JP2002523042A - Dcr5、bmp結合タンパク質、およびそれらの適用 - Google Patents
Dcr5、bmp結合タンパク質、およびそれらの適用Info
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Abstract
(57)【要約】
DCR5(DANに関連するタンパク質(神経芽細胞種において示差的なスクリーニングにより選択された異常遺伝子))、および関連する核酸が提供される。いくつかの種に由来する天然DCR5ホモログおよび特異的活性(特に、骨形成タンパク質をアンタゴナイズする能力)を有するDCR5ドメインが含まれる。これらのタンパク質は、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞から組換え産生され得る。開示された遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る単離されたハイブリダイゼーションプローブおよびプライマー、特異的な結合因子、ならびに本発明の組成物を作製および使用する方法もまた、提供される。
Description
【0001】 本出願は、1998年8月20日に出願された米国出願第60/097,296
号(この内容は、本出願に参考として援用される)の優先権を主張する。
号(この内容は、本出願に参考として援用される)の優先権を主張する。
【0002】 (発明の分野) 本発明の分野は、細胞機能を調節するタンパク質、および特に骨形成タンパク
質をアンタゴナイズするタンパク質である。
質をアンタゴナイズするタンパク質である。
【0003】 (背景) 細胞増殖、分化および機能の天然のレギュレーターは、重要な薬学的ツール、
臨床的ツールおよび実験室的ツール、ならびに治療介入についての標的を提供し
た。種々のこのようなレギュレーターは、基本的な細胞の分化および発生経路に
対して顕著な効果を有することが示されている。例えば、最近クローニングされ
たcerberusタンパク質は、脊椎動物の胚の内胚葉前部における頭部構造
の形成を誘導する。同様に、Nogginタンパク質は、脊椎動物の胚において
、頭部構造を誘導し、そして腹面運命(例えば、血液および間葉)から背面運命
(例えば、筋肉および脊索)に、中胚葉運命を再び指向し得、そして前部神経運
命に上皮運命を再び指向し得る。Chordinの活性は、Nogginの活性
と同様であり、このことは、共通の作用機構(すなわち、骨形成タンパク質(B
MP)をアンタゴナイズし、それによってそれらの機能を妨げること)を反映し
ている。BMPは、異なる生物学的状況において多様な生物学的活性(軟骨、骨
および結合組織の誘導、ならびに腎臓、歯、腸、皮膚および髪の発達における役
割を含む)を有する。
臨床的ツールおよび実験室的ツール、ならびに治療介入についての標的を提供し
た。種々のこのようなレギュレーターは、基本的な細胞の分化および発生経路に
対して顕著な効果を有することが示されている。例えば、最近クローニングされ
たcerberusタンパク質は、脊椎動物の胚の内胚葉前部における頭部構造
の形成を誘導する。同様に、Nogginタンパク質は、脊椎動物の胚において
、頭部構造を誘導し、そして腹面運命(例えば、血液および間葉)から背面運命
(例えば、筋肉および脊索)に、中胚葉運命を再び指向し得、そして前部神経運
命に上皮運命を再び指向し得る。Chordinの活性は、Nogginの活性
と同様であり、このことは、共通の作用機構(すなわち、骨形成タンパク質(B
MP)をアンタゴナイズし、それによってそれらの機能を妨げること)を反映し
ている。BMPは、異なる生物学的状況において多様な生物学的活性(軟骨、骨
および結合組織の誘導、ならびに腎臓、歯、腸、皮膚および髪の発達における役
割を含む)を有する。
【0004】 TGFβスーパーファミリーの異なるメンバーは、細胞が異なる運命に従うよ
うに支持し得、例えば、TGFβは、神経堤が平滑筋を形成するように誘導し、
一方、BMP2は、この同じ細胞がニューロンになるように誘導する。Xeno
pusの実験では、解離した動物キャップ細胞(cap細胞)(予期外胚葉)は
、BMP4に応答すると表皮になるが、アクチビンに応答すると中胚葉になる。
うに支持し得、例えば、TGFβは、神経堤が平滑筋を形成するように誘導し、
一方、BMP2は、この同じ細胞がニューロンになるように誘導する。Xeno
pusの実験では、解離した動物キャップ細胞(cap細胞)(予期外胚葉)は
、BMP4に応答すると表皮になるが、アクチビンに応答すると中胚葉になる。
【0005】 アクチビンとBMP4との間の配列同一性は低いので、それらが、異なる運命
を誘導することは驚きではない。非常に密接に関連した配列であるBMPスーパ
ーファミリーのメンバーが、異なる運命を誘導し得ることがより驚きである。著
しい例は、BMPが染み込んだマトリクスを筋肉内に移植することから生じる。
この効果が組織学的にモニターされる場合、BMP2、BMP4およびBMP7
は、軟骨内の骨形成を誘導し、一方、関連する分子であるBMP12/GDF7
は、腱に類似する結合組織を誘導する。同様に、BMP4は、菱脳の神経堤にお
ける細胞死を誘導し得、一方、関連するタンパク質であるdorsalinは、
誘導しない。
を誘導することは驚きではない。非常に密接に関連した配列であるBMPスーパ
ーファミリーのメンバーが、異なる運命を誘導し得ることがより驚きである。著
しい例は、BMPが染み込んだマトリクスを筋肉内に移植することから生じる。
この効果が組織学的にモニターされる場合、BMP2、BMP4およびBMP7
は、軟骨内の骨形成を誘導し、一方、関連する分子であるBMP12/GDF7
は、腱に類似する結合組織を誘導する。同様に、BMP4は、菱脳の神経堤にお
ける細胞死を誘導し得、一方、関連するタンパク質であるdorsalinは、
誘導しない。
【0006】 異なるBMPファミリーメンバーは、異なる運命を誘導し得るので、次いで、
BMPのサブセットをブロックする際に特異性を有するBMPアンタゴニストは
、細胞に提示されるBMPの平衡を変化させ得、それによって細胞運命を変更さ
せる。ヒトの健康および疾患における相対的なBMP発現の重要性に鑑みれば、
細胞機能およびBMP機能のレギュレーター、特に例えば、Nogginおよび
cereberusは、臨床適用および生物工学的適用の宿主に価値ある試薬を
提供する。本発明は、細胞機能のレギュレーターの新規なファミリーに関する。
BMPのサブセットをブロックする際に特異性を有するBMPアンタゴニストは
、細胞に提示されるBMPの平衡を変化させ得、それによって細胞運命を変更さ
せる。ヒトの健康および疾患における相対的なBMP発現の重要性に鑑みれば、
細胞機能およびBMP機能のレギュレーター、特に例えば、Nogginおよび
cereberusは、臨床適用および生物工学的適用の宿主に価値ある試薬を
提供する。本発明は、細胞機能のレギュレーターの新規なファミリーに関する。
【0007】 (関連文献) Bouwmeesterら(1996)Nature 382:595〜60
1は、Xenopusのcerberus遺伝子のクローニングを記載する;L
amb,T.M.ら(1993)Science 262:713〜718;S
mith,W.C.ら(1992)Cell 70:829〜840;Smit
h,W.C.ら(1993)Nature 361:547〜549;およびZ
immerman,L.B.ら(1996)Cell 86:599〜606は
、Nogginタンパク質の単離および機能を記載する。Piccolo,S.
ら(1996)Cell 86:589〜598;Sasai,Y.ら(199
5)Nature 376:333〜336;およびSasai,Y.ら(19
94)Cell 79:779〜790は、chordinタンパク質に関する
。Enomotoら(1994)Oncogene 9:2785〜2791お
よびOzakiら(1996)Jpn.J.Cancer Res.87:58
〜61は、DAN遺伝子のヒトホモログおよびマウスホモログを記載する。Hs
uら(1998)Mol Cell 1:673〜683は、種々の種(ヒトを
含む)に由来するGremlinを記載し;Minabe−Saegusa,C
.ら(1998)Dev Growth Differ 40:343〜353
は、マウスPRDCを記載する。
1は、Xenopusのcerberus遺伝子のクローニングを記載する;L
amb,T.M.ら(1993)Science 262:713〜718;S
mith,W.C.ら(1992)Cell 70:829〜840;Smit
h,W.C.ら(1993)Nature 361:547〜549;およびZ
immerman,L.B.ら(1996)Cell 86:599〜606は
、Nogginタンパク質の単離および機能を記載する。Piccolo,S.
