JP2002523091A - 異種gタンパク質共役受容体の機能を改変する方法 - Google Patents
異種gタンパク質共役受容体の機能を改変する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、Gタンパク質の結合および受容体の応答が改変された変異型Gタンパク質共役受容体、かかる受容体を発現する酵母細胞、かかる細胞を作出するのに有用なベクター、ならびにそれを作出および使用する方法に関する。
Description
【0001】
発明の分野 本発明は、Gタンパク質の結合および受容体の応答が改変された変異型Gタン
パク質共役受容体、かかる受容体を発現する宿主細胞、かかる細胞を作出するの
に有用なベクター、ならびにそれを作出および使用する方法に関する。
パク質共役受容体、かかる受容体を発現する宿主細胞、かかる細胞を作出するの
に有用なベクター、ならびにそれを作出および使用する方法に関する。
【0002】 背景技術 神経伝達物質、ホルモン、臭気物質、および光などの多くの細胞外シグナルの
作用は三つ組のタンパク質によって媒介されており、これは酵母から哺乳類にい
たる生物において同定されている。この三つ組は三量体グアニンヌクレオチド結
合性調節タンパク質(Gタンパク質)に結合した受容体からなり、これが次に細
胞のエフェクターと結合する。これらの受容体は7つのトランスメンブラン・ド
メインを有し、それらのGタンパク質との会合のために「Gタンパク質共役受容
体」(「GPCR」)と名づけられている。
作用は三つ組のタンパク質によって媒介されており、これは酵母から哺乳類にい
たる生物において同定されている。この三つ組は三量体グアニンヌクレオチド結
合性調節タンパク質(Gタンパク質)に結合した受容体からなり、これが次に細
胞のエフェクターと結合する。これらの受容体は7つのトランスメンブラン・ド
メインを有し、それらのGタンパク質との会合のために「Gタンパク質共役受容
体」(「GPCR」)と名づけられている。
【0003】 調節Gタンパク質は3つのサブユニット:グアニルヌクレオチド結合性αサブ
ユニット;βサブユニット;およびγサブユニットからなる(B.R. Conklin and
H.R.Bourne(1993))。Gタンパク質はGDPまたはGTPがαサブユニットに結
合しているかどうかによって2つの形態の間を循環する。GDPが結合している
場合には、Gタンパク質はへテロ三量体であるGαβγ複合体として存在する。
GTPが結合している場合には、αサブユニットは解離し、Gβγ複合体が残る
。重要なことに、Gαβγ複合体は細胞膜において活性化されたGタンパク質共
役受容体と機能し得る形で会合し、GTPと結合型GDPの交換率が高まるので
、Gβγ複合体からの結合したGαサブユニットの解離率も高まる。遊離Gαサ
ブユニットおよびGβγ複合体はシグナルを種々のシグナル変換経路の下流エレ
メントに伝達することができる。これら下流の細胞エフェクタータンパク質の例
としては、中でも、アデニレートシクラーゼ、イオンチャンネルおよびホスホリ
パーゼが挙げられる。現象のこの基本的なスキームが種々の細胞シグナル伝達現
象の多様性の基礎をなしている(H.G. Dohlman et al. (1991))。
ユニット;βサブユニット;およびγサブユニットからなる(B.R. Conklin and
H.R.Bourne(1993))。Gタンパク質はGDPまたはGTPがαサブユニットに結
合しているかどうかによって2つの形態の間を循環する。GDPが結合している
場合には、Gタンパク質はへテロ三量体であるGαβγ複合体として存在する。
GTPが結合している場合には、αサブユニットは解離し、Gβγ複合体が残る
。重要なことに、Gαβγ複合体は細胞膜において活性化されたGタンパク質共
役受容体と機能し得る形で会合し、GTPと結合型GDPの交換率が高まるので
、Gβγ複合体からの結合したGαサブユニットの解離率も高まる。遊離Gαサ
ブユニットおよびGβγ複合体はシグナルを種々のシグナル変換経路の下流エレ
メントに伝達することができる。これら下流の細胞エフェクタータンパク質の例
としては、中でも、アデニレートシクラーゼ、イオンチャンネルおよびホスホリ
パーゼが挙げられる。現象のこの基本的なスキームが種々の細胞シグナル伝達現
象の多様性の基礎をなしている(H.G. Dohlman et al. (1991))。
【0004】 重要な生化学経路におけるそれらの遍在性により、Gタンパク質共役受容体は
新規治療薬の重要な標的に相当する。次に、かかる薬剤の発見には高い特異性の
スクリーニングアッセイおよび処理用語で高処理量スクリーニング(HTS)ア
ッセイが必ず必要となろう。Gタンパク質共役受容体の機能的発現がなされるよ
う遺伝的に改変された酵母系統などの微生物を利用するスクリーニングアッセイ
は種々の病状に関係する多数の受容体へのリガンド結合に関する研究に著しい利
点を与える。
新規治療薬の重要な標的に相当する。次に、かかる薬剤の発見には高い特異性の
スクリーニングアッセイおよび処理用語で高処理量スクリーニング(HTS)ア
ッセイが必ず必要となろう。Gタンパク質共役受容体の機能的発現がなされるよ
う遺伝的に改変された酵母系統などの微生物を利用するスクリーニングアッセイ
は種々の病状に関係する多数の受容体へのリガンド結合に関する研究に著しい利
点を与える。
【0005】 しかしながら、野生型受容体で形質転換された微生物は増殖アッセイにおいて
、例えば、ヘテロ三量体Gタンパク質と相互作用できないこと、不適当な局在化
および/または脱感作を示して、あまりうまく働かない場合もある。多くのGP
CRは慢性および持続性のアゴニスト刺激に応答してリン酸化されるが、これが
脱感作とそれに続く受容体の隔離またはインターナリゼーションをもたらすこと
も多い。GPCRの脱感作はヘテロ三量体Gタンパク質との相互作用からの解放
を引き起こす。このプロセスはGタンパク質共役受容体キナーゼ(GPK)、タ
ンパク質キナーゼA(PHA)、タンパク質キナーゼC(PKC)およびカゼイ
ンキナーゼ(CK)をはじめとする種々の調節受容体タンパク質キナーゼによっ
て媒介されている。インターナリゼーションは受容体により媒介されるエンドサ
イトーシスによる原形質膜からのGPCRの除去を必要とする。インターナリゼ
ーションを受けた受容体は再循環して細胞表面に戻るか、または分解のためにリ
ソソーム/液胞コンパートメントに送達され得る。ユビキチンによって媒介され
る分解経路もこのプロセスに関与している。受容体リン酸化および隔離/インタ
ーナリゼーションの最終的な結果はしばしば細胞増殖の抑止であり、これにより
スクリーニングアッセイにおける遺伝的に改変された微生物の有用性は著しく低
いものとなる。
、例えば、ヘテロ三量体Gタンパク質と相互作用できないこと、不適当な局在化
および/または脱感作を示して、あまりうまく働かない場合もある。多くのGP
CRは慢性および持続性のアゴニスト刺激に応答してリン酸化されるが、これが
脱感作とそれに続く受容体の隔離またはインターナリゼーションをもたらすこと
も多い。GPCRの脱感作はヘテロ三量体Gタンパク質との相互作用からの解放
を引き起こす。このプロセスはGタンパク質共役受容体キナーゼ(GPK)、タ
ンパク質キナーゼA(PHA)、タンパク質キナーゼC(PKC)およびカゼイ
ンキナーゼ(CK)をはじめとする種々の調節受容体タンパク質キナーゼによっ
て媒介されている。インターナリゼーションは受容体により媒介されるエンドサ
イトーシスによる原形質膜からのGPCRの除去を必要とする。インターナリゼ
ーションを受けた受容体は再循環して細胞表面に戻るか、または分解のためにリ
ソソーム/液胞コンパートメントに送達され得る。ユビキチンによって媒介され
る分解経路もこのプロセスに関与している。受容体リン酸化および隔離/インタ
ーナリゼーションの最終的な結果はしばしば細胞増殖の抑止であり、これにより
スクリーニングアッセイにおける遺伝的に改変された微生物の有用性は著しく低
いものとなる。
【0006】
本発明の目的はいずれかの真核細胞、好ましくは酵母細胞において実施される
、高処理量スクリーニングアッセイにおいて十分に機能する改変型Gタンパク質
共役受容体を提供することである。従って、本発明の第1の態様は受容体をヘテ
ロ三量体Gタンパク質とより有効に結合させ、かつ/または細胞脱感作および/
もしくは隔離/インターナリゼーション機構と相互作用できなくする、かつ/ま
たは原形質膜に適当に局在化させることによって、GPCRの機能を向上させる
よう改変されている、Gタンパク質共役受容体をコードするヌクレオチド配列に
向けられる。好ましい態様によれば、かかる改変は改変型アゴニスト刺激性増殖
促進能をもたらす。本発明に包含される、Gタンパク質共役受容体をコードする
ヌクレオチド配列の1つの特定の改変は、いずれかの細胞内ドメインまたは内部
ドメインに隣接する膜領域における変異である。この変異は例えば、点突然変異
をはじめとする欠失であり得る。
、高処理量スクリーニングアッセイにおいて十分に機能する改変型Gタンパク質
共役受容体を提供することである。従って、本発明の第1の態様は受容体をヘテ
ロ三量体Gタンパク質とより有効に結合させ、かつ/または細胞脱感作および/
もしくは隔離/インターナリゼーション機構と相互作用できなくする、かつ/ま
たは原形質膜に適当に局在化させることによって、GPCRの機能を向上させる
よう改変されている、Gタンパク質共役受容体をコードするヌクレオチド配列に
向けられる。好ましい態様によれば、かかる改変は改変型アゴニスト刺激性増殖
促進能をもたらす。本発明に包含される、Gタンパク質共役受容体をコードする
ヌクレオチド配列の1つの特定の改変は、いずれかの細胞内ドメインまたは内部
ドメインに隣接する膜領域における変異である。この変異は例えば、点突然変異
をはじめとする欠失であり得る。
【0007】 本発明はまた、有利なGタンパク質結合特性または酵母細胞脱感作および/も
しくは隔離/インターナリゼーション機構を受けないドメインを提供する異種G
PCRの細胞内ドメインを用いて、注目されるGPCR中の匹敵するドメインが
置換されているキメラGPCRに向けられる。本発明はまた、キメラGPCRを
コードする改変型ヌクレオチド配列、改変型ヌクレオチド配列を含んでなる発現
ベクター、およびそれらで形質転換された宿主細胞に関する。
しくは隔離/インターナリゼーション機構を受けないドメインを提供する異種G
PCRの細胞内ドメインを用いて、注目されるGPCR中の匹敵するドメインが
置換されているキメラGPCRに向けられる。本発明はまた、キメラGPCRを
コードする改変型ヌクレオチド配列、改変型ヌクレオチド配列を含んでなる発現
ベクター、およびそれらで形質転換された宿主細胞に関する。
【0008】 本発明のさらなる態様は、試験化合物の細胞増殖に対する作用を測定すること
によって本発明の変異体またはキメラGPCRへ結合するリガンドの作用を求め
るために化合物をアッセイする改良法である。変異型GPCRは慢性および持続
性アゴニスト刺激による細胞増殖抑止率を抑えるかまたは減少させ、それによっ
て先行技術のスクリーニング法で起こる偽陰性数が少なくなり、かつ/またはバ
イオアッセイの感度が高まる。
によって本発明の変異体またはキメラGPCRへ結合するリガンドの作用を求め
るために化合物をアッセイする改良法である。変異型GPCRは慢性および持続
性アゴニスト刺激による細胞増殖抑止率を抑えるかまたは減少させ、それによっ
て先行技術のスクリーニング法で起こる偽陰性数が少なくなり、かつ/またはバ
イオアッセイの感度が高まる。
【0009】
【発明の具体的な説明】改変型Gタンパク質共役受容体 Gタンパク質共役受容体をコードするヌクレオチド配列は、受容体をヘテロ三
量体Gタンパク質とより有効に結合させる、かつ/または細胞脱感作および/も
しくは隔離/インターナリゼーション機構と相互作用できなくすることによって
GPCRの機能を向上させるよう改変することができる。かかる改変は改変型ア
ゴニスト刺激性酵母細胞増殖促進能をもたらす。宿主細胞におけるGPCR−G
タンパク質結合の改変および/または受容体リン酸化および/もしくは隔離/イ
ンターナリゼーションの排除は有用な酵母細胞増殖応答を刺激できない野生型異
種GPCRの機能を改変する手段を提供する。従って、その野生型形態では機能
できないGPCRが本発明の方法によって働くようになり得る。
量体Gタンパク質とより有効に結合させる、かつ/または細胞脱感作および/も
しくは隔離/インターナリゼーション機構と相互作用できなくすることによって
GPCRの機能を向上させるよう改変することができる。かかる改変は改変型ア
ゴニスト刺激性酵母細胞増殖促進能をもたらす。宿主細胞におけるGPCR−G
タンパク質結合の改変および/または受容体リン酸化および/もしくは隔離/イ
ンターナリゼーションの排除は有用な酵母細胞増殖応答を刺激できない野生型異
種GPCRの機能を改変する手段を提供する。従って、その野生型形態では機能
できないGPCRが本発明の方法によって働くようになり得る。
