JP2002513768A - Ｇｄｆ−８の阻害による糖尿病の処置法 - Google Patents
Ｇｄｆ−８の阻害による糖尿病の処置法Info
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Abstract
(57)【要約】
GDF-8のインヒビター、または構造的に関連する増殖因子のトランスフォーミング増殖因子−ベータ（TGF-β）スーパーファミリーの関連する員（例えばGDF-11）を投与することによる糖尿病の処置法を開示する。また個体にGDF-8インヒビターを投与することにより、GLUT4およびGLUT1のようなヘキソーストランスポーターの発現をアップレギュレートする方法も開示する。GDF-8のインヒビターを投与することにより個体中の細胞によるグルコースの取り込みを増加させる方法も開示する。
Description
【０００１】 （技術分野）発明の背景 真性糖尿病は世界中で最も一般的な代謝性疾患である。米国では毎日、1700の
新たな糖尿病の例が診断され、そして少なくとも糖尿病に罹っている1600万のア
メリカ人の１／３はそれに気づいていない。糖尿病は成人では失明、腎不全およ
び下肢切断の原因を生じ、そして心臓血管疾患および発作の主要な危険因子であ
る。
新たな糖尿病の例が診断され、そして少なくとも糖尿病に罹っている1600万のア
メリカ人の１／３はそれに気づいていない。糖尿病は成人では失明、腎不全およ
び下肢切断の原因を生じ、そして心臓血管疾患および発作の主要な危険因子であ
る。
【０００２】 正常なグルコースの恒常性には、グルカゴンのような対抗調節ホルモンの分泌
で微妙にバランスがとられている血中グルコースレベルのわずかな変化に反応し
て、膵臓のベータ細胞によるインスリン分泌の細かく調整された調和が必要であ
る。１型糖尿病は、インスリンの欠乏を引き起こす膵臓ベータ細胞の自己免疫破
壊によりもたらされる。２型または非インスリン依存的真性糖尿病は（NIDDM）
は症例の90％以上を占め、そして（１）末梢組織、特に骨格筋および脂肪細胞に
おけるグルコースの取り込みに及ぼすインスリン作用に対する耐性、（２）肝臓
のグルコースの生産を抑制する低下したインスリン作用、および（３）調節され
ていないインスリンの分泌の３つの組合わせが特徴である（DeFronzo,(1997) Di
abetes Rev.5:177-269)。ほとんどの場合、２型糖尿病は複雑な遺伝パターンを
持つポリジーン遺伝性疾患である（Kahn et al.,(1996)Annu.Rev.Med.47:509-53
1を参照されたい)。
で微妙にバランスがとられている血中グルコースレベルのわずかな変化に反応し
て、膵臓のベータ細胞によるインスリン分泌の細かく調整された調和が必要であ
る。１型糖尿病は、インスリンの欠乏を引き起こす膵臓ベータ細胞の自己免疫破
壊によりもたらされる。２型または非インスリン依存的真性糖尿病は（NIDDM）
は症例の90％以上を占め、そして（１）末梢組織、特に骨格筋および脂肪細胞に
おけるグルコースの取り込みに及ぼすインスリン作用に対する耐性、（２）肝臓
のグルコースの生産を抑制する低下したインスリン作用、および（３）調節され
ていないインスリンの分泌の３つの組合わせが特徴である（DeFronzo,(1997) Di
abetes Rev.5:177-269)。ほとんどの場合、２型糖尿病は複雑な遺伝パターンを
持つポリジーン遺伝性疾患である（Kahn et al.,(1996)Annu.Rev.Med.47:509-53
1を参照されたい)。
【０００３】 環境的因子、特に食事、運動および加齢は、罹患率に影響を与える遺伝的素因
と関係する。インスリン耐性およびインスリン分泌欠乏の両方に対する感受性は
、遺伝的に決定されるようである（Kahn et al.）。インスリン作用の欠乏は表
立った疾患に先立ち、そして糖尿病個体の非糖尿病の親戚に見られる。徹底的な
調査にもかかわらず、２型糖尿病に共通する状態の原因である遺伝子は未知であ
る。
と関係する。インスリン耐性およびインスリン分泌欠乏の両方に対する感受性は
、遺伝的に決定されるようである（Kahn et al.）。インスリン作用の欠乏は表
立った疾患に先立ち、そして糖尿病個体の非糖尿病の親戚に見られる。徹底的な
調査にもかかわらず、２型糖尿病に共通する状態の原因である遺伝子は未知であ
る。
【０００４】 インスリンの１つの基本的な作用は、血中から組織、特に筋肉および脂肪への
グルコースの取り込みを刺激することである。これは細胞の形質膜に挿入する特
異的なグルコーストランスポータータンパク質により媒介される促進された拡散
により起こる。GLUT4はこのような組織中で最も重要なインスリン−感受性グル
コーストランスポーターである。インスリンはそのレセプターに形質膜中で結合
し、GLUT4トランスポーター小胞の形質膜への転位（translocation）または移動
をもたらす一連のシグナルを発信し、ここで第１のドッキング段階、続いて形質
膜との融合が起こり；活性化または暴露段階が起こった後、グルコースは細胞に
入る。動物およびヒトを対象とした研究では、糖尿病および他のインスリン−耐
性状態でGLUT4発現、転送および／または活性の変化が脂肪細胞および筋肉中で
起こることが示唆されている（Abel et al.,真性糖尿病：基本および臨床テキス
ト(Diabet Mellitus:A Fundamental and Clinical Text)(1996)、第530〜543頁
）。
グルコースの取り込みを刺激することである。これは細胞の形質膜に挿入する特
異的なグルコーストランスポータータンパク質により媒介される促進された拡散
により起こる。GLUT4はこのような組織中で最も重要なインスリン−感受性グル
コーストランスポーターである。インスリンはそのレセプターに形質膜中で結合
し、GLUT4トランスポーター小胞の形質膜への転位（translocation）または移動
をもたらす一連のシグナルを発信し、ここで第１のドッキング段階、続いて形質
膜との融合が起こり；活性化または暴露段階が起こった後、グルコースは細胞に
入る。動物およびヒトを対象とした研究では、糖尿病および他のインスリン−耐
性状態でGLUT4発現、転送および／または活性の変化が脂肪細胞および筋肉中で
起こることが示唆されている（Abel et al.,真性糖尿病：基本および臨床テキス
ト(Diabet Mellitus:A Fundamental and Clinical Text)(1996)、第530〜543頁
）。
【０００５】 この分野において新しく、しかも革新的な糖尿病の処置法は研究者にとって明
らかに最優先とされるだろう。本発明はGLUT4発現および活性、および関連する
ヘキソーストランスポーター（例えばGLUT1）の発現および活性に関する知識を
利用して、そのような革新的処置を提供する。発明の要約 本発明は、個体にGDF-8のインヒビターを投与することにより、糖尿病および
肥満症のような関連疾患を処置する方法を提供する。本発明の方法に使用するこ
とができる適当なGDF-8のインヒビターは、限定するわけではないがGDF-8ペプチ
ド（例えばプロ−ドメインに由来する）、GDF-8優性−ネガティブ変異体、GDF-8
（またはGDF-8のレセプター）に結合し、そしてGDF-8がそのレセプターに結合す
るのを阻害する抗体および抗体フラグメント、GDF-8レセプターペプチドアンタ
ゴニスト、GDF-8 mRNAに対するアンチセンス核酸および抗GDF-8リボザイムを含
む。
らかに最優先とされるだろう。本発明はGLUT4発現および活性、および関連する
ヘキソーストランスポーター（例えばGLUT1）の発現および活性に関する知識を
利用して、そのような革新的処置を提供する。発明の要約 本発明は、個体にGDF-8のインヒビターを投与することにより、糖尿病および
肥満症のような関連疾患を処置する方法を提供する。本発明の方法に使用するこ
とができる適当なGDF-8のインヒビターは、限定するわけではないがGDF-8ペプチ
ド（例えばプロ−ドメインに由来する）、GDF-8優性−ネガティブ変異体、GDF-8
（またはGDF-8のレセプター）に結合し、そしてGDF-8がそのレセプターに結合す
るのを阻害する抗体および抗体フラグメント、GDF-8レセプターペプチドアンタ
ゴニスト、GDF-8 mRNAに対するアンチセンス核酸および抗GDF-8リボザイムを含
む。
【０００６】 別の観点では、本発明はGDF-8インヒビターを投与することより、細胞（例え
ば個体の筋肉細胞または脂肪細胞）中のGLUT4発現の増加法、あるいは細胞によ
るグルコース取り込みの増加法を提供する。そのような方法は糖尿病および関連
疾患を処置するだけでなく、高血糖症のような不十分なグルコース代謝から生じ
る幾つかの全身的問題を処置するためにも使用することができる。
ば個体の筋肉細胞または脂肪細胞）中のGLUT4発現の増加法、あるいは細胞によ
るグルコース取り込みの増加法を提供する。そのような方法は糖尿病および関連
疾患を処置するだけでなく、高血糖症のような不十分なグルコース代謝から生じ
る幾つかの全身的問題を処置するためにも使用することができる。
【０００７】 本発明の方法は、標的としてGDF-11のようなGDF-8に構造および活性が関連す
る他のTGF-β増殖因子を使用して行うこともできる。したがって別の態様では、
本発明は個体にGDF-11のインヒビターを単独または他のGDFインヒビター（例え
ばGDF-8インヒビター）と組み合わせて投与することにより、糖尿病を処置する
方法を提供する。発明の詳細な説明 本発明は部分的には、GDF-8が組織、主に筋肉および脂肪中のGLUT4の発現をダ
ウンレギュレートするという知見に基づいている。インスリンによるグルコース
代謝の調節は重要なメカニズムであり、これにより動物では恒常性が維持されて
いる。循環しているグルコースレベルの調節におけるインスリンの作用は、筋肉
および脂肪組織中にグルコースの取り込みを刺激することである。インスリンは
このような組織中へのグルコースの取り込みを、GLUT4（インスリン−感受性グ
ルコーストランスポーター）の転位を細胞内小胞から形質膜へ増加させることに
より刺激する。
る他のTGF-β増殖因子を使用して行うこともできる。したがって別の態様では、
本発明は個体にGDF-11のインヒビターを単独または他のGDFインヒビター（例え
ばGDF-8インヒビター）と組み合わせて投与することにより、糖尿病を処置する
方法を提供する。発明の詳細な説明 本発明は部分的には、GDF-8が組織、主に筋肉および脂肪中のGLUT4の発現をダ
ウンレギュレートするという知見に基づいている。インスリンによるグルコース
代謝の調節は重要なメカニズムであり、これにより動物では恒常性が維持されて
いる。循環しているグルコースレベルの調節におけるインスリンの作用は、筋肉
および脂肪組織中にグルコースの取り込みを刺激することである。インスリンは
このような組織中へのグルコースの取り込みを、GLUT4（インスリン−感受性グ
ルコーストランスポーター）の転位を細胞内小胞から形質膜へ増加させることに
より刺激する。
【０００８】 さらに本発明の一部として、筋肉および脂肪細胞中のGLUT4発現はGDF-8を阻害
することによりアップレギレートできることが見いだされた。このような細胞に
よるグルコースの取り込みは、GDF-8を阻害することにより増すことができるこ
とも見いだされた。このような効果を、グルコース代謝の機能不全（例えば高血
糖症）および／またはインスリン耐性から生じる種々の代謝性疾患を処置するた
めに有利に利用することができる。
することによりアップレギレートできることが見いだされた。このような細胞に
よるグルコースの取り込みは、GDF-8を阻害することにより増すことができるこ
とも見いだされた。このような効果を、グルコース代謝の機能不全（例えば高血
糖症）および／またはインスリン耐性から生じる種々の代謝性疾患を処置するた
めに有利に利用することができる。
【０００９】 したがって１つの態様では、本発明は疾患の症状を緩和するために十分な量で
GDF-8インヒビターを個体に投与することにより、真性糖尿病および肥満症また
は高血糖症のような関連疾患を処置する方法を提供する。２型または非インスリ
ン−依存的真性糖尿病（NIDDM）は、特に（１）末梢組織、特に骨格筋および脂
肪細胞におけるグルコースの取り込みに及ぼすインスリン作用に対する耐性、（
２）肝臓のグルコースの生産を抑制する低下したインスリン作用、および（３）
調節されていないインスリンの分泌の３つの組合わせに特徴がある（DeFronzo,(
1997) Diabetes Rev.5:177-269)。したがって２型糖尿病に罹っている個体は、G
DF-8インヒビターを投与することにより本発明に従い処置することができ、この
方法はインスリンに対する感受性および細胞によるグルコースの取り込みを上昇
させる。
GDF-8インヒビターを個体に投与することにより、真性糖尿病および肥満症また
は高血糖症のような関連疾患を処置する方法を提供する。２型または非インスリ
ン−依存的真性糖尿病（NIDDM）は、特に（１）末梢組織、特に骨格筋および脂
肪細胞におけるグルコースの取り込みに及ぼすインスリン作用に対する耐性、（
２）肝臓のグルコースの生産を抑制する低下したインスリン作用、および（３）
調節されていないインスリンの分泌の３つの組合わせに特徴がある（DeFronzo,(
1997) Diabetes Rev.5:177-269)。したがって２型糖尿病に罹っている個体は、G
DF-8インヒビターを投与することにより本発明に従い処置することができ、この
方法はインスリンに対する感受性および細胞によるグルコースの取り込みを上昇
させる。
【００１０】 同様に、インスリンの機能不全（例えば耐性、不活性または欠乏）および／ま
たは細胞への不十分なグルコース輸送が特徴である他の疾患も、GDF-8インヒビ
ターを投与することにより本発明に従い処置することができ、この方法はインス
リンに対する感受性および細胞によるグルコースの取り込みを上昇させる。定義 本明細書で使用するように「GDF-8インヒビター」または「GDF-8のインヒビタ
ー」という用語は、GDF-8活性を阻害することができる任意の作用物質を含み、
それには限定するわけではないがペプチド（GDF-8、GDF-11または他の非関連配
列に由来する）、優性−ネガティブタンパク質変異体、ペプチド模造物、抗体ま
たはそれらの抗体フラグメント、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド
、あるいはGDF-8の活性を特異的に阻害するが、好ましくはTGF-β活性は完全な
ままである他の小分子、アクチビンまたはTGF-βスーパーファミリーの他の員を
含む。用語「GDF-11インヒビター」もこのような種類のインヒビターを包含し、
そして好ましくは特異的にGDF-11を阻害する。GDF-8およびGDF-11は構造的およ
び機能的に関連する増殖因子のTGF-βファミリーの員である。
たは細胞への不十分なグルコース輸送が特徴である他の疾患も、GDF-8インヒビ
ターを投与することにより本発明に従い処置することができ、この方法はインス
リンに対する感受性および細胞によるグルコースの取り込みを上昇させる。定義 本明細書で使用するように「GDF-8インヒビター」または「GDF-8のインヒビタ
ー」という用語は、GDF-8活性を阻害することができる任意の作用物質を含み、
それには限定するわけではないがペプチド（GDF-8、GDF-11または他の非関連配
列に由来する）、優性−ネガティブタンパク質変異体、ペプチド模造物、抗体ま
たはそれらの抗体フラグメント、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド
、あるいはGDF-8の活性を特異的に阻害するが、好ましくはTGF-β活性は完全な
ままである他の小分子、アクチビンまたはTGF-βスーパーファミリーの他の員を
含む。用語「GDF-11インヒビター」もこのような種類のインヒビターを包含し、
そして好ましくは特異的にGDF-11を阻害する。GDF-8およびGDF-11は構造的およ
び機能的に関連する増殖因子のTGF-βファミリーの員である。
【００１１】 本発明の方法に使用するGDF-8インヒビター、特にGDF-8自体に由来するもの（
例えばGDF-8ペプチド、それらのプロドメインまたは部分のような）は、好まし
くはGDF-8活性を保有しない。そのようなインヒビターおよびそれらを同定する
ための方法は、「増殖分化因子インヒビターおよびそれらの使用（Growth Diffe
rentiation Factor Inhibitor and Uses Therefor)」という表題の米国特許出願
第60/116,639号明細書に記載されており、これは引用により全部、本明細書に編
入する。例えばGDF-8インヒビターの阻害作用は、GDF-8 mRNAのノーザンブロッ
ト分析またはGDF-8タンパク質レベルのウエスタンブロット分析もしくは免疫染
色分析等のような当該技術分野で認識されている種々のアッセイを使用して評価
することができる。同定されたGDF-8阻害化合物は、さらに液体中で、または固
体支持体に結合した後のいずれかで、PCR、オリゴマー制限(Sakai et al.,Bio/T
echnology,3:1008(1985))、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プロー
ブ分析（Conner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:278(1983))、リガーゼ−媒
介遺伝子検出（Landegren et al.,Science 241:1077(1988))等のような、特別な
DNA配列を検出するために通常適用される任意の方法により評価し、検出し、ク
ローン化し、配列決定等することができる。
例えばGDF-8ペプチド、それらのプロドメインまたは部分のような）は、好まし
くはGDF-8活性を保有しない。そのようなインヒビターおよびそれらを同定する
ための方法は、「増殖分化因子インヒビターおよびそれらの使用（Growth Diffe
rentiation Factor Inhibitor and Uses Therefor)」という表題の米国特許出願
第60/116,639号明細書に記載されており、これは引用により全部、本明細書に編
入する。例えばGDF-8インヒビターの阻害作用は、GDF-8 mRNAのノーザンブロッ
ト分析またはGDF-8タンパク質レベルのウエスタンブロット分析もしくは免疫染
色分析等のような当該技術分野で認識されている種々のアッセイを使用して評価
することができる。同定されたGDF-8阻害化合物は、さらに液体中で、または固
体支持体に結合した後のいずれかで、PCR、オリゴマー制限(Sakai et al.,Bio/T
echnology,3:1008(1985))、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プロー
ブ分析（Conner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:278(1983))、リガーゼ−媒
介遺伝子検出（Landegren et al.,Science 241:1077(1988))等のような、特別な
DNA配列を検出するために通常適用される任意の方法により評価し、検出し、ク
ローン化し、配列決定等することができる。
【００１２】 本明細書で使用するように、「GDF-8活性」または「GDF-11活性」という用語
は、それぞれGDF-8またはGDF-11により媒介される任意の活性を含む。例えばGDF
-8は脂肪細胞への繊維芽細胞分化を阻害し、筋肉−特異的酵素、例えばクレアチ
ンキナーゼの生産をモジュレートし、細胞によるグルコースの取り込みをモジュ
レートし、そして筋芽細胞増殖を刺激することが知られている。したがって、GD
F-8インヒビターがGDF-8活性を抑制する程度は、例えばGDF-8が3T3-L1前-脂肪細
胞（繊維芽細胞）の脂肪細胞への分化プロセスを妨害する能力、筋肉−特異的酵
素（例えばクレアチンキナーゼ）の活性をモジュレートする能力、細胞によるグ
ルコースの取り込みをモジュレートする能力、または筋芽細胞増殖を刺激する能
力により測定するような、GDF-8活性を遮断するインヒビターの能力を試験する
ことにより確認することができる。GLUT4発現およびグルコース取り込みのイン
スリン刺激の阻害に及ぼすインヒビターの効果も評価することができ、そして化
合物の存在下でインキューベーションする前および後の測定を含むことができる
。
は、それぞれGDF-8またはGDF-11により媒介される任意の活性を含む。例えばGDF
-8は脂肪細胞への繊維芽細胞分化を阻害し、筋肉−特異的酵素、例えばクレアチ
ンキナーゼの生産をモジュレートし、細胞によるグルコースの取り込みをモジュ
レートし、そして筋芽細胞増殖を刺激することが知られている。したがって、GD
F-8インヒビターがGDF-8活性を抑制する程度は、例えばGDF-8が3T3-L1前-脂肪細
胞（繊維芽細胞）の脂肪細胞への分化プロセスを妨害する能力、筋肉−特異的酵