ら(1996)Cell 86:589〜598;Sasai,Y.ら(199
5)Nature 376:333〜336;およびSasai,Y.ら(19
94)Cell 79:779〜790は、chordinタンパク質に関する
。Enomotoら(1994)Oncogene 9:2785〜2791お
よびOzakiら(1996)Jpn.J.Cancer Res.87:58
〜61は、DAN遺伝子のヒトホモログおよびマウスホモログを記載する。Hs
uら(1998)Mol Cell 1:673〜683は、種々の種(ヒトを
含む)に由来するGremlinを記載し;Minabe−Saegusa,C
.ら(1998)Dev Growth Differ 40:343〜353
は、マウスPRDCを記載する。
【0008】 (発明の要旨) 本発明は、DCR5(Gremlinに関連するタンパク質)、DAN(神経
芽細胞腫において示差的なスクリーニングにより選択された異常遺伝子およびC
erberus、ならびに関連する核酸に関する方法ならびに組成物を提供する
。異なる種由来の天然のDCR5ホモログ、ならびにDCR5ドメインを含みか
つDCR5特異的活性(特に、骨形成タンパク質をアンタゴナイズする能力)を
有するタンパク質が、含まれる。このタンパク質は、本発明の核酸で形質転換さ
れた宿主細胞から組換え産生され得る。本発明は、開示された遺伝子に特異的に
ハイブリダイズし得る単離されたハイブリダイゼーションプローブおよびプライ
マー、特異的な結合因子(例えば、特異的な抗体)、ならびに診断(例えば、D
CR5転写物に対する遺伝子ハイブリダイゼーションスクリーニング)、治療(
例えば、DCR5遺伝子発現を調節する遺伝子治療)、および生物薬学的産業(
例えば、薬理学的リード物質についての化学ライブラリーをスクリーニングする
ための試薬)において、本発明の組成物を作製および使用する方法を提供する。
芽細胞腫において示差的なスクリーニングにより選択された異常遺伝子およびC
erberus、ならびに関連する核酸に関する方法ならびに組成物を提供する
。異なる種由来の天然のDCR5ホモログ、ならびにDCR5ドメインを含みか
つDCR5特異的活性(特に、骨形成タンパク質をアンタゴナイズする能力)を
有するタンパク質が、含まれる。このタンパク質は、本発明の核酸で形質転換さ
れた宿主細胞から組換え産生され得る。本発明は、開示された遺伝子に特異的に
ハイブリダイズし得る単離されたハイブリダイゼーションプローブおよびプライ
マー、特異的な結合因子(例えば、特異的な抗体)、ならびに診断(例えば、D
CR5転写物に対する遺伝子ハイブリダイゼーションスクリーニング)、治療(
例えば、DCR5遺伝子発現を調節する遺伝子治療)、および生物薬学的産業(
例えば、薬理学的リード物質についての化学ライブラリーをスクリーニングする
ための試薬)において、本発明の組成物を作製および使用する方法を提供する。
【0009】 本発明のDCR5タンパク質の好ましい適用は、外因性DCR5タンパク質が
、培地の成分および/または細胞外表面と特異的と相互作用して細胞の生理に変
化をもたらす条件下で、細胞または細胞の周囲の培地とこの添加された外因性D
CR5タンパク質とを接触させることによって、細胞外表面を含む細胞の生理を
改変することを包含する。生物学的に活性な因子をスクリーニングするための方
法もまた、好ましく、この方法は、細胞外DCR5タンパク質特異的結合標的お
よび候補因子の存在下で、その因子がなければこのタンパク質が参照アフィニテ
ィーで結合標的に特異的に結合する条件下で、DCR5タンパク質をインキュベ
ートすること;この結合標的に対するこのタンパク質の結合アフィニティーを検
出し、因子に対して偏りのある(agent−biased)アフィニティーを
決定することであって、因子に対して偏りのあるアフィニティーと参照アフィニ
ティーとの間の差異は、この因子が結合標的に対するこのタンパク質の結合を調
節することを示す、ことを包含する。
、培地の成分および/または細胞外表面と特異的と相互作用して細胞の生理に変
化をもたらす条件下で、細胞または細胞の周囲の培地とこの添加された外因性D
CR5タンパク質とを接触させることによって、細胞外表面を含む細胞の生理を
改変することを包含する。生物学的に活性な因子をスクリーニングするための方
法もまた、好ましく、この方法は、細胞外DCR5タンパク質特異的結合標的お
よび候補因子の存在下で、その因子がなければこのタンパク質が参照アフィニテ
ィーで結合標的に特異的に結合する条件下で、DCR5タンパク質をインキュベ
ートすること;この結合標的に対するこのタンパク質の結合アフィニティーを検
出し、因子に対して偏りのある(agent−biased)アフィニティーを
決定することであって、因子に対して偏りのあるアフィニティーと参照アフィニ
ティーとの間の差異は、この因子が結合標的に対するこのタンパク質の結合を調
節することを示す、ことを包含する。
【0010】 本発明の別の好ましい実施態様は、ヒトDCR5ポリペプチドの治療用量を投
与することによって、ヒトまたは動物の身体を処置(ここで処置は、軟骨および
骨の成長の調節である)する方法である。
与することによって、ヒトまたは動物の身体を処置(ここで処置は、軟骨および
骨の成長の調節である)する方法である。
【0011】 本発明のさらなる好ましい実施態様は、イムノグロブリン定常領域に融合され
たヒトDCR5を含むリガンド体(ligandbody)であり、ここでイム
ノグロブリン定常領域は、ヒトIgG1のFc部分である。
たヒトDCR5を含むリガンド体(ligandbody)であり、ここでイム
ノグロブリン定常領域は、ヒトIgG1のFc部分である。
【0012】 好ましい実施態様において、リガンド体は、ヒトまたは動物の身体を処置する
方法において、または診断方法において使用され得る。
方法において、または診断方法において使用され得る。
【0013】 (発明の詳細な説明) 本発明は、天然DCRタンパク質およびDCR5アミノ酸配列を含む組換えタ
ンパク質を含むDCR5タンパク質、またはアッセイで判別可能なDCR5特異
的活性を有するそれらの機能的DCR5タンパク質ドメインを提供する。従って
、これらのタンパク質は、開示された天然DCR5タンパク質の欠失変異体であ
り得、そして例えば、非DCR5ポリペプチドとの融合産物として提供され得る
。本発明のDCR5タンパク質のドメインは、DCR5特異的な活性または機能
を有し、そして互いにおよびDANホモログ、cerberusホモログ、Gr
emlinホモログおよびNogginホモログとは機能的に異なる。このよう
なドメインは、天然DCR5タンパク質の少なくとも6個および好ましくは少な
くとも8個の連続する残基を含む(Enomotoら(1994)Oncoge
ne 9:2785〜2791により報告されるDAN配列を参照のこと)。好
ましいDCR5タンパク質は、種間で保存されるDCR5配列を含む。
ンパク質を含むDCR5タンパク質、またはアッセイで判別可能なDCR5特異
的活性を有するそれらの機能的DCR5タンパク質ドメインを提供する。従って
、これらのタンパク質は、開示された天然DCR5タンパク質の欠失変異体であ
り得、そして例えば、非DCR5ポリペプチドとの融合産物として提供され得る
。本発明のDCR5タンパク質のドメインは、DCR5特異的な活性または機能
を有し、そして互いにおよびDANホモログ、cerberusホモログ、Gr
emlinホモログおよびNogginホモログとは機能的に異なる。このよう
なドメインは、天然DCR5タンパク質の少なくとも6個および好ましくは少な
くとも8個の連続する残基を含む(Enomotoら(1994)Oncoge
ne 9:2785〜2791により報告されるDAN配列を参照のこと)。好
ましいDCR5タンパク質は、種間で保存されるDCR5配列を含む。
【0014】 本明細書中に記載されるDCR5タンパク質は、それらが特定の形態発生タン
パク質(例えば、BMP)のアンタゴニストとして細胞外で活性であるという点
で、DANおよびCerberusに構造的かつ機能的に関連する。DCR5特
異的な活性または機能は、簡便なインビトロでの細胞ベースのアッセイまたはイ
ンビボでのアッセイ(例えば、インビトロでの結合アッセイ、細胞培養アッセイ
、動物においてなど)(例えば、免疫応答、遺伝子治療、トランスジェニックな
ど)などによって決定され得る。結合アッセイは、DCR5タンパク質と結合標
的との特異的分子相互作用が評価される任意のアッセイを包含する。この結合標
的は、天然の結合標的(例えば、TGFβタンパク質、形態発生タンパク質、好
ましくは骨形成タンパク質(BMP2またはBMP4)、シャペロン、またはD
CR5活性またはその局在を直接的に調節する他のレギュレーター);あるいは
非天然結合標的(例えば、特異的免疫応答タンパク質(例えば、抗体)、または
以下に記載されるアッセイにおいて同定されるようなDCR5特異的因子であり
得る。一般に、結合特異性は、バイオアッセイ(例えば、注入された胚の外胚葉
からニューロン組織を誘導する能力)によって、TGFβタンパク質結合の平衡
定数(通常、少なくとも約107M-1、好ましくは少なくとも約108M-1、より
好ましくは少なくとも約109M-1)によって、本発明のタンパク質が、DCR
5発現細胞におけるネガティブな変異体として機能する能力、異種宿主(例えば
、げっ歯類またはウサギ)におけるDCR5特異的抗体を誘発する能力によって
などで、アッセイされる。
パク質(例えば、BMP)のアンタゴニストとして細胞外で活性であるという点
で、DANおよびCerberusに構造的かつ機能的に関連する。DCR5特
異的な活性または機能は、簡便なインビトロでの細胞ベースのアッセイまたはイ
ンビボでのアッセイ(例えば、インビトロでの結合アッセイ、細胞培養アッセイ
、動物においてなど)(例えば、免疫応答、遺伝子治療、トランスジェニックな
ど)などによって決定され得る。結合アッセイは、DCR5タンパク質と結合標
的との特異的分子相互作用が評価される任意のアッセイを包含する。この結合標
的は、天然の結合標的(例えば、TGFβタンパク質、形態発生タンパク質、好
ましくは骨形成タンパク質(BMP2またはBMP4)、シャペロン、またはD
CR5活性またはその局在を直接的に調節する他のレギュレーター);あるいは
非天然結合標的(例えば、特異的免疫応答タンパク質(例えば、抗体)、または
以下に記載されるアッセイにおいて同定されるようなDCR5特異的因子であり
得る。一般に、結合特異性は、バイオアッセイ(例えば、注入された胚の外胚葉
からニューロン組織を誘導する能力)によって、TGFβタンパク質結合の平衡
定数(通常、少なくとも約107M-1、好ましくは少なくとも約108M-1、より
好ましくは少なくとも約109M-1)によって、本発明のタンパク質が、DCR
5発現細胞におけるネガティブな変異体として機能する能力、異種宿主(例えば
、げっ歯類またはウサギ)におけるDCR5特異的抗体を誘発する能力によって
などで、アッセイされる。
【0015】 本願のタンパク質は、単離されてい得るか、または、純粋であり得る。「単離
された」タンパク質は、その天然の状態で会合しているいくつかの物質をもはや
付随せず、そして好ましくは所定のサンプル中で総タンパク質の好ましくは少な
くとも約0.5重量%、およびより好ましくは少なくとも約5重量%を構成する
ものである;「純粋な」タンパク質は、所定のサンプル中で総タンパク質の少な
くとも約90重量%、および好ましくは少なくとも約99重量%を構成する。本
発明のタンパク質およびタンパク質ドメインは、合成され得るか、組換え技術に
より産生され得るか、または細胞から精製され得る。広範な種々の分子方法およ
び生化学方法が、本発明の組成物の生化学的合成、分子の発現および精製に利用
可能である(例えば、Molecular Cloning、A Labora
tory Manual(Sambrookら、Cold Spring Ha
rbor Laboratory)、Current Protocols i
n Molecular Biology(Ausubelら編、Greene
Publ.Assoc.、Wiley−Interscience、NYを参
照のこと)。
された」タンパク質は、その天然の状態で会合しているいくつかの物質をもはや
付随せず、そして好ましくは所定のサンプル中で総タンパク質の好ましくは少な
くとも約0.5重量%、およびより好ましくは少なくとも約5重量%を構成する
ものである;「純粋な」タンパク質は、所定のサンプル中で総タンパク質の少な
くとも約90重量%、および好ましくは少なくとも約99重量%を構成する。本
発明のタンパク質およびタンパク質ドメインは、合成され得るか、組換え技術に
より産生され得るか、または細胞から精製され得る。広範な種々の分子方法およ
び生化学方法が、本発明の組成物の生化学的合成、分子の発現および精製に利用
可能である(例えば、Molecular Cloning、A Labora
tory Manual(Sambrookら、Cold Spring Ha
