JP2002513553A - 成長関連プロテアーゼインヒビタ重鎖前駆体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、成長関連プロテアーゼインヒビタ重鎖前駆体（ＧＡＰＩＰ）及びＧＡＰＩＰを同定かつコードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、発現ベクタ、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。また本発明はＧＡＰＩＰの発現に関連する障害を治療或いは予防するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は、成長関連プロテアーゼインヒビタ重（Ｈ）鎖前駆体の核酸配列及び
アミノ酸配列、並びに生殖傷害、発生障害、腫瘍性傷害および免疫傷害の診断、
治療及び予防におけるこれらの配列の使用法に関する。

【０００２】 背景技術 タンパク分解処理は正常な細胞の成長、分化、再構築及び恒常性の不可欠な要
素である。細胞内のペプチド結合の分割は、前駆タンパク質の活性形態への成熟
、ターゲットとなるタンパク質からのシグナル配列の除去、不正確に折り畳まれ
たタンパク質の分解、及び細胞内のペプチドの制御された代謝回転にために必要
である。プロテアーゼは、アポトーシス、抗原提示、炎症、胚発生中の組織の再
構築、創傷治癒、及び正常な成長に関係する。それらは、宿主内の細菌性、寄生
性及びウイルス性浸潤並びに複製の不可欠な成分である。活性部位構造、活動の
機構、及び全３次元構造に基づいて、哺乳類プロテアーゼの４つの主な種類が同
定されている（Beynon, R.J. and J.S. Bond (1994) Proteolytic Enzymes: A P ractical Approach , Oxford University Press, New York, NY, pp. 1-5）。

【０００３】 セリンプロテアーゼ（ＳＰ）は、消化酵素、トリプシン及びキモトリプシンを
含むタンパク分解酵素、補体カスケード及び血液凝固カスケードの成分、並びに
細胞外マトリクスの高分子の分解及び代謝回転を制御する酵素からなる大きなフ
ァミリである。ＳＰは、タンパク質分割のための活性触媒部位において見出され
るセリン残基の存在により、そのように称されている。全てのＳＰの活性部位は
、上記セリン残基、アスパラギン酸残基、及びヒスチジン残基を含む３つの残基
からなる。ＳＰは、幅広い範囲の基質特性を有し、これらの特異性に基づいてサ
ブファミリに細分することができる。主なサブファミリには、アルギニン或いは
リジンの後で切断するトリパーゼ（trypase）、アスパラギン酸の後で切断する
アスパーゼ（aspase）、フェニルアラニン或いはロイシンの後で切断するキマー
ゼ（chymase）、メチオニンの後で切断するメターゼ（metase）、及びセリンの
後で切断するセラーゼ（serase）がある。

【０００４】 血漿インター−α−トリプシンインヒビタファミリ分子は、少なくとも異なる
５種類の糖タンパク質からなる２４０ｋＤａの血漿タンパク質複合体から構成さ
れるセリンプロテアーゼインヒビタ（セルピン：serpins）である。これらの糖
タンパク質はＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４と名付けられる４つの重（Ｈ）鎖及びＬと
名付けられる１つの３０ｋＤａ軽（Ｌ）鎖からなり、前駆タンパク質から個別に
合成され、タンパク質分解処理される（Daveau, M.等(1998~ Arch.Biochem. Bio
phys. 350:315-323; 及び Salier, J.P.等(1992) Mature. Genome 2:233-239）
。血漿インター−α−トリプシンインヒビタ軽鎖は、全ての脊椎動物に存在する
と思われるＫｕｎｉｔｚトリプシンインヒビタに類似の配列を有する（Salier,
J.P. (1990)Trends Biochem. Sci. 15:435-439）。Ｋｕｎｉｔｚトリプシンイン
ヒビタのいくつの例は、組織因子により誘発される凝固を調節する組織因子経路
インヒビタ、及び血清凝固因子ＸＩａを調節するプロテアーゼネキシン−２であ
る（Broze, G.J. (1995) Annu. Rev. Med. 46:103-112; 及びWagner, S.L.等(19
93) Brain Res. 626:90-98）。重鎖前駆体は、シグナルペプチド配列及び成熟鎖
をコードする。他の血漿インター−α−トリプシンインヒビタ重鎖は、ヒト及び
げっ歯類において記載されている（Bourguignon, J.等(1993) Eur. J. Biochem.
212:771-776; Salier, 1992, 前掲;及びSalier, J.P. (1996) Biochem. J. 315
:1-9）。プロテアーゼ及びプロテアーゼ抑制性分子は、フォンウィルブランドフ
ァクタタイプＡ３（ｖＷＦＡ３）モチーフの潜在的な金属結合部位、グリシン−
アミノ酸−セリン−アミノ酸−セリンのような、タンパク質−タンパク質相互作
用を決定するアミノ酸配列モチーフを含む場合がある。これらのモチーフは、イ
ンテグリンＣＲ３及びＬＦＡ−１の相同性Ｉ‐タイプドメインにおけるリガンド
相互作用にためにも必要である（Huizinga, E.G. (1997) Structure 5:1147-115
6）。

【０００５】 ラット血漿インター−α−トリプシンインヒビタ遺伝子の発現は、in vivoで
炎症により調整される。その遺伝子はラット肝臓において支配的に発現されるが
、Ｈ２及びＨ３ｍＲＮＡは脳、腸及び胃にも存在する（Daveau、前掲）。

【０００６】 プロテアーゼインヒビタは、プロテアーゼの活性及び作用の調節において主な
役割を果たす。プロテアーゼインヒビタは、タンパク分解障害の動物モデル及び
ＨＩＶの治療において病原を抑制することが知られている（Murphy, G. (1991)
Agents Actions Suppl. 35:69-76; 及びPakyz, A. and Isreal, D. (1997) J. A
m. Pharm. Assoc. (Wash.) NS37:543-551）。

【０００７】 新規の成長関連プロテアーゼインヒビタ重鎖前駆体及びそれをコードするポリ
ヌクレオチドの発見は、生殖障害、発生障害、腫瘍性障害及び免疫障害の診断、
予防及び治療において有用な新規の組成物を提供することができ、当分野におけ
る必要性を満足する。

【０００８】 発明の概要 本発明は、新規の成長関連プロテアーゼインヒビタ重鎖前駆体（ＧＡＰＩＰ）
、ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチド及び生殖障害、発生障害、腫瘍性障
害及び免疫障害の診断、予防及び治療のためのこれらの組成物の使用法の発見に
基づく。

【０００９】 本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
のフラグメントを含む実質的に精製されたポリペプチドを特徴とする。

【００１０】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１のフラグメントに少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する実質的に
精製された変異体を提供する。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列或い
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のフラグメントを含むポリペプチドをコードする単離さ
れ、精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のフラグメント含むポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも９０％ポリヌクレオチド配列同一
性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列を含む。

【００１１】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１のフラグメントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに厳密
な条件下でハイブリダイズする単離され、精製されたポリヌクレオチド、並びに
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のフラグメン
トを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列を有する単
離され、精製されたポリヌクレオチドを提供する。

【００１２】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列或いはＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントを含む単離され、精製されたポリヌクレオチド、
並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２のフラグメントを含むポリヌクレオチドに少なくとも９０％ポリヌクレオチド
配列同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する
。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列或いはＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントを含むポリヌクレオチドに相補的な配列を有する
単離され、精製されたポリヌクレオチドを提供する。

【００１３】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１のフラグメントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少な
くともフラグメントを含む発現ベクタを提供する。別の態様では、発現ベクタは
宿主細胞に含まれる。

【００１４】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１のフラグメントを含むポリペプチドを生成するための方法を提供し、その方
法は、（ａ）ポリペプチドの発現に適した条件下で、そのポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドの少なくともフラグメントを有する発現ベクタを含む宿主
細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞培養株からポリペプチドを回収する
過程とを有する。

【００１５】 また本発明は、適当な医薬品担体とともに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸
配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のフラグメントを有する実質的に精製されたポ
リペプチドを含む医薬品組成物を提供する。

【００１６】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１のフラグメントを含むポリペプチドに結合する精製された抗体、並びにそ
のポリペプチドの精製されたアゴニスト及び精製されたアンタゴニストを提供す
る。

【００１７】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１のフラグメントを有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成
物の有効量を治療を要する被検者に投与する過程を含む、生殖障害を治療或いは
予防するための方法を提供する。

【００１８】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１のフラグメントを有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成
物の有効量を治療を要する被検者に投与する過程を含む、発生障害を治療或いは
予防するための方法を提供する。

【００１９】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１のフラグメントを有するポリペプチドのアンタゴニストの有効量を治療を要
する被検者に投与する過程を含む、腫瘍性障害を治療或いは予防するための方法
を提供する。

【００２０】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１のフラグメントを有するポリペプチドのアンタゴニストの有効量を治療を要
する被検者に投与する過程を含む、免疫障害を治療或いは予防するための方法を
提供する。

【００２１】 また本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の
アミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のフラグメントを有するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを検出するための方法を提供し、その方法は、（
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のフラグ
メントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補配列を生物学的
サンプルの核酸の少なくとも１つにハイブリダイズさせ、それよりハイブリダイ
ゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体
を検出する過程とを有し、ハイブリダイゼーション複合体の存在が生物学的サン
プルにおけるそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関をな
している。一態様では、生物学的サンプルの核酸は、ハイブリダイズする前にポ
リメラーゼ連鎖反応により増幅される。

【００２２】 発明を実施するための形態 本タンパク質、ヌクレオチド配列及び方法を記載する前に、本発明は記載され
る特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクタ並びに薬剤に限定されず、変更され
る場合もあることを理解されたい。また本明細書で用いられる専門用語は、特定
の実施例を記載することのみを目的としており、本発明の範囲を制限することを
意図するわけではなく、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されること
を理解されたい。

【００２３】 本明細書で用いられるように、添付の請求の範囲では、単数形の冠詞並びに「
その（前記）」は、文脈において異なるように明確に規定されない限り、複数の
指示物を含むことに注意されたい。従って例えば、「ある宿主細胞」が示すもの
は、複数のそのような宿主細胞を含んでおり、「その抗体」は当業者には既知の
１つ或いはそれ以上の抗体及びその等価物を示しており、他も同様である。

【００２４】 異なるように規定されなければ、本明細書で用いられる科学技術用語は、本発
明が属する分野の当業者に通常理解されているのと同じ意味である。本明細書で
記載される内容と類似或いは等価な任意の方法、装置並びに材料が本発明の検証
に際して用いられてもよいが、好適な方法、装置並びに材料は本明細書中に記載
される。本明細書に記載される全ての発行物は、本発明に関連して用いられる場
合がある発行物において報告される細胞株、ベクタ、方法論を記載及び開示する
ために、参照して本明細書の一部としている。本明細書に記載される内容は、本
発明が、先行発明によるそのような開示に先行して権利を与えられないことを容
認するものと解釈されるべきではない。

【００２５】 定義 「ＧＡＰＩＰ」は自然、合成、半合成或いは組換え体の何れかの任意のソース
からの任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好適にはヒトを含
む哺乳類から得られる実質的に精製されたＧＡＰＩＰのアミノ酸配列である。

【００２６】 「アゴニスト」は、ＧＡＰＩＰに結合される際に、ＧＡＰＩＰの量を増加する
か、或いは活性の期間を延長する分子のことである。アゴニストはタンパク質、
核酸、炭水化物或いはＧＡＰＩＰに結合し、その作用を調節する任意の他の分子
を含む場合がある。

【００２７】 「アレル配列配列」はＧＡＰＩＰをコードする遺伝子の代替形である。アレル
は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ、変化したｍＲＮＡ或
いはポリペプチドを生じ、その構造或いは機能は変化する場合もしない場合もあ
る。任意の所与の遺伝子は、１つ或いは多くのアレル形を有する場合もあれば、
全く有さない場合もある。アレルを引き起こす通常の突然変異は一般に、ヌクレ
オチドの自然の欠失、付加或いは置換に起因する。これらの種類の変化はそれぞ
れ単独で、或いは他との組み合わせにおいて、所与の配列において１回或いは２
回以上生じる場合がある。

【００２８】 ＧＡＰＩＰをコードする「変化した」核酸配列は、同一或いは機能的に等価な
ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失
、挿入或いは置換を含む。本定義には、ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチ
ドのある特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出することができ
る場合もできない場合もある多形性及びＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチ
ド配列に対する通常の染色***置とは異なる位置を有する、アレルへの不適当な
或いは予想外のハイブリダイゼーションが含まれる。またコードされたタンパク
質は「変化して」、サイレント変化を生成し、機能的に等価なＧＡＰＩＰをもた
らすアミノ酸残基の欠失、挿入或いは置換も含む場合もある。故意のアミノ酸置
換は、ＧＡＰＩＰの生物活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎
水性、親水性並びにまた両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。
例えば、負に帯電したアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正に
帯電したアミノ酸はリジン及びアルギニンを含み、同様の親水値を有する帯電し
ていない極性頭基（polar head group）有するアミノ酸はロイシン、イソロイシ
ン及びバリン、グリシン及びアラニン、アスパラギン及びグルタミン、セリン及
びスレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを含む。

【００２９】 「アミノ酸」或いは「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペ
プチド或いはタンパク質配列及びそのフラグメント、並びに自然発生或いは合成
分子のことである。ＧＡＰＩＰのフラグメントは長さが約５〜約１５アミノ酸で
あり、ＧＡＰＩＰの生物学的活性或いは免疫学的活性を保持していることが好ま
しい。「アミノ酸配列」は自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を示すものと
して表されるが、アミノ酸配列等の用語は、示されるタンパク質分子に関連する
完全な自然アミノ酸配列にそのアミノ酸配列を限定することを意味しない。

【００３０】 「増幅」は、核酸配列のさらなる複製の生成のことであり、一般に当分野にお
いて周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて実行される（例えば、 Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Lab. oratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY, pp. 1-5.を参照されたい）。

【００３１】 「アンタゴニスト」は、ＧＡＰＩＰに結合される際にＧＡＰＩＰの生物学的或
いは免疫学的活性を減少させる分子のことである。アンタゴニストはタンパク質
、核酸、炭水化物或いはＧＡＰＩＰに結合し、ＧＡＰＩＰの作用を減少させる任
意の他の分子を含む場合がある。

【００３２】 「抗体」は、エピトープ決定基を結合することができる、Ｆａ、Ｆ（ａｂ′） ₂ 及びＦｖのような無傷の分子及びそのフラグメントのことである。ＧＡＰＩＰ
ポリペプチドを結合する抗体は、免疫性抗原として対象の小さなペプチドを含む
無傷のポリペプチド或いはフラグメントを用いて作製ことができる。動物（例え
ばマウス、ラット或いはウサギ）を免疫するために用いられるポリペプチド或い
はオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳に由来するか、或いは化学的に合成され、所
望により担体タンパク質に結合することができる。ペプチドに化学的に結合され
る通常用いられる担体は、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホー
ルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む。その後結合されたペプチドを用い
て動物を免疫する。

【００３３】 「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の部分（すなわちエピトープ）
のことである。タンパク質或いはそのフラグメントを用いて宿主動物を免疫する
際、タンパク質の多くの領域が、タンパク質上の所与の領域或いは三次元構造体
に特異に結合する抗体の生成を誘発する場合がある。これらの領域或いは構造体
は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体に結合するために、無傷の抗原（
すなわち免疫反応を誘発するために用いられるイムノゲン）と競合する場合があ
る。

【００３４】 「アンチセンス」は、特異なＤＮＡ或いはＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド
配列を含む任意の組成物である。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に相
補的な核酸鎖を示すために用いられる。アンチセンス分子はペプチド核酸を含み
、合成或いは転写を含む任意の方法により生成することができる。一度細胞内に
導入されれば、相補ヌクレオチドは細胞により生成される自然配列と結合し、二
重鎖を形成し、転写或いは翻訳のいずれかを遮断する。記号「負（マイナス）」
はアンチセンス鎖を示す際に用いられる場合があり、「正（プラス）」はセンス
鎖を示す場合に用いられることがある。

【００３５】 「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的或いは生化学的機能を有
するタンパク質のことである。同様に「免疫学的活性」は自然、組換え或いは合
成ＧＡＰＩＰ、又はその任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞におい
て特異な免疫反応を誘発し、かつ特異な抗体と結合する能力のことである。

【００３６】 「相補的」或いは「相補性」は、塩基対による許容塩類及び温度条件下でのポ
リヌクレオチドの自然結合のことである。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」の場合、
相補配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、核酸のあ
るものだけが結合する「部分的」であるか、或いは完全な相補性が一本鎖分子間
に存在する場合には完全である場合もある。核酸鎖間の相補性の度合いは、核酸
鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しく影響する。これは核酸鎖
間の結合に及びペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計及び使用に依存する増幅反応
において特に重要である。

