JP2002515588A - 試薬及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
含む種類の試薬、および合成経路および/又は使用される試薬を追跡する関連す
るタグ残基(associated tag moieties)に関する。生成物はオリゴマーであるこ
とが多く、タグはオリゴマー中の少なくとも1つのモノマー残基(monomer resid
ue)のアイデンティティーおよび位置を規定する。この様な試薬は、単純な標識
分析物より生ずることが可能な情報に比べ、より多くの情報を生ずることができ
るアッセイ法において有用である。この様な試薬のセットおよびライブラリーは
、組合せ化学により創製することができ、そして例えば生物学的活性に関する大
量の化合物のスクリーニングに有益である。発明による好ましいシステムでは、
中性分子の、例えば光解裂の様な解裂により、マススペクトロメトリーによる分
析に供される正に荷電したタグ基が生成される。
基を含むタグ成分にあって、レポーター基が分析残基を指定し、タグ成分の各位
置にあるレポーター基が分析成分の限定位置にある分析残基を指定する様に選択
されるタグ成分に結合している試薬を記述している。それぞれが異なる分析体成
分を含んでいるこの様な試薬の多くは、標的基質を含むアッセイ法にて使用でき
る試薬のライブラリーを提供する。タグ成分の分析は、標的基質に結合した分析
体部分の性質を示す。
ラリーを同時に作成するのに用いるシステムを記述している。分割および混合工
程により製造された各ビーズは、それぞれユニークな化学的生成物を担持してお
り、またこのことは同一合成経路を通過した各ビーズに共通する。プロセス中の
各ポイントにおいて、では2つのカップリング工程が用いられる:一方の工程は
シントン又はリガンドに作用する;もう一工程はこれもビーズ上に担持されるタ
グの構造を変える。タグはビーズが経てきた工程を同定するよう設計される。
たは分離された状態で用い得る標識化合物のセット又はライブラリーを提供する
ことである。
合物のセットを製造する方法を提供することであり、その方法には以下の工程が
含まれる: a)支持体をロットに分割すること、支持体の各ロット上で異なる化学反応を実
施し、支持体のそのロットを修飾するか、又は支持体のそのロットに化学残基(c
hemical moiety)を結合させること、支持体の各ロットの画分に異なる標識によ
るタグ付けをすること、及び支持体の該ロットを組み合わせることを含む少なく
とも1の第1工程又は中間工程、並びに b)支持体をロットに分割すること、支持体の各ロット上にて異なる化学反応を
実施し、支持体のそのロットを修飾するか、又は支持体のそのロットに化学残基
を結合させること、支持体の各ロットの画分に異なる標識によるタグ付けをする
ことにより、別の工程において支持体に結合した化学残基に各々異なる標識を結
合させ、その化学残基と共に支持体より分離可能な標識化合物を形成し、及び支
持体の該ロットを組み合わせることを含む、少なくとも1の中間工程または最終
工程。
量の支持体、例えばフラットシートまたはシリコンチップ、あるいは例えば異な
る化学反応を実施するために領域にマスキングすることで分割されるマイクロタ
イタープレートであろう。支持体は幾つかの溶媒に可溶性であり、その他の溶媒
には可溶性でなく、そして例えば沈殿または溶解によりロットに分割され又は組
み合わされるポリマー材料であり得る。通常、支持体は、例えばピン又は繊維の
ような粒子、又は毛細管であり、好ましくはビーズである。***および混合戦略
による組合せ化学の実施のための誘導化ビーズは市販されており、本発明に利用
できる。好ましい微粒子支持体は、解裂可能なリンカーを有するビーズを含み、
各々の解裂可能なリンカーには、規定される化学的方法、例えばオリゴマー合成
のための1個の基、および標識のためのもう一つの基が含まれる。このことは、
合成終了時において、例えば、オリゴマーのような標識化化学生成物を溶液中に
回収できることを意味する。
することを含み、通常は合計で少なくとも3工程を行うことを含む。各工程は、
通常は化学反応であるが、必ずしもそれである必要はない反応を実施することを
含む。これら反応の1例は、保護基を除去し第一級アミンまたはヒドロキシまた
はカルボン酸基を残すものであろう。通常、化学反応は支持体への化学残基の結
合を含む。化学残基は通常は有機化学基、例えばWO94/08051記載の如
くの基である。連続する化学残基は別のリンカーを介して支持体に結合してもよ
いが、より一般的には、連続する化学残基は相互に結合し支持体より延伸する鎖
を形成する。好ましくは、化学残基はオリゴマー鎖を形成する様形成されたモノ
マーユニットである。
ブラリである。ここで、nは異なるモノマーユニットの数であり、sは各標識オ
リゴマー中のモノマーユニットの数であり、工程a)は支持体の各ロットに対し
異なるモノマーユニットを結合させるために1回実施され、そして工程b)はs
−1回実施される。
ーがオリゴヌクレオチド又は類似体の場合、一般にnは4である。オリゴマーが
オリゴペプチドの場合、天然のアミノ酸のみ使用する場合にはnは一般に約20
である。しかし発明の原理は、他の重合可能なモノマーより形成された他のオリ
ゴマーにも等しく適用され得る。sの値は重要ではなく、典型的には2〜100
であり、例えば3〜20またはそれ以上である。
である。好ましくは各支持体の各ロットの0.25%ないし25%が、各工程に
て異なる標識によりタグ付けされる。好ましくは、支持体は解裂可能なリンカー
を有し、各解裂可能なリンカーは。化学反応、例えば化学合成に適した基を少な
くとも1個、および標識化に適したもう一つの基を有する。好ましくは、得られ
た各標識化合物は、単一の標識と少なくとも1個の化学残基を含む。
。標識体の性質は重要ではないが、各異なる標識は、標識の検出に用いられる分
析的手段により区別可能であることが、発明の好ましい特徴である。標識として
利用される基は、一般に使用されている保護基(例えばヌクレオチドシントン中
の5’又は3’−保護を提供するDMT基)に比べ、オリゴマー合成に含まれる
酸性(又は他の化学的)処理に対し極めて安定でなければならない。好ましい標
識体は、解裂、例えばマススペクトロメトリーによる分析に適した中性分子の光
解裂、により荷電基、好ましくは正に荷電した基が生ずるものである。そのよう
な好ましい標識の例は、以下に述べる。
合を介した固体支持体へ結合するためのもの;1つは化学生成物、例えばオリゴ
マーの合成を開始するためのもの、そして三番目は、タグの結合の為ためのもの
である腕を持つ、解裂可能なリンカーを保持する固体支持体を必要とする。シン
トンおよびタグモノマーの結合のための部位は、除去可能な基により随意保護さ
れるだろう。このプロセスは粒子状固体支持体上でのオリゴマー合成により例示
できる。
個のロットに分けられ(ここで、nは、異なるモノマーの数であり、天然ヌクレ
オチドの場合、4である)、次いで、各モノマーは支持体の1つのロット上の部
位に結合する。次に、加えられたばかりのモノマーおよび配列中のその位置を代
表するユニークなタグが、最終オリゴマー中のモノマーの数にほぼ対応するだけ
支持体の画分に結合される。あるいは、タグは、それが代表するモノマーの後で
はなく前、あるいは同時に支持体の画分に結合されてもよい。部分的結合は様々
な方法にて達成できるだろう。例えば、(i)その部分の保護基を部分的に除去
する;(ii)終了画分に結合を実施する;(iii)支持体の画分を除去し、
画分をプールに戻す前に結合を終了する。結合工程が進むにつれ、オリゴマーは
1回毎に1ユニット伸長し、タグが1回毎に1個加わる。最終結果は、各粒子上
の分子の混合体であり;各分子はオリゴマーにおけるモノマーの同一配列を有す
るが、s−merの1/sの画分はs結合工程の何れかにおいて加えられたタグ
を有するだろう。
つ解裂可能リンカーで誘導されたビーズ形状の固体支持体が描写されている。B
には、各リンカーの2本の腕の一本がスクシンイミジル置換基を持つトリチル基
と反応している。Cでは、各リンカーのもう一つの腕が図Gに示されたヌクレオ
チド残基と反応している;そしてNHS基の一部は標識体R1により置換されて
いる。Dでは、ダイマー鎖GTの形成によりオリゴヌクレオチド合成が継続され
ている;そしてNHS基の第2部分が第2標識R2により置換されている。Eで
は、オリゴヌクレオチド合成は鎖GTTの形成により継続されている;そしてN
HS基の第3部分が標識R3により置換されている。Fではビーズのアンモニア
分解により、それぞれが異なるタグに結合した、同一配列中のオリゴヌクレオチ
ドのプールが生じる。Gでは、光分解がマススペクトロメトリーによる分析に適
した、3種類の誘導化トリチル基を分離する。***および混合法は、何れかのビ
ーズに結合したオリゴヌクレオチドは全て同一のs−merの配列を有すること
、ならびにビーズが、s個の異なる評せ引きの合計を保持し、それぞれの標識が
オリゴマーの1モノマー残基の位置と特性を示すことを保証する。
化合物のフラクションの伸長を、安定なタグ基によりキャップするものである。
例えば、オリゴヌクレオチド合成の場合、結合試薬は、マスタグとして以下に記
す安定したトリチル基の一つにより保護された少量のホスホアミダイト(phospho
ramidite)を含むことができる。伸長は、所望する塩基を持つ主要部と、塩基の
特性および位置をマーキングする対応するタグを持つ小画分を生ずるだろう。
は誘導化ビーズ上で実施されA、合成の第1、第2、および第3ステージはB、
CおよびDに示される。各4種類のホスホアミダイト試薬は、極めて酸安定なN
HS−置換トリチル基を有するキャッピングホスホアミダイトの小画分であって
、オリゴマーの長さに依存して、好ましくは1/sより少ない小画分を含む。合
成の各ステージの後、全ての取り込まれたNHS基はアミンと反応させられ、そ
れにより標識が結合する。より長いオリゴヌクレオチドの合成の場合には、o−
メチルホスホルアミダイトを利用することでアミノ化反応の反復に耐える様にで
きる。B、CおよびDにて使用される3種類の標識体は、図2中R1、R2および
R3として表されている。合成終了時、オリゴヌクレオチドはアンモニア処理に
より脱保護されるが、ビーズには結合したままである。即ち、各ビーズは同一配
列を持つ複数のs−merのオリゴマーを、それぞれがオリゴマーのモノマー単
位の特性と位置を示す合計s種類の置換トリチル標識と共に保持している。ビー
ズはアッセイ法に利用される。その後、ビーズの光分解により、マススペクトロ
スコピーによる検出に適した電荷を持つ置換トリチル成分Eが生じる。あるいは
、標識化オリゴヌクレオチドは液中に放出できる。
分子が、その分子の成分の特性および/又は位置を特定する単一の標識体による
タグが付され、そして同一化合物の別分子に別の標識体がタグ付されている。標
識化合物のセットは、放出可能に固体支持体、例えばビーズに結合されるか、又
は液中に共に混合され得る。
を含むライブラリー、例えばnが異なるモノマーユニットの数であり、sが各標
識化合物内のモノマーユニットの数である、ns個の標識オリゴマーのライブラ
リーである。
異なるオリゴマー分子を有するオリゴマー分子を、その表面に担持する固体支持
体を含む試薬を提供する。前記オリゴマー分子には、いくつかのより短いオリゴ
マー分子が含まれ、1のより短いオリゴマー分子には、そのオリゴマー分子のモ
ノマーユニットの特性及び位置を特定する標識が含まれる。ライブラリーは、固
体支持体が好ましくはビーズである複数の該試薬より構成される。
