JP2002516393A - リガンド結合アッセイおよび阻害性分析物分離領域を有するキット - Google Patents
リガンド結合アッセイおよび阻害性分析物分離領域を有するキットInfo
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Abstract
Description
する。
上のサンプル適用領域(ASZ)にサンプルを適用する。 この流動マトリックスはさらに、 a)所望により、分析的に検出可能な結合反応物(反応物*=R*)適用領域(
AR*Z)、 b)ASZの下流に位置し、かつ、マトリックスにしっかり固定されたもう
1つの結合反応物(キャプチャー)を示し、そこで当該法においてキャプチャーお
よび分析物ならびに/または反応物*を含む複合体(シグナル複合体)が形成され
る検出領域(DZ) を含んでなる。 ii.流れによりサンプル成分の輸送が達成される。 iii.検出領域においてシグナル複合体を検出し、測定されたシグナルを分析
物を測定に使用する。
されていたものと同種のものであってもよい流動マトリックスに向けられる。以
下を参照。
、および共有結合反応、特に遊離チオールと反応性ジスルフィド間の交換反応な
らびに穏やかな求電子物質と穏やかな求核原子間のその他の反応に関与するもの
がある。一般的な生物特異的親和性反応には免疫化学、すなわち抗体と抗原また
はハプテン間のものがある。他のタイプの生物親和性反応としては、相補的な核
酸間(オリゴヌクレオチドを含む)のハイブリダイゼーション、レクチンと炭水化
物構造間の反応、Ig(Fc)構造とAタンパク質またはGタンパク質などのIg(F
c)結合性タンパク質間の反応がある。生物親和性反応としては、生体分子と合成
により製造されたリガンド/キャプチャー間の反応が含まれる。
について記載する。サンドイッチ技術とは、通常、分析物が2種の生物親和性対
応物に結合する、分析的に検出可能な複合体が形成され、その一方が分析的に検
出可能であり、他方がキャプチャーであるということを意味する。一般的な競合
的変法では、分析物および分析的に検出可能な分析物類似体が限定量の生物親和
性対応物をめぐって競合する。2種の競合的変法の例としては、a)しっかり固
定されたキャプチャーの形の限定量のリガンドをめぐる、分析物と標識された分
析物類似体の間の競合、およびb)可溶性で、かつ、分析的に検出可能な限定量
の生物親和性対応物をめぐる、分析物としっかり固定されたキャプチャーの形の
分析物類似体の間の競合を用いるものが挙げられる。
る情報については、US−A−4,861,711(Behringwerke)、WO 88/
08534(Unilever)、US−A−5,120,643および4,740,468(
Abbott)、EP−A−284,232およびUS−A−4,855,240(Becto
n Dickinson)ならびにWO 96/22532(Pharmacia AB)を参照。
テロ型はタンパク質のイソ型、例えばイソ酵素などであり得る。ヘテロ型という
用語には特に種々の形態の生物親和性複合体が含まれ、これらは上記の定義を満
たすことで互いに「相似している」。例としては、抗原は同一であるが抗体が種
々のクラス/サブクラスのものである免疫複合体が挙げられる。さらには下記の
タイトル「分析物」を参照。
決定され得る。
プルの成分は、2つの主要な群:a)分析物およびb)直接的または間接的に検
出を阻害する成分に分類することができる。直接的阻害成分には、例えば複合体
が蛍光によって検出される場合の血清中の蛍光成分など、シグナルを干渉するも
のがある。間接的阻害成分の例としては、キャプチャーおよび/または付加され
た生物親和性反応物R(例えばR*)に関するヘテロ型が挙げられる。その他の間
接的阻害成分、例えば異種親和性抗体が最初のサンプル中に存在していてDZに
おけるシグナル複合体の形成を阻害する場合もある。本発明のある具体例では、
本発明の分離領域から放出されるリガンドが阻害的に作用し得る(実施例1を参
照)。
害成分の分離と検出は異なる系で実施されていることが多い。
0nm)のいずれかにより分析が実施されている例としては、炭水化物欠損トラン
スフェリン(CDT=CDトランスフェリン=アシアロ−、モノシアロ−および
ジシアロ−トランスフェリン)の測定がある。CDTが相対的に高い濃度(10-9 M)で存在する場合には、両検出法とも可能であったが、低濃度の分析物には免
疫測定が必要である。イオン交換クロマトグラフィー分離は進んだ、コストの高
い装置で制御されており、これには特別に教育された人員が必要である。また、
従来の免疫学的試験もコストが高く、かつ、十分に教育された人員を必要とする
。
yanら(Nature 358(1992)603−604)およびIrthら(Anal. Che
m. 14(1995)355−361)により記載されており、その問題点もKru
llら(LC−GC 15(7)(1997)620−629)により要約されてい
る。
高い前領域において細胞が機械的に(濾過により)捕捉される流動マトリックスの
使用がこれまでに知られている(Oudheusdenら,Ann. Clin. Biochem. 28
(1991)55−59)。
ル適用領域に所定量の分析物結合性抗体が固定されており、一定量の分析物がそ
こに保持されるといった、クロマトグラフィー免疫分析系が開示されている。
様の方法で、標識された反応物(次に、これが検出領域において検出される)と反
応する前に一定量の分析物を捕捉することによってサンプルの希釈効果を達成す
るといった、クロマトグラフィー免疫分析系が開示されている。
物結合性反応物の検出領域、および(ii)分析物結合性反応物と分析物との間の
複合体の検出領域を有する、免疫分析用のクロマトグラフィー膜が開示されてい
る。非結合分析物結合性反応物と分析物の反応複合体の相対的な量によりサンプ
ル中の分析物の量の測定値が得られる。
を有する分析試験装置が開示されている。この負の制御領域はサンプルにおいて
、分析物検出に作用し、それが信頼できないものとなるほどの成分の存在を示す
機能を有する。
かつ迅速な方法を作り出すことである。特に本発明の目的は、注目される液体媒
質に可溶性であるかまたは懸濁し得る阻害成分に伴う問題を回避することである
。
生理学的に活性な化合物を含む、ペプチド、炭水化物または脂質構造を示すヘテ
ロ型のより迅速かつ簡単な測定にある。脂質の中にはステロイドおよびその他の
脂溶性物質が含まれる。
して、<10-7M、特に<10-9Mという濃度範囲の分析物の測定を助けること
にある。
テロ型またはその組合せの測定を簡単にすることにある。
ーなどの化学物質ライブラリーのより迅速かつ簡単な評価を提供することにある
。
定量的に)、ならびに、進んだ実験室において(正確な定量の可能性を有する)測
定に実施の可能性を高めることにある。
Z)を含み、それによりDZにおいてシグナル複合体からのシグナルに影響を及
ぼし得る少なくとも1つの成分の遅延/分離が可能となる場合に、本明細書の導
入部分に記載された方法を用いて達成され得る。これは以下に記載のリガンド相
互作用によりSZにおいて起こるはずであり、それは可逆的でも、不可逆的でも
あり得る。その成分は阻害成分であても、分析物であってもよい。成分が分析物
でない場合には、遅延とは、成分がSZを通って分析物よりもよりゆっくりと移
動するか、またはSZに不可逆的に結合し、それによってDZに到達しなくなり
、その結果、DZにおける分析物の検出が問題の成分によって実質的に阻害され
なくなるということを意味する。通常、これは影響を受けるサンプル中の阻害成
分の実質的にすべてに対して十分量のリガンドが存在していなければならないこ
とを意味する。「実質的にすべて」とは、成分の相対的な濃度にもよるが、通常
、阻害成分の少なくとも90%、好ましくは少なくとも約95%、より好ましく
は少なくとも99%が分離領域において遅延または捕捉されることを意味する。