【００３７】 「所与のポリヌクレオチド配列を含む組成物」或いは「所与のアミノ酸配列を
含む組成物」は、所与のポリヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列を含む任意の
組成物に幅広く用いられる。その組成物は乾燥状態或いは水溶液状態を含む。Ｇ
ＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチド配列或いはそのフラグメントを含む組成
物はハイブリダイゼーションプローブとして用いることもできる。そのプローブ
は凍結乾燥状態で保管され、炭水化物のような安定化剤と関連することもできる
。ハイブリダイゼーションでは、そのプローブは塩類（例えばＮａＣｌ）、界面
活性剤（例えばＳＤＳ）及び他の組成物（例えばデンハート液、粉乳、サケ***
ＤＮＡ等）を含む水溶液に分散される場合もある。

【００３８】 「コンセンサス配列」は、核酸配列のうち、不要な塩基を分解するために再配
列されているもの、或いは５´或いは３´方向にXL-PCR (Perkin Elmer, Norwal
k, CT)を用いて伸長され、再配列されているもの、或いはフラグメント構築用コ
ンピュータプログラム（例えばGELVIEW Fragment Assembly System、GCG, Madis
on WI）を用いて２つ以上のインサイト社クローンの重複配列から構築されてい
るもののことである。ある配列は伸長及び構築のいずれもが施され、コンセンサ
ス配列を生成している。

【００３９】 「ポリヌクレオチドの発現と相関がある」は、ノーザン分析によるＧＡＰＩＰ
をコードするポリヌクレオチドに類似のリボ核酸の存在の検出が、サンプルにお
いてＧＡＰＩＰをコードするｍＲＮＡの存在を示しており、それによりそのタン
パク質をコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関があることを示
す。

【００４０】 「欠失」は、アミノ酸配列或いはヌクレオチド配列いずれかにおいて変化し、
１つ或いはそれ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドが欠如することである。

【００４１】 「誘導体」は、ＧＡＰＩＰをコードする核酸配列或いはＧＡＰＩＰ又はコード
されたＧＡＰＩＰの相補配列の化学修飾体のことである。そのような修飾の例示
は、水素をアルキル基、アシル基或いはアミノ基に置換することである。核酸誘
導体は、自然分子の生物学的及び免疫学的機能を保持するポリペプチドをコード
する。誘導体ポリペプチドは、グリコシレーション、ポリエチレングリコール形
成（pegylation）或いは由来したポリペプチドの生物学的或いは免疫学的機能を
保持する任意の類似のプロセスにより修飾されるポリペプチドである。

【００４２】 「相同性」は相補性の度合いのことである。部分的相同性或いは完全相同性（
すなわち同一）がある。部分的相同性配列は、同一配列が標的核酸にハイブリダ
イズするのを少なくとも部分的に抑制する配列であり、実用的な用語「実質的に
相同性の」を用いることが好ましい。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブ
リダイゼーションの抑制は、低い厳密性の条件下でハイブリダイゼーション検定
法（サザンブロット或いはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）
を用いて検査することができる。実質的に相同的な配列或いはプローブは、低い
厳密性の条件下で完全に相同的な配列及びプローブの標的配列への結合と競合し
、それを抑制するであろう。低い厳密性の条件は非特異な結合が許容されるよう
な条件であることは言うまでもない。低い厳密な条件は、２つの配列の互いへの
結合が特異な（すなわち選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異な
結合の欠如は、部分的な度合いの相補性さえ存在しない（例えば約３０％同一性
より小さい）第２の標的配列の使用により検査される場合もある。非特異な結合
が存在しない場合、そのプローブは第２の非相補的標的配列にハイブリダイズし
ないであろう。

【００４３】 「パーセント同一性」或いは「％同一性」という表現は、２以上のアミノ酸ま
たは核酸配列を比較する際の配列類似性のパーセンテージである。パーセント同
一性は、例えばMegAlignプログラム（DNASTAR, Inc., Madison WI）を用いるこ
とによって電子工学的に求めることができる。このMegAlign^TMプログラムは、異
なる方法、例えばクラスタ法（clustal method）（例えばHiggins, D.G.及びP.M
. Sharp (1988) Gene 73:237-244参照）に従って２以上の配列のアライメントを
作成することができる。このクラスタ法のアルゴリズムでは、配列群を、全ての
配列の対について両配列間の距離を調べることによってクラスタ（集団）にグル
ープ分けする。このクラスタ群について、一対毎にアライメントをとり、次にグ
ループにおいてアライメントをとる。２つのアミノ酸配列、例えば配列Ａと配列
Ｂの間のパーセント類似性は、（配列Ａの長さ−配列Ａにおけるギャップ残基の
数−配列Ｂにおけるギャップ残基の数）／（配列Ａと配列Ｂとの間の残基の一致
の総数）×１００で計算する。２つのアミノ酸配列の間の類似性の差が低いか無
いケースは、パーセント類似性の計算に含められない。核酸配列間のパーセント
同一性も、他の周知の方法、例えばJotun Hein法（例えばHein J. (1990) Metho
ds Enzymol. 183: 626-645参照）によってカウント即ち計算することができる。
配列間の同一性は、他の周知の方法、例えばハイブリダイゼーション条件を変え
ることによっても決定することができる。

【００４４】 「ヒト人工染色体」（ＨＡＣ）は、大きさが６ｋｂから１０ＭｂのＤＮＡ配列
を含み、安定した有糸***染色体の分離及び保持に必要とされる全ての要素を含
む直鎖状の小染色体である(例えばHarrington, J.J. et al. (1997) Nat Genet. 15:345-355を参照されたい)。

【００４５】 「ヒト化抗体」は、ヒト抗体により似せるために非抗原結合領域内においてア
ミノ酸が置換されているが、その一方で元の結合能力を保持している抗体分子の
ことである。

【００４６】 「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対を介して相補鎖と結合する
任意のプロセスのことである。

【００４７】 ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧとＣ塩基との間、並びに相補
的なＡとＴ塩基との間に水素結合を形成することにより２つの核酸配列間に形成
される複合体のことである。これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用に
よりさらに安定化する場合もある。２つの相補的核酸配列は、逆平行形状におい
て水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液（例えばＣ₀ｔ或いは
Ｒ₀ｔ分析）内に、又は溶液中に存在する一方の核酸配列と固形支持体（例えば
紙、膜、フィルタ、チップ、ピン、或いはスライドガラス、又は細胞或いはその
核酸が固定されている任意の他の適切な支持体）上に固定化される別の核酸配列
との間に形成することもできる。

【００４８】 「挿入」或いは「付加」は、自然発生分子に比べて、１つ或いはそれ以上のア
ミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ加わるアミノ酸配列或いはヌクレオチ
ド配列における変化のことである。

【００４９】 「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫疾患、又は感染症や遺伝病等と関連のある
状態を指すものである。これらの状態は、細胞や全身の防御系を活性化する様々
な因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、及び他のシグナル伝達分子の産生に
よって特徴付けることができる。

【００５０】 「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン或いは他の種類の膜、フィルタ、チップ
、スライドガラス或いは任意の他の適当な固形支持体のような支持体上に配列さ
れる個別のポリヌクレオチド或いはオリゴヌクレオチドからなるアレイのことで
ある。

【００５１】 マイクロアレイに関して用いられる「エレメント」或いは「アレイエレメント
」は、基質の表面上に配列されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドのこと
である。

【００５２】 「調節」は、ＧＡＰＩＰの生物学的活性の変更ことである。例えば調節により
、ＧＡＰＩＰのタンパク質活性、結合特性或いは生物学的、機能的或いは免疫学
的特性が増減するようになる。

【００５３】 「核酸」或いは「核酸配列」はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド或いはポリ
ヌクレオチド並びにそのフラグメント、一本鎖或いは二本鎖の場合があり、セン
ス鎖或いはアンチセンス鎖を表すゲノム或いは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡ、
ペプチド核酸（ＰＮＡ）或いは任意のＤＮＡ様或いはＲＮＡ様物質のことである
。「フラグメント」は、翻訳される際に、いくつかの機能的な特徴、例えば抗原
性、或いは構造的な領域の特性、例えば完全長ポリペプチドのＡＴＰ−結合部位
を保持しているポリペプチドを生成する核酸配列のことである。

【００５４】 本明細書において、用語「機能的に関連する」又は「機能的に結び付いた」は
、機能的に関連する核酸配列を表す。プロモータは、そのプロモータがコードさ
れるポリペプチドの転写を調節している場合、コード配列の機能的に関連又は機
能的に結びついている。機能的に関連した、又は機能的に結びついた核酸配列は
近接して読み枠内に存在することができるが、ある種のゲノムの配列、例えばリ
プレッサー遺伝子は、コードされるポリペプチドに近接していないが、やはりそ
のポリペプチドの発現を調節するオペレーター配列に結合する。

【００５５】 「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも約６ヌクレオチドから６０ヌクレオチ
ドの核酸配列、好ましくは約１５−３０ヌクレオチドの核酸配列、より好ましく
は２０−２５ヌクレオチドの核酸配列であり、ＰＣＲ増幅或いはハイブリダイゼ
ーション検定法において用いることができる。ここで用いる場合、オリゴヌクレ
オチドは、一般に当分野において定義されているような用語「アンプリマ」、「
プライマ」、「オリゴマ」及び「プローブ」と実質的に等価である。

【００５６】 「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、リジンにおいて終端するアミノ酸残基のペプ
チドバックボーンに結合する、長さが少なくとも５ヌクレオチドからなるオリゴ
ヌクレオチドを含むアンチセンス分子或いは抗遺伝因子（anti-gene agent）こ
とである。ＰＮＡはポリエチレングリコール化され、細胞の寿命を延長し、その
中で相補一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを優先的に結合し、転写延長を停止する（例え
ばNielsen PE 等(1993) Anticancer Drug Des 8:53-63を参照されたい）。

【００５７】 「サンプル」は幅広い意味に用いられる。ＧＡＰＩＰをコードする核酸或いは
そのフラグメント又はＧＡＰＩＰ自体を含むと予想される生物学的サンプルは、
溶液中に存在するか、或いは固形支持体、組織、組織転写物（tissue print）等
に結合されている体液、細胞からの抽出物、染色体、細胞器官或いは細胞から単
離された膜、細胞、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ或いはｃＤＮＡを含む。

【００５８】 「特異な結合」或いは「特異に結合する」は、タンパク質或いはペプチドとア
ゴニスト、抗体とアンタゴニストとの間の相互作用のことである。その相互作用
は、結合分子により識別されるタンパク質の特定の構造（すなわち抗原決定基或
いはエピトープ）の存在に依存する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して
特異である場合には、標識された「Ａ」を含むある反応におけるエピトープＡ或
いは遊離し、標識されないＡ及びその抗体を含むタンパク質の存在が、その抗体
に結合される標識されたＡの量を減らすであろう。

【００５９】 「厳密な条件」は、ポリヌクレオチド配列と、特許請求の範囲に記載されたポ
リヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションを許容する条件のことであ
る。適切なレベルの厳密な条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション及びハ
イブリダイゼーション領域における塩又はホルムアミドの濃度、又はハイブリダ
イゼーション温度によって決定することができ、当分野でよく知られている。詳
述すると、厳密性は、塩の濃度を低下させること、ホルムアミドの濃度を上昇さ
せること、又はハイブリダイゼーション温度を高めることによって高めることが
できる。

【００６０】 例えば、厳密な塩濃度は、通常は約７５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約７５
ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、好ましくは約５００ｍＭ未満の塩化ナ
トリウムと約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、最も好ましくは約２
５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである
。例えば、ホルムアミドなどの有機溶剤を使用しないと、厳密性の低いハイブリ
ダイゼーションになり、約３５％以上のホルムアミド、更に好ましくは５０％以
上のホルムアミドを使用すると、厳密性の高いハイブリダイゼーションになる。
温度の厳密条件は、通常は約３０℃以上であり、より好ましくは約３７℃以上で
あり、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の変更できるパラメーターに
は、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの薬
品の濃度、キャリアＤＮＡの含有の有無があり、当分野の技術者には公知である
。必要な様々な条件を組み合わせることで、厳密性の程度を変えることができる
。好適な実施例では、ハイブリダイゼーションは、温度が３０℃で、７５０ｍＭ
の塩化ナトリウムと７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳで行う。よ
り好適な実施例では、温度が３７℃で、５００ｍＭの塩化ナトリウムと５０ｍＭ
のクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、１００μｇ／
ｍｌの変性サケ***ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で行う。最も好適な実施例では、温度
が４２℃で、２５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、
１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡで行う。
これらの条件の有用な変更は、当分野の技術者には明らかである。

【００６１】 ハイブリダイゼーションの後の洗浄にも、様々な厳密性の程度がある。洗浄の
厳密な条件は、塩濃度と温度によって決められる。上記したように、塩濃度を下
げること或いは温度を上げることで洗浄の厳密性を高めることができる。例えば
、洗浄過程での塩濃度の厳密な条件は、好ましくは約３０ｍＭ未満の塩化ナトリ
ウムと約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、更に好ましくは約１５ｍＭ
未満の塩化ナトリウムと約１０５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。洗浄
過程の温度の厳密な条件は、通常は約２５℃以上であり、好ましくは約４２℃以
上であり、更に好ましくは約６８℃以上である。好適な実施例では、洗浄過程は
、温度が２５℃で、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３ｍＭのクエン酸三ナトリウム
、０．１％ＳＤＳで行われる。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度が４２
℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１
％ＳＤＳで行われる。最も好適な実施例では、洗浄過程は、温度が６８℃で、１
５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％ＳＤＳ
で行われる。更なるこれらの条件の変更は、当分野の技術者には明らかである。

【００６２】 「実質的に精製された」は、自然環境から除去されるか、単離されるか或いは
分離された核酸配列或いはアミノ酸配列のことであり、それらは自然に関連する
他の成分を少なくとも６０％、好適には７５％、最も好適には９０％含まないも
のである。

【００６３】 「置換」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはアミノ酸が、それぞれ
異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えられることである。

【００６４】 「形質転換」は、外来ＤＮＡが侵入し、受容体細胞を変化させるプロセスを意
味する。それは当分野において周知の種々の方法を用いて自然或いは人工的条件
下で生じさせることができる。形質転換は、外来核酸配列を原核或いは真核宿主
細胞に挿入するための任意の既知の方法に基づく場合がある。その方法は形質転
換される宿主細胞に基づいて選択され、限定はしないが、ウイルス感染、電気穿
孔法、熱ショック、リポフェクション並びに粒子照射を含む場合がある。そのよ
うに「形質転換された」細胞は、安定に形質転換された細胞を含んでおり、その
細胞では挿入されたＤＮＡが、自動的に複製するプラスミド或いはその宿主染色
体の一部の何れかとして複製されることができる。またその細胞は、限られた期
間だけ挿入されたＤＮＡ或いはＲＮＡを一時的に発現する細胞も含む。

【００６５】 ここで用いるＧＡＰＩＰの「変異体」は、１つ或いはそれ以上のアミノ酸によ
り変更されるアミノ酸配列のことである。変異体は「保存的に」変化する場合が
あり、その場合置換されたアミノ酸は、例えばロイシンをイソロイシンに置き換
える場合のように、類似の構造的及び化学的特性を有する。さらにまれにではあ
るが、変異体は、グリシンをトリプトファンに置き換える場合のように「非保存
的に」変化する場合がある。また類似の少数変異体は、アミノ酸欠失或いは挿入
、又はその両方を含む場合もある。生物学的及び免疫学的活性を無くすことなく
アミノ酸残基が置換、挿入或いは欠失されるかを判定する際の指標は、当業者に
周知のコンピュータプログラム、例えばDNASTARソフトウエアを用いて見出すこ
とができる。

【００６６】 発明 本発明は、新規の成長関連プロテアーゼインヒビタ重鎖前駆体（ＧＡＰＩＰ）
、ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチド及び生殖障害、発生障害、腫瘍性障
害及び免疫障害の診断、予防及び治療のためのこれらの組成物の使用法の発見に
基づく。

【００６７】 本発明のＧＡＰＩＰをコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントのコンピ
ュータ検索、例えばＢＬＡＳＴを用いて、子宮ｃＤＮＡライブラリ（ＵＴＲＳＮ
ＯＴ０２）からのインサイト社クローン６８８１８３において最初に同定された
。コンセンサス配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、重複及び／または伸長した核酸
配列、インサイト社クローン６８８１８３（ＵＴＲＳＮＯＴ０２）、３０４３９
６９（ＨＥＡＡＮＯＴ０１）、３１１２６７３（ＢＲＳＴＮＯＴ１７）、３０５
２５９５（ＬＮＯＤＮＯＴ０８）、７８９１００（ＰＲＯＳＴＵＴ０３）、７８
５１８２（ＰＲＯＳＮＯＴ０５）、１５０５０６１及び１５０５７１７（ＢＲＡ
ＩＴＵＴ０７）、１７９４１９５及び１７９５０８３（ＰＲＯＳＴＵＴ０５）、
２１２５５９０（ＢＲＳＴＮＯＴ０７）、１５５８２１８（ＳＰＬＮＮＯＴ０４
）、１３６１０７２（ＬＵＮＧＮＯＴ１２）、１９６４４３９（ＢＲＳＴＮＯＴ
０４）に由来した。