素（例えばクレアチンキナーゼ）の活性をモジュレートする能力、細胞によるグ
ルコースの取り込みをモジュレートする能力、または筋芽細胞増殖を刺激する能
力により測定するような、GDF-8活性を遮断するインヒビターの能力を試験する
ことにより確認することができる。GLUT4発現およびグルコース取り込みのイン
スリン刺激の阻害に及ぼすインヒビターの効果も評価することができ、そして化
合物の存在下でインキューベーションする前および後の測定を含むことができる
。
【００１３】 本明細書で使用するように、用語「モジュレート」とは機能の上昇を称する。
例えば遺伝子転写または発現のモジュレーションは、このような機能のアップレ
ギュレーションを称する。タンパク質活性のモジュレーションは、活性の上昇を
称する。
例えば遺伝子転写または発現のモジュレーションは、このような機能のアップレ
ギュレーションを称する。タンパク質活性のモジュレーションは、活性の上昇を
称する。
【００１４】 本明細書で使用するように、用語「阻害する」とは部分的でも全体的であって
も機能の減少を称する。例えば遺伝子転写または発現の阻害はこのような機能の
任意のレベルのダウンレギュレーションを称し、このような機能の完全な排除を
含む。タンパク質活性のモジュレーションは任意の活性低下を称し、活性の完全
な排除を含む。
も機能の減少を称する。例えば遺伝子転写または発現の阻害はこのような機能の
任意のレベルのダウンレギュレーションを称し、このような機能の完全な排除を
含む。タンパク質活性のモジュレーションは任意の活性低下を称し、活性の完全
な排除を含む。
【００１５】 本明細書で使用する「糖尿病」という用語は、Abel et al.,真性糖尿病：基本
および臨床テキスト(Diabet Mellitus:A Fundamental and Clinical Text)(1996
)、第530〜543頁に記載されているようなI型およびII型糖尿病を含めすべての既
知の状態の糖尿病を含む。
および臨床テキスト(Diabet Mellitus:A Fundamental and Clinical Text)(1996
)、第530〜543頁に記載されているようなI型およびII型糖尿病を含めすべての既
知の状態の糖尿病を含む。
【００１６】 本発明のGDF-8インヒビターは、典型的には個体に「実質的に純粋」な形態で
投与される。本明細書で使用する用語「実質的に純粋」とは、他のタンパク質、
脂質、炭水化物または自然に付随する他の物質を実質的に含まないGDF-8を称す
る。当業者は、タンパク質精製に関する標準的な技法を使用してGDF-8を精製す
ることができる。実質的に純粋なポリペプチドは、非−還元ポリアクリルアミド
ゲルで１本の主要バンドを生じるだろう。GDF-8ポリペプチドの純度は、アミノ
−末端アミノ酸配列分析により決定することもできる。
投与される。本明細書で使用する用語「実質的に純粋」とは、他のタンパク質、
脂質、炭水化物または自然に付随する他の物質を実質的に含まないGDF-8を称す
る。当業者は、タンパク質精製に関する標準的な技法を使用してGDF-8を精製す
ることができる。実質的に純粋なポリペプチドは、非−還元ポリアクリルアミド
ゲルで１本の主要バンドを生じるだろう。GDF-8ポリペプチドの純度は、アミノ
−末端アミノ酸配列分析により決定することもできる。
【００１７】 本発明に使用するためのインヒビターを試験し、そして開発するためのGDF-8
の生産に関する具体的な詳細は、McPherron,et al.,Nature 387:83 90(1997)お
よび米国特許第5,827,733号明細書により提供され、これは引用により全部、本
明細書に編入する。
の生産に関する具体的な詳細は、McPherron,et al.,Nature 387:83 90(1997)お
よび米国特許第5,827,733号明細書により提供され、これは引用により全部、本
明細書に編入する。
【００１８】 本明細書で使用するように、用語「ヘキソーストランスポーター」は、細胞の
外部から内部にグルコースのようなヘキソース糖を輸送することができる細胞の
内在性膜タンパク質を含む。そのようなトランスポーターの例は、中でも筋肉お
よび脂肪細胞中のGLUT1およびGLUT4トランスポータータンパク質である。
外部から内部にグルコースのようなヘキソース糖を輸送することができる細胞の
内在性膜タンパク質を含む。そのようなトランスポーターの例は、中でも筋肉お
よび脂肪細胞中のGLUT1およびGLUT4トランスポータータンパク質である。
【００１９】 本明細書で使用するように、用語「GDF-8活性のモジュレーション」または「G
DF-8レベルのモジュレーション」は、自然な状態と比較してGDF-8活性またはレ
ベルの変化を称する。この変化は陽性（アップレギュレーション）、または陰性
（ダウンレギュレーション）のいずれでもよいが、本発明の目的に関しては好ま
しくは後者である。
DF-8レベルのモジュレーション」は、自然な状態と比較してGDF-8活性またはレ
ベルの変化を称する。この変化は陽性（アップレギュレーション）、または陰性
（ダウンレギュレーション）のいずれでもよいが、本発明の目的に関しては好ま
しくは後者である。
【００２０】 筋肉および脂肪細胞のような本発明の方法により標的とされる細胞は、培養中
に維持された単離された細胞材料ならびに自然なインビボの状況（例えば、胸筋
、三頭筋、腹筋、四頭筋および腸肋筋のような脂肪組織または筋肉組織中）の細
胞を含む。
に維持された単離された細胞材料ならびに自然なインビボの状況（例えば、胸筋
、三頭筋、腹筋、四頭筋および腸肋筋のような脂肪組織または筋肉組織中）の細
胞を含む。
【００２１】 用語「アンチセンス核酸」は、特異的なmRNA分子の少なくとも一部と相補的で
あるDNAまたはRNA分子を称する（Weintraub,Scientific American 262:40(199))
。細胞中でアンチセンス核酸は対応するmRNAにハイブリダイズし、二本鎖分子を
形成する。細胞は二本鎖であるmRNAを翻訳しないので、アンチセンス核酸はmRNA
の翻訳を妨害する。容易に合成され、そして標的とするGDF-8生産細胞中に導入
された時により大きな分子よりも問題を生じることが少ないので、約15ヌクレオ
チドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。遺伝子のインビトロ翻訳を阻害する
ためのアンチセンス法の使用は、当該技術分野では周知である（Marcus-Sakura,
Anal.Biochem.172:289(1988))。
あるDNAまたはRNA分子を称する（Weintraub,Scientific American 262:40(199))
。細胞中でアンチセンス核酸は対応するmRNAにハイブリダイズし、二本鎖分子を
形成する。細胞は二本鎖であるmRNAを翻訳しないので、アンチセンス核酸はmRNA
の翻訳を妨害する。容易に合成され、そして標的とするGDF-8生産細胞中に導入
された時により大きな分子よりも問題を生じることが少ないので、約15ヌクレオ
チドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。遺伝子のインビトロ翻訳を阻害する
ためのアンチセンス法の使用は、当該技術分野では周知である（Marcus-Sakura,
Anal.Biochem.172:289(1988))。
【００２２】 本明細書で使用するように、「リボザイム」は特異的な核酸配列にヌクレアー
ゼ活性を有する核酸分子である。GDF-8 mRNAに特異的なリボザイムは、例えばGD
F-8 mRNAの特異的領域に結合そして開裂し、これにより翻訳不能とし、そしてGD
F-8ポリペプチド生産の欠失をもたらす。
ゼ活性を有する核酸分子である。GDF-8 mRNAに特異的なリボザイムは、例えばGD
F-8 mRNAの特異的領域に結合そして開裂し、これにより翻訳不能とし、そしてGD
F-8ポリペプチド生産の欠失をもたらす。
【００２３】 用語「優性−ネガティブ変異体」とは、自然な状態から突然変異し、しかもGD
F-8またはGDF-8遺伝子と相互作用し、これによりその生産および／または活性を
阻害するGDF-8タンパク質を称する。
F-8またはGDF-8遺伝子と相互作用し、これによりその生産および／または活性を
阻害するGDF-8タンパク質を称する。
【００２４】 本発明の「抗体」は、GDF-8ポリペプチドまたはそれらの機能的フラグメント
と免疫反応性の抗体を含む。異なるエピトープ特異性を持つプールしたモノクロ
ーナル抗体、ならびに別々のモノクローナル抗体調製物から本質的に成る抗体を
提供する。モノクローナル抗体は当業者に周知な方法により、タンパク質の抗原
を含有するフラグメントから作成する（Kohler et al.,Nature 256:495(1975))
。本発明で使用する用語「抗体」は、完全な分子ならびにGDF-8上のエピトープ
決定基に結合することができるFabおよびF(ab')2、FvおよびSCAフラグメントの
ようなそれらのフラグメントを含むことを意味する。
と免疫反応性の抗体を含む。異なるエピトープ特異性を持つプールしたモノクロ
ーナル抗体、ならびに別々のモノクローナル抗体調製物から本質的に成る抗体を
提供する。モノクローナル抗体は当業者に周知な方法により、タンパク質の抗原
を含有するフラグメントから作成する（Kohler et al.,Nature 256:495(1975))
。本発明で使用する用語「抗体」は、完全な分子ならびにGDF-8上のエピトープ
決定基に結合することができるFabおよびF(ab')2、FvおよびSCAフラグメントの
ようなそれらのフラグメントを含むことを意味する。
【００２５】 「Fabフラグメント」は抗体分子の一価の抗原−結合フラグメントから成り、
そして全抗体分子を酵素パパインを用いて消化することにより調製するこどかで
き、完全な軽鎖および重鎖の一部からなるフラグメントを生じる。
そして全抗体分子を酵素パパインを用いて消化することにより調製するこどかで
き、完全な軽鎖および重鎖の一部からなるフラグメントを生じる。
【００２６】 抗体分子の「Fab'フラグメント」は、全抗体分子のペプシンを用いた処理、続
いて還元により得ることができ、完全な軽鎖および重鎖の一部からなる分子を生
じる。抗体分子あたり２つのFab'フラグメントがこの様式で処置して得られる。
いて還元により得ることができ、完全な軽鎖および重鎖の一部からなる分子を生
じる。抗体分子あたり２つのFab'フラグメントがこの様式で処置して得られる。
【００２７】 抗体の「F(ab')2」は、後の還元無しで全抗体分子の酵素ペプシンを用いた処
理により得ることができる。F(ab')2フラグメントは２つのジスルフィド結合に
より一緒に保持されている２つのFab'フラグメントの二量体である。
理により得ることができる。F(ab')2フラグメントは２つのジスルフィド結合に
より一緒に保持されている２つのFab'フラグメントの二量体である。
【００２８】 「Fvフラグメント」は２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の
可変領域を含む遺伝的に操作されたフラグメントと定める。
可変領域を含む遺伝的に操作されたフラグメントと定める。
【００２９】 「一本鎖抗体」（SCA）は、適当な柔軟なポリペプチドリンカーにより連結さ
れた軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝的に操作された一本鎖分子
である。本発明の方法に使用するためのGDF-8およびGDF-11インヒビター 本発明に使用するために適するGDF-8インヒビターは、限定するわけではない
がGDF-8に由来するペプチド（例えば成熟GDF-8またはGDF-8のプロ−ドメイン）
、非-GDF-8-ペプチド、GDF-8優性−ネガティブ変異体、GDF-8（またはGDF-8のレ
セプター）に結合し、そしてGDF-8がそのレセプターに結合するのを阻害する抗
体および抗体フラグメント、GDF-8レセプターペプチドアンタゴニストを含むペ
プチド、GDF-8 mRNAに対するアンチセンス核酸および抗-GDF-8リボザイムを含む
。このようにGDF-8インヒビターはメッセージ（転写）レベルまたはタンパク質
（発現または活性）レベルで作用することができる。
れた軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝的に操作された一本鎖分子
である。本発明の方法に使用するためのGDF-8およびGDF-11インヒビター 本発明に使用するために適するGDF-8インヒビターは、限定するわけではない
がGDF-8に由来するペプチド（例えば成熟GDF-8またはGDF-8のプロ−ドメイン）
、非-GDF-8-ペプチド、GDF-8優性−ネガティブ変異体、GDF-8（またはGDF-8のレ
セプター）に結合し、そしてGDF-8がそのレセプターに結合するのを阻害する抗
体および抗体フラグメント、GDF-8レセプターペプチドアンタゴニストを含むペ
プチド、GDF-8 mRNAに対するアンチセンス核酸および抗-GDF-8リボザイムを含む
。このようにGDF-8インヒビターはメッセージ（転写）レベルまたはタンパク質
（発現または活性）レベルで作用することができる。
【００３０】 本明細書で使用するように、用語「GDF-8」にはすべての既知のGDF-8形態、限
定するわけではないがヒトGDF-8、ウシGDF-8、ニワトリGDF-8、マウスGDF-8、ラ
ットGDF-8、ブタGDF-8、ヒツジGDF-8、七面鳥GDF-8およびヒヒGDF-8を含む。こ
のような分子は、MacPerrron A.C.et al.,(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.94:12457-
12461に記載され、その内容は引用により本明細書に編入する。このようなタン
パク質のアミノ酸配列は図１２に示す。
定するわけではないがヒトGDF-8、ウシGDF-8、ニワトリGDF-8、マウスGDF-8、ラ
ットGDF-8、ブタGDF-8、ヒツジGDF-8、七面鳥GDF-8およびヒヒGDF-8を含む。こ
のような分子は、MacPerrron A.C.et al.,(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.94:12457-
12461に記載され、その内容は引用により本明細書に編入する。このようなタン
パク質のアミノ酸配列は図１２に示す。
【００３１】 本明細書で使用するように、用語「GDF-11」にはすべての既知のGDF-11形態、
限定するわけではないがヒトGDF-11、ウシGDF-11、ニワトリGDF-11、マウスGDF-
11、ラットGDF-11、ブタGDF-11、ヒツジGDF-11、七面鳥GDF-11およびヒヒGDF-11
を含む。
限定するわけではないがヒトGDF-11、ウシGDF-11、ニワトリGDF-11、マウスGDF-
11、ラットGDF-11、ブタGDF-11、ヒツジGDF-11、七面鳥GDF-11およびヒヒGDF-11
を含む。
【００３２】 GDF-8およびGDF-11阻害ペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過クロマトグラフィー、超遠心、電気泳動およびGDF-8またはGDF-11インヒビタ
ーに特異的な抗体またはそれらの部分を用いたイムノアフィニティ精製を含むペ
プチドまたはタンパク質の精製について当該技術分野で既知の技法を使用して、
GDF-8またはGDF-11を発現している細胞の媒質から同定し、そして単離すること
ができる。１つの態様では、GDF-8またはGDF-11を発現する細胞のカルチャーか
ら得られた媒質を高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）にかける。得られたサ
ンプルは、次にGDF-8またはGDF-11阻害活性について以下に記載するように試験
することができる。
過クロマトグラフィー、超遠心、電気泳動およびGDF-8またはGDF-11インヒビタ
ーに特異的な抗体またはそれらの部分を用いたイムノアフィニティ精製を含むペ
プチドまたはタンパク質の精製について当該技術分野で既知の技法を使用して、
GDF-8またはGDF-11を発現している細胞の媒質から同定し、そして単離すること
ができる。１つの態様では、GDF-8またはGDF-11を発現する細胞のカルチャーか
ら得られた媒質を高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）にかける。得られたサ
ンプルは、次にGDF-8またはGDF-11阻害活性について以下に記載するように試験
することができる。
【００３３】 あるいはGDF-8およびGDF-11ペプチドインヒビターは、阻害活性に関してGDF-8
またはGDF-11のフラグメントをスクリーニングすることにより同定することがで
きる。GDF-8またはGDF-11フラグメントは、様々な既知の技法により調製するこ
とができる。例えばGDF-8およびGDF-11配列を広げる特異的オリゴペプチド（約1
0〜25アミノ酸長)を合成し（例えば化学的または組換え的に）、そしてそれらが
GDF-8またはGDF-11を阻害する能力を、例えば本明細書に記載するアッセイを使
用して試験することができる。GDF-8またはGDF-11ペプチドフラグメントは、Bod
ansky,M.ペプチド合成の原理（Principle of Peptide Synthesis)、スプリンガ
ー出版（Springer Verlag)、ベルリン(1993)およびGrant,G.A.(編集)、合成ペプ
チド:ユーザーズガイド(Synthetic Peptides:User's Guide)、W.H.フリーマン
アンド カンパニー(W.H.Freeman and Company)、ニューヨーク、(1992)に記載さ
れているような標準的技法を使用して合成することができる。自動化ペプチド合
成器が市販されている（例えばAdvanced ChemTech Model 396：Milligen/Biosea
rch 9600)。
またはGDF-11のフラグメントをスクリーニングすることにより同定することがで
きる。GDF-8またはGDF-11フラグメントは、様々な既知の技法により調製するこ
とができる。例えばGDF-8およびGDF-11配列を広げる特異的オリゴペプチド（約1
0〜25アミノ酸長)を合成し（例えば化学的または組換え的に）、そしてそれらが
GDF-8またはGDF-11を阻害する能力を、例えば本明細書に記載するアッセイを使
用して試験することができる。GDF-8またはGDF-11ペプチドフラグメントは、Bod
ansky,M.ペプチド合成の原理（Principle of Peptide Synthesis)、スプリンガ
ー出版（Springer Verlag)、ベルリン(1993)およびGrant,G.A.(編集)、合成ペプ
チド:ユーザーズガイド(Synthetic Peptides:User's Guide)、W.H.フリーマン
アンド カンパニー(W.H.Freeman and Company)、ニューヨーク、(1992)に記載さ
れているような標準的技法を使用して合成することができる。自動化ペプチド合
成器が市販されている（例えばAdvanced ChemTech Model 396：Milligen/Biosea
rch 9600)。
【００３４】 あるいはGDF-8またはGDF-11フラグメントは、天然または組換え的に生成したG
DF-8またはGDF-11を例えばプロテアーゼ（例えばトリプシン、サーモリシン、キ
モトリプシンまたはペプシン）を使用して消化することにより調製することがで
きる。コンピューター分析（市販されているソフトウェア、例えばMacVector、O
mega、PCGene、モレキュラーシュミレーション社(Molecular Simulation社)）を
使用して、タンパク質溶解開裂部位を確認することができる。
DF-8またはGDF-11を例えばプロテアーゼ（例えばトリプシン、サーモリシン、キ
モトリプシンまたはペプシン）を使用して消化することにより調製することがで
きる。コンピューター分析（市販されているソフトウェア、例えばMacVector、O
mega、PCGene、モレキュラーシュミレーション社(Molecular Simulation社)）を
使用して、タンパク質溶解開裂部位を確認することができる。
【００３５】 本発明の方法に使用するGDF-8またはGDF-11インヒビターは、好ましくは単離
されている。本明細書で使用する「単離された」または「精製された」タンパク
質または生物学的に活性なそれらのペプチドとは、GDF-8またはGDF-11タンパク
質もしくはペプチドが由来する細胞の材料または細胞もしくは組織源からの他の
混入タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成する時は化学前駆体
もしくは他の化学品を実質的に含まない。「細胞の材料を実質的に含まない」と
いう言い回しは、タンパク質またはそれらのペプチドがそれが単離または組換え
的に生産された細胞の細胞成分から分離されているGDF-8またはGDF-11タンパク
