JP2002509117A - 粒状複合体による核酸ワクチンの経口投与 - Google Patents

粒状複合体による核酸ワクチンの経口投与

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Abstract

(57)【要約】 核酸および多価陽イオンのナノ粒子コアセルベートは、経口投与されるとき、効果的なワクチンとして作用する。それらは種々の疾患起因菌に対する免疫を誘導することができ、またアレルゲンに対する防御応答を生ずることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の技術分野 本発明は、免疫学およびアレルギー疾患の分野に関する。より詳細には、本発
明は食物アレルギーの分野に関する。
【０００２】発明の背景 IgEは、I型即時型過敏症を含む種々のアレルギー疾患の病因において重要であ
り（1）、十分に特徴づけられている食物アレルギー応答はIgE媒介応答に関係す
る（2）。経口耐性の形成不良すなわち経口耐性の崩壊により食物特異的IgE Ab が形成される。IgE Abおよび抗原は高親和性IgE受容体により肥満細胞および好 塩基球を活性化し（Fce RI）、活性化された肥満細胞および好塩基球から放出さ
れるヒスタミンおよび他のメディエーターによって全身アナフィラキシー反応が
発現する（3）。数多くの臨床研究および実験動物における研究が、IgE関連アレ
ルギー疾患の発症におけるT細胞およびサイトカインの重要な役割を示している （4-5）。特に、サイトカイン分泌パターンによって機能的に識別されているT細
胞サブセット（Th2）は主要な役割を果たすと考えられている。Th2細胞は、それ
ぞれ、IgE産生および肥満細胞発生および好酸球増加症を促進するサイトカイン 、IL-4およびIL-5の分泌によってアレルギー応答を促進すると考えられている。
IFN-γなどの、対向する経路（Th1）によって放出されるサイトカインはTh2細胞
の発生および膨潤並びにサイトカイン産生を阻害する。これらの研究は、Th2応 答を調節する際のサイトカインの重要性を実証しており、IgE-およびTh2-関連表
現型の形成を調節する治療方法の可能性を示唆している。
【０００３】 食物アレルギー（ナッツ、卵、ミルクおよび魚介類に対するアレルギー反応を
含む）は、アレルギー反応が重症になる可能性、アレルギー性過敏反応の性質お
よび食品の汎用使用されることにより、主要な健康問題である。米国における最
近の調査によって、食物アレルギーは、病院の救急治療室で治療されるアナフィ
ラキシーも最も一般的な一要因であると判定した（6,7）。両報告では、食物性 アナフィラキシーはアナフィラキシー症例の約3分の1を占め、ピーナッツおよび
ツリーナッツは食物に対する反応の大多数を占める。米国では毎年約100例の食 物性アナフィラキシーの致死症例が生じ（8）、ピーナッツは食物アレルギー反 応の主要原因の1つであり（9,10）、ピーナッツおよびツリーナッツは共に致死 的および致死的に近い食物性アナフィラキシーの主要原因である（6、8、11-12 ）と考えられている。
【０００４】 食物アレルギーは増加傾向の国家的な健康問題として認識されるようになった
が、食物アレルギーの証明されている唯一の治療は、食物アレルゲンの考えられ
る全ての原因を完全に回避するように患者を教育することである。しかし、頻繁
な偶発的摂取[1年あたりでピーナッツアレルギー患者の50%にまで及ぶ（13〜14 ）]は種々の食品にピーナッツタンパク質が汎用されているために起こる。ピー ナッツアレルギーの標準的な緊急の免疫療法を用いた2つの小規模な臨床試験は 、有効性の低さと許容されない副作用を実証した（15）。致死的となる可能性の
ある食物アレルギーを有する大多数の患者、全ての食物アレルゲン暴露を回避す
ることの極端な困難さおよび標準的な免疫療法の有効性のなさを考慮すると、新
規で、効果的な治療方法が早急に必要とされている。
【０００５】 経口および腹腔内（i.p.）感作の組み合わせを使用したとき、C3Hマウスはピ ーナッツ特異的IgE Abを形成し、ピーナッツタンパク質を投与すると全身アナフ
ィラキシーを敬虔することを本発明者らは最近示した（16）。本発明者らは、ピ
ーナッツタンパク質（PN）で経口感作し、次にPNでi.p.抗原投与したマウスは、
掻痒および毛髪直立などの活動性の全身アナフィラキシーを含む、アレルギー患
者に観察される同様の特徴を示し、経口摂取およびアジュバント[それぞれ、コ レラトキシン（CTx）およびミョウバン]と共にi.p.注射の組み合わせを使用した
感作の場合には、死亡を含むより重症の症状が含まれたことを実証した。症状ス
コア、血清中の特異的IgEレベル、並びに血漿ヒスタミン、肥満細胞脱顆粒およ び血管漏出の抗原投与による変化を含む過敏性応答のいくつかのパラメーターを
マウスにおいてモニターすることができる。結論として、スナイダー（Snider）
ら（17）は、CTxの存在下におけるマウスのニワトリ卵リゾチームまたはOVAによ
る経口感作次いでi.p.抗原投与により、感作したマウスの80%において致死的な 全身アナフィラキシーが発現したことを実証した。致死率は数多くの標的器官に
おいて血漿中のヒスタミン濃度の上昇および肥満細胞の脱顆粒と関連していた。
AgおよびアジュバントとしてCTxを用いて感作し、抗原投与したマウスにおいて より重症のアナフィラキシー反応が見られるという所見は、CTxがTh2-型応答を 促進することがあることを実証している最近の検討と一致している（18〜19）。
これらの研究は、過敏症発症におけるAg誘発性IgEおよびTh2応答の重要な役割を
さらに示唆しており、ピーナッツ誘導性過敏症の調節機構を調査したり、DNAに 基づいた免疫方法の利用性を開発する有用なモデルになっている。
【０００６】 「DNAに基づいた免疫化」を使用して免疫系を操作する際の最近の進歩は、種 々のヒト疾患における重要で新規な治療法を提供してきた（20）。DNAに基づい た免疫化は宿主の免疫応答を形成および/または調節するために使用されており 、最終的な目的は疾患の予防、回復、安定または進行遅延である。免疫系を操作
する際のこの方法は、宿主を種々の疾患から防御する新規な方法を探索している
研究者に多大な関心を生じた（21〜24）。Agをコードする「裸の(naked）」プラ
スミドDNA（pDNA）を注射すると、Agに対する長時間持続する細胞性および液性 免疫応答が形成される（25）。免疫化の成功は、筋肉内経路、皮内経路、静脈内
経路および皮下経路によるpDNAの投与により実証されている（20,26〜28）。pDN
Aの筋肉内注射が、特異的IgG Abの合成並びにCD8+細胞毒性T細胞およびCD4+ Th1
細胞の効率的な形成によって特徴づけられる長期免疫応答を発生することは再現
性よく実証されている（29）。最近の結果はまた、pDNAは、複製されたりまたは
宿主細胞のゲノムに組み込まれることなくエピソームのままでいることを示して
いる（20）。従って、これらの新規で、興奮的な開発は、種々の疾患の安全で効
果的な治療の有望性を示す。
【０００７】 フシュ（Hsu）ら（30〜31）は、筋肉内遺伝子輸送を使用して、ラットおよび マウスにおいて筋肉内注射を行い、ハウスダストダニアレルゲン（Der p 5）を コードするpDNAは、エアゾール化した抗原で抗原投与した動物においてIgE合成 、ヒスタミン放出および気道の過剰応答性の誘発を防止することを最近実証した
。ラズ（Raz）ら（32）は、β-ガラクトシダーゼ（β-gal）をコードするpDNAで
皮内免疫化し、β-gal/ミョウバンで特発したBalb/cマウスは6週間後にβ-gal特
