JP2002509863A - パピローマウイルス特異的腫瘍の回避用または治療用医薬 - Google Patents
パピローマウイルス特異的腫瘍の回避用または治療用医薬Info
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Abstract
(57)【要約】
この発明は、少なくとも一つの融合タンパク質および任意に適切な添加剤および／または補助剤を含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）特異的腫瘍の回避用または治療用医薬に関する。上記融合タンパク質は、一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのＬ1 タンパク質を含み、かつまた、一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのＥタンパク質を含み、この場合の融合タンパク質はパピローマウイルス非特異的エピトープを含まない。
Description
【０００１】
この発明は、一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのＬ
1 タンパク質および一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つ
のＥタンパク質からの少なくとも一つの融合タンパク質、ならびに任意に適切な
添加剤および／また賦形剤を含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）特異的腫
瘍の回避用または治療用医薬であって、この融合タンパク質がパピローマウイル
ス非特異的エピトープを含まないことを特徴とする上記医薬に関するものである
。
1 タンパク質および一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つ
のＥタンパク質からの少なくとも一つの融合タンパク質、ならびに任意に適切な
添加剤および／また賦形剤を含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）特異的腫
瘍の回避用または治療用医薬であって、この融合タンパク質がパピローマウイル
ス非特異的エピトープを含まないことを特徴とする上記医薬に関するものである
。
【０００２】
いぼウイルスとも呼ばれるパピローマウイルスは、約８０００塩基対のゲノム
寸法および直径約５５ｎｍの正十二面体様キヤプシッドを有する二本鎖ＤＮＡウ
イルスである。現在までに１００を超える異なったヒトパピローマウイルス型が
知られており、この中のある種のもの例えばＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰ
Ｖ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５２またはＨ
ＰＶ−５８は悪性腫瘍を、および他の例えばＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１またはＨ
ＰＶ−４２は良性腫瘍を起こし得る。
寸法および直径約５５ｎｍの正十二面体様キヤプシッドを有する二本鎖ＤＮＡウ
イルスである。現在までに１００を超える異なったヒトパピローマウイルス型が
知られており、この中のある種のもの例えばＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰ
Ｖ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５２またはＨ
ＰＶ−５８は悪性腫瘍を、および他の例えばＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１またはＨ
ＰＶ−４２は良性腫瘍を起こし得る。
【０００３】 ＢＰＶ−１およびＨＰＶ−１の電子顕微鏡分析では、これらのウイルスは７２
の五角形キヤプソマーから構築され、これらは一方では五つのＬ1 分子から成る
（Baker, T. らによる (1991) Biophys. J., 60, 1445) 。
の五角形キヤプソマーから構築され、これらは一方では五つのＬ1 分子から成る
（Baker, T. らによる (1991) Biophys. J., 60, 1445) 。
【０００４】 パピローマウイルスのゲノムは、次の３領域に細別できる：第１領域は非コー
ド領域に関し、この領域はウイルスの転写および複製のための調節因子を含む。
所謂Ｅ（early;初期）領域である第２領域は、各種のタンパク質コード部分Ｅ1
からＥ7 を含み、この中で例えばＥ6 およびＥ7 タンパク質は上皮細胞の悪性転
換の原因であり、Ｅ1 タンパク質はＤＮＡコピー数を制御する。Ｅ6 およびＥ7
領域は所謂腫瘍遺伝子であり、これらはまた腫瘍的に変性した細胞中にも現れる
。第３領域はＬ（late; 後期）領域とも呼称し、二つのタンパク質コード部分Ｌ
1 おょびＬ2 を含み、これらの部分はウイルスキヤプシッドの構造的成分をコー
ドする。このＬ1 タンパク質はウイルスキヤプシッド中に９０％を超えて存在し
、Ｌ1 ：Ｌ2 の比率は一般的に３０：１である。
ド領域に関し、この領域はウイルスの転写および複製のための調節因子を含む。
所謂Ｅ（early;初期）領域である第２領域は、各種のタンパク質コード部分Ｅ1
からＥ7 を含み、この中で例えばＥ6 およびＥ7 タンパク質は上皮細胞の悪性転
換の原因であり、Ｅ1 タンパク質はＤＮＡコピー数を制御する。Ｅ6 およびＥ7
領域は所謂腫瘍遺伝子であり、これらはまた腫瘍的に変性した細胞中にも現れる
。第３領域はＬ（late; 後期）領域とも呼称し、二つのタンパク質コード部分Ｌ
1 おょびＬ2 を含み、これらの部分はウイルスキヤプシッドの構造的成分をコー
ドする。このＬ1 タンパク質はウイルスキヤプシッド中に９０％を超えて存在し
、Ｌ1 ：Ｌ2 の比率は一般的に３０：１である。
【０００５】 ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１は、特に生殖器いぼの原因としての地位を維持
している；ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ
−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５２およびＨＰＶ−５８等のある種パピローマ
ウイルス型は肛門性器道の悪性腫瘍と関係する。この場合の５０％を超える割合
で、ＨＰＶ−１６が頚部癌（頚部様構造における上皮組織悪性腫瘍）に関係する
。したがって、ＨＰＶ−１６は頚部上皮内癌形成の場合の主たる危険因子である
。加えて、この疾患の進行には免疫系が重要な役割を演ずる。このように、細胞
免疫応答、具体的には抗原特異的Ｔリンパ細胞は、その防護機構のために重要で
あると考えられる。その上、ハイグレードの頚部上皮内癌（CIN II/III）および
頚部腫瘍においては、このＥ7 遺伝子は感染上皮の全層中に構造的に現れる。し
たがってこのＥ7 タンパク質は潜在的腫瘍抗原として、および活性化されたＴ細
胞に対する標的分子であると考えられる (例えばWO 93/20844 号参照）。しかし
ながら、患者においてＥ7 により誘発される細胞免疫応答は、疾患進行に影響を
及ぼすほど充分に強力ではないようである。この免疫応答は適切なワクチンによ
り増幅され得る可能性がある。
している；ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ
−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５２およびＨＰＶ−５８等のある種パピローマ
ウイルス型は肛門性器道の悪性腫瘍と関係する。この場合の５０％を超える割合
で、ＨＰＶ−１６が頚部癌（頚部様構造における上皮組織悪性腫瘍）に関係する
。したがって、ＨＰＶ−１６は頚部上皮内癌形成の場合の主たる危険因子である
。加えて、この疾患の進行には免疫系が重要な役割を演ずる。このように、細胞
免疫応答、具体的には抗原特異的Ｔリンパ細胞は、その防護機構のために重要で
あると考えられる。その上、ハイグレードの頚部上皮内癌（CIN II/III）および
頚部腫瘍においては、このＥ7 遺伝子は感染上皮の全層中に構造的に現れる。し
たがってこのＥ7 タンパク質は潜在的腫瘍抗原として、および活性化されたＴ細
胞に対する標的分子であると考えられる (例えばWO 93/20844 号参照）。しかし
ながら、患者においてＥ7 により誘発される細胞免疫応答は、疾患進行に影響を
及ぼすほど充分に強力ではないようである。この免疫応答は適切なワクチンによ
り増幅され得る可能性がある。
【０００６】 Ｌ1 遺伝子の発現またはＬ1 およびＬ2 遺伝子の共発現がウイルス様粒子（Ｖ
ＬＰｓ）を形成するということを証明することが可能になった。各種動物系中で
中和用抗体を形成する目的でＶＬＰS を使用することは可能であった。しかしウ
イルス中和用抗体の形成は、ウイルス感染が既に生起しているならば臨床的な重
要性は比較的低く、その理由はウイルス感染細胞の除去に対してはウイルス特異
的細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答が必要であると考えられるからである。したが
って所謂キメラパピローマウイルス様粒子（ＣＶＬＰS ）が開発され、このもの
はキメラＬ1 −Ｅ7 タンパク質（Muller, M. らの (1997) Virology, 234, 93)
から成る；ＣＶＬＰS を用いたマウスの免疫化によりＥ7 に対する抗体を誘発す
る実験には失敗したが（Muller, M. らの (1997), supra) 、ある種のＣＶＬＰ S はマウス中でＥ7 特異的ＣＴＬ応答を誘発する。加えて、患者におけるＨＰＶ
関連疾患の中和用抗体は投与Ｌ1 タンパク質に対する免疫応答を制約するように
考えられる（Muller, M.らの (1997), supra) 。しかしながら、クラスＩのＭＨ
Ｃ分子を介して提供される腫瘍細胞のＥ7 タンパク質はＣＴＬの標的分子を表す
であろうから、ワクチン開発の目的ではＣＶＬＰS は依然として興味がある。
ＬＰｓ）を形成するということを証明することが可能になった。各種動物系中で
中和用抗体を形成する目的でＶＬＰS を使用することは可能であった。しかしウ
イルス中和用抗体の形成は、ウイルス感染が既に生起しているならば臨床的な重
要性は比較的低く、その理由はウイルス感染細胞の除去に対してはウイルス特異
的細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答が必要であると考えられるからである。したが
って所謂キメラパピローマウイルス様粒子（ＣＶＬＰS ）が開発され、このもの
はキメラＬ1 −Ｅ7 タンパク質（Muller, M. らの (1997) Virology, 234, 93)
から成る；ＣＶＬＰS を用いたマウスの免疫化によりＥ7 に対する抗体を誘発す
る実験には失敗したが（Muller, M. らの (1997), supra) 、ある種のＣＶＬＰ S はマウス中でＥ7 特異的ＣＴＬ応答を誘発する。加えて、患者におけるＨＰＶ
関連疾患の中和用抗体は投与Ｌ1 タンパク質に対する免疫応答を制約するように
考えられる（Muller, M.らの (1997), supra) 。しかしながら、クラスＩのＭＨ
Ｃ分子を介して提供される腫瘍細胞のＥ7 タンパク質はＣＴＬの標的分子を表す
であろうから、ワクチン開発の目的ではＣＶＬＰS は依然として興味がある。
【０００７】 Peng らによる (1998) Virology, 240, 147は、ウシパピローマウイルス（Ｂ
ＰＶ）およびＨＰＶ−１６Ｅ7 49-57 のＣ末端切り取りＬ1 から成るＣＶＬＰに
ついて記載し、このものはＣ５７Ｂ1 ／6 マウスの接種後にＥ7 特異的細胞毒性
Ｔ細胞を誘発し、Ｅ7 発現性腫瘍の成長から守ることが記載されている。Greens
tone らの (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1800 は、等身大のＨＰ
Ｖ−１６Ｅ7 タンパク質に融合したＨＰＶ−１６Ｌ1 プラスＨＰＶ−１６Ｌ2 か
ら成るＣＶＬＰS を記載し、このものはＣ５７Ｂ1 ／6 マウスの免疫化後に上皮
Ｅ7 発現性腫瘍細胞の成長から守ることが記載されているが、細胞毒性Ｔ細胞は
検出されず、したがって免疫応答の誘発には有効性が低いように見える。
ＰＶ）およびＨＰＶ−１６Ｅ7 49-57 のＣ末端切り取りＬ1 から成るＣＶＬＰに
ついて記載し、このものはＣ５７Ｂ1 ／6 マウスの接種後にＥ7 特異的細胞毒性
Ｔ細胞を誘発し、Ｅ7 発現性腫瘍の成長から守ることが記載されている。Greens
tone らの (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1800 は、等身大のＨＰ
Ｖ−１６Ｅ7 タンパク質に融合したＨＰＶ−１６Ｌ1 プラスＨＰＶ−１６Ｌ2 か
ら成るＣＶＬＰS を記載し、このものはＣ５７Ｂ1 ／6 マウスの免疫化後に上皮
Ｅ7 発現性腫瘍細胞の成長から守ることが記載されているが、細胞毒性Ｔ細胞は
検出されず、したがって免疫応答の誘発には有効性が低いように見える。
【０００８】 一般的にはＶＬＰおよびＣＶＬＰS は、一種または二種以上のＬタンパク質ま
たはＬおよびＥタンパク質をコードする対応遺伝子の、適切な発現系中での発現
により遺伝子工学的手法で調製される。この対応遺伝子は、例えば Kinbaum, R.
らによる (1994) J. Virol., 67, 6929-6936 中に記載があり、またはＥＭＢ
Ｌデータバンクを介して入手可能である。アクセス番号は、例えばＨＰＶ１８の
場合はＰＡＰＨＰＶ１８；ＨＰＶ３１の場合はＰＡＰＰＰＨ３１；ＨＰＶ３３の
場合はＰＡＰＰＰＨ３３またはＨＰＶ−５８の場合はＰＡＰＰＰＨ５８である。
たはＬおよびＥタンパク質をコードする対応遺伝子の、適切な発現系中での発現
により遺伝子工学的手法で調製される。この対応遺伝子は、例えば Kinbaum, R.
