JP2002509863A - パピローマウイルス特異的腫瘍の回避用または治療用医薬 - Google Patents
パピローマウイルス特異的腫瘍の回避用または治療用医薬Info
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Abstract
(57)【要約】
この発明は、少なくとも一つの融合タンパク質および任意に適切な添加剤および/または補助剤を含む、ヒトパピローマウイルス(HPV)特異的腫瘍の回避用または治療用医薬に関する。上記融合タンパク質は、一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのL1 タンパク質を含み、かつまた、一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのEタンパク質を含み、この場合の融合タンパク質はパピローマウイルス非特異的エピトープを含まない。
Description
【0001】
この発明は、一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのL
1 タンパク質および一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つ
のEタンパク質からの少なくとも一つの融合タンパク質、ならびに任意に適切な
添加剤および/また賦形剤を含む、ヒトパピローマウイルス(HPV)特異的腫
瘍の回避用または治療用医薬であって、この融合タンパク質がパピローマウイル
ス非特異的エピトープを含まないことを特徴とする上記医薬に関するものである
。
1 タンパク質および一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つ
のEタンパク質からの少なくとも一つの融合タンパク質、ならびに任意に適切な
添加剤および/また賦形剤を含む、ヒトパピローマウイルス(HPV)特異的腫
瘍の回避用または治療用医薬であって、この融合タンパク質がパピローマウイル
ス非特異的エピトープを含まないことを特徴とする上記医薬に関するものである
。
【0002】
いぼウイルスとも呼ばれるパピローマウイルスは、約8000塩基対のゲノム
寸法および直径約55nmの正十二面体様キヤプシッドを有する二本鎖DNAウ
イルスである。現在までに100を超える異なったヒトパピローマウイルス型が
知られており、この中のある種のもの例えばHPV−16、HPV−18、HP
V−31、HPV−33、HPV−39、HPV−45、HPV−52またはH
PV−58は悪性腫瘍を、および他の例えばHPV−6、HPV−11またはH
PV−42は良性腫瘍を起こし得る。
寸法および直径約55nmの正十二面体様キヤプシッドを有する二本鎖DNAウ
イルスである。現在までに100を超える異なったヒトパピローマウイルス型が
知られており、この中のある種のもの例えばHPV−16、HPV−18、HP
V−31、HPV−33、HPV−39、HPV−45、HPV−52またはH
PV−58は悪性腫瘍を、および他の例えばHPV−6、HPV−11またはH
PV−42は良性腫瘍を起こし得る。
【0003】 BPV−1およびHPV−1の電子顕微鏡分析では、これらのウイルスは72
の五角形キヤプソマーから構築され、これらは一方では五つのL1 分子から成る
(Baker, T. らによる (1991) Biophys. J., 60, 1445) 。
の五角形キヤプソマーから構築され、これらは一方では五つのL1 分子から成る
(Baker, T. らによる (1991) Biophys. J., 60, 1445) 。
【0004】 パピローマウイルスのゲノムは、次の3領域に細別できる:第1領域は非コー
ド領域に関し、この領域はウイルスの転写および複製のための調節因子を含む。
所謂E(early;初期)領域である第2領域は、各種のタンパク質コード部分E1
からE7 を含み、この中で例えばE6 およびE7 タンパク質は上皮細胞の悪性転
換の原因であり、E1 タンパク質はDNAコピー数を制御する。E6 およびE7
領域は所謂腫瘍遺伝子であり、これらはまた腫瘍的に変性した細胞中にも現れる
。第3領域はL(late; 後期)領域とも呼称し、二つのタンパク質コード部分L
1 おょびL2 を含み、これらの部分はウイルスキヤプシッドの構造的成分をコー
ドする。このL1 タンパク質はウイルスキヤプシッド中に90%を超えて存在し
、L1 :L2 の比率は一般的に30:1である。
ド領域に関し、この領域はウイルスの転写および複製のための調節因子を含む。
所謂E(early;初期)領域である第2領域は、各種のタンパク質コード部分E1
からE7 を含み、この中で例えばE6 およびE7 タンパク質は上皮細胞の悪性転
換の原因であり、E1 タンパク質はDNAコピー数を制御する。E6 およびE7
領域は所謂腫瘍遺伝子であり、これらはまた腫瘍的に変性した細胞中にも現れる
。第3領域はL(late; 後期)領域とも呼称し、二つのタンパク質コード部分L
1 おょびL2 を含み、これらの部分はウイルスキヤプシッドの構造的成分をコー
ドする。このL1 タンパク質はウイルスキヤプシッド中に90%を超えて存在し
、L1 :L2 の比率は一般的に30:1である。
【0005】 HPV−6およびHPV−11は、特に生殖器いぼの原因としての地位を維持
している;HPV−16、HPV−18、HPV−31、HPV−33、HPV
−39、HPV−45、HPV−52およびHPV−58等のある種パピローマ
ウイルス型は肛門性器道の悪性腫瘍と関係する。この場合の50%を超える割合
で、HPV−16が頚部癌(頚部様構造における上皮組織悪性腫瘍)に関係する
。したがって、HPV−16は頚部上皮内癌形成の場合の主たる危険因子である
。加えて、この疾患の進行には免疫系が重要な役割を演ずる。このように、細胞
免疫応答、具体的には抗原特異的Tリンパ細胞は、その防護機構のために重要で
あると考えられる。その上、ハイグレードの頚部上皮内癌(CIN II/III)および
頚部腫瘍においては、このE7 遺伝子は感染上皮の全層中に構造的に現れる。し
たがってこのE7 タンパク質は潜在的腫瘍抗原として、および活性化されたT細
胞に対する標的分子であると考えられる (例えばWO 93/20844 号参照)。しかし
ながら、患者においてE7 により誘発される細胞免疫応答は、疾患進行に影響を
及ぼすほど充分に強力ではないようである。この免疫応答は適切なワクチンによ
り増幅され得る可能性がある。
している;HPV−16、HPV−18、HPV−31、HPV−33、HPV
−39、HPV−45、HPV−52およびHPV−58等のある種パピローマ
ウイルス型は肛門性器道の悪性腫瘍と関係する。この場合の50%を超える割合
で、HPV−16が頚部癌(頚部様構造における上皮組織悪性腫瘍)に関係する
。したがって、HPV−16は頚部上皮内癌形成の場合の主たる危険因子である
。加えて、この疾患の進行には免疫系が重要な役割を演ずる。このように、細胞
免疫応答、具体的には抗原特異的Tリンパ細胞は、その防護機構のために重要で
あると考えられる。その上、ハイグレードの頚部上皮内癌(CIN II/III)および
頚部腫瘍においては、このE7 遺伝子は感染上皮の全層中に構造的に現れる。し
たがってこのE7 タンパク質は潜在的腫瘍抗原として、および活性化されたT細
胞に対する標的分子であると考えられる (例えばWO 93/20844 号参照)。しかし
ながら、患者においてE7 により誘発される細胞免疫応答は、疾患進行に影響を
及ぼすほど充分に強力ではないようである。この免疫応答は適切なワクチンによ
り増幅され得る可能性がある。
【0006】 L1 遺伝子の発現またはL1 およびL2 遺伝子の共発現がウイルス様粒子(V
LPs)を形成するということを証明することが可能になった。各種動物系中で
中和用抗体を形成する目的でVLPS を使用することは可能であった。しかしウ
イルス中和用抗体の形成は、ウイルス感染が既に生起しているならば臨床的な重
要性は比較的低く、その理由はウイルス感染細胞の除去に対してはウイルス特異
的細胞毒性T細胞(CTL)応答が必要であると考えられるからである。したが
って所謂キメラパピローマウイルス様粒子(CVLPS )が開発され、このもの
はキメラL1 −E7 タンパク質(Muller, M. らの (1997) Virology, 234, 93)
から成る;CVLPS を用いたマウスの免疫化によりE7 に対する抗体を誘発す
る実験には失敗したが(Muller, M. らの (1997), supra) 、ある種のCVLP S はマウス中でE7 特異的CTL応答を誘発する。加えて、患者におけるHPV
関連疾患の中和用抗体は投与L1 タンパク質に対する免疫応答を制約するように
考えられる(Muller, M.らの (1997), supra) 。しかしながら、クラスIのMH
C分子を介して提供される腫瘍細胞のE7 タンパク質はCTLの標的分子を表す
であろうから、ワクチン開発の目的ではCVLPS は依然として興味がある。
LPs)を形成するということを証明することが可能になった。各種動物系中で
中和用抗体を形成する目的でVLPS を使用することは可能であった。しかしウ
イルス中和用抗体の形成は、ウイルス感染が既に生起しているならば臨床的な重
要性は比較的低く、その理由はウイルス感染細胞の除去に対してはウイルス特異
的細胞毒性T細胞(CTL)応答が必要であると考えられるからである。したが
って所謂キメラパピローマウイルス様粒子(CVLPS )が開発され、このもの
はキメラL1 −E7 タンパク質(Muller, M. らの (1997) Virology, 234, 93)
から成る;CVLPS を用いたマウスの免疫化によりE7 に対する抗体を誘発す
る実験には失敗したが(Muller, M. らの (1997), supra) 、ある種のCVLP S はマウス中でE7 特異的CTL応答を誘発する。加えて、患者におけるHPV
関連疾患の中和用抗体は投与L1 タンパク質に対する免疫応答を制約するように
考えられる(Muller, M.らの (1997), supra) 。しかしながら、クラスIのMH
C分子を介して提供される腫瘍細胞のE7 タンパク質はCTLの標的分子を表す
であろうから、ワクチン開発の目的ではCVLPS は依然として興味がある。
【0007】 Peng らによる (1998) Virology, 240, 147は、ウシパピローマウイルス(B
PV)およびHPV−16E7 49-57 のC末端切り取りL1 から成るCVLPに
ついて記載し、このものはC57B1 /6 マウスの接種後にE7 特異的細胞毒性
T細胞を誘発し、E7 発現性腫瘍の成長から守ることが記載されている。Greens
tone らの (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1800 は、等身大のHP
V−16E7 タンパク質に融合したHPV−16L1 プラスHPV−16L2 か
ら成るCVLPS を記載し、このものはC57B1 /6 マウスの免疫化後に上皮
E7 発現性腫瘍細胞の成長から守ることが記載されているが、細胞毒性T細胞は
検出されず、したがって免疫応答の誘発には有効性が低いように見える。
PV)およびHPV−16E7 49-57 のC末端切り取りL1 から成るCVLPに
ついて記載し、このものはC57B1 /6 マウスの接種後にE7 特異的細胞毒性
T細胞を誘発し、E7 発現性腫瘍の成長から守ることが記載されている。Greens
tone らの (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1800 は、等身大のHP
V−16E7 タンパク質に融合したHPV−16L1 プラスHPV−16L2 か
ら成るCVLPS を記載し、このものはC57B1 /6 マウスの免疫化後に上皮
E7 発現性腫瘍細胞の成長から守ることが記載されているが、細胞毒性T細胞は
検出されず、したがって免疫応答の誘発には有効性が低いように見える。
【0008】 一般的にはVLPおよびCVLPS は、一種または二種以上のLタンパク質ま
たはLおよびEタンパク質をコードする対応遺伝子の、適切な発現系中での発現
により遺伝子工学的手法で調製される。この対応遺伝子は、例えば Kinbaum, R.
