JP2002523042A

JP2002523042A - Ｄｃｒ５、ｂｍｐ結合タンパク質、およびそれらの適用

Info

Publication number: JP2002523042A
Application number: JP2000566417A
Authority: JP
Inventors: アリスエヌ．エコノミデス，; ネイルスタハル，
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-08-20
Filing date: 1999-08-12
Publication date: 2002-07-30
Also published as: US20040106134A1; AU5471299A; US6846908B2; EP1105477A1; CA2339968A1; IL141330A0; US6660499B1; WO2000011163A1

Abstract

(57)【要約】ＤＣＲ５（ＤＡＮに関連するタンパク質（神経芽細胞種において示差的なスクリーニングにより選択された異常遺伝子））、および関連する核酸が提供される。いくつかの種に由来する天然ＤＣＲ５ホモログおよび特異的活性（特に、骨形成タンパク質をアンタゴナイズする能力）を有するＤＣＲ５ドメインが含まれる。これらのタンパク質は、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞から組換え産生され得る。開示された遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る単離されたハイブリダイゼーションプローブおよびプライマー、特異的な結合因子、ならびに本発明の組成物を作製および使用する方法もまた、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、１９９８年８月２０日に出願された米国出願第６０／０９７，２９６
号（この内容は、本出願に参考として援用される）の優先権を主張する。

【０００２】（発明の分野）本発明の分野は、細胞機能を調節するタンパク質、および特に骨形成タンパク
質をアンタゴナイズするタンパク質である。

【０００３】（背景）細胞増殖、分化および機能の天然のレギュレーターは、重要な薬学的ツール、
臨床的ツールおよび実験室的ツール、ならびに治療介入についての標的を提供し
た。種々のこのようなレギュレーターは、基本的な細胞の分化および発生経路に
対して顕著な効果を有することが示されている。例えば、最近クローニングされ
たｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質は、脊椎動物の胚の内胚葉前部における頭部構造
の形成を誘導する。同様に、Ｎｏｇｇｉｎタンパク質は、脊椎動物の胚において
、頭部構造を誘導し、そして腹面運命（例えば、血液および間葉）から背面運命
（例えば、筋肉および脊索）に、中胚葉運命を再び指向し得、そして前部神経運
命に上皮運命を再び指向し得る。Ｃｈｏｒｄｉｎの活性は、Ｎｏｇｇｉｎの活性
と同様であり、このことは、共通の作用機構（すなわち、骨形成タンパク質（Ｂ
ＭＰ）をアンタゴナイズし、それによってそれらの機能を妨げること）を反映し
ている。ＢＭＰは、異なる生物学的状況において多様な生物学的活性（軟骨、骨
および結合組織の誘導、ならびに腎臓、歯、腸、皮膚および髪の発達における役
割を含む）を有する。

【０００４】ＴＧＦβスーパーファミリーの異なるメンバーは、細胞が異なる運命に従うよ
うに支持し得、例えば、ＴＧＦβは、神経堤が平滑筋を形成するように誘導し、
一方、ＢＭＰ２は、この同じ細胞がニューロンになるように誘導する。Ｘｅｎｏ
ｐｕｓの実験では、解離した動物キャップ細胞（ｃａｐ細胞）（予期外胚葉）は
、ＢＭＰ４に応答すると表皮になるが、アクチビンに応答すると中胚葉になる。

【０００５】アクチビンとＢＭＰ４との間の配列同一性は低いので、それらが、異なる運命
を誘導することは驚きではない。非常に密接に関連した配列であるＢＭＰスーパ
ーファミリーのメンバーが、異なる運命を誘導し得ることがより驚きである。著
しい例は、ＢＭＰが染み込んだマトリクスを筋肉内に移植することから生じる。
この効果が組織学的にモニターされる場合、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４およびＢＭＰ７
は、軟骨内の骨形成を誘導し、一方、関連する分子であるＢＭＰ１２／ＧＤＦ７
は、腱に類似する結合組織を誘導する。同様に、ＢＭＰ４は、菱脳の神経堤にお
ける細胞死を誘導し得、一方、関連するタンパク質であるｄｏｒｓａｌｉｎは、
誘導しない。

【０００６】異なるＢＭＰファミリーメンバーは、異なる運命を誘導し得るので、次いで、
ＢＭＰのサブセットをブロックする際に特異性を有するＢＭＰアンタゴニストは
、細胞に提示されるＢＭＰの平衡を変化させ得、それによって細胞運命を変更さ
せる。ヒトの健康および疾患における相対的なＢＭＰ発現の重要性に鑑みれば、
細胞機能およびＢＭＰ機能のレギュレーター、特に例えば、Ｎｏｇｇｉｎおよび
ｃｅｒｅｂｅｒｕｓは、臨床適用および生物工学的適用の宿主に価値ある試薬を
提供する。本発明は、細胞機能のレギュレーターの新規なファミリーに関する。

【０００７】（関連文献）Ｂｏｕｗｍｅｅｓｔｅｒら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８２：５９５〜６０
１は、Ｘｅｎｏｐｕｓのｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子のクローニングを記載する；Ｌ
ａｍｂ，Ｔ．Ｍ．ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：７１３〜７１８；Ｓ
ｍｉｔｈ，Ｗ．Ｃ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ７０：８２９〜８４０；Ｓｍｉｔ
ｈ，Ｗ．Ｃ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６１：５４７〜５４９；およびＺ
ｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｂ．ら（１９９６）Ｃｅｌｌ８６：５９９〜６０６は
、Ｎｏｇｇｉｎタンパク質の単離および機能を記載する。Ｐｉｃｃｏｌｏ，Ｓ．
ら（１９９６）Ｃｅｌｌ８６：５８９〜５９８；Ｓａｓａｉ，Ｙ．ら（１９９
５）Ｎａｔｕｒｅ３７６：３３３〜３３６；およびＳａｓａｉ，Ｙ．ら（１９
９４）Ｃｅｌｌ７９：７７９〜７９０は、ｃｈｏｒｄｉｎタンパク質に関する
。Ｅｎｏｍｏｔｏら（１９９４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ９：２７８５〜２７９１お
よびＯｚａｋｉら（１９９６）Ｊｐｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．８７：５８
〜６１は、ＤＡＮ遺伝子のヒトホモログおよびマウスホモログを記載する。Ｈｓ
ｕら（１９９８）ＭｏｌＣｅｌｌ１：６７３〜６８３は、種々の種（ヒトを
含む）に由来するＧｒｅｍｌｉｎを記載し；Ｍｉｎａｂｅ−Ｓａｅｇｕｓａ，Ｃ
．ら（１９９８）ＤｅｖＧｒｏｗｔｈＤｉｆｆｅｒ４０：３４３〜３５３
は、マウスＰＲＤＣを記載する。

