JP2002508192A - 核酸をシーケンスするための質量分析法 - Google Patents
核酸をシーケンスするための質量分析法Info
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Abstract
(57)【要約】
DNA依存およびRNA依存RNAポリメラーゼを含むRNAポリメラーゼを用いる、核酸をシーケンスするための質量分析法を提供する。その方法には、RNAポリメラーゼを用い、ネストした一群のRNA転写産物を生成させ、それをマススペクトロメトリーで分析することを含む。転写ターミネーターおよびアテニュエーター配列を同定する方法をも提供する。
Description
【0001】 関連する応用 標題が“核酸をシーケンスするための質量分析法”であって、Changwon Kang 、Young-Soo Kwon、Young Tae Kim、Hubert Koester、Daniel Little、Maryanne
O'Donnell、Guobing Xiang、Charies CantorおよびDavid Loughによる1997
年12月15日付け米国特許出願番号08/990,851に基づき優先権の利
益を請求する。許されるならば、この出願の対象物すべてを引用によりこの文書
に加える。
O'Donnell、Guobing Xiang、Charies CantorおよびDavid Loughによる1997
年12月15日付け米国特許出願番号08/990,851に基づき優先権の利
益を請求する。許されるならば、この出願の対象物すべてを引用によりこの文書
に加える。
【0002】 この出願の対象物は以下の仮特許出願、国際出願および特許に関係する。米国
特許出願番号5,605,798、5,622,824および5,547,835、5
,691,141、国際PCT出願番号WO98/20019、WO98/201
66およびWO97/42348。許されるならば、これら出願および特許権の
対象物を引用によりこの文書に加える。
特許出願番号5,605,798、5,622,824および5,547,835、5
,691,141、国際PCT出願番号WO98/20019、WO98/201
66およびWO97/42348。許されるならば、これら出願および特許権の
対象物を引用によりこの文書に加える。
【0003】 背景技術 核酸をシーケンスする方法は、遺伝子発現および調節を評価および理解するた
めの分子生物学者の技術の中で重要であり強力なツールである。DNA分子をシ
ーケンスする方法には、化学的崩壊シーケンシング(chemical degradation sequ
encing)(Maxam et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560参照、また
Ambrose et al., (1987) Methods Enz. 152:522)およびチェーンターミネーショ
ンシーケンシング(Sanger et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:546
3)が含まれる。マキサム-ギルバートシーケンシング法は特異的切断DNA断片 に基く分解的方法である。一方の端を放射標識したDNA断片を5回の化学反応
で部分的に切断する。各反応は塩基型および塩基に特異的であり、長さの異なる
標識断片の群が5つ生ずる。断片群をポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAG E)で分離する。
めの分子生物学者の技術の中で重要であり強力なツールである。DNA分子をシ
ーケンスする方法には、化学的崩壊シーケンシング(chemical degradation sequ
encing)(Maxam et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560参照、また
Ambrose et al., (1987) Methods Enz. 152:522)およびチェーンターミネーショ
ンシーケンシング(Sanger et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:546
3)が含まれる。マキサム-ギルバートシーケンシング法は特異的切断DNA断片 に基く分解的方法である。一方の端を放射標識したDNA断片を5回の化学反応
で部分的に切断する。各反応は塩基型および塩基に特異的であり、長さの異なる
標識断片の群が5つ生ずる。断片群をポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAG E)で分離する。
【0004】 チェーンターミネーション法またはサンガー法は、DNA合成に基づいている
。一本鎖DNAを鋳型として用い、標識したプライマーを用い、相補鎖の形成を
開始する。合成反応は、4つのデオキシヌクレオチド(dNTP)、dATP、d
TTP、dCTPおよびdGTP、ならびに4つのジデオキシヌクレオチド(d dNTP)、ddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTPのうちの1 つの存在下に実施する。相補鎖は、ジデオキシヌクレオチドを伸張する鎖に加え
ることにより、完成前に終結する。4つのddNTPのうち1つをそれぞれ含む
4つの反応混合物で開始することにより、A、C、GおよびTで終結する鎖の群
を生ずる。各反応混合物をポリアクリルアミドゲルの1レーンで電気泳動し、断
片を分離すると、1塩基の長さで違いが生じる。
。一本鎖DNAを鋳型として用い、標識したプライマーを用い、相補鎖の形成を
開始する。合成反応は、4つのデオキシヌクレオチド(dNTP)、dATP、d
TTP、dCTPおよびdGTP、ならびに4つのジデオキシヌクレオチド(d dNTP)、ddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTPのうちの1 つの存在下に実施する。相補鎖は、ジデオキシヌクレオチドを伸張する鎖に加え
ることにより、完成前に終結する。4つのddNTPのうち1つをそれぞれ含む
4つの反応混合物で開始することにより、A、C、GおよびTで終結する鎖の群
を生ずる。各反応混合物をポリアクリルアミドゲルの1レーンで電気泳動し、断
片を分離すると、1塩基の長さで違いが生じる。
【0005】 これらの方法は、一本鎖ファージベクター内にクローニングするように、DN
Aの変性および一本鎖の分離または他の方法により作成する一本鎖DNAをシー
ケンスするため主としてデザインされる。これらのシーケンス方法は、長さが1
塩基異なる断片のアレイを生ずる反応に基づき、同定可能な塩基で終結する。断
片はPAGEを用い大きさにより分離され、放射性同位体のような標識を用い検
出される。電気泳動ゲルのバンドの分離はDNA断片の長さが増加するにつれて
指数的に減少するため、これらの方法は、約300から400までのヌクレオチ
ドのシーケンスするDNA断片のみ可能である。
Aの変性および一本鎖の分離または他の方法により作成する一本鎖DNAをシー
ケンスするため主としてデザインされる。これらのシーケンス方法は、長さが1
塩基異なる断片のアレイを生ずる反応に基づき、同定可能な塩基で終結する。断
片はPAGEを用い大きさにより分離され、放射性同位体のような標識を用い検
出される。電気泳動ゲルのバンドの分離はDNA断片の長さが増加するにつれて
指数的に減少するため、これらの方法は、約300から400までのヌクレオチ
ドのシーケンスするDNA断片のみ可能である。
【0006】 標的DNAはまた、ポリメラーゼ連鎖反応(例えば、Mullis et al., (1986) C
old Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263;Mullisらの米国特許出願番号4,
683,202)を用い増幅でき、その結果、増幅濃度の二重鎖標的DNAを生ずる。多
くの方法を用い、その後のシークエンス用にPCRから直接一本鎖鋳型を生ずる
。例えば、一本鎖のみに特異的な放射標識プライマーが用い得る。他に、PCR
は、1プライマーが限られた濃度である条件下で行い得る。限られた濃度である
プライマーが使い尽くされると、2番目の鎖が直線的な割合で次のサイクルで増
幅される(Gyllenstein et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:7652;Mihil
ovic et al., (1989) BioTechniques 7:14)。
old Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263;Mullisらの米国特許出願番号4,
683,202)を用い増幅でき、その結果、増幅濃度の二重鎖標的DNAを生ずる。多
くの方法を用い、その後のシークエンス用にPCRから直接一本鎖鋳型を生ずる
。例えば、一本鎖のみに特異的な放射標識プライマーが用い得る。他に、PCR
は、1プライマーが限られた濃度である条件下で行い得る。限られた濃度である
プライマーが使い尽くされると、2番目の鎖が直線的な割合で次のサイクルで増
幅される(Gyllenstein et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:7652;Mihil
ovic et al., (1989) BioTechniques 7:14)。
【0007】 多くの使用できるシーケンシングストラテジーがある。ストラテジーの選択は
、DNAをシーケンスする目的およびシーケンスする前のDNAについての利用
し得る情報量に依存する。例えば、標的DNAを、特定の変異がDNA内に導入
されるていることを確認するためにシーケンスするならば、小領域のDNAをシ
ーケンスすることのみが必要となる。DNA断片は、配列を正確に決定しなけれ
ばならない未知の遺伝子または遺伝子部分であるならば、断片全体をシーケンス
する必要がある。シーケンスし得る断片の大きさは約400塩基が限界であるた
め、この大きさよりも長いDNA断片は切断しなければならない。切断はランダ
ムでよく、標的DNAのセグメントのサブクローニングによる。次いで、オーバ
ーラップする断片を含むサブクローニングした断片をシーケンスし、コンピュー
タープログラムで並べる(例えば、Staden(1986) Nucl. Acids Res. 14:217参照)
。他に、DNAを、オーバーラップする変異かネストする変異を生じ、そして、
シーケンスすることにより、または他の整列アプローチにより、系統的にサブク
ローニングし得る。
、DNAをシーケンスする目的およびシーケンスする前のDNAについての利用
し得る情報量に依存する。例えば、標的DNAを、特定の変異がDNA内に導入
されるていることを確認するためにシーケンスするならば、小領域のDNAをシ
ーケンスすることのみが必要となる。DNA断片は、配列を正確に決定しなけれ
ばならない未知の遺伝子または遺伝子部分であるならば、断片全体をシーケンス
する必要がある。シーケンスし得る断片の大きさは約400塩基が限界であるた
め、この大きさよりも長いDNA断片は切断しなければならない。切断はランダ
ムでよく、標的DNAのセグメントのサブクローニングによる。次いで、オーバ
ーラップする断片を含むサブクローニングした断片をシーケンスし、コンピュー
タープログラムで並べる(例えば、Staden(1986) Nucl. Acids Res. 14:217参照)
。他に、DNAを、オーバーラップする変異かネストする変異を生じ、そして、
シーケンスすることにより、または他の整列アプローチにより、系統的にサブク
ローニングし得る。
【0008】 サンガーチェーンターミネーション法および他のシーケンシング方法は、標的
DNAを一本鎖ファージェベクターにクローニングすることによる、一本鎖鋳型
の使用に依存する。しかし、標的DNAのためベクターとしてプラスミドを使用
することは、多くの理由からファージDNAの使用よりも好ましく、それには、
種々の利用可能なプラスミド、プラスミドの操作容易性、およびファージベクタ
ーと比べて挿入DNAがプラスミド中でより安定であることを含む。したがって
、標的DNAを一本鎖ファージDNA以外のプラスミドDNAにクローニングす
るシーケンシング方法(例えば、Wallance et al., (1981) Gene 16:21-26; Guo
et al., (1982) Nucl. Acids Res. 10:2065-2084;Vieira et al., (1982) Gene
19:259-268参照)が開発されている。
DNAを一本鎖ファージェベクターにクローニングすることによる、一本鎖鋳型
の使用に依存する。しかし、標的DNAのためベクターとしてプラスミドを使用
することは、多くの理由からファージDNAの使用よりも好ましく、それには、
種々の利用可能なプラスミド、プラスミドの操作容易性、およびファージベクタ
ーと比べて挿入DNAがプラスミド中でより安定であることを含む。したがって
、標的DNAを一本鎖ファージDNA以外のプラスミドDNAにクローニングす
るシーケンシング方法(例えば、Wallance et al., (1981) Gene 16:21-26; Guo
et al., (1982) Nucl. Acids Res. 10:2065-2084;Vieira et al., (1982) Gene
19:259-268参照)が開発されている。
【0009】 これらの方法は、同時に一本鎖標的DNAの配列決定するためにのみ設計され
る(例えば、Chen et al., (1985) DNA 4:165-170; Hattori et al., (1986) Ana
l. Biochem. 152:232-238; Mierendorf et al., (1987) Methods Enzymol. 152:
556;Mehra et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7013-7017参照)。 しかし、二本鎖DNAの使用により、一本鎖DNA断片のサブクローニングまた
は単離が避けられ、それはジデオキシ鎖ターミネーターシーケンシング反応を使
用する。しかし、二本鎖DNAの使用が制限される。それは、変性させた二重鎖
DNAの鋳型としての性質が悪いからである。結果として、これらの方法からは
、一本鎖ベクターにDNAをクローニングする方法と同程度に正確な配列データ
は得られなかった。
る(例えば、Chen et al., (1985) DNA 4:165-170; Hattori et al., (1986) Ana
l. Biochem. 152:232-238; Mierendorf et al., (1987) Methods Enzymol. 152:
556;Mehra et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7013-7017参照)。 しかし、二本鎖DNAの使用により、一本鎖DNA断片のサブクローニングまた
は単離が避けられ、それはジデオキシ鎖ターミネーターシーケンシング反応を使
用する。しかし、二本鎖DNAの使用が制限される。それは、変性させた二重鎖
DNAの鋳型としての性質が悪いからである。結果として、これらの方法からは
、一本鎖ベクターにDNAをクローニングする方法と同程度に正確な配列データ
は得られなかった。
【0010】 最近、鋳型の品質に伴う問題が、鎖特異的プライマーが効果的にハイブリダイ
ズし、挿入DNAの相補鎖に隣接する部位を含むプラスミドを使用する方法の開
発により解決された。これら方法の効果により、二本鎖DNAの各一本鎖は、直
接プラスミドDNAから、事前にファージベクターへサブクローニングすること
もなく、シーケンスされ得る(例えば、Chen et al., (1985) DNA 4:165-170 お よび Chi et al., (1988) Nucl. Acids Res. 16:10382参照)。鎖特異的合成プラ
イマーを、共有結合で閉環し、熱またはアルカリで変性させたDNAにアニール
し、その後、ジデオキシシーケンシング反応を行う。他に、プライマーをアルカ
リで変性した開環二本鎖プラスミドDNAにアニールし、それを鋳型とした(Hat
tori et al., (1986) Anal. Biochem. 152:232-238参照)。二本鎖DNAをアル カリまたは熱により変性させ、その後、サンガー法を用いシーケンスする。それ
は37℃またはそれ以上で行う。別の“フォワード”および“リバース”プライ
マーの使用も記載されており(Mehra et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 83:7013-7017参照)、λgt11中のEcoRI部位に隣接するlacZ配列
にそれぞれ相補的であり、λgt11にクローニングした各DNA鎖を別々にシ
ーケンスする。
ズし、挿入DNAの相補鎖に隣接する部位を含むプラスミドを使用する方法の開
発により解決された。これら方法の効果により、二本鎖DNAの各一本鎖は、直
接プラスミドDNAから、事前にファージベクターへサブクローニングすること
もなく、シーケンスされ得る(例えば、Chen et al., (1985) DNA 4:165-170 お よび Chi et al., (1988) Nucl. Acids Res. 16:10382参照)。鎖特異的合成プラ
イマーを、共有結合で閉環し、熱またはアルカリで変性させたDNAにアニール
し、その後、ジデオキシシーケンシング反応を行う。他に、プライマーをアルカ
リで変性した開環二本鎖プラスミドDNAにアニールし、それを鋳型とした(Hat
tori et al., (1986) Anal. Biochem. 152:232-238参照)。二本鎖DNAをアル カリまたは熱により変性させ、その後、サンガー法を用いシーケンスする。それ
は37℃またはそれ以上で行う。別の“フォワード”および“リバース”プライ
マーの使用も記載されており(Mehra et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 83:7013-7017参照)、λgt11中のEcoRI部位に隣接するlacZ配列