らによる (1994) J. Virol., 67, 6929-6936 中に記載があり、またはEMB
Lデータバンクを介して入手可能である。アクセス番号は、例えばHPV18の
場合はPAPHPV18;HPV31の場合はPAPPPH31;HPV33の
場合はPAPPPH33またはHPV−58の場合はPAPPPH58である。
たはLおよびEタンパク質をコードする対応遺伝子の、適切な発現系中での発現
により遺伝子工学的手法で調製される。この対応遺伝子は、例えば Kinbaum, R.
らによる (1994) J. Virol., 67, 6929-6936 中に記載があり、またはEMB
Lデータバンクを介して入手可能である。アクセス番号は、例えばHPV18の
場合はPAPHPV18;HPV31の場合はPAPPPH31;HPV33の
場合はPAPPPH33またはHPV−58の場合はPAPPPH58である。
【0009】 適切な発現系は例えば、遺伝子工学的に修飾された酵母例えば Saccharomyces
(cerevisiae) 、Pichia (pastoris) 、Kluyvermyces (lactis) 、Schizosaccha
romyces (pombe) または Hansenula(polymorpha) (Carter. J.J. らによる (19
91), Virology,182, 513) 、例えば Trichoplusia ni High Five 等の昆虫細胞
(例えば Muller らの (1997)参照, supra )、または原核細胞(例えば WO96/
11272 号公報参照)である。原核細胞中での上記粒子の産生の場合、一般的には
これらを細胞中に析出させて所謂封入体を形成させ、次いでこのものを復元させ
て溶液にする。遺伝子工学的に産生させた粒子またはキヤプシッドまたはそれら
の前駆体を使用する場合は、発現後にさらなる精製工程を必要とする。
(cerevisiae) 、Pichia (pastoris) 、Kluyvermyces (lactis) 、Schizosaccha
romyces (pombe) または Hansenula(polymorpha) (Carter. J.J. らによる (19
91), Virology,182, 513) 、例えば Trichoplusia ni High Five 等の昆虫細胞
(例えば Muller らの (1997)参照, supra )、または原核細胞(例えば WO96/
11272 号公報参照)である。原核細胞中での上記粒子の産生の場合、一般的には
これらを細胞中に析出させて所謂封入体を形成させ、次いでこのものを復元させ
て溶液にする。遺伝子工学的に産生させた粒子またはキヤプシッドまたはそれら
の前駆体を使用する場合は、発現後にさらなる精製工程を必要とする。
【0010】 しかしながら文献記載の対HPV活性化合物の重大な欠点は、これらが僅かな
作用しか示さない一方、他方ではパピローマウイルス特異的腫瘍に対する有効な
免疫治療性を、今日までなんら示し得ないことである。
作用しか示さない一方、他方ではパピローマウイルス特異的腫瘍に対する有効な
免疫治療性を、今日までなんら示し得ないことである。
【0011】
したがってこの発明の目的は、ヒトパピローマウイルス特異的腫瘍を有効に回
避または治療し得る医薬であって、生産が簡単で医薬としての許認可に適すると
思考される医薬の提供にあった。
避または治療し得る医薬であって、生産が簡単で医薬としての許認可に適すると
思考される医薬の提供にあった。
【0012】 この度、意外にも、この発明における医薬がHPV特異的腫瘍に対抗するのに
有効であることが判った。したがって、この発明の一つの目的は、一種または二
種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのL1 タンパク質および一種また
は二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのEタンパク質からの少なく
とも一つの融合タンパク質、ならび適切な添加剤および/また賦形剤を任意に含
む、ヒトパピローマウイルス(HPV)特異的腫瘍回避用または治療用医薬であ
って、この融合タンパク質がパピローマウイルス非特異的エピトープを含まない
ことを特徴とする上記医薬にある。
有効であることが判った。したがって、この発明の一つの目的は、一種または二
種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのL1 タンパク質および一種また
は二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのEタンパク質からの少なく
とも一つの融合タンパク質、ならび適切な添加剤および/また賦形剤を任意に含
む、ヒトパピローマウイルス(HPV)特異的腫瘍回避用または治療用医薬であ
って、この融合タンパク質がパピローマウイルス非特異的エピトープを含まない
ことを特徴とする上記医薬にある。
【0013】 この発明の趣旨以内におけるパピローマウイルス非特異的エピトープとは、一
般的には外来タンパク質フラクションにより、転写後修飾により、またはパピロ
ーマウイルス特異的タンパク質の誤折畳みにより惹起される、融合タンパク質中
のエピトープを意味するものと理解される。
般的には外来タンパク質フラクションにより、転写後修飾により、またはパピロ
ーマウイルス特異的タンパク質の誤折畳みにより惹起される、融合タンパク質中
のエピトープを意味するものと理解される。
【0014】 パピローマウイルス非特異的エピトープは、例えば、中和性抗体またはCTL
免疫応答が誘発されるにしても、非特異的抗体またはCTLS または実際の活性
化合物の作用を損なう免疫学的副作用によりその免疫的作用が弱められるので、
パピローマウイルス特異的腫瘍が効果的に回避または制御され得ないという事実
に対する一つの理由である。
免疫応答が誘発されるにしても、非特異的抗体またはCTLS または実際の活性
化合物の作用を損なう免疫学的副作用によりその免疫的作用が弱められるので、
パピローマウイルス特異的腫瘍が効果的に回避または制御され得ないという事実
に対する一つの理由である。
【0015】 この発明における医薬は、良性または悪性腫瘍、具体的には例えばハイグレー
ドCIN(頚部上皮内癌)等の準備段階を包含する喉頭、頚部、陰茎、外陰また
は肛門の悪性腫瘍の回避または治療に好ましい効果がある。
ドCIN(頚部上皮内癌)等の準備段階を包含する喉頭、頚部、陰茎、外陰また
は肛門の悪性腫瘍の回避または治療に好ましい効果がある。
【0016】 好ましいさらなる実施態様では、この発明における医薬は、Lタンパク質特に
L1 の存在が既に適切に免疫を増幅させるので、アジュバントすなわちパピロー
マウイルス特異的タンパク質の免疫を増幅させる物質をなんら含有しない。現在
では許認可当局により認可される唯一の免疫刺激性材料はアルミニウム塩である
ことから、この性質は医薬または診断薬としての認可に際しては殊の外有利であ
る。その上、アジュバントおよび/または他の賦形剤および添加剤の省略により
、好ましからぬ副作用が回避される。
L1 の存在が既に適切に免疫を増幅させるので、アジュバントすなわちパピロー
マウイルス特異的タンパク質の免疫を増幅させる物質をなんら含有しない。現在
では許認可当局により認可される唯一の免疫刺激性材料はアルミニウム塩である
ことから、この性質は医薬または診断薬としての認可に際しては殊の外有利であ
る。その上、アジュバントおよび/または他の賦形剤および添加剤の省略により
、好ましからぬ副作用が回避される。
【0017】 既に記載のように、医薬としてのキヤプシッドまたはキヤプソマーの使用にお
けるさらに重要な問題点は、それらが溶解性に乏しいことである。したがって例
えばHPV−16のキャプシドまたはキヤプソマーは凝集する傾向があり、これ
により溶解性が目立って低下する。ある場合にはキャプシドまたはキヤプソマー
の低い溶解性が収率を低減させるのみではなく、同時に医薬としての使用を複雑
化させる。
けるさらに重要な問題点は、それらが溶解性に乏しいことである。したがって例
えばHPV−16のキャプシドまたはキヤプソマーは凝集する傾向があり、これ
により溶解性が目立って低下する。ある場合にはキャプシドまたはキヤプソマー
の低い溶解性が収率を低減させるのみではなく、同時に医薬としての使用を複雑
化させる。
【0018】 したがってさらなる好ましい実施態様では、この発明における医薬は約0.3
から約4M、好ましくは約0.4から約3M、特に約0.5から2M、とりわけ
約1から約2Mで、pH約7.3から約7.45好ましくは約7.4の塩を適切
な添加剤または賦形剤として含有する。
から約4M、好ましくは約0.4から約3M、特に約0.5から2M、とりわけ
約1から約2Mで、pH約7.3から約7.45好ましくは約7.4の塩を適切
な添加剤または賦形剤として含有する。
【0019】 この塩溶液の利点は、融合タンパク質が溶液中に残留または懸濁物として微細
に細分化されて存在することであり、一般的には融合タンパク質の約90%を越
す量、特に約95%を越す量が溶液中に残留し、かつ同時に、少なくとも約12
時間は析出しないことである。この融合タンパク質は、最大5000gの遠心分
離によってさえも顕著に析出され得ない。
に細分化されて存在することであり、一般的には融合タンパク質の約90%を越
す量、特に約95%を越す量が溶液中に残留し、かつ同時に、少なくとも約12
時間は析出しないことである。この融合タンパク質は、最大5000gの遠心分
離によってさえも顕著に析出され得ない。
【0020】 この塩は一般的にはアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、好ましくはハ
ロゲン化物またはリン酸塩、具体的にはアルカリ金属ハロゲン化物、特にNaC
lおよび/またはKClである。NaClの使用は医薬用配合物の調製の場合に
特に好ましい。
ロゲン化物またはリン酸塩、具体的にはアルカリ金属ハロゲン化物、特にNaC
lおよび/またはKClである。NaClの使用は医薬用配合物の調製の場合に
特に好ましい。
【0021】 この医薬のpHは、例えば燐酸塩緩衝剤、トリス緩衝剤[トリス(ヒドロキシ
メチル)アミノメタン]、HEPES緩衝剤([4−(2−ヒドロキシエチル)
ピペラジノ]エタンスルホン酸)またはMOP緩衝剤(3−モルホリノ−1−プ
ロパンスルホン酸)を好ましく使用する等の、適切な有機または無機緩衝剤を用
いて調整する。個々の緩衝剤の選択は一般的には所望緩衝剤のモル濃度に依存す
る。注射溶液または点滴溶液の場合はリン酸塩緩衝剤が適する。
メチル)アミノメタン]、HEPES緩衝剤([4−(2−ヒドロキシエチル)
ピペラジノ]エタンスルホン酸)またはMOP緩衝剤(3−モルホリノ−1−プ
ロパンスルホン酸)を好ましく使用する等の、適切な有機または無機緩衝剤を用
いて調整する。個々の緩衝剤の選択は一般的には所望緩衝剤のモル濃度に依存す
る。注射溶液または点滴溶液の場合はリン酸塩緩衝剤が適する。