り出し、例えば固体支持体からのオリゴマーの切り出しに用いられる化学的手段
に対し安定である結合により固定されなければならない。
それらの検出に利用される分析的手段によりn×s個の標識体を区別することが
できる特性を有していなければならない。以下の実施例に示すように、36種類
のタグモノマーを利用することで262144種類全てのノナヌクレオチドを特
異的にコードすることができることが分かる。この数は、下記トリチル誘導体を
用い容易に達成できる。あるいは、好ましさに於いて劣るが、9−merの同一
数は、18種類のバイナリータグにより、又はWO94/08051記載の様な
9種類のタグのユニークな組合せによってさえもコードすることができる。
、酵素的方法のような解裂に際して、それらはマススペクトロメトリーによる分
析に適した、中性分子または好ましくは、荷電したイオンのいずれにかの安定種
を生じなければならない。マススペクトロメトリーは分析の好ましい方法であり
、数百の標識体の同時検出が可能である。中性分子の光解裂による、好ましくは
荷電基を生成するこの特性は、マトリックス添加を必要とすることなくイオンが
気相内に持ち込まれることを保証する。従って、マトリックスを加えた場合に必
要とされる「ホットスポット」を探す必要は無い。更にマトリックスが存在しな
いことで、オリゴヌクレオチド連結の様な別の生化学的プロセスも可能になる。
酸を含むような特定の解裂方法では、マトリックスの添加は検出感度を上げ得る
。
びR3が同一または異なるものであり、かつそれぞれが置換または非置換型の縮
合環状芳香族基又は単環である、式R1R2R3C−の基である。これらはトリチ
ル(トリフェニルメチル)系の基である。その他の可能な標識には、トロポニウ
ムおよびWO97/27331に考察されるものが含まれる。トリチル基は、マ
ススペクトロメーター内のレーザー照射により容易に解裂されるという所望され
る特性を有している。トリチル基の検出感度は、正に荷電したカルボニウムイオ
ンが安定であることから高い。この感度が、例えばトリチル標識分子が表面に共
有結合的に結合される場合に結果として分子単層中に十分な量のトリチル基が存
在するといった多くの利点を提供する。
ン酸、スルフォン酸、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、第1級、第2
級、あるいは第3級アミノ、1級又は2級アミド、無水物、ハロゲン化カルボニ
ル又は活性化エステルにより置換されたC1〜C20アルコキシ又はヒドロカルビ
ルより選択される置換基を有する。これら置換基の水素原子は、重水素またはフ
ッ素の様なハロゲンにより部分的または全体的に置換されるだろう;これにより
マススペクトロメトリーによる分析の利用可能域が改善される。
フェニルである。置換基は芳香族(例えばフェニル)環の何れの位置にも存在で
きるが、パラ置換基が都合よく、好ましい。置換基が存在することで、トリチル
(又はその他の)基に望まれる物理的又は化学的特性を付与するだろう。例えば
電子求引性基がオルトまたはパラ位置にあると、酸加水分解に対するトリチル基
の安定性が増す。置換基の存在は、トリチル(又はその他)の基の式量を変更し
、マススペクトロメトリーによる検出と識別を容易にする。非放射活性同位元素
置換基はこの目的に好適であり、例えば1、2または3重水素分子を含む小アル
キル基である。好ましい置換基はアミン又はアミド基である。下表1に示すよう
に、各種分子量を有する多数のアミンが市販されており、また識別し得る式量を
有する置換トリチル基の提供に利用できる。
は、数百までの質量のタグを有することが望まれる。TOF−マススペクトロメ
トリーによりタグを解像するためには、少なくとも4Daのタグの質量の差があ
れば十分でることが分かっている。従って、アミンの上限域では約50種類のタ
グを生ずるに過ぎない。アミンの同一プールを利用してこの量を増やすために、
トリチル基当たり2又は4、あるいはそれ以上のアミド置換基さえ取り込むこと
が可能であり、そしてそれは以下実験欄に例示される。
ドはCPG支持体上に合成される。Bでは、オリゴヌクレオチドの5’−ヒドロ
キシ基はNHS−置換トリチル基により置換されている。Cでは、式中のRが式
量を特徴付けるアミド基NHRが導入されている。Dでは標識化されたオリゴヌ
クレオチドはアッセイ法での利用を目的とし溶液中に放出される。Eでは、NH
R−置換トリチル基は光分解により蒸発させられ、マススペクトロメトリーによ
り検出された。
である。即ち、別の態様によれば、本発明は、核酸決定方法を提供する。この方
法は、標識オリゴヌクレオチドまたは核酸を提供し、解裂により標識を除去し、
マススペクトロメトリーに供される荷電種を供与することを含む。好ましくは、
配列決定または配列差の分析の様な核酸解析は、標識体が上記の如くである標識
プライマーおよび/又は標識された鎖延長ヌクレオチド、および/又は標識化さ
れた鎖停止ヌクレオチド類似体を利用し、実施される。
定されたものに分離する方法を提供する。前記標識プローブは、解裂によってマ
ススペクトロメトリー分析に適した荷電種を供する結合により標識に結合するリ
ガンドを含む。本発明には更に、それぞれが解裂によってマススペクトロメトリ
ー分析に適した荷電種を供する結合により標識に結合するリガンドを含むプロー
ブであり、かつ各種プローブが異なるラベルを有するプローブのライブラリーが
含まれる。好ましくは、標識は上記したものである。
式R1R2R3Yの化合物である;式中Yは、例えばチオール、アルコール又はア
ミン基の様な求核基による置換に適した、例えばハロゲン又はトシレートの様な
脱離基であり;そしてR1、R2およびR3は上記に同じである。但し、R1、R2
およびR3は一緒に、例えばN−ヒドロキシスクシンイミドエステル基のような
カップリングに適した少なくとも2個の反応基および/又は少なくとも2個のア
ミン基を保持する。
ption ionisation mass spectrometry)の標的表面として使用するための、使い
捨て型ガラス製インサート(insert)を製造した。ガラス製標的はガラス表面上に
直接スポットされ乾燥したサンプルの分析に使用できるだろう。ガラス標的はま
た、化学的に活性化でき、既存の方法を使った核酸またはその他の化合物の固定
用個体支持体として利用できるだろう。ガラス標的上に分離され、局在化した相
補的核酸、かさのあるタグ付きオリゴヌクレオチド又はその他化合物はレーザー
脱着イオン化型マススペクトロメトリーによる分析に直接供される。固体支持体
を利用する利点の一つは、連続検出用マススペクトロメトリーに直接導入でき、
不要なサンプル液操作を避けることができることである。ポリプロピレンの様な
有機重合性表面はガラスの代替に成り得るだろう。
脱着イオン化型マススペクトロメトリー又はマトリックス支援レーザー脱着イオ
ン化型マススペクトロメトリーに適した標的にこれら化合物を直接固定化するこ
とができるだろう。核酸の結合については、例えば3−メルカプトプロピルシラ
ン誘導化(Rogersら、1999)又はアミン誘導化(Beattleら、
1995;Chenら、1999)がある。ガラス製インサートは通常のインサ
ートに比べ安価であり、かつ完全に使い捨て可能である。マススペクトロメトリ
ーの性能に影響しない(以下実施例4を参照)。
用に適したインサートにあって、分析のための固定化化合物を保持している標的
ガラス表面を持つインサートを提供する。
ーザー脱着マススペクトロメトリーの標的としての利用に適したインサート供給
物を含むキットを提供する。
個体支持体; ・マススペクトロメトリーによる分析に好ましい成分がタグ付けされたオリゴヌ
クレオチド試薬 ・タグ付けされたオリゴヌクレオチドと標的との間の特異的相互作用を可能にす
る生化学的操作に適した試薬および装置 ・マススペクトロメーター内にサンプルを導入する手段 ・マススペクトロメーター。
たシステムは以下を含む: ・分析に適した標的として作用するか、又は標的を捕捉するプローブとして作用
する核酸の並びを保持する固体支持体; ・マススペクトロメトリーによる分析に好ましい残基でタグ付けされたオリゴヌ
クレオチド試薬; ・固体支持体表面で行われるタグ付けされたオリゴヌクレオチドと標的との間の
特異的相互作用を可能にする生化学的操作に適した試薬および装置 ・マススペクトロメーター内にサンプルを導入する手段 ・マススペクトロメーター。
クレオチド試薬 ・マススペクトロメーター ・分析を行うコンピューター ・マススペクトラムを解釈するソフトウエアー。
チド配列決定の為に提供される。 オリゴヌクレオチド内の各塩基および塩基位置にはユニークなマスタグ(mass
tag)により関連付けられている。
て識別するには4s個のタグが必要とされる。 注意深くタグを選択することで、全てのタグが十分に異なる質量を有する様に
なり、マススペクトラム分析に際してタグの割付の不確実性を回避できる。 各タグの化学式は既知であり、従って各タグの単一同位体の質量を計算するこ
とができる。
完全な質量分布および各々のタグの有り全ての同位体変種の存在も計算すること
ができる。 使用されるタグに関しては、タグの主要な重同位体は13Cの存在によるもので
あり、典型的な同位体存在比分布は、同位体質量がそれぞれ400.228、4
01.231および402.234である、相対同位体比73:22:3のC27 H30O2Nに関するものである。これらの存在度分布はマススペクトラム中のタ
グの存在を特徴付けるものであり、スペクトラム中のその他の特性からタグを識
別するのに役立つ。
なる同位体存在比分布を持つことから、タグの検出と同定に更に役立つ; 35Cl:37Clに関する存在比は76:24 78Br、81Brのそれは51:49である。
いる。一般に、化学的「ノイズ」のバックグランドに対して同定を容易にするた
めの特徴的な質量のセットを持つタグを設計することが目的となる。
軸が計算可能になる。タグ質量域内およびいずれかの領域端部に質量スタンダー
ドを利用することで、この領域での正確な質量測定が保証される。可能な質量の
完全なセットを表すイオンがしばしばマススペクトラム中に見られ、これらは理
想的なキャリブレーションセットを表す。
体存在比分布と質量タグに対応する同位体質量を計算する様に書かれている。こ
の情報は、タグ付きオリゴヌクレオチド内への利用に適した、利用可能な全ての
質量タグについて計算されている。
リゴヌクレオチドにより作られたマススペクトラム中の配列を決定し、更に以下
の如く作動する。オリゴヌクレオチド中の各塩基の位置に関しては、4種類の可
能なタグ(それらの同位体変種も含む)の質量に対応するマススペクトラムの4
領域を検証し、期待されるタグスペクトルと比較される。比較は、スペクトルの
ピーク位置の同定および大きさ、ならびに潜在的タグの位置および大きさとの差
、によるか、あるいは実験的スペクトラムと潜在的タグより予測されるスペクト
ラムとの差の平方の合計を測定することの何れかにて行われる。いずれのケース
でも、4種類のタグは選択された測定法によって等級付けされ、最善のタグを用
いてそれら塩基位置に塩基が割り付けられる。
より全sタグ領域について適合度を調べ、次にこの結果に基づいてオリゴヌクレ
オチド配列を等級付けする方法である。
化合物を作成した。これらの化合物の内のいくつかは、新規であると思われ、そ
して本発明の別の態様を形成する。関与した化学は、付随の図面の図4に例示さ
れる。化合物およびそれらの特性は、以下のとおりである。
5当量。c.臭化フェニルマグネシウム。d.80%AcOH、48時間。e.