らによる (1994) J. Virol., 67, 6929-6936 中に記載があり、またはＥＭＢ
Ｌデータバンクを介して入手可能である。アクセス番号は、例えばＨＰＶ１８の
場合はＰＡＰＨＰＶ１８；ＨＰＶ３１の場合はＰＡＰＰＰＨ３１；ＨＰＶ３３の
場合はＰＡＰＰＰＨ３３またはＨＰＶ−５８の場合はＰＡＰＰＰＨ５８である。
【０００９】 適切な発現系は例えば、遺伝子工学的に修飾された酵母例えば Saccharomyces
(cerevisiae) 、Pichia (pastoris) 、Kluyvermyces (lactis) 、Schizosaccha
romyces (pombe) または Hansenula(polymorpha) (Carter. J.J. らによる (19
91), Virology,182, 513) 、例えば Trichoplusia ni High Five 等の昆虫細胞
（例えば Muller らの (1997）参照, supra ）、または原核細胞（例えば WO96/
11272 号公報参照）である。原核細胞中での上記粒子の産生の場合、一般的には
これらを細胞中に析出させて所謂封入体を形成させ、次いでこのものを復元させ
て溶液にする。遺伝子工学的に産生させた粒子またはキヤプシッドまたはそれら
の前駆体を使用する場合は、発現後にさらなる精製工程を必要とする。
(cerevisiae) 、Pichia (pastoris) 、Kluyvermyces (lactis) 、Schizosaccha
romyces (pombe) または Hansenula(polymorpha) (Carter. J.J. らによる (19
91), Virology,182, 513) 、例えば Trichoplusia ni High Five 等の昆虫細胞
（例えば Muller らの (1997）参照, supra ）、または原核細胞（例えば WO96/
11272 号公報参照）である。原核細胞中での上記粒子の産生の場合、一般的には
これらを細胞中に析出させて所謂封入体を形成させ、次いでこのものを復元させ
て溶液にする。遺伝子工学的に産生させた粒子またはキヤプシッドまたはそれら
の前駆体を使用する場合は、発現後にさらなる精製工程を必要とする。
【００１０】 しかしながら文献記載の対ＨＰＶ活性化合物の重大な欠点は、これらが僅かな
作用しか示さない一方、他方ではパピローマウイルス特異的腫瘍に対する有効な
免疫治療性を、今日までなんら示し得ないことである。
作用しか示さない一方、他方ではパピローマウイルス特異的腫瘍に対する有効な
免疫治療性を、今日までなんら示し得ないことである。
【００１１】
したがってこの発明の目的は、ヒトパピローマウイルス特異的腫瘍を有効に回
避または治療し得る医薬であって、生産が簡単で医薬としての許認可に適すると
思考される医薬の提供にあった。
避または治療し得る医薬であって、生産が簡単で医薬としての許認可に適すると
思考される医薬の提供にあった。
【００１２】 この度、意外にも、この発明における医薬がＨＰＶ特異的腫瘍に対抗するのに
有効であることが判った。したがって、この発明の一つの目的は、一種または二
種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのＬ1 タンパク質および一種また
は二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのＥタンパク質からの少なく
とも一つの融合タンパク質、ならび適切な添加剤および／また賦形剤を任意に含
む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）特異的腫瘍回避用または治療用医薬であ
って、この融合タンパク質がパピローマウイルス非特異的エピトープを含まない
ことを特徴とする上記医薬にある。
有効であることが判った。したがって、この発明の一つの目的は、一種または二
種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのＬ1 タンパク質および一種また
は二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのＥタンパク質からの少なく
とも一つの融合タンパク質、ならび適切な添加剤および／また賦形剤を任意に含
む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）特異的腫瘍回避用または治療用医薬であ
って、この融合タンパク質がパピローマウイルス非特異的エピトープを含まない
ことを特徴とする上記医薬にある。
【００１３】 この発明の趣旨以内におけるパピローマウイルス非特異的エピトープとは、一
般的には外来タンパク質フラクションにより、転写後修飾により、またはパピロ
ーマウイルス特異的タンパク質の誤折畳みにより惹起される、融合タンパク質中
のエピトープを意味するものと理解される。
般的には外来タンパク質フラクションにより、転写後修飾により、またはパピロ
ーマウイルス特異的タンパク質の誤折畳みにより惹起される、融合タンパク質中
のエピトープを意味するものと理解される。
【００１４】 パピローマウイルス非特異的エピトープは、例えば、中和性抗体またはＣＴＬ
免疫応答が誘発されるにしても、非特異的抗体またはＣＴＬS または実際の活性
化合物の作用を損なう免疫学的副作用によりその免疫的作用が弱められるので、
パピローマウイルス特異的腫瘍が効果的に回避または制御され得ないという事実
に対する一つの理由である。
免疫応答が誘発されるにしても、非特異的抗体またはＣＴＬS または実際の活性
化合物の作用を損なう免疫学的副作用によりその免疫的作用が弱められるので、
パピローマウイルス特異的腫瘍が効果的に回避または制御され得ないという事実
に対する一つの理由である。
【００１５】 この発明における医薬は、良性または悪性腫瘍、具体的には例えばハイグレー
ドＣＩＮ（頚部上皮内癌）等の準備段階を包含する喉頭、頚部、陰茎、外陰また
は肛門の悪性腫瘍の回避または治療に好ましい効果がある。
ドＣＩＮ（頚部上皮内癌）等の準備段階を包含する喉頭、頚部、陰茎、外陰また
は肛門の悪性腫瘍の回避または治療に好ましい効果がある。
【００１６】 好ましいさらなる実施態様では、この発明における医薬は、Ｌタンパク質特に
Ｌ1 の存在が既に適切に免疫を増幅させるので、アジュバントすなわちパピロー
マウイルス特異的タンパク質の免疫を増幅させる物質をなんら含有しない。現在
では許認可当局により認可される唯一の免疫刺激性材料はアルミニウム塩である
ことから、この性質は医薬または診断薬としての認可に際しては殊の外有利であ
る。その上、アジュバントおよび／または他の賦形剤および添加剤の省略により
、好ましからぬ副作用が回避される。
Ｌ1 の存在が既に適切に免疫を増幅させるので、アジュバントすなわちパピロー
マウイルス特異的タンパク質の免疫を増幅させる物質をなんら含有しない。現在
では許認可当局により認可される唯一の免疫刺激性材料はアルミニウム塩である
ことから、この性質は医薬または診断薬としての認可に際しては殊の外有利であ
る。その上、アジュバントおよび／または他の賦形剤および添加剤の省略により
、好ましからぬ副作用が回避される。
【００１７】 既に記載のように、医薬としてのキヤプシッドまたはキヤプソマーの使用にお
けるさらに重要な問題点は、それらが溶解性に乏しいことである。したがって例
えばＨＰＶ−１６のキャプシドまたはキヤプソマーは凝集する傾向があり、これ
により溶解性が目立って低下する。ある場合にはキャプシドまたはキヤプソマー
の低い溶解性が収率を低減させるのみではなく、同時に医薬としての使用を複雑
化させる。
けるさらに重要な問題点は、それらが溶解性に乏しいことである。したがって例
えばＨＰＶ−１６のキャプシドまたはキヤプソマーは凝集する傾向があり、これ
により溶解性が目立って低下する。ある場合にはキャプシドまたはキヤプソマー
の低い溶解性が収率を低減させるのみではなく、同時に医薬としての使用を複雑
化させる。
【００１８】 したがってさらなる好ましい実施態様では、この発明における医薬は約０．３
から約４Ｍ、好ましくは約０．４から約３Ｍ、特に約０．５から２Ｍ、とりわけ
約１から約２Ｍで、ｐＨ約７．３から約７．４５好ましくは約７．４の塩を適切
な添加剤または賦形剤として含有する。
から約４Ｍ、好ましくは約０．４から約３Ｍ、特に約０．５から２Ｍ、とりわけ
約１から約２Ｍで、ｐＨ約７．３から約７．４５好ましくは約７．４の塩を適切
な添加剤または賦形剤として含有する。
【００１９】 この塩溶液の利点は、融合タンパク質が溶液中に残留または懸濁物として微細
に細分化されて存在することであり、一般的には融合タンパク質の約９０％を越
す量、特に約９５％を越す量が溶液中に残留し、かつ同時に、少なくとも約１２
時間は析出しないことである。この融合タンパク質は、最大５０００ｇの遠心分
離によってさえも顕著に析出され得ない。
に細分化されて存在することであり、一般的には融合タンパク質の約９０％を越
す量、特に約９５％を越す量が溶液中に残留し、かつ同時に、少なくとも約１２
時間は析出しないことである。この融合タンパク質は、最大５０００ｇの遠心分
離によってさえも顕著に析出され得ない。
【００２０】 この塩は一般的にはアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、好ましくはハ
ロゲン化物またはリン酸塩、具体的にはアルカリ金属ハロゲン化物、特にＮａＣ
ｌおよび／またはＫＣｌである。ＮａＣｌの使用は医薬用配合物の調製の場合に
特に好ましい。
ロゲン化物またはリン酸塩、具体的にはアルカリ金属ハロゲン化物、特にＮａＣ
ｌおよび／またはＫＣｌである。ＮａＣｌの使用は医薬用配合物の調製の場合に
特に好ましい。
【００２１】 この医薬のｐＨは、例えば燐酸塩緩衝剤、トリス緩衝剤［トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン］、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（［４−（２−ヒドロキシエチル）
ピペラジノ］エタンスルホン酸）またはＭＯＰ緩衝剤（３−モルホリノ−１−プ
ロパンスルホン酸）を好ましく使用する等の、適切な有機または無機緩衝剤を用
いて調整する。個々の緩衝剤の選択は一般的には所望緩衝剤のモル濃度に依存す
る。注射溶液または点滴溶液の場合はリン酸塩緩衝剤が適する。
メチル）アミノメタン］、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（［４−（２−ヒドロキシエチル）
ピペラジノ］エタンスルホン酸）またはＭＯＰ緩衝剤（３−モルホリノ−１−プ
ロパンスルホン酸）を好ましく使用する等の、適切な有機または無機緩衝剤を用
いて調整する。個々の緩衝剤の選択は一般的には所望緩衝剤のモル濃度に依存す
る。注射溶液または点滴溶液の場合はリン酸塩緩衝剤が適する。
【００２２】 この発明における医薬中のパピローマウイルス特異的タンパク質の安定性にさ
らに寄与する、好適な他の添加剤および／または賦形剤の例は、例えば「Triton
X-100」またはコール酸ナトリウム等の洗剤であるが、例えばポリエチレングリ
コールまたはグリセロール等のポリオール、例えばスクロースまたはグルコース
等の糖類、例えばグリシンまたは具体的にはタウリンまたはベタイン等のアミノ
酸のような双性イオン化合物、および／または例えばウシまたはヒト血清アルブ
ミン等のタンパク質も挙げられる。洗剤、ポリオールおよび／または双性イオン
化合物が好ましい。他の添加剤および／または賦形剤は、例えばアプロチニン、
ε−アミノカプロン酸またはペプスタチンＡ等のプロテアーゼ阻害剤である。免
疫学的副作用を誘発しない添加剤が好ましい。
らに寄与する、好適な他の添加剤および／または賦形剤の例は、例えば「Triton
X-100」またはコール酸ナトリウム等の洗剤であるが、例えばポリエチレングリ
コールまたはグリセロール等のポリオール、例えばスクロースまたはグルコース
等の糖類、例えばグリシンまたは具体的にはタウリンまたはベタイン等のアミノ
酸のような双性イオン化合物、および／または例えばウシまたはヒト血清アルブ
ミン等のタンパク質も挙げられる。洗剤、ポリオールおよび／または双性イオン
化合物が好ましい。他の添加剤および／または賦形剤は、例えばアプロチニン、
ε−アミノカプロン酸またはペプスタチンＡ等のプロテアーゼ阻害剤である。免
疫学的副作用を誘発しない添加剤が好ましい。
【００２３】 Ｌ1 ／Ｌ2 タンパク質およびＥタンパク質なる用語は、例えば欠失突然変異体
等の、等身大タンパク質およびそれらの突然変異体両方を意味するものとして、
この発明の趣旨以内で理解される。
等の、等身大タンパク質およびそれらの突然変異体両方を意味するものとして、
この発明の趣旨以内で理解される。
【００２４】 さらなる好ましい実施態様では、この発明における融合タンパク質は欠失Ｌタ
ンパク質好ましくは欠失Ｌ1 および任意にＬ2 タンパク質を含む。この欠失は、
特に活性な異種タンパク質例えばパピローマウイルス特異的Ｅタンパク質配列を
欠失領域中へ挿入し得る利点があり、これにより本発明における組成の応用領域
が拡大する。Ｃ末端欠失を有するＬタンパク質、具体的にはＣ末端欠失Ｌ1 タン
パク質は殊の外好ましい。Ｃ末端欠失は、Ｃ末端に位置する核位置信号が欠失す
るので、ウイルス様粒子形成効率を増強できる利点がある。したがってこのＣ末
端欠失は、好ましくは約３５アミノ酸まで、特に約２５から約３５アミノ酸、と
りわけ約３２から３４アミノ酸である。例えばアミノ酸長３２のＨＰＶ−１６Ｌ
1 のＣ末端欠失は、少なくとも約１０倍までウイルス様粒子形成を増強し得るの
で適切である。
ンパク質好ましくは欠失Ｌ1 および任意にＬ2 タンパク質を含む。この欠失は、
特に活性な異種タンパク質例えばパピローマウイルス特異的Ｅタンパク質配列を
欠失領域中へ挿入し得る利点があり、これにより本発明における組成の応用領域
が拡大する。Ｃ末端欠失を有するＬタンパク質、具体的にはＣ末端欠失Ｌ1 タン
