JP2002512802A5 - 芳香族代謝からの物質の微生物による製造 - Google Patents

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】 微生物学的に芳香族代謝から物質を製造する方法において、当該物質を産生する微生物中で、グルコース又はグルコース含有基質がグルコース酸化酵素の活性を増加させる結果として変化されることを特徴とする方法。
【請求項２】 グルコースデヒドロゲナーゼの活性を該微生物中に導入し及び/又はその中で増加させることを特徴とする請求項１に記載した方法。
【請求項３】 バチルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）グルコースデヒドロゲナーゼの活性を微生物中に導入し及び/又はその中で増加させることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】 バチルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）グルコースデヒドロゲナーゼIVの活性を微生物中に導入し及び/又はその中で増加させることを特徴とする請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】 グルコン酸ホスホリル化酵素の活性を追加的に増加させることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】 グルコネートキナーゼの活性を増加させることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）グルコネートキナーゼの活性を増加させることを特徴とする請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】 グルコノラクトナーゼ、特にザイモモナス モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）グルコノラクトナーゼの活性を追加的に増加させることを特徴とする請求項２乃至７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】 グルコース又はグルコース含有基質のPEP非依存性摂取のための輸送タンパク質の活性を追加的に増加させる請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】輸送タンパク質が促進剤である請求項９記載の方法。
【請求項１１】促進剤がザイモモナス モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）グルコース促進剤タンパク（Ｇｌｆ）であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】 a )遺伝子を導入することにより、
b ）及び／又は酵素の遺伝子コピー数を増加させることにより、
c ）及び／又は酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現を増加させることにより、
d ）及び／又は酵素の内在的活性を増加させることにより、
e ）及び／又は酵素の構造を変更することにより、
f ）及び／又は脱制御された酵素として酵素を使用することにより、
g ）及び／又は脱制御された酵素として酵素をコードする遺伝子を導入することにより、
グルコース酸化酵素活性、又はグルコース酸化酵素活性とさらにグルコン酸ホスホリル化酵素、グルコノラクトナーゼ及びグルコース又はグルコース含有基質のPEP非依存性摂取用輸送タンパク質の内の少なくとも１つの活性を増加させることを特徴とする請求項２乃至１１の１つに記載の方法。
【請求項１３】活性の増加が、単一の遺伝子構造または複数の遺伝子構造に組み込まれた遺伝子によって達成され、ここで該遺伝子は、単一コピーとして又は増加されたコピー数で遺伝子構造中に導入されていることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】もし存在すれば、グルコース又はグルコース含有基質のPEP依存性摂取系の活性を追加的に減少させ又はスイッチオフすることを特徴とする請求項９乃至１３の１つに記載の方法。
【請求項１５】微生物中で、当該芳香族代謝からの物質の合成に追加的に関与する１以上の芳香族代謝の酵素を脱制御し、その活性を増加させた微生物を使用することを特徴とする請求項１乃至１４の１つに記載された方法。
【請求項１６】当該調製された物質が芳香族アミノ酸であることを特徴とする請求項１乃至１５の１つに記載の方法。
【請求項１７】芳香族アミノ酸がL-フェニルアラニンであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】採用される微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属することを特徴とする請求項１乃至１７の１つに記載の方法。
【請求項１９】微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】グルコン酸ホスホリル化酵素をコードする遺伝子と共に、グルコース酸化酵素をコードする遺伝子、又は
グルコース又はグルコース含有基質のPEP非依存性摂取用輸送タンパク質をコードする遺伝子と共に、グルコース酸化酵素をコードする遺伝子、又は
つぎの３つの遺伝子、グルコン酸ホスホリル化酵素をコードする遺伝子、グルコノラクトナーゼをコードする遺伝子、又はグルコース又はグルコース含有基質のPEP非依存性摂取用輸送タンパク質をコードする遺伝子の内の少なくとも２つの遺伝子と共に、グルコース酸化酵素をコードする遺伝子
の内のいずれかを組換え型遺伝子内に含む遺伝子構造物。
【請求項２１】グルコース酸化酵素のための遺伝子がグルコースデヒドロゲナーゼをコードしかつグルコン酸ホスホリル化酵素のための遺伝子がグルコネートキナーゼをコードすることを特徴とする請求項２０に記載の遺伝子構造物。
【請求項２２】グルコースデヒドロゲナーゼのための遺伝子がバチルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）から誘導され、グルコネートキナーゼのための遺伝子が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から誘導され、グルコノラクトナーゼ及び輸送タンパク質のための遺伝子がザイモモナス モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）から誘導されることを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】請求項２０乃至２２のいずれか１つに記載の遺伝子構造を複製できる形で有する形質転換細胞。
【請求項２４】細胞中で、当該物質の合成に追加的に関与する１以上の酵素を脱制御し及び／又はその／それらの活性が増加されたものであることを特徴とする請求項２３に記載の形質転換細胞。
【請求項２５】該細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である請求項２３又は２４に記載の形質転換細胞。
【請求項２６】もしグルコース又はグルコース含有基質のPEP依存性摂取系が存在するならば、それは減少され又はスイッチオフされた活性を有していたことを特徴とする請求項２３乃至２５の１つに記載した形質転換細胞。
【請求項２７】芳香族アミノ酸を産生することができる請求項２３乃至２６の１つに記載の形質転換細胞。
【請求項２８】芳香族アミノ酸がL-フェニルアラニンであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】請求項２０乃至２２の１つに記載の遺伝子構造物をその内部に有する請求項２３乃至２８の１つに記載の形質転換細胞を使用することを特徴とする請求項１乃至１９の１つに記載の、物質を微生物的に製造する方法。