rbor Laboratory)、Current Protocols i
n Molecular Biology(Ausubelら編、Greene
Publ.Assoc.、Wiley−Interscience、NYを参
照のこと)。
【0016】 本発明のタンパク質は、免疫原、スクリーニングアッセイにおける標的、細胞
増殖、分化および/または機能を調節するための生物活性試薬などとしての使用
を含む、広範な種々の使用を見出す。例えば、本発明は、細胞外表面を含む細胞
の生理を改変するための方法を提供し、この方法は、外因性DCR5タンパク質
が培地の成分および/または細胞外表面と特異的に相互作用し、細胞の生理の変
化をもたらす条件下で、この添加されたタンパク質と細胞または細胞の周囲の培
地とを接触させることによる。これらの方法に従って、この細胞外表面は、原形
質膜会合レセプターを含み;この外因性DCR5は、細胞により作製されないタ
ンパク質をいい、すなわちそのような場合、非天然のレベル、時間または生理学
的位置にて発現され;そして適切な培地は、インビトロの培養培地および生理学
的流体(例えば、血液、滑液)などを含む。本発明のタンパク質の効果的な投与
は、所望されない(例えば、異所性の)骨形成を減少させるため、形態発生タン
パク質を必要とする細胞(例えば、BMP依存性神経芽細胞種および神経膠腫)
の成長を阻害するため、移植または注入のための細胞を含むような培養物中のモ
ルフォゲン依存性細胞運命/分化を変更するためなどに使用され得る。これらの
タンパク質は、マイクロインジェクション、組換え酵素のプロモーター特異的発
現、脂質小胞の標的化送達などのような任意の従来の方法により、細胞の特定の
集団に導入、発現、または抑制され得る。
増殖、分化および/または機能を調節するための生物活性試薬などとしての使用
を含む、広範な種々の使用を見出す。例えば、本発明は、細胞外表面を含む細胞
の生理を改変するための方法を提供し、この方法は、外因性DCR5タンパク質
が培地の成分および/または細胞外表面と特異的に相互作用し、細胞の生理の変
化をもたらす条件下で、この添加されたタンパク質と細胞または細胞の周囲の培
地とを接触させることによる。これらの方法に従って、この細胞外表面は、原形
質膜会合レセプターを含み;この外因性DCR5は、細胞により作製されないタ
ンパク質をいい、すなわちそのような場合、非天然のレベル、時間または生理学
的位置にて発現され;そして適切な培地は、インビトロの培養培地および生理学
的流体(例えば、血液、滑液)などを含む。本発明のタンパク質の効果的な投与
は、所望されない(例えば、異所性の)骨形成を減少させるため、形態発生タン
パク質を必要とする細胞(例えば、BMP依存性神経芽細胞種および神経膠腫)
の成長を阻害するため、移植または注入のための細胞を含むような培養物中のモ
ルフォゲン依存性細胞運命/分化を変更するためなどに使用され得る。これらの
タンパク質は、マイクロインジェクション、組換え酵素のプロモーター特異的発
現、脂質小胞の標的化送達などのような任意の従来の方法により、細胞の特定の
集団に導入、発現、または抑制され得る。
【0017】 本発明は、天然および非天然のDCR5特異的結合因子、このような因子を道
程および作製する方法、および診断、治療および薬学的発達におけるそれらの使
用を提供する。DCR5特異的結合因子には、DCR5特異的リガンド(例えば
、BMP)、およびレセプター(例えば、特異的抗体またはT細胞レセプターの
ような体細胞的に組換えられたタンパク質レセプター)が挙げられ(例えば、H
arlowおよびLane(1988)Antibodies、A Labor
atory Manual、Cold Spring Harbor Labo
ratory)、そしてまた、ワンハイブリッドスクリーニング、ツーハイブリ
ッドスクリーニング、スリーハイブリッドスクリーニングのようなアッセイで同
定された他の天然の結合因子、および以下に記載されるような化学ライブラリー
のスクリーニングにおいて同定された非天然の結合因子が挙げられる。特に興味
深い因子は、DCR5機能を調節する。
程および作製する方法、および診断、治療および薬学的発達におけるそれらの使
用を提供する。DCR5特異的結合因子には、DCR5特異的リガンド(例えば
、BMP)、およびレセプター(例えば、特異的抗体またはT細胞レセプターの
ような体細胞的に組換えられたタンパク質レセプター)が挙げられ(例えば、H
arlowおよびLane(1988)Antibodies、A Labor
atory Manual、Cold Spring Harbor Labo
ratory)、そしてまた、ワンハイブリッドスクリーニング、ツーハイブリ
ッドスクリーニング、スリーハイブリッドスクリーニングのようなアッセイで同
定された他の天然の結合因子、および以下に記載されるような化学ライブラリー
のスクリーニングにおいて同定された非天然の結合因子が挙げられる。特に興味
深い因子は、DCR5機能を調節する。
【0018】 本発明は、DCR5核酸を提供し、これは、翻訳可能な転写物、ハイブリダイ
ゼーションプローブ、PCRプライマー、診断用核酸などのような使用、ならび
にDCR5遺伝子および遺伝子転写物の存在の検出での使用、およびさらなるD
CR5ホモログおよび構造アナログをコードする核酸の検出および増幅での使用
を含む、広範な種々の適用を見出す。
ゼーションプローブ、PCRプライマー、診断用核酸などのような使用、ならび
にDCR5遺伝子および遺伝子転写物の存在の検出での使用、およびさらなるD
CR5ホモログおよび構造アナログをコードする核酸の検出および増幅での使用
を含む、広範な種々の適用を見出す。
【0019】 本発明の核酸は、合成/非天然の配列であり、そして/または単離されており
、すなわち、その天然の状態において会合しているいくらかの物質がもはや付随
しておらず、好ましくは、所定の画分中に存在する総核酸のうちの少なくとも約
0.5重量%、より好ましくは少なくとも約5重量%を構成し、そして通常は、
組換え体であり、このことは、これらが、天然の染色体上で結合されている以外
のヌクレオチドに結合されている非天然配列または天然配列を含むことを意味す
る。SEQ ID NO:11のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含
む核酸は、天然の染色体上に結合している配列以外の配列が直に隣接するか、ま
たは天然の染色体上に結合している配列以外の配列が直に隣接する、10kb未
満、好ましくは2kb未満、の天然の隣接領域により隣接される、このような配
列またはフラグメントを末端にて含む。これらの核酸は、通常、RNAまたはD
NAであるが、これは、しばしば、改変された安定性などを提供する他の塩基ま
たは核酸アナログを含む核酸を使用するために有利である。
、すなわち、その天然の状態において会合しているいくらかの物質がもはや付随
しておらず、好ましくは、所定の画分中に存在する総核酸のうちの少なくとも約
0.5重量%、より好ましくは少なくとも約5重量%を構成し、そして通常は、
組換え体であり、このことは、これらが、天然の染色体上で結合されている以外
のヌクレオチドに結合されている非天然配列または天然配列を含むことを意味す
る。SEQ ID NO:11のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含
む核酸は、天然の染色体上に結合している配列以外の配列が直に隣接するか、ま
たは天然の染色体上に結合している配列以外の配列が直に隣接する、10kb未
満、好ましくは2kb未満、の天然の隣接領域により隣接される、このような配
列またはフラグメントを末端にて含む。これらの核酸は、通常、RNAまたはD
NAであるが、これは、しばしば、改変された安定性などを提供する他の塩基ま
たは核酸アナログを含む核酸を使用するために有利である。
【0020】 開示されたDCR5タンパク質のアミノ酸配列は、選択された発現系に最適化
されたDCR5タンパク質をコードする核酸を逆翻訳するために使用されるか(
Hollerら(1993)Gene 136:323〜328;Martin
ら(1995)Gene 154:150〜166)または天然のDCR5をコ
ードする核酸配列の単離における使用のために縮重オリゴヌクレオチドプライマ
ーおよびプローブを作製するために使用される(「GCG」ソフトウェア、Ge
netics Computer Group,Inc.、Madison、W
I)。DCR5をコードする核酸は、発現ベクターの一部であり得、そして例え
ば、発現およびスクリーニングのため、トランスジェニック動物のため、機能研
究のため(DCR5媒介シグナル伝達と関連する進化に対する候補薬物の効率)
などのために、組換え宿主細胞中に組み込まれ得る。発現系は、選択的翻訳後プ
ロセシングを通じて、DCR5タンパク質の構造改変体および機能改変体をもた
らすように選択および/またはあつらえられる。
されたDCR5タンパク質をコードする核酸を逆翻訳するために使用されるか(
Hollerら(1993)Gene 136:323〜328;Martin
ら(1995)Gene 154:150〜166)または天然のDCR5をコ
ードする核酸配列の単離における使用のために縮重オリゴヌクレオチドプライマ
ーおよびプローブを作製するために使用される(「GCG」ソフトウェア、Ge
netics Computer Group,Inc.、Madison、W
I)。DCR5をコードする核酸は、発現ベクターの一部であり得、そして例え
ば、発現およびスクリーニングのため、トランスジェニック動物のため、機能研
究のため(DCR5媒介シグナル伝達と関連する進化に対する候補薬物の効率)
などのために、組換え宿主細胞中に組み込まれ得る。発現系は、選択的翻訳後プ
ロセシングを通じて、DCR5タンパク質の構造改変体および機能改変体をもた
らすように選択および/またはあつらえられる。
【0021】 本発明はまた、DCR5 cDNA特異的配列を有し、かつSEQ ID N
O:11との特異的なハイブリダイゼーションをもたらすに十分な核酸ハイブリ
ダイゼーションプローブおよび複製/増幅プライマーを提供する。特異的ハイブ
リダイゼーションの実証は、一般に、ストリンジェントな条件を必要とする(例
えば、5×SSPE(0.18M NaCl、0.01M NaPO4,pH7
.7,0.001M EDTA)緩衝液中に30%ホルムアミドを含む緩衝液中
で42℃でハイブリダイズさせ、そして0.2×SSPEで42℃での洗浄に供
される場合に残っている結合;好ましくは、5×SSPE緩衝液中に50%ホル
ムアミドを含む緩衝液中で42℃の温度でハイブリダイズさせ、そして0.2×
SSPE緩衝液での42℃での洗浄に供される場合に残っている結合)。DCR
5 cDNAホモログはまた、アライメントアルゴリズム(例えば、BLAST
X)(Altschulら(1990)Basic Local Alignm
ent Search Tool、J.Mol.Biol.215:403〜4
210)を使用して他のタンパク質から区別され得る。
O:11との特異的なハイブリダイゼーションをもたらすに十分な核酸ハイブリ
ダイゼーションプローブおよび複製/増幅プライマーを提供する。特異的ハイブ
リダイゼーションの実証は、一般に、ストリンジェントな条件を必要とする(例
えば、5×SSPE(0.18M NaCl、0.01M NaPO4,pH7
.7,0.001M EDTA)緩衝液中に30%ホルムアミドを含む緩衝液中
で42℃でハイブリダイズさせ、そして0.2×SSPEで42℃での洗浄に供
される場合に残っている結合;好ましくは、5×SSPE緩衝液中に50%ホル
ムアミドを含む緩衝液中で42℃の温度でハイブリダイズさせ、そして0.2×
SSPE緩衝液での42℃での洗浄に供される場合に残っている結合)。DCR
5 cDNAホモログはまた、アライメントアルゴリズム(例えば、BLAST
X)(Altschulら(1990)Basic Local Alignm
ent Search Tool、J.Mol.Biol.215:403〜4
210)を使用して他のタンパク質から区別され得る。
【0022】 DCR5ハイブリダイゼーションプローブは、臨床サンプルおよび実験室サン
プル中の野生型および変異対立遺伝子の同定における使用を見出す。変異対立遺
伝子は、ハイスループット臨床診断のために、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオ
チド(ASO)プローブを作製するために使用される。DCR5核酸はまた、活
性DCR5の細胞発現または細胞内濃度またはアベイラビリティーを調節するた
めに使用される。DCR5阻害核酸は、代表的には、開示された天然のDCR5
をコードする配列の相補体を含む、アンチセンスの一本鎖配列である。所定のD
CR5タンパク質の発現のアンチセンス調節は、遺伝子調節配列に作動可能に連
結されたアンチセンス核酸を用い得る。細胞は、配向されたプロモーター配列と
ともにDCR5配列を含むベクターでトランスフェクトされ、その結果、この遺