1以上のリガンドの分析物に結合する能力を調べたい場合には、成分は分析物で
あり得る。この場合にはかかるリガンドは分離領域に固定化される。
る。遅延は多少ともリガンド構造と遅延される成分間の種々の特異的な相互作用
に基づき得る。以下のタイトル「分離領域」を参照。SZを通過後、分析物は輸
送流とともに検出領域(DZ)に移動し、そこでキャプチャーおよび分析物ならび
に/またはR*を含む複合体が形成される。
不在下で起こる。DZにおけるシグナル複合体の検出は分析物の定性および定量
値として取ってもよい。
、またはSZにおける分析物−リガンド結合が不可逆的である場合には、シグナ
ル複合体の形成は完全に阻害され可能性がある。DZにおけるシグナル複合体の
形成はSZにおける分析物のリガンドに対する結合能の測定値となる。
ASZは分離されている。 図2Aは、主として、同一のリガンドを有する5個の分離領域を有することで図
1の変形とは異なる。ARZとASZは分離されている。 図2Bは、ARZとASZが一致しているという点を除いては、図2Aの変形と
同様である。 図3は、実施例1において使用される、3つの分離領域を有する本発明の流動マ
トリックスの変形を示す。このうち2つの領域(SZ1)はあるリガンドを示し、
もう1つの領域(SZ2)は別のリガンドを示す。ASZとARZ(=AR*Z)は
分離されている。
に関しては実施例1の導入部に示されている。図1〜3で示される流動マトリッ
クスは原則として以下のいずれかの幾何学的具体例を有し得る。
使用されたものと同種のもの(流動マトリックス)であり、反応物とサンプル成分
が輸送される区画を規定する。従って、マトリックスは単一の流動チャンネル(
例えば毛管)の内部表面、流動チャンネルの浸透系を有する有孔マトリックス(有
孔マトリックス)の内部表面などであり得る。マトリックスはモノリス、シート
、カラム、膜、分離流動チャンネル、例えば毛管状のもの、またはかかる流動チ
ャンネルの集合系などの形態であり得る。また、それらはカラムカートリッジま
たはカット溝に充填された粒子、圧縮ファイバーなどの形態でもあってもよい。
あるいはいわゆる液体クロマトグラフィーナノカラム、すなわちマイクロ平板印
刷により作製された約2μm以下のチャンネルを有するシリコーンまたは石英プ
レートがある(例えば、He. B.ら,Anal. Chem. 1998,70,3790
−3797を参照)。マトリックスの内表面、すなわち流動チャンネルの表面は
、毛管力によるかまたは加圧もしくは吸引のいずれかによって水性媒質(主とし
て水)がマトリックスを通って輸送されるよう十分親水性でなければならない。
流動チャンネルの最小内寸(球形チャンネルに関しては直径として測定される)は
、分析物、付加反応物、および検出領域において相互作用し、かつSZにおいて
遅延される成分がマトリックスを通って輸送されるよう十分大きくなければなら
ない。経験則としては、好適なマトリックスは0.1〜1000μmの範囲の最小
内寸を有する流動チャンネルを有するものの中から選択すればよく、マトリック
スが連絡流動チャンネル系を有する場合には0.4〜100μmが好ましい。外的
な加圧/吸引によって駆動される流れについては、主として広い範囲(1000
μmまでの)の高い方に最小寸法を有する流動チャンネルが注目される。
リエチルスルホン、ナイロン、硝酸/酢酸セルロース、セルロース、再生セルロ
ースから構築されることが多い。これらの膜は例えばポリエステルの堅い裏貼り
をともなって提供するのが有利である。
トリックスのある部分の意図した使用に応じた流れに沿って可変である[WO
96/22532(Pharmacia AB)、WO 94/15215(Medix)]。1つ
の同一のマトリックスは平行であるかまたは共通中心から放射状に向けられたい
くつかの輸送流を、例えば個別のチャンネルの形態で含んでなってもよい。いく
つかの最も重要な具体例では、少なくとも検出領域およびマトリックスの最も近
い部分は、DZへの、DZにおける、またDZからの輸送流がマトリックスにお
いて横方向に起こり得るような形態であるべきであり、すなわち、マトリックス
の少なくともこの部分は膜ストリップまたはカット溝を有するプレートなどの形
態である。
公報に記載されている。例えば、US−A−4,861,711(Behringwerke)
、WO 88/08534(Unilever)、US−A−5,120,643およびUS
−A−4,740,468(Abbott)、EP−A−284,232およびUS−A−
4,855,240(Becton Dickinson)、WO 96/22532(Pharmacia
AB)を参照。
づいており、それは例えば膜ストリップの形態である(図1を参照)。このストリ
ップは輸送流(1)を規定するマトリックスから作製し、また液体−堅い裏貼り
(2)に適用し、プラスチック製が好適である。マトリックス上にはサンプル適
用領域(3、ASZ)およびその下流に位置する検出領域(4、DZ)がある。
輸送流はASZからDZへ向かう方向にある。サンプル適用領域(ASZ)および
検出領域の間には分離領域(5、SZ)がある。輸送流には、特定の具体例に必
要とされる場合には付加反応物適用領域(6)(R、例えばR*、適用領域ARZ
に関しては、例えばAR*Z)が存在してもよい。該領域間にはその唯一の機能が
反応物を輸送することである領域(7)が存在してもよい。適用領域ARZ(A
R*Z)の位置は使用される試験プロトコールによって決定され、ASZの上流も
しくは下流にあってもよいし、またはASZと一致していてもよい。ARZ(例
えばAR*Z)がASZの上流にある場合に関しては、ASZにおける液体の付加
がその上流に位置する領域ARZ(AR*Z)における液体の付加と実質的に同時
に起これば有利である。発明者らの初期に出願した国際特許出願PCT/SE9
8/02463を参照(出展明示により本明細書の一部とする)。ある種の試験プ
ロトコールに関しては、ARZ(AR*Z)はDZは一致していてもよい。
ある。これは特にARZがASZの下流に位置する場合であり、同時に使用され
る試験プロトコールの変法が生じ、すなわち、反応物Rおよび分析物がDZに実
質的に同時に移動する。
するのが望ましい場合には、反応物適用領域(ARZ)がASZの下流にあれば、
RはサンプルがARZを通過した後に加えられるべきである。連続法はまた、A
RZがASZの上流にある場合にも達成され、その場合Rは所望によりARZに
予め付着されていてもよい。
のとは別の方向からの分離した輸送流においてDZに移動されてもよい。例えば
、US−A−4,855,240(Becton & Dickinson)を参照。
物を意図したいくつかの検出領域が存在してもよい。分析物が異なる場合に関し
ては、個々のDZにおけるキャプチャーは、もちろん、いずれの分析物に対して
もいずれの実質的な交差反応性も示してはならない。
管力により駆動される液流であってよい。要すれば、流動マトリックスは輸送液
に浸漬され、ASZの上流に適用される有孔マトリックスの形態で液体貯蔵槽(
8)および/またはDZの下流に位置する吸引有孔マトリックス(9)を示して
もよい。液体貯蔵槽および吸引マトリックスは流れの維持を助けるものである。
液流はまた、マトリックスを通じての圧力または吸引によっても達成され得る。
従って、圧力は、例えばマトリックスの一部が、垂直に位置し、かつ、その出口
が水平に位置した流動マトリックスと直接液体連絡するミニカラムとして設計す
ることにより、静水的にてかけてもよい。後者の形態では、水平に位置したマト
リックスの一部はストリップ/膜形態であり得る。分析物、反応物および阻害成
分の輸送の別法として、マトリックスへ電場を適用してもよい。
び輸送流が深層にあるマトリックスに対しても構築され得る。
望によりそれらの間に液体遮断層をともなって配置してもよい。所望により、流
れは共通のASZ、共通のARZ(AR*Z)などを有してもよい。基本的には、
