JP2002515746A - Transformation of Pichia methanolica - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）を形質転換する方法、およびピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の形質転換において有用なＤＮＡ分子を開示する。ＤＮＡ分子の存在において、２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍの電界強度および１〜４０ミリセカントのパルス期間を有するパルス電界に、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を暴露し、これによりＤＮＡ分子を前記細胞の中に導入する。ＤＮＡ分子は、問題のポリペプチドまたはタンパク質をコードするセグメントに作用可能に連結されたピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）遺伝子を含む発現単位を含んでなることができる。ＤＮＡ分子は、また、選択マーカー、例えば、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＡＤＥ２遺伝子をコードすることができる。本発明に従い形質転換された細胞は、商業的に重要性を有するタンパク質を産生する産生系において使用することができる。 (57) [Summary] Disclosed are a method for transforming P. methanolica and a DNA molecule useful in the transformation of P. methanolica. In the presence of the DNA molecule, P. methanolica cells are exposed to a pulsed electric field having a field strength of 2.5-4.5 kV / cm and a pulse duration of 1-40 milliseconds, thereby exposing the DNA molecule. The cells are introduced into the cells. The DNA molecule may comprise an expression unit comprising a P. methanolica gene operably linked to a segment encoding the polypeptide or protein of interest. The DNA molecule can also encode a selectable marker, for example, the P. methanolica ADE2 gene. The cells transformed according to the present invention can be used in production systems that produce proteins of commercial importance.

Description

【発明の詳細な説明】 ピヒア・メタノリカの形質転換 発明の背景 メチロトロープ酵母は、炭素およびエネルギーの唯一の源としてメタノールを 利用することができる酵母である。メタノール利用に必要な生化学的経路を有す る酵母の種は、４つの属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピヒア（Ｐｉｃ ｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐ ｓｉｓ）に分類される。これらの属は多少人為的であり、細胞の形態学および増 殖特性に基づいており、そして密接な遺伝的関係を反映していない（Ｂｉｌｌｏ ｎ−Ｇｒａｎｄ、Ｍｙｃｏｔａｘｏｎ、３５：２０１−２０４、１９８９；Ｋｕ ｌｔｚｍａｎ、Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ、８４：７２−７６、１９９２）。さらに、 これらの属内のすべての種が炭素およびエネルギー源としてメタノールを利用す ることができるわけではない。この分類の結果として、１つの属の個々の種の間 で生理学および代謝において大きい差が存在する。 メチロトロープ酵母は組換えタンパク質産生系において使用するための魅力的 候補である。いくつかのメチロトロープ酵母は、最小規定培地で高いバイオマス に増殖することが示された。メチロトロープ酵母のある遺伝子は、緊密に調節さ れ、そして誘導された、または抑制解除された条件下に高度に発現され、それら の遺伝子のプロモーターが商業的価値を有するポリペプチドの製造に有用であろ うことが示唆される。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｆａｂｅｒ ｅｔ ａ ｌ．、Ｙｅａｓ、１１：１３３１、１９９５；Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｙｅａｓ 、８：４２３、１９９２；およ びＣｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：９０５、 １９９３。 組換え産生系において使用するための宿主としてのメチロトロープ酵母の開発 は、一部分適当な材料（例えば、プロモーター、選択マーカー、および突然変異 の宿主細胞）および方法（例えば、形質転換技術）を欠如するために、遅かった 。最も高度に開発されたメチロトロープ宿主系は、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃ ｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびハンセンヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎ ｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を利用する（Ｆａｂｅｒ ｅｔａｌ．、Ｃｕｒ ｒ．Ｇｅｎｅｔ． 、２５：３０５−３１０、１９９４；Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ ．、前掲；Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．、前掲；米国特許第４，８５５，２４ ２号；米国特許第４，８５７，４６７号；米国特許第４，８７９，２３１号；お よび米国特許第４，９２９，５５５号）。 メチロトロープ酵母のさらなる種を形質転換する方法、および工業用酵素およ び製薬用タンパク質を包含する、経済的重要性を有するポリペプチドを製造する ために形質転換された細胞を使用する必要性がこの分野において残っている。本 発明は、このような方法、ならびに他の関係する利点を提供する。 発明の要約 本発明は、ピヒア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細 胞の中にＤＮＡ分子を導入する方法およびこれらの方法に従い形質転換された細 胞を提供する。 本発明の１つの観点の範囲内において、これらの方法は、直鎖状ＤＮＡ分子の 存在において、２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍの電界強度および１〜４０ミリ秒の時 間定数を有する、指数的に減衰するパル ス電界に、ピヒア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞 を暴露し、これによりＤＮＡ分子を前記細胞の中に導入することを含んでなる。 本発明の１つの態様の範囲内において、ＤＮＡ分子は、ピヒア・メタノリカ（Ｐ ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のポリペプチド以外のペプチドをコードし、ピヒア ・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）遺伝子の転写プロモーターおよび ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）遺伝子の転写ターミネータ ーに作用可能に連結されたセグメントを含んでなる。好ましい態様の範囲内にお いて、転写プロモーターはピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ） のＡＵＧ１遺伝子のプロモーターであり、これは、１つの態様の範囲内において 、ヌクレオチド２４からヌクレオチド１３５４までの配列番号：２に示すヌクレ オチド配列を含んでなる。ＤＮＡ分子は、さらに、宿主細胞における突然変異を 補足する選択マーカー遺伝子を含んでなることができる。１つの態様の範囲内に おいて、選択マーカー遺伝子はピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ ａ）の遺伝子である。 本発明の第２の観点の範囲内において、異種ＤＮＡでピヒア・メタノリカ（Ｐ ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）を形質転換する方法が提供され、これらの方法は、 異種直鎖状ＤＮＡ分子の存在において、２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍの電界強度お よび１〜４０ミリ秒の時間定数を有する、指数的に減衰するパルス電界に、ピヒ ア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞の集団を暴露し、これによ り異種ＤＮＡを細胞集団の少なくとも一部分の中に導入し、そしてＤＮＡが導入 された細胞を回収することを含んでなる。本発明の１つの態様の範囲内において 、異種ＤＮＡの１μｇ当たり１０³〜１０⁵細胞を回収する。他の態様の範囲内に おいて、異種ＤＮＡの１μｇ当たり０．９×１０⁴〜１．１×１０⁴細胞を回収す る。さら なる態様の範囲内において、これらの方法は、例えば、炭素源としてソルビトー ルを含む増殖培地中で細胞を培養することによって、回収された細胞から組込み 形質転換体を回収する工程をさらに含む。追加の態様の範囲内において、細胞集 団は初期対数期の増殖にある。 他の観点の範囲内において、本発明は上記に開示する方法により形質転換され たピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を提供する。 本発明のこれらの面および他の面は、下記の詳細な説明および添付図面を参照 することによって明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 第１図は、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のエレクトロ ポレーションの効率に対する電界強度およびパルス期間の効果を示す。 第２図は、プラスミドｐＣＺＲ１４０とピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａ ｎｏｌｉｃａ）のゲノムＤＮＡとの間の組換え事象の略線図である。 第３図は、プラスミドｐＣＺＲ１３７とピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａ ｎｏｌｉｃａ）のゲノムＤＮＡとの間の組換え事象の略線図である。 発明の詳細な説明 本発明をいっそう詳細に記載する前に、本明細書おいて使用される幾つかの用 語を定義する： 初期対数期の増殖−細胞濃度が２×１０⁶細胞／ｍｌ〜８×１０⁸細胞／ｍｌで あるときの培養における細胞増殖期。 異種ＤＮＡ−所定の宿主細胞内に天然に存在しないＤＮＡ分子またはＤＮＡ分 子の集団。特定の宿主細胞に対して異種のＤＮＡ分子は、その宿主ＤＮＡが非宿 主ＤＮＡと組合わせられるかぎり、宿主細胞種に由来するＤＮＡを含有すること ができる。例えば、転写プロモーターを含んでなる宿主ＤＮＡセグメントに作用 可能に連結されているポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含有 するＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子であると考えられる。 組込み形質転換体−異種ＤＮＡが導入されている細胞、ここで異種ＤＮＡは細 胞のゲノムＤＮＡの中に組込まれるようになっている。 直鎖状ＤＮＡ−遊離の５’および３’末端を有するＤＮＡ分子、すなわち、非 円形ＤＮＡ分子。直鎖状ＤＮＡは、閉じた円形ＤＮＡ分子、例えば、プラスミド から酵素的消化または物理的崩壊により製造することができる。 作用可能に連結された−この作用可能に連結されたという用語は、ＤＮＡセグ メントがそれらの意図する目的のために調和して機能するように、例えば、転写 がプロモーターにおいて開始しかつコーディングセグメントを通してターミネー ターに進行するように、ＤＮＡセグメントが配置されていることを示す。 前述したように、本発明は、ＤＮＡをメチロトロープ酵母ピヒア・メタノリカ （Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ｎｏ細胞の中に導入する方法、およびＤＮＡが 導入されている細胞を選択する方法を提供する。当業者は認識するように、同種 （ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ＤＮＡ（宿主種からのＤＮＡ）および異種（ｈｅｔｅ ｒｏｌｏｇｏｕｓ）ＤＮＡの双方を使用する細胞の形質転換は多数の多様な生物 学的用途のための前提条件である。本発明の方法は、異種ＤＮＡで形質転換され た細胞の製造によく適し、前記細胞は、ヒトを包含す る高等生物のポリペプチドおよびタンパク質を包含する、ポリペプチドおよびタ ンパク質の製造に使用することができる。本発明は、さらに、ＤＮＡライブラリ ーおよび合成ＤＮＡ分子を包含する、他のＤＮＡ分子を使用するピヒア・メタノ リカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞の形質転換を提供する。こうして、本 発明は、多様なライブラリーを遺伝的に発現させて産物を産生し、これらの産物 を新規な生物学的活性についてスクリーニングし、化合物のライブラリーをスク リーニングするためのターゲットとして使用するために細胞を操作し、そして細 胞を遺伝的に修飾して他の方法における細胞の実用性を増強するために使用でき る技術を提供する。 ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の株は、アメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（マリイランド州ロックビレ）および他の貯蔵所か ら入手可能である。本発明の１つの態様の範囲内において、異種ＤＮＡで形質転 換すべき細胞は、異種ＤＮＡ分子上の遺伝子（「選択マーカー」）により補足す ることができる突然変異を有するであろう。この選択マーカーは、非形質転換細 胞が増殖することができない条件（「選択的条件」）において形質転換された細 胞の増殖を可能とする。選択の一般的原理はこの分野においてよく知られている 。普通に使用される選択マーカーは、アミノ酸またはヌクレオチドの合成に要求 される酵素をコードする遺伝子である。これらの遺伝子の中に突然変異を有する 細胞は、突然変異が選択マーカーにより補足されないかぎり、特定のアミノ酸ま たはヌクレオチドを欠如する培地中で増殖することができない。このような「選 択的」培地の使用は、宿主細胞内の異種ＤＮＡの安定な維持を保証する。ピヒア ・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）において使用するためのこの型の 好ましい選択 マーカーは、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のＡＤＥ２遺 伝子であり、これはホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキラーゼ（ ＡＩＲＣ；ＥＣ４．１．１．２１）をコードする。ＡＤＥ２遺伝子は、ａｄｅ２ 宿主細胞の中に形質転換するとき、この細胞をアデニンの非存在において増殖さ せる。代表的なピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のＡＤＥ２ 遺伝子の配列コーディングストランドは配列番号：１に示されている。図解され ている配列は、５’の非コード配列の１００６ヌクレオチドおよび３’非コード 配列の４４２非コード配列を含み、ヌクレオチド１００７−１００９に開始ＡＴ Ｇコドンを有する。本発明の好ましい態様の範囲内において、ヌクレオチド４０ ７−２８５１を含んでなるＤＮＡセグメントを選択マーカーとして使用するが、 コード部分がプロモーターおよびターミネーターの配列に作用可能に連結されて いるかぎり、より長いまたはより短いセグメントを使用できるであろう。当業者 は認識するように、本発明において提供されるこの配列および他の配列はそれぞ れの遺伝子の単一の対立遺伝子（ａｌｌ ｅｌｅ）を表し、そしてその対立遺伝 子の変異型は存在することが期待される。任意の機能的ＡＤＥ２対立遺伝子を本 発明の範囲内で使用することができる。本発明の範囲内で使用できる他の栄養マ ーカーは、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のＡＤＥ１、Ｈ ＩＳ３、およびＬＥＵ２遺伝子を包含し、これらは、それぞれ、アデニン、ヒス チジン、およびロイシンの非存在下での選択を可能とする。メタノールの使用を 最少にすることを望む、大規模な工業的方法のために、双方のメタノール利用遺 伝子（ＡＵＧ１およびＡＵＧ２）が欠失している宿主細胞を使用することが好ま しい。分泌されるタンパク質の産生のために、液胞（ｖａｃｕｏｌａｒ）プロテ アーゼ遺伝子（ＰＥＰ４およびＰＲＢ１ ）を欠失する宿主細胞が好ましい。遺伝子欠失突然変異体は既知の方法、例えば 、部位特異的突然変異誘発により製造することができる。ピヒア・メタノリカ（ Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の遺伝子は、それらの相手サッカロミセス・セレ ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子との相 同性に基づいてクローニングすることができる。本明細書において開示するＡＤ Ｅ２遺伝子は、このような相同性に基づいてその表示が与えられている。 本発明の他の態様の範囲内において、優性選択マーカーを使用し、これにより 突然変異した宿主細胞した必要性を排除する。優性選択マーカーは、野生型細胞 に増殖の利点を提供できるものである。典型的な優性選択マーカーは、抗体、例 えば、ネオマイシン型抗体（例えば、Ｇ４１８）、ヒグロマイシンＢ）およびブ レオマイシン／フレオマイシン型抗体（例えば、Ｚｅｏｃｉｎ^TM；Ｉｎｖｉｔｒ ｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンディエゴ、から入手 可能である）に対する耐性を提供する遺伝子である。ピヒア・メタノリカ（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）において使用するために好ましい優性選択マーカーは 、Ｚｅｏｃｉｎ^TMの活性を阻害するＳｈ ｂｌａ遺伝子である。 エレクトロポレーションを本発明の範囲内において使用して、ピヒア・メタノ リカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞の中へのＤＮＡの導入を促進する。エ レクトロポレーションは、パルス電界を使用して細胞膜を一時的に透過可能化し 、高分子、例えば、ＤＮＡを細胞の中に入れる方法である。エレクトロポレーシ ョンは、哺乳動物（例えば、Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．、１ ：８４１−８４５、１９８２）および真菌（例えば、Ｍｅｉｌｈｏｃ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：２２３ −２２７、１９９０）の宿主細胞を用いる使用について記載されてきている。し かしながら、ＤＮＡが細胞の中に転移される実際のメカニズムはよく理解されて いない。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の形質転換につい て、２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍの電界強度および１〜４０ミリ秒の時間定数（τ ）を有する、指数的に減衰するパルス電界に、細胞を暴露するとき、驚くべきこ とには、エレクトロポレーションは効率よいことが見出された。時間定数τは、 最初のピーク電圧Ｖ₀がＶ₀／ｅの値に低下するために要求される時間として定義 される。時間定数は合計の抵抗とパルス回路のキャパシタンスとを掛けた値、す なわち、τ＝Ｒ×Ｃとして計算することができる。典型的には、抵抗およびキャ パシタンスは前もって設定されるか、あるいは選択されたエレクトロポレーショ ン装置に依存して、ユーザーが選択することができる。いずれの場合においても 、装置は製造業者の取扱説明書に従い前述の電界強度および減衰パラメーターを 提供するように形作られる。エレクトロポレーション装置は商業的供給会社から 入手可能である（例えば、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォ ルニア州ハーキュレス）。 ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の形質転換に使用するＤ ＮＡ分子は、普通に、二本鎖の、円形プラスミドとして調製され、好ましくはこ れらのプラスミドは形質転換の前に線状化される。ポリペプチドまたはタンパク 質の産生のために、ＤＮＡ分子は、前述の選択マーカーに加えて、転写プロモー ター、注目のポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡセグメント（例 えば、ｃＤＮＡ）、および転写ターミネーターを含んでなる発現カセットを含む であろう。これらの因子は注目のＤＮＡセグメントの転写を提供するように作用 可能に連結される。プロモーターおよび ターミネーターはピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の遺伝子 のそれであることが好ましい。好ましいプロモーターはピヒア・メタノリカ（Ｐ ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のアルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１）のそれであり 、その代表的なコード鎖の配列は配列番号：２に示されている。配列番号：２内 において、開始ＡＴＧコドンはヌクレオチド１３５５−１３５７である。配列番 号：２のヌクレオチド１−２３は非ＡＵＧ１ポリリンカー配列である。プロモー ターとして、配列番号：２のヌクレオチド２４−１３５４を含んでなるセグメン トを利用することは特に好ましいが、追加の上流の配列を含めることもできる。 ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）は第２アルコール利用遺伝 子、ＡＵＧ２、を含有し、そのプロモーターは本発明の範囲内において使用する ことができる。他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ ＤＨＡＳ）、ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）、およびカタラーゼ（ＣＡ Ｔ）の遺伝子のプロモーターを包含する。ＤＮＡ分子は、さらに、形質転換体の 同定、選択、および維持を可能とする選択マーカーを含むであろう。ＤＮＡ分子 は、さらに、追加の因子、例えば、複製起点、および別の宿主（例えば、大腸菌 （Ｅ．ｃｏｌｉ））におけるＤＮＡの増幅および維持を可能とする選択マーカー を含有することができる。宿主染色体の中へのＤＮＡの組込みを促進するために 、宿主ＤＮＡ配列を両端に有する、プロモーター−注目の遺伝子−ターミネータ ー＋選択マーカーを含んでなる、全体の発現セグメントを有することが好ましい 。これは発現セグメントの下流端に３’非翻訳ＤＮＡ配列を含め、そして５’末 端におけるプロモーター配列に頼ることによって、好都合に達成される。直鎖状 ＤＮＡを使用するとき、発現セグメントは切断部位によりはさまれ、分子の線状 化および発現セグメントの 他の配列（例えば、細菌の複製起点および選択マーカー）からの分離を可能とす る。好ましいこのような部位は、ＤＮＡ配列内でめったに切断しない制限エンド ヌクレアーゼ、例えば、８塩基のターゲット配列を認識するもの（例えば、Ｎｏ ｔＩ）により認識される部位である。 本発明の方法を使用してピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ） において生産することができるタンパク質は、工業的および製剤学的に重要なタ ンパク質を包含する。このようなタンパク質は、酵素、例えば、リパーゼ、セル ラーゼ、およびプロテアーゼ；酵素インヒビター、例えば、プロテアーゼインヒ ビター；成長因子、例えば、血小板由来成長因子、繊維芽細胞成長因子、および 表皮成長因子；サイトカイン、例えば、エリトロポイエチンおよびトロンボポイ エチン；およびホルモン、例えば、インスリン、レプチン、およびグルカゴンを 包含する。 本発明の範囲内において使用するために、適切な炭素源、窒素源および微量栄 養素を含んでなる培地中で約２５℃〜３５℃の温度においてピヒア・メタノリカ （Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を培養する。液体培地を慣用手段、例えば 、小さいフラスコの震盪または発酵槽のスパージにより十分に通気する。好まし い培地はＹＥＰＤ（表１）である。細胞を新鮮な培地の中に希釈することによっ て継代培養するか、あるいは冷蔵下にプレート上で短期間貯蔵することができる 。長期間の貯蔵のために、細胞を好ましくは５０％のグリセロール溶液の中に− ７０℃において保持する。 表１ ＹＥＰＤ ２％Ｄ−グルコース ２％Ｂａｃｔｏ^TMペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ、ミシガン州デトロイト） １％Ｂａｃｔｏ^TM酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） ０．００４％アデニン ０．００６％Ｌ−ロイシンＡＤＥ Ｄ ０．０５６％−Ａｄｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末 ０．６７％アミノ酸を含まない酵母窒素原基礎培地 ２％Ｄ−グルコース ０．５％２００×トリプトファン、スレオニン溶液ＡＤＥ ＤＳ ０．０５６％−Ａｄｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末 ０．６７％アミノ酸を含まない酵母窒素原基礎培地 ２％Ｄ−グルコース ０．５％２００×トリプトファン、スレオニン溶液 １８．２２％Ｄ−ソルビトールＬＥＵ Ｄ ０．０５２％−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末 ０．６７％アミノ酸を含まない酵母窒素原基礎培地 ２％Ｄ−グルコース ０．５％２００×トリプトファン、スレオニン溶液ＨＩＳ Ｄ ０．