【0010】 宿主細胞におけるGPCR−Gタンパク質結合の改変およびまたは受容体リン
酸化および/もしくは隔離/インターナリゼーションの排除は、以下に示される
実施例に記載されたもの、または当業者に公知のものなどの通常の技術を用いる
ことによって評価すればよい。例えば、野生型に対する変異型GPCRの機能の
改変はノイズに対するシグナル率の増加、および/または液体バイオアッセイの
感度の増加として定量できる。ノイズに対するシグナル率はアゴニスト誘導性増
殖率とアゴニストの不在下で認められる増殖率とを比較することによって求めら
れる。変異型GPCRのアゴニスト刺激に起因するノイズに対するシグナル率の
、野生型受容体を含む細胞から得られる同様の値に対する統計的に有意な増加は
変異型GPCRの機能が改変されているということを示す。
酸化および/もしくは隔離/インターナリゼーションの排除は、以下に示される
実施例に記載されたもの、または当業者に公知のものなどの通常の技術を用いる
ことによって評価すればよい。例えば、野生型に対する変異型GPCRの機能の
改変はノイズに対するシグナル率の増加、および/または液体バイオアッセイの
感度の増加として定量できる。ノイズに対するシグナル率はアゴニスト誘導性増
殖率とアゴニストの不在下で認められる増殖率とを比較することによって求めら
れる。変異型GPCRのアゴニスト刺激に起因するノイズに対するシグナル率の
、野生型受容体を含む細胞から得られる同様の値に対する統計的に有意な増加は
変異型GPCRの機能が改変されているということを示す。
【0011】 液体バイオアッセイの感度は半最大増殖率(ED50またはEC50)をもた
らすのに必要なアゴニスト濃度として定義される。野生型GPCRによって必要
とされるよりも低いアゴニスト濃度で変異型GPCRが半最大増殖率を示すなら
ばバイオアッセイの感度は、高まっている。
らすのに必要なアゴニスト濃度として定義される。野生型GPCRによって必要
とされるよりも低いアゴニスト濃度で変異型GPCRが半最大増殖率を示すなら
ばバイオアッセイの感度は、高まっている。
【0012】 同様に、より定量的な寒天ベースのバイオアッセイは、変異型GPCRのアゴ
ニスト刺激によるノイズに対するシグナル率および/または感度の増加を反映す
る。寒天ベースのバイオアッセイでは、ノイズに対するシグナル率の増加は変異
型および野生型受容体の刺激に起因するアゴニスト誘導性増殖領域内の増殖度を
比較することによって求められる。バイオアッセイの感度は増殖領域の半径に比
例する。塗布される化合物は寒天の塗布部位から放射状に拡散するので、アゴニ
スト濃度は増殖領域の半径の二乗で変化する。従って、変異型GPCRのアゴニ
スト活性化に応答した増殖領域が大きくなることは感度の上昇を反映している。
ニスト刺激によるノイズに対するシグナル率および/または感度の増加を反映す
る。寒天ベースのバイオアッセイでは、ノイズに対するシグナル率の増加は変異
型および野生型受容体の刺激に起因するアゴニスト誘導性増殖領域内の増殖度を
比較することによって求められる。バイオアッセイの感度は増殖領域の半径に比
例する。塗布される化合物は寒天の塗布部位から放射状に拡散するので、アゴニ
スト濃度は増殖領域の半径の二乗で変化する。従って、変異型GPCRのアゴニ
スト活性化に応答した増殖領域が大きくなることは感度の上昇を反映している。
【0013】 本発明の実施には、いずれのGタンパク質共役受容体を用いてもよい。かかる
受容体の例としては、限定されるものではないが、アデノシン受容体、ソマトス
タチン受容体、ドーパミン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン様コリ
ン作動性受容体、αアドレナリン作動性受容体、βアドレナリン作動性受容体、
アヘン受容体、カンナビノイド受容体、増殖ホルモン放出因子、グルカゴン、セ
ロトニン受容体、バソプレシン受容体、メラノコルチン受容体、およびニューロ
テンシン受容体が挙げられる。ある好ましい態様によれば、受容体はムスカリン
様アセチルコリン受容体であり、より好ましくは、このムスカリン様アセチルコ
リン受容体はM3サブタイプのものである。
受容体の例としては、限定されるものではないが、アデノシン受容体、ソマトス
タチン受容体、ドーパミン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン様コリ
ン作動性受容体、αアドレナリン作動性受容体、βアドレナリン作動性受容体、
アヘン受容体、カンナビノイド受容体、増殖ホルモン放出因子、グルカゴン、セ
ロトニン受容体、バソプレシン受容体、メラノコルチン受容体、およびニューロ
テンシン受容体が挙げられる。ある好ましい態様によれば、受容体はムスカリン
様アセチルコリン受容体であり、より好ましくは、このムスカリン様アセチルコ
リン受容体はM3サブタイプのものである。
【0014】 同様に、いずれの好適な宿主細胞を本発明の改変型Gタンパク質共役受容体を
コードするヌクレオチド配列で形質転換してもよい。好適な宿主細胞の例として
は酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、および細菌細胞がある。好ましくは、宿主
細胞は酵母細胞である。
コードするヌクレオチド配列で形質転換してもよい。好適な宿主細胞の例として
は酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、および細菌細胞がある。好ましくは、宿主
細胞は酵母細胞である。
【0015】 宿主細胞において発現されるGPCRの機能を改変する1つの一般化できる方
法として、Gタンパク質共役受容体の第3の細胞内ドメイン(IC3)配列など
のGPCRの細胞内ドメインの改変または排除によるものがある。脱感作および
インターナリゼーション機構はGPCRの細胞内ドメインに作用するので、GP
CRの細胞内ドメインの排除によって、より安定な受容体発現がもたらされる。
このことは哺乳類細胞で行われた実験において証明されている。受容体インター
ナリゼーションに関与すると考えられているそれらの第3の細胞内ループのドメ
インを欠くM3サブタイプをはじめとするムスカリン様アセチルコリン受容体は
野生型の対応物よりも高い程度まで原形質膜に維持されている(Moro et al. (19
93))。
法として、Gタンパク質共役受容体の第3の細胞内ドメイン(IC3)配列など
のGPCRの細胞内ドメインの改変または排除によるものがある。脱感作および
インターナリゼーション機構はGPCRの細胞内ドメインに作用するので、GP
CRの細胞内ドメインの排除によって、より安定な受容体発現がもたらされる。
このことは哺乳類細胞で行われた実験において証明されている。受容体インター
ナリゼーションに関与すると考えられているそれらの第3の細胞内ループのドメ
インを欠くM3サブタイプをはじめとするムスカリン様アセチルコリン受容体は
野生型の対応物よりも高い程度まで原形質膜に維持されている(Moro et al. (19
93))。
【0016】
以下、実施例において、本発明の代表的な態様をより詳しく説明する。例1 酵母における変異型ラットM3のムスカリン様アセチルコリン受容体(M
AR)の機能的発現 GPCRの第3の細胞内ループはGタンパク質と相互作用してアゴニスト結合
の際にGタンパク質の活性化に関与すると考えられている(J. Wess(1997))。酵
母接合フェロモン受容体Ste2およびSte3のIC3における突然変異はG
タンパク質の結合に対して著しい影響を及ぼす(C. Boone et al. (1993) and C
. Clark et al. (1994))。重要なことは、哺乳類のMAR、特にラットM3
MARのIC3部分の欠失が、ヘテロ三量体Gタンパク質Gq(Gαβγ)と結
合するための十分な能力を保持する哺乳類細胞における改変された機能的発現と
相関していることである。変異型M3 MARはすべての外部ループを保持して
いる。トランスメンブランドメイン(TMD)およびIC3以外の内部ドメイン
は変化しない。5番目と6番目の膜にまたがるらせんの間に見られるこのIC3
は、改変された唯一のドメインであった。このドメインの大部分、IC3の中心
の96個のアミノ酸(Ala273−Lys469)が欠失しており、5番目お
よび6番目のトランスメンブランらせん双方に隣接したわずか22個のアミノ酸
が残っていた。このように、野生型M3 MARのIC3のアミノ酸が240個
であるのに対し、IC3欠失(IC3Δ)を含むMARの第3の細胞内ループは
44個のアミノ酸長である。機能的発現の改変は、細胞の脱感作機構と相互作用
して、より機能的なMARを細胞表面に持たせることが知られているドメインの
排除によるものかもしれない。
AR)の機能的発現 GPCRの第3の細胞内ループはGタンパク質と相互作用してアゴニスト結合
の際にGタンパク質の活性化に関与すると考えられている(J. Wess(1997))。酵
母接合フェロモン受容体Ste2およびSte3のIC3における突然変異はG
タンパク質の結合に対して著しい影響を及ぼす(C. Boone et al. (1993) and C
. Clark et al. (1994))。重要なことは、哺乳類のMAR、特にラットM3
MARのIC3部分の欠失が、ヘテロ三量体Gタンパク質Gq(Gαβγ)と結
合するための十分な能力を保持する哺乳類細胞における改変された機能的発現と
相関していることである。変異型M3 MARはすべての外部ループを保持して
いる。トランスメンブランドメイン(TMD)およびIC3以外の内部ドメイン
は変化しない。5番目と6番目の膜にまたがるらせんの間に見られるこのIC3
は、改変された唯一のドメインであった。このドメインの大部分、IC3の中心
の96個のアミノ酸(Ala273−Lys469)が欠失しており、5番目お
よび6番目のトランスメンブランらせん双方に隣接したわずか22個のアミノ酸
が残っていた。このように、野生型M3 MARのIC3のアミノ酸が240個
であるのに対し、IC3欠失(IC3Δ)を含むMARの第3の細胞内ループは
44個のアミノ酸長である。機能的発現の改変は、細胞の脱感作機構と相互作用
して、より機能的なMARを細胞表面に持たせることが知られているドメインの
排除によるものかもしれない。
【0017】 このIC3Δ変異も酵母における機能的発現を改変することができるかどうか
を検討するために、標準的な方法により、野生型およびIC3ΔラットM3 M
ARをコードするDNA配列を、酵母発現プラスミドp426GPD中のグリセ
ロール−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの近位にクローン化した。ラット
M3 MAR配列を、5’BgIII(AAAAGATCT AAA ATG T
AC CCC TAC GAC GTC CCC)(配列番号1)および3’X
hoI(AAA CTCGAG CTA CAA GGC CTG CTC C
GG CAC TCG C)(配列番号2)部位を含むオリゴヌクレオチドを用
いてPCR法により増幅した。得られたPCR産物を適当な制限エンドヌクレア
ーゼで消化し、精製してp426GPDの適当な部位に連結した。ラットM3
IC3Δを形成するために、3つのM3 MAR断片をPCR法により増幅した
。アミノ末端をコードする断片を5’BgIII(AAAAGATCT AAA
ATG TAC CCC TAC GAC GTC CCC)(配列番号1)お
よび3’AgeI(ATAGTCATGATGGTG ACCGGT ATGT
AAAAGGCAGCGATC)(配列番号3)部位を含むオリゴヌクレオチド
を用いて増幅した。カルボキシ末端をコードする断片は5’PmII(GCCT
TCATCAT CACGTG GACCCCCTACACC)(配列番号4)
および3’XhoI(AAA CTCGAG CTA CAA GGC CTG
CTC CGG CAC TCG C)(配列番号2)部位を含むオリゴヌク
レオチドを用いて増幅した。IC3をコードする断片は、M3 IC3Δ配列を
用い、5’AgeI(CGATCGCTGCCTTTTACTT ACCGGT
CACCATCATGACTAT)(配列番号5)および3’PmII(GT
TGTAGGGGGTC CACGTG ATGATGAAGGC)(配列番号
6)部位を含むオリゴヌクレオチドを用いて増幅した(J. Wess (1997))。得ら
れたPCR産物を適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、精製してp4
26GPD中の適当な部位に連結した。プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ
マッピングおよびDNA配列決定法により確認した。得られたプラスミドを、従
来の酢酸リチウム形質転換法を用い、参照することにより本明細書の一部とされ
る米国特許第5,691,188号に記載のものなど、具体的にはPaush et al.