にそれぞれ相補的であり、λgt11にクローニングした各DNA鎖を別々にシ
ーケンスする。
【0011】 反対向きのプライマー領域を有するプラスミドは、転写を含む方法に使用され
、また、シーケンスされる標的DNAの媒体として使用される。各プロモーター
領域は、挿入DNAをシーケンスするため、明確な特異的プライミング部位とし
ての役割をする。そのプラスミドは商業的に利用可能である。例えば、二対のプ
ロモータープラスミドpGEMTMには、バクテリオファージSP6およびT7R
NAポリメラーゼプロモーターが反対方向に含まれ(Mierendorf et al., (1987)
Meth. Enzymol. 152:556-562)、それにより、シーケンスするために転写産物を
生じ得る。
、また、シーケンスされる標的DNAの媒体として使用される。各プロモーター
領域は、挿入DNAをシーケンスするため、明確な特異的プライミング部位とし
ての役割をする。そのプラスミドは商業的に利用可能である。例えば、二対のプ
ロモータープラスミドpGEMTMには、バクテリオファージSP6およびT7R
NAポリメラーゼプロモーターが反対方向に含まれ(Mierendorf et al., (1987)
Meth. Enzymol. 152:556-562)、それにより、シーケンスするために転写産物を
生じ得る。
【0012】 核酸をシーケンスする殆どの方法には、人工物をシーケンスし得るポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動(即ち、PAGE)の使用が必要であるか、または、放射性
同位元素、酵素、または蛍光または化学ルミネセンス部分のような検出可能な標
識が必要とされる。質量分析的検出を用いるDNAのシーケンシング方法もまた
使用されている(米国特許出願番号5,547,835参照)。これらの方法は、本来、D NAのシーケンシングに依存する。
ルアミドゲル電気泳動(即ち、PAGE)の使用が必要であるか、または、放射性
同位元素、酵素、または蛍光または化学ルミネセンス部分のような検出可能な標
識が必要とされる。質量分析的検出を用いるDNAのシーケンシング方法もまた
使用されている(米国特許出願番号5,547,835参照)。これらの方法は、本来、D NAのシーケンシングに依存する。
【0013】 DNAシーケンシング方法論を用い、ヒトゲノム配列全体を最終的に決定する
。ヒトゲノムDNAの完全配列の知識は、ヒトの疾患の理解、診断、防止、およ
び処置の助けとなる。適度な時間枠で、そして経済的な方法で、約30臆塩基対
のヒトゲノムの決定を成功させるため、迅速で、信頼性があり、感度がよく、安
価な方法であることが必要とされている。
。ヒトゲノムDNAの完全配列の知識は、ヒトの疾患の理解、診断、防止、およ
び処置の助けとなる。適度な時間枠で、そして経済的な方法で、約30臆塩基対
のヒトゲノムの決定を成功させるため、迅速で、信頼性があり、感度がよく、安
価な方法であることが必要とされている。
【0014】 したがって、本明細書の目的は、シーケンスするための更なる方法を提供する
ことである。特に、本明細書の目的は、RNAポリメラーゼを用い核酸をシーケ
ンスする質量分析法を提供することである。更に、本明細書の目的は、RNAポ
リメラーゼを用いアレイ形で核酸をシーケンスする方法であって、核酸プローブ
を高密度で支持体に固定化し質量分析的検出を促進する方法を提供することであ
る。また、本明細書の目的は、質量分析法を用い転写ターミネーター配列を同定
する方法を提供することである。
ことである。特に、本明細書の目的は、RNAポリメラーゼを用い核酸をシーケ
ンスする質量分析法を提供することである。更に、本明細書の目的は、RNAポ
リメラーゼを用いアレイ形で核酸をシーケンスする方法であって、核酸プローブ
を高密度で支持体に固定化し質量分析的検出を促進する方法を提供することであ
る。また、本明細書の目的は、質量分析法を用い転写ターミネーター配列を同定
する方法を提供することである。
【0015】 本発明の要旨 核酸、特にDNAを、RNA転写産物を用い、シーケンスする方法を提供する
。特に、RNAポリメラーゼを用い、核酸をシーケンスする方法であって、DN
A依存およびRNA依存RNAポリメラーゼ含む方法を提供する。RNA転写産
物をマススペクトロメトリーで分析する。
。特に、RNAポリメラーゼを用い、核酸をシーケンスする方法であって、DN
A依存およびRNA依存RNAポリメラーゼ含む方法を提供する。RNA転写産
物をマススペクトロメトリーで分析する。
【0016】 本方法の実施では、プロモーターおよび操作可能となるようにプロモーターに
連結した標的核酸配列を含むDNA分子を、産生される標的を含む一群のネスト
したRNA転写産物を生ずる条件下、プロモーターを認識するRNAポリメラー
ゼで転写する。転写産物の分子量を、マススペクトロメトリーで測定し、そして
標的配列の核酸配列を決定する。核酸および標的を含むDNA分子は、好ましく
は固定化されている。
連結した標的核酸配列を含むDNA分子を、産生される標的を含む一群のネスト
したRNA転写産物を生ずる条件下、プロモーターを認識するRNAポリメラー
ゼで転写する。転写産物の分子量を、マススペクトロメトリーで測定し、そして
標的配列の核酸配列を決定する。核酸および標的を含むDNA分子は、好ましく
は固定化されている。
【0017】 ある態様では、その方法は、標的DNAを含む分子を捕捉する、一端に一本鎖
領域を有し、プロモーターを含む二本鎖の断片を用いる。これらの態様では、標
的DNAは、好ましくは、一本鎖である。
領域を有し、プロモーターを含む二本鎖の断片を用いる。これらの態様では、標
的DNAは、好ましくは、一本鎖である。
【0018】 好ましい態様では、プロモーターを含む核酸は、3'末端の非コーディング鎖 または5'末端のコーディング鎖を介して固相と共有結合する。結合は、当業者 に既知の任意の方法を用い、例えばチオール結合を用いる。例えば、5'-または
3'-チオール酸化DNAを調製し、アミノシラン処置固体支持体でに結合する。
結合は、直接か、またはリンカー基を介する。生じた固定化分子は好ましくはア
レイ形に並べられる。
3'-チオール酸化DNAを調製し、アミノシラン処置固体支持体でに結合する。
結合は、直接か、またはリンカー基を介する。生じた固定化分子は好ましくはア
レイ形に並べられる。
【0019】 プロモーターをコードしている二本鎖核酸分子は、任意の源から得られ、例え
ば細菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物および真核生物であり、または合
成プロトコールと合わせることができる。それを、用い、工作すると、生じた断
片はコーディング(センス)鎖の3'末端に少なくとも5ヌクレオチドの一本鎖領 域を含む。この一本鎖領域を、シーケンスされる核酸領域または通常のオーバー
ラッピング配列、例えば制限エンドヌクレアーゼ部位と相補的となるように設計
する。
ば細菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物および真核生物であり、または合
成プロトコールと合わせることができる。それを、用い、工作すると、生じた断
片はコーディング(センス)鎖の3'末端に少なくとも5ヌクレオチドの一本鎖領 域を含む。この一本鎖領域を、シーケンスされる核酸領域または通常のオーバー
ラッピング配列、例えば制限エンドヌクレアーゼ部位と相補的となるように設計
する。
【0020】 シーケンスされる核酸領域を含む標的核酸は、一本鎖であるか二本鎖であるが
、一本鎖3'末端を含み、プロモーターを含むDNAの相補的配列にハイブリダ イズする。ハイブリダイゼーションは固定化前または後何れかに行う。2つの核
酸分子のハイブリダイゼーションにより、1またはそれ以上の“ニック”がハイ
ブリッド中の隣接核酸分子のジャンクションの位置に導入される。ある態様では
、コーディングまたは非コーディング鎖、好ましくは、コーディング鎖中のニッ
クは、転写開始前に適当な核酸リガーゼの添加により連結される。
、一本鎖3'末端を含み、プロモーターを含むDNAの相補的配列にハイブリダ イズする。ハイブリダイゼーションは固定化前または後何れかに行う。2つの核
酸分子のハイブリダイゼーションにより、1またはそれ以上の“ニック”がハイ
ブリッド中の隣接核酸分子のジャンクションの位置に導入される。ある態様では
、コーディングまたは非コーディング鎖、好ましくは、コーディング鎖中のニッ
クは、転写開始前に適当な核酸リガーゼの添加により連結される。
【0021】 好ましくは、方法は、ネストしたRNA転写産物を生ずる任意の適当なストラ
テジーを採用する。好ましい方法は、修飾したサンガーシーケンシングストラテ
ジーに基づき、それは、RNAを用い、塩基特異的チェーンターミネーションに
より得られる一群のネストしたRNA転写産物を生じる。これらは、マススペク
トロメトリーにより分析される。修飾したギルバート-マキサムストラテジーも また考慮される。この方法において、転写産物は、塩基特異的RNaseを用い
切断され、塩基特異的に終結した断片を生じ、次いで、分子量はマススペクトロ
メトリーにより評価する。
テジーを採用する。好ましい方法は、修飾したサンガーシーケンシングストラテ
ジーに基づき、それは、RNAを用い、塩基特異的チェーンターミネーションに
より得られる一群のネストしたRNA転写産物を生じる。これらは、マススペク
トロメトリーにより分析される。修飾したギルバート-マキサムストラテジーも また考慮される。この方法において、転写産物は、塩基特異的RNaseを用い
切断され、塩基特異的に終結した断片を生じ、次いで、分子量はマススペクトロ
メトリーにより評価する。
【0022】 転写は、適当なRNAポリメラーゼの添加により、リボヌクレオシド三リン酸
および選択された塩基特異的チェーンターミネイティング3'-デオキシリボヌク
レオシド三リン酸の存在下、プロモーターから開始される。好ましい態様では、
転写混合物はまた、修飾されたリボヌクレオシド三リン酸およびリボヌクレオチ
ド類似体、リボヌクレオチド三リン酸類似体を含み、それらは、生ずるRNA転
写産物の二次構造を減少し、および/またはRNAポリメラーゼ酵素の終結およ
びターンオーバーの忠実性を増加し、それによって分析に利用できるRNA転写
産物の量が増加する。これら類似体には、二次構造を減少させるイノシン5'-三
リン酸(ITP)、RNAポリメラーゼ酵素の終結およびターンオーバーの忠実性
を増加しそれによって分析に利用可能なRNA転写産物の量を増加する4-チオ ウリジン5'-三リン酸(UTP)および5-ブロモUTPまたは5'-ヨードCTP が含まれるが、これらに限らない。生じたRNA転写産物は、マススペクトロメ
トリーで分析する。
および選択された塩基特異的チェーンターミネイティング3'-デオキシリボヌク
レオシド三リン酸の存在下、プロモーターから開始される。好ましい態様では、
転写混合物はまた、修飾されたリボヌクレオシド三リン酸およびリボヌクレオチ
ド類似体、リボヌクレオチド三リン酸類似体を含み、それらは、生ずるRNA転
写産物の二次構造を減少し、および/またはRNAポリメラーゼ酵素の終結およ
びターンオーバーの忠実性を増加し、それによって分析に利用できるRNA転写
産物の量が増加する。これら類似体には、二次構造を減少させるイノシン5'-三
リン酸(ITP)、RNAポリメラーゼ酵素の終結およびターンオーバーの忠実性
を増加しそれによって分析に利用可能なRNA転写産物の量を増加する4-チオ ウリジン5'-三リン酸(UTP)および5-ブロモUTPまたは5'-ヨードCTP が含まれるが、これらに限らない。生じたRNA転写産物は、マススペクトロメ
トリーで分析する。
【0023】 他の態様では、サンプルは、マトリクス利用レーザー吸収/イオン化マススペ
クトロメトリー(MALDI)による分析としてのマススペクトロメトリー用のマ
トリクス物質を更に含み、好ましくは、更に、飛行時間(TOF)分析に使用する
。核酸の配列は、4つのチェーンターミネイティング塩基をそれぞれ含むシーケ
ンシング反応から得られるチェーンターミネイテッドRNA転写産物の観察すべ
き質量を並べることにより得られる。
クトロメトリー(MALDI)による分析としてのマススペクトロメトリー用のマ
トリクス物質を更に含み、好ましくは、更に、飛行時間(TOF)分析に使用する
。核酸の配列は、4つのチェーンターミネイティング塩基をそれぞれ含むシーケ
ンシング反応から得られるチェーンターミネイテッドRNA転写産物の観察すべ
き質量を並べることにより得られる。
【0024】 本明細書中で提供するシーケンスする方法は診断的適応に使用し得る。診断的
適応は、既知の標的核酸中の遺伝的な変化の存在を決定する方法を含む。例えば
、標的核酸領域を増幅し、非コーディング鎖に相当する核酸鎖を単離する。プロ
モーターを含む核酸プローブは、天然の源から単離されるか、またはプロモータ
ー配列を形成する2つの相補的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることに
より合成的に組合せることができる。シーケンスされる核酸の領域と、または通
常の配列と相補的な少なくとも5ヌクレオチドの一本鎖領域は、コーディング鎖
の3'末端の位置での組換え法により導入される。好ましい態様では、プロモー ターを含んでいる核酸は、非コーディング鎖の3'末端またはコーディング鎖の 5'末端を介し、固体支持体と共有結合し、更に好ましくは、5'-または3'-チ オール酸化DNAが高密度でアミノシラン処理固体支持体と連結する。その連結
は、リンカー基の非存在下、または存在下であり、好ましくはアレイ形に並べら
れる。
適応は、既知の標的核酸中の遺伝的な変化の存在を決定する方法を含む。例えば
、標的核酸領域を増幅し、非コーディング鎖に相当する核酸鎖を単離する。プロ
モーターを含む核酸プローブは、天然の源から単離されるか、またはプロモータ
ー配列を形成する2つの相補的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることに
より合成的に組合せることができる。シーケンスされる核酸の領域と、または通
常の配列と相補的な少なくとも5ヌクレオチドの一本鎖領域は、コーディング鎖
の3'末端の位置での組換え法により導入される。好ましい態様では、プロモー ターを含んでいる核酸は、非コーディング鎖の3'末端またはコーディング鎖の 5'末端を介し、固体支持体と共有結合し、更に好ましくは、5'-または3'-チ オール酸化DNAが高密度でアミノシラン処理固体支持体と連結する。その連結
は、リンカー基の非存在下、または存在下であり、好ましくはアレイ形に並べら
れる。
【0025】 一本鎖または二本鎖形の、シーケンスされる核酸の一本鎖3'オーバーハング は、非コーディング鎖の相補的配列とハイブリダイズし、ある態様では、1また
はそれ以上の核酸鎖間のニックは転写される前に連結される。転写は、適当なR
NAポリメラーゼを用い、リボースヌクレオシド三リン酸および選択された塩基
特異的チェーンターミネイティング3'-デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存
在下、開始される。好ましい態様では、転写混合物はまた、イノシン5'-三リン
酸および/または1もしくはそれ以上の修飾されたリボヌクレオシド三リン酸を
含み、RNA転写の分析を促進する。RNA転写は、マススペクトロメトリーに
より、好ましくは、MALDI-TOFを用い分析される。
はそれ以上の核酸鎖間のニックは転写される前に連結される。転写は、適当なR
NAポリメラーゼを用い、リボースヌクレオシド三リン酸および選択された塩基
特異的チェーンターミネイティング3'-デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存
在下、開始される。好ましい態様では、転写混合物はまた、イノシン5'-三リン
酸および/または1もしくはそれ以上の修飾されたリボヌクレオシド三リン酸を
含み、RNA転写の分析を促進する。RNA転写は、マススペクトロメトリーに
より、好ましくは、MALDI-TOFを用い分析される。
【0026】 アレイ形で用いられるとき、プロモーターを含む核酸プローブのパネルが構成
され、アレイ形で連結され、そのため、標的核酸は配列全体、例えば遺伝子のコ
ーディング配列が置換され、単一の反応配列の間、遺伝子全体の核酸配列を決定
することができる。
され、アレイ形で連結され、そのため、標的核酸は配列全体、例えば遺伝子のコ
ーディング配列が置換され、単一の反応配列の間、遺伝子全体の核酸配列を決定
することができる。
【0027】 転写ターミネーターおよびアテニュエーター配列を同定する方法も提供される
。転写条件を修飾し、全長の転写産物を生ずることにより、rho-依存性およ びrho-独立性ターミネーターのような転写ターミネーター配列が、マススペ クトロメトリー法を用い、同定され得る。その方法の実施では、一本鎖領域であ
るシーケンスされる標的核酸の3'末端が、相補的配列と、コーディング鎖、プ ロモーターを含む核酸プローブの3'末端でハイブリダイズする。好ましい態様 では、プロモーターを含む核酸は、非コーディング鎖の5'末端またはコーディ ング鎖の3'末端を介し、固体支持体と共有結合し、更に好ましくは、5'-また は3'-チオール酸化DNAは高密度でアミノシラン処理固体支持体と連結する。
連結はリンカー基の存在下または非存在下でされ得、好ましくはアレイ形に並べ
られる。
。転写条件を修飾し、全長の転写産物を生ずることにより、rho-依存性およ びrho-独立性ターミネーターのような転写ターミネーター配列が、マススペ クトロメトリー法を用い、同定され得る。その方法の実施では、一本鎖領域であ
るシーケンスされる標的核酸の3'末端が、相補的配列と、コーディング鎖、プ ロモーターを含む核酸プローブの3'末端でハイブリダイズする。好ましい態様 では、プロモーターを含む核酸は、非コーディング鎖の5'末端またはコーディ ング鎖の3'末端を介し、固体支持体と共有結合し、更に好ましくは、5'-また は3'-チオール酸化DNAは高密度でアミノシラン処理固体支持体と連結する。