質またはそれらのペプチドの調製物を含む。１つの態様では「細胞の材料を実質
的に含まない」という言い回しは、約30(乾燥重量)％未満の非GDF-8またはGDF-1
1タンパク質またはそれらのペプチド（本明細書では「混入タンパク質」と呼ぶ
）、より好ましくは約20％未満の非GDF-8またはGDF-11タンパク質またはそれら
のペプチド、さらに一層好ましくは約10％未満の非GDF-8またはGDF-11タンパク
質またはそれらのペプチド、そして最も好ましくは約５％未満の非GDF-8またはG
DF-11タンパク質またはそれらのペプチドを有するGDF-8またはGDF-11タンパク質
またはそれらのペプチドの調製物を含む。GDF-8またはGDF-11タンパク質または
それらの生物学的に活性な部分が組換え的に生産される時、好ましくは培養基を
実質的に含まず、すなわち培養基はタンパク質調製物の容量の約20％未満、より
好ましくは約10％未満、そして最も好ましくは約５％未満を表す。
されている。本明細書で使用する「単離された」または「精製された」タンパク
質または生物学的に活性なそれらのペプチドとは、GDF-8またはGDF-11タンパク
質もしくはペプチドが由来する細胞の材料または細胞もしくは組織源からの他の
混入タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成する時は化学前駆体
もしくは他の化学品を実質的に含まない。「細胞の材料を実質的に含まない」と
いう言い回しは、タンパク質またはそれらのペプチドがそれが単離または組換え
的に生産された細胞の細胞成分から分離されているGDF-8またはGDF-11タンパク
質またはそれらのペプチドの調製物を含む。１つの態様では「細胞の材料を実質
的に含まない」という言い回しは、約30(乾燥重量)％未満の非GDF-8またはGDF-1
1タンパク質またはそれらのペプチド（本明細書では「混入タンパク質」と呼ぶ
）、より好ましくは約20％未満の非GDF-8またはGDF-11タンパク質またはそれら
のペプチド、さらに一層好ましくは約10％未満の非GDF-8またはGDF-11タンパク
質またはそれらのペプチド、そして最も好ましくは約５％未満の非GDF-8またはG
DF-11タンパク質またはそれらのペプチドを有するGDF-8またはGDF-11タンパク質
またはそれらのペプチドの調製物を含む。GDF-8またはGDF-11タンパク質または
それらの生物学的に活性な部分が組換え的に生産される時、好ましくは培養基を
実質的に含まず、すなわち培養基はタンパク質調製物の容量の約20％未満、より
好ましくは約10％未満、そして最も好ましくは約５％未満を表す。
【００３６】 そのようなタンパク質溶解的に開裂したGDF-8またはGDF-11ペプチドを調製し
、そして単離するための２段階法を使用することができる。第１工程は、GDF-8
またはGDF-11タンパク質の酵素的消化が関与する。GDF-8またはGDF-11はCHO細胞
にコンディショニングした培地から二量体として、大腸菌（E.coli）または酵母
からは単量体として生産させることができ、あるいは自然にGDF-8またはGDF-11
を生産する細胞から単離することができる。例えばHPLCクロマトグラフィーによ
りGDF-8またはGDF-11単量体または二量体の精製後、それらの酵素的消化を以下
に記載するように行う。消化中のアミノ酸開裂は、当該技術分野で知られている
ように実験に使用する具体的なプロテアーゼに依存する。例えばもし選択したプ
ロテアーゼがトリプシンならば、開裂部分はアミノ酸のアルギニンおよびリシン
になるだろう。GDF-8またはGDF-11タンパク質は、１以上のそのようなプロテア
ーゼを使用して消化することができる。
、そして単離するための２段階法を使用することができる。第１工程は、GDF-8
またはGDF-11タンパク質の酵素的消化が関与する。GDF-8またはGDF-11はCHO細胞
にコンディショニングした培地から二量体として、大腸菌（E.coli）または酵母
からは単量体として生産させることができ、あるいは自然にGDF-8またはGDF-11
を生産する細胞から単離することができる。例えばHPLCクロマトグラフィーによ
りGDF-8またはGDF-11単量体または二量体の精製後、それらの酵素的消化を以下
に記載するように行う。消化中のアミノ酸開裂は、当該技術分野で知られている
ように実験に使用する具体的なプロテアーゼに依存する。例えばもし選択したプ
ロテアーゼがトリプシンならば、開裂部分はアミノ酸のアルギニンおよびリシン
になるだろう。GDF-8またはGDF-11タンパク質は、１以上のそのようなプロテア
ーゼを使用して消化することができる。
【００３７】 消化後、第２工程にはタンパク質消化により生じたペプチド画分の単離が関与
する。これは例えば以下に記載するような高解像度のペプチド分離により行うこ
とができる。いったん画分が単離されれば、それらのGDF-8またはGDF-11阻害活
性を以下に記載する適切なバイオアッセイにより試験することができる。
する。これは例えば以下に記載するような高解像度のペプチド分離により行うこ
とができる。いったん画分が単離されれば、それらのGDF-8またはGDF-11阻害活
性を以下に記載する適切なバイオアッセイにより試験することができる。
【００３８】 タンパク質溶解または合成のGDF-8またはGDF-11フラグメントは、例えば部分
的にまたは完全にGDF-8またはGDF-11機能を阻害するために必要な数のアミノ酸
残基を含んで成ることができ、そして好ましくは少なくとも５、10、15、20、25
、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100以上のアミ
ノ酸長を含んで成る。
的にまたは完全にGDF-8またはGDF-11機能を阻害するために必要な数のアミノ酸
残基を含んで成ることができ、そして好ましくは少なくとも５、10、15、20、25
、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100以上のアミ
ノ酸長を含んで成る。
【００３９】 １つの態様では、Ｔ細胞媒介免疫反応を誘導するために十分な数のＴ細胞エピ
トープを含まず、かつ／または哺乳動物に投与した時に抗体を誘導する十分な数
のＢ細胞エピトープを含むペプチドが選択される。好適なGDF-8またはGDF-11ペ
プチドインヒビターは、Ｔ−細胞媒介（例えばサイトカイン）反応を誘導するた
めに十分な数のＴ細胞エピトープを含まない。しかしＢ細胞エピトープは望まし
く、そして例えば以下に記載するような抗体反応を誘導するためのペプチドの能
力を試験することにより選択することができる。
トープを含まず、かつ／または哺乳動物に投与した時に抗体を誘導する十分な数
のＢ細胞エピトープを含むペプチドが選択される。好適なGDF-8またはGDF-11ペ
プチドインヒビターは、Ｔ−細胞媒介（例えばサイトカイン）反応を誘導するた
めに十分な数のＴ細胞エピトープを含まない。しかしＢ細胞エピトープは望まし
く、そして例えば以下に記載するような抗体反応を誘導するためのペプチドの能
力を試験することにより選択することができる。
【００４０】 GDF-8またはGDF-11フラグメント内のＴ細胞エピトープは、多数の周知技法を
使用して同定することができる。例えばＴ細胞エピトープは、アルゴリズムを使
用して予測することができる（例えばRothbard,J.and Taylor,W.R.(1988)EMBO J . 7:93-100;Berzofsky,J.A.(1989)Philos Trans R.Soc.Lond.323:535-544を参照
にされたい)。好ましくは、GDF-8またはGDF-11タンパク質内のヒトＴ細胞エピト
ープは、既知のHLAクラスII結合特異的アミノ酸残基を使用して予測することが
できる。成功裏に使用されてきたＴ細胞刺激活性を有するペプチドの予測のため
の１つのアルゴリズムは、Rothbard、第１回ウイルスフォーラム、パスツール研
究所の１年間の記録（1st Forum in Virology,Annals of the Paster Institute ）、第518〜526（1986年12月)、Rothbard and Taylor,(1988)Embo,7:93-100およ
び欧州特許第0 304 279号明細書に報告されている。これらの技術文献は、一般
的なＴ細胞パターン（アルゴリズム）の定義、その統計的意義およびその既知の
Ｔ細胞エピトープとの相関ならびにこれまでに同定されていなかった種々のタン
パク質の抗原および自己抗原のＴ細胞エピトープを予測する際のその成功裏の使
用を報告している。上記の技術文献で報告されているＴ細胞エピトープに関する
一般的パターンは、変化したアミノ酸残基またはグリシンに続いて２つの疎水性
残基から成る直線パター(patter)を含むようである。これまでに見いだされてい
ないタンパク質のＴ細胞エピトープを予測するために使用された他のアルゴリズ
ムは、Margalit et al.,(1987) J.Immumol.,138:2213-2229により報告されたア
ルゴリズムを含み、これは両親媒性ヘリックスモデルに基づく。
使用して同定することができる。例えばＴ細胞エピトープは、アルゴリズムを使
用して予測することができる（例えばRothbard,J.and Taylor,W.R.(1988)EMBO J . 7:93-100;Berzofsky,J.A.(1989)Philos Trans R.Soc.Lond.323:535-544を参照
にされたい)。好ましくは、GDF-8またはGDF-11タンパク質内のヒトＴ細胞エピト
ープは、既知のHLAクラスII結合特異的アミノ酸残基を使用して予測することが
できる。成功裏に使用されてきたＴ細胞刺激活性を有するペプチドの予測のため
の１つのアルゴリズムは、Rothbard、第１回ウイルスフォーラム、パスツール研
究所の１年間の記録（1st Forum in Virology,Annals of the Paster Institute ）、第518〜526（1986年12月)、Rothbard and Taylor,(1988)Embo,7:93-100およ
び欧州特許第0 304 279号明細書に報告されている。これらの技術文献は、一般
的なＴ細胞パターン（アルゴリズム）の定義、その統計的意義およびその既知の
Ｔ細胞エピトープとの相関ならびにこれまでに同定されていなかった種々のタン
パク質の抗原および自己抗原のＴ細胞エピトープを予測する際のその成功裏の使
用を報告している。上記の技術文献で報告されているＴ細胞エピトープに関する
一般的パターンは、変化したアミノ酸残基またはグリシンに続いて２つの疎水性
残基から成る直線パター(patter)を含むようである。これまでに見いだされてい
ないタンパク質のＴ細胞エピトープを予測するために使用された他のアルゴリズ
ムは、Margalit et al.,(1987) J.Immumol.,138:2213-2229により報告されたア
ルゴリズムを含み、これは両親媒性ヘリックスモデルに基づく。
【００４１】 Ｔ細胞エピトープの他の同定法には、ヒトＴ細胞刺激活性のために本発明のGD
F-8またはGDF-11阻害ペプチドのスクリーニングが関与する。これは１以上の異
なるアッセイを使用して行うことができる。例えばインビトロでＴ細胞刺激活性
は本発明のペプチドをＴ細胞培養で適切なMHC分子を与える抗原提示細胞と接触
させることによりアッセイすることができる。本発明のGDF-8またはGDF-11阻害
ペプチドを適当なMHC分子と会合してＴ細胞に提示することは、必要な副刺激と
一緒に、サイトカイン類、特にインターロイキン-２およびインターロイキン-４
の生産レベルの増加を誘導するシグナルをＴ細胞に伝達する効果を有することが
できる。培養上清を得、そしてインターロイキン-２または他の既知のサイトカ
イン類についてアッセイすることができる。例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8
6:1333(1989)（この全内容は引用により本明細書に編入する）に記載されている
アッセイのようなインターロイキン-２に関する幾つかの通例のアッセイの任意
の１つを採用することができる。インターフェロンの生産に関するアッセイ用キ
ットもジェンザイム社（Genzyme Corporation)（ケンブリッジ、マサチューセッ
ツ州）から市販されている。
F-8またはGDF-11阻害ペプチドのスクリーニングが関与する。これは１以上の異
なるアッセイを使用して行うことができる。例えばインビトロでＴ細胞刺激活性
は本発明のペプチドをＴ細胞培養で適切なMHC分子を与える抗原提示細胞と接触
させることによりアッセイすることができる。本発明のGDF-8またはGDF-11阻害
ペプチドを適当なMHC分子と会合してＴ細胞に提示することは、必要な副刺激と
一緒に、サイトカイン類、特にインターロイキン-２およびインターロイキン-４
の生産レベルの増加を誘導するシグナルをＴ細胞に伝達する効果を有することが
できる。培養上清を得、そしてインターロイキン-２または他の既知のサイトカ
イン類についてアッセイすることができる。例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8
6:1333(1989)（この全内容は引用により本明細書に編入する）に記載されている
アッセイのようなインターロイキン-２に関する幾つかの通例のアッセイの任意
の１つを採用することができる。インターフェロンの生産に関するアッセイ用キ
ットもジェンザイム社（Genzyme Corporation)（ケンブリッジ、マサチューセッ
ツ州）から市販されている。
【００４２】 Ｔ細胞増殖に関する通例のアッセイには、トリチル化チミジンの取り込み測定
を伴う。Ｔ細胞の増殖は培養した細胞中の複製したDNA中に取り込まれた3H-標識
チミジンの量を測定することによりインビトロで測定することができる。それゆ
えに、DNA合成の速度そして次に細胞***の速度を定量することができる。
を伴う。Ｔ細胞の増殖は培養した細胞中の複製したDNA中に取り込まれた3H-標識
チミジンの量を測定することによりインビトロで測定することができる。それゆ
えに、DNA合成の速度そして次に細胞***の速度を定量することができる。
【００４３】 GDF-8またはGDF-11の他の好適なペプチドインヒビターは、GDF-8およびGDF-11
タンパク質の表面上、例えば親水性領域ならびに高い抗原性を有する領域に位置
するか、あるいは高い表面実在性スコア（surface probability scores)を持つ
フラグメントは当業者に周知なコンピューター分析プログラムを使用して同定す
ることができる（Hopp and Wood,(1983),Mol.Immumol.,20,483-9,Kyte and Dool
ittle,(1982),J.Mol.Biol.,157,105-32,Corrigan and Huang,(1982),Comput,Pro
grams Biomed,3,163-8)。
タンパク質の表面上、例えば親水性領域ならびに高い抗原性を有する領域に位置
するか、あるいは高い表面実在性スコア（surface probability scores)を持つ
フラグメントは当業者に周知なコンピューター分析プログラムを使用して同定す
ることができる（Hopp and Wood,(1983),Mol.Immumol.,20,483-9,Kyte and Dool
ittle,(1982),J.Mol.Biol.,157,105-32,Corrigan and Huang,(1982),Comput,Pro
grams Biomed,3,163-8)。
【００４４】 GDF-8またはGDF-11阻害活性について試験されるさらに他の好適なGDF-8および
GDF-11のペプチドは、１以上のＢ−細胞エピトープを含む。そのようなペプチド
は動物にそのペプチドを単独で、またはアジュバントと組み合わせて、もしくは
連結して（例えばハプテン）免疫感作し、そして免疫感作した動物からの血清を
抗-GDF-8またはGDF-11抗体について試験することにより同定することができる。
好適なペプチドはGDF-8またはGDF-11活性を阻害する抗-GDF-8またはGDF-11抗体
を生成し、このようなペプチドが幾らかタンパク質の活性に関連していることを
示す（例えば活性部位のすべてまたは部分に対応する）。例えば、免疫感作した
動物に由来する血清は、本明細書に記載する任意のGDF-8またはGDF-11バイオア
ッセイを使用してGDF-8またはGDF-11阻害活性について試験することができる。
GDF-11のペプチドは、１以上のＢ−細胞エピトープを含む。そのようなペプチド
は動物にそのペプチドを単独で、またはアジュバントと組み合わせて、もしくは
連結して（例えばハプテン）免疫感作し、そして免疫感作した動物からの血清を
抗-GDF-8またはGDF-11抗体について試験することにより同定することができる。
好適なペプチドはGDF-8またはGDF-11活性を阻害する抗-GDF-8またはGDF-11抗体
を生成し、このようなペプチドが幾らかタンパク質の活性に関連していることを
示す（例えば活性部位のすべてまたは部分に対応する）。例えば、免疫感作した
動物に由来する血清は、本明細書に記載する任意のGDF-8またはGDF-11バイオア
ッセイを使用してGDF-8またはGDF-11阻害活性について試験することができる。
【００４５】 あるいはGDF-8またはGDF-11抗体または抗体フラグメントは、GDF-8またはGDF-
11活性を阻害するために個体に直接投与することができる。好適な抗体には、ヒ
ト化された、キメラの、およびヒトモノクローナル抗体もしくはそれらのフラグ
メントを含めモノクローナル抗体が含まれる。
11活性を阻害するために個体に直接投与することができる。好適な抗体には、ヒ
ト化された、キメラの、およびヒトモノクローナル抗体もしくはそれらのフラグ
メントを含めモノクローナル抗体が含まれる。
【００４６】 そのような抗体を生成するために、タンパク質溶解的または合成的GDF-8また
はGDF-11フラグメント（単独または適当なキャリアーもしくはハプテンと結合し
て）を使用して、個体（例えば限定するわけではないがウサギ、ヤギ、マウスま
たは他の哺乳動物を含む哺乳類）に免疫感作することができる。例えば米国特許
第5,422,110号；同第5,837,268号；5,708,155号；5,723,129号；および5,849,53
1号明細書に記載されているような方法を使用することができ、そしてこれらは
引用により本明細書に編入する。好適な態様では、免疫感作した哺乳動物は内因
性のGDF-8またはGDF-11を含まない（例えばGDF-8またはGDF-11ノックアウトトラ
ンスジェニック動物）。免疫原性調製物はさらに、フロインド完全もしくは不完
全アジュバントのようなアジュバント、または同様な免疫刺激剤を含むことがで
きる。適当な個体を免疫原性のタンパク質溶解的または合成GDF-8またはGDF-11
フラグメント調製物で免疫感作すると、ポリクローナル抗GDF-8またはGDF-11抗
体反応が誘導される。免疫感作した個体中の抗GDF-8またはGDF-11抗体力価は、
固定化したGDF-8またはGDF-11を使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA)を
用いるような標準的な技法により継時的にモニターすることができる。続いて免
疫感作した個体からの血清は、それらのGDF-8またはGDF-11阻害活性に関して本
明細書に記載する任意のバイオアッセイを使用して試験することができる。
はGDF-11フラグメント（単独または適当なキャリアーもしくはハプテンと結合し
て）を使用して、個体（例えば限定するわけではないがウサギ、ヤギ、マウスま
たは他の哺乳動物を含む哺乳類）に免疫感作することができる。例えば米国特許
第5,422,110号；同第5,837,268号；5,708,155号；5,723,129号；および5,849,53
1号明細書に記載されているような方法を使用することができ、そしてこれらは
引用により本明細書に編入する。好適な態様では、免疫感作した哺乳動物は内因
性のGDF-8またはGDF-11を含まない（例えばGDF-8またはGDF-11ノックアウトトラ
ンスジェニック動物）。免疫原性調製物はさらに、フロインド完全もしくは不完
全アジュバントのようなアジュバント、または同様な免疫刺激剤を含むことがで
きる。適当な個体を免疫原性のタンパク質溶解的または合成GDF-8またはGDF-11
フラグメント調製物で免疫感作すると、ポリクローナル抗GDF-8またはGDF-11抗
体反応が誘導される。免疫感作した個体中の抗GDF-8またはGDF-11抗体力価は、
固定化したGDF-8またはGDF-11を使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA)を
用いるような標準的な技法により継時的にモニターすることができる。続いて免
疫感作した個体からの血清は、それらのGDF-8またはGDF-11阻害活性に関して本
明細書に記載する任意のバイオアッセイを使用して試験することができる。