パク質は殊の外好ましい。Ｃ末端欠失は、Ｃ末端に位置する核位置信号が欠失す
るので、ウイルス様粒子形成効率を増強できる利点がある。したがってこのＣ末
端欠失は、好ましくは約３５アミノ酸まで、特に約２５から約３５アミノ酸、と
りわけ約３２から３４アミノ酸である。例えばアミノ酸長３２のＨＰＶ−１６Ｌ
1 のＣ末端欠失は、少なくとも約１０倍までウイルス様粒子形成を増強し得るの
で適切である。
【００２５】 さらなる好ましい実施態様では、上記Ｅタンパク質特にＥ6 および／またはＥ
7 タンパク質も欠失される。Ｅ7 タンパク質のＣ末端部分好ましくはＥ7 タンパ
ク質のＣ末端部分が欠失される場合が特に好ましく、この場合、これらの構築体
は欠失Ｌタンパク質との組み合わせでキャプソマーおよび／またはキヤプシッド
を形成する。５５アミノ酸までの欠失が特に好ましく、好ましくは約５から約５
５アミノ酸、具体的には約３２から約４３アミノ酸の欠失が好ましい。
7 タンパク質も欠失される。Ｅ7 タンパク質のＣ末端部分好ましくはＥ7 タンパ
ク質のＣ末端部分が欠失される場合が特に好ましく、この場合、これらの構築体
は欠失Ｌタンパク質との組み合わせでキャプソマーおよび／またはキヤプシッド
を形成する。５５アミノ酸までの欠失が特に好ましく、好ましくは約５から約５
５アミノ酸、具体的には約３２から約４３アミノ酸の欠失が好ましい。
【００２６】 特に好ましい構築体は例えばＮ末端アミノ酸１から約６０を有するＥ7 であり
、この構築体はアミノ酸４９から５７の領域に位置する、細胞毒性Ｔリンパ細胞
の活性化のためのマウスエピトープを含有するからである。他の好ましい構築体
はＮ末端アミノ酸１から約５５を有するＥ7 であり、この構築体はキヤプシッド
形成を損ない得るＥ7 特異的配列をアミノ酸５６−７０領域中に含まないので、
欠失Ｌタンパク質との組み合わせでキヤプソマーおよびキヤプシッドを好ましく
形成する。３２アミノ酸によりＣ末端で欠失されたＨＰＶ−１６のＬ1 タンパク
質および、これがアミノ酸１−５５または１−６０を有するＨＰＶ−１６のＥ7
タンパク質と結合したものは特に好ましい。これらの構築体は中和性抗体または
特異的ＣＴＬ応答を誘発するのみでなく、一方では腫瘍形成を阻止し、他方では
既存の腫瘍の進行を動物実験では退化させる。特にアミノ酸１−６０を有するＥ
7 は、腫瘍中で顕著な予防的および治療的作用を特に発揮する。したがって、こ
の発明における特に好ましい実施態様はＬ1 ΔＥ7 1-X 融合タンパク質好ましく
はＣＶＬＰs 形態における具体的にはＨＰＶ１６の形態における融合タンパク質
であり（ｘは６０を包含する、５５から６０までの整数）、特にＬ1 ΔＥ7 1-55 またはＬ1 ΔＥ7 1-60融合タンパク質である。
、この構築体はアミノ酸４９から５７の領域に位置する、細胞毒性Ｔリンパ細胞
の活性化のためのマウスエピトープを含有するからである。他の好ましい構築体
はＮ末端アミノ酸１から約５５を有するＥ7 であり、この構築体はキヤプシッド
形成を損ない得るＥ7 特異的配列をアミノ酸５６−７０領域中に含まないので、
欠失Ｌタンパク質との組み合わせでキヤプソマーおよびキヤプシッドを好ましく
形成する。３２アミノ酸によりＣ末端で欠失されたＨＰＶ−１６のＬ1 タンパク
質および、これがアミノ酸１−５５または１−６０を有するＨＰＶ−１６のＥ7
タンパク質と結合したものは特に好ましい。これらの構築体は中和性抗体または
特異的ＣＴＬ応答を誘発するのみでなく、一方では腫瘍形成を阻止し、他方では
既存の腫瘍の進行を動物実験では退化させる。特にアミノ酸１−６０を有するＥ
7 は、腫瘍中で顕著な予防的および治療的作用を特に発揮する。したがって、こ
の発明における特に好ましい実施態様はＬ1 ΔＥ7 1-X 融合タンパク質好ましく
はＣＶＬＰs 形態における具体的にはＨＰＶ１６の形態における融合タンパク質
であり（ｘは６０を包含する、５５から６０までの整数）、特にＬ1 ΔＥ7 1-55 またはＬ1 ΔＥ7 1-60融合タンパク質である。
【００２７】 したがってこの発明は、一方ではＨＰＶ特異的腫瘍との関連で、他方では既存
ＨＰＶ特異的腫瘍を退化させる目的で、この発明における構築体を医薬生産の目
的で使用することにも関する。
ＨＰＶ特異的腫瘍を退化させる目的で、この発明における構築体を医薬生産の目
的で使用することにも関する。
【００２８】 予防用および治療用の両方で活性な医薬の調製の場合には、上記パピローマウ
イルス特異的融合タンパク質がキヤプシッドおよび／またはキヤプソマーの形態
で存在するのが好ましく、その理由はこのキヤプシッドおよび／またはキヤプソ
マーにより、具体的にはＬタンパク質のフラクションにより免疫反応が追加的に
顕著に増強されるからでる。したがってキヤプシッドおよび／またはキヤプソマ
ー形成に適する好ましい融合タンパク質は、例えば欠失Ｌ1 およびＥ7 、Ｅ6 お
よび／またはＥ1 からの融合タンパク質である。
イルス特異的融合タンパク質がキヤプシッドおよび／またはキヤプソマーの形態
で存在するのが好ましく、その理由はこのキヤプシッドおよび／またはキヤプソ
マーにより、具体的にはＬタンパク質のフラクションにより免疫反応が追加的に
顕著に増強されるからでる。したがってキヤプシッドおよび／またはキヤプソマ
ー形成に適する好ましい融合タンパク質は、例えば欠失Ｌ1 およびＥ7 、Ｅ6 お
よび／またはＥ1 からの融合タンパク質である。
【００２９】 この発明の趣旨以内でのキヤプシッドは、一般的には７２キヤプソマーから構
築される一般的正二十面体様形態におけるウイルスまたはウイルス様構造体であ
る。
築される一般的正二十面体様形態におけるウイルスまたはウイルス様構造体であ
る。
【００３０】 この発明の趣旨以内でのキヤプソマーは、少なくとも一種のパピローマウイル
ス構造タンパク質、好ましくはＬ1 またはＬ1 の欠失体を含む集合タンパク質で
ある。この発明における５種の融合タンパク質は、集合してキヤプソマーを与え
、このものは今度はキヤプシッドを与えるために集合し得る。
ス構造タンパク質、好ましくはＬ1 またはＬ1 の欠失体を含む集合タンパク質で
ある。この発明における５種の融合タンパク質は、集合してキヤプソマーを与え
、このものは今度はキヤプシッドを与えるために集合し得る。
【００３１】 ヒト用医薬生産の場合は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、好ましくはＨ
ＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ
−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５２およびＨＰ
Ｖ−５８、具体的にはＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１および／また
はＨＰＶ−４５のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のタンパク質またはペプチ
ドが上記構築体に適している。特に組み合わせワクチン生産の場合には、各種Ｈ
ＰＶ型からのタンパク質またはペプチドを組み合わせるのが有利であり、例えば
頚部様構造における悪性腫瘍の場合にはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８または
ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−４５およびＨＰＶ−４５の組み合わせ、
または例えばコンジロームの場合にはＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１の組み合わ
せが有利である。
ＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ
−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５２およびＨＰ
Ｖ−５８、具体的にはＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１および／また
はＨＰＶ−４５のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のタンパク質またはペプチ
ドが上記構築体に適している。特に組み合わせワクチン生産の場合には、各種Ｈ
ＰＶ型からのタンパク質またはペプチドを組み合わせるのが有利であり、例えば
頚部様構造における悪性腫瘍の場合にはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８または
ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−４５およびＨＰＶ−４５の組み合わせ、
または例えばコンジロームの場合にはＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１の組み合わ
せが有利である。
【００３２】 この発明のさらなる目的は、この発明における医薬の生産方法であり、この方
法では、上記融合タンパク質をコードする適切な発現ベクターを含む適切な細胞
を適切な条件下に培養し、発現生成物を単離し、適切な添加剤および／または賦
頚剤を任意に添加する。
法では、上記融合タンパク質をコードする適切な発現ベクターを含む適切な細胞
を適切な条件下に培養し、発現生成物を単離し、適切な添加剤および／または賦
頚剤を任意に添加する。
【００３３】 この発現ベクターは例えば原核または真核発現ベクターであってよい。原核発
現ベクターの例は、Ｅ．coli における発現の場合、例えばベクターｐＧＥＭま
たはｐＵＣ誘導体である（例えば、WO 96/11272 号公報参照）。真核発現ベクタ
ーの例は、Saccharomyces cerevisiae における発現の場合、例えばベクターｐ
４２６Ｍｅｔ２５またはｐ４２６ＧＡＬ1 であり（Mumberg らによる (1994) Nu
cl. Acids Res., 22, 5767-5768, Carter, J.J. らによる (1991) supra ）、ま
た昆虫細胞における発現の場合、例えば Baculovirus ベクター具体的には EP-
B1-0127839号または EP-B1-0549721号公報開示のような Autographa Californic
a ウイルスであり（例えば WO 94/20137号公報参照）、また哺乳類細胞における
発現の場合、例えばベクターＲｃ／ＣＭＶおよびＲｃ／ＲＳＶまたはＳＶ４０ベ
クターであり、これらはすべて一般的に取得可能である。しかしながら、Pharmi
ngen社製「Baculo Gold TM」トランスフエクション用具または Gibco BRL社製
「Bac-to-Bac TM 」Baculovirus 発現系等の、商業的に入手可能な Baculovirus
発現系もまた適当である。さらに適当な発現系は、組み換えワクシニア症ウイ
ルス（例えば、WO 93/02184 号公報参照）である。
現ベクターの例は、Ｅ．coli における発現の場合、例えばベクターｐＧＥＭま
たはｐＵＣ誘導体である（例えば、WO 96/11272 号公報参照）。真核発現ベクタ
ーの例は、Saccharomyces cerevisiae における発現の場合、例えばベクターｐ
４２６Ｍｅｔ２５またはｐ４２６ＧＡＬ1 であり（Mumberg らによる (1994) Nu
cl. Acids Res., 22, 5767-5768, Carter, J.J. らによる (1991) supra ）、ま
た昆虫細胞における発現の場合、例えば Baculovirus ベクター具体的には EP-
B1-0127839号または EP-B1-0549721号公報開示のような Autographa Californic
a ウイルスであり（例えば WO 94/20137号公報参照）、また哺乳類細胞における
発現の場合、例えばベクターＲｃ／ＣＭＶおよびＲｃ／ＲＳＶまたはＳＶ４０ベ
クターであり、これらはすべて一般的に取得可能である。しかしながら、Pharmi
ngen社製「Baculo Gold TM」トランスフエクション用具または Gibco BRL社製
「Bac-to-Bac TM 」Baculovirus 発現系等の、商業的に入手可能な Baculovirus
発現系もまた適当である。さらに適当な発現系は、組み換えワクシニア症ウイ
ルス（例えば、WO 93/02184 号公報参照）である。
【００３４】 一般的に、これらの発現ベクターは、 E. coliにおける発現のためのｔｒｐプ
ロモーター（例えば、EP-B1-0154133 号公報参照）、酵母における発現のための
ＡＤＨ２プロモーター［Russel らによる (1983), J. Biol.Chem. 258, 2674-2
682)］、昆虫細胞における発現のための Baculovirus 多面体プロモーター（例
えば、 EP-B1-0127839号または U.S. 5,004,687 号公報参照）または例えばＭＭ
ＴＶ［mouse mammary tumour uirus (マウス哺乳類腫瘍ウイルス）：Lee らによ
る (1981) Nature 214, 228-232 ］の初期ＳＶ４０プロモーターまたはＬＴＲプ
ロモーター等の、個々の宿主細胞に適するプロモーターもまた含む。
ロモーター（例えば、EP-B1-0154133 号公報参照）、酵母における発現のための
ＡＤＨ２プロモーター［Russel らによる (1983), J. Biol.Chem. 258, 2674-2
682)］、昆虫細胞における発現のための Baculovirus 多面体プロモーター（例
えば、 EP-B1-0127839号または U.S. 5,004,687 号公報参照）または例えばＭＭ
ＴＶ［mouse mammary tumour uirus (マウス哺乳類腫瘍ウイルス）：Lee らによ
る (1981) Nature 214, 228-232 ］の初期ＳＶ４０プロモーターまたはＬＴＲプ