【0022】 この発明における医薬中のパピローマウイルス特異的タンパク質の安定性にさ
らに寄与する、好適な他の添加剤および/または賦形剤の例は、例えば「Triton
X-100」またはコール酸ナトリウム等の洗剤であるが、例えばポリエチレングリ
コールまたはグリセロール等のポリオール、例えばスクロースまたはグルコース
等の糖類、例えばグリシンまたは具体的にはタウリンまたはベタイン等のアミノ
酸のような双性イオン化合物、および/または例えばウシまたはヒト血清アルブ
ミン等のタンパク質も挙げられる。洗剤、ポリオールおよび/または双性イオン
化合物が好ましい。他の添加剤および/または賦形剤は、例えばアプロチニン、
ε−アミノカプロン酸またはペプスタチンA等のプロテアーゼ阻害剤である。免
疫学的副作用を誘発しない添加剤が好ましい。
らに寄与する、好適な他の添加剤および/または賦形剤の例は、例えば「Triton
X-100」またはコール酸ナトリウム等の洗剤であるが、例えばポリエチレングリ
コールまたはグリセロール等のポリオール、例えばスクロースまたはグルコース
等の糖類、例えばグリシンまたは具体的にはタウリンまたはベタイン等のアミノ
酸のような双性イオン化合物、および/または例えばウシまたはヒト血清アルブ
ミン等のタンパク質も挙げられる。洗剤、ポリオールおよび/または双性イオン
化合物が好ましい。他の添加剤および/または賦形剤は、例えばアプロチニン、
ε−アミノカプロン酸またはペプスタチンA等のプロテアーゼ阻害剤である。免
疫学的副作用を誘発しない添加剤が好ましい。
【0023】 L1 /L2 タンパク質およびEタンパク質なる用語は、例えば欠失突然変異体
等の、等身大タンパク質およびそれらの突然変異体両方を意味するものとして、
この発明の趣旨以内で理解される。
等の、等身大タンパク質およびそれらの突然変異体両方を意味するものとして、
この発明の趣旨以内で理解される。
【0024】 さらなる好ましい実施態様では、この発明における融合タンパク質は欠失Lタ
ンパク質好ましくは欠失L1 および任意にL2 タンパク質を含む。この欠失は、
特に活性な異種タンパク質例えばパピローマウイルス特異的Eタンパク質配列を
欠失領域中へ挿入し得る利点があり、これにより本発明における組成の応用領域
が拡大する。C末端欠失を有するLタンパク質、具体的にはC末端欠失L1 タン
パク質は殊の外好ましい。C末端欠失は、C末端に位置する核位置信号が欠失す
るので、ウイルス様粒子形成効率を増強できる利点がある。したがってこのC末
端欠失は、好ましくは約35アミノ酸まで、特に約25から約35アミノ酸、と
りわけ約32から34アミノ酸である。例えばアミノ酸長32のHPV−16L
1 のC末端欠失は、少なくとも約10倍までウイルス様粒子形成を増強し得るの
で適切である。
ンパク質好ましくは欠失L1 および任意にL2 タンパク質を含む。この欠失は、
特に活性な異種タンパク質例えばパピローマウイルス特異的Eタンパク質配列を
欠失領域中へ挿入し得る利点があり、これにより本発明における組成の応用領域
が拡大する。C末端欠失を有するLタンパク質、具体的にはC末端欠失L1 タン
パク質は殊の外好ましい。C末端欠失は、C末端に位置する核位置信号が欠失す
るので、ウイルス様粒子形成効率を増強できる利点がある。したがってこのC末
端欠失は、好ましくは約35アミノ酸まで、特に約25から約35アミノ酸、と
りわけ約32から34アミノ酸である。例えばアミノ酸長32のHPV−16L
1 のC末端欠失は、少なくとも約10倍までウイルス様粒子形成を増強し得るの
で適切である。
【0025】 さらなる好ましい実施態様では、上記Eタンパク質特にE6 および/またはE
7 タンパク質も欠失される。E7 タンパク質のC末端部分好ましくはE7 タンパ
ク質のC末端部分が欠失される場合が特に好ましく、この場合、これらの構築体
は欠失Lタンパク質との組み合わせでキャプソマーおよび/またはキヤプシッド
を形成する。55アミノ酸までの欠失が特に好ましく、好ましくは約5から約5
5アミノ酸、具体的には約32から約43アミノ酸の欠失が好ましい。
7 タンパク質も欠失される。E7 タンパク質のC末端部分好ましくはE7 タンパ
ク質のC末端部分が欠失される場合が特に好ましく、この場合、これらの構築体
は欠失Lタンパク質との組み合わせでキャプソマーおよび/またはキヤプシッド
を形成する。55アミノ酸までの欠失が特に好ましく、好ましくは約5から約5
5アミノ酸、具体的には約32から約43アミノ酸の欠失が好ましい。
【0026】 特に好ましい構築体は例えばN末端アミノ酸1から約60を有するE7 であり
、この構築体はアミノ酸49から57の領域に位置する、細胞毒性Tリンパ細胞
の活性化のためのマウスエピトープを含有するからである。他の好ましい構築体
はN末端アミノ酸1から約55を有するE7 であり、この構築体はキヤプシッド
形成を損ない得るE7 特異的配列をアミノ酸56−70領域中に含まないので、
欠失Lタンパク質との組み合わせでキヤプソマーおよびキヤプシッドを好ましく
形成する。32アミノ酸によりC末端で欠失されたHPV−16のL1 タンパク
質および、これがアミノ酸1−55または1−60を有するHPV−16のE7
タンパク質と結合したものは特に好ましい。これらの構築体は中和性抗体または
特異的CTL応答を誘発するのみでなく、一方では腫瘍形成を阻止し、他方では
既存の腫瘍の進行を動物実験では退化させる。特にアミノ酸1−60を有するE
7 は、腫瘍中で顕著な予防的および治療的作用を特に発揮する。したがって、こ
の発明における特に好ましい実施態様はL1 ΔE7 1-X 融合タンパク質好ましく
はCVLPs 形態における具体的にはHPV16の形態における融合タンパク質
であり(xは60を包含する、55から60までの整数)、特にL1 ΔE7 1-55 またはL1 ΔE7 1-60融合タンパク質である。
、この構築体はアミノ酸49から57の領域に位置する、細胞毒性Tリンパ細胞
の活性化のためのマウスエピトープを含有するからである。他の好ましい構築体
はN末端アミノ酸1から約55を有するE7 であり、この構築体はキヤプシッド
形成を損ない得るE7 特異的配列をアミノ酸56−70領域中に含まないので、
欠失Lタンパク質との組み合わせでキヤプソマーおよびキヤプシッドを好ましく
形成する。32アミノ酸によりC末端で欠失されたHPV−16のL1 タンパク
質および、これがアミノ酸1−55または1−60を有するHPV−16のE7
タンパク質と結合したものは特に好ましい。これらの構築体は中和性抗体または
特異的CTL応答を誘発するのみでなく、一方では腫瘍形成を阻止し、他方では
既存の腫瘍の進行を動物実験では退化させる。特にアミノ酸1−60を有するE
7 は、腫瘍中で顕著な予防的および治療的作用を特に発揮する。したがって、こ
の発明における特に好ましい実施態様はL1 ΔE7 1-X 融合タンパク質好ましく
はCVLPs 形態における具体的にはHPV16の形態における融合タンパク質
であり(xは60を包含する、55から60までの整数)、特にL1 ΔE7 1-55 またはL1 ΔE7 1-60融合タンパク質である。
【0027】 したがってこの発明は、一方ではHPV特異的腫瘍との関連で、他方では既存
HPV特異的腫瘍を退化させる目的で、この発明における構築体を医薬生産の目
的で使用することにも関する。
HPV特異的腫瘍を退化させる目的で、この発明における構築体を医薬生産の目
的で使用することにも関する。
【0028】 予防用および治療用の両方で活性な医薬の調製の場合には、上記パピローマウ
イルス特異的融合タンパク質がキヤプシッドおよび/またはキヤプソマーの形態
で存在するのが好ましく、その理由はこのキヤプシッドおよび/またはキヤプソ
マーにより、具体的にはLタンパク質のフラクションにより免疫反応が追加的に
顕著に増強されるからでる。したがってキヤプシッドおよび/またはキヤプソマ
ー形成に適する好ましい融合タンパク質は、例えば欠失L1 およびE7 、E6 お
よび/またはE1 からの融合タンパク質である。
イルス特異的融合タンパク質がキヤプシッドおよび/またはキヤプソマーの形態
で存在するのが好ましく、その理由はこのキヤプシッドおよび/またはキヤプソ
マーにより、具体的にはLタンパク質のフラクションにより免疫反応が追加的に
顕著に増強されるからでる。したがってキヤプシッドおよび/またはキヤプソマ
ー形成に適する好ましい融合タンパク質は、例えば欠失L1 およびE7 、E6 お
よび/またはE1 からの融合タンパク質である。
【0029】 この発明の趣旨以内でのキヤプシッドは、一般的には72キヤプソマーから構
築される一般的正二十面体様形態におけるウイルスまたはウイルス様構造体であ
る。
築される一般的正二十面体様形態におけるウイルスまたはウイルス様構造体であ
る。
【0030】 この発明の趣旨以内でのキヤプソマーは、少なくとも一種のパピローマウイル
ス構造タンパク質、好ましくはL1 またはL1 の欠失体を含む集合タンパク質で
ある。この発明における5種の融合タンパク質は、集合してキヤプソマーを与え
、このものは今度はキヤプシッドを与えるために集合し得る。
ス構造タンパク質、好ましくはL1 またはL1 の欠失体を含む集合タンパク質で
ある。この発明における5種の融合タンパク質は、集合してキヤプソマーを与え
、このものは今度はキヤプシッドを与えるために集合し得る。
【0031】 ヒト用医薬生産の場合は、ヒトパピローマウイルス(HPV)、好ましくはH
PV−6、HPV−11、HPV−16、HPV−18、HPV−31、HPV
−33、HPV−35、HPV−39、HPV−45、HPV−52およびHP
V−58、具体的にはHPV−16、HPV−18、HPV−31および/また
はHPV−45のヒトパピローマウイルス(HPV)のタンパク質またはペプチ
ドが上記構築体に適している。特に組み合わせワクチン生産の場合には、各種H
PV型からのタンパク質またはペプチドを組み合わせるのが有利であり、例えば
頚部様構造における悪性腫瘍の場合にはHPV−16およびHPV−18または
HPV−18、HPV−31、HPV−45およびHPV−45の組み合わせ、
または例えばコンジロームの場合にはHPV−6およびHPV−11の組み合わ
せが有利である。
PV−6、HPV−11、HPV−16、HPV−18、HPV−31、HPV
−33、HPV−35、HPV−39、HPV−45、HPV−52およびHP
V−58、具体的にはHPV−16、HPV−18、HPV−31および/また
はHPV−45のヒトパピローマウイルス(HPV)のタンパク質またはペプチ
ドが上記構築体に適している。特に組み合わせワクチン生産の場合には、各種H
PV型からのタンパク質またはペプチドを組み合わせるのが有利であり、例えば
頚部様構造における悪性腫瘍の場合にはHPV−16およびHPV−18または
HPV−18、HPV−31、HPV−45およびHPV−45の組み合わせ、
または例えばコンジロームの場合にはHPV−6およびHPV−11の組み合わ
せが有利である。
【0032】 この発明のさらなる目的は、この発明における医薬の生産方法であり、この方
法では、上記融合タンパク質をコードする適切な発現ベクターを含む適切な細胞