【００４７】 あるいは、米国特許第5,795,872号、Ricigliano et al.、「免疫感作のための
DNA構築物(DNA construct for immunization)」(1988)、および米国特許第5,643
,578号、Robinson et al.、「DNA転写単位の接種による免疫感作(Immunization
by inoculation of transcription unit)」(1997)に開示されているようなDNA免
疫感作法を使用して、GDF-8およびGDF-11を発現するプラスミドで個体（例えばG
DF-8およびGDF-11ノックアウトマウス）を免疫感作することも可能である。
DNA構築物(DNA construct for immunization)」(1988)、および米国特許第5,643
,578号、Robinson et al.、「DNA転写単位の接種による免疫感作(Immunization
by inoculation of transcription unit)」(1997)に開示されているようなDNA免
疫感作法を使用して、GDF-8およびGDF-11を発現するプラスミドで個体（例えばG
DF-8およびGDF-11ノックアウトマウス）を免疫感作することも可能である。
【００４８】 GDF-8またはGDF-11に対する抗体分子は哺乳動物から単離することができ（例
えば血液から）、そしてIgG画分を得るためのプロテインＡカラムクロマトグラ
フィーのような周知技法によりさらに精製することができる。免疫感作後の適当
な時期（例えばGDF-8またはGDF-11抗体力価が最高である時）に、抗体生産細胞
を個体から得、そして例えば最初にKohler and Milstein(1975) Nature 256:495
-497により記載されたハイブリドーマ法（またBrown et al.,(1981) J.Immumol. 127:539-46；Brown et al.,(1980) J.Biol.Chem.255:4980-83；Yeh et al.,(197
6) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:2927-31；およびYeh et al.,(1982) Int.J.Canc
er 29:269-75も参照にされたい）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ko
zbor et al.,(1983) Immunol.Today 4:72）、EBV-ハイブリドーマ法（Cole et a
l.、(1985)、モノクローナル抗体および癌療法（Monoclonal Antibodies and Ca ncer Therapy )、アラン アール リス社(Alan R.Liss、Inc）、第77〜96頁）、あ
るいはトリオーマ法のような標準的な技法によりモノクローナル抗体を調製する
ために使用することができる、モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成する技
法は周知である（一般には、R.H.Kenneth、モノクローナル抗体:生物学分析にお
ける新次元（Monoclonal Antibodies:A New Dimension In Biological Analyses ）、プレナム出版社（Plenum Publishing Corp.)、ニューヨーク、ニューヨーク
(1980)；E.A.Lerner(1981) Yale J.Biol.Med.,54:387-402；M.L.Gefter et al.(
1977) Somatic Cell Genet.3:231-36)。簡単に説明すると不死化細胞系（典型的
には骨髄腫）を、上記のようにGDF-8またはGDF-11免疫原で免疫感作した哺乳動
物に由来するリンパ球（典型的には脾細胞）と融合し、そして生成したハイブリ
ドーマ細胞の培養上清をスクリーニングし、そしてGDF-8またはGDF-11に結合す
るハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体を同定する。
えば血液から）、そしてIgG画分を得るためのプロテインＡカラムクロマトグラ
フィーのような周知技法によりさらに精製することができる。免疫感作後の適当
な時期（例えばGDF-8またはGDF-11抗体力価が最高である時）に、抗体生産細胞
を個体から得、そして例えば最初にKohler and Milstein(1975) Nature 256:495
-497により記載されたハイブリドーマ法（またBrown et al.,(1981) J.Immumol. 127:539-46；Brown et al.,(1980) J.Biol.Chem.255:4980-83；Yeh et al.,(197
6) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:2927-31；およびYeh et al.,(1982) Int.J.Canc
er 29:269-75も参照にされたい）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ko
zbor et al.,(1983) Immunol.Today 4:72）、EBV-ハイブリドーマ法（Cole et a
l.、(1985)、モノクローナル抗体および癌療法（Monoclonal Antibodies and Ca ncer Therapy )、アラン アール リス社(Alan R.Liss、Inc）、第77〜96頁）、あ
るいはトリオーマ法のような標準的な技法によりモノクローナル抗体を調製する
ために使用することができる、モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成する技
法は周知である（一般には、R.H.Kenneth、モノクローナル抗体:生物学分析にお
ける新次元（Monoclonal Antibodies:A New Dimension In Biological Analyses ）、プレナム出版社（Plenum Publishing Corp.)、ニューヨーク、ニューヨーク
(1980)；E.A.Lerner(1981) Yale J.Biol.Med.,54:387-402；M.L.Gefter et al.(
1977) Somatic Cell Genet.3:231-36)。簡単に説明すると不死化細胞系（典型的
には骨髄腫）を、上記のようにGDF-8またはGDF-11免疫原で免疫感作した哺乳動
物に由来するリンパ球（典型的には脾細胞）と融合し、そして生成したハイブリ
ドーマ細胞の培養上清をスクリーニングし、そしてGDF-8またはGDF-11に結合す
るハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体を同定する。
【００４９】 リンパ球と不死化細胞系を融合するために使用する任意の多くの周知プロトコ
ールを、GDF-8またはGDF-11モノクローナル抗体を生成する目的に応用すること
ができる（例えば、G.Galfre et al.(1977) Nature 266:55052；Galfre et al.S omatic Cell Genet. ,同上；Lerner,Yale J.Biol.Med.同上；Kenneth、Monoclona l Antibodies :同上を参照にされたい）。さらに当業者は、そのような方法の有
用な多くの変更が存在すると認識するだろう。典型的には不死化細胞系（例えば
骨髄腫細胞系）はリンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えばマウスのハイブ
リドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫感作したマウスに由来するリンパ球
を不死化したマウスの細胞系と融合することにより生成することができる。好適
な不死化細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する
培養基（“HAT"培地）に感受性であるマウスの骨髄腫細胞系である。標準的な技
法に従い融合のパートナーとして任意の多数の骨髄腫細胞系、例えばP3-NS1/1-A
g4-1、P3-x63-Ag8.653またはSp2/O-Ag14骨髄腫系を使用することができる。この
ような骨髄腫系はATCCから入手できる。典型的には、HAT-感受性マウス骨髄腫細
胞をポリエチレングリコール(“PEG")を使用してマウスの脾細胞と融合する。融
合から得られたハイブリドーマ細胞は次にHAT培地を使用して選択し、この培地
は非融合および非生産的に融合した骨髄腫細胞を殺す（非融合脾細胞は形質転換
しないので数日後に死ぬ）。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリド
ーマ細胞は、GDF-8またはGDF-11に結合するモノクローナル抗体について標準的
なELISAアッセイを使用してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすること
により検出する。
ールを、GDF-8またはGDF-11モノクローナル抗体を生成する目的に応用すること
ができる（例えば、G.Galfre et al.(1977) Nature 266:55052；Galfre et al.S omatic Cell Genet. ,同上；Lerner,Yale J.Biol.Med.同上；Kenneth、Monoclona l Antibodies :同上を参照にされたい）。さらに当業者は、そのような方法の有
用な多くの変更が存在すると認識するだろう。典型的には不死化細胞系（例えば
骨髄腫細胞系）はリンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えばマウスのハイブ
リドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫感作したマウスに由来するリンパ球
を不死化したマウスの細胞系と融合することにより生成することができる。好適
な不死化細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する
培養基（“HAT"培地）に感受性であるマウスの骨髄腫細胞系である。標準的な技
法に従い融合のパートナーとして任意の多数の骨髄腫細胞系、例えばP3-NS1/1-A
g4-1、P3-x63-Ag8.653またはSp2/O-Ag14骨髄腫系を使用することができる。この
ような骨髄腫系はATCCから入手できる。典型的には、HAT-感受性マウス骨髄腫細
胞をポリエチレングリコール(“PEG")を使用してマウスの脾細胞と融合する。融
合から得られたハイブリドーマ細胞は次にHAT培地を使用して選択し、この培地
は非融合および非生産的に融合した骨髄腫細胞を殺す（非融合脾細胞は形質転換
しないので数日後に死ぬ）。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリド
ーマ細胞は、GDF-8またはGDF-11に結合するモノクローナル抗体について標準的
なELISAアッセイを使用してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすること
により検出する。
【００５０】 本発明の別の観点では、GDF-8タンパク質フラグメントはGDF-8プロ−ドメイン
のすべてまたは一部を含んで成る。TGF-βのプロ-ドメインは成熟した活性なTGF
-βに対して阻害活性を有することが示された（Bottinger et al.,(1996) PNAS,
93,5877-5882；Gentry and Nash,(1990) Biochemistry,29,6851-6857)。GDF-8
はTGF-βのスーパーファミリーの一員であるので、GDF-8のプロ−ドメインも活
性なGDF-8に対するインヒビターとして作用し得る。GDF-8のプロ−ドメインは、
種々の発現系（例えばCHO、バキュロウイルス等）を使用してそれを発現させる
ことにより生成することができる。発現したGDF-8のプロ−ドメインは、例えば
Bottinger et al.（同上）に記載されている方法またはペプチドを精製するため
に当該技術分野で認識されている方法を使用して精製することができる。あるい
はプロ-ドメインは以下に記載するようにFLAGまたは6-Hisに付けることができる
。
のすべてまたは一部を含んで成る。TGF-βのプロ-ドメインは成熟した活性なTGF
-βに対して阻害活性を有することが示された（Bottinger et al.,(1996) PNAS,
93,5877-5882；Gentry and Nash,(1990) Biochemistry,29,6851-6857)。GDF-8
はTGF-βのスーパーファミリーの一員であるので、GDF-8のプロ−ドメインも活
性なGDF-8に対するインヒビターとして作用し得る。GDF-8のプロ−ドメインは、
種々の発現系（例えばCHO、バキュロウイルス等）を使用してそれを発現させる
ことにより生成することができる。発現したGDF-8のプロ−ドメインは、例えば
Bottinger et al.（同上）に記載されている方法またはペプチドを精製するため
に当該技術分野で認識されている方法を使用して精製することができる。あるい
はプロ-ドメインは以下に記載するようにFLAGまたは6-Hisに付けることができる
。
【００５１】 TGF-βについて得られた情報に基づき、成熟したGDF-8のＣ−末端に広がるペ
プチドフラグメントを設計し、そして合成することができる。好ましくはGDF-8
ペプチドフラグメントは約25アミノ酸長である。別の好適な態様では、GDF-8 ペプチドフラグメントは約20〜25、25〜30、30〜35、35〜40または40〜45アミノ
酸残基長の配列長を有することができる。前述のペンタコサペプチド後にモデル
化したGDF-8ペプチドは、本明細書に記載するアッセイを使用してGDF-8またはGD
F-11阻害活性について試験することができる。
プチドフラグメントを設計し、そして合成することができる。好ましくはGDF-8
ペプチドフラグメントは約25アミノ酸長である。別の好適な態様では、GDF-8 ペプチドフラグメントは約20〜25、25〜30、30〜35、35〜40または40〜45アミノ
酸残基長の配列長を有することができる。前述のペンタコサペプチド後にモデル
化したGDF-8ペプチドは、本明細書に記載するアッセイを使用してGDF-8またはGD
F-11阻害活性について試験することができる。
【００５２】 本発明の方法に使用するためのGDF-8またはGDF-11インヒビターは、GDF-8また
はGDF-11活性の阻害について試験する種々の適当なバイオアッセイを使用して同
定することができる。GDF-8またはGDF-11インヒビターがGDF-8またはGDF-11活性
を阻害する能力は、好ましくは特異的、すなわちGDF-8インヒビターはGDF-8タン
パク質を特異的に阻害することができ、そしてGDF-11インヒビターはGDF-11タン
パク質を特異的に阻害することができる。特定の態様では、GDF-8インヒビター
はGDF-11活性も阻害することもでき、そしてGDF-11インヒビターはGDF-8活性も
阻害することができる。
はGDF-11活性の阻害について試験する種々の適当なバイオアッセイを使用して同
定することができる。GDF-8またはGDF-11インヒビターがGDF-8またはGDF-11活性
を阻害する能力は、好ましくは特異的、すなわちGDF-8インヒビターはGDF-8タン
パク質を特異的に阻害することができ、そしてGDF-11インヒビターはGDF-11タン
パク質を特異的に阻害することができる。特定の態様では、GDF-8インヒビター
はGDF-11活性も阻害することもでき、そしてGDF-11インヒビターはGDF-8活性も
阻害することができる。
【００５３】 本明細書で使用するように、用語「バイオアッセイ」はGDF-8またはGDF-11イ
ンヒビターを同定すために設計された任意のアッセイを含む。このアッセイは、
GDF-8またはGDF-11がGDF-8またはGDF-11の１以上の生物学的機能を阻害できるか
どうかを同定するために適するインビトロまたはインビボのアッセイであること
ができる。適当なバイオアッセイの例には、DNA複製アッセイ、転写に基づくア
ッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、3T3-L1前-脂肪細胞の分化に基づくアッセ
イ、3T3-L1 脂肪細胞におけるグルコース取り込み制御に基づくアッセイおよび
免疫学的アッセイを含む（サブセクションIIに記載する）。
ンヒビターを同定すために設計された任意のアッセイを含む。このアッセイは、
GDF-8またはGDF-11がGDF-8またはGDF-11の１以上の生物学的機能を阻害できるか
どうかを同定するために適するインビトロまたはインビボのアッセイであること
ができる。適当なバイオアッセイの例には、DNA複製アッセイ、転写に基づくア
ッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、3T3-L1前-脂肪細胞の分化に基づくアッセ
イ、3T3-L1 脂肪細胞におけるグルコース取り込み制御に基づくアッセイおよび
免疫学的アッセイを含む（サブセクションIIに記載する）。
【００５４】 GDF-8はタンパク質レベル、したがって筋肉に特異的な酵素であるクレアチン
キナーゼの活性をモジュレートすることが確立されている。このGDF-8またはGDF
-11の効果は、GDF-8またはGDF-11インヒビターの可能性（potential)を含む画分
をスクリーニングするために使用することができる。このアッセイはマウス骨格
筋筋芽細胞系C1C12または11日目のニワトリの胚から単離した第１段階(primary)
のニワトリ筋芽細胞で行うことができる。細胞は細胞の未分化を維持する血清-
含有培養中で48ウェルトレイ中で成長させる。70％のコンフルエンスに達した時
、培地を１％血清に切り変え、これは分化およびクレアチンキナーゼの発現を可
能とする。切り変えの時、可能性のあるGDF-8またはGDF-11阻害画分を同じウェ
ルに加え、いくから後にGDF-8またはGDF-11自体を加える。細胞はさらに２〜３
日間インキュベーターに戻す。最後に細胞を溶解し、そして溶解物中のクレアチ
ンキナーゼ活性を市販されているキット（モンタナ州、セントルイスのシグマ（
Sigma)から販売されている）を使用して測定する。用途 １つの態様では、本発明の方法はインビトロまたはインビボのいずれかで使用
して、GLUT4またはGLUT1のようなヘキソース トランスポーターの発現を、筋肉
および／または脂肪細胞のようなこのようなトランスポーターを発現する細胞中
でモジュレート（すなわちアップレギュレート）するために使用することができ
る。これは細胞中または細胞外のGDF-8またはGDF-11の活性または発現を阻害す
ることにより成される。
キナーゼの活性をモジュレートすることが確立されている。このGDF-8またはGDF
-11の効果は、GDF-8またはGDF-11インヒビターの可能性（potential)を含む画分
をスクリーニングするために使用することができる。このアッセイはマウス骨格
筋筋芽細胞系C1C12または11日目のニワトリの胚から単離した第１段階(primary)
のニワトリ筋芽細胞で行うことができる。細胞は細胞の未分化を維持する血清-
含有培養中で48ウェルトレイ中で成長させる。70％のコンフルエンスに達した時
、培地を１％血清に切り変え、これは分化およびクレアチンキナーゼの発現を可
能とする。切り変えの時、可能性のあるGDF-8またはGDF-11阻害画分を同じウェ
ルに加え、いくから後にGDF-8またはGDF-11自体を加える。細胞はさらに２〜３
日間インキュベーターに戻す。最後に細胞を溶解し、そして溶解物中のクレアチ
ンキナーゼ活性を市販されているキット（モンタナ州、セントルイスのシグマ（
Sigma)から販売されている）を使用して測定する。用途 １つの態様では、本発明の方法はインビトロまたはインビボのいずれかで使用
して、GLUT4またはGLUT1のようなヘキソース トランスポーターの発現を、筋肉
および／または脂肪細胞のようなこのようなトランスポーターを発現する細胞中
でモジュレート（すなわちアップレギュレート）するために使用することができ
る。これは細胞中または細胞外のGDF-8またはGDF-11の活性または発現を阻害す
ることにより成される。
【００５５】 別の態様では、本発明の方法はインビトロまたはインビボのいずれかでインス
リン感受性かつ／または細胞によるグルコースの取り込みを増加させるために使
用することができる。
リン感受性かつ／または細胞によるグルコースの取り込みを増加させるために使
用することができる。
【００５６】 別の態様では、本発明の方法は不十分なGLUT4発現、インスリン機能不全（例
えば耐性、不活性または欠乏）かつ／または細胞中への不十分なグルコース取り
込みを特徴とする疾患を処置するために使用することができる。そのような疾患
は、限定するわけではないが糖尿病、高血糖症および肥満症を含む。