ロモーター等の、個々の宿主細胞に適するプロモーターもまた含む。
【００３５】 適当な宿主細胞の例は、 E. coli 株ＤＨ５、ＨＢ１０１またはＢＬ2 １、酵
母株 Saccharomyces、Pichia、Kluyvermyces、Schizosaccharomyces または Han
senula(Carter, J.J. らによる (1991), Virology, 182, 513 ）、 例えば spod
optera frugiperda、Trichoplusia ni 、Rachiplusia ou または Galleria Mel
lonela からの昆虫細胞系 Lepidopteran 、または動物細胞ＣＯＳ、Ｃ１２７、 Ｖｅｒｏ、２９３およびＨｅｌａであり、これらは一般的に得られる（例えば、
WO 94/00152 号公報参照）。
母株 Saccharomyces、Pichia、Kluyvermyces、Schizosaccharomyces または Han
senula(Carter, J.J. らによる (1991), Virology, 182, 513 ）、 例えば spod
optera frugiperda、Trichoplusia ni 、Rachiplusia ou または Galleria Mel
lonela からの昆虫細胞系 Lepidopteran 、または動物細胞ＣＯＳ、Ｃ１２７、 Ｖｅｒｏ、２９３およびＨｅｌａであり、これらは一般的に得られる（例えば、
WO 94/00152 号公報参照）。
【００３６】 個々のパピローマウイルス特異的タンパク質に対するコード核酸は単離でき、
かつ、例えばＰＣＲ（polymerase chain reaction) 増幅手法により遺伝子バン
クからクローン化できる。例えば、ＢＰＶ−１のゲノムは GenBankアクセス番号
X02346 の下に、またはＨＰＶ−１６は GenBank アクセス番号 K02718 の下に
一般的に得られる。例えばWO 94/05792 号公報には、ＨＰＶ−１６Ｌ1 配列も開
示されている。９８アミノ酸長のＨＰＶ−１６Ｅ7 タンパク質の配列は、例えば
Seedorf らによる (1985) Virology, 145, 181-185 中に記載がある。所望す
る核酸を取得する他の方法は、ＰＣＲ手法によりパピローマウイルス特異的遺伝
子をいぼまたは腫瘍から直接単離することにある。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−
１８からのＥ6 およびＥ7 遺伝子に対する好適なプライマーは、例えば WO 93/2
1958 号公報中に開示がある。所望する核酸に対するさらなる引例は、例えば K
irnbaum, R. らによる (1994), supraであり、または上記ＥＭＢＬデータバンク
に寄託したクローン類である。
かつ、例えばＰＣＲ（polymerase chain reaction) 増幅手法により遺伝子バン
クからクローン化できる。例えば、ＢＰＶ−１のゲノムは GenBankアクセス番号
X02346 の下に、またはＨＰＶ−１６は GenBank アクセス番号 K02718 の下に
一般的に得られる。例えばWO 94/05792 号公報には、ＨＰＶ−１６Ｌ1 配列も開
示されている。９８アミノ酸長のＨＰＶ−１６Ｅ7 タンパク質の配列は、例えば
Seedorf らによる (1985) Virology, 145, 181-185 中に記載がある。所望す
る核酸を取得する他の方法は、ＰＣＲ手法によりパピローマウイルス特異的遺伝
子をいぼまたは腫瘍から直接単離することにある。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−
１８からのＥ6 およびＥ7 遺伝子に対する好適なプライマーは、例えば WO 93/2
1958 号公報中に開示がある。所望する核酸に対するさらなる引例は、例えば K
irnbaum, R. らによる (1994), supraであり、または上記ＥＭＢＬデータバンク
に寄託したクローン類である。
【００３７】 さらなる好ましい実施態様では、ベクターによりもたらされるさらなるアミノ
酸によって発現融合タンパク質が延長されない態様で発現ベクターが構築される
。このことは、例えば適切なプライマーオリゴヌクレオチド手法（Ho らによる
(1989) Gene, 77, 51-59) により、ＰＣＲ反応における突然変異誘発により追
加的アミノ酸をコードする望ましからぬヌクレオチドの除去により遂行される。
このようにして追加的アミノ酸を含まず、したがって免疫学的副反応の原因であ
る追加的外来エピトープの可能性が無い融合タンパク質が得られる。
酸によって発現融合タンパク質が延長されない態様で発現ベクターが構築される
。このことは、例えば適切なプライマーオリゴヌクレオチド手法（Ho らによる
(1989) Gene, 77, 51-59) により、ＰＣＲ反応における突然変異誘発により追
加的アミノ酸をコードする望ましからぬヌクレオチドの除去により遂行される。
このようにして追加的アミノ酸を含まず、したがって免疫学的副反応の原因であ
る追加的外来エピトープの可能性が無い融合タンパク質が得られる。
【００３８】 上記融合タンパク質の発現後、これをさらに精製または復元するのが好ましい
。クロマログラフイーによる精製方法の例は、Hjorth, R. & Moreno-Lopez, L.
(1982) J. Virol. Meth. 5, 151; Nakai, Y. らによる (1987) J. Gen. Virol.
, 68, 1891; Hofmann, K. J. らによる (1995) Virology, 209, 506; Rose, R.
C. らによる (1993) J. Virol., 67, 1936; Sasagawa, T. らによる (1995) Vi
rology, 206, 126 または WO 95/31532 号公報中に見られる。
。クロマログラフイーによる精製方法の例は、Hjorth, R. & Moreno-Lopez, L.
(1982) J. Virol. Meth. 5, 151; Nakai, Y. らによる (1987) J. Gen. Virol.
, 68, 1891; Hofmann, K. J. らによる (1995) Virology, 209, 506; Rose, R.
C. らによる (1993) J. Virol., 67, 1936; Sasagawa, T. らによる (1995) Vi
rology, 206, 126 または WO 95/31532 号公報中に見られる。
【００３９】 一般的にこの医薬は、例えば皮下、筋肉内または粘膜経由等の経口的、非経口
的に、液状または懸濁状、エリキシル形状またはカプセル形状で、好ましくは注
射溶液または点滴溶液として投与できる。この発明における調合物の場合には、
特に有利なアジュバントを一緒に分散できる。
的に、液状または懸濁状、エリキシル形状またはカプセル形状で、好ましくは注
射溶液または点滴溶液として投与できる。この発明における調合物の場合には、
特に有利なアジュバントを一緒に分散できる。
【００４０】 したがってこの発明のさらなる目的は、注射溶液または点滴溶液としての、こ
の発明における調合物の使用に関する。
の発明における調合物の使用に関する。
【００４１】 注射溶液は、例えば約１から約２０ｍｌの比較的小量の溶液または懸濁物を身
体に投与する際に一般的には使用される。点滴溶液は、例えば１リットリまたは
それを越す量の大量の溶液または懸濁物を投与する場合に一般的には使用する。
点滴溶液とは対照的に注射溶液の場合には僅か数ミリリットルが投与されるので
、注射における血液または組織流体のｐＨおよび浸透圧からの微妙な差異は、痛
みに関してはそれ自体が感知できないか、または微々たる程度でのみ感知し得る
程度である。したがって、この発明における配合物の使用前希釈は、一般的には
必要がない。しかし、比較的大量投与の場合には、この発明における配合物は、
少なくとも等浸透圧溶液が得られるような態様で投与直前に希釈すべきである。
等浸透圧溶液の例は０．９％強度塩化ナトリウム溶液である。点滴の場合は、例
えば滅菌水を用いて希釈を行うことができ、一方、投与は例えば所謂バイパスを
介して実施できる。
体に投与する際に一般的には使用される。点滴溶液は、例えば１リットリまたは
それを越す量の大量の溶液または懸濁物を投与する場合に一般的には使用する。
点滴溶液とは対照的に注射溶液の場合には僅か数ミリリットルが投与されるので
、注射における血液または組織流体のｐＨおよび浸透圧からの微妙な差異は、痛
みに関してはそれ自体が感知できないか、または微々たる程度でのみ感知し得る
程度である。したがって、この発明における配合物の使用前希釈は、一般的には
必要がない。しかし、比較的大量投与の場合には、この発明における配合物は、
少なくとも等浸透圧溶液が得られるような態様で投与直前に希釈すべきである。
等浸透圧溶液の例は０．９％強度塩化ナトリウム溶液である。点滴の場合は、例
えば滅菌水を用いて希釈を行うことができ、一方、投与は例えば所謂バイパスを
介して実施できる。
【００４２】 図面および次の実施例は発明のさらに詳細な説明を目的とし、範囲の制限を意
図するものではない。
図するものではない。
【００４３】 図１は、１μｇのＬ1 Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS を用いた免疫化後に生じたＥ7 特異
的ＣＴＬ応答を示す。Ｌ1 Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS （黒記号）およびＨＢＭ緩衝剤（
白記号）で免疫化したマウスの単離脾臓細胞を放射ＲＭＡ−Ｅ7 細胞で in vitr
o で一度刺激し、標準４時間51Ｃｒ放出細胞毒性試験における５日後に次の標的
細胞を採用して試験した：ＲＭＡ−Ｅ7 細胞（四角）、Ｅ7 49-57 ペプチド負荷
ＲＭＡ細胞（三角）およびＲＭＡ細胞（丸）。結果を比溶菌（％）として示す。
的ＣＴＬ応答を示す。Ｌ1 Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS （黒記号）およびＨＢＭ緩衝剤（
白記号）で免疫化したマウスの単離脾臓細胞を放射ＲＭＡ−Ｅ7 細胞で in vitr
o で一度刺激し、標準４時間51Ｃｒ放出細胞毒性試験における５日後に次の標的
細胞を採用して試験した：ＲＭＡ−Ｅ7 細胞（四角）、Ｅ7 49-57 ペプチド負荷
ＲＭＡ細胞（三角）およびＲＭＡ細胞（丸）。結果を比溶菌（％）として示す。
【００４４】 図２は、２０μｇのＬ1 Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS を用いたＣ57ＢＬ／６マウスのワ
クチン化および in vitro でのＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタントを用いた３回
の刺激後に得られたＥ7 特異的ＣＴＬ系を用いて実施した滴定試験の結果を示す
。ペプチド濃度は１００ｐｇから１μｇ／ｍｌであった。使用標的細胞は51Ｃｒ
標識されたＥ7 49-57 ペプチド負荷ＲＭＡ細胞であった。細胞：標的細胞の比率
は３０：１であった。
クチン化および in vitro でのＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタントを用いた３回
の刺激後に得られたＥ7 特異的ＣＴＬ系を用いて実施した滴定試験の結果を示す
。ペプチド濃度は１００ｐｇから１μｇ／ｍｌであった。使用標的細胞は51Ｃｒ
標識されたＥ7 49-57 ペプチド負荷ＲＭＡ細胞であった。細胞：標的細胞の比率
は３０：１であった。
【００４５】 図３は、ＴＣ−１腫瘍細胞の成長からのＣ57ＢＬ／６マウスの保護を示す。１
０μｇのＬ1 Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS （三角）、１０μｇのＬ1 ΔＣＶＬＰs （丸）
またはＨＢＳ緩衝剤（四角）のいずれかを用いてマウス（群当たり５匹）を免疫
化（s.ｃ.）した。２週間後、マウス当たり６×１０4 ＴＣ−１腫瘍細胞をマウ ス（s.ｃ.）の左横腹中に接種した。１週２回、このマウスを検査した。
０μｇのＬ1 Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS （三角）、１０μｇのＬ1 ΔＣＶＬＰs （丸）
またはＨＢＳ緩衝剤（四角）のいずれかを用いてマウス（群当たり５匹）を免疫
化（s.ｃ.）した。２週間後、マウス当たり６×１０4 ＴＣ−１腫瘍細胞をマウ ス（s.ｃ.）の左横腹中に接種した。１週２回、このマウスを検査した。
【００４６】 図４は、Ｌ1 Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS によるＴＧ−１腫瘍の成長阻止を示す。マウ
ス当たり６×１０4 ＴＣ−１腫瘍細胞をＣ57ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）の
左横腹中に接種した。２週間後、１０μｇのＬ1 Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS （三角）、
１０μｇのＬ1 ΔＣＶＬＰS （丸）またはＨＢＳ緩衝剤（四角）の s.c. 注射を
用いてこれらのマウスを免疫化した。
ス当たり６×１０4 ＴＣ−１腫瘍細胞をＣ57ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）の
左横腹中に接種した。２週間後、１０μｇのＬ1 Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS （三角）、
１０μｇのＬ1 ΔＣＶＬＰS （丸）またはＨＢＳ緩衝剤（四角）の s.c. 注射を
用いてこれらのマウスを免疫化した。
【００４７】