【０００８】（発明の要旨）本発明は、ＤＣＲ５（Ｇｒｅｍｌｉｎに関連するタンパク質）、ＤＡＮ（神経
芽細胞腫において示差的なスクリーニングにより選択された異常遺伝子およびＣ
ｅｒｂｅｒｕｓ、ならびに関連する核酸に関する方法ならびに組成物を提供する
。異なる種由来の天然のＤＣＲ５ホモログ、ならびにＤＣＲ５ドメインを含みか
つＤＣＲ５特異的活性（特に、骨形成タンパク質をアンタゴナイズする能力）を
有するタンパク質が、含まれる。このタンパク質は、本発明の核酸で形質転換さ
れた宿主細胞から組換え産生され得る。本発明は、開示された遺伝子に特異的に
ハイブリダイズし得る単離されたハイブリダイゼーションプローブおよびプライ
マー、特異的な結合因子（例えば、特異的な抗体）、ならびに診断（例えば、Ｄ
ＣＲ５転写物に対する遺伝子ハイブリダイゼーションスクリーニング）、治療（
例えば、ＤＣＲ５遺伝子発現を調節する遺伝子治療）、および生物薬学的産業（
例えば、薬理学的リード物質についての化学ライブラリーをスクリーニングする
ための試薬）において、本発明の組成物を作製および使用する方法を提供する。

【０００９】本発明のＤＣＲ５タンパク質の好ましい適用は、外因性ＤＣＲ５タンパク質が
、培地の成分および／または細胞外表面と特異的と相互作用して細胞の生理に変
化をもたらす条件下で、細胞または細胞の周囲の培地とこの添加された外因性Ｄ
ＣＲ５タンパク質とを接触させることによって、細胞外表面を含む細胞の生理を
改変することを包含する。生物学的に活性な因子をスクリーニングするための方
法もまた、好ましく、この方法は、細胞外ＤＣＲ５タンパク質特異的結合標的お
よび候補因子の存在下で、その因子がなければこのタンパク質が参照アフィニテ
ィーで結合標的に特異的に結合する条件下で、ＤＣＲ５タンパク質をインキュベ
ートすること；この結合標的に対するこのタンパク質の結合アフィニティーを検
出し、因子に対して偏りのある（ａｇｅｎｔ−ｂｉａｓｅｄ）アフィニティーを
決定することであって、因子に対して偏りのあるアフィニティーと参照アフィニ
ティーとの間の差異は、この因子が結合標的に対するこのタンパク質の結合を調
節することを示す、ことを包含する。

【００１０】本発明の別の好ましい実施態様は、ヒトＤＣＲ５ポリペプチドの治療用量を投
与することによって、ヒトまたは動物の身体を処置（ここで処置は、軟骨および
骨の成長の調節である）する方法である。

【００１１】本発明のさらなる好ましい実施態様は、イムノグロブリン定常領域に融合され
たヒトＤＣＲ５を含むリガンド体（ｌｉｇａｎｄｂｏｄｙ）であり、ここでイム
ノグロブリン定常領域は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分である。

【００１２】好ましい実施態様において、リガンド体は、ヒトまたは動物の身体を処置する
方法において、または診断方法において使用され得る。

【００１３】（発明の詳細な説明）本発明は、天然ＤＣＲタンパク質およびＤＣＲ５アミノ酸配列を含む組換えタ
ンパク質を含むＤＣＲ５タンパク質、またはアッセイで判別可能なＤＣＲ５特異
的活性を有するそれらの機能的ＤＣＲ５タンパク質ドメインを提供する。従って
、これらのタンパク質は、開示された天然ＤＣＲ５タンパク質の欠失変異体であ
り得、そして例えば、非ＤＣＲ５ポリペプチドとの融合産物として提供され得る
。本発明のＤＣＲ５タンパク質のドメインは、ＤＣＲ５特異的な活性または機能
を有し、そして互いにおよびＤＡＮホモログ、ｃｅｒｂｅｒｕｓホモログ、Ｇｒ
ｅｍｌｉｎホモログおよびＮｏｇｇｉｎホモログとは機能的に異なる。このよう
なドメインは、天然ＤＣＲ５タンパク質の少なくとも６個および好ましくは少な
くとも８個の連続する残基を含む（Ｅｎｏｍｏｔｏら（１９９４）Ｏｎｃｏｇｅ
ｎｅ９：２７８５〜２７９１により報告されるＤＡＮ配列を参照のこと）。好
ましいＤＣＲ５タンパク質は、種間で保存されるＤＣＲ５配列を含む。

【００１４】本明細書中に記載されるＤＣＲ５タンパク質は、それらが特定の形態発生タン
パク質（例えば、ＢＭＰ）のアンタゴニストとして細胞外で活性であるという点
で、ＤＡＮおよびＣｅｒｂｅｒｕｓに構造的かつ機能的に関連する。ＤＣＲ５特
異的な活性または機能は、簡便なインビトロでの細胞ベースのアッセイまたはイ
ンビボでのアッセイ（例えば、インビトロでの結合アッセイ、細胞培養アッセイ
、動物においてなど）（例えば、免疫応答、遺伝子治療、トランスジェニックな
ど）などによって決定され得る。結合アッセイは、ＤＣＲ５タンパク質と結合標
的との特異的分子相互作用が評価される任意のアッセイを包含する。この結合標
的は、天然の結合標的（例えば、ＴＧＦβタンパク質、形態発生タンパク質、好
ましくは骨形成タンパク質（ＢＭＰ２またはＢＭＰ４）、シャペロン、またはＤ
ＣＲ５活性またはその局在を直接的に調節する他のレギュレーター）；あるいは
非天然結合標的（例えば、特異的免疫応答タンパク質（例えば、抗体）、または
以下に記載されるアッセイにおいて同定されるようなＤＣＲ５特異的因子であり
得る。一般に、結合特異性は、バイオアッセイ（例えば、注入された胚の外胚葉
からニューロン組織を誘導する能力）によって、ＴＧＦβタンパク質結合の平衡
定数（通常、少なくとも約１０⁷Ｍ^-1、好ましくは少なくとも約１０⁸Ｍ^-1、より
好ましくは少なくとも約１０⁹Ｍ^-1）によって、本発明のタンパク質が、ＤＣＲ
５発現細胞におけるネガティブな変異体として機能する能力、異種宿主（例えば
、げっ歯類またはウサギ）におけるＤＣＲ５特異的抗体を誘発する能力によって
などで、アッセイされる。

【００１５】本願のタンパク質は、単離されてい得るか、または、純粋であり得る。「単離
された」タンパク質は、その天然の状態で会合しているいくつかの物質をもはや
付随せず、そして好ましくは所定のサンプル中で総タンパク質の好ましくは少な
くとも約０．５重量％、およびより好ましくは少なくとも約５重量％を構成する
ものである；「純粋な」タンパク質は、所定のサンプル中で総タンパク質の少な
くとも約９０重量％、および好ましくは少なくとも約９９重量％を構成する。本
発明のタンパク質およびタンパク質ドメインは、合成され得るか、組換え技術に
より産生され得るか、または細胞から精製され得る。広範な種々の分子方法およ
び生化学方法が、本発明の組成物の生化学的合成、分子の発現および精製に利用
可能である（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉ
ｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参
照のこと）。