(1998)に記載のMPY578fc細胞をはじめとするGPCRアゴニスト刺激
性増殖アッセイを行うのに有用な酵母細胞に導入した。
を検討するために、標準的な方法により、野生型およびIC3ΔラットM3 M
ARをコードするDNA配列を、酵母発現プラスミドp426GPD中のグリセ
ロール−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの近位にクローン化した。ラット
M3 MAR配列を、5’BgIII(AAAAGATCT AAA ATG T
AC CCC TAC GAC GTC CCC)(配列番号1)および3’X
hoI(AAA CTCGAG CTA CAA GGC CTG CTC C
GG CAC TCG C)(配列番号2)部位を含むオリゴヌクレオチドを用
いてPCR法により増幅した。得られたPCR産物を適当な制限エンドヌクレア
ーゼで消化し、精製してp426GPDの適当な部位に連結した。ラットM3
IC3Δを形成するために、3つのM3 MAR断片をPCR法により増幅した
。アミノ末端をコードする断片を5’BgIII(AAAAGATCT AAA
ATG TAC CCC TAC GAC GTC CCC)(配列番号1)お
よび3’AgeI(ATAGTCATGATGGTG ACCGGT ATGT
AAAAGGCAGCGATC)(配列番号3)部位を含むオリゴヌクレオチド
を用いて増幅した。カルボキシ末端をコードする断片は5’PmII(GCCT
TCATCAT CACGTG GACCCCCTACACC)(配列番号4)
および3’XhoI(AAA CTCGAG CTA CAA GGC CTG
CTC CGG CAC TCG C)(配列番号2)部位を含むオリゴヌク
レオチドを用いて増幅した。IC3をコードする断片は、M3 IC3Δ配列を
用い、5’AgeI(CGATCGCTGCCTTTTACTT ACCGGT
CACCATCATGACTAT)(配列番号5)および3’PmII(GT
TGTAGGGGGTC CACGTG ATGATGAAGGC)(配列番号
6)部位を含むオリゴヌクレオチドを用いて増幅した(J. Wess (1997))。得ら
れたPCR産物を適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、精製してp4
26GPD中の適当な部位に連結した。プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ
マッピングおよびDNA配列決定法により確認した。得られたプラスミドを、従
来の酢酸リチウム形質転換法を用い、参照することにより本明細書の一部とされ
る米国特許第5,691,188号に記載のものなど、具体的にはPaush et al.
(1998)に記載のMPY578fc細胞をはじめとするGPCRアゴニスト刺激
性増殖アッセイを行うのに有用な酵母細胞に導入した。
【0018】 MARを含む酵母細胞を、MARアゴニストカルバコール(CCh)を用いて
液体培養液中でアッセイした。この細胞を2mlのSC−グルコース−ura培
地中で一晩培養した。基礎増殖速度を低下させるための5mMの3−アミノトリ
アゾールを含有するSC−グルコース−ura−his培地pH6.8で細胞を
500倍に希釈した。ムスカリン様受容体アゴニストの連続希釈サンプル(10 −1 〜10−8M)20μlを含有する、滅菌96ウェルマイクロタイターディ
ッシュのウェルに細胞懸濁液サンプル(180μl)を分注した。このプレート
を30℃にて18時間、振盪しつつ(600rpm)インキュベートした。増殖
はマイクロプレートリーダーを用いて、OD620における記録値の増加により
モニターした。アッセイは2回行い、酵母細胞の対数増殖期に増殖速度を測定し
た。GraphPad Prismを用いて光学的密度の測定値を分析し、平均値±標準誤差と
して表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。図1に示されるように、M3
MAR IC3Δを含む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答をし、M3
MAR IC3Δが機能していることが示されたが、酵母細胞のアゴニスト依存
性増殖が認められなかったので野生型MARは機能していない。M3 MAR
IC3Δを含む細胞の増殖応答は用量依存的であり、カルバコール(CCh)に
対するEC50は3μMに相当した。この値は、HEK細胞において得られたC
Chに対するKD値(7.9μM)および、CCh誘導IP3(イノシトール3
リン酸)蓄積に関するEC50(4.0μM)に匹敵したが、このことはM3
MAR IC3Δが酵母細胞膜で発現した場合、期待される薬理学的特性を保持
することを示唆するものである。さらに、増殖応答はMAR特異的アンタゴニス
トであるアトロピン(At)により阻害される。
液体培養液中でアッセイした。この細胞を2mlのSC−グルコース−ura培
地中で一晩培養した。基礎増殖速度を低下させるための5mMの3−アミノトリ
アゾールを含有するSC−グルコース−ura−his培地pH6.8で細胞を
500倍に希釈した。ムスカリン様受容体アゴニストの連続希釈サンプル(10 −1 〜10−8M)20μlを含有する、滅菌96ウェルマイクロタイターディ
ッシュのウェルに細胞懸濁液サンプル(180μl)を分注した。このプレート
を30℃にて18時間、振盪しつつ(600rpm)インキュベートした。増殖
はマイクロプレートリーダーを用いて、OD620における記録値の増加により
モニターした。アッセイは2回行い、酵母細胞の対数増殖期に増殖速度を測定し
た。GraphPad Prismを用いて光学的密度の測定値を分析し、平均値±標準誤差と
して表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。図1に示されるように、M3
MAR IC3Δを含む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答をし、M3
MAR IC3Δが機能していることが示されたが、酵母細胞のアゴニスト依存
性増殖が認められなかったので野生型MARは機能していない。M3 MAR
IC3Δを含む細胞の増殖応答は用量依存的であり、カルバコール(CCh)に
対するEC50は3μMに相当した。この値は、HEK細胞において得られたC
Chに対するKD値(7.9μM)および、CCh誘導IP3(イノシトール3
リン酸)蓄積に関するEC50(4.0μM)に匹敵したが、このことはM3
MAR IC3Δが酵母細胞膜で発現した場合、期待される薬理学的特性を保持
することを示唆するものである。さらに、増殖応答はMAR特異的アンタゴニス
トであるアトロピン(At)により阻害される。
【0019】 あるいは、M3 MAR IC3Δを含む酵母細胞によるCChに対する応答
は、その発現がMARアゴニストにより刺激される緑色蛍光タンパク質レポータ
ー遺伝子の、アゴニストにより誘導される蛍光発光の増加量の測定により観察さ
れ得る。緑色蛍光タンパク質(GFP)はクラゲ(Aequorea)由来のタンパク質で
あり、酵母細胞内で発現した場合、内因的蛍光を有する。GFP由来の蛍光は生
存酵母菌において検出可能で、その発現レベルは酵母細胞を損傷することなく測
定できる。この特徴は、その検出のために付加的な工程を必要としないのでレポ
ーター遺伝子アッセイにおいて特に有利である。酵母中で発現した異種GPCR
のアゴニスト活性化検出に有用な誘導性レポーター遺伝子は、シグナル変換経路
と交わることにより活性化される転写プロモーターを利用する。かかるプロモー
ターの1つがFUS2プロモーターである。アゴニスト刺激がない状態では、F
us2タンパク質またはその発現がFUS2プロモーターによって命令される他
のいずれかのタンパク質の発現もほとんど、または全く検出されない。アゴニス
ト処理後、FUS2プロモーターからの転写が700倍にまで誘導され、Fus
2の発現、またはその発現がFUS2プロモーターの制御下にある遺伝子産物の
いずれかの発現の実質的な増加が起こる。このように、FUS2−GFPレポー
ター遺伝子由来のFUS2プロモーター制御下でのGFP発現の結果得られる酵
母細胞の蛍光は異種GPCRのアゴニスト活性化後のみに認められる。
は、その発現がMARアゴニストにより刺激される緑色蛍光タンパク質レポータ
ー遺伝子の、アゴニストにより誘導される蛍光発光の増加量の測定により観察さ
れ得る。緑色蛍光タンパク質(GFP)はクラゲ(Aequorea)由来のタンパク質で
あり、酵母細胞内で発現した場合、内因的蛍光を有する。GFP由来の蛍光は生
存酵母菌において検出可能で、その発現レベルは酵母細胞を損傷することなく測
定できる。この特徴は、その検出のために付加的な工程を必要としないのでレポ
ーター遺伝子アッセイにおいて特に有利である。酵母中で発現した異種GPCR
のアゴニスト活性化検出に有用な誘導性レポーター遺伝子は、シグナル変換経路
と交わることにより活性化される転写プロモーターを利用する。かかるプロモー
ターの1つがFUS2プロモーターである。アゴニスト刺激がない状態では、F
us2タンパク質またはその発現がFUS2プロモーターによって命令される他
のいずれかのタンパク質の発現もほとんど、または全く検出されない。アゴニス
ト処理後、FUS2プロモーターからの転写が700倍にまで誘導され、Fus
2の発現、またはその発現がFUS2プロモーターの制御下にある遺伝子産物の
いずれかの発現の実質的な増加が起こる。このように、FUS2−GFPレポー
ター遺伝子由来のFUS2プロモーター制御下でのGFP発現の結果得られる酵
母細胞の蛍光は異種GPCRのアゴニスト活性化後のみに認められる。
【0020】 GFPレポーター遺伝子を産生するために、増強されたGFP(EGFP、Cl
onetech)、FUS2プロモーター、およびFUS2転写ターミネーター配列を
コードするDNA配列をPCR法により増幅した。これらの断片をプラスミドp
RS414を含む動原体に組み込んで、EGFP発現をプラスミドpRS414
を含む動原体のフェロモン応答性FUS2プロモーターの制御下に置いてpMP
241を作出した。得られたプラスミドを、従来の酢酸リチウム形質転換法を用
い、M3 MAR IC3Δを含む細胞のGPCRアゴニスト刺激による増殖ア
ッセイを行うのに有用な、米国特許第5,691,188号に記載の種類の酵母
細胞中に導入した。具体的には、このプラスミドをPausch et al (1998)に記載
のMPY578fc細胞に導入した。
onetech)、FUS2プロモーター、およびFUS2転写ターミネーター配列を
コードするDNA配列をPCR法により増幅した。これらの断片をプラスミドp
RS414を含む動原体に組み込んで、EGFP発現をプラスミドpRS414
を含む動原体のフェロモン応答性FUS2プロモーターの制御下に置いてpMP
241を作出した。得られたプラスミドを、従来の酢酸リチウム形質転換法を用
い、M3 MAR IC3Δを含む細胞のGPCRアゴニスト刺激による増殖ア
ッセイを行うのに有用な、米国特許第5,691,188号に記載の種類の酵母
細胞中に導入した。具体的には、このプラスミドをPausch et al (1998)に記載
のMPY578fc細胞に導入した。
【0021】 M3 MAR IC3Δを含む酵母細胞およびFUS2−EGFP受容体プラ
スミドを、液体培養液中でMARアゴニストカルバコール(CCb)を用いてア
ッセイした。この細胞を2mlのSC−グルコース−ura培地中で一晩培養し
た。細胞を洗浄し、基礎増殖速度を低下させるために5mMの3−アミノトリア
ゾールを含有するSC−グルコース−ura−his培地pH6.8で5倍希釈
した。細胞懸濁液サンプル(180μl)を、CChの連続希釈サンプル(10 −1 〜10−8M)20μlを含有する滅菌96ウェルマイクロタイターディッ
シュのウェルに分注した。このプレートを30℃で6時間、振盪しつつ(600
rpm)インキュベートした。FUS2−EGFPレポーター遺伝子発現の刺激
は、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、480nm光で励起した後の53
0nmにおける発光の増大を記録することによりモニターした。アッセイは2回
行い、測定値は酵母細胞の対数増殖期に得た。蛍光発光の測定値は、GraphPad P
rismを用いて解析し、平均±標準誤差として表し、アゴニスト濃度に対してプロ
ットした。図1Bに示されるように、M3 MAR IC3Δを含む酵母細胞は
蛍光発光における用量依存的な増大を示し、それはアゴニスト誘導性FUS2−
GFPレポーター遺伝子構築体由来のEFGP発現の増大と一致していた。CC
h刺激の蛍光発光に対するEC50は4μMであり、これは増殖アッセイにおい
て得られた値と同じであった。
スミドを、液体培養液中でMARアゴニストカルバコール(CCb)を用いてア
ッセイした。この細胞を2mlのSC−グルコース−ura培地中で一晩培養し
た。細胞を洗浄し、基礎増殖速度を低下させるために5mMの3−アミノトリア
ゾールを含有するSC−グルコース−ura−his培地pH6.8で5倍希釈
した。細胞懸濁液サンプル(180μl)を、CChの連続希釈サンプル(10 −1 〜10−8M)20μlを含有する滅菌96ウェルマイクロタイターディッ
シュのウェルに分注した。このプレートを30℃で6時間、振盪しつつ(600
rpm)インキュベートした。FUS2−EGFPレポーター遺伝子発現の刺激
は、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、480nm光で励起した後の53
0nmにおける発光の増大を記録することによりモニターした。アッセイは2回
行い、測定値は酵母細胞の対数増殖期に得た。蛍光発光の測定値は、GraphPad P
rismを用いて解析し、平均±標準誤差として表し、アゴニスト濃度に対してプロ
ットした。図1Bに示されるように、M3 MAR IC3Δを含む酵母細胞は
蛍光発光における用量依存的な増大を示し、それはアゴニスト誘導性FUS2−
GFPレポーター遺伝子構築体由来のEFGP発現の増大と一致していた。CC
h刺激の蛍光発光に対するEC50は4μMであり、これは増殖アッセイにおい
て得られた値と同じであった。
【0022】 このように、ラットM3 MARにおけるIC3部分の欠失は、酵母において
発現した場合に機能的GPCRが産生されたが、このことは内部ドメインの改変
が酵母において発現した異種GPCRの機能改変のために一般化できる方法であ
り得ることを示唆するものである。
発現した場合に機能的GPCRが産生されたが、このことは内部ドメインの改変