【実施例】１．ＨＰＶ１６Ｌ1 Ｅ7 融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子の調製 ＨＰＶ−１６Ｌ1 オープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）を制限エンドヌク
レアーゼＢｇ1 ＩＩを用いてプラスミドＨＰＶ−１６−114/k −Ｌ1 ／Ｌ2 -pＳ
ｙｎｘｔＶＴ- （Kirnbauser, R. らによる（1994）J. Virol. 67, 6929）から
切除し、ベクターｐＵＣ19（New England Biolabs) 中でＢａｍＨＩサイト中に
クローン化した。
レアーゼＢｇ1 ＩＩを用いてプラスミドＨＰＶ−１６−114/k −Ｌ1 ／Ｌ2 -pＳ
ｙｎｘｔＶＴ- （Kirnbauser, R. らによる（1994）J. Virol. 67, 6929）から
切除し、ベクターｐＵＣ19（New England Biolabs) 中でＢａｍＨＩサイト中に
クローン化した。
【００４８】 ＨＰＶ−１６Ｌ1 ΔＣの調製のために、ＨＰＶ−１６Ｌ1 ＯＲＦに相補の二つ
のプライマーを構築した。最初のプライマーは次の配列： AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC を有し、第２プライマーは次の配列： AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG を有した。
のプライマーを構築した。最初のプライマーは次の配列： AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC を有し、第２プライマーは次の配列： AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG を有した。
【００４９】 両方のプライマーはＥcoＲＶ制限酵素切断サイト５’をコードする。下流に位
置するプライマーでは、ＨＰＶ１６Ｌ1 ＯＲＦの最後の３４アミノ酸を欠失する
目的でＴＡＡ翻訳停止コドンがＥcoＲＶに続く。全Ｌ1 ＯＲＦおよび全ベクター
を増幅する目的でＰＣＲ反応を実施した。この直鎖生成物をＥcoＲＶで切断し、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼで環化し、 E. coli ＤＨ5 α細胞をトランスフオームさせ
た。ＥcoＲＶサイトの存在に関して、このクローンを分析した。得られたｐＵＣ
ＨＰＶ１６Ｌ1 ΔＣ構築体を、ＨＰＶ16Ｅ7 1-50のＯＲＦのＥcoＲＶサイトへの
クローン化の目的で用いた。
置するプライマーでは、ＨＰＶ１６Ｌ1 ＯＲＦの最後の３４アミノ酸を欠失する
目的でＴＡＡ翻訳停止コドンがＥcoＲＶに続く。全Ｌ1 ＯＲＦおよび全ベクター
を増幅する目的でＰＣＲ反応を実施した。この直鎖生成物をＥcoＲＶで切断し、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼで環化し、 E. coli ＤＨ5 α細胞をトランスフオームさせ
た。ＥcoＲＶサイトの存在に関して、このクローンを分析した。得られたｐＵＣ
ＨＰＶ１６Ｌ1 ΔＣ構築体を、ＨＰＶ16Ｅ7 1-50のＯＲＦのＥcoＲＶサイトへの
クローン化の目的で用いた。
【００５０】 このフラグメントのクローン化のために、５’ＥcoＲＶ制限酵素切断サイトを
有するプライマーを使用した。次のプライマー対を用いた： AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC および TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC このＰＣＲ生成物をＥcoＲＶを用いて切断し，修飾Ｌ1 遺伝子のＥcoＲＶサイ
トへ挿入した。
有するプライマーを使用した。次のプライマー対を用いた： AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC および TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC このＰＣＲ生成物をＥcoＲＶを用いて切断し，修飾Ｌ1 遺伝子のＥcoＲＶサイ
トへ挿入した。
【００５１】 ＥcoＲＶサイトの除去にために、クローンｐＵＣ−ＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣＥ7 1-50 の二つの重複フラグメントを増幅する目的で二つのＰＣＲ反応を実施した。生成
ＤＮＡフラグメントはＬ1 ／Ｅ7 境界の位置で重複した（四つのプライマーＰＣ
Ｒ、Ho, S.N. らの (1989） Gene 77, 51）。しかし、これらのプライマーは二
つのＥcoＲＶ制限酵素切断サイトを含まなかった。フラグメント１はプライマー
Ｐ１およびＰ２を用いて調製し、フラグメント２はプライマーＰ３およびＰ４を
用いて調製した。 Ｐ１：GTTATGACATACATACATTCTATG (Ｌ1 ） Ｐ２：CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC （Ｅ7 ） Ｐ３：CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC （Ｅ7 ） Ｐ４：CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG（Ｅ7 ）
ＤＮＡフラグメントはＬ1 ／Ｅ7 境界の位置で重複した（四つのプライマーＰＣ
Ｒ、Ho, S.N. らの (1989） Gene 77, 51）。しかし、これらのプライマーは二
つのＥcoＲＶ制限酵素切断サイトを含まなかった。フラグメント１はプライマー
Ｐ１およびＰ２を用いて調製し、フラグメント２はプライマーＰ３およびＰ４を
用いて調製した。 Ｐ１：GTTATGACATACATACATTCTATG (Ｌ1 ） Ｐ２：CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC （Ｅ7 ） Ｐ３：CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC （Ｅ7 ） Ｐ４：CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG（Ｅ7 ）
【００５２】 精製生成物の１／１０を混合し、プライマーＰ1 およびＰ4 のみを用いたＰＣ
Ｒ反応のマトリックスとして用いた。ＥcoＮＩ（Ｌ1 ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（
プライマーＰ4 上の停止コドンの下流）を用いて生成物を切断し、クローン化Ｈ
ＰＶ16Ｌ1 ＯＲＦのＥcoＮＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを置換基する目的で
これを使用した。したがって、生成したクローンは、ふたつの内部ＥcoＲＶ制限
酵素切断サイトの消失、ならびにＬ1 ＯＲＦおよびＥ7 間の対応非ＨＰＶアミノ
酸ＡｓｐとＩｌｅおよびＥ7 の下流の消失によりクローンＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣＥ7 1-50 とは異なっている。最初のＥcoＲＶサイトは、この位置（ＡｌａＧｌｙ）で
本来のＬ1 アミノ酸で置換した。第２のＥｃｏＲＶサイトは翻訳停止信号により
置換した。このクローン（ＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ7 1-52）はＨＰＶ16Ｅ7 の最初
の５２アミノ酸を追加的に含んでなる。クローンＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ7 1-52は
、Ｐ5 、Ｐ6 およびＰ7 との組み合わせにおけるプライマーＰ1 の手助けでクロ
ーンＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ7 1-55、1-60および1-65の調製用に使用した。 Ｐ５：CATCTGAAGCTTATCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG (Ｅ7 1-55） Ｐ６：CATCTGAAGCTTACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG（Ｅ7 1-60） Ｐ７：CATCTGAAGCTTAAAGCGTAGAGTCACACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGT
CCG （Ｅ7 1-65）
Ｒ反応のマトリックスとして用いた。ＥcoＮＩ（Ｌ1 ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（
プライマーＰ4 上の停止コドンの下流）を用いて生成物を切断し、クローン化Ｈ
ＰＶ16Ｌ1 ＯＲＦのＥcoＮＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを置換基する目的で
これを使用した。したがって、生成したクローンは、ふたつの内部ＥcoＲＶ制限
酵素切断サイトの消失、ならびにＬ1 ＯＲＦおよびＥ7 間の対応非ＨＰＶアミノ
酸ＡｓｐとＩｌｅおよびＥ7 の下流の消失によりクローンＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣＥ7 1-50 とは異なっている。最初のＥcoＲＶサイトは、この位置（ＡｌａＧｌｙ）で
本来のＬ1 アミノ酸で置換した。第２のＥｃｏＲＶサイトは翻訳停止信号により
置換した。このクローン（ＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ7 1-52）はＨＰＶ16Ｅ7 の最初
の５２アミノ酸を追加的に含んでなる。クローンＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ7 1-52は
、Ｐ5 、Ｐ6 およびＰ7 との組み合わせにおけるプライマーＰ1 の手助けでクロ
ーンＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ7 1-55、1-60および1-65の調製用に使用した。 Ｐ５：CATCTGAAGCTTATCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG (Ｅ7 1-55） Ｐ６：CATCTGAAGCTTACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG（Ｅ7 1-60） Ｐ７：CATCTGAAGCTTAAAGCGTAGAGTCACACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGT
CCG （Ｅ7 1-65）
【００５３】 ＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ7 1-70をクローンＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ7 1-65およびプ
ライマーＰ1 およびＰ8 を用いて調製した。 Ｐ８： CATCTGAAGCTTATTGTACGCACAACCGAAGCGTAGAGTCACACTTG
ライマーＰ1 およびＰ8 を用いて調製した。 Ｐ８： CATCTGAAGCTTATTGTACGCACAACCGAAGCGTAGAGTCACACTTG
【００５４】 全ての場合、対応フラグメントを置換する目的でＥcoＮＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉを使用した。このクローンはＤＮＡ配列決定により解析した。
Ｉを使用した。このクローンはＤＮＡ配列決定により解析した。
【００５５】２．組み換え Baculovirus の調製 Spodoptera frugiperda (Sf9）を、単層として、または１０％胎児子牛血清お
よび２ｍＭグルタミンを用いたＴＮＭ−ＦＨ昆虫媒体（Sigma, Deisenhofen）で
の懸濁培養中で使用した。組み換え baculovirus ＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣＥ7 1-X を
、１０μｇの組み換えプラスミドおよび２μｇの直鎖化 Baculo-Gold ＤＮＡ（
Pharmingen, San Diego, CA)のコントラフエクションによりSf9 細胞中にトラン
スフエクトさせた。組み換えウイルスはメーカー指示に従って精製した。発現試
験の目的で、１０6Sf9 細胞を組み換え Baculovirus および５から１０のｍ．
ｏ．ｉ．（multiplicity of infection ；感染多重度）で感染させた。保温後、
培地を除き、ＰＢＳ（140mM NaCl、 2.7mM Kcl [sic]、8.1mM Na2PO4、1.5mM KH 2 PO4、pH 7.2）で洗浄した。次いで細胞をＳＤＳ試料緩衝剤中に溶菌し、ＳＤＳ
ゲルクロマトグラフイーおよび免疫アッセイにより試験した。
よび２ｍＭグルタミンを用いたＴＮＭ−ＦＨ昆虫媒体（Sigma, Deisenhofen）で
の懸濁培養中で使用した。組み換え baculovirus ＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣＥ7 1-X を
、１０μｇの組み換えプラスミドおよび２μｇの直鎖化 Baculo-Gold ＤＮＡ（
Pharmingen, San Diego, CA)のコントラフエクションによりSf9 細胞中にトラン
スフエクトさせた。組み換えウイルスはメーカー指示に従って精製した。発現試
験の目的で、１０6Sf9 細胞を組み換え Baculovirus および５から１０のｍ．
ｏ．ｉ．（multiplicity of infection ；感染多重度）で感染させた。保温後、
