JP2957005B2

JP2957005B2 - 粘着性薬物送達組成物

Info

Publication number: JP2957005B2
Application number: JP2500218A
Authority: JP
Inventors: イラム，リスベス; ウィリアムズ，ポール; ジェームズキャストン，アントニー
Original assignee: DANBAIOSHISUTO YUU KEE Ltd
Current assignee: DANBAIOSHISUTO YUU KEE Ltd
Priority date: 1988-11-08
Filing date: 1989-11-03
Publication date: 1999-10-04
Anticipated expiration: 2014-10-04
Also published as: WO1990004963A1; GB8826116D0; GB9109769D0; EP0442949B1; JPH04502910A; US6387408B1; GB2243778A; US6355276B1; DE68909242D1; DE68909242T2; EP0442949A1; GB2243778B

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、薬物送達組成物（drug delivery composit
ion）、特に胃腸器官を経由する薬物投与のための薬物
送達組成物に関するものである。

胃腸器官は薬理学的組成物を投与するうえで一つの主
要な投与経路となっている。薬物は通常、カプセル、錠
剤および懸濁液状に調剤されて投与され、特に腸におい
て良く吸収される。最近になって、このような製剤から
薬物が単位時間あたりに放出される量を調整することに
よって薬物投与による治療有効時間を延ばすための方法
および手段の開発が行なわれるようになってきた。通
常、このような放出量調整によって薬物投与は一日に一
回に抑えられ、これによって副作用等の問題や、患者側
の負担を軽減することが可能となる。

しかし、このような薬物放出量調整は、胃腸器官の特
性を考慮してなされる必要が有る。例えば、ある薬物の
吸収にとっては重要な部位である小腸における物質の急
激な通過を考慮する必要がある。ノッチンガム大学にお
けるデイビスらの最近の研究によれば、この小腸におけ
る物質の通過は３時間あるいはそれ以下の時間でなされ
ることが明らかにされている。よって長時間にわたる薬
物放出、例えば24時間にわたる薬物放出がなされるよう
に薬剤の調製を実施したとすると、このような薬物が放
出される前に薬剤は小腸を通過してしまい、十分な治療
効果を得ることは困難である。

もし、小腸において前記薬物放出量調整がなされた形
状の薬剤が捕捉されるようにすれば、長時間にわたる薬
物放出を計画的に繰り返して実施することが可能とな
る。

最近、ムコまたはビオ粘着特性を有する合成ポリマー
を利用することについての研究がなされている。例え
ば、WO85/02092ではそのようなポリマーとして交差結合
したアクリル酸とメタクリル酸ポリマーが開示されてい
る。しかし、このような合成ポリマーはその薬物動態に
関して問題があり、特に粘膜またはグリコカリックス
に、または直接的に小腸細胞表面に結合する性質がある
のだが、一方で容易に捨てられる、すなわち小腸から排
出されるものでなければならない。切除された消化器官
をを用いたインビトロ（in vitro）での実験はインビボ
（in vivo）における条件を反映したものであるとは考
えられず、また物質が小腸を通過する動態を明らかにす
るものではない。

そこで、本発明の好ましい態様の目的は、上記欠点を
克服し、胃腸器官を標的とし、そして薬物をこの標的器
官上に一定時間維持しておく薬物送達システムを提供す
ることを目的とする。例えば、小腸においては、長時間
にわたって単位時間あたりに必要な投与量を投与するこ
とが可能になる。また、時間を延ばすことによって単位
時間あたりの投与量を少なくし、有害反応および副作用
をより少なくすることが可能となる。

よって、本発明は薬物送達システムを提供するもの
で、好ましくはこの薬物送達システムは薬理学的活性を
有する物質を含む複数の粒子を含むもので、また好まし
くはこの粒子の大きさは20ミクロンもしくはそれ以下の
大きさであり、さらにこのような粒子の少なくとも一部
はその表面に細菌由来の生物粘着物質を取り込んでお
り、この物質によって小腸に付着することが可能とな
る。