えば耐性、不活性または欠乏）かつ／または細胞中への不十分なグルコース取り
込みを特徴とする疾患を処置するために使用することができる。そのような疾患
は、限定するわけではないが糖尿病、高血糖症および肥満症を含む。
【００５７】 別の態様では、本発明の方法は新規なインビトロモデルを作成するために使用
することができ、このモデルではGDF-8が脂肪細胞中のグルコースの取り込みま
たは代謝を調査するために使用される。インビボの筋肉および脂肪で特異的に発
現するGDF-8は、3T3-L1脂肪細胞の分化を直接的または間接的阻害し、脂肪細胞
−特異的な遺伝子の発現を抑制する（例えばGLUT4トランスポーター）。したが
ってGDF-8は、3T3-L1細胞系でこのような遺伝子のプロトタイプの調節物質(regu
lator)として使用することができる。この系は限定するわけではないが、転写因
子、シグナル伝達タンパク質、レプチン、脂肪酸結合タンパク質、脂肪酸シンタ
ーゼ、ペルオキソーム増殖剤応答性受容体、脱共役タンパク質１および２のよう
な分子の脂肪細胞−特異的な遺伝子発現およびタンパク質活性、ならびにGDF-8
の作用により活性化、不活性化または改質される分子の調節に、GDF-8が果たす
役割を理解するためのモデルとなることができる。
することができ、このモデルではGDF-8が脂肪細胞中のグルコースの取り込みま
たは代謝を調査するために使用される。インビボの筋肉および脂肪で特異的に発
現するGDF-8は、3T3-L1脂肪細胞の分化を直接的または間接的阻害し、脂肪細胞
−特異的な遺伝子の発現を抑制する（例えばGLUT4トランスポーター）。したが
ってGDF-8は、3T3-L1細胞系でこのような遺伝子のプロトタイプの調節物質(regu
lator)として使用することができる。この系は限定するわけではないが、転写因
子、シグナル伝達タンパク質、レプチン、脂肪酸結合タンパク質、脂肪酸シンタ
ーゼ、ペルオキソーム増殖剤応答性受容体、脱共役タンパク質１および２のよう
な分子の脂肪細胞−特異的な遺伝子発現およびタンパク質活性、ならびにGDF-8
の作用により活性化、不活性化または改質される分子の調節に、GDF-8が果たす
役割を理解するためのモデルとなることができる。
【００５８】 本発明の方法の他の用途は、当業者には以下の実施例および特許請求の範囲か
ら明らかとなるであろう。医薬組成物中のGDF-8およびGDF-11インヒビターの投与 本発明の方法に使用するGDF-8およびGDF-11インヒビターは、一般に適当な医
薬組成物の状態で個体に投与される。そのような組成物は、典型的にはインヒビ
ターおよび医薬的に許容できるキャリアーを含む。本明細書で使用する「医薬的
に許容できるキャリアー」とは、医薬投与に適合する任意かつすべての溶媒、分
散媒質、コーティング、抗バクテリアおよび抗菌・カビ剤、等張剤および吸収遅
延剤等を含むことを意図する。医薬的に活性な物質にそのような媒質および薬剤
を使用することは、当該技術分野では周知である。GDF-8インヒビターと適合し
ない通例の媒質または薬剤を除く限り、組成物中へのそれらの使用を意図する。
補助的に活性な化合物も組成物に包含することができる。
ら明らかとなるであろう。医薬組成物中のGDF-8およびGDF-11インヒビターの投与 本発明の方法に使用するGDF-8およびGDF-11インヒビターは、一般に適当な医
薬組成物の状態で個体に投与される。そのような組成物は、典型的にはインヒビ
ターおよび医薬的に許容できるキャリアーを含む。本明細書で使用する「医薬的
に許容できるキャリアー」とは、医薬投与に適合する任意かつすべての溶媒、分
散媒質、コーティング、抗バクテリアおよび抗菌・カビ剤、等張剤および吸収遅
延剤等を含むことを意図する。医薬的に活性な物質にそのような媒質および薬剤
を使用することは、当該技術分野では周知である。GDF-8インヒビターと適合し
ない通例の媒質または薬剤を除く限り、組成物中へのそれらの使用を意図する。
補助的に活性な化合物も組成物に包含することができる。
【００５９】 本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤される。
適当な投与経路の例は、非経口、例えば静脈内、経皮内、皮下、経口（例えば吸
入）、経皮（局所的）、経粘膜(transmucosal)、および直腸投与を含む。非経口
、経皮内または皮下投与に使用される溶剤または懸濁剤は、以下の成分を含むこ
とができる：注入用水のような滅菌希釈水、塩溶液、固定油、ポリエチレングリ
コール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアル
コールまたはメチルパラベンのような抗バクテリア剤；アスコルビン酸または重
亜硫酸ナトリウムのような酸化防止剤；エチレンジアミンテトラ酢酸のような錯
化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のようなバッファーおよび塩化ナトリ
ウムまたはデキストロースのような張性調節剤。pHは塩酸または水酸化ナトリウ
ムのような酸または塩基により調整することができる。非経口用調製物は、ガラ
スまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアルに
包含することができる。
適当な投与経路の例は、非経口、例えば静脈内、経皮内、皮下、経口（例えば吸
入）、経皮（局所的）、経粘膜(transmucosal)、および直腸投与を含む。非経口
、経皮内または皮下投与に使用される溶剤または懸濁剤は、以下の成分を含むこ
とができる：注入用水のような滅菌希釈水、塩溶液、固定油、ポリエチレングリ
コール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアル
コールまたはメチルパラベンのような抗バクテリア剤；アスコルビン酸または重
亜硫酸ナトリウムのような酸化防止剤；エチレンジアミンテトラ酢酸のような錯
化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のようなバッファーおよび塩化ナトリ
ウムまたはデキストロースのような張性調節剤。pHは塩酸または水酸化ナトリウ
ムのような酸または塩基により調整することができる。非経口用調製物は、ガラ
スまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアルに
包含することができる。
【００６０】 注入可能な使用に適する医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分
散液および即座に調製される滅菌の注入可能な溶剤または分散剤用の滅菌粉末を
含む。静脈内投与には、適当なキャリアーには生理学的塩溶液、静菌水、Cremop
hor EL(商標)(BASF、パリスパニー、ニュージャージー州）またはリン酸緩衝化
塩溶液（PBS）を含む。すべての場合で、組成物は滅菌されなければならず、し
かもシリンジが容易に利用できる程度に流体であるべきである。これは製造およ
び保存の条件下で安定でなければならず、そしてバクテリアおよび菌類のような
微生物の混入作用に対して保護されなければならない。キャリアーは、例えば水
、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、およ
び液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの適当な混合物を含む溶媒また
は分散媒質であることができる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコー
ティングを使用することにより、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持するこ
とにより、および表面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用
の保護は、種々の抗バクテリアおよび抗菌・カビ剤、例えばパラベン、クロロブ
タノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成できる。多
くの場合で張性剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコ
ール、塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましいだろう。注入可能な組成物
の持効的吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウ
ムおよびゼラチンを組成物中に含めることによりもたらすことができる。
散液および即座に調製される滅菌の注入可能な溶剤または分散剤用の滅菌粉末を
含む。静脈内投与には、適当なキャリアーには生理学的塩溶液、静菌水、Cremop
hor EL(商標)(BASF、パリスパニー、ニュージャージー州）またはリン酸緩衝化
塩溶液（PBS）を含む。すべての場合で、組成物は滅菌されなければならず、し
かもシリンジが容易に利用できる程度に流体であるべきである。これは製造およ
び保存の条件下で安定でなければならず、そしてバクテリアおよび菌類のような
微生物の混入作用に対して保護されなければならない。キャリアーは、例えば水
、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、およ
び液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの適当な混合物を含む溶媒また
は分散媒質であることができる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコー
ティングを使用することにより、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持するこ
とにより、および表面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用
の保護は、種々の抗バクテリアおよび抗菌・カビ剤、例えばパラベン、クロロブ
タノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成できる。多
くの場合で張性剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコ
ール、塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましいだろう。注入可能な組成物
の持効的吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウ
ムおよびゼラチンを組成物中に含めることによりもたらすことができる。
【００６１】 滅菌の注入可能な溶剤は、GDF-8インヒビターを必要に応じて上記に挙げた１
以上の成分と組み合わせて必要な量で適切な溶媒に包含し、続いて濾過滅菌する
ことにより調製することができる。一般に分散剤は、GDF-8インヒビターを基材
となる分散媒質および上に挙げた必要な他の成分を含む滅菌賦形剤に包含するこ
とにより調製できる。滅菌された注入溶剤を調製するための滅菌粉末の場合は、
好適な調製法は前以て滅菌濾過したそれらの溶液から有効成分の粉末に加えてさ
らに任意の所望する成分を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
以上の成分と組み合わせて必要な量で適切な溶媒に包含し、続いて濾過滅菌する
ことにより調製することができる。一般に分散剤は、GDF-8インヒビターを基材
となる分散媒質および上に挙げた必要な他の成分を含む滅菌賦形剤に包含するこ
とにより調製できる。滅菌された注入溶剤を調製するための滅菌粉末の場合は、
好適な調製法は前以て滅菌濾過したそれらの溶液から有効成分の粉末に加えてさ
らに任意の所望する成分を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【００６２】 経口用組成物は一般に、不活性な希釈剤または可食性キャリアーを含む。それ
らはゼラチンカプセルに包含されるか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療剤
投与の目的には、GDF-8インヒビターを補形剤に包含させ、そして錠剤、トロー
チおよびカプセルの形態で使用することができる。経口組成物は、口中清浄剤用
として使用するために流体キャリアーを使用して調製することもでき、ここで流
体キャリアー中の化合物が経口で適用され、そして口をすすぎ、そして吐き出さ
れるか、または飲み込まれ得る。医薬的に適合する結合剤、および／または補助
材料も、組成物の一部として含むことができる。錠剤、ピル、カプセル、トロー
チ等は、以下の任意の成分または同様の性質の化合物を含むことができる：微結
晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンのような結合剤；澱粉またはラ
クトースのような補形剤、アルギン酸、Primogelまたはコーンスターチのような
崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesのような潤滑剤；コロイド状
二酸化珪素のようなグライダント(glidant)；シュクロースまたはサッカリンの
ような甘味料；ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料のような香
料。
らはゼラチンカプセルに包含されるか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療剤
投与の目的には、GDF-8インヒビターを補形剤に包含させ、そして錠剤、トロー
チおよびカプセルの形態で使用することができる。経口組成物は、口中清浄剤用
として使用するために流体キャリアーを使用して調製することもでき、ここで流
体キャリアー中の化合物が経口で適用され、そして口をすすぎ、そして吐き出さ
れるか、または飲み込まれ得る。医薬的に適合する結合剤、および／または補助
材料も、組成物の一部として含むことができる。錠剤、ピル、カプセル、トロー
チ等は、以下の任意の成分または同様の性質の化合物を含むことができる：微結
晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンのような結合剤；澱粉またはラ
クトースのような補形剤、アルギン酸、Primogelまたはコーンスターチのような
崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesのような潤滑剤；コロイド状
二酸化珪素のようなグライダント(glidant)；シュクロースまたはサッカリンの
ような甘味料；ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料のような香
料。
【００６３】 吸入による投与には、化合物は適当な高圧剤、例えば二酸化炭素のようなガス
を含む加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからエアゾールスプ
レーのような状態で送達される。
を含む加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからエアゾールスプ
レーのような状態で送達される。
【００６４】 全身投与は、経粘膜的または経皮的手段によっても投与することができる。経
粘膜的または経皮的投与には、浸透すべきバリアに適当な浸透剤を製剤に使用す
る。そのような浸透剤は一般に当該技術分野では既知であり、そして例えば粘膜
的投与には界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。粘膜的投与は
鼻内スプレーまたは坐薬の使用を通して行うことができる。経皮的投与には、活
性化合物を当該技術分野で一般的に知られているような軟膏、膏薬、ゲルまたは
クリームに製剤する。
粘膜的または経皮的投与には、浸透すべきバリアに適当な浸透剤を製剤に使用す
る。そのような浸透剤は一般に当該技術分野では既知であり、そして例えば粘膜
的投与には界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。粘膜的投与は
鼻内スプレーまたは坐薬の使用を通して行うことができる。経皮的投与には、活
性化合物を当該技術分野で一般的に知られているような軟膏、膏薬、ゲルまたは
クリームに製剤する。
【００６５】 GDF-8インヒビターは、坐薬の形態（例えばカカオバターおよび他のグリセリ
ドのような通例の坐薬用基剤を用いて）または直腸送達のための停留浣腸に調製
することもできる。
ドのような通例の坐薬用基剤を用いて）または直腸送達のための停留浣腸に調製
することもできる。
【００６６】 １つの態様では、GDF-8インヒビターは制御された放出製剤のような化合物が
体内から急速に排除されことを防ぐキャリアーを用いて調製され、インプラント
およびマイクロカプセル化送達系を含む。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポ
リグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分
解性、生物適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製法は
、当業者には明らかである。この材料はアルザ コーポレーション(Alza Corpora
tion）およびノバ ファルマシューティカル社(Nova Pharmaceutical Inc.)から
得ることもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗
体を持つ感染した細胞を標的とするリポソームを含む）も、医薬的に許容できる
キャリアーとして使用することができる。これらは例えば米国特許第4,522,811
号明細書に記載されているように、当業者には既知の方法に従い調製することが
できる。
体内から急速に排除されことを防ぐキャリアーを用いて調製され、インプラント
およびマイクロカプセル化送達系を含む。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポ
リグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分
解性、生物適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製法は
、当業者には明らかである。この材料はアルザ コーポレーション(Alza Corpora
tion）およびノバ ファルマシューティカル社(Nova Pharmaceutical Inc.)から
得ることもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗
体を持つ感染した細胞を標的とするリポソームを含む）も、医薬的に許容できる
キャリアーとして使用することができる。これらは例えば米国特許第4,522,811
号明細書に記載されているように、当業者には既知の方法に従い調製することが
できる。
【００６７】 経口または非経口組成物は投与の容易さおよび用量の均一性のために、単位剤
形に製剤することが特に有利である。本明細書で使用する単位剤形とは、処置す
る個体に単位用量として適当な物理的に別れた単位であり；各単位は必要な医薬
的キャリアーと共に所望する治療効果を生成するように算出された予め決定され
た量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物および達
成される特定な治療効果に独特な特徴ならびに個体の処置のためのそのような化
合物の製剤技術に固有な限界により決定され、そして直接的に依存する。
形に製剤することが特に有利である。本明細書で使用する単位剤形とは、処置す
る個体に単位用量として適当な物理的に別れた単位であり；各単位は必要な医薬
的キャリアーと共に所望する治療効果を生成するように算出された予め決定され
た量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物および達
成される特定な治療効果に独特な特徴ならびに個体の処置のためのそのような化
合物の製剤技術に固有な限界により決定され、そして直接的に依存する。
【００６８】 そのような化合物の毒性および治療効力は、例えばLD50（群の50％に致死的な
用量）およびED50（群の50％に治療効果がある用量）を決定するために、細胞培
養または実験動物で標準的な製薬的手順により決定することができる。毒性と治
療効力との間の用量比が治療指数であり、そして比LD50／ED50として表すことが
できる。大きな治療指数を有するGDF-8インヒビターが好ましい。毒性の副作用
を表すGDF-8インヒビターを使用してもよいが、非感染細胞に与え得る損害を最
小にするために、影響を及ぼす組織の部位にそのようなGDF-8インヒビターを標
的とする送達系の設計には注意を払うべきであり、これにより副作用を減らす。
