JP2002523091A - 異種ｇタンパク質共役受容体の機能を改変する方法 - Google Patents

異種ｇタンパク質共役受容体の機能を改変する方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｇタンパク質の結合および受容体の応答が改変された変異型Ｇタンパク質共役受容体、かかる受容体を発現する酵母細胞、かかる細胞を作出するのに有用なベクター、ならびにそれを作出および使用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野 本発明は、Ｇタンパク質の結合および受容体の応答が改変された変異型Ｇタン
パク質共役受容体、かかる受容体を発現する宿主細胞、かかる細胞を作出するの
に有用なベクター、ならびにそれを作出および使用する方法に関する。
【０００２】 背景技術 神経伝達物質、ホルモン、臭気物質、および光などの多くの細胞外シグナルの
作用は三つ組のタンパク質によって媒介されており、これは酵母から哺乳類にい
たる生物において同定されている。この三つ組は三量体グアニンヌクレオチド結
合性調節タンパク質（Ｇタンパク質）に結合した受容体からなり、これが次に細
胞のエフェクターと結合する。これらの受容体は７つのトランスメンブラン・ド
メインを有し、それらのＧタンパク質との会合のために「Ｇタンパク質共役受容
体」（「ＧＰＣＲ」）と名づけられている。
【０００３】 調節Ｇタンパク質は３つのサブユニット：グアニルヌクレオチド結合性αサブ
ユニット；βサブユニット；およびγサブユニットからなる(B.R. Conklin and
H.R.Bourne(1993))。Ｇタンパク質はＧＤＰまたはＧＴＰがαサブユニットに結
合しているかどうかによって２つの形態の間を循環する。ＧＤＰが結合している
場合には、Ｇタンパク質はへテロ三量体であるＧαβγ複合体として存在する。
ＧＴＰが結合している場合には、αサブユニットは解離し、Ｇβγ複合体が残る
。重要なことに、Ｇαβγ複合体は細胞膜において活性化されたＧタンパク質共
役受容体と機能し得る形で会合し、ＧＴＰと結合型ＧＤＰの交換率が高まるので
、Ｇβγ複合体からの結合したＧαサブユニットの解離率も高まる。遊離Ｇαサ
ブユニットおよびＧβγ複合体はシグナルを種々のシグナル変換経路の下流エレ
メントに伝達することができる。これら下流の細胞エフェクタータンパク質の例
としては、中でも、アデニレートシクラーゼ、イオンチャンネルおよびホスホリ
パーゼが挙げられる。現象のこの基本的なスキームが種々の細胞シグナル伝達現
象の多様性の基礎をなしている(H.G. Dohlman et al. (1991))。
【０００４】 重要な生化学経路におけるそれらの遍在性により、Ｇタンパク質共役受容体は
新規治療薬の重要な標的に相当する。次に、かかる薬剤の発見には高い特異性の
スクリーニングアッセイおよび処理用語で高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）ア
ッセイが必ず必要となろう。Ｇタンパク質共役受容体の機能的発現がなされるよ
う遺伝的に改変された酵母系統などの微生物を利用するスクリーニングアッセイ
は種々の病状に関係する多数の受容体へのリガンド結合に関する研究に著しい利
点を与える。
【０００５】 しかしながら、野生型受容体で形質転換された微生物は増殖アッセイにおいて
、例えば、ヘテロ三量体Ｇタンパク質と相互作用できないこと、不適当な局在化
および／または脱感作を示して、あまりうまく働かない場合もある。多くのＧＰ
ＣＲは慢性および持続性のアゴニスト刺激に応答してリン酸化されるが、これが
脱感作とそれに続く受容体の隔離またはインターナリゼーションをもたらすこと
も多い。ＧＰＣＲの脱感作はヘテロ三量体Ｇタンパク質との相互作用からの解放
を引き起こす。このプロセスはＧタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＰＫ）、タ
ンパク質キナーゼＡ（ＰＨＡ）、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）およびカゼイ
ンキナーゼ（ＣＫ）をはじめとする種々の調節受容体タンパク質キナーゼによっ
て媒介されている。インターナリゼーションは受容体により媒介されるエンドサ
イトーシスによる原形質膜からのＧＰＣＲの除去を必要とする。インターナリゼ
ーションを受けた受容体は再循環して細胞表面に戻るか、または分解のためにリ
ソソーム／液胞コンパートメントに送達され得る。ユビキチンによって媒介され
る分解経路もこのプロセスに関与している。受容体リン酸化および隔離／インタ
ーナリゼーションの最終的な結果はしばしば細胞増殖の抑止であり、これにより
スクリーニングアッセイにおける遺伝的に改変された微生物の有用性は著しく低
いものとなる。
【０００６】
【発明の概要】
本発明の目的はいずれかの真核細胞、好ましくは酵母細胞において実施される
、高処理量スクリーニングアッセイにおいて十分に機能する改変型Ｇタンパク質
共役受容体を提供することである。従って、本発明の第１の態様は受容体をヘテ
ロ三量体Ｇタンパク質とより有効に結合させ、かつ／または細胞脱感作および／
もしくは隔離／インターナリゼーション機構と相互作用できなくする、かつ／ま
たは原形質膜に適当に局在化させることによって、ＧＰＣＲの機能を向上させる
よう改変されている、Ｇタンパク質共役受容体をコードするヌクレオチド配列に
向けられる。好ましい態様によれば、かかる改変は改変型アゴニスト刺激性増殖
促進能をもたらす。本発明に包含される、Ｇタンパク質共役受容体をコードする
ヌクレオチド配列の１つの特定の改変は、いずれかの細胞内ドメインまたは内部
ドメインに隣接する膜領域における変異である。この変異は例えば、点突然変異
をはじめとする欠失であり得る。
【０００７】 本発明はまた、有利なＧタンパク質結合特性または酵母細胞脱感作および／も
しくは隔離／インターナリゼーション機構を受けないドメインを提供する異種Ｇ
ＰＣＲの細胞内ドメインを用いて、注目されるＧＰＣＲ中の匹敵するドメインが
置換されているキメラＧＰＣＲに向けられる。本発明はまた、キメラＧＰＣＲを
コードする改変型ヌクレオチド配列、改変型ヌクレオチド配列を含んでなる発現
ベクター、およびそれらで形質転換された宿主細胞に関する。
【０００８】 本発明のさらなる態様は、試験化合物の細胞増殖に対する作用を測定すること
によって本発明の変異体またはキメラＧＰＣＲへ結合するリガンドの作用を求め
るために化合物をアッセイする改良法である。変異型ＧＰＣＲは慢性および持続
性アゴニスト刺激による細胞増殖抑止率を抑えるかまたは減少させ、それによっ
て先行技術のスクリーニング法で起こる偽陰性数が少なくなり、かつ／またはバ
イオアッセイの感度が高まる。
【０００９】
【発明の具体的な説明】改変型Ｇタンパク質共役受容体 Ｇタンパク質共役受容体をコードするヌクレオチド配列は、受容体をヘテロ三
量体Ｇタンパク質とより有効に結合させる、かつ／または細胞脱感作および／も
しくは隔離／インターナリゼーション機構と相互作用できなくすることによって
ＧＰＣＲの機能を向上させるよう改変することができる。かかる改変は改変型ア
ゴニスト刺激性酵母細胞増殖促進能をもたらす。宿主細胞におけるＧＰＣＲ−Ｇ
タンパク質結合の改変および／または受容体リン酸化および／もしくは隔離／イ
ンターナリゼーションの排除は有用な酵母細胞増殖応答を刺激できない野生型異
種ＧＰＣＲの機能を改変する手段を提供する。従って、その野生型形態では機能
できないＧＰＣＲが本発明の方法によって働くようになり得る。
【００１０】 宿主細胞におけるＧＰＣＲ−Ｇタンパク質結合の改変およびまたは受容体リン
酸化および／もしくは隔離／インターナリゼーションの排除は、以下に示される
実施例に記載されたもの、または当業者に公知のものなどの通常の技術を用いる
ことによって評価すればよい。例えば、野生型に対する変異型ＧＰＣＲの機能の
改変はノイズに対するシグナル率の増加、および／または液体バイオアッセイの
感度の増加として定量できる。ノイズに対するシグナル率はアゴニスト誘導性増
殖率とアゴニストの不在下で認められる増殖率とを比較することによって求めら
れる。変異型ＧＰＣＲのアゴニスト刺激に起因するノイズに対するシグナル率の
、野生型受容体を含む細胞から得られる同様の値に対する統計的に有意な増加は