【００１６】本発明のタンパク質は、免疫原、スクリーニングアッセイにおける標的、細胞
増殖、分化および／または機能を調節するための生物活性試薬などとしての使用
を含む、広範な種々の使用を見出す。例えば、本発明は、細胞外表面を含む細胞
の生理を改変するための方法を提供し、この方法は、外因性ＤＣＲ５タンパク質
が培地の成分および／または細胞外表面と特異的に相互作用し、細胞の生理の変
化をもたらす条件下で、この添加されたタンパク質と細胞または細胞の周囲の培
地とを接触させることによる。これらの方法に従って、この細胞外表面は、原形
質膜会合レセプターを含み；この外因性ＤＣＲ５は、細胞により作製されないタ
ンパク質をいい、すなわちそのような場合、非天然のレベル、時間または生理学
的位置にて発現され；そして適切な培地は、インビトロの培養培地および生理学
的流体（例えば、血液、滑液）などを含む。本発明のタンパク質の効果的な投与
は、所望されない（例えば、異所性の）骨形成を減少させるため、形態発生タン
パク質を必要とする細胞（例えば、ＢＭＰ依存性神経芽細胞種および神経膠腫）
の成長を阻害するため、移植または注入のための細胞を含むような培養物中のモ
ルフォゲン依存性細胞運命／分化を変更するためなどに使用され得る。これらの
タンパク質は、マイクロインジェクション、組換え酵素のプロモーター特異的発
現、脂質小胞の標的化送達などのような任意の従来の方法により、細胞の特定の
集団に導入、発現、または抑制され得る。

【００１７】本発明は、天然および非天然のＤＣＲ５特異的結合因子、このような因子を道
程および作製する方法、および診断、治療および薬学的発達におけるそれらの使
用を提供する。ＤＣＲ５特異的結合因子には、ＤＣＲ５特異的リガンド（例えば
、ＢＭＰ）、およびレセプター（例えば、特異的抗体またはＴ細胞レセプターの
ような体細胞的に組換えられたタンパク質レセプター）が挙げられ（例えば、Ｈ
ａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）、そしてまた、ワンハイブリッドスクリーニング、ツーハイブリ
ッドスクリーニング、スリーハイブリッドスクリーニングのようなアッセイで同
定された他の天然の結合因子、および以下に記載されるような化学ライブラリー
のスクリーニングにおいて同定された非天然の結合因子が挙げられる。特に興味
深い因子は、ＤＣＲ５機能を調節する。

【００１８】本発明は、ＤＣＲ５核酸を提供し、これは、翻訳可能な転写物、ハイブリダイ
ゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、診断用核酸などのような使用、ならび
にＤＣＲ５遺伝子および遺伝子転写物の存在の検出での使用、およびさらなるＤ
ＣＲ５ホモログおよび構造アナログをコードする核酸の検出および増幅での使用
を含む、広範な種々の適用を見出す。

【００１９】本発明の核酸は、合成／非天然の配列であり、そして／または単離されており
、すなわち、その天然の状態において会合しているいくらかの物質がもはや付随
しておらず、好ましくは、所定の画分中に存在する総核酸のうちの少なくとも約
０．５重量％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成し、そして通常は、
組換え体であり、このことは、これらが、天然の染色体上で結合されている以外
のヌクレオチドに結合されている非天然配列または天然配列を含むことを意味す
る。ＳＥＱＩＤＮＯ：１１のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含
む核酸は、天然の染色体上に結合している配列以外の配列が直に隣接するか、ま
たは天然の染色体上に結合している配列以外の配列が直に隣接する、１０ｋｂ未
満、好ましくは２ｋｂ未満、の天然の隣接領域により隣接される、このような配
列またはフラグメントを末端にて含む。これらの核酸は、通常、ＲＮＡまたはＤ
ＮＡであるが、これは、しばしば、改変された安定性などを提供する他の塩基ま
たは核酸アナログを含む核酸を使用するために有利である。

【００２０】開示されたＤＣＲ５タンパク質のアミノ酸配列は、選択された発現系に最適化
されたＤＣＲ５タンパク質をコードする核酸を逆翻訳するために使用されるか（
Ｈｏｌｌｅｒら（１９９３）Ｇｅｎｅ１３６：３２３〜３２８；Ｍａｒｔｉｎ
ら（１９９５）Ｇｅｎｅ１５４：１５０〜１６６）または天然のＤＣＲ５をコ
ードする核酸配列の単離における使用のために縮重オリゴヌクレオチドプライマ
ーおよびプローブを作製するために使用される（「ＧＣＧ」ソフトウェア、Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ
Ｉ）。ＤＣＲ５をコードする核酸は、発現ベクターの一部であり得、そして例え
ば、発現およびスクリーニングのため、トランスジェニック動物のため、機能研
究のため（ＤＣＲ５媒介シグナル伝達と関連する進化に対する候補薬物の効率）
などのために、組換え宿主細胞中に組み込まれ得る。発現系は、選択的翻訳後プ
ロセシングを通じて、ＤＣＲ５タンパク質の構造改変体および機能改変体をもた
らすように選択および／またはあつらえられる。

【００２１】本発明はまた、ＤＣＲ５ｃＤＮＡ特異的配列を有し、かつＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１１との特異的なハイブリダイゼーションをもたらすに十分な核酸ハイブリ
ダイゼーションプローブおよび複製／増幅プライマーを提供する。特異的ハイブ
リダイゼーションの実証は、一般に、ストリンジェントな条件を必要とする（例
えば、５×ＳＳＰＥ（０．１８ＭＮａＣｌ、０．０１ＭＮａＰＯ₄，ｐＨ７
．７，０．００１ＭＥＤＴＡ）緩衝液中に３０％ホルムアミドを含む緩衝液中
で４２℃でハイブリダイズさせ、そして０．２×ＳＳＰＥで４２℃での洗浄に供
される場合に残っている結合；好ましくは、５×ＳＳＰＥ緩衝液中に５０％ホル
ムアミドを含む緩衝液中で４２℃の温度でハイブリダイズさせ、そして０．２×
ＳＳＰＥ緩衝液での４２℃での洗浄に供される場合に残っている結合）。ＤＣＲ
５ｃＤＮＡホモログはまた、アライメントアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ
Ｘ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍ
ｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４
２１０）を使用して他のタンパク質から区別され得る。