異的IgEの濃度の66〜75%の低下を示すことを示した。また、このpDNA免疫化プロ
トコールは、β-gal/ミョウバンで特発したマウスにおいてTh細胞による特異的I
gG2aおよびIFN-γ分泌を誘導した。しかし、種々のモデルにおけるIgE-およびTh
2-関連免疫応答を変更する際のDNAに基づいた免疫化の最近の成功にもかかわら ず、予防的および/または治療的可能性は全く明らかになっておらず、改善され たDNA輸送系を使用したより良く、より効率的で、より安全な遺伝子導入および 遺伝子発現系が早急に必要とされている。
【０００８】 遺伝子治療は多くの遺伝的疾患を治療する際に興奮させられるような有望さを
持ち続けている[36,37]。最近の臨床試験は、効率的で安全な輸送担体が遺伝子 治療成功の重大な障壁になっていることを示している[38]。ウィルスベクターお
よびレトロウィルスベクターはインビボにおける遺伝子導入のための最も効率的
で、一般に使用される輸送法となっている[39〜41]。しかし、ウィルスタンパク
質に対する免疫応答の問題が検討されている。合成の容易さ、細胞/組織の標的 性、免疫応答の低さおよびプラスミドサイズの制限のなさなどの利点の可能性の
ために、ウィルス以外の輸送系がウィルスベクターの代替として次第に提案され
てきた。
【０００９】 DNAワクチン用途における「遺伝子銃(gene gun）」以外の最も有望なウィルス
以外の遺伝子輸送系は、DNAと多価陽イオンリポソームとの間に形成されるイオ ン複合体を含む[42〜45]。リポソーム法の成功を妨害する因子は複合体の不安定
性、陽イオン脂質の毒性および複合体化したDNA半減期の短さであると思われる 。静電気的な相互作用で一体化されると、これらの複合体は、体液中での多価電
解質の電荷スクリーニング効果のために、解離することがある。強塩基性脂質組
成物は複合体を安定化することができるが、このような脂質は細胞毒性作用があ
ることがある。リポソームの外側にDNAがコーティングされるということにより 、投与部位から標的細胞の核への移行の際にDNAはヌクレアーゼによる分解を受 けやすくなる。最近の薬物動態学的検討では、HLA-B7遺伝子は、DC-Chol/DOPEに
よって静脈内に輸送されると、半減期が5分より短く、1時間後には検出不可能に
なることを示している[46]。注射後1日目または7日目の免疫組織化学的分析によ
って残存プラスミドを保有する組織中にはコードされたタンパク質は検出されな
い。このような低い生物有用性は、多くの治療用タンパク質の特徴である同様の
不安定性の点からは驚くべきことではない。例えば、インターフェロンおよびい
くつかの他のサイトカインも血漿中の半減期は数分のオーダーである。このよう
な分解されやすいポリペプチドの多数の治療の可能性は、放出制御型製剤によっ
て改善されている。
【００１０】 複雑なコアセルベート化は、2種の反対に帯電した多価電解質が水溶液中で混 合されるとき生ずる自発的な相分離の一過程である。2種の高分子間の静電気的 相互作用により、コアセルベート（ポリマーが豊富な相）が上清（ポリマーが少
ない相）から分離される。この現象を使用して、マイクロスフェアを形成し、種
々の化合物を封入することができる。封入過程は水溶液中で、低温で全て実施す
ることができ、従って、封入体の生物活性を維持する可能性がある。注射可能な
放出制御系を開発する際に、本発明者らはゼラチンおよびコンドロイチン硫酸の
複雑なコアセルベート化を使用して数多くの薬剤およびタンパク質を封入した[4
7]。サイトカインは癌ワクチンのためにこのようなマイクロスフェアに封入され
ている[48]。抗炎症剤も変性性関節症を治療するために関節へ関節内輸送するた
めに組み入れられている[49]。本発明者らは、コンドロイチン硫酸を多価陰イオ
ンとしてのDNAと交換して、ゼラチンまたは他の多価陽イオンを用いてマイクロ スフェアを形成することができた。
【００１１】 コラーゲンの変性型であるゼラチンは、35〜40℃より低い温度でゲル化する多
価電解質である。ゼラチンは食物（55%）、薬剤（25%）および写真（15%）産業 に広く使用されている[50]。pH 5未満では、ゼラチンは正に帯電し、DNAと複合 体を形成して、コアセルベートを形成することができる。架橋すると、コアセル
ベートは高イオン強度の溶液中で安定になる。キトサンは生物吸収可能で、毒性
がなく、免疫原性が低いポリサッカライドである。ポリサッカライドは、ジサッ
カライド単位あたり0.837の平均アミノ酸基密度を有する。ゼラチンは放出制御 型のマイクロスフェア製剤のための基質として、また細胞を封入するアルギン酸
カプセルの安定化剤として提案されている。
【００１２】発明の概要 本発明の目的は、経口投与に好適なワクチン製剤を提供することである。
【００１３】 本発明の別の目的は、ワクチンを摂取することによって哺乳動物を免疫する方
法を提供することである。
【００１４】 本発明のこれらの目的および他の目的は、経口摂取に好適であるワクチン製剤
を提供することによって達成される。ワクチンは、ポリマー多価陽イオンおよび
多価陰イオンのコアセルベートを含み、多価陰イオンが抗原をコードする核酸で
ある、5μmより小さい固体のナノ粒子を含む。単体として薬学的に許容される担
体を使用してもよい。
【００１５】 別の態様によると、抗原に対して哺乳動物をワクチン化する方法が提供される
。本発明の方法は、5μmより小さい固体のナノ粒子を含むワクチン化製剤を経口
投与する段階を含む。ナノ粒子はポリマー多価陽イオンおよび多価陰イオンのコ
アセルベートを含む。多価陰イオンは抗原をコードする核酸である。
【００１６】 これらの態様および他の態様は、特にウィルス、寄生虫、真菌および細菌疾患
に対してヒトおよびヒト以外の哺乳動物を簡単且つ効果的にワクチン化する新規
ツールを当技術に提供する。環境および食物アレルゲンも抗原として使用するこ
とができる。
【００１７】詳細な説明 米国特許出願第08/265,966号および米国特許出願第08/657,913号の開示内容が
本明細書に組み入れられる。
【００１８】 経口投与するためにDNAナノスフェアを使用した本発明者らの新規方法は、DNA
に基づいた経口免疫の一般的な利用性を実証している。誘導される応答は液性ま
たは細胞性のどちらかまたは両方であってもよい。それは、望ましい任意の種類
の免疫応答を誘導するために使用することができる。これは、細菌、ウィルス、
真菌、寄生虫または腫瘍に関連した抗原に対するものであってもよい。
【００１９】 ワクチン化した哺乳動物において、任意の種類の発現構築物を使用して抗原遺
伝子の発現物を得てもよい。一般に、遺伝子は、受容細胞中で活性を有するプロ
モーターに機能的に結合する。CMVなどのウィルスプロモーターはこの目的のた めには特に有用であるが、任意の周知のプロモーターを使用することができる。
抗原をコードする遺伝子またはオリゴヌクレオチドはRNA、DNA、cDNAの形態であ
ってもよい。
【００２０】 アレルゲン、特に食物アレルゲンまたは細菌、ウィルス、真菌、寄生虫、また
は腫瘍関連抗原を含むが、これらに限定されない抗原は当技術分野において周知
のいかなるものであってもよい。
【００２１】 本発明の重大な局面はワクチンの経口経路による投与である。従って、製剤は
、経口摂取にとって安全で、健康的であるいかなるものであってもよい。好まし
くは、製剤は毒性物質を含有しない。液体の形態である場合には、滅菌が望まし
いと思われる。ワクチンの形態は錠剤、カプセル、液体、エリキシル、粉末、顆
粒等としてであってもよい。食物または飲料に混合されてもよい。注射および他