この明細書において使用される「薬物」という用語の
意味には薬理学的に活性のある化合物または抗原含有物
質も含まれる。

また、「生物粘着物質」とは腸壁に粘着（結合）する
ことが可能な物質を意味する。細菌由来の生物粘着物質
は、細菌そのものから単離されるもののみならず、化学
合成することも可能であり、またはそのような物質の断
片または類似体を用いることも可能である。

例えば、文献WO88/07078に開示されているように、こ
のような生物粘着物質はすでに医学分野において使用さ
れているが、その場合生物学的物質をイモビライジング
（不動化）物質に結合させること、例えば担体物質に血
液凝固剤を結合させるようなことのみに使用されている
にすぎない。このような従来技術には腸壁に対して直接
的作用する薬剤にこの生物粘着物質を用いることに関し
てはなんら示唆されていない。

哺乳類胃腸に結合可能な生物粘着物質を単離すること
が可能な微生物としては、大腸菌（Ｅ．coli）、クレブ
シエラ（Klebsiella spp.）おびサルモネラ（salmonell
a spp.）などが挙げられる。

好ましくは、生物粘着物質はエスケリチア・コリ（Es
cherichia coli、以下大腸菌と呼ぶ）、特にヒトの胃腸
に感染するその細菌株から、またはそのような物質に該
当するものから得られる。

小腸内においては、ある細菌属が非常に良く粘着する
ことが知られている。例えば、大腸菌は線毛（pili;fim
briae）と呼ばれる表層タンパク質によって粘着する。
大腸菌は以下のような線毛型を発現する。

（ａ）マンノースによって粘着特性を阻害される１型ま
たは「共通」型線毛（マンノース感受性線毛）。

（ｂ）Ｐ−線毛（マンノース抵抗性）。

（ｃ）マンノース抵抗性のコロニー形成因子抗原（CFA
IまたはCFA II）。

これらのもののなかで、本発明に特に関連するもの
は、（ａ）クラスのものである。これらの物質は、精製
に際してモルモット赤血球の凝集反応によって同定する
ことができる。大腸菌の１型線毛の場合、飽和グアニジ
ン塩酸による変性の後のドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって17キロダルトン（kD
a）のサブユニットタンパク質が検出される。他の細
菌、例えばクレブシエラ（Klebsiella spp.）ではサブ
ユニットタンパク質は大腸菌のものよりもわすかながな
がら大きいかまたは小さいものとして検出される。最後
に、与えられた細菌から単離された１型線毛は、ドット
およびウエスタンイムノブロットにおいて同一細菌から
得られた１型線毛に対する抗血清と反応することが期待
される。

大腸菌（Ｅ．coli）から事前に単離された１型線毛は
複数のポリペプチドからなり、それぞれの分子量は約14
kDa、17kDaおよび28kDaである。例えば、ハンソンとブ
リントンの文献:Hanson ＆ Briton,Nature 332,265（19
88）およびハンソンらの文献:Hanson et al.,J.Bact.17
0（８）,3350（1988）を参照せよ。これらの文献に記載
されている分子量が28kDaからなるポリペプチドは、ア
ブラハムらの文献:Abraham et al,Infect.＆ immun.56
（５）,1023−1029,1988に記載されている分子量が29kD
aからなるFimHポリペプチドと同一のものと考えられ
る。アブラハムらの文献（前掲）ではFimHが大腸菌の結
合に対する免疫性を与えれることが示されているが、し
かし腸壁に対する薬物または抗原を腸壁に結合させるた
めにこのFimHを用いることに関してはなんら記述されて
いない。17kDaポリペプチドは１型線毛を構成するポリ
ペプチドのなかで主要なものである（メージャーポリペ
プチド）。微生物は粘着分子（アドヒシン（adhesin）
および糖残基（例えばマンノオシド））によって胃腸管
に強固に粘着することができる。本発明においては個々
の粘着ポリペプチドを単離および精製することによって
同様な粘着効果を得ることが可能であろう。例えば、ア
ドヒシンをウサギに投与すると、アドヒシンが胃腸管に
粘着すると考えられる。

