアデニル化シグナル(例えば、オクトピンシンターゼ遺伝子又はノパリ
ンシンターゼ遺伝子)、植物翻訳開始共通配列、イントロン、転写エンハンサー
その他の、adhイントロン1のような調節要素等々を更に包含してよく、これ
らは、遺伝子又はそのフラグメントに機能的に結合されている。加えて、該組換
えポリ核酸は、本発明のポリ核酸の遺伝子産物を、植物細胞内の特定の細胞内区
画へと照準し、更にタンパク質を細胞外環境へと仕向けるために構成かつ利用す
ることができる。これは、一般的には、通過又はシグナルペプチドをコードする
DNA配列を、該組換えポリ核酸に機能的に結合することによって得ることがで
きる。
ーカー遺伝子を伴ってよい〔Hansen et al., 1999、及びその中の引用文献〕。
キメラマーカー遺伝子は、植物発現可能プロモーター、好ましくは構成プロモー
ター、例えばCaMV35Sプロモーター、又は光誘導性プロモーター、例えば
Rubiscoの小副単位をコードしている遺伝子のプロモーターにその5′末端が機
能的に結合され、適切な植物転写3′末端形成及びポリアデニル化のシグナルに
その3′末端が機能的に結合されている、マーカーDNAを含むことができる。
マーカーDNAの選択は、決定的に重要ではなく、適切ないかなるマーカーDN
Aも用いることができると予測される。例えば、マーカーDNAは、A1遺伝子
〔Meyer et al., (1987)〕のように、形質転換された植物細胞に区別できる色彩
を与える、タンパク質をコードすることができるか、ホスフィノトリシンに対す
る抵抗性をコードしている、bar遺伝子(ヨーロッパ特許第0 242 246号公報)の
ように、形質転換された植物細胞に除草剤耐性を与えることができるか、又はゲ
ンタマイシンに対する耐性をコードしている、aac(6′)遺伝子のように(国
際公開特許第94/01560号公報)、形質転換された細胞に抗生物質耐性を
与えることができる。
上記ポリ核酸の用途に関する。より好ましくは、本発明は、選別できるマーカー
遺伝子としての上記に定義されたとおりの植物DBF2遺伝子の用途にも関し、
選別は、ストレス条件による処理で実施される。
は、植物細胞に選別できる表現型を与える、マーカー遺伝子も含むことになる。
例えば、該マーカーは、殺生物剤耐性、特に抗生物質耐性、例えばカナマイシン
、G418、ブレオマイシン、ヒグロマイシンに対する耐性、又は除草剤耐性、
例えばクロロスルホロン若しくはBastaに対する耐性をコードしていてよい。
宿主細胞にも関する。該宿主は、当技術に公知のいかなる宿主であることもでき
る。好ましくは、該組換え宿主細胞は、植物細胞、酵母、真菌、昆虫細胞等々で
ある。該宿主で効率的に発現させるために、該ポリ核酸は、該宿主系で機能する
ことが公知である、いかなる宿主と組み合せることもできる。該宿主細胞を形質
転換する方法も、当技術に周知である。
酸で形質転換された植物細胞にも関する。
質転換された植物細胞より基本的になる植物にも関する。
スジーンを含む植物を意味する。
ムに導入してよい〔例えば、総説についてはHansen et al., 1999、及び国際公
開特許第99/05902号公報を参照されたい〕。例えば、本発明のDNA構
成体は、プロトプラスト形質転換、バイオリスティックスbiolistics若しくは微
量注入衝撃、又はアグロバクテリアを介する形質転換のような手法を用いること
によって、望みの植物宿主のゲノムに導入してよい。
分に記載されている。ポリエチレングリコール沈降を用いたDNA構築物の導入
は、Paszkowskiら(1984)に記載されている。
転換法は、Kleinら(1987)に記載されている。
せ、慣用のアグロバクテリアの宿主ベクターに導入してよい。アグロバクテリア
という宿主の毒性の機能は、細胞をこの細菌に感染させたとき、植物細胞DNA
への構築物及び隣接マーカーの挿入へと向かわせることになる。バイナリーベク
ターの無害化及び利用は、学術文献に充分に記載されている。例えば、Horschら
(1984)、及びFraleyら(1983)を参照されたい。
は、形質転換された遺伝子型と、したがって望みの表現型も保有する全植物体を
再生するよう、培養することができる。そのような再生手法は、組織培養成長培
地中での一定の植物ホルモンの操作に依拠する。培養されたプロトプラストから
の植物の再生は、Evansら(1983)、及びBinding(1985)に記載されている。再
生は、植物のカルス、外植体、器官、又はその部分から達成することもできる。
そのような再生手法は、Kleeら(1987)に全般的に記載されている。
農業、林業又は園芸に利害を有する植物種に属するもの、例えば、農作物、根菜
植物、採油植物、果樹、牧草及び飼草用マメ科植物、愛玩若しくは鑑賞又は園芸
用植物を包含する、広範囲の植物に望みの形質を与えるのに用いることができる
。これらの植物は、サルナシActinidia、セロリーApium、ネギAllium、パイナッ
プルAnanas、ナンキンマメArachis、テンナンショウArisaema、クサスギカズラA
sparagus、ベラドンナAtropa、カラスムギAvena、フダンソウBeta、アブラナBra
ssica、パパイヤCarica、チコリーCichorium、レモンCitrus、スイカCitrullus
、トウガラシCapsicum、キウリCucumis、カボチャCucurbita、シドニアCydonia
、ニンジンDaucus、カキDiospyros、オランダイチゴFragaria、ダイズGlycine、
ワタGossypium、ヒマワリHelianthus、ヘテロカリスHeterocallis、オオムギHor
deum、ヒヨスHyoscyamus、サツマイモIpomoea、アキノノゲシLactuca、アマLinu
m、ドクムギLolium、トマトLycopersicon、リンゴMalus、マンゴーMangifera、
キャッサバManihot、マヨラナMajorana、ウマゴヤシMedicago、バショウMusa、
タバコNicotiana、イネOryza、キビPanicum、パンネセツムPannesetum、アボカ
ドPersea、ペトロセリヌムPetroselinum、インゲンマメPhaseolus、エンドウPis
um、ナシPyrus、サクラPrunus、ダイコンRaphanus、ダイオウRheum、スグリRibe
s、アカネRubia、サトウキビSaccharum、ライムギSecale、ハンゴンソウSenecio
、カラシSinapis、ナスSolanum、モロコシSorghum、ホウレンソウSpinacia、ト
リゴネラTrigonella、コムギTriticum、コケモモVaccinium、ブドウVitis、ソラ
マメVicia、トウモロコシZea及びショウガZingiberの属からの種を包含すること
ができる。追加的な種は、除外されない。地下水による潅漑が必要とされる、乾
燥又は半乾燥地域の耕作地で栽培される農作物は、好都合にも、本発明からの恩
恵を受けてよい。
、機能できると確認された後は、有***配によって他の植物にも導入できること
を認識すると思われる。交配しようとする種に応じて、数多くの標準的な育種手
法のいずれを用いることもできる。前記のとおり、本発明の植物細胞、植物組織
、特にトランスジェニック植物は、環境ストレス条件に対して、対応する野生型
植物に比して、より高度な、又は増強された一定程度の耐性(又は抵抗性でさえ
)を示す。「環境ストレス」の意味については、上記を参照されたい。本発明の
好適実施態様では、該トランスジェニック植物は、浸透圧ストレス、塩ストレス
、寒冷及び/又は熱ストレスに対する増強された耐性を示す。そのような環境ス
トレスに対する耐性の増大は、当技術に公知の方法論によって決定される限りで
の、対応する非形質転換植物の成長及び生産性を阻害する、そのようなあるレベ
ルのストレスに対する耐性を意味すると解される。トランスジェニック植物にお
ける増強された耐性は、該トランスジェニック植物、又はその部分における、本
発明の1種類若しくはそれ以上のポリ核酸の発現レベルの上昇、及び/又は当技
術に公知の方法論によって決定される限りでの、該ポリ核酸がコードしているポ
リペプチドの活性レベルの上昇に関連付けられる。それらの形質転換されていな
い相手と比較し、かつ当技術に公知の方法論に従って決定されて、本発明による
トランスジェニック植物は、穏やかな環境ストレス条件下で、成長、生存度、代
謝、稔性及び/又は生産性の増大を示す。代替策では、本発明によるトランスジ
ェニック植物は、形質転換されていないその相手が成長できない、環境ストレス
条件下で成長することができる。塩ストレスに対する耐性の増大は、トランスジ
ェニック植物が、該ストレス耐性トランスジェニック植物がそれから誘導された