本発明は、請求項１乃至１９項及び請求項２９記載の芳香族代謝から物質を微生物学的に製造する方法、請求項２０乃至２２記載の遺伝子構造物、及び請求項２３乃至２８記載の形質転換された細胞に関する。

微生物学的に製造された芳香族代謝からの物質（以下、芳香族代謝物質という）、例えば、特に芳香族アミノ酸は、アミノ酸の需要が増大し続けていて多大な経済的関心の対象となっている。

驚くべきことに、グルコース酸化酵素活性を単純に増加させることにより、芳香族代謝からの物質（以下、芳香族代謝物質という）を産生する微生物中で、グルコース又はグルコース含有基質が変化されることによりその目的が達成される。このようにして、既存のものに変わる代謝経路が提供される。この経路は、遊離のグルコースをグルコノラクトン/グルコネートへの酸化及び６−ホスホグルコネートを形成するグルコネートのホスホリル化を含む。

形質転換のために、物質の合成に追加的に関与する1以上の酵素が、脱制御され及び/又はその活性を増加されている宿主細胞を採用することが有利となる。微生物菌株、特に本発明に基づき芳香族代謝から芳香族アミノ酸または他の物質を産生するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、関連する遺伝子を含む遺伝子構造物により形質転換される。

【００６８】
【実施例１】
本発明に基づくプラスミドをベースとした遺伝子構造のモデルとしてのｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶの調製
グルコースデヒドロゲナーゼＩＶをコードするＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＤＳＭ ３１９ ｇｄｈＩＶ 遺伝子が、Ｎａｇａｏ等著、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１５巻（１９９２）、第５０１３〜５０２０頁に記載された既知の遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて、ポリメラーゼチェーン反応法（ＰＣＲ）によってＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＤＳＭ ３１９の染色体ＤＮＡの特異的増幅に従いクローン化された。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、制限酵素ＢａｍＨＩ（５´末端）及びＳａｃＩ（３´末端）についての開裂部位が備えられた。プライマー１（ＢａｍＨＩ）は、５´ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＴＧＡ ＡＡＡ ＣＡＣ ＴＡＧ ＧＡＧ ＧＡＴ ＴＴＴ ３´からなる。プライマー２（ＳａｃＩ）は、５´ ＧＣＣ ＡＧＡ ＧＣＴ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＣＡ ＴＣＧ ＡＴＴ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＡＴ ３´からなり，ｇｄｈＩＶ 遺伝子の３´末端に対し相補的であった。結果として生じるＤＮＡ増幅産生物は、約８００の塩基対を持ちＢａｍＨＩ及びＳａｃＩによって制限され、次いで同じように処理された（表１参照）ベクターｐＧＥＭ７内に連結された。形質転換は、菌株ＪＭ１０９ＤＥ３の中でＸ−ＧａＬ及びアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選別して達成された。成功裡のクローン化が、クローン化されたｇｄｈＩＶ遺伝子のＤＮＡ配列を決定することにより検出された。このベクター（ｐＧＥＭ７ｇｄｈＩＶ）は、Ｔ７ポリメラーゼ系（菌株ＪＭ１０９ＤＥ３）の存在なしでもグルコースデヒドロゲナーゼＩＶ活性の発現を可能にした（表２参照）。染色体テンプレートとしてのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ Ｗ３１１０菌株を使用して，特異性ＤＮＡ増幅法によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ グルコネートキナーゼのｇｎｔＫ遺伝子がクローン化された。ｇｎｔＫ遺伝子の配列は、Ｔｏｎｇ等によって、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１７８巻（１９６６）、第３２６０〜３２６９頁において記載されている。ＰＣＲによる増幅法については、ＥｃｏＲＩ（５´）及びＢａｍＨＩ（３´）に関する制限開裂部位を追加的に備えたオリゴヌクレオチドプライマーが選択された。プライマー１は、５´ ＣＣＧ ＡＡＴ ＴＣＴ ＴＧＴ ＡＴＴ ＧＴＧ ＧＧＧ ＧＣＡ Ｃ ３´からなり及びｇｎｔＫ遺伝子の５´上流に結合する；プライマー２は、５´ ＣＣＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＴＡ ＡＴＧ ＴＡＧ ＴＣＡ ＣＴＡ ＣＴＴ Ａ ３´からなり、ｇｎｔＫ遺伝子の３´末端に対し相補性である。約６００の塩基対を持つ増幅産生物は精製され、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによって制限され、開環されているベクターｐＧＥＭ７に連結された。形質転換は、菌株ＪＭ１０９ＤＥ３の中でＸ−ＧａＬ及びアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上を選択して達成された。成功裡のクローン化が、クローン化されたｇｎｔＫ遺伝子のＤＮＡ配列を決定することにより検出された。このベクター（ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫ）は、Ｔ７ポリメラーゼ系（菌株ＪＭ１０９ＤＥ３）の存在なしでもグルコネートキナーゼ活性の発現を可能にした（表２参照）。