伝子の転写は、内因性DCR5をコードするmRNAに結合し得るアンチセンス
転写物を生じる。このアンチセンス核酸の転写は、構成的または誘導性であり得
、そしてこのベクターは、アンテナ染色体外維持または組み込みを提供する。あ
るいは、ゲノムDNAまたはmRNAをコードする所定のDCR5タンパク質に
結合する一本鎖アンチセンス核酸は、標的核酸に投与され得るか、または一時的
に、標的化されたタンパク質の発現の実質的減少をもたらす濃度にて、宿主から
単離され得る。DCR5発現における増強は、対応する遺伝子産物の機能的発現
を増大させるDCR5核酸を、標的化細胞型に導入することによってもたらされ
る。このような核酸は、DCR5発現ベクター、内因性対立遺伝子の機能的発現
を上方制御するベクター、または変異対立遺伝子の標的化された修正のための置
換ベクターであり得る。核酸を生細胞中に導入するための技術は、当該分野にお
いて公知であり、そしてレトロウイルスベースのトランスフェクション、ウイル
スコートタンパク質−リポソーム媒介性トランスフェクションなどが挙げられる
。
プル中の野生型および変異対立遺伝子の同定における使用を見出す。変異対立遺
伝子は、ハイスループット臨床診断のために、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオ
チド(ASO)プローブを作製するために使用される。DCR5核酸はまた、活
性DCR5の細胞発現または細胞内濃度またはアベイラビリティーを調節するた
めに使用される。DCR5阻害核酸は、代表的には、開示された天然のDCR5
をコードする配列の相補体を含む、アンチセンスの一本鎖配列である。所定のD
CR5タンパク質の発現のアンチセンス調節は、遺伝子調節配列に作動可能に連
結されたアンチセンス核酸を用い得る。細胞は、配向されたプロモーター配列と
ともにDCR5配列を含むベクターでトランスフェクトされ、その結果、この遺
伝子の転写は、内因性DCR5をコードするmRNAに結合し得るアンチセンス
転写物を生じる。このアンチセンス核酸の転写は、構成的または誘導性であり得
、そしてこのベクターは、アンテナ染色体外維持または組み込みを提供する。あ
るいは、ゲノムDNAまたはmRNAをコードする所定のDCR5タンパク質に
結合する一本鎖アンチセンス核酸は、標的核酸に投与され得るか、または一時的
に、標的化されたタンパク質の発現の実質的減少をもたらす濃度にて、宿主から
単離され得る。DCR5発現における増強は、対応する遺伝子産物の機能的発現
を増大させるDCR5核酸を、標的化細胞型に導入することによってもたらされ
る。このような核酸は、DCR5発現ベクター、内因性対立遺伝子の機能的発現
を上方制御するベクター、または変異対立遺伝子の標的化された修正のための置
換ベクターであり得る。核酸を生細胞中に導入するための技術は、当該分野にお
いて公知であり、そしてレトロウイルスベースのトランスフェクション、ウイル
スコートタンパク質−リポソーム媒介性トランスフェクションなどが挙げられる
。
【0023】 本発明は、DCR5の調節可能な細胞機能のレベルにて活性な因子に対する、
因子、化合物またはリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。一般に、
これらのスクリーニング方法は、天然DCR5結合標的とのDCR5相互作用を
調節する化合物をアッセイすることを包含する。タンパク質間結合アッセイ、イ
ムノアッセイ、細胞ベースのアッセイなどを含む、結合因子についての広範な種
々のアッセイが、提供される。好ましい方法は、リード化合物についての、化学
物質ライブラリーの自動化された経済的なハイスループットスクリーニングに受
け入れられる。
因子、化合物またはリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。一般に、
これらのスクリーニング方法は、天然DCR5結合標的とのDCR5相互作用を
調節する化合物をアッセイすることを包含する。タンパク質間結合アッセイ、イ
ムノアッセイ、細胞ベースのアッセイなどを含む、結合因子についての広範な種
々のアッセイが、提供される。好ましい方法は、リード化合物についての、化学
物質ライブラリーの自動化された経済的なハイスループットスクリーニングに受
け入れられる。
【0024】 インビトロでの結合アッセイは、DCR5タンパク質を含む成分の混合物を用
い、このDCR5タンパク質は、別のペプチドまたはポリペプチド(例えば、検
出または係留のためのタグなど)との融合産物の一部であり得る。このアッセイ
混合物は、天然のDCR5結合標的(例えば、BMPのようなTGFβタンパク
質)を含む。ネイティブな結合標的が使用され得るが、それらの部分がこのアッ
セイにおいて簡便に測定可能な本発明のDCR5に対する結合アフィニティーお
よびアビディティーを提供する限り、その部分を使用することが好ましい。この
アッセイ混合物はまた、候補の薬学的因子を含む。候補因子は、多くの化学クラ
スを含むが、代表的には、それらは、有機化合物、好ましくは小さな有機化合物
であり、そして合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、広範な種々
の供給源から得られる。塩、緩衝剤、中性タンパク質(例えば、アルブミン)、
界面活性剤、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤な
どのような種々の他の試薬もまた、含まれ得る。これらの混合物成分は、必須の
結合を提供する任意の順番で添加され得、そしてインキュベーションは、最適な
結合を容易にする任意の温度にて実行され得る。この混合物は、候補の薬理学的
因子の存在がなければ、このDCR5が細胞結合標的、部分または参照結合アフ
ィニティーを有するアナログを特異的に結合する条件下で、インキュベートされ
る。インキュベーション期間は、最適な結合について選択されるがまた、迅速な
ハイスループットスクリーニングを容易にするために最小化される。
い、このDCR5タンパク質は、別のペプチドまたはポリペプチド(例えば、検
出または係留のためのタグなど)との融合産物の一部であり得る。このアッセイ
混合物は、天然のDCR5結合標的(例えば、BMPのようなTGFβタンパク
質)を含む。ネイティブな結合標的が使用され得るが、それらの部分がこのアッ
セイにおいて簡便に測定可能な本発明のDCR5に対する結合アフィニティーお
よびアビディティーを提供する限り、その部分を使用することが好ましい。この
アッセイ混合物はまた、候補の薬学的因子を含む。候補因子は、多くの化学クラ
スを含むが、代表的には、それらは、有機化合物、好ましくは小さな有機化合物
であり、そして合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、広範な種々
の供給源から得られる。塩、緩衝剤、中性タンパク質(例えば、アルブミン)、
界面活性剤、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤な
どのような種々の他の試薬もまた、含まれ得る。これらの混合物成分は、必須の
結合を提供する任意の順番で添加され得、そしてインキュベーションは、最適な
結合を容易にする任意の温度にて実行され得る。この混合物は、候補の薬理学的
因子の存在がなければ、このDCR5が細胞結合標的、部分または参照結合アフ
ィニティーを有するアナログを特異的に結合する条件下で、インキュベートされ
る。インキュベーション期間は、最適な結合について選択されるがまた、迅速な
ハイスループットスクリーニングを容易にするために最小化される。
【0025】 インキュベーション後に、DCR5と1以上の結合標的との間の因子に対して
偏りのある結合は、任意の簡便な方法によって検出される。細胞を含まない結合
型アッセイについて、分離工程は、しばしば、非結合成分から結合成分を分離す
るために使用される。分離は、沈降、固定化など、続いて例えば、膜濾過または
ゲルクロマトグラフィーによる洗浄によってもたらされ得る。細胞を含まない結
合アッセイについて、これらの成分のうちの1つは、通常、標識を含むか、また
は標識に結合される。この標識は、放射能、発光、光学密度または電子密度など
のような直接的な検出、あるいはエピトープタグ、酵素などのような間接的な検
出を提供し得る。種々の方法は、例えば、光学密度または電子密度、放射射出、
非放射エネルギー転位を通じて、標識および他のアッセイ成分の性質に依存して
、標識を検出するために使用され、あるいは抗体結合体を用いて間接的に検出さ
れる。因子の存在下での結合アフィニティーと比較した場合、この因子の非存在
下での標的に対するDCR5タンパク質の結合アフィニティーにおける差異は、
この因子が対応する結合標的へのDCR5タンパク質の結合を調節することを示
す。本明細書中で使用される場合、差異は、統計学的に有意であり、そして好ま
しくは、少なくとも50%、より好ましくは90%の差異を示す。
偏りのある結合は、任意の簡便な方法によって検出される。細胞を含まない結合
型アッセイについて、分離工程は、しばしば、非結合成分から結合成分を分離す
るために使用される。分離は、沈降、固定化など、続いて例えば、膜濾過または
ゲルクロマトグラフィーによる洗浄によってもたらされ得る。細胞を含まない結
合アッセイについて、これらの成分のうちの1つは、通常、標識を含むか、また
は標識に結合される。この標識は、放射能、発光、光学密度または電子密度など
のような直接的な検出、あるいはエピトープタグ、酵素などのような間接的な検
出を提供し得る。種々の方法は、例えば、光学密度または電子密度、放射射出、
非放射エネルギー転位を通じて、標識および他のアッセイ成分の性質に依存して
、標識を検出するために使用され、あるいは抗体結合体を用いて間接的に検出さ
れる。因子の存在下での結合アフィニティーと比較した場合、この因子の非存在
下での標的に対するDCR5タンパク質の結合アフィニティーにおける差異は、
この因子が対応する結合標的へのDCR5タンパク質の結合を調節することを示
す。本明細書中で使用される場合、差異は、統計学的に有意であり、そして好ま
しくは、少なくとも50%、より好ましくは90%の差異を示す。
【0026】 本発明は、培地と接触している細胞外表面を含む細胞の生理を改変するための
方法を提供し、この方法は、上記の培地と外因性DCR5タンパク質とを、上記
のタンパク質が上記の培地および細胞外表面の成分の少なくとも1つと特異的に
相互作用して、上記の細胞の生理における変化をもたらす条件下で、接触させる
ことを包含する。
方法を提供し、この方法は、上記の培地と外因性DCR5タンパク質とを、上記
のタンパク質が上記の培地および細胞外表面の成分の少なくとも1つと特異的に
相互作用して、上記の細胞の生理における変化をもたらす条件下で、接触させる
ことを包含する。
【0027】 本発明はさらに、生物学的に活性な因子をスクリーニングするための方法を提
供し、この方法は、a)細胞外DCR5タンパク質特異的結合標的および候補因
子の存在下で、DCR5タンパク質を、上記の因子の存在がなければ、上記のタ
ンパク質が参照アフィニティーで上記の結合標的と特異的に結合する条件下でイ
ンキュベートすること;b)上記結合標的に対する上記のタンパク質の結合アフ
ィニティーを検出し、因子に対して偏りのあるアフィニティーを検出することで
あって、ここで因子に対して偏りのあるアフィニティーと参照アフィニティーと
の間の差異が、上記の因子が上記の結合標的に対する上記のタンパク質の結合を
調節することを示す、ことを包含する。
供し、この方法は、a)細胞外DCR5タンパク質特異的結合標的および候補因
子の存在下で、DCR5タンパク質を、上記の因子の存在がなければ、上記のタ
ンパク質が参照アフィニティーで上記の結合標的と特異的に結合する条件下でイ
ンキュベートすること;b)上記結合標的に対する上記のタンパク質の結合アフ
ィニティーを検出し、因子に対して偏りのあるアフィニティーを検出することで
あって、ここで因子に対して偏りのあるアフィニティーと参照アフィニティーと
の間の差異が、上記の因子が上記の結合標的に対する上記のタンパク質の結合を
調節することを示す、ことを包含する。
【0028】 本発明はまた、リガンド体産生を提供する。リガンド体は、IgGのFcドメ
インに結合したリガンドポリペプチドから構成され、そして二量体化し得る(例
えば、Davisら、1994、Science 266:816〜819を参
照のこと)。リガンド体は、増強した薬理学的特性を示す利点を有する。従って
、DCR5リガンド体は、DCR5の増強した薬物導体学的特性が所望される場
合に、治療用の適用に有用であり得る。
インに結合したリガンドポリペプチドから構成され、そして二量体化し得る(例
えば、Davisら、1994、Science 266:816〜819を参
照のこと)。リガンド体は、増強した薬理学的特性を示す利点を有する。従って
、DCR5リガンド体は、DCR5の増強した薬物導体学的特性が所望される場
合に、治療用の適用に有用であり得る。