NHS、DCC。f.AcCl、トルエン、還流。g.グリニャール合成。3は
、ベンゾフェノンおよび4−ブロモフェニルオキサゾリンから選択的に合成され
る。
]−ベンゾエート(1)を、報告された手段(1,2)によって合成した。 N−スクシンイミジル−4−[(4−メトキシジフェニル)−クロロメチル]
−ベンゾエート(2)を、4−メトキシベンゾフェノンを、4,4’−ジメトキ
シベンゾフェノンの代わりにグリニャール合成に使用した以外は、報告された手
段(1,2)によって合成した。1H-NMR(CDCl3, δ, md): 7.95-6.8(m, 13H, ar
om.), 3.8(s, 3H, OCH3), 2.88(s, 4H, NHS). Mass-spectrum, TOF(マトリック
スなし):(MI+H+)。
エート(3)を、ベンゾフェノンを、4,4’−ジメトキシベンゾフェノンの代
わりにグリニャール合成に使用した以外は、報告された手段(1,2)によって
合成した。1H-NMR(CDCl3, δ, md): 8.0-6.8(m, 14H, arom.), 2.88(s, 4H, NHS
). Mass-spectrum, TOF(マトリックスなし):(MI+H+)。
得られるグリニャール試薬の形成は、アクチベータとしてRED−Al(登録商
標)(アルドリッチ(Aldrich))を使用する場合でさえ、むしろ信頼で
きず、そして再生不可能である。市販で入手可能なグリニャール試薬(アルドリ
ッチ)の利点を得るために、発明者らは、4−カルボキシベンゾフェノンから出
発して、オキサゾリル保護4−カルボキシベンゾフェノン(4)を合成した。グ
リニャール反応に続いて、連続段階は、化合物1−3について使用されるものに
類似した。
)。4−ベンゾイル安息香酸(50g、ミリモル)を、3時間、300mlの塩
化チオニル中で還流させ、蒸散させ(生成物は、油状物から結晶化する)、そし
てその後、トルエンで蒸散させた(2×30ml)。残渣を、254mlの乾燥
塩化メチレンに溶解させた。この氷冷却溶液に、150mlの乾燥塩化メチレン
中の46g(2.5当量)の2−アミノ−2−メチルプロパノール−1を2時間
、滴加した。その溶液を、室温で一夜攪拌させ、そして沈殿物を、塩化メチレン
で数回洗浄した。混合画分を、蒸散させ、注意深く350mlの塩化チオニルに
溶解させ、そして4時間還流させた。反応混合液を、1/3まで蒸散させ、2L
の乾燥エーテルに注ぎ、そして4℃で一夜静置させた。塩酸化物の沈殿物を、1
0℃で、1Lの水に溶解させ、そして300mlの5M KOHを、攪拌しなが
らそれに添加した。混合液を、クロロホルム(3×350ml)で抽出させ、有
機層をCaCl2上で乾燥させ、そして蒸散させた。結晶生成物を、トルエンか
ら得た。42g(75%)白色結晶性固体、融点81℃。1H-NMR(CDCl3, δ, md
): 8.2-7.2(m, 9H, arom.), 4.18(s, 2H, CH2), 1.45(s, 6H, CH3). Mass-spect
rum, MALDI-TOF: 279.091(MI), 302.085(MI+Na+), 319.656(MI+K+)。
種の用途については、数百までの質量のタグを有することが望ましい。TOF質
量スペクトロメーターでタグの分割は、多量のタグの間で少なくとも4Daの差
異で十分であることが分かった。したがって、上記範囲のアミンは、約50の異
なるタグを得ることができるのみである。同じ保存のアミンを使用してこの量を
増加するために、発明者らは、2つの活性化カルボキシル基(6)を有する別の
トリチル基本の化合物を合成し、そしてアミンとの反応でそれは、2つのアミド
結合を形成し、したがって例えば(2)と比べるとき他の一連の質量タグを得た
。追加の質量の増加は、例えば、(8)を使用することによってトリチル・コア
までさらにいっそうアミンを付着させることによって達成できる。
−4’’−メトキシトリタノール(5)。ヨウ素で活性化された1.5gのマグ
ネシウム分岐点に、150mlの乾燥THF中の15.34g(ミリモル)のブ
ロモフェニルオキサゾリンおよび1滴のRED−A1(登録商標)を、攪拌しな
がら添加し、そして混合液を、3時間還流させ、室温まで冷却し、そして40m
lの乾燥THF中の4.64g(ミリモル)のメチル4−メトキシベンゾエート
を滴加した。混合液を、6時間、穏やかに還流し、室温まで冷却し、そして10
mlの水を、攪拌しながら添加した。有機層を、注意深く分取し、そして残渣を
、少量のTHFで数回洗浄した。合せた有機画分を、蒸散させ、そして精製(フ
ラッシュ−クロマトグラフィー)して、11.4g(84%)の明るい黄色の固
体を得た。Mass-spectrum, MALDI-TOF: 467.545(MI-OH), 484.869(MI), 1H-NMR(
CDCl3, δ, md): 7.95-6.75(m, 12H, arom.), 4.12(s, 4H, CH2), 3.78(s, 3H,
OCH3), 1.37(s, 12H, CH3)。
キシトリチルクロリド(6)。250mlの80%酢酸中の5(10g、ミリモ
ル)の溶液を、48時間、72℃で保持し、蒸散させ、そしてその後水(2×5
0ml)で蒸散させた。生成物を、75mlの50%EtOH/水に溶解させ、
3時間還流させ、そして1/3まで蒸散させた。その後、混合液を、100ml
の水に溶解させ、そして3M HClでpH1〜2まで酸性化させた。沈殿物を
、クロロホルムに溶解させ、乾燥(Na2SO4)させ、そして乾固するまで蒸散
させ、そしてさらに真空で一夜乾燥させた。得られたジカルボン酸を、100m
lの乾燥THFに溶解させた。8.5g(ミリモル)のN−ヒドロキシスクシン
イミドを添加し、そして混合液を0℃に冷却させた。20mlの乾燥THF中の
ジシクロヘキシルカルボジイミド(8.5g、ミリモル)を攪拌しながら滴加し
た。反応混合液を、0℃で1時間、そして室温で一夜攪拌した。ジシクロヘキシ
ルウレアを濾取し、そして有機層を、乾固するまで蒸散させ、そして精製(フラ
ッシュ−クロマトグラフィー)して、8.5g(%)の白黄色−白色の固形物を
得た。Mass-spectrum, MALDI-TOF: 554.703(MI+OH), 570.794(MI). 1H-NMR(CDCl 3 δ, md): 8.2-6.75(m, 12H, arom.), 3.81(s, 3H, OCH3), 2.9(s, 8H, CH2)。
のトリチルクロリドに変換させた。その後、反応混合液を、1/3まで蒸散させ
た。2/3の量のトルエンを添加し、混合液を、再度1/3まで蒸散させ、そし
てさらに精製することなしに使用した。
は、プロパンジオール構造に基づいて非ヌクレオシドホスホルアミダイトシント
ン7を合成し、そしてそれは、標準A、C、GおよびTホスホルアミダイトに類
似する反応性を供した。MMTr(NHS)Clは、DMTrClおよびDMT
r(NHS)Clの両方と比較して反応性が減少されていることを示し、そして
低温でトリチル化反応を行って、過剰のプロパンジオールと活性化カルボキシル
基の間のエステル結合の形成を防止する(データは示さず)ことは、7を合成す
る場合、重要である。ホスホルアミダイト7は、室温で、少なくとも2日間、ア
セトニトリル溶液中で安定であった。
}−1,3−プロパンジオール。
された手段(4)によって標記化合物を合成した。フラッシュ−クロマトグラフ
ィーの後、55%の収量を示すモノ保護プロパンジオールを、白色発泡体として
得た。
-NMR(CDCl3, δ, md): 8.15-6.8(m, 13H, arom.), 3.8(s, 3H, OCH3), 3.79(t,
2H, CH2OH), 3.28(t, 2H, J=6Hz, MMTr(NHS)OCH2), 2.9(s, 4H, スクシンイミド
), 1.89(quin. 2H, CH2CH2CH2)。
−O3−(N,N−ジイソプロピルアミノ−2−シアノエトキシホスフィニル)
−1,3−プロパンジオール(7)。
、70%の収率で白色発泡体として標記ホスホルアミダイトを得た。31P-NMR(CD
Cl3, δ, md): 144.512. Mass-spectrum, MALDI-TOF(ジヒドロキシ安息香酸): 6
89.934(MI)。
/ジオキサン(1:1)の混合液中で製造した。110μlのこれらの溶液を4
0μl(6の場合、80μl)の様々なアミン(表1)の0.5−1M溶液と混
合した。その後、直接的に、または様々の組合せで混合した場合のいずれかで、
マトリックスを用いて、あるいはなしで混合液を分析した。
するために、化合物1および2を使用して、5’−保護チミジンを合成した。2
00μlのおのおののトリチル化化合物を、対応の量のアミン溶液と混合させ、
そしてそれを5分間反応させることによって、これらのヌクレオシドの、および
さらにTHF中のHO形態(トリタノール)での化合物3および6の0.1M溶
液を、THFまたはジオキサン中のアミンの0.5−1M溶液(モノ−HNS−
基本化合物についてアミンの5当量、および6について10当量)と反応させた
。その後、1μlのこれらの混合物を、サンプル標的プレート上に塗布し、それ
を乾燥させることによって、反応混合液を、分子イオンの形成を防止するマトリ
ックスなしの質量スペクトルによって分析した。典型的結果は、表1に表される
。全てのトリチル誘導体については、最強のシグナルを示めす化合物を選択し、
そして全てを混合し、1μlの混合液を標的プレートに塗布することによって、
混合液として分析した。マトリックスを用いて、またはなしの両方で、素晴らし
い結果が達成された。
%TsOHまたはHClO4で処理すること、および飽和ジカルボン酸ナトリウ
ムで急冷した後生成物をTLC分析することによって、酸不安定性について試験
した。予測されるとおり、DMTr、MMTrおよびTrの間の安定性において
約1桁の規模の差があった。対応するNHS−誘導体は、安定な場合の約2倍で
あった。すなわち、安定性は、DMTr<DMTr(NHS)<MMTr<MM
Tr(NHS)<Tr<Tr(NHS)
(MA)LDI−TOF分析で明らかに高い強度のシグナルを示すに違いなかっ
た。それは、オリゴヌクレオチド合成で5’−DMTr基を除去するのに使用さ
れる数段階の酸性処理にも耐える、すなわち関与した他の保護基と直交であるに
違いなかった。(NHS−基は、オリゴヌクレオチド合成の条件に対して安定で
ある、実施例2参照)。MMTr(NHS)基は、これらの要求の両方の適する
ものとして好ましい。それは、ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸の2倍希釈標
準溶液および減少された脱保護時間を用いて、オリゴヌクレオチド合成での少な
くとも5〜8サイクルの酸性脱保護の後、一次水酸基に付着したままであった。