、ストレス耐性でない親植物の95%以上の成長を阻害するストレス条件下で、
成長できる能力を意味すると解される。代表的には、本発明のストレス耐性植物
の成長率は、ストレス耐性でない親植物の95%以上の成長を阻害する成長条件
によって、50%未満、好ましくは30%未満だけ阻害されると思われ、最も好
ましくは、有意には阻害されない成長率を有すると思われる。代替例では、穏や
かな環境ストレス条件下で、トランスジェニック植物の成長及び/又は生産性は
、統計的に、それらの形質転換されていない相手より1%以上高く、好ましくは
5%より高く、最も好ましくは10%より高い。
くはin vitroでの植物繁殖に用いて、同じ特性を有する、より多くの形質転換植
物を生産することができ、及び/又は同じ特性を、他の様々な同じか、若しくは
関連する種に導入するのに用いることができる。
本発明のトランスジェニック植物の特性は、他のストレス耐性遺伝子を用いて、
環境ストレス耐性を与えるための様々な取組み方と組み合せることができる。そ
のようなストレス耐性遺伝子のいくつかの例は、Holmberg及びBuelow(1998)に
与えられている。様々なストレス耐性遺伝子の導入を包含する、先行技術による
殆どの取組み方は、正常な、ストレスのない条件下では、(トランスジェニック
でない対照に比して)低下したか、又は異常な成長を招く、すなわち、ストレス
耐性は、成長及び生産性と引き換えに得られる〔Kasuga et al., 1999〕。スト
レス応答遺伝子の構成的発現と、正常な成長条件下での低下した成長率との間の
この相関関係は、ストレス応答制御と成長制御との間の双方向性機序の存在を示
す。
物の特性は、他のストレス耐性、例えば、マンニトール、プロリン、グリシン−
ベタイン、水チャンネルタンパク質等々のような浸透圧防護剤を植物に与える、
様々な取組み方と組み合せることができる。したがって、環境ストレス条件に対
する耐性を植物に与える、本発明の取組み方は、様々なストレス耐性遺伝子の導
入を包含する、先行技術による取組み方と組み合せることができる。これらの取
組み方の組合せは、環境ストレスに対する耐性又は抵抗性を増強するのに追加的
な、及び/又は相乗的な効果を有する可能性がある。
する、トランスジェニックストレス耐性植物を生産するために用いることができ
ることが直ちに明らかであり〔総説については、TIPTEC Plant Product & Crop
Biotechnology 13 (1995), 312-397〕、含まれるものは、下記のとおりである。 (i)除草剤耐性〔ドイツ国特許第3701623号公報;Stalker (1988)〕
、 (ii)昆虫耐性〔Vaek (1987)〕、 (iii)ウイルス耐性〔Powell (1986)、Pappu (1995)、Lawson (1996)〕、 (iv)オゾン耐性〔Van Camp (1994)〕、 (v)果実保存の改良〔Oeller (1991)〕、 (vi)澱粉の組成及び/又は生産の改良〔Stark (1992)、Visser (1991)〕、 (vii)脂質組成の変更〔Voelker (1992)〕、 (ix)例えばアントシアニン及びフラボノイド生合成経路の操作による、花色
の変更〔Meyer (1987)、国際公開特許第90/12084号公報〕、 (x)細菌、昆虫及び真菌に対する耐性〔Duering (1996)、Strittmatter (19
95)、Estruch (1997)〕、 (xi)アルカロイド及び/又は強心配糖体組成の変更、 (xii)雄及び/又は雌性不稔性の維持の誘導〔ヨーロッパ特許A1第0 41
2 006号;同第0 223 399号公報;国際公開特許第93/25695
号公報〕、 (xiii)花序/花の寿命の延長、並びに (xiv)ストレス耐性。
な、新規な表現型を植物に与える核酸分子を更に含む、環境ストレスに対する増
強された耐性又は抵抗性を、遺伝子工学によって示す、いかなる植物細胞、植物
組織若しくは植物に関する。
単数又は複数のカルスにも関する。そのようなトランスジェニックカルスは、好
ましくは、植物細胞の懸濁培養での二次代謝物の生産に用いることができる。
できる部分、器官若しくは組織、又は増殖材料にも関する。
ランスジェニック植物の種子にも関する。
ニック植物を生産するための用途にも関する。
植物、好ましくは環境ストレス条件に対する増強された耐性又は抵抗性を有する
トランスジェニック植物を生産するための使用にも関する。好ましくは、該ポリ
核酸は、表1に列挙されたようなポリペプチドをコードしている。
対する増強された耐性又は抵抗性を有するカルスを生産するための使用にも関す
る。好ましくは、該ポリ核酸は、表1に列挙されたようなポリペプチドをコード
している。
23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、
47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、
71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、
93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、
113、115、117、119又は121のいずれかに類似するが、それらと
は異なり、かつ配列番号2〜120(ただし偶数)のいずれかのアミノ酸配列を
有するタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードして
いる配列を有する、追加の遺伝子の、例えば、当技術に公知の手法、例えばPC
Rによる単離に役立つ、本発明の遺伝子から誘導されるプローブ及びプライマー
にも関する。もう一つの植物種における相同遺伝子の存在は、例えば、ノーザン
又はサザンブロット分析の実験によって確認することができる。
23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、
47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、
71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、
93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、
113、115、117、119又は121に表わされるようなcDNA配列の
いずれかの、ゲノム上の相手のクローニングにも関する。これらのゲノム上の相
手は、これらのcDNA配列をプローブとして用いて、ゲノムライブラリーから
選ぶことができる。本発明は、該ゲノムクローンのいずれかのコーディング領域
はもとより、プロモーター領域にも関する。
イブリダイズするよう設計された、一本鎖オリゴヌクレオチドの「配列」を意味
する。
ー伸長産物の合成開始点として作用できる、一本鎖オリゴヌクレオチド配列を意
味する。好ましくは、該プライマーは、約5〜50ヌクレオチド長である。本発
明によるプローブ又はプライマーの用語「標的領域」は、該プローブ又はプライ
マーがそれに完全に相補的であるか、又は部分的に相補的である(すなわち多少
の程度の食違いを有する)、ポリ核酸内の配列である。該標的配列の相補体も、
ある場合には、適合する標的配列である。
プローブが、用いられた実験条件下で、この領域の一部、又は領域全体と二本鎖
を形成すること、及びこれらの条件下で、このプローブが、分析しようとするサ
ンプル中に存在するポリ核酸のその他の領域とは二本鎖を実質的に形成しないこ
とを意味する。
増幅工程の際、該プライマーが、用いられた実験条件下で、この領域の一部、又
は領域全体と二本鎖を形成すること、及びこれらの条件下で、該プライマーが、
分析しようとするサンプル中に存在するポリ核酸のその他の領域とは二本鎖を形
成しないことを意味する。本明細書によって用いられる限りでの「二本鎖」は、
特異的増幅へと導くような二本鎖を意味すると解されなければならない。
くは約10〜25ヌクレオチド長である。本発明に用いられる限りでのヌクレオ
チドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及びイノシンのような
修飾されたヌクレオチド、又はそのハイブリダイゼーション特性を基本的に変え
ない、修飾された基を有するヌクレオチドであってよい。本発明によるプローブ
は、好ましくは、上記に定義されたとおりのポリ核酸のいずれかの、cDNA配
列の部分を含む。
のポリペプチド、上記に定義されたとおりのプローブ、又は上記に定義されたと
おりのプライマーを含む組成物にも関する。
む、製剤又は農薬組成物にも関する。
にも関する。
ェニック植物及び酵母について観察される、いくつかの環境ストレス条件に対す