を適切な条件下に培養し、発現生成物を単離し、適切な添加剤および/または賦
頚剤を任意に添加する。
法では、上記融合タンパク質をコードする適切な発現ベクターを含む適切な細胞
を適切な条件下に培養し、発現生成物を単離し、適切な添加剤および/または賦
頚剤を任意に添加する。
【0033】 この発現ベクターは例えば原核または真核発現ベクターであってよい。原核発
現ベクターの例は、E.coli における発現の場合、例えばベクターpGEMま
たはpUC誘導体である(例えば、WO 96/11272 号公報参照)。真核発現ベクタ
ーの例は、Saccharomyces cerevisiae における発現の場合、例えばベクターp
426Met25またはp426GAL1 であり(Mumberg らによる (1994) Nu
cl. Acids Res., 22, 5767-5768, Carter, J.J. らによる (1991) supra )、ま
た昆虫細胞における発現の場合、例えば Baculovirus ベクター具体的には EP-
B1-0127839号または EP-B1-0549721号公報開示のような Autographa Californic
a ウイルスであり(例えば WO 94/20137号公報参照)、また哺乳類細胞における
発現の場合、例えばベクターRc/CMVおよびRc/RSVまたはSV40ベ
クターであり、これらはすべて一般的に取得可能である。しかしながら、Pharmi
ngen社製「Baculo Gold TM」トランスフエクション用具または Gibco BRL社製
「Bac-to-Bac TM 」Baculovirus 発現系等の、商業的に入手可能な Baculovirus
発現系もまた適当である。さらに適当な発現系は、組み換えワクシニア症ウイ
ルス(例えば、WO 93/02184 号公報参照)である。
現ベクターの例は、E.coli における発現の場合、例えばベクターpGEMま
たはpUC誘導体である(例えば、WO 96/11272 号公報参照)。真核発現ベクタ
ーの例は、Saccharomyces cerevisiae における発現の場合、例えばベクターp
426Met25またはp426GAL1 であり(Mumberg らによる (1994) Nu
cl. Acids Res., 22, 5767-5768, Carter, J.J. らによる (1991) supra )、ま
た昆虫細胞における発現の場合、例えば Baculovirus ベクター具体的には EP-
B1-0127839号または EP-B1-0549721号公報開示のような Autographa Californic
a ウイルスであり(例えば WO 94/20137号公報参照)、また哺乳類細胞における
発現の場合、例えばベクターRc/CMVおよびRc/RSVまたはSV40ベ
クターであり、これらはすべて一般的に取得可能である。しかしながら、Pharmi
ngen社製「Baculo Gold TM」トランスフエクション用具または Gibco BRL社製
「Bac-to-Bac TM 」Baculovirus 発現系等の、商業的に入手可能な Baculovirus
発現系もまた適当である。さらに適当な発現系は、組み換えワクシニア症ウイ
ルス(例えば、WO 93/02184 号公報参照)である。
【0034】 一般的に、これらの発現ベクターは、 E. coliにおける発現のためのtrpプ
ロモーター(例えば、EP-B1-0154133 号公報参照)、酵母における発現のための
ADH2プロモーター[Russel らによる (1983), J. Biol.Chem. 258, 2674-2
682)]、昆虫細胞における発現のための Baculovirus 多面体プロモーター(例
えば、 EP-B1-0127839号または U.S. 5,004,687 号公報参照)または例えばMM
TV[mouse mammary tumour uirus (マウス哺乳類腫瘍ウイルス):Lee らによ
る (1981) Nature 214, 228-232 ]の初期SV40プロモーターまたはLTRプ
ロモーター等の、個々の宿主細胞に適するプロモーターもまた含む。
ロモーター(例えば、EP-B1-0154133 号公報参照)、酵母における発現のための
ADH2プロモーター[Russel らによる (1983), J. Biol.Chem. 258, 2674-2
682)]、昆虫細胞における発現のための Baculovirus 多面体プロモーター(例
えば、 EP-B1-0127839号または U.S. 5,004,687 号公報参照)または例えばMM
TV[mouse mammary tumour uirus (マウス哺乳類腫瘍ウイルス):Lee らによ
る (1981) Nature 214, 228-232 ]の初期SV40プロモーターまたはLTRプ
ロモーター等の、個々の宿主細胞に適するプロモーターもまた含む。
【0035】 適当な宿主細胞の例は、 E. coli 株DH5、HB101またはBL2 1、酵
母株 Saccharomyces、Pichia、Kluyvermyces、Schizosaccharomyces または Han
senula(Carter, J.J. らによる (1991), Virology, 182, 513 )、 例えば spod
optera frugiperda、Trichoplusia ni 、Rachiplusia ou または Galleria Mel
lonela からの昆虫細胞系 Lepidopteran 、または動物細胞COS、C127、 Vero、293およびHelaであり、これらは一般的に得られる(例えば、
WO 94/00152 号公報参照)。
母株 Saccharomyces、Pichia、Kluyvermyces、Schizosaccharomyces または Han
senula(Carter, J.J. らによる (1991), Virology, 182, 513 )、 例えば spod
optera frugiperda、Trichoplusia ni 、Rachiplusia ou または Galleria Mel
lonela からの昆虫細胞系 Lepidopteran 、または動物細胞COS、C127、 Vero、293およびHelaであり、これらは一般的に得られる(例えば、
WO 94/00152 号公報参照)。
【0036】 個々のパピローマウイルス特異的タンパク質に対するコード核酸は単離でき、
かつ、例えばPCR(polymerase chain reaction) 増幅手法により遺伝子バン
クからクローン化できる。例えば、BPV−1のゲノムは GenBankアクセス番号
X02346 の下に、またはHPV−16は GenBank アクセス番号 K02718 の下に
一般的に得られる。例えばWO 94/05792 号公報には、HPV−16L1 配列も開
示されている。98アミノ酸長のHPV−16E7 タンパク質の配列は、例えば
Seedorf らによる (1985) Virology, 145, 181-185 中に記載がある。所望す
る核酸を取得する他の方法は、PCR手法によりパピローマウイルス特異的遺伝
子をいぼまたは腫瘍から直接単離することにある。HPV−16およびHPV−
18からのE6 およびE7 遺伝子に対する好適なプライマーは、例えば WO 93/2
1958 号公報中に開示がある。所望する核酸に対するさらなる引例は、例えば K
irnbaum, R. らによる (1994), supraであり、または上記EMBLデータバンク
に寄託したクローン類である。
かつ、例えばPCR(polymerase chain reaction) 増幅手法により遺伝子バン
クからクローン化できる。例えば、BPV−1のゲノムは GenBankアクセス番号
X02346 の下に、またはHPV−16は GenBank アクセス番号 K02718 の下に
一般的に得られる。例えばWO 94/05792 号公報には、HPV−16L1 配列も開
示されている。98アミノ酸長のHPV−16E7 タンパク質の配列は、例えば
Seedorf らによる (1985) Virology, 145, 181-185 中に記載がある。所望す
る核酸を取得する他の方法は、PCR手法によりパピローマウイルス特異的遺伝
子をいぼまたは腫瘍から直接単離することにある。HPV−16およびHPV−
18からのE6 およびE7 遺伝子に対する好適なプライマーは、例えば WO 93/2
1958 号公報中に開示がある。所望する核酸に対するさらなる引例は、例えば K
irnbaum, R. らによる (1994), supraであり、または上記EMBLデータバンク
に寄託したクローン類である。
【0037】 さらなる好ましい実施態様では、ベクターによりもたらされるさらなるアミノ
酸によって発現融合タンパク質が延長されない態様で発現ベクターが構築される
。このことは、例えば適切なプライマーオリゴヌクレオチド手法(Ho らによる
(1989) Gene, 77, 51-59) により、PCR反応における突然変異誘発により追
加的アミノ酸をコードする望ましからぬヌクレオチドの除去により遂行される。
このようにして追加的アミノ酸を含まず、したがって免疫学的副反応の原因であ
る追加的外来エピトープの可能性が無い融合タンパク質が得られる。
酸によって発現融合タンパク質が延長されない態様で発現ベクターが構築される
。このことは、例えば適切なプライマーオリゴヌクレオチド手法(Ho らによる
(1989) Gene, 77, 51-59) により、PCR反応における突然変異誘発により追
加的アミノ酸をコードする望ましからぬヌクレオチドの除去により遂行される。
このようにして追加的アミノ酸を含まず、したがって免疫学的副反応の原因であ
る追加的外来エピトープの可能性が無い融合タンパク質が得られる。
【0038】 上記融合タンパク質の発現後、これをさらに精製または復元するのが好ましい
。クロマログラフイーによる精製方法の例は、Hjorth, R. & Moreno-Lopez, L.
(1982) J. Virol. Meth. 5, 151; Nakai, Y. らによる (1987) J. Gen. Virol.
, 68, 1891; Hofmann, K. J. らによる (1995) Virology, 209, 506; Rose, R.
C. らによる (1993) J. Virol., 67, 1936; Sasagawa, T. らによる (1995) Vi
rology, 206, 126 または WO 95/31532 号公報中に見られる。
。クロマログラフイーによる精製方法の例は、Hjorth, R. & Moreno-Lopez, L.
(1982) J. Virol. Meth. 5, 151; Nakai, Y. らによる (1987) J. Gen. Virol.
, 68, 1891; Hofmann, K. J. らによる (1995) Virology, 209, 506; Rose, R.