分析については、同じ溶液中の3−4%TFAを用いて、それは、容易に放出さ
れた(〜1〜3分)。
イトを用いて1μモル規模の合成でPEGグラフト化ラップビーズ上で直接合成
した。その後、そのビーズを、今回は、7と16の様々のアミンを用い、したが
って、256の様々な7−merのライブラリーを生成しながら、図2に概略さ
れるとおりスプリット・アンド・ミッスクス攻略法にしたがって、さらに4段階
のオリゴヌクレオチド合成にかけた。アンモニア脱保護の後、ビーズを洗浄し、
そして以下に記述されるとおり0.05μモルの5’−Cy5−TTC.CAG
.T(10)および5’−Cy5−TTC.TAT.T(11)にハイブリッド
形成した。
びTホスホルアミダイトと混合した。全塩基に5%添加剤として7を使用して合
成された8−merのライブラリーについて、オリゴヌクレオチド合成の段階収
量が約99%であると仮定すると、全長のオリゴヌクレオチドに占有されたビー
ズの全部位の約60%を示した。最初のタグの濃度(全ての当初の部位の5%)
は、最後のタグ(残りの60%の部位の5%)のものより約2倍大きく、そして
それは、さらに、同じ混合液中のそれらの全てを検出することを可能にする。4
−カラムAB1装置でオリゴヌクレオチド合成を行った。各酸化段階の後、カラ
ムを除去し、そして様々のアミンで処理した。特定の塩基/位置のコード化のた
めに使用されるべきタグの質量を選択するとき、特定の原理は使用されなかった
。しかし、特に、基本型(すなわち、全Asは、400から500Daまでの範
囲にあるタグによってコードされ、全Csは、500〜600Daの間隔にある
タグによってコードされる等)のいずれかをコードするのに、特定の質量範囲が
使用できるか、または一方、その塩基の位置は、決定因子(すなわち、位置番号
1、または3’−末端(A、C、GまたはT)は、400〜420Daまでの範
囲にある質量タグによってコードされ、位置番号2は、420〜440Daによ
ってコードされる)でありえた。
選択した。ラップ−ビースのサイズ(〜0.3mm)は、その保存物から裸眼で
見ることができる陽性で確認されるビースの手動の除去に対処する。小さなビー
ズについては、フローサイトメトリー(FACS)のような自動的方法を使用す
ることができるかもしれない。選択ビーズを、脱トリチル化し、そして放出され
たタグの混合物を、質量スペクトルによって分析した。
ドする徐々の損失のあらゆる問題を排除するために、5’−Fmoc−保護攻略
法も使用され、したがって、一緒に酸性条件を使用することを省いた。各酸化段
階の後、カラムを、合成装置から取除き、そしてそのビースを、対応のアミンで
処理し、アセトニトリルで洗浄し、その後、アセトニトリル中の0.1M DB
Uで処理して、Fmoc−保護を除去した。この攻略法を使用して合成された9
−merのオリゴヌクレオチドをコードするタグを、(MA)LD1−TOF分
析を用いて検出した。長い配列については、5’−Fmoc保護ヌクレオチドの
3’−メチルホスホルアミダイトを、シアノエトキシホスホルアミダイトの代わ
りに好ましく使用して、アミンおよびDBUで処理するためにCNET基の不順
な損失を防止できた。
な標準A、C、GおよびT、PAC、フルオレセインおよびCy5ホスホルアミ
ダイトを用いてオリゴヌクレオチド合成を行った。
%の総量のホスホルアミダイトまで標準A、C、GおよびTホスホルアミダイト
に添加した。35−40mg(約2500ビーズ)のRapp テンタゲルマク
ロビーズを、4つのポリプロピレンDNA合成カラム(1μモル規模、グレン・
リサーチ、米国)の各々に載せた。ホスホルアミダイト混合液を用いて、1μモ
ル規模でオリゴヌクレオチド合成を行った:製造業者のプロトコールに従って、
A+7、C+7およびT+7。しかし、カラムに対する脱保護試薬(塩化メチレ
ンでそれの元の濃度の50%まで希釈した)の供給を、連続の待機段階(10秒
)と、酸の別の部分(10秒)を伴い10〜15秒まで減少させた。そのカラム
のアセトニトリル洗浄を通した連続で、全DMTR+が放出されることを確認し
た。各脱トリチル化段階の前に、カラムを、自動制御態様を用いてアセトニトリ
ルで洗浄し、そしてその後、1分間、1mlシリンジを用いて対応のアミン(ア
ミンの安定性によって、ジオキサン/THF中の0.3−0.5mlの0.5−
1M溶液)で処理した。その後、カラムを、アセトニトリルで過度に洗浄し、そ
して15分間、真空で乾燥させた。その後、全カラムから得たビーズを、円筒形
チャンバー(ピエロ(Pieror))で0.3ml反応バイアル中に一緒に合
せ、混合し、そしてその後、再度アセトニトリル中のビーズの懸濁液(1容積の
ビーズ当たり約1容積の溶媒)を、1mlエフェンドルフチップを用いてピペッ
トで採取することによって4つの部分に分けた。その後ビーズを洗浄し、乾燥さ
せ、55℃で1.5mlの濃縮アンモニア中で14時間脱保護し、その後、蒸留
水で数回洗浄し、乾燥させ、そして4℃で保存した。
。ビーズを、4mlバイアル中の1.5mlの3.5MのTMA緩衝液(51)
中で5’−Cy5標識7−merオリゴヌクレオチド5’−TTC.CAG.T
(10)および5’−TTC.TAT.T(11)にハイブリッド形成させ、そ
れを、一夜、8℃でスパイラミックス10装置で回転させた。その後、ビーズを
、同じ温度でTMA緩衝液で5回洗浄し、7.5×5cm顕微鏡スライドの表面
に移し、そして余分の緩衝液を、ティッシュペーパーで吸取ることにより除去し
た。その後、着色またはさもなければ同定されたビーズを、ピンセットで除去(
通常、約30〜50ビーズ)し、水、アセトンで洗浄し、乾燥させた。標準De
blok溶液(クルアケム;ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸)中のトリフル
オロ酢酸の3−4%(v/v)溶液0.08〜0.1mlでビーズを3〜4分間
、処理することによって、トリチルタグを切断した。アセトンまたはメタノール
で数回、上清を蒸散させて、酸を除去し、そして残渣を、(MA)LDI−TO
Fによって分析した。素晴らしい品質の結果が得られた。
先に使用された(例えば、Hegnerら)。付着は、金とチオール基の間の結
合による。この化学反応を使用して、チオール結合を介して、質量スペクトルメ
トリー標的プレートの金メッキ表面上に任意の遺伝子または任意の遺伝子の領域
を固定することが可能である。
R生成物を固定化することを例示する;対のオリゴヌクレオチドのハイブリダイ
ゼーションおよびリゲーション、その内の1つは、遺伝子座を規定し、そして他
方は、推定対立遺伝子を規定する。その対立遺伝子は、質量スペクトルメトリー
によってトリチルタグ(類)を検出することによって特徴づけられる。示された
実施例は、推定標的領域としてM13mp18ssDNAを使用する。
CGATCGGTGCGG3’−を用いてM13mp18ssDNAから増幅さ
せた。A1を、従来のホスホルアミダイト化学を使用して5’末端に17原子リ
ンカー分子、およびチオール基を添加して合成した(図参照)。チオール基を、
200倍過剰のDTTで活性化させ、そして5ngの生成物を、金標的プレート
上にスポット付けした。100%湿度で、一夜のインキュベーションが、PCR
生成物を固定化するのに十分であった。10mMトリス−HCl(pH7.5)
でそのプレートを浮遊させることによって、過剰テンプレートを、除去した。
ゴヌクレオチドを、5’末端に結合したホスフェートで合成した。オリゴヌクレ
オチドを規定する2つの推定対立遺伝子を合成した、D1は、ジメトキシトリチ
ルでタグ付けされ、そしてD2は、モノメトキシトリチルでタグ付けされたそれ
らの5’末端でのみ異なるD1およびD2−5’CACGACGTT3’である
。従来のホスホルアミダイト化学を用いて、両方のオリゴヌクレオチドを合成し
、そしてPCR増幅生成物に完全に相補的であった。
℃(HousbyおよびSouthern、1998年)であり、そしてオリゴ
ヌクレオチドC1およびD1および/またはD2の飽和濃度下であった。リゲー
ションについては、リゲーションにおけるその高温最適性と、基質オリゴヌクレ
オチドの3’末端についての差別化の程度が高いので、熱安定性DNAリガーゼ
Tthを使用した。残渣の未結合オリゴヌクレオチドを洗浄により除去した。
物からMMTを切断することを明らかに例示した。イオン化を補助するのにマト
リックスは使用されなかった。対照サンプルは、272で検出可能なピークがな
かったことを示した。
DMTも十分に「フライする(flies)」こと、および303質量単位でピークを
示すことを例示する。 誘導されたT残渣は、記述されるとおりアミン化DMTおよびMMT誘導体と
結合した。DMTタグT残渣の選択を、一緒に混合し、そして質量スペクトロメ
トリーによって分析した(図7参照)。
るための使い捨てガラス製挿入物を、1mmの普通のナトリウムガラスから製造
し、長方形45mm×46mmに切断し、そして切断エッジをはすに切った。標
準金メッキ金属挿入物(パーキン・エルマー/パーセプティブ・バイオシステム
ズ部品番号VES503 405)は、組立て前にガラス挿入物の逆に位置配向
マーキングに対するテンプレートとして使用しうる。挿入物を、使い捨てサンプ
ルプレート支持体(パーキン・エルマー/パーセプティブ・バイオシステムズ(
Perkin Elmer/Perseptive Biosystems)部
品番号VES700 314)に保持させた。サンプル支持体の4つの小売の栓
を除去し、ガラス挿入物を、後ろから上部長方形枠に載せ、そしてサンプル支持
体を再組立した。分析用のサンプルは、現存の方法を用いて行いうる。パーキン
・エルマー/パーセプティブ・バイオシステムズの商標「ボエジャー(Voya
ger)」TMバイオスペクトロメトリーTM・ワークステーションソフトウエア・
バージョン4.03は、サンプルをプレート上に正確に配置するのに使用でき、
そして現存の方法を用いて分析を行った。
正混合液の使用によって得られた。その混合液(パーキン・エルマー/パーセプ
ティブ・バイオシステムズ部品番号2−3243−00−000)は、3つのペ
プチドdes−arg1−ブラディキニン、アングロテンシン1およびglu1
−フィブリノペプチドBを包含する。標準法を用いて、分析を行った。単独にプ
ロトン化したイオンの理論的質量は、それぞれ、904.4681Da、129
6.6853Daおよび1570.6774Daである。
、詳細に記述された(Matsonら、1994年;Southernら、19
94年)。特定の短い(10〜20塩基)配列の表面合成は、標的配列を捕捉す
るのに使用されうる。いったん捕捉されると、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオ
チド(ASO)は、捕捉された標的配列とハイブリッド形成されうる。質量タグ