【００２２】ＤＣＲ５ハイブリダイゼーションプローブは、臨床サンプルおよび実験室サン
プル中の野生型および変異対立遺伝子の同定における使用を見出す。変異対立遺
伝子は、ハイスループット臨床診断のために、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオ
チド（ＡＳＯ）プローブを作製するために使用される。ＤＣＲ５核酸はまた、活
性ＤＣＲ５の細胞発現または細胞内濃度またはアベイラビリティーを調節するた
めに使用される。ＤＣＲ５阻害核酸は、代表的には、開示された天然のＤＣＲ５
をコードする配列の相補体を含む、アンチセンスの一本鎖配列である。所定のＤ
ＣＲ５タンパク質の発現のアンチセンス調節は、遺伝子調節配列に作動可能に連
結されたアンチセンス核酸を用い得る。細胞は、配向されたプロモーター配列と
ともにＤＣＲ５配列を含むベクターでトランスフェクトされ、その結果、この遺
伝子の転写は、内因性ＤＣＲ５をコードするｍＲＮＡに結合し得るアンチセンス
転写物を生じる。このアンチセンス核酸の転写は、構成的または誘導性であり得
、そしてこのベクターは、アンテナ染色体外維持または組み込みを提供する。あ
るいは、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡをコードする所定のＤＣＲ５タンパク質に
結合する一本鎖アンチセンス核酸は、標的核酸に投与され得るか、または一時的
に、標的化されたタンパク質の発現の実質的減少をもたらす濃度にて、宿主から
単離され得る。ＤＣＲ５発現における増強は、対応する遺伝子産物の機能的発現
を増大させるＤＣＲ５核酸を、標的化細胞型に導入することによってもたらされ
る。このような核酸は、ＤＣＲ５発現ベクター、内因性対立遺伝子の機能的発現
を上方制御するベクター、または変異対立遺伝子の標的化された修正のための置
換ベクターであり得る。核酸を生細胞中に導入するための技術は、当該分野にお
いて公知であり、そしてレトロウイルスベースのトランスフェクション、ウイル
スコートタンパク質−リポソーム媒介性トランスフェクションなどが挙げられる
。

【００２３】本発明は、ＤＣＲ５の調節可能な細胞機能のレベルにて活性な因子に対する、
因子、化合物またはリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。一般に、
これらのスクリーニング方法は、天然ＤＣＲ５結合標的とのＤＣＲ５相互作用を
調節する化合物をアッセイすることを包含する。タンパク質間結合アッセイ、イ
ムノアッセイ、細胞ベースのアッセイなどを含む、結合因子についての広範な種
々のアッセイが、提供される。好ましい方法は、リード化合物についての、化学
物質ライブラリーの自動化された経済的なハイスループットスクリーニングに受
け入れられる。

【００２４】インビトロでの結合アッセイは、ＤＣＲ５タンパク質を含む成分の混合物を用
い、このＤＣＲ５タンパク質は、別のペプチドまたはポリペプチド（例えば、検
出または係留のためのタグなど）との融合産物の一部であり得る。このアッセイ
混合物は、天然のＤＣＲ５結合標的（例えば、ＢＭＰのようなＴＧＦβタンパク
質）を含む。ネイティブな結合標的が使用され得るが、それらの部分がこのアッ
セイにおいて簡便に測定可能な本発明のＤＣＲ５に対する結合アフィニティーお
よびアビディティーを提供する限り、その部分を使用することが好ましい。この
アッセイ混合物はまた、候補の薬学的因子を含む。候補因子は、多くの化学クラ
スを含むが、代表的には、それらは、有機化合物、好ましくは小さな有機化合物
であり、そして合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、広範な種々
の供給源から得られる。塩、緩衝剤、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、
界面活性剤、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤な
どのような種々の他の試薬もまた、含まれ得る。これらの混合物成分は、必須の
結合を提供する任意の順番で添加され得、そしてインキュベーションは、最適な
結合を容易にする任意の温度にて実行され得る。この混合物は、候補の薬理学的
因子の存在がなければ、このＤＣＲ５が細胞結合標的、部分または参照結合アフ
ィニティーを有するアナログを特異的に結合する条件下で、インキュベートされ
る。インキュベーション期間は、最適な結合について選択されるがまた、迅速な
ハイスループットスクリーニングを容易にするために最小化される。

【００２５】インキュベーション後に、ＤＣＲ５と１以上の結合標的との間の因子に対して
偏りのある結合は、任意の簡便な方法によって検出される。細胞を含まない結合
型アッセイについて、分離工程は、しばしば、非結合成分から結合成分を分離す
るために使用される。分離は、沈降、固定化など、続いて例えば、膜濾過または
ゲルクロマトグラフィーによる洗浄によってもたらされ得る。細胞を含まない結
合アッセイについて、これらの成分のうちの１つは、通常、標識を含むか、また
は標識に結合される。この標識は、放射能、発光、光学密度または電子密度など
のような直接的な検出、あるいはエピトープタグ、酵素などのような間接的な検
出を提供し得る。種々の方法は、例えば、光学密度または電子密度、放射射出、
非放射エネルギー転位を通じて、標識および他のアッセイ成分の性質に依存して
、標識を検出するために使用され、あるいは抗体結合体を用いて間接的に検出さ
れる。因子の存在下での結合アフィニティーと比較した場合、この因子の非存在
下での標的に対するＤＣＲ５タンパク質の結合アフィニティーにおける差異は、
この因子が対応する結合標的へのＤＣＲ５タンパク質の結合を調節することを示
す。本明細書中で使用される場合、差異は、統計学的に有意であり、そして好ま
しくは、少なくとも５０％、より好ましくは９０％の差異を示す。

【００２６】本発明は、培地と接触している細胞外表面を含む細胞の生理を改変するための
方法を提供し、この方法は、上記の培地と外因性ＤＣＲ５タンパク質とを、上記
のタンパク質が上記の培地および細胞外表面の成分の少なくとも１つと特異的に
相互作用して、上記の細胞の生理における変化をもたらす条件下で、接触させる
ことを包含する。

【００２７】本発明はさらに、生物学的に活性な因子をスクリーニングするための方法を提
供し、この方法は、ａ）細胞外ＤＣＲ５タンパク質特異的結合標的および候補因
子の存在下で、ＤＣＲ５タンパク質を、上記の因子の存在がなければ、上記のタ
ンパク質が参照アフィニティーで上記の結合標的と特異的に結合する条件下でイ
ンキュベートすること；ｂ）上記結合標的に対する上記のタンパク質の結合アフ
ィニティーを検出し、因子に対して偏りのあるアフィニティーを検出することで
あって、ここで因子に対して偏りのあるアフィニティーと参照アフィニティーと
の間の差異が、上記の因子が上記の結合標的に対する上記のタンパク質の結合を
調節することを示す、ことを包含する。

【００２８】本発明はまた、リガンド体産生を提供する。リガンド体は、ＩｇＧのＦｃドメ
インに結合したリガンドポリペプチドから構成され、そして二量体化し得る（例
えば、Ｄａｖｉｓら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：８１６〜８１９を参
照のこと）。リガンド体は、増強した薬理学的特性を示す利点を有する。従って
、ＤＣＲ５リガンド体は、ＤＣＲ５の増強した薬物導体学的特性が所望される場
合に、治療用の適用に有用であり得る。

【００２９】本発明の１つの実施態様は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるアミノ酸配
列またはＤＣＲ５特異的活性を有するそのフラグメントを含む単離されたＤＣＲ
５タンパク質である。

【００３０】本発明の別の実施態様は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列
を含むＤＣＲ５タンパク質またはＤＣＲ５特異的活性を有するそのフラグメント
をコードする組換え核酸である。

【００３１】なお別の実施態様は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に示されるヌクレオチド配列
を含む単離された核酸、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１の少なくとも１８個の連続す
る塩基を有し、かつ天然のＤＡＮおよびｃｅｒｂｅｒｕｓのｃＤＮＡの存在下で
ＳＥＱＩＤＮＯ：１１の配列を有する核酸と特異的にハイブリダイズするに
十分なそのフラグメントである。