C. らによる (1993) J. Virol., 67, 1936; Sasagawa, T. らによる (1995) Vi
rology, 206, 126 または WO 95/31532 号公報中に見られる。
【0039】 一般的にこの医薬は、例えば皮下、筋肉内または粘膜経由等の経口的、非経口
的に、液状または懸濁状、エリキシル形状またはカプセル形状で、好ましくは注
射溶液または点滴溶液として投与できる。この発明における調合物の場合には、
特に有利なアジュバントを一緒に分散できる。
的に、液状または懸濁状、エリキシル形状またはカプセル形状で、好ましくは注
射溶液または点滴溶液として投与できる。この発明における調合物の場合には、
特に有利なアジュバントを一緒に分散できる。
【0040】 したがってこの発明のさらなる目的は、注射溶液または点滴溶液としての、こ
の発明における調合物の使用に関する。
の発明における調合物の使用に関する。
【0041】 注射溶液は、例えば約1から約20mlの比較的小量の溶液または懸濁物を身
体に投与する際に一般的には使用される。点滴溶液は、例えば1リットリまたは
それを越す量の大量の溶液または懸濁物を投与する場合に一般的には使用する。
点滴溶液とは対照的に注射溶液の場合には僅か数ミリリットルが投与されるので
、注射における血液または組織流体のpHおよび浸透圧からの微妙な差異は、痛
みに関してはそれ自体が感知できないか、または微々たる程度でのみ感知し得る
程度である。したがって、この発明における配合物の使用前希釈は、一般的には
必要がない。しかし、比較的大量投与の場合には、この発明における配合物は、
少なくとも等浸透圧溶液が得られるような態様で投与直前に希釈すべきである。
等浸透圧溶液の例は0.9%強度塩化ナトリウム溶液である。点滴の場合は、例
えば滅菌水を用いて希釈を行うことができ、一方、投与は例えば所謂バイパスを
介して実施できる。
体に投与する際に一般的には使用される。点滴溶液は、例えば1リットリまたは
それを越す量の大量の溶液または懸濁物を投与する場合に一般的には使用する。
点滴溶液とは対照的に注射溶液の場合には僅か数ミリリットルが投与されるので
、注射における血液または組織流体のpHおよび浸透圧からの微妙な差異は、痛
みに関してはそれ自体が感知できないか、または微々たる程度でのみ感知し得る
程度である。したがって、この発明における配合物の使用前希釈は、一般的には
必要がない。しかし、比較的大量投与の場合には、この発明における配合物は、
少なくとも等浸透圧溶液が得られるような態様で投与直前に希釈すべきである。
等浸透圧溶液の例は0.9%強度塩化ナトリウム溶液である。点滴の場合は、例
えば滅菌水を用いて希釈を行うことができ、一方、投与は例えば所謂バイパスを
介して実施できる。
【0042】 図面および次の実施例は発明のさらに詳細な説明を目的とし、範囲の制限を意
図するものではない。
図するものではない。
【0043】 図1は、1μgのL1 E7 1-60CVLPS を用いた免疫化後に生じたE7 特異
的CTL応答を示す。L1 E7 1-60CVLPS (黒記号)およびHBM緩衝剤(
白記号)で免疫化したマウスの単離脾臓細胞を放射RMA−E7 細胞で in vitr
o で一度刺激し、標準4時間51Cr放出細胞毒性試験における5日後に次の標的
細胞を採用して試験した:RMA−E7 細胞(四角)、E7 49-57 ペプチド負荷
RMA細胞(三角)およびRMA細胞(丸)。結果を比溶菌(%)として示す。
的CTL応答を示す。L1 E7 1-60CVLPS (黒記号)およびHBM緩衝剤(
白記号)で免疫化したマウスの単離脾臓細胞を放射RMA−E7 細胞で in vitr
o で一度刺激し、標準4時間51Cr放出細胞毒性試験における5日後に次の標的
細胞を採用して試験した:RMA−E7 細胞(四角)、E7 49-57 ペプチド負荷
RMA細胞(三角)およびRMA細胞(丸)。結果を比溶菌(%)として示す。
【0044】 図2は、20μgのL1 E7 1-60CVLPS を用いたC57BL/6マウスのワ
クチン化および in vitro でのRMA−E7 トランスフエクタントを用いた3回
の刺激後に得られたE7 特異的CTL系を用いて実施した滴定試験の結果を示す
。ペプチド濃度は100pgから1μg/mlであった。使用標的細胞は51Cr
標識されたE7 49-57 ペプチド負荷RMA細胞であった。細胞:標的細胞の比率
は30:1であった。
クチン化および in vitro でのRMA−E7 トランスフエクタントを用いた3回
の刺激後に得られたE7 特異的CTL系を用いて実施した滴定試験の結果を示す
。ペプチド濃度は100pgから1μg/mlであった。使用標的細胞は51Cr
標識されたE7 49-57 ペプチド負荷RMA細胞であった。細胞:標的細胞の比率
は30:1であった。
【0045】 図3は、TC−1腫瘍細胞の成長からのC57BL/6マウスの保護を示す。1
0μgのL1 E7 1-60CVLPS (三角)、10μgのL1 ΔCVLPs (丸)
またはHBS緩衝剤(四角)のいずれかを用いてマウス(群当たり5匹)を免疫
化(s.c.)した。2週間後、マウス当たり6×104 TC−1腫瘍細胞をマウ ス(s.c.)の左横腹中に接種した。1週2回、このマウスを検査した。
0μgのL1 E7 1-60CVLPS (三角)、10μgのL1 ΔCVLPs (丸)
またはHBS緩衝剤(四角)のいずれかを用いてマウス(群当たり5匹)を免疫
化(s.c.)した。2週間後、マウス当たり6×104 TC−1腫瘍細胞をマウ ス(s.c.)の左横腹中に接種した。1週2回、このマウスを検査した。
【0046】 図4は、L1 E7 1-60CVLPS によるTG−1腫瘍の成長阻止を示す。マウ
ス当たり6×104 TC−1腫瘍細胞をC57BL/6マウス(群当たり5匹)の
左横腹中に接種した。2週間後、10μgのL1 E7 1-60CVLPS (三角)、
10μgのL1 ΔCVLPS (丸)またはHBS緩衝剤(四角)の s.c. 注射を
用いてこれらのマウスを免疫化した。
ス当たり6×104 TC−1腫瘍細胞をC57BL/6マウス(群当たり5匹)の
左横腹中に接種した。2週間後、10μgのL1 E7 1-60CVLPS (三角)、
10μgのL1 ΔCVLPS (丸)またはHBS緩衝剤(四角)の s.c. 注射を
用いてこれらのマウスを免疫化した。
【0047】
【実施例】1.HPV16L1 E7 融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子の調製 HPV−16L1 オープンリーデイングフレーム(ORF)を制限エンドヌク
レアーゼBg1 IIを用いてプラスミドHPV−16−114/k −L1 /L2 -pS
ynxtVT- (Kirnbauser, R. らによる(1994)J. Virol. 67, 6929)から
切除し、ベクターpUC19(New England Biolabs) 中でBamHIサイト中に
クローン化した。
レアーゼBg1 IIを用いてプラスミドHPV−16−114/k −L1 /L2 -pS
ynxtVT- (Kirnbauser, R. らによる(1994)J. Virol. 67, 6929)から
切除し、ベクターpUC19(New England Biolabs) 中でBamHIサイト中に
クローン化した。
【0048】 HPV−16L1 ΔCの調製のために、HPV−16L1 ORFに相補の二つ
のプライマーを構築した。最初のプライマーは次の配列: AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC を有し、第2プライマーは次の配列: AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG を有した。
のプライマーを構築した。最初のプライマーは次の配列: AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC を有し、第2プライマーは次の配列: AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG を有した。
【0049】 両方のプライマーはEcoRV制限酵素切断サイト5’をコードする。下流に位
置するプライマーでは、HPV16L1 ORFの最後の34アミノ酸を欠失する
目的でTAA翻訳停止コドンがEcoRVに続く。全L1 ORFおよび全ベクター
を増幅する目的でPCR反応を実施した。この直鎖生成物をEcoRVで切断し、
T4 DNAリガーゼで環化し、 E. coli DH5 α細胞をトランスフオームさせ
た。EcoRVサイトの存在に関して、このクローンを分析した。得られたpUC
HPV16L1 ΔC構築体を、HPV16E7 1-50のORFのEcoRVサイトへの
クローン化の目的で用いた。
置するプライマーでは、HPV16L1 ORFの最後の34アミノ酸を欠失する
目的でTAA翻訳停止コドンがEcoRVに続く。全L1 ORFおよび全ベクター
を増幅する目的でPCR反応を実施した。この直鎖生成物をEcoRVで切断し、
T4 DNAリガーゼで環化し、 E. coli DH5 α細胞をトランスフオームさせ
た。EcoRVサイトの存在に関して、このクローンを分析した。得られたpUC
HPV16L1 ΔC構築体を、HPV16E7 1-50のORFのEcoRVサイトへの
クローン化の目的で用いた。
【0050】 このフラグメントのクローン化のために、5’EcoRV制限酵素切断サイトを
有するプライマーを使用した。次のプライマー対を用いた: AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC および TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC このPCR生成物をEcoRVを用いて切断し,修飾L1 遺伝子のEcoRVサイ
トへ挿入した。
有するプライマーを使用した。次のプライマー対を用いた: AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC および TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC このPCR生成物をEcoRVを用いて切断し,修飾L1 遺伝子のEcoRVサイ
トへ挿入した。
【0051】 EcoRVサイトの除去にために、クローンpUC−HPV16L1 ΔCE7 1-50 の二つの重複フラグメントを増幅する目的で二つのPCR反応を実施した。生成
DNAフラグメントはL1 /E7 境界の位置で重複した(四つのプライマーPC
R、Ho, S.N. らの (1989) Gene 77, 51)。しかし、これらのプライマーは二
つのEcoRV制限酵素切断サイトを含まなかった。フラグメント1はプライマー
P1およびP2を用いて調製し、フラグメント2はプライマーP3およびP4を
用いて調製した。 P1:GTTATGACATACATACATTCTATG (L1 ) P2:CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC (E7 ) P3:CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC (E7 ) P4:CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG(E7 )
DNAフラグメントはL1 /E7 境界の位置で重複した(四つのプライマーPC
R、Ho, S.N. らの (1989) Gene 77, 51)。しかし、これらのプライマーは二
つのEcoRV制限酵素切断サイトを含まなかった。フラグメント1はプライマー
P1およびP2を用いて調製し、フラグメント2はプライマーP3およびP4を
用いて調製した。 P1:GTTATGACATACATACATTCTATG (L1 ) P2:CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC (E7 ) P3:CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC (E7 ) P4:CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG(E7 )
【0052】 精製生成物の1/10を混合し、プライマーP1 およびP4 のみを用いたPC
R反応のマトリックスとして用いた。EcoNI(L1 )およびHindIII(
プライマーP4 上の停止コドンの下流)を用いて生成物を切断し、クローン化H
PV16L1 ORFのEcoNI/HindIIIフラグメントを置換基する目的で
これを使用した。したがって、生成したクローンは、ふたつの内部EcoRV制限
酵素切断サイトの消失、ならびにL1 ORFおよびE7 間の対応非HPVアミノ
酸AspとIleおよびE7 の下流の消失によりクローンHPV16L1 ΔCE7 1-50 とは異なっている。最初のEcoRVサイトは、この位置(AlaGly)で
本来のL1 アミノ酸で置換した。第2のEcoRVサイトは翻訳停止信号により
置換した。このクローン(HPV16L1 ΔC* E7 1-52)はHPV16E7 の最初
の52アミノ酸を追加的に含んでなる。クローンHPV16L1 ΔC* E7 1-52は
、P5 、P6 およびP7 との組み合わせにおけるプライマーP1 の手助けでクロ
ーンHPV16L1 ΔC* E7 1-55、1-60および1-65の調製用に使用した。 P5:CATCTGAAGCTTATCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG (E7 1-55) P6:CATCTGAAGCTTACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG(E7 1-60) P7:CATCTGAAGCTTAAAGCGTAGAGTCACACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGT
CCG (E7 1-65)
R反応のマトリックスとして用いた。EcoNI(L1 )およびHindIII(
プライマーP4 上の停止コドンの下流)を用いて生成物を切断し、クローン化H
PV16L1 ORFのEcoNI/HindIIIフラグメントを置換基する目的で
これを使用した。したがって、生成したクローンは、ふたつの内部EcoRV制限
酵素切断サイトの消失、ならびにL1 ORFおよびE7 間の対応非HPVアミノ
酸AspとIleおよびE7 の下流の消失によりクローンHPV16L1 ΔCE7 1-50 とは異なっている。最初のEcoRVサイトは、この位置(AlaGly)で
本来のL1 アミノ酸で置換した。第2のEcoRVサイトは翻訳停止信号により
置換した。このクローン(HPV16L1 ΔC* E7 1-52)はHPV16E7 の最初
の52アミノ酸を追加的に含んでなる。クローンHPV16L1 ΔC* E7 1-52は
、P5 、P6 およびP7 との組み合わせにおけるプライマーP1 の手助けでクロ
ーンHPV16L1 ΔC* E7 1-55、1-60および1-65の調製用に使用した。 P5:CATCTGAAGCTTATCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG (E7 1-55) P6:CATCTGAAGCTTACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG(E7 1-60) P7:CATCTGAAGCTTAAAGCGTAGAGTCACACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGT
CCG (E7 1-65)
【0053】 HPV16L1 ΔC* E7 1-70をクローンHPV16L1 ΔC* E7 1-65およびプ
ライマーP1 およびP8 を用いて調製した。 P8: CATCTGAAGCTTATTGTACGCACAACCGAAGCGTAGAGTCACACTTG
ライマーP1 およびP8 を用いて調製した。 P8: CATCTGAAGCTTATTGTACGCACAACCGAAGCGTAGAGTCACACTTG
【0054】 全ての場合、対応フラグメントを置換する目的でEcoNIおよびHindII
Iを使用した。このクローンはDNA配列決定により解析した。
Iを使用した。このクローンはDNA配列決定により解析した。
【0055】2.組み換え Baculovirus の調製 Spodoptera frugiperda (Sf9)を、単層として、または10%胎児子牛血清お
よび2mMグルタミンを用いたTNM−FH昆虫媒体(Sigma, Deisenhofen)で
の懸濁培養中で使用した。組み換え baculovirus HPV16L1 ΔCE7 1-X を
、10μgの組み換えプラスミドおよび2μgの直鎖化 Baculo-Gold DNA(
Pharmingen, San Diego, CA)のコントラフエクションによりSf9 細胞中にトラン
スフエクトさせた。組み換えウイルスはメーカー指示に従って精製した。発現試
験の目的で、106Sf9 細胞を組み換え Baculovirus および5から10のm.