変異型ＧＰＣＲの機能が改変されているということを示す。
【００１１】 液体バイオアッセイの感度は半最大増殖率（ＥＤ５０またはＥＣ５０）をもた
らすのに必要なアゴニスト濃度として定義される。野生型ＧＰＣＲによって必要
とされるよりも低いアゴニスト濃度で変異型ＧＰＣＲが半最大増殖率を示すなら
ばバイオアッセイの感度は、高まっている。
【００１２】 同様に、より定量的な寒天ベースのバイオアッセイは、変異型ＧＰＣＲのアゴ
ニスト刺激によるノイズに対するシグナル率および／または感度の増加を反映す
る。寒天ベースのバイオアッセイでは、ノイズに対するシグナル率の増加は変異
型および野生型受容体の刺激に起因するアゴニスト誘導性増殖領域内の増殖度を
比較することによって求められる。バイオアッセイの感度は増殖領域の半径に比
例する。塗布される化合物は寒天の塗布部位から放射状に拡散するので、アゴニ
スト濃度は増殖領域の半径の二乗で変化する。従って、変異型ＧＰＣＲのアゴニ
スト活性化に応答した増殖領域が大きくなることは感度の上昇を反映している。
【００１３】 本発明の実施には、いずれのＧタンパク質共役受容体を用いてもよい。かかる
受容体の例としては、限定されるものではないが、アデノシン受容体、ソマトス
タチン受容体、ドーパミン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン様コリ
ン作動性受容体、αアドレナリン作動性受容体、βアドレナリン作動性受容体、
アヘン受容体、カンナビノイド受容体、増殖ホルモン放出因子、グルカゴン、セ
ロトニン受容体、バソプレシン受容体、メラノコルチン受容体、およびニューロ
テンシン受容体が挙げられる。ある好ましい態様によれば、受容体はムスカリン
様アセチルコリン受容体であり、より好ましくは、このムスカリン様アセチルコ
リン受容体はＭ３サブタイプのものである。
【００１４】 同様に、いずれの好適な宿主細胞を本発明の改変型Ｇタンパク質共役受容体を
コードするヌクレオチド配列で形質転換してもよい。好適な宿主細胞の例として
は酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、および細菌細胞がある。好ましくは、宿主
細胞は酵母細胞である。
【００１５】 宿主細胞において発現されるＧＰＣＲの機能を改変する１つの一般化できる方
法として、Ｇタンパク質共役受容体の第３の細胞内ドメイン（ＩＣ３）配列など
のＧＰＣＲの細胞内ドメインの改変または排除によるものがある。脱感作および
インターナリゼーション機構はＧＰＣＲの細胞内ドメインに作用するので、ＧＰ
ＣＲの細胞内ドメインの排除によって、より安定な受容体発現がもたらされる。
このことは哺乳類細胞で行われた実験において証明されている。受容体インター
ナリゼーションに関与すると考えられているそれらの第３の細胞内ループのドメ
インを欠くＭ３サブタイプをはじめとするムスカリン様アセチルコリン受容体は
野生型の対応物よりも高い程度まで原形質膜に維持されている(Moro et al. (19
93))。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例において、本発明の代表的な態様をより詳しく説明する。例１ 酵母における変異型ラットＭ３のムスカリン様アセチルコリン受容体（Ｍ
ＡＲ）の機能的発現 ＧＰＣＲの第３の細胞内ループはＧタンパク質と相互作用してアゴニスト結合
の際にＧタンパク質の活性化に関与すると考えられている(J. Wess(1997))。酵
母接合フェロモン受容体Ｓｔｅ２およびＳｔｅ３のＩＣ３における突然変異はＧ
タンパク質の結合に対して著しい影響を及ぼす（C. Boone et al. (1993) and C
. Clark et al. (1994)）。重要なことは、哺乳類のＭＡＲ、特にラットＭ３
ＭＡＲのＩＣ３部分の欠失が、ヘテロ三量体Ｇタンパク質Ｇｑ（Ｇαβγ）と結
合するための十分な能力を保持する哺乳類細胞における改変された機能的発現と
相関していることである。変異型Ｍ３ ＭＡＲはすべての外部ループを保持して
いる。トランスメンブランドメイン（ＴＭＤ）およびＩＣ３以外の内部ドメイン
は変化しない。５番目と６番目の膜にまたがるらせんの間に見られるこのＩＣ３
は、改変された唯一のドメインであった。このドメインの大部分、ＩＣ３の中心
の９６個のアミノ酸（Ａｌａ２７３−Ｌｙｓ４６９）が欠失しており、５番目お
よび６番目のトランスメンブランらせん双方に隣接したわずか２２個のアミノ酸
が残っていた。このように、野生型Ｍ３ ＭＡＲのＩＣ３のアミノ酸が２４０個
であるのに対し、ＩＣ３欠失（ＩＣ３Δ）を含むＭＡＲの第３の細胞内ループは
４４個のアミノ酸長である。機能的発現の改変は、細胞の脱感作機構と相互作用
して、より機能的なＭＡＲを細胞表面に持たせることが知られているドメインの
排除によるものかもしれない。
【００１７】 このＩＣ３Δ変異も酵母における機能的発現を改変することができるかどうか
を検討するために、標準的な方法により、野生型およびＩＣ３ΔラットＭ３ Ｍ
ＡＲをコードするＤＮＡ配列を、酵母発現プラスミドｐ４２６ＧＰＤ中のグリセ
ロール−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの近位にクローン化した。ラット
Ｍ３ ＭＡＲ配列を、５’ＢｇＩII（ＡＡＡＡＧＡＴＣＴ ＡＡＡ ＡＴＧ Ｔ
ＡＣ ＣＣＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＧＴＣ ＣＣＣ）（配列番号１）および３’Ｘ
ｈｏＩ（ＡＡＡ ＣＴＣＧＡＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＧＧＣ ＣＴＧ ＣＴＣ Ｃ
ＧＧ ＣＡＣ ＴＣＧ Ｃ）（配列番号２）部位を含むオリゴヌクレオチドを用
いてＰＣＲ法により増幅した。得られたＰＣＲ産物を適当な制限エンドヌクレア
ーゼで消化し、精製してｐ４２６ＧＰＤの適当な部位に連結した。ラットＭ３
ＩＣ３Δを形成するために、３つのＭ３ ＭＡＲ断片をＰＣＲ法により増幅した
。アミノ末端をコードする断片を５’ＢｇＩII（ＡＡＡＡＧＡＴＣＴ ＡＡＡ
ＡＴＧ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＧＴＣ ＣＣＣ）（配列番号１）お
よび３’ＡｇｅＩ（ＡＴＡＧＴＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧ ＡＣＣＧＧＴ ＡＴＧＴ
ＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＡＴＣ）（配列番号３）部位を含むオリゴヌクレオチド
を用いて増幅した。カルボキシ末端をコードする断片は５’ＰｍＩＩ（ＧＣＣＴ
ＴＣＡＴＣＡＴ ＣＡＣＧＴＧ ＧＡＣＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣ）（配列番号４）
および３’ＸｈｏＩ（ＡＡＡ ＣＴＣＧＡＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＧＧＣ ＣＴＧ
ＣＴＣ ＣＧＧ ＣＡＣ ＴＣＧ Ｃ）（配列番号２）部位を含むオリゴヌク
レオチドを用いて増幅した。ＩＣ３をコードする断片は、Ｍ３ ＩＣ３Δ配列を
用い、５’ＡｇｅＩ（ＣＧＡＴＣＧＣＴＧＣＣＴＴＴＴＡＣＴＴ ＡＣＣＧＧＴ
ＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧＡＣＴＡＴ）（配列番号５）および３’ＰｍＩＩ（ＧＴ
ＴＧＴＡＧＧＧＧＧＴＣ ＣＡＣＧＴＧ ＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣ）（配列番号
６）部位を含むオリゴヌクレオチドを用いて増幅した（J. Wess (1997)）。得ら
れたＰＣＲ産物を適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、精製してｐ４
２６ＧＰＤ中の適当な部位に連結した。プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ
マッピングおよびＤＮＡ配列決定法により確認した。得られたプラスミドを、従
来の酢酸リチウム形質転換法を用い、参照することにより本明細書の一部とされ
る米国特許第５，６９１，１８８号に記載のものなど、具体的にはPaush et al.