ｇｎｔＫ及びｇｄｈＩＶ遺伝子は、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩによる二重制限に付してベクターｐＧＥＭ７ｇｄｈＩＶを開くことにより結合される。８００の塩基対断片は、ベクターｐＧＥＭ７ｇｄｈＩＶを制限した後に得られ、ｇｄｈＩＶ遺伝子を含んでいるが、このようにして開かれたこのベクター内に連結される。再び、形質転換がアンピシリンについて選別して遂行される。新しい遺伝子構造ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶが、本発明に従い、グルコースデヒドロゲナーゼＩＶに関して又グルコネートキナーゼＧｎｔＫに関して酵素活性のＴ７ポリメラーゼ非依存性発現を媒介する（表２参照）。
得られた形質転換細胞は、−８０℃においてグリセリン培養物の形でＬＢ培地上で保管される。必要なときに、グリセリン培養物は使用直前に解凍される。

【００７１】
【実施例４】
グルコースデヒドラゲナーゼの酵素活性の増加に加えてＰＥＰ非依存性糖摂取系が発現される菌株を使用しての物質の製造
Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ｇｌｆ遺伝子は、プラスミドｐＺＹ６００（Ｗｅｉｓｓｅｒ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７７ （１９９５） ３３５１−３３４５）を使用してテンプレートとして増幅された。同時に、プライマーの選択は、ＢａｍＨＩ開裂部位及びＫｐｎＩ開裂部位の導入が結果としてもたらされた。これらの特有の開裂部位を用いてベクターｐＵＣＢＭ２０（ベーリンガーマンハイム）に遺伝子が挿入され、これらは同様にＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩにより開かれた。大きさが１．５ｋｂのＤＮＡ断片は、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで制限することによりこのベクター（ｐＢＭ２０ｇｌｆ）より分離され、ベクタープラスミドｐＺＹ５０７（Ｗｅｉｓｓｅｒ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７７ （１９９５） ３３５１−３３４５）に連結され、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで同様に開かれた。組換えプラスミドｐＺＹ５０７ｇｌｆは、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し形質転換細胞をクローン化した後に得られた。このベクターはクロラムフェニコール耐性を与え、ｌａｃＩ^q −ｔａｃ プロモーターシステムを含み、低いコピー数を有している。
ベクターｐＺＹ５０７ｇｌｆは、実施例１の記載に従って得られた本発明の遺伝子構造と共に宿主菌株ＡＴ２４７１に形質転換された。
実施例３で述べられた実験条件に従って、突然変異体 Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆ、 Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫ及びＥ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶはそれぞれ２つの並列する混合液で培養された。４８時間後、培地中のＬ−フェニルアラニン濃度が測定された。
指標値１００に相当するＬ−フェニルアラニン濃度を達成する開始菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆとの比較において、ベクターｐＧＥＭ７の存在は
指標値９６をもたらし、結果的に、実質的には同一の濃度が達成される。対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫの使用は、既述した菌株と比較すれば指標値１７９に相当するＬ−フェニルアラニン濃度を結果としてもたらす。Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶ中の代替の代謝遺伝子、即ちグルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコネートキナーゼ双方の発現は、指標値１９５を表すフェニルアラニン濃度のさらなる増加を達成した。
この結果は、グルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性を導入し、グルコネートキナーゼの酵素活性を増大させることによる代替の代謝経路の発現が、同時にＰＥＰ非依存性糖摂取システムが形質転換されそして発現されたこれらの微生物中で特異的にＬ−フェニルアラニン合成に対するポジティブな影響力を有していることを証明している。