o.i.(multiplicity of infection ;感染多重度)で感染させた。保温後、
培地を除き、PBS(140mM NaCl、 2.7mM Kcl [sic]、8.1mM Na2PO4、1.5mM KH 2 PO4、pH 7.2)で洗浄した。次いで細胞をSDS試料緩衝剤中に溶菌し、SDS
ゲルクロマトグラフイーおよび免疫アッセイにより試験した。
よび2mMグルタミンを用いたTNM−FH昆虫媒体(Sigma, Deisenhofen)で
の懸濁培養中で使用した。組み換え baculovirus HPV16L1 ΔCE7 1-X を
、10μgの組み換えプラスミドおよび2μgの直鎖化 Baculo-Gold DNA(
Pharmingen, San Diego, CA)のコントラフエクションによりSf9 細胞中にトラン
スフエクトさせた。組み換えウイルスはメーカー指示に従って精製した。発現試
験の目的で、106Sf9 細胞を組み換え Baculovirus および5から10のm.
o.i.(multiplicity of infection ;感染多重度)で感染させた。保温後、
培地を除き、PBS(140mM NaCl、 2.7mM Kcl [sic]、8.1mM Na2PO4、1.5mM KH 2 PO4、pH 7.2)で洗浄した。次いで細胞をSDS試料緩衝剤中に溶菌し、SDS
ゲルクロマトグラフイーおよび免疫アッセイにより試験した。
【0056】3.ウイルス様粒子の精製 CVLPS 調製のために、Trichoplusia ni (TN) High Five 細胞を Ex-Cell
405 無血清培地(JRH, Biosciences, Lennexa, KS) 中でml当たりの密度1−
1.5×106 細胞/mlまで27℃で培養した。400ml培地を収穫し、周
期的反転下に1時間、組み換え baculovirus を用いてm.o.i.2から5で感染さ
せた。培地240mlまでを添加し、3−4日間細胞を培養した。次いで細胞を
ペレット化し、抽出緩衝液(10mM Mg Cl2 、1-50mM Ca Cl2 、150mM NaCl、20mM
Hepes、0.01% Triton (任意)、pH 7.4)10ml中に再懸濁し、60ワットで
45秒間超音波処理した。Sorvall SS34 ローター を用いた 10,000 rpm での
遠心分離後、ペレットを6mlの抽出緩衝液中に溶解し,60ワットで30秒間
超音波処理し、再度遠心分離した。上澄み液を併合し、40% (w/V) スクロー
スおよび57.5%(W/V )CsClの2段勾配に処した。27,000 rpmのSW−
28ローター中での遠心分離後、中間層およびCsCl層を採取し、CsCl密
度1.38g/mlに調整し、45,000 rpmで16時間遠心分離した。この勾配体
を分画し、各フラクションをアンチHPV16L1 mAb Camvirl(Pharningen, S
an Diego, CA) によるウエスターンプロットにより試験した。反応性フラクショ
ンを併合し、Centricon 30 ミクロ濃縮器(Amicon Corp. Beverly, MA )を使 用する限界濾過手段により Hepes 緩衝液(1mM Hepes 、 149mM NaCl 、 0.5mM
KCl、 pH 7.2 )に対して透析し、透過電子顕微鏡手法によりCVLPs の存在
を確認した。L1 E7 タンパク質の濃度は、クーマシーブルーで汚染したSDS
ゲル中で標準BSAと比較することにより、ざっと決定した。
405 無血清培地(JRH, Biosciences, Lennexa, KS) 中でml当たりの密度1−
1.5×106 細胞/mlまで27℃で培養した。400ml培地を収穫し、周
期的反転下に1時間、組み換え baculovirus を用いてm.o.i.2から5で感染さ
せた。培地240mlまでを添加し、3−4日間細胞を培養した。次いで細胞を
ペレット化し、抽出緩衝液(10mM Mg Cl2 、1-50mM Ca Cl2 、150mM NaCl、20mM
Hepes、0.01% Triton (任意)、pH 7.4)10ml中に再懸濁し、60ワットで
45秒間超音波処理した。Sorvall SS34 ローター を用いた 10,000 rpm での
遠心分離後、ペレットを6mlの抽出緩衝液中に溶解し,60ワットで30秒間
超音波処理し、再度遠心分離した。上澄み液を併合し、40% (w/V) スクロー
スおよび57.5%(W/V )CsClの2段勾配に処した。27,000 rpmのSW−
28ローター中での遠心分離後、中間層およびCsCl層を採取し、CsCl密
度1.38g/mlに調整し、45,000 rpmで16時間遠心分離した。この勾配体
を分画し、各フラクションをアンチHPV16L1 mAb Camvirl(Pharningen, S
an Diego, CA) によるウエスターンプロットにより試験した。反応性フラクショ
ンを併合し、Centricon 30 ミクロ濃縮器(Amicon Corp. Beverly, MA )を使 用する限界濾過手段により Hepes 緩衝液(1mM Hepes 、 149mM NaCl 、 0.5mM
KCl、 pH 7.2 )に対して透析し、透過電子顕微鏡手法によりCVLPs の存在
を確認した。L1 E7 タンパク質の濃度は、クーマシーブルーで汚染したSDS
ゲル中で標準BSAと比較することにより、ざっと決定した。
【0057】4.マウス細胞の培養 C57BL/6 由来マウス細胞TC−1 はC57BL/6 マウスの一次肺上皮細胞
であり、これらは腫瘍遺伝子HPV−16E6 およびE7 ならびにc−Ha−ra
s(Lon, K.-Y. (1996), supra)によるトランスフエクションによりトランスフ
オームされている。RMA(Lijungrenn & Karre (1985) J. Exp. Med., 162, 1
745-1757) および処理用欠失細胞系RMA−SはC57BL/6 胸腺細胞である。
HPV−16E7 トランスフエクト化RMA−E7 は Speidel, K.らによる(1997
) Eur. J. Immunol., 27 (9),2391-2399中に記載がある。全ての細胞は、10%
FCS、2−ME、L−グルタミンおよび抗性物質で補足されたRPM1 −1640
中で培養した。0.8mg/mlのG 418 (Gibco BRL,Gaithersburg, MD)
をRMA−E7 トランスフエクタントの培養のために添加した。TC−1 細胞は
、0.4mg/mlのG418 、0.2mg/mlのハイグロマイシンおよび1m
Mのピルビン酸ナトリウムの存在下にさらに成長させた。
であり、これらは腫瘍遺伝子HPV−16E6 およびE7 ならびにc−Ha−ra
s(Lon, K.-Y. (1996), supra)によるトランスフエクションによりトランスフ
オームされている。RMA(Lijungrenn & Karre (1985) J. Exp. Med., 162, 1
745-1757) および処理用欠失細胞系RMA−SはC57BL/6 胸腺細胞である。
HPV−16E7 トランスフエクト化RMA−E7 は Speidel, K.らによる(1997
) Eur. J. Immunol., 27 (9),2391-2399中に記載がある。全ての細胞は、10%
FCS、2−ME、L−グルタミンおよび抗性物質で補足されたRPM1 −1640
中で培養した。0.8mg/mlのG 418 (Gibco BRL,Gaithersburg, MD)
をRMA−E7 トランスフエクタントの培養のために添加した。TC−1 細胞は
、0.4mg/mlのG418 、0.2mg/mlのハイグロマイシンおよび1m
Mのピルビン酸ナトリウムの存在下にさらに成長させた。
【0058】5.T−細胞(CTL)系の調製 免疫化後10−14日で、脾臓細胞を調製した:2−4×107 脾臓細胞を1
05 放射(200GY)同一遺伝子型RMA−E7 トランスフエクタント/ml
を用いて共培養した。5日後、最初の 51 Cr放出細胞毒性試験を実施っした。
CTL系の生産のために、この脾臓細胞を24穴プレート中で穴当たり2×10 5 放射RMA−E7 トランスフエクタントを刺激細胞として、および穴当たり5
×106 放射(33Gy)C57BL/6 脾臓細胞を指示細胞として用いて1週に
1度再刺激した。
05 放射(200GY)同一遺伝子型RMA−E7 トランスフエクタント/ml
を用いて共培養した。5日後、最初の 51 Cr放出細胞毒性試験を実施っした。
CTL系の生産のために、この脾臓細胞を24穴プレート中で穴当たり2×10 5 放射RMA−E7 トランスフエクタントを刺激細胞として、および穴当たり5
×106 放射(33Gy)C57BL/6 脾臓細胞を指示細胞として用いて1週に
1度再刺激した。
【0059】6.51Cr放出細胞毒 性試験 51Cr放出細胞毒試験の目的でエフエクタ−T細胞を、異なったエフエクター
細胞を有する96穴プレート上で1×104 51Crラベル標的細胞/穴に標的
細胞比(E:T)で添加した。この標的細胞をNa2 51 CrO4 (100μCi
/2×106 細胞)を用いて37℃で1時間ラベル化した。配列RAHYNIV
TF(HPV−16E7 のアミノ酸49−57;Feltkamp, M.C.W.らの (1993),
Eur. J. Immunol., 23, 2242-2249) を有するこのペプチドを上記保温中に濃度
50μMで添加した。一定E:T比を用いたペプチド滴定試験において、この51 Crラベル標的細胞を低減ペプチド濃度(1μg−100pg/ml)を用いて
エフエクター細胞の添加に先立ち37℃で1時間培養した。37℃で4時間保温
後、穴当たり上澄み液50μlを Luma プレート(Packard)に移して乾燥した。
この放射能をβカウンター(Trilux Microbeta, Wallac) 中で測定した。次式に
従って平均比溶菌(%)を計算した:%比溶菌=(実験放出−自然放出)(完全
放出−自然放出)×100
細胞を有する96穴プレート上で1×104 51Crラベル標的細胞/穴に標的
細胞比(E:T)で添加した。この標的細胞をNa2 51 CrO4 (100μCi
/2×106 細胞)を用いて37℃で1時間ラベル化した。配列RAHYNIV
TF(HPV−16E7 のアミノ酸49−57;Feltkamp, M.C.W.らの (1993),
Eur. J. Immunol., 23, 2242-2249) を有するこのペプチドを上記保温中に濃度
50μMで添加した。一定E:T比を用いたペプチド滴定試験において、この51 Crラベル標的細胞を低減ペプチド濃度(1μg−100pg/ml)を用いて
エフエクター細胞の添加に先立ち37℃で1時間培養した。37℃で4時間保温
後、穴当たり上澄み液50μlを Luma プレート(Packard)に移して乾燥した。
この放射能をβカウンター(Trilux Microbeta, Wallac) 中で測定した。次式に
従って平均比溶菌(%)を計算した:%比溶菌=(実験放出−自然放出)(完全
放出−自然放出)×100
【0060】7.CVLPS によるE7 特異的細胞毒性Tリンパ細胞の誘発 生後6から16週の雌C57BL/6 マウス11匹を、CVLPS 1−20μg
を用いて単純 s.c. 注射手法で無アジュバントで免疫化した。2週後、脾臓細胞
を調製し、in vitro で刺激細胞としてC57BL/6 由来腫瘍細胞系RMA(R
MA−E7 )のHPV−16E7 発現トランフエクタントを用いて刺激した。5日
間培養後、最初の細胞毒性試験を実施した。
を用いて単純 s.c. 注射手法で無アジュバントで免疫化した。2週後、脾臓細胞
を調製し、in vitro で刺激細胞としてC57BL/6 由来腫瘍細胞系RMA(R
MA−E7 )のHPV−16E7 発現トランフエクタントを用いて刺激した。5日
間培養後、最初の細胞毒性試験を実施した。
【0061】 脾臓細胞の刺激を1週間間隔で繰り返した。図1に示すように、1μgのL1
ΔCE7 1-60CVLLPS すなわちHPV−16L1 のカルボキシ末端34アミノ
酸での免疫化をHPV−16E7 のアミノ酸 1-60 で置き換えたところ、強いE7
特異的CTL応答を引き起こした。
ΔCE7 1-60CVLLPS すなわちHPV−16L1 のカルボキシ末端34アミノ
酸での免疫化をHPV−16E7 のアミノ酸 1-60 で置き換えたところ、強いE7
特異的CTL応答を引き起こした。
【0062】 全体で5日間後、7.7%から54.7%(平均値33.6%;E:T比8:
1から33:1)の、RMA−E7 トランスフエクタントの比溶菌が観察された
。第2刺激後の平均溶菌は35.8&から57.8%(平均値45.3%;E:
T比8:1から44:1)であった。マウスを1μgのL1 ΔCE7 1-60CVL
PS のみで免疫化すると、平均で5日間の培養時間後、5μg(17.2から4
4.7%;平均値33.9%)または20μg(26.0から54.7%;平均
値38.5%)を用いた免疫化後よりも一層低いE7 特異的CTLS の反応性が
観察された(7.7から49.5%;平均値28.5%)。対照マウスの脾臓細
胞(HBS緩衝液でワクチン化した)は、5日後でもE7 特異的反応性をなんら
の示さなかった(0.3−8.9%、平均値3.4%、E:T比4:1−9:1
)。
1から33:1)の、RMA−E7 トランスフエクタントの比溶菌が観察された
。第2刺激後の平均溶菌は35.8&から57.8%(平均値45.3%;E:
T比8:1から44:1)であった。マウスを1μgのL1 ΔCE7 1-60CVL
PS のみで免疫化すると、平均で5日間の培養時間後、5μg(17.2から4
4.7%;平均値33.9%)または20μg(26.0から54.7%;平均
値38.5%)を用いた免疫化後よりも一層低いE7 特異的CTLS の反応性が
観察された(7.7から49.5%;平均値28.5%)。対照マウスの脾臓細
胞(HBS緩衝液でワクチン化した)は、5日後でもE7 特異的反応性をなんら
の示さなかった(0.3−8.9%、平均値3.4%、E:T比4:1−9:1
)。
【0063】 L1 ΔCE7 1-60CVLPはE7 タンパク質(E7 49-57 ,Feltkamp, M.C.W.
