JP2002521733A - コンパクト単一対物レンズθ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】単一対物レンズまたは二重対物レンズシステムを有するθ顕微鏡として使用することができるコンパクト共焦点顕微鏡 【解決手段】顕微鏡の一つの像平面と物体の間のビ−ム路には、照明光をカップリングするためおよび／または検知光をデカップリングするためのビ−ム分割器または反射器が設けれれている。照明光をカップリングして顕微鏡に入れる作動および／または検知光をデカップリングして顕微鏡から出す作動は、それぞれ、１本または数本の光ファイバを介して行われ、別個の照明方向および検出方向において傑出しており、検知方向は、物体内で、照明方向に対して相対的に所定の角度だけ傾斜しており、照明体積と検知体積との重畳領域は、従来の共焦点顕微鏡に比べて減少している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【従来の技術】

光学顕微鏡検査においては、分解能は、焦点の領域内の電磁エネルギの散逸の
数学的記述によって表現される点像強度分布関数（英語では、Point Spread Fu
nction，ＰＳＦ）の大きさによって定義される。 顕微鏡対物レンズの ＰＳＦ の大きさが小さければ小さいほど、単一点の表
示が精密になり、従って、顕微鏡の分解能が良好になる。すべての従来の顕微鏡
において焦点面の分解能より不良である光学軸沿いの分解能は、共焦点配置によ
って改善される（米国特許３０１３５６７、Ｋ.ミンスキ−、顕微鏡検査装置）
。それでもなお、共焦点顕微鏡においてさえも横方向の分解能は、一般に軸方向
の分解能より少なくとも３ｘ良好である。

【０００２】 学術文献から、次のことが知られている。すなわち、例えば、波長の減少によ
って（Ｃ．Ｊ．コッグズウェルおよびＫ．Ｇ．ラ−キン、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏ
ｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、第２版
、Ｊ．Ｐ．ポ−リ−版、１２８ペ−ジ（ニュ−ヨ−ク、プリ−ナム・プレス、１
９５５年）、装置の開口の拡大によって（Ｓ．Ｗ．ヘル、Ｓ．リンデック、およ
びＥ．Ｈ．Ｋ．シュテルツァ−、Ｊ．ＭＯＤ．Ｏｐｔ．４１、６７４（１９９４
）；Ｓ．Ｗ．ヘル、Ｓ．リンデック、Ｅ．Ｈ．Ｋ．シュテルツァ−、およびＣ．
クレマ−、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．、１９、２２２（１９９４））、または照明軸に
対するある角度のもとでのプロ−ブの観察によって、分解能の更なる改善を達成
することができる

【０００３】 ＤＥ ４３ ２６ ４７３ Ｃ２から、回折限定点照明に第１対物レンズを使
用し、点検出器に対物光の共焦点を結像するために第２対物レンズを使用するこ
とを特徴とし、且つ照明体積と検出体積との重畳領域が従来の共焦点顕微鏡に比
して減少するように、照明方向に対する相対検出方向がある角度で傾斜している
ことを特徴とする共焦点顕微鏡が知られている。従って、共焦点θ顕微鏡と呼ば
れるこの顕微鏡においては、分解能の改善のための最新の方法が使用され、ほと
んど等方性の分解能が達成される。

【０００４】 プロ−ブの照明のためおよび放射光の検出のために軸間に０に等しくない角度
を有するこのような共焦点顕微鏡を第１図に示す。 照明は、ｚ軸沿いに行われ、これによって発生するＰＳＦは、この方向に拡大
される。同様に、方向ＰＳＦは、ｘ軸沿いに拡大される。両方のＰＳＦは、共通
の焦点の領域に重畳される。この重畳領域においてのみ、点が照明され、その放
射が検知される。照明軸と検出軸の間の角度θが９０°になると、重畳領域はほ
とんど球状になる。これは次のことを意味する。すなわち、三つの空間方向のす
べてにおいて、分解能が匹敵する。照明ＰＳＦと検出ＰＳＦの積から成る全ＰＳ
Ｆは、最小値まで減少し、このことは、顕微鏡の分解能の改善と同義である。

【０００５】 ＤＥ−ＯＳ ４０ ４０ ４４１から知られていて、文献では４Ｐｉ共焦点顕
微鏡検査法とも呼ばれる二重共焦点顕微鏡検査法に共焦点θ顕微鏡検査法を組合
せることもできることが、 ＤＥ ４３ ２６ ４７３ Ｃ２から同様に知られ
ている。４Ｐｉ共焦点顕微鏡検査法は、共焦点顕微鏡の開口数を増大させ、これ
によって軸方向の分解能を改善する（Ｓ．ヘルおよびＥ．Ｈ．Ｋ．シュテルツァ
−、Ｊ．Ｏｐｔ．ＳｏＣ，Ａｍ．Ａ．、９、２１５９（１９９２））。

【０００６】 学術文献で４Ｐｉ（Ａ）共焦点顕微鏡検査法と呼ばれる技法においては、プロ
−ブは、２本の逆方向に拡大する収束光線によってコヒ−レントに照明される。
これらの２本の光線の干渉は、照明ＰＳＦの主最大値の半値幅を減少させる。