が酵母において発現した異種GPCRの機能改変のために一般化できる方法であ
り得ることを示唆するものである。
【0023】例2 酵母における変異型D.メラノガスター(D. melanogaster)・ムスカリ
ン様アセチルコリン受容体の機能的発現 Gタンパク質共役昆虫ムスカリン様アセチルコリン受容体(MAR)のアゴニ
ストは、実質的な殺虫力および殺ダニ力を有している(M.R. Dick et al. (1997
))。これらの知見から、昆虫MARに対して有効なアゴニストに関する酵母に
基づく高処理量スクリーニング法(HTS)の開発は、新規の作用様式の殺虫剤
に発展する可能性のあるリード化合物の同定に有用であることが示唆される。予
備実験から、昆虫のGタンパク質共役受容体(GPCR)である野生型D.メラ
ノガスターMAR(DMAR)は、酵母中では機能しないことが示されている。
このように、DMAR IC3をM3 MAR IC3Δ由来の機能的IC3と
置換することで、酵母におけるDMARの機能を向上させる方法を開発する努力
が始められた。
ン様アセチルコリン受容体の機能的発現 Gタンパク質共役昆虫ムスカリン様アセチルコリン受容体(MAR)のアゴニ
ストは、実質的な殺虫力および殺ダニ力を有している(M.R. Dick et al. (1997
))。これらの知見から、昆虫MARに対して有効なアゴニストに関する酵母に
基づく高処理量スクリーニング法(HTS)の開発は、新規の作用様式の殺虫剤
に発展する可能性のあるリード化合物の同定に有用であることが示唆される。予
備実験から、昆虫のGタンパク質共役受容体(GPCR)である野生型D.メラ
ノガスターMAR(DMAR)は、酵母中では機能しないことが示されている。
このように、DMAR IC3をM3 MAR IC3Δ由来の機能的IC3と
置換することで、酵母におけるDMARの機能を向上させる方法を開発する努力
が始められた。
【0024】 昆虫細胞において、DMARはヘテロ三量体Gqタンパク質と相互作用し、ム
スカリン様アゴニストに応答して細胞内カルシウムを増加させる。酵母中でDM
ARが不活性であることに対する、可能性のある説明の1つに、酵母のヘテロ三
量体Gタンパク質と効率的に結合できないことが挙げられる。従って、酵母にお
いてDMAR機能を改変する方法を考案するために、機能的発現の改変およびヘ
テロ三量体Gタンパク質との結合に働きを持つGPCRにおける選択的突然変異
を検討した。
スカリン様アゴニストに応答して細胞内カルシウムを増加させる。酵母中でDM
ARが不活性であることに対する、可能性のある説明の1つに、酵母のヘテロ三
量体Gタンパク質と効率的に結合できないことが挙げられる。従って、酵母にお
いてDMAR機能を改変する方法を考案するために、機能的発現の改変およびヘ
テロ三量体Gタンパク質との結合に働きを持つGPCRにおける選択的突然変異
を検討した。
【0025】 IC3置換体を構築するために、標準的な方法により3つのドメインをコード
するPCR断片を調製した。断片1は5番目のTMD内のショウジョウバエMA
Rのアミノ末端コード部分からAgeI部位までからなり、オリゴヌクレオチド
(AAA AGATCT AAA ATG TACGGAAACCAGACGA
AC)(配列番号7)および(CCA GTA GAG GAA GCACAT
GATGGTC AGGCCT AAG TAG AAG GCG GCC A
GT GC)(配列番号8)を用いてPCR法により増幅した。DMARの第2
の断片は、6番目のTMD中のPmII部位から始まるカルボキシ末端コード配列
からなり、オリゴヌクレオチド(TTCATCATCACGTGGACTCCG
TACAACATC)(配列番号9)および(AAA CTCGAGTTATC
TAATTGTAGACGCGGC)(配列番号10)を用いてPCR法により
増幅した。このM3 MAR IC3Δドメインを、例1に記載された断片1お
よび2とともにフレーム内にコード配列を有するAgeI−PmII断片として増
幅した。これらの断片をプラスミドp426GPDに組み込んで、変異型DMA
RをGPDプロモーターの制御下に置いた。この野生型DMARを、米国特許第
5,691,188号に記載された発現ベクターpMP3中にクローン化した。
得られたプラスミドを、従来の酢酸リチウム形質転換法を用い、米国特許第5,
691,188号に記載の、特にPausch et al. (1998)に記載のMPY578f
c細胞をはじめとする、GPCRアゴニスト刺激性増殖のアッセイを行うのに有
用な酵母細胞に導入した。
するPCR断片を調製した。断片1は5番目のTMD内のショウジョウバエMA
Rのアミノ末端コード部分からAgeI部位までからなり、オリゴヌクレオチド
(AAA AGATCT AAA ATG TACGGAAACCAGACGA
AC)(配列番号7)および(CCA GTA GAG GAA GCACAT
GATGGTC AGGCCT AAG TAG AAG GCG GCC A
GT GC)(配列番号8)を用いてPCR法により増幅した。DMARの第2
の断片は、6番目のTMD中のPmII部位から始まるカルボキシ末端コード配列
からなり、オリゴヌクレオチド(TTCATCATCACGTGGACTCCG
TACAACATC)(配列番号9)および(AAA CTCGAGTTATC
TAATTGTAGACGCGGC)(配列番号10)を用いてPCR法により
増幅した。このM3 MAR IC3Δドメインを、例1に記載された断片1お
よび2とともにフレーム内にコード配列を有するAgeI−PmII断片として増
幅した。これらの断片をプラスミドp426GPDに組み込んで、変異型DMA
RをGPDプロモーターの制御下に置いた。この野生型DMARを、米国特許第
5,691,188号に記載された発現ベクターpMP3中にクローン化した。
得られたプラスミドを、従来の酢酸リチウム形質転換法を用い、米国特許第5,
691,188号に記載の、特にPausch et al. (1998)に記載のMPY578f
c細胞をはじめとする、GPCRアゴニスト刺激性増殖のアッセイを行うのに有
用な酵母細胞に導入した。
【0026】 DMARを含む酵母細胞および野生型DMARを含むプラスミドを、液体培養
液中でMARアゴニストカルバコール(CCh)を用いてアッセイした。この細
胞を2mlのSC−グルコース−ura培地中で一晩培養した。この細胞を、基
礎増殖速度を低下させるための5mMの3−アミノトリアゾールを含有するSC
−グルコース−ura−his培地(pH6.8)に500倍希釈した。細胞懸
濁液サンプル(180μl)を、ムスカリン様受容体アゴニストの連続希釈サン
プル(10−1〜10−8M)20μlを含有する滅菌96ウェルマイクロタイ
ターディッシュのウェルに分注した。このプレートを30℃で18時間、振盪し
つつ(600rpm)インキュベートした。アッセイは2回行い、増殖速度測定
は酵母細胞の対数増殖期に行った。光学的密度の測定値をGraphPad Prismを用い
て解析し、平均±標準誤差として表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。
図2に示されたように、変異型DMAR、すなわちM3 MAR IC3Δを含
む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を示し、DMAR−M3 MAR I
C3Δは機能していることが示された。野生型のDMARはアゴニスト依存性酵
母細胞増殖が起こらなかったことにより示されるように機能しなかった。
液中でMARアゴニストカルバコール(CCh)を用いてアッセイした。この細
胞を2mlのSC−グルコース−ura培地中で一晩培養した。この細胞を、基
礎増殖速度を低下させるための5mMの3−アミノトリアゾールを含有するSC
−グルコース−ura−his培地(pH6.8)に500倍希釈した。細胞懸
濁液サンプル(180μl)を、ムスカリン様受容体アゴニストの連続希釈サン
プル(10−1〜10−8M)20μlを含有する滅菌96ウェルマイクロタイ
ターディッシュのウェルに分注した。このプレートを30℃で18時間、振盪し
つつ(600rpm)インキュベートした。アッセイは2回行い、増殖速度測定
は酵母細胞の対数増殖期に行った。光学的密度の測定値をGraphPad Prismを用い
て解析し、平均±標準誤差として表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。
図2に示されたように、変異型DMAR、すなわちM3 MAR IC3Δを含
む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を示し、DMAR−M3 MAR I
C3Δは機能していることが示された。野生型のDMARはアゴニスト依存性酵
母細胞増殖が起こらなかったことにより示されるように機能しなかった。
【0027】 このようにDMARのIC3を、ラットM3 MAR産物由来の機能的欠失し
たIC3で置換すると、酵母において発現した際に機能的キメラGPCRが産生
され、この内部ドメインを置換する方法は酵母アッセイのような細胞に基づくア
ッセイにおいて、異種GPCRの機能的発現の改変のために一般化できる方法で
あり得ることが示された。
たIC3で置換すると、酵母において発現した際に機能的キメラGPCRが産生
され、この内部ドメインを置換する方法は酵母アッセイのような細胞に基づくア
ッセイにおいて、異種GPCRの機能的発現の改変のために一般化できる方法で
あり得ることが示された。
【0028】例3 酵母における変異型ラット・コレシストキニンCCKB受容体の機能的発
現 例1および2で示したように、哺乳類MAR、特にラットM3 MARのIC
3部分の欠失は、ヘテロ三量体Gタンパク質と結合するための完全な能力を保持
した哺乳類および酵母細胞の機能的発現の改変と相関する。このIC3Δ突然変
異がまた酵母において他のGPCRの機能的発現を改変することができるかどう
かを検討するために、ラット野生型およびIC3ΔコレシストキニンCCKB受
容体をコードするDNA配列をPCR法により増幅して、標準的な方法により、
酵母発現プラスミドp426GPD中のグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼプ
ロモーターの近位へクローン化した。野生型CCKBRは、オリゴヌクレオチド
(ACTTAGATCAAAAAATGGAGCGCTCAAGCTGAACC
G)(配列番号11)および(TCCCGTCGACTCAGCCAGGCCC
CAGTGTGCTG)(配列番号12)を用いてPCR法により増幅した。I
C3ΔコレシストキニンCCKB受容体は、2つの重複する断片を融合すること
により調製した。断片1は5番目のTMDに隣接した22個のアミノ酸を含むア
ミノ末端コード配列を含んでおり、これはオリゴヌクレオチド(ACTTAGA
TCAAAAAATGGAGCGCTCAAGCTGAACCG)(配列番号1
1)および(CGAGGGCCAGGGACTGGCCCCGGCCGGGCC
CGGCTTTGGGTCTCG)(配列番号13)を用いてPCR法により増
幅した。断片2は6番目のTMDに隣接した22個のアミノ酸を含むカルボキシ
末端コード配列を含んでおり、これはオリゴヌクレオチド(TCCCGTCGA
CTCAGCCAGGCCCCAGTGTGCTG)(配列番号12)および(
CGAGACCCAAAGCCGGGCCCGGCCGGGGCCAGTCCC
TGGCCCTCG)(配列番号14)を用いてPCR法により増幅した。この2
つの断片を、全長CCKB受容体の5’および3’末端でオリゴヌクレオチドを
用いてPCR法により増幅させて融合させた。得られたプラスミドを、従来の酢
酸リチウム形質転換法を用い、米国特許第5,691,188号に記載のものな
ど、特にはPausch et al. (1998)に記載のMPY578fc細胞をはじめとする
GPCRアゴニスト刺激性増殖のアッセイを行うのに有用な酵母細胞中に導入し
た。
現 例1および2で示したように、哺乳類MAR、特にラットM3 MARのIC
3部分の欠失は、ヘテロ三量体Gタンパク質と結合するための完全な能力を保持
した哺乳類および酵母細胞の機能的発現の改変と相関する。このIC3Δ突然変
異がまた酵母において他のGPCRの機能的発現を改変することができるかどう
かを検討するために、ラット野生型およびIC3ΔコレシストキニンCCKB受
容体をコードするDNA配列をPCR法により増幅して、標準的な方法により、
酵母発現プラスミドp426GPD中のグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼプ
ロモーターの近位へクローン化した。野生型CCKBRは、オリゴヌクレオチド
(ACTTAGATCAAAAAATGGAGCGCTCAAGCTGAACC
G)(配列番号11)および(TCCCGTCGACTCAGCCAGGCCC
CAGTGTGCTG)(配列番号12)を用いてPCR法により増幅した。I
C3ΔコレシストキニンCCKB受容体は、2つの重複する断片を融合すること
により調製した。断片1は5番目のTMDに隣接した22個のアミノ酸を含むア
ミノ末端コード配列を含んでおり、これはオリゴヌクレオチド(ACTTAGA
TCAAAAAATGGAGCGCTCAAGCTGAACCG)(配列番号1
1)および(CGAGGGCCAGGGACTGGCCCCGGCCGGGCC
CGGCTTTGGGTCTCG)(配列番号13)を用いてPCR法により増
幅した。断片2は6番目のTMDに隣接した22個のアミノ酸を含むカルボキシ
末端コード配列を含んでおり、これはオリゴヌクレオチド(TCCCGTCGA
CTCAGCCAGGCCCCAGTGTGCTG)(配列番号12)および(
CGAGACCCAAAGCCGGGCCCGGCCGGGGCCAGTCCC
TGGCCCTCG)(配列番号14)を用いてPCR法により増幅した。この2
つの断片を、全長CCKB受容体の5’および3’末端でオリゴヌクレオチドを
用いてPCR法により増幅させて融合させた。得られたプラスミドを、従来の酢
酸リチウム形質転換法を用い、米国特許第5,691,188号に記載のものな
ど、特にはPausch et al. (1998)に記載のMPY578fc細胞をはじめとする
GPCRアゴニスト刺激性増殖のアッセイを行うのに有用な酵母細胞中に導入し
た。
【0029】 野生型およびIC3ΔコレシストキニンCCKB受容体を含む酵母株を、2m
lのグルコース(2%)を含む合成完全液体培地およびウラシル欠損(SCD−
ura)培地で一晩増殖させた。この寒天ベースのプレートアッセイでは、0.