らによる (1993),supra )の既知H2 - Db T細胞エピトープを含む。したが
って得られたCTLS のE7 特異性を確認する目的で、ペプチドE7 49-57 で負
荷されたRMA細胞に対してこれらを試験した。RMA−E7 トランスフエクタ
ントを認識するCTLS はE749-57RMAまたはRMA−S標的細胞に対する特
異的細胞毒活性を示した。測定した比溶菌は5日間後に21.2から25%(E
:T比8:1から15:1、図1参照)間で変動した。第3刺激後に実施したペ
プチド滴定試験では、RMA−S細胞は濃度1μg/mlのE7 49-57 で負荷後
は70.5%または71.4%へと溶菌した(二つのCR系試験)。RMA−S
細胞が100pg/mlという僅かなE7 49-57 ペプチドを与えられた場合でも
、比溶菌値36.2%および47.2%が得られた。対照ペプチド、すなわちア
ミノ酸366−374を有しDb-CTLエピトープを表すインフルエンザウイル
スヌクレオタンパク質由来ペプチドで負荷されたCTLs は認められなかった。
L1 ΔCE7 1-55CVLPS (5アミノ酸で切頭したE7 配列)で処理後のC57
BL/6 マウスから単離した脾臓細胞は、例えマウスを250μgまでの増量投
与量でワクチン化しても、RMA−E7 細胞を認識しなかった。
らによる (1993),supra )の既知H2 - Db T細胞エピトープを含む。したが
って得られたCTLS のE7 特異性を確認する目的で、ペプチドE7 49-57 で負
荷されたRMA細胞に対してこれらを試験した。RMA−E7 トランスフエクタ
ントを認識するCTLS はE749-57RMAまたはRMA−S標的細胞に対する特
異的細胞毒活性を示した。測定した比溶菌は5日間後に21.2から25%(E
:T比8:1から15:1、図1参照)間で変動した。第3刺激後に実施したペ
プチド滴定試験では、RMA−S細胞は濃度1μg/mlのE7 49-57 で負荷後
は70.5%または71.4%へと溶菌した(二つのCR系試験)。RMA−S
細胞が100pg/mlという僅かなE7 49-57 ペプチドを与えられた場合でも
、比溶菌値36.2%および47.2%が得られた。対照ペプチド、すなわちア
ミノ酸366−374を有しDb-CTLエピトープを表すインフルエンザウイル
スヌクレオタンパク質由来ペプチドで負荷されたCTLs は認められなかった。
L1 ΔCE7 1-55CVLPS (5アミノ酸で切頭したE7 配列)で処理後のC57
BL/6 マウスから単離した脾臓細胞は、例えマウスを250μgまでの増量投
与量でワクチン化しても、RMA−E7 細胞を認識しなかった。
【0064】 これらのデータから、L1 ΔCE7 1-60CVLPS により誘発されたCTLs
はE7 特異的であり、かつ、高い親和性でペプチドE7 49-57 を認識すると結論
される。代表的TL系のFACS分析では、このCTLs はCD8 ポジテイブと
して同定された。
はE7 特異的であり、かつ、高い親和性でペプチドE7 49-57 を認識すると結論
される。代表的TL系のFACS分析では、このCTLs はCD8 ポジテイブと
して同定された。
【0065】8.C57BL/6 マウスにおける同系間E7 発現腫瘍の成長阻害 L1 ΔCE71-60 CVLPS によるワクチン接種が同系間腫瘍細胞(TC−1
、Lin, K-Y. (1996), Cancer Res. 56, 21-26)に対して有効な免疫化を誘発
するか否かを決定する目的で、腫瘍防護実験を実施した。C57BL/6 マウス(
群当たり3から5匹)が10μgのL1 ΔCE7 1-60CVLPS 、10μgのL
1 ΔCE7 1-55CVLPS 、10μgのL1 ΔCVLPS または当量容積の無ア
ジュバントHBS緩衝液の1S.C.注射を受けた。免疫化後2週間で、200μl
のPBS中に懸濁した6×104 TC−1 細胞をマウスの左横腹中に接種した。
マウスを犠牲にするまで2ケ月間週2回腫瘍の大きさを測定した。
、Lin, K-Y. (1996), Cancer Res. 56, 21-26)に対して有効な免疫化を誘発
するか否かを決定する目的で、腫瘍防護実験を実施した。C57BL/6 マウス(
群当たり3から5匹)が10μgのL1 ΔCE7 1-60CVLPS 、10μgのL
1 ΔCE7 1-55CVLPS 、10μgのL1 ΔCVLPS または当量容積の無ア
ジュバントHBS緩衝液の1S.C.注射を受けた。免疫化後2週間で、200μl
のPBS中に懸濁した6×104 TC−1 細胞をマウスの左横腹中に接種した。
マウスを犠牲にするまで2ケ月間週2回腫瘍の大きさを測定した。
【0066】 全ての実験結果を表1に集約した。HBS緩衝剤、L1 Δ CVLPS または
L1 ΔCE7 1-55CVLPS でワクチン接種したマウスの全腫瘍成長率は平均8
0.5%であった。L1 Δ CVLPS によるワクチン接種は、腫瘍の遅延が観
測されたが(図3参照)、腫瘍からは保護しなかった。しかし、L1 Δ CE7 1-60 CVLPS によるマウスのワクチン接種は腫瘍成長から保護した:僅かマウ
ス1匹(1/13)が38日後に小さく徐々に成長する腫瘍を生じ、この腫瘍は
期間2ケ月以内に退化した。
L1 ΔCE7 1-55CVLPS でワクチン接種したマウスの全腫瘍成長率は平均8
0.5%であった。L1 Δ CVLPS によるワクチン接種は、腫瘍の遅延が観
測されたが(図3参照)、腫瘍からは保護しなかった。しかし、L1 Δ CE7 1-60 CVLPS によるマウスのワクチン接種は腫瘍成長から保護した:僅かマウ
ス1匹(1/13)が38日後に小さく徐々に成長する腫瘍を生じ、この腫瘍は
期間2ケ月以内に退化した。
【0067】 TC−1 腫瘍を生じたHBSまたはL1 VLPワクチン接種マウスの脾臓細胞は
、このマウスが腫瘍を生じたか否かに関係無く、E7 特異的CTL応答を全く示
さないか、または僅かな水準のみの応答を示した。2回目の刺激後、腫瘍保持マ
ウスの0から21%(平均値14%、E:T比は5:1から24:1)間および
0から22.2%(平均値10.4%、E:T比は7:1から40:1)間のR
MA−E7 標的細胞のE7 比溶菌を、無腫瘍マウスにおいて観察した。これとは
対照的に、CVLPL1 Δ CE7 1-60で免疫化後に腫瘍成長から保護されたマ
ウスでは、29.1から49.8%(平均値36.9%、E:T比は11:1か
ら24:1)のE7 特異的CTL応答が2回刺激後に見いだされた。
、このマウスが腫瘍を生じたか否かに関係無く、E7 特異的CTL応答を全く示
さないか、または僅かな水準のみの応答を示した。2回目の刺激後、腫瘍保持マ
ウスの0から21%(平均値14%、E:T比は5:1から24:1)間および
0から22.2%(平均値10.4%、E:T比は7:1から40:1)間のR
MA−E7 標的細胞のE7 比溶菌を、無腫瘍マウスにおいて観察した。これとは
対照的に、CVLPL1 Δ CE7 1-60で免疫化後に腫瘍成長から保護されたマ
ウスでは、29.1から49.8%(平均値36.9%、E:T比は11:1か
ら24:1)のE7 特異的CTL応答が2回刺激後に見いだされた。
【0068】 さらに、このワクチン接種が、既存腫瘍の退化に繋がるか否かを解析した。6
×104 TC−1 細胞(S.C.) を接種後2週間で、マウス(群当たり5匹)が1
0μgのL1 Δ CE7 1-60CVLPS 、10μgのVLPL1 ΔCまたは無ア
ジュバントHBS緩衝液の単回注射を受けた。この実験(図4参照)では、HB
Sで処置された、またはVLPL1 ΔCで免疫化された、いずれかの対照マウス
の腫瘍発生は僅か60%(各群の3匹、6/10)であった。しかし、L1 ΔC
E7 1-60CVLPS でワクチン接種した全てのマウス(5/5)は、確立腫瘍に
対する免疫応答を生じ、かつ、腫瘍細胞注射後2ケ月間は無腫瘍で維持された。
×104 TC−1 細胞(S.C.) を接種後2週間で、マウス(群当たり5匹)が1
0μgのL1 Δ CE7 1-60CVLPS 、10μgのVLPL1 ΔCまたは無ア
ジュバントHBS緩衝液の単回注射を受けた。この実験(図4参照)では、HB
Sで処置された、またはVLPL1 ΔCで免疫化された、いずれかの対照マウス
の腫瘍発生は僅か60%(各群の3匹、6/10)であった。しかし、L1 ΔC
E7 1-60CVLPS でワクチン接種した全てのマウス(5/5)は、確立腫瘍に
対する免疫応答を生じ、かつ、腫瘍細胞注射後2ケ月間は無腫瘍で維持された。
【0069】表1 L1 ΔCE71-60CVLPsで免疫後の腫瘍防護 ワクチン マウスの数 腫瘍の数 HS 緩衝剤 18 16 L1ΔC VLPs 13 11 L1ΔCE71-55 CVLPs 10 7L1ΔCE71-60 CVLPs 13 1
【配列表】
【図1】 1μgのL1 E7 1-60CVLPS を用いた免疫化後に生じたE7 特異的CTL
応答を示すグラフ。
応答を示すグラフ。
【図2】 20μgのL1 E7 1-60CVLPS を用いたC57BL/6マウスのワクチン化
および in vitro でのRMA−E7 トランスフエクタントを用いた3回の刺激後
に得られたE7 特異的CTL系を用いて実施した滴定試験の結果を示すグラフ。
および in vitro でのRMA−E7 トランスフエクタントを用いた3回の刺激後
に得られたE7 特異的CTL系を用いて実施した滴定試験の結果を示すグラフ。
【図3】 TC−1腫瘍細胞の成長からのC57BL/6マウスの保護を示すグラフ。
【図4】 L1 E7 1-60CVLPS によるTG−1腫瘍の成長阻止を示すグラフ。
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成12年3月24日(2000.3.24)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項20】 一方でHPV特異的腫瘍を防止し、かつ、他方では既存のHPV特異的腫瘍を
退行させるための医薬の生産のための、請求項1、および7から17項のいずれ
か1項記載の融合タンパク質の使用。
退行させるための医薬の生産のための、請求項1、および7から17項のいずれ
か1項記載の融合タンパク質の使用。
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成12年6月14日(2000.6.14)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0026