【００３２】本発明の別の好ましい実施態様は、ヒトＤＣＲ５ポリペプチドをの治療用量を
投与することにより、ヒトまたは動物の身体を処置（ここで、この処置は、軟骨
および骨の成長の調節である）する方法である。

【００３３】本発明はまた、本明細書中に記載されるＤＣＲ５タンパク質に対する抗体を提
供し、これは、例えば、診断適用におけるタンパク質の検出に有用である。この
ＤＣＲ５タンパク質に対して指向されるモノクローナル抗体の調製については、
培養中の連続的な細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術が使用され
得る。例えば、もともとは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより開発さ
れたハイブリドーマ技術（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５〜４９７）
、ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、
１９８３、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ４：７２）、およびヒトモノク
ローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９
８５、「ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ」、ＡｌａｎＲ、Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７〜９６頁）などは
、本発明の範囲内である。

【００３４】診断または治療での使用のためのモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル
抗体またはキメラヒト−マウス（または他の種）のモノクローナル抗体であり得
る。ヒトモノクローナル抗体は、当該分野において公知の多くの技術のいずれか
により作製され得る（例えば、Ｔｅｎｇら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：７３０８〜７３１２；Ｋｏｚｂｏｒら、１
９８３、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ４：７２〜７９；Ｏｌｓｓｏｎら
、１９８２、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：３〜１６）。ヒト定常領域を有
するマウス抗原結合ドメインを含むキメラ抗体分子が、調製され得る（Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
８１：６８５１、Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２）
。

【００３５】当該分野において公知の種々の手順は、本明細書中に記載されるＤＣＲ５タン
パク質のエピトープに対するポリクローナル抗体の産生に使用され得る。抗体の
産生のために、種々の宿主動物（ウサギ、マウスおよびラットを含むがこれらに
限定されない）は、ＤＣＲ５タンパク質、またはそのフラグメントもしくは誘導
体の注射によって免疫され得る。種々のアジュバントが、宿主の種に依存して、
免疫学的応答を増大させるために使用され得、このアジュバントは、フロイント
アジュバント（完全および不完全）、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）
、表面活性物質（例えば、リゾレシチン）、ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、ポリ
アニオン、ポリペプチド、油性乳剤、キーホルリンペットヘモシアニン、ジニト
ロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（Ｂａ
ｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｐａｒｖｕｍ））を含むがこれらに限定されない。

【００３６】選択されたＤＣＲ５タンパク質エピトープに対する抗体の分子クローンは、公
知の技術により調製され得る。組換えＤＮＡ方法論（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら、１９８２、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋを参照のこと
）は、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合部位をコードする核酸配列を
構築するために使用され得る。

【００３７】本発明は、抗体分子、ならびにこのような抗体分子のフラグメントを提供する
。この分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術により作製
され得る。例えば、このようなフラグメントは、以下を含むがこれらに限定され
ない：抗体分子のペプシン消化により産生され得るＦ（ａｂ’）₂フラグメント
；Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより作製さ
れ得るＦａｂ’フラグメント；および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理す
ることにより作製され得るＦａｂフラグメント。抗体分子は、公知の技術（例え
ば、免疫吸着、またはイムノアフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高
速液体クロマトグラフィー）のようなクロマトグラフィー方法、またはそれらの
組合せ）により精製され得る。

【００３８】本発明はさらに、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）活性のアンタゴニストとして、
単独または他の因子（ＢＭＰの活性を調節するかまたは調整する、ＤＡＮ、Ｃｅ
ｒｂｅｒｕｓ、ｂ５７またはフォン・ビルブラント因子を含む）との組合せで、
ＤＣＲ５タンパク質またはそのフラグメントを使用する方法を提供する。

【００３９】以下の実施例は、例示の目的のために提供され、そして限定のためには提供さ
れない。

【００４０】（実施例）（実施例１）（ヒトＤＣＲ５のクローニング）問合せとしてヒトＧｒｅｍｌｉｎ（ｈＧＲＥ）ヌクレオチド配列を使用する、
ＮＣＢＩでのヌクレオチドデータベースの検索は、「ＤＡＮおよびＣｅｒｂｅｒ
ｕｓに関連するタンパク質」について、ＰＲＤＣ（Ｍｉｎａｂｅ−Ｓａｅｇｕｓ
ａ、１９９８）と呼ばれるマウスタンパク質をコードするエントリーをプール出
力した。ＰＣＲを使用して、ゲノムＤＮＡおよびいくつかのマウスｃＤＮＡ供給
源（脳、平滑筋、骨格筋、肝臓、胚齢１５日の胚、胚齢１７日の胚）からマウス
ＰＲＤＣをクローニングした。マウスＰＲＤＣをコードするオープンリーディン
グフレーム（ＯＲＦ）は、単一のエキソン上に存在する。本発明者らは、ＰＲＤ
ＣＯＲＦが単一のエキソン上に存在する場合、（ヒトＤＡＮ／Ｃｅｒｂｅｒｕ
ｓ関連遺伝子番号５について）ヒトＤＣＲ５と命名されたそのヒトホモログもま
た、単一のエキソン上に存在するはずであり、このことによりこの遺伝子の完全
なＯＲＦについてスクリーニングする際にヒトゲノムＤＮＡの使用が可能になる
と推定した。さらに、本発明者らは、プローブとしてＰＲＤＣＯＲＦを使用し
て、ＭｕｌｔｉｐｌｅＨｕｍａｎＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏ
ｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）における推定ヒトＤＣＲ５の発現を調査した。そして
これは、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、小腸、結腸（粘膜裏打ち）、胃、結腸（筋肉
）、小腸（筋肉）、膀胱（筋肉）、胃（筋肉）、および前立腺（筋肉）中に発現
しているようであり、このことにより、ｈＤＣＲ５ｃＤＮＡをクローニングす
るために使用され得るｃＤＮＡのいくつかの供給源を指し示した。

【００４１】ＰＲＤＣのペプチド配列を、ＤＡＮ／Ｃｅｒｂｅｒｕｓ（ＤＡＮ／ＣＥＲ）フ
ァミリーの公知の全てのメンバーに対して整列させ、そして高度に保存される領
域を決定した。ＤＮＡ／ＣＥＲファミリーに属するタンパク質の最も著しい特徴
のうちの１つは、システイン（ＣＹＳ）の保存されたパターンである。これらの
Ｃｙｓ残基のうちのいくつかを含む４つの異なるアミノ酸配列を、以下の配列を
有する４つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために選択した：

【００４２】

【化１】鍵：ＩＵＰＡＣ命名法を使用して、縮重塩基を示す。括弧内のアミノ酸は、マウスＰＲＤＣにおいてその位置に存在するアミノ酸を示
す。

【００４３】イタリック体の番号は、ＰＲＤＣタンパク質の配列中のアミノ酸番号（開始メ
チオニンをアミノ酸番号１として開始する）を示す。アミノ酸配列の方向は、矢
印（＜）により示されるように、プライマーＤＣＲ５．ｄ３−３’（ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：３）およびＤＣＲ５．ｄ４−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）に対し
て逆である。