培地を除き、ＰＢＳ（140mM NaCl、 2.7mM Kcl [sic]、8.1mM Na2PO4、1.5mM KH 2 PO4、pH 7.2）で洗浄した。次いで細胞をＳＤＳ試料緩衝剤中に溶菌し、ＳＤＳ
ゲルクロマトグラフイーおよび免疫アッセイにより試験した。
【００５６】３．ウイルス様粒子の精製 ＣＶＬＰS 調製のために、Trichoplusia ni (TN) High Five 細胞を Ex-Cell
405 無血清培地(JRH, Biosciences, Lennexa, KS) 中でｍｌ当たりの密度１−
１．５×１０6 細胞／ｍｌまで２７℃で培養した。４００ｍｌ培地を収穫し、周
期的反転下に１時間、組み換え baculovirus を用いてm.o.i.２から５で感染さ
せた。培地２４０ｍｌまでを添加し、３−４日間細胞を培養した。次いで細胞を
ペレット化し、抽出緩衝液（10mM Mg Cl2 、1-50mM Ca Cl2 、150mM NaCl、20mM
Hepes、0.01% Triton (任意）、pH 7.4）１０ｍｌ中に再懸濁し、６０ワットで
４５秒間超音波処理した。Sorvall SS34 ローター を用いた 10,000 rpm での
遠心分離後、ペレットを６ｍｌの抽出緩衝液中に溶解し，６０ワットで３０秒間
超音波処理し、再度遠心分離した。上澄み液を併合し、４０％ (w/V) スクロー
スおよび５７．５％（W/V ）ＣｓＣｌの２段勾配に処した。27,000 rpmのＳＷ−
２８ローター中での遠心分離後、中間層およびＣｓＣｌ層を採取し、ＣｓＣｌ密
度１．３８ｇ／ｍｌに調整し、45,000 rpmで１６時間遠心分離した。この勾配体
を分画し、各フラクションをアンチＨＰＶ16Ｌ1 ｍＡｂ Camvirl(Pharningen, S
an Diego, CA) によるウエスターンプロットにより試験した。反応性フラクショ
ンを併合し、Centricon 30 ミクロ濃縮器（Amicon Corp. Beverly, MA ）を使 用する限界濾過手段により Hepes 緩衝液（1mM Hepes 、 149mM NaCl 、 0.5mM
KCl、 pH 7.2 ）に対して透析し、透過電子顕微鏡手法によりＣＶＬＰs の存在
を確認した。Ｌ1 Ｅ7 タンパク質の濃度は、クーマシーブルーで汚染したＳＤＳ
ゲル中で標準ＢＳＡと比較することにより、ざっと決定した。
405 無血清培地(JRH, Biosciences, Lennexa, KS) 中でｍｌ当たりの密度１−
１．５×１０6 細胞／ｍｌまで２７℃で培養した。４００ｍｌ培地を収穫し、周
期的反転下に１時間、組み換え baculovirus を用いてm.o.i.２から５で感染さ
せた。培地２４０ｍｌまでを添加し、３−４日間細胞を培養した。次いで細胞を
ペレット化し、抽出緩衝液（10mM Mg Cl2 、1-50mM Ca Cl2 、150mM NaCl、20mM
Hepes、0.01% Triton (任意）、pH 7.4）１０ｍｌ中に再懸濁し、６０ワットで
４５秒間超音波処理した。Sorvall SS34 ローター を用いた 10,000 rpm での
遠心分離後、ペレットを６ｍｌの抽出緩衝液中に溶解し，６０ワットで３０秒間
超音波処理し、再度遠心分離した。上澄み液を併合し、４０％ (w/V) スクロー
スおよび５７．５％（W/V ）ＣｓＣｌの２段勾配に処した。27,000 rpmのＳＷ−
２８ローター中での遠心分離後、中間層およびＣｓＣｌ層を採取し、ＣｓＣｌ密
度１．３８ｇ／ｍｌに調整し、45,000 rpmで１６時間遠心分離した。この勾配体
を分画し、各フラクションをアンチＨＰＶ16Ｌ1 ｍＡｂ Camvirl(Pharningen, S
an Diego, CA) によるウエスターンプロットにより試験した。反応性フラクショ
ンを併合し、Centricon 30 ミクロ濃縮器（Amicon Corp. Beverly, MA ）を使 用する限界濾過手段により Hepes 緩衝液（1mM Hepes 、 149mM NaCl 、 0.5mM
KCl、 pH 7.2 ）に対して透析し、透過電子顕微鏡手法によりＣＶＬＰs の存在
を確認した。Ｌ1 Ｅ7 タンパク質の濃度は、クーマシーブルーで汚染したＳＤＳ
ゲル中で標準ＢＳＡと比較することにより、ざっと決定した。
【００５７】４．マウス細胞の培養 Ｃ57ＢＬ／6 由来マウス細胞ＴＣ−1 はＣ57ＢＬ／6 マウスの一次肺上皮細胞
であり、これらは腫瘍遺伝子ＨＰＶ−16Ｅ6 およびＥ7 ならびにｃ−Ｈａ−ｒａ
ｓ（Lon, K.-Y. (1996), supra）によるトランスフエクションによりトランスフ
オームされている。ＲＭＡ（Lijungrenn & Karre (1985) J. Exp. Med., 162, 1
745-1757) および処理用欠失細胞系ＲＭＡ−ＳはＣ57ＢＬ／6 胸腺細胞である。
ＨＰＶ−16Ｅ7 トランスフエクト化ＲＭＡ−Ｅ7 は Speidel, K.らによる（1997
) Eur. J. Immunol., 27 (9),2391-2399中に記載がある。全ての細胞は、１０％
ＦＣＳ、２−ＭＥ、Ｌ−グルタミンおよび抗性物質で補足されたＲＰＭ1 −1640
中で培養した。０．８ｍｇ／ｍｌのＧ 418 (Gibco ＢＲＬ，Gaithersburg, MD)
をＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタントの培養のために添加した。ＴＣ−1 細胞は
、０．４ｍｇ／ｍｌのＧ418 、０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンおよび１ｍ
Ｍのピルビン酸ナトリウムの存在下にさらに成長させた。
であり、これらは腫瘍遺伝子ＨＰＶ−16Ｅ6 およびＥ7 ならびにｃ−Ｈａ−ｒａ
ｓ（Lon, K.-Y. (1996), supra）によるトランスフエクションによりトランスフ
オームされている。ＲＭＡ（Lijungrenn & Karre (1985) J. Exp. Med., 162, 1
745-1757) および処理用欠失細胞系ＲＭＡ−ＳはＣ57ＢＬ／6 胸腺細胞である。
ＨＰＶ−16Ｅ7 トランスフエクト化ＲＭＡ−Ｅ7 は Speidel, K.らによる（1997
) Eur. J. Immunol., 27 (9),2391-2399中に記載がある。全ての細胞は、１０％
ＦＣＳ、２−ＭＥ、Ｌ−グルタミンおよび抗性物質で補足されたＲＰＭ1 −1640
中で培養した。０．８ｍｇ／ｍｌのＧ 418 (Gibco ＢＲＬ，Gaithersburg, MD)
をＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタントの培養のために添加した。ＴＣ−1 細胞は
、０．４ｍｇ／ｍｌのＧ418 、０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンおよび１ｍ
Ｍのピルビン酸ナトリウムの存在下にさらに成長させた。
【００５８】５．Ｔ−細胞（ＣＴＬ）系の調製 免疫化後１０−１４日で、脾臓細胞を調製した：２−４×１０7 脾臓細胞を１
０5 放射（２００ＧＹ）同一遺伝子型ＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタント／ｍｌ
を用いて共培養した。５日後、最初の 51 Ｃｒ放出細胞毒性試験を実施っした。
ＣＴＬ系の生産のために、この脾臓細胞を２４穴プレート中で穴当たり２×１０ 5 放射ＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタントを刺激細胞として、および穴当たり５
×１０6 放射（３３Ｇｙ）Ｃ57ＢＬ／6 脾臓細胞を指示細胞として用いて１週に
１度再刺激した。
０5 放射（２００ＧＹ）同一遺伝子型ＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタント／ｍｌ
を用いて共培養した。５日後、最初の 51 Ｃｒ放出細胞毒性試験を実施っした。
ＣＴＬ系の生産のために、この脾臓細胞を２４穴プレート中で穴当たり２×１０ 5 放射ＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタントを刺激細胞として、および穴当たり５
×１０6 放射（３３Ｇｙ）Ｃ57ＢＬ／6 脾臓細胞を指示細胞として用いて１週に
１度再刺激した。
【００５９】６．51Ｃｒ放出細胞毒 性試験 51Ｃｒ放出細胞毒試験の目的でエフエクタ−Ｔ細胞を、異なったエフエクター
細胞を有する９６穴プレート上で１×１０4 51Ｃｒラベル標的細胞／穴に標的
細胞比（Ｅ：Ｔ）で添加した。この標的細胞をＮａ2 51 ＣｒＯ4 （１００μＣｉ
／２×１０6 細胞）を用いて３７℃で１時間ラベル化した。配列ＲＡＨＹＮＩＶ
ＴＦ（ＨＰＶ−16Ｅ7 のアミノ酸４９−５７；Feltkamp, M.C.W.らの (1993），
Eur. J. Immunol., 23, 2242-2249) を有するこのペプチドを上記保温中に濃度
５０μＭで添加した。一定Ｅ：Ｔ比を用いたペプチド滴定試験において、この51 Ｃｒラベル標的細胞を低減ペプチド濃度（１μｇ−１００ｐｇ／ｍｌ）を用いて
エフエクター細胞の添加に先立ち３７℃で１時間培養した。３７℃で４時間保温
後、穴当たり上澄み液５０μｌを Luma プレート（Packard)に移して乾燥した。
この放射能をβカウンター（Trilux Microbeta, Wallac) 中で測定した。次式に
従って平均比溶菌（％）を計算した：％比溶菌＝（実験放出−自然放出）（完全
放出−自然放出）×１００
細胞を有する９６穴プレート上で１×１０4 51Ｃｒラベル標的細胞／穴に標的
細胞比（Ｅ：Ｔ）で添加した。この標的細胞をＮａ2 51 ＣｒＯ4 （１００μＣｉ
／２×１０6 細胞）を用いて３７℃で１時間ラベル化した。配列ＲＡＨＹＮＩＶ
ＴＦ（ＨＰＶ−16Ｅ7 のアミノ酸４９−５７；Feltkamp, M.C.W.らの (1993），
Eur. J. Immunol., 23, 2242-2249) を有するこのペプチドを上記保温中に濃度
５０μＭで添加した。一定Ｅ：Ｔ比を用いたペプチド滴定試験において、この51 Ｃｒラベル標的細胞を低減ペプチド濃度（１μｇ−１００ｐｇ／ｍｌ）を用いて
エフエクター細胞の添加に先立ち３７℃で１時間培養した。３７℃で４時間保温
後、穴当たり上澄み液５０μｌを Luma プレート（Packard)に移して乾燥した。
この放射能をβカウンター（Trilux Microbeta, Wallac) 中で測定した。次式に
従って平均比溶菌（％）を計算した：％比溶菌＝（実験放出−自然放出）（完全
放出−自然放出）×１００
【００６０】７．ＣＶＬＰS によるＥ7 特異的細胞毒性Ｔリンパ細胞の誘発 生後６から１６週の雌Ｃ57ＢＬ／6 マウス１１匹を、ＣＶＬＰS １−２０μｇ
を用いて単純 s.c. 注射手法で無アジュバントで免疫化した。２週後、脾臓細胞
を調製し、in vitro で刺激細胞としてＣ57ＢＬ／6 由来腫瘍細胞系ＲＭＡ（Ｒ
ＭＡ−Ｅ7 ）のＨＰＶ−16Ｅ7 発現トランフエクタントを用いて刺激した。５日
間培養後、最初の細胞毒性試験を実施した。
を用いて単純 s.c. 注射手法で無アジュバントで免疫化した。２週後、脾臓細胞
を調製し、in vitro で刺激細胞としてＣ57ＢＬ／6 由来腫瘍細胞系ＲＭＡ（Ｒ
ＭＡ−Ｅ7 ）のＨＰＶ−16Ｅ7 発現トランフエクタントを用いて刺激した。５日
間培養後、最初の細胞毒性試験を実施した。
【００６１】 脾臓細胞の刺激を１週間間隔で繰り返した。図１に示すように、１μｇのＬ1
ΔＣＥ7 1-60ＣＶＬＬＰS すなわちＨＰＶ−16Ｌ1 のカルボキシ末端３４アミノ
酸での免疫化をＨＰＶ−16Ｅ7 のアミノ酸 1-60 で置き換えたところ、強いＥ7
特異的ＣＴＬ応答を引き起こした。
ΔＣＥ7 1-60ＣＶＬＬＰS すなわちＨＰＶ−16Ｌ1 のカルボキシ末端３４アミノ
酸での免疫化をＨＰＶ−16Ｅ7 のアミノ酸 1-60 で置き換えたところ、強いＥ7
特異的ＣＴＬ応答を引き起こした。
【００６２】 全体で５日間後、７．７％から５４．７％（平均値３３．６％；Ｅ：Ｔ比８：
１から３３：１）の、ＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタントの比溶菌が観察された
。第２刺激後の平均溶菌は３５．８＆から５７．８％（平均値４５．３％；Ｅ：
Ｔ比８：１から４４：１）であった。マウスを１μｇのＬ1 ΔＣＥ7 1-60ＣＶＬ
ＰS のみで免疫化すると、平均で５日間の培養時間後、５μｇ（１７．２から４
４．７％；平均値３３．９％）または２０μｇ（２６．０から５４．７％；平均
値３８．５％）を用いた免疫化後よりも一層低いＥ7 特異的ＣＴＬS の反応性が
観察された（７．７から４９．５％；平均値２８．５％）。対照マウスの脾臓細
胞（ＨＢＳ緩衝液でワクチン化した）は、５日後でもＥ7 特異的反応性をなんら
の示さなかった（０．３−８．９％、平均値３．４％、Ｅ：Ｔ比４：１−９：１
）。
１から３３：１）の、ＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタントの比溶菌が観察された
。第２刺激後の平均溶菌は３５．８＆から５７．８％（平均値４５．３％；Ｅ：
Ｔ比８：１から４４：１）であった。マウスを１μｇのＬ1 ΔＣＥ7 1-60ＣＶＬ
ＰS のみで免疫化すると、平均で５日間の培養時間後、５μｇ（１７．２から４
４．７％；平均値３３．９％）または２０μｇ（２６．０から５４．７％；平均
値３８．５％）を用いた免疫化後よりも一層低いＥ7 特異的ＣＴＬS の反応性が
観察された（７．７から４９．５％；平均値２８．５％）。対照マウスの脾臓細
胞（ＨＢＳ緩衝液でワクチン化した）は、５日後でもＥ7 特異的反応性をなんら
の示さなかった（０．３−８．９％、平均値３．４％、Ｅ：Ｔ比４：１−９：１
）。
【００６３】 Ｌ1 ΔＣＥ7 1-60ＣＶＬＰはＥ7 タンパク質（Ｅ7 49-57 ，Feltkamp, M.C.W.