【0029】 本発明の1つの実施態様は、SEQ ID NO:12に示されるアミノ酸配
列またはDCR5特異的活性を有するそのフラグメントを含む単離されたDCR
5タンパク質である。
列またはDCR5特異的活性を有するそのフラグメントを含む単離されたDCR
5タンパク質である。
【0030】 本発明の別の実施態様は、SEQ ID NO:12に示されるアミノ酸配列
を含むDCR5タンパク質またはDCR5特異的活性を有するそのフラグメント
をコードする組換え核酸である。
を含むDCR5タンパク質またはDCR5特異的活性を有するそのフラグメント
をコードする組換え核酸である。
【0031】 なお別の実施態様は、SEQ ID NO:11に示されるヌクレオチド配列
を含む単離された核酸、SEQ ID NO:11の少なくとも18個の連続す
る塩基を有し、かつ天然のDANおよびcerberusのcDNAの存在下で
SEQ ID NO:11の配列を有する核酸と特異的にハイブリダイズするに
十分なそのフラグメントである。
を含む単離された核酸、SEQ ID NO:11の少なくとも18個の連続す
る塩基を有し、かつ天然のDANおよびcerberusのcDNAの存在下で
SEQ ID NO:11の配列を有する核酸と特異的にハイブリダイズするに
十分なそのフラグメントである。
【0032】 本発明の別の好ましい実施態様は、ヒトDCR5ポリペプチドをの治療用量を
投与することにより、ヒトまたは動物の身体を処置(ここで、この処置は、軟骨
および骨の成長の調節である)する方法である。
投与することにより、ヒトまたは動物の身体を処置(ここで、この処置は、軟骨
および骨の成長の調節である)する方法である。
【0033】 本発明はまた、本明細書中に記載されるDCR5タンパク質に対する抗体を提
供し、これは、例えば、診断適用におけるタンパク質の検出に有用である。この
DCR5タンパク質に対して指向されるモノクローナル抗体の調製については、
培養中の連続的な細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術が使用され
得る。例えば、もともとは、KohlerおよびMilsteinにより開発さ
れたハイブリドーマ技術(1975、Nature 256:495〜497)
、ならびにトリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、
1983、Immunology Today 4:72)、およびヒトモノク
ローナル抗体を産生するためのEBV−ハイブリドーマ技術(Coleら、19
85、「Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy」、Alan R、Liss,Inc.77〜96頁)などは
、本発明の範囲内である。
供し、これは、例えば、診断適用におけるタンパク質の検出に有用である。この
DCR5タンパク質に対して指向されるモノクローナル抗体の調製については、
培養中の連続的な細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術が使用され
得る。例えば、もともとは、KohlerおよびMilsteinにより開発さ
れたハイブリドーマ技術(1975、Nature 256:495〜497)
、ならびにトリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、
1983、Immunology Today 4:72)、およびヒトモノク
ローナル抗体を産生するためのEBV−ハイブリドーマ技術(Coleら、19
85、「Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy」、Alan R、Liss,Inc.77〜96頁)などは
、本発明の範囲内である。
【0034】 診断または治療での使用のためのモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル
抗体またはキメラヒト−マウス(または他の種)のモノクローナル抗体であり得
る。ヒトモノクローナル抗体は、当該分野において公知の多くの技術のいずれか
により作製され得る(例えば、Tengら、1983、Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A.80:7308〜7312;Kozborら、1
983、Immunology Today 4:72〜79;Olssonら
、1982、Meth.Enzymol.92:3〜16)。ヒト定常領域を有
するマウス抗原結合ドメインを含むキメラ抗体分子が、調製され得る(Morr
isonら、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
81:6851、Takedaら、1985、Nature 314:452)
。
抗体またはキメラヒト−マウス(または他の種)のモノクローナル抗体であり得
る。ヒトモノクローナル抗体は、当該分野において公知の多くの技術のいずれか
により作製され得る(例えば、Tengら、1983、Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A.80:7308〜7312;Kozborら、1
983、Immunology Today 4:72〜79;Olssonら
、1982、Meth.Enzymol.92:3〜16)。ヒト定常領域を有
するマウス抗原結合ドメインを含むキメラ抗体分子が、調製され得る(Morr
isonら、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
81:6851、Takedaら、1985、Nature 314:452)
。
【0035】 当該分野において公知の種々の手順は、本明細書中に記載されるDCR5タン
パク質のエピトープに対するポリクローナル抗体の産生に使用され得る。抗体の
産生のために、種々の宿主動物(ウサギ、マウスおよびラットを含むがこれらに
限定されない)は、DCR5タンパク質、またはそのフラグメントもしくは誘導
体の注射によって免疫され得る。種々のアジュバントが、宿主の種に依存して、
免疫学的応答を増大させるために使用され得、このアジュバントは、フロイント
アジュバント(完全および不完全)、鉱物ゲル(例えば、水酸化アルミニウム)
、表面活性物質(例えば、リゾレシチン)、pluronicポリオール、ポリ
アニオン、ポリペプチド、油性乳剤、キーホルリンペットヘモシアニン、ジニト
ロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント(例えば、BCG(Ba
cille Calmette−Guerin)およびCorynebacte
rium parvum))を含むがこれらに限定されない。
パク質のエピトープに対するポリクローナル抗体の産生に使用され得る。抗体の
産生のために、種々の宿主動物(ウサギ、マウスおよびラットを含むがこれらに
限定されない)は、DCR5タンパク質、またはそのフラグメントもしくは誘導
体の注射によって免疫され得る。種々のアジュバントが、宿主の種に依存して、
免疫学的応答を増大させるために使用され得、このアジュバントは、フロイント
アジュバント(完全および不完全)、鉱物ゲル(例えば、水酸化アルミニウム)
、表面活性物質(例えば、リゾレシチン)、pluronicポリオール、ポリ
アニオン、ポリペプチド、油性乳剤、キーホルリンペットヘモシアニン、ジニト
ロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント(例えば、BCG(Ba
cille Calmette−Guerin)およびCorynebacte
rium parvum))を含むがこれらに限定されない。
【0036】 選択されたDCR5タンパク質エピトープに対する抗体の分子クローンは、公
知の技術により調製され得る。組換えDNA方法論(例えば、Maniatis
ら、1982、Molecular Cloning、A Laborator
y Manual、Cold Spring Harbor Laborato
ry、Cold Spring Harbor、New Yorkを参照のこと
)は、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合部位をコードする核酸配列を
構築するために使用され得る。
知の技術により調製され得る。組換えDNA方法論(例えば、Maniatis
ら、1982、Molecular Cloning、A Laborator
y Manual、Cold Spring Harbor Laborato
ry、Cold Spring Harbor、New Yorkを参照のこと
)は、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合部位をコードする核酸配列を
構築するために使用され得る。
【0037】 本発明は、抗体分子、ならびにこのような抗体分子のフラグメントを提供する
。この分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術により作製
され得る。例えば、このようなフラグメントは、以下を含むがこれらに限定され
ない:抗体分子のペプシン消化により産生され得るF(ab’)2フラグメント
;F(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより作製さ
れ得るFab’フラグメント;および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理す
ることにより作製され得るFabフラグメント。抗体分子は、公知の技術(例え
ば、免疫吸着、またはイムノアフィニティークロマトグラフィー、HPLC(高
速液体クロマトグラフィー)のようなクロマトグラフィー方法、またはそれらの
組合せ)により精製され得る。
。この分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術により作製
され得る。例えば、このようなフラグメントは、以下を含むがこれらに限定され
ない:抗体分子のペプシン消化により産生され得るF(ab’)2フラグメント
;F(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより作製さ
れ得るFab’フラグメント;および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理す
ることにより作製され得るFabフラグメント。抗体分子は、公知の技術(例え
ば、免疫吸着、またはイムノアフィニティークロマトグラフィー、HPLC(高
速液体クロマトグラフィー)のようなクロマトグラフィー方法、またはそれらの
組合せ)により精製され得る。
【0038】 本発明はさらに、骨形成タンパク質(BMP)活性のアンタゴニストとして、
単独または他の因子(BMPの活性を調節するかまたは調整する、DAN、Ce
rberus、b57またはフォン・ビルブラント因子を含む)との組合せで、
DCR5タンパク質またはそのフラグメントを使用する方法を提供する。
単独または他の因子(BMPの活性を調節するかまたは調整する、DAN、Ce
rberus、b57またはフォン・ビルブラント因子を含む)との組合せで、
DCR5タンパク質またはそのフラグメントを使用する方法を提供する。
【0039】 以下の実施例は、例示の目的のために提供され、そして限定のためには提供さ
れない。
れない。
【0040】 (実施例) (実施例1) (ヒトDCR5のクローニング) 問合せとしてヒトGremlin(hGRE)ヌクレオチド配列を使用する、
NCBIでのヌクレオチドデータベースの検索は、「DANおよびCerber
usに関連するタンパク質」について、PRDC(Minabe−Saegus
a、1998)と呼ばれるマウスタンパク質をコードするエントリーをプール出
力した。PCRを使用して、ゲノムDNAおよびいくつかのマウスcDNA供給
源(脳、平滑筋、骨格筋、肝臓、胚齢15日の胚、胚齢17日の胚)からマウス
PRDCをクローニングした。マウスPRDCをコードするオープンリーディン
グフレーム(ORF)は、単一のエキソン上に存在する。本発明者らは、PRD
C ORFが単一のエキソン上に存在する場合、(ヒトDAN/Cerberu
s関連遺伝子番号5について)ヒトDCR5と命名されたそのヒトホモログもま
た、単一のエキソン上に存在するはずであり、このことによりこの遺伝子の完全
なORFについてスクリーニングする際にヒトゲノムDNAの使用が可能になる
と推定した。さらに、本発明者らは、プローブとしてPRDC ORFを使用し
て、Multiple Human Tissue Northern Blo
ts(Clontech)における推定ヒトDCR5の発現を調査した。そして
これは、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、小腸、結腸(粘膜裏打ち)、胃、結腸(筋肉