【００４４】本発明者らは、標準的なＰＣＲ方法論を使用して、テンプレートとしてヒトゲ
ノムＤＮＡを使用するＰＣＲを設定するために、プライマーＤＣＲ５．ｄ１−５
’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）およびＤＣＲ５．ｄ４−３’（ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：４）（すなわち、ＰＲＤＣの配列中の最も外側のプライマー）を用いた。こ
れらの反応の産物を、プライマーＤＣＲ５．ｄ２−５’（ＳＥＱＩＤＮＯ：
２）およびＤＣＲ５．ｄ３−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）を使用するＰＣＲ
反応の第２のセットについてのテンプレートして使用した。この第２のＰＣＲ反
応は、およそ２００塩基対のＤＮＡフラグメント（これは、ＰＲＤＣ配列に従っ
て予測されるサイズに近い）を増幅した。このフラグメントを、標準的な遺伝子
工学方法論を使用して、プラスミドベクターｐＵＣ１８中にサブクローニングし
、次いで配列決定した。この配列は、ＰＲＤＣに対して非常に高い相同性を示し
、このことにより、これは、実際にヒトＤＣＲ５のフラグメントであることを示
す。この情報に基づいて、この配列の５’末端および３’末端に対応する正確な
プライマーを、以下に示されるように操作した：Ａ．ＰＣＲにより作製されたヒトＤＣＲ５のフラグメントの配列：

【００４５】

【化２】鍵：プライマーｈ／ｍＤＣＲ５．ｉｎ１−５’およびｈＤＣＲ５．ｉｎ２ｒｅｖに下
線を付す：Ｂ．ヒトＤＣＲ５部分ゲノム配列に基づいて合成されたプライマーの配列：（ｉ）プライマーｈ／ｍＤＣＲ５．ｉｎ１−５’：

【００４６】

【化３】（ｉｉ）プライマーｈＤＣＲ５．ｉｎ２ｒｅｖ

【００４７】

【化４】これらのプライマーを、ＰＣＲにおいて、肝臓ｃＤＮＡをテンプレートとして
使用して、１４０ｂｐのフラグメントを増幅した。全長のｈＤＣＲ５ＯＲＦを
クローニングするために、本発明者らは、上記のプライマーを使用するＰＣＲに
よって、ＲａｐｉｄＳｃｒｅｅｎＨｕｍａｎＬｉｖｅｒｃＤＮＡＬｉ
ｂｒａｒｙＰａｎｅｌ（ＯｒｉＧｅｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ
．）をスクリーニングした。これは、いくつかの独立したｃＤＮＡクローンの同
定につながった。これらのクローンのうちの１つの配列決定は、本発明者らがヒ
トＤＣＲ５と命名した１６８アミノ酸ポリペプチドをコードする５０７ｂｐＯ
ＲＦの存在を示した。以下に示される配列は、ＰＲＤＣに対して非常に高い配列
同一性（９５％）を有する。さらに、これは、ヒトＧｒｅｍｌｉｎと６５％の配
列同一性、およびＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＤＡＮとそれぞれ２８％および２６％
の配列同一性を保有する（これらの全ては、保存されたシステインパターンおよ
びコンセンサス配列を含むファミリーのメンバーであり、そしてこれらの全ては
、ＢＭＰアンタゴニストとして機能する）。

【００４８】ヒトＤＣＲ５のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１１）およびアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）を以下に
示される通りであると決定した：

【００４９】

【化５】ヒトＣＤＲ５ポリペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）の配列を決定した。こ
れは以下に示される通りである：

【００５０】

【化６】鍵：シグナルペプチド領域に下線を付す。＞ＮＧｌｙｃｏｓは、推定Ｎ−結合グリコシル化部位の位置を表す。

【００５１】

【化７】ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に示されるヒトＤＣＲ５ＤＮＡ配列（前出）は、
クローニングベクターｐＣＭＶ６−ＸＬ３（ＯｒｉＧｅｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中にあり、そしてこれをｐＣＡＥ６２６と命名する。

【００５２】（実施例２）（ヒトＤＣＲ５−ｍｙｃ３の構築および発現）ヒトＤＣＲ５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、以下の２つのプラ
イマーを使用してＰＣＲによって増幅した：

【００５３】

【化８】ＰＣＲ増幅を、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を使用して
実行した。このＰＣＲ産物を過剰のプライマーから取り出して精製し、制限エン
ドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＡｇｅＩで消化し、ゲル精製し、そしてＥｃｏ
ＲＩおよびＡｇｅＩクローニング部位にて哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２１−ｍ
ｙｃ３中にサブクローニングし、これにより、三重のｍｙｃタグをインフレーム
（ｉｎｆｒａｍｅ）で有するヒトＤＣＲ５ＯＲＦ（停止コドンなし）がもた
らされた。この配列を以下に示す：

【００５４】

【化９】この三重のｍｙｃタグは、クローニング目的に使用された唯一のＡｇｅＩ部位
のすぐ３’で、このベクター中に含まれる。最終ＤＮＡ構築物を、標準的な制限
分析およびジデオキシ配列決定により確認した。

【００５５】ヒトＤＣＲ５−ｍｙｃ３タンパク質を、上記のｐＭＴ２１／ヒトＤＣＲ５−ｍ
ｙｃ３ＤＮＡ構築物を用いて一過的にトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞中で
発現させた。このトランスフェクションを、製造業者により記載されるように、
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．
）を使用して実行した。血清を含まない馴化培地を、トランスフェクションの２
日後に収集し、そして低速遠心分離により細胞片を除いた。ＥＤＴＡを馴化培地
に添加して５ｍＭの濃度にした。この馴化培地をアリコートし、そして−２０℃
で貯蔵した。ヒトＤＣＲ５−ｍｙｃ３の発現を、ｍｙｃタグに対する抗ｍｙｃモ
ノクローナル抗体（９Ｅ１０；１μｇ／ｍｌ）を使用して、標準的なウエスタン
ブロッティング技術により確認した。標準的な非還元条件下で、ヒトＤＣＲ５−
ｍｙｃ３は、およそ３０，０００の分子サイズを示し、これは、２つの潜在的な
Ｎ結合グリコシル化部位でのグリコシル化を説明する場合に、ヒトＤＣＲ５−ｍ
ｙｃ３の推定分子サイズと一致する。