【０００７】 ４Ｐｉ（Ｂ）共焦点顕微鏡検査法と呼ばれる技法においては、干渉は、検知ス
クリ−ンに生じ、このようにして、検出ＰＳＦの拡大を減少させる。 ４Ｐｉ（Ｃ）共焦点顕微鏡検査法と呼ばれる技法は、これら二つの技法を組合
せる。

【０００８】 ＤＥ ４３ ２６ ４７３ Ｃ２から知られている共焦点θ顕微鏡検査法およ
びＤＥ−ＯＳ ４０ ４０ ４４１から知られている４Ｐｉ共焦点顕微鏡検査法
の組合せにおいては、プロ−ブは、４Ｐｉ共焦点顕微鏡におけるように照明され
、放射光は、θ顕微鏡におけるように直交的に検知されるので、軸方向の第２極
大は、抑制される。これは、４Ｐｉ照明における焦点面の外側の放射は検知され
ないことを意味する。

【０００９】 従来の方法では、２枚（またはそれ以上）の対物レンズレンズが角度θで配置
される（Ｓ．リンデック、Ｒ．ピック、およびＥ．Ｈ．Ｋ．シュテルツァ−、Ｒ
ＥＶ．ＳＣｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．、３３６７（１９９４））。これは、θ顕微鏡
検の明白な配置であるが、この配置によって、照明用および検知用のビ−ム路を
分割する必要があり、そのために、約２倍の個数の光学構成品に分割ビ−ム路が
必要となる。

【００１０】 ＤＥ−ＯＳ １９６ ３２ ０４０ないしはＷＯ９８／０７５０９から次のこ
とが知られている。すなわち、共焦点θ顕微鏡検査の原理は、単一の顕微鏡対物
レンズによっても実現することができる。ＤＥ−４３ ２６ ４７３ Ｃ２およ
びＤＥ−ＯＳ １９６ ２９ ７２５ Ａ１ないしＷＯ９８／０３８９２から知
られているように、このような単一対物レンズθ顕微鏡（英語では、Ｓｉｎｇｌ
ｅ−Ｌｅｎｓ Ｔｈｅｔａ ＭｉＣｒＯＳＣｏｐｅ）と呼ばれる装置は、二重対
物レンズシステムと結びついている複雑性を防止する。

【００１１】 図２は、このようなＳＬＴＭのうちの一つの作用を示す。顕微鏡の対物レンズ
とその焦点面ＢＥの間のθミラ−装置と呼ばれる１個のビ−ム切換装置および１
個の対物レンズの組合せによって、種々の角度からプロ−ブの結像を行うことが
できる。ここにおいて、照明光は、対物レンズを通過し、４５°ミラ−装置の下
方に虚焦点Ｃ_jを形成する。４５°ミラ−装置の鏡面における反射は、観察対象
物体内の焦点Ｃまで光を水平に導く。これとは逆に、検知レンズは、水平ミラ−
によって形成される虚像Ｃ_dの光のみを集める。従って、検知軸は垂直であり、
照明軸および検知軸は、それゆえ、９０°の角度を成す。Ｃの像Ｃ_jおよびＣ_dが
対物レンズの焦点面に存在し且つ照明レンズおよび検知レンズに虚焦点的に結像
するように、両方のミラ−面の配向が選定される。

【００１２】 従来の共焦点顕微鏡におけるビ−ム路は、ＳＬＴＭとして作動させることがで
きるように、変更しなければならない。これらの変更はとりわけ、今後も顕微鏡
を従来の共焦点モ−ドで作動させることができるように、実施しなければならな
い。特に、４Ｐｉ照明に対しては、照明装置の特殊変更が必要である。

【００１３】

【発明の実施の形態】

従来の共焦点顕微鏡の変更を実施することができる方法が本発明によって明示
されている。これに加えて、対物レンズと顕微鏡の焦点面の間にあるビ−ム分割
器または反射器によって光をカップリングおよび／もしくはデカップリングする
こと、および／またはカップリングおよび／もしくはデカップリングを光ファイ
バを介して行うことを本特許によって提案する。

【００１４】 以下において、添付図に関連付けて、本発明の実施例を詳細に説明する。 本発明による顕微鏡の好ましい実施形態は、ツァイスのアクシオプラ−ン万能
顕微鏡（型式１）に基づいており、この顕微鏡においては、１本またはそれ以上
の光ファイバによって、装置での光のカップリングおよびデカップリングが可能
であるように、反射器スライダ（顕微鏡の鏡胴と対物レンズの間に装着されてい
る）を改修する。追加の外部部品があるにもかかわらず、スライダのみを改修し
、その結果、アクシオプラ−ンの元の機能が保持されたままとなる。

【００１５】 このシステムにおいて可能な顕微鏡検査法の種類は、次のとおりである。 １）伝統的な広視野顕微鏡検査法 ２）共焦点レ−ザ−走査顕微鏡検査法（ＬＳＭ）（ここでは記述されないシステ
ム改修によって） ３）共焦点θ顕微鏡検査法 ４）４Ｐｉ共焦点θ顕微鏡検査法（ＬＳＭ） θ顕微鏡検査法においては、空間的に広大な構造物を保持するために、物体走
査が適用される。