０５２％−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末 ０．６７％アミノ酸を含まない酵母窒素原基礎培地 ２％Ｄ−グルコース ０．５％２００×トリプトファン、スレオニン溶液ＵＲＡ Ｄ ０．０５２％−Ｕｒａ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末 ０．６７％アミノ酸を含まない酵母窒素原基礎培地 ２％Ｄ−グルコース ０．５％２００×トリプトファン、スレオニン溶液ＵＲＡ ＤＳ ０．０５２％−Ｕｒａ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末 ０．６７％アミノ酸を含まない酵母窒素原基礎培地 ２％Ｄ−グルコース ０．５％２００×トリプトファン、スレオニン溶液 １８．２２％Ｄ−ソルビトール−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末 ４．０ｇアデニン、３．０ｇアルギニン、５．０ｇアスパラギン酸、２．０ｇ ヒスチジン、６．０ｇイソロイシン、４．０ｇリジン、２．０ｇメチオニン、６ ．０ｇフェニルアラニン、５．０ｇセリン、５．０ｇチロシン、４．０ｇウラシ ル、および６．０ｇバリン（すべてはＬ−アミノ酸である）を組合わせることに よって製造された粉末−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末 ４．０ｇアデニン、３．０ｇアルギニン、５．０ｇアスパラギン酸、６．０ｇ イソロイシン、８．０ｇロイシン、４．０ｇリジン、２．０ｇメチオニン、６． ０ｇフェニルアラニン、５．０ｇセリン、５．０ｇチロシン、４．０ｇウラシル 、および６．０ｇバリン（すべてはＬ−アミノ酸である）を組合わせることによ って製造された粉末−Ｕｒａ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末 ４．０ｇアデニン、３．０ｇアルギニン、５．０ｇアスパラギン酸、２．０ｇ ヒスチジン、６．０ｇイソロイシン、８．０ｇロイシ ン、４．０ｇリジン、２．０ｇメチオニン、６．０ｇフェニルアラニン、５．０ ｇセリン、５．０ｇチロシン、および６．０ｇバリン（すべてはＬ−アミノ酸で ある）を組合わせることによって製造された粉末−Ａｄｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末 ３．０ｇアルギニン、５．０ｇアスパラギン酸、２．０ｇヒスチジン、６．０ ｇイソロイシン、８．０ｇロイシン、４．０ｇリジン、２．０ｇメチオニン、６ ．０ｇフェニルアラニン、５．０ｇセリン、５．０ｇチロシン、４．０ｇウラシ ルおよび６．０ｇバリン（すべてはＬ−アミノ酸である）を組合わせることによ って製造された粉末２００×トリプトファン、スレオニン溶液 Ｈ₂Ｏ中の３．０％Ｌ−スレオニン、０．８％Ｌ−スレオニンプレートのため に、１．８％Ｂａｃｔｏ^TM寒天（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添 加する。 ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のエレクトロポレーショ ンは、初期対数期の増殖中の細胞について実施ことが好ましい。細胞を固形培地 、好ましくは固形ＹＥＰＤ上に単一のコロニーについてストリークする。３０℃ において約２日の増殖後、新鮮なプレートからの単一のコロニーを使用して、所 望の体積の富んだ培地（例えば、ＹＥＰＤ）を約５〜１０×１０⁵細胞／ｍｌの 細胞密度に接種する。細胞が初期対数期にあるまで、激しく震盪しながら約２５ 〜３５℃、好ましくは３０℃において細胞をインキュベートする。次いで、例え ば、３０００×ｇにおける２〜３分間の遠心により、細胞を収集し、再懸濁させ る。細胞壁中のジサルファイド結合を還元することによって、細胞をエレクトロ コンピテントとし、エレクトロポレーション条件と適合性であるイオン溶液中で 細胞を平衡化し、細胞を冷却する。典型的には、還元剤、例えば、ジチオスレイ トール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含有するｐＨ６ 〜８の緩衝液中で細胞をインキュベートして、細胞壁のタンパク質を還元して引 き続くＤＮＡの吸収を促進することによって、細胞をエレクトロコンピテントと する。これに関して好ましいインキュベーション緩衝液は、２５ｍＭのＤＴＴを 含有する５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５の新鮮な溶液である。細胞 をこの緩衝液（典型的にはもとの培養体積の１／５を使用する）中で約３０℃に おいて約５〜３０分間、好ましくは約１５分間インキュベートする。次いで細胞 を収集し、氷冷して使用する適当なエレクトロポレーション緩衝液中で洗浄する 。これに関して適当な緩衝液は、弱い緩衝剤、２価のカチオン（例えば、Ｍｇ⁺⁺ 、Ｃａ⁺⁺）および浸透圧安定剤（例えば、糖）を含有するｐＨ６〜８の溶液を包 含する。洗浄後、細胞を小さい体積の緩衝液の中に再懸濁させ、この時細胞をエ レクトロポレートし、そして直接使用するか、あるいはアリコートを取り、凍結 して（好ましくは−７０℃において）貯蔵することができる。好ましいエレクト ロポレーション緩衝液はＳＴＭ（２７０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＴｒｉｓ 、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ₂）である。好ましいプロトコールの範囲内に おいて、細胞を２回洗浄し、まずもとの培養体積の氷冷緩衝液中で、次いでもと の体積の１／２中で洗浄する。第２回の洗浄後、細胞を収集し、典型的には、２ ００ｍｌのもとの培養値について約３〜５ｍｌの緩衝液を使用して、再懸濁させ る。 小さい体積のエレクトロコンピテント細胞（典型的には約１００μｌ）および １／１０体積までの直鎖状ＤＮＡ分子を使用して、エレクトロポレーションを実 施する。例えば、０．１ｍｌの５０ｍＭのイオン強度を超えない緩衝液中の細胞 懸濁液を０．１〜１０μｇ のＤＮＡ（体積≦１０μｌ）と組合わせる。この混合物を氷冷エレクトロポレー ションクベットの中に入れ、そして２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍ）好ましくは約３ ．７５ｋＶ／ｃｍのおよび１〜４０ミリ秒、好ましくは１０〜３０ミリ秒、より 好ましくは１５〜２５ミリ秒、最も好ましくは約２０ミリ秒の時間定数のパルス 電界に、指数的減衰で、暴露する。所望のパルスパラメーターを達成するために 使用する実際の装置の設定は、使用する装置により決定されるであろう。Ｂｉｏ Ｒａｄ（カリフォルニア州ハーキュレス）Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ^TMを２ｍｍの エレクトロポレーションクベットとともに使用するとき、抵抗は６００オームま たはそれより大きく、好ましくは「無限」であり、そしてキャパシタンスを２５ μＦに設定して所望の電界特性を得る。パルス後、細胞を１ｍｌのＹＥＰＤブロ スの中にほぼ１０×に希釈し、３０℃において１時間インキュベートする。 次いで細胞を収集し、選択培地上にプレートする。好ましい態様の範囲内にお いて、細胞を小さい体積（エレクトロポレートした細胞の希釈体積に等しい）の １×酵母窒素原基礎培地（６．７ｇ／ｌのアミノ酸を含まない酵母窒素原基礎培 地；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州デトロイト）で１回洗 浄し、最小選択培地上にプレートする。ＡＤＥ２選択マーカーで形質転換された ａｄｅ２突然変異を有する細胞を、アデニンを欠如する最小培地、例えば、ＡＤ Ｅ Ｄ（表１）またはＡＤＥ ＤＳ（表１）上にプレートすることができる。典 型的な手順において、２５０μｌのアリコートの細胞を４つの別々のＡＤＥ Ｄ およびＡＤＥ ＤＳプレート上にプレートして、Ａｄｅ⁺細胞について選択する 。 ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）は、ある種のめったに存 在しない配列［自律複製配列（ＡＲＳ）と命名する］ を、ＤＮＡ複製起点として認識し、そしてこれらの配列は形質転換に使用される ＤＮＡ分子内に偶発的に存在して、形質転換するＤＮＡの染色体外での維持を可 能とすることがある。しかしながら、（ｉｔｅｇｒａｔｉｖｅ）組込み形質転換 体は一般にタンパク質産生系において使用するために好ましい。組込み形質転換 体は、炭素源としてソルビトールを含有する選択培地上でＡＲＳ形質転換体を越 えた深遠な増殖の利点を有し、これにより組込み形質転換体を形質転換された細 胞集団の中から選択するための方法を提供する。ＡＲＳ配列はピヒア・メタノリ カ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のＡＤＥ２遺伝子および、多分、ＡＵＧ１遺 伝子の中に存在することが見出された。したがって、ＡＤＥ２遺伝子で形質転換 されたピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のａｄｅ２宿主細胞 は少なくとも２つの異なるモードによりＡｄｅ⁺となることができる。ＡＤＥ２ 遺伝子内のＡＲＳは、形質転換するＤＮＡの不安定な染色体外の維持を可能とす る（Ｈｉｅｐ ｅｔ ａｌ．、Ｙｅａｓｔ、９：１１８９−１１９７、１９９３ ）。このような形質転換体のコロニーは、Ａｄｅ^-である子孫の多産性世代のた めに、より遅い増殖速度およびピンク色により特性決定される。形質転換するＤ ＮＡは、また、宿主ゲノムの中に組込まれて、急速に増殖し、白色であり、そし てＡｄｅ^-子孫の検出可能なメンバーを生ずることができない、安定な形質転換 体を生ずることができる。ＡＤＥ Ｄプレートは、形質転換された細胞の最も急 速な増殖、およびほぼ同一の速度における不安定および安定な形質転換体の増殖 を可能とする。３０℃においてＡＤＥ Ｄプレート上の３〜５日のインキュベー ション後、安定な形質転換体のコロニーは白色であり、そして不安定な、ピンク 色の形質転換体はほぼ２倍の大きさを有する。ＡＤＥ ＤＳプレートは安定な形 質転換体についていっそう選択的であり 、これらの形質転換体は５〜７日で大きい（約５ｍｍ）のコロニーを形成するが 、不安定な（ＡＲＳ維持）コロニーは非常に小さい（約１ｍｍ）。したがって、 より選択的なＡＤＥ ＤＳ培地は安定な形質転換体の同定および選択のために好 ましい。いくつかの用途のために、例えば、遺伝的に多様なライブラリーを遺伝 因子の希有な組合わせについてスクリーニングするために、ほぼ１００倍で安定 な形質転換体に数でまさって観察された、多数の不安定な形質転換体をスクリー ニングすることが時々望ましい。このような場合において、低い選択性の培地、 例えば、ＡＤＥ Ｄ上に形質転換体をプレートする実用性を当業者は認識するで あろう。 組込み形質転換体はタンパク質生産法において使用するために好ましい。この ような細胞は連続的な選択的圧力なしに増殖することができる。なぜなら、ＤＮ Ａはゲノムからめったに失われないからである。宿主染色体の中へのＤＮＡの組 込みはサザンブロット分析により確証することができる。簡単に述べると、形質 転換された宿主ＤＮＡおよび非形質転換の宿主ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ で消化し、電気泳動により分離し、支持膜にブロットし、そして適当な宿主ＤＮ Ａセグメントでプローブする。非形質転換細胞および形質転換された細胞におい て見られるフラグメントのパターンの差は、組込み形質転換を示す。形質転換す るＤＮＡセグメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、異種ＤＮＡ、お よび選択マーカーの配列）をゲノムフラグメントの中から同定するために、制限 酵素およびプローブを選択することができる。 異種タンパク質の発現レベルの差は、組込み部位および発現カセットのコピー 数のような因子および個々の単離物の間のプロモーターの差から発生させること ができる。したがって、産生株を選択する前に、多数の単離物を発現レベルにつ いてスクリーニングするこ とが有利である。種々の適当なスクリーニング法が利用可能である。例えば、形 質転換体のコロニーをプレート上で増殖させ、プレートをタンパク質に結合する 膜（例えば、ニトロセルロース）でオーバーレイする。タンパク質は細胞からの 分泌によるか、あるいは引き続く溶解により解放され、そして膜に結合する。次 いで結合したタンパク質を既知の方法、例えば、イムノアッセイによりアッセイ することができる。細胞を液体培地中で培養し、必要に応じて、コンディショニ ングされた培地または細胞ライゼイトを分析することによって、発現レベルのよ り正確な分析を得ることができる。タンパク質を培地およびライゼイトから濃縮 しかつ精製する方法は、注目のタンパク質により一部分決定されるであろう。 小規模のタンパク質の生産（例えば、プレートまたは震盪フラスコでの生産） のために、メタノールで制御されるプロモーター（例えば、ＡＵＧ１プロモータ ー）を含んでなる発現カセットを有するピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎ ｏｌｉｃａ）の形質転換体を、メタノールの存在下でかつ妨害量の他の炭素源（ 例えば、グルコース）の非存在下で増殖させる。発現レベルの予備的スクリーニ ングを包含する、小規模の実験のために、形質転換体を、例えば、２０ｇ／ｌの Ｂａｃｔｏ寒天（Ｄｉｆｃｏ）、６．７ｇ／ｌのアミノ酸を含まない酵母窒素原 基礎培地（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｇ／ｌのメタノール、０．４μｇ／ｌのビオチン 、および０．５６ｇ／ｌのＡｄｅ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ粉末を含有する固形培地上で ３０℃において増殖させることができる。メタノールは揮発性炭素源であるので 、それは長期間のインキュベーションで容易に失われる。倒立プレートの蓋の中 に水中５０％メタノール溶液を入れることによってメタノールを連続的に供給す ることができ、これによりメタノールは蒸発的転移（ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）により 増殖する細胞に転移される。一般に、１００ｍｍのプレートにつき１ｍｌ以下の メタノールを使用する。震盪フラスコ中で増殖させた培養物を使用して、わずか により大きい規模の実験を実施することができる。典型的な手順において、前述 したように３０℃において最少メタノールプレート上で細胞を２日間培養し、次 いでコロニーを使用して小さい体積の最少メタノール培地（６．７ｇ／ｌのアミ ノ酸を含まない酵母窒素原基礎培地、１０ｇ／ｌのメタノール、０．４μｇ／ｌ のビオチン）を約１×１０⁶細胞／ｍｌの細胞密度で接種する。細胞を３０℃に おいて増殖させる。メタノールで増殖する細胞は高い酸素要求を有し、培養の間 の激しい震盪を必要とする。メタノールを毎日補充する（典型的には１／１００ 体積の５０％メタノール／日）。 生産規模の培養のために、高い産生性のクローンの新鮮な培養物を震盪フラス コ中で調製する。次いで生ずる培養物を使用して、発酵槽中の培地を接種する。 典型的には、３０℃において１〜２日間激しく撹拌しながら増殖させたＹＥＰＤ 中の５００ｍｌの培養物を使用して、５リットルの発酵槽を接種する。塩類、グ ルコース、ビオチン、および微量元素を含有する適当な培地中で２８℃、ｐＨ５ ．０、および＞３０％溶解Ｏ₂において、細胞を増殖させる。最初に供給したグ ルコースが消費された後（酸素消費の減少により示される）、グルコース／メタ ノールの供給物を容器の中に導入して、問題のタンパク質の産生を誘発する。大 規模の発酵は炭素を制限する条件下に実施されるので、供給物中のグルコースの 存在はメタノール誘発可能なプロモーターを抑制しない。 実施例 実施例１． ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞（ＣＢ Ｓ６５１５株、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ ｉｏｎ、マリイランド州ロックビレ）を紫外線暴露により突然変異誘発した。ま ず、いくつかのプレート上にほぼ２００〜２５０細胞／プレートでプレートする ことによって、死滅曲線を発生させた。次いでプレートの表面から２５ｃｍに懸 垂されたＧ８Ｔ５殺菌燈（Ｓｙｌｖａｎｉａ）を使用して、プレートを紫外線に 表２に示す時間の間暴露した。次いでプレートを可視光線源から保護し、３０℃ において２日間インキュベートした。 次いで２秒間の紫外線暴露を使用して約２０％の死滅を発生させることによっ て、大規模な突然変異誘発を実施した。同種の欠損（ｃｏｇｎａｔｅ ｄｅｆｉ ｃｉｅｎｃｙ）を有する潜在的栄養要求株の増殖を補助するために添加された、 １００ｍｇ／ｌの各ウラシル、アデニン、およびロイシンを補充した、８つのＹ ＥＰＤプレート上に細胞をほぼ１０⁴細胞／プレートでプレートした。紫外線暴 露後、プレートを箔の中に包み、３０℃において一夜インキュベートした。次の 日に、プレート上のコロニー（合計約１０⁵）を水中に再懸濁させ、水で１回洗 浄した。０．１〜０．２のＯＤ₆₀₀を与 えるために十分な量の細胞懸濁液を使用して、アミノ酸またはアンモニアを含ま ない酵母窒素原基礎培地を使用して調製され、１％グルコースおよび４００μｇ ／ｌのビオチンを補充した、５００ｍｌの最小ブロスに接種した。培養物を２． ８リットルのバッフルベル（ｂａｆｆｌｅｄ Ｂｅｌｌ）フラスコの中に入れ、 ３０℃において一夜激しく震盪した。次の日に、細胞は約１．０〜２．０のＯＤ₆₀₀ に到達した。細胞を沈降させ、５ｇ／ｌの硫酸アンモニウムを補充した５０ ０ｍｌの最小ブロスの中に再懸濁させた。細胞懸濁液を２．８リットルのバッフ ルベルフラスコの中に入れ、３０℃において６時間激しく震盪した。培養物の５ ０ｍｌを対照として取って置き、培養物の残りに１ｍｇのナイスタチンを添加し て栄養要求性突然変異体について選択した（Ｓｎｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ、２１１： ２０６−２０７、１９６６）。培養物をさらに１時間震盪しながらインキュベー トした。次いで、対照細胞およびナイスタチン処理細胞を遠心により収集し、水 で３回洗浄した。洗浄した細胞を５０％グリセロールの中に１．０のＯＤ₆₀₀に 再懸濁させ、凍結させた。コロニー形成単位についてナイスタチン処理細胞／対 照細胞の力価は、ナイスタチンの濃縮が生存できる細胞の数を１０⁴倍減少させ たことを明らかにした。 ナイスタチン処理細胞の１０^-2希釈物を１５のＹＥＰＤプレート上にプレート した。コロニーを最小プレート（２％寒天、１×ＹＮＢ、２％グルコース、４０ ０μｇ／ｌビオチン）上にレプリカ−プレートした。栄養要求株の頻度は約２〜 ４％であった。ほぼ１８０の栄養要求性コロニーをＹＥＰＤ＋Ａｄｅ、Ｌｅｕ、 Ｕｒａプレートに取り上げ、種々のドロップアウトプレートにレプリカ−プレー トした。栄養要求株のすべてはＡｄｅ^-であった。これらのうちで、３０はドロ ップアウトプレート上で顕著にピンク色であった（Ｌ ＥＵ Ｄ、ＨＩＳ Ｄ、およびその他；表１参照）。３０のピンク色の突然変異 体のうちで、２１をそれ以上の研究のために選択した；残りはＡＤＥ Ｄプレー ト上の増殖について漏出性であるか、あるいは野生型細胞で汚染されていた。 次いでＡｄｅ^-突然変異体を相補性分析および表現型試験に付した。突然変異 体により定められる遺伝子座の数を決定するために、すべての２１の突然変異体 を単一のピンク色のＡｄｅ^-テスター株（株＃２）に交配させた。細胞懸濁液（ ＯＤ₆₀₀＝１）を混合し、この混合物を１０μｌのアリコートでＹＥＰＤプレー ト上にプレートすることによって、交配を実施した。次いで細胞をＳＰＯＲ培地 （０．５％酢酸ナトリウム、１％ＫＣｌ、１％グルコース、１％寒天）に複製し 、３０℃において一夜インキュベートした。表３に示すように、突然変異体のい くつかの組合わせはＡｄｅ⁺コロニーを与えることができなかった（おそらく株 ＃２におけるのと同一の遺伝子座を定めるために）が、他のものは多数のＡｄｅ⁺ コロニーを生じた（おそらく別の遺伝子座を定めるために）。突然変異体＃３ は、＃２と交配させたとき、Ａｄｅ⁺コロニーを与えたので、相補性の試験を突 然変異体＃３を使用して反復した。突然変異体のグループが２つの遺伝子座を定 める場合、株＃２と交配させたときにＡｄｅ⁺コロニーを与えることができなか ったすべての突然変異体は、株＃３と交配させたときＡｄｅ⁺コロニーを与える であろう。交雑の結果を表３に示す。 表３に示すように、大部分の突然変異体は２つのグループのうち の１つに入り、欠失したとき、制限アデニン培地上でピンク色のコロニーを生ず る２つのアデニン生合成遺伝子が存在するという考えと一致する。３つのコロニ ー（＃４、＃１２、および＃１６）は３つの遺伝子座を定めるか、あるいは遺伝 子内相補性（ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を示す 。２つの相補性（ｃｏｍｐｒｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）グループ（＃３と＃１０、 ＃６と＃１１）の各々からの強く色素沈着した突然変異体をさらなる研究のため に選択した。追加の分析は、Ａｄｅ^-がこれらの株の中に存在する唯一の栄養要 求株であることを示した。 ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のクローンのバンクをベ クターｐＲＳ４２６、すなわち、２μおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＵＲＡ配列を含んでなるシャトルベクター中で構築し、 サッカロミヤス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるその増殖を 可能とした。標準的手順に従い、ＣＢＳ６５１５株からゲノムＤＮＡを調製した 。簡単に述べると、細胞を富んだ培地中で一夜培養し、ザイモリアーゼでスフェ ロプラストとし、そしてＳＤＳで溶解した。ＤＮＡをライゼイトからエタノール で沈降させ、フェノール／クロロホルム混合物で抽出し、次いで酢酸アンモニウ ムおよびエタノールで沈降させた。ＤＮＡ調製物のゲル電気泳動は、完全な、高 分子量のＤＮＡおよび認められる量のＲＮＡの存在を示した。酵素の希釈系列の 存在においてＤＮＡをインキュベートすることによって、ＤＮＡをＳａｕ３Ａで 部分的に消化した。消化物のサンプルを電気泳動により分析して、フラグメント の大きさ分布を決定した。４〜１２ｋｂの間を移動するＤＮＡをゲルから切断し 、ゲルのスライスから抽出した。次いで大きさで分画したＤＮＡをＢａｍＨＩで 消化したｐＲＳ４２６に結合し、アルカリ性ホスファターゼで処理した。製造業 者が推奨するようにＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ^TM装置を使用して、 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１において、反応混合物のアリコートをエレ クトロポレートした。 ゲノムライブラリーを使用してエレクトロポレーションによりサッカロミヤス ・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＢＹ２１Ａ株（ａｄｅ２ｕｒａ３ ）を形質転換した（ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ ｎｚｙｍｏｌ． 、１９４：１８２−１８７、１９９１）。細胞を１．２Ｍのソル ビトールの中に再懸濁させ、６×３００μｌのアリコートをＡＤＥ Ｄ、ＡＤＥ ＤＳ、ＵＲＡ ＤおよびＵＲＡ ＤＳプレート（表１）上にプレートした。プ レートを３０℃において４〜５日間インキュベートした。ＡＤＥ ＤまたはＡＤ Ｅ ＤＳプレート上で、Ａｄｅ⁺コロニーは回収されなかった。ＵＲＡ Ｄおよ びＵＲＡ ＤＳプレートからのコロニーをＡＤＥ Ｄプレートにレプリカ−プレ ートし、２つの密接に間隔を置いて位置する白色のコロニーが得られた。これら のコロニーを再ストリークし、Ｕｒａ⁺およびＡｄｅ⁺であることが確証された。 これらの２つの株（Ａｄｅ１およびＡｄｅ６と表示する）を、５ＦＯＡ（５フル オロオロト酸；ＳｉｋｏｒｓｋｉおよびＢｏｅｋｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ ｍｏｌ． 、１９４：３０２−３１８）を含有する培地上にストリークした。Ｕｒ ａ^-が得られ、これらはレプリカプレートするときＡｄｅ^-であることが見出され た。これらの結果が示すように、Ａｄｅ⁺補足活性はプラスミドを含むＵＲＡ３ マーカーに遺伝的に関係づけられる。酵母Ａｄｅ１およびＡｄｅ６から得られた プラスミドは、後述するように、制限マッピングにより同一であるように見えた 。これらのゲノムのクローンを、それぞれ、ｐＡＤＥ１−１およびｐＡＤＥ１− ６と表示する。 全体のＤＮＡをＨＢＹ２１Ａ形質転換体Ａｄｅ１およびＡｄｅ６から単離し、 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１をＡｍｐ^rに形質転換するために使用した 。Ａｄｅ１の２つのＡｍｐ^rコロニーおよびＡｄｅ６の３つのＡｍｐ^rコロニーか らＤＮＡを調製した。ＤＮＡをＰｓｔＩ、ＳｃａＩ、およびＰｓｔＩ＋ＳｃａＩ で消化し、ゲル電気泳動により分析した。すべての５つの単離物は同一の制限パ ターンを生成した。 ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のＡＤＥ２遺伝子（また 、ＡＤＥ１として知られている；Ｈｉｅｐ ｅｔ ａ１．、Ｙｅａｓｔ、９：１ ２５１−１２５８、１９９３）の発表された配列から、ＰＣＲプライマーを設計 した。プライマー９０８０（配列番号：３）をＡＤＥ２のＤＮＡ（配列番号：１ ）の塩基４０６−４２９においてプライムするように設計し、そしてプライマー ９０７９（配列番号：４）を塩基２８５２−２８２９においてプライムするよう に設計した。双方のプライマーは、増幅された配列の各末端にＡｖｒＩＩおよび ＳｐｅＩを導入するテイルを含んだ。生ずるＰＣＲフラグメントの予測された大 きさは２４５０ｂｐであった。 鋳型ＤＮＡとして５つの推定上のＡＤＥ２からのプラスミドＤＮＡを使用して 、ＰＣＲを実施した。１００μｌの反応混合物は、１×Ｔａｑ ＰＣＲ緩衝液（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インジアナ州インディアナポリス） 、１０〜１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、１００ｐ ｍｏｌの各プライマー、および１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有した。ＰＣＲを３０サイクルの３０秒、９２℃ 、および１２０秒、７２℃で実施した。５つの推定上のＡＤＥ２ゲノムのクロー ンの各々は、期待された大きさ（２．４ ｋｂ）のＰＣＲ生成物を生じた。１つの反応からのＤＮＡフラグメントの制限マ ッピングは、ＢｇｌＩＩまたはＳａｌＩで消化したとき、期待された大きさのフ ラグメントを与えた。 陽性のＰＣＲ反応物をプールし、ＳｐｅＩで消化した。べクターｐＲＳ４２６ をＳｐｅＩで消化し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理した。４μｌのＰＣＲフラ グメントおよび１μｌのベクターＤＮＡを、慣用の結合条件を使用して、１０μ ｌの反応混合物中で組合わせた。