【００６８】 一実施形態では、本発明は、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、
１Ｈ、１Ｉ及び１Ｊに示されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を
有するポリペプチドを含む。ＧＡＰＩＰは長さが９４２アミノ酸であり、残基Ｎ
９７、Ｎ１２７、Ｎ２３１、Ｎ４２１、Ｎ５０８、Ｎ７７６、Ｎ７９５及びＮ８
６２において８個の潜在的なＮ−グリコシレーション部位と、残基Ｓ１７、Ｓ２
８、Ｔ１１２、Ｔ１２９、Ｓ１５８、Ｓ２６９、Ｓ３５４、Ｔ４１０、Ｔ５８１
、Ｓ５９２、Ｔ６７６及びＳ７５４において１２個の潜在的なカゼインキナーゼ
ＩＩリン酸化部位と、残基Ｓ２１３及びＳ３９１において２個の潜在的なグリコ
サミノグリカン付着部位と、残基Ｓ５５、Ｓ７０、Ｔ１１２、Ｓ１７５、Ｓ１８
２、Ｓ２１３、Ｓ３３７、Ｓ３５４〜Ｔ４１６、Ｔ４５８、Ｓ５３５、Ｓ５５９
、Ｔ５８１、Ｓ６１１、Ｓ６２０、Ｓ６５１及びＴ８８０において１７個の潜在
的なプロテインキナーゼＣリン酸化部位と、残基Ｙ９１９において１個の潜在的
なチロシンキナーゼリン酸化部位と、Ｍ１からＣ１４までに潜在的なシグナルペ
プチド配列と、Ｎ２９５からＮ４４０までに、潜在的な金属結合部位グリシン−
アミノ酸−セリン−アミノ酸−セリンを含むｖＷＦＡ３ドメインとを有する。図
２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ及び２Ｇに示されるように、ＧＡＰＩＰは
、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ（ＧＩ ３３９８５；ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ重鎖Ｈ１（Ｇ
Ｉ ３３９８９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒトプレインター−α−トリプシ
ンインヒビタ重鎖Ｈ３（ＧＩ ２８８５６３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）と化学的
及び構造的相同性を有する。具体的には、ＧＡＰＩＰ及びヒトプレインター−α
−トリプシンインヒビタは２８％同一性を有し、１つの潜在的なＮ−グリコシレ
ーション部位と、４つの潜在的なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位と、４つの
潜在的なプロテインキナーゼＣリン酸化部位と、潜在的なシグナルペプチド配列
と、ｖＷＦＡ３潜在金属結合部位、グリシン−アミノ酸−セリン−アミノ酸−セ
リンとを共有する。さらにＧＡＰＩＰと、ヒトプレインター−α−トリプシンイ
ンヒビタ重鎖Ｈ１及びＨ３とは、それぞれ２７％及び２５％同一性を有し、１つ
の潜在的なＮ−グリコシレーション部位と、４つの潜在的なカゼインキナーゼＩ
Ｉリン酸化部位と、５つの潜在的なプロテインキナーゼＣリン酸化部位と、潜在
的なシグナルペプチド配列と、ｖＷＦＡ３潜在金属結合部位、グリシン−アミノ
酸−セリン−アミノ酸−セリンとを共有する。図３により示されるように、ＧＡ
ＰＩＰとヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ重鎖とは、共通の系統学
的遺伝物を共有する。約ヌクレオチド９８２〜約ヌクレオチド１０１１からのＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントは、例えばオリゴヌクレオチドを設計するた
めに、或いはハイブリダイゼーションプローブとして有用である。ノーザン分析
は種々のライブラリにおけるこの配列の発現を示しており、その少なくとも６３
％は不死化或いは癌性であり、その少なくとも２６％は免疫応答に関連する。特
に、生殖組織、胃腸組織、神経組織及び胎児組織におけるＧＡＰＩＰの発現に注
目されたい。

【００６９】 また本発明は、ＧＡＰＩＰ変異体を含む。好適なＧＡＰＩＰ変異体はＧＡＰＩ
Ｐアミノ酸配列に少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最
も好ましいＧＡＰＩＰ変異体はＧＡＰＩＰに少なくとも約９５％アミノ酸が同一
で、ＧＡＰＩＰの少なくとも１つの機能的或いは構造的特徴を含む変異体である
。

【００７０】 また本発明はＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形
態では本発明は、ＧＡＰＩＰをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を含むポ
リヌクレオチド配列を含む。

【００７１】 また本発明は、ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含
む。詳細には、そのようなポリヌクレオチド変異配列は、ＧＡＰＩＰをコードす
るポリヌクレオチド配列に少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９
０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有す
るであろう。本発明の特定の態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも約８０
％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の
ポリヌクレオチド配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリヌクレオチド
配列の変異配列を含む。上記のポリヌクレオチド変異配列の任意の１つが、ＧＡ
ＰＩＰの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを含むアミノ酸配列をコード
することができる。

【００７２】 遺伝子コードの縮重の結果として、ＧＡＰＩＰをコードする多数のヌクレオチ
ド配列が生成され、その中には任意の既知の自然発生遺伝子のヌクレオチド配列
に最低限の相同性を示すものもあることは当業者には理解されよう。このように
本発明は、可能なコドン選択に基いて組み合わせを選択することにより形成され
るようになるヌクレオチド配列のあらゆる可能な変異配列を考慮する。これらの
組み合わせは、自然発生ＧＡＰＩＰのヌクレオチド配列に適用されるような標準
的なトリプレット遺伝子コードに従って形成され、全てのそのような変形形態が
明確に開示されているものと考慮されたい。

【００７３】 ＧＡＰＩＰをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適当に選択さ
れた厳密な条件下で、自然発生ＧＡＰＩＰのヌクレオチド配列にハイブリダイズ
できることが好ましいが、実質的に異なるコドン使用法を有するＧＡＰＩＰをコ
ードするヌクレオチド配列或いはその誘導体を生成することが有利な場合もある
。コドンを選択して、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に応じて、ペ
プチドの発現が特定の原核或いは真核発現宿主において生じる割合を増加しても
よい。コードされたアミノ酸配列を変更することなくＧＡＰＩＰをコードするヌ
クレオチド配列及びその誘導体を実質的に変更する他の理由は、より長い半減期
のような、自然発生配列から生成された転写物より望ましい特性を有するＲＮＡ
転写物を生成することを含む。

【００７４】 また本発明は、合成化学的に完全に、ＧＡＰＩＰ及びその誘導体をコードする
ＤＮＡ配列或いはそのフラグメントを生成することを含む。生成後、本特許出願
の出願時点で当分野において周知の薬剤を用いて、合成配列を、任意の多くの入
手可能な発現ベクタ及び細胞系に挿入することができる。さらに合成化学的に、
ＧＡＰＩＰをコードする配列或いは任意のそのフラグメントに突然変異を導入す
ることもできる。

【００７５】 また本発明にはに教示されるような種々の厳密性の条件下で請求されるヌクレ
オチド配列、詳細にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグ
メントに示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるポリヌク
レオチド配列が含まれる（例えば、Wahl,G.M及びS.L.Berger(1987;Methods Enzy
mol. Vol. 152:399-407)及びKimmel, A.R.(1987;Methods Enzymol. Vol 152: 50
7-511)を参照されたい）。

【００７６】 当分野において周知で、一般に入手可能なＤＮＡ配列決定のための方法が本発
明の任意の実施例を実行するために用いられる。これらの方法はDNA polymerase
I, Sequenase(US Biochemical Corp, Cleveland OH))のKlenow fragment、Taq
polymerase (Perkin Elmer)、耐熱性T7 polymerase (Amersham, Chicago IL)或
いはGibco BRL (Gaithersburg MD)により市販されているELONGASE Amplificatio
n Systemのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアー
ゼの組み合わせのような酵素を利用する。このプロセスはHamilton Micro Lab 2
200 (Hamilton, Reno NV), Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Wa
tertown MA) 及びABI Catalyst並びに373及び377 DNA sequencers (Perkin Elme
r)のような機器を用いて自動化することが好ましい。

【００７７】 ＧＡＰＩＰをコードする核酸配列は、部分ヌクレオチド配列を利用して、かつ
プロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当分野におい
て既知の種々の方法を用いて伸長させることができる。例えば、用いられる場合
がある１つの方法、「制限部位」ＰＣＲは、汎用プライマを用いて既知の位置に
隣接する未知の配列を回収する（例えばSarkar. G (1993) PCR Methods Applic
2:318-322を参照されたい）。詳細には、ゲノムＤＮＡがリンカー配列に対する
プライマ及び既知の領域に特異なプライマの存在下で最初に増幅される。その後
増幅された配列は、同じリンカープライマ及び第１のプライマに内在する別の特
異なプライマを用いて第２巡目のＰＣＲにかけられる。各回のＰＣＲの生成物は
、適当なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定さ
れる。また別の方法、すなわち逆ＰＣＲを利用して、既知領域に基づく多岐プラ
イマを用いて配列を増幅或いは伸長することもできる。そのテンプレートは、既
知のゲノム位置及び周囲をなす配列を含む制限フラグメントに由来する（Trigli
a T等(1988) Nucleic Acids Res 16:8186）。第３の方法は、ヒト及び酵母人工
染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅すること
を伴う捕獲ＰＣＲ（Lagerstrom M 等(1991) PCR Methods Applic 1:111-19）で
ある。この方法では、多数の制限酵素消化及び連結を用いて、ＰＣＲを実行する
前に遺伝子操作された二本鎖配列を未知の配列の領域に挿入することができる。
未知の配列を回収するために用いられることがある別の方法は当分野で公知であ
る（例えばParker JD 等 (1991; Nucleic Acids Res 19:3055-3060を参照された
い)。さらにある方法はＰＣＲ、入れ子状プライマ及びPromoterFinderライブラ
リを用いて、ゲノムＤＮＡを歩行することができる（Clontech, Palo Alto CA）
。このプロセスによりライブラリをスクリーニングする必要がなくなり、イント
ロン／エクソン接合部を見つける際に有用である。全てのＰＣＲに基づく方法の
場合、プライマはOLIGO4.06 Primer Analysis Software (National Biosciences
Inc, Plymouth MN)或いは別の適当なプログラムのような市販のソフトウエアを
用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含量を有し、
さらに約６８〜７２℃の温度でテンプレートにアニールするように設計すること
ができる。

【００７８】 完全長ｃＤＮＡに対してスクリーニングする際に、より長いｃＤＮＡを含むよ
うに大きさを選択されたライブラリを用いることが好ましい。またランダムに初
回抗原刺激を受けたライブラリも、それらが遺伝子の５´及び上流領域を含むよ
り大きな配列を含むという点で好ましい。ランダムに初回抗原刺激を受けたライ
ブラリの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況
では特に好ましい。ゲノムライブラリは５´非転写制御領域に配列を伸長するた
めに有用な場合がある。

【００７９】 市販の毛細管電気泳動系を用いて、配列決定或いはＰＣＲ生成物の大きさを解
析したり、或いはそのヌクレオチド配列を確認することもできる。詳細には毛細
管配列決定法は、電気泳動分離のための流動性ポリマ、レーザにより活性化され
る（各ヌクレオチドに対して１種類の）４つの異なる蛍光性染料及びＣＣＤカメ
ラによる放射波長の検出を用いる場合がある。出力／光強度が適当なソフトウエ
ア（例えばGenotyper及びSequence Navigator 、Perkin Elmer）を用いて電気信
号に変換され、サンプルの装填からコンピュータ解析及び電子データ表示までの
全プロセスがコンピュータ制御される。毛細管電気泳動法は、特定のサンプルの
限定された量内に存在する場合があるＤＮＡの小片の配列決定に特に好ましい。

【００８０】 本発明の別の実施例では、ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチド配列或い
はそのフラグメントが、適当な宿主細胞においてＧＡＰＩＰ、そのフラグメント
或いはその機能的等価物の発現をもたらすために組換えＤＮＡ分子に用いられる
場合がある。ゲノムコードの固有の縮重により、概ね同一か或いは機能的に等価
なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が生成され、この配列を用いてＧＡ
ＰＩＰをクローニングし、発現することもできる。

【００８１】 本発明のヌクレオチド配列は、限定はしないが、遺伝子生成物のクローニング
、プロセッシング並びにまた発現を修飾する変更を含む種々の理由によりＧＡＰ
ＩＰをコードする配列を変更するために、当分野において周知の方法を用いて遺
伝子操作することができる。遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドの
ランダムなフラグメント化及びＰＣＲ再構築によるＤＮＡ混合を用いて、ヌクレ
オチド配列を遺伝子操作することができる。例えば、位置指定突然変異誘発を用
いて、新しい制限部位の挿入、グリコシレーションパターンの変更、コドン優先
度の変更、スプライシング変異配列の生成或いは突然変異の導入等を行うことも
できる。

【００８２】 別の実施例では、当分野で周知の化学的方法を用いて、ＧＡＰＩＰをコードす
る配列を、全体的に或いは部分的に合成することができる（例えばCaruthers MH
等 (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T等(1980) Nuc Acids Res S
ymp Ser 225-232を参照されたい）。別法では、タンパク質自体が、ＧＡＰＩＰ
のアミノ酸配列或いは一部を合成するために化学的方法を用いて生成される場合
がある。例えばペプチド合成は種々の固相技術（例えばRoberge JY 等(1995) Sc
ience 269:202-204を参照されたい）を用いて実行することができ、自動合成は
、例えばABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer)を用いることにより実
現することができる。さらにＧＡＰＩＰのアミノ酸配列或いはその任意の一部は
、直接合成中に変更されるか、並びにまた他のタンパク質或いはその任意の一部
からの配列を用いる化学的方法により結合され、変異体ポリペプチドを生成する
こともできる。

【００８３】 そのペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフィにより実質的に精製される
ことができる（例えばChiez, R.M. and F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol.
182:392-421を参照されたい）。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析或いは
配列決定により確認することができる（例えばCreighton, T. (1984) Proteins,
Structures. and. Molecular Prop..erties, WH Freeman and Co., New York,
NYを参照されたい）。

【００８４】 生物学的に活性なＧＡＰＩＰを発現させるためには、ＧＡＰＩＰをコードする
ヌクレオチド配列或いはその誘導体を、適切な発現ベクター、即ち適切な宿主内
で挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な配列を含むベクタ
ーに挿入する。これらの配列としては、例えば、ベクターにおける、及びＧＡＰ
ＩＰをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成的及び誘導
的プロモーター、及び５’及び３’末端非翻訳領域のような制御配列が挙げられ
る。このようなエレメントの作用の強さや特異性は様々に異なったものであり得
る。また、ＧＡＰＩＰをコードする配列のより効率的な翻訳のためには、特定の
開始シグナルも必要である。このようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドン及
び隣接する配列、例えばKozak配列が挙げられる。ＧＡＰＩＰ及びその開始コド
ン及び上流の制御配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合には、他の転写
または翻訳の制御シグナルは不要である。しかし、コーディング配列又はそのフ
ラグメントのみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シ
グナルを与えなければならない。さらに、全インサートの転写が確実に行われる
ようにするために、開始コドンは正しい読み枠に存在しなければならない。外来
転写エレメント及び開始コドンは、天然及び合成両方の様々な起源に由来するも
のであり得る。使用される特定の細胞系に適切なエンハンサーを含めることによ
り、発現の効率を高めることができる（例えば、Scharf,D.他（1994）Results P
robl. Cell Differ. 20:125-162参照）。

【００８５】 当業者に周知の方法を用いて、ＧＡＰＩＰをコードする配列及び適当な転写或
いは翻訳制御エレメントを含む発現ベクタを作製することができる。これらの方
法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術並びにｉｎ ｖｉｖｏゲノ
ム組換えを含む（例えば、Sambrook,等(1989) Molecular Cloning. A Laborator y Manual , Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, ch. 4, 8, and 16-17;
並びにAusubel, F.M.等(1995, and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York, NY, ch. 9, 13, and 16
を参照されたい）。

【００８６】 種々の発現ベクタ／宿主系を利用して、ＧＡＰＩＰをコードする配列を含有し
、発現する場合もある。これらは、限定はしないが、組換えバクテリオファージ
、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクタと形質転換されたバクテリア、酵
母発現ベクタと形質転換された酵母、ウイルス発現ベクタで感染した昆虫細胞系
（例えばバキュロウイルス）、ウイルス発現ベクタと形質転換された植物細胞系
（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴ
ＭＶ）或いはバクテリア発現ベクタと形質転換された植物細胞系（例えば、Ｔｉ
或いはｐＢＲ３２２プラスミド）又は動物細胞系のような微生物を含む。本発明
は用いられる宿主細胞により制限されない。

【００８７】 細菌系では、ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチドの用途に応じて様々な
クローニング及び発現ベクターを選択することができる。例えば、ＧＡＰＩＰを
コードするポリヌクレオチドのルーチンのクローニング、サブクローニング、及
び成長（propagation）を、例えばBLUSCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）やpSP
ORT1プラスミド（Life Technologies）のような多機能大腸菌ベクターを用いて
達成することができる。ベクターの様々なクローニング部位にＧＡＰＩＰをコー
ドする配列を組み入れてlacZ遺伝子を壊すことによって、組換え分子を含む形質
転換された細菌を特定するための比色によるスクリーニングを行うことができる
ようになる。更に、これらのベクターは、in vitro転写、ジデオキシ法のシーク
エンシング、ヘルパーファージによる一本鎖レスキュー（single strand rescue
）、及びクローン化した配列における入れ子欠失の生成のために有用であり得る
（例えばVan Heeke, G.及びS.M. Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-55
09）。例えば抗体産生のために大量のＧＡＰＩＰが必要な場合には、ＧＡＰＩＰ
の高レベルで発現を誘導するベクターを用いることができる。例えば、強い誘導
性Ｔ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを用いること
ができる。