付けオリゴヌクレオチドの連続リゲーションは、質量スペクトロメトリーで使用
して、対立遺伝子を規定する。質量スペクトロメトリーは、実施例4で記述され
たものに類似の方法で使い捨てサンプルプレート支持体にポリプロピレン配列を
確保することによって可能になった。
−merのオリゴヌクレオチドを、一片のポリプロピレンの上にスポット(20
00ピコモル)付けした。マトリックスなしのレーザー脱離/イオン化時間のフ
ライト質量スペクトロメトリーが、309.3質量単位でピークを表した。質量
が高度に観察されたのは、使い捨て標的プレートの後ろに置かれるべきポリプロ
ピレン(ストリップ)標的のためであり、それにより、イオン飛行距離を増やす
ためである。プレートは、質量スペクトロメトリーのために確保されるポリプロ
ピレンストリップを保持するのに使用された。
は、エポキシシラン(Beattieら、1995年)で処理することによって
活性化され、そして標的DNAは、3’または5’末端のいずれかで末端アミン
で合成される。5μMのアミン化オリゴヌクレオチドを、活性化ガラス製プレー
トの表面にスポット付けし、そして2時間から一夜放置した。表面を、60℃で
、H2Oで、室温で10mMトリエチルアミン(pH9.2)で洗浄し、続いて
熱水で2回洗浄した。32P放射性アイソトープで標識したプローブオリゴヌクレ
オチドのハイブリダイゼーションは、3M TMAC、60mMトリス(pH7
.5)、6mMのEDTA、0.03%SDS中で1時間、続いて同じ緩衝液で
1時間洗浄する。ハイブリダイゼーション効率の分析は、リン光測定分析によっ
て測定でき、そしてタグ付オリゴヌクレオチドの質量分光光度測定分析が対立遺
伝子を決定する。
7年)。これらの実験の目的については、ガラス製標的プレートは、10%Na
OHで一夜浸漬し、続いてH2Oおよびメタノールで洗浄することによって、シ
ラン化する。その後、プレートを、メタノール中の3%アミノプロピルトリメト
キシシラン中で超音波処理し、続いて水、続いてメタノールで洗浄する。その後
、プレートを、窒素中におき、そして15分間、110℃で焼付ける。
ト(PDITC)によってプレートを活性化させる(WeilerおよびHoh
eisel、1997年)。5’または3’アミンで標的オリゴヌクレオチドを
合成する。室温で、2時間、0.001MのNaOH、0.1〜1.0μMオリ
ゴヌクレオチド中で標的DNAの固定化を行う。1時間、3×SSPEおよび0
.5%SDS中で32P放射性標識した相補的プローブオリゴヌクレオチドのハイ
ブリダイゼーションを行い、続いて、同じ緩衝液中で洗浄し、そして連続ホスホ
ルイメージャー分析する。タグ付オリゴヌクレオチドのリゲーションおよび質量
分光光度分析が、対立遺伝子を決定する。
ている(Rogersら、1999年)。簡便には、ガラス製標的プレートは、
25%水酸化アンモニウムナトリウム中で一夜洗浄され、10分間、水で洗浄し
、続いて無水エタノールで簡便に洗浄する。シラン化については、ガラス製プレ
ートを、30分間、3−メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPTS)の
1%溶液、95%エタノール、16mM酢酸(pH4.5)で浸漬する。最終的
に、プレートを、95%エタノール/16mM酢酸(pH4.5)で洗浄し、そ
して2時間、150℃で真空オーブンで乾燥させる。
ル基は、標準ホスホルアミダイト化学を用いて任意のオリゴヌクレオチドの5’
末端に容易に加えることができる。一般に、チオール化オリゴヌクレオチドであ
る場合、500mMのNaHCO3(pH9.0)中の10μMを、2時間、一
夜まで活性化メルカプトシラン表面にスポット付けする。その後、その表面を、
TNTw緩衝液(10mMトリスHCl(pH7.5、150mM NaClお
よび0.05%Tween20)で洗浄する。
製標的に固定された。32P放射性標識した17塩基の相補的プローブ配列のハ
イブリダイゼーションは、ほとんどバックグランドハイブリダイゼーションなし
の相補的標的配列に非常に特異性があることを示した。
スペクトロメトリー標的に付着させた。非特異的血およびグリニャールを阻害す
る処理の後、高い効率を示す相補的14−merの特異的ハイブリダイゼーショ
ンが、成功裏に例示された。
液(シグマP8920)で処理し、続いて以下に記述される一般の手段で処理し
た。
解させる。420mlの95%エタノールを添加する。総量は、700ml(=
2×350ml)である。完全に混合するまで攪拌する。溶液が曇りを残す場合
、透明になるまでddH2Oを加える。
。2時間、軌道振蘯器で混合する。スライドが透明になったら、それらを、でき
る限り少ない空気に曝すべきである。塵粒子は、被覆および印刷に干渉する。 4.ddH2Oで充填した新たなチャンバーにラックを移す。ラックを上げ下
げすることによって激しく洗浄する。ddH2Oで4回繰返し洗浄する。それは
、NaOH−エタノールの全ての軌跡を除去するために重要である。
+70ml組織培養PBS。プラスチック製勾配シリンダーおよびビーカーを使
用する。 6.ポリリシン溶液にスライドを移し、そして15分−1時間、振蘯させる。 7.ddH2Oで充填した新たなチャンバーにラックを移行させる。5回上げ
下げして、洗浄する。
A 3’ 1b 5’ GCAGTCAGTC ACAGAAGGTG TTTCTG
A 3’ 2 5’Cy−GAAACACCTT CTGT 3’
列である。オリゴ2も、標識されたシアニンであり、そしてオリゴ1aおよび1
bの塩基11から24までに対する配列に相補的である。
lまでの脱イオン化蒸留水中で作成した。各機希釈の2つの二重1μlスポット
を、ガラス標的に載せ、そして空気で乾燥させた。ガラス標識を、処理して、以
下に記述される一般手段に続いて非特異的DNA結合を阻害する。
を空にさせる。 2.遮断溶液を作成する。325mlの1−メチル−2−ピロリジノン中に5
.5gの無水コハク酸を溶解させる。無水コハク酸を溶解させた直後に、25m
lホウ酸ナトリウムを加える。
注ぐ。スライドラックを溶液に数回突っ込む。軌道振蘯器で、15〜20分間混
合する。同時に、〜700ml水(スライドラックを覆うのに十分である)を、
2リットルのビーカー中で95℃まで加熱する。 4.2分間、スライドラックを95℃の水に穏やかに突っ込む。 5.95%エタノール中にスライドラックを5回突っ込む。
ゴ1aの付着を確認した。同じ配列の未標識オリゴ1bの付着が、推論される。
ルのオリゴ2)を、総量52μlで作成し、2分間沸騰させ、ガラス標的に載せ
、そして未処理ガラス標的で被覆した。ハイブリダイゼーションは、室温で3×
SSCを含む湿潤チャンバー中で8時間、進行させた。その後、標的を2×SS
Cで3回洗浄し、脱イオン化蒸留水で簡便に洗浄し、そして空気で乾燥させた。
固定化された未標識の相補的配列オリゴ1bへの標識オリゴ2の付着は、蛍光走
査によって確認された。
/μlから検出した。ハイブリダイゼーション後、結合オリゴ2の蛍光は、50
0ng/μlから1ng/μlまでの希釈の完全な範囲を越えて検出された。非
特異的バックグランド蛍光は、許容しうる。
ために、溶液実験を行った。9塩基のオリゴヌクレオチドは、タグ付けされてい
るか、またはいなかった。適合したオリゴヌクレオチドは、413.5単位の質
量タグを示し、そしてミスマッチオリゴヌクレオチドは、402単位の質量タグ
を示した。17塩基プライマーを、リゲーション処理を指示するのに使用した。
反応は、各9−merのオリゴヌクレオチドの組合せから構成された。テンプレ
ートとタグ付オリゴヌクレオチドの濃度は、120fモルであった一方で、17
塩基プライマーは、60fモルの濃度にあった。プライマーを、ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて32Pで放射性標識した。各反応液は、50単位のサーモム
スサモフィルス(Thermus thermophilus)DNAリガーゼ
を含み、そして37℃または46℃のいずれかで、4時間、インキュベートした
。反応液を、ホルムアミドでスポット付けし、そして生成物を、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって分析した。
分緩衝液中でのインキュベーションによって溶出させた。その後、DNAを精製
し、そしてマトリックスなしの質量分光光度計によって分析した。生じた413
.5の質量は、完全に相補的なオリゴヌクレオチドNのリゲーションに使用され
た質量タグに対応した。402質量単位で、オリゴヌクレオチドMのミスマッチ
配列に対応する検出可能なピークはなかった。これは、リゲーション配列が、最
近適合したオリゴヌクレオチドに非常に特異的であること、したがって、その手
段が、高い処理量の遺伝子型に適合性があることの確認がされる。
シシランでシラン化させた。その後、末端チオール官能基を、2,2’−ジピリ
ジルジスルフィドと反応させて、ピリジルジスルフィド結合を形成させた。末端
ホスホロチオエート基でその5’−末端に修飾した43−merのオリゴデオキ
シヌクレオチドを、修飾スライドに付着させた。
ルカプトプロピル)トリメトキシシランの溶液に漬けた。スライドを、乾燥トル
エン、続いてエタノールで洗浄した。スライドを、イソプロパノール中の2,2
’−ジピリジル・ジスルフィドの6.66g/lの溶液に連続して一夜漬けた。
最後に、スライドを、イソプロパノールで洗浄し、空気乾燥させた。
で作成した。
lエチレングリコールおよび40μlの水を添加した。
、室温で保持し、水、続いてイソプロパノールで洗浄し、そして乾燥させた。
}−5−トリフルオロアセトアミド−1−ヘキサノール(2)。周囲温度で、ピ
リジン(25ml)中のN−スクシンイミジル−4−[ビス−(フェニル)−ク
ロロメチル]−ベンゾエート(1)(0.8g、1.7ミリモル)の溶液を、固
形物として少量で添加された過剰の6−トリフルオロアセトアミド−1−ヘキサ
ノール(0.91g、4.25ミリモル)で処理した。得られる溶液を、窒素の
雰囲気下で、周囲温度で一夜攪拌した。その後、溶媒を真空下で除去して、光沢
のある黄色油状物として得た。フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー(5:
1 ジクロロメタン−酢酸エチル)は、白色発泡体として標記化合物をもたらし
た。収量=0.39g(35%)。δ(300MHz, CDCl3) 8.02(2H, d, アリール),
7.61(2H, d, アリール), 7.39-7.20(9H, m, アリール), 6.82(2H, d, アリール
), 6.27(1H, br, アミド), 3.78(3H, s, OCH3), 3.32(2H, m), 3.03(2H, m), 2.