連結はリンカー基の存在下または非存在下でされ得、好ましくはアレイ形に並べ
られる。
【0028】 転写は、RNAポリメラーゼ終結の効率を、その4-チオUTP、5-ブロモU
TPまたは5'-ヨードCTPのようなターミネーター配列の位置で増加する修飾
RNA三リン酸類似体の非存在下または存在下で開始される。ある態様では、1
またはそれ以上の鎖中のニックが、転写開始前に適当な核酸リガーゼの添加によ
り連結され得る(即ち、DNAまたはRNAリガーゼの添加)。終結したRNA転
写産物の質量がマススペクトロメトリーにより決定される。観察された質量は、
転写のターミネーター依存停止の位置を示し、明確なゲノム位置由来の転写終結
部位の直前にある配列の並びを比較することにより、ターミネーターおよびアテ
ニュエーター配列を種々のRNAポリメラーゼと同定し得る。
TPまたは5'-ヨードCTPのようなターミネーター配列の位置で増加する修飾
RNA三リン酸類似体の非存在下または存在下で開始される。ある態様では、1
またはそれ以上の鎖中のニックが、転写開始前に適当な核酸リガーゼの添加によ
り連結され得る(即ち、DNAまたはRNAリガーゼの添加)。終結したRNA転
写産物の質量がマススペクトロメトリーにより決定される。観察された質量は、
転写のターミネーター依存停止の位置を示し、明確なゲノム位置由来の転写終結
部位の直前にある配列の並びを比較することにより、ターミネーターおよびアテ
ニュエーター配列を種々のRNAポリメラーゼと同定し得る。
【0029】 詳細な説明および好ましい態様 定義 特に定義しなければ、本明細書中で用いる技術的および科学的語は、本発明が
属する技術の当業者が通常理解している意味と同じである。本明細書で言及する
特許および刊行物すべてを本明細書に引用により含める。
属する技術の当業者が通常理解している意味と同じである。本明細書で言及する
特許および刊行物すべてを本明細書に引用により含める。
【0030】 本明細書で使用したように、“核酸”という語は、デオキシリボ核酸(DNA)
およびリボ核酸(RNA)のようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、
ならびにRNAまたはDNAの何れかの類似体について言及し、例えばそれはヌ
クレオチド類似体から作成され、何れの場合も一本鎖または二本鎖形であり、お
よびPNAでもある。核酸分子は、合成し得るか、または特に生体サンプルから
、当分野に既知の任意の多くの方法を用い単離することができ、選択する特定の
方法を特定の生体サンプルにあわせる。
およびリボ核酸(RNA)のようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、
ならびにRNAまたはDNAの何れかの類似体について言及し、例えばそれはヌ
クレオチド類似体から作成され、何れの場合も一本鎖または二本鎖形であり、お
よびPNAでもある。核酸分子は、合成し得るか、または特に生体サンプルから
、当分野に既知の任意の多くの方法を用い単離することができ、選択する特定の
方法を特定の生体サンプルにあわせる。
【0031】 本明細書中で使用するとき、ヌクレオチドは、ヌクレトシドモノ-、ジ-および
三リン酸を含む。ヌクレオチドはまた、ホスホロチオネートヌクレオチドおよび
デアザプリンヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドを含む。完全な一群の鎖伸
張ヌクレオチドは、DNA鋳型をを含む4種の塩基それぞれとハイブリダイズで
きる4種のヌクレオチドについて言及する。
三リン酸を含む。ヌクレオチドはまた、ホスホロチオネートヌクレオチドおよび
デアザプリンヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドを含む。完全な一群の鎖伸
張ヌクレオチドは、DNA鋳型をを含む4種の塩基それぞれとハイブリダイズで
きる4種のヌクレオチドについて言及する。
【0032】 本明細書中で使用するとき、核酸プロモーター含有プローブは、プロモーター
をコードする二本鎖領域を含む核酸断片、およびプロモーターに関連するコーデ
ィング(センス)鎖の3'末端位置に少なくとも5ヌクレオチドを含む一本鎖領域 について言及する。目的の標的核酸を含む核酸の3'末端位置の一本鎖領域に相 補的となるように少なくとも5ヌクレオチドが選択される。3'末端への言及は 、標的が二本鎖分子中に含まれる場合、アンチセンス鎖への言及となる。標的が
二本鎖であるとき、生じた分子はコーディングおよび非コーディング鎖にニック
を有する。
をコードする二本鎖領域を含む核酸断片、およびプロモーターに関連するコーデ
ィング(センス)鎖の3'末端位置に少なくとも5ヌクレオチドを含む一本鎖領域 について言及する。目的の標的核酸を含む核酸の3'末端位置の一本鎖領域に相 補的となるように少なくとも5ヌクレオチドが選択される。3'末端への言及は 、標的が二本鎖分子中に含まれる場合、アンチセンス鎖への言及となる。標的が
二本鎖であるとき、生じた分子はコーディングおよび非コーディング鎖にニック
を有する。
【0033】 他に核酸プロモーター含有プローブの一本鎖領域は、非コーディング(アンチ センス)鎖(プロモーターに関連する)の5'末端に少なくとも約5ヌクレオチドを
含み、そのヌクレオチドは標的核酸のコーディング鎖の5'末端の少なくとも約 5つのヌクレオチドに相補的である。この態様では、標的は二本鎖でなければな
らない。 ハイブリダイゼーション後、生じた分子はコーディングおよび非
コーディング鎖中にニックを有する。
含み、そのヌクレオチドは標的核酸のコーディング鎖の5'末端の少なくとも約 5つのヌクレオチドに相補的である。この態様では、標的は二本鎖でなければな
らない。 ハイブリダイゼーション後、生じた分子はコーディングおよび非
コーディング鎖中にニックを有する。
【0034】 すべての態様では、ニックは転写前に連結される。しかし、本明細書中で示す
ように、ニック間に十分な距離、好ましくは少なくとも約+7ヌクレオチドがあ
れば、それらを連結する必要はない。
ように、ニック間に十分な距離、好ましくは少なくとも約+7ヌクレオチドがあ
れば、それらを連結する必要はない。
【0035】 本明細書中で使用するとき、標的核酸はシーケンスされた核酸分子である。巨
大分子の一部であり得る。標的核酸を含む分子は、少なくとも約5ヌクレオチド
であって、プロモーターを含む捕捉プローブにおいて3'末端(または選択された
配置に依存する5'末端)でオーバー ハングする少なくとも5つの隣接ヌクレオ
チドと十分に相補的となるように配列が設計されたヌクレオチドを含み得るか、
当該ヌクレオチドを含むように修飾され得る。標的核酸は二本鎖であって、3' または5'一本鎖オーバーハングであるかまたは一本鎖であり得る。RNAポリ メラーゼは、特に、三重複合体が一旦形成されると、一本鎖分子を転写できるか
、または転写する。標的はまた、RNAまたはPNAでもよい(アミノ酸バック ボーンに塩基を結合することにより形成されるタンパク質核酸;例えばNielsen
et al., (1991) Science 254; 1497参照)。
大分子の一部であり得る。標的核酸を含む分子は、少なくとも約5ヌクレオチド
であって、プロモーターを含む捕捉プローブにおいて3'末端(または選択された
配置に依存する5'末端)でオーバー ハングする少なくとも5つの隣接ヌクレオ
チドと十分に相補的となるように配列が設計されたヌクレオチドを含み得るか、
当該ヌクレオチドを含むように修飾され得る。標的核酸は二本鎖であって、3' または5'一本鎖オーバーハングであるかまたは一本鎖であり得る。RNAポリ メラーゼは、特に、三重複合体が一旦形成されると、一本鎖分子を転写できるか
、または転写する。標的はまた、RNAまたはPNAでもよい(アミノ酸バック ボーンに塩基を結合することにより形成されるタンパク質核酸;例えばNielsen
et al., (1991) Science 254; 1497参照)。
【0036】 本明細書中で使用するとき、核酸合成は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌク
レオチドを生ずる任意の方法であって、化学的または酵素学的反応を含むがこれ
らに限らない方法を含む方法について言及する。
レオチドを生ずる任意の方法であって、化学的または酵素学的反応を含むがこれ
らに限らない方法を含む方法について言及する。
【0037】 本明細書中で使用するとき、塩基特異的に終結するリボヌクレオチドは、転写
終結を生ずるヌクレオチドの組込みにより転写中に生じるものである。塩基特異
的に終結するリボヌクレオシドトリホフェートは、塩基特異的に終結するリボヌ
クレオチドを合成するものであって、当業者に既知である。塩基特異的に終結す
るリボヌクレオシド三リン酸の例は、3'-dGTPのような3'-デオキシリボヌ
クレオシド三リン酸および本明細書に記載する他のものおよび当業者に既知の他
のものを含むがこれらに限らない。
終結を生ずるヌクレオチドの組込みにより転写中に生じるものである。塩基特異
的に終結するリボヌクレオシドトリホフェートは、塩基特異的に終結するリボヌ
クレオチドを合成するものであって、当業者に既知である。塩基特異的に終結す
るリボヌクレオシド三リン酸の例は、3'-dGTPのような3'-デオキシリボヌ
クレオシド三リン酸および本明細書に記載する他のものおよび当業者に既知の他
のものを含むがこれらに限らない。
【0038】 本明細書中で使用するとき、2つのヌクレオチド配列について言及する際の相
補性は、2つのヌクレオチド配列が、反対のヌクレオチドとの間で、好ましくは
、25%未満、更に好ましくは15%未満、更に好ましくは5%未満のミスマッ
チで、最も好ましくはミスマッチなく、ハイブリダイズできることを意味する。
好ましくは、2つの分子は高緊縮条件下ハイブリダイズする。
補性は、2つのヌクレオチド配列が、反対のヌクレオチドとの間で、好ましくは
、25%未満、更に好ましくは15%未満、更に好ましくは5%未満のミスマッ
チで、最も好ましくはミスマッチなく、ハイブリダイズできることを意味する。
好ましくは、2つの分子は高緊縮条件下ハイブリダイズする。
【0039】 本明細書中で使用するとき;ミスマッチの割合の測定におけるハイブリダイゼ
ーションの緊縮は以下の通りである。 1)高緊縮:0.1xSSPE、0.1%SDS、65℃ 2)中緊縮:0.2xSSPE、0.1%SDS、50℃ 3)低緊縮:1.0xSSPE、0.1%SDS、50℃ 同等の緊縮が、他の緩衝液、塩および温度を用いて達成することができると理解
される。
ーションの緊縮は以下の通りである。 1)高緊縮:0.1xSSPE、0.1%SDS、65℃ 2)中緊縮:0.2xSSPE、0.1%SDS、50℃ 3)低緊縮:1.0xSSPE、0.1%SDS、50℃ 同等の緊縮が、他の緩衝液、塩および温度を用いて達成することができると理解
される。
【0040】 本明細書中で使用するとき、“アレイ”という語は、要素(member)または位置
についての秩序正しい配列について言及する。アレイは、任意の多くの要素また
は位置を含み得、多様な形をし得る。好ましい態様では、アレイは二次元的であ
り、n×m要素[式中、mおよびnは同一または異なる整数である。]を含む。特
に好ましい態様では、nおよびmは何れも4であるか、その倍数である。
についての秩序正しい配列について言及する。アレイは、任意の多くの要素また
は位置を含み得、多様な形をし得る。好ましい態様では、アレイは二次元的であ
り、n×m要素[式中、mおよびnは同一または異なる整数である。]を含む。特
に好ましい態様では、nおよびmは何れも4であるか、その倍数である。
【0041】 “架橋剤”という語は技術的に理解されており、本明細書中で使用するとき、
核酸を不溶性-支持体に、好ましくは共有結合を介して固定化する試薬について 言及する。したがって、本明細書中で使用する適当な“架橋剤”は、不溶性支持
体の表面上に存在する官能基および核酸分子中に存在する官能基と反応すること
ができる多様な試薬を含む。その反応ができる試薬にはホモ-およびヘテロ-二機
能性(bifunctional)試薬、当分野に既知の多くのものを含む。ヘテロ二機能性試
薬が好ましい。
核酸を不溶性-支持体に、好ましくは共有結合を介して固定化する試薬について 言及する。したがって、本明細書中で使用する適当な“架橋剤”は、不溶性支持
体の表面上に存在する官能基および核酸分子中に存在する官能基と反応すること
ができる多様な試薬を含む。その反応ができる試薬にはホモ-およびヘテロ-二機
能性(bifunctional)試薬、当分野に既知の多くのものを含む。ヘテロ二機能性試
薬が好ましい。
【0042】 本明細書中で使用するとき、“チオール反応性機能(functionality)”という 語は、急速にまたは好ましくは求核性チオール成分と反応し、ジスルフィド結合
またはチオエーテル結合のような共有結合を生ずる機能について言及する。通常
、チオール基は、良好な求核基であり、好ましいチオール反応性機能は反応的求
電子性である。多様なチオール反応性機能は当分野に既知であり、例えば、ハロ
アセチル(好ましくはヨードアセチル)、ジアゾケトン、エポキシケトン、α,β-
不飽和カルボニル(α,β-エノン(enone))および他の反応性ミカエル受容体(マレ
インイミドを含む)、酸ハリド、ベンジルハリドなどを含む。ある態様では、ジ スルフィドの遊離チオール基はジスルフィド交換を含むジスルフィド結合のよう
な形成により遊離チオール基と反応できる。本明細書中で使用するとき、“チオ
ール反応的”架橋試薬は、少なくとも1つのチオール反応性機能を含むか、含む
ように修飾できる架橋試薬(または表面)について言及する。チオール基の反応は
、当分野において通常である適当な保護基でのブロックにより一時的に妨げられ
得る(例えば、T.W. Greene and P.G.M. Wuts "Protective Groups in Organic S
ynthesis," 2nd ed. John Wiley & Sons, (1991)参照)。
またはチオエーテル結合のような共有結合を生ずる機能について言及する。通常
、チオール基は、良好な求核基であり、好ましいチオール反応性機能は反応的求
電子性である。多様なチオール反応性機能は当分野に既知であり、例えば、ハロ
アセチル(好ましくはヨードアセチル)、ジアゾケトン、エポキシケトン、α,β-
不飽和カルボニル(α,β-エノン(enone))および他の反応性ミカエル受容体(マレ
インイミドを含む)、酸ハリド、ベンジルハリドなどを含む。ある態様では、ジ スルフィドの遊離チオール基はジスルフィド交換を含むジスルフィド結合のよう
な形成により遊離チオール基と反応できる。本明細書中で使用するとき、“チオ
ール反応的”架橋試薬は、少なくとも1つのチオール反応性機能を含むか、含む
ように修飾できる架橋試薬(または表面)について言及する。チオール基の反応は
、当分野において通常である適当な保護基でのブロックにより一時的に妨げられ
得る(例えば、T.W. Greene and P.G.M. Wuts "Protective Groups in Organic S
ynthesis," 2nd ed. John Wiley & Sons, (1991)参照)。
【0043】 本明細書中で使用するとき、選択的に切断可能なリンカーは、光開裂可能リン
カー、化学的切断可能リンカーおよび酵素学的切断可能リンカー(即ち、制限エ ンドヌクレアーゼ部位またはリボヌクレオチド/RNase消化)のような、選 択条件下、切断されるリンカーである。リンカーが、支持体と固定化DNAとの
間に介在する。
カー、化学的切断可能リンカーおよび酵素学的切断可能リンカー(即ち、制限エ ンドヌクレアーゼ部位またはリボヌクレオチド/RNase消化)のような、選 択条件下、切断されるリンカーである。リンカーが、支持体と固定化DNAとの
間に介在する。
【0044】 本明細書中で使用するとき、“タンパク質”、“ポリペプチド”および“ペプ
チド”という語は、遺伝子産物のような翻訳した核酸について言及するとき、相
互に置き換えて使用する。
チド”という語は、遺伝子産物のような翻訳した核酸について言及するとき、相
互に置き換えて使用する。
【0045】 本明細書中で使用するとき、“サンプル”は、検出される物質を含む組成物に
ついて言及する。好ましい態様では、サンプルは“生体サンプル”であって、そ
れは、動物、特にヒトを含む、哺乳類、植物、細菌、カビ、原生生物およびウイ
ルスを含むがこれらに限らない生物から得られる任意の物質について言及する。
生体サンプルは任意の形態であり得、組織、細胞および生検物質のような固体物
質、ならびに尿、血液、唾液、羊水、脳髄液および含嗽液(口内細胞を含む)を含
む体液を含む。好ましくは固体物質は液体と混合される。
ついて言及する。好ましい態様では、サンプルは“生体サンプル”であって、そ
れは、動物、特にヒトを含む、哺乳類、植物、細菌、カビ、原生生物およびウイ
ルスを含むがこれらに限らない生物から得られる任意の物質について言及する。
生体サンプルは任意の形態であり得、組織、細胞および生検物質のような固体物
質、ならびに尿、血液、唾液、羊水、脳髄液および含嗽液(口内細胞を含む)を含
む体液を含む。好ましくは固体物質は液体と混合される。
【0046】 本明細書中で使用するとき、“基体”または“固体支持体”は、サンプルが本
明細書に記載の物質のように沈殿する不溶性支持体を意味する。適当な基体の例
は、シリカゲルを含む(これに限らない)ビーズ、調節細孔ガラス(controlled po
re glass)、磁石、デキストラン、アガロースおよびセルロース、キャピラリー 、ガラスファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、ア ルミニウム、銅およびシリコン)、マルチウェルプレートを含むプラスチック物 質または膜(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニル インデンジフルオリド)のような平坦支持体、ピン、コンビナトリアル合成(comb