(1998)に記載のＭＰＹ５７８ｆｃ細胞をはじめとするＧＰＣＲアゴニスト刺激
性増殖アッセイを行うのに有用な酵母細胞に導入した。
【００１８】 ＭＡＲを含む酵母細胞を、ＭＡＲアゴニストカルバコール（ＣＣｈ）を用いて
液体培養液中でアッセイした。この細胞を２ｍｌのＳＣ−グルコース−ｕｒａ培
地中で一晩培養した。基礎増殖速度を低下させるための５ｍＭの３−アミノトリ
アゾールを含有するＳＣ−グルコース−ｕｒａ−ｈｉｓ培地ｐＨ６．８で細胞を
５００倍に希釈した。ムスカリン様受容体アゴニストの連続希釈サンプル（１０ −１ 〜１０−８Ｍ）２０μｌを含有する、滅菌９６ウェルマイクロタイターディ
ッシュのウェルに細胞懸濁液サンプル（１８０μｌ）を分注した。このプレート
を３０℃にて１８時間、振盪しつつ（６００ｒｐｍ）インキュベートした。増殖
はマイクロプレートリーダーを用いて、ＯＤ６２０における記録値の増加により
モニターした。アッセイは２回行い、酵母細胞の対数増殖期に増殖速度を測定し
た。GraphPad Prismを用いて光学的密度の測定値を分析し、平均値±標準誤差と
して表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。図１に示されるように、Ｍ３
ＭＡＲ ＩＣ３Δを含む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答をし、Ｍ３
ＭＡＲ ＩＣ３Δが機能していることが示されたが、酵母細胞のアゴニスト依存
性増殖が認められなかったので野生型ＭＡＲは機能していない。Ｍ３ ＭＡＲ
ＩＣ３Δを含む細胞の増殖応答は用量依存的であり、カルバコール（ＣＣｈ）に
対するＥＣ５０は３μＭに相当した。この値は、ＨＥＫ細胞において得られたＣ
Ｃｈに対するＫＤ値（７．９μＭ）および、ＣＣｈ誘導ＩＰ３（イノシトール３
リン酸）蓄積に関するＥＣ５０（４．０μＭ）に匹敵したが、このことはＭ３
ＭＡＲ ＩＣ３Δが酵母細胞膜で発現した場合、期待される薬理学的特性を保持
することを示唆するものである。さらに、増殖応答はＭＡＲ特異的アンタゴニス
トであるアトロピン（Ａｔ）により阻害される。
【００１９】 あるいは、Ｍ３ ＭＡＲ ＩＣ３Δを含む酵母細胞によるＣＣｈに対する応答
は、その発現がＭＡＲアゴニストにより刺激される緑色蛍光タンパク質レポータ
ー遺伝子の、アゴニストにより誘導される蛍光発光の増加量の測定により観察さ
れ得る。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）はクラゲ(Aequorea)由来のタンパク質で
あり、酵母細胞内で発現した場合、内因的蛍光を有する。ＧＦＰ由来の蛍光は生
存酵母菌において検出可能で、その発現レベルは酵母細胞を損傷することなく測
定できる。この特徴は、その検出のために付加的な工程を必要としないのでレポ
ーター遺伝子アッセイにおいて特に有利である。酵母中で発現した異種ＧＰＣＲ
のアゴニスト活性化検出に有用な誘導性レポーター遺伝子は、シグナル変換経路
と交わることにより活性化される転写プロモーターを利用する。かかるプロモー
ターの１つがＦＵＳ２プロモーターである。アゴニスト刺激がない状態では、Ｆ
ｕｓ２タンパク質またはその発現がＦＵＳ２プロモーターによって命令される他
のいずれかのタンパク質の発現もほとんど、または全く検出されない。アゴニス
ト処理後、ＦＵＳ２プロモーターからの転写が７００倍にまで誘導され、Ｆｕｓ
２の発現、またはその発現がＦＵＳ２プロモーターの制御下にある遺伝子産物の
いずれかの発現の実質的な増加が起こる。このように、ＦＵＳ２−ＧＦＰレポー
ター遺伝子由来のＦＵＳ２プロモーター制御下でのＧＦＰ発現の結果得られる酵
母細胞の蛍光は異種ＧＰＣＲのアゴニスト活性化後のみに認められる。
【００２０】 ＧＦＰレポーター遺伝子を産生するために、増強されたＧＦＰ（ＥＧＦＰ、Cl
onetech）、ＦＵＳ２プロモーター、およびＦＵＳ２転写ターミネーター配列を
コードするＤＮＡ配列をＰＣＲ法により増幅した。これらの断片をプラスミドｐ
ＲＳ４１４を含む動原体に組み込んで、ＥＧＦＰ発現をプラスミドｐＲＳ４１４
を含む動原体のフェロモン応答性ＦＵＳ２プロモーターの制御下に置いてｐＭＰ
２４１を作出した。得られたプラスミドを、従来の酢酸リチウム形質転換法を用
い、Ｍ３ ＭＡＲ ＩＣ３Δを含む細胞のＧＰＣＲアゴニスト刺激による増殖ア
ッセイを行うのに有用な、米国特許第５，６９１，１８８号に記載の種類の酵母
細胞中に導入した。具体的には、このプラスミドをPausch et al (1998)に記載
のＭＰＹ５７８ｆｃ細胞に導入した。
【００２１】 Ｍ３ ＭＡＲ ＩＣ３Δを含む酵母細胞およびＦＵＳ２−ＥＧＦＰ受容体プラ
スミドを、液体培養液中でＭＡＲアゴニストカルバコール（ＣＣｂ）を用いてア
ッセイした。この細胞を２ｍｌのＳＣ−グルコース−ｕｒａ培地中で一晩培養し
た。細胞を洗浄し、基礎増殖速度を低下させるために５ｍＭの３−アミノトリア
ゾールを含有するＳＣ−グルコース−ｕｒａ−ｈｉｓ培地ｐＨ６．８で５倍希釈
した。細胞懸濁液サンプル（１８０μｌ）を、ＣＣｈの連続希釈サンプル（１０ −１ 〜1０−８Ｍ）２０μｌを含有する滅菌９６ウェルマイクロタイターディッ
シュのウェルに分注した。このプレートを３０℃で６時間、振盪しつつ（６００
ｒｐｍ）インキュベートした。ＦＵＳ２−ＥＧＦＰレポーター遺伝子発現の刺激
は、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、４８０ｎｍ光で励起した後の５３
０ｎｍにおける発光の増大を記録することによりモニターした。アッセイは２回
行い、測定値は酵母細胞の対数増殖期に得た。蛍光発光の測定値は、GraphPad P
rismを用いて解析し、平均±標準誤差として表し、アゴニスト濃度に対してプロ
ットした。図１Ｂに示されるように、Ｍ３ ＭＡＲ ＩＣ３Δを含む酵母細胞は
蛍光発光における用量依存的な増大を示し、それはアゴニスト誘導性ＦＵＳ２−
ＧＦＰレポーター遺伝子構築体由来のＥＦＧＰ発現の増大と一致していた。ＣＣ
ｈ刺激の蛍光発光に対するＥＣ５０は４μＭであり、これは増殖アッセイにおい
て得られた値と同じであった。
【００２２】 このように、ラットＭ３ ＭＡＲにおけるＩＣ３部分の欠失は、酵母において
発現した場合に機能的ＧＰＣＲが産生されたが、このことは内部ドメインの改変
が酵母において発現した異種ＧＰＣＲの機能改変のために一般化できる方法であ
り得ることを示唆するものである。
【００２３】例２ 酵母における変異型Ｄ．メラノガスター（D. melanogaster）・ムスカリ
ン様アセチルコリン受容体の機能的発現 Ｇタンパク質共役昆虫ムスカリン様アセチルコリン受容体（ＭＡＲ）のアゴニ
ストは、実質的な殺虫力および殺ダニ力を有している（M.R. Dick et al. (1997
)）。これらの知見から、昆虫ＭＡＲに対して有効なアゴニストに関する酵母に
基づく高処理量スクリーニング法（ＨＴＳ）の開発は、新規の作用様式の殺虫剤
に発展する可能性のあるリード化合物の同定に有用であることが示唆される。予
備実験から、昆虫のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である野生型Ｄ．メラ
ノガスターＭＡＲ（ＤＭＡＲ）は、酵母中では機能しないことが示されている。
このように、ＤＭＡＲ ＩＣ３をＭ３ ＭＡＲ ＩＣ３Δ由来の機能的ＩＣ３と
置換することで、酵母におけるＤＭＡＲの機能を向上させる方法を開発する努力
が始められた。
【００２４】 昆虫細胞において、ＤＭＡＲはヘテロ三量体Ｇｑタンパク質と相互作用し、ム
スカリン様アゴニストに応答して細胞内カルシウムを増加させる。酵母中でＤＭ
ＡＲが不活性であることに対する、可能性のある説明の１つに、酵母のヘテロ三
量体Ｇタンパク質と効率的に結合できないことが挙げられる。従って、酵母にお
いてＤＭＡＲ機能を改変する方法を考案するために、機能的発現の改変およびヘ
テロ三量体Ｇタンパク質との結合に働きを持つＧＰＣＲにおける選択的突然変異
を検討した。
【００２５】 ＩＣ３置換体を構築するために、標準的な方法により３つのドメインをコード
するＰＣＲ断片を調製した。断片１は５番目のＴＭＤ内のショウジョウバエＭＡ
Ｒのアミノ末端コード部分からＡｇｅＩ部位までからなり、オリゴヌクレオチド
（ＡＡＡ ＡＧＡＴＣＴ ＡＡＡ ＡＴＧ ＴＡＣＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＣＧＡ
ＡＣ）（配列番号７）および（ＣＣＡ ＧＴＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＣＡＣＡＴ
ＧＡＴＧＧＴＣ ＡＧＧＣＣＴ ＡＡＧ ＴＡＧ ＡＡＧ ＧＣＧ ＧＣＣ Ａ
ＧＴ ＧＣ）（配列番号８）を用いてＰＣＲ法により増幅した。ＤＭＡＲの第２
の断片は、６番目のＴＭＤ中のＰｍII部位から始まるカルボキシ末端コード配列
からなり、オリゴヌクレオチド（ＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＴＧＧＡＣＴＣＣＧ
ＴＡＣＡＡＣＡＴＣ）（配列番号９）および（ＡＡＡ ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣ
ＴＡＡＴＴＧＴＡＧＡＣＧＣＧＧＣ）（配列番号１０）を用いてＰＣＲ法により
増幅した。このＭ３ ＭＡＲ ＩＣ３Δドメインを、例１に記載された断片１お
よび２とともにフレーム内にコード配列を有するＡｇｅＩ−ＰｍII断片として増
幅した。これらの断片をプラスミドｐ４２６ＧＰＤに組み込んで、変異型ＤＭＡ
ＲをＧＰＤプロモーターの制御下に置いた。この野生型ＤＭＡＲを、米国特許第
５，６９１，１８８号に記載された発現ベクターｐＭＰ３中にクローン化した。
得られたプラスミドを、従来の酢酸リチウム形質転換法を用い、米国特許第５，
６９１，１８８号に記載の、特にPausch et al. (1998)に記載のＭＰＹ５７８ｆ
ｃ細胞をはじめとする、ＧＰＣＲアゴニスト刺激性増殖のアッセイを行うのに有
用な酵母細胞に導入した。
【００２６】 ＤＭＡＲを含む酵母細胞および野生型ＤＭＡＲを含むプラスミドを、液体培養
液中でＭＡＲアゴニストカルバコール（ＣＣｈ）を用いてアッセイした。この細
胞を２ｍｌのＳＣ−グルコース−ｕｒａ培地中で一晩培養した。この細胞を、基
礎増殖速度を低下させるための５ｍＭの３−アミノトリアゾールを含有するＳＣ
−グルコース−ｕｒａ−ｈｉｓ培地（ｐＨ６．８）に５００倍希釈した。細胞懸
濁液サンプル（１８０μｌ）を、ムスカリン様受容体アゴニストの連続希釈サン
プル（１０−１〜1０−８Ｍ）２０μｌを含有する滅菌９６ウェルマイクロタイ
ターディッシュのウェルに分注した。このプレートを３０℃で１８時間、振盪し
つつ（６００ｒｐｍ）インキュベートした。アッセイは２回行い、増殖速度測定
は酵母細胞の対数増殖期に行った。光学的密度の測定値をGraphPad Prismを用い
て解析し、平均±標準誤差として表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。
図２に示されたように、変異型ＤＭＡＲ、すなわちＭ３ ＭＡＲ ＩＣ３Δを含
む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を示し、ＤＭＡＲ−Ｍ３ ＭＡＲ Ｉ
Ｃ３Δは機能していることが示された。野生型のＤＭＡＲはアゴニスト依存性酵
母細胞増殖が起こらなかったことにより示されるように機能しなかった。
【００２７】 このようにＤＭＡＲのＩＣ３を、ラットＭ３ ＭＡＲ産物由来の機能的欠失し
たＩＣ３で置換すると、酵母において発現した際に機能的キメラＧＰＣＲが産生
され、この内部ドメインを置換する方法は酵母アッセイのような細胞に基づくア
ッセイにおいて、異種ＧＰＣＲの機能的発現の改変のために一般化できる方法で
あり得ることが示された。
【００２８】例３ 酵母における変異型ラット・コレシストキニンＣＣＫＢ受容体の機能的発
現 例１および２で示したように、哺乳類ＭＡＲ、特にラットＭ３ ＭＡＲのＩＣ
３部分の欠失は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質と結合するための完全な能力を保持
した哺乳類および酵母細胞の機能的発現の改変と相関する。このＩＣ３Δ突然変
異がまた酵母において他のＧＰＣＲの機能的発現を改変することができるかどう
かを検討するために、ラット野生型およびＩＣ３ΔコレシストキニンＣＣＫＢ受
容体をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲ法により増幅して、標準的な方法により、
酵母発現プラスミドｐ４２６ＧＰＤ中のグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼプ
ロモーターの近位へクローン化した。野生型ＣＣＫＢＲは、オリゴヌクレオチド
（ＡＣＴＴＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＧＣＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣ
Ｇ）（配列番号１１）および（ＴＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣ
ＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧ）（配列番号１２）を用いてＰＣＲ法により増幅した。Ｉ
Ｃ３ΔコレシストキニンＣＣＫＢ受容体は、２つの重複する断片を融合すること
により調製した。断片１は５番目のＴＭＤに隣接した２２個のアミノ酸を含むア
ミノ末端コード配列を含んでおり、これはオリゴヌクレオチド（ＡＣＴＴＡＧＡ
ＴＣＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＧＣＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＧ）（配列番号１
１）および（ＣＧＡＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＧＧＧＣＣ
ＣＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＣＴＣＧ）（配列番号１３）を用いてＰＣＲ法により増
幅した。断片２は６番目のＴＭＤに隣接した２２個のアミノ酸を含むカルボキシ
末端コード配列を含んでおり、これはオリゴヌクレオチド（ＴＣＣＣＧＴＣＧＡ
ＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧ）（配列番号１２）および（
ＣＧＡＧＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＡＧＴＣＣＣ
ＴＧＧＣＣＣＴＣＧ）（配列番号14）を用いてＰＣＲ法により増幅した。この２
つの断片を、全長ＣＣＫＢ受容体の５’および３’末端でオリゴヌクレオチドを
用いてＰＣＲ法により増幅させて融合させた。得られたプラスミドを、従来の酢
酸リチウム形質転換法を用い、米国特許第５，６９１，１８８号に記載のものな
ど、特にはPausch et al. (1998)に記載のＭＰＹ５７８ｆｃ細胞をはじめとする
ＧＰＣＲアゴニスト刺激性増殖のアッセイを行うのに有用な酵母細胞中に導入し
た。
【００２９】 野生型およびＩＣ３ΔコレシストキニンＣＣＫＢ受容体を含む酵母株を、２ｍ
ｌのグルコース（２％）を含む合成完全液体培地およびウラシル欠損（ＳＣＤ−
ｕｒａ）培地で一晩増殖させた。この寒天ベースのプレートアッセイでは、０．
５ｍＭ ＡＴ（３−アミノトリアゾール）を含有する、融解させた（５０℃）Ｓ
ＣＤ−ｕｒａ−ｈｉｓ寒天培地（３５ｍｌ、オートクレーブにかける前に濃ＫＯ
ＨまたはＮＨ４ＯＨを加えてｐＨ６．８に調整）に、一晩培養したもの（２×１
０４細胞／ｍｌ）を播種し、正方形（９×９ｃｍ）のペトリプレートに注いだ。
ＤＭＳＯ（１ｍＭ、１０μｌ）中のＣＣＫアゴニスト溶液を固化した寒天の表面
に塗布した（上部左、ＣＣＫ８Ｓ；上部右、ＣＣＫ８ＵＳ；下部左、ＣＣＫ５；
下部右、ＣＣＫ４）。プレート表面に塗布した化合物は、塗布した部位から放射
状に拡散し、寒天中に包埋されている細胞表面で発現したＣＣＫＢ受容体と結合
し、その結果ＦＵＳ１−ＨＩＳ３発現が誘導される。応答している細胞は高密度
の増殖領域を形成し、基礎的なＦＵＳ１−ＨＩＳ３発現に応答して見られる限ら
れた細胞増殖とは容易に区別できる。プレートを３０℃で３日間インキュベート
した（図３）。図３ＡはＩＣ３ΔコレシストキニンＣＣＫＢ受容体を含む酵母細
胞の強い増殖応答を示しているが、図３Ｂは野生型ＣＣＫＢ受容体を含む酵母細
胞の限られた増殖を示しているに過ぎず、このことより、ＣＣＫＢ受容体の第３