【００７２】
【実施例５】
その内部でグルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性が増加されることに加えてＰＥＰ−非依存性糖摂取システムが発現されるＰＴＳ−突然変異を使用した物質の製造
Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＴＳ系の成分をコードする遺伝子中にｇｌｆ遺伝子を取込むために、プラスミドｐＰＴＳ１は、ＢｇｌＩＩで消化され、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で処理される。その独特の開裂部位はｐｔｓＩ遺伝子に存在する。そのｇｌｆ遺伝子は、ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ断片としてプラスミドｐＢＭ２０ｇｌｆｇｌｋから分離され、クレノウ断片で同じように処理される。ｐｔｓＨＩとしての同じ配位におけるｇｌｆ遺伝子を運搬するクローンは、平滑末端によって得られた。ｐｔｓＨ遺伝子及び取込まれたｇｌｆおよびｃｒｒを有するｐｔｓＩの３´領域を運ぶ４．６ｋｂのＰｓｔＩ断片は、結果として生ずるプラスミドｐＰＴＳｇｌｆから得られた。この断片は、ベクターｐＧＰ７０４のＥｃｏＲＶ開裂部位に連結された。このベクターは、λｐｉｒ菌株においてのみ複製されることができるので、このファージを宿さない形質転換細胞は、もしそれらがカルベニシリン上で成長可能であるならば、染色体の中にそのベクターを取込むことができる。取込みは、サザン分析法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｍｉｌｌｅｒ Ｖ．Ｌ．等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０（１９８８）２５７５−８３）によってチェックされた。ｇｌｆ遺伝子に加えて、得られた形質転換細胞は、完全なＰＴＳ遺伝子も含んでいた。
ベクターの部分はカルベニシリン耐性の欠損へと導く第２の相同的交差の状態に組替えが行われ得る。この場合ｐｔｓ遺伝子は、ｇｌｆ遺伝子の挿入によって妨げられるので、ＰＴＳはこれらの突然変異体中で機能的に発現されない。
望ましいＰＴＳ^-突然変異体は、次ぎのように選別される：静止したＰＴＳ⁺形質転換細胞を抗生物質なしでＬＢ培地上で繰り返しサブイノキュレート（サブ接種）した後、細胞縣濁液の一部は１００μｇ／ｌのホスホマイシンを含むＬＢプレート上に置き培養された。ＰＴＳ^-突然変異体は、これらのプレート上で成長可能である。成長するクローンは、ホスホマイシン又は２０μｇ／ｌのカルベニシリンのいずれかを含むＬＢプレート上で画線培養された。染色体ＤＮＡは、ホスホマイシンプレート上で新たな成長を示すがカルベニシリンプレート上では成長はしないクローンから分離された。ｇｌｆ遺伝子のＰＴＳ系をコードする遺伝子への組み込みは、サザン分析により確認された。相当する突然変異体は、表現型上ＰＴＳ欠損として同定された。
一つのクローンは、宿主有機体がＥ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ^-として選別され、プラスミドｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶで形質転換のため使用された（上記参照）。
実施例３及び４で記載された実験的条件に従い、ＰＴＳ陰性突然変異体 Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ^-／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶ及び相当する宿主菌株 ＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ^- は、それぞれの場合、２つの並列の混合液で培養された。４８時間培養後全体のバイオマス特異的生産性が、その結果より計算された。
宿主菌株 Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ^-と比較されるように、その全体バイオマス特異的生産性は指標値１００として表されるが、突然 変異体 ＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ^-／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶは、指標値１３３を有する全体バイオマス特異的生産性を達成した。
この結果は、グルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性を導入し、グルコネートキナーゼの酵素活性を増大させることが、同時にＰＥＰ非依存性糖摂取システムが取込まれそしてその酵素活性が減少されるか完全にスイッチオフされたＰＴＳ系によって特徴づけられるこれらの微生物中で特異的にフェニルアラニン合成の生産性に対しポジティブな影響力を有していることを証明している。