【００１６】 図３は、ＳＬＴＭの対物レンズ、θ顕微鏡装置、ならびに照明ビ−ム路および
検出ビ−ム路を示す。 単一対物レンズが、虚焦点面内の３点に照明光および検知光の焦点を結ばせる
。θミラ−装置が、水平ミラ−Ｒ１、並びに水平面に対してφ_１およびφ_２の角
度を成す２枚の傾斜ミラ−という三つの部分で構成されるという点において、こ
のシステムは、図２の実施例と異なる。これによって、三つの異なる方向からプ
ロ−ブに対して最適のアクセスを行うことができる。両方の外側ビ−ム路が照明
に使用されるので、４Ｐｉ照明を達成することができ、中間のビ−ム路は、プロ
−ブの観察に使用される。

【００１７】 とりわけ、φ_１＝φ_２＝４５°およびθ_１＝θ_２＝９０°となるように、ミラ
−構成品の角度が選定される。これは、次のことを意味する。 すなわち、１）検知の方向は、照明に対して垂直である（この結果、ほとんど
球対称の照明ＰＳＦおよび検知ＰＳＦの重畳領域ができる）。および２）４Ｐｉ
照明における複数の照明光は逆方向である（焦点Ｃの領域における干渉節点間距
離の最小化）。

【００１８】 従って、以下において、φ_１＝φ_２＝φ＝４５°である対称システムを考察す
る。 ＳＬＴＭに対して、対物レンズの選定およびθミラ−装置のサイズの選定を行
わなければならない。 図３において、作動距離ｄ_ｗおよび最大開口角度αが対物レンズによって決定
される。角度αは、次のように定義される。 α＝sin^−１（ＮＡ／η_r）

【００１９】 ＮＡは、対物レンズの開口数であり、η_rは、液浸媒体の屈折率である。ｄ_ｗ
およびαは、できる限り大きいのが理想であるが、市販の対物レンズについては
、多くの場合、作動距離は、開口数と共に減少する。出願人が意図する該システ
ムの用途（例えば、生物学的プロ−ブ用の蛍光顕微鏡として）を考慮して、ｄ_ｗ ＝１.４６ｍｍおよびＮＡ＝０.９の３ｘのツァイス・アクロプラ−ン浸水対物レ
ンズ（ドイツ、カール・ツアイス・イエナ）を選定した。この対物レンズにおい
ては、水中でα＝４２．６°の開口角が達成される。

【００２０】 θミラ−装置を完全に規定するためには、次のパラメ−タを決定しなければな
らない。すなわち、水平ミラ−と焦点面ＢＥの間の距離ｗ、ミラ−装置の中心と
４５°ミラ−の内稜の間の距離Ｌ、４５°ミラ−の内稜と照明ビ−ム路の中心軸
の間の距離ｓ、およびミラ−の高さｈ。φ＝４５°を前提にすると、図３におい
て、次のようになる。 Ｌ＝ｓ＝ｗ

【００２１】 従って、所要のθミラ−装置の形状を決定するためには、Ｌおよびｈのみを決
定しなければならない。 θミラ−装置には、対物レンズの作動距離よりも小さくなければならないとい
う制約がある。すなわち、ｈ＜ｈ_ｍａｘ＝ｄ_ｗ−Ｌでなければならない。ミラ−
の高さの値がｈ＝１.０ｍｍであり、作動距離ｄ_ｗ＝１.４６ｍｍより小さい場合
は、それゆえ、対物レンズとθミラ−装置の間に若干のスペ−スがある。 パラメ−タＬは、θミラ−装置と焦点Ｃの間の最短距離を意味しており、且つ
該システムにおいて１個の物体を垂直に走査することができるようにするための
最大距離を表している。

【００２２】 Ｌの値が大きいと有利であるが、ｄ_ｗ以外に、Ｌによって実際上制約される要
因が更に二つある。全入射光が焦点Ｃに到達しなければならない場合は、両方の
照明虚焦点は対物レンズの視野の焦点面内に位置しなければならない。対象面内
の照明虚焦点間の距離が４Ｌに等しい場合は、像平面内の該距離は、４Ｍ_ｏｂｊ Ｌである。但し、Ｍ_ｏｂｊは、対物レンズの倍率を表す（図３参照）。顕微鏡が
両方の焦点を同時に表示することができるようにするためには、両方の焦点の間
の距離は、フィ−ルドの直径φ_fよりも小さくなければならない。

【００２３】 従って、次のようになる。 Ｌ＜φ_f／４Ｍ_ｏｂｊ Ｌによって制約されるもう一つの要因は、外側光円錐が４５°ミラ−の表面に
当たる最大高さｈ_Ｃである（図３参照）。一般に、ｈ_ＣはＬに比例する。とりわ
け、このシステムにおいては、ｈ_Ｃは約１.９ｍｍである。ｈ_Ｃ＞ｈである場合
は、光円錐全体が焦点Ｃに回折する訳ではないこと、および光エネルギの一部が
失われることは、明らかであろう。一定の状況下において、この損失が顕微鏡の
性能に影響を及ぼすことはあるが、該詳述ケ−スにおいては、Ｌ＜７９μmによ
って生じる性能損失は、０.８％未満である。従って、Ｌ＝７５μmは、このシス
テムにとって好都合な選択である。