【００８８】 ＧＡＰＩＰの産生のために、酵母菌発現系を用いることもできる。例えばα因
子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨのような構成的または誘導的プロモー
ターを含む様々なベクターを、酵母菌のサッカロミセスセレビシエ（Saccharomy ces cerevisiae ）やメタノール資化酵母ピチアパストリス（Pichia pastoris）
において用いることができる。更に、そのようなベクターは、発現されたタンパ
ク質の細胞外への分泌または細胞内での保持の何れかを誘導し、安定的な発現の
ための外来配列の宿主のゲノムへの組み入れを可能にする（例えばAusubel, 前
掲; 及びScorer, C.A.ら (1994) Bio/Technology 12:181-184参照）。

【００８９】 植物発現ベクタが用いられる場合には、ＧＡＰＩＰをコードする配列の発現は
、いくつかのプロモータの任意のものにより行われる。例えばＣａＭＶの３５Ｓ
及び１９Ｓプロモータのようなウイルス性プロモータは単独で、或いはＴＭＶか
らのω−リーダ配列と共に用いることができる（Takamatsu 等 (1987) EMBO J 6
:307-311）。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモー
タ或いは熱ショックプロモータ（Coruzzi 等 (1984) EMBO J 3:1671-1680; Brog
lie 等 (1984) Science 224:838-843及びWinter J and Sinibaldi RM (1991) Re
sults Probl Cell Differ 17:85-105）を用いる場合もある。これらの構成体は
、直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介形質移入により植物細胞内に導入される
ことができる。その技術は一般に入手できるいくつかの概説に記載される（例え
ば、Hobbs S or Murry LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technolog y (1992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196を参照されたい）。

【００９０】 哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルス性発現系が利用される場合がある。
アデノウイルスが発現ベクタとして用いられる場合には、ＧＡＰＩＰをコードす
る配列は、後期プロモータ及び３連のリーダ配列からなるアデノウイルス転写／
翻訳複合体に結合される場合がある。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１或いはＥ３領
域内の挿入により、感染した宿主細胞においてＧＡＰＩＰを発現することができ
る生ウイルスを得ることができる（例えば、Logan and Shenk (1984) Proc Natl
Acad Sci 81:3655-3659を参照されたい）。さらにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ
）エンハンサのような転写エンハンサを用いて、哺乳動物宿主細胞内の発現を増
加させることができる。ＳＶ４０或いはＥＢＶ系ベクタを用いて、高レベルのタ
ンパク質を発現することもできる。

【００９１】 またヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ、発現させるこ
とができるＤＮＡのより大きなフラグメントを送達することもできる。治療のた
め、６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣが構成され、従来の送達方法（リポソーム、ポリ
カチオンアミノポリマ或いはベシクル）を用いて送達される。

【００９２】 哺乳動物系において長期間組換え体タンパク質を歩留まり高く生産する場合、
安定した発現が望ましい。例えば、ＧＡＰＩＰを安定して発現する細胞株は、複
製或いは内性発現エレメントのウイルス起源及び同じ或いは別のベクタにおける
選択可能マーカ遺伝子を含む発現ベクタを用いて形質転換することができる。ベ
クタの導入に続いて、細胞を強化培地内で１〜２日間成長させ、その後選択培地
に切り替えるようにする。選択可能マーカの目的は、選択への耐性を与えること
であり、その存在により、導入された配列を有効に発現する細胞が成長し、回収
されるようになる。安定して形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞タイプ
に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。

【００９３】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞株を回収することができる。
これらは、限定はしないが、それぞれｔｋ^-細胞或いはａｐｒｔ^-細胞において用
いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler,M等(1977) C
ell 11:223-32）及びアデニンフォスフォリボシール転換酵素遺伝子（Lowy I等(
1980) Cell 22:817-23）含む。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤耐性を
選択のための基準として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキセ
ートへの耐性を与え（Wigler M等(1980)Proc Natl Acad Sci 77:3567-70）、ｎ
ｐｔはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８への耐性を与え（Colber
e-Garapin F等(1981) J Mol Biol 150:1-14）、ａｌｓ或いはｐａｔはそれぞれ
クロルスルフロン及びホスフィノトリシン（phosphinotricin）アセチル基転移
酵素への耐性を与える（Murry、前掲）。さらに選択可能遺伝子が記載されてお
り、例えば、ｔｒｐＢにより細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用
できるようになり、ｈｉｓＤにより細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（
histinol）を利用できるようになる（Hartman S.C及びR.C Mulligan(1988)Proc
Natl Acad Sci 85:8047-51）。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光
タンパク質（green fluorescent protein；ＧＦＰ; Clonetech, Palo Alto, CA
）、β−グルクロニダーゼ及びその基質であるβ−Ｄ−グルクロノシド、または
ルシフェラーゼ及びその基質であるルシフェリンを用いてもよい。これらのマー
カは、転換体を同定するのみならず、特異なベクタ系に起因する一過性或いは安
定したタンパク質発現の量を定量するために幅広く用いられる（Rhodes CA等(19
95) Methods Mol Biol 55:121-131）。

【００９４】 マーカ遺伝子発現の存否は、対象の遺伝子が存在することを示唆するが、その
存在及び発現は確認される必要がある。例えば、ＧＡＰＩＰをコードする配列が
マーカ遺伝子配列内に挿入される場合には、ＧＡＰＩＰをコードする配列を含む
組換え細胞は、マーカ遺伝子機能の欠如により同定されることができる。別法で
は、マーカ遺伝子は、単一のプロモータの制御下でＧＡＰＩＰをコードする配列
と直列に配置される。誘導及び選択に応じたマーカ遺伝子の発現は通常、同様に
直列型遺伝子の発現を示す。

【００９５】 全般的に、ＧＡＰＩＰをコードする核酸配列を含み、ＧＡＰＩＰを発現する宿
主細胞は、当業者に知られる種々の手順により同定されることができる。この手
順は、限定はしないが、核酸或いはタンパク質の検出並びにまた定量化のための
膜、溶液或いはチップ系技術を含むＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブ
リダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ技術を含
む。

【００９６】 特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いて、Ｇ
ＡＰＩＰの発現を検出し、測定するための免疫学的方法は、当業者には周知であ
る。例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ
）、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＥ）などである。ＧＡＰＩＰにおける２つの非
干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位のモノクローナ
ル系イムノアッセイ（monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、結合タン
パク競合測定法が用いられてもよい。これら及び他の検定法は当分野において公
知である。（例えば、Hampton,R.等(1990)Serological Methods,a Laboratory M
anual, APS Press,St Paul. MN, Section IV;Coligan, J. E.等(1997 and perio
dic supplements) Current Protocols in Immunology,Greene Pub. Associates
and Wiley-Interscience, New York, NY; and Maddox, D.E.等.(1983) J. Exp.
Med. 158:1211-1216を参照されたい)。

【００９７】 幅広い標識及び接合技術が当業者には知られており、種々の核酸及びアミノ酸
検定法において用いることができる。ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチド
に関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプ
ローブを生成するための手段は、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末
端標識化或いは標識化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含む。別法では、ＧＡ
ＰＩＰをコードする配列或いはその任意の一部が、ｍＲＮＡプローブの生成のた
めにベクタ内にクローニングされる場合もある。そのようなベクタが当分野にお
いて知られ、市販されており、Ｔ７、Ｔ３或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポ
リメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることによりｉｎ ｖｉｔｒｏで
ＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。これらの手順は種々の市
販のキット（Pharmacia&upjohn (Kalamazoo,MI)、Promega (Madison WI)及びUS
Biochemical Corp (Cleveland OH)）を用いて行われる。適当なリポータ分子或
いは標識が用いられる場合もあり、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或い
は色素生産剤並びに基質、コファクタ、インヒビタ、磁気粒子等を含む。

【００９８】 ＧＡＰＩＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、この
タンパク質を細胞培地で発現させ、そこから回収するのに適した条件の下で培養
することができる。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いら
れる配列及び／またはベクターに応じて、分泌されるか、または細胞内に保持さ
れる。当業者には理解されるように、ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチド
を含む発現ベクターを、原核細胞か真核細胞の細胞膜を通してのＧＡＰＩＰ分泌
を誘導するシグナル配列を含むように設計することができる。

【００９９】 さらに宿主細胞株は、挿入された配列の発現を変調したり、発現したタンパク
質を望ましい形にプロセシングする能力ついて選択することができる。このよう
なポリペプチドの修飾としては、限定するものではないが、アセチル化、カルボ
キシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）並びにアシル化が含
まれる。またタンパク質の「プレプロ」部分を切り離す翻訳後プロセシングも、
タンパク質のターゲティング、折り畳み、及び／又は作用を特定するために用い
ることができる。翻訳後の作用のための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有し
ている種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、293、及びWI38）はAmerican T
ype Culture Collection（ATCC; Bethesda, MD）より入手でき、導入される外来
タンパク質の正しい修飾やプロセシングが確実に行われるように、このなかから
選択することができる。

【０１００】 本発明の別の実施例では、ＧＡＰＩＰをコードする、天然の、修飾した、或い
は組換えた核酸配列をヘテロの配列に連結して、上述の宿主系の何れかにおける
融合タンパク質の翻訳を生じさせることができる。例えば、市販の抗体によって
認識され得る異種分子を含むキメラＧＡＰＩＰタンパク質は、ペプチドライブラ
リーからのＧＡＰＩＰの活性のインヒビターの選別を促進し得る。そのような分
子としては、限定するものではないが、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GS
T）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュ
リン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、及び赤血球凝集素（HA）が挙
げられる。GST、MBP、Trx、CBP、及び6-Hisによって、それぞれ固定化グルタチ
オン、マルトース、酸化フェニルアルシン（phenylarsine oxide）、カルモジュ
リン、及び金属キレート樹脂の上でのそれらの同属の融合タンパク質の精製が可
能となる。FLAG、c-myc、及び赤血球凝集素（HA）によって、それらのエピトー
プのタグを特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体
を用いた融合タンパク質のイムノアフィニティ精製が可能となる。融合タンパク
質を、ＧＡＰＩＰをコードする配列とへテロのタンパク質配列との間にタンパク
分解酵素による切断部位を含むように組換えることによって、ＧＡＰＩＰを、精
製の後にヘテロの分子から切り離すことができるようになる。融合タンパク質の
発現及び精製のための方法は、Ausubel, F.M.他(1995及び定期的補遺) Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, ch 10に
記載されている。融合タンパク質の発現や精製を速やかに行うために、様々な市
販のキットを用いてもよい。

【０１０１】 本発明の更に別の実施例では、放射標識したＧＡＰＩＰを、TNT^TMウサギ網状
赤血球のライセートまたはコムギ胚芽抽出物系（Promega, Madison, WI）を用い
てin vitroで合成することができる。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６
プロモーターに機能的に関連するタンパク質コーディング配列の転写と翻訳を結
びつける。翻訳は、放射標識したアミノ酸前駆体、好ましくは³⁵S-メチオニンの
存在の下で生じる。

【０１０２】 ＧＡＰＩＰのフラグメントの作製は、組換え体の産生によって行うのみならず
、固相技術を用いた直接のペプチド合成によっても行うことができる（例えばCr
eighton, 前出pp.55-60参照）。タンパク質合成は、手作業により、或いは自動
的に行うことができる。合成の自動化は、例えば、Applied Biosystems 431Aペ
プチド合成機 (The Perkin-Elmer) を用いて達成することができる。ＧＡＰＩＰ
の様々なフラグメントを個別に合成し、それを連結して完全長分子を作り出すこ
とができる。

【０１０３】 治療 ＧＡＰＩＰは、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ（ＧＩ ３３９
８５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ
重鎖Ｈ１（ＧＩ ３３９８９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒトプレインター−
α−トリプシンインヒビタ重鎖Ｈ３（ＧＩ ２８８５６３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
５）と化学的及び構造的相同性を有する。さらにＧＡＰＩＰは、癌組織、免疫組
織、生殖組織、胃腸組織、神経組織及び胎児組織において発現される。それゆえ
ＧＡＰＩＰは、生殖障害、発生障害、腫瘍性障害及び免疫障害において、ある役
割を担うものと考えられる。

【０１０４】 それゆえ一実施形態では、適当な医薬品担体とともに実質的に精製されたＧＡ
ＰＩＰを含む医薬品組成物を被検者に投与して、生殖障害を治療或いは予防する
ことができる。そのような生殖障害は、限定はしないが、プロラクチン生成の障
害、卵管障害、***異常および子宮内膜症を含む不妊症、発情周期の破壊、月経
周期の破壊、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜および卵巣の
癌、自己免疫障害、子宮外妊娠、奇形発生、***の癌、線維嚢胞性乳腺症、乳汁
漏出症、***形成の破壊、異常***生理、精巣の癌、前立腺の癌、前立腺肥大症
、前立腺炎、男性***の癌および女性化***症を含むことができる。

【０１０５】 別の実施形態では、ＧＡＰＩＰ或いはそのフラグメントは又は誘導体を発現す
ることができるベクタを被検者に投与して、限定はしないが、上記障害を含む生
殖障害を治療或いは予防することができる。

【０１０６】 さらに別の実施形態では、ＧＡＰＩＰ或いはそのフラグメント又は誘導体を被
検者に投与して、限定はしないが、上記障害を含む生殖障害を治療或いは予防す
ることができる。

【０１０７】 さらに別の実施形態では、ＧＡＰＩＰの活性を調節するアゴニストを被検者に
投与して、限定はしないが、上記障害を含む生殖障害を治療或いは予防すること
ができる。

【０１０８】 一実施形態では、適当な医薬品担体とともに実質的に精製されたＧＡＰＩＰを
含む医薬品組成物を被検者に投与して、発生障害を治療或いは予防することがで
きる。用語「発生障害」は、被検者の組織、器官或いは系（例えば脳、副腎、腎
臓、骨格或いは生殖系）の発生或いは機能に関連する任意の障害のことである。
そのような障害は、限定はしないが、尿細管性アシドーシス、貧血症、クッシン
グ症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌおよびベッカー型筋ジストロフ
ィ、てんかん、性腺形成異常症、ＷＡＧＲ（ウィルムスの癌、無虹彩症、尿生殖
器奇形及び精神薄弱）症候群、スミス−マジェンニス（Smith-Magenis）症候群
、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮形成異常、遺伝性角皮症、シャルコー・
マリーツース病および神経線維腫症のような遺伝性神経病、甲状腺不全症、水頭
症、シドナム舞踏病および脳性麻痺のような発作障害、脊椎披裂、および先天性
緑内障、白内障或いは感覚神経性聴力損失を含むことができる。

【０１０９】 別の実施形態では、ＧＡＰＩＰ或いはそのフラグメントは又は誘導体を発現す
ることができるベクタを被検者に投与して、限定はしないが、上記障害を含む発
生障害を治療或いは予防することができる。

【０１１０】 さらに別の実施形態では、ＧＡＰＩＰ或いはそのフラグメント又は誘導体を被
検者に投与して、限定はしないが、上記障害を含む発生障害を治療或いは予防す
ることができる。

【０１１１】 さらに別の実施形態では、ＧＡＰＩＰの活性を調節するアゴニストを被検者に
投与して、限定はしないが、上記障害を含む発生障害を治療或いは予防すること
ができる。

【０１１２】 一実施形態では、ＧＡＰＩＰのアンタゴニストを被検者に投与して、腫瘍性障
害を治療或いは予防することができる。そのような腫瘍性障害には、限定はしな
いが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、詳細には
、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、***、子宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎
臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾
臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。一態様では、ＧＡＰＩＰを
特異に結合する抗体を、アンタゴニストとして直接、或いはＨＰＬＭを発現する
細胞或いは組織に医薬品因子を運ぶためのターゲッティング或いは送達機構とし
て間接的に用いることもできる。

【０１１３】 別の実施形態では、ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発
現するベクタを被検者に投与して、限定はしないが上記障害を含む腫瘍性障害を
治療或いは予防することができる。

【０１１４】 一実施形態では、ＧＡＰＩＰのアンタゴニストを被検者に投与して免疫障害を
治療或いは予防することができる。そのような免疫障害は、限定はしないが、後
天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギ
ー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自
己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、
クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮
性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状
腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、紅班性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無
力症、心筋または心膜の炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発筋炎、リウ
マチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシ、全身性紅
班性狼瘡、全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、及び癌、血液透析
、体外循環の合併症、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原虫感
染、及び蠕虫感染；及び外傷、及び動脈硬化症、滑液泡炎、肝硬変、肝炎、混合
型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間血色素尿症、真性多血症、
及び原発性血小板血症を含む場合がある。

【０１１５】 さらに別の実施例では、ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列
を発現するベクタを被検者に投与して、限定はしないが上記障害を含む免疫障害
を治療或いは予防することができる。