DZは各々の輸送流に対して分離されている。
分析物)を測定する。分離領域のないマトリックスを使用すれば、分析物に対す
るものと類似の方法でサンプル中に存在する分析物のすべてのヘテロ型を測定で
きる。これら2種の領域配列を組み合わせれば、サンプル中の分析物の相対量な
らびに絶対量を容易に測定することができる。
に対して結合能を有するリガンド/構造を示す。マトリックスがSZにおいて阻
害成分に機械的障害(濾過)を与えるからではなく、分離が数種の特異的/選択的
結合反応によって達成されることが特徴である。特に特異性、結合力(親和力)お
よび速度論に関する分離/遅延するリガンド/構造の選択の指標となる原理はイ
オン交換クロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィーをはじめとするアフ
ィニティークロマトフラフィー、およびキャプチャーに対して固相技術が使用さ
れる生物特異的分析法におけるものと同様である。結合力(親和力(affinity,av
idity))および速度論に関しては、本発明の目下のところ好ましい変法の主たる
目的は、分析物に対して阻害成分を遅延させることであり、その結果、DZにお
ける検出がこれらの成分の不在下で起こり得る。一般に、このことは阻害成分が
分離領域においてできる限り効率的に遅延される、またはできる限り強く、かつ
、迅速に結合されなければならないことを意味する。
もの、陽イオンのもの、両性のもの=イオン交換リガンド)、両性のもの/両親
媒性のもの、生物親和性のもの、キレート化している、硫黄含有である(いわゆ
る硫黄親和性に関しては主としてチオエーテル)、共有結合クロマトグラフィー
を可能にするもの(ピリジルジスルフィドなどの反応性ジスルフィド)、またはπ
−π相互作用するもの、疎水性のものなどであってよい。
リガンドの結合能が分析物に対するものよりも強くなければならない。これをS
Zにおける分離に使用される条件に適用する。どれほど分離が成功するかを決定
する因子は分離領域の長さ、リガンド密度、リガンドの有効性、温度、流速、バ
ッファー、イオン強度、pHなどである。
ち、抗体およびその抗原結合性断片、ならびに抗原およびハプテンが挙げられる
。その他の親和性リガンドの例としては、レクチン(例えば、シアル酸結合レク
チン)、Ig(Fc)結合性タンパク質(Aタンパク質およびGタンパク質など)、一
本鎖もしくは二本鎖形態のオリゴまたはポリヌクレオチドなどの核酸、酵素の基
質類似体、酵素阻害剤などが挙げられる。生物特異的親和性リガンドに関しては
、特異性は遅延される成分上の1以上の結合部位に向けられるものであってよい
。相当する結合部位は分析物には同程度には利用できないものであるべきである
(これには非露出形態では存在しさえしない場合も意図される)。
リックスへの共有結合によって分離領域に固定され得る。後者の例としてはビオ
チンとストレプトアビジン間、高親和性の抗体とハプテン間の相互作用などが挙
げられる。マトリックスへの固定はポリマーまたはその他の置換基を介して起こ
ってもよく、次に、それは分離に使用される、共有結合的に、物理的吸着により
、または生物特異的に結合したリガンドを保持する。もう1つの可能性としては
所望の種類のリガンドを示す高分子粒子の付着がある。この粒子は親水性または
疎水性のものであってよく、またこれにリガンド構造を示す化合物が吸着または
共有結合されている。分離するリガンドをマトリックスSZに結合する技術は基
本的には、DZにおけるキャプチャーに関してこれまでに知られているものと同
様にして選択すればよい。例えば、発明者らの初期に出願した国際特許出願PC
T/SE98/02462、PCT/SE98/02463およびPCT/SE
98/02464を参照(なお、それらはキャプチャーの検出領域への導入に関
しては、出展明示により本明細書の一部とする)。この点について、共有結合さ
れたリガンドを有する市販の膜、例えばDEAEセルロース紙(ジエチルアミノ
エチル)(DE81、Whatman International Ltd,England)があるというこ
とが記載できる。
に従って選択され得る(ただし、キャプチャーの結合能は分析物に、および/ま
たは分析物が関係する反応物に向けられるべきである)。リガンドの捕捉に関し
て迅速な速度論を有する高親和性のキャプチャーを選択することが有利である。
抗体または抗原/ハプテンの使用が主として注目され、それに関しては高親和性
抗体を見出すことが容易であることが多い。
プル中の分析物の存在に比例する量でキャプチャーに結合し得る反応物(R)を意
味する。分析物が関係する反応物の例としては、a)固相に結合された限定量の
抗分析物抗体をめぐる競合を使用する競合法における標識された分析物類似体、
およびb)固相に結合された分析物類似体と分析物間の、溶解した形態の限定量
の抗分析物抗体をめぐる競合/阻害を使用する方法における標識されたまたは非
標識の可溶性抗分析物抗体の形態のR*が挙げられる。
技術により検出領域に固定すればよい。
ること、例えば、分離用イオン交換クロマトグラフィーとDZにおける捕捉用免
疫化学的吸着が好適であり得る。2つの領域において遅延と捕捉に同一の原理を
使用することが実用的であり得る場合もある(例えば、異なる特異性を有する2
種のモノクローナル抗体、実施例を参照)。
対関係の測定に関するものである。分析物の定性はいずれかの有無を検出するこ
と(イエス/ノー試験)、またはあるリガンドへの親和性結合能など、化合物の質
的特性に関するものである。
型のもう1つの組合せの合計の割合であることを意味する。例としてはある対応
物に関する分析物量とすべてのヘテロ型の総量の割合が挙げられる(総量は分析
物量を含む)。
うなキャプチャーを提供できれば分析物は基本的にはいずれの物質であってもよ
いということを意味する。特異な例としては、抗原/ハプテン、酵素または抗体
または完全にか、または部分的に一本鎖形態である核酸が挙げられる。分析物は
アミノ酸/ペプチド、炭水化物または脂質構造を示し得る。
反応物R、例えばR*への結合能に関して特に大きな利点が得られる。これは特
に分析物が<10-7M、特に10-9Mのサンプル濃度中に存在する場合に適用さ
れる。この種のヘテロ型の例としては、a)例えば、分析物としてCDTを用い
るイソトランスフェリン、例えば分析物としてHbAlcを用いるイソヘモグロビ
ンなど、荷電において互いに異なる化合物、b)付加的に挿入されたまたは切断
された(例えば分解による)アミノ酸、またはペプチド鎖の部分的相違など、基本
構造のある部分において互いに異なる化合物、c)異なる物質/構造が基本構造
に付加されているという点によって互いに異なる化合物、例えば共有結合した炭
水化物構造、d)高分子中で、受容体リガンド複合体における受容体とリガンド
間および免疫複合体における抗原と抗体間の生物親和性結合などの非共有結合に
よって、または例えば抗体の鎖間のシステイン架橋によって互いに結合する2個
以上のサブユニットからなる高分子が挙げられる。
ヘテロ型、例えば同一か、または同様のタンパク質部分を有する糖タンパク質で
ある。この種のヘテロ型の変種は癌、炎症および肝疾患などのいくつかの疾病症
状において知られている(Turner G A,”N−glycosylation of serum prote
ins in disease and its investigation using lectins”,Clin. Chim. Act
a 208(1992)149−171;およびVarki A,”Biological roles
of oligosaccharides:all of the theories correct”,Glycobiology 3(
2)(1993)97−130)。特に、i)アシアロ−、モノシアロ−および
ジシアロ−トランスフェリンの組合せの測定(これに関する分離はSZにおける