る耐性及び/又は抵抗性を、例示のために説明する。実施例中に別途指示されな
い限り、すべての組換えDNA手法は、Sambrookら(1989)、およびAusubelら
(1994)の第1及び2巻に記載のような標準的プロトコルに従って実施されてい
る。植物の分子的研究の標準的材料及び方法は、BIOS Scientific Publications
Ltd. (UK)とBlackwell Scientific Publications, UKとによって共同出版され
た、R.D.D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax (1993)に記載されてい
る。
限定すると解されてはならない。本明細書に引用された参考文献はすべて、引用
により組み込まれる。
説明に従って単離されたクローンを、それらが耐性を与えられる能力について分
析した。実施例2に記載した方法によれば、アラビドプシス属cDNAを発現す
る異なる酵母形質転換体の、浸透圧ストレス及び塩ストレスに対する耐性を、D
Y野生型細胞の耐性と比較した。 + :DY野生型細胞と類似する成長; ++ :形質転換体の成長は、対照(1:1)より10倍高い希釈(1:1
0)で視認することができる。 +++ :形質転換体の成長は、対照(1:1)より100倍高い希釈(1:
100)で視認することができる。 ++++ :形質転換体の成長は、対照(1:1)より1,000倍高い希釈(
1:1,000)で視認することができる。 表2 本発明の実施に用いるための植物発現可能プロモーターの例。 表3 本発明の実施に用いるためのストレス誘導性プロモーターの例。
角果1gを抽出緩衝液(100mMトリスHCl、pH8、10mMのEDTA、1
00mMのLiCl)4ml中で4℃で粉砕し、次いでフェノールで処理し、クロロ
ホルム:イソアミルアルコール(24:1)で抽出することによって単離した。
水相に、LiClを2Mの最終濃度まで加え、全RNAを4℃で一晩沈澱させた
。遠心分離した後、ペレットを、H2O400μlに再溶解し、エタノールで再沈
殿させた。この全RNAから、ポリ(A)メッセンジャーRNAを、オリゴdT
セルローススパンカラム(Pharmacia)にこれを結合させ、カラムを10mMトリ
スHCl、pH7.5、1mMのEDTA、0.5MのNaClで3回洗浄し、1
0mMトリスHCl、pH7.5、1mMのEDTAで65℃でmRNAを溶離させ
ることによって単離した。
a)、及び第一鎖に対してd(T)14−XhoIプライマーを、かつ第二鎖に対
して大腸菌DNAポリメラーゼ(Pharmacia)を用いて合成した。
hoIフラグメントとしてpYXベクター(Ingenius, R&D Systems;バンク1
に対して2μベースのpYX212、バンク2に対してARS/CENベースの
pYX112)にクローニングした。
る。酢酸リチウム形質転換の手順〔Gietz & Schietsl, 1995〕を用いて、酵母の
DY株(MATa, his3, can1-100, ade2, leu2, trp1, ura3::3xSV40AP1-lacZ; N.
Jones, Imperial Cancer Research Fund, London, UKの好意により提供)を、
これらのcDNAで形質転換した。アラビドプシス属cDNAバンクによる形質
転換の後、形質転換体を、100mMのLiClの存在下で成長できる能力につい
て段階的選別〔Lee et al., 1999〕で選別した。LiClは、酵母における塩耐
性スクリーニング〔Haro et al., 1991〕に共通して用いた。酵母に浸透圧耐性
を与える、いくつかのシロイヌナズナの遺伝子を単離した(表1)。選別された
アラビドプシス属cDNAが、酵母に環境ストレスに対する耐性を与える能力を
更に分析するため、そのような選別されたアラビドプシス属cDNAを発現する
それぞれの酵母形質転換体を、浸透圧ストレス及び塩ストレスに接触させた。そ
のため、各形質転換体を、YPD(富裕培地)中で16時間成長させ、細胞密度
を2でOD600に調整した。連続する3段階で、1:10の連続希釈を実施した
。各希釈10μlを2Mのソルビトール(浸透圧ストレス)、又は1.2MのNa
Cl(塩ストレス)を補った固体YPD培地(対照)にスポットし、28℃で3
日間温置した。この液滴成長試験〔Lee et al., 1999も参照されたい〕の結果を
、表1に示す。
1)を、酵母Dbf2転写調節因子との81%の類似性を示す、予測された60
.2kDaのタンパク質をコードするとして特定した。相同性(40%未満の類似
性)は、ヒト、C.エレガンス及びショウジョウバエの推定されるDbf2相同
体についても見出された〔関連する核Dbf2に対してNdrと命名、Millward
et al., 1995〕。At−BBF2の推論されたタンパク質配列(配列番号2)
は、タンパク質キナーゼの11ドメインを含む(図1A)。ドメインVIの非変異
残基であるDとNとの間にあるアミノ酸は、Hanksら(1988)が定義したセリン
/トレオニン特異性(LKPE)の特徴に合致しないが、ドメインVIIIのGSP
DYIALEというペプチドは、充分にセリン/トレオニン特異性を示し、At
−DBF2は、酵母dbf2突然変異株と相補結合することができる(図1B)
。
の器官で発現された。転写体の最高の冗多性は、長角果で特定された。アラビド
プシス属、タバコ及びトマトのサザンブロット分析は、DBF2が、植物で保存
されていると思われることを明らかにした(下記の実施例13を参照されたい)
。AT−DBF2が、LiCl耐性についてのスクリーニングで特定されたため
、他のストレス状況でのその効果を、酵母で試験した(図2)。
evisiaeのDBF2の過剰発現は、酵母における寒冷、熱、塩及び乾燥耐性を増
強する この効果が、植物遺伝子に特異的であるか否かを試験するため、酵母DBF2遺伝
子を同じベクター中で過剰発現させた。液滴成長試験〔図2、及びLee et al.,
1999〕による。酵母における、浸透圧ストレス(ソルビトール)の間と、塩及び
寒冷処理の後とに、ストレス耐性の顕著な増強を42℃で認めることができた。
植物又は酵母遺伝子が与えたストレス耐性の間には、全く差がなかった。At−
DBF2又はDBF2の過剰発現によるストレス耐性の増強は、ストレス状況で
のこれらの遺伝子についての役割を反映する。そのため、酵母及びアラビドプシ
ス属の植物を、ソルビトール及びPEGで誘導した浸透圧ストレスに接触させた
。At−DBF2はもとよりDBF2も、浸透圧ストレスの際に急速に(1〜2
時間)、かつ一時的に誘導された(図3A)。図3Aで認められた最高の誘導に
相当する時間後の、アラビドプシス属植物及び酵母細胞におけるその他の環境ス
トレスの際に、At−DBF2及びDBF2の発現を解析した(図3B)。酵母
と同様に植物でも、高熱、塩、浸透圧の後、及びより少ない程度に寒冷の後に、
明確な誘導が存在し、それは、過剰発現が耐性を増強する対象となるストレスと
完全に相関した。しかし、多くの遺伝子は、転写後の機序がその後の翻訳を阻害
するため、とりわけて関連する適応の役割なしに誘導された。ここで、At−D
BF2タンパク質の量は、抗Dbf2抗体によって検出した限り、ストレスの際
に明確に増大した(図3C)。
うことができる ストレスシグナリング経路間のあり得る相互作用を調べるため、塩感受性のh
og1突然変異株をAt−DBF2及びDBF2で形質転換した。HOG1とい
うMAPキナーゼ経路は、酵母における転写の浸透圧誘導を調節する〔Schuller
et al., 1994〕。この突然変異株の浸透圧感受性は、At−DBF2及びDB
F2の双方の過剰発現によって回復させることができる(図4)。
CCR4複合体との関連を通じて、細胞周期で調節される〔Komarnitsky et al.
, 1998;Johnston et al., 1990〕。この調節を植物で調べた。他の植物細胞系
に比して、最高レベルの培養同調が現在までに達成されている〔Shaul et al.,
1996;Reicheld et al., 1995〕、タバコBY−2細胞を用いた。定常期の細胞
を、新鮮な培地に希釈し、アフィジコリン(S期の開始時に細胞を遮断する)で
24時間処理し、次いで洗浄した。アフィジコリン遮断から解放した後の同調有
糸***の百分率は、約65%であった(図5A〜B)。プローブとしてのAt−
DBF2によるノーザンブロット分析で、1.6kbのタバコDBF2相同体(T
−DBF2)を検出することができた。T−DBF2の定常状態転写レベルは、
細胞周期の間明確に変動し、主にS期の間存在し、G2からM後期まで低下し、
それから、S期でのピークまで上昇した。T−DBF2の発現は、CYCB1.