の細胞内ループ部分の欠失が酵母においてその機能を改変したことが示される。
【００３０】例４ 酵母における変異型ラット・ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）の機能的
発現 第３の細胞内ループは、Ｇタンパク質共役、脱感作および様々な改変タンパク
質との相互作用を含む、多くのＧＰＣＲ機能に関与する。ソマトスタチン受容体
はＳＳＴＲ１−５と表示される５つのサブタイプにコードされている。ＳＳＴＲ
３サブタイプの第３の細胞内ループ内にはいくつかのアミノ酸が認められるが、
ＳＳＴＲ２サブタイプの同領域には認められない。ＳＳＴＲ２は酵母中で有効に
機能するため、ＩＣ３からのこれらのアミノ酸の欠失がＳＳＴＲ３にこの機能的
有効性を付与するものと考えられる。このように、８個のアミノ酸Ｇｌｎ−Ｔｒ
ｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号１５）がｒＳＳＴＲ３
ｃＤＮＡの第３の細胞内ループから欠失しており、酵母内でより有効な受容体
シグナル伝達を可能にしている。
【００３１】 ラットＳＳＴＲ３配列は、５’ＢｇＩIIおよび３’ＸｈｏＩ部位を含むオリゴ
ヌクレオチドを用いてＰＣＲ法により増幅した。得られた約１．３ｋｂのＰＣＲ
産物をＢｇＩIIおよびＸｈｏＩで消化して精製し、ｐ４２６ＧＰＤのＢａｍＨＩ
とＸｈｏＩ部位の間に挿入してプラスミドｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴＲ３を作出
した。組換えプラスミドは制限エンドヌクレアーゼ消化およびＤＮＡ配列決定法
により確認した。
【００３２】 ｒＳＳＴＲ３ ｃＤＮＡの増幅には標準的なＰＣＲ反応を用い、以下のような
３６ｂｐの重複を有する２つのＰＣＲ断片を得た。５’ＢｇＩオリゴヌクレオチ
ド（ＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴ ＡＡＡＡＴＧＧＣＣＡ ＣＴＧＴＴＡＣＣＴＡ Ｔ
）（配列番号１６）および３’オリゴヌクレオチド（ＣＴＣＡＧＡＧＣＧＧ Ｃ
ＧＴＣＧＣＣＧＣＴ ＧＡＣＡＣＧＡＧＧＧ ＣＧＣＣＣＧ（配列番号１７））
を用いて、おおよそのサイズが７５０ｂｐのＰＣＲインサートＡを作出した。５
’オリゴヌクレオチドＧＣＧＣＣＣＴＣＧＴ ＧＴＣＡＧＣＧＧＣＧ ＡＣＧＣ
ＣＧＣＴＣＴ ＧＡＧ（配列番号１８）および３’ＸｈｏＩオリゴヌクレオチド
（ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧ ＴＴＡＣＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＴＧＣ Ｔ）（
配列番号１９）を用いて、おおよそのサイズが５３０ｂｐのＰＣＲインサートＢ
を作出した。ＰＣＲ断片ＡおよびＢをゲル精製し、アニーリングして、フランキ
ング５’ＢｇＩIIおよび３’ＸｈｏＩオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法によ
り増幅し、−１．３ｋｂのｒＳＳＴＲ３ΔＩＣ３のＰＣＲ産物を得た。精し、Ｂ
ｇＩII−ＸｈｏＩで消化した後、ｒＳＳＴ３ΔＩＣ３インサートをｐ４２６ＧＰ
ＤのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に連結してプラスミドｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴ
Ｒ３ΔＩＣ３を作出した。制限マッピングおよびＤＮＡ配列決定により、適切な
読み取り枠と配列を確認した。
【００３３】 米国特許第５，６９１，１８８号に記載の、ＧＰＣＲの発現のために有用なタ
イプの酵母細胞を、標準的な方法を用いてｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴＲ３および
ｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴＲ３ΔＩＣ３で形質転換した。この細胞（すなわち、
Price et al. (1995)に記載のＬＹ２９６細胞）を、例３に記載の寒天に基づく
バイオアッセイ法を用いてアッセイした。ソマトスタチン（Ｓ−１４、１ｍＭ）
のサンプル（１０μｌ）をＳＳＴＲ３を発現する酵母細胞を含有する選択寒天培
地の表面に塗布した。このプレートを３０℃で３日間インキュベートした。ｐ４
２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴＲ３とともにｐＬＰ８２で形質転換された酵母細胞（Ｇｐ
ａｌ／Ｇａｉ２キメラＧタンパク質発現プラスミドを含有）は、Ｓ−１４に対し
て弱い増殖応答を示したが（図４Ａ）、ｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴＲ３ΔＩＣ３
を同条件下でアッセイした場合にはより強い応答が認められた（図４Ｂ）。これ
らの結果は、ＩＣ３部分の欠失により、酵母におけるＳＳＴＲ３の機能が改変さ
れることを示す。
【００３４】例５ ＩＣ３欠失ヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体 例１〜４で示したように、哺乳類ＧＰＣＲのＩＣ３部分の欠失は、ヘテロ三量
体Ｇタンパク質との結合に関して十分な能力を保持した哺乳類および酵母細胞に
おける改変型の機能的発現と相関している。変異型ＭＡＲ、ＣＣＫＢＲ、および
ＳＳＴＲ３は全外部ループを保持している。ＩＣ３以外のトランスメンブランド
メインおよび内部ドメインは変化していない。膜にまたがるらせんの５番目と６
番目の間に見出されるＩＣ３が、改変された唯一のドメインである。５番目と６
番目のトランスメンブランらせんの双方に隣接する２２個のアミノ酸だけを残し
て、このドメインの大部分が欠失していた。このように、ＩＣ３欠失（ＩＣ３Δ
）を含むＧＰＣＲのＩＣ３は４４個のアミノ酸長である。機能的発現の改変は、
細胞脱感作機構と相互作用することが知られているドメインが除去されて、より
機能的なＭＡＲが細胞表面に保持されることによるものであろう。 他のＩＣ３Δ変異も酵母における他のＧＰＣＲの機能的発現を改変するかどう
かを検討するために、ＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体をコードす
るＤＮＡ配列をＰＣＲ法により増幅して、標準的な方法により、酵母発現プラス
ミドｐ４２６ＧＰＤのグリセロール−リン酸ジヒドロゲナーゼプロモーターの近
位にクローン化した。このＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体は、２
つの重複する断片を融合させることにより作出した。断片１は５番目のＴＭＤに
隣接する３９個のアミノ酸を含むアミノ末端コード配列を含んでおり、これはオ
リゴヌクレオチド（ＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＴＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧ
ＣＡＧＣＣＧＧＡＣＧＣ）（配列番号２０）および（ＣＧＧＧＣＣＣＣＧＣＧＧ
ＧＣＧＣＴＣＧＧＧＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＴＴＧＧＧＣ）（配列番号２１）を用
いてＰＣＲ法により増幅した。第２の断片は６番目のＴＭＤに隣接した４１個の
アミノ酸を含むカルボキシ末端コード配列を含んでおり、これはオリゴヌクレオ
チド（ＣＧＧＧＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＧＣＧＧＣ）（配列番号２２）および
（ＡＧＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＣＧＡＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＣＣ）
（配列番号２３）を用いてＰＣＲ法により増幅した。この２つの断片を、全長α
２Ａアドレナリン作動性受容体の５’および３’末端でオリゴヌクレオチドを用
いてＰＣＲ法により増幅させて融合させた。得られたプラスミドを、従来の酢酸
リチウム形質転換法を用い、米国特許第５，６９１，１８８号に記載のものなど
、特にはPausch et al. (1998)に記載のＭＰＹ５７８ｆｃ細胞をはじめとするＧ