イオン交換リガンドおよびレクチンリガンドによって行えばよい)ならびに、ii
)HbAlcの測定(これはイオン交換またはボロネートリガンドによって分離すれ
ばよい)が挙げられる。タンパク質の炭水化物含量における変種はまた、正常な
生物学的変化、例えば月経周期および年齢および性別における相違に関しても知
られている。
またはボロネートリガンドによって測定することができる。この場合には、分析
物はSZにおいてリガンドに結合する炭水化物構造を含まない組換えタンパク質
の画分であり、それゆえSZを最も迅速に移動する。
またはIgG結合性配列は、ハンドルの完全な切断が重要であるが、それぞれ金
属キレートリガンドまたは、およびIgG(Fc)リガンドによるSZにおける分離
後に確認できる。この場合分析物は、それからそれぞれヒスチジン配列またはI
g(Fc)結合性配列が切断除去されている組換えタンパク質の画分である。
ドによって活性および不活性型に分離できる。分析物は不活性酵素である。
、ペプチドまたはその他の生体分子は、SZにおいて生体分子の受容体であるリ
ガンドによって分離できる。分析物は受容体への結合能を欠くか、または低下し
た分子の画分である。
IgA、IgM)を有し得る。これらの自己抗体は一方でタンパク質の免疫化学的
測定において異なる応答を生じ、他方、変化したターンオーバー速度/機能を生
じる。分離領域において問題の自己抗体に対する抗体をリガンドとして用いるこ
とによって、遊離型および免疫複合体結合型の自己抗体を分離することができ、
また遊離型のタンパク質(=分析物、例えばIgEの)量を算出することができる
。
ローナル抗体によって、結合部位を示さないタンパク質のヘテロ型(=分析物)の
存在はDZにおける定量により検出できる。
の存在は、SZにおいて好適なリガンドを使用することによって測定できる。S
Zにおける好適なリガンドの選択によって、結合した薬剤を含む、または含まな
い輸送タンパク質をDZにおいて測定できる。
よびIgAが種々の表面への吸着が増加している。荷電特性を持つIgGおよびI
gAに結合し得るリガンドを分離領域に固定することによって、DZにおいて非
荷電吸着特性を持つIgGとIgAの割合(=分析物)を測定することができる。対
応する自己抗原/ハプテンをDZにキャプチャーとして持つことによって、Ig
GまたはIgAクラスの特異的自己抗体が良好な感度で測定できる。
清中でバインダータンパク質との複合体の形態で輸送される。SZにおいてリガ
ンドとしてバインダータンパク質に対する抗体を使用することにより、これらの
化合物の非複合体結合型(遊離型)(=分析物)が後に続く検出領域で免疫化学的に
測定できる。例としてはトリヨードチロニンおよびチロキシンがあり、これらは
チロキシン結合性グロブリン(TBG)またはチロキシン結合性プレアルブミン(
TBPA)と結合して輸送される。同様に、性ホルモン結合性グロブリンと結合
した形態で輸送される遊離型のエストラジオールおよびテストステロンも測定で
きる。
定しできる。この具体例では、あるものは、SZにガンドとしての第2の化合物
を、DZには分析物に対して公知の結合能を有するキャプチャーを有する。SZ
におけるキャプチャー/遅延は分析物の結合能の測定値となり、これはDZにお
いて測定できる。
する化合物の種々のライブラリー(例えば、化学物質ライブラリー)のスクリーニ
ングにおいて特に有利であり得る。
測定できる。例えば、クレアチンキナーゼ(CK)の分解イソ型は興味深い心臓病
マーカーである。
によって行えばよい。分析物自体が検出可能で、かつ、シグナル複合体の一部で
ある場合には、検出および定量はR*を用いずに行える。
粒子など、分析的に検出可能な原子団で標識された生物特異的親和反応物である
。また、分析的に検出可能な反応物(R*)としては、それ自体結合部位または結
合性を有し、該反応物がシグナル複合体の一部である場合には分析的に検出され
得る反応物が挙げられる。反応物が抗体である場合、かかる結合部位の例として
は、Igクラス特異的およびIgサブクラス特異的抗原決定基であり、その抗原結
合部分を用いて検出領域で複合体を形成する。
テンがある。標識抗体は主に下記のような用途を持つ。 A)サンドイッチ法などの非競合法、ここではキャプチャーは a)標識抗体と同じ抗原(=分析物)に向けられる抗体、または b)抗原/ハプテンである、または B)競合法、ここでは限定された量の抗分析物抗体をめぐって、分析物と固相
結合分析物類似体との間で競合が起こり、固相上のフリーな部位または占有部位
の検出はそれぞれ標識抗分析物抗体と抗抗分析物抗体によりなされ得る。
)をめぐって非標識抗原/ハプテンと競合する、または B)サンドイッチ法、ここでは抗原/ハプテン特異的抗体がキャプチャーとし
ての抗抗体を用いて求められる。
物自体が複合体の一部である場合にDZにおいて検出可能な場合である。これは
分析物としての酵素を、分析的に検出可能な生成物を与える基質、例えば不溶性
であるべき発色または蛍光生成物を与える基質と併用して用いて例示される。
結合能を示す。R*が結合能を有する限り、SZに対するR*の結合量による阻害
性ヘテロ型のレベルの測定が望まれるとしても、その適用領域は分離領域(SZ)
の下流に置くべきである。
発色粒子)など、所望により上記の検出可能な原子団を1つ含む粒子である。有
用な粒子としては0.001ないし5μmの範囲、好ましくは0.05ないし5μm
の範囲のサイズである場合が多い。該粒子はコロイド状、いわゆるゾル(すなわ
ち、通常0.001ないし1μmの範囲のサイズを有する球形の単分散)であって
もよい。特に、金属粒子(例えば金ゾル)、非金属粒子(例えばSiO2、炭素、ラ
テックスならびに死滅した赤血球および細菌)が挙げられる。また非コロイド状
粒子も使用されている。これらの粒子は多少不規則で、多少多分散である(例え
ば炭素粒子<1μm;Pharmacia AB,WO 96/22532)。
たは光学測定装置(例えば、画像解析用の特殊なソフトウエアを備えたコンピュ
ーターに接続したCCDカメラまたはレーザースキャナ)により検出されること
が多い。
A−5,120,643(Abbott);EP−A−284,232(Becton Dickinso
n)他に記載されている。
涙、尿、脳骨髄液、汗などを意図したものである。本発明はまた、例えば発酵溶
液、反応混合物、SZにおけるリガンドに対する結合能が調べられるあるタンパ
ク質を含有する溶液など、その他のサンプルにも適用できる。上記タイトル「分
析物」を参照。環境上のサンプルの分析に対する本発明を使用が特に注目されよ
う。
置およびキットそれぞれに関する。
3およびPCT/SE98/02464に開示される発明は、関連部分において
本発明の好ましい具体例をなす。3つの出願はすべて出典明示により本発明の一
部とみなす。
の測定のための試験ストリップ 図2A、2Bおよび3では、輸送流の方向が矢印(10)で示されている。各
変法では輸送流の最初にサンプル用の領域ASZ(11)、その下流に領域DZ
(12)、輸送流の末端に吸引部(13)、および各種領域の間に輸送領域とし
てのみ働く部分(14)があってよい。 図2A:この図面の変法は5つの分離領域(SZ)(ここでリガンドは同一であっ
ても異なっていてもよいし、あるいは異なる量で存在していてもよい(15−1
9))および試薬用のAR*Z(20)を有する。 図2B:これはASZ(11)とAR*Z(20)が一致している(21)こと
以外は図2Aと同様の領域配列である。この領域配列はまた、分析物自体がDZ
におけるシグナル複合体の一部である場合に検出可能な場合にも使用してよい。
この時、AR*Zは必要でない。 図3:この図面の領域配列は2つのタイプの分離領域、それぞれSZ1(22、
23)およびSZ2(24)と、SZ1(23)とSZ2(24)の下流に独立
にAR*Zを示す。
結合の測定が注目される。しかしながら上記すべてのうち、遊離IgEは厳密に
定量しなければならない。IgEの測定に関する現行の試験では、自己抗体は試