inatorial synthesis)もしくは分析に適当なピンのアレイのようなもの、または
ウェハー、特にシリコンウェハーのような平坦表面のピン中のビーズ(プレート を有するかまたは有しない)を含む。
明細書に記載の物質のように沈殿する不溶性支持体を意味する。適当な基体の例
は、シリカゲルを含む(これに限らない)ビーズ、調節細孔ガラス(controlled po
re glass)、磁石、デキストラン、アガロースおよびセルロース、キャピラリー 、ガラスファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、ア ルミニウム、銅およびシリコン)、マルチウェルプレートを含むプラスチック物 質または膜(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニル インデンジフルオリド)のような平坦支持体、ピン、コンビナトリアル合成(comb
inatorial synthesis)もしくは分析に適当なピンのアレイのようなもの、または
ウェハー、特にシリコンウェハーのような平坦表面のピン中のビーズ(プレート を有するかまたは有しない)を含む。
【0047】 本明細書中で使用するとき、RNAポリメラーゼは、DNA依存RNAポリメ
ラーゼおよびRNA依存RNAポリメラーゼにつて言及する。任意のRNAポリ
メラーゼは、特定プロモーター配列を認識し、転写開始およびRNA転写物の伸
張が可能であり、それらが本明細書の範囲となることを目的とする。本明細書で
提供される方法で使用する典型的なRNAポリメラーゼは、1)Halobacterium、
Methanobacterium、Methanococcus、SulfolobalesおよびThermoplasmaのような 古細菌、2)グラム陰性細菌、例えばEscherichia coliおよびSalmonellaおよびS
higella、グラム陽性細菌、例えばBacillus subtilisおよびStaphlococcus aure
usのような真正細菌、3)T7、T3、SP6、ニックの入ったSP6およびN 4のようなバクテリオファージ、4)DNAウイルス、5)インフルエンザウイル
スのようなRNAウイルス、6)小麦のような植物、ならびに7)カビから単離し
た真核性RNAポリメラーゼII、例えばSaccharomyces cerevisiaeおよび高等真
核生物、例えば哺乳類から得られるがこれらに限らないものを含む。RNAファ
ージQβレプリカーゼ(国際PCT出願番号PCT/US87/00880および5,270,184)は 本明細書中で使用するRNAポリメラーゼの語の範囲に含まれている。植物およ
び動物を含む真核組織から単離されるものといった真核性RNAポリメラーゼは
、真核性細胞に感染するウイルス由来のウイルス性プロモーターを含む真核性プ
ロモーターを認識する。そのポリメラーゼをも本明細書の目的とする。T7、T
3、およびSP6RNAポリメラーゼはクローニングされており、配列およびそ
れを精製する方法ならびに細菌性RNAポリメラーゼを精製する方法および真核
性DNA依存RNAポリメラーゼは既知である。加えて、多くのRNAポリメラ
ーゼが、商業上多量に利用可能、商業的に利用可能なベクターから簡単に作成す
ることも可能である。上記ポリメラーゼおよび他のRNAポリメラーゼ、それぞ
れ用のプロモーターの配列もまた当業者に既知である。
ラーゼおよびRNA依存RNAポリメラーゼにつて言及する。任意のRNAポリ
メラーゼは、特定プロモーター配列を認識し、転写開始およびRNA転写物の伸
張が可能であり、それらが本明細書の範囲となることを目的とする。本明細書で
提供される方法で使用する典型的なRNAポリメラーゼは、1)Halobacterium、
Methanobacterium、Methanococcus、SulfolobalesおよびThermoplasmaのような 古細菌、2)グラム陰性細菌、例えばEscherichia coliおよびSalmonellaおよびS
higella、グラム陽性細菌、例えばBacillus subtilisおよびStaphlococcus aure
usのような真正細菌、3)T7、T3、SP6、ニックの入ったSP6およびN 4のようなバクテリオファージ、4)DNAウイルス、5)インフルエンザウイル
スのようなRNAウイルス、6)小麦のような植物、ならびに7)カビから単離し
た真核性RNAポリメラーゼII、例えばSaccharomyces cerevisiaeおよび高等真
核生物、例えば哺乳類から得られるがこれらに限らないものを含む。RNAファ
ージQβレプリカーゼ(国際PCT出願番号PCT/US87/00880および5,270,184)は 本明細書中で使用するRNAポリメラーゼの語の範囲に含まれている。植物およ
び動物を含む真核組織から単離されるものといった真核性RNAポリメラーゼは
、真核性細胞に感染するウイルス由来のウイルス性プロモーターを含む真核性プ
ロモーターを認識する。そのポリメラーゼをも本明細書の目的とする。T7、T
3、およびSP6RNAポリメラーゼはクローニングされており、配列およびそ
れを精製する方法ならびに細菌性RNAポリメラーゼを精製する方法および真核
性DNA依存RNAポリメラーゼは既知である。加えて、多くのRNAポリメラ
ーゼが、商業上多量に利用可能、商業的に利用可能なベクターから簡単に作成す
ることも可能である。上記ポリメラーゼおよび他のRNAポリメラーゼ、それぞ
れ用のプロモーターの配列もまた当業者に既知である。
【0048】 本明細書中で使用するとき、プロモーター領域は、DNAの発現を調節する遺
伝子のDNA部分であって、操作可能となるように連結されている部分について
言及する。プロモーター領域は、DNAの特定配列を含み、その配列はRNAポ
リメラーゼ認識、結合および転写開始に重要である。プロモーター領域の部分を
プロモーターとして言及する。加えて、プロモーター領域は、RNAポリメラー
ゼの、この認識、結合および転写開始活性を修飾する配列を含む。これらの配列
は、シス作用性因子であるか、トランス作用性因子に応答し得る。調節の性質に
依存するプロモーターは構成されるか調製され得る。構造プロモーターは常にス
イッチが入っている。調節可能プロモーターは、スイッチを入れるかまたは切る
特定シグナルを必要とする。発生学的調節プロモーターは、発生の機能としてス
イッチを入れるかまたは切るプロモーターである。プロモーターは共通配列であ
り、または多様である。非野生型プロモーターを用いるとき、転写は、検出可能
な転写物の合成に十分である速さで生じ、そして、その転写は、典型的に、野生
型または天然プロモーターがRNAポリメラーゼにより用いられインビトロで核
酸が転写される場合に生じる速さの少なくとも約5-10%である。各種のRN Aポリメラーゼは、特定のプロモーター配列に特異的である。3つのバクテリオ
ファージRNAポリメラーゼ(T7、T3、およびSP6)は、それぞれ自身の特
異的DNAプロモーター配列を有する。RNAポリメラーゼが鋳型のプロモータ
ー配列に結合し、転写が開始した後、プロモータ配列からRNAポリメラーゼが
外れる。次いで、RNAポリメラーゼは、(1)RNA出発物質を使い切り、(2)
転写反応が特定ヌクレオチド、ヌクレオシドまたは類似体により終結し、(3)R
NAポリメラーゼと鋳型が解離し、転写が自然に停止し、または(4)DNA鋳型
の最後に到達するまで、鋳型に沿って転写が継続する。
伝子のDNA部分であって、操作可能となるように連結されている部分について
言及する。プロモーター領域は、DNAの特定配列を含み、その配列はRNAポ
リメラーゼ認識、結合および転写開始に重要である。プロモーター領域の部分を
プロモーターとして言及する。加えて、プロモーター領域は、RNAポリメラー
ゼの、この認識、結合および転写開始活性を修飾する配列を含む。これらの配列
は、シス作用性因子であるか、トランス作用性因子に応答し得る。調節の性質に
依存するプロモーターは構成されるか調製され得る。構造プロモーターは常にス
イッチが入っている。調節可能プロモーターは、スイッチを入れるかまたは切る
特定シグナルを必要とする。発生学的調節プロモーターは、発生の機能としてス
イッチを入れるかまたは切るプロモーターである。プロモーターは共通配列であ
り、または多様である。非野生型プロモーターを用いるとき、転写は、検出可能
な転写物の合成に十分である速さで生じ、そして、その転写は、典型的に、野生
型または天然プロモーターがRNAポリメラーゼにより用いられインビトロで核
酸が転写される場合に生じる速さの少なくとも約5-10%である。各種のRN Aポリメラーゼは、特定のプロモーター配列に特異的である。3つのバクテリオ
ファージRNAポリメラーゼ(T7、T3、およびSP6)は、それぞれ自身の特
異的DNAプロモーター配列を有する。RNAポリメラーゼが鋳型のプロモータ
ー配列に結合し、転写が開始した後、プロモータ配列からRNAポリメラーゼが
外れる。次いで、RNAポリメラーゼは、(1)RNA出発物質を使い切り、(2)
転写反応が特定ヌクレオチド、ヌクレオシドまたは類似体により終結し、(3)R
NAポリメラーゼと鋳型が解離し、転写が自然に停止し、または(4)DNA鋳型
の最後に到達するまで、鋳型に沿って転写が継続する。
【0049】 本明細書中で使用するとき、“プロモーターを含む核酸”は、RNAポリメラ
ーゼ分子の特異的結合を指示するヌクレオチドの配列を含む核酸であり、二本鎖
DNAに結合し解離し、リボヌクレオチド三リン酸の存在下RNA合成を開始し
得るオープン転写開始複合体(open transcription initiation complex)を形成 する。更に、機能性(functional)プロモーター配列は、DNA依存RNAポリメ
ラーゼが結合、解離、開始複合体の形成および転写開始するヌクレオチドの配列
である。プロモーターを含む核酸捕捉プローブは、二本鎖分子について言及し、
プロモーター領域、および標的核酸が特に高緊縮条件下ハイブリダイズする少な
くとも約5つのヌクレオチドの3'オーバーハングを含む。典型的に、そのハイ ブリダイゼーションは、標的とプロモーターを含む捕捉プローブとの間で同一の
約5つの隣接塩基対を必要とする。転写開始後、RNAポリメラーゼ(またはそ のサブユニット)は、ポリメラーゼ、DNAおよび発生RNA転写産物を含む三 重複合体の一部である。
ーゼ分子の特異的結合を指示するヌクレオチドの配列を含む核酸であり、二本鎖
DNAに結合し解離し、リボヌクレオチド三リン酸の存在下RNA合成を開始し
得るオープン転写開始複合体(open transcription initiation complex)を形成 する。更に、機能性(functional)プロモーター配列は、DNA依存RNAポリメ
ラーゼが結合、解離、開始複合体の形成および転写開始するヌクレオチドの配列
である。プロモーターを含む核酸捕捉プローブは、二本鎖分子について言及し、
プロモーター領域、および標的核酸が特に高緊縮条件下ハイブリダイズする少な
くとも約5つのヌクレオチドの3'オーバーハングを含む。典型的に、そのハイ ブリダイゼーションは、標的とプロモーターを含む捕捉プローブとの間で同一の
約5つの隣接塩基対を必要とする。転写開始後、RNAポリメラーゼ(またはそ のサブユニット)は、ポリメラーゼ、DNAおよび発生RNA転写産物を含む三 重複合体の一部である。
【0050】 本明細書中で使用するとき、“コーディング鎖”は、プロモーターから開始し
た相当するmRNA分子と同じ方向を有する、プロモーターを含む核酸の核酸鎖
について言及する。そのため、それはセンス鎖について言及する。非コーディン
グ鎖はRNAポリメラーゼにより転写されるアンチセンス鎖である。
た相当するmRNA分子と同じ方向を有する、プロモーターを含む核酸の核酸鎖
について言及する。そのため、それはセンス鎖について言及する。非コーディン
グ鎖はRNAポリメラーゼにより転写されるアンチセンス鎖である。
【0051】 本明細書中で使用するとき、“天然のヌクレオシド(またはリボヌクレオシド)
三リン酸”または“天然のヌクレオチド”またはリボヌクレオチド三リン酸は、
天然に生ずるRNAの通常の前駆体のうち何れか1つ、即ち、ATP、GTP、
CTP、またはUTPを意味する。“ヌクレオシド三リン酸類似体”または“ヌ
クレオチド類似体”は、天然のヌクレオチドに類似する任意のヌクレオシド三リ
ン酸であって、天然のヌクレオシドまたはヌクレオチドに比べ1またはそれ以上
の化学修飾を有するものを意味する。
三リン酸”または“天然のヌクレオチド”またはリボヌクレオチド三リン酸は、
天然に生ずるRNAの通常の前駆体のうち何れか1つ、即ち、ATP、GTP、
CTP、またはUTPを意味する。“ヌクレオシド三リン酸類似体”または“ヌ
クレオチド類似体”は、天然のヌクレオチドに類似する任意のヌクレオシド三リ
ン酸であって、天然のヌクレオシドまたはヌクレオチドに比べ1またはそれ以上
の化学修飾を有するものを意味する。
【0052】 本明細書中で使用するとき、“マトリクス物質”は、プロトン供与性、UV吸
収物質、通常有機酸であるマススペクトロメトリーで使用する物質について言及
し、その物質はMALDIの間に容易にイオン化する結晶化マトリクス核酸構造
を形成する。典型的なマトリクス物質は3-ヒドロキシピコリン酸溶液(3-HP A、50%アセトニトリル、10%クエン酸アンモニウムにおいて0.7M)で ある。
収物質、通常有機酸であるマススペクトロメトリーで使用する物質について言及
し、その物質はMALDIの間に容易にイオン化する結晶化マトリクス核酸構造
を形成する。典型的なマトリクス物質は3-ヒドロキシピコリン酸溶液(3-HP A、50%アセトニトリル、10%クエン酸アンモニウムにおいて0.7M)で ある。
【0053】 本明細書中で使用するとき、“コンディショニング”は、質量分析前に、分析
する核酸を修飾し、例えば気化(volatization)に必要なレーザーエネルギーを減
少させ、および/または断片化を最少とするプロセスについて言及する。コンデ
ィショニングは、核酸、好ましくは固定化後行われ得る。コンディショニングの
例は、例えば陽イオン交換による核酸分子のホスホジエステルバックボーンの修
飾であり、ヌクレオチド単位あたりの結合する陽イオンにおける不均一により広
がるピークが除去される。核酸分子を、アルキルヨウ化物、ヨードアセトアミド
、ヨードエタノール、または2,3-エポキシ-1-プロパノールのようなアルキル
化剤と接触することにより、核酸分子のモノチオホスホジエステル結合はホスホ
トリエステル結合に変換する。同様に、ホスホジエステル結合を、トリアルキル
シリルクロリドを用い変換すると非電荷誘導体を生ずる。コンディショニングは
また、合成の間に修飾ヌクレオチドを核酸に組込むことにより行い得る。その修
飾ヌクレオチドは、N5-、N7-またはN9-デアザプリンヌクレオチドまたは リボヌクレオチドのようなプリン類似体により、脱プリン化の感度の減少(MS 間の断片化)に使用し得る。修飾ヌクレオチドはまた、アルキル化する、RNA ビルディングブロック、オリゴヌクレオチドトリエステル、ホスホロチオネート
機能、またはPNAのような偽オリゴヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチ
ドを有するコンディショニングしたRNA転写産物の調製では、選択されたRN
Aポリメラーゼが、修飾ヌクレオチドをRNA転写産物中に組込めなければなら
ない。
する核酸を修飾し、例えば気化(volatization)に必要なレーザーエネルギーを減
少させ、および/または断片化を最少とするプロセスについて言及する。コンデ
ィショニングは、核酸、好ましくは固定化後行われ得る。コンディショニングの
例は、例えば陽イオン交換による核酸分子のホスホジエステルバックボーンの修
飾であり、ヌクレオチド単位あたりの結合する陽イオンにおける不均一により広
がるピークが除去される。核酸分子を、アルキルヨウ化物、ヨードアセトアミド
、ヨードエタノール、または2,3-エポキシ-1-プロパノールのようなアルキル
化剤と接触することにより、核酸分子のモノチオホスホジエステル結合はホスホ
トリエステル結合に変換する。同様に、ホスホジエステル結合を、トリアルキル
シリルクロリドを用い変換すると非電荷誘導体を生ずる。コンディショニングは
また、合成の間に修飾ヌクレオチドを核酸に組込むことにより行い得る。その修
飾ヌクレオチドは、N5-、N7-またはN9-デアザプリンヌクレオチドまたは リボヌクレオチドのようなプリン類似体により、脱プリン化の感度の減少(MS 間の断片化)に使用し得る。修飾ヌクレオチドはまた、アルキル化する、RNA ビルディングブロック、オリゴヌクレオチドトリエステル、ホスホロチオネート
機能、またはPNAのような偽オリゴヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチ
ドを有するコンディショニングしたRNA転写産物の調製では、選択されたRN
Aポリメラーゼが、修飾ヌクレオチドをRNA転写産物中に組込めなければなら
ない。
【0054】 シーケンシングの方法 核酸をシーケンスする質量分析法を提供する。特に、シーケンスする方法は、
プロモーターをコードする二本鎖領域および標的核酸の相補的領域とハイブリダ
イズする一本鎖領域を含む、核酸を含むプローブを用いる。核酸プロモーターを
含む捕捉プローブは、好ましくは固体支持体に固定化される。一本鎖領域は、シ
ーケンスされる核酸およびプローブの5隣接一本鎖ヌクレオチドと同一の一本鎖
領域の少なくとも5ヌクレオチドを含む、標的核酸の相補的な部分とハイブリダ
イズする。
プロモーターをコードする二本鎖領域および標的核酸の相補的領域とハイブリダ
イズする一本鎖領域を含む、核酸を含むプローブを用いる。核酸プロモーターを
含む捕捉プローブは、好ましくは固体支持体に固定化される。一本鎖領域は、シ
ーケンスされる核酸およびプローブの5隣接一本鎖ヌクレオチドと同一の一本鎖
領域の少なくとも5ヌクレオチドを含む、標的核酸の相補的な部分とハイブリダ
イズする。
【0055】 核酸プロモーター含有プローブに標的がハイブリダイズした後、核酸配列を、
プロモーターから開始され標的核酸を介して転写される一群のネストした塩基特