ＰＣＲアゴニスト−刺激性増殖のアッセイを行うのに有用な酵母細胞に導入した
。
【００３５】 野生型ＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体を含む酵母細胞を、液体
培養液中で、αアドレナリン作動性完全アゴニストＵＫ１４３０４（ＲＢ１）お
よび部分アゴニストであるクロリジンを用いてアッセイした。この細胞を２ｍｌ
のＳＣ−グルコース−ｕｒａ培地中で一晩培養した。細胞をＳＣ−グルコース−
ｕｒａ−ｈｉｓ培地ｐＨ６．８で５００倍に希釈した。この細胞を、基礎増殖速
度を低下させるための５ｍＭの３−アミノトリアゾールを含有するＳＣ−グルコ
ース−ｕｒａ−ｈｉｓ培地ｐＨ６．８で５００倍希釈した。細胞懸濁液サンプル
（１８０μｌ）を、アドレナリン作動性受容体アゴニストＵＫ１４３０４の連続
希釈サンプル（１０−３〜1０−１０Ｍ）２０μｌを含有する滅菌９６ウェルマ
イクロタイターディッシュのウェルに分注した。このプレートを３０℃で１８時
間、振盪しつつ（６００ｒｐｍ）インキュベートした。増殖はマイクロプレート
リーダーを用いて、ＯＤ６２０における記録値の増大によりモニターした。アッ
セイは２回行い、増殖速度測定値は酵母細胞増殖の対数増殖期に得た。光学的密
度の測定値をGraphPad Prismを用いて解析し、平均±標準誤差として表し、アゴ
ニスト濃度に対してプロットした。
【００３６】 野生型ＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体を含む酵母細胞は、用量
依存性の増殖応答を示し、このことよりこのＩＣ３欠失が機能していることが示
された（図５）。
【００３７】例６ ラット・ニューロテンシンＮＴ１受容体の末端切断はアゴニスト感受性を
増強させる 例１〜４において、第３の細胞内ループの改変により、酵母において発現した
種々の異種ＧＰＣＲの機能的発現が向上した。アゴニスト誘導性のＧＰＣＲの脱
感作もまた、部分的には、細胞内カルボキシ末端テールのような第３の細胞内ル
ープ以外のＧＰＣＲ内部ドメインにより媒介されている。
【００３８】 ＧＰＣＲからのカルボキシ末端ドメインの除去により、酵母および哺乳類細胞
における機能的発現が向上することが示されている。α−接合型酵母細胞に発現
したＧタンパク質共役α接合フェロモン受容体のカルボキシ末端テールの末端切
断は、接合フェロモンの存在に対する過敏性を引き起こす（Reneke et al. (198
8); Konopka et al.(1988)）。これらの知見と一致して、そのカルボキシ末端テ
ールを欠く変異型ラット・ニューロテンシンＮＴ１受容体（ｒＮＴＲ1）は、哺
乳類細胞において発現した場合に、アゴニスト誘導性のインターナリゼーション
に対し耐性を有する（Hermans et al. (1996)）。
【００３９】 カルボキシ末端の末端切断が酵母において発現した異種ＧＰＣＲの機能的応答
を改変するかどうか検討するために、カルボキシ末端テールを構成する５２個の
アミノ酸を欠失させて、受容体を３７２アミノ酸長に縮めることによりラットＮ
ＴＲ１を改変した。野生型および末端切断型ニューロテンシン受容体（ｒＮＴＲ
１Ｃ−ｔｅｒｍΔ）のコード配列を、共通アミノ末端コード配列を指定する５’
オリゴヌクレオチドプライマー（ＡＧＴＣＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴ ＡＡＡＡ
ＡＴＧ ＣＡＣ ＣＴＣ ＡＡＣ ＡＧＣ ＴＣＣ）（配列番号２４）および
野生型を定義する分離型オリゴヌクレオチド（ＡＧＴＣ ＡＧＡＴＣＴ ＣＴＡ
ＧＴＡ ＣＡＧ ＧＧＴＣＴＣＣＣ）（配列番号２５）、および末端切断型カ
ルボキシ末端（ＡＧＡＧ ＡＧＡＴＣＴ ＴＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣ
ＡＡＡＧＧＣ）（配列番号２６）を用いてＰＣＲ法により増幅した。標準的な方
法により、これらの断片を酵母発現ベクターｐＰＧＫ中のＰＧＫプロモーターの
近位にクローン化した（Y-S. Kang et al. (1990)）。得られたプラスミドを、
従来の酢酸リチウム形質転換法を用て、特にはPausch et al. (1998)に記載のＭ
ＰＹ５７８ｆｃ細胞をはじめとする、ＧＰＣＲアゴニスト刺激性増殖のアッセイ
を行うのに有用な米国特許第５，６９１，１８８号に記載の種類の酵母細胞中に
導入した。
【００４０】 ＮＴ受容体アゴニストであるアセチルニューロテンシン８−１３（ＡｃＮｔ８
−１３）を用いて、ＮＴＲ１を含む酵母細胞を液体培養液中でアッセイした。こ
の細胞を２ｍｌのＳＣ−グルコース−ｕｒａ培地中で一晩培養した。細胞を基礎
増殖速度を低下させるための２ｍＭの３−アミノトリアゾールを含有するＳＣ−
グルコース−ｕｒａ−ｈｉｓ培地（ｐＨ６．８）で５００倍希釈した。細胞懸濁
液サンプル（１８０μｌ）を、ＡｃＮＴ８−１３の連続希釈サンプル（１０−３ 〜1０−１０Ｍ）２０μｌを含有する滅菌９６ウェルマイクロタイターディッシ
ュのウェルに分注した。このプレートを３０℃で１８時間、振盪しつつ（６００
ｒｐｍ）インキュベートした。増殖はマイクロプレートリーダーを用いて、ＯＤ ６２０ における記録値の増大によりモニターした。増殖速度測定値は酵母細胞増
殖の対数増殖期に得た。光学的密度の測定値をGraphPad Prismを用いて解析し、
平均±標準誤差として表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。図６に示さ
れたように、ＮＴＲ１を含む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を引き起こ
し、このことは野生型およびカルボキシ末端における末端切断型ＮＴＲ１の双方
が機能していることを示している。ｒＮＴＲ１ Ｃ−ｔｅｒｍΔを含む細胞の増
殖応答は用量依存的であり、ＡｃＮＴ８−１３のＥＣ５０は５２０ｎＭに相当し
た。この値は野生型ＮＴＲ１を発現している細胞において観察された値（２．１
μＭ）の５分の１であった。カルボキシ末端の欠失により、より低い濃度のＮＴ
Ｒアゴニストに応答するｒＮＴＲ１が産生され、酵母バイオアッセイの感受性が
向上した。
【００４１】 このように、ラットＮＴＲ１のカルボキシ末端の細胞内ドメイン部分の欠失が
、酵母において発現した場合にアゴニスト感受性が増強される機能的ＧＰＣＲが
産生されたが、このことはこの内部ドメインの改変が、酵母において発現した異
種ＧＰＣＲの機能改変のために一般化できる方法であることを示唆するものであ
る。
【００４２】例７ 酵母における変異型Ｃ．エレガンス（C. elegans）セロトニン受容体の機
能的発現 Ｇタンパク質共役Ｃ．エレガンスセロトニン受容体（Ｃｅ ５ＨＴＲ）のアゴ
ニストは、本質的な殺線虫力を有しているものと考えられる。これらの知見から
、Ｃｅ ５ＨＴＲにおいて有効なアゴニストに関する、酵母に基づくＨＴＳの開
発は新規な作用様式の殺線虫剤に発展する可能性のあるリード化合物の同定に有
用であり得る。予備実験から、野生型のＣｅ ５ＨＴＲは酵母中では機能しない
ことが示されている。従って、Ｃｅ ５ＨＴＲ ＩＣ３をＭ３ ＭＡＲ ＩＣ３
Δ由来の機能性ＩＣ３と置換することで、酵母におけるＣｅ ５ＨＴＲの機能を
改変する方法を開発する努力が始められた。
【００４３】 ＩＣ３置換体を構築するために、標準的な方法により３つのドメインをコード
するＰＣＲ断片を調製した。断片１は５番目のＴＭＤの細胞内インターフェイス
に対してＣｅ ５ＨＴＲのアミノ末端コード部分を含み、オリゴヌクレオチド（
ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＣＧＡＣＧＡＧＡＣＧＣＴＴＣ）（配列番
号２７）および（ＣＣＧＣＴＴＧＧＴＧＡＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴ
ＧＴＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣ ＴＧＴＡＧＧＣＣＡＧ ＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＧ
ＴＡＣＧＣＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＴＡＣＡ
ＣＧＣＡＡＡＴＴＡＴＴＧＣ）（配列番号２８）を用いてＰＣＲ法により増幅し
た。Ｃｅ ５ＨＴＲの第２番目の断片は、６番目のＴＭＤの細胞内インターフェ
ースの近位から開始するカルボキシ末端コード配列を含み、オリゴヌクレオチド
（ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＧＴＧＡＡＴＡＡＧＧＣＡ）（配列
番号２９）および（ＧＧＣＣＴＡＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡＣＣ
ＡＧＡＡＧＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＴＣＧＣＴＣ
ＡＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＧＣＴＡＧＣＡＡＴＴ
ＡＴＴＡＣＡＧＧＴＡＣ）（配列番号３０）を用いてＰＣＲ法により増幅した。
Ｍ３ ＭＡＲ ＩＣ３Δドメインは例１の記載に従ってＰＣＲ法により増幅した
。
【００４４】 これらの断片を単離、混合して、５’（ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴ
ＣＧＡＣＧＡＧＡＣＧＣＴＴＣ）（配列番号２７）および３’（ＡＡＡＡＣＴＣ
ＧＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＧＴＧＡＡＴＡＡＧＧＣＡ）（配列番号２９）オリゴ
ヌクレオチドを用いてＰＣＲ法により増幅した。得られた断片を適当な制限エン
ドヌクレアーゼで消化し、ｐ４２６ＧＰＤに組み込んで変異型Ｃｅ ５ＨＴＲを
ＧＰＤプロモーターの制御下に置いた。得られたプラスミドを、従来の酢酸リチ
ウム形質転換法を用いて、米国特許第５，６９１，１８８号に記載のものなど、
特にPausch et al. (1998)に記載のＭＰＹ５７８ｆｃ細胞をはじめとする、ＧＰ
ＣＲアゴニスト刺激性増殖のアッセイを行うために有用な酵母細胞中に導入した
。
【００４５】 Ｃｅ ５ＨＴＲを含む酵母細胞を、液体培養液中でアッセイした。細胞を２ｍ
ｌのＳＣ−グルコース−ｕｒａ培地中で一晩培養した。この細胞を基礎増殖速度
を低下させるための２ｍＭの３−アミノトリアゾールを含有するＳＣ−グルコー
ス−ｕｒａ−ｈｉｓ培地（ｐＨ６．８）で５００倍希釈した。細胞懸濁液サンプ
ル（２００μｌ）を、セロトニン（５ＨＴ）の連続希釈サンプル（１０−２〜1
０−９Ｍ）２．０μｌを含有する滅菌９６ウェルマイクロタイターディッシュの
ウェルに分注した。同様の反応において、セロトニン作動性アンタゴニストであ
るリスリドおよびミアンセリンを各ウェルあたり１０μＭ加えた。このプレート
を３０℃で１８時間、振盪しつつ（６００ｒｐｍ）インキュベートした。増殖は
マイクロプレートリーダーを用いて、ＯＤ６２０における記録値の増大によりモ
ニターした。アッセイは２回行い、増殖速度測定値は酵母細胞増殖の対数増殖期
に得た。光学的密度の測定値をGraphPad Prismを用いて解析し、平均±標準誤差
として表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。Cheng and Pruesoff(Y. Ch
eng et al. (1973))の方程式を用いてＫｉ値を求めた。図７に示されるように、
Ｍ３ ＭＡＲ ＩＣ３Δを含む突然変異Ｃｅ ５ＨＴＲを含む酵母細胞は、アゴ
ニスト依存性の増殖応答を示したが、このことはＣｅ ５ＨＴＲは酵母中で発現
した場合、予想された薬理学的特性を表すことを示している。
【００４６】 このように、ラットＭ３ ＭＡＲ由来の機能的に欠失したＩＣ３を有するＣｅ
５ＨＴＲのＩＣ３の置換により、酵母中で発現した場合に機能的キメラＧＰＣ
Ｒが産生されたが、このことは内部ドメインを置換するこの方法が、酵母アッセ
イのような細胞に基づくアッセイにおいて異種ＧＰＣＲの機能的発現の改変のた
めに一般化できる方法であり得ることを示唆するものである。
【００４７】 本発明の他の態様は、本明細書に開示された本発明の明細書および実施を考慮
すれば当業者には明らかとなろう。明細書および実施例は以下の請求項により示
される本発明の真の範囲および精神の範囲内で単に例示としてみなすものとする
。 本明細書で引用された参照文献は、参照することによりそのまま本明細書の一
部とする。
【００４８】 参考文献
【表１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 ＭＡＲアゴニスト、カルバコール（ＣＣｈ）を用いた、ラットＭ３ムスカリン
様アセチルコリン受容体（ＭＡＲ）を含む酵母細胞に対する液体培養アッセイの
結果を示す。第３の細胞内ループ（ＩＣ３Δ）に欠失のあるＭ３ＭＡＲを含む酵
母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を示したが、他方、野生型ＭＡＲはそうで
はなく、このことはＭ３ＭＡＲＩＣ３Δは機能的なＧＰＣＲであるということを
示すものである。
【図１Ｂ】 ＭＡＲアゴニスト、カルバコール（ＣＣｈ）を用いた、ラットＭ３ＭＡＲＩＣ
３ΔおよびＦＵＳ２−ＧＦＰ受容体プラスミドを含む酵母細胞に対する液体培養
蛍光誘導アッセイの結果を示す。酵母において発現したＭ３ＭＡＲＩＣ３ΔのＣ
Ｃｈ活性化に応答して緑色蛍光タンパク質の発現の用量依存性増大が認められる
。
【図２】 ＭＡＲアゴニスト、カルバコール（ＣＣｈ）を用いた、キイロショウジョウバ
エ・ムスカリン様アセチルコリン受容体を含む酵母細胞に対する液体培養アッセ
イの結果を示す。Ｍ３ＭＡＲＩＣ３Δを含む変異型キイロショウジョウバエＭＡ
Ｒを含む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を示したが、他方、野生型キイ
ロショウジョウバエＭＡＲではアゴニスト依存性の酵母細胞増殖応答はなかった
。
【図３Ａ】 寒天ベースプレートバイオアッセイの結果を示す。 ＩＣ３ΔコレシストキニンＣＣＫＢ受容体を含む酵母細胞の強い増殖応答を示
す。
【図３Ｂ】 寒天ベースプレートバイオアッセイの結果を示す。 野生型ＣＣＫＢ受容体を含む酵母細胞による増殖は限定されたものでしかなく
、このことは酵母においてはＣＣＫＢ受容体の第３の細胞内ループの一部の欠失
がその機能を改変するということを示すものである。
【図４Ａ】 ｒＳＳＴＲ３およびｒＳＳＴＲ３ΔＩＣ３で形質転換された酵母細胞を示す。 ｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴＲ３を含む酵母細胞はソマトスタチン（Ｓ−１４）
に対して弱い応答しか示さないことを証明するものである。
【図４Ｂ】 ｒＳＳＴＲ３およびｒＳＳＴＲ３ΔＩＣ３で形質転換された酵母細胞を示す。 同様の条件下でアッセイされたｐ４２６ＧＰＤ−ｒＳＳＴＲ３ΔＩＣ３を含む
酵母細胞によるずっと強い応答を証明するものである。
【図５】 αアドレナリン作動性受容体完全アゴニストＵＫ１４３０４を用いた、野生型
ＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体を含む酵母細胞に対する液体培養
アッセイの結果を示す。野生型およびＩＣ３Δヒトα２Ａアドレナリン作動性受
容体を含む酵母細胞は用量依存性の増殖応答を示し、このことはＩＣ３の欠失が
機能的であるということを示すものである。
【図６】 ニューロテンシン受容体アゴニストであるＡｃＮＴ８−１３を用いた、野生型
およびカルボキシ末端切断型のラットＮＴ１−ニューロテンシン受容体を含む酵
母細胞に対する液体培養アッセイの結果を示す。ラットＮＴ１−ニューロテンシ
ン受容体の末端切断物は野生型受容体で認められるものよりもより感度の高いア
ゴニスト依存性の増殖応答をもたらす。
【図７】 酵母細胞増殖を刺激するためにセロトニン（５ＨＴ）を用いた、Ｃ．エレガン
ス(C.elebans)セロトニン受容体を含む酵母細胞に対する液体培養アッセイの結
果を示す。Ｍ３ＭＡＲＩＣ３Δを含む変異型Ｃ．エレガンス・セロトニン受容体
を含む酵母細胞は５ＨＴ依存性の増殖応答を示した。この増殖応答はセロトニン
受容体アンタゴニストであるリスリドおよびミアンセリンの添加によって妨げら