薬抗体(抗IgE抗体)と同じIgEエピトープに結合でき、次いでこれはこの試験
の設計によっても異なるが、誤った低すぎる総IgEレベルを与える。IgEの測
定前にIgG、IgMおよびIgAを分離することで、遊離IgEが検出され得る。
自己抗体の量はまた、複合体としても、IgEに向けられた遊離IgG抗体として
も定量されるはずである。
相当)に結合したIgEを用いる方法により遊離抗体を測定する。この血清サンプ
ルが抗IgE抗体を含むならば、後者は免疫複合体を形成する固相に結合する。
非結合血清成分を洗い去った後、例えば酵素で標識した抗IgG抗体(R*)を加え
る。過剰量の標識抗体(R*)を除去し、固定化された免疫複合体に結合した酵素
標識抗IgG抗体(R*)の量を好適な基質の添加により求める。これらの試験の感
受性は固相に対するIgGの非特異的結合により制限される。このIgG集団のI
gE特異的部分は一般に非常に小さく、非特異的に結合したIgGの量から区別す
るのは困難であると考えられる。IgGを固相に捕捉し、IgEの結合を測定する
ことで、この制限は回避できる。
抗体(キャプチャー)を支持する固相(DZに相当)に捕捉される。標識された抗I
gE抗体(R*)を加えることで、複合体結合IgEの量が測定できる。
うな横方向の液体輸送に基づく免疫アッセイ技術の使用により、IgE−IgG関
連パラメーターの単純な測定に多くの可能性が開かれる。例えばまず、遊離Ig
EおよびIgGクラスのヒト抗IgE抗体と結合したIgEの混合物を含むサンプ
ルを作製して、固相に結合した抗ヒトIgG抗体(SZにおけるリガンド)を含有
する領域、次に、固相に結合した抗IgE抗体(DZにおけるキャプチャー)を含
有する領域を通過させ、IgEとIgGクラスの抗IgE抗体との複合体のサンプ
ル含量が分離領域に結合し、一方、遊離のIgEは検出領域へと進み、そこでそ
れは検出領域(12)の上流であり、単に検出領域を通すためだけの分離領域(
15−19)の下流に標識された抗IgE抗体(R*)を加えることにより測定され
る(図2Aの領域20での添加)。抗IgE抗体(R*)も分離領域を通過させること
で、抗ヒトIgG(リガンド)と結合することによって分離領域に捕捉されるIgE
−IgG複合体の量も測定され得る(ASZとAR*Zが一致)(図2Bの領域21
における添加、ASZはAR*Zと共通)。分離領域では、IgEとIgGクラスの
抗IgE抗体との複合体の他、IgEに対する遊離の抗体も存在する。後者の量は
、標識IgE(R* 1)を分離領域に通すことにより測定され得る。次いで標識IgE
(R* 1)は別の試験でSZの上流のメンブランストリップに添加される。
くつかSZとして使用しなければならない。複合体と結合した、また遊離の抗I
gE抗体は次に双方ともIgGの総量によるいくつかのバンドにわたって阻害され
、これらのバンドのシグナル強度の合計がIgEに対する抗体の量を示す。
ている。当該複合体はIgEに対するモノクローナル抗体を用いて製造したが、
それゆえマウスIgGに対する抗体は分離膜に結合している。この検出系では、
複合体を形成している抗体以外のエピトープに対して向けられたIgE抗体が用
いられている。これにより検出系において遊離のIgEと同様に複合体の測定が
可能となる。
中で、1.0mg/mlの抗体と20mg/mlポリスチレンアルデヒド粒子を混合する
ことにより、ヒツジ抗マウスIgG(Fc)(リガンド1)とポリスチレンアルデヒド
粒子(直径0.29μm,IDC,Portland,Oregon,U.S.A.)とを結合させ
た。該粒子を20mM ホウ酸バッファー、pH 8.6中で洗浄し、粒子50mgに
つき15mgのNaCNBH3(Sigma−Aldrich Chemie,Steinheim,Germany)
と20時間反応させた。次いでこの粒子を20mM ホウ酸バッファー、pH 8.
6中で繰り返し懸濁させ、遠心分離し、デカントすることで洗浄した。この粒子
懸濁液を3% トレハロース、20mM ホウ酸バッファーで希釈して25mg粒子
/mlとした。希釈した懸濁液を、ニトロセルロース膜(ポリエステル上のニトロ
セルロース、孔径5μm、Whatman International Ltd,England)のストリッ
プ(20cm×3cm)にストリップの長辺に平行な幅0.3cmの2本のラインとなる
ように噴霧した。噴霧装置(IVEKライナーストリッパー,IVEK Corpora
tion,Vermont,U.S.A.)では、各ラインにつき約50μgのポリスチレン粒
子/cmが送達された。当該膜を室温で乾燥させた後、小片に切断した(0.5cm×
3cm)。
釈して3.4mgタンパク質/mlとした。希釈した抗体をニトロセルロース膜(上記
と同様のタイプ)のストリップ(20cm×4cm)上に、約6.8μg抗体/cmを含む
幅0.3cmのライン状になるように噴霧した(上記の噴霧装置)。この膜を室温で
乾燥させた後、小片に切断した(0.5cm×1cm)。
向けられたもの、キャプチャー)を20mM ホウ酸バッファーで希釈して1.0mg
タンパク質/mlとした。希釈した抗体をニトロセルロース膜(上記と同様のタイ
プ)のストリップ(20cm×4cm)上に、約1μg抗体/cmを含む幅0.15cmのラ
イン状になるように噴霧した(上記の噴霧装置)。この膜を室温で乾燥させた後、
抗体を含んだラインが短辺と平行となるように小片に切断した(0.5cm×4cm)
。
22および23)を一枚の分離膜2(0.5cm×1cm、図3のSZ2、24)に貼り
付け、このようにして得られた複合分離膜を次に検出膜のストリップ(0.5cm×
4cm、図3のライン=DZ=12)に組み込んだ(短辺に対してそれらの間にギャ
ップを持つ短辺)。これらの小片を接着テープで底辺にともに固定した。上辺に
は、隣り合う2辺の短辺といく分か重ねてニトロセルロース片(0.5cm×0.3c
m)(A100、12μm、Schleicher and Schull,Dassel,Germany)を置い
た。後者の小片はさらに接着テープで正しい位置に固定した。セルロースフィル
ター(図3の13)(0.5cm×2cm;GB004、Schleicher and Schull,Da
ssel,Germany)を検出膜の固定されていない短辺と重ねて吸引膜として固定し
た。領域の配列はASZ、SZ1、SZ2、DZであった。
ホウ酸バッファー、pH 8.4 200mlに懸濁し、氷浴中で、100% 振幅、
9.9+2秒パルスにて5分間3回音波処理を施した(VibraCell 600W,1
.5cm探針,Soniced Materials,Danebury,Connecticut,U.S.A.)。
られたもの)のFab' 35μg/mlと炭素粒子(250μg/ml)懸濁液とを3時間
混合した。ウシ血清アルブミン(BSA)を1%まで加え、粒子をさらに30分間
混合した後、1% BSA(0.1M ホウ酸バッファー、pH 8.5、0.05%
NaN3)中で遠心分離することで洗浄し、洗浄バッファーで希釈して0.8mg炭素
/mlとした。調製済みの炭素複合体を洗浄バッファー中4℃で保存した。
抗IgEモノクローナル抗体(IgGクラスのもので、ドメイン2に向けられたも
の)を50mM リン酸バッファー、pH 7.5中、室温で2.75時間反応させた
。サンプル混合物(0.35ml)をSuperdexTM 200prep級、16/60(Amers
ham Pharmacia Biotech AB,Sweden)で分離した。この分離により識別でき
る2つの複合体ピークが得られ、一方のピークはIgE−IgGに相当し、もう一
方のピークはIgG−IgE−IgGに相当した。
に向けられたもの)とIgEを125I(クロラミンT)で、抗IgE抗体については0
.03、IgEについては1.5の標識度で標識した。この標識タンパク質を6%
BSA(50mM ホウ酸バッファー、pH 7.5)で希釈し、抗IgE抗体は約2.