87(4H, s, スクシミジル), 1.62-1.49(6H, m), 1.42-1.21(6H, m): IR(film) ν
3345, 1770, 1730, 1708 cm-1; MS(ES+) 644(M+H2O)+。
トリチル}−6−トリフルオロアセトアミド−1−ヘキサノール(3)を、上に
記述される手段を用いて、N−スクシンイミジル−4−[(4−メトキシジフェ
ニル)−クロロメチル]−ベンゾエート(4)(1.2g、2.5ミリモル)お
よび6−トリフルオロアセトアミド−1−ヘキサノール(1.33g、6.25
ミリモル)から製造した。収量=白色発泡体として1.02g(62%)。δH(
300MHz, CDCl3) 8.02(2H, d, アリール), 7.61(2H, d, アリール), 7.24(4H, d,
アリール), 6.81(4H, d, アリール), 6.26(1H, br, アミド), 3.78(6H, s, OCH 3 ×2), 3.32(2H, m), 3.02(2H, m), 2.86(4H, s, スクシンイミジル), 1.6-1.5(
7H, m), 1.36-1.21(5H, m); IR(film) ν 3400, 1770, 1740, 1708 cm-1: MS(ES
+) 697(M+MeCN)+。
6−トリフルオロアセトアミド−1−ヘキサノール(5)。アセトニトリル(5
ml)中のO1−{[4−(スクシンイミジルカルボキシ)]−4’−メトキシ
トリチル}−6−トリフルオロアセトアミド−1−ヘキサノール(0.39g、
0.63ミリモル)の溶液を、過剰の混ざりのないn−ブチルアミン(0.18
g、2.5ミリモル、0.25ml)で処理した。窒素の雰囲気下で、周囲温度
で一夜溶液を攪拌した。その後、溶媒を、真空下で除去し、そして残渣を、酢酸
エチルおよび水の間に分配した。有機層を分離し、Na2SO4上で乾燥させ、そ
して濾過した。濾液の濃縮で、継続して結晶化する透明な油状物を得た。収量=
0.35g(96%)。
2H, d, アリール), 7.27-7.20(5H, m, アリール), 6.4(1H, br, アミド), 6.13(
1H, br, アミド), 3.77(3H, s, OCH3), 3.41(2H, m), 3.29(2H, m), 3.02(2H, m
), 1.57-1.50(7H, m), 1.38-1.21(5H, m), 0.91(3H, t, CH 3(CH2)3N); IR(film)
ν 3303, 3083, 1707, 1637, 1543, 1508 cm-1。
チル}−6−トリフルオロアセトアミド−1−ヘキサノール(6)を、上に記述
される手段を用いて、O1−{[4−(スクシンイミジルカルボキシ)]−4’
,4”−ジメトキシトリチル}−6−トリフルオロアセトアミド−1−ヘキサノ
ール(0.6g、0.76ミリモル)およびブチルアミン(0.22g、3.0
ミリモル、0.3ml)から製造した。収量=透明な油状物として0.45g(
95%)。
1H, d, アリール), 7.34-7.27(3H, m, アリール), 7.13(2H, d, アリール), 6.7
9(4H, m, アリール), 6.36(1H, br, アミド), 6.05(1H, br, アミド), 3.77(6H,
s, OCH3×2), 3.63(1H, m), 3.46-3.28(6H, m), 1.55(7H, m), 1.37(4H, m), 0
.91(4H, m); IR(film) ν 3301, 3033, 1708, 1637, 1544, 1508 cm-1。 O1−{[4−(ブチルアミドカルボキシ)]−4’−メトキシトリチル}−
6−アミノ−1−ヘキサノール(7)。メタノール(5ml)中のO1−{[4
−(ブチルアミドカルボキシ)]−4’−メトキシトリチル}−6−トリフルオ
ロアセトアミド−1−ヘキサノール(0.35g、0.6ミリモル)の溶液を、
周囲温度で、0.88spgのアンモニア水溶液(1ml)で処理した。その溶
液を一夜攪拌し、そしてその後、溶媒を真空下で除去した。薄層クロマトグラフ
ィー(4:1 ジクロロメタン−酢酸エチル)による分析は、アミノ基(ニンヒ
ドリン)およびトリチル残基(アニスアルデヒド/酸)の存在について試験する
ときに、陽性の結果を示す新規で極性のある材料の存在を示した。粗材料は、さ
らなる精製なしに使用された。
チル}−6−アミノ−1−ヘキサノール(8)を、上に記述される手段を用いて
、O1−{[4−(ブチルアミドカルボキシ)]−4’,4”−ジメトキシトリ
チル}−6−トリフルオロアセトアミド−1−ヘキサノール(0.45g、0.