異的チェーンターミネイテッドRNA転写産物を生じることにより、決定する。
生じるネストしたRNA転写産物をマススペクトロメトリーを用い分析する。
プロモーターから開始され標的核酸を介して転写される一群のネストした塩基特
異的チェーンターミネイテッドRNA転写産物を生じることにより、決定する。
生じるネストしたRNA転写産物をマススペクトロメトリーを用い分析する。
【0056】 DNAは時折、シーケンシングに好ましい媒体である一方、本明細書の方法は
により、RNA転写産物がシーケンスされる。RNA断片は、マトリクスアシス
トレーザー吸収/イオン化(MALDI)マススペクトロメトリーの間、DNA断 片よりも安定する。理論によると結合しないが、促進された安定性は、RNAの
糖部分の2'-ヒドロキシル基の存在により生じ、MALDIプロセスの間、脱プ
リン化の減少を助ける。
により、RNA転写産物がシーケンスされる。RNA断片は、マトリクスアシス
トレーザー吸収/イオン化(MALDI)マススペクトロメトリーの間、DNA断 片よりも安定する。理論によると結合しないが、促進された安定性は、RNAの
糖部分の2'-ヒドロキシル基の存在により生じ、MALDIプロセスの間、脱プ
リン化の減少を助ける。
【0057】 RNAポリメラーゼおよびプロモーター RNA分子のインビトロの転写を目的とし得る任意のRNAポリメラーゼは、
本明細書に記載の方法で使用することを目的とする。好ましいRNAポリメラー
ゼは、DNA依存RNAポリメラーゼである。RNAポリメラーゼ分子を単離し
および精製する方法は、当業者に既知である:Qβレプリカーゼ(seee、例えば 米国特許番号5,696,249、再発行:35,443およびProcedures in Nucl. Acids Res
each, Cantoni and Davies, eds., Volume 2, pp. 829-839, Harper and Rowe,
NY中のEoyang et al., (1971));細菌(例えばE.coli、Burgess and Jendrisak(1
975)Biochemistry 14:4634-4638およびHager et al., (1990)Biochemistry 29:7
890-7894参照;Leishmania、例えばSadhukhan et al., (1997)Mol. Cell. Bioch
em. 171; 105-114;Bacillus subtilis、Giacomoni(1980)Eur. J. Biochem. 106
:579-591);ファージ(例えば、T7、McDonnell et al., (1977)J. Mol. Biol. 89
:719-736およびStudier et al., (1969) Virology 39:562-574;またHe et al.,
(1997) Protein Expr. Purif. 9:142-151);ウイルス(例えば、rhabdovirus、Da
s et al., (1996) Methods Enzymol. 275:99-122参照;turnip mosiac virus, D
eidman et al., (1997)J.Viral Meth. 64:184-195参照;vaccinia、Gershon et a
l., (1996)Methods Enzymol. 275:35-57);哺乳類(例えば、yeast polII, Koles
ke et al., (1996)Methods Enzymol. 273:176-184;ヒトpolII、Maldonado et al
., (1996) Methods Enzymol. 274:72-100)。加えて、多くの原核、真核、バクテ
リオファージおよびウイルスRNAポリメラーゼ、例えばT3、T7およびSP
6は、商業上利用可能であり(例えば、Stratage, La Jolla, CA; Boehringer Ma
nnheim, Indianapolis, IN;Pharmacia, Uppsala, Sweden;およびSigma Chemical
Corp, St. Louis, MO)、および/または既知である。プロモーターも既知であ り、容易に利用可能である(例えば、Promega, Madison WIより利用できるpGE
Mプラスミドシリーズ、米国特許番号4,766,072も参照。それはpGEMプラス ミドの構成について記載されている)。
本明細書に記載の方法で使用することを目的とする。好ましいRNAポリメラー
ゼは、DNA依存RNAポリメラーゼである。RNAポリメラーゼ分子を単離し
および精製する方法は、当業者に既知である:Qβレプリカーゼ(seee、例えば 米国特許番号5,696,249、再発行:35,443およびProcedures in Nucl. Acids Res
each, Cantoni and Davies, eds., Volume 2, pp. 829-839, Harper and Rowe,
NY中のEoyang et al., (1971));細菌(例えばE.coli、Burgess and Jendrisak(1
975)Biochemistry 14:4634-4638およびHager et al., (1990)Biochemistry 29:7
890-7894参照;Leishmania、例えばSadhukhan et al., (1997)Mol. Cell. Bioch
em. 171; 105-114;Bacillus subtilis、Giacomoni(1980)Eur. J. Biochem. 106
:579-591);ファージ(例えば、T7、McDonnell et al., (1977)J. Mol. Biol. 89
:719-736およびStudier et al., (1969) Virology 39:562-574;またHe et al.,
(1997) Protein Expr. Purif. 9:142-151);ウイルス(例えば、rhabdovirus、Da
s et al., (1996) Methods Enzymol. 275:99-122参照;turnip mosiac virus, D
eidman et al., (1997)J.Viral Meth. 64:184-195参照;vaccinia、Gershon et a
l., (1996)Methods Enzymol. 275:35-57);哺乳類(例えば、yeast polII, Koles
ke et al., (1996)Methods Enzymol. 273:176-184;ヒトpolII、Maldonado et al
., (1996) Methods Enzymol. 274:72-100)。加えて、多くの原核、真核、バクテ
リオファージおよびウイルスRNAポリメラーゼ、例えばT3、T7およびSP
6は、商業上利用可能であり(例えば、Stratage, La Jolla, CA; Boehringer Ma
nnheim, Indianapolis, IN;Pharmacia, Uppsala, Sweden;およびSigma Chemical
Corp, St. Louis, MO)、および/または既知である。プロモーターも既知であ り、容易に利用可能である(例えば、Promega, Madison WIより利用できるpGE
Mプラスミドシリーズ、米国特許番号4,766,072も参照。それはpGEMプラス ミドの構成について記載されている)。
【0058】 方法の実施において、DNA依存RNAポリメラーゼおよびRNA依存RNA
ポリメラーゼを使用し得る。例えば、本明細書中で提供される方法に使用し得る
RNAポリメラーゼには、1)Halobacterium、Methanobacterium、Methanococcu
s、SulfolobalesおよびThermoplasmaのような古細菌、2)グラム陰性細菌、例え
ばEscherichia coliおよびSalmonellaおよびShigella、グラム陽性細菌、例えば
Bacillus subtilisおよびStaphlococcus aureusのような真正細菌、3)T7、T
3、SP6およびN4のようなバクテリオファージ、4)DNAウイルス、5)イ
ンフルエンザウイルスのようなRNAウイルス、6)小麦のような植物および植 物ウイルスおよびカブモシアックウイルス、ならびに7)カビから単離した真核 性RNAポリメラーゼII、例えばSaccharomyces cerevisiaeおよび高等真核生物
、例えば哺乳類(再検討のため、In RNA Polymerase and the Regulation of Tra
nscription, Rezinkoff et al., eds, Elsevier, NY参照)から得られたものを含
むがこれらに限らない。また、本明細書での使用に含まれるのは、QβRNAフ
ァージのQβレプリカーゼである(例えば、米国特許番号5,670,353、5,696,249 および再発行:35,443参照)。
ポリメラーゼを使用し得る。例えば、本明細書中で提供される方法に使用し得る
RNAポリメラーゼには、1)Halobacterium、Methanobacterium、Methanococcu
s、SulfolobalesおよびThermoplasmaのような古細菌、2)グラム陰性細菌、例え
ばEscherichia coliおよびSalmonellaおよびShigella、グラム陽性細菌、例えば
Bacillus subtilisおよびStaphlococcus aureusのような真正細菌、3)T7、T
3、SP6およびN4のようなバクテリオファージ、4)DNAウイルス、5)イ
ンフルエンザウイルスのようなRNAウイルス、6)小麦のような植物および植 物ウイルスおよびカブモシアックウイルス、ならびに7)カビから単離した真核 性RNAポリメラーゼII、例えばSaccharomyces cerevisiaeおよび高等真核生物
、例えば哺乳類(再検討のため、In RNA Polymerase and the Regulation of Tra
nscription, Rezinkoff et al., eds, Elsevier, NY参照)から得られたものを含
むがこれらに限らない。また、本明細書での使用に含まれるのは、QβRNAフ
ァージのQβレプリカーゼである(例えば、米国特許番号5,670,353、5,696,249 および再発行:35,443参照)。
【0059】 シーケンスされる核酸および鋳型に適当なRNAポリメラーゼの選択は、技術
者の技術の範囲内であり、シーケンスされる核酸分子および選択されたプロモー
ター領域により変化する。その選択は、当業者に既知の教えを用い従い経験的に
決定でき、それらには本明細書に記載のものを含む。シーケンスされる好ましい
核酸分子はDNA分子である。RNAおよび、特にPNA(タンパク質核酸)はま
た、適当なRNAポリメラーゼの選択に応じてシーケンシングに影響を与える。
者の技術の範囲内であり、シーケンスされる核酸分子および選択されたプロモー
ター領域により変化する。その選択は、当業者に既知の教えを用い従い経験的に
決定でき、それらには本明細書に記載のものを含む。シーケンスされる好ましい
核酸分子はDNA分子である。RNAおよび、特にPNA(タンパク質核酸)はま
た、適当なRNAポリメラーゼの選択に応じてシーケンシングに影響を与える。
【0060】 本明細書に記載したシーケンシング方法に使用する核酸プロモーター含有プロ
ーブ、それぞれにはプロモーターを含む。本明細書の方法に使用するプロモータ
ーは任意の源から得られ得、選択されたRNAポリメラーゼにより認識される配
列を基にして合成的に調製され得る。例えば、プロモーターを含む核酸は、細菌
、ウイルス、ファージおよび真核性生物のような多種多様な生物から、クローニ
ングすることにより直接得られるか、または商業的に利用可能な発現ベクターか
ら得られる(例えば、Boehringer MannheimおよびPharmaciaのT7、T3、SP 6およびλPLおよびλPRプロモーター;blaまたはlacプロモーター、RS
V-LTRプロモーターおよびF9-1プロモーター;Stratagene)。適当なプロ モーターの選択は、シーケンスされる核酸、シーケンシングの条件、および最も
重要であるのは転写用に選択するRNAポリメラーゼに依存する。
ーブ、それぞれにはプロモーターを含む。本明細書の方法に使用するプロモータ
ーは任意の源から得られ得、選択されたRNAポリメラーゼにより認識される配
列を基にして合成的に調製され得る。例えば、プロモーターを含む核酸は、細菌
、ウイルス、ファージおよび真核性生物のような多種多様な生物から、クローニ
ングすることにより直接得られるか、または商業的に利用可能な発現ベクターか
ら得られる(例えば、Boehringer MannheimおよびPharmaciaのT7、T3、SP 6およびλPLおよびλPRプロモーター;blaまたはlacプロモーター、RS
V-LTRプロモーターおよびF9-1プロモーター;Stratagene)。適当なプロ モーターの選択は、シーケンスされる核酸、シーケンシングの条件、および最も
重要であるのは転写用に選択するRNAポリメラーゼに依存する。
【0061】 プロモーターは、プロモーターのコーディングおよび非コーディングDNA鎖
をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより合成し得る( 実施例4参照)。核酸の別々の鎖は、好ましくは核酸合成技術により得られる。 プロモーターの集合に使用するオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション
後に標的DNAがハイブリダイズできるコーディング鎖の3'末端の位置に一本 鎖領域が存在するように設計する。
をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより合成し得る( 実施例4参照)。核酸の別々の鎖は、好ましくは核酸合成技術により得られる。 プロモーターの集合に使用するオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション
後に標的DNAがハイブリダイズできるコーディング鎖の3'末端の位置に一本 鎖領域が存在するように設計する。
【0062】 核酸プロモーター含有プローブの固定化 好ましい態様では、核酸プロモーター含有プローブを、直接か、架橋剤により
、本明細書中で提供する固体支持体に固定化する。プローブを、標的とハイブリ
ダイズする前、またはハイブリダイズした後、固定化し得る。好ましくは、そし
て、最も都合よくはハイブリダイゼーションは固体支持体に固定化した後行う。
プローブは、好ましくはコーディング鎖の5'末端または非コーディング鎖の3'
末端を介し固定化される。
、本明細書中で提供する固体支持体に固定化する。プローブを、標的とハイブリ
ダイズする前、またはハイブリダイズした後、固定化し得る。好ましくは、そし
て、最も都合よくはハイブリダイゼーションは固体支持体に固定化した後行う。
プローブは、好ましくはコーディング鎖の5'末端または非コーディング鎖の3'
末端を介し固定化される。
【0063】 他の態様では、プロモーターおよび下流標的核酸を、転写単位として、ゲノム
DNAから、プライマーによる増幅またはハイブリダイゼーションクローニング
技術により、単離することができる。次いで、プロモーターおよび標的をコード
するDNAを、コーディング鎖(センス鎖)の5'末端または非コーディング鎖の 3'末端の終端ヌクレオチドを介し固体に固定化し得る。更に以下で考察するよ うに、連結基をPCRプライマーに組込み、固相への有向固定化を行うプロモー
ター含有核酸鋳型の単離に使用し得る。プロモーターを認識する適当なRNAポ
リメラーゼの使用により、チェーンターミネイティングヌクレオチドが存在し、
シーケンスを決定できる一群のネストした断片が生ずる。
DNAから、プライマーによる増幅またはハイブリダイゼーションクローニング
技術により、単離することができる。次いで、プロモーターおよび標的をコード
するDNAを、コーディング鎖(センス鎖)の5'末端または非コーディング鎖の 3'末端の終端ヌクレオチドを介し固体に固定化し得る。更に以下で考察するよ うに、連結基をPCRプライマーに組込み、固相への有向固定化を行うプロモー
ター含有核酸鋳型の単離に使用し得る。プロモーターを認識する適当なRNAポ
リメラーゼの使用により、チェーンターミネイティングヌクレオチドが存在し、
シーケンスを決定できる一群のネストした断片が生ずる。
【0064】 好ましい支持体は核酸の連結を高密度で支持できるものであり、そのため、好
ましくは、共有結合した核酸が、基質上に、密度が少なくとも約20fmol/
mm2、より好ましくは少なくとも約75fmol/mm2、それでもより好まし
くは少なくとも約85fmol/mm2、またさらに好ましくは少なくとも約1 00fmol/mm2、および最も好ましくは少なくとも約150fmol/m m2で存在する。基体のなかで、本明細書中で提供する基体に核酸を固定化する 特定の方法の使用に最も好ましい基体は、シリコンであり、その一方、あまり好
ましくない基体にはポリアクリルアミドのような重合体物質を含む。本明細書中
で提供するアレイを作成する方法に使用する基質には、任意の多様な不溶性支持
体物質を含み、それらには、シリカゲル、調節細孔ガラス、セルロース、ガラス
ファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、アルミニウ ム、シリコンおよび銅)、プラスチック物質(例えば、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリアミド、ポリビニルデンジフルオリド)およびシリコンを含むが、こ れらに限らない。
ましくは、共有結合した核酸が、基質上に、密度が少なくとも約20fmol/
mm2、より好ましくは少なくとも約75fmol/mm2、それでもより好まし