結合したＤＮＡをゲル電気泳動により分析した 。ＳｐｅＩ消化物を分析して、ｐＲＳ４２６内にＡＤＥ２遺伝子のサブクローン を有するプラスミドを同定した。正しいプラスミドをｐＣＺＲ１１８と表示した 。 ｐＣＺＲ１１８中のＡＤＥ２遺伝子はＰＣＲにより増幅されたので、その遺伝 子の機能特性を不能とする突然変異を発生させることができた可能性が存在した 。このような突然変異を試験するために、所望のインサートを有するサブクロー ンを単一にサッカロミセス．セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ）ＨＢＹ２１Ａ株の中に形質転換した。標準的手順に従い、細胞 をエレクトロコンピテントとし、形質転換した。形質転換体をＵＲＡ Ｄおよび ＡＤＥ Ｄプレート上にプレートした。３つの表現型のグループが同定された。 クローン１、２、１１、および１２は、ＡＤＥ Ｄ上で多数の形質転換体の健康 な増殖を与えた。形質転換体の頻度はＵｒａ⁺形質転換体の頻度に匹敵した。ク ローン６、８、１０、および１４は、また、Ｕｒａ⁺およびＡｄｅ⁺の双方に対す る形質転換の高い効率を与えたが、Ａｄｅ⁺コロニーは第１グループにおけるそ れらよりも多少小さかった。クローン３は多数のＵｒａ⁺コロニーを与えたが、 Ａｄｅ⁺コロニーを与えず、それは非機能的ａｄｅ２突然変異を有することが示 唆された。クローン１、 ２、１１、および１２をプールした。 ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のａｄｅ２相補性グルー プを同定するために、各相補性グループ（＃３および＃１０；＃６および＃１１ ）からの２つのそれぞれの突然変異体（これらは制限アデニン上で増殖させたと き、深い赤色の色素沈着に基づいて選択された）をクローニングされたＡＤＥ遺 伝子で形質転換した。初期対数期の細胞の２００ｍｌの培養物を３０００×ｇの ２分間の遠心により収集し、２０ｍｌの新鮮なＫＤ緩衝液（５０ｍＭのリン酸カ リウム緩衝液、ｐＨ７．５、２５ｍＭのＤＴＴを含有する）の中に再懸濁させた 。細胞を３０℃においてこの緩衝液中で１５分間インキュベートした。次いで細 胞を収集し、２００ｍｌの氷冷ＳＴＭ（２７０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＴ ｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ₂）の中に再懸濁させた。細胞を収集し 、１００ｍｌの氷冷ＳＴＭの中に再懸濁させた。再び、細胞を収集し、３〜５ｍ ｌの氷冷ＳＴＭの中に再懸濁させた。次いで、各培養からのエレクトロコンピテ ント細胞の１００μｌのアリコートをＮｏｔＩ消化したｐＡＤＥ１−１のＤＮＡ と混合した。細胞／ＤＮＡ混合物を２ｍｍのエレクトロポレーションクベットの 中に入れ、１０００Ωの抵抗および２５μＦのキャパシタンスに設定されたＢｉ ｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ^TM装置を使用して、５ｋＶ／ｃｍのパルス電 界に暴露した。パルス後、細胞を１ｍｌのＹＥＰＤの添加により希釈し、３０℃ において１時間インキュベートした。次いで細胞をおだやかな遠心により収集し 、アデニンを欠如する４００μｌの最小選択培地（ＡＤＥ Ｄ）の中に再懸濁さ せた。再懸濁させたサンプルを２００μｌのアリコートに分割し、ＡＤＥ Ｄお よびＡＤＥ ＤＳプレート上にプレートした。プレートを３０℃において４〜５ 日間インキュベートした。突然変異体＃６および＃１ １はＡｄｅ⁺形質転換体を与えた。ＤＮＡを省略したとき、Ａｄｅ⁺形質転換体は 観察されず、それゆえ、単離物はａｄｅ２相補性グループを定めるように見える た。ＡＤＥ２配列を配列番号：１に示す。 実施例２． 実施例１で開示したピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のク ローンのバンクを、アルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１）をクローニングするため の源として使用した。このクローンのバンクを独立のプールとして貯蔵し、各々 は約２００〜２５０の個々のゲノムのクローンを表した。ハンゼヌラ・ポリモル ファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏ１ｙｍｏｒｐｈａ）、カンジダ・ボイディニ（ Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）からのアルコールオキシダーゼ遺伝子の中に保存された配 列の整列から設計された、ＰＣＲプライマー（８７８４、配列番号：５；８７８ ７；配列番号：６）を使用するポリメラーゼ連鎖反応において、各プールからの ０．１μｌの「ミニプレプ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）」ＤＮＡを鋳型として使用した 。増幅反応を３０サイクルの９４℃、３０秒；５０℃、３０秒；７２℃、６０秒 で実施し、次いで７２℃において７分間インキュベートした。１つのプール（＃ ５）は約６００ｂｐのバンドを与えた。このＰＣＲ生成物のＤＮＡの配列決定に おいて、ＡＯＸ１遺伝子によりコードされるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のアルコールオキシダーゼと約７０％の配列の同一性およ びＡＯＸ１遺伝子によりコードされるハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎ ｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のアルコールオキシダーゼと約８５％の配列の 同一性を有するアミノ酸配列をそれがコードすることが明らかにされた。クロー ニングされたＡＵＧ１遺伝 子の配列を配列番号：２に示す。 最初の増幅において使用したのと同一のプライマーを使用するＰＣＲにより、 プール＃５のサブプールを分析した。１つの陽性のサブプールをさらに破壊して 、陽性のコロニーを同定した。この陽性のコロニーをプレート上にストリークし 、ＤＮＡを個々のコロニーから調製した。３つのコロニーは、ＣｌａＩで消化後 、同一のパターンを与えた。 ゲノムのクローンおよびＰＣＲ生成物の制限マッピングにおいて、ＡＵＧ１遺 伝子は７．５ｋｂのゲノムのインサート上に横たわり、そしてＰＣＲフラグメン ト内の部位をゲノムのインサート内でユニークに同定できることが明らかにされ た。ＰＣＲフラグメント内の遺伝子の向きは知られているので、ＰＣＲフラグメ ントの情報はゲノムのインサート内のＡＵＧ１遺伝子の概算位置および方向を提 供した。この領域内のＤＮＡの配列決定は、アミノ酸レベルにおいて他の既知の アルコールオキシダーゼ遺伝子に対して非常に高い類似性を有する遺伝子を明ら かにした。 実施例３． ａｄｅ２突然変異体のピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細 胞を、本質的前述したように、ＡＵＧ１のプロモーターおよびターミネーター、 ヒトＧＡＤ６５ＤＮＡ（Ｋａｒｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３３７−８３４１、１９９１）、およびＡ ＤＥ２選択マーカーを含んでなる発現ベクターを使用して、エレクトロポレーシ ョンにより形質転換する。２０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ^TM寒天（Ｄｉｆｃｏ）、６． ７ｇ／ｌのアミノ酸を含まない酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｇ／ｌ のメタノール、および０．４μｇ／ｌのビオチンを含有する寒天最小メタノール プレートにコロニーをパッ チする（１０〜１００コロニー／１００ｍｍのプレート）。寒天をニトロセルロ ースでオーバーレイし、１ｍｌの水中の５０％メタノールを含有する蓋上にプレ ートを倒立させ、３０℃において３〜５日間インキュベートする。次いで膜をフ ィルターに移し、０．２ＭのＮａＯＨ、０．１％のＳＤＳ、３５ｍＭのジチオス レイトールの中にソーキングして、付着した細胞を溶解する。３０分後、細胞の 破片をフィルターから蒸留水せすすぎ、フィルターを０．１Ｍの酢酸中で３０分 間すすぐことによって中和する。 次いでフィルターを付着したタンパク質についてアッセイする。ＴＴＢＳ−Ｎ ＦＭ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．１％のツイーン２０、１６０ｍＭ のＮａＣｌ、５％の粉末状無脂肪ミルク）中で室温において３０分間すすぐこと によって、非占有部位をブロックする。次いで、ＴＴＢＳ−ＮＦＭ中で１：１０ ００に希釈した、ＧＡＤ６モノクローナル抗体（ＣｈａｎｇおよびＧｏｔｔｌｉ ｅｂ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、８：２１２３−２１３０、１９８８）を含有す る溶液に、フィルターを移す。フィルターを抗体溶液中でおだやかに撹拌しなが ら少なくとも１時間インキュベートし、次いでＴＴＢＳ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、 ｐＨ７．４、０．１％のツイーン２０、１６０ｍＭのＮａＣｌ）で各回５分間２ 回洗浄する。次いで、フィルターをセイヨウワサビペルオキシダーゼに接合した ヤギ抗マウス抗体（ＴＴＢＳ−ＮＦＭ中の１μｇ／ｍｌ）中で少なくとも１時間 インキュベートし、ＴＴＢＳで各回５分間３回洗浄する。次いでフィルターを商 業的に入手可能な化学発光性試薬（ＥＣＬ^TM、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｃ．、イ リノイ州アーリントンハイツ）に暴露する。陽性のパッチから発生する光をＸ線 フィルム上に検出する。 ＧＡＤ₆₅発現レベルをいっそう正確に検出するために、候補のク ローンを震盪フラスコの培養において培養する。前述したように、３０℃におい て最小メタノールプレート上でコロニーを２日間増殖させる。これらのコロニー を使用して、２０ｍｌの最小メタノール培地（６．７ｇ／ｌのアミノ酸を含まな い酵母窒素原基礎培地、１０ｇ／ｌのメタノール、０．４μｇ／ｌのビオチン） を１×１０⁶細胞／ｍｌの細胞密度で接種する。培養物を激しく震盪しながら３ ０℃において１〜２日間増殖させる。０．２ｍｌの５０％メタノールを各培養物 に毎日添加する。細胞を遠心により収集し、氷***解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉ ｓ、ｐＨ８．０、４０ｍＭのＨＣｌ、２ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのペプスタチン、１μｇ／ｍｌのアプ ロチニン）の中に１０ｍｌの最終体積／１ｇの細胞ペーストで懸濁させる。生ず る懸濁液の２．５ｍｌを１５ｍｌの容器中の２．５ｍｌの４００〜６００ミクロ ンの氷冷酸洗浄したガラスビーズに添加し、この混合物を１分間激しく撹拌し、 次いで氷上で１分間インキュベートする。この手順を細胞が合計５分間撹拌され るまで反復する。大きい破片および未破壊の細胞を１０００×ｇにおける５分間 の遠心により除去する。次いで清浄化ライゼイトをきれいな容器にデカントする 。透明なライゼイトをサンプル緩衝液（５％のＳＤＳ、８Ｍの尿素、１００ｍＭ のＴｒｉｓ、ｐＨ６．８、１０％のグリセロール、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１ ％のブロモフェノールにかわ）中に希釈し、４〜２０％のアクリルアミドの勾配 ゲル（Ｎｏｖｅｘ、カリフォルニア州サンディエゴ）上で電気泳動させる。前述 したように、タンパク質をニトロセルロース上にブロットし、ＧＡＤ６抗体で検 出する。 震盪フラスコの培養において高いレベルの外来タンパク質のメタノール誘発発 現を示すクローンを、高い密度の発酵条件下にいっそ う広範に分析する。細胞をまず０．５リットルのＹＥＰＤブロス中で３０℃にお いて１〜２日間激しく撹拌しながら培養し、次いで５リットルの発酵装置（例え ば、ＢｉｏＦｌｏｗ ＩＩＩ；Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ ｃ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、ニュージャージイ州エジソン）を接種するために使用す る。発酵容器にまず無機質塩を供給し、次いで５７．８ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、 ６８ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、３０．８ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８．６ｇのＣａＳＯ₄ ・２Ｈ₂Ｏ、２．０ｇのＮａＣｌ、および１０ｍｌの泡消剤（ＰＰＧ）を添加す る。Ｈ₂Ｏを添加して体積を２．５リットルにし、この溶液を４０分間オートク レーブ処理する。冷却後、３５０ｍｌの５０％グルコース、２５０ｍｌの１０× 微量元素（表４）、２５ｍｌの２００μｇ／ｍｌのビオチン、および２５０ｍｌ の細胞接種物を添加する。１〜２ｍｌ／ｌのＨ₂ＳＯ₄を添加して化合物を溶液にする。 発酵容器を２８℃、ｐＨ５．０、および＞３０％の溶解Ｏ₂にお いて運転する。グルコース消費の間の酸素の鋭い要求および引き続くグルコース 消耗後の酸素消費の減少により示されるように、細胞はグルコースの開始供給物 を消費するであろう。開始グルコース供給物の消耗後、ＮＨ₄ ⁺および微量元素を 補充したグルコース−メタノール供給物を容器に０．２％（ｗ／ｖ）グルコース 、０．２％（ｗ／ｖ）メタノールで５時間導入し、次いで０．１％（ｗ／ｖ）グ ルコース、０．４％（ｗ／ｖ）メタノールで２５時間導入する。容器の１つの口 を通して純粋なメタノールとして１２．５ｍｌ／時の開始導入速度および２５ｍ ｌ／時の最終速度で、合計５５０ｇのメタノールを供給する。１７５ｇのグルコ ース、２５０ｍｌの１０×微量元素、および９９ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を含有す る７００ｍｌの溶液を使用して、第２口を通して、グルコースを供給する。これ らの条件下に、グルコースおよびメタノールは同時に利用され、グルコース−メ タノールの供給が開始されると、ＧＡＤ₆₅の発現が誘発される。震盪フラスコの 培養について前述したように、発酵容器からの細胞をＧＡＤ₆₅の発現について分 析する。 細胞を発酵容器からある時間間隔で取出し、引き続いて分析する。グルコース についての増殖の間に、ＧＡＤ₆₅の発現はほとんど観察されない。グルコースの 消耗はＧＡＤ₆₅タンパク質の低い発現に導く；発酵培養の供給の間におけるＭｅ ＯＨの添加により、発現は増強される。メタノールの添加は、メタノール応答性 ＡＵＧ１プロモーターにより推進されるヒトＧＡＤ₆₅の発現に対して明瞭な刺激 効果を有する。 実施例４． 形質転換条件を研究して、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ ）の効率よい形質転換に最適である、電界条件、ＤＮＡのトポロジー、およびＤ ＮＡ濃度を決定した。すべての実験にお いて、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のａｄｅ２株＃１１ を使用した。前述したように、コンピテント細胞を調製した。ＢｉｏＲａｄ Ｇ ｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ^TMを使用して、エレクトロポレーションを実施した。 ２つの電界のパラメーターはエレクトロポレーションによる形質転換効率に影 響を及ぼす：キャパシタンス、電界強度、およびパルスの期間。電界強度は電気 パルスの電圧により決定されるが、パルスの期間は計装の抵抗の設定により決定 される。この組の実験の範囲内において、種々の抵抗における電界強度の設定の マトリックスを検査した。すべての実験において、計装の最高のキャパシタンス の設定（２５μＦ）を使用した。氷上で、ほぼ１μｇの制限酵素ＮｏｔＩで線状 化されたＡＤＥ２プラスミドｐＣＺＲ１３３を含有するＤＮＡの１０μｌと、エ レクトロコンピテント細胞の１００μｌのアリコートを混合した。細胞およびＤ ＮＡを２ｍｍのエレクトロポレーションクベット（ＢＴＸ Ｃｏｒｐ．、カリフ ォルニア州サンディエゴ）に移し、０．５ｋＶ（２．５ｋＶ／ｃｍ）、０．７５ ｋＶ（３．７５ｋＶ／ｃｍ）、１．０ｋＶ（５．０ｋＶ／ｃｍ）、１．２５ｋＶ （６．２５ｋＶ／ｃｍ）、および１．５ｋＶ（７．５ｋＶ／ｃｍ）においてエレ クトロポレートした。これらの電界強度の条件を種々のパルスの期間において検 査した。計装の設定抵抗を２００オーム、または「無限」オームに変化させるこ とによって、パルスの期間を操作した。パルスした細胞をＹＥＰＤの中に懸濁さ せ、３０℃において１時間インキュベートし、収集し、再懸濁させ、プレートし た。３っの別々の組の実験を実施した。各組において、「無限」オームの抵抗に おける０．７５ｋＶ（３．７５ｋＶ／ｃｍ）のエレクトロポレーション条件は、 試験した他の条件よりも劇的により高い形質転換効率を与えることが見出された （第１図参照 ）。 最適なパルス条件が確立された後、形質転換効率に対するＤＮＡのトポロジー の影響を研究した。エレクトロコンピテント細胞を１μｇの非切断の円形ｐＣＺ Ｒ１３３または１μｇのＮｏｔＩ消化ｐＣＺＲ１３３と混合した。３つの別々の 実験において、円形ＤＮＡを使用して平均ほぼ２５の形質転換体が回収されたが 、直鎖状ＤＮＡは平均ほぼ１×１０⁴の形質転換体を生じた。これらのデータが 示すように、直鎖状ＤＮＡは円形ＤＮＡよりも非常により大きい効率でピヒア・ メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）を形質転換する。 最後に、ＤＮＡ濃度と形質転換効率との間の関係を研究した。直鎖状ｐＣＺＲ １３３ＤＮＡのアリコート（１０μｌのＨ₂Ｏ中の１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎ ｇおよび１μｇ）を１００μｌのエレクトロコンピテント細胞と混合し、そして ３．７５ｋＶ／ｃｍおよび「無限」オームにおいてエレクトロポレーションを実 施した。形質転換体の数は約１０（１ｎｇのＤＮＡ）から１０⁴（１μｇのＤＮ Ａ）の間で変化し、そしてＤＮＡ濃度に比例することが見出された。 実施例５． 野生型細胞および安定な、白色の形質転換体のコロニーからのＤＮＡを比較す ることによって、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のゲノム の中への形質転換するＤＮＡの組込みを検出した。２つのクラスの組込み形質転 換体が同定された。第１において、形質転換するＤＮＡは相同部位の中に組込ま れることが見出された。第２のクラスにおいて、形質転換するＤＮＡは内因性Ａ ＵＧ１オープンリーディングフレームと置換することが見出された。理論により 拘束されたくないが、この第２の形質転換体は「転位 組換え事象」により発生したと考えられ（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． 、１９４：２８１−３０１、１９９１）これにより形質転換 するＤＮＡを二重組換え事象を経て内因性ＤＮＡを置換する。 ＡｓｐＩ消化ｐＣＺＲ１４０、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉ ｃａ）のＡＤＥ２遺伝子を含有するブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^TM ）（Ｓｔｒａｔａｇｎｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニ ア州ラジョラ）をベースとするベクター、およびプロモーター領域とターミネー ター領域との間の全体のオープンリーディングフレームが欠失されているＡＵＧ １の突然変異体を使用して、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ ）のａｄｅ２株＃１１をＡｄｅ⁺に形質転換した（第２図）。野生型細胞および ３０℃においてＹＥＰＤプレート上で２日間増殖させた形質転換体細胞から、ゲ ノムＤＮＡを調製した。約１００〜２００μｌの細胞を１ｍｌのＨ₂Ｏの中に懸 濁させ、次いでマイクロ遠心機により３０秒間遠心した。細胞ペレットを回収し 、４００μｌのＳＣＥ＋ＤＴＴ＋ザイモリアーゼ（１．２Ｍのソルビトール、１ ０ｍＭのＮａクエン酸塩、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１〜２ｍｇ／ｍｌのザイモリア ーゼ１００Ｔ）の中に再懸濁させ、３７℃において１０〜１５分間インキュベー トした。４００μｌの１％ＳＤＳを添加し、この溶液を透明になるまで混合した 。３００μｌの５Ｍの酢酸カリウム、ｐＨ８．９を添加し、この溶液を混合し、 マイクロ遠心機中で５分間最高速度において遠心した。７５０μｌの上清を新し い管に移し、等しい体積のフェノール／クロロホルムで抽出した。６００μｌの 生ずる上清を回収し、ＤＮＡを２体積のエタノールの添加により沈降させ、冷時 に１５分間遠心した。ＤＮＡペレットを５０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、 ｐＨ８、１ｍ ＭのＥＤＴＡ）＋１００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼの中に６５℃において約１時間 再懸濁させた。３７℃において１０μｌのＤＮＡサンプルを１００μｌの反応体 積においてＥｃｏＲＩ（５μｌ）で消化した。ＤＮＡをエタノールで沈降させ、 遠心により回収し、７．５μｌのＴＥ＋２．５μｌの５×負荷色素の中に再懸濁 させた。０．５×ＴＢＥ（１０×ＴＢＥは１０８ｇ／ｌのＴｒｉｓ塩基７〜９、 ５５ｇ／ｌのホウ酸、８．３ｇ／ｌの２ナトリウムＥＤＴＡ）ゲル中の０．７％ アガロースの１レーンに、全体の１０ｍｌの体積を適用した。臭化エチジウムを 含有する０．５×ＴＢＥ中で１００Ｖにおいてゲルを展開させた。ゲルを写真撮 影し、陽性に誘導化されたナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ^TMＮ＋、Ｓｃｈｌｅｉｃｈ ｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、ニューハンプシャイヤー州キーン）に４００ｍＡ、 ２０ｍＶにおいて３０分間ＤＮＡを電気泳動的に移した。次いで膜を２×ＳＳＣ 中ですすぎ、変性溶液上に５分間ブロットし、次いで紫外線架橋装置（Ｓｔｒａ ｔａｌｉｎｋｅｒ^TM、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ）中で自動設定において湿潤状態で架橋させた。商業的に入手可能なキット（Ｅ ＣＬ^TMキット、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．、イリノイ州アーリントンハイツ ）を使用して、ＰＣＲ発生ＡＵＧ１プロモーターのプローブに、ブロットをハイ ブリダイゼーションさせた。これらの結果が示すように、形質転換するＤＮＡは ＡＵＧ１プロモーターＤＮＡの構造を変更させ、これは相同組込み事象と一致し た（第２図）。 第２実験において、ＮｏｔＩ消化ｐＣＺＲ１３７、ＡＵＧ１プロモーターとタ ーミネーターとの間でヒトＧＡＤ６５ｃＤＮＡを含有するベクターを使用して、 ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のａｄｅ２株＃１１をＡｄ ｅ⁺に形質転換させた（第３図）。前述したようにゲノムＤＮＡを野生型細胞お よび安定な、 白色のＡｄｅ⁺形質転換体から調製し、ＥｃｏＲＩで消化した。消化したＤＮＡ を電気泳動により分離し、膜上にブロットした。ＡＵＧ１オープンリーディング フレームまたはＡＵＧ１プロモーターに対応するＰＣＲ発生プローブでブロット をプロービングした。ＡＵＧ１オープンリーディングフレームは形質転換体株に 存在せず、そしてＡＵＧ１プロモーターは有意な再配列を行っていることを結果 は証明した。これらの結果は、形質転換するＤＮＡと宿主ゲノムとの間の二重組 換え事象（転位）と一致する（第３図）。 以上から、理解されるように、本発明の特定の態様を例示の目的で記載したが 、本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変更が可能である。したがっ て、本発明は添付された請求の範囲以外限定されない。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Transformation of Pichia methanolica Background of the Invention   Methylotropic yeast uses methanol as the sole source of carbon and energy. It is a yeast that can be used. Has biochemical pathways necessary for methanol utilization Yeast species include four genera, Hansenula and Pichia. ia), Candida, and Torulops sis). These genera are somewhat artificial, with cell morphology and proliferation. Based on breeding characteristics and does not reflect a close genetic relationship (Billo n-Grand,Mycotaxon,35: 201-204, 1989; Ku ltzman,Mylogia,84: 72-76, 1992). further, All species within these genera utilize methanol as a carbon and energy source. You can't do that. As a result of this classification, between individual species of a genus There are large differences in physiology and metabolism.   Methylotropic yeast is attractive for use in recombinant protein production systems It is a candidate. Some methylotrophic yeasts have high biomass in minimal defined media. Was shown to proliferate. Some genes in methylotrophic yeast are tightly regulated. And are highly expressed under induced or derepressed conditions. May be useful in the production of polypeptides of commercial value It is suggested that See, for example, the following document: Faber et a l. ,Yeas,11: 1331, 1995; Romanos et al. ,Yeas ,8: 423, 1992; and And Cregg et al. ,Bio / Technology,11: 905, 1993.   