5mM AT(3−アミノトリアゾール)を含有する、融解させた(50℃)S
CD−ura−his寒天培地(35ml、オートクレーブにかける前に濃KO
HまたはNH4OHを加えてpH6.8に調整)に、一晩培養したもの(2×1
04細胞/ml)を播種し、正方形(9×9cm)のペトリプレートに注いだ。
DMSO(1mM、10μl)中のCCKアゴニスト溶液を固化した寒天の表面
に塗布した(上部左、CCK8S;上部右、CCK8US;下部左、CCK5;
下部右、CCK4)。プレート表面に塗布した化合物は、塗布した部位から放射
状に拡散し、寒天中に包埋されている細胞表面で発現したCCKB受容体と結合
し、その結果FUS1−HIS3発現が誘導される。応答している細胞は高密度
の増殖領域を形成し、基礎的なFUS1−HIS3発現に応答して見られる限ら
れた細胞増殖とは容易に区別できる。プレートを30℃で3日間インキュベート
した(図3)。図3AはIC3ΔコレシストキニンCCKB受容体を含む酵母細
胞の強い増殖応答を示しているが、図3Bは野生型CCKB受容体を含む酵母細
胞の限られた増殖を示しているに過ぎず、このことより、CCKB受容体の第3
の細胞内ループ部分の欠失が酵母においてその機能を改変したことが示される。
lのグルコース(2%)を含む合成完全液体培地およびウラシル欠損(SCD−
ura)培地で一晩増殖させた。この寒天ベースのプレートアッセイでは、0.
5mM AT(3−アミノトリアゾール)を含有する、融解させた(50℃)S
CD−ura−his寒天培地(35ml、オートクレーブにかける前に濃KO
HまたはNH4OHを加えてpH6.8に調整)に、一晩培養したもの(2×1
04細胞/ml)を播種し、正方形(9×9cm)のペトリプレートに注いだ。
DMSO(1mM、10μl)中のCCKアゴニスト溶液を固化した寒天の表面
に塗布した(上部左、CCK8S;上部右、CCK8US;下部左、CCK5;
下部右、CCK4)。プレート表面に塗布した化合物は、塗布した部位から放射
状に拡散し、寒天中に包埋されている細胞表面で発現したCCKB受容体と結合
し、その結果FUS1−HIS3発現が誘導される。応答している細胞は高密度
の増殖領域を形成し、基礎的なFUS1−HIS3発現に応答して見られる限ら
れた細胞増殖とは容易に区別できる。プレートを30℃で3日間インキュベート
した(図3)。図3AはIC3ΔコレシストキニンCCKB受容体を含む酵母細
胞の強い増殖応答を示しているが、図3Bは野生型CCKB受容体を含む酵母細
胞の限られた増殖を示しているに過ぎず、このことより、CCKB受容体の第3
の細胞内ループ部分の欠失が酵母においてその機能を改変したことが示される。
【0030】例4 酵母における変異型ラット・ソマトスタチン受容体(SSTR)の機能的
発現 第3の細胞内ループは、Gタンパク質共役、脱感作および様々な改変タンパク
質との相互作用を含む、多くのGPCR機能に関与する。ソマトスタチン受容体
はSSTR1−5と表示される5つのサブタイプにコードされている。SSTR
3サブタイプの第3の細胞内ループ内にはいくつかのアミノ酸が認められるが、
SSTR2サブタイプの同領域には認められない。SSTR2は酵母中で有効に
機能するため、IC3からのこれらのアミノ酸の欠失がSSTR3にこの機能的
有効性を付与するものと考えられる。このように、8個のアミノ酸Gln−Tr
p−Val−Gln−Ala−Pro−Cys(配列番号15)がrSSTR3
cDNAの第3の細胞内ループから欠失しており、酵母内でより有効な受容体
シグナル伝達を可能にしている。
発現 第3の細胞内ループは、Gタンパク質共役、脱感作および様々な改変タンパク
質との相互作用を含む、多くのGPCR機能に関与する。ソマトスタチン受容体
はSSTR1−5と表示される5つのサブタイプにコードされている。SSTR
3サブタイプの第3の細胞内ループ内にはいくつかのアミノ酸が認められるが、
SSTR2サブタイプの同領域には認められない。SSTR2は酵母中で有効に
機能するため、IC3からのこれらのアミノ酸の欠失がSSTR3にこの機能的
有効性を付与するものと考えられる。このように、8個のアミノ酸Gln−Tr
p−Val−Gln−Ala−Pro−Cys(配列番号15)がrSSTR3
cDNAの第3の細胞内ループから欠失しており、酵母内でより有効な受容体
シグナル伝達を可能にしている。
【0031】 ラットSSTR3配列は、5’BgIIIおよび3’XhoI部位を含むオリゴ
ヌクレオチドを用いてPCR法により増幅した。得られた約1.3kbのPCR
産物をBgIIIおよびXhoIで消化して精製し、p426GPDのBamHI
とXhoI部位の間に挿入してプラスミドp426GPD−rSSTR3を作出
した。組換えプラスミドは制限エンドヌクレアーゼ消化およびDNA配列決定法
により確認した。
ヌクレオチドを用いてPCR法により増幅した。得られた約1.3kbのPCR
産物をBgIIIおよびXhoIで消化して精製し、p426GPDのBamHI
とXhoI部位の間に挿入してプラスミドp426GPD−rSSTR3を作出
した。組換えプラスミドは制限エンドヌクレアーゼ消化およびDNA配列決定法
により確認した。
【0032】 rSSTR3 cDNAの増幅には標準的なPCR反応を用い、以下のような
36bpの重複を有する2つのPCR断片を得た。5’BgIオリゴヌクレオチ
ド(AAAAAGATCT AAAATGGCCA CTGTTACCTA T
)(配列番号16)および3’オリゴヌクレオチド(CTCAGAGCGG C
GTCGCCGCT GACACGAGGG CGCCCG(配列番号17))
を用いて、おおよそのサイズが750bpのPCRインサートAを作出した。5
’オリゴヌクレオチドGCGCCCTCGT GTCAGCGGCG ACGC
CGCTCT GAG(配列番号18)および3’XhoIオリゴヌクレオチド
(AAAACTCGAG TTACAGATGGCTCAGTGTGC T)(
配列番号19)を用いて、おおよそのサイズが530bpのPCRインサートB
を作出した。PCR断片AおよびBをゲル精製し、アニーリングして、フランキ
ング5’BgIIIおよび3’XhoIオリゴヌクレオチドを用いてPCR法によ
り増幅し、−1.3kbのrSSTR3ΔIC3のPCR産物を得た。精し、B
gIII−XhoIで消化した後、rSST3ΔIC3インサートをp426GP
DのBamHI−XhoI部位に連結してプラスミドp426GPD−rSST
R3ΔIC3を作出した。制限マッピングおよびDNA配列決定により、適切な
読み取り枠と配列を確認した。
36bpの重複を有する2つのPCR断片を得た。5’BgIオリゴヌクレオチ
ド(AAAAAGATCT AAAATGGCCA CTGTTACCTA T
)(配列番号16)および3’オリゴヌクレオチド(CTCAGAGCGG C
GTCGCCGCT GACACGAGGG CGCCCG(配列番号17))
を用いて、おおよそのサイズが750bpのPCRインサートAを作出した。5
’オリゴヌクレオチドGCGCCCTCGT GTCAGCGGCG ACGC
CGCTCT GAG(配列番号18)および3’XhoIオリゴヌクレオチド
(AAAACTCGAG TTACAGATGGCTCAGTGTGC T)(
配列番号19)を用いて、おおよそのサイズが530bpのPCRインサートB
を作出した。PCR断片AおよびBをゲル精製し、アニーリングして、フランキ
ング5’BgIIIおよび3’XhoIオリゴヌクレオチドを用いてPCR法によ
り増幅し、−1.3kbのrSSTR3ΔIC3のPCR産物を得た。精し、B
gIII−XhoIで消化した後、rSST3ΔIC3インサートをp426GP
DのBamHI−XhoI部位に連結してプラスミドp426GPD−rSST
R3ΔIC3を作出した。制限マッピングおよびDNA配列決定により、適切な
読み取り枠と配列を確認した。
【0033】 米国特許第5,691,188号に記載の、GPCRの発現のために有用なタ
イプの酵母細胞を、標準的な方法を用いてp426GPD−rSSTR3および
p426GPD−rSSTR3ΔIC3で形質転換した。この細胞(すなわち、
Price et al. (1995)に記載のLY296細胞)を、例3に記載の寒天に基づく
バイオアッセイ法を用いてアッセイした。ソマトスタチン(S−14、1mM)
のサンプル(10μl)をSSTR3を発現する酵母細胞を含有する選択寒天培
地の表面に塗布した。このプレートを30℃で3日間インキュベートした。p4
26GPD−rSSTR3とともにpLP82で形質転換された酵母細胞(Gp
al/Gai2キメラGタンパク質発現プラスミドを含有)は、S−14に対し
て弱い増殖応答を示したが(図4A)、p426GPD−rSSTR3ΔIC3
を同条件下でアッセイした場合にはより強い応答が認められた(図4B)。これ
らの結果は、IC3部分の欠失により、酵母におけるSSTR3の機能が改変さ
れることを示す。
イプの酵母細胞を、標準的な方法を用いてp426GPD−rSSTR3および
p426GPD−rSSTR3ΔIC3で形質転換した。この細胞(すなわち、
Price et al. (1995)に記載のLY296細胞)を、例3に記載の寒天に基づく
バイオアッセイ法を用いてアッセイした。ソマトスタチン(S−14、1mM)
のサンプル(10μl)をSSTR3を発現する酵母細胞を含有する選択寒天培
地の表面に塗布した。このプレートを30℃で3日間インキュベートした。p4
26GPD−rSSTR3とともにpLP82で形質転換された酵母細胞(Gp
al/Gai2キメラGタンパク質発現プラスミドを含有)は、S−14に対し
て弱い増殖応答を示したが(図4A)、p426GPD−rSSTR3ΔIC3
を同条件下でアッセイした場合にはより強い応答が認められた(図4B)。これ
らの結果は、IC3部分の欠失により、酵母におけるSSTR3の機能が改変さ
れることを示す。
【0034】例5 IC3欠失ヒトα2Aアドレナリン作動性受容体 例1〜4で示したように、哺乳類GPCRのIC3部分の欠失は、ヘテロ三量
体Gタンパク質との結合に関して十分な能力を保持した哺乳類および酵母細胞に
おける改変型の機能的発現と相関している。変異型MAR、CCKBR、および
SSTR3は全外部ループを保持している。IC3以外のトランスメンブランド
メインおよび内部ドメインは変化していない。膜にまたがるらせんの5番目と6
番目の間に見出されるIC3が、改変された唯一のドメインである。5番目と6
番目のトランスメンブランらせんの双方に隣接する22個のアミノ酸だけを残し
て、このドメインの大部分が欠失していた。このように、IC3欠失(IC3Δ
)を含むGPCRのIC3は44個のアミノ酸長である。機能的発現の改変は、
細胞脱感作機構と相互作用することが知られているドメインが除去されて、より
機能的なMARが細胞表面に保持されることによるものであろう。 他のIC3Δ変異も酵母における他のGPCRの機能的発現を改変するかどう
かを検討するために、IC3Δヒトα2Aアドレナリン作動性受容体をコードす
るDNA配列をPCR法により増幅して、標準的な方法により、酵母発現プラス
ミドp426GPDのグリセロール−リン酸ジヒドロゲナーゼプロモーターの近
位にクローン化した。このIC3Δヒトα2Aアドレナリン作動性受容体は、2
つの重複する断片を融合させることにより作出した。断片1は5番目のTMDに
隣接する39個のアミノ酸を含むアミノ末端コード配列を含んでおり、これはオ
リゴヌクレオチド(GGCCAGGATCCAAAAATGGGCTCCCTG
CAGCCGGACGC)(配列番号20)および(CGGGCCCCGCGG
GCGCTCGGGGCCCAGACCGTTGGGC)(配列番号21)を用
いてPCR法により増幅した。第2の断片は6番目のTMDに隣接した41個の
アミノ酸を含むカルボキシ末端コード配列を含んでおり、これはオリゴヌクレオ
チド(CGGGCGACAGCCTGCCGCGGC)(配列番号22)および
(AGCGGTCGACTCACACGATCCGCTTCCTGTCCCC)
(配列番号23)を用いてPCR法により増幅した。この2つの断片を、全長α
2Aアドレナリン作動性受容体の5’および3’末端でオリゴヌクレオチドを用
いてPCR法により増幅させて融合させた。得られたプラスミドを、従来の酢酸
リチウム形質転換法を用い、米国特許第5,691,188号に記載のものなど
、特にはPausch et al. (1998)に記載のMPY578fc細胞をはじめとするG
PCRアゴニスト−刺激性増殖のアッセイを行うのに有用な酵母細胞に導入した
。
体Gタンパク質との結合に関して十分な能力を保持した哺乳類および酵母細胞に
おける改変型の機能的発現と相関している。変異型MAR、CCKBR、および
SSTR3は全外部ループを保持している。IC3以外のトランスメンブランド
メインおよび内部ドメインは変化していない。膜にまたがるらせんの5番目と6