【補正方法】変更
【補正内容】
【0026】 特に好ましい構築体はN末端アミノ酸1から約55のE7 であり、この構築体
はキヤプシッド形成を妨げ得るE7 特異的配列をアミノ酸56−70領域中に含
まないので、欠失Lタンパク質との組み合わせでキヤプメアおよびキヤプシッド
を好ましく形成する。32アミノ酸によりC末端が欠失したHPV−16のL1
タンパク質、および、これがアミノ酸1−55または1−60のHPV−16の
E7 タンパク質に結合したものは特に好ましい。これらの構築体は中和性抗体ま
たは特異的CTL応答を誘発するのみではなく、また一方では腫瘍形成を阻害し
、他方で既存腫瘍の退化を動物実験で引き起こす。アミノ酸1−60のE7 は腫
瘍中で顕著な予防作用および治療的作用を特に示す。したがって、この発明にお
いて特に好ましい実施態様はL1 ΔE7 1-X 融合タンパク質、好ましくはCVL
PS 具体的にはHPV16(Xは60を含む、55から60にいたる整数)の形
態における融合タンパク質であり、かつ具体的にはL1 ΔCE7 1-55またはL1
ΔCE7 1-60融合タンパク質である。
はキヤプシッド形成を妨げ得るE7 特異的配列をアミノ酸56−70領域中に含
まないので、欠失Lタンパク質との組み合わせでキヤプメアおよびキヤプシッド
を好ましく形成する。32アミノ酸によりC末端が欠失したHPV−16のL1
タンパク質、および、これがアミノ酸1−55または1−60のHPV−16の
E7 タンパク質に結合したものは特に好ましい。これらの構築体は中和性抗体ま
たは特異的CTL応答を誘発するのみではなく、また一方では腫瘍形成を阻害し
、他方で既存腫瘍の退化を動物実験で引き起こす。アミノ酸1−60のE7 は腫
瘍中で顕著な予防作用および治療的作用を特に示す。したがって、この発明にお
いて特に好ましい実施態様はL1 ΔE7 1-X 融合タンパク質、好ましくはCVL
PS 具体的にはHPV16(Xは60を含む、55から60にいたる整数)の形
態における融合タンパク質であり、かつ具体的にはL1 ΔCE7 1-55またはL1
ΔCE7 1-60融合タンパク質である。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0027
【補正方法】変更
【補正内容】
【0027】 したがって本発明は、医薬生産のために本発明における構築体を、一方ではH
PV特異的腫瘍阻害のために、他方では既存HPV特異的腫瘍を退化させるため
に使用することに関する。
PV特異的腫瘍阻害のために、他方では既存HPV特異的腫瘍を退化させるため
に使用することに関する。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0028
【補正方法】変更
【補正内容】
【0028】 予防および治療の両方で活性な医薬の生産の場合、所望のパピローマウイルス
特異的融合タンパク質はキヤプシッドおよび/またはキヤプソマーの形態で存在
するのが好ましく、その理由は、このキヤプシッドおよび/またはキヤプソマー
により、具体的にはタンパク質のフラクションにより免疫反応が追加的に顕著に
増進され得るからである。したがってキヤプシッドおよび/またはキヤプソマー
形成に適する好ましい融合タンパク質は、例えば欠失L1 およびE7 、E6 およ
び/またはE1 からの融合タンパク質である。
特異的融合タンパク質はキヤプシッドおよび/またはキヤプソマーの形態で存在
するのが好ましく、その理由は、このキヤプシッドおよび/またはキヤプソマー
により、具体的にはタンパク質のフラクションにより免疫反応が追加的に顕著に
増進され得るからである。したがってキヤプシッドおよび/またはキヤプソマー
形成に適する好ましい融合タンパク質は、例えば欠失L1 およびE7 、E6 およ
び/またはE1 からの融合タンパク質である。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0029
【補正方法】変更
【補正内容】
【0029】 この発明の趣旨以内におけるキヤプシッドは、一般的に72キヤプソマーから
構築された一般に正二十面体形態のウイルスまたはウイルス様構造体である。
構築された一般に正二十面体形態のウイルスまたはウイルス様構造体である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Fターム(参考) 4C084 AA02 BA01 BA20 BA44 CA01 DC50 NA02 NA03 NA14 ZB262 ZB332 4C085 AA03 BA76 CC08 EE03
Claims (20)
- 【請求項1】 一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのL1 タンパク質
および一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのEタンパク
質からの少なくとも一つの融合タンパク質、ならびに任意に適切な添加剤および
/また賦形剤を含む、ヒトパピローマウイルス(HPV)特異的腫瘍の回避用ま
たは治療用医薬であって、この融合タンパク質がパピローマウイルス非特異的エ
ピトープを含まないことを特徴とする上記医薬。 - 【請求項2】 腫瘍が、喉頭、頚部、陰茎、外陰または肛門における上皮組織悪性腫瘍である
ことを特徴とする、請求項1記載の医薬。 - 【請求項3】 医薬がアジュバントを含まないことをことを特徴とする、請求項1または2記
載の医薬。 - 【請求項4】 添加剤または賦形剤が、濃度約0.3から約4M、好ましくは約0.4から約
3M、具体的には約0.5Mから2M特に約1から2Mの、pH約7.3から約
7.45好ましくは約7.4を示す塩であることを特徴とする、請求項1から3
のいずれか1項記載の医薬。 - 【請求項5】 塩が、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、好ましくはハロゲン化物ま
たはリン酸塩、具体的にはアルカリ金属ハロゲン化物特にNaClまたはKCl
であることを特徴とする、請求項4記載の薬剤。 - 【請求項6】 緩衝剤好ましくはリン酸塩緩衝剤、トリス緩衝剤、HEPES緩衝剤またはM
OPS緩衝剤を用いてpHを調整することを特徴とする、請求項4または5記載
の医薬。 - 【請求項7】 Lタンパク質が欠失Lタンパク質、好ましくは欠失L1 および/またはL2 タ
ンパク質であることを特徴とする、請求項1から6のいずれか1項記載の医薬。 - 【請求項8】 Lタンパク質が、C末端欠失Lタンパク質、具体的のはC末端欠失L1 タンパ
ク質であることを特徴とする、請求項7記載の医薬。 - 【請求項9】 約35アミノ酸まで、好ましくは約25から約35アミノ酸、具体的には約3
2から34アミノ酸がLタンパク質から欠失されることを特徴とする、請求項7
または8記載の医薬。 - 【請求項10】 Eタンパク質が、欠失Eタンパク質特に欠失E6 および/またはE7 タンパク
質であることを特徴とする、請求項1から9のいずれか1項記載の医薬。 - 【請求項11】 欠失Eタンパク質がC末端欠失Eタンパク質好ましくはC末端欠失E7 タンパ
ク質であることを特徴とする、請求項10記載の医薬。 - 【請求項12】 約55アミノ酸まで、好ましくは約5から約55アミノ酸、具体的には約38
から約43アミノ酸が欠失されてなることを特徴とする、請求項10または11
記載の医薬。 - 【請求項13】 融合タンパク質がキヤプシッドおよび/またはキヤプソマーの形態で存在する
ことを特徴とする、請求項1から12のいずれか1項記載の医薬。 - 【請求項14】 HPVが、HPV−6、HPV−11、HPV−16、HPV−18、HPV
−31、HPV−33、HPV−35、HPV−39、HPV−42、HPV−
45、HPV−52および/またはHPV−58から選択されることを特徴とす
る、請求項1から13のいずれか1項記載の医薬。 - 【請求項15】 パピローマウイルスが、HPV−16およびHPV−18またはHPV−18
、HPV−31、HPV−45およびHPV−58またはHPV−6およびHP
V−11から選択されることを特徴とする、組み合わせワクチンの形態における
請求項14記載の医薬。 - 【請求項16】 融合タンパク質が、L1 ΔCE7 1-X 融合タンパク質好ましくはCVLPの形
態のもの、特にHPV−16の形態[Xは60を含む、55から60までの整数
]のものであることを特徴とする、請求項1から15のいずれか1項記載の医薬
。 - 【請求項17】 融合タンパク質が、L1 ΔCE7 1-55またはL1 ΔCE7 1-60融合タンパク質
であることを特徴とする、請求項16記載の医薬。 - 【請求項18】 上記融合タンパク質をコードする発現ベクターを含む細胞を適切な条件下に培
養し、発現生成物を単離し、任意に適切な添加剤および賦形剤を添加することを
特徴とする、請求項1から17のいずれか1項記載の医薬の製造方法。 - 【請求項19】 発現ベクターが、発現中に上記融合タンパク質をさらなるアミノ酸により延長
させる核酸配列を含まないことを特徴とする、請求項18記載の医薬。 - 【請求項20】 一方でHPV特異的腫瘍を防止し、かつ、他方では既存のHPV特異的腫瘍を
退行させるための医薬の生産のための、請求項1、および7から17項のいずれ
か1項記載の融合タンパク質の使用。
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DE19812941.6 | 1998-03-24 | ||
PCT/EP1999/001996 WO1999048518A2 (de) | 1998-03-24 | 1999-03-24 | Arzneimittel zur vermeidung oder behandlung von papillomavirus-specifischem tumor |
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DE10059630A1 (de) * | 2000-12-01 | 2002-06-06 | Medigene Ag | Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von durch humanen Papillomavirus-Typ 18-hervorgerufenem Tumor |
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