)、小腸(筋肉)、膀胱(筋肉)、胃(筋肉)、および前立腺(筋肉)中に発現
しているようであり、このことにより、hDCR5 cDNAをクローニングす
るために使用され得るcDNAのいくつかの供給源を指し示した。
NCBIでのヌクレオチドデータベースの検索は、「DANおよびCerber
usに関連するタンパク質」について、PRDC(Minabe−Saegus
a、1998)と呼ばれるマウスタンパク質をコードするエントリーをプール出
力した。PCRを使用して、ゲノムDNAおよびいくつかのマウスcDNA供給
源(脳、平滑筋、骨格筋、肝臓、胚齢15日の胚、胚齢17日の胚)からマウス
PRDCをクローニングした。マウスPRDCをコードするオープンリーディン
グフレーム(ORF)は、単一のエキソン上に存在する。本発明者らは、PRD
C ORFが単一のエキソン上に存在する場合、(ヒトDAN/Cerberu
s関連遺伝子番号5について)ヒトDCR5と命名されたそのヒトホモログもま
た、単一のエキソン上に存在するはずであり、このことによりこの遺伝子の完全
なORFについてスクリーニングする際にヒトゲノムDNAの使用が可能になる
と推定した。さらに、本発明者らは、プローブとしてPRDC ORFを使用し
て、Multiple Human Tissue Northern Blo
ts(Clontech)における推定ヒトDCR5の発現を調査した。そして
これは、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、小腸、結腸(粘膜裏打ち)、胃、結腸(筋肉
)、小腸(筋肉)、膀胱(筋肉)、胃(筋肉)、および前立腺(筋肉)中に発現
しているようであり、このことにより、hDCR5 cDNAをクローニングす
るために使用され得るcDNAのいくつかの供給源を指し示した。
【0041】 PRDCのペプチド配列を、DAN/Cerberus(DAN/CER)フ
ァミリーの公知の全てのメンバーに対して整列させ、そして高度に保存される領
域を決定した。DNA/CERファミリーに属するタンパク質の最も著しい特徴
のうちの1つは、システイン(CYS)の保存されたパターンである。これらの
Cys残基のうちのいくつかを含む4つの異なるアミノ酸配列を、以下の配列を
有する4つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために選択した:
ァミリーの公知の全てのメンバーに対して整列させ、そして高度に保存される領
域を決定した。DNA/CERファミリーに属するタンパク質の最も著しい特徴
のうちの1つは、システイン(CYS)の保存されたパターンである。これらの
Cys残基のうちのいくつかを含む4つの異なるアミノ酸配列を、以下の配列を
有する4つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために選択した:
【0042】
【化1】 鍵: IUPAC命名法を使用して、縮重塩基を示す。 括弧内のアミノ酸は、マウスPRDCにおいてその位置に存在するアミノ酸を示
す。
す。
【0043】 イタリック体の番号は、PRDCタンパク質の配列中のアミノ酸番号(開始メ
チオニンをアミノ酸番号1として開始する)を示す。アミノ酸配列の方向は、矢
印(<)により示されるように、プライマーDCR5.d3−3’(SEQ I
D NO:3)およびDCR5.d4−3’(SEQ ID NO:4)に対し
て逆である。
チオニンをアミノ酸番号1として開始する)を示す。アミノ酸配列の方向は、矢
印(<)により示されるように、プライマーDCR5.d3−3’(SEQ I
D NO:3)およびDCR5.d4−3’(SEQ ID NO:4)に対し
て逆である。
【0044】 本発明者らは、標準的なPCR方法論を使用して、テンプレートとしてヒトゲ
ノムDNAを使用するPCRを設定するために、プライマーDCR5.d1−5
’(SEQ ID NO:1)およびDCR5.d4−3’(SEQ ID N
O:4)(すなわち、PRDCの配列中の最も外側のプライマー)を用いた。こ
れらの反応の産物を、プライマーDCR5.d2−5’(SEQ ID NO:
2)およびDCR5.d3−3’(SEQ ID NO:3)を使用するPCR
反応の第2のセットについてのテンプレートして使用した。この第2のPCR反
応は、およそ200塩基対のDNAフラグメント(これは、PRDC配列に従っ
て予測されるサイズに近い)を増幅した。このフラグメントを、標準的な遺伝子
工学方法論を使用して、プラスミドベクターpUC18中にサブクローニングし
、次いで配列決定した。この配列は、PRDCに対して非常に高い相同性を示し
、このことにより、これは、実際にヒトDCR5のフラグメントであることを示
す。この情報に基づいて、この配列の5’末端および3’末端に対応する正確な
プライマーを、以下に示されるように操作した: A.PCRにより作製されたヒトDCR5のフラグメントの配列:
ノムDNAを使用するPCRを設定するために、プライマーDCR5.d1−5
’(SEQ ID NO:1)およびDCR5.d4−3’(SEQ ID N
O:4)(すなわち、PRDCの配列中の最も外側のプライマー)を用いた。こ
れらの反応の産物を、プライマーDCR5.d2−5’(SEQ ID NO:
2)およびDCR5.d3−3’(SEQ ID NO:3)を使用するPCR
反応の第2のセットについてのテンプレートして使用した。この第2のPCR反
応は、およそ200塩基対のDNAフラグメント(これは、PRDC配列に従っ
て予測されるサイズに近い)を増幅した。このフラグメントを、標準的な遺伝子
工学方法論を使用して、プラスミドベクターpUC18中にサブクローニングし
、次いで配列決定した。この配列は、PRDCに対して非常に高い相同性を示し
、このことにより、これは、実際にヒトDCR5のフラグメントであることを示
す。この情報に基づいて、この配列の5’末端および3’末端に対応する正確な
プライマーを、以下に示されるように操作した: A.PCRにより作製されたヒトDCR5のフラグメントの配列:
【0045】
【化2】 鍵: プライマーh/mDCR5.in1−5’およびhDCR5.in2revに下
線を付す: B.ヒトDCR5部分ゲノム配列に基づいて合成されたプライマーの配列: (i)プライマーh/mDCR5.in1−5’:
線を付す: B.ヒトDCR5部分ゲノム配列に基づいて合成されたプライマーの配列: (i)プライマーh/mDCR5.in1−5’:
【0046】
【化3】 (ii)プライマーhDCR5.in2rev
【0047】
【化4】 これらのプライマーを、PCRにおいて、肝臓cDNAをテンプレートとして
使用して、140bpのフラグメントを増幅した。全長のhDCR5 ORFを
クローニングするために、本発明者らは、上記のプライマーを使用するPCRに
よって、Rapid Screen Human Liver cDNA Li
brary Panel(OriGene Technologies,Inc
.)をスクリーニングした。これは、いくつかの独立したcDNAクローンの同
定につながった。これらのクローンのうちの1つの配列決定は、本発明者らがヒ
トDCR5と命名した168アミノ酸ポリペプチドをコードする507bp O
RFの存在を示した。以下に示される配列は、PRDCに対して非常に高い配列
同一性(95%)を有する。さらに、これは、ヒトGremlinと65%の配
列同一性、およびCerberusおよびDANとそれぞれ28%および26%
の配列同一性を保有する(これらの全ては、保存されたシステインパターンおよ
びコンセンサス配列を含むファミリーのメンバーであり、そしてこれらの全ては
、BMPアンタゴニストとして機能する)。
使用して、140bpのフラグメントを増幅した。全長のhDCR5 ORFを
クローニングするために、本発明者らは、上記のプライマーを使用するPCRに
よって、Rapid Screen Human Liver cDNA Li
brary Panel(OriGene Technologies,Inc
.)をスクリーニングした。これは、いくつかの独立したcDNAクローンの同
定につながった。これらのクローンのうちの1つの配列決定は、本発明者らがヒ
トDCR5と命名した168アミノ酸ポリペプチドをコードする507bp O
RFの存在を示した。以下に示される配列は、PRDCに対して非常に高い配列
同一性(95%)を有する。さらに、これは、ヒトGremlinと65%の配
列同一性、およびCerberusおよびDANとそれぞれ28%および26%
の配列同一性を保有する(これらの全ては、保存されたシステインパターンおよ
びコンセンサス配列を含むファミリーのメンバーであり、そしてこれらの全ては
、BMPアンタゴニストとして機能する)。
【0048】 ヒトDCR5のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列(SEQ
ID NO:11)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO:12)を以下に
示される通りであると決定した:
ID NO:11)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO:12)を以下に
示される通りであると決定した:
【0049】
【化5】 ヒトCDR5ポリペプチド(SEQ ID NO:12)の配列を決定した。こ
れは以下に示される通りである:
れは以下に示される通りである:
【0050】
【化6】 鍵: シグナルペプチド領域に下線を付す。 >N Glycosは、推定N−結合グリコシル化部位の位置を表す。
【0051】
【化7】 SEQ ID NO:11に示されるヒトDCR5 DNA配列(前出)は、
クローニングベクターpCMV6−XL3(OriGene Technolo
gies,Inc.)中にあり、そしてこれをpCAE626と命名する。
クローニングベクターpCMV6−XL3(OriGene Technolo
gies,Inc.)中にあり、そしてこれをpCAE626と命名する。
【0052】 (実施例2) (ヒトDCR5−myc3の構築および発現) ヒトDCR5オープンリーディングフレーム(ORF)を、以下の2つのプラ
イマーを使用してPCRによって増幅した:
イマーを使用してPCRによって増幅した:
【0053】
【化8】 PCR増幅を、ExTaq DNAポリメラーゼ(TaKaRa)を使用して
実行した。このPCR産物を過剰のプライマーから取り出して精製し、制限エン
ドヌクレアーゼEcoRIおよびAgeIで消化し、ゲル精製し、そしてEco
RIおよびAgeIクローニング部位にて哺乳動物発現ベクターpMT21−m
yc3中にサブクローニングし、これにより、三重のmycタグをインフレーム
(in frame)で有するヒトDCR5 ORF(停止コドンなし)がもた
らされた。この配列を以下に示す:
実行した。このPCR産物を過剰のプライマーから取り出して精製し、制限エン
ドヌクレアーゼEcoRIおよびAgeIで消化し、ゲル精製し、そしてEco
RIおよびAgeIクローニング部位にて哺乳動物発現ベクターpMT21−m
yc3中にサブクローニングし、これにより、三重のmycタグをインフレーム
(in frame)で有するヒトDCR5 ORF(停止コドンなし)がもた
らされた。この配列を以下に示す:
【0054】
【化9】 この三重のmycタグは、クローニング目的に使用された唯一のAgeI部位
のすぐ3’で、このベクター中に含まれる。最終DNA構築物を、標準的な制限
分析およびジデオキシ配列決定により確認した。
のすぐ3’で、このベクター中に含まれる。最終DNA構築物を、標準的な制限
分析およびジデオキシ配列決定により確認した。
【0055】 ヒトDCR5−myc3タンパク質を、上記のpMT21/ヒトDCR5−m
yc3 DNA構築物を用いて一過的にトランスフェクトしたCOS7細胞中で
発現させた。このトランスフェクションを、製造業者により記載されるように、
Lipofectamine(Life Technologies,Inc.
)を使用して実行した。血清を含まない馴化培地を、トランスフェクションの2
日後に収集し、そして低速遠心分離により細胞片を除いた。EDTAを馴化培地
に添加して5mMの濃度にした。この馴化培地をアリコートし、そして−20℃
で貯蔵した。ヒトDCR5−myc3の発現を、mycタグに対する抗mycモ
ノクローナル抗体(9E10;1μg/ml)を使用して、標準的なウエスタン
ブロッティング技術により確認した。標準的な非還元条件下で、ヒトDCR5−
myc3は、およそ30,000の分子サイズを示し、これは、2つの潜在的な
N結合グリコシル化部位でのグリコシル化を説明する場合に、ヒトDCR5−m
yc3の推定分子サイズと一致する。
yc3 DNA構築物を用いて一過的にトランスフェクトしたCOS7細胞中で
発現させた。このトランスフェクションを、製造業者により記載されるように、
Lipofectamine(Life Technologies,Inc.