の摂取法にしばしば要求されるように、投与のための医療従事者の費用を必要と
しないで、簡便さを追加するためにワクチンは自己投与されてもよい。
【００２２】 ナノスフェアは5ミクロンより小さいことが好ましい。3ミクロンより小さいナ
ノスフェアはさらに好ましく、2、1、0.5および0.1ミクロンより小さいナノスフ
ェアはよりさらに好ましい。サイズはコアセルベート化条件並びに成分である多
価陰イオンおよび多価陽イオンのサイズによって影響されることがあるが、望ま
しいサイズのナノスフェアは、サイズに基づいてナノスフェアを分離する技術を
使用して選択されたサイズであってもよい。粒子は、例えば、ショ糖濃度勾配超
遠心分離によってサイズ分画されてもよい。150ナノメーターより小さいサイズ の粒子は、ほとんどの血管壁の裏打ちしている有窓を通って移動することによっ
て間質腔に接近することができる。
【００２３】 コアセルベートが形成されるポリマー多価陽イオンは、生物分解性で、経口摂
取が安全ないかなるものであってもよい。これには、ゼラチンおよびキトサンが
含まれるが、これらに限定されない。ポリリジン、ポリリジン-ポリ-アルギニン
、ポリアルギニン、プロタミン、スペルミン、スペルミジン等などの合成または
天然型のポリアミノ酸を使用してもよい。ポリサッカライドが使用されてもよい
。
【００２４】 望ましい場合には、標的リガンドはナノスフェアの表面に直接結合されても、
または「橋」もしくは「スペーサー」を使用して間接的に結合されてもよい。ゼ
ラチンのリジン基によって提供されるアミノ基のために、ナノスフェアの表面は
、標的部分と直接結合するために容易に誘導化することができる。例えば、カル
ボジイミドを誘導化剤として使用してもよい。または、アビジン-ビオチンなど のスペーサー（架橋分子および標的リガンド上の誘導化部分）を、標的リガンド
をナノスフェアに間接的に結合するために使用してもよい。アビジンに対するビ
オチンの高い親和性のために（Ka-1015M-1）、ビオチン化抗体および/または他 のビオチン化リガンドをアビジンをコーティングしたナノスフェア表面に効率的
に結合することができる（Hazuda,et al., 1990, 「前駆体インターロイキン1β
のプロセシングと炎症疾患（Processing of precursor interleukin 1 beta and
inflammatory disease）」, J. Biol. Chem.265:6318-22; Wilchek, et al., 1
990, 「アビジン・ビオチン技術概論（Introduction to avidin-biotin technol
ogy）」, Methods In Enzymology, 184:5-13）。IgGsの配向選択性結合は、Fc部
分に見られるオリゴサッカライド基の抗体をビオチン化することによって実施す
ることができる（O'Shannessy, et al.,1984, 「オリゴ多糖類部分との結合によ
って免疫グロブリンを標識する新規方法（A novel procedure for labeling imm
unoglobulins by conjugation to oligosaccharides moieties）」, Immunol. L
ett., 8;273-277）。このようなデザインにすることにより、利用可能な結合部 位の総数を維持する助けとなり、結合した抗体は、マクロファージなどのFc受容
体保有細胞に対する免疫原性が低くなる。当技術分野において周知であるように
、アビジン-ビオチン橋ではなくスペーサーを使用してもよい。例えば、免疫グ ロブリン分子のFc部分をナノスフェアに結合するためにブドウ球菌のプロテイン
Aをナノスフェアにコーティングしてもよい。
【００２５】 ナノスフェアに対する架橋分子または標的リガンドの架橋を使用して、ナノス
フェアの安定性を促進し、またナノスフェアに対して架橋分子または標的リガン
ドを共有結合する。架橋程度はナノスフェアからの核酸の放出率に直接影響を与
える。架橋は、グルタールアルデヒド、EDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプ
ロピル）-カルボジイミド、DCC（N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド）など のカルボジイミド、カルボキシル（ペプチド結合）結合、ビス（スルホスクシン
イミジル）スベレート、ジメチルスベリミデート等を使用して実施することがで
きる。
【００２６】 本発明による標的リガンドは、生体内の特殊な種類の細胞に結合する任意の分
子である。これらは、細胞受容体が存在する任意の種類の分子であってもよい。
好ましくは、細胞受容体は特殊な細胞の種類上のみで発現される。使用すること
ができる標的リガンドの例はホルモン、抗体、細胞接着分子、サッカライド、薬
剤および神経伝達物質である。
【００２７】 本発明のナノスフェアは良好な負荷（loading）特性を有する。一般に、本発 明の方法により、少なくとも5%（w/w）の核酸を有するナノスフェアを得ること ができる。好ましくは、負荷は10%または15%より多い核酸である。しばしば、核
酸が20%または30%より多いが、40%または50%より少ないナノスフェアを得ること
ができる。一般に、95%より大きい、ナノスフェアへの核酸の負荷効率を得るこ とができる。
【００２８】 本発明の方法は、ポリマー陽イオンおよび核酸のコアセルベート化を含む。こ
の過程は、正に帯電したポリマー陽イオンと負に帯電した核酸との相互作用に依
存するので、それは複雑なコアセルベート化過程と考えることができる。しかし
、硫酸ナトリウム（またはエタノール）は相転移を誘導することによってコアセ
ルベート化反応を誘導するので、それは単純なコアセルベート化反応と考えても
よい。核酸は、コアセルベート混合物中に、1 ng/ml〜500μg/mlの濃度で存在す
る。望ましくは、核酸は鎖長が少なくとも約2〜3 kbである。硫酸ナトリウムは7
〜43 mMの濃度で存在する。ゼラチンまたは他のポリマー陽イオンは、コアセル ベート混合物中で約2〜7%の濃度で存在する。
【００２９】 DNAと、ゼラチンまたはキトサンのどちらかとの複雑なコアセルベート化によ って合成されるナノスフェア輸送担体はいくつかの魅力的と思われる特徴を有す
る：1）受容体依存性エンドサイトーシスを標的とする、または刺激するために リガンドをナノスフェアに結合することができる；2）エンドソームおよびリソ ソーム区域におけるDNAの分解を低下するためにソソーム向性（lysosomolytic）
因子を組み入れることができる；3）他の生物活性剤または多数のプラスミドを 同時に封入することができる；4）マトリックスごとに血清ヌクレアーゼによる 分解から保護されるので、DNAの生物有用性を改善することができる；5）ナノス
フェアを凍結乾燥して保存することができる。
【００３０】 魅力的なナノスフェア輸送系では、製造の簡易性、費用有効性、核酸負荷レベ
ル、放出制御能、保存安定性および成分の免疫原性などの因子間に微妙な均衡が
必要である。本明細書に記載する遺伝子輸送系は、リポソーム系を含む他の粒状
輸送系と比較して、利点を提供することができる。不安定性、低い負荷レベルお
よび放出制御能の問題はポリマーナノスフェア系を使用すれば、より良く解消さ
れる。ゼラチンは、手術用の組織接着剤（Weinschelbaum, et al., 1992, 「本 来の大動脈弁を保存した急性A型解離性動脈瘤の外科的処置と生物接着剤の利用 、６年追跡調査（Surgical treatment of acute type A dissecting aneurysm w