らによる (1993），supra ）の既知Ｈ2 - Ｄb Ｔ細胞エピトープを含む。したが
って得られたＣＴＬS のＥ7 特異性を確認する目的で、ペプチドＥ7 49-57 で負
荷されたＲＭＡ細胞に対してこれらを試験した。ＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタ
ントを認識するＣＴＬS はＥ749-57ＲＭＡまたはＲＭＡ−Ｓ標的細胞に対する特
異的細胞毒活性を示した。測定した比溶菌は５日間後に２１．２から２５％（Ｅ
：Ｔ比８：１から１５：１、図１参照）間で変動した。第３刺激後に実施したペ
プチド滴定試験では、ＲＭＡ−Ｓ細胞は濃度１μｇ／ｍｌのＥ7 49-57 で負荷後
は７０．５％または７１．４％へと溶菌した（二つのＣＲ系試験）。ＲＭＡ−Ｓ
細胞が１００ｐｇ／ｍｌという僅かなＥ7 49-57 ペプチドを与えられた場合でも
、比溶菌値３６．２％および４７．２％が得られた。対照ペプチド、すなわちア
ミノ酸３６６−３７４を有しＤb-ＣＴＬエピトープを表すインフルエンザウイル
スヌクレオタンパク質由来ペプチドで負荷されたＣＴＬs は認められなかった。
Ｌ1 ΔＣＥ7 1-55ＣＶＬＰS （５アミノ酸で切頭したＥ7 配列）で処理後のＣ57
ＢＬ／6 マウスから単離した脾臓細胞は、例えマウスを２５０μｇまでの増量投
与量でワクチン化しても、ＲＭＡ−Ｅ7 細胞を認識しなかった。
らによる (1993），supra ）の既知Ｈ2 - Ｄb Ｔ細胞エピトープを含む。したが
って得られたＣＴＬS のＥ7 特異性を確認する目的で、ペプチドＥ7 49-57 で負
荷されたＲＭＡ細胞に対してこれらを試験した。ＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタ
ントを認識するＣＴＬS はＥ749-57ＲＭＡまたはＲＭＡ−Ｓ標的細胞に対する特
異的細胞毒活性を示した。測定した比溶菌は５日間後に２１．２から２５％（Ｅ
：Ｔ比８：１から１５：１、図１参照）間で変動した。第３刺激後に実施したペ
プチド滴定試験では、ＲＭＡ−Ｓ細胞は濃度１μｇ／ｍｌのＥ7 49-57 で負荷後
は７０．５％または７１．４％へと溶菌した（二つのＣＲ系試験）。ＲＭＡ−Ｓ
細胞が１００ｐｇ／ｍｌという僅かなＥ7 49-57 ペプチドを与えられた場合でも
、比溶菌値３６．２％および４７．２％が得られた。対照ペプチド、すなわちア
ミノ酸３６６−３７４を有しＤb-ＣＴＬエピトープを表すインフルエンザウイル
スヌクレオタンパク質由来ペプチドで負荷されたＣＴＬs は認められなかった。
Ｌ1 ΔＣＥ7 1-55ＣＶＬＰS （５アミノ酸で切頭したＥ7 配列）で処理後のＣ57
ＢＬ／6 マウスから単離した脾臓細胞は、例えマウスを２５０μｇまでの増量投
与量でワクチン化しても、ＲＭＡ−Ｅ7 細胞を認識しなかった。
【００６４】 これらのデータから、Ｌ1 ΔＣＥ7 1-60ＣＶＬＰS により誘発されたＣＴＬs
はＥ7 特異的であり、かつ、高い親和性でペプチドＥ7 49-57 を認識すると結論
される。代表的ＴＬ系のＦＡＣＳ分析では、このＣＴＬs はＣＤ8 ポジテイブと
して同定された。
はＥ7 特異的であり、かつ、高い親和性でペプチドＥ7 49-57 を認識すると結論
される。代表的ＴＬ系のＦＡＣＳ分析では、このＣＴＬs はＣＤ8 ポジテイブと
して同定された。
【００６５】８．Ｃ57ＢＬ／6 マウスにおける同系間Ｅ7 発現腫瘍の成長阻害 Ｌ1 ΔＣＥ71-60 ＣＶＬＰS によるワクチン接種が同系間腫瘍細胞（ＴＣ−１
、Lin, K-Y. (1996), Cancer Res. 56, 21-26）に対して有効な免疫化を誘発
するか否かを決定する目的で、腫瘍防護実験を実施した。Ｃ57ＢＬ／6 マウス（
群当たり３から５匹）が１０μｇのＬ1 ΔＣＥ7 1-60ＣＶＬＰS 、１０μｇのＬ
1 ΔＣＥ7 1-55ＣＶＬＰS 、１０μｇのＬ1 ΔＣＶＬＰS または当量容積の無ア
ジュバントＨＢＳ緩衝液の１S.C.注射を受けた。免疫化後２週間で、２００μｌ
のＰＢＳ中に懸濁した６×１０4 ＴＣ−1 細胞をマウスの左横腹中に接種した。
マウスを犠牲にするまで２ケ月間週２回腫瘍の大きさを測定した。
、Lin, K-Y. (1996), Cancer Res. 56, 21-26）に対して有効な免疫化を誘発
するか否かを決定する目的で、腫瘍防護実験を実施した。Ｃ57ＢＬ／6 マウス（
群当たり３から５匹）が１０μｇのＬ1 ΔＣＥ7 1-60ＣＶＬＰS 、１０μｇのＬ
1 ΔＣＥ7 1-55ＣＶＬＰS 、１０μｇのＬ1 ΔＣＶＬＰS または当量容積の無ア
ジュバントＨＢＳ緩衝液の１S.C.注射を受けた。免疫化後２週間で、２００μｌ
のＰＢＳ中に懸濁した６×１０4 ＴＣ−1 細胞をマウスの左横腹中に接種した。
マウスを犠牲にするまで２ケ月間週２回腫瘍の大きさを測定した。
【００６６】 全ての実験結果を表１に集約した。ＨＢＳ緩衝剤、Ｌ1 Δ ＣＶＬＰS または
Ｌ1 ΔＣＥ7 1-55ＣＶＬＰS でワクチン接種したマウスの全腫瘍成長率は平均８
０．５％であった。Ｌ1 Δ ＣＶＬＰS によるワクチン接種は、腫瘍の遅延が観
測されたが（図３参照）、腫瘍からは保護しなかった。しかし、Ｌ1 Δ ＣＥ7 1-60 ＣＶＬＰS によるマウスのワクチン接種は腫瘍成長から保護した：僅かマウ
ス１匹（１／１３）が３８日後に小さく徐々に成長する腫瘍を生じ、この腫瘍は
期間２ケ月以内に退化した。
Ｌ1 ΔＣＥ7 1-55ＣＶＬＰS でワクチン接種したマウスの全腫瘍成長率は平均８
０．５％であった。Ｌ1 Δ ＣＶＬＰS によるワクチン接種は、腫瘍の遅延が観
測されたが（図３参照）、腫瘍からは保護しなかった。しかし、Ｌ1 Δ ＣＥ7 1-60 ＣＶＬＰS によるマウスのワクチン接種は腫瘍成長から保護した：僅かマウ
ス１匹（１／１３）が３８日後に小さく徐々に成長する腫瘍を生じ、この腫瘍は
期間２ケ月以内に退化した。
【００６７】 ＴＣ−1 腫瘍を生じたＨＢＳまたはＬ1 ＶＬＰワクチン接種マウスの脾臓細胞は
、このマウスが腫瘍を生じたか否かに関係無く、Ｅ7 特異的ＣＴＬ応答を全く示
さないか、または僅かな水準のみの応答を示した。２回目の刺激後、腫瘍保持マ
ウスの０から２１％（平均値１４％、Ｅ：Ｔ比は５：１から２４：１）間および
０から２２．２％（平均値１０．４％、Ｅ：Ｔ比は７：１から４０：１）間のＲ
ＭＡ−Ｅ7 標的細胞のＥ7 比溶菌を、無腫瘍マウスにおいて観察した。これとは
対照的に、ＣＶＬＰＬ1 Δ ＣＥ7 1-60で免疫化後に腫瘍成長から保護されたマ
ウスでは、２９．１から４９．８％（平均値３６．９％、Ｅ：Ｔ比は１１：１か
ら２４：１）のＥ7 特異的ＣＴＬ応答が２回刺激後に見いだされた。
、このマウスが腫瘍を生じたか否かに関係無く、Ｅ7 特異的ＣＴＬ応答を全く示
さないか、または僅かな水準のみの応答を示した。２回目の刺激後、腫瘍保持マ
ウスの０から２１％（平均値１４％、Ｅ：Ｔ比は５：１から２４：１）間および
０から２２．２％（平均値１０．４％、Ｅ：Ｔ比は７：１から４０：１）間のＲ
ＭＡ−Ｅ7 標的細胞のＥ7 比溶菌を、無腫瘍マウスにおいて観察した。これとは
対照的に、ＣＶＬＰＬ1 Δ ＣＥ7 1-60で免疫化後に腫瘍成長から保護されたマ
ウスでは、２９．１から４９．８％（平均値３６．９％、Ｅ：Ｔ比は１１：１か
ら２４：１）のＥ7 特異的ＣＴＬ応答が２回刺激後に見いだされた。
【００６８】 さらに、このワクチン接種が、既存腫瘍の退化に繋がるか否かを解析した。６
×１０4 ＴＣ−1 細胞（S.C.) を接種後２週間で、マウス（群当たり５匹）が１
０μｇのＬ1 Δ ＣＥ7 1-60ＣＶＬＰS 、１０μｇのＶＬＰＬ1 ΔＣまたは無ア
ジュバントＨＢＳ緩衝液の単回注射を受けた。この実験（図４参照）では、ＨＢ
Ｓで処置された、またはＶＬＰＬ1 ΔＣで免疫化された、いずれかの対照マウス
の腫瘍発生は僅か６０％（各群の３匹、６／１０）であった。しかし、Ｌ1 ΔＣ
Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS でワクチン接種した全てのマウス（５／５）は、確立腫瘍に
対する免疫応答を生じ、かつ、腫瘍細胞注射後２ケ月間は無腫瘍で維持された。
×１０4 ＴＣ−1 細胞（S.C.) を接種後２週間で、マウス（群当たり５匹）が１
０μｇのＬ1 Δ ＣＥ7 1-60ＣＶＬＰS 、１０μｇのＶＬＰＬ1 ΔＣまたは無ア
ジュバントＨＢＳ緩衝液の単回注射を受けた。この実験（図４参照）では、ＨＢ
Ｓで処置された、またはＶＬＰＬ1 ΔＣで免疫化された、いずれかの対照マウス
の腫瘍発生は僅か６０％（各群の３匹、６／１０）であった。しかし、Ｌ1 ΔＣ
Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS でワクチン接種した全てのマウス（５／５）は、確立腫瘍に
対する免疫応答を生じ、かつ、腫瘍細胞注射後２ケ月間は無腫瘍で維持された。
【００６９】表１ Ｌ1 ΔＣＥ71-60ＣＶＬＰsで免疫後の腫瘍防護 ワクチン マウスの数 腫瘍の数 ＨＳ 緩衝剤 １８ １６ Ｌ１ΔＣ ＶＬＰｓ １３ １１ Ｌ１ΔＣＥ７1-55 ＣＶＬＰｓ １０ ７Ｌ１ΔＣＥ７1-60 ＣＶＬＰｓ １３ １
【配列表】
【図１】 １μｇのＬ1 Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS を用いた免疫化後に生じたＥ7 特異的ＣＴＬ
応答を示すグラフ。
応答を示すグラフ。
【図２】 ２０μｇのＬ1 Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS を用いたＣ57ＢＬ／６マウスのワクチン化
および in vitro でのＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタントを用いた３回の刺激後
に得られたＥ7 特異的ＣＴＬ系を用いて実施した滴定試験の結果を示すグラフ。
および in vitro でのＲＭＡ−Ｅ7 トランスフエクタントを用いた３回の刺激後
に得られたＥ7 特異的ＣＴＬ系を用いて実施した滴定試験の結果を示すグラフ。
【図３】 ＴＣ−１腫瘍細胞の成長からのＣ57ＢＬ／６マウスの保護を示すグラフ。
【図４】 Ｌ1 Ｅ7 1-60ＣＶＬＰS によるＴＧ−１腫瘍の成長阻止を示すグラフ。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月２４日（２０００．３．２４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２０】 一方でＨＰＶ特異的腫瘍を防止し、かつ、他方では既存のＨＰＶ特異的腫瘍を
退行させるための医薬の生産のための、請求項１、および７から１７項のいずれ
か１項記載の融合タンパク質の使用。
退行させるための医薬の生産のための、請求項１、および７から１７項のいずれ