くは少なくとも約85fmol/mm2、またさらに好ましくは少なくとも約1 00fmol/mm2、および最も好ましくは少なくとも約150fmol/m m2で存在する。基体のなかで、本明細書中で提供する基体に核酸を固定化する 特定の方法の使用に最も好ましい基体は、シリコンであり、その一方、あまり好
ましくない基体にはポリアクリルアミドのような重合体物質を含む。本明細書中
で提供するアレイを作成する方法に使用する基質には、任意の多様な不溶性支持
体物質を含み、それらには、シリカゲル、調節細孔ガラス、セルロース、ガラス
ファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、アルミニウ ム、シリコンおよび銅)、プラスチック物質(例えば、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリアミド、ポリビニルデンジフルオリド)およびシリコンを含むが、こ れらに限らない。
【0065】 架橋試薬を用いない方法の態様では、修飾核酸は、直接、適当な機能化表面と
反応し、固定化核酸を生ずる。そのため、例えば、ヨードアセチル修飾表面(ま たは他のチオール反応性表面機能)は、チオール修飾核酸と反応し、固定化核酸 を提供することができる。
反応し、固定化核酸を生ずる。そのため、例えば、ヨードアセチル修飾表面(ま たは他のチオール反応性表面機能)は、チオール修飾核酸と反応し、固定化核酸 を提供することができる。
【0066】 架橋試薬を使用する態様では、架橋試薬は、不溶性支持体上に固定化した核酸
が高密度となるように選択する。架橋試薬(および支持体表面または核酸分子の 機能化に使用する他の試薬)を選択し、支持体表面から固定化核酸分子を任意の 望ましい一定距離だけ離し、お互いから固定化核酸を任意の望ましい一定距離だ
け離す。そのため、核酸分子の立体的障害物を、適当な架橋剤の選択により減少
するか、除去することができる。ある態様では、架橋剤は、複数の核酸が単一の
架橋部分に結合するデンドライマー(dendrimer)合成に使用するとき複数の反応 機能を提供するように選択される。好ましくは、架橋剤は、核酸分子に高い反応
性があり、急速の、完全な、および/または選択的反応を提供するように選択さ
れる。好ましい態様では、試薬(例えば、チオール基試薬およびチオール反応機 能)の反応体積は小さい。
が高密度となるように選択する。架橋試薬(および支持体表面または核酸分子の 機能化に使用する他の試薬)を選択し、支持体表面から固定化核酸分子を任意の 望ましい一定距離だけ離し、お互いから固定化核酸を任意の望ましい一定距離だ
け離す。そのため、核酸分子の立体的障害物を、適当な架橋剤の選択により減少
するか、除去することができる。ある態様では、架橋剤は、複数の核酸が単一の
架橋部分に結合するデンドライマー(dendrimer)合成に使用するとき複数の反応 機能を提供するように選択される。好ましくは、架橋剤は、核酸分子に高い反応
性があり、急速の、完全な、および/または選択的反応を提供するように選択さ
れる。好ましい態様では、試薬(例えば、チオール基試薬およびチオール反応機 能)の反応体積は小さい。
【0067】 修飾核酸プロモーター含有プローブおよびリンカー 本明細書中で使用するための、好ましい核酸プロモーター含有プローブは、“
チオール修飾核酸”、即ち、少なくとも1つの反応性チオール部分を含むように
誘導された核酸である。更に下記実施例1で詳細したように、少なくとも1つの
反応性チオールを含む核酸を、3'または5'ジスルフィドを含む核酸を好ましく
は後の反応で拮抗しない(即ち、ヨードアセトイミド機能と反応しない)還元剤で
処理することにより、好ましくは合成する。ジスルフィド誘導性核酸は様々な方
法で合成され得る。例えば、核酸は、ジスルフィド含有修飾試薬との反応により
3'または5'末端で修飾され得る。他に、チオール酸プライマーは、酵素学的に
、または非酵素学的に連結する核酸によりなり得る。5'ホスホロアミデイト機 能はまたチオールまたはジスルフィド含有シトシンまたはデオキシシトシンへの
結合点を提供し得る。ジスルフィド修飾核酸の還元に適当な還元剤の例には、ト
リス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(好ましくは1-100mMの
範囲の濃度(最も好ましくは約10mM))がpH3-6の範囲(最も好ましくは約 4.5)、温度20-45℃の範囲(最も好ましくは約37℃)で、約1ないし約1
0時間(最も好ましくは約5時間)反応すること、ジチオスレイトール(好ましく は25ないし100mMの濃度範囲(反応物が単離されるかどうかに依存する)) がpH6-10(最も好ましくは約8)および温度25-45℃(最も好ましくは約 37℃)で、約1ないし約10時間(最も好ましくは5時間)反応することを含む 。TCEPは、反応し得る低pHで利点がある。この低いpHは、チオールを効
率的にプロトン化し、そのため、チオールの求核反応を抑制し、高いpHで使用
する他のジスルフィド還元剤を有する場合よりも副作用が少ない。
チオール修飾核酸”、即ち、少なくとも1つの反応性チオール部分を含むように
誘導された核酸である。更に下記実施例1で詳細したように、少なくとも1つの
反応性チオールを含む核酸を、3'または5'ジスルフィドを含む核酸を好ましく
は後の反応で拮抗しない(即ち、ヨードアセトイミド機能と反応しない)還元剤で
処理することにより、好ましくは合成する。ジスルフィド誘導性核酸は様々な方
法で合成され得る。例えば、核酸は、ジスルフィド含有修飾試薬との反応により
3'または5'末端で修飾され得る。他に、チオール酸プライマーは、酵素学的に
、または非酵素学的に連結する核酸によりなり得る。5'ホスホロアミデイト機 能はまたチオールまたはジスルフィド含有シトシンまたはデオキシシトシンへの
結合点を提供し得る。ジスルフィド修飾核酸の還元に適当な還元剤の例には、ト
リス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(好ましくは1-100mMの
範囲の濃度(最も好ましくは約10mM))がpH3-6の範囲(最も好ましくは約 4.5)、温度20-45℃の範囲(最も好ましくは約37℃)で、約1ないし約1
0時間(最も好ましくは約5時間)反応すること、ジチオスレイトール(好ましく は25ないし100mMの濃度範囲(反応物が単離されるかどうかに依存する)) がpH6-10(最も好ましくは約8)および温度25-45℃(最も好ましくは約 37℃)で、約1ないし約10時間(最も好ましくは5時間)反応することを含む 。TCEPは、反応し得る低pHで利点がある。この低いpHは、チオールを効
率的にプロトン化し、そのため、チオールの求核反応を抑制し、高いpHで使用
する他のジスルフィド還元剤を有する場合よりも副作用が少ない。
【0068】 以下の実施例1で更に記載するような、好ましい二機能性架橋剤は、N-スク シンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)である。他の 架橋剤には、ジマレイミド、ジチオ-ビス-ニトロ安息香酸(DTNB)、N-スク シンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、N-スクシンイミジル- 3-(2-ピリジルジチオールプロピオネート)(SPDP)、4-(N-マレイミドメ チル)シクロヘキサン-1-カルボン酸スクシンイミジル(SMCC)および6-ヒド
ラジノニコチンイミド(nicotimide)(HYNIC)が含まれるが、これらに限らず
、新規プロセスにも使用され得る。架橋剤の更なる例は、例えばWong "Chemistr
y of Protein Conjugation and Cross-Linking, " CRC Press (1991), and Herm
anson, "Bioconjugate Techniques" Academic Press (1995)参照。
ラジノニコチンイミド(nicotimide)(HYNIC)が含まれるが、これらに限らず
、新規プロセスにも使用され得る。架橋剤の更なる例は、例えばWong "Chemistr
y of Protein Conjugation and Cross-Linking, " CRC Press (1991), and Herm
anson, "Bioconjugate Techniques" Academic Press (1995)参照。
【0069】 他の態様では、核酸を、マススペクトロメトリーで切断する光開裂可能または
光に不安定なリンカー部分を用い固定化する。典型的な光に不安定な架橋リンカ
ーには、3-アミノ-(2-ニトロフェニル)プロピオン酸(Brown et al.(1995) Mol
ecular Diversity, pp.4-12 and Rothschild et al., (1996) Nucl. Acids Res.
24:361-66)を含むがこれらに限らない。また国際特許出願番号WO98/200
19参照。
光に不安定なリンカー部分を用い固定化する。典型的な光に不安定な架橋リンカ
ーには、3-アミノ-(2-ニトロフェニル)プロピオン酸(Brown et al.(1995) Mol
ecular Diversity, pp.4-12 and Rothschild et al., (1996) Nucl. Acids Res.
24:361-66)を含むがこれらに限らない。また国際特許出願番号WO98/200
19参照。
【0070】 核酸プロモーター含有プローブを、固体支持体に、標的核酸分子(T)の適当な
機能(L')と捕捉分子の適当な機能(L)との間の可逆性または不可逆性連結を介 して直接結合させる。その形式は米国特許番号5,503,980に示され多も
のに類似する。可逆性連結には、マススペクトロメトリー条件下で切断される連
結を含む。これらには、電荷移動複合体のような光開裂可能結合、および比較的
安定な有機性基間で形成された不安定結合が含まれるが、これらに限らない。
機能(L')と捕捉分子の適当な機能(L)との間の可逆性または不可逆性連結を介 して直接結合させる。その形式は米国特許番号5,503,980に示され多も
のに類似する。可逆性連結には、マススペクトロメトリー条件下で切断される連
結を含む。これらには、電荷移動複合体のような光開裂可能結合、および比較的
安定な有機性基間で形成された不安定結合が含まれるが、これらに限らない。
【0071】 更に、連結は4級アンモニウム基であるL'で形成され得、その場合、固体支 持体の表面は好ましくは陰性の電荷を有し、陰性電荷の核酸バックボーンと反発
する。そのため、質量分析計の分析に必要な脱着を促進する。脱着は、レーザー
パルスにより生ずる熱によるか、および/または、L'に依存する、L'発色団と
共鳴するレーザーエネルギーの特定吸収によるか、何れかにより生ずる。
する。そのため、質量分析計の分析に必要な脱着を促進する。脱着は、レーザー
パルスにより生ずる熱によるか、および/または、L'に依存する、L'発色団と
共鳴するレーザーエネルギーの特定吸収によるか、何れかにより生ずる。
【0072】 そのため、L-L'化学的性質はジスルフィド結合の型であり得(例えば、メル カプトエタノールまたはジチオエリトロールにより化学的切断可能、ビオチン/
ストレプトアビジンシステム、トリチルエーテル基のヘテロ二機能性誘導体、例
えばKoester et al.,(1990)"A Versatile Acid-Labile Linker for Modificatio
n of Synthetic Biomolecules, " Tetrahedron Letters 31:7095参照)、その結 合は、穏やかな酸性条件下およびマススペクトロメトリー条件下、レブリニル基
を切断し得る殆ど中性のヒドラジニウム/酢酸緩衝液を有する条件下であって、
トリプシンのようなエンドペプチダーゼ酵素により切断可能なアルギニン−アル
ギニンまたはリシン-リシン結合またはピロホスファターゼにより切断可能なピ ロリン酸結合、または例えばリボヌクレアーゼまたはアルカリにより切断可能な
オリゴデオキシヌクレオチド配列間のリボヌクレオチド結合を有する条件下、切
断され得る。
ストレプトアビジンシステム、トリチルエーテル基のヘテロ二機能性誘導体、例
えばKoester et al.,(1990)"A Versatile Acid-Labile Linker for Modificatio
n of Synthetic Biomolecules, " Tetrahedron Letters 31:7095参照)、その結 合は、穏やかな酸性条件下およびマススペクトロメトリー条件下、レブリニル基
を切断し得る殆ど中性のヒドラジニウム/酢酸緩衝液を有する条件下であって、
トリプシンのようなエンドペプチダーゼ酵素により切断可能なアルギニン−アル
ギニンまたはリシン-リシン結合またはピロホスファターゼにより切断可能なピ ロリン酸結合、または例えばリボヌクレアーゼまたはアルカリにより切断可能な
オリゴデオキシヌクレオチド配列間のリボヌクレオチド結合を有する条件下、切
断され得る。
【0073】 機能、LおよびL'はまた、電荷移動複合体を形成し得、そのため、一時的な L-L'連結を形成する。多くの場合、“電荷移動バンド”は、UV/visスペ
クトロメトリー(例えば、Organic Charge Transfer Complexes by R. Foster, A
cademic Press, 1969)により決定され得るため、レーザーエネルギーは、電荷移
動波長の相当するエネルギーに変化し得、そのため、固体支持体から特定の脱着
が開始し得る。幾つかの組み合わせが本目的であり、ドナー機能が固体支持体か
または検出される核酸分子に結合するか、またはその逆か、何れかであると当業
者は認識する。
クトロメトリー(例えば、Organic Charge Transfer Complexes by R. Foster, A
cademic Press, 1969)により決定され得るため、レーザーエネルギーは、電荷移
動波長の相当するエネルギーに変化し得、そのため、固体支持体から特定の脱着
が開始し得る。幾つかの組み合わせが本目的であり、ドナー機能が固体支持体か
または検出される核酸分子に結合するか、またはその逆か、何れかであると当業
者は認識する。
【0074】 他のアプローチでは、可逆性L-L'連結は、比較的適当な基を均等に形成する
ことにより生じ得る。レーザーパルスの影響のもと、脱着(上記考察したような)
およびイオン化が基の位置で生ずる。他の有機性基群が選択され得、それらの間
の結合を均等に切断するために必要な解離エネルギーに関し、相当するレーザー
波長が選択され得る(例えば、Reactive Molecules by C. Wentrup, John Wiley
& Sons, 1984参照)と当業者は認識する。
ことにより生じ得る。レーザーパルスの影響のもと、脱着(上記考察したような)
およびイオン化が基の位置で生ずる。他の有機性基群が選択され得、それらの間
の結合を均等に切断するために必要な解離エネルギーに関し、相当するレーザー
波長が選択され得る(例えば、Reactive Molecules by C. Wentrup, John Wiley
& Sons, 1984参照)と当業者は認識する。
【0075】 既述のように、固定化を含む方法の幾つかの態様を本明細書の目的とする。こ
れらには、1)プライマー核酸が固体支持体に固定化され、標的核酸がハイブリ ダイズし、プロモーター配列を形成すること、2)プロモーターをコードする二 本鎖核酸(増幅または単離した)を、連結を介して、事前に決定した鎖に固定化し
、インビトロの転写を事前に決定したデオキシ リボヌクレオチド存在下開始す
ること、および3)利用可能な配列情報がある場合に増幅され得る標的核酸が3'
オーバーハングを有する二本鎖核酸補足プローブとハイブリダイズし、生じたハ
イブリッドを固定化することが含まれるが、これらの態様に限らない。
れらには、1)プライマー核酸が固体支持体に固定化され、標的核酸がハイブリ ダイズし、プロモーター配列を形成すること、2)プロモーターをコードする二 本鎖核酸(増幅または単離した)を、連結を介して、事前に決定した鎖に固定化し
、インビトロの転写を事前に決定したデオキシ リボヌクレオチド存在下開始す
ること、および3)利用可能な配列情報がある場合に増幅され得る標的核酸が3'
オーバーハングを有する二本鎖核酸補足プローブとハイブリダイズし、生じたハ
イブリッドを固定化することが含まれるが、これらの態様に限らない。
【0076】 プライマー核酸を固体支持体に固定化し、標的核酸をそれにハイブリダイズす
る場合の態様では、切断可能リンカーの含有により、プライマーDNAを5'末 端で固定化する。そのため遊離3'-OHは、遊離DNA鎖に標的DNA“ハイブ
リダイズ”し、転写を開始させるのに有用となる。
る場合の態様では、切断可能リンカーの含有により、プライマーDNAを5'末 端で固定化する。そのため遊離3'-OHは、遊離DNA鎖に標的DNA“ハイブ
リダイズ”し、転写を開始させるのに有用となる。
【0077】 核酸を固体支持体に固定化するための、当業者に既知の任意のリンカーを、本
明細書中で使用し、核酸を固体支持体に連結する。本明細書中の好ましいリンカ
ーは、選択的に切断されるリンカーであり、特に本明細書中で例示するものであ
る。他のリンカーには、ビスマレイミデオトキシプロパンのような酸切断可能リ
ンカーおよび酸に不安定なトリチルリンカーを含む。酸切断可能リンカー、光開
裂および熱感受性リンカーをも使用し、特にその場合、容易に反応をする標的試
薬を切断する必要がある。
明細書中で使用し、核酸を固体支持体に連結する。本明細書中の好ましいリンカ
ーは、選択的に切断されるリンカーであり、特に本明細書中で例示するものであ
る。他のリンカーには、ビスマレイミデオトキシプロパンのような酸切断可能リ
ンカーおよび酸に不安定なトリチルリンカーを含む。酸切断可能リンカー、光開
裂および熱感受性リンカーをも使用し、特にその場合、容易に反応をする標的試
薬を切断する必要がある。
【0078】 酸切断可能リンカー 酸切断可能リンカーには、ビスマレイミデオトキシプロパン、およびアジピン
酸ジヒドラジドリンカー(例えば、Fattom et al., (1992) Infection & Immun.