Development of methylotrophic yeast as a host for use in recombinant production systems Are partially suitable materials (eg, promoters, selectable markers, and mutations). Host cells) and lack of methods (eg, transformation techniques) . The most highly developed methylotrope host system is Pichia pastoris (Pic ia pastoris and Hansennula polymorpha (Hansen) ula polymorpha (Faber et al.,Cur r. Genet. ,25: 305-310, 1994; Cregg et al. . Romanos et al., Supra. U.S. Pat. No. 4,855,24. No. 2, US Patent No. 4,857,467; US Patent No. 4,879,231; And U.S. Pat. No. 4,929,555).   Methods for transforming additional species of methylotrophic yeast, and industrial enzymes and Produce polypeptides of economic importance, including pharmaceutical and pharmaceutical proteins There remains a need in the art to use transformed cells. Book The invention provides such a method, as well as other related advantages. Summary of the Invention   The present invention relates to Pichia methanolica (Pichia methanolica) Methods for introducing DNA molecules into cells and cells transformed according to these methods Provide vesicles.   Within one aspect of the present invention, these methods involve the use of linear DNA molecules. In the presence, when the electric field strength of 2.5-4.5 kV / cm and 1-40 ms Exponentially decaying pal with interspace constant Pichia methanolica cells in the electric field And thereby introducing a DNA molecule into said cell. Within one aspect of the invention, the DNA molecule is Pichia methanolica (P . coding for a peptide other than the polypeptide of A transcription promoter for the methanolica (P. methanolica) gene and Transcription terminator of P. methanolica gene A segment operably linked to the segment. Within the scope of the preferred embodiment And the transcription promoter is Pichia methanolica (P. methanolica). Of the AUG1 gene, which, within one aspect, Nucleotide represented by SEQ ID NO: 2 from nucleotide 24 to nucleotide 1354 Comprising an otide sequence. DNA molecules can also introduce mutations in host cells. It may comprise a supplementary selectable marker gene. Within one embodiment In this regard, the selectable marker gene is Pichia methanolica (P. methanolic). The gene of a).   Within the scope of the second aspect of the invention, Pichia methanolica (P. . methods for transforming C. methanolica are provided, comprising: In the presence of heterologous linear DNA molecules, an electric field strength of 2.5-4.5 kV / cm and And an exponentially decaying pulsed electric field having a time constant of 1 to 40 ms. Exposing a population of P. methanolica cells, thereby Introducing the heterologous DNA into at least a portion of the cell population; Recovering the isolated cells. Within one aspect of the invention , 10 / μg of heterologous DNA^Three-10^FiveHarvest cells. Within other aspects 0.9 × 10 μg / μg of heterologous DNA^Four~ 1.1 × 10^FourHarvest cells You. Further Within certain embodiments, these methods include, for example, sorbitol as a carbon source. Cells from the harvested cells by culturing the cells in a growth medium containing The method further includes a step of recovering the transformant. Within additional aspects, the cell collection The group is in early log phase growth.   Within other aspects, the invention may be transformed by the methods disclosed above. P. methanolica cells are provided.   These and other aspects of the invention refer to the following detailed description and the accompanying drawings. Will become clear. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 shows the electrophoresis of P. methanolica. 5 illustrates the effect of field strength and pulse duration on poration efficiency.   FIG. 2 shows the plasmid pCZR140 and Pichia methanolica (P. FIG. 1 is a schematic diagram of recombination events with genomic DNA of S. norica).   FIG. 3 shows the plasmid pCZR137 and P. methanolica (P. FIG. 1 is a schematic diagram of recombination events with genomic DNA of S. norica). DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION   Before describing the present invention in more detail, some of the utilities used herein Define a word:   Early log phase growth-cell concentration of 2x10⁶Cells / ml-8 x 10⁸Cells / ml The cell growth phase in a culture at some point.   Heterologous DNA-A DNA molecule or DNA component not naturally present in a given host cell. A group of children. DNA molecules that are heterologous to a particular host cell Contain DNA from the host cell species when combined with the main DNA Can be. For example, acting on a host DNA segment comprising a transcription promoter Contains a non-host DNA segment encoding an operably linked polypeptide The resulting DNA molecule is considered to be a heterologous DNA molecule.   Integrative transformant-a cell into which heterologous DNA has been introduced, wherein the heterologous DNA is Genomic DNA of the vesicle.   Linear DNA-a DNA molecule having free 5 'and 3' ends, i.e., non- Circular DNA molecule. Linear DNA is a closed circular DNA molecule, such as a plasmid. Can be produced by enzymatic digestion or physical disintegration.   Operably linked-The term operably linked refers to a DNA segment. For example, transcription can be performed so that the elements function in harmony for their intended purpose. Starts at the promoter and terminates through the coding segment This indicates that the DNA segments are arranged so as to progress to the center.   As described above, the present invention provides a method for converting DNA into a methylotrophic yeast, Pichia methanolica. (P. methanolica) Method for introduction into no cells, and DNA Methods for selecting cells that have been introduced are provided. As those skilled in the art will recognize, (Homogous) DNA (DNA from a host species) and heterologous (hete) Transformation of cells using both (logous) DNA can be performed in many diverse organisms. Prerequisite for scientific use. The method of the invention comprises transforming the heterologous DNA. Well-suited for the production of isolated cells, said cells comprising humans Polypeptides and proteins, including higher organism polypeptides and proteins. It can be used for protein production. The present invention further provides a DNA library Methano using other DNA molecules, including synthetic and synthetic DNA molecules Transformation of P. methanolica cells is provided. Thus, the book The invention provides for the production of products by genetically expressing a diverse library, Are screened for novel biological activities and libraries of compounds are screened. Manipulate cells to use as targets for leaning, and Can be used to genetically modify cells to enhance their utility in other ways. To provide technologies.   The strain of Pichia methanolica (P. methanolica) was Ip Culture Collection (American Type Culture) e Collection (Rockville, Maryland) and other repositories Available from Within one aspect of the invention, transformation with heterologous DNA Cells to be replaced are supplemented by genes on the heterologous DNA molecule ("selectable markers"). Will have a mutation that can be This selectable marker is used for non-transformed cells. Cells transformed under conditions in which the cells cannot grow ("selective conditions"). Enables the growth of vesicles. General principles of choice are well known in the art . Commonly used selectable markers require amino acid or nucleotide synthesis Is the gene that encodes the enzyme to be produced Have mutations in these genes Cells will not contain specific amino acids unless the mutation is complemented by a selectable marker. Or it cannot grow in media lacking nucleotides. Such "selection" The use of "alternative" media ensures stable maintenance of heterologous DNA in the host cell. Pihia -Of this type for use in P. methanolica Preferred choice The marker is the ADE2 site of P. methanolica. Gene, which is a phosphoribosyl-5-aminoimidazole carboxylase ( AIRC; EC 4.1.1.21). The ADE2 gene is ade2 When transformed into a host cell, the cell is grown in the absence of adenine. Let Representative ADE2 of P. methanolica The sequence coding strand of the gene is shown in SEQ ID NO: 1. Illustrated The sequence is 1006 nucleotides of the 5 'non-coding sequence and 3' non-coding Sequence containing 442 non-coding sequences, starting at nucleotides 1007-11009. Has a G codon. Within a preferred embodiment of the present invention, nucleotide 40 A DNA segment comprising 7-2851 is used as a selectable marker, The coding portion is operably linked to promoter and terminator sequences Longer or shorter segments could be used as long as possible. Skilled person As will be appreciated, this and other sequences provided in the present invention are each Represents a single allele of each of the genes and its alleles It is expected that offspring variants will exist. Book any functional ADE2 allele It can be used within the scope of the invention. Other nutritional tools that can be used within the scope of the present invention ADE1, H of Pichia methanolica (P. methanolica) And the IS3 and LEU2 genes, which are adenine, hiss, respectively. Allows selection in the absence of thydin and leucine. Use of methanol For large-scale industrial processes that we want to minimize, both methanol utilization sites It is preferred to use host cells that lack the genes (AUG1 and AUG2). New For production of secreted proteins, a vacuolar protein is used. Ase gene (PEP4 and PRB1 ) Are preferred. Gene deletion mutants can be prepared by known methods, e.g., , By site-directed mutagenesis. Pichia methanolica ( P. methanolica) genes are their counterparts, Saccharomyces cerevisiae. Phase with the gene of Saccharomyces cerevisiae Cloning can be based on homosexuality. AD disclosed herein The designation of the E2 gene is given based on such homology.   Within other aspects of the invention, a dominant selectable marker is used, whereby Eliminates the need to mutate host cells. Dominant selectable marker is wild-type cell Can provide the advantage of growth. Typical dominant selectable markers are antibodies, e.g. For example, neomycin-type antibodies (eg, G418), hygromycin B) and Reomycin / phleomycin-type antibodies (eg, Zeocin)^TM; Invitr Ogen Corporation, obtained from San Diego, CA (Possible) resistance. Pichia methanolica (P. preferred dominant selectable markers for use in L. methanolica) , Zeocin^TMShbla gene that inhibits the activity of   Using electroporation within the scope of the present invention, Pichia methano Promotes the introduction of DNA into Rica (P. methanolica) cells. D Lectroporation uses a pulsed electric field to temporarily penetrate cell membranes This is a method of introducing a macromolecule, for example, DNA, into cells. Electroporacy Are mammals (eg, Neumann et al.,EMBO J.S.,1 : 841-845, 1982) and fungi (eg, Meilhoc et. al. ,Bio / Technology,8: 223 -227, 1990) has been described for use with host cells. I However, the actual mechanism by which DNA is transferred into cells is well understood. Not in. About transformation of Pichia methanolica (P. methanolica) And an electric field strength of 2.5 to 4.5 kV / cm and a time constant of 1 to 40 milliseconds (τ When exposing cells to an exponentially decaying pulsed electric field with In some cases, electroporation was found to be efficient. The time constant τ is Initial peak voltage V₀Is V₀Defined as the time required to fall to the value of / e Is done. The time constant is the value obtained by multiplying the total resistance by the capacitance of the pulse circuit. That is, it can be calculated as τ = R × C. Typically, resistors and capacitors The pasitance is preset or selected for electroporation. It can be selected by the user depending on the device. In any case , The equipment shall comply with the manufacturer's instructions for the aforementioned field strength and attenuation parameters. Shaped to provide. Electroporation equipment from commercial suppliers Available (eg, BioRad Laboratories, California) Hercules, Lunia).   