4μg/ml、IgEは0.06μg/mlとした。より高レベルの抗IgE抗体を測定
するために125I−抗IgE抗体(ドメイン2)と非標識の抗IgE抗体(ドメイン2
に向けられたもの)とを混合した。吸引膜(0.5cm×2cm、GB004、Schlei
cher and Schull,Dassel,Germany)を、ヒツジ抗マウスIgG(Fc)を吸着さ
せた一枚の分離膜1(0.5cm×4cm)の一方の末端にテープで貼り付けた。10
μlの0.1M ホウ酸バッファー、pH 8.5(6% BSA、0.05% NaN3)
、次いで10μlの125I−タンパク質溶液を分離膜の固定されていない末端につ
けた。次いで4×10μlの0.1M ホウ酸バッファー、pH 8.5(1% BSA
、0.05% NaN3)を固定されていない末端へ添加することにより横方向の流
れを開始させた。液体がすべて膜へ移動した後、シートの種々の領域(分離およ
び輸送領域)の放射能を測定するために細かく切断した。ガンマカウンターで測
定を行い、遊離の放射性ヨウ素量の補正をした後に、種々の領域で捕捉された12 5 I−タンパク質(標識抗IgE抗体および標識IgE、各々)の割合を算出した。
IgEは、IgG抗体がリガンドである分離領域には、中間の輸送領域以上には結
合しなかった。85%を超えるIgEが膜を通過した。他方、120ngまでの抗
IgE抗体を添加した場合には、標識抗IgE抗体はすべて2つの分離領域へ結合
した。1000ngの抗IgE抗体を添加した場合には、200ngがそれぞれの抗
マウスIgG領域(分離領域)に結合し、500ngが通過した。ヒト血清中のIgG
に関しては、血清を1/100(約1000ngのIgG)希釈し、より多くの抗Ig
G抗体(ヒトIgGに対するもの)がしっかりと固定されたリガンドとして使用さ
れば、この能力で十分であると考えられる。
た可能性がある、あるいはバックグラウンドシグナルを強める結果となる、検出
領域に結合するであろう抗マウスIgG抗体のいずれをも結合させた(抗マウスI
gG抗体は2つのFab部分を有しており、そのため双方がマウスIgGであるR*
およびキャプチャーと同時に結合する)。遊離したヒツジ抗IgGの量は検出領域
の前のマウスIgGを含む分離領域で結合させるのが有利である。この捕捉領域(
SZ2)によって、検出領域における非特異的な結合を6倍を超えて低下させる
ことができる。
0.1M ホウ酸バッファー、pH 8.4、0.05% NaN3)を上記のもの(配列
SZ1、SZ2、DZ)の複合ストリップ上の分離膜1の固定されていない末端
の縁(図3のASZ=11)につけた。次いで10μlのIgE標準(IgE、4〜5
00kU/l、0.01〜1.2μg/ml)およびサンプル(約1μg複合体/mlのIg
E−IgG複合体、約1.3μg複合体/mlのIgG−IgE−IgG複合体)をそれ
ぞれ添加した。両サンプルおよび標準は6% BSAおよび0.05% NaN3を
含む50mM リン酸バッファー、pH 7.5で希釈した。洗浄バッファー、0.1
M ホウ酸バッファー、pH 8.4(1% BSA、0.9% NaCl、1% Tween
20、0.05% NaN3)を含む0.6cm×0.6cm×0.3cmのセルローススポン
ジをストリップの分離部分の固定されていない末端に置くことで横方向の流れを
開始させた。試験溶液は分離領域(図3の22、23、24)および検出領域(図
3の12)を通って、吸引セルローススポンジ(図3の13)へと移動した。7分
間流した後、10μlの炭素粒子と抗IgE抗体の複合体(R*)(0.1M ホウ酸バ
ッファー、pH 8.4(1% BSA、0.05% NaN3)中、0.8mg炭素/ml)を
検出領域とストリップの分離部分(25)との間の位置に添加した。さらに5分
間流した後、検出領域は灰色ないし黒色となった。黒色化部分をレーザースキャ
ナ(Ultroscan,Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden)で
読み取り、ピーク強度を算出し、IgE標準曲線で読み取ることで濃度を求めた
。IgE濃度が高いほど、シグナルは黒みを増す。
有するストリップについても同様評価した(標準およびサンプル)。
1をリガンドを含まないニトロセルロースに置き換えた場合には、複合体(IgE
−IgGおよびIgG−IgE−IgG)はDZにおける強い黒色シグナルとして検
出された。SZ1がリガンドとして抗マウスIgGを含んでいる場合には、DZ
において複合体のシグナルは検出できなかった。
捕捉された。
上のニトロセルロース、Whatman International Ltd,England)を超高純度
の水(Milli Q,Millipore Corp.,Bedford,MA,U.S.A.)中の0.1%
ポリエチレンイミン(PEI,Sigma,St Louis,MO,U.S.A.)溶液に入
れた。この溶液を3時間振盪し、次いで30分間Tween20中に入れ、風乾させ
、その後、プラスチックバッグに入れて4℃で保存した。膜の変性度はブロモフ
ェノールブルー(pK=4.1)で確認した。
横方向の液流で125I標識タンパク質(クロラミンT法により標識したウシ血清ア
ルブミン、テトラアシアロトランスフェリンおよびアシアロトランスフェリン)
を輸送することにより確認した。最も高いpIを有するタンパク質が液流ととも
に移動する傾向が最も強かった。別の試験において液体が漸増濃度のNaCl(0
〜1000mM)を含んでいる場合、最も低いpIを有するタンパク質の移動率が
か最も影響を受けた。これらの2つの機能の制御は、ポリエチレンイミンによる
処理において正電荷を持つ官能基が導入され、これらの官能基がタンパク質およ
びNaClのイオン交換基として機能し得るということを支持するものである。
mg/mlの抗体と22mg/mlポリスチレンアルデヒド粒子とを混合することにより
、抗トランスフェリンモノクロナール抗体とポリスチレンアルデヒド粒子(直径
0.29μm,IDC,Portland,Oregon,U.S.A.)とを結合させた。該粒子
を20mM ホウ酸バッファー、pH 8.6中で洗浄し、粒子40mg/mlにつき5m
gのNaCNBH3(Sigma−Aldrich Chemie,GmbH Steinheim,Germany)と
18時間反応させた。この粒子を20mM ホウ酸バッファー、pH 8.6中で洗
浄し、6% トレハロースを含む20mM ホウ酸バッファーで希釈して14mg粒
子/mlとした。希釈した懸濁液を、ニトロセルロース膜(5μm、ポリエステル支
持体上のニトロセルロース、Whatman International Ltd,England)のスト
リップ(20cm×4cm)にストリップの中央に、かつストリップの長辺に平行な幅
1.4mmのラインとなるように噴霧した。噴霧装置は実施例1と同一のものであ
り、これにより約14μgのポリスチレン粒子/cmが送達された。当該膜を室温
で乾燥させた後、プラスチック袋に入れて4℃で保存した。
の末端を0.5cmに短くした検出膜のストリップ(0.5cm×3.5cm、図1の抗体
を含むライン=DZ=4)の末端の下辺にテープで貼り付けた。この末端間のギ
ャップはニトロセルロース片(0.3cm×0.5cm、A100、12μm、Schleic
her and Schull,Dassel,Germany)を重ねることでブリッジし、これをテー
プで固定した。吸引膜(図1の9)としてセルロースフィルター(0.5cm×2cm、