【００２４】 レ−ザ−光が外側ビ−ム路を経由して観察対象物体に向けられるように、２本
の偏光保持光ファイバ（ＰＰファイバ）の出口が配置されている（図３参照）。
多重モ−ド光ファイバ（ＭＭファイバ）が中央ビ−ム路に存在し、観察対象物体
の迷光または蛍光を集める。 この配置を実現することができるようにするために、対物レンズと鏡胴レンズ
の間にあるアクシオプラ−ン顕微鏡の標準ミラ−・スライダを改修した。該顕微
鏡の４個の開口部をＳＬＴＭ用に利用するように、該顕微鏡を有利に変更した。
ここでは、もう一つのスライダにも該当する。その他の型式の顕微鏡においては
、光ファイバを顕微鏡スタンドに固定する可能性がある。

【００２５】 図４は、ミラ−・スライダおよび隣接レンズの概要図を示す。スライダおよび
これに結合された部材を正面図および平面図に示す。 アクシオプラ−ンの標準形態においては、対物レンズと標準鏡胴レンズの間で
横方向に動かすことができるスライダに、観察対象物体から来る光が４個の穴（
Ａ〜Ｄ）のうちの１個を介して射し込む。その後で、該光は、上部を経由して接
眼レンズに射し込むか、または後部スクリ−ンを経由して検知レンズに射し込む
。位置ＣおよびＤは、上述の原理に従って、変更システムにおいてさらに機能す
る。

【００２６】 Ｂは、光ファイバの接続に使用され、Ａは、光ファイバへのビ−ム路を塞がな
いようにするために、ブランクのままとする。このブランクの位置は、該システ
ムの虚焦点ＬＳＭモ−ドにおいて使用され、該モ−ドにおいて、光は、ビデオ・
ポ−トを経由してアクシオプラ−ンからカップリングないしデカップリングされ
る。 対物レンズおよびスライダの位置Ｂにおいて実施された変更の組合せは、主と
して、テレセントリック結像システムになっている。該システムは、対物焦点面
内の虚焦点からの光を集め、該虚焦点の拡大像を像平面内の光ファイバに投影す
るように、構成されている。

【００２７】 アクシオプラ−ン標準鏡胴レンズの焦点距離（ｆ_t，standard＝１６４．５ｍ
ｍ）および対物レンズ・ベ−スまでの距離１００.５ｍｍ）は、次のことを示し
ている。すなわち、対物レンズの後部焦点面は、対物レンズのストッパより６４
ｍｍ．下方にある。この前提の下で、且つ対物レンズのストッパと鏡胴レンズの
間の距離ｄ_ｏｔが３６.３ｍｍであるという事実の下で、図４に示すように、配
置をテレセントリックに構成するためには、新しい鏡胴レンズの焦点距離は、１
００.３ｍｍでなければならない。

【００２８】 収差の限界を考慮に入れて、ｆ_t＝１００ｍｍの焦点距離および２６.５ｍｍの
直径を有するメレス・グリオ−ト・ダプロマ−トのハイブリッド・レンズを鏡胴
レンズとして選択した。光ファイバに適合させなければならない焦点結像の位置
および大きさを、これらのパラメ−タによって決定することができた。

【００２９】 図４において鏡胴レンズとミラ−の間の距離ｄ_ｔｍおよび鏡胴レンズとファイ
バ−の間の距離ｄ_ｔｍによって決定される像平面の位置は、ｄ_ｔｍ＋ｄ_ｍｆ＝ｆ _t という関係によって決定される。構成品をミラ−・スライダに組込むために、
ｄ_ｔｍを４.６ｍｍで設定したので、ｄ_ｍｆは、９５.４ｍｍになる。アクシオプ
ラ−ンのｆ_０は、各観察対象物体に対して、次のようになる。 ｆ_０＝ｆ_{Ｃ，standard}／Ｍ_ｏｂｊ ここで使用する６３ｘの対物レンズにおいては、焦点距離は、２.６１ｍｍで
ある。従って、改修システムの有効倍率は、Ｍ_ｓｙｓ＝３８.３になる。

【００３０】 図３における虚焦点間距離は２Ｌ＝１５０μmになるので、該システムの共焦
点において光ファイバを有するためには、該光ファイバは、ｘ_Ｅ＝５.５７ｍｍ
で位置決めしなければならない。 最大空間寸度は、鏡胴レンズにおける光ビ−ム間に存在し（図４におけるＸ_{ｍ ａｘ} ）、Ｘ_ｍａｘ＝１６.３ｍｍ）になる。この値は鏡胴レンズの光学的直径（
２３.９ｍｍ）よりも小さいので、光ビ−ム路の開口は鏡胴レンズによって制限
されない。

【００３１】 この作動のための正面光ファイバとしては、例えば、３.５μｍのフィ−ルド
直径、４７０ｎｍ未満の極小波長、および０.１１のＮＡ_ＰＰを有するペンダ・
タイプＰＰ光導体（米国カリフォルニア州マウンテン・ヴュ−、ウェイヴオプテ
ィックス社製、＃ＷＴ−０１−ＰＧＡ−２１３−７０Ｃ−００５）がある。この
開口数は、２２ｍｍの最大ビ−ム幅を達成し、該ビ−ム幅は、対物レンズ開口φ _ｏｂｊ ＝４.８ｍｍよりかなり大きい。対物レンズは、それゆえ、照明されるの
で、後部焦点面全体の上のフィ−ルドは等質であるとみなすことができる。