60:584-589)および細胞内トランスフェリンサイクリング経路に導入する重要な トランスフェリン部分を含む酸に不安定なトランスフェリンコンジュゲート(例 えば、Welhoener et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:4309-4314)を含むがこれ
らに限らない。
酸ジヒドラジドリンカー(例えば、Fattom et al., (1992) Infection & Immun.
60:584-589)および細胞内トランスフェリンサイクリング経路に導入する重要な トランスフェリン部分を含む酸に不安定なトランスフェリンコンジュゲート(例 えば、Welhoener et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:4309-4314)を含むがこれ
らに限らない。
【0079】 光開裂リンカー 光開列リンカーは、光にさらされることにより切断され(例えば、Goldmacher
et al., (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107参照)、光にさらされることにより標
的試薬を放出するリンカーである。光にさらされることにより切断する光開裂リ
ンカーは、光にさらされることにより標的試薬を放出することが知られている( 例えば、Hazum et al., (1981)、システインの光開裂保護基としてニトロベンジ
ル基の使用を記載しているPept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt,
K(Ed), pp.105-110、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体、グリシン 共重合体、フルオレセイン共重合体およびメチルローダミン共重合体を含む水溶
性光開裂共重合体について記載するYen et al., (1989) Makromol. Chem 190:69
-82、UV光(350nm)近辺にさらすことにより光分解する架橋リンカーおよび試薬
について記載するGoldmacher et al., (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107、およ
び光開裂可能な連結を作成するニトロベンジルオキシカルボニルクロリド架橋連
結試薬について記載するSenter et al., (1985) Photochem. Photobiol 42:231-
237)。好ましい態様では、核酸は、マススペクトロメトリーの間に切断される光
切断可能リンカー部分を用い固定化される。
et al., (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107参照)、光にさらされることにより標
的試薬を放出するリンカーである。光にさらされることにより切断する光開裂リ
ンカーは、光にさらされることにより標的試薬を放出することが知られている( 例えば、Hazum et al., (1981)、システインの光開裂保護基としてニトロベンジ
ル基の使用を記載しているPept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt,
K(Ed), pp.105-110、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体、グリシン 共重合体、フルオレセイン共重合体およびメチルローダミン共重合体を含む水溶
性光開裂共重合体について記載するYen et al., (1989) Makromol. Chem 190:69
-82、UV光(350nm)近辺にさらすことにより光分解する架橋リンカーおよび試薬
について記載するGoldmacher et al., (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107、およ
び光開裂可能な連結を作成するニトロベンジルオキシカルボニルクロリド架橋連
結試薬について記載するSenter et al., (1985) Photochem. Photobiol 42:231-
237)。好ましい態様では、核酸は、マススペクトロメトリーの間に切断される光
切断可能リンカー部分を用い固定化される。
【0080】 化学的に切断可能リンカー 様々な化学的切断可能リンカーを用い、固定化核酸と固体支持体との間に切断
可能な結合を導入する。酸に不安定なリンカーには、マススペクトロメトリー、
特にMALDI-TOF MS用の化学的に切断可能リンカーが今のところ好まし
い。酸に不安定な結合が、3-HPAマトリクス溶液の添加による核酸のコンデ ィショニングの間に切断されるためである。酸に不安定な結合は、別のリンカー
基、例えば酸に不安定なトリチル基として導入されるか、または1またはそれ以
上のシリルインターヌクレオシドブリッジを、ジイソプロピルシリルを用い導入
することにより合成核酸リンカー中に組み入れられ、ジイソプロピルシリル-連 結オリゴヌクレオチド類似体を形成する。ジイソプロピルシリルブリッジが、D
NAバックボーン中のホスホジエステル結合に、1.5%トリフルオロ酢酸(T FA)または3-HPA/1%TFA MALDI-TOFマトリクス溶液のような
穏やかな酸性条件下で置換されると、DNA分子中に1またはそれ以上の鎖内部
ブレイクが導入される。ジイソプロピルシリル連結オリゴヌクレオチド前駆体お
よび類似体を調製する方法は当業者に既知である(例えば、Saha et al., (1993)
J. Org. Chem. 58:7827-7831)。これらオリゴヌクレオチド類似体は、ジイソプ
ロピルシリル誘導デオキシリボヌクレオシドを用いる固体状態オリゴヌクレオチ
ド合成方法を用い容易に調製される。
可能な結合を導入する。酸に不安定なリンカーには、マススペクトロメトリー、
特にMALDI-TOF MS用の化学的に切断可能リンカーが今のところ好まし
い。酸に不安定な結合が、3-HPAマトリクス溶液の添加による核酸のコンデ ィショニングの間に切断されるためである。酸に不安定な結合は、別のリンカー
基、例えば酸に不安定なトリチル基として導入されるか、または1またはそれ以
上のシリルインターヌクレオシドブリッジを、ジイソプロピルシリルを用い導入
することにより合成核酸リンカー中に組み入れられ、ジイソプロピルシリル-連 結オリゴヌクレオチド類似体を形成する。ジイソプロピルシリルブリッジが、D
NAバックボーン中のホスホジエステル結合に、1.5%トリフルオロ酢酸(T FA)または3-HPA/1%TFA MALDI-TOFマトリクス溶液のような
穏やかな酸性条件下で置換されると、DNA分子中に1またはそれ以上の鎖内部
ブレイクが導入される。ジイソプロピルシリル連結オリゴヌクレオチド前駆体お
よび類似体を調製する方法は当業者に既知である(例えば、Saha et al., (1993)
J. Org. Chem. 58:7827-7831)。これらオリゴヌクレオチド類似体は、ジイソプ
ロピルシリル誘導デオキシリボヌクレオシドを用いる固体状態オリゴヌクレオチ
ド合成方法を用い容易に調製される。
【0081】 核酸の修飾 A.質量修飾 ある態様では、3'-または5'-末端以外の位置での核酸修飾が使用し得る。3
'および5'位以外の位置のヌクレオチド糖部分の修飾が、通常の方法を通して可
能である。また、核酸塩基は、例えば、F. Eckstein, ed., "Oligonucleotides
and Analogues: A Practical Approach, " IRL Press (1991)に記載のように修 飾され得る。そのリンカーアームは修飾されチオール部分を含み得る。他に、チ
オール基が、修飾リン酸バックボーンにより提供される窒素原子中心に結合し得
るため、バックボーン修飾核酸が使用され得る。
'および5'位以外の位置のヌクレオチド糖部分の修飾が、通常の方法を通して可
能である。また、核酸塩基は、例えば、F. Eckstein, ed., "Oligonucleotides
and Analogues: A Practical Approach, " IRL Press (1991)に記載のように修 飾され得る。そのリンカーアームは修飾されチオール部分を含み得る。他に、チ
オール基が、修飾リン酸バックボーンにより提供される窒素原子中心に結合し得
るため、バックボーン修飾核酸が使用され得る。
【0082】 好ましい態様では、上記のような核酸の修飾は、核酸分子のその相補体へのハ
イブリダイズ能を事実上損なわない。そのため、任意の修飾では、Watson-Crick
塩基対を要因とする核酸の機能を実質的に修飾することは避けるべきである。核
酸は、非末端チオール基が存在するために修飾され、支持体に固定化されるとき
核酸は自己相補的塩基対が可能となり、二重領域を有する“ヘアピン”構造を形
成する。
イブリダイズ能を事実上損なわない。そのため、任意の修飾では、Watson-Crick
塩基対を要因とする核酸の機能を実質的に修飾することは避けるべきである。核
酸は、非末端チオール基が存在するために修飾され、支持体に固定化されるとき
核酸は自己相補的塩基対が可能となり、二重領域を有する“ヘアピン”構造を形
成する。
【0083】 B.他の修飾RNA類似体 本明細書中に記載する方法の実施において、一群のネストした塩基特異的チェ
ーンターミネイテッドRNA転写物は、修飾塩基特異的チェーンターミネイティ
ングリボヌクレオチド類似体の組込みによる転写の間に生ずる(または修飾マキ サム-ギルバートストラテジーにおけるRNaseにより特異的に切断される)。
RNAポリメラーゼによるRNA分子への組込みにおいて転写伸張の配列特異的
停止を生ずる任意のリボヌクレオシド三リン酸類似体は、本明細書中の方法に使
用し得る。現在、好ましいリボヌクレオチド類似体は3'-デオキシリボヌクレオ
チドであり、転写の塩基特異的に終結する(例えば、Axelrod et al., (1985) Bi
ochemistry 24:5716-5723;Tyagarajan et al., (1985) Biochemistry 30:10920-
10924)。
ーンターミネイテッドRNA転写物は、修飾塩基特異的チェーンターミネイティ
ングリボヌクレオチド類似体の組込みによる転写の間に生ずる(または修飾マキ サム-ギルバートストラテジーにおけるRNaseにより特異的に切断される)。
RNAポリメラーゼによるRNA分子への組込みにおいて転写伸張の配列特異的
停止を生ずる任意のリボヌクレオシド三リン酸類似体は、本明細書中の方法に使
用し得る。現在、好ましいリボヌクレオチド類似体は3'-デオキシリボヌクレオ
チドであり、転写の塩基特異的に終結する(例えば、Axelrod et al., (1985) Bi
ochemistry 24:5716-5723;Tyagarajan et al., (1985) Biochemistry 30:10920-
10924)。
【0084】 ある態様では、塩基特異的チェーンターミネイティングリボヌクレオシド三リ
ン酸類似体に加えて、付加的リボヌクレオチド類似体を加え、生ずるRNA転写
物の二次構造を少なくするか、および/または成熟前の転写終結を防止または停
止するかまたはRNA切断を防止または停止し得る。例えば、イノシン5'-三リ
ン酸を用いるリボイノシンの組込みにより、RNA産物の二次構造が少なくなる
ことが知られている。ジヌクレオチドグアニンイニシエーターの存在下、イノシ
ン5'-三リン酸は、インビトロ転写反応においてGTPに効率的に置換され得る
(例えば、Axelrod et al., (1985) Biochemistry 24:5716-5723)。
ン酸類似体に加えて、付加的リボヌクレオチド類似体を加え、生ずるRNA転写
物の二次構造を少なくするか、および/または成熟前の転写終結を防止または停
止するかまたはRNA切断を防止または停止し得る。例えば、イノシン5'-三リ
ン酸を用いるリボイノシンの組込みにより、RNA産物の二次構造が少なくなる
ことが知られている。ジヌクレオチドグアニンイニシエーターの存在下、イノシ
ン5'-三リン酸は、インビトロ転写反応においてGTPに効率的に置換され得る
(例えば、Axelrod et al., (1985) Biochemistry 24:5716-5723)。
【0085】 加えて、修飾リボヌクレオチド類似体を転写混合物に加え、転写終結および/
または転写産物放出の効率を増加し、速度酵素ターンオーバー(rate enzyme tur
nover)を促進し得る。例えば、4-チオUTP、5-ブロモUTP、5-ヨードC TPの添加は、少なくとも幾つかのRNAポリメラーゼにより、転写終結および
転写物放出を促進する核酸の水素結合を変化する。
または転写産物放出の効率を増加し、速度酵素ターンオーバー(rate enzyme tur
nover)を促進し得る。例えば、4-チオUTP、5-ブロモUTP、5-ヨードC TPの添加は、少なくとも幾つかのRNAポリメラーゼにより、転写終結および
転写物放出を促進する核酸の水素結合を変化する。
【0086】 固体支持体および基質 本明細書中で使用する不溶性支持体および基体には、シリカゲル、調節細孔ガ
ラス、磁性ビーズ、デキストランおよびアガロース(Sephadex および Sepharose
)ビーズ、セルロースビーズならびに他のもののようなビーズ、キャピラリー、 ガラスファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、アル ミニウム、シリコンおよび銅)、マルチウェルプレートを含むプラスチック物質 または膜(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニルデ ンジフルオリド)のような平坦支持体、ウェハーのような(例えば、シリコンウェ
ハー)平坦表面のピット中のウェファー、コーム、ピン(例えば、コンビナトリア
ル合成または分析に適当なピンのアレイ)またはビーズであって、フィルタープ レートを有するものまたは有さないものが含まれるが、これらに限らない。
ラス、磁性ビーズ、デキストランおよびアガロース(Sephadex および Sepharose
)ビーズ、セルロースビーズならびに他のもののようなビーズ、キャピラリー、 ガラスファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、アル ミニウム、シリコンおよび銅)、マルチウェルプレートを含むプラスチック物質 または膜(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニルデ ンジフルオリド)のような平坦支持体、ウェハーのような(例えば、シリコンウェ
ハー)平坦表面のピット中のウェファー、コーム、ピン(例えば、コンビナトリア
ル合成または分析に適当なピンのアレイ)またはビーズであって、フィルタープ レートを有するものまたは有さないものが含まれるが、これらに限らない。
【0087】 マススペクトロメトリー 転写が完了すると、RNA転写産物は、任意の様々な手段により分析され得、
その手段には、例えばUV/VIS、IR、蛍光、化学ルミネセンスまたはNM
R分光法のような分光技術、質量分析法、ゲル電気泳動および当分野に既知の他
の方法、またはそれらの組合せを含む。ここではマススペクトロメトリーが好ま
しい。質量分析計形式には、マトリクスアシストレーザー脱着(MALDI)のよ
うなイオン化(I)技術、連続的またはパルス状のエレクトロスプレー(ESI)お
よび関係のある方法(例えば、イオンスプレーまたはサーモスプレー)、ならびに
マッシングクラスターインパクト(massive cluster impact)(MCI)を含み、こ
れらのイオン源は、リニアまたはリフレクトロン飛行時間(linear or reflectro
n time-of-flight)(TOF)、シングルまたはマルチプルクワドループル(single
or multiple quadruple)、シングルまたはマルチプルマグネティックセクター(
single or multiple magnetic sector)、イオンサイクロトロン型フーリエ変換 質量分析計(Fourier Transform ion cyclotron resonance)(FTICR)、イオ ントラップ型およびそれらの組合せを含む検出形式と調和し得、ハイブリッド検
出器を生ずる(例えば、イオン-トラップ/飛行時間)。イオン化のために、多種 のマトリクス/波長の組合せ(MALDI)または溶媒の組合せ(ESI)が用いら
れる。
その手段には、例えばUV/VIS、IR、蛍光、化学ルミネセンスまたはNM
R分光法のような分光技術、質量分析法、ゲル電気泳動および当分野に既知の他
の方法、またはそれらの組合せを含む。ここではマススペクトロメトリーが好ま
しい。質量分析計形式には、マトリクスアシストレーザー脱着(MALDI)のよ
うなイオン化(I)技術、連続的またはパルス状のエレクトロスプレー(ESI)お
よび関係のある方法(例えば、イオンスプレーまたはサーモスプレー)、ならびに
マッシングクラスターインパクト(massive cluster impact)(MCI)を含み、こ
れらのイオン源は、リニアまたはリフレクトロン飛行時間(linear or reflectro
n time-of-flight)(TOF)、シングルまたはマルチプルクワドループル(single
or multiple quadruple)、シングルまたはマルチプルマグネティックセクター(
single or multiple magnetic sector)、イオンサイクロトロン型フーリエ変換 質量分析計(Fourier Transform ion cyclotron resonance)(FTICR)、イオ ントラップ型およびそれらの組合せを含む検出形式と調和し得、ハイブリッド検