GB004、Schleicher and Schull,Dassel,Germany)を検出膜から送達
されるストリップの固定されていない末端と重ねてテープで固定した。
酸バッファー、pH 8.4 100mlに懸濁し、実施例1と同じ装置を用いて、氷
浴中で、100% 振幅、5+5秒パルスにて5分間音波処理を施した。
素懸濁液(250μg/ml)とを2時間混合した。BSAを1%まで加え、粒子を
さらに30分間混合した後、0.1M ホウ酸バッファー、pH 8.5、(1% B
SAおよび0.05% NaN3を含む)中で遠心分離することで洗浄し、洗浄バッ
ファーで希釈して1.9mg炭素/mlとした。調製済みの炭素複合体を洗浄バッフ
ァー中4℃で保存した。
ランスフェリン(主としてテトラアシアロトランスフェリン)の鉄で飽和した調製
物からMono Q(Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala Sweden)イオ
ン交換クロマトグラフィーにより単離した。
,St Louis,MO,U.S.A.)をノイラミダーゼ(Behringwerke,Marburg,
Germany)で処理した後、アシアロトランスフェリンをMono Q(Amersham Pha
rmacia Biotech AB,Uppsala Sweden)イオン交換クロマトグラフィーによ
り単離した。
Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala Sweden)における等電点電気
泳動法により求めた。アシアロ型 pI=5.7、テトラアシアロ型 pI=5.3、
およびウシ血清アルブミン pI=4.7。
.2% BSA、0.1% Tween20、0.1mM クエン酸鉄(III)、1mM NaH
CO3および0.05% NaN3を含む20mM BIS−TRIS、pH 6.3で希
釈して濃度0.07〜16.6μgトランスフェリン/mlとし、標準として使用し
た。
ブリン(Sigma,St Louis,U.S.A.)、0.1% Tween20、0.1mM クエ
ン酸鉄(III)、1mM NaHCO3および0.05% NaN3を含む20mM BIS
−TRIS、pH 6.3で1/50希釈した。血清サンプルを予めCDTect(Ph
armacia & Upjohn Diagnostics AB,Uppsala Sweden)によってCDTに
ついて分析した。CDTectはCD−トランスフェリンを測定するものである。
ェリンの希釈系および希釈した血清サンプルそれぞれ)を上記のものの複合スト
リップ上の分離領域を有する膜部分の固定されていない末端の縁(図1のASZ
=3)から1cmの位置につけた。15mM NaClおよび0.1% Tween20を含
む20mM BIS−TRISバッファー、pH 6.5を吸収させた0.6cm×0.
6cm×0.3cmのセルローススポンジ(図1の8)を分離領域の固定されていない
末端に置くことで横方向の液流を開始させた。分離領域(図1の5)では分析物(
CD−トランスフェリン)とそのヘテロ型(他のトランスフェリン)は領域内にし
っかりと固定された正電荷(PEI処理により導入されたリガンド)によって引き
寄せられ、大きな負電荷を有するヘテロ型(他のトランスフェリン)が小さな負電
荷を有するヘテロ型(CD−トランスフェリン)より強く引き寄せられ、すなわち
CD−トランスフェリンはトリシアロ−、テトラアシアロ−、ペンタアシアロ−
などのトランスフェリンよりも容易に液流とともに移動する。そのため複合スト
リップ/マトリックスを通るその移動中、全トランスフェリン量の一定の割合が
検出領域(図1のDZ=4)において抗トランスフェリン抗体(キャプチャー)と結
合できる。4分間流した後、5μlの炭素粒子と抗トランスフェリン抗体の複合
体(R*)(30% トレハロース、1% Tween20、1% BSA、0.05% Na
N3を含む0.1M ホウ酸バッファー、pH 8.4中、1.8mg炭素/ml)を分離領
域と検出領域との間(図1の領域(6)(=AR*Z))に添加した。さらに5分間
後、流れを止め、検出領域の黒色部をレーザースキャナ(Ultroscan,Amersham
Pharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden)で読み取り、アシアロトラン
スフェリンの希釈系の測定値に対して読み取って濃度を算出した。サンプルにお
けるCD−トランスフェリンのレベルが高いほど、黒色シグナルが強くなる。
非常に優れた一致(相関係数0.97)を示した。本発明はCDTectの実施よりも
極めて迅速、かつ簡単である。
man International Ltd,England)をシアノ−ジエチル−アミノピリジン(C
DAP)(KohnおよびWilchek,Appl. Biochem. Biotechnol. 9(1984
)285−304)によって活性化した。活性化したシートを0.1M NaHCO 3 、pH 8.4中の0.1mg/mlのSambucus Nigraレクチン(炭素鎖の末端位にあ
るシアル酸と結合する;Vector Laboratories Inc.,Burlingame. CA. U
.S.A)溶液に入れた。この溶液を2時間振盪し、次いでそのシートをa)0.1
M NaHCO3、b)0.5M NaCl、c)蒸留水、d)0.1M 酢酸バッファ
ー、pH 4.5、e)0.1M NaHCO3、pH 8.4、f)0.5M NaCl、g
)蒸留水、h)0.1M 酢酸バッファー、pH 4.5、i)0.1% Tween20
を含む5mM BIS−TRIS、pH 6.4中に入れた。種々の水浴間では、過
剰な液体をキッチンロールペーパーで吸い取った。洗浄工程の後、シートを風乾
させ、プラスチックバッグに入れて4℃で保存した。
フィルム;Gelman Science Inc,Ann Arbor,MI,U.S.A.)に貼り付け
た。
すればよい。図1も参照。SZにおけるリガンドはここではレクチンである。
ンスフェリンとウシアルブミンを125I(クロラミンT、標識度0.08〜0.13
)で標識した。標識タンパク質を0.1% Tween20、0.04mM クエン酸鉄(I
II)および0.05% NaN3を含む10mM BIS−TRIS、pH 6.4で希釈
して約0.3μg/mlとした。さらに0.4mgBSA/mlを加えた。
m、GB004、Schleicher and Schull,Dassel,Germany)を、それらの末
端がある程度重なるように下辺でテープで貼り合わせた。1μlの125Iタンパク
質溶液をそれぞれの分離膜の固定されていない末端から1cmの位置につけた。セ
ルローススポンジ(0.6cm×0.6cm×0.3cm)を分離膜の固定されていない末
端に置くことで横方向の流れを開始させた。このスポンジには0.1% Tween2
0とともに0.5M NaCl、1mM CaCl2を含む20mM TRIS−HCLバ
ッファー、pH 7.5を吸収させた。2、4、6および10分後それぞれにセル
ローススポンジを取り除き、流れを中断させて、分離膜の固定されていない末端
から膜を2および3cm切断した。放射能を持つ膜片をガンマカウンターで測定し
、2および3cm移動した添加の割合を算出した。1cm以上の移動についての値を
表4に示している。
チンによって分離膜で著しく遅延されているが、アシアロトランスフェリンおよ
びBSAではそれと同程度まで遅延されることがないことが明らかである。この