あるいは、ポリペプチドよりも大きなフィムブリノソ
ーム（fimbriosomes）と呼ばれるものを用いることも可
能である。このフィムブリノソームはアブラハムらの文
献:Abraham et al,Infect.＆ immun.56（５）,1023−10
29,1988に開示されている。

本発明では、微生物から産生されるアドヒシンおよび
それと同様の生物粘着性物質を胃腸器官における薬物の
一定時間にわたる放出量調整のための機構、すなわち薬
物送達システムに利用する。この薬物送達システムは、
好ましくは小さな粒子（大きさが数ミクロン）からなる
ものである。なぜなら粘着物質によって糖残基、レクチ
ン媒介プロセスによって胃腸器官の壁に粒子が結合可能
となるようにするためである。アドヒシンは粒子にコー
トされるか、もしくは粒子の表面に共有結合（移植）さ
れる。好ましいアドヒシンは細菌由来のアドヒシンで、
これは大腸菌から得られる。しかし、ほかにも多くのア
ドヒシン産生細菌が利用可能であり、そのような細菌と
してシュードモナス（Pseudomonas aeruginosa）が挙
げられる。

また、線毛物質の粘着性特性は、完全な線毛構造を必
要とするものではなく、適当な断片状のものまたは同様
な粘着特性を示す完全なアミノ酸配列を有する合成産物
でもよい。このようなペプチドの調製は、アブラハムと
ビーキイーの文献:Abraham ＆ Beachey,J.Bact.169
（６）,240,（1987）に開示されている。さらに、この
粘着性物質は特にVDAGTVDQTVQLGC（すなわち、Val−Asp
−Gly−Thr−Val−Asp−Gln−Thr−Val−Gln−Lys−Gly
−Cys）と呼ばれる大腸菌１型線毛タンパク質残基23−3
5からなるものである。このようなペプチドは従来から
既知の方法によって合成される。

同様に、アドヒシンと同様の構造を有する合成ペプチ
ドは小腸壁と投与されたコロイド状粒子との間の相互作
用を増強させる同様の効果を有する。精製アドヒシン物
質または合成類似体は高分子担体として利用可能であ
り、この高分子担体において薬物はアドヒシン分子に直
接結合し、そして微粒子に取り込ませる必要が無い。

薬物含有粒子の表面に対する線毛の結合は、共有結合
またはペプチドの疎水性領域と適当な粒子（例えば、ポ
リメリックマイクロスフェア、ポリスチレン、ポリメチ
ルメタクリレート、ポリアルキルシアノクリレート、エ
マルジョン（トリグリセリド））の疎水性表面との間に
おける吸着によってなされる。マイクロスフェアとタン
パク質との結合のメカニズムはイリュウムおよびジョー
ンズの総説:Illum ＆ Jones,Methods in Enzymology 11
2,67−84（1985）を参照するとよい。

タンパク質を結合させる他の方法は、適当な結合基の
結合または吸着によって粒子表面の修飾が行なわれた後
にタンパク質が結合することも含まれる。このようなも
のの例として、アルブミン、ゲラチン、デキストラン、
アルギン酸、ポリラクチド／グリコライド、ポリヒドロ
キシブチレート、ポリアンヒドリドマイクロスフェアお
よびリポソームが挙げられる。

調剤として乾燥状のものが好ましいが、懸濁液状のも
のでもよい。例えば、ポリエチレングリコールまたはト
リグリセリドオイルである。実際の薬物の調剤において
は、マイクロスフェアまたはマイクロカプセルのような
多微粒子状薬物含有システム（好ましくは大きさが1mm
以下であること）が好ましい。薬物のマイクロスフェア
またはマイクロカプセルへの取り込みは、調製過程（例
えば、エマルシフィケーション、ポリメリゼーション）
または調製後（リモートローデイング）において実施さ
れる。

