JP2002521496A - レプチン介在性遺伝子誘導 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 モデル系としてＰＣ１２細胞系を用いて、レプチンレセプター又はｇｐ１３０の活性化によって誘導された１連の転写物を同定した。未分化ＰＣ１２細胞での動態研究に基づき、２つの異なる遺伝子セット：最初期応答遺伝子であるＳＴＡＴ−３、ＳＯＣＳ−３、メタロチオネイン−II、セリン／トレオニンキナーゼＦｎＫ及びＭＲＦ−１のラット相同体、並びに後期誘発標的遺伝子である膵炎関連タンパク質Ｉ、スルアレンエポキシダーゼ、ウリジン二リン酸グルクロニルトランスフェラーゼ及びアネキシンVIIIを認めることができた。後者においてのみ、アデニル酸シクラーゼ活性化因子であるフォルスコリンによる強力な共刺激が認められた。レプチン誘導タンパク質Ｉ（ＬＩＰ−１）及びレプチン誘導タンパク質II（ＬＩＰ−II）をコードする２つの付加的転写物も認められた。ＬＩＰ−IIは、ヒトダウン症候群細胞接着分子（ＤＳ−ＣＡＭ）のラットオルトローグである。いずれにしても、フォルスコリン共刺激作用は全く認められなかった。β−ＮＧＦ及びフォルスコリン併用処置によって神経表現型に分化したＰＣ１２細胞で、膵炎関連タンパク質III、ペリフェリン及びＭｘ２タンパク質が、レプチンによって調節されるものとして更に認められた。最後に、ＩＬ−６又はレプチン過誘導ＰＣ１２細胞のいずれかからのｍＲＮＡを用いるＲＤＡ実験から、膵炎関連タンパク質ファミリーの別のメンバーであるＲｅｇ遺伝子及びＨＩＰ−１がＨ−ＩＬ−６によって選択的に上方調節されるものとして認められた。以前にインビボのレプチンシグナル伝達において、ＳＴＡＴ−３及びＳＯＣＳ−３が認めれている。本発明もまた、レプチンがＭＴ−II、Ｆｎｋ及び膵炎関連タンパク質Ｉ遺伝子のインビボ発現を調節することを示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、場合により、アデニル酸シクラーゼに作用するか、又は該シクラー
ゼの１つ以上の下流標的に作用する化合物と組合せた、レプチン及び／又はｇｐ
１３０を含む受容体複合体に結合し、その結果として、極初期応答遺伝子及び／
又は後期標的遺伝子が、神経−内分泌細胞又は神経−内分泌に由来する細胞にお
いて誘導されることによってシグナル伝達カスケードを活性化する、サイトカイ
ンの使用に関する。

【０００２】 発明の背景情報 健康な状態では、栄養エネルギーの同化、貯蔵及び利用が、高度に統合された
恒常性システムを構成する。エネルギー貯蔵、したがって体重の相対的な一定レ
ベルを維持するには、食物摂取とエネルギー消費の間の均衡の達成が必要である
。「設定値」仮説は、中枢神経系におけるコントロールセンターによる協調調節
を提唱する。食物摂取（飢餓対満腹）、体重、エネルギー消費（適応性産熱）並
びに基質相互変換、その後の貯蔵及び動員を支配するホルモン統合の調節による
、恒常性の導入における重要な役割を考えると、視床下部核は、「設定値」が調
節される部位であると考えられる。

【０００３】 末梢又は直接視床下部に投与されると食物摂取を変化させる、拡張する一連の
（神経）ペプチド及び神経伝達物質が発見されている。肥満のマウスモデルは、
５つの明らかな単一遺伝子突然変異を含む。最も集中して研究される突然変異は
、ｏｂ及びｄｂ遺伝子に発生するが、これらは、体脂肪沈着の制御に密接に関係
している。この制御には、脂肪細胞により分泌されるホルモンの作用を含み、か
つ摂取行動及び代謝活性を支配する脳の領域の特異的受容体を通じて作用する、
シグナル伝達経路を必要とする（Flier, 1997；FlierとMaratos-Flier, 1998；S
piegelmanとFlier, 1996）。

【０００４】 マウスｏｂ遺伝子及びそのヒト相同体のクローニングにより、今やレプチンと
命名されているｏｂ遺伝子産生物（ｏｂタンパク質）が同定された（Zhangら, 1
994）。これは、主として白色脂肪細胞組織により、１６kDaのＭＷを有する非グ
リコシル化１４６アミノ酸ポリペプチドとして分泌される。仮定される脂肪由来
満腹因子としてのそれの役割と一致し、組換えレプチンのｏｂ／ｏｂマウスへの
投与は、食物摂取を低下させ、かつエネルギー消費を増大させることにより、肥
満表現型の迅速な反転を引き起こした（Campfieldら, 1995；Halaasら, 1995；P
elleymounterら, 1995）。更に、レプチンの投与は、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて
、全部ではないとしてもほとんどの代謝性及び内分泌性欠陥（不妊症を含む）を
矯正する（Chehabら, 1996）。

【０００５】 レプチンは、他のどの既知のタンパク質とも明らかな配列類似性を示さない。
しかし、構造予測分析に基づき、レプチンは、典型的な４つのα−らせんバンド
ル構造を有する造血系サイトカイン受容体ファミリーの一員として同定されてい
る。したがって、その受容体は、クラス１サイトカイン受容体スーパーファミリ
ーに属する。サイトカインとして、レプチンは、免疫防御及び炎症、及びメス齧
歯類における生殖及び妊娠、腎機能の調節並びに思春期開始の促進における、造
血系に及ぼす効果を含む多面的役割を有する。その中枢の視床下部作用に加えて
、レプチンは、また、その代謝作用を拡張する神経外組織にも効果を発揮する。
これは、脂肪酸及び脂質合成の抑制、組織のトリアシルグリセリド涸渇並びに脂
肪酸代謝の酵素及び産熱において重要な役割を演じると考えられる結合解離タン
パク質ＵＣＰ−２の発現増大を含む。最近の研究により、レプチンが、造血、細
胞における脂肪酸の恒常性、肝性代謝及びＴＮＦ誘導毒性に対する防御において
も一定の役割を演じることが証明されている。レプチンはまた、ＣＤ４⁺ Ｔ細
胞の増殖を刺激し、そして内皮細胞及び胃腸管の細胞に及ぼす直接作用を有する
。

【０００６】 レプチンは、ｄｂ遺伝子の産生物である高親和性受容体への結合によってその
作用を発揮する。この受容体は、元々マウス脈絡叢からクローン化し、そして選
択的スプライシングによって少なくとも６つのイソフォームで存在しうる（Tart
agliaら, 1995；Leeら, 1996）。これまで、短い細胞質テールを持つ遍在的に発
現するスプライス種（ＯＢ−Ｒａ）、及び長い細胞質ドメインを持つイソフォー
ム（ＯＢ−Ｒｂ）（主に視床下部のある核において発現される）に、多くの注意
が集まっていた。ＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロット分析によって、膵臓、肝臓
、肺、腎臓及び副腎、小腸及び脂肪組織を含む末梢組織、更には内皮細胞及びＣ
Ｄ４⁺ヘルパーＴ細胞における後者のイソフォームの発現も示された。マウスレ
プチン受容体遺伝子の詳細な構造が、最近報告された。ｄｂ／ｄｂマウスでは、
潜在性スプライス部位の使用を引き起こす点突然変異によって、断端型細胞質テ
ールを持つ受容体の発現が起こるが、これはシグナル伝達欠乏と思われる。ラッ
トにおける脂肪（ｆａ）遺伝子は、受容体の細胞外ドメインにおけるＧｌｎ２６
９Ｐｒｏ置換によるマウスｄｂ遺伝子の機能的相同体であり、シグナル伝達障害
及び肥満を導くと考えられる。この経路の進化的に保存された役割を強調すると
、相同突然変異が、ヒトにおいて最近報告された。重篤な早期発症肥満は、障害
レプチン（Mantagueら, 1997）又はレプチン受容体（Clementら, 1998）機能の
いずれかを導く突然変異を持つ患者において観察された。

【０００７】 配列相同性及び機能性側面に基づき、レプチン受容体は、クラスＩサイトカイ
ン受容体スーパーファミリーの一員であると考えられ、そしてＩＬ−６Ｒ複合体
のシグナル伝達成分であるｇｐ１３０、並びにＬＩＦ及びＧ−ＣＳＦ受容体に最
も密接に関連している。それ自体で、レプチン受容体は、ＪＡＫチロシンキナー
ゼ結合部位、及びリガンド誘導受容体チロシンリン酸化へのＳＴＡＴ−３の補充
に関係するＢｏｘ３のようなシグナル伝達に関係する代表的なモチーフを含む。
長イソフォームが、一般にシグナル伝達成分受容体であると考えられているが、
相違するシグナル伝達能力が、長イソフォームと短イソフォーム（両方ともＢｏ
ｘ１モチーフを含む）について報告されている。この受容体は、ｇｐ１３０とは
独立に、（リガンド誘導性）ホモ二量体として機能する。レプチン結合は、ＪＡ
Ｋ２及び多数のＳＴＡＴ（ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−３及びＳＴＡＴ−５ｂ）の
活性化を導くが、インビボの視床下部中心ではＳＴＡＴ−３活性化だけが観察さ
れた。安定的にＯＢ−Ｒ長イソフォームを発現する樹立肝癌細胞株では、レプチ
ン受容体は、内因性ＩＬ−６Ｒと機能的に同等であると考えられる。