)を使用して実行した。血清を含まない馴化培地を、トランスフェクションの2
日後に収集し、そして低速遠心分離により細胞片を除いた。EDTAを馴化培地
に添加して5mMの濃度にした。この馴化培地をアリコートし、そして−20℃
で貯蔵した。ヒトDCR5−myc3の発現を、mycタグに対する抗mycモ
ノクローナル抗体(9E10;1μg/ml)を使用して、標準的なウエスタン
ブロッティング技術により確認した。標準的な非還元条件下で、ヒトDCR5−
myc3は、およそ30,000の分子サイズを示し、これは、2つの潜在的な
N結合グリコシル化部位でのグリコシル化を説明する場合に、ヒトDCR5−m
yc3の推定分子サイズと一致する。
【0056】 (実施例3) (ヒトDCR5は、BMP2およびBMP4に結合するが、他のBMPには結
合しない) ヒトDCR5−myc3(上記の、COS7細胞に由来する血清を含まない馴
化培地の1ml)を、2〜5μg/mlのヒトnogginタンパク質hNGΔ
B2(公開されたPCT出願公開番号WO99/03996(1999年1月2
8日公開され、そしてその全体が本明細書中で参考として援用される)に記載さ
れる)の非存在下または存在下で、ヒトBMP−2(1μg/ml)、またはヒ
トBMP−4(0.5μg/ml)(R&D Systems)、またはヒトB
MP−5(1μg/ml)(R&D Systems)、あるいはマウスNod
al(mBMP−16としても公知;X.laevis卵母細胞中で発現される 35 S−マウスNodalとして提供される)、またはヒトBMP−11(ヒトG
DF−11としても公知;X.laevis卵母細胞中で発現される35S−ヒト
BMP−11として提供される)と同時にインキュベートした。ヒトDCR5−
myc3と異なるBMPファミリーメンバーとの間の安定な複合体の形成を、プ
ロテインA Ultralink(Pierce)に結合した抗mycモノクロ
ーナル抗体(9E10;1μg/ml)を使用して、ヒトDCR5−myc3と
会合したタンパク質とを免疫沈降させることにより決定した。結合反応を、20
mM Tris pH 7.6、150mM NaCl、0.1% Tween
20(TBST)、および1mg/ml ウシ血清アルブミン(BSA)を含
む無血清馴化培地において実行した。結合を、プロテインA−Ultralin
k(Pierce)の懸濁を維持するために連続的に混合しながら、1.1ml
の反応容量中にて25℃で1時間進行させた。インキュベーションの後に、これ
らのビーズを、低速遠心分離によりペレットにして、TBSTで1回洗浄し、新
しいエッペンドルフチューブに移し、そしてTBSTでさらに3回洗浄した。こ
れらのビーズに結合したタンパク質を、25μlの標準的なLaemli SD
S−PAGEサンプル緩衝液の添加により可溶化し、そして標準的な還元条件下
で実行される、NuPAGE/MESの4〜12%の勾配ゲル(Novex)上
に充填した。その後、電気泳動されたタンパク質を、Immuobilon P
メンブラン上に移し、そして各々のそれぞれのタンパク質に対して惹起された抗
血清を使用して、ヒトBMP−2またはヒトBMP−4またはヒトBMP−5の
存在についてプローブした。
合しない) ヒトDCR5−myc3(上記の、COS7細胞に由来する血清を含まない馴
化培地の1ml)を、2〜5μg/mlのヒトnogginタンパク質hNGΔ
B2(公開されたPCT出願公開番号WO99/03996(1999年1月2
8日公開され、そしてその全体が本明細書中で参考として援用される)に記載さ
れる)の非存在下または存在下で、ヒトBMP−2(1μg/ml)、またはヒ
トBMP−4(0.5μg/ml)(R&D Systems)、またはヒトB
MP−5(1μg/ml)(R&D Systems)、あるいはマウスNod
al(mBMP−16としても公知;X.laevis卵母細胞中で発現される 35 S−マウスNodalとして提供される)、またはヒトBMP−11(ヒトG
DF−11としても公知;X.laevis卵母細胞中で発現される35S−ヒト
BMP−11として提供される)と同時にインキュベートした。ヒトDCR5−
myc3と異なるBMPファミリーメンバーとの間の安定な複合体の形成を、プ
ロテインA Ultralink(Pierce)に結合した抗mycモノクロ
ーナル抗体(9E10;1μg/ml)を使用して、ヒトDCR5−myc3と
会合したタンパク質とを免疫沈降させることにより決定した。結合反応を、20
mM Tris pH 7.6、150mM NaCl、0.1% Tween
20(TBST)、および1mg/ml ウシ血清アルブミン(BSA)を含
む無血清馴化培地において実行した。結合を、プロテインA−Ultralin
k(Pierce)の懸濁を維持するために連続的に混合しながら、1.1ml
の反応容量中にて25℃で1時間進行させた。インキュベーションの後に、これ
らのビーズを、低速遠心分離によりペレットにして、TBSTで1回洗浄し、新
しいエッペンドルフチューブに移し、そしてTBSTでさらに3回洗浄した。こ
れらのビーズに結合したタンパク質を、25μlの標準的なLaemli SD
S−PAGEサンプル緩衝液の添加により可溶化し、そして標準的な還元条件下
で実行される、NuPAGE/MESの4〜12%の勾配ゲル(Novex)上
に充填した。その後、電気泳動されたタンパク質を、Immuobilon P
メンブラン上に移し、そして各々のそれぞれのタンパク質に対して惹起された抗
血清を使用して、ヒトBMP−2またはヒトBMP−4またはヒトBMP−5の
存在についてプローブした。
【0057】 1つの例において、ヒトDCR5−myc3は、ヒトBMP−2に結合するこ
とが示された。この相互作用は、この結合反応に2μgのhNGΔB2を含ませ
ることによりブロックされた。この結果は、ヒトBMP−2とヒトDCR5−m
yc3との間の相互作用が特異的であることを示す。ヒトDCR5−myc3が
hNGΔB2の存在下または非存在下のいずれかにおいて結合反応中に含まれな
かった場合、ビーズに対するヒトBMP−2の結合は全く存在しなかった。
とが示された。この相互作用は、この結合反応に2μgのhNGΔB2を含ませ
ることによりブロックされた。この結果は、ヒトBMP−2とヒトDCR5−m
yc3との間の相互作用が特異的であることを示す。ヒトDCR5−myc3が
hNGΔB2の存在下または非存在下のいずれかにおいて結合反応中に含まれな
かった場合、ビーズに対するヒトBMP−2の結合は全く存在しなかった。
【0058】 別の例において、ヒトBMP−4に結合するヒトDCR5−myc3の能力を
試験した。ヒトDCR5−myc3は、ヒトBMP−4を結合し得た。さらに、
ヒトDCR5−myc3とのヒトBMP−4の相互作用を、hNGΔB2(5μ
g)の添加によりブロックした。ヒトBMP−2について上記のように、ヒトD
CR5−myc3がhNGΔB2の存在または非存在下のいずれかにおいて、反
応混合液から除かれる場合、ビーズに対するヒトBMP−4の結合は、全く存在
しなかった。E.Coli中に発現され、精製されかつ再折り畳みされたヒトD
CR5(前出を参照のこと)を、hBMP−4に対する結合について、ヒトDC
R5−myc3と競合するその能力について試験した。E.coliで発現され
、精製されかつ再折り畳みされた5μgのヒトDCR−5を含むことは、hBM
P−4へのヒトDCR5−myc3の結合をブロックし得。、このことは、この
再折り畳みされたヒトDCR−5が活性であることを示す。
試験した。ヒトDCR5−myc3は、ヒトBMP−4を結合し得た。さらに、
ヒトDCR5−myc3とのヒトBMP−4の相互作用を、hNGΔB2(5μ
g)の添加によりブロックした。ヒトBMP−2について上記のように、ヒトD
CR5−myc3がhNGΔB2の存在または非存在下のいずれかにおいて、反
応混合液から除かれる場合、ビーズに対するヒトBMP−4の結合は、全く存在
しなかった。E.Coli中に発現され、精製されかつ再折り畳みされたヒトD
CR5(前出を参照のこと)を、hBMP−4に対する結合について、ヒトDC
R5−myc3と競合するその能力について試験した。E.coliで発現され
、精製されかつ再折り畳みされた5μgのヒトDCR−5を含むことは、hBM
P−4へのヒトDCR5−myc3の結合をブロックし得。、このことは、この
再折り畳みされたヒトDCR−5が活性であることを示す。
【0059】 BMPファミリーの他のメンバーに結合するヒトDCR−5の能力もまた試験
した。この結果は、以下の通りである:hDCR−5は、ヒトBMP−5、マウ
スNodal(mBMP−16)、またはヒトBMP−11(GDF−11とし
ても知られる)を結合しない。これらのBMPとの相互作用の欠如は、ヒトDC
R−5がBMP−2およびBMP−4の特異的アンタゴニストであるさらなる証
拠を提供する。しかし、ヒトDCR−5が他のBMPファミリーのメンバーに結
合し、かつその活性をブロックする可能性は、排除され得ない。
した。この結果は、以下の通りである:hDCR−5は、ヒトBMP−5、マウ
スNodal(mBMP−16)、またはヒトBMP−11(GDF−11とし
ても知られる)を結合しない。これらのBMPとの相互作用の欠如は、ヒトDC
R−5がBMP−2およびBMP−4の特異的アンタゴニストであるさらなる証
拠を提供する。しかし、ヒトDCR−5が他のBMPファミリーのメンバーに結
合し、かつその活性をブロックする可能性は、排除され得ない。
【0060】 (実施例4) (ヒトDCR5 E.Coli発現プラスミドpRG764の構築) ヒトDCR5の遺伝子をコードするDNAフラグメントを、テンプレートとし
てプラスミドpCAE626(上記)および増幅プライマーとして以下のオリゴ
ヌクレオチドを使用して標準的な技術によりPCR増幅した:
てプラスミドpCAE626(上記)および増幅プライマーとして以下のオリゴ
ヌクレオチドを使用して標準的な技術によりPCR増幅した:
【0061】
【化10】 得られた472bpのフラグメントは、SEQ ID NO:11のヌクレオ
チド64〜504に加えて、クローニングのためのさらなる配列(前出のオリゴ
ヌクレオチドプライマー配列に下線を付した)を含み、そしてシグナル配列切断
部位後の第1のアミノ酸であるとコンピューター分析により決定された、SEQ
ID NO:12の22位のアルギニンで開始する成熟ヒトDCR5遺伝子を
コードする。E.coliでのクローニングを容易にするために、ヒトDCR5
をコードする配列を、クローニングのためにAfl III制限部位を導入した
メチオニンおよびセリンのコドンに先行させた。ヒトDCR5配列の25位およ
び27位のアルギニンおよびアラニンのコドンを、それぞれ、CGGおよびGC
GからCGTおよびGCTに変化させて、翻訳開始部位に近接する配列のGC含
量を減少させた。これらの変化は、サイレント変異であり、そしてアミノ酸配列
を変更しない。得られたDNAフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼAfl
IIIで消化し、次いで、標準的な技術を使用して、E.coli発現プラス
ミドpRG663中のNcoIおよびEag1クローニング部位中に連結した。
pRG764と命名された得られたプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子をコ
ードする高コピー数のプラスミドにおいて、T7 F1.1プロモーターの転写
制御下にヒトDCR5遺伝子を含む。このプラスミドを、当業者に公知の標準的
技術を使用する制限酵素分析およびDNA配列決定により確認した。
チド64〜504に加えて、クローニングのためのさらなる配列(前出のオリゴ
ヌクレオチドプライマー配列に下線を付した)を含み、そしてシグナル配列切断
部位後の第1のアミノ酸であるとコンピューター分析により決定された、SEQ
ID NO:12の22位のアルギニンで開始する成熟ヒトDCR5遺伝子を
コードする。E.coliでのクローニングを容易にするために、ヒトDCR5
をコードする配列を、クローニングのためにAfl III制限部位を導入した
メチオニンおよびセリンのコドンに先行させた。ヒトDCR5配列の25位およ
び27位のアルギニンおよびアラニンのコドンを、それぞれ、CGGおよびGC
GからCGTおよびGCTに変化させて、翻訳開始部位に近接する配列のGC含
量を減少させた。これらの変化は、サイレント変異であり、そしてアミノ酸配列
を変更しない。得られたDNAフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼAfl
IIIで消化し、次いで、標準的な技術を使用して、E.coli発現プラス
ミドpRG663中のNcoIおよびEag1クローニング部位中に連結した。
pRG764と命名された得られたプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子をコ
ードする高コピー数のプラスミドにおいて、T7 F1.1プロモーターの転写
制御下にヒトDCR5遺伝子を含む。このプラスミドを、当業者に公知の標準的
技術を使用する制限酵素分析およびDNA配列決定により確認した。