【０１１６】 他の実施例では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、
相補配列或いはベクタの任意のものが、他の適当な治療薬剤と組み合わせて投与
される場合もある。併用療法において用いるのに適した薬剤の選択は、従来の製
薬原理に基づいて当業者により行われることができる。治療薬剤の組み合わせは
相互依存的に作用し、上記種々の疾患の治療及び予防に影響を与えるようになる
。このアプローチを用いて、少ない投与量の薬剤で治療有効度を達成し、それに
より有害な副作用に対する危険性を低減することができる。

【０１１７】 ＧＡＰＩＰのアンタゴニストは当業者に広く知られた方法を用いて生成される
ことができる。詳細には、精製されたＧＡＰＩＰを用いて抗体を生成するか、或
いは医薬品因子のライブラリをスクリーニングし、ＧＡＰＩＰと特異に結合する
ものを同定することができる。

【０１１８】 ＧＡＰＩＰに対する抗体は当業者に周知の方法を用いて産生することができる
。そのような抗体は、限定はしないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメ
ラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリにより生成されるフ
ラグメントを含む場合がある。中和性抗体（ダイマ形成を抑制する抗体）が特に
治療上の使用に適している。

【０１１９】 抗体を産生する場合、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿
主を、ＧＡＰＩＰ或いはその任意のフラグメント又は免疫原特性を有するオリゴ
ペプチドを注射することにより免疫することができる。宿主種に応じて、種々の
アジュバントを用いて免疫学的反応を高めることができる。そのようなアジュバ
ントは、限定はしないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのよう
なミネラルゲル、及びリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペ
プチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールの
ような表面活性物質を含む。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（
カルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。

【０１２０】 ＧＡＰＩＰに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチ
ド、或いはフラグメントは、少なくとも５アミノ酸からなるアミノ酸配列を有し
、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。それ
らは自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小さな自然発生分子か
らなる完全なアミノ酸配列を含むことが好ましい。ＧＡＰＩＰアミノ酸の短い伸
展部はＫＬＭのような別のタンパク質の伸展部及びキメラ分子に対して生成され
る抗体と融合されることもできる。

【０１２１】 ＧＡＰＩＰに対するモノクローナル抗体は、培養中の持続細胞株による抗体分
子の生成を実現する任意の技術を用いて調製することができる。これらの技術は
、限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥ
ＢＶ−ハイブリドーマ技術を含む（Koehler等(1975) Nature 256:495-497、Kozb
or 等 (1985) J.Immunol Methods 81:31-42、Cote等(1983) Proc Natl Acad Sci
80:2026-2030、Cole, S.P 等 (1984) Mol. Cell Biol.62:109-120）。

【０１２２】 さらに「キメラ抗体」を生成するために開発された技術、適当な抗原特異性及
び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのス
プライシングを用いることができる（Morrison 等(1984) Proc Natl Acad Sci 8
1:6851-6855: Neuberger 等(1984) Nature 312:604-608; Takeda 等(1985) Natu
re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載される技術を、当
分野で知られた方法を用いて適合して、ＧＡＰＩＰ特異性一本鎖抗体を生成して
もよい。関連する特異性を有するが、個別のイディオタイプ組成物からなる抗体
が、ランダムに組み合わせた免疫グロビンライブラリからの鎖混合により生成さ
れることもできる（Burton D.R.(1991)Proc Natl Acad Sci 88:10134-10137）。

【０１２３】 また抗体は、リンパ球集団においてin vivoで生成を誘発することにより、或
いは組換え免疫グロブリンライブラリ又は論文（Orlandi 等(1989, Proc Natl A
cad Sci 86:3833-3837、Winter G and Milstein C (1991; Nature 349:293-299)
に開示されるような非常に特異的な結合剤のパネルをスクリーニングすることに
より生成することもできる。

【０１２４】 またＧＡＰＩＰに対する特異な結合部位を含む抗体フラグメントを発生させる
こともできる。例えば、そのようなフラグメントは、限定はしないが、抗体分子
のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ´）２フラグメント及びＦ
（ａｂ´）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成するこ
とができるＦａｂフラグメントを含む。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを、所
望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速にしかも容易に同
定できるように作製してもよい（Huse WD 等 (1989) Science 256:1275-1281）
。

【０１２５】 種々のイムノアッセイを用いて、所望の特異性を有する抗体を同定するために
スクリーニングすることができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗
体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる結合タンパク競合測定法或いは
免疫放射測定法用の種々のプロトコルが、当分野では周知である。そのようなイ
ムノアッセイは典型的には、ＧＡＰＩＰとその特異的抗体との間の複合形成体を
測定することを含む。２つの非干渉性ＧＡＰＩＰエピトープに反応するモノクロ
ーナル抗体を利用する２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、結
合タンパク質競合測定法を用いることもできる(Maddox、前掲)。

【０１２６】 本発明の別の実施例では、ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチド或いはそ
の任意のフラグメント又は相補配列を治療のために用いる場合もある。一態様で
は、ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列が、ｍＲＮＡの
転写を遮断することが望ましい状況において用いられる。詳細には、細胞は、Ｇ
ＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列と形質転換されることが
できる。このように相補分子或いはフラグメントを用いて、ＧＡＰＩＰ活性を調
節するか、或いは遺伝子機能の調節を実現することができる。そのような技術は
当分野では周知であり、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はより
大きなフラグメントを、ＧＡＰＩＰをコードする配列のコード化或いは調節領域
に沿った種々の位置から設計することができる。

【０１２７】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス或いはワクシニアウイル
スに、また種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクタが、標的となる器官、
組織或いは細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために用いられる場合がある
。当業者には周知の方法を用いて、ＧＡＰＩＰをコードする遺伝子のポリヌクレ
オチドに相補的な核酸配列を発現するベクタを作製することができる（例えばSa
mbrook 等(前掲)及びAusubel 等 (前掲)を参照されたい）。

【０１２８】 ＧＡＰＩＰをコードする遺伝子は、細胞或いは組織を、ＧＡＰＩＰをコードす
る高レベルのポリヌクレオチド或いはそのフラグメントを発現する発現ベクタと
形質転換することにより遮断されるようになる。そのような作製物は、翻訳でき
ないセンス或いはアンチセンス配列を細胞内に導入するために用いられる。ＤＮ
Ａ内に統合されない場合であっても、そのようなベクタは、内因性ヌクレアーゼ
により無能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過性の発
現は、非複製ベクタを用いて一ヶ月或いはそれ以上の間持続し、適当な複製エレ
メントがベクタ系の一部であるならさらに長く持続するようになる。

【０１２９】 上記のように遺伝子発現の修飾は、ＧＡＰＩＰをコードする遺伝子の制御、５
´或いは調節領域（シグナル配列、プロモータ、エンハンサ及びイントロン）に
対する相補配列或いはアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはＰＮＡ）を設計
することにより得られるようになる。転写開始部位、例えば開始部位からの位置
−１０と＋１０との間に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に「三重
らせん」塩基対技術を用いて抑制を実現することができる。二重らせんの能力の
抑制がポリメラーゼ、転写因子或いは調節分子を結合するのに十分に開放される
ようになるため、三重らせん対は有用である。三重ＤＮＡを用いる最近の治療の
進歩は、論文（Gee JE 等(1994)In: Huber BE and BI Carr, Molecular and Imm unologic Approaches, Futura Publishing Co. Mt Kisco NY, pp.163-177)に記
載されている。また相補配列或いはアンチセンス分子は、転写物がリボソームに
結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計することがで
きる。

【０１３０】 リボザイム、すなわち酵素ＲＮＡ分子が、ＲＮＡの特異な切断を触媒するため
に用いられる場合がある。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションを伴い、それにヌクレオチド鎖
切断分割が伴う。用いられる例は、ＧＡＰＩＰをコードする配列のヌクレオチド
鎖切断分割に特異にしかも有効に触媒作用することができる遺伝子操作されたハ
ンマヘッドモチーフリボザイムを含む。

【０１３１】 任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異なリボザイム切断部位は、配列を含むリボ
ザイム切断部位ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣに対して標的分子を走査することによ
り最初に同定される。一度同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する１５〜２０の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオ
チドを無能にする副次構造的な特徴に対して評価されることができる。また候補
標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーションに対する容易性を検査することにより評価す
ることができる。

【０１３２】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成に関して当分
野で知られた任意の方法により調製することができる。これらは、固相ホスホラ
ミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための方法を
含む。別法では、ＲＮＡ分子は、ＧＡＰＩＰをコードするＤＮＡ配列のin vitro 及びin vivo転写により生成することができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７
或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて種々のベク
タ内に組み込むことができる。別法では、これらのｃＤＮＡ作成物は、相補ＲＮ
Ａを合成し、細胞株、細胞或いは組織内に構成的に或いは誘導的に導入すること
ができる。

【０１３３】 ＲＮＡ分子を修飾して細胞内安定性及び半減期を改善することもできる。可能
な修飾は、限定はしないが、分子の５´並びにまた３´末端でのフランキング配
列の付加、或いは分子のバックボーンにおけるホスホジエステラーゼ連鎖ではな
くホスホロチオネート或いは２´Ｏ−メチルの使用を含む。この概念はＰＮＡの
生成に固有のものであり、イノシン、キュェオシン及びワイブトシン並びにアセ
チル−、メチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易には識別
されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様に修飾され
た形成体のような従来にはない塩基を含有することにより、これら分子の全体に
拡張されることができる。

【０１３４】 細胞或いは組織内にベクタを導入するために多くの方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoで使用するのに同様に適している。ex vivo治療の
場合、ベクタは、患者から取り出された基幹細胞内に導入され、同じ患者に戻さ
れる自家移植物に対してクローンのように繁殖することができる。形質移入、リ
ポソーム注射或いはポリカチオンアミノポリマによる送達は、当分野で周知の方
法を用いて実現することができる（例えばGoldman, C.K. 等(1997）Nature Biot
echnology 15:462-466を参照されたい)。

【０１３５】 上記治療方法の任意の方法は、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、そして最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、治療を要する被検体に適用
されることができる。

【０１３６】 本発明のさらに別の実施例は、上記任意の治療効果のために、製薬的に許容可
能な担体と共に用いられる医薬品組成物の投与に関連する。そのような医薬品組
成物は、ＧＡＰＩＰ、ＧＡＰＩＰに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニ
スト或いはＧＡＰＩＰのインヒビタからなることができる。組成物は単独で、或
いは限定はしないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水を含む任意の
滅菌の生体適合性医薬品担体において投与されることがある、安定化化合物のよ
うな少なくとも１つの他の薬剤との組み合わせて投与されることができる。これ
らの組成物は単独で、或いは他の薬剤、薬物或いはホルモンと組み合わせて患者
に投与してもよい。

【０１３７】 本発明に用いられる医薬品組成物は、限定はしないが、経口、静脈内、筋肉内
、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸内、局
所、舌下、直腸手段を含む任意の経路により投与されることができる。

【０１３８】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物は、製薬的に用いることができ
るプレパラートへの活性化合物の処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含
む適当な製薬的に許容可能な担体を含む場合もある。さらに製剤及び投与に関す
る技術についての詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publis
hing Co. Easton PA)の最新版に見出される。

【０１３９】 経口投与の場合の医薬品組成物は、経口投与に適した投与量の当分野で周知の
製薬的に許容可能な担体を用いて調剤することができる。そのような担体により
、医薬品組成物は、患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤
、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調剤されることができ
る。

【０１４０】 経口投与するための医薬品調剤は、活性化合物と固形の医薬品添加物とを混合
して、選択的にはその混合物を細かく砕いて、さらに所望に応じて、錠剤或いは
糖衣剤コアを得るために適当な補助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を処理して得
られるようになる。適当な医薬品添加物は、ラクトース、スクロース、マンニト
ール或いはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、じゃがいも或いは
他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、及び
アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、並びにゼラチン及びコラーゲン
のようなタンパク質を含む炭水化物或いはタンパク質賦形剤である。必要なら、
架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸或いはアルギン酸ナト
リウムのようなその塩を含む、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられてもよい。

【０１４１】 糖衣剤コアは濃縮糖液のような適当なコーティングと共に用いられ、その濃縮
糖液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（carbop
ol gel）、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び
適当な有機溶剤或いは溶剤混合物を含む場合もある。染料或いは色素が製品識別
、或いは活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤或いは糖衣
錠コーティングに加えられる場合もある。

【０１４２】 経口投与される医薬品製剤は、ゼラチンからなる押込嵌合式のプッシュフィッ
トカプセル剤、並びにゼラチン及びグリコール或いはソルビトールのようなコー
ティングからなる軟らかく封止されたソフトシールカプセル剤を含む。プッシュ
フィットカプセル剤は、ラクトース或いはデンプンのような賦形剤或いは結合剤
、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、さらに選択的に安定
化剤と混合された活性処方成分を含むことができる。ソフトカプセル剤では、活
性化合物は、脂肪油、パラフィン油、或いは安定化剤を用いる場合も用いない場
合があるが液体ポリエチレングリコールのような適当な溶液内に溶解或いは懸濁
される場合がある。

【０１４３】 非経口投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射するため
に、本発明の医薬品組成物は、水溶液内で、好ましくはハンクス溶液、リンガー
溶液或いは生理緩衝食塩水のような生体適合性緩衝液内で調製される。水性の注
入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデ
キストランのように、懸濁液を増粘する物質を含む場合がある。さらに活性化合
物の懸濁液は、適当な油性の注射懸濁液として調製される場合もある。適当な親
油性溶剤或いは溶媒は、ゴマ油のような脂肪油、或いはオレイン酸エチル又はト
リグリセリドのような合成脂肪酸エステル、或いはリポソームを含む。選択に応
じて懸濁液は、高濃縮の溶液の調製を可能とするために化合物の可溶性を増加さ
せる適当な安定化剤或いは薬剤を含む場合もある。

【０１４４】 局所或いは鼻腔投与の場合、特定の障壁を浸透させるのに適した浸透剤が調製
において用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般に知られている。

【０１４５】 本発明の医薬品組成物は、当分野において知られた、例えば、従来の混合、溶
解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化、乳状化、カプセル化、封入（entrapping）或
いは凍結乾燥処理による方法で製造される。

【０１４６】 医薬品組成物は塩類として提供され、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩
類は、対応する遊離塩基形の場合より、水性或いはプロトン性溶剤において可溶
性を有する傾向がある。他の場合に好ましい製剤は、使用前に緩衝剤と結合され
たｐＨ範囲４．５〜５．５の１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スク
ロース、２％〜７％マンニトールの任意のもの或いは全てを含む凍結乾燥粉末で
ある。

【０１４７】 医薬品組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ、指示された条
件の治療のためにラベルを貼付される。ＧＡＰＩＰの投与の場合、そのようなラ
ベル貼付は、投与の量、頻度並びに方法を含むであろう。

【０１４８】 本発明に用いるために適した医薬品組成物は、活性処方成分が目的を果たすた
めの有効な量だけ含まれる組成物を含む。有効な量を投与することは、当業者の
能力内で果たすことができる。

【０１４９】 任意の化合物の場合、製薬的に有効な量は、例えば腫瘍性細胞の細胞培養アッ
セイ、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ或いはブタの動物標本のいずれかにおい
て最初に見積もられる。また動物標本を用いて、所望の濃縮範囲及び投与の経路
が確定される。その後その情報を用いて、ヒトに投与するための有効な量及び経
路を確定することができる。

【０１５０】 製薬的に有効な量は、症状或いは状態を改善する、例えばＧＡＰＩＰ或いはそ
のフラグメント、ＧＡＰＩＰの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、或いはＧＡ
ＰＩＰのインヒビタの主成分の量である。そのような化合物の治療に対する有効
度及び毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬的手順、例えばＥ
Ｄ₅₀（集団の５０％において製薬的に有効な量）及びＬＤ₅₀（集団の５０％が致
死する量）により確定することができる。治療効果と毒性効果の投与量比が治療
指数であり、比ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀として表すことができる。大きな治療指数を示す
医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータは
、ヒトに投与するための量の範囲を処方する際に用いられる。そのような化合物
の投与量は、毒性が非常に少ないか或いは全くなくＥＤ₅₀を含む血中濃度の範囲
内にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感度及び投与
経路によりこの範囲内で変化する。

【０１５１】 厳密な投与量は、治療を要する患者に関連する要因により医師によって確定さ
れるであろう。量及び投与を調整して、十分なレベルの活性成分を与えたり、或
いは所望の効果を維持することもある。考慮される場合がある要因は疾患状態の
重症度、被検者の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び
頻度、薬物の組み合わせ、反応への敏感度、並びに治療に対する耐性／反応を含
む。特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて、３〜４日毎、毎週或いは
２週間毎に一度、長時間作用性の医薬品組成物が投与される場合もある。

【０１５２】 通常の投与量は０．１μｇ〜１００，０００μｇまで変化し、投与の経路にも
よるが、全投与量は約１ｇまでである。詳細な投与量及び送達の方法に関する手
引きは文献に与えられており、一般に当分野の開業医が利用できる。当業者は、
タンパク質或いはそのインヒビタの場合とは異なる製剤を、ヌクレオチドの場合
に用いるであろう。同様にポリヌクレオチド或いはポリペプチドの送達は特定の
細胞、状態、位置等に対して特異であろう。