ith preservation of the native aortic valve and use of biologic glue. Fo
llow-up to 6 years）」, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 130:369-74）から免
疫組織化学的定量アッセイ法（Izumi, et al.,1990, 「戦場におけるらい病の血
清診断に関する新規ゼラチン粒子凝集試験（Novel gelatin particle agglutina
tion test for serodiagnosis of leprosy in the field）」, J. Clinical Mic
robiol., 28:525-9）にいたる範囲、並びにインビボにおける生体適合性および 酵素分解性によって、薬剤輸送担体（Tabata, et al., 1991, 「インビボマウス
腫瘍細胞増殖に及ぼす組換え型αインターフェロン-ゼラチン結合物の影響（Eff
ects of recombinant alpha-interferon-gelatin conjugate on in vivo murine
tumor cell growth）」, Cancer Res., 51:5532-8）として生物的な用途が増加
している。広範に研究されているポリ乳酸/ポリグリコール酸コポリマーなどの 、他の合成ポリマー系と比較すると、ナノスフェア製剤の緩和な条件は魅力的で
ある。合成ポリマーナノスフェアを製剤化するために使用される溶媒留去および
ホット-メルト技法とは異なり、複雑なコアセルベート化は有機溶媒および熱と の接触が必要ない。受動的溶媒捕獲だけでなく直接的な電荷-電荷相互作用によ り、それは核酸などの生体高分子を封入するのにも特に好適である。
【００３１】 10 kbより大きい遺伝子を輸送することができないウィルスベクターとは異な り、本発明のナノスフェア輸送系にはこのようなサイズの制限がない。約2 kbよ
り大きい核酸分子を使用することができ、10 kbよりさらに大きい核酸分子を使 用することができる。一般に、核酸は300塩基より大きく、一般に、0.5、1、2、
5または10 kbより大きい。一般に核酸分子は200、100または50 kbより小さい。
【００３２】 上記の開示は本発明を一般的に記載している。例示的な目的のために本明細書
に提供され、本発明の範囲を限定する意図のものではない以下の具体的な実施例
を参照することによって、より完全な理解を得ることができる。
【００３３】 本発明者らは、経口キトサン/DNAに基づいた免疫法を使用して、ピーナッツア
レルゲン（モデルアレルゲン）に誘発される過敏症の調節を評価した。本発明の
研究のモデルは同系マウス（C3H）におけるピーナッツアレルゲンに対する過敏 性応答であり、定量的な過敏症のパラメーターをいくつか確立し、遺伝子免疫後
に免疫応答の有意な誘導を実証した。この系は、抗原はDNAの経口投与によって 動物の全身の循環に輸送されることができることを実証している。
【００３４】実施例1 材料：約6〜7週齢の同系C3HおよびAKR/Jマウスをマサチューセッツ州のチャー
ルズリバーラボラトリーズ（Charles River Laboratories）から購入した。ピー
ナッツアレルゲンArah2（pArah2）をコードするプラスミドをPEG法によって大規
模に産生した。高分子量キトサン（C390、Mw〜390,000）および低分子量キトサ ン（PCL113、Mw〜60,000〜100,000）を多価陽イオンとして使用して、DNAと複合
体を形成した。
【００３５】 遺伝子発現構築物：pCR3Arah2：バークス（Burks）ら（33〜34）はピーナッツ
における2つの主要なタンパク質分画、Ara h1（63.5 kD）およびAra h2（17 kD ）を同定した。ピーナッツアレルギー患者の95%以上はこれらのタンパク質に感 受性を示す。本発明者らは、発現ベクター（pCR3）中でAra h2遺伝子構築物、pC
R3Arah2を作製した。コザック（Kozak）コンセンサス翻訳コドンを添加してPCR 増幅したAra h2コード領域遺伝子セグメントを、CMVプロモーター配列を含有す るpCR3発現ベクターにライゲーションした。
【００３６】 ナノスフェアの調製：簡単に説明すると、DNA-キトサンナノスフェアは以前に
記載したように製造した。簡単に説明すると、55℃において、50 mM硫酸ナトリ ウム中で0.02%キトサン溶液（NaAc-HOAc緩衝液中、pH 5.7）を50 ug/mlのDNA溶 液と共に15〜20秒間撹拌した。低分子量キトサンは、濃度を脱イオン水中で0.04
%（pHを5.7に調整）に変更し、塩濃度は5 mM硫酸ナトリウムであった。
【００３７】 経口投与：全てのナノスフェアは投与直前に調製し、室温においた。麻酔をし
ていないマウスに、マウスあたり50 ug DNAの用量の異なる製剤のナノスフェア および「裸の」DNAを摂取させた。摂取（胃内投与）は、動物用投与針（Fisher
Scientic, USA）を取り付けた1 mlの注射筒を使用して実施した。摂取容量は各 マウスにつき1 mlであった。
【００３８】 実験プロトコール：検討は2つの実験に分割した：第一に、ワクチン化後の異 なる経過時間における免疫応答を調査し、第二に、免疫プロトコールの防御効果
を検討した。最初の検討では、実験群は以下のようであった：1群：高分子量キ トサン-pArah2ナノスフェアの単回投与、2群：高分子量キトサン-pArah2ナノス フェアを1回投与し、次に2週間後に追加抗原投与、3群：低分子量キトサン-pAra
h2ナノスフェアの単回投与、4群：低分子量キトサン-pArah2ナノスフェアを1回 投与し、次に2週間後に追加抗原投与、5群：裸のDNA（pArah2）、6群：低分子量
キトサン-pEGFP（ホタル緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミド、Clontech
Inc., USA）ナノスフェアの単回投与および7群：リン酸緩衝生理食塩液（PBS）
を摂取させた未処理のマウス。第2の実験では、検討群は以下のようであった：1
群：高分子量キトサン-pArah2ナノスフェアを1回投与し、次に2週間後に追加抗 原投与、2群：低分子量キトサン-pArah2ナノスフェアを1回投与し、次に2週間後
に追加抗原投与、3群：低分子量キトサン-pArah2ナノスフェアの単回投与、4群 ：PBSを摂取させた未処理のマウス。
【００３９】 試料採取と測定：第一の検討では、免疫後の異なる経過時間に血清および糞抽
出液を採取した。血清の採取は、100 ulの血液を各マウスの尾静脈から採取し、
室温で1時間凝固させ、次いで3000 rpmで25分遠心分離した。得られた上清（血 清）を抗体測定時まで-80℃で保存した。糞抽出液は、新鮮な糞ペレットの1つま
たは2つを採取し、秤量し、PBS（100mg/ml）に溶解した。不溶物を14,000 rpmで
25分間遠心分離し、上清を測定のために-80℃で保存した。抗原特異的ELISA（酵
素結合免疫吸着アッセイ法）を使用して、血清および糞抽出液中の抗-Arah2特異
的IgGまたはIgA濃度を測定した。マイクロタイタープレートを10 ug/ml（100 ul
）の精製Arah2タンパク質を炭酸ナトリウム-炭酸水素ナトリウム緩衝液に加えた
もので一晩コーティングした。4%ウシ血清アルブミン、2%正常ヤギ血清をPBSに 加えたものでプレートを室温で2時間ブロッキングし、次いで血清または糞抽出 液の逐次希釈液と共に18時間インキュベーションし、インキュベーション後、ビ