【００５６】（実施例３）（ヒトＤＣＲ５は、ＢＭＰ２およびＢＭＰ４に結合するが、他のＢＭＰには結
合しない）ヒトＤＣＲ５−ｍｙｃ３（上記の、ＣＯＳ７細胞に由来する血清を含まない馴
化培地の１ｍｌ）を、２〜５μｇ／ｍｌのヒトｎｏｇｇｉｎタンパク質ｈＮＧΔ
Ｂ２（公開されたＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９９／０３９９６（１９９９年１月２
８日公開され、そしてその全体が本明細書中で参考として援用される）に記載さ
れる）の非存在下または存在下で、ヒトＢＭＰ−２（１μｇ／ｍｌ）、またはヒ
トＢＭＰ−４（０．５μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、またはヒトＢ
ＭＰ−５（１μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、あるいはマウスＮｏｄ
ａｌ（ｍＢＭＰ−１６としても公知；Ｘ．ｌａｅｖｉｓ卵母細胞中で発現される ³⁵ Ｓ−マウスＮｏｄａｌとして提供される）、またはヒトＢＭＰ−１１（ヒトＧ
ＤＦ−１１としても公知；Ｘ．ｌａｅｖｉｓ卵母細胞中で発現される³⁵Ｓ−ヒト
ＢＭＰ−１１として提供される）と同時にインキュベートした。ヒトＤＣＲ５−
ｍｙｃ３と異なるＢＭＰファミリーメンバーとの間の安定な複合体の形成を、プ
ロテインＡＵｌｔｒａｌｉｎｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合した抗ｍｙｃモノクロ
ーナル抗体（９Ｅ１０；１μｇ／ｍｌ）を使用して、ヒトＤＣＲ５−ｍｙｃ３と
会合したタンパク質とを免疫沈降させることにより決定した。結合反応を、２０
ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０（ＴＢＳＴ）、および１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
む無血清馴化培地において実行した。結合を、プロテインＡ−Ｕｌｔｒａｌｉｎ
ｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）の懸濁を維持するために連続的に混合しながら、１．１ｍｌ
の反応容量中にて２５℃で１時間進行させた。インキュベーションの後に、これ
らのビーズを、低速遠心分離によりペレットにして、ＴＢＳＴで１回洗浄し、新
しいエッペンドルフチューブに移し、そしてＴＢＳＴでさらに３回洗浄した。こ
れらのビーズに結合したタンパク質を、２５μｌの標準的なＬａｅｍｌｉＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液の添加により可溶化し、そして標準的な還元条件下
で実行される、ＮｕＰＡＧＥ／ＭＥＳの４〜１２％の勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ）上
に充填した。その後、電気泳動されたタンパク質を、ＩｍｍｕｏｂｉｌｏｎＰ
メンブラン上に移し、そして各々のそれぞれのタンパク質に対して惹起された抗
血清を使用して、ヒトＢＭＰ−２またはヒトＢＭＰ−４またはヒトＢＭＰ−５の
存在についてプローブした。

【００５７】１つの例において、ヒトＤＣＲ５−ｍｙｃ３は、ヒトＢＭＰ−２に結合するこ
とが示された。この相互作用は、この結合反応に２μｇのｈＮＧΔＢ２を含ませ
ることによりブロックされた。この結果は、ヒトＢＭＰ−２とヒトＤＣＲ５−ｍ
ｙｃ３との間の相互作用が特異的であることを示す。ヒトＤＣＲ５−ｍｙｃ３が
ｈＮＧΔＢ２の存在下または非存在下のいずれかにおいて結合反応中に含まれな
かった場合、ビーズに対するヒトＢＭＰ−２の結合は全く存在しなかった。

【００５８】別の例において、ヒトＢＭＰ−４に結合するヒトＤＣＲ５−ｍｙｃ３の能力を
試験した。ヒトＤＣＲ５−ｍｙｃ３は、ヒトＢＭＰ−４を結合し得た。さらに、
ヒトＤＣＲ５−ｍｙｃ３とのヒトＢＭＰ−４の相互作用を、ｈＮＧΔＢ２（５μ
ｇ）の添加によりブロックした。ヒトＢＭＰ−２について上記のように、ヒトＤ
ＣＲ５−ｍｙｃ３がｈＮＧΔＢ２の存在または非存在下のいずれかにおいて、反
応混合液から除かれる場合、ビーズに対するヒトＢＭＰ−４の結合は、全く存在
しなかった。Ｅ．Ｃｏｌｉ中に発現され、精製されかつ再折り畳みされたヒトＤ
ＣＲ５（前出を参照のこと）を、ｈＢＭＰ−４に対する結合について、ヒトＤＣ
Ｒ５−ｍｙｃ３と競合するその能力について試験した。Ｅ．ｃｏｌｉで発現され
、精製されかつ再折り畳みされた５μｇのヒトＤＣＲ−５を含むことは、ｈＢＭ
Ｐ−４へのヒトＤＣＲ５−ｍｙｃ３の結合をブロックし得。、このことは、この
再折り畳みされたヒトＤＣＲ−５が活性であることを示す。

【００５９】ＢＭＰファミリーの他のメンバーに結合するヒトＤＣＲ−５の能力もまた試験
した。この結果は、以下の通りである：ｈＤＣＲ−５は、ヒトＢＭＰ−５、マウ
スＮｏｄａｌ（ｍＢＭＰ−１６）、またはヒトＢＭＰ−１１（ＧＤＦ−１１とし
ても知られる）を結合しない。これらのＢＭＰとの相互作用の欠如は、ヒトＤＣ
Ｒ−５がＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４の特異的アンタゴニストであるさらなる証
拠を提供する。しかし、ヒトＤＣＲ−５が他のＢＭＰファミリーのメンバーに結
合し、かつその活性をブロックする可能性は、排除され得ない。

【００６０】（実施例４）（ヒトＤＣＲ５Ｅ．Ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＲＧ７６４の構築）ヒトＤＣＲ５の遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを、テンプレートとし
てプラスミドｐＣＡＥ６２６（上記）および増幅プライマーとして以下のオリゴ
ヌクレオチドを使用して標準的な技術によりＰＣＲ増幅した：

【００６１】

【化１０】得られた４７２ｂｐのフラグメントは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１のヌクレオ
チド６４〜５０４に加えて、クローニングのためのさらなる配列（前出のオリゴ
ヌクレオチドプライマー配列に下線を付した）を含み、そしてシグナル配列切断
部位後の第１のアミノ酸であるとコンピューター分析により決定された、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１２の２２位のアルギニンで開始する成熟ヒトＤＣＲ５遺伝子を
コードする。Ｅ．ｃｏｌｉでのクローニングを容易にするために、ヒトＤＣＲ５
をコードする配列を、クローニングのためにＡｆｌＩＩＩ制限部位を導入した
メチオニンおよびセリンのコドンに先行させた。ヒトＤＣＲ５配列の２５位およ
び２７位のアルギニンおよびアラニンのコドンを、それぞれ、ＣＧＧおよびＧＣ
ＧからＣＧＴおよびＧＣＴに変化させて、翻訳開始部位に近接する配列のＧＣ含
量を減少させた。これらの変化は、サイレント変異であり、そしてアミノ酸配列
を変更しない。得られたＤＮＡフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＡｆｌ
ＩＩＩで消化し、次いで、標準的な技術を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラス
ミドｐＲＧ６６３中のＮｃｏＩおよびＥａｇ１クローニング部位中に連結した。
ｐＲＧ７６４と命名された得られたプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子をコ
ードする高コピー数のプラスミドにおいて、Ｔ７Ｆ１．１プロモーターの転写
制御下にヒトＤＣＲ５遺伝子を含む。このプラスミドを、当業者に公知の標準的
技術を使用する制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定により確認した。