【0062】 (実施例5) (ヒトDCR5タンパク質のE.coliでの発現、精製および再折り畳み) プラスミドpRG764(上記)を、標準的な形質転換技術を使用して、原栄
養菌E.coli K12発現株RFJ143中に形質転換した。株RFJ14
3は、lacUV5プラスミドの転写制御下で、ファージT7 RNAポリメラ
ーゼを発現する。pRG764プラスミドを含有するE.coli株RFJ14
3を、1ml当たり20μgのカナマイシン加えたLB培地中で増殖させた。ヒ
トDCR5タンパク質の発現を、1mM IPTGの添加により誘導した。誘導
された細胞を、10,000gでの10分間の遠心分離により収集し、10容量
の100mM Tris−HCl、pH8.5、20mM EDTA中に再懸濁
し、そしてNiro−Soave Panda細胞崩壊器(cell disr
upter)を通じて通過させることにより溶解した。この細胞溶解物を、10
,000gで10分間遠心分離し、そしてペレットを、10容量の8M グアニ
ジン−HCl、50mM Tris−HCl、pH8.5、1mM EDTA、
100mM Na2SO3、10mM Na2S4O6中に再懸濁し、そして室温で
16時間攪拌した。溶化された封入体を、8M尿素、50mM MES、pH6
.0、200mM NaCl、1mM EDTAで平衡化したSephacry
l S−300カラム(Pharmacia)上で分画した。ヒトDCR5を含
有する画分をプールし、そして4容量の緩衝液(6M尿素、20mM MES、
pH6.0を含む)で希釈した。希釈したヒトDCR5プールを、6M尿素、2
0mM MES、pH6.0で平衡化したSP−Sepharoseイオン交換
カラム(Pharmacia)上に充填し、次いで、6M 尿素、20mM M
ES、pH6.0中の0〜1M NaClの範囲の線形勾配により溶出した。精
製されたヒトDCR5を含む画分をプールし、次いで、50mM Tris−H
Cl、pH8.5を用いて約0.1mg/mlのヒトDCR5に希釈した。シス
テインを添加して0.5mMにして、NaClを添加して1Mにした。この再折
り畳み混合液を、穏やかに攪拌しながら、4℃で5日間インキュベートした。再
折り畳みされたヒトDCR5を収集し、そしてH2O中0.1% TFA〜アセ
トニトリル中0.1% TFAの線形勾配で実行した、Phenomenex
Jupiter C5カラム上での逆相クロマトグラフィーにより精製した。再
折り畳みされたヒトDCR5を含む画分をプールし、減圧下で乾燥させ、そして
PBSに再懸濁した。
養菌E.coli K12発現株RFJ143中に形質転換した。株RFJ14
3は、lacUV5プラスミドの転写制御下で、ファージT7 RNAポリメラ
ーゼを発現する。pRG764プラスミドを含有するE.coli株RFJ14
3を、1ml当たり20μgのカナマイシン加えたLB培地中で増殖させた。ヒ
トDCR5タンパク質の発現を、1mM IPTGの添加により誘導した。誘導
された細胞を、10,000gでの10分間の遠心分離により収集し、10容量
の100mM Tris−HCl、pH8.5、20mM EDTA中に再懸濁
し、そしてNiro−Soave Panda細胞崩壊器(cell disr
upter)を通じて通過させることにより溶解した。この細胞溶解物を、10
,000gで10分間遠心分離し、そしてペレットを、10容量の8M グアニ
ジン−HCl、50mM Tris−HCl、pH8.5、1mM EDTA、
100mM Na2SO3、10mM Na2S4O6中に再懸濁し、そして室温で
16時間攪拌した。溶化された封入体を、8M尿素、50mM MES、pH6
.0、200mM NaCl、1mM EDTAで平衡化したSephacry
l S−300カラム(Pharmacia)上で分画した。ヒトDCR5を含
有する画分をプールし、そして4容量の緩衝液(6M尿素、20mM MES、
pH6.0を含む)で希釈した。希釈したヒトDCR5プールを、6M尿素、2
0mM MES、pH6.0で平衡化したSP−Sepharoseイオン交換
カラム(Pharmacia)上に充填し、次いで、6M 尿素、20mM M
ES、pH6.0中の0〜1M NaClの範囲の線形勾配により溶出した。精
製されたヒトDCR5を含む画分をプールし、次いで、50mM Tris−H
Cl、pH8.5を用いて約0.1mg/mlのヒトDCR5に希釈した。シス
テインを添加して0.5mMにして、NaClを添加して1Mにした。この再折
り畳み混合液を、穏やかに攪拌しながら、4℃で5日間インキュベートした。再
折り畳みされたヒトDCR5を収集し、そしてH2O中0.1% TFA〜アセ
トニトリル中0.1% TFAの線形勾配で実行した、Phenomenex
Jupiter C5カラム上での逆相クロマトグラフィーにより精製した。再
折り畳みされたヒトDCR5を含む画分をプールし、減圧下で乾燥させ、そして
PBSに再懸濁した。
【0063】 本明細書に引用される全ての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物ま
たは特許出願が参考として援用されることが詳細かつ個別に示されるのと同様に
、参考として本明細書中に援用される。前述の発明は、理解の明瞭さの目的のた
めに例証および例示によっていくらか詳細に記載されているが、特定の変化およ
び改変が、添付の特許請求の精神または範囲から逸脱することなく本発明に対し
てなされ得ることは、本発明の教示を鑑みて当業者に容易に明らかである。
たは特許出願が参考として援用されることが詳細かつ個別に示されるのと同様に
、参考として本明細書中に援用される。前述の発明は、理解の明瞭さの目的のた
めに例証および例示によっていくらか詳細に記載されているが、特定の変化およ
び改変が、添付の特許請求の精神または範囲から逸脱することなく本発明に対し
てなされ得ることは、本発明の教示を鑑みて当業者に容易に明らかである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 19/08 C07K 16/18 4C084 C07K 14/47 19/00 4C085 16/18 C12N 1/19 4H045 19/00 1/21 C12N 1/19 C12P 21/02 C 1/21 G01N 33/15 Z 5/10 33/50 T 15/02 Z C12P 21/02 33/53 D G01N 33/15 33/577 B 33/50 C12P 21/08 C12Q 1/68 A 33/53 (C12P 21/02 C 33/577 C12R 1:19) // C12P 21/08 C12N 15/00 ZNAA C12Q 1/68 5/00 B (C12P 21/02 C C12R 1:19) A61K 37/02 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CR, CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI,G B,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL ,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ, LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,M G,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT ,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL, TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,V N,YU,ZA,ZW (72)発明者 スタハル, ネイル アメリカ合衆国 ニューヨーク 10512, カーメル, ケント ショアー ドライ ブ, アールディー ナンバー10 Fターム(参考) 2G045 AA34 AA35 AA40 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 HA12 4B063 QA13 QA18 QA19 QQ43 QR32 QR55 QR62 QS25 QS34 4B064 AG01 AG27 CA02 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA72X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 BA01 BA08 BA22 CA18 CA53 DB60 NA14 ZA962 4C085 AA13 AA14 BB31 CC22 CC23 EE01 KA03 KA04 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 DA76 EA20 EA50 FA72 FA73 FA74 GA15 GA23 GA25
Claims (21)
- 【請求項1】 ヒトDCR5をコードする、単離された核酸分子。
- 【請求項2】 請求項1に記載の単離された核酸分子であって、該単離され
た核酸分子は、以下: (a)SEQ ID NO:11に示される前記ヒトDCR5のコード領域を
含む、ヌクレオチド配列; (b)ストリンジェントな条件下で、(a)のヌクレオチド配列にハイブリダ
イズし、かつ該ヒトDCR5の生物学的活性を有する分子をコードする、ヌクレ
オチド配列;または (c)遺伝コードの縮重の結果として、(a)または(b)の核酸とは異なり
、かつヒトDCR5をコードする、ヌクレオチド配列、 からなる群より選択される配列を有する、単離された核酸分子。 - 【請求項3】 請求項1または2に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 【請求項4】 前記核酸分子が、宿主細胞中でその発現を指向し得る発現制
御配列に作動可能に連結されている、請求項3に記載のベクター。 - 【請求項5】 プラスミドである、請求項3または4に記載のベクター。
- 【請求項6】 単離されたヒトDCR5タンパク質。
- 【請求項7】 SEQ ID NO:12に示されるアミノ酸配列を有する
、単離されたヒトDCR5タンパク質。 - 【請求項8】 請求項3、4、または5に記載のベクターを宿主細胞中に含
む、ヒトDCR5の産生のための宿主−ベクター系。 - 【請求項9】 前記宿主細胞が細菌性細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳
動物細胞である、請求項8に記載の宿主−ベクター系。 - 【請求項10】 前記ヒトDCR5の産生を可能にする条件下で、請求項8
または9に記載の宿主−ベクター系の細胞を増殖させる工程、およびそのように
産生された該ヒトDCR5を回収する工程を包含する、ヒトDCR5を産生する
方法。 - 【請求項11】 請求項6または7に記載のヒトDCR5を特異的に結合す
る、抗体。 - 【請求項12】 モノクローナル抗体である、請求項11に記載の抗体。
- 【請求項13】 請求項6または7に記載のヒトDCR5、およびキャリア
を含む、組成物。 - 【請求項14】 請求項11または12に記載の抗体、およびキャリアを含
む、組成物。 - 【請求項15】 ヒトまたは動物の身体の処置の方法における、または診断
の方法における使用のための、請求項6または7に記載のヒトDCR5、請求項
11または12に記載の抗体、あるいは請求項13または14に記載の組成物。 - 【請求項16】 請求項10に記載の方法により産生される、ポリペプチド
。 - 【請求項17】 イムノグロブリン定常領域に融合されたヒトDCR5を含
む、リガンド体。 - 【請求項18】 前記イムノグロブリン定常領域がヒトIgG1のFc部分
である、請求項17に記載のリガンド体。 - 【請求項19】 ヒトまたは動物の身体の処置の方法における、または診断
の方法における使用のための、請求項17または18に記載のリガンド体。 - 【請求項20】 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SE
Q ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SE
Q ID NO:7およびSEQ ID NO:9からなる群より選択されるヌ
クレオチド配列を含む、単離された核酸。 - 【請求項21】 請求項15に記載のヒトDCR5、または抗体、あるいは
組成物を投与する工程を包含する、軟骨および骨の成長を調節する方法。
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---|---|---|---|
US9729698P | 1998-08-20 | 1998-08-20 | |
US60/097,296 | 1998-08-20 | ||
PCT/US1999/017979 WO2000011163A1 (en) | 1998-08-20 | 1999-08-12 | Dcr5, a bmp-binding protein, and applications thereof |
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