オチン化抗-IgGまたは抗-IgAをウェルに添加して37℃で1時間インキュベーショ ンした。次いで、プレートをHRP結合ストレプトアビジンと共に室温で30分間イ ンキュベーションし、o-フェニルアデネリン（o-phenyladeneline）（OPD）で展
開した。マイクロプレートリーダー（Bio-rad Lab., USA）を使用して490 nmの 吸光度を読んだ。異なる濃度のマウスIgG、次にビオチン化抗体をプレートにコ ーティングし、その後の段階によりIgG力価を測定した。IgAデータはO.D.値とし
て表した。
【００４０】 抗原投与および防御の検討：追加抗原投与の2週間後、すなわち最初の免疫か ら4週間後に、全てのマウスを粗ピーナッツ抽出液で経口的および腹腔内的に感 作した。感作は1週間間隔でさらに3回実施した。感作後、マウスに1 mgの精製Ar
ah2タンパク質を腹腔内投与し、アナフィラキシー応答を観察し、以下に記載す るように等級分けした。
【００４１】 C3Hマウスにおけるピーナッツ誘導性過敏症： 同系C3Hマウスは、OVAをアジュバントとしてCTxと共に用いて感作後、即時型 過敏症を呈すことが示されている（17）。C3Hマウスの経口感作の影響をピーナ ッツアレルゲン抽出液（PN）を用いて調査するために、本発明者らは種々の感作
プロトコールを使用して検討を実施し、PN-誘導性過敏症を測定するための定量 パラメーターを決定した（16）。マウスのアナフィラキシー症状は、Ag投与から
5〜10分後に発現し、30〜50分後にピークに達した。症状の重症度は抗原投与後 のマウスの行動を観察して判定し、軽度な刺激などの刺激に対する応答別にスコ
アリングした。アナフィラキシーは以下のスコアリングシステムによって分類し
た：0、反応の徴候なし；1、鼻および頭部の周囲をひっかき、こする；2、活動 の低下、呼吸速度の増加、体毛の逆立ちおよび/または目の周囲の腫脹；3、呼吸
困難、口および尾の周囲にチアノーゼ；4、刺激によりわずかに活動もしくは活 動なしまたは振戦、痙攣；5、死亡。このスコアリングシステムは本発明者らの 以前の実験および以前に使用したスコアリングシステムを改良したものに基づい
て確立した（35）。
【００４２】 図1の結果は、DNAナノスフェアで免疫した群では陽性の抗体応答が見られたこ
とを示す。最も重要なことには、過敏症の検討は、DNAナノスフェアで免疫した マウスでは、アナフィラキシーの症状に関しては、有意に改善された応答を示す
（図2）。
【００４３】実施例2 材料： キトサン（Mw-390,000）は米国ワシントン州ヴァンセン（Vansen Inc.,）から
購入した。主要なピーナッツアレルゲン遺伝子Arah2を含有する発現ベクターを 作製するために、コザック（Kozak）コンセンサス翻訳コドンを添加してPCR増幅
したArah2コード領域遺伝子セグメント（親切にも、アーカンサス大学のバノン （Dr.G.Bannon）博士が提供してくれた）を、CMVプロモーター/エンハンサー配 列を含有するpCR3発現ベクターにライゲーションした。得られた発現構築物はpC
MV Arah2と命名した。β-ガラクトシダーゼをコードするプラスミドはフロリダ 大学のバイム（Dr. Barry Byme）博士から提供されたものであった。4〜5週齢の
雄AKR/Jマウスを米国、マサチューセッツ州のジャクソンラボラトリーズ（Jacks
on Laboratories）から入手した。
【００４４】 方法： ナノ粒子製剤： ナノ粒子は、以前に記載したように２４、キトサンおよびDNAを用いて製造し た。簡単に説明すると、10μgのプラスミドを100μlの硫酸ナトリウムに添加し 、55℃に加熱した。キトサン（0.02%）も同じ温度に加熱し、100μlのキトサン を高速で撹拌しながら20秒間でDNA-硫酸ナトリウム溶液に添加した。光学顕微鏡
下で粒子を速やかに観察し、室温で保存した。
【００４５】 粒子の特徴： 米国、マサチューセッツ州のマルベルンインスツルメンツ社（Malvern Instru
ments Inc.,）製のゼータサイザー（Zetasizer）3000を使用して、サイズおよび
ゼータ電位によって粒子を特徴づけた。ディップ細胞水溶液中で測定したゼータ
サイザーおよびゼータ電子（pH 5.7）によって分析した粒子サイズの数分布をナ
ノ粒子の品質管理に使用した。透過型電子顕微鏡および走査型電子顕微鏡でこれ
らの粒子をさらに特徴づけた。TEMでは、製造直後の粒子をグロー放電したカー ボングリッド上にのせ、数分放置し、次いで空気乾燥した。7度においてグリッ ドを白金で回転式シャドウイングした。ザイス（Zeiss）社製の透過型電子顕微 鏡を使用して粒子を可視化した。SEMでは、細胞をカバーガラス上に増殖させ、 ナノスフェアと共に10分間インキュベーションした。インキュベーション後、そ
れらを固定し、等級エタノールで脱水し、数サイクル臨界点乾燥し、白金をスパ
ッターコーティングした。次いで、走査型電子顕微鏡で細胞表面上の粒子を可視
化した。
【００４６】 遺伝子発現： 動物用投与針を使用して、AKR/JマウスにLacZ遺伝子（p43LacZ）を含有するキ
トサン-DNAナノスフェアまたは裸のプラスミドDNA（p43LacZ）を摂取させた。5 日後、動物を犠牲にし、胃および小腸を外科的に切除した。標準的なプロトコー
ルにより、組織全体を4-クロロ-5ブロモ-3-インドリル-β-ガラクトシド（X-Gal
）で染色した。湿潤したチャンバー中で一晩染色した後、ジョンズホプキンス病
院（Johns Hopkins Hospital）、病理学写真室（Pathology Photography）で写 真撮影した。像をコンピュータでスキャンし、アドーブフォトショップ（Adobe
Photoshop）を使用して輝度およびコントラストを等しく調節した。組織をOCT中
で凍結し、薄い切片に切断した。切片をヌクレアーファストレッドで対比染色し
、デジタルカメラを装備した光学顕微鏡下で可視化した。アドーブフォトショッ
プ（Adobe Photoshop）で輝度およびコントラストを等しく調節した。
【００４７】 免疫化： AKR/Jマウスを異なる実験群に分割し、1ｍｌの注射筒に取り付けた動物用投与
針（Fisher Scientific Inc., USA）を使用して種々の製剤を用いて経口免疫し た。各マウスには〜50μgのDNA量を500〜900μlの容量（製剤に応じて）で摂取 させた。異なる実験群および対照群を用いてアナフィラキシー防御実験を実施し
た。免疫したマウスおよび対照マウスから血液および糞抽出液を採取して、糞抽
出物中に分泌されたIgA量、血清中のIgG2a、免疫前後の血清IgEの増加およびAg 投与後の血漿中のヒスタミンの放出を測定した。
【００４８】 血清および糞抽出液の採取： 異なる群のマウスの尾静脈を介して、4週目（感作前）および7週目（感作直後
であるが、抗原投与前）に血液を採取した。室温で30分〜1時間後、血液を4℃で
25〜30分遠心分離し、血清（上清）を採取し、測定時まで-80℃で保存した。免 疫後3週目および4週目に同じ群のマウスから糞ペレットも採取し、測定時まで-8
0℃で凍結した。
【００４９】 ピーナッツアレルギーの感作 全てのマウスは粗ピーナッツ抽出液で1週間間隔で3回感作した。各感作は2日 連続して実施した；初日は、マウスあたり1 mgの粗ピーナッツ抽出液および10μ
gのコレラトキシンを経口投与し、2日目は、マウスあたり0.5μgの抽出液および
アジュバントとして水酸化アルミニウムをi.p.投与した。両場合において、投与
容量はマウスあたり200μlであった。