用量）およびED50（群の50％に治療効果がある用量）を決定するために、細胞培
養または実験動物で標準的な製薬的手順により決定することができる。毒性と治
療効力との間の用量比が治療指数であり、そして比LD50／ED50として表すことが
できる。大きな治療指数を有するGDF-8インヒビターが好ましい。毒性の副作用
を表すGDF-8インヒビターを使用してもよいが、非感染細胞に与え得る損害を最
小にするために、影響を及ぼす組織の部位にそのようなGDF-8インヒビターを標
的とする送達系の設計には注意を払うべきであり、これにより副作用を減らす。
【００６９】 細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するため
の投薬範囲に製剤するために使用することができる。そのような化合物の投薬量
は、好ましくは毒性がわずかにしかないか、または無いED50を含む循環濃度の範
囲内である。投薬量は使用する剤形および利用する投与経路に依存してこの範囲
内で変動することができる。本発明の方法で使用する任意のGDF-8インヒビター
について、治療に効果的な用量は最初に細胞培養アッセイから予想することがで
きる。用量を動物モデルに製剤して細胞培養で決定したIC50を含む循環血漿濃度
範囲に到達させる（すなわち、最大の症状を半分に抑制する試験GDF-8インヒビ
ターの濃度）。そのような情報を使用して、ヒトにおいてより正確な有用な用量
を決定する。血漿中のレベルは例えば高性能液体クロマトグラフィーにより測定
することができる。
の投薬範囲に製剤するために使用することができる。そのような化合物の投薬量
は、好ましくは毒性がわずかにしかないか、または無いED50を含む循環濃度の範
囲内である。投薬量は使用する剤形および利用する投与経路に依存してこの範囲
内で変動することができる。本発明の方法で使用する任意のGDF-8インヒビター
について、治療に効果的な用量は最初に細胞培養アッセイから予想することがで
きる。用量を動物モデルに製剤して細胞培養で決定したIC50を含む循環血漿濃度
範囲に到達させる（すなわち、最大の症状を半分に抑制する試験GDF-8インヒビ
ターの濃度）。そのような情報を使用して、ヒトにおいてより正確な有用な用量
を決定する。血漿中のレベルは例えば高性能液体クロマトグラフィーにより測定
することができる。
【００７０】 医薬組成物は投与のための説明書と一緒に容器、パックまたはディスペンサー
に含まれ得る。
に含まれ得る。
【００７１】 本発明のGDF-8インヒビター、例えばアンチ−センスオリゴヌクレオチドイン
ヒビターはさらにベクターに挿入され、そして遺伝子治療に使用され得る。遺伝
子治療法ベクターは、例えば静脈内注入、局所投与（米国特許第5,328,470号明
細書を参照にされたい）により、あるいは定位注入（Chen et al.,(1994) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 91:3054-3057を参照にされたい）により個体に送達すること
ができる。遺伝子治療ベクターの医薬組成物は、許容できる希釈剤中に遺伝子治
療ベクターを含むことができ、あるいは遺伝子送達賦形剤が埋め込まれた徐放性
マトリックスを含んで成ることができる。あるいは完全な遺伝子送達ベクターが
組換え細胞（例えばレトロウイルスベクター）から完全に生産できる場合、医薬
調製物は遺伝子送達系を生産する１以上の細胞を含むことができる。
ヒビターはさらにベクターに挿入され、そして遺伝子治療に使用され得る。遺伝
子治療法ベクターは、例えば静脈内注入、局所投与（米国特許第5,328,470号明
細書を参照にされたい）により、あるいは定位注入（Chen et al.,(1994) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 91:3054-3057を参照にされたい）により個体に送達すること
ができる。遺伝子治療ベクターの医薬組成物は、許容できる希釈剤中に遺伝子治
療ベクターを含むことができ、あるいは遺伝子送達賦形剤が埋め込まれた徐放性
マトリックスを含んで成ることができる。あるいは完全な遺伝子送達ベクターが
組換え細胞（例えばレトロウイルスベクター）から完全に生産できる場合、医薬
調製物は遺伝子送達系を生産する１以上の細胞を含むことができる。
【００７２】 遺伝子治療に使用するために適するベクターは、当該技術分野では周知である
。例えばアデノウイルスに由来するベクターを使用することができる。アデノウ
イルスのゲノムは、それが目的の遺伝子産物をコードしそして発現するが、正常
な溶菌のウイルス生活環で複製する能力という点においては不活性化されるよう
に操作することができる。例えばBerkner et al.,(1988) BioTechniques 6:616
；Rosenfeld et al.(1991) Science 252:431-434；およびRosenfeld et al.(199
2) Cell 68:143-155を参照にされたい。アデノウイルスAd型 5 dl324株または他
のアデノウイルス株（例えばAd2、Ad3、Ad7等）に由来する適当なアデノウイル
スベクターは、当業者には周知である。組換えアデノウイルスはそれらが非分割
細胞に感染できない特定の状況において有利となり得る。さらにウイルス粒子は
比較的安定であり、そして精製および濃縮することができ、そして上記のように
感染性のスペクトルに影響を及ぼすように改質することができる。さらに導入さ
れたアデノウイルスDNA（およびそれに含まれる外来DNA）は宿主細胞のゲノム中
には組み込まれないがエピソームには残り、これにより導入されたDNAが宿主ゲ
ノムの組み込まれる状況で挿入変異の結果として起こり得る問題の潜在性を回避
する（例えばレトロウイルスDNA）。さらに外来DNAに関してアデノウイルスゲノ
ムの運搬能力は、他の遺伝子送達ベクターに比して大きい（８キロベースまで）
（Berkner et al.同上；Haj-Ahmand and Graham(1986) J.Virol.57:267）。現在
使用されているほとんどの複製−欠失アデノウイルスベクター、そしてそれゆえ
に本発明で好ましいのは、ウイルスE1およびE3遺伝子のすべてまたは部分が欠失
しているが、80％ものアデノウイルス遺伝子材料を保持している（例えばJones
et al.(1979) Cell 16:683；Berkner et al.,同上；およびGraham et al.、分子
生物学の方法（Methods in Molecular Biology）、E.J.Murray編集（フマナ(Hum
ana)、クリフトン、ニュージャージー州、1991）、第７巻、第109〜127頁）。核
酸分子中に含まれる目的遺伝子の発現は、例えばE1Aプロモーター、主要後期プ
ロモーター（MLP）および付随するリーダー配列、E3プロモーター、または異種
の付加されたプロモーター配列の制御下であることができる。
。例えばアデノウイルスに由来するベクターを使用することができる。アデノウ
イルスのゲノムは、それが目的の遺伝子産物をコードしそして発現するが、正常
な溶菌のウイルス生活環で複製する能力という点においては不活性化されるよう
に操作することができる。例えばBerkner et al.,(1988) BioTechniques 6:616
；Rosenfeld et al.(1991) Science 252:431-434；およびRosenfeld et al.(199
2) Cell 68:143-155を参照にされたい。アデノウイルスAd型 5 dl324株または他
のアデノウイルス株（例えばAd2、Ad3、Ad7等）に由来する適当なアデノウイル
スベクターは、当業者には周知である。組換えアデノウイルスはそれらが非分割
細胞に感染できない特定の状況において有利となり得る。さらにウイルス粒子は
比較的安定であり、そして精製および濃縮することができ、そして上記のように
感染性のスペクトルに影響を及ぼすように改質することができる。さらに導入さ
れたアデノウイルスDNA（およびそれに含まれる外来DNA）は宿主細胞のゲノム中
には組み込まれないがエピソームには残り、これにより導入されたDNAが宿主ゲ
ノムの組み込まれる状況で挿入変異の結果として起こり得る問題の潜在性を回避
する（例えばレトロウイルスDNA）。さらに外来DNAに関してアデノウイルスゲノ
ムの運搬能力は、他の遺伝子送達ベクターに比して大きい（８キロベースまで）
（Berkner et al.同上；Haj-Ahmand and Graham(1986) J.Virol.57:267）。現在
使用されているほとんどの複製−欠失アデノウイルスベクター、そしてそれゆえ
に本発明で好ましいのは、ウイルスE1およびE3遺伝子のすべてまたは部分が欠失
しているが、80％ものアデノウイルス遺伝子材料を保持している（例えばJones
et al.(1979) Cell 16:683；Berkner et al.,同上；およびGraham et al.、分子
生物学の方法（Methods in Molecular Biology）、E.J.Murray編集（フマナ(Hum
ana)、クリフトン、ニュージャージー州、1991）、第７巻、第109〜127頁）。核
酸分子中に含まれる目的遺伝子の発現は、例えばE1Aプロモーター、主要後期プ
ロモーター（MLP）および付随するリーダー配列、E3プロモーター、または異種
の付加されたプロモーター配列の制御下であることができる。
【００７３】 本発明のGDF-8インヒビターの送達に有用なさらに別のウイルスベクター系は
、アデノ−随伴ウイルス（AAV）である。アデノ−随伴ウイルスは、効率的な複
製および増殖的生活環のためにヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘ
ルペスウイルスのような別のウイルスを必要とする自然に存在する欠失ウイルス
である（総説としてMuzyczka et al.Curr.Topics in Micro.and Immunol.(1992)
158:97-129を参照にされたい）。アデノ-随伴ウイルスは高頻度の安定な組み込
みを表す（例えばFlotte et al.(1992) Am J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356;
Samulski et al.(1988) J.Virol.63:3822-3828;およびMcLaughlin et al.(1989)
J.Virol.62:1963-1973を参照にされたい）。わずか300塩基対のAAVを含有する
ベクターをパッケージし、そして組み込むことができる。外因性DNAに関する空
間は約4.5kbに限定されている。Tratschin et al.(1985) Mol.Cell Biol.5:3251
-3260に記載されているようなAAVベクターを使用して、DNAをＴ細胞に導入する
ことができる。種々の核酸がAAVベクターを使用して異なる細胞型に導入された
（例えばHermonat et al.(1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470；Trats
chin et al.(1985) Mol.Cell Biol.4:2072-2081；Wondisford et al.(1988) Mol .Endcrinol .2:32-39；Tratschin et al.(1984) J.Virol.51:611-619；およびFlo
tte et al.(1993) J.Biol.Chem.268:3781-3790を参照にされたい）。本発明のGD
F-8インヒビターの送達に有用となり得る他のウイルスベクター系は、ヘルペス
ウイルス、ワクシニアウイルスおよび数種のRNAウイルスに由来する。
、アデノ−随伴ウイルス（AAV）である。アデノ−随伴ウイルスは、効率的な複
製および増殖的生活環のためにヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘ
ルペスウイルスのような別のウイルスを必要とする自然に存在する欠失ウイルス
である（総説としてMuzyczka et al.Curr.Topics in Micro.and Immunol.(1992)
158:97-129を参照にされたい）。アデノ-随伴ウイルスは高頻度の安定な組み込
みを表す（例えばFlotte et al.(1992) Am J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356;
Samulski et al.(1988) J.Virol.63:3822-3828;およびMcLaughlin et al.(1989)
J.Virol.62:1963-1973を参照にされたい）。わずか300塩基対のAAVを含有する
ベクターをパッケージし、そして組み込むことができる。外因性DNAに関する空
間は約4.5kbに限定されている。Tratschin et al.(1985) Mol.Cell Biol.5:3251
-3260に記載されているようなAAVベクターを使用して、DNAをＴ細胞に導入する
ことができる。種々の核酸がAAVベクターを使用して異なる細胞型に導入された
（例えばHermonat et al.(1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470；Trats
chin et al.(1985) Mol.Cell Biol.4:2072-2081；Wondisford et al.(1988) Mol .Endcrinol .2:32-39；Tratschin et al.(1984) J.Virol.51:611-619；およびFlo
tte et al.(1993) J.Biol.Chem.268:3781-3790を参照にされたい）。本発明のGD
F-8インヒビターの送達に有用となり得る他のウイルスベクター系は、ヘルペス
ウイルス、ワクシニアウイルスおよび数種のRNAウイルスに由来する。
【００７４】 以下の実施例は具体的に説明することを意図し、本発明を限定するものではな
い。それらは使用される典型的な例であるが、当業者に周知他の手法もあるいは
使用してよい。
い。それらは使用される典型的な例であるが、当業者に周知他の手法もあるいは
使用してよい。
【００７５】
【実施例】材料および方法 以下の実験は、Intracel（ロックヴィル、メリーランド州）で６週齢のBalc/c
マウスを使用して行った。GDF-8ノックアウトおよび野生型（対照）マウスはS.J
.Lee博士から得た（ジョンズ ホプキンス大学、Mcpherron et al.,Nature 387:8
3-90(1997)を参照にされたい）。
マウスを使用して行った。GDF-8ノックアウトおよび野生型（対照）マウスはS.J
.Lee博士から得た（ジョンズ ホプキンス大学、Mcpherron et al.,Nature 387:8
3-90(1997)を参照にされたい）。
【００７６】 組換えヒトGDF-8はチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞で生産した。分泌
したタンパク質は、幾つかのクロマトグラフィー工程を使用して精製して実質的
に均一なGDF-8を得た。
したタンパク質は、幾つかのクロマトグラフィー工程を使用して精製して実質的
に均一なGDF-8を得た。
【００７７】 他の材料および方法は、以下の実施例に記載する。実施例１−筋肉細胞中のGLUT4タンパク質発現に及ぼすGDF-8ノックアウトの効果 筋肉細胞のグルコーストランスポーターであるGLUT4のタンパク質発現に及ぼ
す自然なGDF-8発現のノックアウトの影響を評価するために、種々の筋肉サンプ
ルを野生型およびGDF-8ノックアウトマウスから得た。筋肉サンプルは10（容量
／容量）％の中性緩衝化ホルムアルデヒド（スタットラボ（StatLab）、レヴィ
スヴィル、テキサス州）中で室温にて８時間固定し、続いてParaplast(商標)X-t
ra組織−包埋媒質（オックスフォード ラボウェア(Oxford Labware)、セントル
イス、モンタナ州）に包埋した。マウスの筋肉サンプルの断面を調製した。スラ
イドはGLUT4ノ免疫検出に先だちオーブン中で60℃に少なくとも30分間暖めた。
パラフィン切片をキシレンで３回、各回５分間パラフィンを除いた。切片は再度
水和し、そして次に「抗体希釈剤」（DAKO、カルピンテリア、カリフォルニア州
）中の20％の正常ヤギ血清で20分間ブロックした（ベクター（Vector)、バーリ
ンガム、カリフォルニア州）。切片は、抗体希釈剤で２μg/mlの濃度に希釈した
ウサギ抗-GLUT4（アルファ ダイアグノスティク インターナショナル(Alpha Dia
gnostic International)、サン アントニオ、テキサス州）と、室温にて一晩イ
ンキューベーションした。切片をOptiMax 洗浄バッファー（バイオジェネックス
（Biogenex、サンラモン、カリフォルニア州）ですすぎ、そしてビオチン化ヤギ
抗−ウサギ免疫グロブリン（バイオジェネックス）と、結合したストレプトアビ
ジン（バイオジェネックス）について30分間インキューベーションした。切片を
洗浄バッファーですすぎ、そして次に抗体結合部位を視覚化するためにDAB基質
（DAKO）を適用した。切片をメチルグリーン（DAKO）でカウンター染色し、そし
てCytoseal（商標）60（ステファンズ サイエンティフィック(Stephens Scienti
fic）、リバーダーレ、ニュージャージー州）を使用して固定した。茶色い染色
はGLUT4の発現を示し、そして緑色の染色は核を同定する。
す自然なGDF-8発現のノックアウトの影響を評価するために、種々の筋肉サンプ
ルを野生型およびGDF-8ノックアウトマウスから得た。筋肉サンプルは10（容量
／容量）％の中性緩衝化ホルムアルデヒド（スタットラボ（StatLab）、レヴィ
スヴィル、テキサス州）中で室温にて８時間固定し、続いてParaplast(商標)X-t
ra組織−包埋媒質（オックスフォード ラボウェア(Oxford Labware)、セントル
イス、モンタナ州）に包埋した。マウスの筋肉サンプルの断面を調製した。スラ
イドはGLUT4ノ免疫検出に先だちオーブン中で60℃に少なくとも30分間暖めた。
パラフィン切片をキシレンで３回、各回５分間パラフィンを除いた。切片は再度
水和し、そして次に「抗体希釈剤」（DAKO、カルピンテリア、カリフォルニア州
）中の20％の正常ヤギ血清で20分間ブロックした（ベクター（Vector)、バーリ
ンガム、カリフォルニア州）。切片は、抗体希釈剤で２μg/mlの濃度に希釈した
ウサギ抗-GLUT4（アルファ ダイアグノスティク インターナショナル(Alpha Dia
gnostic International)、サン アントニオ、テキサス州）と、室温にて一晩イ
ンキューベーションした。切片をOptiMax 洗浄バッファー（バイオジェネックス
（Biogenex、サンラモン、カリフォルニア州）ですすぎ、そしてビオチン化ヤギ
抗−ウサギ免疫グロブリン（バイオジェネックス）と、結合したストレプトアビ
ジン（バイオジェネックス）について30分間インキューベーションした。切片を
洗浄バッファーですすぎ、そして次に抗体結合部位を視覚化するためにDAB基質
（DAKO）を適用した。切片をメチルグリーン（DAKO）でカウンター染色し、そし
てCytoseal（商標）60（ステファンズ サイエンティフィック(Stephens Scienti
fic）、リバーダーレ、ニュージャージー州）を使用して固定した。茶色い染色
はGLUT4の発現を示し、そして緑色の染色は核を同定する。
【００７８】 図１Ａおよび１Ｂに示すように、GDF-8ノックアウトマウスのサンプルは調査
した筋肉の種類にかかわらず野生型のサンプルと比較して有意に増加したGLUT4
発現を示す（抗-GLUT4抗体で有意に上昇した染色により示されるように）。これ
はGDF-8がこのようなマウスでGLUT4の発現に低下を引き起こしたにとを示してい
る。実施例２−筋肉細胞中のGLUT4タンパク質発現に及ぼすGDF-8投与の効果 実施例１で見いだされたことの逆、すなわち外因性のGDF-8が筋肉細胞中でGLU
T4の発現を抑えるかどうか（実施例１から予想されるように）、そしてまたGDF-
8の投与がGLUT4刺激物であるインスリンの効果を打ち消すことができるかどうか
を評価するために行った。
した筋肉の種類にかかわらず野生型のサンプルと比較して有意に増加したGLUT4
発現を示す（抗-GLUT4抗体で有意に上昇した染色により示されるように）。これ
はGDF-8がこのようなマウスでGLUT4の発現に低下を引き起こしたにとを示してい
る。実施例２−筋肉細胞中のGLUT4タンパク質発現に及ぼすGDF-8投与の効果 実施例１で見いだされたことの逆、すなわち外因性のGDF-8が筋肉細胞中でGLU
T4の発現を抑えるかどうか（実施例１から予想されるように）、そしてまたGDF-
8の投与がGLUT4刺激物であるインスリンの効果を打ち消すことができるかどうか
を評価するために行った。
【００７９】 マウスは、5マイクログラムの組換えヒトGDF-8（20mM NaPO4、150mM NaCl、0.