れた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 33/68 33/68 (Ｃ１２Ｎ 1/19 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ユルゲン、ウェス アメリカ合衆国メリーランド州、ベセス ダ、ロックビル、パイク、9000、ルーム、 ビー１エイ‐05、ビルディング、８エイ、 エヌアイエイチ‐エヌアイディーディーケ イ、ラボラトリー、オブ、バイオオーガニ ック、ケミストリー内 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB21 DA36 DA77 FB02 FB07 FB12 GC30 4B024 AA01 AA11 BA63 CA01 DA12 EA04 FA02 FA10 GA11 GA19 4B063 QA01 QA18 QQ61 QR33 QR60 QR76 QR80 QS05 QS36 QX02 4B065 AA80X AA86Y AA90Y AA91Y AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA30 CA20 CA40 CA51 DA50 EA50 FA74

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 改変型のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）をコードする配列を有する単離
    された核酸配列であって、その改変がＧタンパク質共役受容体の細胞内ドメイン
    に突然変異を含み、細胞に基づくアッセイにおける機能的応答の改変をもたらし
    、かつ、改変型Ｇタンパク質共役受容体がムスカリン様アセチルコリン受容体、
    コレシストキニンＣＣＫＢ受容体、ソマトスタチン受容体、α２Ａアドレナリン
    作動性受容体、およびセロトニン受容体からなる群から選択される、核酸配列。
  2. 【請求項２】 改変がアゴニスト刺激性増殖を促進し、このアゴニストがＧタンパク質共役受
    容体アゴニストである、請求項１に記載の核酸配列。
  3. 【請求項３】 改変が受容体とヘテロ三量体Ｇタンパク質の間の結合の改変をもたらすか、ま
    たは受容体が細胞脱感作もしくは隔離−インターナリゼーション機構と相互作用
    できないようにするか、または適切な原形質膜局在化をもたらす、請求項２に記
    載の核酸。
  4. 【請求項４】 突然変異が欠失である、請求項１に記載の核酸。
  5. 【請求項５】 欠失が点突然変異である、請求項４に記載の核酸。
  6. 【請求項６】 欠失がＧタンパク質共役受容体の第３の細胞内ループに存在する、請求項４に
    記載の核酸。
  7. 【請求項７】 Ｇタンパク質共役受容体がムスカリン様アセチルコリン受容体、コレシストキ
    ニンＣＣＫＢ受容体、およびα２Ａアドレナリン作動性受容体からなる群から選
    択される、請求項６に記載の核酸。
  8. 【請求項８】 セロトニン受容体がＣｅ ５ＨＴＲである、請求項１に記載の核酸配列。
  9. 【請求項９】 ムスカリン様アセチルコリン受容体がラットＭ３ムスカリン様アセチルコリン
    受容体またはＤ．メラノガスタームスカリン様アセチルコリン受容体である、請
    求項１に記載の核酸配列。
  10. 【請求項１０】 コレシストキニンＣＣＫＢ受容体がラット・コレシストキニンＣＣＫＢ受容体
    である、請求項１に記載の核酸配列。
  11. 【請求項１１】 ソマトスタチン受容体がラット・ソマトスタチン受容体サブタイプ３である、
    請求項１に記載の核酸配列。
  12. 【請求項１２】 α２Ａアドレナリン作動性受容体がヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体であ
    る、請求項１に記載の核酸配列。
  13. 【請求項１３】 請求項１に記載の核酸配列によりコードされている、改変型Ｇタンパク質共役
    受容体。
  14. 【請求項１４】 欠失した第３の細胞内ループが４４個のアミノ酸長である、請求項１３に記載
    のＧタンパク質共役受容体。
  15. 【請求項１５】 請求項１０に記載の核酸配列によってコードされており、配列Ｇｌｎ−Ｔｒｐ
    −Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（配列番号１５）がその変
    異型Ｇタンパク質共役受容体の第３の細胞内ループから欠失している、変異型Ｇ
    タンパク質共役受容体。
  16. 【請求項１６】 キメラＧタンパク質共役受容体をコードする配列を有する単離核酸であって、
    そのキメラＧタンパク質共役受容体が細胞に基づくアッセイにおいてキメラＧタ
    ンパク質共役受容体に機能的応答の改変を付与するＧタンパク質共役受容体の改
    変型の細胞内ドメインを含んでなる、核酸。
  17. 【請求項１７】 改変型細胞内ドメインが第３の細胞内ループである、請求項１６に記載の核酸
    。
  18. 【請求項１８】 請求項１または１６に記載の核酸配列を含んでなる、ベクター。
  19. 【請求項１９】 請求項８に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。
  20. 【請求項２０】 誘導性受容体遺伝子を含むプラスミドをさらに含んでなる、請求項１９に記載
    の宿主細胞。
  21. 【請求項２１】 真核細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
  22. 【請求項２２】 真核細胞が酵母細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
  23. 【請求項２３】 誘導性受容体遺伝子を含むプラスミドをさらに含んでなる、請求項２２に記載
    の宿主細胞。
  24. 【請求項２４】 受容体遺伝子が緑色蛍光タンパク質である、請求項２３に記載の宿主細胞。
  25. 【請求項２５】 緑色蛍光タンパク質が機能し得る形でＦＵＳ２プロモーターに連結されている
    、請求項２４に記載の宿主細胞。
  26. 【請求項２６】 Ｇタンパク質共役受容体と結合し得る化合物をスクリーニングする方法であっ
    て、 （ａ）請求項１９に記載の宿主細胞を試験化合物に曝し、さらに （ｂ）細胞増殖に対する試験化合物の作用を測定する ことを含んでなる、方法。
  27. 【請求項２７】 異種Ｇタンパク質共役受容体を含んでなる宿主細胞であって、そのＧタンパク
    質共役受容体が細胞に基づくアッセイにおいてＧタンパク質共役受容体の機能的
    応答の改変をもたらす改変を有する、宿主細胞。
  28. 【請求項２８】 改変がアゴニスト刺激性増殖を促進し、そのアゴニストがＧタンパク質共役受
    容体アゴニストである、請求項２７に記載の宿主細胞。
  29. 【請求項２９】 改変が受容体とヘテロ三量体Ｇタンパク質の間の結合の改変をもたらすか、ま
    たは受容体が細胞脱感作もしくは隔離−インターナリゼーション機構と相互作用
    できないようにするか、または適切な原形質膜局在化をもたらす、請求項２８に
    記載の宿主細胞。
  30. 【請求項３０】 真核細胞である、請求項２７に記載の宿主細胞。
  31. 【請求項３１】 異種Ｇタンパク質共役受容体が細胞内ドメインで改変されている、請求項３０
    に記載の宿主細胞。
  32. 【請求項３２】 細胞内ドメインが第３の細胞内ドメインである、請求項３１に記載の宿主細胞
    。
  33. 【請求項３３】 異種Ｇタンパク質共役受容体がＧタンパク質共役受容体のカルボキシ末端テー
    ルで改変されている、請求項２７に記載の宿主細胞。
  34. 【請求項３４】 酵母である、請求項３１または３３に記載の宿主細胞。
  35. 【請求項３５】 改変型Ｇタンパク質共役受容体がニューロテンシン受容体である、請求項３４
    に記載の宿主細胞。
  36. 【請求項３６】 ニューロテンシン受容体がラットニューロテンシンＮＴ１受容体である、請求
    項３５に記載の宿主細胞。
  37. 【請求項３７】 Ｇタンパク質共役受容体と結合し得る化合物をスクリーニングする方法であっ
    て、 （ａ）請求項２７に記載の宿主細胞を試験化合物に曝し、さらに （ｂ）酵母の細胞増殖に対する試験化合物の作用を測定する ことを含んでなる、方法。
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