か１項記載の融合タンパク質の使用。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月１４日（２０００．６．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２６】 特に好ましい構築体はＮ末端アミノ酸１から約５５のＥ7 であり、この構築体
はキヤプシッド形成を妨げ得るＥ7 特異的配列をアミノ酸５６−７０領域中に含
まないので、欠失Ｌタンパク質との組み合わせでキヤプメアおよびキヤプシッド
を好ましく形成する。３２アミノ酸によりＣ末端が欠失したＨＰＶ−１６のＬ1
タンパク質、および、これがアミノ酸１−５５または１−６０のＨＰＶ−１６の
Ｅ7 タンパク質に結合したものは特に好ましい。これらの構築体は中和性抗体ま
たは特異的ＣＴＬ応答を誘発するのみではなく、また一方では腫瘍形成を阻害し
、他方で既存腫瘍の退化を動物実験で引き起こす。アミノ酸１−６０のＥ7 は腫
瘍中で顕著な予防作用および治療的作用を特に示す。したがって、この発明にお
いて特に好ましい実施態様はＬ1 ΔＥ7 1-X 融合タンパク質、好ましくはＣＶＬ
ＰS 具体的にはＨＰＶ１６（Ｘは６０を含む、５５から６０にいたる整数）の形
態における融合タンパク質であり、かつ具体的にはＬ1 ΔＣＥ7 1-55またはＬ1
ΔＣＥ7 1-60融合タンパク質である。
はキヤプシッド形成を妨げ得るＥ7 特異的配列をアミノ酸５６−７０領域中に含
まないので、欠失Ｌタンパク質との組み合わせでキヤプメアおよびキヤプシッド
を好ましく形成する。３２アミノ酸によりＣ末端が欠失したＨＰＶ−１６のＬ1
タンパク質、および、これがアミノ酸１−５５または１−６０のＨＰＶ−１６の
Ｅ7 タンパク質に結合したものは特に好ましい。これらの構築体は中和性抗体ま
たは特異的ＣＴＬ応答を誘発するのみではなく、また一方では腫瘍形成を阻害し
、他方で既存腫瘍の退化を動物実験で引き起こす。アミノ酸１−６０のＥ7 は腫
瘍中で顕著な予防作用および治療的作用を特に示す。したがって、この発明にお
いて特に好ましい実施態様はＬ1 ΔＥ7 1-X 融合タンパク質、好ましくはＣＶＬ
ＰS 具体的にはＨＰＶ１６（Ｘは６０を含む、５５から６０にいたる整数）の形
態における融合タンパク質であり、かつ具体的にはＬ1 ΔＣＥ7 1-55またはＬ1
ΔＣＥ7 1-60融合タンパク質である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】 したがって本発明は、医薬生産のために本発明における構築体を、一方ではＨ
ＰＶ特異的腫瘍阻害のために、他方では既存ＨＰＶ特異的腫瘍を退化させるため
に使用することに関する。
ＰＶ特異的腫瘍阻害のために、他方では既存ＨＰＶ特異的腫瘍を退化させるため
に使用することに関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】 予防および治療の両方で活性な医薬の生産の場合、所望のパピローマウイルス
特異的融合タンパク質はキヤプシッドおよび／またはキヤプソマーの形態で存在
するのが好ましく、その理由は、このキヤプシッドおよび／またはキヤプソマー
により、具体的にはタンパク質のフラクションにより免疫反応が追加的に顕著に
増進され得るからである。したがってキヤプシッドおよび／またはキヤプソマー
形成に適する好ましい融合タンパク質は、例えば欠失Ｌ1 およびＥ7 、Ｅ6 およ
び／またはＥ1 からの融合タンパク質である。
特異的融合タンパク質はキヤプシッドおよび／またはキヤプソマーの形態で存在
するのが好ましく、その理由は、このキヤプシッドおよび／またはキヤプソマー
により、具体的にはタンパク質のフラクションにより免疫反応が追加的に顕著に
増進され得るからである。したがってキヤプシッドおよび／またはキヤプソマー
形成に適する好ましい融合タンパク質は、例えば欠失Ｌ1 およびＥ7 、Ｅ6 およ
び／またはＥ1 からの融合タンパク質である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】 この発明の趣旨以内におけるキヤプシッドは、一般的に７２キヤプソマーから
構築された一般に正二十面体形態のウイルスまたはウイルス様構造体である。
構築された一般に正二十面体形態のウイルスまたはウイルス様構造体である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA01 BA20 BA44 CA01 DC50 NA02 NA03 NA14 ZB262 ZB332 4C085 AA03 BA76 CC08 EE03
Claims (20)
- 【請求項１】 一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのＬ1 タンパク質
および一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つのＥタンパク
質からの少なくとも一つの融合タンパク質、ならびに任意に適切な添加剤および
／また賦形剤を含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）特異的腫瘍の回避用ま
たは治療用医薬であって、この融合タンパク質がパピローマウイルス非特異的エ
ピトープを含まないことを特徴とする上記医薬。 - 【請求項２】 腫瘍が、喉頭、頚部、陰茎、外陰または肛門における上皮組織悪性腫瘍である
ことを特徴とする、請求項１記載の医薬。 - 【請求項３】 医薬がアジュバントを含まないことをことを特徴とする、請求項１または２記
載の医薬。 - 【請求項４】 添加剤または賦形剤が、濃度約０．３から約４Ｍ、好ましくは約０．４から約
３Ｍ、具体的には約０．５Ｍから２Ｍ特に約１から２Ｍの、ｐＨ約７．３から約
７．４５好ましくは約７．４を示す塩であることを特徴とする、請求項１から３
のいずれか１項記載の医薬。 - 【請求項５】 塩が、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、好ましくはハロゲン化物ま
たはリン酸塩、具体的にはアルカリ金属ハロゲン化物特にＮａＣｌまたはＫＣｌ
であることを特徴とする、請求項４記載の薬剤。 - 【請求項６】 緩衝剤好ましくはリン酸塩緩衝剤、トリス緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤またはＭ
ＯＰＳ緩衝剤を用いてｐＨを調整することを特徴とする、請求項４または５記載
の医薬。 - 【請求項７】 Ｌタンパク質が欠失Ｌタンパク質、好ましくは欠失Ｌ1 および／またはＬ2 タ
ンパク質であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項記載の医薬。 - 【請求項８】 Ｌタンパク質が、Ｃ末端欠失Ｌタンパク質、具体的のはＣ末端欠失Ｌ1 タンパ
ク質であることを特徴とする、請求項７記載の医薬。 - 【請求項９】 約３５アミノ酸まで、好ましくは約２５から約３５アミノ酸、具体的には約３
２から３４アミノ酸がＬタンパク質から欠失されることを特徴とする、請求項７
または８記載の医薬。 - 【請求項１０】 Ｅタンパク質が、欠失Ｅタンパク質特に欠失Ｅ6 および／またはＥ7 タンパク
質であることを特徴とする、請求項１から９のいずれか１項記載の医薬。 - 【請求項１１】 欠失Ｅタンパク質がＣ末端欠失Ｅタンパク質好ましくはＣ末端欠失Ｅ7 タンパ
ク質であることを特徴とする、請求項１０記載の医薬。 - 【請求項１２】 約５５アミノ酸まで、好ましくは約５から約５５アミノ酸、具体的には約３８
から約４３アミノ酸が欠失されてなることを特徴とする、請求項１０または１１
記載の医薬。 - 【請求項１３】 融合タンパク質がキヤプシッドおよび／またはキヤプソマーの形態で存在する
ことを特徴とする、請求項１から１２のいずれか１項記載の医薬。 - 【請求項１４】 ＨＰＶが、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ
−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４２、ＨＰＶ−
４５、ＨＰＶ−５２および／またはＨＰＶ−５８から選択されることを特徴とす
る、請求項１から１３のいずれか１項記載の医薬。 - 【請求項１５】 パピローマウイルスが、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８またはＨＰＶ−１８
、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−４５およびＨＰＶ−５８またはＨＰＶ−６およびＨＰ
Ｖ−１１から選択されることを特徴とする、組み合わせワクチンの形態における
請求項１４記載の医薬。 - 【請求項１６】 融合タンパク質が、Ｌ1 ΔＣＥ7 1-X 融合タンパク質好ましくはＣＶＬＰの形
態のもの、特にＨＰＶ−１６の形態［Ｘは６０を含む、５５から６０までの整数
］のものであることを特徴とする、請求項１から１５のいずれか１項記載の医薬
。 - 【請求項１７】 融合タンパク質が、Ｌ1 ΔＣＥ7 1-55またはＬ1 ΔＣＥ7 1-60融合タンパク質
であることを特徴とする、請求項１６記載の医薬。 - 【請求項１８】 上記融合タンパク質をコードする発現ベクターを含む細胞を適切な条件下に培
養し、発現生成物を単離し、任意に適切な添加剤および賦形剤を添加することを
特徴とする、請求項１から１７のいずれか１項記載の医薬の製造方法。 - 【請求項１９】 発現ベクターが、発現中に上記融合タンパク質をさらなるアミノ酸により延長
させる核酸配列を含まないことを特徴とする、請求項１８記載の医薬。 - 【請求項２０】 一方でＨＰＶ特異的腫瘍を防止し、かつ、他方では既存のＨＰＶ特異的腫瘍を
退行させるための医薬の生産のための、請求項１、および７から１７項のいずれ
か１項記載の融合タンパク質の使用。
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| DE19812941.6 | 1998-03-24 | ||
| PCT/EP1999/001996 WO1999048518A2 (de) | 1998-03-24 | 1999-03-24 | Arzneimittel zur vermeidung oder behandlung von papillomavirus-specifischem tumor |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP2000537565A Pending JP2002509863A (ja) | 1998-03-24 | 1999-03-24 | パピローマウイルス特異的腫瘍の回避用または治療用医薬 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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