【００３２】 本計算においては、ＰＳＦは回折によって制限されているものとして取扱う。
これは、次のことを意味する。すなわち、直径は、ほぼ、次のとおりである。 φ_{ｉｍａｇｅ}＝Ｍ_ＳＹＳ１.２２λ／ＮＡ_ｏｂｊ 但し、λは、光の波長である。

【００３３】 平均波長が−５２５ｎｍであるという仮定の下に、φ_{ｉｍａｇｅ}＝２７.６μ
ｍの像直径が得られ、該像直径によって該システムの検出穴スクリ−ンの最適サ
イズが規定される。追加の穴スクリ−ンを回避するために、φ_{ｉｍａｇｅ}に適合
するファイバ・コア直径を有する石英ＭＭ光ファイバ（ドイツ、ヴァイル・デア
・シュタット、ＢＴＯブンガ−ト有限責任会社製ＮＡ_ｍｍ＝０.２２、２３０ｎ
ｍ＜λ＜１１００ｎｍ、２５μｍコア） を検知光ファイバとして選択した。こ
のファイバの開口数ＮＡ_ｍｍは鏡胴レンズの開口数より大きいので、光ファイバ
は、検出に供すべきすべての光を集めることができる。

【００３４】 鏡胴レンズの像平面内に３本の光ファイバを正確に位置決めすることは、ＳＬ
ＴＭを首尾よく作動させるために重要である。該ファイバは、常に、相互に、か
つθミラ−装置に対して、正確に配置しなければならない。有利になるように、
ＭＭ光ファイバは改修ミラ−・スライダに直接固定されるので、確実な基準点と
して利用される。 次いで、物体テ−ブルのｘｙｚ位置決め用の制御要素を操作することによって
、この基準点に基づいて、θミラ−装置の位置決めが行われ、該θミラ−装置は
、該物体テ−ブルの上に置かれる。

【００３５】 図４において述べたように、ＰＰ光ファイバは、有利になるように、並進調整
要素に固定される。呈示した実施例においては、ファイバは、各方向に３８μｍ
の動きを許す３軸の圧電位置スイッチ（ドイツ、圧電システム・イエナ社製、ミ
ニ・トリ−トル３Ｄ ＭＩＮ ３８ ＮＶ）に固定されている。これらは、照明
ファイバをナノメ−タ的精度でＭＭファイバに対して相対的に空間で位置決めす
ることを許す。ファイバをミラ−・スライダに固定するスクリュを使用して、３
本のファイバすべての粗調整が行われる。

【００３６】 ４Ｐｉ共焦点θ顕微鏡検査法において最適性能を達成するために、照明ＰＳＦ
の中央最大値を検知ＰＳＦの中央最大値と一致させることが重要である。そのた
めに必要な位相制御は、並進調整要素、例えば圧電補正要素を使用して１本また
は両方のＰＰファイバの軸方向の位置を調整することによって実現される。

【００３７】 図５は、アクシオプラ−ン顕微鏡の外側にあるＳＬＴＭの照明要素および検知
要素の概略図を示す。光拡散の方向は、矢印によって提示されている。照明ビ−
ム路は、実線によって示されており、検知ビ−ム路は、破線によって示されてい
る。レ−ザ−としては、４８８ｎｍ単位で直線を発生させるアルゴン・イオンレ −ザ−（ドイツ、エ−ヒング、ウニファ−ゼ販売会社製、型式２０１４）および ６３３、５９４、ないし５４３ｎｍの波長用の３個のＨｅＮｅレ−ザ−（米国コ ロラド州ボウルダ−、エレクトロ・オプティックス社製、型式ＬＨＲＰ−１７０ １、ＬＨＹＰ−０１０１、ＬＨＲＰ−１７０、ＬＨＧＰ−０１０１）がある。
該装置全体は、防振光学的テ−ブルに装着されている。

【００３８】 ４個のレ−ザ−の光は、ダイクロイック・ミラ−ｄ１〜ｄ３を介して集束され
て、１本のビ−ムになり、次いで、該ビ−ムは、ＡＯＭ（フランス、サン・レミ
−・レ・シェヴル−ズ、ＡＡ．オプト・エレクロニック社製アクスト光学モジュ
レ−タ、ＡＡ．ＭＯＤ．４Ｃ．２３０ＶＡＣ）に導かれる。これは、７波長以上
のエネルギを変調することができるので、照明ビ−ムの各個々の波長を制御する
ことができる

【００３９】 ＡＯＭから来る光ビ−ムは、直接、第１ファイバ・カップラｆＣ１に供給する
ことができるし、または可斜式ミラ−（ドイツ、シュタウフェンｉ、Ｂｒ．，オ
−ヴィス社）ｆｍ１およびミラ−ｍ３を介して、ビ−ム分割器に導くことができ
る。共焦点レ−ザ−走査モ−ドでの作動のために、ｆＣ１は、光をカップリング
してＰＰファイバＰＰ１に入れる。

【００４０】 （４Ｐｉ）共焦点θ顕微鏡検査法においては、ｆｍ１はビ−ム路に運ばれ、Ａ
ＯＭから来る光ビ−ムは５０：５０の非偏光ビ−ム分割器ｂｓ（ドイツ、ベンス
ハイム、メレス・グリオ−ト社製、広帯域ハイブリッド立方ビ−ム分割器０３
ＢＳＣ ００５）に導かれる。分割ビ−ムは、ｆＣ２およびｆＣ３を介して、カ
ップリングされて、ファイバＰＰ２およびＰＰ３に入る（ｆｍ２はアウトの状態
で）。これらは、（４Ｐｉ）共焦点θ顕微鏡検査法の照明源として、使用される
。