【０００８】 視床下部におけるレプチン作用の１つの標的は、食欲を刺激する栄養恒常性の
重要なエフェクターである、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）である。レプチンは、Ｎ
ＰＹ生合成及び放出の阻害を誘導する。ＮＰＹ欠乏マウスは肥満を完全には反転
しないが、ＮＰＹは、ｏｂ／ｏｂ表現型の完全な発現に必要であるという観察に
よって、他のレプチン標的が存在する必要があると考えられる。このような別の
標的候補は、脳幹で産生され食物摂取を減少させるグルカゴン様ペプチド１（Ｇ
ＬＰ−１）、これも摂取行動の視床下部調節に関係するメラニン濃縮ホルモン、
食欲を阻害し代謝を刺激する視床下部コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）、並
びに最近報告された視床下部満腹因子であるオレキシン（orexin）及び、コカイ
ン−及びアンフェタミン−調節転写物（ＣＡＲＴ）を含む。レプチンによるプロ
−オピオ−メラノコルチン（pro-opio-melanocortin）遺伝子の発現に及ぼす効
果もまた報告されている。

【０００９】 レプチン又はその受容体の遺伝子に稀な上述の突然変異を持つ患者を除いて、
肥満のヒトは、一般に高レベルの循環レプチンを産生するが、このことは肥満が
、「レプチン耐性」と関連していることを示唆している。このような耐性は、幾
つかのレベル、すなわち、末梢レプチン機能不全、血液脳関門を通る飽和性レプ
チン輸送の調節不全、及び視床下部レプチン受容体の発現及び同受容体によるシ
グナル伝達でも起こると考えられる。レプチン耐性を導く種々の機作は、マウス
モデルにおける研究によって示唆される（Halaasら, 1997）。

【００１０】 発明の詳細な説明 レプチンのシグナル伝達及び機能における更に多くの洞察を得るために、神経
内分泌型であるＰＣ１２細胞株におけるレプチン介在性遺伝子誘導及びシグナル
伝達の解析を開始して、極初期応答及び後期標的遺伝子セットの両方を同定した
。３つの同定遺伝子が、レプチン機能又はインビボの肥満に関係していたため、
ＰＣ１２細胞株は、レプチン誘導遺伝子調節を研究するために生理学的に適切な
細胞株であると考えられる。ＳＴＡＴ−３タンパク質の活性化、及びＳＯＣＳ−
３遺伝子発現のアップレギュレーションは、ｏｂ／ｏｂマウスのレプチン処理に
より視床下部核において起こるが、ｄｂ／ｄｂマウスでは起こらないことが証明
されている（Vaisseら, 1996；Bjorbaekら, 1998）。ＭＴ−ＩとＭＴ−IIの両方
の遺伝子を標的として破壊したマウスは、血漿レプチンレベルの上昇を伴って肥
満になることが最近証明されたため、レプチン誘導極初期応答遺伝子としてのメ
タロチオネイン−IIの同定は、特に興味深い。これまで、他の明白な生理学的役
割をこれらのタンパク質に帰することができなかった。本発明によって、レプチ
ンがインビボでＭＴ−IIの発現を調節することが更に証明される。更に、セリン
／トレオニンキナーゼＦｎｋ、及び膵炎関連タンパク質Ｉ（Pancreatitis Assoc
iated Protein I）のインビボのレプチン介在性調節が示される。両方の遺伝子
転写物が、ＰＣ１２細胞においてレプチン誘導されたものとして同定され、この
インビトロモデル系の有効性が更に強調される。更に、新しいレプチンでアップ
レギュレートされた転写物が、ニューロン表現型に向かって分化したＰＣ１２細
胞において同定され、同じくインターロイキン６ファミリーのサイトカインに対
する受容体のｇｐ１３０シグナル伝達成分の起動（triggering）を介して転写物
が誘導された。

【００１１】 レプチン受容体の下流で作用し、かつレプチン機能を調節する分子は、明らか
に、ヒト肥満又は食欲不振を含む他の代謝障害の処置における使用可能性を与え
ることは明らかなはずである。

【００１２】 我々の発明は、場合により、アデニル酸シクラーゼに作用するか、又は該シク
ラーゼの１つ以上の下流標的に作用する化合物と組合せた、レプチン及び／又は
ｇｐ１３０を含む受容体複合体に結合し、その結果として、極初期応答遺伝子及
び／又は後期標的遺伝子が、神経−内分泌細胞又は神経−内分泌に由来する細胞
において誘導されることによってシグナル伝達カスケードを活性化する、サイト
カインを使用できるということである。

【００１３】 該シグナル伝達カスケードは、好ましくはレプチン受容体によって活性化され
、そして神経−内分泌細胞は、ＰＣ１２細胞である。

【００１４】 また、本発明は、場合により該化合物（ここで、化合物は、フォルスコリンで
ある）と組合せた、レプチン及び／又はｇｐ１３０を含む受容体複合体に結合す
るサイトカインの使用が含まれる。

【００１５】 更に、ＰＣ１２細胞は、該受容体複合体の活性化の前に、β−ＮＧＦ（ベータ
−神経成長因子）及びフォルスコリンでの処理によりニューロン状態に分化して
いてもよい。

【００１６】 場合によりフォルスコリンと組合せた本発明のレプチンの使用は、ＳＴＡＴ−
３、ＳＯＣＳ−３、メタロチオネイン−II、セリン／トレオニンキナーゼＦｎｋ
及びＭＲＦ−１のような極初期応答遺伝子の誘導を提供するが、一方でレプチン
とフォルスコリンとの組合せは、膵炎関連タンパク質Ｉ（Pancreatitis Associa
ted Protein I）、スクアレンエポキシダーゼ（Squalene Epoxidase）、ウリジ
ン二リン酸グルクロニルトランスフェラーゼ（Uridinediphosphate Glucuronyl
Transferase）及びアネキシンVIII（Annexin VIII）のような後期標的遺伝子に
著しい誘導作用を及ぼす。

【００１７】 レプチン誘導タンパク質Ｉ（Leptin Induced Protein I）（ＬＩＰ−Ｉ）及び
レプチン誘導タンパク質II（Leptin Induced Protein II）（ＬＩＰ−II）をコ
ードする２つの追加の転写物も同定された。ＬＩＰ−IIは、ヒトダウン症候群細
胞接着分子（Down Syndrome Cell Adhesion Molecule）（ＤＳ−ＣＡＭ）のラッ
トオルトローグ（orthologue）である。両方の場合で、フォルスコリン共刺激作
用は観察されなかった。β−ＮＧＦとフォルスコリンの組合せ処理により神経表
現型に分化したＰＣ１２細胞では、レプチンにより調節されるものとして膵炎関
連タンパク質III（Pancreatitis Associated Protein III）、ペリフェリン（Pe
ripherin）及びＭｘ２タンパク質が更に同定された。最後に、ＰＣ１２細胞にお
いてレプチンと比較してハイパー−ＩＬ−６により差動的に誘導される転写物を
探索するためのＲＤＡ実験から、膵炎関連タンパク質（Pancreatitis Associate
d Protein）ファミリーの別の一員であるＲｅｇ遺伝子、及びＨｉｐ−１が、Ｈ
−ＩＬ−６によって選択的にアップレギュレートされるものとして同定された。

【００１８】 また、本発明の範囲には、哺乳動物細胞、特にヒト細胞において、本発明によ
り単離された遺伝子のヒト相同体を使用する、極初期応答遺伝子及び／又は後期
標的遺伝子の誘導、又は該遺伝子の産生物の活性を、直接又は間接的に妨げる分
子のスクリーニングの方法であって、該遺伝子が、場合により、アデニル酸シク
ラーゼに作用するか、又は１つ以上のその下流標的に直接若しくは間接的に作用
する化合物と組合せた、レプチン及び／又はｇｐ１３０を含む受容体複合体に結
合するサイトカインにより誘導可能である方法が含まれる。

【００１９】 本発明の一部は、スクリーニング法によってこのように得られる分子及び該分
子を含む医薬組成物である。

【００２０】 本明細書において使用される「組成物」という用語は、当業者に知られている
適切な賦形剤の存在下であることでき、活性成分として本発明の該分子を含み、
そして当業者の知識の範囲内のあらゆる適切な投与方法によって、以下に詳述さ
れるようなあらゆる適切な組成の剤型で投与しうる医薬組成物のような、あらゆ
る組成物を意味する。投与の好ましい経路は、非経口である。非経口投与では、
本発明の組成物は、医薬学的に許容しうる賦形剤と合せて、液剤、懸濁剤又は乳
剤のような単位投与注射剤型に処方される。このような賦形剤は、本質的に非毒
性かつ非治療用である。このような賦形剤の例は、食塩水、リンガー液、デキス
トロース溶液及びハンクス液である。不揮発性油及びオレイン酸エチルのような
非水性賦形剤も使用することができる。好ましい賦形剤は、食塩水中の５％デキ
ストロースである。賦形剤は、緩衝化剤及び保存料を含む、等張性及び化学的安
定性を強化する物質のような少量の添加剤を含んでもよい。