【００６２】（実施例５）（ヒトＤＣＲ５タンパク質のＥ．ｃｏｌｉでの発現、精製および再折り畳み）プラスミドｐＲＧ７６４（上記）を、標準的な形質転換技術を使用して、原栄
養菌Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２発現株ＲＦＪ１４３中に形質転換した。株ＲＦＪ１４
３は、ｌａｃＵＶ５プラスミドの転写制御下で、ファージＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼを発現する。ｐＲＧ７６４プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ株ＲＦＪ１４
３を、１ｍｌ当たり２０μｇのカナマイシン加えたＬＢ培地中で増殖させた。ヒ
トＤＣＲ５タンパク質の発現を、１ｍＭＩＰＴＧの添加により誘導した。誘導
された細胞を、１０，０００ｇでの１０分間の遠心分離により収集し、１０容量
の１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、２０ｍＭＥＤＴＡ中に再懸濁
し、そしてＮｉｒｏ−ＳｏａｖｅＰａｎｄａ細胞崩壊器（ｃｅｌｌｄｉｓｒ
ｕｐｔｅｒ）を通じて通過させることにより溶解した。この細胞溶解物を、１０
，０００ｇで１０分間遠心分離し、そしてペレットを、１０容量の８Ｍグアニ
ジン−ＨＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１ｍＭＥＤＴＡ、
１００ｍＭＮａ₂ＳＯ₃、１０ｍＭＮａ₂Ｓ₄Ｏ₆中に再懸濁し、そして室温で
１６時間攪拌した。溶化された封入体を、８Ｍ尿素、５０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６
．０、２００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡで平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙ
ｌＳ−３００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で分画した。ヒトＤＣＲ５を含
有する画分をプールし、そして４容量の緩衝液（６Ｍ尿素、２０ｍＭＭＥＳ、
ｐＨ６．０を含む）で希釈した。希釈したヒトＤＣＲ５プールを、６Ｍ尿素、２
０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．０で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換
カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に充填し、次いで、６Ｍ尿素、２０ｍＭＭ
ＥＳ、ｐＨ６．０中の０〜１ＭＮａＣｌの範囲の線形勾配により溶出した。精
製されたヒトＤＣＲ５を含む画分をプールし、次いで、５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．５を用いて約０．１ｍｇ／ｍｌのヒトＤＣＲ５に希釈した。シス
テインを添加して０．５ｍＭにして、ＮａＣｌを添加して１Ｍにした。この再折
り畳み混合液を、穏やかに攪拌しながら、４℃で５日間インキュベートした。再
折り畳みされたヒトＤＣＲ５を収集し、そしてＨ₂Ｏ中０．１％ＴＦＡ〜アセ
トニトリル中０．１％ＴＦＡの線形勾配で実行した、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ
ＪｕｐｉｔｅｒＣ５カラム上での逆相クロマトグラフィーにより精製した。再
折り畳みされたヒトＤＣＲ５を含む画分をプールし、減圧下で乾燥させ、そして
ＰＢＳに再懸濁した。

【００６３】本明細書に引用される全ての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物ま
たは特許出願が参考として援用されることが詳細かつ個別に示されるのと同様に
、参考として本明細書中に援用される。前述の発明は、理解の明瞭さの目的のた
めに例証および例示によっていくらか詳細に記載されているが、特定の変化およ
び改変が、添付の特許請求の精神または範囲から逸脱することなく本発明に対し
てなされ得ることは、本発明の教示を鑑みて当業者に容易に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/08 Ｃ０７Ｋ 16/18 ４Ｃ０８４Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 ４Ｃ０８５ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｈ０４５ 19/00 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｔ 15/02 ＺＣ１２Ｐ 21/02 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/15 33/577 Ｂ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 33/53 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 33/577 Ｃ１２Ｒ 1:19） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｒ 1:19）Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者スタハル，ネイルアメリカ合衆国ニューヨーク 10512，カーメル，ケントショアードライブ，アールディーナンバー10 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 HA12 4B063 QA13 QA18 QA19 QQ43 QR32 QR55 QR62 QS25 QS34 4B064 AG01 AG27 CA02 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA72X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 BA01 BA08 BA22 CA18 CA53 DB60 NA14 ZA962 4C085 AA13 AA14 BB31 CC22 CC23 EE01 KA03 KA04 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 DA76 EA20 EA50 FA72 FA73 FA74 GA15 GA23 GA25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトＤＣＲ５をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２】請求項１に記載の単離された核酸分子であって、該単離され
た核酸分子は、以下：（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に示される前記ヒトＤＣＲ５のコード領域を
含む、ヌクレオチド配列；（ｂ）ストリンジェントな条件下で、（ａ）のヌクレオチド配列にハイブリダ
イズし、かつ該ヒトＤＣＲ５の生物学的活性を有する分子をコードする、ヌクレ
オチド配列；または（ｃ）遺伝コードの縮重の結果として、（ａ）または（ｂ）の核酸とは異なり
、かつヒトＤＣＲ５をコードする、ヌクレオチド配列、からなる群より選択される配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項３】請求項１または２に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項４】前記核酸分子が、宿主細胞中でその発現を指向し得る発現制
御配列に作動可能に連結されている、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】プラスミドである、請求項３または４に記載のベクター。
【請求項６】単離されたヒトＤＣＲ５タンパク質。
【請求項７】ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有する
、単離されたヒトＤＣＲ５タンパク質。
【請求項８】請求項３、４、または５に記載のベクターを宿主細胞中に含
む、ヒトＤＣＲ５の産生のための宿主−ベクター系。
【請求項９】前記宿主細胞が細菌性細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳
動物細胞である、請求項８に記載の宿主−ベクター系。
【請求項１０】前記ヒトＤＣＲ５の産生を可能にする条件下で、請求項８
または９に記載の宿主−ベクター系の細胞を増殖させる工程、およびそのように
産生された該ヒトＤＣＲ５を回収する工程を包含する、ヒトＤＣＲ５を産生する
方法。
【請求項１１】請求項６または７に記載のヒトＤＣＲ５を特異的に結合す
る、抗体。
【請求項１２】モノクローナル抗体である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】請求項６または７に記載のヒトＤＣＲ５、およびキャリア
を含む、組成物。
【請求項１４】請求項１１または１２に記載の抗体、およびキャリアを含
む、組成物。
【請求項１５】ヒトまたは動物の身体の処置の方法における、または診断
の方法における使用のための、請求項６または７に記載のヒトＤＣＲ５、請求項
１１または１２に記載の抗体、あるいは請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】請求項１０に記載の方法により産生される、ポリペプチド
。
【請求項１７】イムノグロブリン定常領域に融合されたヒトＤＣＲ５を含
む、リガンド体。
【請求項１８】前記イムノグロブリン定常領域がヒトＩｇＧ１のＦｃ部分
である、請求項１７に記載のリガンド体。
【請求項１９】ヒトまたは動物の身体の処置の方法における、または診断
の方法における使用のための、請求項１７または１８に記載のリガンド体。
【請求項２０】ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：７およびＳＥＱＩＤＮＯ：９からなる群より選択されるヌ
クレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項２１】請求項１５に記載のヒトＤＣＲ５、または抗体、あるいは
組成物を投与する工程を包含する、軟骨および骨の成長を調節する方法。