【００４１】 ＭＭファイバｍｍ１は、アクシオプラ−ンからの光をカップリングして共焦点
θモ−ドに入れるために、ｆｍ３がインの状態で、使用される。このファイバ（
遮断アダプタｆＣ４が端末である）から出てくる光は、レンズＬ（ｆ／ｌ、直径
２５ｍｍ、平凸、可視光に対して反射防止コーティングされている）ならびにミ
ラ−ｍ５およびｍ３（イン位置）を介して、関連放射信号のみを通過させるフィ
ルタ・ホイ−ルｆｗまでバイパスされる。このフィルタを通る光は、ＰＭＴ（ド
イツ、ヘルシング、ドイツ浜松フォトニックス社製、光センサ−・モジュ−ルＨ
５７０２−５０）によって検知される。

【００４２】 本システムをレ−ザ−走査モ−ドで使用するには、ｆｍ１がアウト位置にあり
、その結果、レ−ザ−光線がＰＰ１を介して観察対象物体まで伝達されることが
必要である。 該システムの共焦点θモ−ドにおいては、ｆｍ１、ｆｍ２、およびｆｍ３は、
イン位置になければならない。これによって、ＰＰ２における光がカップリング
され、ｍｍ１の信号が検知される。ｆｍ２がインの状態で、かつｆｍ３がアウト
の状態にあると、光は、ｆｍ３からもＰＭＴに導かれる。

【００４３】 ４Ｐｉ共焦点顕微鏡検査法用の形態は、同様に構成される。但し、ｆｍ２はア
ウト位置にあり、その結果、ＰＰ２もＰＰ３も照明源として使用されることがで
きる点が異なる。レ−ザ−走査レンズおよび検知レンズは、ＳＬＴＭ形態におい
ては使用されない。 数ミリメ−トルの移動範囲を有し、２０μｍの領域で４０ｎｍ以上の精度で走
査されることのできる精密走査テ−ブル（ドイツ、ヴァルトブロン、フュジ−ク
・インストゥルメンテ社製、型式Ｐ−７６２．００）に固定されている毛細管に
よって、プロ−ブは保持される。物体を位置Ｃ（図３参照）に保持するために、
該毛細管は、水平に向けられ、対物レンズとθミラ−装置の間に取付けられる。
とりわけ、毛細管は回転させられるので、観察対象物体は、その下方に位置し、
該毛細管は、ビ−ム路を最小限ふさぐのみである。

【００４４】 該θ顕微鏡は、ＩＢＭ ＰＣ適合コンピュ−タによって制御され、該コンピュ
−タは、フィルタ・ホイ−ル内のステップ・モ−タ−を制御するためのカ−ド、
対象物体テ−ブルを駆動するデジタル・アナログ変換器（米国、タクソン、バ−
・ブラウン／インテリジェント・インストゥルメンテ−ション製ＰＣＩ−２００
９８Ｃ）、ならびにＰＭＴの物体テ−ブルのゲイン制御を備えている。

【００４５】 ＰＭＴから受信した光の強さを記録するために、デジタル・アナログ変換器（
米国、タクソン、バ−・ブラウン／インテリジェント・インストゥルメンテ−シ
ョン製ＰＣＩ−２００９８Ｃ）が使用される。可斜式ミラ−およびファイバ用の
圧電制御要素の駆動装置は、コンピュ−タを介して動作させることができるが、
コンピュ−タに接続されているのではなくて、対応駆動装置（ドイツ、圧電シス
テム・イエ−ナ有限責任会社製、ＰＳ１６１２電源、モナコ−ルおよびＥ−１０
１−０１圧電調整要素電源）を介して動作させられる。

【００４６】 ヴィジュアル・ベイシック（米国、レッドモント、マイクロソフト株式会社）
に書かれているプログラムがデ−タ作成を行う。この処理において、観察対象物
体が対物レンズおよびθミラ−装置に対して相対的に位置決めするｘｙｚアドレ
スの３個の値をコンピュ−タが生成する。位置決めは、閉制御ル−プの中で作動
する電子部品（ドイツ、ヴァルトブロン、ＰＩフュジ−ク・インストゥルメンテ
社製、型式Ｐ−９２５．２７２）を介して制御される。観察対象物体から放射さ
れる光の強さは、物体の焦点位置の関数として、ＰＭＴを介して測定される。

【００４７】 あらかじめ既述した配置においては、いくつかの顕微鏡検査法が許容される。 １）従来の広視野・反射・伝送顕微鏡には、その構造を変えないアクシオプラ
−ンにおいて可能である。観察対象物体は、反射用の水銀蒸気ランプもしくは蛍
光灯を使用して上方から照明するか、またはハロゲン・ランプを使用して下方か
ら照明することができる。 ２）共焦点レ−ザ−走査顕微鏡検査法を実施することができる。この場合は、
照明灯および検知灯は、対物レンズおよび個別のミラ−配置を介して、同一のビ
−ム路を共用する。照明光は、光ファイバを介して利用可能であり（図５におけ
るＰＰ１）、ここでは詳細には記述されていない検知器へ、フィルタを介して、
蛍光光線が射し込む。 ３）ここで記述されるアクシオプラ−ンの改修の適用において、ＳＬＴＭが可
能である。