【００５０】 ELISA測定： 感作前後に採取した血清についてELISAを実施して、IgEおよびIgG2a値を求め 、糞抽出液では、分泌型IgAを測定した。簡単に説明すると、HAS-DNP標準品また
はArah2タンパク質（10μg/ml）を用いて4℃において一晩プレートをコーティン
グした。1%BSA-PBSTを用いて37℃で2時間ブロッキングした。各群について血清 試料をプールし、二回目の測定で添加し（IgEは1:5希釈で、IgG2aは1:20希釈） 、4℃で一晩インキュベーションした。ビオチン化した抗-マウスIgA、IgEおよび
IgG2aを添加し、次にストレプトアビジン-HRPおよびTMB基質を添加した。マイク
ロプレートマネージャー（Bio Rad USA）で450 nmでプレートの値を読んだ。ヒ スタミン測定では、免疫マウスおよび対照マウスに精製Arah2を投与し、12〜15 分後に血液を視動脈から採取し、競合的ELISAに基づいたヒスタミンキット（Imm
unotech Inc., USA）を使用してヒスタミン量について血清を測定した。
【００５１】 Arah2タンパク質の投与： 先ず、免疫されていない（感作された）マウスに200μgのArah2タンパク質をi
.p.投与した。先に報告した論点により、異なる経過時間においてアナフィラキ シー反応を等級分けした。簡単に説明すると、以下の等級分けプロトコールを観
察した。アナフィラキシーは以下のスコアリングシステムによって分類した：0 、反応の徴候なし；1、鼻および頭部の周囲をひっかき、こする；2、活動の低下
、呼吸速度の増加、体毛の逆立ちおよび/または目の周囲の腫脹；3、呼吸困難、
口および尾の周囲にチアノーゼ；4、刺激によりわずかに活動もしくは活動なし または振戦、痙攣；5、死亡。
【００５２】 血管漏出検討： エアバンスブルーアッセイ法を使用してアナフィラキシー性血管漏出を測定し
た。簡単に説明すると、200μlのエアバンスブルー染料をマウスの尾静脈に注射
し、直後に200μgのArah2をi.p.投与した。45分間マウスをモニターして、屠殺 し、四肢の青色の着色によって判断したアナフィラキシー性の血管漏出の影響を
記録した。アナフィラキシーを発現したマウスは、血管漏出により四肢が青色で
あったが、免疫され、アナフィラキシーから防御されているマウスは青色が全く
ないかまたはわずかであると予測される。ニコン（Nikon）社製のカメラを使用 して写真を撮影し、エクタクローム（Ektachrome）スライドとして現像した。ス
ライドをスキャンし、拡大し、アドーブフォトショップ（Adobe Photoshop）を 使用して輝度とコントラストを調節した。
【００５３】 結果： ナノ粒子の合成および特徴づけ： 高分子量（〜390,000）キトサンおよびpDNAを複合体化してナノ粒子を合成し た。高速で撹拌しながら0.02%キトサン、pH 5.7（55℃）をpDNA（50 mM硫酸ナト
リウム中50μg/ml）に添加することによって均一な粒子が得られた。透過型電子
顕微鏡および走査型電子顕微鏡は、製造直後の粒子はサイズが約150〜300 nmで 、ほぼ球状であることを示した（図3a）。本発明者らは、プラスミドはDNアーゼ
による分解から部分的に保護されていることおよびそのゲル移動特性は複合体形
成過程によって変化しないことを４１以前に実証した（データは示していない）
。動的光散乱（Malvern Zetasizer 3000）測定は、100〜200 nmの単峰形数平均 粒子サイズ分布を示した（図3b）。ゼータ電位はpH 5.7において約+10 mVで、pH
7において中性に近かった。これは、胃および早期十二指腸のpHでは粒子は正に
帯電しやすいが、以降のより生理的すなわちアルカリpHでは中性でありやすいこ
とを示唆している。
【００５４】 遺伝子発現検討： 経口DNA投与後の導入遺伝子の発現および分布を検討するために、AKR/Jマウス
にLacZ遺伝子（p43LacZ）を含有するキトサン-DNAナノ粒子または裸のプラスミ ドDNA（p43LacZ）を摂取させた。図4aは、経口投与後5日目の胃および小腸にお ける細菌β-ガラクトシダーゼ（LacZ）の組織発現を示す。染色された切片は、 平均で、小腸全体の10%を占める。未処理のマウスおよび裸のDNAを摂取させたマ
ウスは弱いバックグラウンドの染色を示したが、ナノ粒子を摂取させたマウスは
胃および小腸のどちらにおいてもより高い程度の遺伝子発現をはっきりと示した
。図4bは、ヌクレアーファストレッドで対比染色した組織全体（4aに示す）の凍
結切片を示す。組織学的には、胃および小腸のどちらにおいても上皮細胞だけが
X-galによって強く染色されると思われる。造血細胞の染色は観察されなかった が、免疫組織化学的方法はごく少数のトランスフェクトされた免疫細胞を同定す
るほど感度が十分ではないことがある。
【００５５】 抗-Arah2抗体応答： 粘膜の免疫応答を調節するために経口ナノ粒子依存性遺伝子免疫法を利用する
可能性を検討するために、ピーナッツアレルゲン誘導性過敏症のマウスモデルを
使用した。感受性株のマウスは、アレルギー患者において観察されるものと同様
の特徴を有するアナフィラキシー反応を呈することは以前４２に実証されている
。アナフィラキシーの誘導は、粗ピーナッツ抽出液およびアジュバント[それぞ れ、コレラトキシン（Ctx）およびミョウバン]を用いた経口感作および腹腔内（
i.p.）感作の組み合わせを実施し、次に組換えArah2をi.p.投与することによっ て実施される。過敏性応答には特異的IgE Abの誘導、ヒスタミン、血管透過性お
よび活性型全身アナフィラキシーが含まれる。このモデルを使用して、本発明者
らはまず、pCMV Arah2を含有するナノ粒子の経口投与が重大な免疫応答を誘発す
ることができるかどうか検討した。最初の免疫化後4週目に、分泌抗体および血 清抗体の量の有意な差がナノ粒子で免疫したマウスと対照（PBS摂取すなわち未 処理）または裸のDNA（pCMV Arah2）で免疫したマウスとの間に観察された（図5
a、b、c）。pCMV Arah2-ナノ粒子で免疫したマウスは糞抽出液中の分泌IgAの量 の増加を示した。これは、粘膜免疫応答の誘導を示す。また、ナノ粒子で処理し
た動物において血清抗-Arah2 IgG2aの有意な誘導が観察され、Th1型T細胞応答を
示している。キトサンを併用しないで、pCMV Arah2単独（裸のDNA）を投与され たマウスはどの経過時点においても糞中IgAおよび血清IgG2aの検出可能な量を示
さなかった。アレルギー反応は、主に、Ag特異的血清IgE量の増加によって特徴 づけられるので、本発明者らまた、免疫したマウスおよび対照マウスにおいて感
作前後の抗-Arah2血清IgE量を測定した。血清IgEの増加（感作後マイナス前）は
、対照動物または裸のDNAで免疫した動物と比較して、ナノ粒子で免疫した群で は有意に低かった。
【００５６】 Arah2抗原投与に対する免疫マウスの防御： 図6は、PNによる3回目の感作後1週間目に免疫マウスおよび対照マウスにArah2
タンパク質をi.p.投与直後のアナフィラキシー応答（2つの別個のセットの実験 において）を示す。事前に免疫化を行わず感作単独だけ受けたマウスまたは裸の
DNA（pCMV Arah2）で処理したマウスは、抗原投与の10〜20分以内にアナフィラ キシーの身体徴候を示した。症状には、刺激後のわずかな活動または活動しない
、退縮を伴う痙攣性の呼吸困難および死亡も含まれる。重症度はスコアリングシ
ステムで3〜5と判定された。一方、抗原投与後にキトサン-pCMV Arah2-で免疫し
た動物では重症度が有意に低く（スコア0〜2）、遅延型のアナフィラキシー応答