2(G2〜M期のマーカー)の前に明確に出現するが、T−DBF2転写体がよ
り早期に減少するS/G2移行の際、及びT−DBF2発現がより早期に増大す
るM/G1移行の際以外はH4(S期のマーカー)と平行する。細胞周期マーカ
ーのCYCB1.2及びH4の使用は、Reicheldらに記載されている。
手順〔Nagata et al., 1992〕を用いて同調させた。アフィジコリン遮断からの
解放後、最初期の開始時にプロピザミドで細胞を4時間処理した。プロピザミド
遮断からの解放後の有糸***の百分率は、75%より高かった。T−BDF2は
、Mの後期までは検出できない発現、G1では急激な上昇、及びS中期でのピー
クを示して(図5C〜D)、定期的に発現され、図5A〜Bの結果が確認された
。しかし、細胞周期における植物DBF2についての機能は、このキナーゼ活性
の測定によってのみ想定されたにすぎない。酵母では、DBF2転写体レベルは
、脱リン酸化によって生じるキナーゼ活性化と相関しない〔Toyn & Johnston, 1
994〕。細胞周期の調節におけるDbf2の正確な機能は、知られていない。本
質的な役割は、後期及び終期の間に提唱されている。DNA合成の開始における
Dbf2についての役割の証拠はあるが、G1での活性は、全く測定されなかっ
た。
な細胞周期移行である、M/G1移行を制御する〔Aerne et al., 1998〕。M/
G1制御の関門の存在は、植物細胞で示唆されているが〔Hemmerlin & Bach 199
8〕、G1/S及びG2/Mに比してのその重要性は、調査されていない。
招くが、それは、翻訳後失活の機序の飽和によると思われる〔Toyn & Johnston,
1994〕。機能的に保存されたAt−DBF2の過剰発現は、同じ効果を有する
可能性が最も高い。しかし、細胞周期の不適当な時期でのDbf2活性の存在は
、見かけ上は、その進行に影響しない。著しく対照的に、構成活性は、ストレス
耐性に対して顕著な効果を有する。ストレスの際にAt−DBF2又はDBF2
が果たす役割は、細胞***周期とは無関係である可能性が最も高い。At−DB
F2発現は、すべての植物器官に存在し(冗多発現は、1〜2%の細胞のみが有
糸***活性を有するにすぎない、幹で観察される)、ストレスの際に急速に誘導
されることができる。しかし、細胞周期との関連は、除外されない。酵母では、
DBF2又はAt−DBF2の過剰発現は、酵母細胞がストレスに特に敏感であ
る場合の、G1におけるキナーゼの過剰生産と相関している可能性がある。ほと
んどの植物細胞も、G1で遮断されると考えられるが、ストレス応答との関連性
は、僅かにしか知られていない。
−At−DBF2又はpBIN−35S−ASAt−DBF2の組換えバイナリ
ーベクターを有する、アグロバクテリウム・ツメファシエンスAgrobacterium tu
mefaciensのC58c1RifR(pGV2260)株〔Deblaere et al., 1985
〕によって安定的に形質転換した。pBIN−35S−At−DBF2は、gf
pリポーター遺伝子を有するBamHI−SacIフラグメントが、pYX−A
t−DBF2からのAt−DBF2 cDNAを有するBamHI−SacIフ
ラグメントい置き換えられた、植物バイナリーベクターpBIN m−gfp4
である。p−Bin−35S−CaMVterは、そのHindIII−SacI
制限部位に、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35SRNAプロモ
ーター及びターミネーターを有するpDH51のHindIII-SacIフラグメント
がクローニングされた、植物バイナリーベクターpBIN19である。pBIN
−35S−ASAt−DBF2は、At−DBF2 cDNAが、CaMV35
SRNAプロモーターとターミネーターとの間で、BamHI−SmaI制限部
位に、pYX−At−DBF2からアンチセンスの配向でクローニングされた、
pBin−35S−CaMVterベクターである。より詳しくは、Lee ら(19
99)に記載されている。
剰発現 At−DBF2を過剰発現するトランスジェニック植物細胞を生成して、スト
レス耐性におけるこのタンパク質の役割をin plantaで試験した。タバコBY2
細胞を、強い構成的CaMV35SRNAによって作動されるAt−DBF2
cDNAを有する、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによって安定的に形
質転換した。アンチセンスAt−DBF2RNAも、同じプロモーターの制御下
で過剰発現させた。対照系統は、タバコBY2細胞をpBIN−35S−CaM
Vterで形質転換することによって得た。独立に得られたAt−DBF2を過
剰発現する三つのタバコトランスジェニック細胞系統を、高度な、類似するAt
−DBF2発現で選別し、更に解析した。検出できないタバコDBF2転写体レ
ベルを示した、アンチセンスAt−DBF2を過剰発現する、三つのタバコトラ
ンスジェニック細胞系統を選んだ。アンチセンスという方策によるAt−DBF
2の過剰発現と、内因性遺伝子のダウンレギュレーションとは、2週間後も成長
の有意差を招かなかった(図12A及び12B)。対照的に、NaCl、PEG
誘導乾燥、寒冷又は高温による2週間の処理後は、成長の顕著な差が観察された
。At−DBF2を過剰発現したトランスジェニック系統は、対照系統より明確
に耐性であった。内因性DBF2発現の阻害は、これらのストレスに対する、よ
り高い感受性と相関した。At−DBF2を過剰発現する植物細胞におけるスト
レス耐性の基盤を理解するため、ストレス誘導遺伝子の発現を、対照及びストレ
ス条件で追跡した(図12C)。タバコkin1及びHSP17.6A相同体は
、既に、対照条件でのAt−DBF2過剰発現タバコ細胞で、ストレス条件(P
EG誘導ストレス)の間に観察されたのに類似するレベルまで誘導されていて、
At−DBF2の過剰発現が、ストレスシグナルを模倣し得ることが示唆される
。
の形質転換、及び組換えT−DNAベクターの構築 Clarke、Wei及びLindsey(1992)に記載されたとおり、アグロバクテリウム・
ツメファシエンスのpBIN−35S−At−DBF2、pBIN−35S−A
t−HSP17.6A、pBIN−35S−At−c74の組換えバイナリーベ
クターを有するC58C1RifR(pGV2260)株によって、アラビドプ
シス属を安定的に形質転換した。pBIN−35S−At−HSP17.6A組
換えバイナリーベクターは、下記のとおりに構成した:初めに、pYX−HSP
17.6A(組換えpYX212)中にAt−HSP17.6Ac DNAを含
むEcoRI−XhoIフラグメントを、pYES2(Invitrogen)にクローニ
ングして、pYES−HSP17.6Aを得た。次いで、At−HSP17.6
A cDNAを含むpYES−HSP17.6AのBamHI−SphIフラグ
メントを、植物バイナリーベクターのpBINm−gfp4にクローニングし、
ここで、gfp受容体遺伝子を含むBamHI−SacIフラグメントを削除し
、At−HSP17.6A cDNAと置き換えた。SacI及びSphIが形
成した3′突出末端を、T4DNAポリメラーゼによって平滑末端化した。pB
IN−35S−c74は、中間的なpYES−Atc74ベクターにより、pB
IN−35S−At−HSP17.6Aと類似の方策で構成した。初めに、At
−c74cDNAを、プライマーの5′ AAA AAA CAC ATA C
AG GAA TTC 3′(配列番号122)及び5′ AGT TAG C
TA GCT GAG CTC GAG 3′(配列番号)を用いたPCRで増
幅し、次いで、ベクターpYES2に「平滑末端化しつつ」クローニングし、N
otI及びBstXIで切断し、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化した。そ
の後、pYES−c74のBamHI−SphIフラグメントを、上記に説明し
たとおり、pBIN−gfp4にクローニングした。
ランスジェニックアラビドプシス属系統の各々から、トランスジェニックカルス