線毛物質は粒子調製段階（粒子表面に結合する場合、
タンパク質はエマルジョンの好適な安定剤となる）また
はポリメリゼーション段階においてその表面に移植され
る。

このような概念は経口投与される薬物に当てはめるこ
とができよう。そのような薬物にはセファロシポリン、
クロルチアジン、イソソルビッドおよびフルセミド（こ
れは小腸の上側領域で吸収される）。また、結腸で吸収
される経口のあるペプチドとしてインシュリン、成長ホ
ルモン、カルシトニン、インターフェロンおよび腫瘍壊
死因子が挙げられる。

以下、本発明の好適な実施態様を実施例によって表わ
す。

実施例１栄養培地で培養した大腸菌（Escherichia coli）AD9
777株から１型線毛を得た。そして、モルモット赤血球
細胞を用いて１型線毛の凝集特性を調べた。

すなわち、大腸菌を遠心によって集め、つづいて下記
に示す方法にもとづいてマイクロフルイダー装置（マイ
クロフルイデイックスコーポレーション）によって線毛
（fimbriae）を除去した。粗調製産物を遠心分離によっ
て精製し、得られた精製産物を凍結保存した。この線毛
タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
ってキャラクタライズした。細菌由来１型線毛の抗体を
ウサギによって産生させ、イムノブロッテイング、エリ
ザ（ELISA）分析に用いた。

より具体的には、線毛タンパク質は以下のようにして
得た。線毛タンパク質の採取と調製の安定化を図るため
に、マイクロフルイダイザー（microfluidizer Model M
110,Mjcrofluidics,Newton,Mass,USA）を用いた。その
装置は従来から用いられているエマルジョン調製用高圧
ホモゲナイザーである。これは水浸ジェット理論（subm
erged jet theory）にもとづくもので、２つの同一の流
れ（ストリーム）が限定されたマイクロチャンネル内で
正確に相互に影響し合う高速度で動く。この２つのスト
リームの相互作用は、細菌懸濁液の場合、細胞を崩壊さ
せる。増殖して単離された細菌からなる２％W/v懸濁液
を作った。この懸濁液をマイクロフルイダイザーに添加
し、圧力を500psiから6000psi（3.4から41.4MNm^-2）ま
で徐々に増加させた。各圧力段階で装置内において懸濁
液を回転させ、冷却遠心した。つづいてこの懸濁液を採
取し、そして４℃で保存した。そしてペレットを再懸濁
し、高圧で前記操作を繰り返した。懸濁液が半透明状に
なってきたら、それは細菌細胞が破壊されたことを意味
するので、圧力の増加は必要がない。このような状態に
なった懸濁液を凍結乾燥し、この凍結乾燥された懸濁液
に含まれるタンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動（SDS−PAGE）によって調べた。その結果、500ps
i（3.4MNm^-2）の圧力において主要な線毛タンパク質は
小量のコンタミを含んだ状態で剥がれることがわかっ
た。また、6000psi（41.4MNm^-2）では細菌は完全に崩壊
したことがわかった。

精製線毛物質はその物質上に、あるいはコロイド粒子
であるポリスチレンラテックスに結合して赤血球を凝集
させることができる。このような凝集効果はマンノース
によって阻害することができる。このことから、この凝
集はマンノース特異的結合部位（レクチン−媒介）に対
する結合によって媒介されていると考えられる。