7ミリモル)およびアンモニア水溶液(1ml)から製造した。
6−スクシンアミド−1−ヘキサノール(9)。O1−{[4−(ブチルアミド
カルボキシ)]−4’−メトキシトリチル}−6−アミノ−1−ヘキサノール(
〜0.3ミリモル)を、周囲温度で、無水ピリジン(5ml)に溶解させた。そ
の後、無水コハク酸(0.07g、0.7ミリモル)を添加し、そして生じた溶
液を、2時間、周囲温度で攪拌させた。その後、溶媒を真空下で除去し、そして
残渣を、tlc(4:1 ジクロロメタン−酢酸エチル)によって分析した。新
しい材料を観察し(Rf0.3)、そしてそれは、トリチル残基(アニスアルデ
ヒド/酸)について試験したときに陽性を示したが、しかし、アミン(ニンヒド
リン)の存在について試験したときには陽性を示さなかった。粗生成物は、さら
に精製することなしに使用した。
チル}−6−スクシンアミド−1−ヘキサノール(10)を、上に記述される手
段を用いて、O1−{[4−(ブチルアミドカルボキシ)]−4’,4”−ジメ
トキシトリチル}−6−アミノ−1−ヘキサノール(〜0.35ミリモル)およ
び無水コハク酸(0.09g、0.9ミリモル)から製造した。生成物は、さら
なる精製なしに使用された。
メトキシトリチル}−6−スクシンアミド−1−ヘキサノエート(11)。アセ
トニトリル中のO1−{[4−(ブチルアミドカルボキシ)]−4’−メトキシ
トリチル}−6−スクシンアミド−1−ヘキサノールおよびO−(N−スクシン
イミジル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボ
レートの溶液を、周囲温度で攪拌しながら、N,N−(ジイソプロピル)エチル
アミンで処理した。2時間攪拌した後、溶媒を真空下で除去し、そして残渣を、
フラッシュカラムクロマトグラフィー(98:2 ジクロロメタン−メタノール
)に掛けた。部分的に精製された生成物を得て、その後、それは、分取薄層クロ
マトグラフィーを用い、そして9:1ジクロロメタン−メタノールで溶出して純
化させた。そのプレートを、十分に乾燥させ、その後、再度溶出させた。tlc
上のトリチル活性材料に対応するバンドを取り出し、9:1ジクロロメタン−メ
タノールで粉砕した。シリカを濾取し、そして濾液を真空下で濃縮させて、少量
の標記化合物を得た。収量=10mg。
2(2H, d, アリール), 7.33-7.23(5H, m, アリール), 7.1(1H, br, アミド), 6.8
6(2H, d, アリール), 6.6(1H, br, アミド), 3.75(3H, δ, OCH3), 3.34-3.27(2
H, m), 3.10(2H, m), 2.99(2H, m), 2.56(4H, s), 2.55-2.38(4H, m), 1.56-1.4
9(3H, m), 1.40-1.29(7H, m), 1.21(1H, m), 0.91(3H, t, CH 3(CH2)3N)。
4”−ジメトキシトリチル}−6−スクシンアミド−1−ヘキサノエート(12
)を、O1−{[4−(ブチルアミドカルボキシ)]−4’,4”−ジメトキシ
トリチル}−6−スクシンアミド−1−ヘキサノール(〜0.3ミリモル)、O
−(N−スクシンイミジル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウム・
テトラフルオロボレート(0.27g、0.91ミリモル)およびN,N−(ジ
イソプロピル)エチルアミン(0.24g、1.9ミリモル、0.33ml)か
ら製造された。生成物を不純で得た。収量=0.045g。
−ブチルアミンを添加することによって活性エステルの存在について試験した。
反応液を、tlc(9:1ジクロロメタン−メタノール)によって実験し、そし
て両方の場合に、出発材料をよりいっそう極性を示す生成物に完全に変換するこ
とを示した。アミノヌクレオチド誘導体との活性化エステルの反応は、類似のア
ミド結合生成物の形成を生じることが予想されえた。
ヘキシルカルボジイミド(154mg、0.75ミリモル)、4−N−ジメチル
アミノピリジン(21mg、0.17ミリモル)およびN−ヒドロキシスクシン
イミド(86mg、0.75ミリモル)を乾燥ジオキサン(5ml)に溶解させ
た。反応混合液を、室温で、一夜攪拌させた。ジシクロヘキシルウレアを濾取し
、そして濾液を乾固するまで蒸散させ、そしてフラッシュ・クロマトグラフィー
(2%メタノール/ジクロロメタンまでのジクロロメタンの濃度勾配)によって
精製した。光沢のある黄色発泡体を単離した(270mg、98%)。
ミド), 2.53(t, 2H, NH-CH 2), 2.06(t, 2H, COCH 2), 1.86-1.16(m, 6H, 3×CH2)
。 Mass spectrum(Electrospray, +ve mode) 471.53[M+H]+, 243.28[トリチル]+
。
デオキシウリジン−5’−トリホスフェート
5’−トリホスフェート(500μlの炭酸緩衝液(pH8.5)中で2.5m
g)を、マイクロスターラー棒を有するエフェンドルフに注入した。アセトニト
リルを添加(125μl)し、その後6−N−トリチルアミノスクシンイミジル
ヘキサノエート(45μlアセトニトリル中6mg)を添加し、続いてさらにア
セトニトリル(45μl)を添加した。反応混合液が、最初に濁り、その後さら
に攪拌で透明になる室温で、溶液を攪拌させた。5時間の攪拌の後、反応混合液
を、濃縮ゾーンを有するシリカ分取プレート(5:4:1プロパン−2−オール
:アンモニア:水)上で精製した。生成物を含むシリカをプレート上から擦り取
り、そして同じ溶出系で抽出し、蒸散し、50:50アセトニトリル:水に再溶
解させ、そして生綿栓を通して濾過させた。溶液を、微細な白色粉末になるまで
蒸散させた。精製の後のTLCでは、生成物が、出発トリホスフェートより高い
流出量であり、そしてアニスアルデヒドで強力に加熱するときに茶色に染まる(
糖の指標である)ことが示された。
]+. (- ve mode) 990.35[M-H]-, 910.18[M-H2PO3]-。
tpの接合体は、ポリメラーゼによる取込みのための基質として文献に報告され
た。
オチドを固定した相補的DNA配列に結合させるシステムが、記述される。その
システムは、酵素的成分としてTthDNAリガーゼを使用し、そしてそれは、
ハイブリッド形成「プローブ」オリゴ上へのDMT修飾オリゴ(「レポーター」
配列)のリゲーションを触媒する。溶液に使用されるプローブオリゴは、全ての
操作および検出を通して固形支持体に付着されたままである繋がれた「テンプレ
ート」オリゴへのハイブリダイゼーションによって起源を探り出される。プロー
ブまたはレポーターオリゴのいずれでもないハイブリダイゼーションは、それら
の長さが短いので上昇した温度で起こるが、一貫して高いTmを示す結合生成物
は、洗浄温度が上がったときに保有される。リゲーションの成功は、固定された
テンプレート上の対応の塩基に対するレポーターでの3’塩基の正しいミスマッ
チ検出による。Tthリガーゼは、この位置でミスマッチ塩基の存在下で反応を
触媒しない。
に特異的に付着された。末端5’アミノ基を有するオリゴは、イソチオシアネー
トとエポキシド誘導ガラスの接合体に使用された一方で、チオール修飾オリゴは
、メルカプトプロピルシランおよびピリジルジスルフィド法を用いて固定された
。この後者の方法は、この報告で記述された実験の主題である。 ハイブリダイゼーション実験 以下のオリゴ配列が使用された。
TTCTGAGACC 3’(鋳型) TCAGTCAGTGTCTTCCACA
AAGAC*(質量タグを有するレポーター) (プローブ)
示し、両方を、22℃の実験温度でアニールさせた。高温での連続洗浄は、15
−merのプローブについてチャート図1で例示される、アニールされたプライ
マーの量を減少させ、そして最大の減少は、オリゴのTmの領域で生じる。この
パターンは、分析されたオリゴの両方の濃度(8および6μM)に一致する。こ
れは、ハイブリダイゼーションが、高濃度のテンプレートについて生じる優れた
シグナル対ノイズ比を示す、プローブとテンプレートとの間の相互作用の一次態
様であることを示す。
の減少が示される。低いテンプレート濃度で、ハイブリダイゼーション強度が一
致しないようなピリジルジスルフィド付着化学で考慮すべき変化がある。
よび質量スペクトロメトリーによる検出の表示を計数する。
の緊縮洗浄が増加した影響(条件 1×Tthリゲーション緩衝液、0.1%S
DS)
、付着テンプレート濃度に比例する。(1×Tthリゲーション緩衝液中でのサ
ンプル洗浄、22℃で0.1%SDS)。
質量タグを利用したコーディング法の図である。
ルをベースとした質量タグを利用したコーディング法の図である。
ある。
法を示す図である。
法を示す図である。
Claims (58)
- 【請求項1】 担体及び標識のセットを用いることにより、標識化合物のセ
ットを製造する方法において、前記方法が、次の工程: a)少なくとも1の、第1又は中間工程であって、前記担体を複数個のロット
に分割し、前記担体の各々のロットに対して異なる化学反応を行い、前記担体の
当該ロットを修飾するか又は前記担体の当該ロットに化学残基を結合させ、前記
担体の各々のロットの画分を異なる標識によりタグ付けし、及び前記担体の前記
ロットを組み合わせることを含む工程、並びに b)少なくとも1の、中間又は最終工程であって、前記担体を複数個のロット
に分割し、前記担体の各々のロットに異なる化学反応を行い、前記担体の当該ロ
ットを修飾するか又は前記担体の当該ロットに化学残基を結合させ、前記担体の
各々のロットの画分を異なる標識によりタグ付けすることにより、異なる工程で
前記担体に結合した化学残基に各々の異なる標識が結合し、当該化学残基ととも
に、前記担体から分離し得る標識化合物を形成し、及び前記担体の前記ロットを
組み合わせることを含む工程 を含む方法。 - 【請求項2】 前記担体が、粒子状固形担体である請求項1の方法。
- 【請求項3】 工程b)を行い、前記担体に予め結合した化学残基に対して
、前記化学残基を結合させる請求項1又は2の方法。 - 【請求項4】 前記化学残基がモノマー単位であり、前記標識化合物がオリ
ゴマーである請求項3の方法。 - 【請求項5】 前記標識化合物のセットが、nsオリゴマーのライブラリー
であり(式中、nは、異なるモノマー単位の数であり、sは、各々の標識された
オリゴマーにおけるモノマー単位の数である。)、工程a)を1回行い、異なる
モノマーユニットを前記担体の各々のロットに結合させ、及び工程b)をs−1
回行う、請求項4の方法。 - 【請求項6】 前記標識化合物のセットが、n×s個の異なる標識を有する
請求項5の方法。 - 【請求項7】 前記標識化合物の各々が、単一の標識及び少なくとも1つの
化学残基を有する請求項1ないし6のいずれか1項の方法。 - 【請求項8】 前記担体が、前記標識化合物を溶液中に放出するように処理
される請求項1ないし7の何れか1項の方法。 - 【請求項9】 前記担体の各々のロットの0.25%〜25%が、各々の工
程で、異なる標識によりタグ付けされる請求項1ないし8の何れか1項の方法。 - 【請求項10】 前記担体が、解裂し得るリンカーを有し、各々の解裂し得
るリンカーが、化学合成のための基を少なくとも1つ及び標識のための別の基を
1つ有する請求項1ないし9の何れか1項の方法。 - 【請求項11】 前記標識が、解裂し、質量分析法のための荷電種を提供し
得る結合により連結される請求項1ないし10の何れか1項の方法。 - 【請求項12】 前記各々の標識が、式R1R2R3C−(式中、R1、R2及
びR3は、同じでも異なっていてもよく、置換又は無置換の、単環又は縮合環芳
香族基である。)の基である請求項1ないし11の何れか1項の基。 - 【請求項13】 R1、R2及びR3の少なくとも1つが、無置換又はカルボ
ン酸、スルホン酸、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、第1級、第2級
若しくは第3級アミノ、第1級若しくは第2級アミド、無水物、ハロゲン化カル
ボニル、又は活性エステルにより置換された、C1〜C20アルコキシ又はヒドロ
カルビルから選択される置換基を有する請求項12の方法。 - 【請求項14】 前記標識化合物が、標識されたオリゴヌクレオチドである