が観察された。全ての動物は約2時間後には回復した。第2の組の実験では、3回 の感作後に抗原投与したとき、免疫群および対照群の各々から1匹のマウスが突 然死し、アナフィラキシーであるとは思われなかった。この現象は最初の組の抗
原投与実験では観察されなかった。残りのマウスのアナフィラキシー応答は、最
初の組の実験と同様であり、上記のように、ナノ粒子で免疫した動物では有意な
遅延および低下が観察された。
【００５７】 血漿中のヒスタミン濃度および血管漏出： 脱顆粒した肥満細胞からのヒスタミンの放出および血管透過性の亢進は、アナ
フィラキシーを特徴づける重要なパラメータのうちの2つである。ナノ粒子で免 疫化したマウスにおいて観察される遅延型で、重症度の低いPN-誘導性アナフィ ラキシー応答がヒスタミン放出の調節と関連があるかどうかを検討するために、
PN-感作した免疫マウスおよび対照マウスの血漿ヒスタミン濃度をArah2抗原投与
後10〜15分経過時に測定した。図7aは、単回投与した免疫群のヒスタミン濃度は
対照群より有意に低いことを示している。しかし、部分的な防御を示したナノ粒
子追加抗原投与群はヒスタミン濃度の有意な低下を示さなかった。抗原投与時の
血管透過性レベルの変化を求めるために、PN抗原投与の前に、異なる実験群のマ
ウスの尾静脈にエバンスブルー染料を注射した。図7bは、末梢血管からのエバン
スブルーの漏出を示す（皮膚および下肢）。キトサン-DNAで免疫した群のマウス
は、対照群および裸のDNAで免疫した群のマウスと比較して、漏出が有意に少な かった（すなわち、足裏および皮膚の青色の着色）。
【００５８】 考察： 本発明の検討は、経口経路で投与されたキトサン-pDNAナノ粒子は、マウスに おいて免疫系を調節することができ、食物アレルゲンが誘発した過敏症から防御
することができることを実証している。このような経口ワクチンの主要な魅力の
1つは、全身だけでなく粘膜の免疫を形成する可能性である。粘膜の免疫系は全 身の免疫系への抗原の流入を防御するように調節されるだけでなく、食物抗原に
対して無応答性となる。ピーナッツアレルギーは、通常は無反応である免疫系が
摂取されたタンパク質に対して過敏性となり、強力で異常なアナフィラキシー反
応を呈する「粘膜疾患」である。従って、食物アレルゲン誘導性のアナフィラキ
シーから宿主を防御するためには、粘膜免疫系を事前に調節することが理想的で
ある。さらに、特に小児において経口投与に対する患者の遵守性が高いとこのよ
うな輸送系に大きな利点が与えられる。ポリ-ラクタイド-コ-グリコライド（PLG
）マイクロスフェアに封入したDNAの経口投与はロタウィルス感染症に対する免 疫応答を形成することができることが報告されている。ラットモデルにおいて乳
糖耐性を矯正するための経口遺伝子投与もアデノ-結合-ウィルス-ベクターを使 用して実施されている４５。キトサンは、報告されている接着性と腸内への輸送
性のために魅力的な経口遺伝子担体である。さらに、キトサンは、pDNAと複合体
形成すると、胃腸管内の細胞によってエンドサイトーシスされることができる安
定なナノ粒子を形成することができる。キトサン-p43LacZ投与後のβ-ガラクト シダーゼ発現によって示されるように、キトサンは粘膜接着性ポリマーであるの
で、DNA-ナノ粒子は胃腸管上皮に接着し、M-細胞によって粘膜境界を通過して輸
送され、直接または「抗原輸送」によって上皮および/または粘膜細胞を通過し て腸管関連リンパ系組織に入ると思われる。インビトロの検討によっても、キト
サンは、小腸上皮単層膜を通過した経細胞輸送および細胞周囲への輸送を増大す
ることができることが示されている。
【００５９】 ナノ粒子で免疫したマウスにおけるアナフィラキシー応答は、粒状製剤のプラ
スミドDNAの単回経口投与によって、アレルゲン投与に対する大きな防御を得る ことができることを示している。残念なことに、単回追加抗原投与の結果は確定
的ではなく、多数回投与の影響および最適なワクチンプロトコールの動態学を検
討するにはさらに検討を実施することが必要であることを示している。抗原投与
後の追加抗原投与群における血漿ヒスタミン濃度はアナフィラキシーの防御を示
すとは思われない。同程度の防御が観察されるということは、このマウスモデル
におけるアレルギー性アナフィラキシーの病因が多因子性であることを示唆して
いる。
【００６０】 上記の実施例は原則を実証するためにIgE応答を利用しているが、これは抗原 に対して誘発される有用な応答の一例にすぎない。本明細書に教示するナノスフ
ェアを使用した経口ワクチン化によっていかなる種類の免疫応答も調節すること
ができる。
【００６１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ピーナッツ抗原をコードするDNA-キトサンナノスフェアおよび裸
のDNAの種々の製剤で経口免疫したAKR/Jマウスにおける免疫応答。上のパネル：
免疫後4週目および6週目の血清中のIgG応答。精製マウスIgGを標品として使用し
て、力価（ng）を算出した。下のパネル：免疫後3週目および4週目の糞抽出液中
のIgA応答。490 nmにおけるO.D値はここでは希釈しない試料について報告してい
る（PBSに溶解した100 mg/ml糞ペレットの上清）。各棒グラフは8匹の動物のプ ールした試料の値を示す（陰性対照の場合は5匹）。
【図２】 防御研究。みせかけ飼養およびpArah2-ナノスフェア免疫AKR/Jマ
ウスに、粗ピーナッツ抽出液を経口および腹腔内投与して1週間間隔で4回感作し
た。感作後、マウスに精製Arah2タンパク質1mg/マウスを腹腔内投与して抗原投 与し、時間間隔にわたってアナフィラキシー応答について調査した。右のパネル
：1時間後のマウスのアナフィラキシーの程度。左のパネル：抗原投与後30分の 異なる群の比較。C390=高分子量キトサン。PCL113=低分子量キトサン。丸はそれ
ぞれ1匹のマウスを示す。
【図３】 図3aはキトサン-DNAナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真を示す。調
製直後の粒子をグロー放電したカーボングリッド上に吸着させ、空気乾燥し、7 ℃において白金で回転式シャドウイングを実施した。グリッドはザイス（Zeiss ）電子顕微鏡（Carl Zeiss Inc. USA）下で観察した。スケールバー＝210 nm。 図3bは調製直後のナノ粒子のサイズ分布を示す。サイズは、マルベルンゼタシザ
ー（Malvern Zetasizer）3000、（Malvern Instruments Inc.）を使用した光子 相関分光光度計（動的光散乱）を使用して測定した。データは「自動」分析モー
ドで分析し、数の分布としてプロットした。
【図４】 LacZ遺伝子の経口輸送後のマウス胃および小腸におけるβ-ガラ クトシダーゼ発現。材料と方法に記載するように、マウスを屠殺し、胃および小
腸を外科的に切除し、X-galを使用してLacZを染色し、写真撮影した。 図4a LacZについて染色した組織全体。染色された部分だけを示す。群を以下
に示す： 1.高分子量キトサン-p43LacZナノスフェア、マウスあたり40μg。 2.高分子量キトサン-p43LacZナノスフェア、マウスあたり100μg。 3.未処理（PBS飼育） 4.裸のDNA（p43LacZ） 図4b 1の組織の組織切片（図2a） 核はヌクレアーファストレッドで対染色した。
【図５】 図５ａは、最初の免疫後3週目および4週目の糞抽出液中の抗-Ara
h2 IgA応答を示す。490 nmにおけるO.Dはここでは希釈しない試料について報告 している（方法に記載するように、PBSに溶解した100 mg/mlの糞ペレットの上清