【００４８】 該システムは、４Ｐｉ共焦点θ顕微鏡としても利用される。このモ−ドは、Ｓ
ＬＴＭに非常に類似している。但し、観察対象物体が少なくとも２方向から干渉
的に照明される点が異なる。反対方向に拡散するこれら両方のビ−ムによって形
成され干渉パタ−ンは、照明ＰＳＦのサイズを減少させるので、該システムの分
解能を改善する。

【００４９】 すべての方法を１個の装置において組合せると、ユ−ザ−は、種々の作動モ−
ドの間で、あれこれと切換えることができ、自分の検査に最も適した方法を選定
することができる。例えば、広視野レ−ザ−走査法または共焦点レ−ザ−走査法
によって、対象物体の最初の観察を実行することができる。感度が増大するにつ
れて、調整の複雑さが増すので、関心の対象である特性を具現する最も単純な顕
微鏡検査法モ−ドのみをユ−ザ−は使用しなければならない。

【００５０】 本器具の設計は、生物学的研究に適合している。液浸媒体として水を使用する
と、生物標本をその自然の環境の中で観察することができる。２個の対物レンズ
を有するθ顕微鏡と比べて自由作動距離が短いということは、標本はその場所に
おけるように大きくてはならないことを意味する。細胞および亜細胞の生物学的
研究の手段として、ＳＬＴＭは、それゆえに、最大の重要性を有する。浸水対物
レンズを使用すると、異なる屈折率による収差が最小化されるという利点がある
。 共焦点θ顕微鏡検査法における２００−３５０ｎｍおよび共焦点レ−ザ−走査
モ−ドにおける約１４００ｎｍと比べて、可能な限り最良の分解能は、約１００
ｎｍである。

【図面の簡単な説明】

【図１】プロ−ブの照明のためおよび放射光の検出のために軸間に０に等しく
ない角度を有する共焦点顕微鏡を示す

【図２】ＳＬＴＭのうちの一つの作用を示す。

【図３】ＳＬＴＭの対物レンズ、θ顕微鏡装置、ならびに照明ビ−ム路および
検出ビ−ム路を示す。

【図４】ミラ−・スライダおよび隣接レンズの概要図を示し、スライダおよび
これに結合された部材を正面図（ａ）および平面図（ｂ）に示す。

【図５】アクシオプラ−ン顕微鏡の外側にあるＳＬＴＭの照明要素および検知
要素の概略図を示す。

【符号の説明】

（図２） Ｃ 焦点 Ｃ_d 検知虚焦点 Ｃ_I 照明虚焦点 Ｒ_１ 水平反射器 Ｒ_２ 傾斜反射器 （図３） α 集束ビ−ムの半開口角 φ_I ミラ−の傾斜角 θ_I 角度θ ｈ θ ミラ−装置の高さ ｈ_Ｃ 臨界ミラ−高さ Ｌ 傾斜ミラ−のベ−スと中心軸の間の水平距離 ｓ 照明焦点と傾斜ミラ−のベ−スの間の水平距離 ｗ 水平ミラ−と共通焦点の間の垂直距離 ｄ_ｗ 自由作動距離 （図４） ｄ_ｍｆ ファイバと鏡胴レンズの間の距離 ｄ_Ｃm 鏡胴レンズとミラ−の間の距離 ｄ_０Ｃ 鏡胴レンズと対物レンズの間の距離 ｘ_f ファイバ相互間の距離 ｘ_max ミラ−上での照明フィ−ルドの最大寸度 （図５） ＡＯＭ 音響・光学的変調器 ｂｓ ビ−ム分割器 ｄｉ 二色性ミラ− ｆＣＩ ファイバ・カップラ ｆｍｉ 可傾式ミラ− ｆｗ フィルタ・ホイ−ル Ｌ レンズ ｍｉ ミラ− ｍｍ１ 多重モ−ド光ファイバ ＰＭＴ 光電子増倍管 ＰＰｉ 偏光保存光ファイバ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トーマス ステファニー （原語表記）Ｓ ＴＥＦＡＮＹ，Ｔｈｏｍａｓ ドイツ国 Ｄ−68181 レイメン クルフ ュルステナリー 22 (72)発明者 ステフェン リンデック （原語表記）Ｌ ＩＮＤＥＫ，Ｓｔｅｆｆｅｎ ドイツ国 Ｄ−68723 プランクスタッツ ヒンター デン ドルフゲルテン ５− ７ (72)発明者 ジム スヴォゲル（原語表記）ＳＷＯＧＥ Ｒ，Ｊｉｍ ドイツ国 Ｄ−69115 ハイデルベルグ ガイスベルグストラッセ 70−72 Ｆターム(参考） 2H052 AA08 AA09 AC06 AC15 AC26 AC27 AC34 AD31 AF02