番目の間に見出されるIC3が、改変された唯一のドメインである。5番目と6
番目のトランスメンブランらせんの双方に隣接する22個のアミノ酸だけを残し
て、このドメインの大部分が欠失していた。このように、IC3欠失(IC3Δ
)を含むGPCRのIC3は44個のアミノ酸長である。機能的発現の改変は、
細胞脱感作機構と相互作用することが知られているドメインが除去されて、より
機能的なMARが細胞表面に保持されることによるものであろう。 他のIC3Δ変異も酵母における他のGPCRの機能的発現を改変するかどう
かを検討するために、IC3Δヒトα2Aアドレナリン作動性受容体をコードす
るDNA配列をPCR法により増幅して、標準的な方法により、酵母発現プラス
ミドp426GPDのグリセロール−リン酸ジヒドロゲナーゼプロモーターの近
位にクローン化した。このIC3Δヒトα2Aアドレナリン作動性受容体は、2
つの重複する断片を融合させることにより作出した。断片1は5番目のTMDに
隣接する39個のアミノ酸を含むアミノ末端コード配列を含んでおり、これはオ
リゴヌクレオチド(GGCCAGGATCCAAAAATGGGCTCCCTG
CAGCCGGACGC)(配列番号20)および(CGGGCCCCGCGG
GCGCTCGGGGCCCAGACCGTTGGGC)(配列番号21)を用
いてPCR法により増幅した。第2の断片は6番目のTMDに隣接した41個の
アミノ酸を含むカルボキシ末端コード配列を含んでおり、これはオリゴヌクレオ
チド(CGGGCGACAGCCTGCCGCGGC)(配列番号22)および
(AGCGGTCGACTCACACGATCCGCTTCCTGTCCCC)
(配列番号23)を用いてPCR法により増幅した。この2つの断片を、全長α
2Aアドレナリン作動性受容体の5’および3’末端でオリゴヌクレオチドを用
いてPCR法により増幅させて融合させた。得られたプラスミドを、従来の酢酸
リチウム形質転換法を用い、米国特許第5,691,188号に記載のものなど
、特にはPausch et al. (1998)に記載のMPY578fc細胞をはじめとするG
PCRアゴニスト−刺激性増殖のアッセイを行うのに有用な酵母細胞に導入した
。
【0035】 野生型IC3Δヒトα2Aアドレナリン作動性受容体を含む酵母細胞を、液体
培養液中で、αアドレナリン作動性完全アゴニストUK14304(RB1)お
よび部分アゴニストであるクロリジンを用いてアッセイした。この細胞を2ml
のSC−グルコース−ura培地中で一晩培養した。細胞をSC−グルコース−
ura−his培地pH6.8で500倍に希釈した。この細胞を、基礎増殖速
度を低下させるための5mMの3−アミノトリアゾールを含有するSC−グルコ
ース−ura−his培地pH6.8で500倍希釈した。細胞懸濁液サンプル
(180μl)を、アドレナリン作動性受容体アゴニストUK14304の連続
希釈サンプル(10−3〜10−10M)20μlを含有する滅菌96ウェルマ
イクロタイターディッシュのウェルに分注した。このプレートを30℃で18時
間、振盪しつつ(600rpm)インキュベートした。増殖はマイクロプレート
リーダーを用いて、OD620における記録値の増大によりモニターした。アッ
セイは2回行い、増殖速度測定値は酵母細胞増殖の対数増殖期に得た。光学的密
度の測定値をGraphPad Prismを用いて解析し、平均±標準誤差として表し、アゴ
ニスト濃度に対してプロットした。
培養液中で、αアドレナリン作動性完全アゴニストUK14304(RB1)お
よび部分アゴニストであるクロリジンを用いてアッセイした。この細胞を2ml
のSC−グルコース−ura培地中で一晩培養した。細胞をSC−グルコース−
ura−his培地pH6.8で500倍に希釈した。この細胞を、基礎増殖速
度を低下させるための5mMの3−アミノトリアゾールを含有するSC−グルコ
ース−ura−his培地pH6.8で500倍希釈した。細胞懸濁液サンプル
(180μl)を、アドレナリン作動性受容体アゴニストUK14304の連続
希釈サンプル(10−3〜10−10M)20μlを含有する滅菌96ウェルマ
イクロタイターディッシュのウェルに分注した。このプレートを30℃で18時
間、振盪しつつ(600rpm)インキュベートした。増殖はマイクロプレート
リーダーを用いて、OD620における記録値の増大によりモニターした。アッ
セイは2回行い、増殖速度測定値は酵母細胞増殖の対数増殖期に得た。光学的密
度の測定値をGraphPad Prismを用いて解析し、平均±標準誤差として表し、アゴ
ニスト濃度に対してプロットした。
【0036】 野生型IC3Δヒトα2Aアドレナリン作動性受容体を含む酵母細胞は、用量
依存性の増殖応答を示し、このことよりこのIC3欠失が機能していることが示
された(図5)。
依存性の増殖応答を示し、このことよりこのIC3欠失が機能していることが示
された(図5)。
【0037】例6 ラット・ニューロテンシンNT1受容体の末端切断はアゴニスト感受性を
増強させる 例1〜4において、第3の細胞内ループの改変により、酵母において発現した
種々の異種GPCRの機能的発現が向上した。アゴニスト誘導性のGPCRの脱
感作もまた、部分的には、細胞内カルボキシ末端テールのような第3の細胞内ル
ープ以外のGPCR内部ドメインにより媒介されている。
増強させる 例1〜4において、第3の細胞内ループの改変により、酵母において発現した
種々の異種GPCRの機能的発現が向上した。アゴニスト誘導性のGPCRの脱
感作もまた、部分的には、細胞内カルボキシ末端テールのような第3の細胞内ル
ープ以外のGPCR内部ドメインにより媒介されている。
【0038】 GPCRからのカルボキシ末端ドメインの除去により、酵母および哺乳類細胞
における機能的発現が向上することが示されている。α−接合型酵母細胞に発現
したGタンパク質共役α接合フェロモン受容体のカルボキシ末端テールの末端切
断は、接合フェロモンの存在に対する過敏性を引き起こす(Reneke et al. (198
8); Konopka et al.(1988))。これらの知見と一致して、そのカルボキシ末端テ
ールを欠く変異型ラット・ニューロテンシンNT1受容体(rNTR1)は、哺
乳類細胞において発現した場合に、アゴニスト誘導性のインターナリゼーション
に対し耐性を有する(Hermans et al. (1996))。
における機能的発現が向上することが示されている。α−接合型酵母細胞に発現
したGタンパク質共役α接合フェロモン受容体のカルボキシ末端テールの末端切
断は、接合フェロモンの存在に対する過敏性を引き起こす(Reneke et al. (198
8); Konopka et al.(1988))。これらの知見と一致して、そのカルボキシ末端テ
ールを欠く変異型ラット・ニューロテンシンNT1受容体(rNTR1)は、哺
乳類細胞において発現した場合に、アゴニスト誘導性のインターナリゼーション
に対し耐性を有する(Hermans et al. (1996))。
【0039】 カルボキシ末端の末端切断が酵母において発現した異種GPCRの機能的応答
を改変するかどうか検討するために、カルボキシ末端テールを構成する52個の
アミノ酸を欠失させて、受容体を372アミノ酸長に縮めることによりラットN
TR1を改変した。野生型および末端切断型ニューロテンシン受容体(rNTR
1C−termΔ)のコード配列を、共通アミノ末端コード配列を指定する5’
オリゴヌクレオチドプライマー(AGTCAGATCTAAGCTT AAAA
ATG CAC CTC AAC AGC TCC)(配列番号24)および
野生型を定義する分離型オリゴヌクレオチド(AGTC AGATCT CTA
GTA CAG GGTCTCCC)(配列番号25)、および末端切断型カ
ルボキシ末端(AGAG AGATCT TTAGCGCCACCCAGGAC
AAAGGC)(配列番号26)を用いてPCR法により増幅した。標準的な方
法により、これらの断片を酵母発現ベクターpPGK中のPGKプロモーターの
近位にクローン化した(Y-S. Kang et al. (1990))。得られたプラスミドを、
従来の酢酸リチウム形質転換法を用て、特にはPausch et al. (1998)に記載のM
PY578fc細胞をはじめとする、GPCRアゴニスト刺激性増殖のアッセイ
を行うのに有用な米国特許第5,691,188号に記載の種類の酵母細胞中に
導入した。
を改変するかどうか検討するために、カルボキシ末端テールを構成する52個の
アミノ酸を欠失させて、受容体を372アミノ酸長に縮めることによりラットN
TR1を改変した。野生型および末端切断型ニューロテンシン受容体(rNTR
1C−termΔ)のコード配列を、共通アミノ末端コード配列を指定する5’
オリゴヌクレオチドプライマー(AGTCAGATCTAAGCTT AAAA
ATG CAC CTC AAC AGC TCC)(配列番号24)および
野生型を定義する分離型オリゴヌクレオチド(AGTC AGATCT CTA
GTA CAG GGTCTCCC)(配列番号25)、および末端切断型カ
ルボキシ末端(AGAG AGATCT TTAGCGCCACCCAGGAC
AAAGGC)(配列番号26)を用いてPCR法により増幅した。標準的な方
法により、これらの断片を酵母発現ベクターpPGK中のPGKプロモーターの
近位にクローン化した(Y-S. Kang et al. (1990))。得られたプラスミドを、
従来の酢酸リチウム形質転換法を用て、特にはPausch et al. (1998)に記載のM
PY578fc細胞をはじめとする、GPCRアゴニスト刺激性増殖のアッセイ
を行うのに有用な米国特許第5,691,188号に記載の種類の酵母細胞中に
導入した。
【0040】 NT受容体アゴニストであるアセチルニューロテンシン8−13(AcNt8
−13)を用いて、NTR1を含む酵母細胞を液体培養液中でアッセイした。こ
の細胞を2mlのSC−グルコース−ura培地中で一晩培養した。細胞を基礎
増殖速度を低下させるための2mMの3−アミノトリアゾールを含有するSC−
グルコース−ura−his培地(pH6.8)で500倍希釈した。細胞懸濁
液サンプル(180μl)を、AcNT8−13の連続希釈サンプル(10−3 〜10−10M)20μlを含有する滅菌96ウェルマイクロタイターディッシ
ュのウェルに分注した。このプレートを30℃で18時間、振盪しつつ(600
rpm)インキュベートした。増殖はマイクロプレートリーダーを用いて、OD 620 における記録値の増大によりモニターした。増殖速度測定値は酵母細胞増
殖の対数増殖期に得た。光学的密度の測定値をGraphPad Prismを用いて解析し、
平均±標準誤差として表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。図6に示さ
れたように、NTR1を含む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を引き起こ
し、このことは野生型およびカルボキシ末端における末端切断型NTR1の双方
が機能していることを示している。rNTR1 C−termΔを含む細胞の増
殖応答は用量依存的であり、AcNT8−13のEC50は520nMに相当し
た。この値は野生型NTR1を発現している細胞において観察された値(2.1
μM)の5分の1であった。カルボキシ末端の欠失により、より低い濃度のNT
Rアゴニストに応答するrNTR1が産生され、酵母バイオアッセイの感受性が
向上した。
−13)を用いて、NTR1を含む酵母細胞を液体培養液中でアッセイした。こ
の細胞を2mlのSC−グルコース−ura培地中で一晩培養した。細胞を基礎
増殖速度を低下させるための2mMの3−アミノトリアゾールを含有するSC−
グルコース−ura−his培地(pH6.8)で500倍希釈した。細胞懸濁
液サンプル(180μl)を、AcNT8−13の連続希釈サンプル(10−3 〜10−10M)20μlを含有する滅菌96ウェルマイクロタイターディッシ
ュのウェルに分注した。このプレートを30℃で18時間、振盪しつつ(600
rpm)インキュベートした。増殖はマイクロプレートリーダーを用いて、OD 620 における記録値の増大によりモニターした。増殖速度測定値は酵母細胞増
殖の対数増殖期に得た。光学的密度の測定値をGraphPad Prismを用いて解析し、
平均±標準誤差として表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。図6に示さ
れたように、NTR1を含む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を引き起こ
し、このことは野生型およびカルボキシ末端における末端切断型NTR1の双方
が機能していることを示している。rNTR1 C−termΔを含む細胞の増
殖応答は用量依存的であり、AcNT8−13のEC50は520nMに相当し