1mg/ml BSA、pH6.5を含有するバッファー中）を含有する50マイクロリットルま
たはバッファー単独を無作為に筋肉内（腹筋）注射された。20分後にマウスは、
モンタナ州、セントルイスのシグマ ケミカルス(Sigma Chemicals)から購入した
ブタのインスリン（上記で使用したものと同じであるがpHが7.0の0.1mlバッファ
ー中で13単位/kg）、またはバッファー単独の腹腔内注射を受けた。インスリン
投与から１時間後、動物を屠殺し、そして注射した筋肉のサンプルを摘出した。
1mg/ml BSA、pH6.5を含有するバッファー中）を含有する50マイクロリットルま
たはバッファー単独を無作為に筋肉内（腹筋）注射された。20分後にマウスは、
モンタナ州、セントルイスのシグマ ケミカルス(Sigma Chemicals)から購入した
ブタのインスリン（上記で使用したものと同じであるがpHが7.0の0.1mlバッファ
ー中で13単位/kg）、またはバッファー単独の腹腔内注射を受けた。インスリン
投与から１時間後、動物を屠殺し、そして注射した筋肉のサンプルを摘出した。
【００８０】 図２に示すように、外因性のGDF-8単独の投与でマウス腹筋細胞中のGLUT4発現
に有意な減少をもたらす。対照的に、インスリン単独の投与では反対の効果がも
たらされ、GLUT4発現の有意な上昇（すなわち染色）がこのような細胞中で観察
された。GDF-8およびインスリンを同時に投与した時、GLUT4染色パターンは未処
置対照細胞に近いようであり、２つの分子がGLUT4に反対の調節効果を有するこ
とを示唆している。 Ｃ．Ｄ．実施例３−ヌードマウスを対象としたGDF-8を発現するCHO細胞腫瘍の効果 前述の実施例の結果は、GDF-8が筋肉細胞中でGLUT4タンパク質発現の調節に重
要な役割を果たしていることを示している。インビボの全体的なグルコース代謝
の調節におけるGDF-8の役割をさらに調査するために、ヒトGDF-8（hGDF-8）を生
産するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）腫瘍細胞系をヌードマウスに注射し
て、GDF-8を発現する腫瘍を形成した。このCHO腫瘍細胞注射法は、インビボで種
々の遺伝子産物の効果を測定するためのモデルとして使用されてきた（Black et
al.,Endocrinology 123:2657-2659(1991))。
に有意な減少をもたらす。対照的に、インスリン単独の投与では反対の効果がも
たらされ、GLUT4発現の有意な上昇（すなわち染色）がこのような細胞中で観察
された。GDF-8およびインスリンを同時に投与した時、GLUT4染色パターンは未処
置対照細胞に近いようであり、２つの分子がGLUT4に反対の調節効果を有するこ
とを示唆している。 Ｃ．Ｄ．実施例３−ヌードマウスを対象としたGDF-8を発現するCHO細胞腫瘍の効果 前述の実施例の結果は、GDF-8が筋肉細胞中でGLUT4タンパク質発現の調節に重
要な役割を果たしていることを示している。インビボの全体的なグルコース代謝
の調節におけるGDF-8の役割をさらに調査するために、ヒトGDF-8（hGDF-8）を生
産するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）腫瘍細胞系をヌードマウスに注射し
て、GDF-8を発現する腫瘍を形成した。このCHO腫瘍細胞注射法は、インビボで種
々の遺伝子産物の効果を測定するためのモデルとして使用されてきた（Black et
al.,Endocrinology 123:2657-2659(1991))。
【００８１】 hGDF-8を発現するCHO細胞を、0.1マイクロモルのメトトレキセートおよび１mg
/mlのG418を含むアルファ培地中で培養する一方、対照CHO細胞（空の発現ベクタ
ーを含む）は0.1マイクロモルのメトトレキセートを含むアルファ培地中で培養
した。細胞をトリプシン処理して回収し、そしてPBS中で２×107細胞/mlの濃度
に再懸濁した。オスのnu/nu NCRマウスの右大腿部に0.5ml中の１×107細胞を皮
下注射した。実験期間中、１週間に２回、体重および腫瘍サイズを測定した。CH
O GDF-8腫瘍から単離したmRNAのノーザンブロット分析では、GDF-8が発現された
ことが確認された。
/mlのG418を含むアルファ培地中で培養する一方、対照CHO細胞（空の発現ベクタ
ーを含む）は0.1マイクロモルのメトトレキセートを含むアルファ培地中で培養
した。細胞をトリプシン処理して回収し、そしてPBS中で２×107細胞/mlの濃度
に再懸濁した。オスのnu/nu NCRマウスの右大腿部に0.5ml中の１×107細胞を皮
下注射した。実験期間中、１週間に２回、体重および腫瘍サイズを測定した。CH
O GDF-8腫瘍から単離したmRNAのノーザンブロット分析では、GDF-8が発現された
ことが確認された。
【００８２】 成長しているCHO GDF-8腫瘍により生産されるGDF-8の全身効果を評価した。図
３に示すように、GDF-8を過剰に発現するCHO腫瘍は実験開始時の体重に比べて、
ヌードマウスにおいて20日内に劇的な全体重の減少が生じた(25％の減少）。対
照的に、GDF-8を発現しない対照CHO腫瘍をもつマウスにはわずかな体重の増加が
あった（図３）。
３に示すように、GDF-8を過剰に発現するCHO腫瘍は実験開始時の体重に比べて、
ヌードマウスにおいて20日内に劇的な全体重の減少が生じた(25％の減少）。対
照的に、GDF-8を発現しない対照CHO腫瘍をもつマウスにはわずかな体重の増加が
あった（図３）。
【００８３】 図４に示すように、CHO GDF-8腫瘍を持つマウスは正味の体重（全腫瘍）を対
照の腫瘍を持つマウスと比べた時、より一層劇的な体重の減少（35％）が示され
た（図４、パネルＡ）。体重の減少は対照の腫瘍重量が実際にはCHO GDF-8腫瘍
よりも重いので、CHO GDF-8腫瘍のサイズによるものでは無かった（図４、パネ
ルＢ、および図５）。
照の腫瘍を持つマウスと比べた時、より一層劇的な体重の減少（35％）が示され
た（図４、パネルＡ）。体重の減少は対照の腫瘍重量が実際にはCHO GDF-8腫瘍
よりも重いので、CHO GDF-8腫瘍のサイズによるものでは無かった（図４、パネ
ルＢ、および図５）。
【００８４】 CHOおよびCHO GDF-8を発現する腫瘍を持つ動物の個々の組織も単離し、そして
重量を測定した。CHO GDF-8を持つ動物からの筋肉および脂肪パッドは、CHO腫瘍
を持つ動物に比べて有意な重量の減少を示した（図４、パネルＣ、ＤおよびＥ）
。この一般的な骨格筋塊の消耗および減少は、移植されたCHO細胞から生産され
たGDF-8タンパク質がGDF-8ノックアウト法の結果と厳密に適合し、そしてそれか
ら予想された様式で作用することを証明している。
重量を測定した。CHO GDF-8を持つ動物からの筋肉および脂肪パッドは、CHO腫瘍
を持つ動物に比べて有意な重量の減少を示した（図４、パネルＣ、ＤおよびＥ）
。この一般的な骨格筋塊の消耗および減少は、移植されたCHO細胞から生産され
たGDF-8タンパク質がGDF-8ノックアウト法の結果と厳密に適合し、そしてそれか
ら予想された様式で作用することを証明している。
【００８５】 GDF-8が全身性のグルコースの運用（handling）に関与しているかどうかを評
価するために、CHO-GDF-8腫瘍を持つ野生型のヌードマウスを、グルコースの上
昇について試験した。図６に示すように、CHO-GDF-8腫瘍を持つ動物は高血糖症
を現し、そして筋肉組織中のGLUT4レベルの有意な減少を現した。GDF-8ノックア
ウトマウスが高血糖症であり、そして筋肉中に上昇したGLUT4発現レベルを有す
るという事実と一緒に考えると、このような結果はGDF-8はインビボでGLUT4レベ
ルを抑制することにより血清中のグルコースレベルを増加させることを示唆して
いた。 Ｅ．Ｆ．実施例４−マウスを対象としたGDF-8ノックアウトの全身性効果 GDF-8遺伝子がノックアウトされているトランスジェニックマウスは、特徴的
な全身性の問題、特に高血糖症、有意な筋肉の肥厚化および全体的な体脂肪の劇
的な減少を有した。このような知見はGDF-8のモジュレーションが血清中のグル
コースレベルの調節を可能とすることができるだけでなく（これは糖尿病の処置
として役立つ）、GDF-8が肥満症および他のそれに関連する障害の処置に有用で
あり得ることも示している。
価するために、CHO-GDF-8腫瘍を持つ野生型のヌードマウスを、グルコースの上
昇について試験した。図６に示すように、CHO-GDF-8腫瘍を持つ動物は高血糖症
を現し、そして筋肉組織中のGLUT4レベルの有意な減少を現した。GDF-8ノックア
ウトマウスが高血糖症であり、そして筋肉中に上昇したGLUT4発現レベルを有す
るという事実と一緒に考えると、このような結果はGDF-8はインビボでGLUT4レベ
ルを抑制することにより血清中のグルコースレベルを増加させることを示唆して
いた。 Ｅ．Ｆ．実施例４−マウスを対象としたGDF-8ノックアウトの全身性効果 GDF-8遺伝子がノックアウトされているトランスジェニックマウスは、特徴的
な全身性の問題、特に高血糖症、有意な筋肉の肥厚化および全体的な体脂肪の劇
的な減少を有した。このような知見はGDF-8のモジュレーションが血清中のグル
コースレベルの調節を可能とすることができるだけでなく（これは糖尿病の処置
として役立つ）、GDF-8が肥満症および他のそれに関連する障害の処置に有用で
あり得ることも示している。
【００８６】 GDF-8ノックアウトマウスは筋肉および脂肪の成長ならびに代謝機能の調節に
おいてGDF-8の一般的役割を仮定するモデルを提供するが、観察された変化が胚
のGDF-8欠失の結果であるのか、または出生後の発育の結果であるのかは不明で
ある。このようにこの実施例および直前の実施例（すなわち実施例３）では、GD
F-8が動物の成体に重要な生理学的役割を有することを初めて証明している。こ
のような２つの実験は、出生後にGDF-8発現および活性をモジュレーションする
ことが限定するわけではないが筋肉の成長、グルコースの恒常性および糖尿病の
感受性を含め、筋肉および脂肪の成長ならびに代謝的機能を調節する手段である
という概念に対して明らかな支持を提供する。実施例５−GDF-8が3T3-L1 前-脂肪細胞の分化に及ぼす効果 GDF-8がグルコースの恒常性に及ぼす効果をより特徴付けるために、3T3-L1細
胞を脂肪細胞モデルとして使用した（実際にインスリンに反応性の細胞型であり
、インスリンの能力を通してGLUT4を介したヘキソース輸送が増す）。このよう
な細胞は脂肪生成の優れたモデルとしてよく特徴付けられている（Hwang et al.
,Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.13,231〜259(1997)、およびMacDougald and Lane,Ann u.Rev.Biochem .64,345〜373(1995)）。このような細胞がインスリン、デキサメ
タソンおよびイソブチルメチルキサンチン（IBMX）で刺激される時、それらは形
態的および生化学的変化の両方を受け、それらの脂肪細胞への分化をもたらす。
おいてGDF-8の一般的役割を仮定するモデルを提供するが、観察された変化が胚
のGDF-8欠失の結果であるのか、または出生後の発育の結果であるのかは不明で
ある。このようにこの実施例および直前の実施例（すなわち実施例３）では、GD
F-8が動物の成体に重要な生理学的役割を有することを初めて証明している。こ
のような２つの実験は、出生後にGDF-8発現および活性をモジュレーションする
ことが限定するわけではないが筋肉の成長、グルコースの恒常性および糖尿病の
感受性を含め、筋肉および脂肪の成長ならびに代謝的機能を調節する手段である
という概念に対して明らかな支持を提供する。実施例５−GDF-8が3T3-L1 前-脂肪細胞の分化に及ぼす効果 GDF-8がグルコースの恒常性に及ぼす効果をより特徴付けるために、3T3-L1細
胞を脂肪細胞モデルとして使用した（実際にインスリンに反応性の細胞型であり
、インスリンの能力を通してGLUT4を介したヘキソース輸送が増す）。このよう
な細胞は脂肪生成の優れたモデルとしてよく特徴付けられている（Hwang et al.
,Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.13,231〜259(1997)、およびMacDougald and Lane,Ann u.Rev.Biochem .64,345〜373(1995)）。このような細胞がインスリン、デキサメ
タソンおよびイソブチルメチルキサンチン（IBMX）で刺激される時、それらは形
態的および生化学的変化の両方を受け、それらの脂肪細胞への分化をもたらす。
【００８７】 未分化の前−脂肪細胞がコンフルエンスに達した時、以下のようにそれらの血
清を含有するDMEM培地を連続的に交換することにより、分化が予想どおりに起こ
った（Spiegelman et al.,J.Biol.Chem.268:6823-6826(1993))：DMEM+血清+IBMX
+デキサメタソン+インスリンを２日間、DMEM+血清+インスリンをさらに２日間。
この後に培地を再度、DMEM+/-血清と置き換えた。GDF-8および他の増殖因子は分
化の開始時に加え、そして各培地交換時にさらに補充した。脂肪細胞は完全に分
化が起こるように、この培地中でさらに３〜５日間維持した。
清を含有するDMEM培地を連続的に交換することにより、分化が予想どおりに起こ
った（Spiegelman et al.,J.Biol.Chem.268:6823-6826(1993))：DMEM+血清+IBMX
+デキサメタソン+インスリンを２日間、DMEM+血清+インスリンをさらに２日間。
この後に培地を再度、DMEM+/-血清と置き換えた。GDF-8および他の増殖因子は分
化の開始時に加え、そして各培地交換時にさらに補充した。脂肪細胞は完全に分
化が起こるように、この培地中でさらに３〜５日間維持した。
【００８８】 図７に示すように、GDF-8はこのような3T3-L1前−脂肪細胞の脂肪細胞への分
化を阻害した。脂肪細胞への分化の誘導開始時に、GDF-8を3T3-L1細胞に加える
と、前−脂肪細胞の形態の維持および脂肪滴を含む屈折する細胞が無いことによ
り見られるように、前−脂肪細胞の脂肪細胞への変換が防止された（図７）。加
えて図８に示すように、RNAレベルでGDF-8は脂肪細胞マーカーとして知られてい
るGLUT4 mRNAの発現を抑制した。
化を阻害した。脂肪細胞への分化の誘導開始時に、GDF-8を3T3-L1細胞に加える
と、前−脂肪細胞の形態の維持および脂肪滴を含む屈折する細胞が無いことによ
り見られるように、前−脂肪細胞の脂肪細胞への変換が防止された（図７）。加
えて図８に示すように、RNAレベルでGDF-8は脂肪細胞マーカーとして知られてい
るGLUT4 mRNAの発現を抑制した。
【００８９】 図７はまた、GDF-8はTNF-αおよびTGF-β1がGLUT4 mRNAレベルに及ぼす両方の
効果を模することができることを表している。重要なことはGLUT4が筋肉組織中
だけでなく、脂肪細胞中でもインスリン−感受性のグルコース輸送の要因である
重要な分子になるとことが知られている。このようにGDF-8はII型糖尿病に付随
するインスリン耐性を媒介する役割を果たす。筋肉および脂肪で特異的に発現さ
れるGDF-8は、２種類の広く発現されるサイトカイン、すなわちTNF-αおよびTGF
-βが脂肪細胞の分化および代謝に及ぼすすでに確立された効果を完全に模する
ことができる（Szalkowski et al.,Endocrinology 136:1474-1481(1995))。この
特異的発現から、GDF-8は３つの中でもインビボでそのようなプロセスを調節す
る生理学的に最も関係のあるポリペプチドかもしれない。 Ｂ．Ｃ．実施例６−3T3-L1 脂肪細胞においてグルコース取り込みに及ぼすGDF-8の効 果 分化した脂肪細胞では、インスリンはGLUT4トランスポーターを介して用量依
存的様式でグルコース輸送を刺激する。すなわちGDF-8がこのインスリン−依存
的なグルコース取り込みメカニズムを妨害する能力を以下のように調査した。分
化が完了した時、グルコース輸送アッセイを3T3-L1細胞について行った。GDF-8
を分化の最後の72時間で加えた。インスリンをクレブス-リンゲル溶液中で20分
間加え、続いて[3H]-デオキシグルコース（1mCi/ml）を10分間加えた。徹底的に
洗浄した後、細胞をTriton X-100で溶解し、そして細胞に結合している放射活性
グルコース（GLUT4-媒介の取り込みによる）をシンチレーション計数により測定
した。
効果を模することができることを表している。重要なことはGLUT4が筋肉組織中
だけでなく、脂肪細胞中でもインスリン−感受性のグルコース輸送の要因である
重要な分子になるとことが知られている。このようにGDF-8はII型糖尿病に付随
するインスリン耐性を媒介する役割を果たす。筋肉および脂肪で特異的に発現さ
れるGDF-8は、２種類の広く発現されるサイトカイン、すなわちTNF-αおよびTGF
-βが脂肪細胞の分化および代謝に及ぼすすでに確立された効果を完全に模する
ことができる（Szalkowski et al.,Endocrinology 136:1474-1481(1995))。この
特異的発現から、GDF-8は３つの中でもインビボでそのようなプロセスを調節す
る生理学的に最も関係のあるポリペプチドかもしれない。 Ｂ．Ｃ．実施例６−3T3-L1 脂肪細胞においてグルコース取り込みに及ぼすGDF-8の効 果 分化した脂肪細胞では、インスリンはGLUT4トランスポーターを介して用量依
存的様式でグルコース輸送を刺激する。すなわちGDF-8がこのインスリン−依存
的なグルコース取り込みメカニズムを妨害する能力を以下のように調査した。分
化が完了した時、グルコース輸送アッセイを3T3-L1細胞について行った。GDF-8
を分化の最後の72時間で加えた。インスリンをクレブス-リンゲル溶液中で20分
間加え、続いて[3H]-デオキシグルコース（1mCi/ml）を10分間加えた。徹底的に
洗浄した後、細胞をTriton X-100で溶解し、そして細胞に結合している放射活性
グルコース（GLUT4-媒介の取り込みによる）をシンチレーション計数により測定
した。
【００９０】 図９に示すように、GDF-8はこのような細胞のインスリン−感受性をグルコー
ス取り込みの倍数により測定されるように用量依存的様式で下げた。このグルコ
ース輸送の低下したインスリン−感受性は、GDF-8処理後のこのような細胞中のG
LUT4 mRNAレベルの低下と相関した（図８）。すなわちこのアッセイは、インビ
ボで体脂肪および筋肉代謝機能に及ぼす効果と関連し得るGDF-8活性のインビト
ロでの相関を提供する。
ス取り込みの倍数により測定されるように用量依存的様式で下げた。このグルコ
ース輸送の低下したインスリン−感受性は、GDF-8処理後のこのような細胞中のG