結果により、Sambucus Nigraレクチンを含む分離膜を実施例2と同様の検出膜
と組み合わせ、CD−トランスフェリンよりシアル酸の含量の高いトランスフェ
リンを含むサンプル中のCD−トランスフェリンを定量するのに使用してもよい
ことがわかる。
RZとASZは分離されている。
とで図1の変形とは異なる。ARZとASZは分離されている。
変形と同様である。
流動マトリックスの変形を示す。このうち2つの領域(SZ1)はあるリガンドを
示し、もう1つの領域(SZ2)は別のリガンドを示す。ASZとARZ(=AR* Z)は分離されている。
Claims (22)
- 【請求項1】 結合反応によりサンプル中の分析物を測定する方法であって
、 i.サンプル中に存在する成分の輸送が起こり得る流動マトリックス(輸送流)
上のサンプル適用領域(ASZ)にサンプルを適用し、流動マトリックスがさらに
、 a)所望により、分析的に検出可能な結合反応物(反応物*=R*)適用領域(
AR*Z)、 b)ASZの下流に位置し、かつ、マトリックスにしっかり固定されたもう
1つの結合反応物(キャプチャー)を含んでなり、そこで本方法の際にキャプチャ
ーおよび分析物ならびに/または反応物*を含む複合体(シグナル複合体)が形成さ
れる、検出領域(DZ) を含んでなり、さらに、 ii.検出領域においてシグナル複合体を検出する(なお、測定された当該シグ
ナルは分析物を測定するのに使用される)こと を含んでなり、 流動マトリックスがASZとDZの間に少なくとも1つの分離領域(SZ)を含ん
でなり、またこの領域(SZ)が、(i)マトリックス内に輸送される分析物以外
の少なくとも1つの成分(なお、該成分はDZに輸送される場合には測定可能な
シグナルに影響を及ぼすであろうが、該成分がDZにおける分析物の検出を実質
的に阻害しない)か、または(ii)分析物のいずれかに対して結合能を有する構
造(リガンド)を示し、かつ、分析物に対するリガンドの結合能が測定されること
を特徴とする方法。 - 【請求項2】 該成分がキャプチャーおよび/またはR*に対する結合能に
関して分析物とヘテロ型である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 輸送流が毛管力によるものである、請求項1または2に記載
の方法。 - 【請求項4】 少なくともDZおよびマトリックスの最も近い部分が膜形態
であり、かつ、少なくともDZへの、DZにおける、DZからの輸送流が横方向
である、請求項1−3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 分離領域が、荷電され、かつ、該成分を引き付けるリガンド
を示す、請求項1−4のいずれかに記載の方法。 - 【請求項6】 分離領域が、該成分に向けられる生物特異的親和性を有する
リガンドを示す、請求項1−4のいずれかに記載の方法。 - 【請求項7】 分離領域が該成分に対して免疫化学的親和性を有するリガン
ドを示す(すなわち構造(リガンド)が抗体または抗原/ハプテンである)、請求項
1−4および6のいずれかに記載の方法。 - 【請求項8】 該成分が分析物ではなく、かつ、リガンドの結合能が該成分
上の結合部位に対するものであり、またこの結合部位が分析物に対しては同程度
には利用できない、請求項1−7のいずれかに記載の方法。 - 【請求項9】 該成分が分析物ではなく、かつ、検出領域においてキャプチ
ャーが、該成分に対しても利用できる分析物上の結合部位に対して結合能を示す
、請求項1−8のいずれかに記載の方法。 - 【請求項10】 該成分が分析物ではなく、かつ、反応物*を使用し、これ
がa)分析物および該成分の双方に対してか、またはb)分析物に対してのみ利
用できる結合部位に対する結合能を有する、請求項1−9のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項11】 分析物および該成分が炭水化物構造に関して異なるヘテロ
型である、請求項1−10のいずれかに記載の方法。 - 【請求項12】 測定を阻害する他の成分を含まないサンプルにおいて分析
物を測定する試験キットであって、 A.1つの同一の輸送流中に a)分析物含有サンプル適用領域(ASZ)、 b)分析物または分析物が関係する反応物に向けられ、かつ、DZのマトリ
ックスにしっかり固定されている、生物特異的親和性反応物(キャプチャー)が存
在する検出領域(DZ) を含んでなる流動マトリックス、 B.所望により、分析物またはキャプチャーのいずれかに対して生物特異的親
和性を有する分析的に検出可能な反応物(反応物*=R*) を含んでなり、 流動マトリックスがASZとDZの間に、少なくとも1つの阻害成分に対して結
合能を有する構造(リガンド)を示し、実質的に該阻害成分のすべてに影響を及ぼ
し得る分離領域(SZ)を含んでなることを特徴とするキット。 - 【請求項13】 少なくともDZおよびマトリックスの最も近い部分が膜形
態であり、かつ、少なくともDZへの、DZにおける、DZからの輸送流の方向
が横方向である、請求項12に記載の試験キット。 - 【請求項14】 流動マトリックスの輸送チャネルが毛管状を有する、すな
わち、水性媒質が毛管力によって輸送され得るような形態および表面特性のもの
である、請求項12−13のいずれかに記載の試験キット。 - 【請求項15】 サンプルに由来し、通常、キャプチャーおよび/またはR * に対する結合能に関して分析物とヘテロ型である阻害成分に対して構造(リガン
ド)が結合能を有する、請求項12−14のいずれかに記載の試験キット。 - 【請求項16】 マトリックスが使用される条件下で、構造(リガンド)が1
以上の正および/または負荷電を示す、請求項12−15のいずれかに記載の試
験キット。 - 【請求項17】 構造(リガンド)が生物特異的親和性反応物、例えば抗体ま
たは抗原もしくはハプテンである、請求項12−15のいずれかに記載の試験キ
ット。 - 【請求項18】 キャプチャーが生物特異的親和性反応物、例えば抗体また
は抗原もしくはハプテンである、請求項12−17のいずれかに記載の試験キッ
ト。 - 【請求項19】 キットが分析的に検出可能な反応物R*を含んでなり、流
動マトリックスがR*適用領域(AR*Z)を含んでなり、かつ、AR*ZがSZの
上流および/または下流で、常にDZの上流に位置する、請求項12−18のい
ずれかに記載の試験キット。 - 【請求項20】 AR*ZがASZの上流、下流に位置するか、またはAS
Zと同一のものである、請求項19に記載の試験キット。 - 【請求項21】 R*がAR*Zに予め付着されている、請求項19−20の
いずれかに記載の試験キット。 - 【請求項22】 構造(リガンド)の分析物に対する結合能を測定するための
試験キットであって、 A.1つの同一の輸送流に a)分析物適用領域(ASZ)、 b)分析物または分析物に関係する反応物に向けられ、かつDZのマトリッ
クスにしっかり固定されている、生物特異的親和性反応物(キャプチャー)が存在
する検出領域(DZ)、 B.所望により、分析物またはキャプチャーのいずれかに対して生物特異的親
和性を有する分析的に検出可能な反応物(反応物*=R*) を含んでなる流動マトリックス を含んでなり、 流動マトリックスがASZとDZの間に、該構造(リガンド)を示す分離領域(S
Z)含んでなることを特徴とするキット。
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