【００２１】 こうして得られる本発明の単離機能性分子は、同種移植拒絶、ＧＶＨＤ、アレ
ルギー及び自己免疫疾患を予防するのに治療上有効な濃度で投与される。用量及
び投与の様式は、個体に依存する。一般に、本組成物は、単離機能性タンパク質
／分子が、１μg/kg〜１０mg/kg、更に好ましくは１０μg/kg〜５mg/kg、最も好
ましくは０．１〜２mg/kgの間の用量で与えられるように投与される。好ましく
は、大量瞬時投与量として与えられる。連続短時間注入（３０分間）も利用する
ことができる。本発明の単離機能性タンパク質／分子を含む組成物は、５〜２０
μg/kg/分の間、更に好ましくは７〜１５μg/kg/分の間の用量で注入してもよい
。

【００２２】 特別な場合によれば、必要とされる本発明の単離された機能性タンパク質の「
治療上有効量」は、治療を必要とする患者を治癒させるか、又は少なくとも疾患
及びその合併症を部分的に制止するのに充分な量であるように決定すべきである
。このような使用に有効な量は、疾患の重篤度、及び患者の健康の全身状態に依
存する。患者に必要とされ許容される用量及び頻度に応じて、単回又は多回投与
が必要とされうる。

【００２３】 本説明に関して、「分子」、「タンパク質」及び「化合物」という用語は、反
する記載がなければ相互転換可能である。

【００２４】 本発明を更に開示するために、更に詳細な説明が後述される。

【００２５】 ＰＣ１２細胞に及ぼすレプチン、及びフォルスコリン又はβ−ＮＧＦの相乗効果 神経−内分泌−関連細胞型におけるレプチン受容体シグナル伝達を研究するた
めに、我々は、マウスレプチン受容体の長又は短イソフォームのための発現ベク
ター（それぞれ、ｐＭＥＴ７−ｍＬＲｌｏ及びｐＭＥＴ７−ｍＬＲｓｈ）でＰＣ
１２細胞を一時的にトランスフェクションして、レプチンによる遺伝子誘導をモ
ニターした。ＰＣ１２細胞株は、移植可能なラット副腎褐色細胞腫から樹立した
もので、神経細胞の分化のためのモデル系としてしばしば使用される。組換えラ
ットβ−神経成長因子（β−ＮＧＦ）での刺激により、成長停止及び樹状突起の
形成及びニューロンマーカーの発現が起こる。マウスレプチン−ＳＥＡＰ融合タ
ンパク質を使用する結合試験、及びＲＴ−ＰＣＲ分析によって、未分化であれ分
化であれＰＣ１２細胞がレプチン受容体を発現しないことが証明された。レプチ
ン応答性を測定するために、レプチン受容体の刺激が、ＮＰＹ及びＰＯＭＣを含
む種々の神経ペプチドの発現を変化させるという観察に基づき、種々のレポータ
ー遺伝子構築物を開発した。第１のレポーター構築物は、ルシフェラーゼ遺伝子
に結合させたラット神経ペプチドＹ（ｒＮＰＹ）プロモーター配列の５００bp断
片を含む（ｐＧＬ３−ｒＮＰＹｌｕｃ）。図１Ａは、ｒＮＰＹレポーター構築物
及びｐＭＥＴ７−ｍＬＲｌｏ（しかしｐＭＥＴ７−ＬＲｓｈは含まない）で同時
トランスフェクションしたＰＣ１２細胞のレプチン刺激により、ルシフェラーゼ
活性の穏やかな刺激が起こることを示す。しかし前者のケースにおけるアデニル
酸シクラーゼの刺激物質であるフォルスコリンとの共刺激は、１４倍まで強化さ
れたレポーター活性を示した。最適な共刺激条件は、１００ng/mlレプチン及び
１０μMフォルスコリンと決定した（図１Ｂ）。この効果は、刺激の約７２時間
後に最適となった。

【００２６】 ＰＣ１２細胞におけるレプチン応答性は、マウスレプチン受容体の長イソフォ
ームを安定に発現するクローン（ＰＣ１２−ＬＲ８、下記を参照のこと）を使用
して更に検討した。ヒトＰＯＭＣ（プロオピオメラノコルチン（proopiomelanoc
ortin））プロモーターに基づくレポーター構築物（ｐＧＬ３−ＰＯＭＣｌｕｃ
）（図１Ｃ）、又はラット膵炎関連タンパク質Ｉ（Pancreatitis-Associated Pr
otein I）プロモーターに基づくレポーター構築物（以下を参照のこと）（図１
Ｄ）をＰＣ１２−ＬＲ８のトランスフェクション後、レプチン誘導ルシフェラー
ゼ活性を測定した。β−ＮＧＦの投与（１ng/ml）が、両方のレポーター構築物
について、フォルスコリンの共刺激作用を模倣した。β−ＮＧＦ及びフォルスコ
リンの効果は、このクローンにおいて相加的であると考えられた（図１Ｃ及び１
Ｄ）。

【００２７】 ＰＣ１２細胞におけるレプチンにより調節される遺伝子の同定 ＰＣ１２細胞株においてレプチンにより調節される遺伝子を探索するために、
原法（HubankとSchatz, 1994）の改変法を利用して、ＲＤＡ（提示差分析）実験
を行った。この方法を利用すると、ｐＭＥＴ７−ｍＬＲｌｏで一時的にトランス
フェクションした、レプチン−フォルスコリン共刺激ＰＣ１２細胞からの転写物
に対応するアンプリコンをクローン化できる。３ラウンドのサブトラクション／
増幅後、選択的に増幅されたバンドを精製し、ｐＣＤＮＡ３又はｐＣＲブラント
ベクター（Invitrogen）にサブクローン化した。続くＤＮＡ配列決定により、強
力に誘導された転写物が、ラット膵炎関連タンパク質Ｉ（ｒＰＡＰ Ｉ）をコー
ドすることが明らかになった。この観察に基づき、単純な１チューブＲＴ−ＰＣ
Ｒに基づく方法をセットアップし、レプチン受容体長イソフォームを安定に発現
するＰＣ１２サブクローンを選択した（図２Ａ）。更に別の実験のために、１つ
の安定なクローンＰＣ１２−ＬＲ８を選択した（図２Ｂ）。クローン化アンプリ
コンのコレクションからの個々の挿入配列を放射標識し、レプチン依存性遺伝子
調節を確認し、ＰＣ１２−ＬＲ８細胞株でのノーザンブロット分析により更に詳
細に研究した。表１に示されるように、全部で１１個のレプチン調節遺伝子を同
定した。アップレギュレートされる遺伝子だけが観察された；遺伝子発現のレプ
チン誘導ダウンモジュレーションについて選択する平行実験では、アンプリコン
が１つも得られなかった。興味深いことに、同定された遺伝子産生物の幾つかは
、既にレプチンシグナル伝達又は肥満に結び付けられているものであった。

【００２８】 アネキシンVIII（Annexin VIII）は、肺、皮膚、肝臓、及び腎臓において発現
されるカルシウム依存性リン脂質結合タンパク質である。アネキシンVIIIの生理
学的機能は未知のままである。

【００２９】 ＦＧＦ誘導性キナーゼ（Ｆｎｋ）は、最初はマウスＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞に
おいて繊維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−１により誘導されるセリン／トレオニンキナ
ーゼとして同定された。これは、セリン／トレオニンプロテインキナーゼのポロ
（polo）−ファミリー（ヒトＰｒｋ、マウスＳｎｋ、ヒト及びマウスＰｌｋ、マ
ウスＳａｋ、ドロソフィラ（Drosophila）Ｐｏｌｏ、及び酵母Ｃｄｃ５を含む）
に密接に関連している。成体の動物では、Ｆｎｋ−ｍＲＮＡが、皮膚において高
レベルで発現するが、脳、小腸、腎臓、肺及び卵巣においても検出される。新生
動物では、Ｆｎｋ転写物が、小腸、腎臓、肝臓、肺及び皮膚において高レベルで
発現する。関連するＰｒｋ及びＰｌｋキナーゼは、それぞれ造血細胞（Liら, 19
96）及び一次Ｔ細胞（Holtrichら, 1994）においてサイトカインにより誘導され
る。これらのキナーゼは、細胞増殖において一定の役割を演じるが、これらの正
確な役割は未だ不明なままである。

【００３０】 メタロチオネイン−II（ＭＴ−II）は、重金属の解毒及び恒常性において、フ
リーラジカルの排除において、及び急性期応答において機能することが報告され
ている、金属結合タンパク質のファミリーの一員である。重要なことに、Ｃ５７
ＢＬ／６Ｊ−１２９Ｏｌａ遺伝的背景のＭＴ−Ｉ／II欠乏マウスは、軽度の晩発
性肥満を示すことが最近報告された（Beattieら, 1998）。

【００３１】 モジュレーター認識因子１（Modulator Recognition Factor 1）（ＭＲＦ−１
）は、あまり性状解析されていないタンパク質ファミリーに属するＤＮＡ結合タ
ンパク質である。（ヒト相同体及び関連ヒトＭＲＦ−２の配列のGenBank受入番
号は、それぞれＭ６２３２４及びＭ７３８３７である）。