実施例2:インビトロ（in vitro）結合小腸に対する１型線毛タンパク質の粘着能をラット小
腸から得たサック（gutsacs）を用いたインビトロの系
によって測定した。ある長さの空になったラット小腸の
一端をけっさつ糸で縛り、そして1mlの線毛懸濁液（100
ng/ml）を注意深く注いだ。この線毛懸濁液は前記のよ
うにして得られた線毛をリン酸緩衝塩類（PBS緩衝液、p
H7.4）に懸濁させたものである。注入後、他の端を同様
にして縛り、サック状にした。そして、このサックを20
mlの酸素添加インキュベーションメジウムを含むフラス
コに入れ、37℃で30分間のインキュベーションを行なっ
た。インキュベーション後、サックを取り出し、線毛懸
濁液を試料にして、ドット・ブロット法によってその線
毛含有量を調べた。それぞれの実験をα−メチルマンノ
シド存在下および非存在下において３回繰り返した。

ドット・ブロット法から得られた結果は、インキュベ
ーションメジウムに含まれる線毛タンパク質が減少し、
それが腸に結合したことを示した。

実施例3:アドヒシンのインビボ（in vivo）結合前記のようにして調製された１型線毛タンパク質を通
常の方法を用いてヨード−125（¹²⁵I）標識し、生物組
織中においてこのタンパク質の検出が容易となるように
した。

この¹²⁵I標識タンパク質からなる懸濁液を麻酔かつ絶
食されたラット（ウイスター種、300gアダルト）から単
離された小腸に投与した。麻酔状態を２時間維持させて
からラットを殺し、その全小腸を摘出して1cmの断片に
切断した。それぞれの断片をガンマカウンターにかけて
放射能を測定した。複数のラットについて同様の実験を
繰り返し、それぞれのラットについての活性の分布状況
をプロットし、また腸に結合した全活性量を求めた。い
ろいろな粘着阻害剤の同時投与から、活性は線毛タンパ
ク質に結合したものてあり、この¹²⁵I標識線毛タンパク
質からの遊離¹²⁵I放出は認められなかった。また、阻害
剤存在下の場合と比較して、阻害剤非存在下投与の場合
は全体の15−20％以上の活性が腸に結合したものであっ
た。ここで用いられた阻害剤は非標識線毛タンパク質と
α−メチルマンノシドである。

実施例4:コーテッド粒子のインビボ’（in vivo）結合ここでは実施例３と概略同じであるが、モデル粒子は
１型線毛によって被覆（コート）されたものであり、こ
のような被覆された粒子（コーテッド粒子）を前記した
ような方法にもとづいて腸に投与した。また、粒子はポ
リスチレン粒子を用いた。そして、この粒子をヨード−
125存在下、コバルト60照射することによって¹²⁵I標識
を行なった。粒子は洗浄後に線毛タンパク質によって被
覆された。粒子の一部を線毛タンパク質からなる懸濁液
に室温で24時間懸濁した。この時間経過後、粒子を遠心
し、上清を捨てた。線毛被覆粒子（さもなければ感作さ
れた粒子）を前記したようにしてラットに投与した。ま
た、感作された粒子感作された粒子を遊離線毛として用
いて、前記したようにして得られた結果を評価した。活
性の分布状況と全活性量とをプロットした。それぞれの
実験系で得られた小腸に結合した全平均活性量比を計算
し、そしてそれぞれについて値をプロットした。また、
これらの値に対してＴ−検定を実施した。

結果から、感作された粒子感作された粒子はラットの
小腸に顕著に結合した。腸における平均活性量比は、35
から40％で、対照群のものよりも実験群のものは15から
20％以上も大きかった。この結果の統計的解析によれ
ば、95％信頼限界に対して、有意であった。

調剤（FORMULATION）担体としてのアルブミン調剤は以下のプロセスによってなされた。水溶生アル
ブミン溶液を薬物に添加し、得られた水溶生溶液を油
（適当な表面活性剤とともに）に分散させて、水中油エ
マルジョン（water−in−oil−emulsion）を得た。この
産物を加熱してアルブミンの変性と交差結合を誘導し、
マイクロスフェア（microspheres）を得た。得られたマ
イクロスフェアを洗浄した。最後に、線毛物質を吸着ま
たは共有交差結合（カルボジイミドまたは他の両機能カ
ップリング剤を用いて）によってマイクロスフェアに結
合させた。