を単離した。塩ストレスの際のこれらのトランスジェニックカルスの成長を、測
定し、pBIN−35S−CaMVterで形質転換したトランスジェニックア
ラビドプシス属系統から誘導した、対照カルスと比較した。類似する生重量(5
0〜100mg)のカルス小片(各トランスジェニック系統につき25個)を、そ
れのために、200mM NaClを補ったカルス誘導培地〔Clarke et al., 1992
〕上で成長させた。2週間後、肉眼検査から、At−DBF2、At−HSP1
7.6A又はAt−c74で形質転換したトランスジェニックカルスが、pBI
N−35S−CaMVterで形質転換した対照トランスジェニックカルスより
はるかに良好に見えることは明確であった。後者のカルスは、黄変し、死に始め
ていた。この所見を確かめるため、カルスの生重量を測定した。対照トランスジ
ェニックカルスと比較して、トランスジェニックカルスの生重量は、3系統のそ
れぞれについて、対照トランスジェニックカルスの生重量より少なくとも5倍多
かった。
BIN−35S−At−HSP17.6Aで形質転換したトランスジェニックな
アラビドプシス属植物体からの種子を、カナマイシン(75μg/ml)を補った固
体のK1培地に載せたナイロンフィルター〔Verbruggenら(1993)に記載のとお
り〕上にばら撒き播種した。各組換えpBINバイナリーベクターに対して、少
なくとも5系統の無関係のトランスジェニック系統をストレス耐性について試験
した。これらの系統のそれぞれで、トランス遺伝子の過剰発現を、ノーザンハイ
ブリダイゼーションの実験で確認した。対照植物は、pBIN−35S−CaM
Vterで形質転換したもの、及びpBIN−35S−AS+At−DBF2で
形質転換したトランスジェニック植物であった。播種の後、種子を4℃に一晩保
った(発芽を促進するため)。成長は、22℃、湿度60%、16時間の明/8
時間の暗、70μeinsteinで行なわせた。成長の9日後、フィルターを、200
mM NaClを補った液体のK1培地に移し、一晩インキュベーションした。フ
ィルターを固体のK1培地に移すことによって、植物を5〜6日回復させた。こ
れらの条件下で、対照トランスジェニック植物は、黄変し、その成長は、阻害さ
れ、結果的に死亡した。対照的に、At−DBF2、At−HSP17.6A又
はAt−c74で形質転換したトランスジェニック系統は、非常に好成績で生存
した(図6及び11)。
物を浸透圧ストレスに接触させた。そのためには、pBIN−35S−At−D
BF2、pBIN−35S−At−c74又はpBIN−35S−At−HSP
17.6Aで形質転換したトランスジェニックアラビドプシス属植物体からの種
子を、カナマイシン(75μg/ml)を補った固体のK1培地に載せたナイロンフ
ィルター〔Verbruggenら(1993)に記載のとおり〕上にばら撒き播種した。各組
換えpBINバイナリーベクターに対して、少なくとも5系統の無関係のトラン
スジェニック系統をストレス耐性について試験した。これらの系統のそれぞれで
、トランス遺伝子の過剰発現を、ノーザンハイブリダイゼーションの実験で確認
した。対照植物は、pBIN−35S−CaMVterで形質転換したもの、及
びpBIN−35S−ASAt−DBF2で形質転換したトランスジェニック植
物であった。播種の後、種子を4℃に終夜保った(発芽を促進するため)。成長
は、22℃、湿度60%、16時間の明/8時間の暗、70μeinsteinで行なわ
せた。成長の9日後、フィルターを、20%ポリエチレングリコールを補った液
体のK1培地に移し、一晩インキュベーションした。フィルターを固体のK1培
地に移すことによって、植物を5〜6日回復させた。これらの条件下で、対照ト
ランスジェニック植物は、黄変し、その成長は、阻害され、結果的に死亡した。
対照的に、At−DBF2、At−HSP17.6A又はAt−c74で形質転
換したトランスジェニック系統は、非常に好成績で生存した(図7及び13)。
それらの成長は、ポリエチレングリコールなしの対照培地での成長に匹敵した。
物を高温及び低温に接触させた。そのためには、pBIN−35S−At−DB
F2又はpBIN−35S−At−c74で形質転換したトランスジェニックな
アラビドプシス属植物体からの種子を、カナマイシン(75μg/ml)を補った固
体のK1培地に載せたナイロンフィルター〔Verbruggenら(1993)に記載のとお
り〕上にばら撒き播種した。各組換えpBINバイナリーベクターに対して、少
なくとも5系統の無関係のトランスジェニック系統をストレス耐性について試験
した。これらの系統のそれぞれで、トランス遺伝子の過剰発現を、ノーザンハイ
ブリダイゼーションの実験で確認した。対照植物は、pBIN−35S−CaM
Vterで形質転換したもの、及びpBIN−35S−ASAt−DBF2で形
質転換したトランスジェニック植物であった。播種の後、種子を4℃に終夜保っ
た(発芽を促進するため)。成長は、22℃、湿度60%、16時間の明/8時
間の暗、70μeinsteinで行なわせた。成長の9日後、高温ストレスによる実験
のため、植物を48℃に2時間接触させた。低温による実験のためには、−7℃
まで徐々に低下する温度に、植物を接触させた。フィルターを固体のK1培地に
移すことによって、植物を5〜6日回復させた。
され、結果的に、それらは死亡した。At−DBF2又はAt−c74で形質転
換したトランスジェニック系統は、非常に好成績で生存した。それらの成長は、
正常温度による対照条件下での成長に匹敵した(図8及び9を参照されたい)。
物を、発芽の際に塩ストレスに接触させた。pBIN−35S−At−DBF2
又はpBIN−35S−At−c74で形質転換したトランスジェニック植物体
からの滅菌した成熟種子を、0.8%寒天、及び30g/lのショ糖とともにMS
〔Murashige & Skoog〕培地を含むペトリ皿の上に載せた。対照植物は、pBI
N−35S−CaMVterで形質転換したものであった。発芽、及びpH5.
7の調整の前に、NaClを、125mMの最終濃度まで加えた。1皿あたり平均
40〜50粒の種子を有するこれらのペトリ皿3枚を、各実験での処理ごとに用
いた。完全な実験は、2回反復した。22℃での種子の発芽を追跡した。種子は
、緑色の根子葉の出現が生じた後に、発芽すると思われた。
の発芽は、互いに、及び野生型植物に非常に類似した。125mM NaClを補
った培地では、At−DBF2又はAt−c74を過剰発現するトランスジェニ
ック系統からの種子は、対照トランスジェニック系統より有意に好成績で発芽し
た。pBIN−35S−CaMVterで形質転換したトランスジェニック系統
からの種子の10%未満が、これらの条件下で発芽した。対照的に、At−DB
F2又はAt−c74を過剰発現するトランスジェニック系統からの種子の70
%より多くが、125mM NaClを含む培地で発芽した。
ション DBF2相同体が他の植物種にも存在するか否かを調べるために、完全長At
−DBF2をプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーション解析を実施
した。ゲノムDNAを、Dellaportaら(1983)に従ってタバコ、トマト及びイネ
から抽出し、フェノール:クロロホルム抽出によって更に精製した。DNA(1
0μg)を、制限酵素で消化し、HindIIIで消化したラムダDNAを分子サイ
ズ標準として用いて、1%(w/v)アガロースゲルで分離した。DNAは、0.
4規定のNaOH中で、ナイロン膜(Hybond N; Amersham, Little Chalfont、
英国)に形質転換した。フィルターを、30秒間UV架橋結合させ、ハイブリダ
イゼーション液(2x SSPE、0.1%(w/v)SDS、5xデンハート液)
中で、200g/m3のサケ***変性DNAを用いて、56℃で3時間プレハイブリ
ダイズさせ、放射線標識下プローブと終夜ハイブリダイズさせた。1X SSP
Eは、0.15M NaCl/0.01Mリン酸二水素ナトリウム/1mM EDTA
である。
間、次いで、1x SSPE、0.1%(w/v)SDS中で20分間、最後に0.