【００３２】 膵炎関連タンパク質Ｉ（Pancreatitis-Associated Protein I）（ＰＡＰ Ｉ
）は、ラット膵臓（内分泌及び外分泌細胞の両方）に少量存在するＣ型レクチン
関連分泌タンパク質であり、膵炎の急性期に急速に過剰発現する。ＰＡＰ Ｉの
生理学的役割は、現在なお不明であるが、その急性期タンパク質としての急性膵
炎への関与は、組織防御及び／又は修復における役割を示唆する。ＰＡＰ Ｉも
また、正常小腸において発現され、摂食により誘導される（Dusettiら, 1995）
。

【００３３】 転写のシグナルトランスデューサ及びアクチベーター３（signal transducer
and activator of transcription 3）（ＳＴＡＴ−３）は、種々のサイトカイン
についてシグナルを媒介する重要な転写因子である。レプチンシグナル伝達にお
けるＳＴＡＴ−３の決定的に重要な役割が、細胞株（Baumannら, 1996）及びｏ
ｂ／ｏｂマウス（Vaisseら, 1996）において報告されている。

【００３４】 スクアレンエポキシダーゼ（Squalene epoxidase）は、コレステロール生合成
における律速酵素である。ステロールによるスクアレンエポキシダーゼの転写調
節は、協調的に制御される生合成経路の一部である（Nakamuraら, 1996）。

【００３５】 サイトカインシグナル伝達のサプレッサー−３（Suppressor of Cytokine Sig
nalling-3）（ＳＯＣＳ−３）は、ＳＯＣＳタンパク質の増大するファミリーに
属する。これらのタンパク質は、幾つかのサイトカインシグナルトランスダクシ
ョン経路の細胞内インヒビターとして作用する。ＳＯＣＳ−３が、インビボでレ
プチン耐性に寄与しうることが最近報告された。（Bjorbaekら, 1998）。

【００３６】 ウリジン二リン酸グルクロニルトランスフェラーゼ（Uridinediphosphate Glu
curonyl Transferase）（ＵＧＴ）は、ビリルビン及び薬物解毒、更にはステロ
イドの不活化及び***、並びにプロテオグリカン側鎖形成に関与する重要な酵素
である。グルクロン酸での化合物の抱合により、前駆体の分子よりも分子が強酸
性になり、そして生理学的pHでの水溶性が高まることによって、代謝、輸送及び
分泌が促進される。

【００３７】 それぞれレプチン誘導タンパク質（Leptin Induced Proteins）のＬＩＰ−Ｉ
及びＬＩＰ−IIをコードする、これまで同定されていなかった遺伝子からの転写
物に由来する、２つのアンプリコンをクローン化した（図３、４）。ＬＩＰ−II
は、イムノグロブリンスーパーファミリーに属し、そしてヒトダウン症候群細胞
接着分子（Down Syndrome Cell Adhesion Molecule）、ＤＳＣＡＭのラットオル
トローグ（orthologue）である。ＤＳＣＡＭの発現は、主として脳において起こ
り、そして神経発生に関係している。これらのレプチン誘導タンパク質ＬＩＰ−
Ｉ及びＬＩＰ−IIは、これまで未知であり、よってそれ自体が新しく同定された
核酸／タンパク質配列であり、そして本発明の一部を形成する。

【００３８】 レプチン調節遺伝子の探索はまた、分化ＰＣ１２細胞まで拡大された（図５）
。接着性ＰＣ１２−ＬＲ８細胞をβ−ＮＧＦ及びフォルスコリンで５日間処理す
ると、成長停止、分岐神経突起の形成及び小胞の蓄積が起こった。再度、レプチ
ンで２４時間処理した分化細胞からの、又は未処理細胞からのｍＲＮＡを用いて
、両方とも引き続きβ−ＮＧＦ及びフォルスコリンの存在下でＲＤＡ実験を行っ
た。３つのレプチンでアップレギュレートされた転写物を同定した（表１）。興
味深いことに、遺伝子産生物の１つのＰＡＰ IIIは、ＰＡＰ Ｉと同じタンパ
ク質ファミリーに属する。

【００３９】 Ｍｘ２は、抗ウイルス防御に関与するＩ型インターフェロン誘導性遺伝子であ
る。未分化細胞における非常に弱い発現とは対照的に、分化ＰＣ１２細胞では高
発現レベルが観察される。

【００４０】 ペリフェリン（Peripherin）は、III型中間径フィラメントの一部である、細
胞骨格成分である。未分化細胞に比較すると、分化細胞では発現レベルの増大が
観察される。インターロイキン６（ＩＬ−６）及び白血病阻害因子（Leukemia i
nhibitory Factor）（ＬＩＦ）によるアップレギュレーションが報告されている
。

【００４１】 膵炎関連タンパク質III（Pancreatitis-Associated Protein III）（ＰＡＰ
III）は、上述の、Ｃ型動物レクチンのＰＡＰファミリーの一員である。これは
また、摂食により正常小腸においても誘導される（Dusettiら, 1995）。

【００４２】 レプチンと比較して、ハイパー−ＩＬ−６（Ｈ−ＩＬ−６）により示差的（か
つ選択的）に誘導される転写物を同定するために、別のＲＤＡ実験を行った（図
６）。Ｈ−ＩＬ−６は、ＩＬ−６と分泌ＩＬ−６Ｒサブユニットとの融合タンパ
ク質である（Fischerら, 1997）。多くの場合に、Ｈ−ＩＬ−６処理は、レプチ
ンで観察されたのと同じ遺伝子セットのアップレギュレーションを起こした。レ
プチンでは誘導されない、２つのＨ−ＩＬ−６誘導転写物が同定された。ＨＩＰ
−Ｉ（ハイパー−ＩＬ−６誘導タンパク質Ｉ）は、新規な遺伝子転写物に対応す
る（図７）。Ｒｅｇは、Ｃ型レクチンのＰＡＰファミリーの別の一員である。Ｒ
ｅｇは、元々は再生ラット膵島からのｃＤＮＡライブラリーから単離された。他
の名称は、膵石タンパク質（Pancreatic Stone Protein）（ＰＳＰ）、膵糸タン
パク質（Pancreatic Thread Protein）（ＰＴＰ）、膵島細胞再生因子（Islet C
ell Regenerating Factor）及びリトスタチン（Lithostatin）である。これは、
膵ベータ細胞のための増殖因子と考えられている。同様に、前に同定された、Ｐ
ＡＰ Ｉ及びＰＡＰ IIIをコードする関連転写物もまた、フォルスコリン共刺
激を必要とするレプチンとは対照的に、Ｈ−ＩＬ−６により強く誘導されると考
えられる。

【００４３】 誘導の動態は、極初期応答遺伝子及び後期標的遺伝子を同定する。 次に、レプチン処理による、非分化ＰＣ１２細胞における上述の転写物の誘導
の動態を解析した。興味深いことに、２つの型の遺伝子セットを区別できた：Ｆ
ｎｋ、ＭＴ−II、ＭＲＦ−１、ＳＴＡＴ−３及びＳＯＣＳ−３を含む極初期応答
遺伝子の群（これらの場合は、誘導は、４時間以内に起こる（図８Ａ））、並び
にＰＡＰ Ｉ、ＵＧＴ、Ａｎｎ VIII及びスクアレンエポキシダーゼを含む一連
の後期活性化標的遺伝子（刺激の６時間後より前には誘導が起こらない（図８Ｃ
））。次に極初期応答遺伝子の誘導を更に詳細に検討した（図８Ｂ）。最適な刺
激は、誘導の３０分後（ＳＯＣＳ−３）と８時間後（ＳＴＡＴ−３）の間を変動
した。ＳＯＣＳ−３ ｍＲＮＡの合成の動態は、刺激の２時間後に既に急速な低
下を示した。後期標的遺伝子セットの場合には、最適なｍＲＮＡレベルは、誘導
の２２時間後（ＰＡＰ Ｉ、ＵＧＴ）と９６時間以上後（アネキシンVIII、スク
アレンエポキシダーゼ）の間で観察された。

【００４４】 図８から明らかなように、フォルスコリン共刺激でも、両方の遺伝子セットを
区別できる。極初期応答遺伝子の場合には、ＭＴ−II及びＭＲＦ−１について幾
らかの共刺激が明らかであるが、遅い時点のみであり、初期誘導期では見られな
い。ＳＯＣＳ−３の場合には、フォルスコリン同時処理が、誘導の減少さえもた
らす。これとは対照的に、刺激の２２時間後から、ＰＡＰ Ｉ、ＵＧＴ、Ａｎｎ
VIII及びスクアレンエポキシダーゼの場合では、強い共刺激効果が見られる。

【００４５】 後期遺伝子セットの誘導の機作を扱うために、ｒＰＡＰ Ｉ及びアネキシンVI
II ｍＲＮＡ発現に及ぼすタンパク質合成インヒビターのシクロヘキシミドの作
用を測定した。シクロヘキシミドでの処理（５０μM、誘導の３０分前に開始し
て８．５時間）は、誘導の２４時間後の発現を激しく減少させたことを示したが
、これは後期標的遺伝子セットの誘導には新規タンパク質合成が必要であること
を暗示している。