D used for transformation of P. methanolica NA molecules are usually prepared as double-stranded, circular plasmids, preferably These plasmids are linearized before transformation. Polypeptide or protein For quality production, the DNA molecule is transcribed in addition to the selectable marker described above. Segment, a DNA segment encoding a polypeptide or protein of interest (eg, And an expression cassette comprising a transcription terminator. Will. These factors act to provide transcription of the DNA segment of interest Linked as possible. Promoter and The terminator is the gene of Pichia methanolica It is preferably that of A preferred promoter is Pichia methanolica (P . methanolica) and that of the alcohol utilization gene (AUG1) The sequence of a representative coding strand is shown in SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 In, the start ATG codon is nucleotides 1355-1357. Array number Nucleotides 1-23 of No. 2 are non-AUG1 polylinker sequences. Promo Segment comprising nucleotides 24-1354 of SEQ ID NO: 2 as a marker Although it is particularly preferred to utilize a sequence, additional upstream sequences can be included. Pichia methanolica (P. methanolica) is a secondary alcohol-using genetic AUG2, the promoter of which is used within the scope of the present invention. be able to. Other useful promoters include dihydroxyacetone synthase ( DHAS), formate dehydrogenase (FMD), and catalase (CA T) The promoter of the gene is included. DNA molecules can also be used to transform It will contain selectable markers that allow for identification, selection, and maintenance. DNA molecule May further comprise additional factors, such as an origin of replication, and another host (eg, E. coli). (E. coli)) Selection Markers Allowing Amplification and Maintenance of DNA Can be contained. To facilitate DNA integration into the host chromosome , A promoter-gene of interest-terminator having host DNA sequences at both ends It is preferred to have an entire expression segment comprising a ++ selectable marker . It contains a 3 'untranslated DNA sequence at the downstream end of the expression segment and a 5' end. Conveniently achieved by relying on a promoter sequence at the end. Linear When using DNA, the expression segment is sandwiched by cleavage sites and the linear And expression segments Allows for separation from other sequences, such as bacterial origins of replication and selectable markers You. Preferred such sites are restriction endonucleases that seldom cleave within the DNA sequence. Nucleases, for example, those that recognize an 8-base target sequence (eg, No The site recognized by tI).   Using the method of the present invention, P. methanolica Proteins that can be produced in Includes proteins. Such proteins include enzymes, such as lipases, cells Enzymes and inhibitors, such as protease inhibitors Bitter; growth factors such as platelet-derived growth factor, fibroblast growth factor, and Epidermal growth factor; cytokines such as erythropoietin and thrombopoi Ethyne; and hormones such as insulin, leptin, and glucagon Include.   Suitable carbon sources, nitrogen sources and micronutrients for use within the scope of the present invention. Pichia methanolica at a temperature of about 25 ° C. to 35 ° C. in a medium comprising nutrients (P. methanolica) cells are cultured. Liquid medium can be prepared by conventional means, for example, Thoroughly aerate by shaking the small flask or sparging the fermenter. Preferred The medium used is YEPD (Table 1). By diluting the cells in fresh medium, Can be subcultured or stored for short periods on plates under refrigeration . For long term storage, cells are preferably placed in a 50% glycerol solution- Hold at 70 ° C.                                   Table 1 YEPD   2% D-glucose   2% Bacto^TMPeptone (Difco Laboratori) es, Detroit, Michigan)   1% Bacto^TMYeast extract (Difco Laboratories)   0.004% adenine   0.006% L-leucineADE D   0.056% -Ade-Trp-Thr powder   Yeast nitrogen source basal medium without 0.67% amino acid   2% D-glucose   0.5% 200x tryptophan, threonine solutionADE DS   0.056% -Ade-Trp-Thr powder   Yeast nitrogen source basal medium without 0.67% amino acid   2% D-glucose   0.5% 200x tryptophan, threonine solution   18.22% D-sorbitolLEU D   0.052% -Leu-Trp-Thr powder   Yeast nitrogen source basal medium without 0.67% amino acid   2% D-glucose   0.5% 200x tryptophan, threonine solutionHIS D   0.052% -His-Trp-Thr powder   Yeast nitrogen source basal medium without 0.67% amino acid   2% D-glucose   0.5% 200x tryptophan, threonine solutionURA D   0.052% -Ura-Trp-Thr powder   Yeast nitrogen source basal medium without 0.67% amino acid   2% D-glucose   0.5% 200x tryptophan, threonine solutionURA DS   0.052% -Ura-Trp-Thr powder   Yeast nitrogen source basal medium without 0.67% amino acid   2% D-glucose   0.5% 200x tryptophan, threonine solution   18.22% D-sorbitol-Leu-Trp-Thr powder   4.0 g adenine, 3.0 g arginine, 5.0 g aspartic acid, 2.0 g Histidine, 6.0 g isoleucine, 4.0 g lysine, 2.0 g methionine, 6 g . 0 g phenylalanine, 5.0 g serine, 5.0 g tyrosine, 4.0 g urashi And 6.0 g valine (all are L-amino acids) Thus produced powder-His-Trp-Thr powder   4.0 g adenine, 3.0 g arginine, 5.0 g aspartic acid, 6.0 g 5. Isoleucine, 8.0 g leucine, 4.0 g lysine, 2.0 g methionine, 0 g phenylalanine, 5.0 g serine, 5.0 g tyrosine, 4.0 g uracil , And 6.0 g valine (all are L-amino acids) Powder produced-Ura-Trp-Thr powder   4.0 g adenine, 3.0 g arginine, 5.0 g aspartic acid, 2.0 g Histidine, 6.0 g isoleucine, 8.0 g leucine 4.0 g lysine, 2.0 g methionine, 6.0 g phenylalanine, 5.0 g g serine, 5.0 g tyrosine, and 6.0 g valine (all are L-amino acids) Powder produced by combining-Ade-Trp-Thr powder   3.0 g arginine, 5.0 g aspartic acid, 2.0 g histidine, 6.0 g isoleucine, 8.0 g leucine, 4.0 g lysine, 2.0 g methionine, 6 g . 0 g phenylalanine, 5.0 g serine, 5.0 g tyrosine, 4.0 g urashi And 6.0 g valine (all are L-amino acids) by combining Powder produced200x tryptophan, threonine solution   H_TwoFor 3.0% L-Threonine in O, 0.8% L-Threonine plate 1.8% Bacto^TMAdd agar (Difco Laboratories) Add.   Electroporation of Pichia methanolica Preferably, the step is performed on growing cells in the early log phase. Cells in solid medium , Preferably streaking for a single colony on solid YEPD. 30 ° C After about 2 days of growth in a single colony from a fresh plate, Add the desired volume of rich medium (eg, YEPD) to about 5-10 × 10^FiveCells / ml Inoculate to cell density. Approximately 25 with vigorous shaking until cells are in early log phase. Incubate the cells at ~ 35 ° C, preferably at 30 ° C. Then, for example Cells were collected and resuspended by centrifugation at 3000 xg for 2-3 minutes. You. Electrodes are reduced by reducing disulfide bonds in the cell wall. Competent and in an ionic solution that is compatible with electroporation conditions Equilibrate the cells and cool the cells. Typically, a reducing agent such as dithiosley PH 6 containing toll (DTT) or β-mercaptoethanol (BME) Incubate cells in ~ 8 buffer to reduce and attract proteins on the cell wall. By promoting subsequent DNA absorption, cells can be made electrocompetent. I do. A preferred incubation buffer in this regard is 25 mM DTT. 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.5 containing fresh solution. cell To about 30 ° C. in this buffer (typically using 1/5 of the original culture volume). And incubate for about 5 to 30 minutes, preferably about 15 minutes. Then cells And wash in the appropriate electroporation buffer for use on ice . Suitable buffers in this regard include weak buffers, divalent cations (eg, Mg⁺⁺ , Ca⁺⁺) And a pH 6-8 solution containing an osmotic stabilizer (e.g., sugar). Include. After washing, the cells are resuspended in a small volume of buffer, at which time the cells are Lectroporate and use directly or take aliquots and freeze (Preferably at -70 ° C). Preferred elect The loporation buffer is STM (270 mM sucrose, 10 mM Tris PH 7.5, 1 mM MgCl_Two). Within the scope of a preferred protocol Wash the cells twice, first in the original culture volume of ice-cold buffer, then in the original Wash in 1/2 of the volume. After the second wash, the cells are harvested, typically 2 Resuspend using approximately 3-5 ml of buffer for the original culture value of 00 ml. You.   A small volume of electrocompetent cells (typically about 100 μl) and Perform electroporation using up to 1/10 volume of linear DNA molecules. Give. For example, 0.1 ml of cells in a buffer that does not exceed 50 mM ionic strength 0.1 to 10 μg of suspension Of DNA (volume ≦ 10 μl). This mixture is ice-cold electroporated Put in a shock vet and 2.5-4.5 kV / cm) preferably about 3 . 75 kV / cm and 1-40 ms, preferably 10-30 ms, and more Preferably a pulse with a time constant of 15-25 ms, most preferably about 20 ms Exposure to electric fields with exponential decay. To achieve desired pulse parameters The actual device settings used will be determined by the device used. Bio Rad (Hercules, CA) Gene Pulser^TM2 mm When used with electroporation cuvettes, the resistance can be up to 600 ohms. Or larger, preferably "infinite", and having a capacitance of 25 Set to μF to obtain the desired electric field characteristics. After the pulse, the cells were washed with 1 ml of YEPD Dilute approximately 10 × in a solution and incubate at 30 ° C. for 1 hour.   The cells are then harvested and plated on selective media. Within the scope of the preferred embodiment The cells in a small volume (equal to the diluted volume of the electroporated cells). 1 × yeast nitrogen source basal medium (yeast nitrogen source basal medium without 6.7 g / l amino acid) Once; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) Clean and plate on minimal selection medium. Transformed with ADE2 selectable marker Cells carrying the ade2 mutation are converted to minimal medium lacking adenine, eg, AD It can be plated on ED (Table 1) or ADE DS (Table 1). Scripture In a typical procedure, a 250 μl aliquot of cells was transferred to four separate ADEDs. And plate on ADE DS plate,⁺Select for cells .   Pichia methanolica (P. methanolica) is a rare species Absent sequence [named as autonomously replicating sequence (ARS)] Are recognized as origins of DNA replication, and these sequences are used for transformation. Occasional presence in the DNA molecule to allow extrachromosomal maintenance of the transforming DNA It may be an ability. However, (integrative) integrative transformation The body is generally preferred for use in protein production systems. Integrative transformation Transformants over ARS transformants on selective media containing sorbitol as a carbon source. The advantage of this is that the transformed cells can be transformed with the integrated transformant. Methods for selecting among cell populations are provided. ARS sequence is Pichia methanoli ADE2 gene of mosquito (P. methanolica) and possibly AUG1 It was found to be present in the gene. Therefore, transformation with the ADE2 gene Ade2 host cells of P. methanolica isolated Ade by at least two different modes⁺Can be ADE2 Intragenic ARS enables unstable extrachromosomal maintenance of transforming DNA (Hiep et al.,Yeast,9: 1189-1197, 1993 ). Colonies of such transformants are identified as Ade^-A prolific generation of offspring , Characterized by a slower growth rate and pink color. Transform D NA also integrates into the host genome and grows rapidly, is white, and Ade^-Stable transformation that fails to produce a detectable member of the progeny Can give rise to the body. ADED plates are the fastest of transformed cells. Rapid growth and growth of unstable and stable transformants at about the same rate Is possible. 3-5 days incubate on ADE D plate at 30 ° C After the transformation, colonies of stable transformants are white and unstable, pink. Color transformants are almost twice as large. ADE DS plate is stable form More selective about transgenics These transformants form large (about 5 mm) colonies in 5-7 days, The unstable (ARS maintained) colonies are very small (about 1 mm). Therefore, A more selective ADE DS medium is a good choice for the identification and selection of stable transformants. Good. For some uses, for example, genetically diverse libraries Almost 100-fold stable to screen for rare combinations of factors Screen for a large number of unstable transformants, Is sometimes desirable. In such cases, low selectivity media, For example, those skilled in the art will recognize the utility of plating transformants on ADE D. There will be.   