LUT4 mRNAレベルの低下と相関した（図８）。すなわちこのアッセイは、インビ
ボで体脂肪および筋肉代謝機能に及ぼす効果と関連し得るGDF-8活性のインビト
ロでの相関を提供する。
【００９１】 GLUT4 mRNAレベルの減少の外に（図８を参照にされたい）、3T3-L1細胞におい
てGDF-8は実際に基底のグルコース輸送を約50％まで増加させるというさらに重
要な知見を得た。このベースラインの上昇は、インスリンに反応するグルコース
取り込みの倍数的増加における減少にも貢献するはずである。この基底輸送は主
に偏在するGLUT1トランスポーターにより成されるので（別のヘキソーストラン
スポーター）、脂肪細胞においてGDF-8処理後に観察されるインスリンの非感受
性は、基底輸送における上昇（GLUT1および他のグルコーストランスポーターを
介する）および同時のインスリン-刺激輸送の低下（GLUT4を介する）の組み合わ
せから生じ得る。しかしグルコースの基底レベルの上昇は、GLUT1の効果に限定
されない。さらなるグルコーストランスポーターも3T3-L1細胞においてグルコー
スの基底レベルを増すことができる。Ｇ．実施例７−糖尿病疾患モデルにおけるGDF-8の効果 前述の実施例はGDF-8阻害がGLUT4転写および発現を上昇させることができ、そ
してこれによりインスリン感受性を回復し、そして個体中の全身性グルコースレ
ベルを下げることを証明している。前述の実施例はさらにGDF-8阻害が脂肪細胞
の分化をアップレギレートし、そしてこれによりインスリン−感受性のグルコー
ス取り込みが増すことを証明している。
てGDF-8は実際に基底のグルコース輸送を約50％まで増加させるというさらに重
要な知見を得た。このベースラインの上昇は、インスリンに反応するグルコース
取り込みの倍数的増加における減少にも貢献するはずである。この基底輸送は主
に偏在するGLUT1トランスポーターにより成されるので（別のヘキソーストラン
スポーター）、脂肪細胞においてGDF-8処理後に観察されるインスリンの非感受
性は、基底輸送における上昇（GLUT1および他のグルコーストランスポーターを
介する）および同時のインスリン-刺激輸送の低下（GLUT4を介する）の組み合わ
せから生じ得る。しかしグルコースの基底レベルの上昇は、GLUT1の効果に限定
されない。さらなるグルコーストランスポーターも3T3-L1細胞においてグルコー
スの基底レベルを増すことができる。Ｇ．実施例７−糖尿病疾患モデルにおけるGDF-8の効果 前述の実施例はGDF-8阻害がGLUT4転写および発現を上昇させることができ、そ
してこれによりインスリン感受性を回復し、そして個体中の全身性グルコースレ
ベルを下げることを証明している。前述の実施例はさらにGDF-8阻害が脂肪細胞
の分化をアップレギレートし、そしてこれによりインスリン−感受性のグルコー
ス取り込みが増すことを証明している。
【００９２】 まとめるとこのデータはGDF-8機能を妨害することがII型糖尿病、肥満症およ
び肥満症に関連する障害の処置に重要な応用を有することを示唆している。この
ような有力な応用を追跡するために、以下の方法を行うことができる。Ａ．肥満症／糖尿病のマウスモデルにおけるGDF-8突然変異の効果の分析 GDF-8ノックアウトマウスは、肥満症、特にob/ob、db/dbを現す種々のマウス
種、および致死イエロー（yellow)突然変異を持つマウスと交配することができ
る。グルコース、インスリン、脂質およびクレアチンキナーゼのような肥満症の
既知の分子マーカーの血清レベルを監視し、そして試験動物におけるこの条件の
指標として、そしてGDF-8ノックアウトを欠く対照動物と比較する。
び肥満症に関連する障害の処置に重要な応用を有することを示唆している。この
ような有力な応用を追跡するために、以下の方法を行うことができる。Ａ．肥満症／糖尿病のマウスモデルにおけるGDF-8突然変異の効果の分析 GDF-8ノックアウトマウスは、肥満症、特にob/ob、db/dbを現す種々のマウス
種、および致死イエロー（yellow)突然変異を持つマウスと交配することができ
る。グルコース、インスリン、脂質およびクレアチンキナーゼのような肥満症の
既知の分子マーカーの血清レベルを監視し、そして試験動物におけるこの条件の
指標として、そしてGDF-8ノックアウトを欠く対照動物と比較する。
【００９３】 限定するわけではないが、インスリン感受性アッセイ、グルコース耐性アッセ
イおよび単離された筋肉アッセイによるエクスビボのグルコース取り込みを含む
糖尿病／肥満症に関する機能的アッセイも、子孫のマウスに及ぼすGDF-8ノック
アウトの効果を監視するために行うことができる。
イおよび単離された筋肉アッセイによるエクスビボのグルコース取り込みを含む
糖尿病／肥満症に関する機能的アッセイも、子孫のマウスに及ぼすGDF-8ノック
アウトの効果を監視するために行うことができる。
【００９４】 GDF-8ノックアウトおよび受け継いだ肥満症の遺伝型の両方を持つ子孫マウス
において、GDF-8の欠失はグルコース、インスリン、脂質およびクレアチンキナ
ーゼのような肥満症の既知の分子マーカーの血清レベルにより測定されるように
、対応する対照マウスと比較して肥満症の表現型を抑制するはずである。さらに
、このような動物において糖尿病の発症はGDF-8の不在により遅れるか、または
防止されるはずである。Ｂ．種々の糖尿病モデルにおけるGDF-8ノックアウトマウスの分析 GDF-8ノックアウトは、ストレプトゾトシンのような実験用の糖尿病を誘発さ
せることができる薬剤に供することができる。グルコース、インスリン、脂質お
よびクレアチンキナーゼのような分子糖尿病マーカーの血清レベルの分析をこの
ような動物で行い、そして例えばストレプトゾトシン−処置した野生型の対照動
物と比較する。限定するわけではないが、インスリン感受性アッセイ、グルコー
ス耐性アッセイおよび単離された筋肉アッセイによるエクスビボのグルコース取
り込みを含む糖尿病／肥満症に関する機能的アッセイは、処置した、または非処
置の動物に及ぼすストレプトゾトシンの効果を監視するために行うことができる
。GDF-8ノックアウトマウスはそのような処置に比較的耐性であるはずであり、
そして実験的糖尿病の発症は一緒に防止されるか、遅れるか、または重篤度が低
いはずである。Ｃ．肥満症／糖尿病のマウスモデルにおけるGDF-8インヒビターの効力の証明 肥満症または糖尿病に関するモデルとして役立つマウスをGDF-8インヒビター
で処置して、GDF-8の阻害およびおよび対応してGLUT4に及ぼす影響がこのような
動物において肥満症または糖尿病のいずれかを緩和するのかどうかを決定するこ
とができる。
において、GDF-8の欠失はグルコース、インスリン、脂質およびクレアチンキナ
ーゼのような肥満症の既知の分子マーカーの血清レベルにより測定されるように
、対応する対照マウスと比較して肥満症の表現型を抑制するはずである。さらに
、このような動物において糖尿病の発症はGDF-8の不在により遅れるか、または
防止されるはずである。Ｂ．種々の糖尿病モデルにおけるGDF-8ノックアウトマウスの分析 GDF-8ノックアウトは、ストレプトゾトシンのような実験用の糖尿病を誘発さ
せることができる薬剤に供することができる。グルコース、インスリン、脂質お
よびクレアチンキナーゼのような分子糖尿病マーカーの血清レベルの分析をこの
ような動物で行い、そして例えばストレプトゾトシン−処置した野生型の対照動
物と比較する。限定するわけではないが、インスリン感受性アッセイ、グルコー
ス耐性アッセイおよび単離された筋肉アッセイによるエクスビボのグルコース取
り込みを含む糖尿病／肥満症に関する機能的アッセイは、処置した、または非処
置の動物に及ぼすストレプトゾトシンの効果を監視するために行うことができる
。GDF-8ノックアウトマウスはそのような処置に比較的耐性であるはずであり、
そして実験的糖尿病の発症は一緒に防止されるか、遅れるか、または重篤度が低
いはずである。Ｃ．肥満症／糖尿病のマウスモデルにおけるGDF-8インヒビターの効力の証明 肥満症または糖尿病に関するモデルとして役立つマウスをGDF-8インヒビター
で処置して、GDF-8の阻害およびおよび対応してGLUT4に及ぼす影響がこのような
動物において肥満症または糖尿病のいずれかを緩和するのかどうかを決定するこ
とができる。
【００９５】 肥満症または糖尿病のいずれかのマウスは、治療的に効果的用量で１以上のGD
F-8インヒビターで処置する。処置および対照マウスのGDF-8レベルは、GDF-8に
特異的な抗体を使用してウエスタンブロット分析により評価することができる。
グルコース、インスリン、脂質およびクレアチンキナーゼのような肥満症および
糖尿病に特徴的な分子のレベルを、処置および対照動物から採った血清サンプル
で評価する。限定するわけではないが、インスリン感受性アッセイ、グルコース
耐性アッセイおよび単離された筋肉細胞アッセイによるエクスビボのグルコース
取り込みを含む糖尿病／肥満症に関する機能的アッセイは、処置および非処置動
物に及ぼすインヒビターの効果を監視するために行うことができる。同様に筋肉
および脂肪細胞の分化は、このような動物で観察することができる。そのような
実験の分析は、GDF-8の阻害がこのような疾患に関する動物モデルにおいて、糖
尿病または肥満症の進行に及ぼす全体的効果を決定できるはずである。
F-8インヒビターで処置する。処置および対照マウスのGDF-8レベルは、GDF-8に
特異的な抗体を使用してウエスタンブロット分析により評価することができる。
グルコース、インスリン、脂質およびクレアチンキナーゼのような肥満症および
糖尿病に特徴的な分子のレベルを、処置および対照動物から採った血清サンプル
で評価する。限定するわけではないが、インスリン感受性アッセイ、グルコース
耐性アッセイおよび単離された筋肉細胞アッセイによるエクスビボのグルコース
取り込みを含む糖尿病／肥満症に関する機能的アッセイは、処置および非処置動
物に及ぼすインヒビターの効果を監視するために行うことができる。同様に筋肉
および脂肪細胞の分化は、このような動物で観察することができる。そのような
実験の分析は、GDF-8の阻害がこのような疾患に関する動物モデルにおいて、糖
尿病または肥満症の進行に及ぼす全体的効果を決定できるはずである。
【００９６】 本明細書に開示したすべての特許、公開された特許出願および他の公開されて
いる技術文献は、それらの内容全部を引用により本明細書に編入する。
いる技術文献は、それらの内容全部を引用により本明細書に編入する。
【００９７】 均等物 当業者は１以上の日常的な実験を使用して、本明細書に記載した本発明の具体
的態様に対する多くの均等物を認識し、そして確認することができるだろう。そ
のような均等物は、前記の特許請求の範囲に包含されるものとする。
的態様に対する多くの均等物を認識し、そして確認することができるだろう。そ
のような均等物は、前記の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】 図１Ａは、抗-GLUT4抗体を用いた免疫染色による、野生型マウスおよびGDF-8
ノックアウトマウスからの胸筋および四頭筋中のGLUT4レベルを表す。 図１Ｂは、抗-GLUT4抗体を用いた免疫染色による、野生型マウスおよびGDF-8
ノックアウトマウスの両方の５つの異なる筋肉サンプル、胸筋、三頭筋、腹筋、
四頭筋および腸肋筋中のGLUT4レベルを表す。
ノックアウトマウスからの胸筋および四頭筋中のGLUT4レベルを表す。 図１Ｂは、抗-GLUT4抗体を用いた免疫染色による、野生型マウスおよびGDF-8
ノックアウトマウスの両方の５つの異なる筋肉サンプル、胸筋、三頭筋、腹筋、
四頭筋および腸肋筋中のGLUT4レベルを表す。
【図２】 図２は、抗-GLUT4抗体を用いた免疫染色による、対照マウス、GDF-8−投薬マ
ウス、インスリン−投薬マウス、およびGDF-8こ加えてインスリンを投薬したマ
ウスに由来する筋肉中のGLUT4レベルを表す。
ウス、インスリン−投薬マウス、およびGDF-8こ加えてインスリンを投薬したマ
ウスに由来する筋肉中のGLUT4レベルを表す。
【図３】 図３は、対照マウスと比較して、ヌードマウス中のGDF-8の全身性レベルの上
昇と（GDF-8を発現するCHO腫瘍から分泌する）、重度の体重損失との間の相関を
表すグラフである。
昇と（GDF-8を発現するCHO腫瘍から分泌する）、重度の体重損失との間の相関を
表すグラフである。
【図４】 図４は、GDF-8を発現しないCHO細胞腫瘍を含む対照マウスに由来する組織と比
較して、ヌードマウス中のGDF-8の全身性レベルの上昇（GDF-8を発現するCHO細
胞の腫瘍から分泌される）と、全体重（パネルＡ）、腫瘍重量（パネルＢ）、胸
筋重量（パネルＣ）、精巣上体の脂肪重量（パネルＤ）および腹筋重量（パネル
Ｅ）との間の相関を表すグラフである。
較して、ヌードマウス中のGDF-8の全身性レベルの上昇（GDF-8を発現するCHO細
胞の腫瘍から分泌される）と、全体重（パネルＡ）、腫瘍重量（パネルＢ）、胸
筋重量（パネルＣ）、精巣上体の脂肪重量（パネルＤ）および腹筋重量（パネル
Ｅ）との間の相関を表すグラフである。
【図５】 図５は、ヌードマウス中のGDF-8を分泌するCHO細胞腫瘍のサイズを、GDF-8を
発現しない対照CHO細胞腫瘍を比較したグラフである。腫瘍サイズは断面積で測
定した。
発現しない対照CHO細胞腫瘍を比較したグラフである。腫瘍サイズは断面積で測
定した。
【図６】 図６は、GDF-8を発現しない対照CHO細胞腫瘍を含有する対照と比較して、ヌー
ドマウスにおけるGDF-8レベルの上昇（GDF-8を発現するCHO細胞の腫瘍から）と
、血清グルコースレベル（パネルＡ）および筋肉中のGLUT4発現レベル（パネル
Ｂ）との相関を示すグラフである。
ドマウスにおけるGDF-8レベルの上昇（GDF-8を発現するCHO細胞の腫瘍から）と
、血清グルコースレベル（パネルＡ）および筋肉中のGLUT4発現レベル（パネル
Ｂ）との相関を示すグラフである。
【図７】 図７は、外から加えたGDF-8が3T3-L1脂肪細胞分化におよぼす効果を、未処置
、TNF-α処置およびTGF-β1処置し比較して示す。
、TNF-α処置およびTGF-β1処置し比較して示す。
【図８】 図８は、GDF-8、TGFβおよびTNFαで処置した3T3-L1細胞中のGLUT4発現の低下
を示すノーザンブロット分析である。各サンプルについて全細胞RNAを分画し、
膜に固定化し、そしてGLUT4 mRNAに関する32Pプローブとハイブリダイズさせた
。
を示すノーザンブロット分析である。各サンプルについて全細胞RNAを分画し、
膜に固定化し、そしてGLUT4 mRNAに関する32Pプローブとハイブリダイズさせた
。
【図９】 図９は、分化した3T3-L1脂肪細胞を異なる用量のGDF-8インヒビターが、イン
スリンに反応したこのような細胞のグルコースを取り込む能力を損ない、これが
脱感作(desensitization)を導くことを示すグラフである。
スリンに反応したこのような細胞のグルコースを取り込む能力を損ない、これが
脱感作(desensitization)を導くことを示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｋ 37/02 43/00 １１１ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 トポウジス，スタブロス アメリカ合衆国メリーランド州21227エル クリツジ・サンドライズコート6230・アパ ートメントナンバー301 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA17 BA44 CA18 NA14 ZC352 4C085 AA13 AA14 BB11 BB41 BB42 BB43 EE01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZC35
Claims (11)
- 【請求項１】 個体にGDF-8インヒビターを投与することを含んで成る、個
体中のGLUT4発現の増加法。 - 【請求項２】 個体にGDF-8インヒビターを投与することを含んで成る、個
体中のインスリン感受性および個体中の細胞によるグルコースの取り込みを増加
する方法。 - 【請求項３】 個体にGDF-8インヒビターを投与することを含んで成る、個
体の糖尿病の処置法。 - 【請求項４】 GDF-8インヒビターが抗体または抗体フラグメントである、
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 GDF-8インヒビターが、GDF-8のペプチドフラグメント、GDF-
8の優性ネガティブ変異体、GDF-8レセプターアンタゴニスト、非−GDF-8ペプチ
ド、アンチセンス核酸およびリボザイムから成る群から選択される、請求項１な
いし３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 GDF-8インヒビターが成熟GDF-8タンパク質に由来する請求項
１ないし３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 GDF-8インヒビターがGDF-8タンパク質のプロドメインに由来
する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 インスリン感受性およびグルコースの取り込みを、GLUT4お
よびGLUT1から成る群から選択されるヘキソーストランスポーターの発現をモジ
ュレートすることにより増加させる、請求項２に記載の方法。 - 【請求項９】 細胞が筋肉細胞またはその前駆体である、請求項２に記載の
方法。 - 【請求項１０】 細胞が脂肪細胞またはその前駆体である、請求項２に記載
の方法。 - 【請求項１１】 個体がII型糖尿病に罹患している、請求項３に記載の方法
。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8449098P | 1998-05-06 | 1998-05-06 | |
| US60/084,490 | 1998-05-06 | ||
| PCT/US1999/010089 WO1999056768A1 (en) | 1998-05-06 | 1999-05-06 | Methods for treating diabetes by inhibiting gdf-8 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002513768A true JP2002513768A (ja) | 2002-05-14 |
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Family
ID=22185291
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| DE (1) | DE69941116D1 (ja) |
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