【００４６】 ｏｂ／ｏｂマウスにおけるレプチンによるＭＴ−II、Ｆｎｋ及びＰＡＰ Ｉ発現
の調節。 肥満用の我々のインビトロモデル系の価値を評価するために、我々は、インビ
ボで、同定された遺伝子のサブセットのレプチンによる調節を検討した。組換え
ヒトレプチン（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems））を、レプチン欠乏ｏｂ／ｏ
ｂマウスに１００μgレプチン／マウスの単回用量で腹腔内投与した。処理の５
時間後マウスを頸部脱臼により屠殺して、肝臓及び空腸から全ＲＮＡを単離した
。それぞれＭＴ−II、Ｆｎｋ及びＰＡＰ Ｉをプローブとして使用して、ノーザ
ンブロット分析を実施した（図９）。ｏｂ／ｏｂマウスのレプチン処理によって
、肝臓におけるＭＴ−II及びＦｎｋ ｍＲＮＡ発現の明白な誘導が起こったが、
一方空腸におけるＰＡＰ Ｉの発現は、レプチンによってダウンレギュレートさ
れた。別の実験において、ｏｂ／ｏｂマウス４匹中３匹が、２Ａ５抗体（２００
μg/マウス）と組合せたレプチン（１００μg/マウス）での刺激の２時間後、肝
臓におけるＭＴ−II及びＦｎｋ ｍＲＮＡの明白な誘導を示した。２Ａ５は、イ
ンビボでレプチン活性を強化することが以前に証明されている（Verploegenら,
1997）。注射の１２時間後、発現レベルは、対照レベルに戻った。

【００４７】 野生型マウスにおけるＭＴ−II、Ｆｎｋ及びＰＡＰ Ｉ発現に及ぼす飢餓の効果
。 我々はまた、野生型マウスの肝臓におけるＭＴ−II及びＦｎｋ発現に及ぼす飢
餓の効果を検討した（図１０Ａ）。２４時間飢えさせたマウスに、２Ａ５抗ヒト
レプチン抗体（２００μg/マウス）と組合せた、ヒトレプチンの単回注射を腹腔
内投与（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）、５０μg/マウス）した。対照とし
て、同様にエンドトキシン不含ＰＢＳの単回注射を実施した。レプチンの効果は
、長期飢餓条件下で２、６及び１２時間後、ノーザンブロット分析により評価し
た。飢餓条件により、肝臓におけるＭＴ−II及びＦｎｋ ｍＲＮＡ発現の適度の
上昇が起こった。この効果は、レプチン＋２Ａ５処理により著しく強化されて、
注射の２時間後ＭＴ−II及びＦｎｋ発現の強い誘導が起こった。レプチン投与の
６時間後、ＭＴ−II ｍＲＮＡ発現は、ＰＢＳ処理対照マウスにおいて観察され
るレベルまで戻ったが、一方Ｆｎｋ発現は、対照群と比較して、高発現レベルを
維持した。飢餓はまた、空腸におけるＭＴ−II ｍＲＮＡの自発誘導を引き起こ
した。肝臓における観察とは対照的に、この効果は、レプチン＋２Ａ５処理によ
り注射の６時間後に抑制された。ＭＴ−IIの発現レベルは、注射の１２時間後に
対照レベルまで回復した（図１０Ｂ）。類似のパターンは、空腸におけるＰＡＰ
Ｉ ｍＲＮＡ発現についても観察され、これはＰＢＳ処理対照に比較して、飢
餓マウスにおけるレプチン＋２Ａ５処理の２４時間後の減少を示した。

【００４８】 本発明を更に説明するために、明快さのために幾つかの実施例が後述される。

【００４９】

【実施例】

実施例１ 細胞培養及びトランスフェクション。 ＰＣ１２細胞は、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ｉＦＣＳ）及びゲンタマイシ
ン（５０μg/ml）を含有するグルタマックス−Ｉ（glutamax-I）（ギブコ社（Gi
bcoBRL））を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。細胞は、他に記載がなけれ
ば、培地単独で、又は１００ng/mlのマウスレプチン（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D S
ystems））、１０μMの濃度でフォルスコリン（シグマ（Sigma））、若しくは両
方の組合せを補足した培地で処理した。

【００５０】 ニューロン分化のためには、再懸濁したＰＣ１２を、ラット尾コラーゲン（コ
ラボラティブ・バイオメディカル・プロダクツ（Collaborative Biomedical Pro
ducts））被覆プレートに、１０％熱不活化ウマ血清、５％ ｉＦＣＳ及びゲン
タマイシンを含有するグルタマックス−Ｉを含むＲＰＭＩ１６４０培地中、２〜
３×１０⁶細胞/２５cm²フラスコで接種した。培養１日後、培地を新しくするこ
とで非接着性細胞画分を除去した。分化は、約５日間のβ−ＮＧＦ（１０ng/ml
、Ｒ＆Ｄシステムズ）とフォルスコリン（１０μM）との組合せ処理により誘導
した。培地は、２〜３日及び５日後に置換した。

【００５１】 マウスレプチン受容体の長及び短イソフォーム用の発現ベクターとしてｐＭｅ
ｔ７ベクターを使用した（それぞれｐＭＥＴ７−ｍＬＲｌｏ及びｐＭＥＴ７−ｍ
ＬＲｓｈと称される）。ｐＭｅｔ７は、Takebe（Takebeら, 1988）により報告さ
れたように、ＳＲαプロモーターを利用する哺乳動物ｐＭＥ１８Ｓ発現ベクター
の改変型である。ＰＣ１２細胞は、エクイバイオ（Equibio）の「イージージェ
クト・ワン（Easyject one）」エレクトロポレーターを使用して電気穿孔により
トランスフェクションした。典型的には、１０⁷細胞を０．４cm電極ギャップキ
ュベット中で５μgベクターで３００Ｖ及び１５００Ｃで電気穿孔した。各タン
パク質の細胞表面発現は、レプチン−分泌アルカリ性ホスファターゼ融合タンパ
ク質の特異的結合により測定した（以下を参照のこと）。

【００５２】 Ｃｏｓ１細胞は、１０％ ｉＦＣＳ（ギブコ社）を補足したＤＭＥＭ中で維持
して、リポフェクタミン（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies））を
用いてｐＭＥＴ７−レプチンＳＥＡＰ（マウスレプチン−分泌アルカリ性ホスフ
ァターゼ融合タンパク質を発現するベクター）でトランスフェクションした。培
地を１６時間後に置換して、調整培地（ＣＭ）を６４時間後に回収した。レプチ
ン−ＳＥＡＰ融合タンパク質の推定濃度は、約１μg/mlであった。

【００５３】 実施例２ レプチン受容体の長イソフォームを安定に発現する細胞株の選択 ＰＣ１２細胞を、ネオマイシン耐性マーカーを含有するpHＣＭＶ−ＭＣＳベク
ターと一緒にｐＭＥＴ７−ｍＬＲｌｏ発現ベクターで電気穿孔した。トランスフ
ェクションした細胞は、グルタマックス−Ｉ（ギブコ社）を含有し、１０％熱不
活化ウシ胎仔血清及びゲンタマイシン（５０μg/ml）を補足したＲＰＭＩ１６４
０培地中での増殖について選択した。細胞は、最初に５００μg/ml Ｇ４１８硫
酸塩（カルビオケム（Calbiochem））を含有する選択培地中で７日間、８日目か
らは７５０μg/ml Ｇ４１８中で増殖させた。４週間の増殖後、コロニーを、７
５０μg/ml Ｇ４１８を含有する培地に入れて４８ウェルプレートに移した。１
チューブＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、レプチン応答性及びＰＡＰ Ｉ遺伝子活性化
について、サブクローンを選択した。簡単に述べると、細胞溶解後、ｍＲＮＡを
ビオチン標識オリゴｄＴとハイブリダイズして、ストレプトアビジン被覆チュー
ブに捕捉させた。３回洗浄後、ＰＡＰ Ｉ遺伝子誘導の検出について最適化した
同じチューブをＲＴ−ＰＣＲのために使用した（ｍＲＮＡ捕捉及びタイタン１チ
ューブ法（Titan One Tube procedure）、ベーリンガー・マンハイム（Boehring
er Mannheim））。

【００５４】 レプチン結合測定法 ＰＣ１２細胞でのレプチン受容体の細胞表面発現は、報告（Baumannら, 1996
；FlanaganとLeder, 1990）されたようにマウスレプチン−分泌アルカリ性ホス
ファターゼキメラタンパク質を使用して測定した。簡単に述べると、細胞は、ト
ランスフェクションの４８時間後に洗浄（洗浄緩衝液：ＲＰＭＩ１６４０、０．
１％ ＮａＮ₃、２０mMヘペスpH７．０、０．０１％トゥイーン２０）して、洗
浄緩衝液中にキメラタンパク質を含有するＣｏｓ１ ＣＭの１／１０希釈液と一
緒に室温で９０分間インキュベートした。６連続洗浄工程の後、細胞は、１％
ＴＸ−１００、１０mMトリス．ＨＣｌ pH７．４を含有する緩衝液中で溶解して
、内因性アルカリ性ホスファターゼを不活化するために溶解物を６５℃で３０分
間処理した。アルカリ性ホスファターゼ活性は、製造業者の説明書によりＣＳＰ
Ｄ基質（ホスファライト（PhosphaLight）、トロピックス（Tropix））を使用し
て、トップカウントＮＸＴ化学ルミネセンスカウンター（TopCount.NXT Chemilu
minescence Counter）（パッカード（Packard））中で測定した。