た。この値は野生型NTR1を発現している細胞において観察された値(2.1
μM)の5分の1であった。カルボキシ末端の欠失により、より低い濃度のNT
Rアゴニストに応答するrNTR1が産生され、酵母バイオアッセイの感受性が
向上した。
【0041】 このように、ラットNTR1のカルボキシ末端の細胞内ドメイン部分の欠失が
、酵母において発現した場合にアゴニスト感受性が増強される機能的GPCRが
産生されたが、このことはこの内部ドメインの改変が、酵母において発現した異
種GPCRの機能改変のために一般化できる方法であることを示唆するものであ
る。
、酵母において発現した場合にアゴニスト感受性が増強される機能的GPCRが
産生されたが、このことはこの内部ドメインの改変が、酵母において発現した異
種GPCRの機能改変のために一般化できる方法であることを示唆するものであ
る。
【0042】例7 酵母における変異型C.エレガンス(C. elegans)セロトニン受容体の機
能的発現 Gタンパク質共役C.エレガンスセロトニン受容体(Ce 5HTR)のアゴ
ニストは、本質的な殺線虫力を有しているものと考えられる。これらの知見から
、Ce 5HTRにおいて有効なアゴニストに関する、酵母に基づくHTSの開
発は新規な作用様式の殺線虫剤に発展する可能性のあるリード化合物の同定に有
用であり得る。予備実験から、野生型のCe 5HTRは酵母中では機能しない
ことが示されている。従って、Ce 5HTR IC3をM3 MAR IC3
Δ由来の機能性IC3と置換することで、酵母におけるCe 5HTRの機能を
改変する方法を開発する努力が始められた。
能的発現 Gタンパク質共役C.エレガンスセロトニン受容体(Ce 5HTR)のアゴ
ニストは、本質的な殺線虫力を有しているものと考えられる。これらの知見から
、Ce 5HTRにおいて有効なアゴニストに関する、酵母に基づくHTSの開
発は新規な作用様式の殺線虫剤に発展する可能性のあるリード化合物の同定に有
用であり得る。予備実験から、野生型のCe 5HTRは酵母中では機能しない
ことが示されている。従って、Ce 5HTR IC3をM3 MAR IC3
Δ由来の機能性IC3と置換することで、酵母におけるCe 5HTRの機能を
改変する方法を開発する努力が始められた。
【0043】 IC3置換体を構築するために、標準的な方法により3つのドメインをコード
するPCR断片を調製した。断片1は5番目のTMDの細胞内インターフェイス
に対してCe 5HTRのアミノ末端コード部分を含み、オリゴヌクレオチド(
AAAAGATCTAAAATGATCGACGAGACGCTTC)(配列番
号27)および(CCGCTTGGTGATCTGACTTCTGGTTTCT
GTCCCAGAGGCC TGTAGGCCAG CCAGCTCTTTGG
TACGCTTCTCAGTTTCCTTATAGATCTTCCAGTACA
CGCAAATTATTGC)(配列番号28)を用いてPCR法により増幅し
た。Ce 5HTRの第2番目の断片は、6番目のTMDの細胞内インターフェ
ースの近位から開始するカルボキシ末端コード配列を含み、オリゴヌクレオチド
(AAAACTCGAGTCAATAATCGTGAATAAGGCA)(配列
番号29)および(GGCCTACAGGCCTCTGGGACAGAAACC
AGAAGTCAGATCACCAAGCGGAAGAGGATGTCGCTC
ATCAAGGAGAAGAAGGCCGCCAGAACGCTAGCAATT
ATTACAGGTAC)(配列番号30)を用いてPCR法により増幅した。
M3 MAR IC3Δドメインは例1の記載に従ってPCR法により増幅した
。
するPCR断片を調製した。断片1は5番目のTMDの細胞内インターフェイス
に対してCe 5HTRのアミノ末端コード部分を含み、オリゴヌクレオチド(
AAAAGATCTAAAATGATCGACGAGACGCTTC)(配列番
号27)および(CCGCTTGGTGATCTGACTTCTGGTTTCT
GTCCCAGAGGCC TGTAGGCCAG CCAGCTCTTTGG
TACGCTTCTCAGTTTCCTTATAGATCTTCCAGTACA
CGCAAATTATTGC)(配列番号28)を用いてPCR法により増幅し
た。Ce 5HTRの第2番目の断片は、6番目のTMDの細胞内インターフェ
ースの近位から開始するカルボキシ末端コード配列を含み、オリゴヌクレオチド
(AAAACTCGAGTCAATAATCGTGAATAAGGCA)(配列
番号29)および(GGCCTACAGGCCTCTGGGACAGAAACC
AGAAGTCAGATCACCAAGCGGAAGAGGATGTCGCTC
ATCAAGGAGAAGAAGGCCGCCAGAACGCTAGCAATT
ATTACAGGTAC)(配列番号30)を用いてPCR法により増幅した。
M3 MAR IC3Δドメインは例1の記載に従ってPCR法により増幅した
。
【0044】 これらの断片を単離、混合して、5’(AAAAGATCTAAAATGAT
CGACGAGACGCTTC)(配列番号27)および3’(AAAACTC
GAGTCAATAATCGTGAATAAGGCA)(配列番号29)オリゴ
ヌクレオチドを用いてPCR法により増幅した。得られた断片を適当な制限エン
ドヌクレアーゼで消化し、p426GPDに組み込んで変異型Ce 5HTRを
GPDプロモーターの制御下に置いた。得られたプラスミドを、従来の酢酸リチ
ウム形質転換法を用いて、米国特許第5,691,188号に記載のものなど、
特にPausch et al. (1998)に記載のMPY578fc細胞をはじめとする、GP
CRアゴニスト刺激性増殖のアッセイを行うために有用な酵母細胞中に導入した
。
CGACGAGACGCTTC)(配列番号27)および3’(AAAACTC
GAGTCAATAATCGTGAATAAGGCA)(配列番号29)オリゴ
ヌクレオチドを用いてPCR法により増幅した。得られた断片を適当な制限エン
ドヌクレアーゼで消化し、p426GPDに組み込んで変異型Ce 5HTRを
GPDプロモーターの制御下に置いた。得られたプラスミドを、従来の酢酸リチ
ウム形質転換法を用いて、米国特許第5,691,188号に記載のものなど、
特にPausch et al. (1998)に記載のMPY578fc細胞をはじめとする、GP
CRアゴニスト刺激性増殖のアッセイを行うために有用な酵母細胞中に導入した
。
【0045】 Ce 5HTRを含む酵母細胞を、液体培養液中でアッセイした。細胞を2m
lのSC−グルコース−ura培地中で一晩培養した。この細胞を基礎増殖速度
を低下させるための2mMの3−アミノトリアゾールを含有するSC−グルコー
ス−ura−his培地(pH6.8)で500倍希釈した。細胞懸濁液サンプ
ル(200μl)を、セロトニン(5HT)の連続希釈サンプル(10−2〜1
0−9M)2.0μlを含有する滅菌96ウェルマイクロタイターディッシュの
ウェルに分注した。同様の反応において、セロトニン作動性アンタゴニストであ
るリスリドおよびミアンセリンを各ウェルあたり10μM加えた。このプレート
を30℃で18時間、振盪しつつ(600rpm)インキュベートした。増殖は
マイクロプレートリーダーを用いて、OD620における記録値の増大によりモ
ニターした。アッセイは2回行い、増殖速度測定値は酵母細胞増殖の対数増殖期
に得た。光学的密度の測定値をGraphPad Prismを用いて解析し、平均±標準誤差
として表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。Cheng and Pruesoff(Y. Ch
eng et al. (1973))の方程式を用いてKi値を求めた。図7に示されるように、
M3 MAR IC3Δを含む突然変異Ce 5HTRを含む酵母細胞は、アゴ
ニスト依存性の増殖応答を示したが、このことはCe 5HTRは酵母中で発現
した場合、予想された薬理学的特性を表すことを示している。
lのSC−グルコース−ura培地中で一晩培養した。この細胞を基礎増殖速度
を低下させるための2mMの3−アミノトリアゾールを含有するSC−グルコー
ス−ura−his培地(pH6.8)で500倍希釈した。細胞懸濁液サンプ
ル(200μl)を、セロトニン(5HT)の連続希釈サンプル(10−2〜1
0−9M)2.0μlを含有する滅菌96ウェルマイクロタイターディッシュの
ウェルに分注した。同様の反応において、セロトニン作動性アンタゴニストであ
るリスリドおよびミアンセリンを各ウェルあたり10μM加えた。このプレート
を30℃で18時間、振盪しつつ(600rpm)インキュベートした。増殖は
マイクロプレートリーダーを用いて、OD620における記録値の増大によりモ
ニターした。アッセイは2回行い、増殖速度測定値は酵母細胞増殖の対数増殖期
に得た。光学的密度の測定値をGraphPad Prismを用いて解析し、平均±標準誤差
として表し、アゴニスト濃度に対してプロットした。Cheng and Pruesoff(Y. Ch
eng et al. (1973))の方程式を用いてKi値を求めた。図7に示されるように、
M3 MAR IC3Δを含む突然変異Ce 5HTRを含む酵母細胞は、アゴ
ニスト依存性の増殖応答を示したが、このことはCe 5HTRは酵母中で発現
した場合、予想された薬理学的特性を表すことを示している。
【0046】 このように、ラットM3 MAR由来の機能的に欠失したIC3を有するCe
5HTRのIC3の置換により、酵母中で発現した場合に機能的キメラGPC
Rが産生されたが、このことは内部ドメインを置換するこの方法が、酵母アッセ
イのような細胞に基づくアッセイにおいて異種GPCRの機能的発現の改変のた
めに一般化できる方法であり得ることを示唆するものである。
5HTRのIC3の置換により、酵母中で発現した場合に機能的キメラGPC
Rが産生されたが、このことは内部ドメインを置換するこの方法が、酵母アッセ
イのような細胞に基づくアッセイにおいて異種GPCRの機能的発現の改変のた
めに一般化できる方法であり得ることを示唆するものである。
【0047】 本発明の他の態様は、本明細書に開示された本発明の明細書および実施を考慮
すれば当業者には明らかとなろう。明細書および実施例は以下の請求項により示
される本発明の真の範囲および精神の範囲内で単に例示としてみなすものとする
。 本明細書で引用された参照文献は、参照することによりそのまま本明細書の一
部とする。
すれば当業者には明らかとなろう。明細書および実施例は以下の請求項により示
される本発明の真の範囲および精神の範囲内で単に例示としてみなすものとする
。 本明細書で引用された参照文献は、参照することによりそのまま本明細書の一
部とする。
【0048】 参考文献
【表1】
【表2】
【図1A】 MARアゴニスト、カルバコール(CCh)を用いた、ラットM3ムスカリン
様アセチルコリン受容体(MAR)を含む酵母細胞に対する液体培養アッセイの
結果を示す。第3の細胞内ループ(IC3Δ)に欠失のあるM3MARを含む酵
母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を示したが、他方、野生型MARはそうで
はなく、このことはM3MARIC3Δは機能的なGPCRであるということを
示すものである。
様アセチルコリン受容体(MAR)を含む酵母細胞に対する液体培養アッセイの
結果を示す。第3の細胞内ループ(IC3Δ)に欠失のあるM3MARを含む酵
母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を示したが、他方、野生型MARはそうで
はなく、このことはM3MARIC3Δは機能的なGPCRであるということを
示すものである。
【図1B】 MARアゴニスト、カルバコール(CCh)を用いた、ラットM3MARIC
3ΔおよびFUS2−GFP受容体プラスミドを含む酵母細胞に対する液体培養
蛍光誘導アッセイの結果を示す。酵母において発現したM3MARIC3ΔのC
Ch活性化に応答して緑色蛍光タンパク質の発現の用量依存性増大が認められる
。
3ΔおよびFUS2−GFP受容体プラスミドを含む酵母細胞に対する液体培養
蛍光誘導アッセイの結果を示す。酵母において発現したM3MARIC3ΔのC
Ch活性化に応答して緑色蛍光タンパク質の発現の用量依存性増大が認められる
。
【図2】 MARアゴニスト、カルバコール(CCh)を用いた、キイロショウジョウバ
エ・ムスカリン様アセチルコリン受容体を含む酵母細胞に対する液体培養アッセ
イの結果を示す。M3MARIC3Δを含む変異型キイロショウジョウバエMA
Rを含む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を示したが、他方、野生型キイ
ロショウジョウバエMARではアゴニスト依存性の酵母細胞増殖応答はなかった
。
エ・ムスカリン様アセチルコリン受容体を含む酵母細胞に対する液体培養アッセ