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】別個の照明方向および検知方向を有する共焦点顕微鏡において、 物体の検知方向は、照明方向に対して相対的に所定の角度で傾斜しており、照
   明体積と検知体積との重畳領域が従来の共焦点顕微鏡に比べて減少するように、
   前記角度が選定されており、 物体と顕微鏡の像平面の間のビ−ム路に、ビ−ム分割器または照明光のカップ
   リング用および／もしくは検知光のデカップリング用の反射器が設けられている
   こと および／または 顕微鏡への照明光のカップリングおよび／または顕微鏡からの検知光のデカッ
   プリングは、それぞれ、１本または数本の光ファイバを介して行われることを特
   徴とする共焦点顕微鏡。
2. 【請求項２】請求項１に記載の共焦点顕微鏡において、 請求項１に記載の光学的原理を実現するために、少なくとも１個の物点を照明
   する目的で、且つ対物光を少なくとも１個の検知器に共焦点的に結像する目的で
   、ＤＥ−ＯＳ １９６ ３２ ０４０に単一の顕微鏡対物レンズを使用すること
   、 および対物レンズの物体側に配置されたビ−ム切換装置が照明光を物体に向け
   、対物光を対物レンズの方向に向けることを特徴とする共焦点顕微鏡。
3. 【請求項３】請求項１に記載の光学的原理を実現するために、 ＤＥ １９６ ２９ ７２５に準拠する二重対物レンズを有すること、 ならびに前記二重対物レンズは、少なくとも１個の物点を照明するための照明
   対物レンズおよび少なくとも１個の検知器に対物光を結像するための検知器対物
   レンズで構成されることを特徴とする共焦点顕微鏡。
4. 【請求項４】ビ−ム分割器または反射器が、顕微鏡の対物レンズと鏡胴レンズ
   の間にあることを特徴とする前述の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦
   点顕微鏡。
5. 【請求項５】ビ−ム分割器または反射器が、顕微鏡の反射器スライダの中にあ
   ることを特徴とする前述の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡
   。
6. 【請求項６】光をカップリングおよび／またはデカップリングするための光フ
   ァイバが、直線状に（水平、垂直、もしくは斜めに）または任意のパタ−ンに配
   置されていることを特徴とする前述の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共
   焦点顕微鏡。
7. 【請求項７】光ファイバとビ−ム分割器または反射器の間に、鏡胴レンズが使
   用されることを特徴とする前述の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点
   顕微鏡。
8. 【請求項８】システムの配置が、光ファイバ、鏡胴レンズ、ビ−ム分割器、ま
   たは反射器および対物レンズで構成されることを特徴とする前述の請求項のうち
   の少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
9. 【請求項９】光ファイバが、反射器スライダに固定されていることを特徴とす
   る前述の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
10. 【請求項１０】光ファイバが、顕微鏡スタンドに固定されていることを特徴と
    する前述の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
11. 【請求項１１】並進調整要素によって光ファイバを動かすことができることを
    特徴とする前述の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
12. 【請求項１２】光ファイバを貫通した光の位相が、特定の値を取るように、焦
    点の近傍の各点において前記位相を変化させるために、並進調整要素によって光
    ファイバをその軸沿いに移動することができることを特徴とする前述の請求項の
    うちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
13. 【請求項１３】焦点の近傍の各点において位相を一定に保つことができること
    を特徴とする前述の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
14. 【請求項１４】検知ファイバ−が、堅固に取付けられ、その他のファイバの調
    整用の基準として使用されることを特徴とする前述の請求項のうちの少なくとも
    １つに記載の共焦点顕微鏡。
15. 【請求項１５】照明の強さを測定するための基準ダイオ−ドが、請求項１に記
    載のビ−ム分割器の後方で使用されることを特徴とする前述の請求項のうちの少
    なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
16. 【請求項１６】光ファイバを照明および／または検知用にそれぞれ選択的に使
    用することができることを特徴とする前述の請求項のうちの少なくとも１つに記
    載の共焦点顕微鏡。
17. 【請求項１７】反射器スライダが、交換可能であることを特徴とする前述の請
    求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
18. 【請求項１８】反射器スライダが、さらに別の要素を有することを特徴とする
    前述の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
19. 【請求項１９】対物レンズの物体側に配置されたビ−ム切換装置が、水平第１
    反射器または反射器部（対物レンズの光学軸に垂直）およびこの水平第１反射器
    に隣接して光学軸に対して０〜９０度の角度で配置される、少なくとも１個の第
    ２反射器で構成される共焦点顕微鏡において、 水平第１反射器が、物体の方向に検知焦点を反射し、少なくとも第２反射器が
    それぞれ少なくとも１個の照明焦点を物体上に回折させることをとととする前述
    の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
20. 【請求項２０】対物レンズの物体側に配置されたビ−ム切換装置が、水平第１
    反射器または反射器部（対物レンズの光学軸に垂直）およびこの水平第１反射器
    に隣接して光学軸に対して０〜９０度の角度で配置される、少なくとも１個の第
    ２反射器で構成される共焦点顕微鏡において、 水平第１反射器が、物体の方向に照明焦点を反射し、少なくとも第２反射器が
    それぞれ少なくとも１個の検知焦点を物体上に回折させることを特徴とする前述
    の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
21. 【請求項２１】特に相互に向き合う少なくとも２個の第２反射器を備えている
    ことを特徴とする前述の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
22. 【請求項２２】照明方向および検知方向が、物体の中で直角を成すことを特徴
    とする前述の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
23. 【請求項２３】蛍光顕微鏡検査法のための手段を備えていることを特徴とする
    前述の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。
24. 【請求項２４】散乱光および／または反射光のための手段を備えていることを
    特徴とする前述の請求項のうちの少なくとも１つに記載の共焦点顕微鏡。