請求項1ないし13の何れか1項の方法。 - 【請求項15】 標識化合物のセットにおいて、前記セットの化合物の分子
が、当該分子の成分の性質及び/又は位置を同定する単一の標識によりタグ付け
され、並びに同じ化合物の異なる分子が、異なる標識によりタグ付けされるセッ
ト。 - 【請求項16】 前記標識される化合物が、固体担体に、放出し得るように
固定されている請求項15のセット。 - 【請求項17】 前記固体担体が、粒子である請求項16のセット。
- 【請求項18】 前記標識化合物が、溶液中で混合される請求項15のセッ
ト。 - 【請求項19】 前記標識が、質量分析法のための荷電種を提供するように
解裂し得る結合により連結される請求項15ないし18の何れか1項のセット。 - 【請求項20】 各々の標識が、式R1R2R3C−(式中、R1、R2及びR3 は、同じでも異なっていてもよく、置換又は無置換の、単環又は縮合環芳香族基
である。)の基である請求項15ないし19の何れか1項のセット。 - 【請求項21】 R1、R2及びR3の少なくとも1つが、無置換又はカルボ
ン酸、スルホン酸、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、第1級、第2級
若しくは第3級アミノ、第1級若しくは第2級アミド、無水物、ハロゲン化カル
ボニル、又は活性エステルにより置換された、C1〜C20アルコキシ又はヒドロ
カルビルから選択される置換基を有する請求項20のセット。 - 【請求項22】 前記標識化合物が、標識されたオリゴヌクレオチドである
請求項15ないし21の何れか1項のセット。 - 【請求項23】 請求項19ないし22の何れか1項のセット複数個からな
るライブラリー。 - 【請求項24】 オリゴマーの分子をその表面上に担持する固体担体を含み
、異なるオリゴマー分子が、同じ配列を有する試薬において、前記オリゴマー分
子が、いくつかのより短いオリゴマー分子を含み、前記より短いオリゴマー分子
が、前記オリゴマーのモノマー単位の性質及び位置を同定する標識を含む試薬。 - 【請求項25】 前記固体担体が、ビーズである請求項24の試薬。
- 【請求項26】 前記標識が、質量分析法のための荷電種を提供するように
光解裂し得る結合により連結される請求項24又は25の試薬。 - 【請求項27】 各々の標識が、式R1R2R3C−(式中、R1、R2及びR3 は、同じでも異なっていてもよく、置換又は無置換の、単環又は縮合環芳香族基
である。)の基である請求項24ないし26の何れか1項の試薬。 - 【請求項28】 R1、R2及びR3の少なくとも1つが、無置換又はカルボ
ン酸、スルホン酸、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、第1級、第2級
若しくは第3級アミノ、第1級若しくは第2級アミド、無水物、ハロゲン化カル
ボニル、又は活性エステルにより置換された、C1〜C20アルコキシ又はヒドロ
カルビルから選択される置換基を有する請求項24ないし27の何れか1項の試
薬。 - 【請求項29】 前記オリゴマーが、オリゴヌクレオチドである請求項24
ないし28の何れか1項の試薬。 - 【請求項30】 請求項24ないし29の何れか1項の試薬複数種からなる
ライブラリー。 - 【請求項31】 標識されたオリゴヌクレオチド又は核酸を提供し、質量分
析法に供される荷電種を提供するように解裂することにより、前記標識を除去す
ることを含む方法。 - 【請求項32】 請求項31の方法であって、標識されたプライマー及び/
又は標識されたハイブリダイゼーションプローブ及び/又は標識された鎖伸長ヌ
クレオチド及び/又は標識された鎖停止ヌクレオチド類縁体の使用により、核酸
配列決定が行われ、前記標識が、質量分析法に供される荷電種を提供するように
解裂することにより除去されるものである方法。 - 【請求項33】 標識されたプローブを、その一方が決定された2つの画分
に区分するアッセイ方法において、前記プローブが、質量分析法に供される荷電
種を提供するように解裂し得る結合により標識に連結したリガンドを含むもので
あるアッセイ方法。 - 【請求項34】 前記リガントが、オリゴヌクレオチドである請求項33の
方法。 - 【請求項35】 前記標識が、式R1R2R3C−(式中、R1、R2及びR3は
、同じでも異なっていてもよく、置換又は無置換の、単環又は縮合環芳香族基で
ある。)の基である請求項31ないし34の何れか1項の方法。 - 【請求項36】 R1、R2及びR3の少なくとも1つが、無置換又はカルボ
ン酸、スルホン酸、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、第1級、第2級
若しくは第3級アミノ、第1級若しくは第2級アミド、無水物、ハロゲン化カル
ボニル、又は活性エステルにより置換された、C1〜C20アルコキシ又はヒドロ
カルビルから選択される置換基を有する請求項35の方法。 - 【請求項37】 質量分析法による分析のための荷電種を提供するように解
裂し得る結合により標識に連結されたリガンドを各々含むプローブのライブラリ
ーにおいて、各々の異なるプローブが、異なる標識を有するライブラリー。 - 【請求項38】 前記リガントが、オリゴヌクレオチドである請求項37の
ライブラリー。 - 【請求項39】 各々の標識が、式R1R2R3C−(式中、R1、R2及びR3 は、同じでも異なっていてもよく、置換又は無置換の、単環又は縮合環芳香族基
である。)の基である請求項37又は38のライブラリー。 - 【請求項40】 R1、R2及びR3の少なくとも1つが、無置換又はカルボ
ン酸、スルホン酸、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、第1級、第2級
若しくは第3級アミノ、第1級若しくは第2級アミド、無水物、ハロゲン化カル
ボニル、又は活性エステルにより置換された、C1〜C20アルコキシ又はヒドロ
カルビルから選択される置換基を有する請求項39のライブラリー。 - 【請求項41】 式R1R2R3CY(式中、Yは、求核種との反応のための
離脱基であり、R1、R2及びR3は、同じでも異なっていてもよく、各々、単環
又は縮合環芳香族基であり、その少なくとも1つが、無置換又はカルボン酸、ス
ルホン酸、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、第1級、第2級若しくは
第3級アミノ、第1級若しくは第2級アミド、無水物、ハロゲン化カルボニル、
又は活性エステルにより置換された、C1〜C20アルコキシ又はヒドロカルビル
から選択される置換基を有する。但し、R1、R2及びR3は、一緒に、少なくと
も2つのアミド基及び/又は少なくとも2つのN−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル基を有する。)の化合物 - 【請求項42】 R1R2R3C−が、置換モノメトキシトリチル基である請
求項12、13、35及び38の何れか1項の方法。 - 【請求項43】 R1R2R3C−が、置換モノメトキシトリチル基である請
求項20もしくは21のセット、請求項27もしくは28の試薬、又は請求項4
1もしくは42のライブラリー。 - 【請求項44】 R1R2R3CYが、置換モノメトキシトリチル化合物であ
る請求項41の化合物。 - 【請求項45】 レーザー脱離イオン化質量分析のための標的としての使用
のためのインサートにおいて、前記インサートが、分析に供する不動化化合物を
担持するガラス又は有機ポリマーの標的表面を有するインサート。 - 【請求項46】 前記標的化合物が、式R1R2R3C−(式中、R1、R2及
びR3は、同じでも異なっていてもよく、各々、置換又は無置換の、単環又は縮
合環芳香族基である。)の基を有する請求項45のインサート。 - 【請求項47】 R1、R2及びR3の少なくとも1つが、無置換又はカルボ
ン酸、スルホン酸、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、第1級、第2級
若しくは第3級アミノ、第1級若しくは第2級アミド、無水物、ハロゲン化カル
ボニル、又は活性エステルにより置換された、C1〜C20アルコキシ又はヒドロ
カルビルから選択される置換基を有する請求項46のインサート。 - 【請求項48】 R1R2R3C−が、置換モノメトキシトリチル基である請
求項46又は47のインサート。 - 【請求項49】 前記標的表面が、分析に供する不動化化合物の列を担持す
る請求項45ないし48の何れか1項のインサート。 - 【請求項50】 前記化合物が、エポキシシラン化学又はイソチオシアネー
ト化学又はメルカプトシラン化学又はポリリジンにより、ガラスの標的表面上に
不動化される請求項45ないし49の何れか1項のインサート。 - 【請求項51】 質量分析器、及びガラス又は有機ポリマーの標的表面を有
する、レーザー脱離イオン化質量分析のためのターゲットとして使用するインサ
ートの供給を具備するキット。 - 【請求項52】 核酸を分析するためのシステムであって、 ・分析のための標的として又は標的を捕獲するためのプローブとして作用する
核酸の列を担持する固体担体; ・質量分析法による分析に好適な残基によりタグ付けされたオリゴヌクレオチ
ド試薬; ・前記タグ付けされたオリゴヌクレオチドと前記標的との間の特異的相互作用
を可能にする生化学的方法のための試薬及び装置; ・試料を質量分析器内に導入する手段; ・質量分析器 を備えるシステム。 - 【請求項53】 固体担体上の核酸を分析するためのシステムであって、 ・分析のための標的として又は標的を捕獲するためのプローブとして作用する
核酸の列を担持する固体担体; ・質量分析法による分析に好適な残基によりタグ付けされたオリゴヌクレオチ
ド試薬; ・前記固体担体表面上で行われる、前記タグ付けされたオリゴヌクレオチドと
前記標的との間の特異的相互作用を可能にする生化学的方法のための試薬及び装
置; ・前記固体担体を質量分析器内に導入する手段; ・質量分析器 を備えるシステム。 - 【請求項54】 核酸を分析するための自動化システムであって、 ・質量分析法による分析に好適な残基によりタグ付けされたオリゴヌクレオチ
ド試薬; ・質量分析器; ・分析を行うためのコンピューター; マススペクトラムを翻訳するためのソフトウエアー を備えるシステム。 - 【請求項55】 質量分析による分析に好適なタグにより標識されたヌクレ
オチド又はオリゴヌクレオチドであって、前記標識されたヌクレオチド又はオリ
ゴヌクレオチドが、酵素取り込みに好適なものにおいて、前記タグが、式R1R2 R3CY(式中、Yは、求核種との反応のための離脱基であり、R1、R2及びR3 は、同じでも異なっていてもよく、各々、単環又は縮合環芳香族基であり、その
少なくとも1つが、無置換又はカルボン酸、スルホン酸、ニトロ、シアノ、ヒド
ロキシル、チオール、第1級、第2級若しくは第3級アミノ、第1級若しくは第
2級アミド、無水物、ハロゲン化カルボニル、又は活性エステルにより置換され
た、C1〜C20アルコキシ又はヒドロカルビルから選択される置換基を有する。
)。の化合物であるヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド。 - 【請求項56】 4s個の異なる標識が用いられる請求項31ないし36の
何れか1項の方法において、前記標識されたオリゴヌクレオチド又は核酸が塩基
を含有し、各々の標識が、標識されたオリゴヌクレオチド又は核酸のヌクレオチ
ド残基の位置及びアイデンティティーを示すものである方法。 - 【請求項57】 前記標識されたオリゴヌクレオチド又は核酸の塩基位置の
ために、4つの可能性のある標識(それらの同位体変形も含む)の質量に対応す
るマススペクトラムの4つの領域を検査し、前記標識の期待されるマススペクト
ラムと比較する請求項56の方法。 - 【請求項58】 s個の塩基を有する可能性のあるオリゴヌクレオチド又は
核酸を、s個の異なるタグ領域を含むマススペクトラムに対して順に比較し、最
も適合するオリゴヌクレオチドを同定する請求項31ないし36の何れか1項の
方法。
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