イの結果を示す。M3MARIC3Δを含む変異型キイロショウジョウバエMA
Rを含む酵母細胞はアゴニスト依存性の増殖応答を示したが、他方、野生型キイ
ロショウジョウバエMARではアゴニスト依存性の酵母細胞増殖応答はなかった
。
【図3A】 寒天ベースプレートバイオアッセイの結果を示す。 IC3ΔコレシストキニンCCKB受容体を含む酵母細胞の強い増殖応答を示
す。
す。
【図3B】 寒天ベースプレートバイオアッセイの結果を示す。 野生型CCKB受容体を含む酵母細胞による増殖は限定されたものでしかなく
、このことは酵母においてはCCKB受容体の第3の細胞内ループの一部の欠失
がその機能を改変するということを示すものである。
、このことは酵母においてはCCKB受容体の第3の細胞内ループの一部の欠失
がその機能を改変するということを示すものである。
【図4A】 rSSTR3およびrSSTR3ΔIC3で形質転換された酵母細胞を示す。 p426GPD−rSSTR3を含む酵母細胞はソマトスタチン(S−14)
に対して弱い応答しか示さないことを証明するものである。
に対して弱い応答しか示さないことを証明するものである。
【図4B】 rSSTR3およびrSSTR3ΔIC3で形質転換された酵母細胞を示す。 同様の条件下でアッセイされたp426GPD−rSSTR3ΔIC3を含む
酵母細胞によるずっと強い応答を証明するものである。
酵母細胞によるずっと強い応答を証明するものである。
【図5】 αアドレナリン作動性受容体完全アゴニストUK14304を用いた、野生型
IC3Δヒトα2Aアドレナリン作動性受容体を含む酵母細胞に対する液体培養
アッセイの結果を示す。野生型およびIC3Δヒトα2Aアドレナリン作動性受
容体を含む酵母細胞は用量依存性の増殖応答を示し、このことはIC3の欠失が
機能的であるということを示すものである。
IC3Δヒトα2Aアドレナリン作動性受容体を含む酵母細胞に対する液体培養
アッセイの結果を示す。野生型およびIC3Δヒトα2Aアドレナリン作動性受
容体を含む酵母細胞は用量依存性の増殖応答を示し、このことはIC3の欠失が
機能的であるということを示すものである。
【図6】 ニューロテンシン受容体アゴニストであるAcNT8−13を用いた、野生型
およびカルボキシ末端切断型のラットNT1−ニューロテンシン受容体を含む酵
母細胞に対する液体培養アッセイの結果を示す。ラットNT1−ニューロテンシ
ン受容体の末端切断物は野生型受容体で認められるものよりもより感度の高いア
ゴニスト依存性の増殖応答をもたらす。
およびカルボキシ末端切断型のラットNT1−ニューロテンシン受容体を含む酵
母細胞に対する液体培養アッセイの結果を示す。ラットNT1−ニューロテンシ
ン受容体の末端切断物は野生型受容体で認められるものよりもより感度の高いア
ゴニスト依存性の増殖応答をもたらす。
【図7】 酵母細胞増殖を刺激するためにセロトニン(5HT)を用いた、C.エレガン
ス(C.elebans)セロトニン受容体を含む酵母細胞に対する液体培養アッセイの結
果を示す。M3MARIC3Δを含む変異型C.エレガンス・セロトニン受容体
を含む酵母細胞は5HT依存性の増殖応答を示した。この増殖応答はセロトニン
受容体アンタゴニストであるリスリドおよびミアンセリンの添加によって妨げら
れた。
ス(C.elebans)セロトニン受容体を含む酵母細胞に対する液体培養アッセイの結
果を示す。M3MARIC3Δを含む変異型C.エレガンス・セロトニン受容体
を含む酵母細胞は5HT依存性の増殖応答を示した。この増殖応答はセロトニン
受容体アンタゴニストであるリスリドおよびミアンセリンの添加によって妨げら
れた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 33/50 G01N 33/566 33/566 33/68 33/68 (C12N 1/19 //(C12N 1/19 C12R 1:865) C12R 1:865) C12N 15/00 ZNAA (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CR, CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI,G B,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL ,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ, LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,M G,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT ,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL, TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,V N,YU,ZA,ZW (72)発明者 ユルゲン、ウェス アメリカ合衆国メリーランド州、ベセス ダ、ロックビル、パイク、9000、ルーム、 ビー1エイ‐05、ビルディング、8エイ、 エヌアイエイチ‐エヌアイディーディーケ イ、ラボラトリー、オブ、バイオオーガニ ック、ケミストリー内 Fターム(参考) 2G045 AA40 BB20 CB21 DA36 DA77 FB02 FB07 FB12 GC30 4B024 AA01 AA11 BA63 CA01 DA12 EA04 FA02 FA10 GA11 GA19 4B063 QA01 QA18 QQ61 QR33 QR60 QR76 QR80 QS05 QS36 QX02 4B065 AA80X AA86Y AA90Y AA91Y AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA30 CA20 CA40 CA51 DA50 EA50 FA74
Claims (37)
- 【請求項1】 改変型のGタンパク質共役受容体(GPCR)をコードする配列を有する単離
された核酸配列であって、その改変がGタンパク質共役受容体の細胞内ドメイン
に突然変異を含み、細胞に基づくアッセイにおける機能的応答の改変をもたらし
、かつ、改変型Gタンパク質共役受容体がムスカリン様アセチルコリン受容体、
コレシストキニンCCKB受容体、ソマトスタチン受容体、α2Aアドレナリン
作動性受容体、およびセロトニン受容体からなる群から選択される、核酸配列。 - 【請求項2】 改変がアゴニスト刺激性増殖を促進し、このアゴニストがGタンパク質共役受
容体アゴニストである、請求項1に記載の核酸配列。 - 【請求項3】 改変が受容体とヘテロ三量体Gタンパク質の間の結合の改変をもたらすか、ま
たは受容体が細胞脱感作もしくは隔離−インターナリゼーション機構と相互作用
できないようにするか、または適切な原形質膜局在化をもたらす、請求項2に記
載の核酸。 - 【請求項4】 突然変異が欠失である、請求項1に記載の核酸。
- 【請求項5】 欠失が点突然変異である、請求項4に記載の核酸。
- 【請求項6】 欠失がGタンパク質共役受容体の第3の細胞内ループに存在する、請求項4に
記載の核酸。 - 【請求項7】 Gタンパク質共役受容体がムスカリン様アセチルコリン受容体、コレシストキ
ニンCCKB受容体、およびα2Aアドレナリン作動性受容体からなる群から選
択される、請求項6に記載の核酸。 - 【請求項8】 セロトニン受容体がCe 5HTRである、請求項1に記載の核酸配列。
- 【請求項9】 ムスカリン様アセチルコリン受容体がラットM3ムスカリン様アセチルコリン
受容体またはD.メラノガスタームスカリン様アセチルコリン受容体である、請
求項1に記載の核酸配列。 - 【請求項10】 コレシストキニンCCKB受容体がラット・コレシストキニンCCKB受容体
である、請求項1に記載の核酸配列。 - 【請求項11】 ソマトスタチン受容体がラット・ソマトスタチン受容体サブタイプ3である、
請求項1に記載の核酸配列。 - 【請求項12】 α2Aアドレナリン作動性受容体がヒトα2Aアドレナリン作動性受容体であ
る、請求項1に記載の核酸配列。 - 【請求項13】 請求項1に記載の核酸配列によりコードされている、改変型Gタンパク質共役
受容体。 - 【請求項14】 欠失した第3の細胞内ループが44個のアミノ酸長である、請求項13に記載
のGタンパク質共役受容体。 - 【請求項15】 請求項10に記載の核酸配列によってコードされており、配列Gln−Trp
−Val−Gln−Ala−Pro−Ala−Cys(配列番号15)がその変
異型Gタンパク質共役受容体の第3の細胞内ループから欠失している、変異型G
タンパク質共役受容体。 - 【請求項16】 キメラGタンパク質共役受容体をコードする配列を有する単離核酸であって、
そのキメラGタンパク質共役受容体が細胞に基づくアッセイにおいてキメラGタ
ンパク質共役受容体に機能的応答の改変を付与するGタンパク質共役受容体の改
変型の細胞内ドメインを含んでなる、核酸。 - 【請求項17】 改変型細胞内ドメインが第3の細胞内ループである、請求項16に記載の核酸
。 - 【請求項18】 請求項1または16に記載の核酸配列を含んでなる、ベクター。
- 【請求項19】 請求項8に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。
- 【請求項20】 誘導性受容体遺伝子を含むプラスミドをさらに含んでなる、請求項19に記載
の宿主細胞。 - 【請求項21】 真核細胞である、請求項19に記載の宿主細胞。
- 【請求項22】 真核細胞が酵母細胞である、請求項21に記載の宿主細胞。
- 【請求項23】 誘導性受容体遺伝子を含むプラスミドをさらに含んでなる、請求項22に記載
の宿主細胞。 - 【請求項24】 受容体遺伝子が緑色蛍光タンパク質である、請求項23に記載の宿主細胞。
- 【請求項25】 緑色蛍光タンパク質が機能し得る形でFUS2プロモーターに連結されている
、請求項24に記載の宿主細胞。 - 【請求項26】 Gタンパク質共役受容体と結合し得る化合物をスクリーニングする方法であっ
て、 (a)請求項19に記載の宿主細胞を試験化合物に曝し、さらに (b)細胞増殖に対する試験化合物の作用を測定する ことを含んでなる、方法。 - 【請求項27】 異種Gタンパク質共役受容体を含んでなる宿主細胞であって、そのGタンパク
質共役受容体が細胞に基づくアッセイにおいてGタンパク質共役受容体の機能的
応答の改変をもたらす改変を有する、宿主細胞。 - 【請求項28】 改変がアゴニスト刺激性増殖を促進し、そのアゴニストがGタンパク質共役受
容体アゴニストである、請求項27に記載の宿主細胞。 - 【請求項29】 改変が受容体とヘテロ三量体Gタンパク質の間の結合の改変をもたらすか、ま
たは受容体が細胞脱感作もしくは隔離−インターナリゼーション機構と相互作用
できないようにするか、または適切な原形質膜局在化をもたらす、請求項28に
記載の宿主細胞。 - 【請求項30】 真核細胞である、請求項27に記載の宿主細胞。
- 【請求項31】 異種Gタンパク質共役受容体が細胞内ドメインで改変されている、請求項30
に記載の宿主細胞。 - 【請求項32】 細胞内ドメインが第3の細胞内ドメインである、請求項31に記載の宿主細胞
。 - 【請求項33】 異種Gタンパク質共役受容体がGタンパク質共役受容体のカルボキシ末端テー
ルで改変されている、請求項27に記載の宿主細胞。 - 【請求項34】 酵母である、請求項31または33に記載の宿主細胞。
- 【請求項35】 改変型Gタンパク質共役受容体がニューロテンシン受容体である、請求項34
に記載の宿主細胞。 - 【請求項36】 ニューロテンシン受容体がラットニューロテンシンNT1受容体である、請求
項35に記載の宿主細胞。 - 【請求項37】 Gタンパク質共役受容体と結合し得る化合物をスクリーニングする方法であっ
て、 (a)請求項27に記載の宿主細胞を試験化合物に曝し、さらに (b)酵母の細胞増殖に対する試験化合物の作用を測定する ことを含んでなる、方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US9870498P | 1998-09-01 | 1998-09-01 | |
US60/098,704 | 1998-09-01 | ||
PCT/US1999/020013 WO2000012705A2 (en) | 1998-09-01 | 1999-09-01 | Methods for improving the function of heterologous g protein-coupled receptors |
Publications (1)
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