Integrative transformants are preferred for use in protein production methods. this Such cells can grow without continuous selective pressure. Because DN A is rarely lost from the genome. Set of DNA into host chromosome Integration can be confirmed by Southern blot analysis. In short, traits Restriction endonuclease for transformed and untransformed host DNA And separated by electrophoresis, blotted on a support membrane, and digested with the appropriate host DN. Probe with A segment. In non-transformed and transformed cells Differences in the fragment patterns seen in the experiments indicate integrated transformation. Transform DNA segments (eg, promoters, terminators, heterologous DNA, And the sequence of the selectable marker) to identify Enzymes and probes can be selected.   Differences in the expression level of the heterologous protein will depend on the integration site and the copy of the expression cassette. Generating from factors such as number and promoter differences between individual isolates Can be. Therefore, prior to selecting a producer strain, a number of isolates must be Screening Is advantageous. A variety of suitable screening methods are available. For example, the shape Transformant colonies grow on plates and bind plates to proteins Overlay with a membrane (eg, nitrocellulose). Protein from cells It is released by secretion or by subsequent lysis and binds to the membrane. Next The bound protein is assayed by known methods, e.g., immunoassay. can do. Culture cells in liquid medium and condition, if necessary. Analysis of the conditioned media or cell lysate A more accurate analysis can be obtained. Concentrate proteins from media and lysates The method of purification and purification will be determined in part by the protein of interest.   Small-scale protein production (eg, production on plates or shake flasks) For a promoter controlled by a methanol (eg, AUG1 promoter) -) Having an expression cassette comprising P. methanolica olica) in the presence of methanol and an interfering amount of another carbon source ( (E.g., glucose). Preliminary screening of expression levels For small scale experiments, including transforming, transformants may be used, for example, at 20 g / l. Bacto agar (Difco), 6.7 g / l amino acid-free yeast nitrogen source Basal medium (Difco), 10 g / l methanol, 0.4 μg / l biotin , And on a solid medium containing 0.56 g / l Ade-Thr-Trp powder It can be grown at 30 ° C. Because methanol is a volatile carbon source , It is easily lost with prolonged incubation. In the lid of the inverted plate The methanol continuously by putting a 50% methanol solution in water into the This allows the methanol to evaporate evaporatively transfer) Transferred to proliferating cells. Generally, no more than 1 ml per 100 mm plate Use methanol. Using cultures grown in shake flasks, Larger scale experiments can be performed. In a typical procedure, Cells were cultured on minimal methanol plates for 2 days at 30 ° C. as A small volume of minimal methanol medium (6.7 g / l Non-acid-free yeast nitrogen source basal medium, 10 g / l methanol, 0.4 μg / l About 1 × 10⁶Inoculate at a cell density of cells / ml. Bring cells to 30 ° C To grow. Cells growing on methanol have a high oxygen demand and during culture Requires intense shaking. Make up daily with methanol (typically 1/100 50% methanol / day by volume).   For production-scale cultures, shake fresh cultures of highly productive clones Prepare in batch. The resulting culture is then used to inoculate the medium in the fermentor. Typically, YEPD grown at 30 ° C. with vigorous agitation for 1-2 days The 500 liter culture in is used to inoculate a 5 liter fermentor. Salt, gu 28 ° C., pH 5 in a suitable medium containing glucose, biotin and trace elements . 0 and> 30% dissolved O_TwoIn, the cells are grown. First supply After the glucose has been consumed (indicated by a decrease in oxygen consumption), glucose / meta A feed of knol is introduced into the vessel to induce production of the protein in question. Big Since fermentation on a scale is carried out under carbon-limiting conditions, the glucose in the feed The presence does not repress the methanol-inducible promoter. Example   Embodiment 1 FIG.   Pichia methanolica (P. methanolica) cells (CB S6515 strain, American Type Culture Collect ion, Rockville, Md.) was mutagenized by UV exposure. Ma Plate on some plates at approximately 200-250 cells / plate This produced a death curve. Then suspend it 25 cm from the plate surface. Using a dripped G8T5 germicidal lamp (Sylvania), the plate is exposed to UV light. Exposure was for the time shown in Table 2. The plate is then protected from visible light sources, For 2 days.  Then by using a 2 second UV exposure to produce about 20% killing Large-scale mutagenesis was performed. Cognate defi added to assist the growth of potentially auxotrophic strains having Eight Y, supplemented with 100 mg / l of each uracil, adenine and leucine Approximately 10 cells on EPD plate^FourPlated with cells / plate. UV radiation After exposure, the plates were wrapped in foil and incubated at 30 ° C. overnight. next On the day, the colonies on the plate (about 10^Five) Is resuspended in water and washed once with water Was cleaned. OD of 0.1-0.2₆₀₀Give Use sufficient amount of cell suspension to obtain amino acids or ammonia 1% glucose and 400 μg prepared using no yeast nitrogen source basal medium 500 ml of minimal broth supplemented with / 1 biotin was inoculated. Culture 2. Into an 8 liter baffled Bell flask, Shake vigorously at 30 ° C. overnight. The next day, the cells should have an OD of about 1.0-2.0.₆₀₀ Reached. Cells were spun down and supplemented with 50 g / l ammonium sulfate. Resuspended in 0 ml minimum broth. Transfer the cell suspension to a 2.8 liter buffer Placed in a Revel flask and shaken vigorously at 30 ° C. for 6 hours. 5 of culture Set aside 0 ml as a control and add 1 mg nystatin to the rest of the culture. Selected for auxotrophic mutants (Snow,Nature,211: 206-207, 1966). Incubate the culture for another hour with shaking. I did it. Control and nystatin-treated cells were then collected by centrifugation and And washed three times. Washed cells at an OD of 1.0 in 50% glycerol₆₀₀To Resuspended and frozen. Nystatin-treated cells / colony forming unit The titer of control cells is determined by the number of cells in which nystatin enrichment can survive.^FourFold down Revealed that.   10 of nystatin-treated cells^-2Plate dilutions on 15 YEPD plates did. Colonies were plated on a minimal plate (2% agar, 1 × YNB, 2% glucose, 40% 0-μg / l biotin). The frequency of auxotrophs is about 2 4%. Nearly 180 auxotrophic colonies were isolated from YEPD + Ade, Leu, Take up on Ura plate and replica-play on various dropout plates I did it. All auxotrophs are Ade^-Met. Of these, 30 are mobile On the top-out plate (L EU D, HIS D, and others; see Table 1). 30 pink mutations Of the bodies, 21 were selected for further study; the remainder were ADE D-play Was leaky for growth on cells or was contaminated with wild-type cells.   Then Ade^-Mutants were subjected to complementation analysis and phenotypic testing. mutation To determine the number of loci defined by the body, all 21 mutants A single pink Ade^-It was crossed to a tester strain (strain # 2). Cell suspension ( OD₆₀₀= 1) and mix this mixture in 10 μl aliquots in YEPD Mating was performed by plating on a plate. The cells are then transferred to SPOR medium (0.5% sodium acetate, 1% KCl, 1% glucose, 1% agar) , 30 ° C overnight. As shown in Table 3, the mutants Some combinations are Ade⁺Failed to give a colony (probably strain (To define the same locus as in # 2), but others have multiple Ade⁺ A colony has arisen (possibly to define another locus). Mutant # 3 Is Ade when crossed with # 2⁺Given a colony, we tested complementation It was repeated using mutant # 3. Mutant group defines two loci Ade when crossed with strain # 2⁺Can't give a colony All the mutants that were crossed with strain Ade⁺Give colony Will. Table 3 shows the results of the hybridization.   As shown in Table 3, most mutants were in two groups And when it is deleted, does not give rise to pink colonies on restricted adenine medium This is consistent with the idea that there are two adenine biosynthesis genes. Three colonies -(# 4, # 12, and # 16) define three loci or Shows intragenic complementation . Two complementation groups (# 3 and # 10, Strongly pigmented mutants from each of # 6 and # 11) for further study Selected. Additional analysis is provided by Ade^-Is the only nutrient required in these strains Showed that it was a sought-after stock.   A bank of P. methanolica clones PRS426, ie, 2μ and Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) constructed in a shuttle vector comprising the URA sequence, Its growth in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) Made it possible. Genomic DNA was prepared from CBS6515 strain according to standard procedures . Briefly, cells were cultured overnight in rich media and speared with zymolyase. Loplast and dissolved with SDS. DNA from lysate to ethanol And extracted with a phenol / chloroform mixture, followed by ammonium acetate. And ethanol. Gel electrophoresis of DNA preparations is complete, high It indicated the presence of molecular weight DNA and appreciable amounts of RNA. Enzyme dilution series Incubating the DNA with Sau3A by incubating the DNA in the presence Partially digested. A sample of the digest is analyzed by electrophoresis and fragments Was determined. DNA migrating between 4-12 kb is cut from the gel , Extracted from gel slices. Next, the DNA fractionated by size was digested with BamHI. It was ligated to digested pRS426 and treated with alkaline phosphatase. Manufacturing BioRad Gene Pulser as recommended by^TMUsing the device In E. coli MC1061, aliquots of the reaction mixture were Cutroporate.   Saccharomyces by electroporation using a genomic library -S. cerevisiae HBY21A strain (ade2ura3 ) (Becker and Guarante,Methods E nzymol. ,194182-187, 1991). Transfer cells to 1.2 M sol Resuspend in Bitol and aliquot 6 × 300 μl to ADE D, ADE   Plated on DS, URA D and URA DS plates (Table 1). Step The rates were incubated at 30 ° C. for 4-5 days. ADE D or AD On the EDS plate, Ade⁺No colonies were recovered. URA D and And URA DS plate colonies are replicated on ADE D plates. And two closely spaced white colonies were obtained. these Re-streak colonies of Ura⁺And Ade⁺Was established. These two strains (denoted Ade1 and Ade6) were 5FOA (5 full) Orolotic acid; Sikorski and Boeke,Methods Enzy mol. ,194: 302-318). Ur a^-Are obtained when replica plate Ade^-Is found to be Was. As these results show, Ade⁺Supplementary activity was determined for URA3 containing plasmids. Genetically linked to markers. Obtained from yeast Ade1 and Ade6 Plasmids appeared identical by restriction mapping, as described below. . Clones of these genomes were designated as pADE1-1 and pADE1- 6 is displayed.   Total DNA was isolated from HBY21A transformants Ade1 and Ade6, Amp. E. coli MC1061^rUsed to transform . Two Amps of Ade1^rColony and three Amps of Ade6^rColony DNA was prepared from them. The DNA was converted to PstI, ScaI, and PstI + ScaI. And analyzed by gel electrophoresis. All five isolates have the same restriction Generated a turn.   The ADE2 gene of Pichia methanolica (also P. methanolica) ADE1; Hiep et al. ,Yeast,9: 1 251-1258, 1993) to design PCR primers did. Primer 9080 (SEQ ID NO: 3) was replaced with ADE2 DNA (SEQ ID NO: 1). ) Is designed to prime at bases 406-429 and primers 9079 (SEQ ID NO: 4) to prime at bases 2852-2829 Designed to. Both primers have an AvrII and an End at each end of the amplified sequence. A tail to introduce SpeI was included. The expected size of the resulting PCR fragment The size was 2450 bp.   Using plasmid DNA from 5 putative ADE2s as template DNA PCR was performed. 100 μl of the reaction mixture is in 1 × Taq PCR buffer ( (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) , 10-100 ng of plasmid DNA, 0.25 mM dNTPs, 100 p mol of each primer and 1 μl of Taq polymerase (Boehring er Mannheim). PCR for 30 cycles of 30 seconds at 92 ° C And 120 seconds at 72 ° C. 5 putative ADE2 genome claws Each of the expected sizes (2.4 kb) of the PCR product. Limitation of DNA fragments from one reaction When digested with BglII or SalI, the Lagment was given.   