1x SSPE、0.1%(w/v)SDS中で20分間、洗浄した。フィルターを
、補力スクリーンの存在下で、24時間X線フィルム(Kodak X-AR; Kodak, NY
、米国)に露出させた。
BF2との少なくとも1種類の相同体を有することを示す。
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である。(A)は、At−DBF2の推定されるアミノ酸配列と、酵母DBF2
のそれとの比較を示し、整列を最適化するために、間隙を導入した。At−DB
F2配列の上のローマ数字は、Hanksら(1988)によって定義された、タンパク
質キナーゼ触媒性サブドメインを示す。(B)は、dbf2の補完を示す。db
f2突然変異体のS7−4A〔MATa dbf2Δ::URA3 ura3 l
eu2 ade5 trp1 his7;Toyn & Johnston, 1994〕(B1)は、制
限温度(37℃)で膨潤した対の娘細胞(ダンベル)を形成する。dbf2の欠
陥のある形態学は、At−DBF2cDNA(B2)またはDBF2(B3);
野生型〔CG378株、MAT1 ade5 leu2 trp1 ura3〕(B
4)を有するpYX112動原体プラスミド(Ingenius, R&D system)での形質
転換によって補完することができる。対数期培養物を28℃から37℃に写し、
16時間後に写真撮影した。16時間後には、S7−4A細胞の97%がダンベ
ルの形態学で捕捉された(B1)のに対し、B1、B3及びB4では、6.1及
び0%のダンベルが観察された。菌株は、Dr. Lindl(Max Planck Institut fue
r Zuchtungsforschung, Koeln、ドイツ国)の好意によって提供された。
である。(A)は、At−DBF2の推定されるアミノ酸配列と、酵母DBF2
のそれとの比較を示し、整列を最適化するために、間隙を導入した。At−DB
F2配列の上のローマ数字は、Hanksら(1988)によって定義された、タンパク
質キナーゼ触媒性サブドメインを示す。(B)は、dbf2の補完を示す。db
f2突然変異体のS7−4A〔MATa dbf2Δ::URA3 ura3 l
eu2 ade5 trp1 his7;Toyn & Johnston, 1994〕(B1)は、制
限温度(37℃)で膨潤した対の娘細胞(ダンベル)を形成する。dbf2の欠
陥のある形態学は、At−DBF2cDNA(B2)またはDBF2(B3);
野生型〔CG378株、MAT1 ade5 leu2 trp1 ura3〕(B
4)を有するpYX112動原体プラスミド(Ingenius, R&D system)での形質
転換によって補完することができる。対数期培養物を28℃から37℃に写し、
16時間後に写真撮影した。16時間後には、S7−4A細胞の97%がダンベ
ルの形態学で捕捉された(B1)のに対し、B1、B3及びB4では、6.1及
び0%のダンベルが観察された。菌株は、Dr. Lindl(Max Planck Institut fue
r Zuchtungsforschung, Koeln、ドイツ国)の好意によって提供された。
に対する耐性を増強することを示す図である。酵母細胞をYPD中で増殖させ、
細胞密度を2でOD600に調整した。(1)DY、(2)DBF2、pYX−Y
DBF2を含むpYX212で形質転換したDY、(3)ベクターのみでか、又
は(4)At−DBF2、pYX−AtDBF2を含むベクターで形質転換した
DY株を用いた。連続希釈は、1:10の段階で実施。各希釈10μlを2Mのソ
ルビトール(浸透圧ストレス)、又は1.2MのNaCl(塩ストレス)、又は
H2O2(酸化ストレス)を補った固体YPD培地(対照)にスポットし、28℃
又は42℃(高熱ストレス)又は4℃(寒冷ストレス)で3日間温置した。
示された時間、20%PEG6000で処理した植物におけるAt−DBF2誘
導の動態、及び2Mのソルビトールで処理した酵母におけるDBF2のそれを示
すノーザン分析。(b)対照条件〔Verbruggenら(1993)に記載のとおり〕で(
1)、37℃で(2)、20%PED6000とともに(3)、1% NaCl
とともに(4)、4℃で(5)、又は0.4mM H2O2とともに(6)、5時間
成長させた10日齢の植物におけるAt−DBF2のノーザン分析;及びYPD
中で(1)、37℃で(2)、2Mソルビトールとともに(3)、1.2M Na
Clとともに(4)、4℃で(5)、又は0.4mM H2O2とともに(6)、1
1/2時間増殖させた酵母細胞におけるDBF2のそれを示す。負荷の対照は、
EtBr染色で実施し、各ノーザン分析の下に示す。(c)は、アラビドプシス
属におけるAt−DBF2のウエスタン分析である。サンプルは、(b)で分析
したのと類似する。用いた抗体は、酵母Dbf2に対して形成させ、Dr. Leindl
(Max Planck Institut fuer Zuchtungsforschung, Koeln、ドイツ国)の好意に
よって提供された。
og1突然変異株(4)〔W303−1A,MATa,hog1Δ::TRP1
〕及び野生型(W303)は、Dr. Thevelein(Katholieke Universiteit, Leuv
en、ベルギー国)の好意によって提供された。hog1突然変異株を、pYX−YD
BF2(2)又はpYX−AtDBF2(3)で形質転換した。4株を、それぞ
れ、YPD(富裕培地)中で16時間成長させ、細胞密度を2でOD600に調整
した。連続希釈は、1:10で、連続する5段階で実施。各希釈10μlを、固
体YPD培地(対照)、又は0.9M NaClを補った固体YPD培地にスポッ
トし、28℃で3日間温置した。
に定期的に発現させた。タバコDBF2の発現は、At−DBF2をプローブと
して用い、アフィジコリン(a及びb)又はプウロピザミド(c及びd)で同調
させたBY2細胞について追跡。DNA合成、及び有糸***指数の相対速度の測
定、細胞周期マーカーCYCB1.2及びH4マーカーの使用は、以前に記載さ
れている〔Reicheld et al., 1995〕。T−DBF2転写体レベルは、PhosphorI
mager(Molecular Dynamics)を用いて、b及びcに示されたブロットから定量
した。
、P35Sの対照(右上の区画)、及びP35S−アンチセンスAt−DBF2
(左下の区画)で形質転換したシロイヌナズナの植物体の、終夜の200mM N
aClの塩ストレスを与えた際の成長の比較の結果を示す。
、P35Sの対照(右上の区画)、及びP35S−アンチセンスAt−DBF2
(左下の区画)で形質転換したシロイヌナズナの植物体の、終夜の20%PEG
によって誘導した、浸透圧ストレスを与えた際の成長の比較の結果を示す。
、P35Sの対照(右上の区画)、及びP35S−アンチセンスAt−DBF2
(左下の区画)で形質転換したシロイヌナズナの植物体の、温度を7℃まで徐々
に降下させることによって寒冷ストレスを与えた際の成長の比較の結果を示す。
、P35Sの対照(右上の区画)、及びP35S−アンチセンスAt−DBF2
(左下の区画)で形質転換したシロイヌナズナの植物体の、48℃で2時間の高
熱ストレスを与えた際の成長の比較の結果を示す。
、P35Sの対照(右上の区画)、及びP35S−アンチセンスAt−DBF2
(左下の区画)で形質転換したシロイヌナズナの植物体の成長の比較の結果を示
す。P35S−At−DBF2で形質転換した植物は、対照トランスジェニック
植物に比して、形態学的異常を示さないと結論付けることができる。
シロイヌナズナでの、塩ストレス耐性試験の結果を示す。対照植物(A及びBの
左下)は、pBin−35S−CaMVterで形質転換したトランスジェニッ
ク系統である。Aのその他の区画は、HSP 17.6Aを過剰発現する5系統
の無関係に得られたトランスジェニック系統である。Bのその他の区画は、c7
4を過剰発現する5系統の無関係に得られたトランスジェニック系統である。
影響を示す。BY2細胞を、CaMVの35SRNAプロモーターによって作動
されるAt−DBF2を有する組換えT−DNAベクターである、pBIN−3
5S−At−DBF2(Aの上左及び右の区画、又はBの菱形)、CaMVの3
5Sプロモーター及びターミネーターである、pBIN−35S−CaMVte
r(Aの下左の区画、又はBの三角形)、又はCaMVの35Sプロモーターp
BIN−35S−ASAt−DBF2の制御下にあるアンチセンスAt−DBF
2(Aの下右の区画、又はBの円形)で、シロイヌナズナによって形質転換した
。(A)300mM NaCl、25%PEG、2mM H2O2を補ったか、又は47
℃での(高熱)固体培地での成長の3週間後の、同じ量のトランスジェニック細
胞の様態。(B)液体培地中の懸濁細胞の増殖。ストレスに際しては、増殖を、
生重量として測定し、ストレスを受けない増殖(対照)(a)の百分率として表
わした。ストレスは、継代した後に(=0日目)、示された温度(e)、及びN
aCl(b)、PEG(c)、及びH2O2(f)の濃度で加えた。寒冷ショック
(d)については、細胞を、0℃で2日間保ってから、22℃で2週間培養した
。各構築物について、3系統の無関係のトランスジェニック系統のデータを蓄え
た。図面に過大な負担を与えないため、標準偏差は示さなかった(最大値:測定
値の15%)。(C)At−DBF2+TDBF2、kin1及びHSP17.