【０１５３】 診断 別の実施例では、ＧＡＰＩＰを特異に結合する抗体を、ＧＡＰＩＰの発現によ
り特徴付けられる状態或いは疾患の診断のために、又はＧＡＰＩＰ、アゴニスト
、アンタゴニスト或いはインヒビタを用いて治療中の患者をモニタするための検
定法において用いることができる。診断のために有用な抗体は、治療の場合に上
記した方法と同様の方法で調製することができる。ＧＡＰＩＰに対する診断検定
法は、抗体及び標識を用いて、ヒト体液或いは細胞又は組織の抽出物においてＧ
ＡＰＩＰを検出する方法を含む。抗体は、修飾しても修飾しなくても用いること
ができ、リポータ分子と共有結合或いは非共有結合の何れかで結合することによ
り標識されることができる。当分野において知られる種々のリポータ分子を用い
ることができ、そのいくつかが上記される。

【０１５４】 ＧＡＰＩＰを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを含む種々のプ
ロトコルが当分野において知られており、ＧＡＰＩＰ発現の変更されたレベル或
いは異常なレベルを診断するための方法を提供する。ＧＡＰＩＰ発現のための正
常或いは標準的な値は、正常な哺乳動物被検者、好ましくはヒトから取り出され
た体液或いは細胞抽出物を複合体形成に適した条件下でＧＡＰＩＰに対する抗体
と結合することにより確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法により定
量することができるが、光計測による手段が好ましい。被検者において発現した
ＧＡＰＩＰの量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される
。標準値と被検者値との間の偏差が疾患を診断するためのパラメータを確立する
。

【０１５５】 本発明の別の実施例では、ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチドを診断の
ために用いることができる。用いられるポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド
配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びＰＮＡを含む。ポリヌクレオチド
を用いて、ＧＡＰＩＰの発現が疾患と相関をなす可能性がある生検組織の遺伝子
発現を検出かつ定量することができる。診断検定法を用いて、ＧＡＰＩＰの存否
及び過剰発現を識別することができ、さらに治療処置中のＧＡＰＩＰレベルの調
節をモニタすることができる。

【０１５６】 一態様では、ＧＡＰＩＰ或いは密接に関連する分子をコードするゲノム配列を
含むポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブを用いるハイ
ブリダイゼーションにより、ＧＡＰＩＰをコードする核酸配列を同定することが
できる。非常に特異な領域、例えば５´調節領域内の１０個の特有のヌクレオチ
ド、或いは特異性の低い領域、例えば特に３´コード化領域の何れかからなるプ
ローブの特異性及びそのハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高
、中間或いは低）が、そのプローブがＧＡＰＩＰをコードする自然発生配列、ア
レルのみを同定するか、或いは関連する配列を同定するかを確定するであろう。

【０１５７】 またプローブは関連する配列の検出に用いることもでき、ＧＡＰＩＰをコード
する配列の任意のものからのヌクレオチドの少なくとも５０％を含むことが好ま
しい。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡ或いはＲＮＡであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列に、或いはプロモータ、エンハンサエレメント及び
自然発生ＧＡＰＩＰのイントロンを含むゲノム配列に由来する。

【０１５８】 ＧＡＰＩＰをコードするＤＮＡのための特異なハイブリダイゼーションプロー
ブを生成するための手段は、ＧＡＰＩＰ或いはＧＡＰＩＰ誘導体をコードする核
酸配列を、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクタにクローニングする過程を含
む。そのようなベクタは当分野では周知で、市販されており、適当なＲＮＡポリ
メラーゼ及び適当な標識化ヌクレオチドを加えることによりin vitroでＲＮＡプ
ローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブ
は、種々のリポータ群、例えば³²Ｐ或いは³⁵Ｓのような放射性核種、又はアビジ
ン／ビオチン結合系等を介してプローブに結合されるアルカリ性フォスファター
ゼのような酵素標識により標識されることができる。

【０１５９】 ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチド配列はＧＡＰＩＰの発現に関連する
障害の診断のために用いることができる。そのような障害は、限定はしないが、
そのような生殖障害は、限定はしないが、プロラクチン生成の障害、卵管障害、
***異常および子宮内膜症を含む不妊症、発情周期の破壊、月経周期の破壊、多
嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜および卵巣の癌、自己免疫障
害、子宮外妊娠、奇形発生、***の癌、線維嚢胞性乳腺症、乳汁漏出症、***形
成の破壊、異常***生理、精巣の癌、前立腺の癌、前立腺肥大症、前立腺炎、男
性***の癌および女性化***症のような生殖障害と、尿細管性アシドーシス、貧
血症、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌおよびベッカー
型筋ジストロフィ、てんかん、性腺形成異常症、ＷＡＧＲ（ウィルムスの癌、無
虹彩症、尿生殖器奇形及び精神薄弱）症候群、スミス−マジェンニス（Smith-Ma
genis）症候群、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮形成異常、遺伝性角皮症
、シャルコー・マリーツース病および神経線維腫症のような遺伝性神経病、甲状
腺不全症、水頭症、シドナム舞踏病および脳性麻痺のような発作障害、脊椎披裂
、および先天性緑内障、白内障或いは感覚神経性聴力損失のような発生障害と、
腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、詳細には、副腎
、膀胱、骨、骨髄、脳、***、子宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝
臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精
巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌のような腫瘍性障害と、後天性免疫不全症候群
（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、
アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血
、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピ
ー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎
、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加
症、過敏性腸症候群、紅班性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心
膜の炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発筋炎、リウマチ性関節炎、強皮
症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシ、全身性紅班性狼瘡、全身性硬
化症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、及び癌、血液透析、体外循環の合併症
、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原虫感染、及び蠕虫感染；
及び外傷、及び動脈硬化症、滑液泡炎、肝硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣ
ＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間血色素尿症、真性多血症、及び原発性血小板血
症のような免疫障害とを含む場合がある。ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオ
チド配列は、サザン分析或いはノーザン分析、ドットブロット、又は他の膜系技
術において、又はＰＣＲ技術において、又は変更されたＧＡＰＩＰ発現を検出す
るために患者生検からの体液或いは組織を利用するディップスティック、ｐｉｎ
、ＥＬＩＳＡ検定法或いはマイクロアレイにおいて用いることができる。そのよ
うな定性的或いは定量的方法は当分野において周知である。

【０１６０】 特定の態様では、ＧＡＰＩＰをコードするヌクレオチド配列は、種々の癌、特
に上記したような癌の活性化或いは誘発を検出する検定法において有用である。
ＧＡＰＩＰをコードするヌクレオチド配列は標準的な方法において標識され、ハ
イブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下で患者からの体液或いは組織
サンプルに加えられることができる。適当な時間インキュベートした後、サンプ
ルは洗浄され、そのシグナルが定量され、標準値と比較される。生検された或い
は抽出されたサンプルのシグナルの量が比較制御サンプルのシグナルの量から著
しく変更されている場合には、そのヌクレオチド配列はサンプル内のヌクレオチ
ド配列とハイブリダイズされており、サンプル内のＧＡＰＩＰをコードするヌク
レオチド配列の変更レベルの存在が関連する疾患の存在を示す。またそのような
検定法を用いて、動物実験、臨床試験或いは個々の患者の治療をモニタする際に
特定の治療措置の有効度を評価することができる。

【０１６１】 ＧＡＰＩＰの発現に関連する疾患を診断する基準を与えるために、発現に対す
る正常或いは標準値が確立される。これは、動物或いはヒトいずれかの正常な被
検者から取り出された体液或いは細胞抽出物を、当分野で周知の複合体形成に適
した条件下でＧＡＰＩＰをコードする配列或いはそのフラグメントと結合するこ
とにより与えられる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被検者から得
られた値を、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験
から得られた値と比較することにより定量することができる。正常サンプルから
得られた標準値が、疾患の症状がある被検者のサンプルから得られた値と比較さ
れる。標準値と被検者値との間の偏差を用いて、疾患状態の存在を立証する。

【０１６２】 一度疾患が確定され、治療プロトコルが開始されれば、その患者の発現のレベ
ルが正常な患者において観測されるレベルに接近し始めるか否かを評価するため
に、ハイブリダイゼーション検定法が規則的に繰り返される。継続的な検定法か
ら得られる結果を用いて、数日から数ヶ月の期間に渡る治療の有効度を示すこと
ができる。

【０１６３】 癌の場合、個々の患者からの生検組織内の異常な量の転写物の存在が、疾患の
発生に対する素因を示すか、或いは実際の臨床的な症状が発生する前に疾患を検
出するための手段を提供する。この種のより決定的な診断により、専門医は、予
防措置或いは初期段階での積極的な治療を行うことができ、それにより癌の発生
を予防したり、或いは進行するのを防ぐこともできる。

【０１６４】 ＧＡＰＩＰをコードする配列から設計されるオリゴヌクレオチドに対するさら
なる診断上の使用は、ＰＣＲの使用を含む場合がある。そのようなオリゴマは化
学的に合成されるか、酵素的に生成されるか、或いはin vitroで生成されてもよ
い。オリゴマは、ＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチドのフラグメント、或
いはＧＡＰＩＰをコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのフ
ラグメントを含み、特異な遺伝子或いは条件の同定のために最適化された条件下
で用いられることが好ましい。同一の２つのオリゴマ、入れ子状の組のオリゴマ
、或いはオリゴマの縮重プールであっても、密接に関連するＤＮＡ或いはＲＮＡ
配列を検出並びにまた定量するために低い厳密な条件下で用いることができる。

【０１６５】 またＧＡＰＩＰの発現を定量するために用いることができる方法は、ヌクレオ
チドの放射標識或いはビオチン標識、或いは制御核酸の相互増幅並びに実験結果
が書き込まれる標準曲線を含む（Melby, P.C. 等 (1993) J. Immunol. Methods,
159:235-244; Duplaa, C. 等 (1993) Anal. Blochem. 229-236）。多数サンプ
ルを定量する速度は、ＥＬＩＳＡフォーマットの検定法を実行することにより加
速することができ、その際対象のオリゴマは種々の希釈法において表され、スペ
クトル光計測反応或いは色計測反応が迅速な定量化がもたらされる。

【０１６６】 さらに別の実施例では、ここで記載されたポリヌクレオチド配列の任意のもの
に由来するオリゴヌクレオチド或いはその長寸のフラグメントをマイクロアレイ
の標的として用いることもできる。マイクロアレイを用いて、多数の遺伝子の発
現レベルを同時にモニタし（転写画像を生成するために）、遺伝子変異配列、突
然変異及び多形性を同定することができる。この情報は、遺伝子機能を確定し、
疾患の遺伝的基礎を理解し、かつ疾患を診断し、また治療薬剤の活性を発生及び
モニタするために用いることができる。

【０１６７】 当分野で周知の方法を用いてマイクロアレイが準備、使用及び解析される（例
えばBrennan, T.M. et al. (1995) U.S. Patent NO. 5,474,796; Schena, M. et
al. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler et al.
(1995) PCT applicationWO95/251116; Shalon, D. et al. (1995) PCT applicat
ion WO95/35505; Heller, R.A. et al.(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150
-2155; and Heller, M.J. et al. (1997) U.S. Patent No.5,605,662を参照され
たい）。

【０１６８】 本発明の別の実施例では、ＧＡＰＩＰをコードする核酸配列を用いて、自然発
生ゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブを
生成することもできる。その配列は特定の染色体に或いは染色体の特異領域に、
又は例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）、細菌性人
工染色体（ＢＡＣ）、細菌性Ｐ１構造体或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリの
ような人工染色体構造にマッピンクされてもよい（例えばPrice, C.M. (1993) B
lood Rev. 7:127-134; and Trask, B.J. (1991) Trends Genet.7:149-154を参照
されたい）。

【０１６９】 蛍光in situハイブリダイゼーションは、他の物理的な染色体マッピング技術
及び遺伝マップデータと相関をなす（例えばHeinz-Ulrich, et al.(1995) in Me
yers, R.A. (ed.) Molecular.Biology and Biotechnology, VCH Publishers New
York, NY, pp. 965-968を参照されたい）。遺伝子マップデータの例は種々の科
学雑誌或いはOnline Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）に見出すこと
ができる。物理的染色体マップ上のＧＡＰＩＰをコードする遺伝子の位置と特定
の疾患或いは特定の疾患に対する素因との間の相関は、その遺伝的疾患に関連す
るＤＮＡの領域の境界を定めることを可能にする。本発明のヌクレオチド配列を
用いて、正常者と保菌者、すなわち感染した個体との間の遺伝子配列の差を検出
することができる。

【０１７０】 染色体標本のin situハイブリダイゼーション及び確立された染色体マーカを
用いる連鎖分析のような物理的マッピング技術が、遺伝子マップを拡張するため
に用いることができる。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配
置が、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であっても、関連するマーカを明ら
かにできる場合もある。新規の配列は、物理的なマッピングにより染色体腕或い
はその一部に割り当てることができる。これは、位置クローニング或いは他の遺
伝子発見技術を用いる疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報を与える。一度
疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴから１１ｑ２２−２３まで
への遺伝子連鎖により自然のまま局在されていれば、その領域に対する任意の配
列マッピングが、さらなる研究のための関連或いは調節遺伝子を表すことができ
る(例えばGatti等(1998) Nature 336:577-580を参照されたい)。また本発明のヌ
クレオチド配列を用いて、正常個体と保菌者、すなわち感染個体との間における
転座、逆位等により染色***置内の差を検出することができる。

【０１７１】 本発明の別の実施例では、ＧＡＰＩＰ、その触媒作用或いは免疫原性フラグメ
ント又はオリゴペプチドを用いて、種々の薬物スクリーニング技術の任意のもの
において化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。そのようなス
クリーニングにおいて用いられるフラグメントは溶液中に遊離するか、固形支持
体に付着するか、細胞表面上に支持されるか、或いは細胞内に配置されてもよい
。ＧＡＰＩＰと被試験因子との間に形成される結合複合体が測定される場合もあ
る。

【０１７２】 薬物スクリーニングに用いる場合がある別の技術は、対象のタンパク質への適
当な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを実現する（例
えばGeysen, 等(1984) PCT application WO84/03564を参照されたい）。この方
法では、ＧＡＰＩＰに適用されるような、多数の異なる小さな検査化合物がプラ
スチックピン或いはある他の表面のような固体支持体上で合成される。検査化合
物はＧＡＰＩＰ或いはそのフラグメントと反応し、洗浄される。その後結合され
たＧＡＰＩＰが当分野で周知の方法により検出される。また精製されたＧＡＰＩ
Ｐは、上記の薬物スクリーニング技術において用いるためのプレート上に直接コ
ーティングされることもできる。別法では、非中和性抗体を用いて、ペプチドを
捕捉し、それを固体支持体上に固定化することもできる。

【０１７３】 別の実施例では、ＧＡＰＩＰを特異に結合することができる中和性抗体がＧＡ
ＰＩＰを結合するための検査化合物と競合する、競合薬物スクリーニングアッセ
イを使用する。このようにして、抗体を用いて、ＧＡＰＩＰと１つ或いはそれ以
上の抗原決定基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。

【０１７４】 さらに別の実施例では、その新規の技術が、限定はしないがトリプレット遺伝
子コード及び特異な塩基対相互作用のような特性を含む現在知られているヌクレ
オチド配列の特性に依存する場合には、ＧＡＰＩＰをコードするヌクレオチド配
列を、将来開発されるあらゆる分子生物学技術において用いることができる。

【０１７５】 以下の例は、本発明を例示するために与えるものであり、本発明を制限するも
のではない。

【０１７６】

【実施例】

１ ｃＤＮＡライブラリの作製 ＵＴＲＳＮＯＴ０２ｃＤＮＡは、膣式子宮摘出中の３４歳白人女性（標本番号
００４７Ａ）から得られた子宮組織から構築された。病理報告では、子宮或いは
子宮頚に診断上の異常は認められなかった。しかしながら左側卵巣組織は、全て
包埋した、拡張した小胞性嚢腫を示した。患者の病歴には月経困難症、***疼痛
症、痔、飲酒があった。その患者は全く薬物投与していなかった。家族の病歴と
しては、母親に悪性胃癌、父親に良性大腸癌、兄弟に先天性心臓奇形、過敏性腸
症候群及び潰瘍性大腸炎、父方の叔母に年齢６０歳で結腸癌、父方の叔父に年齢
１１歳で結腸癌、祖父母に脳血管障害、タイプＩＩ糖尿病及びうつ病があった。

【０１７７】 凍結組織をBrinkmann Homogenizer Polytron-PT 3000（Brinkmann Instrument
s, INC., Westbury, NY）を用いて、グアニジウムイソチオシアネートの中でホ
モジナイズし溶解した。この溶解産物を、Beckman L8-70M超遠心分離器において
Beckman SW28ロータを用いて（Beckman Instruments）、５．７Ｍの塩化セシウ
ムクッションを用いて周囲温度で１８時間、１分当たり２５，０００回転の回転
数で遠心分離した。そのＲＮＡはｐＨ４．７のフェノールクロロフォルムで抽出
され、０．３Ｍの酢酸ナトリウム及び２．５倍量のエタノールを用いて沈殿させ
、ＲＮＡアーゼの無い水に再懸濁され、３７℃でＤＮアーゼ処理された。ＲＮＡ
抽出及び沈殿は上記のように繰り返された。ｍＲＮＡをOLIGOTEX kit（QIAGEN,
Chatsworth, CA）を用いて単離し、ｃＤＮＡライブラリの作製のために用いた。