【００５５】 実施例３ ＲＤＡ（提示差分析（representational difference analysis））。 一時的にレプチン受容体長イソフォームでトランスフェクションしたＰＣ１２
細胞から、又はレプチン受容体長イソフォームを安定に発現するニューロン分化
ＰＣ１２−ＬＲ８細胞からの、示差的に発現されるｃＤＮＡをクローン化するた
めに、ＲＤＡを利用した。両方のケースにおいて、クローニングは、レプチン＋
フォルスコリン又はフォルスコリン単独のいずれかで刺激した細胞からのｍＲＮ
Ａを使用して行った。このＲＤＡ法は、本質的には当初報告（HubankとSchatz,
1994）され、そしてBraunら（Braunら, 1995）により改変されたように行った。
ＰＣ１２細胞は、ｐＭＥＴ７−ＬＲｌｏ発現ベクターでトランスフェクションし
て、フォルスコリン単独又はフォルスコリンとレプチンとの組合せで７２時間刺
激した。ニューロン分化ＰＣ１２−ＬＲ８細胞の場合には、ｍＲＮＡは、ニュー
ロン分化を誘導するために５日間上述のようにβ−ＮＧＦ及びフォルスコリンで
処理し、続いてレプチン（１００ng/ml）で２４時間処理するか、又は追加の処
理なしの細胞から得た。ハイパー−ＩＬ−６処理の場合には、未分化ＰＣ１２−
ＬＲ８細胞は、Ｈ−ＩＬ−６（５ng/ml）又はレプチン（１００ng/ml）のいずれ
かで２４時間処理し、次にｍＲＮＡの単離及びＲＤＡ分析を行った。

【００５６】 ｍＲＮＡは、ファストトラック法（Fast Track method）（インビトロジェン
（Invitrogen））を使用して単離した。各細胞集団のｍＲＮＡの２μg試料をＲ
ＤＡ分析に使用した。ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡから合成して、ＤｐｎIIで消化した
。２つのオリゴヌクレオチドアダプター分子の５′ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣ
ＣＴＣＴＣＡＣＣＧＣＡ３′（Ｒ−Ｂｇｌ−２４）及び５′ＧＡＴＣＴＧＣＧＧ
ＴＧＡ３′（Ｒ−Ｂｇｌ−１２）をＤｐｎII消化ｃＤＮＡに連結した。この混合
物をＲ−Ｂｇｌ−２４オリゴヌクレオチドでのＰＣＲにより増幅して、アダプタ
ーをＤｐｎIIで除去した。第２の対のアダプターの５′ＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡ
ＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡ３′（Ｊ−Ｂｇｌ−２４）及び５′ＧＡＴＣＴＧＴ
ＴＣＡＴＧ３′（Ｊ−Ｂｇｌ−１２）は、レプチン−フォルスコリン刺激細胞集
団からの増幅断片に連結して、フォルスコリン刺激細胞集団からのＲ−Ｂｇｌ−
２４増幅ｃＤＮＡ断片（Ｒ−Ｂｇｌアダプターは除去）と１：１００の比で２４
時間ハイブリダイズした。このハイブリダイゼーション混合物を、ＰＣＲによる
増幅のための鋳型として使用した。第２ラウンドのサブトラクションは、第１ラ
ウンドＰＣＲ産生物からＪ−Ｂｇｌアダプターを除去し、第３の対のオリゴヌク
レオチドアダプターの５′ＡＧＧＣＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＴＣＣＧＡＧＧＧＡＡ
３′（Ｎ−Ｂｇｌ−２４）及び５′ＧＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＧ３′（Ｎ−Ｂｇｌ
−１２）を連結し、そして１：８００の比でドライバーアンプリコンとハイブリ
ダイズさせることにより行った。第３ラウンドのサブトラクション及び増幅は、
第１ラウンドと同じ条件を用いて行った。続いて転写物を、ｐＣＤＮＡ３又はｐ
ＣＲ−ブラント（pCR-Blunt）（インビトロジェン）ベクター中にサブクローン
化した。多くの挿入ＤＮＡは、製造業者の説明書によりオートリード・シークエ
ンシング・キット（Autoread Sequencing Kit）を伴うアルフ・エクスプレス・
シークエンサー（Alf Express Sequencer）（ファルマシア（Pharmacia））を使
用して配列決定した。挿入配列を配列決定するためのプライマーは、ｐＣＲ−ブ
ラントクローン用のＣ１５標識Ｍ１３順方向プライマー、並びにｐＣＤＮＡ３ク
ローン用の５′−ＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＣＴＧＧＣ順方向及び５′−
ＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＣ逆方向プライマーとした。他のケー
スでは、配列決定は、Ｍ１３順方向プライマーを用いてＡＢＩプリズム３７７Ｄ
ＮＡシークエンサー（ABI Prism 377 DNA sequencer）（パーキン・エルマー（P
erkin Elmer））を使用して行った。

【００５７】 実施例４ ノーザンブロット及びレポーター分析。 ＲＮイージー法（RNeasy method）（キアジェン（Qiagen））を用いて、ＰＣ
１２細胞から全ＲＮＡを調製した。ＲＮＡ（１０μg）は、１．５％アガロース
、６％ホルムアルデヒドゲル上で分離し、ナイロン膜（ゼータ−プローブＧＴゲ
ノミック（Zeta-Probe GT Genomic）、バイオ−ラッド（Bio-Rad））に移して、
ＵＶ照射を使用して架橋させた。このフィルターを、〔³²Ｐ〕ｄＣＴＰ標識ＤＮ
ＡプローブとエクスプレスＨｙｂ（ExpressHyb）溶液（クローンテク（Clontech
））中で６８℃で１時間ハイブリダイズさせて、２×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤ
Ｓで室温で３回及び０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で５０℃で２回洗浄し
た。ブロットを、−７０℃で増感スクリーンを含むバイオマックスＭＳ（BioMax
MS）フィルム（コダック（Kodak））に露出させてオートラジオグラフを得た。
全てのノーザンブロットは、β−アクチンプローブを用いるハイブリダイゼーシ
ョンによって標準化した。

【００５８】 トランスフェクションした細胞において、化学ルミネセンスによりルシフェラ
ーゼ活性を測定した。簡単に述べると、１×１０⁵細胞を１００μlの溶解緩衝液
（２５mMトリス、pH７．８、Ｈ₃ＰＯ₄を含む；２mM ＣＤＴＡ；２mM ＤＴＴ；
１０％グリセロール；１％トリトンＸ−１００）中で溶解した。７０μlのルシ
フェラーゼ基質緩衝液（２０mMトリシン；１．０７mM（ＭｇＣＯ₃）₄Ｍｇ（ＯＨ
）₂・５Ｈ₂Ｏ；２．６７mM ＭｇＳＯ₄；０．１mM ＥＤＴＡ；３３．３mM Ｄ
ＴＴ；２７０μMコエンザイムＡ（リチウム塩）；４７０μMルシフェリン（ダチ
ェファ（Duchefa））；５３０μM ＡＴＰ、最終pH７．８）を１００μlの細胞
溶解液に加えて、トップカウントＮＸＴ化学ルミネセンスカウンター（TopCount
.NXT Chemiluminescence Counter）（パッカード（Packard））により５秒間測
定した。

【００５９】 実施例５ インビボの遺伝子発現の分析 実験開始時９週齢の特定病原体除去メスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｅｐ^obマウス（
また、ｏｂ／ｏｂという）は、ジャクソンラボラトリー（The Jackson Laborato
ry）（メイン州、米国）から入手した。実験開始時８週齢の特定病原体除去Ｃ５
７ＢＬ／６ＮＣｒｌＢｒマウス（また、野生型（ｗｔ）という）は、チャールズ
・リバーズ・ラブズ（Charles Rivers Labs.）から入手した。マウスは、１２時
間の明／暗サイクルの温度制御された環境で飼い、飢餓実験を除いて、自由に水
及び食物を摂取させた。全ての実験は、「動物保護及び使用に関するヨーロッパ
のガイドライン（European Guidelines on Animal Care and Use）」に沿って行
った。組換えヒトレプチン（Ｒ＆Ｄシステムズ）は、エンドトキシン不含ＰＢＳ
に希釈して、１００μg/マウスの用量で腹腔内投与した。ヒトレプチンに対して
産生させたモノクローナル抗体である２Ａ５（Verploegenら, 1997）の同時投与
の場合には、レプチンの用量は、５０μg/マウスまで減少させた。抗体の用量は
、２００μg/マウスとした。抗体のエンドトキシン含量は、発色性カブトガニ（
Limulus）アメーバ様細胞溶解物測定法（コーテスト（Coatest）、クロモジェニ
ックス（Chromogenix）、ストックホルム、スウェーデン）により評価すると、
０．０７ng/mgタンパク質であった。マウスは、頸部脱臼を用いて屠殺した。組
織を直ちに切除して、液体窒素中で凍結した。ＲＮＡ抽出及びノーザンブロット
分析は、上述のように行った。