Positive PCR reactions were pooled and digested with SpeI. Vector pRS426 Was digested with SpeI and treated with calf intestinal phosphatase. 4 μl PCR flask Fragment and 1 μl of vector DNA were added to 10 μl using conventional ligation conditions. of the reaction mixture. Bound DNA was analyzed by gel electrophoresis . The SpeI digest was analyzed and the subclone of the ADE2 gene in pRS426 was analyzed. Was identified. The correct plasmid was designated as pCZR118. .   The ADE2 gene in pCZR118 was amplified by PCR, It was possible that a mutation could be generated that would disable the functional properties of the offspring . To test for such mutations, subclones with the desired insert A single Saccharomyces. Saccharomyces cere evisiae) transformed into strain HBY21A. Follow standard procedures for cells Was made electrocompetent and transformed. Transformants were transformed with URAD and Plated on ADE D plate. Three phenotypic groups were identified. Clones 1, 2, 11, and 12 show the health of multiple transformants on ADE D Growth. The frequency of transformants is Ura⁺It was comparable to the frequency of transformants. K Loans 6, 8, 10, and 14 are also Ura⁺And Ade⁺For both High efficiency of transformation⁺The colony is It was slightly smaller than these. Clone 3 contains a number of Ura⁺Gave a colony, Ade⁺Did not give a colony, indicating that it had a non-functional ade2 mutation I was instigated. Clone 1, 2, 11, and 12 were pooled.   Ade2 complementation glue of P. methanolica To identify the groups, each complementation group (# 3 and # 10; # 6 and # 11 2) (these were grown on restricted adenine and Selected on the basis of deep red pigmentation) Transformed with the gene. A 200 ml culture of early log phase cells is Collect by centrifugation for 2 minutes and add 20 ml of fresh KD buffer (50 mM phosphate Buffer buffer, pH 7.5, containing 25 mM DTT). . Cells were incubated in this buffer at 30 ° C. for 15 minutes. Then fine The cells are collected and 200 ml of ice-cold STM (270 mM sucrose, 10 mM T ris, pH 7.5, 1 mM MgCl_Two). Collect cells Was resuspended in 100 ml of ice-cold STM. Again, cells are collected and 3-5 m Resuspended in 1 ice-cold STM. The electrocompetent from each culture was then PADE1-1 DNA obtained by NotI digestion of a 100 μl aliquot of the And mixed. The cell / DNA mixture was placed in a 2 mm electroporation cuvette. Bi, set to 1000 Ω resistance and 25 μF capacitance oRad Gene Pulser^TM5 kV / cm pulse power using the device Exposure to the world. After the pulse, the cells are diluted by the addition of 1 ml YEPD and For 1 hour. The cells are then collected by gentle centrifugation. Resuspended in 400 μl Minimal Selection Medium lacking adenine (ADED) I let you. The resuspended sample was divided into 200 μl aliquots, And ADE DS plates. Plate at 5 ° C for 4-5 Incubated for days. Mutants # 6 and # 1 1 is Ade⁺Transformants were provided. When DNA is omitted, Ade⁺Transformants Not observed and therefore the isolate appears to define an ade2 complementation group Was. The ADE2 sequence is shown in SEQ ID NO: 1.   Embodiment 2. FIG.   P. methanolica (P. methanolica) as disclosed in Example 1 Loan bank to clone the alcohol use gene (AUG1) Used as a source of Store this bank of clones as an independent pool, each Represented approximately 200-250 individual genomic clones. Hansenula Polymol Hwa (Hansenula po1ymorpha), Candida boidini ( Candida boidini), and Pichia pastoris (Pichia)   conserved in the alcohol oxidase gene from P. pastoris) PCR primers designed from column alignment (8784, SEQ ID NO: 5; 878) 7; in a polymerase chain reaction using SEQ ID NO: 6), 0.1 μl of “miniprep” DNA was used as template . Amplification reaction was performed for 30 cycles at 94 ° C for 30 seconds; 50 ° C for 30 seconds; 72 ° C for 60 seconds. And then incubated at 72 ° C. for 7 minutes. One pool (# 5) gave a band of about 600 bp. For DNA sequencing of this PCR product Pichia pastoris (Pichia pastoris) encoded by the AOX1 gene   about 70% sequence identity and alcohol oxidase of C. pastoris) Hannula polymorpha (Hansen) encoded by the AOX1 and AOX1 genes ula polymorpha) and about 85% of the sequence It has been shown that it encodes an amino acid sequence having identity. Claw AUG1 genetics The sequence of the offspring is shown in SEQ ID NO: 2.   By PCR using the same primers used in the first amplification, The pool # 5 subpool was analyzed. Further destroy one positive subpool , Positive colonies were identified. Streak this positive colony on the plate DNA was prepared from individual colonies. 3 colonies after digestion with ClaI Gave the same pattern.   In the restriction mapping of genomic clones and PCR products, AUG1 The gene lies on the 7.5 kb genomic insert and the PCR fragment Site in the genome can be uniquely identified within the insert of the genome. Was. Since the orientation of the gene in the PCR fragment is known, the PCR fragment Information provides the approximate location and orientation of the AUG1 gene in the genomic insert. Provided. Sequencing of the DNA within this region was performed at the amino acid level with other known Reveal genes with very high similarity to alcohol oxidase gene I did it.   Embodiment 3 FIG.   ade2 mutant P. methanolica cells The AUG1 promoter and terminator, essentially as described above, Human GAD65 DNA (Karsen et al.,Proc.Natl.Acad .Sci.USA,88: 8337-8341, 1991), and A Electroporation using an expression vector comprising a DE2 selectable marker Transform with different components. 20g / l Bacto^TMAgar (Difco), 6. 7 g / l amino acid-free yeast nitrogen source basal medium (Difco), 10 g / l Methanol and agar minimum methanol containing 0.4 μg / l biotin Pack colonies on plate (10-100 colonies / 100 mm plate). Nitrocellulo agar Overlay on top and place on a lid containing 1 ml of 50% methanol in water. The plate is inverted and incubated at 30 ° C. for 3-5 days. The membrane is then Filter, 0.2 M NaOH, 0.1% SDS, 35 mM dithios Soak in layitol to lyse attached cells. 30 minutes later, the cells The debris is rinsed from the filter with distilled water and the filter is rinsed in 0.1 M Neutralize by rinsing while.   The filter is then assayed for attached protein. TTBS-N FM (20 mM Tris, pH 7.4, 0.1% Tween 20, 160 mM (NaCl, 5% powdered non-fat milk) at room temperature for 30 minutes Blocks unoccupied sites. Then 1:10 in TTBS-NFM GAD6 monoclonal antibody (Chang and Gottli) diluted to eb,J. Neurosci.,8: 2123-2130, 1988). Transfer the filter to the solution. While gently stirring the filter in the antibody solution From TTBS (20 mM Tris, pH 7.4, 0.1% Tween 20, 160 mM NaCl) for 5 minutes each time 2 Wash twice. The filters were then conjugated to horseradish peroxidase At least 1 hour in goat anti-mouse antibody (1 μg / ml in TTBS-NFM) Incubate and wash 3 times for 5 minutes each time with TTBS. Then filter the quotient Commercially available chemiluminescent reagents (ECL^TM, Amersham Inc. ,I Exposure to Arlington Heights, Linnoi). X-ray light generated from positive patches Detect on film.   GAD₆₅To more accurately detect expression levels, candidate The lawn is cultured in shake flask cultures. As described above, at 30 ° C And grow the colonies on a minimal methanol plate for 2 days. These colonies Using 20 ml of a minimal methanol medium (without 6.7 g / l amino acid). Yeast nitrogen source basal medium, 10 g / l methanol, 0.4 μg / l biotin) Is 1 × 10⁶Inoculate at a cell density of cells / ml. 3. Shake the culture vigorously. Grow at 0 ° C. for 1-2 days. 0.2 ml of 50% methanol was added to each culture Add daily. Cells are harvested by centrifugation and ice-cold lysis buffer (20 mM Tri). pH 8.0, 40 mM HCl, 2 mM PMSF, 1 mM EDTA, 1 mM μg / ml leupeptin, 1 μg / ml pepstatin, 1 μg / ml (Rotinin) in a final volume of 10 ml / 1 g of cell paste. Born 2.5 ml of the suspension in 2.5 ml of 400-600 microliters in a 15 ml container To the ice-cold acid-washed glass beads, and vigorously stir the mixture for 1 minute. Then incubate on ice for 1 minute. This procedure is performed when the cells are stirred for a total of 5 minutes. Until it repeats. Large debris and unbroken cells at 1000 × g for 5 minutes Remove by centrifugation. Then decant the cleaned lysate into a clean container . Clear lysate was added to sample buffer (5% SDS, 8 M urea, 100 mM Tris, pH 6.8, 10% glycerol, 2 mM EDTA, 0.01 % Bromophenol) and a gradient of 4-20% acrylamide Run on a gel (Novex, San Diego, CA). Above As described, proteins were blotted on nitrocellulose and tested with GAD6 antibody. Put out.   Methanol-induced generation of high levels of foreign protein in shake flask cultures. Clones showing the current state under high-density fermentation conditions. Analyze extensively. Cells are first placed in 0.5 liter YEPD broth at 30 ° C. And cultivate with vigorous stirring for 1-2 days, then fermenter 5 liters (eg For example, BioFlow III; New Brunswick Scientif c Co. , Inc. Used to inoculate Edison, NJ) You. The fermentation vessel is first supplied with mineral salts and then 57.8 g of (NH_Four)_TwoSO_Four, 68g KH_TwoPO_Four, 30.8 g MgSO_Four・ 7H_TwoO, 8.6 g CaSO_Four ・ 2H_TwoAdd O, 2.0 g NaCl, and 10 ml antifoam (PPG) You. H_TwoAdd O to bring the volume to 2.5 liters and autoclave the solution for 40 minutes. Reave processing. After cooling, 350 ml of 50% glucose, 250 ml of 10 × Trace elements (Table 4), 25 ml of 200 μg / ml biotin, and 250 ml Add the cell inoculum.1-2 ml / l H_TwoSO_FourTo bring the compound into solution.   The fermentation vessel was cooled to 28 ° C., pH 5.0, and> 30% dissolved O_TwoIn And drive. Sharp demand for oxygen and subsequent glucose during glucose consumption Cells are exposed to an initial supply of glucose, as indicated by a decrease in oxygen consumption after exhaustion. Will consume. After depletion of the starting glucose feed, NH_Four ⁺And trace elements Fill the container with 0.2% (w / v) glucose supplemented glucose-methanol feed. , 0.2% (w / v) methanol for 5 hours, then 0.1% (w / v) methanol Lucose is introduced with 0.4% (w / v) methanol for 25 hours. One mouth of the container Starting rate of 12.5 ml / h as pure methanol and 25 m At a final rate of 1 / h, a total of 550 g of methanol are fed. 175g of gluco Source, 250 ml of 10 × trace elements, and 99 g of (NH_Four)_TwoSO_FourContains Glucose is supplied through the second port using 700 ml of the solution. this Under these conditions, glucose and methanol are utilized simultaneously and glucose-me When the supply of tanol is started, GAD₆₅Is induced. Shake flask As described above for the culture, cells from the fermentation vessel were₆₅About the expression of Analyze.   The cells are removed from the fermentation vessel at certain time intervals and subsequently analyzed. glucose GAD during growth for₆₅Is hardly observed. Of glucose Consumption is GAD₆₅Leads to low expression of protein; Me during fermentation culture feed Expression is enhanced by the addition of OH. Methanol addition is responsive to methanol Human GAD driven by the AUG1 promoter₆₅A clear stimulus for the expression of Has an effect.   Embodiment 4. FIG.   By studying the transformation conditions, P. methanolica (P. ), Electric field conditions, DNA topology, and D The NA concentration was determined. For all experiments And ade2 strain # 11 of P. methanolica It was used. Competent cells were prepared as described above. BioRad G ene Pulser^TMWas used to perform electroporation.   Two electric field parameters affect the transformation efficiency by electroporation. Affects: capacitance, field strength, and pulse duration. Electric field strength is electric Determined by pulse voltage, pulse duration determined by instrumentation resistance setting Is done. Within the scope of this set of experiments, the setting of the field strength at various resistances The matrix was inspected. The highest instrumentation capacitance for all experiments (25 μF) was used. On ice, linear with approximately 1 μg of NotI restriction enzyme 10 μl of the DNA containing the ADE2 plasmid pCZR133 100 μl aliquots of Lectrocompetent cells were mixed. Cells and D The electroporation cuvette having a NA of 2 mm (BTX Corp., Calif.) (San Diego, OR), 0.5 kV (2.5 kV / cm), 0.75 kV (3.75 kV / cm), 1.0 kV (5.0 kV / cm), 1.25 kV (6.25 kV / cm) and 1.5 kV (7.5 kV / cm). Cutroporate. The conditions of these electric field strengths are detected during various pulse periods. Inspected. Change the instrument set resistance to 200 ohms or “infinite” ohms. And the pulse duration was manipulated. The pulsed cells are suspended in YEPD And incubated at 30 ° C. for 1 hour, collected, resuspended and plated. Was. Three separate sets of experiments were performed. Each pair has an "infinite" ohm resistance Electroporation conditions of 0.75 kV (3.75 kV / cm) Found to give dramatically higher transformation efficiencies than the other conditions tested (See Fig. 1 ).   