6。pBIN−35S−At−DBF2(1)及び(2)、pBIN−35S−
CaMVter(3)、及びpBIN−35S−ASAt−DBF2(4)で形
質転換した無関係の系統から、全RNAを抽出した。浸透圧ストレスは、10%
PEGの5時間の処理で誘導した(stressed)。
影響を示す。BY2細胞を、CaMVの35SRNAプロモーターによって作動
されるAt−DBF2を有する組換えT−DNAベクターである、pBIN−3
5S−At−DBF2(Aの上左及び右の区画、又はBの菱形)、CaMVの3
5Sプロモーター及びターミネーターである、pBIN−35S−CaMVte
r(Aの下左の区画、又はBの三角形)、又はCaMVの35Sプロモーターp
BIN−35S−ASAt−DBF2の制御下にあるアンチセンスAt−DBF
2(Aの下右の区画、又はBの円形)で、シロイヌナズナによって形質転換した
。(A)300mM NaCl、25%PEG、2mM H2O2を補ったか、又は47
℃での(高熱)固体培地での成長の3週間後の、同じ量のトランスジェニック細
胞の様態。(B)液体培地中の懸濁細胞の増殖。ストレスに際しては、増殖を、
生重量として測定し、ストレスを受けない増殖(対照)(a)の百分率として表
わした。ストレスは、継代した後に(=0日目)、示された温度(e)、及びN
aCl(b)、PEG(c)、及びH2O2(f)の濃度で加えた。寒冷ショック
(d)については、細胞を、0℃で2日間保ってから、22℃で2週間培養した
。各構築物について、3系統の無関係のトランスジェニック系統のデータを蓄え
た。図面に過大な負担を与えないため、標準偏差は示さなかった(最大値:測定
値の15%)。(C)At−DBF2+TDBF2、kin1及びHSP17.
6。pBIN−35S−At−DBF2(1)及び(2)、pBIN−35S−
CaMVter(3)、及びpBIN−35S−ASAt−DBF2(4)で形
質転換した無関係の系統から、全RNAを抽出した。浸透圧ストレスは、10%
PEGの5時間の処理で誘導した(stressed)。
影響を示す。BY2細胞を、CaMVの35SRNAプロモーターによって作動
されるAt−DBF2を有する組換えT−DNAベクターである、pBIN−3
5S−At−DBF2(Aの上左及び右の区画、又はBの菱形)、CaMVの3
5Sプロモーター及びターミネーターである、pBIN−35S−CaMVte
r(Aの下左の区画、又はBの三角形)、又はCaMVの35Sプロモーターp
BIN−35S−ASAt−DBF2の制御下にあるアンチセンスAt−DBF
2(Aの下右の区画、又はBの円形)で、シロイヌナズナによって形質転換した
。(A)300mM NaCl、25%PEG、2mM H2O2を補ったか、又は47
℃での(高熱)固体培地での成長の3週間後の、同じ量のトランスジェニック細
胞の様態。(B)液体培地中の懸濁細胞の増殖。ストレスに際しては、増殖を、
生重量として測定し、ストレスを受けない増殖(対照)(a)の百分率として表
わした。ストレスは、継代した後に(=0日目)、示された温度(e)、及びN
aCl(b)、PEG(c)、及びH2O2(f)の濃度で加えた。寒冷ショック
(d)については、細胞を、0℃で2日間保ってから、22℃で2週間培養した
。各構築物について、3系統の無関係のトランスジェニック系統のデータを蓄え
た。図面に過大な負担を与えないため、標準偏差は示さなかった(最大値:測定
値の15%)。(C)At−DBF2+TDBF2、kin1及びHSP17.
6。pBIN−35S−At−DBF2(1)及び(2)、pBIN−35S−
CaMVter(3)、及びpBIN−35S−ASAt−DBF2(4)で形
質転換した無関係の系統から、全RNAを抽出した。浸透圧ストレスは、10%
PEGの5時間の処理で誘導した(stressed)。
転換したシロイヌナズナの、終夜の20%PEGによって誘導した浸透圧ストレ
スを加えた際の成長の結果を示す。二つの無関係の実験の結果を示し、それぞれ
は、At-HSP17.6Aを過剰発現する無関係に得られた3系統のトランスジェニック
系統で実施した(上左、並びに下左及び右)。
ヌナズナの、125mM NaClを補った無機培地での発芽の結果を示す。二つ
の無関係の実験の結果を示し、それぞれは、Atc74を過剰発現する無関係に
得られた2系統のトランスジェニック系統で実施した(上二つの区画)。
Claims (37)
- 【請求項1】 植物の環境ストレスに関与するコーディング配列及び/又は
遺伝子を含むポリ核酸を得る方法であって、コーディング配列を含むcDNAラ
イブラリーを長角果から調製し、該コーディング配列を酵母細胞に機能的な形式
で導入し、環境ストレス条件に対する耐性又は抵抗性の増強へと導く、該形質転
換された酵母細胞内のポリ核酸についてスクリーニングすることを含む、ポリ核
酸を得る方法。 - 【請求項2】 請求項1記載の方法によって得られる単離されたポリ核酸。
- 【請求項3】 表1に列挙されたとおりのポリペプチドをコードする、請求
項2記載の単離されたポリ核酸。 - 【請求項4】 (a)配列番号1、5、7、9、11、13、15、17、
19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、
43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、
67、69、71、73、75、77若しくは121のいずれか1つ、又はその
相補鎖; (b)(a)に定義された配列、又はそのフラグメントとハイブリダイズする
ポリ核酸配列; (c)遺伝暗号の結果として(a)又は(b)に定義されたポリ核酸配列に縮
重されるポリ核酸配列;或いは (d)(a)〜(c)のいずれかのポリ核酸にコードされるタンパク質のフラ
グメントをコードしているポリ核酸配列 から選ばれる請求項3記載の単離されたポリ核酸。 - 【請求項5】 酵母DBF2キナーゼの植物相同体をコードしている請求項
2〜4のいずれかに記載の単離ポリ核酸。 - 【請求項6】 (a)配列番号1、若しくはその相補鎖; (b)(a)に定義された配列、若しくはそのフラグメントとハイブリダイズ
する、ポリ核酸配列; (c)(a)若しくは(b)に定義されたポリ核酸配列に対する遺伝暗号の結
果として縮重されたポリ核酸配列;又は (d)(a)〜(c)のいずれかのポリ核酸によってコードされるタンパク質
のフラグメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される請求項5記載の単離ポリ核酸。 - 【請求項7】 環境ストレス条件に対する増強された耐性又は抵抗性を有す
るトランスジェニック植物を生産するための、HSP 17.6Aタンパク質を
コードしている請求項2又は3記載の単離ポリ核酸の使用。 - 【請求項8】 ポリ核酸が (a)配列番号3、若しくはその相補鎖; (b)(a)に定義された配列、若しくはそのフラグメントとハイブリダイズ
するポリ核酸配列; (c)遺伝暗号の結果として(a)若しくは(b)に定義されたポリ核酸配列
に縮重されるポリ核酸配列;又は (d)(a)〜(c)のいずれかのポリ核酸にコードされるタンパク質のフラ
グメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される、それによりコードされるタンパク質の植物細胞における発現の
ための、請求項7記載の単離ポリ核酸の使用。 - 【請求項9】 環境ストレス条件に対する増強された耐性又は抵抗性を有す
るトランスジェニック植物を生産するための、 (a)配列番号79、81、83、85、87、89、91、93、95、9
7、99、101、103、105、107、109、111、113、115
、117若しくは119、又はその相補鎖; (b)(a)に定義された配列又はそのフラグメントとハイブリダイズするポ
リ核酸配列; (c)遺伝暗号の結果として(a)又は(b)に定義されたポリ核酸配列に縮
重されるポリ核酸配列;或いは (d)(a)〜(c)のいずれかのポリ核酸にコードされるタンパク質のフラ
グメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される、上記に定義された単離ポリ核酸の使用。 - 【請求項10】 (a)配列番号5、若しくはその相補鎖; (b)(a)に定義された配列、若しくはそのフラグメントとハイブリダイズ