【００６０】

【表１】

【００６１】 表１．同定されたアンプリコンの性状。対応する転写物の長さは、ノーザンブロ
ット分析から推定した。ＲＤＡ番号のカラムでは、１、２及び３は、それぞれフ
ォルスコリン若しくはフォルスコリン＋レプチンで処理した非分化ＰＣ１２細胞
から；β−ＮＧＦとフォルスコリン中で維持し、レプチンで処理したか、若しく
は未処理のままにした分化ＰＣ１２細胞から；又はハイパー−ＩＬ−６若しくは
レプチンで処理した非分化ＰＣ１２細胞からの、ＲＤＡ実験に相当する。

【００６２】

【表２】

【００６３】

【表３】

【００６４】

【表４】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図の凡例 図１．ＰＣ１２細胞におけるレプチンとフォルスコリンとの相乗的シグナル伝達
（Ａ）一時的にトランスフェクションしたＰＣ１２細胞におけるレプチン誘導Ｎ
ＰＹプロモーター活性。ＰＣ１２細胞は、ｐＧＬ３−ｒＮＰＹｌｕｃレポーター
と一緒に、対照ベクター（カラム１及び２）、ｐＭＥＴ７−ｍＬＲｓｈ（カラム
３及び４）又はｐＭＥＴ７−ｍＬＲｌｏ（カラム５及び６）により同時トランス
フェクションした。種々の継代培養物を、７２時間偽刺激（増殖培地単独）した
か、又はマウスレプチン（１００ng/ml）で処理した。細胞溶解物におけるルシ
フェラーゼ活性が示される；データは、三重反復で行った測定の平均±標準偏差
値を表す。 （Ｂ）レプチン誘導ｐＧＬ３−ｒＮＰＹルシフェラーゼ活性に及ぼすフォルスコ
リン共刺激。ＰＣ１２細胞は、ｐＭＥＴ７−ｍＬＲｌｏ及びｐＧＬ３−ｒＮＰＹ
ｌｕｃレポーターで一時的に同時トランスフェクションした。継代培養物は、マ
ウスレプチン単独で（黒四角）、又は１０μMの濃度でフォルスコリンと組合せ
て（黒三角）処理した。７２時間後、細胞を溶解して、ルシフェラーゼ活性を測
定した。３回の独立実験からの標準化した相対ルシフェラーゼ活性の平均値（ｘ
倍上昇）が示される。 （Ｃ、Ｄ）レプチン誘導ＰＯＭＣルシフェラーゼ（Ｃ）又はｒＰＡＰルシフェラ
ーゼ活性（Ｄ）に及ぼすβ−ＮＧＦ及びフォルスコリン共刺激の分析。ＰＣ１２
−ＬＲ８細胞は、ｐＧＬ３−ｈＰＯＭＣｌｕｃ又はｐＧＬ３−ｒＰＡＰｌｕｃレ
ポーターで一時的にトランスフェクションして、２日後に表示されるようにフォ
ルスコリン（Ｆ：１０μM）、レプチン（Ｌ：１００ng/ml）、及びラットβ−Ｎ
ＧＦ（Ｎ：１ng/ml）で処理したか、又は未処理のままとした（ＮＩ）。処理の
２４時間後、細胞を溶解して、ルシフェラーゼ活性を測定した。データは、五重
反復で行った測定の平均値±標準偏差を示す。

【図２】 図２．レプチン応答性ＰＣ１２サブクローンの選択。 （Ａ）マウスレプチン受容体の長イソフォームで一時的にトランスフェクション
したＰＣ１２細胞におけるｒＰＡＰ Ｉ ｍＲＮＡの発現。ＰＣ１２細胞は、ｐ
ＭＥＴ７−ｍＬＲｌｏでトランスフェクションして、培地（ＮＩ、非誘導）、レ
プチン（Ｌ）、フォルスコリン（Ｆ）又はフォルスコリン＋レプチン（Ｆ＋Ｌ）
で４８時間処理した。全ＲＮＡを調製して、ｒＰＡＰ ＩのＲＴ−ＰＣＲ分析に
供した。増幅ＰＣＲ断片は、１％アガロースゲルで視覚化した。β−アクチンの
増幅を対照として使用した。 （Ｂ）ＰＣ１２−ＬＲ８細胞におけるｒＰＡＰ Ｉ ｍＲＮＡの発現 細胞は、培地（ＮＩ、非誘導）又はレプチン（Ｌ）で４８時間処理した。ｒＰ
ＡＰ Ｉ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。β−アクチンの増幅を対照として使用した。

【図３】 図３．未分化ＰＣ１２細胞におけるＬＩＰ−Ｉ及びＬＩＰ−II発現のノーザンブ
ロット分析。 ＰＣ１２−ＬＲ８細胞は、レプチン（Ｌ）、フォルスコリン（Ｆ）、又は両方
の組合せ（Ｆ／Ｌ）で、表示される時間処理した。マウスβ−アクチンプローブ
とのハイブリダイゼーションを対照として使用した。ＮＩは、非誘導対照細胞を
表す。転写物のサイズは、右側に示される。バイオマックスＭＳフィルムへの露
出時間は、ＬＩＰ−Ｉ及びＬＩＰ−IIには５．５日、そして対応するβ−アクチ
ンブロットには１日（全て−８０℃で）とした。

【図４】 図４．ＬＩＰ−Ｉ及びＬＩＰ−IIに対応するクローン化アンプリコンのＤＮＡ配
列。 配列Ａ及びＢは、それぞれラットＬＩＰ−Ｉ及びラットＬＩＰ−IIからのクロ
ーン化アンプリコンに対応する。 ＬＩＰ−Ｉ（３４９bp）

【表５】 ＬＩＰ−II（４８４bp）

【表６】

【図５】 図５．分化ＰＣ１２−ＬＲ８細胞におけるレプチン応答性遺伝子のノーザンブロ
ット分析及び非分化細胞における誘導との比較。 接着性ＰＣ１２−ＬＲ８細胞を、β−ＮＧＦ及びフォルスコリンで５日間処理
することにより、ニューロン分化を誘導した。分化細胞は、引き続きβ−ＮＧＦ
及びフォルスコリンの存在下で、レプチン（ｎＦ／Ｌ）で２４時間処理したか、
又は未処理のまま（ｎＦ）とした。非分化細胞は、レプチン及びフォルスコリン
（Ｆ／Ｌ）又はフォルスコリン単独（Ｆ）で２４時間処理した。ハイブリダイゼ
ーションは、表示されるプローブで行った。マウスβ−アクチンプローブを対照
として使用した。−８０℃でのバイオマックス（BioMax）フィルムへの露出は、
Ｍ×２には３日間、ペリフェリンには３時間、ＰＡＰ IIIには４日間そしてβ
−アクチンには１６時間とした。

【図６】 図６．非分化ＰＣ１２細胞におけるレプチン及びハイパー−ＩＬ−６による種々
の転写物の誘導パターンの比較。 フォルスコリン、レプチン、ハイパー−ＩＬ−６、又はこれらの組合せのいず
れかで処理したＰＣ１２−ＬＲ８細胞からのｍＲＮＡを使用する、ノーザンブロ
ット実験のオートラジオグラフが示される。 （Ａ）フォルスコリン（Ｆ）、レプチン（Ｌ）、フォルスコリン＋レプチン（Ｆ
／Ｌ）、ハイパー−ＩＬ−６（Ｈ）又はフォルスコリン＋ハイパー−ＩＬ−６（
Ｆ／Ｈ）で１２時間刺激後の、Ｒｅｇ Ｉ、ＨＩＰ−Ｉ及びペリフェリンの誘導
パターン。未処理細胞を対照（ＮＩ）として分析した。Ｒｅｇ Ｉ、ＨＩＰ−Ｉ
及びβ−アクチンについてのバイオマックスＭＳフィルムへの露出時間は、それ
ぞれ４日間、５日間及び３時間とした；そしてペリフェリン及びβ−アクチンに
ついての別の実験では、１６時間及び２日間とした。 （Ｂ）非処理対照細胞（ＮＩ）と比較した、レプチン（Ｌ）又はハイパー−ＩＬ
−６（Ｈ）での刺激後のＰＡＰ Ｉ、ＰＡＰ III、ＭＴ−II、Ｆｎｋ、ＭＲＦ
−１、ＳＯＣＳ−３及びＳＴＡＴ−３の誘導パターン。刺激を２４時間としたＰ
ＡＰ IIIを除いて、全てのケースで刺激は１２時間とした。β−アクチンのハ
イブリダイゼーションパターンは対照として示される。−８０℃でのバイオマッ
クスＭＳフィルムへの露出時間は、ＰＡＰ Ｉには１６時間及びβ−アクチンに
は１時間；ＰＡＰ IIIには４日間及びβ−アクチンには１時間；ＭＴ−II及び
Ｆｎｋには３日間、及びβ−アクチンには２日間；ＭＲＦ−１には３日間、ＳＯ
ＣＳ−３には２．５日間及びβ−アクチンに２日間；そしてＳＴＡＴ−３には１
６時間及びβ−アクチンには３時間とした。