【０１７８】 スーパースクリプトプラスミドシステム(Catalog #18248-013: GIBRO/BRL)の
推奨プロトコルに従って、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成及びｃＤＮ
Ａライブラリを作製した。このｃＤＮＡをSepharose CL4Bカラム(Catalog//2751
05-01, Pharmacia, Piscataway, NJ)上で分画し、４００ｂｐを越えるｃＤＮＡ
はpSPORT1(GIBCO BRL)のNotl及びSalI部位に結合させた。その後プラスミドpSPO
RT1をDH5αコンピテント細胞(Catalog # 18258-012, GIBCO BRL)に形質転換した
。

【０１７９】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡは細胞から放出され、Miniprep Kit (Cat. No. 77468; Adva
nced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg MD)を用いて精製した
。このキットは９６０個の精製用の試薬を有する９６穴ブロックからなる。推奨
プロトコルを用いたが、以下の点を変更した。１）２５mg/Lのカルベニシリン及
び０．４%のグリセロールと共に１mlの滅菌Terrific Broth（Catalog#22711, Gi
bco/BRL）において細菌を培養した。２）植菌の後、培地を１９時間インキュベ
ートし、インキュベーション終了時に０．３ｍｌの溶解バッファに溶解した。３
）イソプロパノール沈殿後、プラスミドＤＮＡペレットは、０．１ｍｌの蒸留水
に再懸濁された。プロトコルの最終ステップの終了後、サンプルをBeckman９６
穴ブロックに移し、４℃で保管した。

【０１８０】 このｃＤＮＡの配列決定は、Peltier Thermal Cyclers （PTC200 from MJ Res
earch, Watertown, MA）及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systems
と組み合わせてHamilton Micro Lab 2200 （Hamilton, Reno, NV）を用いてSang
er F.及びA.R. Coulsonの方法（1975, J. Mol. Biol.94:441f）により行われ、
読み枠が決定された。

【０１８１】 ３ ｃＤＮＡクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索 配列表のヌクレオチド配列及び、それらから類推されるアミノ酸配列を問い合
わせ配列として用いて、例えばGenBank、SwissProt、BLOCKS、及びPima IIのよ
うなデータベースを検索した。これらのデータベースには既に同定された配列が
注釈付きで含められており、BLAST（Basic Local Alignment Toolを表す）を用
いて相同性（類似性）を有する領域をこのデータベースのなかから検索した（Al
tschul. S.F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschulら(1990) J. Mol. B
iol. 215:403-410）。

【０１８２】 BLASTは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを作成して配
列の類似性を決定する。そのアライメントの局所的性質のために、BLASTは厳密
な一致、すなわち原核生物（細菌）や真核生物（動物、菌類、又は植物）を起源
とする相同体を求める際に特に有効である。一次配列パターンや二次構造ギャッ
プの問題を処理する際には、参照して本明細書の一部としているSmith R.F.及び
T.F. Smith（1992, Protein Engineering 5:35-51）に記載のアルゴリズムのよ
うな他のアルゴリズムを用いることができる。本明細書に開示された配列の長さ
は少なくとも４９ヌクレオチドであり、不必要な塩基は１２％以下である（この
場合、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴではなく、Ｎが記録される）。

【０１８３】 BLAST法は、参照して本明細書の一部としているKarlin. S.及びS.F. Altschul
（1993: Proc. Nat. Acad. Sci. 90:5873-7）に詳細に記載されているように、
問い合わせ配列とデータベースの配列の一致を検索し、発見したあらゆる配列の
一致の統計的有意性を評価して、ユーザが選択した有意性の閾値を満たす一致の
み３を報告する。本出願での閾値は、ヌクレオチドで１０^-25、ペプチドで１０^{- 8} に設定した。

【０１８４】 インサイト社ヌクレオチド配列が霊長類（ｐｒｉ）、齧歯類（ｒｏｄ）及び哺
乳動物（ｍａｍ）配列の場合にＧｅｎＢａｎｋデータベースに対して検索され、
その後同じクローンから推定されたアミノ酸配列が、GenBank機能タンパク質デ
ータベース、哺乳動物（ｍａｍｐ）、脊椎動物（ｖｒｔｐ）及び真核生物（ｅｕ
ｋｐ）に対して相同性を検索された。

【０１８５】 更に、BLOCKS（Block 2 Bioanalysis Program (Incyte, Palo Alto, CA)）な
どの好適な分析プログラムを用いて、ｃＤＮＡライブラリ由来の同定された配列
を分析して、保存されたタンパク質モチーフをコードするそれらの遺伝子配列を
同定する。BLOCKSは、短いアミノ酸セグメントまたはブロックを用いた重量マト
リクス分析アルゴリズムであり、PROSITEデータベースで編集する。(Bairoch. A
. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:217-221.)。このBLOCKSアルゴリズムは、
未知の機能をもつ遺伝子を分類する際に有用である。(Henikoff S.及びHenikoff
G.J..Nucleic Acids Research (1991) 19:6565-6572.)。アミノ酸３０から６０
個分の長さのBLOKSは、タンパク質の最も高度に保存された領域に対応する。こ
のBLOKSアルゴリズムは、問合わせの配列をBLOKSデータベースの重量評点したブ
ロックのマトリクスと比較する。このBLOKSデータベースのブロックは、SWISS-P
ROTデータベースからの未知の機能をもつタンパク質配列に対して較正して、一
致の確率分布を決定する。タンパク質フィンガープリントであるPRINTSなどの類
似のデータベースもまた、BLOKSアルゴリズムを用いて検索できる。(Attwood. T
. K.他 (1997) J. Chem. Inf. Comput. Sci. 37:417-424.)。PRINTSは、非重複
性の配列に基づいてSWISS-PROTまたはGenBank、PIR、NRL-3Dなどから得た。

【０１８６】 このBLOKSアルゴリズムは、問合わせの配列とBLOKSやPRINTSのデータベースと
の一致を検索し、見つかった一致の全ての統計的有用性を評価する。BLOKSやPRI
NTS検索での一致は、局部的類似性と全体的類似性の２つに分類される。局部的
類似性の程度はスコアによって決められ、全体的類似性の程度はスコアと確率値
とで決められる。BLOKSの最も高い一致レベルは１０００点以上であり、一致し
たブロックをSWISS-PROTに対して較正すると、正の不一致率は０．５％以内であ
る。同様に、１／１０００の確率値は、１０００回の検索で１回より多くは一致
しないと言うことである。１０００点以上のカットオフスコア及び１／１０００
以下のカットオフ確率値をもつ一致のみが、Sequence Listingにおけるタンパク
質配列の機能分析とみなされる。

【０１８７】 配列表の核酸配列及びアミノ酸配列は、ＰＦＡＭを用いて解析することもでき
る。ＰＦＡＭは、タンパク質のファミリ検索において有用な隠れマルコフモデル
（ＨＭＭ）系プロトコルである。ＨＭＭは、遺伝子ファミリのコンセンサス主要
配列を解析する確率的なアプローチである（例えば、Eddy, S.R. (1996) Cur. O
pin. Str. Biol. 6:361-365を参照されたい）。

【０１８８】 PFAMデータベースは、SWISS-PROT及びPROSITEなどの公的に入手できる５２７
のタンパク質ファミリーのタンパク質配列を含む。PFAMは、シードアライメント
(seed alignment)及び全アライメント(full alignment)の２つの高度なアライメ
ントルーチンを使って、十分に特徴の或るタンパク質ドメインを検索する。(例
えば、Sonnhammer, E.L.L. 他 (1997) Proteins 28:405-420.を参照)。このシー
ドアライメントは、局部的一致を検索するプログラムであるhmmlsプログラムと
、PFAMデータベースの重複していない配列１組を利用する。全アライメントは、
反復やモチーフなどの長い配列における複数のフラグメントを検索するプログラ
ムであるhmmfsプログラムと、PFAMデータベースの全ての配列を利用する。１０
０ビットの結果或いはスコアは、配列がモデル配列或いは比較配列と真に一致す
るより２¹⁰⁰倍可能性が高いことを意味する。１０から５０ビットまでの範囲の
カットオフスコアは、モデル配列或るいは比較配列としてSWISS-RPOT配列を用い
るそれぞれのタンパク質のファミリーに対して用いられるのが一般的である。

【０１８９】 上記したHMMアルゴリズムに基づいた２つのアルゴリズム、SIGPEPT及びTMは、
それぞれ潜在シグナル配列及び膜貫通ドメインを同定する。SIGPEPTは、SWISS-R
POTからのシグナル配列注釈(signal sequence annotation)を有するタンパク質
配列を用いて作られ、１４個から３６個のアミノ酸残基の長さをもった重複して
いない約１４１３個のシグナル配列を含む。TMは、同じように膜貫通ドメイン注
釈を用いて作られ、１５７９個の膜貫通ドメインセグメントを含む約４５３個の
重複していない膜貫通配列を含む。好適なHMMのモデルは上記した配列を用いて
作られ、高い相関係数（分析の正確さを表す値）が得られるまで、よく知られて
いるSWISS-RPOTのシグナルペプチド配列または膜貫通ドメイン配列で精製する。
テスト用の配列の組としてSWISS-RPOTデータベースからのタンパク質配列を用い
て上記のように決定した１１ビットのカットオフスコアは９１〜９４％の真の正
及び約４．１％の偽の正に相関し、SIGPEPTに対して約０．８７〜０．９０の相
関係数である。TMの１１ビットのスコアは、７５％の真の正、１．７２％の偽の
正、０．７６の相関係数である。各検索は、見つかった任意の一致の統計的意義
を評価し、１１ビット以上のスコアの一致のみ報告する。

【０１９０】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術
であり、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞タイプまたは組織に由来する
ＲＮＡが結合した膜とのハイブリダイゼーションを行う（例えば、Sambrook, 前
掲, ch. 7及びAusubel, F.M.等 前掲, ch. 4 and 16を参照されたい）。

【０１９１】 BLAST（Altschul, S.F. 1993及び1990, 前出）を用いる類似のコンピュータ技
術を用いて、GenBank又はLIFESEQ^TMデータベース（Incyte Pharmaceuticals）の
ようなデータベースにおける同一或いは関連する分子を検索した。この分析は、
多くの膜系ハイブリダイゼーションと比較して非常に高速である。さらにコンピ
ュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同的であるかの分類
を決定することができる。

【０１９２】 検索の基準値は、積スコア（product score）であり、これは以下の式で定義
されるものである。 （配列の一致率（％）×最大BLASTスコア（％））／１００ この積スコアは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の両方を
考慮している。例えば、積スコアが４０の場合は、一致は誤差が１〜２％の範囲
で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相同な分子は、通常
積スコアとして１５〜４０を示すものを選択することにより同定されるが、スコ
アの低いものも関連する分子として同定することもできる。

【０１９３】 ノーザン分析の結果は、ＧＡＰＩＰをコードする転写物が発生するライブラリ
のリストとして報告される。配列の存在量（abundance）及び存在率（percent a
bundance）のリストも報告される。存在量は、特定の転写物の検出回数を直接反
映し、存在率は、存在量をｃＤＮＡライブラリ内で検出された配列の総数で割っ
た値である。

【０１９４】 ５ ＧＡＰＩＰをコードする配列の延長 インサイト社クローン６８８１８３の核酸配列を用いて、部分ヌクレオチド配
列を完全長まで伸長するためにオリゴヌクレオチドプライマを設計した。１つの
プライマを合成してアンチセンス方向の伸長を開始し、他のプライマを合成して
センス方向の配列を伸長した。プライマを用いて、対象の領域に対する新規で未
知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生させる既知の配列の
伸長を容易にした。初期プライマが、OLIGO 4.06 (National Biosciences)或い
は他の適当なプログラムを用いてｃＤＮＡから設計され、長さが約２２〜３０の
ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含有物を有し、約６８〜７２℃の温度で
標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造及びプライマ−プライマ
２量体化をもたらすことになるヌクレオチドの伸展は避けられた。

【０１９５】 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリ（Gibco/BRL）を用いて配列を伸長した。
２つ以上の伸長が必要或いは望まれる場合には、既知領域をさらに伸長させるた
めに、追加のプライマの組が設計される。

【０１９６】 XL-PCR kit (Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、酵素及び反応混合物を完
全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られた。各プライマを４０ｐｍ
ｏｌかつキット全ての他の成分を推奨された濃度で開始する場合、ＰＣＲがPelt
ier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown MA)を用いて、 ステップ１ １分間９４℃（初期変性） ステップ２ １分間６５℃ ステップ３ ６分間６８℃ ステップ４ １５秒間９４℃ ステップ５ １分間６５℃ ステップ６ ７分間６８℃ ステップ７ さらに１５サイクル間ステップ４−６の繰返し ステップ８ １５秒間９４℃ ステップ９ １分間６５℃ ステップ１０ ７分１５秒間６８℃ ステップ１１ １２サイクル間ステップ８−１０の繰返し ステップ１２ ８分間７２℃ ステップ１３ ４℃（保持） のパラメータで実行された。

【０１９７】 反応混合物の５−１０μｌ部分標本が低濃度（約０．６−０．８％）アガロー
スミニゲル上で電気泳動法により分析され、どの反応物が配列の伸長に成功した
かを判定した。最も大きな生成物を含むと考えられる帯がゲルから切除され、QI
A Quick^TM (QIAGEN Inc.Chatsworth, CA)を用いて精製され、再結合及びクロー
ニングを容易にするためにクレノウ酵素を用いて、オーバーハングから切除され
た。

【０１９８】 エタノール沈殿後、その生成物は１３μｌの連結緩衝液中に再溶解され、１μ
ｌＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼが加えられ、その混合物は２〜３時間室温で、或いは１６℃で一晩の間イン
キュベートされた。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適当な媒質内に
ある）が３μｌの連結混合物と形質転換され、８０μｌのＳＯＣ媒質内で培養さ
れた（例えばSambrook、前掲、付録Ａ p.2を参照されたい）。３７℃で１時間イ
ンキュベートした後、Ｅ．ｃｏｌｉ混合物が、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertan
i (LB)-agar (Sambrook、前掲、付録Ａ p.1を参照されたい)上に蒔かれた。翌日
、いくつかのコロニーが各プレートから無作為に選び取られ、適当な市販の滅菌
９６穴微量定量プレートの個々のウエル内に置かれた１５０μｌの液体ＬＢ／２
ｘＣａｒｂ媒質内で培養された。その翌日、各５μｌの一晩おいた培養株が有菌
の９６穴プレートに移され、水で１：１０に希釈された後、５μｌの各サンプル
がＰＣＲアレイに移された。

【０１９９】 ＰＣＲ増幅の場合、４ユニットのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ベクタプライ
マ及び伸長反応のために用いられる１つ或いは両方の遺伝子特異的プライマを含
む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）が各ウエルに加えられた。増幅
は、 ステップ１ ６０秒間９４℃ ステップ２ ２０秒間９４℃ ステップ３ ３０秒間５５℃ ステップ４ ９０秒間７２℃ ステップ５ さらに２９サイクルの間ステップ２−４の繰返し ステップ６ １８０秒間７２℃ ステップ７ ４℃（保持） の条件で実行された。

【０２００】 ＰＣＲ反応物の部分標本が、分子重量マーカと共にアガロースゲル上で処理さ
れた。ＰＣＲ生成物の大きさが、元の部分ｃＤＮＡと比較され、適当なクローン
が選択され、プラスミドに結合され、そして配列決定された。

【０２０１】 同様にして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を用いて、上記手順、
５´伸長用に設計されたオリゴヌクレオチド及び適当なゲノムライブラリを用い
て５´調節配列を得る。

【０２０２】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に基づくハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃ
ＤＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対から
なるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載されるが、より大きなｃＤＮＡ
フラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドをOLIGO 4.
06（National Bioscience）のような最新のソフトウェアを用いてデザインし、
５０ｐｍｏｌの各オリゴマと、２５０μＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシン三リン酸（
Amersham）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、Boston MA）とを
組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、Se
phadex G-25超精細樹脂カラム（Pharmacia & Upjohn）を用いて精製する。毎分
１０⁷カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、エンドヌクレアーゼ
（AseI，Bgl II，EcoRI，Pst I，Xba1或いはPvuII；DuPont NEN）の１つを用い
て切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜系ハイブリダイゼーション分析におい
て用いる。

【０２０３】 各消化物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン膜
（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハイブリダイ
ゼーションは４０℃で１６時間行われる。非特異的シグナルを取り除くため、ブ
ロットを、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリ
ウムまでの徐々に厳密性が増す条件で順次室温にて洗浄する。XOMAT AR^TMフィル
ム（Kodak, Rochester, NY）を、Phosphoimager cassette（Molecular Dynamics
, Sunnyvale, CA）においてブロットに数時間露光した後、ハイブリダイゼーシ
ョンパターンを視覚的に比較する。