するポリ核酸配列; (c)遺伝暗号の結果として(a)若しくは(b)に定義されたポリ核酸配列
に縮重されるポリ核酸配列;又は (d)(a)〜(c)のいずれかのポリ核酸にコードされるタンパク質のフラ
グメントをコードしているポリ核酸配列 から選択される、c74タンパク質をコードする、請求項2〜4のいずれかに記
載の単離ポリ核酸。 - 【請求項11】 請求項2〜10のいずれか1項に記載若しくは定義された
ポリ核酸にコードされる、単離されたポリペプチド、又はその機能性フラグメン
ト。 - 【請求項12】 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18
、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42
、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66
、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90
、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110
、112、114、116、118又は120のいずれかの配列の少なくとも一
部を有する、請求項11記載の単離ポリペプチド。 - 【請求項13】 環境ストレスに対する増強された耐性又は抵抗性を有する
植物を生産する方法であって、請求項2〜10のいずれか1項に記載又は定義さ
れたポリ核酸を含む組換えDNAを、環境ストレスに対する増強された耐性又は
抵抗性を付与するのに充分な量で発現する植物細胞に、一時的に導入することを
含む方法。 - 【請求項14】 環境ストレスに対する増強された耐性又は抵抗性を有する
植物を生産する方法であって、請求項2〜10のいずれか1項に記載又は定義さ
れたポリ核酸を含む組換えDNAを、環境ストレスに対する増強された耐性又は
抵抗性を付与するのに充分な量で発現する植物細胞に、安定的に導入することを
含む方法。 - 【請求項15】 植物DBF2キナーゼをコードしている請求項5又は6記
載のポリ核酸を該植物に導入することを含む、環境ストレスに対する増強された
耐性又は抵抗性を有する植物を生産するための、請求項13又は14記載の方法
。 - 【請求項16】 HSP 17.6Aタンパク質をコードしている請求項7
又は8記載のポリ核酸を該植物に導入することを含む、環境ストレスに対する増
強された耐性又は抵抗性を有する植物を生産するための、請求項16記載の方法
。 - 【請求項17】 c74タンパク質をコードしている請求項10記載のポリ
核酸を該植物に導入することを含む、環境ストレスに対する増強された耐性又は
抵抗性を有する植物を生産するための、請求項13又は14記載の方法。 - 【請求項18】 1種類以上の組換えDNA分子を植物細胞のゲノムに導入
することを含み、該組換えDNA分子が、 請求項2〜10のいずれか1項に記載又は定義されたポリ核酸と、 植物発現可能プロモーターであって、それによって、該ポリ核酸が、同じ転写
単位内になり、かつ該植物発現可能プロモーターの制御下になる植物発現可能プ
ロモーター を含む、請求項13〜17のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項19】 環境ストレスに対する増強された耐性又は抵抗性を有する
植物を生産する方法であって、1種類以上の組換えDNA分子を植物細胞のゲノ
ムに導入することを含み、該組換えDNA分子が、 該植物細胞内で有効量で発現されたときに、請求項2〜10のいずれか1項に
記載又は定義された、内因性ポリ核酸の発現を間接的に増大させるか、若しくは
誘導するか、又は請求項11若しくは12のポリペプチドの活性を間接的に高め
るか又は誘導するタンパク質をコードしているDNAと、 植物発現可能プロモーターであって、それによって、該DNAが、同じ転写単
位内になり、かつ該植物発現可能プロモーターの制御下になる植物発現可能プロ
モーター を含む方法。 - 【請求項20】 該DNAが、請求項2〜10のいずれか1項に記載又は定
義された該内因性ポリ核酸配列の発現を増大させるか、若しくは誘導することが
できるセンス若しくはアンチセンスRNA分子、又はリボザイムをコードする、
請求項19記載の方法。 - 【請求項21】 請求項2〜10のいずれか1項に記載又は定義されたポリ
核酸と、植物発現可能プロモーターであって、それによって、該ポリ核酸が、同
じ転写単位内になり、かつ該植物発現可能プロモーターの制御下になる植物発現
可能プロモーターとを含む、組換えポリ核酸。 - 【請求項22】 (a)植物細胞内で発現されたときに、請求項2〜10の
いずれか1項に記載又は定義された、内因性ポリ核酸の発現を高めるか、若しく
は誘導するか、或いは請求項11又は12のポリペプチドの活性を上昇させるか
、若しくは誘導するタンパク質をコードしているDNAと、 (b)植物発現可能プロモーターであって、それによって、該DNAが、同じ
転写単位内になり、かつ該植物発現可能プロモーターの制御下になる植物発現可
能プロモーターとを含む、組換えポリ核酸。 - 【請求項23】 該DNAが、植物細胞内で有効量で発現されたときに、請
求項2〜10のいずれか1項に記載又は定義された内因性ポリ核酸の発現を増大
させるか、若しくは誘導するか、又は請求項11若しくは12のタンパク質の活
性を誘導するか、若しくは高める、アンチセンスRNA、リボザイム若しくはセ
ンスRNAをコードしている請求項22記載の組換えポリ核酸。 - 【請求項24】 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、
19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、
43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、
67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、
90、91、93、95、97、99、101、103、105、107、10
9、111、113、115、117、119若しくは121のいずれかのヌク
レオチド配列の少なくとも一部を含む請求項21記載の組換えポリ核酸、又はそ
の一部。 - 【請求項25】 表1に列挙されたタンパク質をコードしている遺伝子のコ
ーディング配列の少なくとも一部を含む請求項21〜24のいずれかに記載の組
換えポリ核酸。 - 【請求項26】 該植物発現可能プロモーターが、構成プロモーターである
請求項21〜25のいずれか1項に記載の組換えポリ核酸。 - 【請求項27】 該植物発現可能プロモーターが、ストレス誘導性、又は器
官若しくは組織特異的プロモーターである、請求項21〜25のいずれか1項に
記載された組換えポリ核酸。 - 【請求項28】 該植物発現可能プロモーターが、CaMVの35Sプロモ
ーターである請求項21〜26のいずれか1項に記載された組換えポリ核酸。 - 【請求項29】 請求項2〜10のいずれか1項に記載又は定義された少な
くとも1種類の単離されたポリ核酸で形質転換された組換え宿主細胞。 - 【請求項30】 請求項21〜28のいずれか一項に記載された組換えポリ
核酸で形質転換された植物細胞。 - 【請求項31】 本質的に請求項30記載の植物細胞からなる植物。
- 【請求項32】 本質的に請求項30記載の植物細胞からなるカルス。
- 【請求項33】 該組換えDNAを含む、請求項31記載の植物の収穫でき
る部分、器官、組織、又は増殖材料。 - 【請求項34】 トランスジェニック植物を生産するための、請求項21〜
28のいずれか1項に記載の組換えポリ核酸の使用。 - 【請求項35】 請求項2〜10のいずれか1項に記載又は定義されたポリ
核酸配列の一部であり、かつ該ポリ核酸又はその相補体と特異的にハイブリダイ
ズするプローブ。 - 【請求項36】 請求項2〜10のいずれか1項に記載又は定義されたポリ
核酸配列の一部であり、かつ該ポリ核酸又はその相補体を特異的に増幅するプラ
イマー。 - 【請求項37】 請求項2〜10のいずれか1項に記載若しくは定義された
ポリ核酸配列、請求項11若しくは12に記載されたポリペプチド、請求項35
記載のプローブ、又は請求項36に記載のプライマーを含む組成物。
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