）。各棒グラフは8匹のマウスのプールした試料の値を示す（陰性対照の場合に は5匹）。図5bは、感作前の血清中の抗-Arah-2 IgG2a濃度を示す（最初の免疫後
4週目）。血液は尾静脈から採取し、Arah-2特異的ELISAを使用して血清をアッセ
イした（方法に記載するように標準として抗-DNP mAb IgG2a）。各棒グラフは2 回測定した5匹のマウス（免疫していない動物では2匹）のプール試料を示す。図
5cは感作後の血清中の抗-Arah-2 IgEの増加を示す。血清は最初の免疫後（感作 前）および3回の感作後4週目に同じ動物から採取した。ELISAを使用してIgE濃度
を測定した（方法に記載するように標準として抗-DNP mAb IgE）。各棒グラフは
、5匹のマウス/群（免疫していない動物では2匹）のプール血清中の感作後と感 作前のIgE濃度の差を示す。 全ての図において、G1：キトサン-pArah2ナノ粒子（単回投与）で免疫したマ ウス。G2：キトサン-DNAナノ粒子の2回投与（1週間間隔）で免疫したマウス。G3
：裸のpArah2で免疫したマウス。G4：免疫しないマウス。
【図６】 Arah2抗原投与後の6匹のマウスの（2つの別個の実験における） 平均的なアナフィラキシー応答。対照およびキトサン-pArah2ナノ粒子で免疫し たマウスは、粗ピーナッツ抽出液の経口投与およびi.p.投与で1週間間隔で3回感
作した。感作後、マウスに組換えArah2タンパク質の200μg/マウスをi.p.投与し
、示した時間間隔にわたってアナフィラキシー応答について調査した。以下のス
コアリングシステムによってアナフィラキシーを分類した：0、反応の徴候なし ；1、鼻および頭部の周囲をひっかき、こする；2、活動の低下、呼吸速度の増加
、体毛の逆立ちおよび/または目の周囲の腫脹；3、呼吸困難、口および尾の周囲
にチアノーゼ；4、刺激によりわずかに活動もしくは活動なしまたは振戦、痙攣 ；5、死亡。G1：キトサン-pArah2ナノ粒子（単回投与）で免疫したマウス。G2：
キトサン-DNAナノ粒子の2回投与（1週間間隔）で免疫したマウス。G3：裸のpAra
h2で免疫したマウス。G4：免疫しないマウス。
【図７】 図7aは、（方法に記載するように）感作および抗原投与後の免疫
マウスまたは対照マウスにおける血漿ヒスタミン（2匹のマウスの平均）値を示 す。抗原投与後10〜15分に、視動脈から血液を採取し、競合的なELISAに基づい たヒスタミンキット（Immunotech Inc., USA）を使用してヒスタミン濃度につい
て血漿を測定した。図7bは血管漏出測定を示す。免疫および対照マウスに、抗原
投与直前に、200μlのエバンスブルーを注射した。材料と方法に記載するように
、Arah2の腹腔内投与を実施し、四肢における血管漏出についてマウスをモニタ ーした。末梢組織の青色の着色（G3、裸のDNAで免疫）は、アナフィラキシーま たはアレルギー応答の結果として毛細血管の透過性の亢進により血管床を通過し
た染料の漏出を示す。青色の着色が見られないものは（G1およびG、キトサン-Ar
ah-2-ナノ粒子で免疫し、追加抗原投与を行った、または行わなかったマウス） アナフィラキシー性の血管漏出がないことを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/35 Ａ６１Ｋ 39/35 47/36 47/36 47/42 47/42 48/00 48/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ハン ショウ−ク アメリカ合衆国 メリーランド州 ボルチ モア モニュメント ストリート 2024 イー． スート ２−100 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー (72)発明者 サンプソン ヒュー アメリカ合衆国 メリーランド州 ボルチ モア モニュメント ストリート 2024 イー． スート ２−100 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー (72)発明者 レオン カン ダブリュ． アメリカ合衆国 メリーランド州 ボルチ モア モニュメント ストリート 2024 イー． スート ２−100 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー Ｆターム(参考） 4C076 AA31 BB01 CC06 EE30 EE41 EE42 FF66 4C084 AA13 MA41 MA52 NA10 ZB092 ZB312 4C085 AA03 BA02 BA05 BA07 BA49 BA51 BB01 BB03 EE05 GG08 4C086 AA01 AA02 EA16 MA03 MA05 MA41 MA52 NA10 ZB02 ZB05 ZB09 ZB26 ZB31

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の段階を含む、抗原に対して哺乳動物をワクチン化する
    方法： ポリマー多価陽イオンおよび多価陰イオンのコアセルベートを含む5μmより小さ
    い固体のナノ粒子を含むワクチン化製剤を経口投与する段階であって、該多価陰
    イオンが抗原をコードする核酸である段階。
  2. 【請求項２】 ポリマー多価陽イオンがゼラチンおよびキトサンからなる群
    から選択される、請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項３】 核酸が、抗原をコードするオリゴヌクレオチドに機能的に結
    合するプロモーターを含む発現ベクターを含む、請求項1に記載の方法。
  4. 【請求項４】 抗原がアレルゲンである、請求項1に記載の方法。
  5. 【請求項５】 抗原が食物アレルゲンである、請求項1に記載の方法。
  6. 【請求項６】 ワクチンが食物中で製剤化される、請求項1に記載の方法。
  7. 【請求項７】 ワクチンが飲料中で製剤化される、請求項1に記載の方法。
  8. 【請求項８】 経口摂取に好適であって、ポリマー多価陽イオンおよび多価
    陰イオンのコアセルベートを含む5μmより小さい固体のナノ粒子を含み、多価陰
    イオンが抗原をコードする核酸であるワクチン製剤。
  9. 【請求項９】 ポリマー多価陽イオンがゼラチンおよびキトサンからなる群
    から選択される、請求項8に記載のワクチン製剤。
  10. 【請求項１０】 核酸が、抗原をコードするオリゴヌクレオチドに機能的に
    結合するプロモーターを含む発現ベクターを含む、請求項8に記載のワクチン製 剤。
  11. 【請求項１１】 抗原がアレルゲンである、請求項8に記載のワクチン製剤 。
  12. 【請求項１２】 抗原が食物アレルゲンである、請求項8に記載のワクチン 製剤。
  13. 【請求項１３】 細胞標的リガンドが該ナノ粒子に結合される請求項8に記 載のワクチン。
  14. 【請求項１４】 標的リガンドが、グルタールアルデヒド架橋によって該ナ
    ノ粒子に共有結合される請求項8に記載のワクチン。
  15. 【請求項１５】 ポリマー陽イオンがゼラチンである請求項8に記載のワク チン。
  16. 【請求項１６】 ポリマー陽イオンがキトサンである請求項8に記載のワク チン。
  17. 【請求項１７】 抗原がウィルス抗原である請求項8に記載のワクチン。
  18. 【請求項１８】 抗原が細菌抗原である請求項8に記載のワクチン。
  19. 【請求項１９】 抗原が腫瘍関連抗原である請求項8に記載のワクチン。
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