【図７】 図７．ＨＩＰ−Ｉに対応するクローン化アンプリコンのＤＮＡ配列 ＨＩＰ−Ｉ（２７４bp）

【表７】

【図８】 図８．非分化ＰＣ１２−ＬＲ８細胞におけるレプチン応答性遺伝子の誘導の動態
。 示されるように処理して、表示される遺伝子の発現についてプローブで探した
ＰＣ１２−ＬＲ８細胞を使用する、ノーザンブロット実験のオートラジオグラフ
が示される。Ｔ₀は、刺激前の発現レベルを与える。マウスβ−アクチンプロー
ブとのハイブリダイゼーションを対照として使用した。転写物のサイズが右側に
マークされている。 （Ａ）極初期応答遺伝子のノーザンブロット分析。ＰＣ１２−ＬＲ８細胞を未処
理のままにした（ＮＩ：非誘導）か、又はフォルスコリン（Ｆ）、レプチン（Ｌ
）若しくは両方の組合せ（Ｆ／Ｌ）で表示される時間処理した。種々の転写物の
バイオマックスＭＳフィルムへの露出時間は、Ｆｎｋ：６日間、ＭＴ−II：５日
間、ＭＲＦ−１：６日間、ＳＯＣＳ−３：１４時間、ＳＴＡＴ−３：１４時間、
β−アクチン：５時間とした。 （Ｂ）極初期応答遺伝子セット：初期動態。ＰＣ１２−ＬＲ８細胞を、表示され
る時間、レプチン単独（Ｌ）又はレプチンとフォルスコリンの組合せ（Ｆ／Ｌ）
で処理した。バイオマックスＭＳフィルムへの露出時間は、Ｆｎｋ：３日間、Ｍ
Ｔ−II：３日間、ＭＲＦ−１：３日間、ＳＯＣＳ−３：２．５日間、ＳＴＡＴ−
３：２．５日間、β−アクチン：１時間とした。 （Ｃ）後期標的遺伝子のノーザンブロット分析。ＰＣ１２−ＬＲ８細胞を、表示
される時間、未処理のままにした（ＮＩ）か、又はフォルスコリン（Ｆ）、レプ
チン（Ｌ）若しくは両方の組合せ（Ｆ／Ｌ）で処理した。バイオマックスＭＳフ
ィルムへの露出時間は、Ａｎｎ VIII：６日間、ＰＡＰ Ｉ：１４時間、スクア
レンエポキシダーゼ：５日間、ＵＧＴ：５日間、β−アクチン：１４時間とした
。

【図９】 図９．レプチン処理ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＭＴ−II、Ｆｎｋ及びＰＡＰ Ｉ
遺伝子発現。 レプチン欠乏ｏｂ／ｏｂマウスを、未処理のままにした（−）か、又はレプチ
ン（１００μg；＋）を腹腔内に投与した。処理の５時間後マウスを屠殺した。
肝臓におけるＭＴ−II及びＦｎｋ、並びに空腸におけるＰＡＰ Ｉ発現のノーザ
ンブロット分析が示される。マウスβ−アクチンプローブとのハイブリダイゼー
ションを対照として使用したが、これは下に示される。バイオマックスＭＳフィ
ルムへの露出時間は、ＭＴ−II、Ｆｎｋ、ＰＡＰ Ｉ及びβ−アクチンについて
、それぞれ４時間、３日間、４時間及び８時間とした。

【図１０】 図１０．飢餓野生型マウスにおけるＭＴ−II及びＦｎｋ遺伝子発現 ｗｔマウスを３６時間飢えさせた。２４時間後、マウスをＰＢＳ（−）又はレ
プチン（５０μg、これに２００μgの２Ａ５抗ヒトレプチン抗体を補足した；＋
）で処理した。種々の時点（−２４、０、２、６、１２時間、上部に表示）で、
マウスを屠殺した。ＲＮＡを肝組織（パネルＡ）又は空腸（パネルＢ）から抽出
して、表示されるようにＭＴ−II及びＦｎｋをプローブとして使用するノーザン
ブロット分析に供した。マウスβ−アクチンプローブとのハイブリダイゼーショ
ンを対照として使用したが、これは下に示される。測定は、二重に行い、かつ示
した。パネルＡに示されるバイオマックスＭＳフィルムへの露出時間は、ＭＴ−
II、Ｆｎｋ及びβ−アクチンについて、それぞれ２時間、２日間及び３時間とし
た。パネルＢでは、露出時間は、ＭＴ−IIには２時間及びβ−アクチンには３時
間とした。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１月３０日（２００１．１．３０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５７】 実施例４ ノーザンブロット及びレポーター分析。 ＲＮイージー法（RNeasy method）（登録商標）（キアジェン（Qiagen））を
用いて、ＰＣ１２細胞から全ＲＮＡを調製した。ＲＮＡ（１０μg）は、１．５
％アガロース、６％ホルムアルデヒドゲル上で分離し、ナイロン膜（ゼータ−プ
ローブＧＴゲノミック（Zeta-Probe GT Genomic）、バイオ−ラッド（Bio-Rad）
）に移して、ＵＶ照射を使用して架橋させた。このフィルターを、〔³²Ｐ〕ｄＣ
ＴＰ標識ＤＮＡプローブとエクスプレスＨｙｂ（ExpressHyb（登録商標））溶液
（クローンテク（Clontech））中で６８℃で１時間ハイブリダイズさせて、２×
ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳで室温で３回及び０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤ
Ｓ中で５０℃で２回洗浄した。ブロットを、−７０℃で増感スクリーンを含むバ
イオマックスＭＳ（BioMax MS）フィルム（コダック（Kodak））に露出させてオ
ートラジオグラフを得た。全てのノーザンブロットは、β−アクチンプローブを
用いるハイブリダイゼーションによって標準化した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/04 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 43/00 １１１ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ファンデケルクホーフェ，ヨエル・ステフ ァーン ベルギー国、ベー−8210 ロッペム、ロー デ・ベンケンドレーフ 27 (72)発明者 フェルヘー，アニック ベルギー国、ベー−8810 リヒテルフェル デ、パストール・デニスラーン 60 (72)発明者 ワエルプット，ウィム ベルギー国、ベー−9100 ニウケルケン− ワース、ニウケルケンストラート 111 (72)発明者 タフェルニール，ヤン ベルギー国、ベー−9860 バレゲム、ボッ テルウェヒ ２ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 FB02 FB03 FB13 4B024 AA01 AA11 CA04 CA12 DA02 DA03 EA04 GA11 GA27 HA01 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ01 QQ08 QQ13 QQ42 QQ52 QR08 QR33 QR42 QR55 QR59 QR62 QR77 QR80 QS05 QS25 QS34 QS36 QX02 4C084 AA20 MA02 NA14 ZC021 4C206 AA01 AA02 DB02 MA02 MA04 NA14 ZA36 ZA42 ZC02 ZC19

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 場合により、アデニル酸シクラーゼに作用するか、又は該シ
   クラーゼの１つ以上の下流標的に作用する化合物と組合せた、レプチン及び／又
   はｇｐ１３０を含む受容体複合体に結合し、その結果として、極初期応答遺伝子
   及び／又は後期標的遺伝子が、神経−内分泌細胞又は神経−内分泌に由来する細
   胞において誘導されることによってシグナル伝達カスケードを活性化する、サイ
   トカインの使用。
2. 【請求項２】 場合により該化合物と組合せた、請求項１記載のレプチン及
   び／又はｇｐ１３０を含む受容体複合体に結合するサイトカイン（ここで、シグ
   ナル伝達カスケードは、レプチン受容体を通じて活性化される）の使用。
3. 【請求項３】 場合により該化合物と組合せた、請求項１記載のレプチン及
   び／又はｇｐ１３０を含む受容体複合体に結合するサイトカイン（ここで、細胞
   は、ＰＣ１２細胞である）の使用。
4. 【請求項４】 場合により該化合物と組合せた、請求項１記載のレプチン及
   び／又はｇｐ１３０を含む受容体複合体に結合するサイトカイン（ここで、化合
   物が、フォルスコリンである）の使用。
5. 【請求項５】 場合により該化合物と組合せた、請求項１記載のレプチン及
   び／又はｇｐ１３０を含む受容体複合体に結合するサイトカイン（ここで、極初
   期応答遺伝子は、ＳＴＡＴ−３、ＳＯＣＳ−３、メタロチオネイン−II、セリン
   ／トレオニンキナーゼＦｎｋ及びＭＲＦ−１のラット相同体などであり、そして
   後期標的遺伝子は、膵炎関連タンパク質Ｉ、スクアレンエポキシダーゼ、ウリジ
   ン二リン酸グルクロニルトランスフェラーゼ、アネキシンVIII、レプチン誘導タ
   ンパク質Ｉ及びII（ＬＩＰ Ｉ、II）、再生タンパク質Ｉ、ハイパー−ＩＬ−６
   誘導タンパク質（ＨＩＰ−Ｉ）、膵炎関連タンパク質III、Ｍｘ２又はペリフェ
   リンである）の使用。
6. 【請求項６】 極初期応答遺伝子及び／若しくは後期標的遺伝子の誘導をか
   、又は請求項１記載の該遺伝子の産生物の活性を、直接又は間接的に妨げる分子
   のスクリーニングの方法（ここで、該遺伝子は、場合により、アデニル酸シクラ
   ーゼに作用するか、又は該シクラーゼの１つ以上の下流標的に直接若しくは間接
   的に作用する化合物と組合せた、レプチン及び／又はｇｐ１３０を含む受容体複
   合体に結合するサイトカインにより誘導可能である）。
7. 【請求項７】 請求項６記載のスクリーニング方法により入手可能な分子。
8. 【請求項８】 請求項７記載の分子を含む、医薬組成物。