After optimal pulse conditions have been established, the DNA topology for transformation efficiency The effects of were studied. Electrocompetent cells were treated with 1 μg of uncut circular pCZ R133 or 1 μg of NotI digested pCZR133. Three separate In experiments, an average of approximately 25 transformants were recovered using circular DNA, , Linear DNA averages approximately 1 × 10^FourOf the transformants. These data As shown, linear DNA is much more efficient than circular DNA. Transform methanolica (P. methanolica).   Finally, the relationship between DNA concentration and transformation efficiency was studied. Linear pCZR Aliquots of 133 DNA (10 μl H_Two1ng, 10ng, 100n in O g and 1 μg) with 100 μl of electrocompetent cells, and Perform electroporation at 3.75 kV / cm and "infinite" ohms gave. The number of transformants ranges from about 10 (1 ng DNA) to 10^Four(1 μg of DN It varied between A) and was found to be proportional to DNA concentration.   Embodiment 5 FIG.   Compare DNA from wild-type cells and colonies of stable, white transformants By doing so, the genome of Pichia methanolica The integration of the transforming DNA into was detected. Two classes of integration transformation A variant was identified. In the first, the transforming DNA is integrated into the homologous site. It was found to be. In the second class, the transforming DNA is endogenous A It was found to replace the UG1 open reading frame. By theory I do not want to be restrained, but this second transformant is Recombination event "(Rothstein,Methods Enzymol. ,194: 281-301, 1991). The replacement DNA undergoes a double recombination event to replace the endogenous DNA.   AspI digested pCZR140, Pichia methanolica (P. methanoli) ca) Bluescript (Bluescript) containing the ADE2 gene^TM ) (Stratagne Cloning Systems, California) La Jolla, A.)-Based vectors, and promoter regions and terminators AUG in which the entire open reading frame between the promoter region and the Using one mutant, P. methanolica (P. methanolica) Ade2 strain # 11 of Ade⁺(FIG. 2). Wild-type cells and From transformants grown for 2 days on YEPD plates at 30 ° C., Nome DNA was prepared. Approximately 100-200 μl of cells are added to 1 ml of H_TwoHang in O The suspension was turbid and then centrifuged for 30 seconds in a microcentrifuge. Collect the cell pellet , 400 μl of SCE + DTT + zymolyase (1.2 M sorbitol, 1 0 mM Na citrate, 10 mM EDTA, 1-2 mg / ml zymoria Resuspended in 100T) and incubated at 37 ° C for 10-15 minutes. I did it. 400 μl of 1% SDS was added and the solution was mixed until clear . Add 300 μl of 5 M potassium acetate, pH 8.9, mix the solution, Centrifuge at maximum speed for 5 minutes in a microcentrifuge. Refresh 750 μl of supernatant And extracted with an equal volume of phenol / chloroform. 600 μl The resulting supernatant is collected and the DNA is precipitated by adding 2 volumes of ethanol and allowed to cool. For 15 minutes. The DNA pellet was mixed with 50 ml of TE (10 mM Tris, pH 8, 1m M EDTA) +100 μg / ml RNase at 65 ° C. for about 1 hour Resuspended. At 37 ° C., 10 μl of DNA sample was added to 100 μl of reactant The product was digested with EcoRI (5 μl). DNA is precipitated with ethanol, Collect by centrifugation and resuspend in 7.5 μl TE + 2.5 μl 5 × loading dye I let it. 0.5 × TBE (10 × TBE is 108 g / l Tris bases 7 to 9, 0.7% in 55 g / l boric acid, 8.3 g / l disodium EDTA) gel One lane of agarose was applied with a total volume of 10 ml. Ethidium bromide The gel was developed at 100 V in the containing 0.5 × TBE. Take a photo of the gel Shaded, positively derivatized nylon membrane (Nytran^TMN +, Schleich er & Schuell, Keene, NH) DNA was electrophoretically transferred at 20 mV for 30 minutes. The membrane is then 2 × SSC Rinse in, blot on denaturing solution for 5 minutes, then UV crosslinker (Strata tallinker^TM, Stratagene Cloning Systems The cross-linking was performed wet in the automatic setting in). Commercially available kits (E CL^TMKit, Amersham Corp. Arlington Heights, Illinois ) Is used to probe the PCR-generated AUG1 promoter for the blot. Hybridization. As these results show, the transforming DNA is The structure of the AUG1 promoter DNA was altered, consistent with a homologous integration event. (FIG. 2).   In a second experiment, NotI digested pCZR137, AUG1 promoter and Using a vector containing the human GAD65 cDNA between the Ade2 strain # 11 of P. methanolica was added to Ad. e⁺(FIG. 3). As described above, genomic DNA is transferred to wild-type cells and And stable, White Ade⁺Prepared from transformants and digested with EcoRI. Digested DNA Were separated by electrophoresis and blotted on a membrane. AUG1 Open Reading Blot with PCR generated probe corresponding to frame or AUG1 promoter Was probed. AUG1 open reading frame in transformant strain Absent, and that the AUG1 promoter is performing significant rearrangement. Proved. These results indicate a double pairing between the transforming DNA and the host genome. It coincides with a commutation event (transposition) (FIG. 3).   From the foregoing, it will be appreciated that certain embodiments of the invention have been described by way of example. Various changes can be made without departing from the spirit and scope of the invention. Accordingly Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｒ 1:84） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ホルダーマン，スーザン ディー. アメリカ合衆国，ワシントン 98033，カ ークランド，ワンハンドレットファースト ウェイ ノースイースト 3712 (72)発明者 バナジャ，エリカ アメリカ合衆国，ワシントン 98103，シ アトル，バーク アベニュ ノース ＃エ ー―103 3420──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification FI FI Theme Court II (Reference) C12R 1:84) C12R 1:84) (81) Designated Countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IL IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN (72) Inventor Holderman, Susan D. United States, Washington 98033, Kirkland, One Handlet First Way North East 3712 (72) Inventor Banaja, Erica United States, Washington 98103, Seattle, Burke Avenue North # A-103 3420

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．直鎖状ＤＮＡ分子の存在下で、２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍの電界強度およ び１〜４０ミリ秒の時間定数を有する、指数的に減衰するパルス電界に、ピヒア ・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を暴露し、これにより前記Ｄ ＮＡ分子を前記細胞の中に導入することを含んでなる、ＤＮＡ分子をピヒア・メ タノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞の中に導入する方法。 ２．前記ＤＮＡ分子が、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ） のポリペプチド以外のペプチドをコードし、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈ ａｎｏｌｉｃａ）の遺伝子の転写プロモーターおよびピヒア・メタノリカ（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の遺伝子の転写ターミネーターに作用可能に連結され たセグメントを含んでなる、請求項１に記載の方法。 ３．前記転写プロモーターがピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ ａ）のＡＵＧ１遺伝子のプロモーターである、請求項２に記載の方法。 ４．前記ＡＵＧ１遺伝子のプロモーターがヌクレオチド２４からヌクレオチド １３５４までの配列番号：２に示すヌクレオチド配列を含んでなる、請求項３に 記載の方法。 ５．前記ＤＮＡ分子が前記細胞における突然変異を補足する選択マーカー遺伝 子をさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。 ６．前記選択マーカー遺伝子がピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉ ｃａ）の遺伝子である、請求項５に記載の方法。 ７．前記マーカー遺伝子がピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ ）のＡＵＥ２遺伝子である、請求項５に記載の方法。 ８．前記ＡＵＥ２遺伝子がヌクレオチド４０７からヌクレオチド ２８５１までの配列番号：１に示すヌクレオチド配列を含んでなる、請求項７に 記載の方法。 ９．前記ＤＮＡ分子が前記細胞における突然変異を補足する選択マーカー遺伝 子をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。 １０．前記マーカー遺伝子がピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ ａ）の遺伝子である、請求項９に記載の方法。 １１．前記マーカー遺伝子がピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ ａ）のＡＤＥ２遺伝子である、請求項９に記載の方法。 １２．前記ＡＤＥ２遺伝子がヌクレオチド４０７からヌクレオチド２８５１ま での配列番号：１に示すヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１１に記載の方 法。 １３．前記時間定数が１０〜３０ミリセカントである、請求項１に記載の方法 。 １４．異種直鎖状ＤＮＡ分子の存在において、２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍの電 界強度および１〜４０ミリセカントの時間定数を有する、指数的に減衰するパル ス電界に、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞の集団を暴 露し、これにより前記異種ＤＮＡを前記細胞集団の少なくとも一部分の中に導入 し、そして前記ＤＮＡが導入された細胞を回収することからなる、異種ＤＮＡで ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）を形質転換する方法。 １５．異種ＤＮＡの１μｇ当たり１０³〜１０⁵細胞を回収する、請求項１４に 記載の方法。 １６．異種ＤＮＡの１μｇ当たり０．９×１０⁴〜１．１×１０⁴細胞を回収す る、請求項１５に記載の方法。 １７．前記回収された細胞から組込み形質転換体を回収する工程 をさらに含む、請求項１４に記載の方法。 １８．前記回収工程が炭素源としてソルビトールを含む増殖培地中で前記細胞 を培養することからなる、請求項１７に記載の方法。 １９．前記細胞集団が初期対数期の増殖にある、請求項１４に記載の方法。 ２０．前記時間定数が１０〜３０ミリセカントである、請求項１４に記載の方 法。 ２１．請求項１に記載の方法により形質転換されたピヒア・メタノリカ（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞。 ２２．請求項６に記載の方法により形質転換されたピヒア・メタノリカ（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞。[Claims] 1. In the presence of linear DNA molecules, an exponentially decaying pulsed electric field having an electric field strength of 2.5-4.5 kV / cm and a time constant of 1-40 milliseconds was added to Pichia methanolica (P. methanolica). A) A method of introducing DNA molecules into P. methanolica cells, comprising exposing the cells to thereby introduce said DNA molecules into said cells. 2. The DNA molecule encodes a peptide other than a P. methanolica polypeptide, and is a transcription promoter of a P. methanolica gene and a transcription of a P. methanolica gene. 2. The method of claim 1, comprising a segment operably linked to the terminator. 3. The method according to claim 2, wherein the transcription promoter is a promoter of the AUG1 gene of P. methanolica. 4. 4. The method of claim 3, wherein the promoter of the AUG1 gene comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 from nucleotide 24 to nucleotide 1354. 5. 3. The method of claim 2, wherein the DNA molecule further comprises a selectable marker gene that complements a mutation in the cell. 6. The method according to claim 5, wherein the selectable marker gene is a gene of Pichia methanolica (P. methanolica). 7. The method according to claim 5, wherein the marker gene is the AUE2 gene of P. methanolica. 8. The method according to claim 7, wherein the AUE2 gene comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 from nucleotide 407 to nucleotide 2851. 9. 2. The method of claim 1, wherein the DNA molecule further comprises a selectable marker gene that complements a mutation in the cell. 10. The method according to claim 9, wherein the marker gene is a gene of Pichia methanolica (P. methanolica). 11. The method according to claim 9, wherein the marker gene is the ADE2 gene of P. methanolica. 12. 12. The method of claim 11, wherein the ADE2 gene comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 from nucleotide 407 to nucleotide 2851. 13. The method of claim 1, wherein the time constant is between 10 and 30 milliseconds. 14． In the presence of a heterologous linear DNA molecule, an exponentially decaying pulsed electric field having an electric field strength of 2.5-4.5 kV / cm and a time constant of 1-40 milliseconds, P. methanolica (P. methanolica) Exposing a population of cells, thereby introducing said heterologous DNA into at least a portion of said cell population, and recovering the cells into which said DNA has been introduced, comprising P. methanolica with the heterologous DNA. ). 15. The method according to claim 14, wherein 10 ³ to 10 ⁵ cells are collected per μg of the heterologous DNA. 16. Recovering 0.9 × 10 ⁴ ~1.1 × 10 ⁴ cells per 1μg of the heterologous DNA, the method of claim 15. 17． The method according to claim 14, further comprising a step of recovering the integrated transformant from the recovered cells. 18. 18. The method of claim 17, wherein said collecting comprises culturing said cells in a growth medium comprising sorbitol as a carbon source. 19. 15. The method of claim 14, wherein the cell population is in early log phase expansion. 20. 15. The method of claim 14, wherein the time constant is between 10 and 30 milliseconds. 21. A P. methanolica cell transformed by the method of claim 1. 22. A Pichia methanolica cell transformed by the method of claim 6.