担体としてのポリラクチド／グリコリドポリラクチド／グリコリド共重合体をまず溶媒（こあ
れはまた薬物の溶媒でもある）に溶かし、この得られた
溶液を用いてて水中油エマルジョン（water−in−oil−
emulsion）を調製した。つづいて溶媒を除去して、薬物
を含む固形のマイクロスフェアを残した。最後に、前記
したように線毛物質を吸着または共有交差結合によって
結合させた。あるいは、マイクロスフェアを二重エマル
ジョン（水中油）プロセスを用いて調製可能である。

アルギン酸マイクロカプセル薬物をまずアルギン酸ナトリウム溶液に溶解し、アル
ギン酸のドロップを塩化カルシウム溶液に添加してマイ
クロカプセルを形成させた。このようにして得られたマ
イクロカプセルを分離し、このマイクロカプセルの表面
に線毛物質を結合させた。

すべての実験において、線毛物質は二者択一的にエマ
ルシフィケーション段階に含まれることが可能であり、
これは好適であり、とくに油−水の調剤（oil−water f
ormulation）に好適である。線毛物質のエマルジョンま
たはリポソームへの取り込みは、脂質（例えば脂肪
酸）、リン脂質（例えばフォスファチジル−エタノール
アミン）またはステロイド（例えばコレステロール）へ
のタンパク質の結合によって達成される。すでに知られ
ているように、脂肪部分はモノクローン抗体と類似の方
法でもってエマルジョン／リポソームによく合致する
（例えば、前掲のイルムとジョーンズの文献を参照せ
よ）。

もし、必要ならば、本発明の調剤は腸溶性被覆物によ
って被覆可能である。これによって、薬物やアドヒシン
を胃における酸性またはタンパク質分解性消化から保護
し、腸壁に結合するために露出されたアドヒシンを残
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 47/46 Ａ６１Ｋ 9/14 Ｋ (72)発明者ウィリアムズ，ポールイギリス国ＮＧ８１ＨＲノッティンガムウォラトンレーンラフグローブ 41 (72)発明者キャストン，アントニージェームズイギリス国ＮＧ７１ＤＬノッティンガムザパークホープドライブ 23 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 47/42,47/46

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】薬物と、哺乳類動物の小腸に結合する細菌
から得られる天然の生物粘着物質とを含むことを特徴と
する薬物送達組成物。
【請求項２】請求項１記載の組成物であって、前記薬物
は複数の粒子として存在することを特徴とする薬物送達
組成物。
【請求項３】請求項２記載の組成物であって、前記粒子
は平均直径が20ミクロン以下であることを特徴とする薬
物送達組成物。
【請求項４】請求項２または３記載の組成物であって、
前記粘着物質は前記薬物粒子に共有的に結合しているこ
とを特徴とする薬物送達組成物。
【請求項５】請求項２から４のいずれか一項記載の組成
物であって、前記粘着物質からなる層は実質的にそれぞ
れの粒子を被覆していることを特徴とする薬物送達組成
物。
【請求項６】請求項１から５のいずれか一項記載の組成
物であって、前記粘着物質は大腸菌の１型アドヒシンに
見出されるものであることを特徴とする薬物送達組成
物。
【請求項７】請求項６記載の組成物であって、前記粘着
物質は大腸菌のアドヒシンの28キロダルトンからなるポ
リペプチドを含むことを特徴とする薬物送達組成物。
【請求項８】請求項１から７のいずれか一項記載の組成
物を調製する方法であって、薬物と、薬物のための担体
と、細菌から得られる天然の生物粘着物質とを組合せ
て、前記粘着物質が哺乳類動物の小腸に結合するように
されていることを特徴とする薬物送達組成物調製方法。
【請求項９】哺乳類動物において使用するための請求項
１から７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】胃腸器官を経由する薬物の送達において
使用するための請求項１から７のいずれか１項記載の組
成物。