【０２０４】 ７ マイクロアレイ 化学的な結合手順及びインクジェット装置を用いて、基質の表面上にアレイエ
レメントを合成することができる（例えば前掲のBaldeschweilerを参照されたい
）。ドット或いはスロットブロットに類似のアレイを用いてエレメントを配列し
、熱的、ＵＶ、機械的或いは化学的結合手順、又は真空システムによりエレメン
トを基質表面に結合することもできる。典型的なアレイは手作業で、或いは利用
可能な方法及び機械を用いて作製し、任意の適当な数のエレメントを含むことが
できる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄してハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。走査画像を調べて、マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列
の相補性の程度及び相対的な量を求める。

【０２０５】 完全長ｃＤＮＡ或いは発現した配列タグ（Expressed Sequence Tag：ＥＳＴ）
はマイクロアレイのエレメントを含む。本発明のヌクレオチド配列の１つに対応
するか、或いは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリから無作為に選択された完
全長ｃＤＮＡ或いはＥＳＴが、適当な基質、例えばスライドガラス上に配列され
る。ｃＤＮＡは、例えばＵＶ架橋結合を用いて、熱及び化学的に、それを乾燥す
ることによりスライドガラスに固定される（Schena, M. et al. (1995) Science
270:467-470, and Shalon, D. et al. (1996) Genome Res. 6:639-645を参照さ
れたい）。基質上のエレメントにハイブリダイズさせるために、蛍光プローブが
準備され、使用される。その基質が上記の手順により解析される。

【０２０６】 ８ 相補的ポリヌクレオチド ＧＡＰＩＰをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、
自然発生のＧＡＰＩＰの発現を低減又は阻害するために用られる。約１５〜約３
０個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について特に記載されるが、より
小さな配列或いはより大きな配列フラグメントの場合でも概ね同じ方法を用いる
ことができる。Oligo4.06ソフトウェア及びＧＡＰＩＰのコーディング配列を用
いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計することができる。転写を阻害するため
には、最も固有の５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドをデザインし、これ
を用いてプロモータがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害す
るためには、相補的なオリゴヌクレオチドをデザインして、リボソームがＧＡＰ
ＩＰをコードする転写物に結合するのを防ぐ。

【０２０７】 ９ ＧＡＰＩＰの発現 ＧＡＰＩＰの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて
行うことができる。細菌でＧＡＰＩＰが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤ
ＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮ
Ａをサブクローニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調
節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びtr
p-lac(tac)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるもので
はない。組換えベクターを、BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。
抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド(IPTG)
で誘発されるとＨＬＯＲを発現する。真核細胞でのＧＡＰＩＰの発現は、昆虫細
胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAuto graphica californica 核多面性ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウ
イルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介
を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＧＡＰＩＰをコードす
るｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモ
ータによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルス
は、多くの場合はSpodoptera frugiperda (Sf9)昆虫細胞に感染に用いられるが
、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロ
ウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。(例えば、Engelhard. E. K.他 (199
4) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V. 他 (1996) Hum. Ge
ne Ther. 7:1937-1945.を参照)。

【０２０８】 ほとんどの発現系では、ＧＡＰＩＰが、例えばグルタチオンＳトランスフェラ
ーゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合
タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和
性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。Schistosoma japonicumから
の２６キロダルトンの酵素であるＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性
を維持した状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる
。(Pharmacia, Piscataway, N J)。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＨ
ＬＯＲからタンパク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡ
Ｇで、市販のモノクロナール及びポリクロナール抗FLAG抗体を用いた免疫親和性
の精製が可能となる。６個のヒスチジン残基が連続して伸展した6-Hisによって
、金属キレート樹脂(QIAGEN Inc, Chatsworth, CA)で精製が可能となる。タンパ
ク質の発現及び精製の方法は、Ausubel. F. M. 他による(1995年、及び定期的に
補足された) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, N
ew York, NY, ch 10, 16)に記載されている。これらの方法で精製したＨＬＯＲ
を直接用いて以下のアッセイを行うことができる。

【０２０９】 １０ ＧＡＰＩＰの活性の実証 ＧＡＰＩＰのプロテアーゼ抑制性活性は、加水分解の度合いが放出された発色
団の分光光度（或いは蛍光光度）吸収により定量化される種々の色素産生分子と
結合された適当な合成ペプチド基質の加水分解により測定される（Beynon and B
ond, supra pp.25-55）。ペプチド基質は、調製されたトリプシンを用いて最適
な活性を得るように選択される。一般に用いられる色素体は、２−ナフチルアミ
ン、４−ニトロアニリン或いはフリルアクリル酸（furylacrylic acid）である
。室温において検定が実行され、トリプシンのアリコートと適切なバッファ内の
適切な基質を含む。反応は光学キュベット内で実行され、その後ペプチド基質の
加水分解中に放出される色素体の吸収度或いは蛍光度を増減させる。ＧＡＰＩＰ
が存在しない場合の基線吸収度が、検定におけるトリプシン活性に比例する。吸
収度の減少がその検定におけるＧＡＰＩＰ活性に比例する。

【０２１０】 １１ 機能的アッセイ ＧＡＰＩＰの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベ
ルでのＧＡＰＩＰをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤ
ＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサ
ブクローニングする。このようなベクターには、pCMV SPORT^TM (Life Technolog
ies. Gaithersburg. MD)及びpCR^TM 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、
どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換
えベクターを、好ましくは内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或
いは電気穿孔法によって一過性に形質移入する。更に、標識タンパク質をコード
する配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質
の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる
。また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現
を正確に予想できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質(GFP
) (Clontech, Palo Alto, CA)、及びCD64またはCD64-GFP融合タンパク質が含ま
れる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(FCM)を用い
て、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、アポトーシス
の状態などの特性を評価する。また、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の
現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プ
ロピジウムヨウ化物でのＤＮＡの染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化
と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成
の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内
のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面へ
の結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は
、Ormerod, M. G.による (1994) Flow Cytometry ( Oxford, New York, NY.)に
記載されている。

【０２１１】 遺伝子発現におけるＧＡＰＩＰの影響は、ＧＡＰＩＰをコードする配列とCD64
またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて
評価することができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し
、ヒト免疫グロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞
と形質転換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆さ
れた磁気ビードを用いて分離することができる。(DYNAL. Lake Success. NYを参
照)。ｍＲＮＡは、当分野で公知の方法で細胞から精製することができる。ＧＡ
ＰＩＰ及び目的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマ
イクロアレイ技術で分析することができる。

【０２１２】 １２ ＧＡＰＩＰ特異的抗体の産生 標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電
気泳動法（例えばHarrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 182:488-495を参
照されたい）または他の精製技術を用いて実質的に精製されたＧＡＰＩＰを用い
る。

【０２１３】 別法では、ＧＡＰＩＰアミノ酸配列をLASERGENETM software（DNASTAR社）を
用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当業者
が周知の手段により合成して、当業者に周知の方法で抗体を産生するために用い
る。Ｃ末端付近或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような、適切なエピ
トープの選択方法は当分野において周知である（例えばAusubel等. 前掲, ch. 1
1を参照されたい.）。

【０２１４】 典型的にはオリゴペプチドは長さ１５残基で、ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキ
シカルボニル）化学作用を用いるApplied Biosystems Peptide Synthesizer Mod
el 431Aを用いて合成され、M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester（
MBS: Ausubel等、前掲）と反応することによりキーホールリンペットヘモシアニ
ン(KLH, Sigma, St.Louis, MO)に結合される。ウサギは、完全なフロイントアジ
ュバント内でオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫される。その結果生じる抗血
清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合し、１％ＢＳＡで遮断し、ウサギ
抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと
反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。

【０２１５】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生ＧＡＰＩＰの精製 自然発生或いは組換えＧＡＰＩＰは、ＧＡＰＩＰに対して特異な抗体を用いる
免疫親和性クロマトグラフィにより実質的に精製される。免疫親和性カラムが、
ＧＡＰＩＰ抗体を、CnBr-activated Sepharose (Pharmacia＆Upjohn)のような活
性化されたクロマトグラフ樹脂に共有結合させることにより構成される。結合後
、製造者の取扱説明書に従って樹脂は遮断及び洗浄される。

【０２１６】 ＧＡＰＩＰを含む培地を免疫親和性カラム上を通過させ、カラムは、ＧＡＰＩ
Ｐを選択吸収させる条件下（例えば洗浄剤中に高イオン強度緩衝剤を入れたもの
）で洗浄される。カラムは、抗体／ＧＡＰＩＰ結合を***させる条件下（ｐＨ２
〜３の緩衝剤或いは尿素或いはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロ
ープ）で溶出され、ＧＡＰＩＰが回収される。

【０２１７】 １３ ＧＡＰＩＰと相互作用する分子の同定 ＧＡＰＩＰ或いはその生物学的活性フラグメントが、¹²⁵I Bolton-Hunter試薬
(Bolton AE 等(1973) Biochem J 133:529)を用いて標識される。多穴プレートの
ウエル内に以前に配列された候補分子が、標識されたＧＡＰＩＰでインキュベー
トされ、洗浄され、標識されたＧＡＰＩＰ複合体を有する任意のウエルが検定さ
れる。種々のＧＡＰＩＰ濃度から得られたデータを用いて、数、親和性及びＧＡ
ＰＩＰと候補分子との関係を示す値を計算する。

【０２１８】 上記明細書中に記載された全ての特許出願及び特許は参照して本明細書の一部
としている。記載された本発明の方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は
、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかとなろう。本発
明は特定の好適な実施例に関連して記載されてきたが、請求される本発明はその
ような特定の実施例に不当に制限されるべきでないことを理解されたい。実際に
、本発明を実施するために記載された形態の種々の変更例は、分子生物学或いは
関連する分野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲内に入るものと考慮
されたい。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＧＡＰＩＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO software (Hitach
i Software Engineering Co. Ltd., San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｂ】 ＧＡＰＩＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO software (Hitach
i Software Engineering Co. Ltd., San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｃ】 ＧＡＰＩＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO software (Hitach
i Software Engineering Co. Ltd., San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｄ】 ＧＡＰＩＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO software (Hitach
i Software Engineering Co. Ltd., San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｅ】 ＧＡＰＩＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO software (Hitach
i Software Engineering Co. Ltd., San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｆ】 ＧＡＰＩＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO software (Hitach
i Software Engineering Co. Ltd., San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｇ】 ＧＡＰＩＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO software (Hitach
i Software Engineering Co. Ltd., San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｈ】 ＧＡＰＩＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO software (Hitach
i Software Engineering Co. Ltd., San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｉ】 ＧＡＰＩＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO software (Hitach
i Software Engineering Co. Ltd., San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｊ】 ＧＡＰＩＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO software (Hitach
i Software Engineering Co. Ltd., San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図２Ａ】 LASERGENE software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて生成された、ＧＡＰＩＰ（６８８１８３；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ（ＧＩ ３３９８５
；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ重鎖
Ｈ１（ＧＩ ３３９８９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒトプレインター−α−
トリプシンインヒビタ重鎖Ｈ３（ＧＩ ２８８５６３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
の間のアミノ酸配列アライメントを示す。

【図２Ｂ】 LASERGENE software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて生成された、ＧＡＰＩＰ（６８８１８３；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ（ＧＩ ３３９８５
；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ重鎖
Ｈ１（ＧＩ ３３９８９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒトプレインター−α−
トリプシンインヒビタ重鎖Ｈ３（ＧＩ ２８８５６３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
の間のアミノ酸配列アライメントを示す。

【図２Ｃ】 LASERGENE software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて生成された、ＧＡＰＩＰ（６８８１８３；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ（ＧＩ ３３９８５
；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ重鎖
Ｈ１（ＧＩ ３３９８９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒトプレインター−α−
トリプシンインヒビタ重鎖Ｈ３（ＧＩ ２８８５６３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
の間のアミノ酸配列アライメントを示す。

【図２Ｄ】 LASERGENE software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて生成された、ＧＡＰＩＰ（６８８１８３；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ（ＧＩ ３３９８５
；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ重鎖
Ｈ１（ＧＩ ３３９８９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒトプレインター−α−
トリプシンインヒビタ重鎖Ｈ３（ＧＩ ２８８５６３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
の間のアミノ酸配列アライメントを示す。

【図２Ｅ】 LASERGENE software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて生成された、ＧＡＰＩＰ（６８８１８３；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ（ＧＩ ３３９８５
；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ重鎖
Ｈ１（ＧＩ ３３９８９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒトプレインター−α−
トリプシンインヒビタ重鎖Ｈ３（ＧＩ ２８８５６３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
の間のアミノ酸配列アライメントを示す。

【図２Ｆ】 LASERGENE software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて生成された、ＧＡＰＩＰ（６８８１８３；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ（ＧＩ ３３９８５
；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ重鎖
Ｈ１（ＧＩ ３３９８９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒトプレインター−α−
トリプシンインヒビタ重鎖Ｈ３（ＧＩ ２８８５６３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
の間のアミノ酸配列アライメントを示す。

【図２Ｇ】 LASERGENE software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて生成された、ＧＡＰＩＰ（６８８１８３；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ（ＧＩ ３３９８５
；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ重鎖
Ｈ１（ＧＩ ３３９８９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒトプレインター−α−
トリプシンインヒビタ重鎖Ｈ３（ＧＩ ２８８５６３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
の間のアミノ酸配列アライメントを示す。

【図３】 LASERGENE software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて生成された、ＧＡＰＩＰ（６８８１８３；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ（ＧＩ ３３９８５
；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ヒトプレインター−α−トリプシンインヒビタ重鎖
Ｈ１（ＧＩ ３３９８９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒトプレインター−α−
トリプシンインヒビタ重鎖Ｈ３（ＧＩ ２８８５６３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
の間の系統樹を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月１５日（２０００．１２．１５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】 成長関連プロテアーゼインヒビタ重鎖前駆体

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 15/00 Ａ６１Ｐ 37/02 ４Ｃ０８５ 35/00 43/00 ４Ｈ０４５ 37/02 Ｃ０７Ｋ 16/40 43/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/50 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/50 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 パターソン、チャンドラ アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・レランドアベニュー 2189 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA19 CA04 CA09 CA11 DA02 DA05 DA11 EA02 EA04 GA11 HA01 HA03 HA12 4B050 CC10 4B063 QA01 QQ01 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA02 BA22 CA17 CA18 CA20 CA21 CA23 NA14 ZA812 ZB012 ZB022 ZB052 ZB262 4C085 AA13 AA14 BB11 BB22 CC02 CC23 CC32 GG01 GG02 GG03 GG04 GG05 GG06 GG08 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 DA56 EA20 FA72 FA74

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
   Ｏ：１のフラグメントを含む実質的に精製されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１の配列に少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有
   する実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され、精製された
   ポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドに少なくとも９０％ポリヌクレ
   オチド配列同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列。
5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチドに厳密な条件でハイブリダイズ
   する単離され、精製されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドに相補的な単離され、精製され
   たポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントを含む単離され、精製されたポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項７のポリヌクレオチドに少なくとも９０％ポリヌクレ
   オチド配列同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列。
9. 【請求項９】 請求項７のポリヌクレオチドに相補的な配列を有する単離さ
   れ、精製されたポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくともフラグメントを
    含む発現ベクタ。
11. 【請求項１１】 請求項１０の発現ベクタを含む宿主細胞。
12. 【請求項１２】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
    のフラグメントを含むポリペプチドを生成するための方法であって、 （ａ）ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１１の宿主細胞を培養する
    過程と、 （ｂ）前記宿主細胞培養株から前記ポリペプチドを回収する過程とを有するこ
    とを特徴とする方法。
13. 【請求項１３】 適当な医薬品担体とともに請求項１のポリペプチドを含む
    医薬品組成物。
14. 【請求項１４】 請求項１のポリペプチドに特異に結合する精製された抗体
    。
15. 【請求項１５】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
17. 【請求項１７】 請求項１３の医薬品組成物の有効量を治療を要する被検者
    に投与する過程を含む、生殖障害を治療或いは予防するための方法。
18. 【請求項１８】 請求項１３の医薬品組成物の有効量を治療を要する被検者
    に投与する過程を含む、発生障害を治療或いは予防するための方法。
19. 【請求項１９】 請求項１６のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検
    者に投与する過程を含む、腫瘍性障害を治療或いは予防するための方法。
20. 【請求項２０】 請求項１６のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検
    者に投与する過程を含む、免疫障害を治療或いは予防するための方法。
21. 【請求項２１】 核酸を含む生物学的サンプルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
    １のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する
    ための方法であって、 （ａ）前記生物学的サンプルの核酸の少なくとも１つに請求項６のポリヌクレ
    オチドをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と
    、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、前記ハイ
    ブリダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルにおける前記ポリペプ
    チドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関をなすことを特徴とする方法。
22. 【請求項２２】 前記生物学的サンプルの前記核酸が、前記ハイブリダイゼ
    ーション過程の前にポリメラーゼ連鎖反応により増幅されることを特徴とする請
    求項２１に記載の方法。