出器を生ずる(例えば、イオン-トラップ/飛行時間)。イオン化のために、多種 のマトリクス/波長の組合せ(MALDI)または溶媒の組合せ(ESI)が用いら
れる。
【0088】 DNAアレイの調製 好ましい態様では、標的核酸とのハイブリダイゼーション前または後の核酸プ
ロモーター含有プローブを、アレイ形の固体支持体の表面にで固定化する。これ
らDNAアレイ形成に特に適当な方法は、本明細書中で記載したものおよび米国
特許出願番号08/746,053、08/787,639および08/786
,988に記載されたものである。各仮米国特許出願の対象物を引用により本明
細書にすべて加え、以下のような要約する。
ロモーター含有プローブを、アレイ形の固体支持体の表面にで固定化する。これ
らDNAアレイ形成に特に適当な方法は、本明細書中で記載したものおよび米国
特許出願番号08/746,053、08/787,639および08/786
,988に記載されたものである。各仮米国特許出願の対象物を引用により本明
細書にすべて加え、以下のような要約する。
【0089】 図1は、診断ツールによる分析用サンプル物質のアレイを調製する1つのシス
テムを示している。図1は、データプロセッサ12、動作コントローラー14、
ロボットアームアセンブリ16、モニターエレメント18A、中央処理装置18
B、ソース素材20のマイクロタイタープレート、ステージハウジング22、ロ
ボットアーム24、ステージ26、圧力コントローラー28、コンジット30、
マウンティングアセンブリ32、ピンアセンブリ38および基体エレメント34
を含むシステム10を示す。図1でみられる図では、ロボットアセンブリ16は
可動性マウントエレメント40および水平スライドグローブ42を含み得るとも
説明される。ロボットアーム24はピン36を中心として回転し得、アーム24
の可動範囲を広げ、そのため、アーム24によりソースプレート20上にピンア
センブリ38が配置され得る。
テムを示している。図1は、データプロセッサ12、動作コントローラー14、
ロボットアームアセンブリ16、モニターエレメント18A、中央処理装置18
B、ソース素材20のマイクロタイタープレート、ステージハウジング22、ロ
ボットアーム24、ステージ26、圧力コントローラー28、コンジット30、
マウンティングアセンブリ32、ピンアセンブリ38および基体エレメント34
を含むシステム10を示す。図1でみられる図では、ロボットアセンブリ16は
可動性マウントエレメント40および水平スライドグローブ42を含み得るとも
説明される。ロボットアーム24はピン36を中心として回転し得、アーム24
の可動範囲を広げ、そのため、アーム24によりソースプレート20上にピンア
センブリ38が配置され得る。
【0090】 図1で示されるデータプロセッサ12は、IBM PC互換性コンピューター システムのような通常のデジタルデータプロセッシングシステムであって、ロボ
ットアセンブリ16の移動および操作を調節する情報を提供する、データのプロ
セッシングおよびプログラム命令の実行に適当であるシステムであり得る。デー
タプロセッサユニット12は任意の型のシステムであり、命令シグナルのプログ
ラムのプロセッシングに適当であり、ロボットハウジング16に組込まれるロボ
ットアセンブリを操作する。所望により、データプロセッサ12は、ロボットハ
ウジング16に組込まれ、微小制御アセンブリとなり得る。更なる他の態様では
、システム10をプログラム化する必要はなく、ロボットアセンブリ16を操作
する命令を蓄積するファームウェアメモリを有するシングルボード・コンピュー
タであり得る。
ットアセンブリ16の移動および操作を調節する情報を提供する、データのプロ
セッシングおよびプログラム命令の実行に適当であるシステムであり得る。デー
タプロセッサユニット12は任意の型のシステムであり、命令シグナルのプログ
ラムのプロセッシングに適当であり、ロボットハウジング16に組込まれるロボ
ットアセンブリを操作する。所望により、データプロセッサ12は、ロボットハ
ウジング16に組込まれ、微小制御アセンブリとなり得る。更なる他の態様では
、システム10をプログラム化する必要はなく、ロボットアセンブリ16を操作
する命令を蓄積するファームウェアメモリを有するシングルボード・コンピュー
タであり得る。
【0091】 図1に示した態様では、データプロセッサ12とロボットアセンブリ16との
間を電気的につなぐコントローラー14がある。図示したコントローラー14は
動作コントローラーであり、選択された位置でロボットアーム24のポジショニ
ングするロボットアセンブリ16のモーターエレメントを操作する。加えて、コ
ントローラー14は、圧力コントローラー28に指令するロボットアセンブリ1
6に命令を与え、図示したピンアセンブリ38の個々のピンエレメントから噴射
する液体の体積を制御する。図示した動作コントローラー14のデザインおよび
構成は電気工学において既知の原理から導かれ、ロボットアセンブリ16の操作
に適当な任意のコントローラーエレメントはその範囲から出発することなく実施
し得る。
間を電気的につなぐコントローラー14がある。図示したコントローラー14は
動作コントローラーであり、選択された位置でロボットアーム24のポジショニ
ングするロボットアセンブリ16のモーターエレメントを操作する。加えて、コ
ントローラー14は、圧力コントローラー28に指令するロボットアセンブリ1
6に命令を与え、図示したピンアセンブリ38の個々のピンエレメントから噴射
する液体の体積を制御する。図示した動作コントローラー14のデザインおよび
構成は電気工学において既知の原理から導かれ、ロボットアセンブリ16の操作
に適当な任意のコントローラーエレメントはその範囲から出発することなく実施
し得る。
【0092】 図1に示したロボットアセンブリ16はコントローラー14と電子光学的につ
ながる。図示したロボットアセンブリ16は構台システムであり、ロボットアー
ムによりXY面について移動するXYテーブルを含み、さらにロボットアームを
当該XY面に対し直交的に動かすZ軸作動装置を含む。図1に示すロボットアセ
ンブリ16は、XYステージにマウントするアーム24を含み、XYアクセスに
より決まる面内でアームが動く。図示した態様では、XYテーブルをZ作動装置
にマウントし、XY面と直交するZ軸に沿ってテーブル全体を動かす。この方法
で、ロボットアセンブリは3方向の自由度を提供し、ピンアセンブリ38を基体
34上の任意の位置に退け得、ステージ26に装備する図1に示したソースプレ
ート20をロボットアセンブリ16にマウントする。
ながる。図示したロボットアセンブリ16は構台システムであり、ロボットアー
ムによりXY面について移動するXYテーブルを含み、さらにロボットアームを
当該XY面に対し直交的に動かすZ軸作動装置を含む。図1に示すロボットアセ
ンブリ16は、XYステージにマウントするアーム24を含み、XYアクセスに
より決まる面内でアームが動く。図示した態様では、XYテーブルをZ作動装置
にマウントし、XY面と直交するZ軸に沿ってテーブル全体を動かす。この方法
で、ロボットアセンブリは3方向の自由度を提供し、ピンアセンブリ38を基体
34上の任意の位置に退け得、ステージ26に装備する図1に示したソースプレ
ート20をロボットアセンブリ16にマウントする。
【0093】 図示したロボットアセンブリ16は、電気工学の分野に既知の原理から導かれ
、ピンアセンブリを基体および図示した基体34のようなソースプレートの隣接
位置への移動に適当なロボットアセンブリの一例である。したがって、他のロボ
ットシステムを、本明細書の記載に従い、当該分野から出発することなく、実施
し得る。
、ピンアセンブリを基体および図示した基体34のようなソースプレートの隣接
位置への移動に適当なロボットアセンブリの一例である。したがって、他のロボ
ットシステムを、本明細書の記載に従い、当該分野から出発することなく、実施
し得る。
【0094】 図1はロボットアセンブリ16の態様を示し、圧力コントローラー28を、コ
ンジット30を通じてマウント32に連結し、ピンアセンブリ38と連結する。
この態様では、マウント32には、コンジット30をピンアセンブリ38に流体
結合(fluidic coupling)する内部チャンネルがある。したがって、圧力コントロ
ーラー28はコンジット30と、マウント32はピンアセンブリ38と流体的に
連結する。この方法では、コントローラー14は、シグナルを圧力コントローラ
ー28に送り、ピンアセンブリ38に伝える液体圧力を選択的に制御する。
ンジット30を通じてマウント32に連結し、ピンアセンブリ38と連結する。
この態様では、マウント32には、コンジット30をピンアセンブリ38に流体
結合(fluidic coupling)する内部チャンネルがある。したがって、圧力コントロ
ーラー28はコンジット30と、マウント32はピンアセンブリ38と流体的に
連結する。この方法では、コントローラー14は、シグナルを圧力コントローラ
ー28に送り、ピンアセンブリ38に伝える液体圧力を選択的に制御する。
【0095】 図2は、ピンアセンブリ50の一態様を示し、圧力コントローラー28を含む
図1に示すシステムの実施に適当である。図示した態様では、ピンアセンブリ5
0には、上側部分52および下側部分54から形成され、クルー56Aおよび5
6Bにより合わされ一緒になり、内部チャンバー容積58が決定されるハウジン
グを含む。更に、内部チャンバー容積58を流体工学的にシールするため、ハウ
ジングには、図2に示すシールエレメントが、上側ブロックおよび下側ブロック
54の間に位置し内部チャンバー容積58の周囲を完全に取巻くO-リングガス ケット60として含まれ得ることを図2は示す。さらに図2では、ピンアセンブ
リ50は多数のベシクル62A-62Dを含み、それぞれ、軸穴(axial bore)を 含み、そこを通して伸びており、図示するホールディングチャンバー64A-6 4Dを形成する。それぞれ図示したベシクルは、それぞれ、孔68A-68Dを 通して伸びており、ハウジングの下側54内に配列している。
図1に示すシステムの実施に適当である。図示した態様では、ピンアセンブリ5
0には、上側部分52および下側部分54から形成され、クルー56Aおよび5
6Bにより合わされ一緒になり、内部チャンバー容積58が決定されるハウジン
グを含む。更に、内部チャンバー容積58を流体工学的にシールするため、ハウ
ジングには、図2に示すシールエレメントが、上側ブロックおよび下側ブロック
54の間に位置し内部チャンバー容積58の周囲を完全に取巻くO-リングガス ケット60として含まれ得ることを図2は示す。さらに図2では、ピンアセンブ
リ50は多数のベシクル62A-62Dを含み、それぞれ、軸穴(axial bore)を 含み、そこを通して伸びており、図示するホールディングチャンバー64A-6 4Dを形成する。それぞれ図示したベシクルは、それぞれ、孔68A-68Dを 通して伸びており、ハウジングの下側54内に配列している。
【0096】 図示した態様でさらに示すように、それぞれのベシクル62A-62Dは上側 フランジ部分を有し、シールエレメント70A-70Dを位置付け、ベシクルと 下側ブロック54との間に流体を通さないシールを形成し、液体が孔68A-6 8Dを通過することを防ぐ。シールの堅固性を維持するため、図示したピンアセ
ンブリ50は、スプリングとして図2に示す一群のバイアシング(biasing)エレ メント74A-74Dを含み、図示した態様では、ベシクル62A-62Dのフラ
ンジエレメントをそれぞれのシールエレメント70A-70Dに押しつけ圧迫し た状態である。図2に示したように、バイアシングエレメント74A-74Dは 、ベシクルと上側ブロック52の間で伸びている。各スプリング74A-74D は、マウンティングパッド76A-76Dにマウントして固定され得、その場合 、スプリングエレメントが上側ブロック52に結合し得る。上側ブロック52は
、更に図2に示す孔78を含む。それは、中央に位置する孔であって、回転して
孔78にマウントし得るスワジロック80を受けるためねじを切っている。
ンブリ50は、スプリングとして図2に示す一群のバイアシング(biasing)エレ メント74A-74Dを含み、図示した態様では、ベシクル62A-62Dのフラ
ンジエレメントをそれぞれのシールエレメント70A-70Dに押しつけ圧迫し た状態である。図2に示したように、バイアシングエレメント74A-74Dは 、ベシクルと上側ブロック52の間で伸びている。各スプリング74A-74D は、マウンティングパッド76A-76Dにマウントして固定され得、その場合 、スプリングエレメントが上側ブロック52に結合し得る。上側ブロック52は
、更に図2に示す孔78を含む。それは、中央に位置する孔であって、回転して
孔78にマウントし得るスワジロック80を受けるためねじを切っている。
【0097】 更に図2に示したように、コンジットによりスワジロック80をバルブ82に
連結し、そのバルブ82はスワジロック80をコンジット84に連結し、そのコ
ンジット84を圧力源に連結し得えるか、または、他にスワジロック80を、内
部58のガス抜きとして提供されるコンジット86に連結し得る。中央の穴88
はスワジロック80を通して伸び、そしてチュービングエレメントにつながり、
そのチュービングエレメントはさらにバルブ82につながり、そのため、流体工
学的および選択的に内部チャンバー容積58を圧力源か、ガス抜きアウトレット
の何れかに連結する。
連結し、そのバルブ82はスワジロック80をコンジット84に連結し、そのコ
ンジット84を圧力源に連結し得えるか、または、他にスワジロック80を、内
部58のガス抜きとして提供されるコンジット86に連結し得る。中央の穴88
はスワジロック80を通して伸び、そしてチュービングエレメントにつながり、
そのチュービングエレメントはさらにバルブ82につながり、そのため、流体工
学的および選択的に内部チャンバー容積58を圧力源か、ガス抜きアウトレット
の何れかに連結する。
【0098】 上記し、図2に図示したピンアセンブリ50が、基体90の上側表面にエッチ
ングされた多数のウェル92を含む基体エレメント90上に配置する。図2によ
り例示されるように、ベシクル62A-62Dのピッチとは次の通りである。各 ベシクルは、隣りのベシクルとある程度の距離があり、その距離は、基体90の
上側表面にエッチングされたウェル92間のピッチ距離の整数倍である。以下の
記載からわかるように、この間隔は液体の平行分配を促進し、液体を多数のウェ
ルに一度の操作で分配し得る。各ベシクルは、ステンレススチール、シリカ、ポ
リマー物質または液体サンプルの保持に適当な任意の他の物質から作成され得る
。ある実施例では、16ベシクルをあわせて用いる。それらは、硬化したベリリ
ウム銅、金メッキしたニッケルプレートを用い作成する。それらは43.2mm
の長さであり、ベシクルのシャフトは外径0.46mmに徐々に変化し、凹状チ
ップとなる。そのピンは、指向精度が約501マイクロメーターとなり得るよう
に、選択した。任意の適当なピン形を装置に使用し得、平坦、星形、凹状、尖頭
固体(pointed solid)、尖頭半中空(pointed semi-hollow)、一端または両端の角
(angled on one or both side)、他の幾何学構造を含むがこれらに限らない。
ングされた多数のウェル92を含む基体エレメント90上に配置する。図2によ
り例示されるように、ベシクル62A-62Dのピッチとは次の通りである。各 ベシクルは、隣りのベシクルとある程度の距離があり、その距離は、基体90の
上側表面にエッチングされたウェル92間のピッチ距離の整数倍である。以下の
記載からわかるように、この間隔は液体の平行分配を促進し、液体を多数のウェ
ルに一度の操作で分配し得る。各ベシクルは、ステンレススチール、シリカ、ポ
リマー物質または液体サンプルの保持に適当な任意の他の物質から作成され得る
。ある実施例では、16ベシクルをあわせて用いる。それらは、硬化したベリリ
ウム銅、金メッキしたニッケルプレートを用い作成する。それらは43.2mm
の長さであり、ベシクルのシャフトは外径0.46mmに徐々に変化し、凹状チ
ップとなる。そのピンは、指向精度が約501マイクロメーターとなり得るよう
に、選択した。任意の適当なピン形を装置に使用し得、平坦、星形、凹状、尖頭
固体(pointed solid)、尖頭半中空(pointed semi-hollow)、一端または両端の角
(angled on one or both side)、他の幾何学構造を含むがこれらに限らない。
【0099】 図3は、図2に示すピンアセンブリ50の下側ブロック54の横からの透視図
を示す。図3は、適当な大きさの1つのビンアセンブリを示す。図示すように下
側ブロック54は下部プレート98および周囲ショルダー100を有する。下部
プレート98は約3mmの厚さであり、ショルダー100は約5mmの厚さであ
る。
を示す。図3は、適当な大きさの1つのビンアセンブリを示す。図示すように下
側ブロック54は下部プレート98および周囲ショルダー100を有する。下部
プレート98は約3mmの厚さであり、ショルダー100は約5mmの厚さであ
る。
【0100】 図4は、通常構造の上からの透視図を示し、図2に示すピンアセンブリ50に
用いるピンアセンブリの使用に適当な、適当な大きさの1つの下側ブロック54
を示す。図4に示したように、下側ブロック54は、穴68の4×4のマトリク
スを含み、各ベシクルを受けるのに適当な16の孔を提供する。上記引用の図2
に記載したように、孔68間の距離は、典型的に、基体表面上のウェル間の距離
およびソースプレートのウェル間の距離の整数倍である。したがって、図4に示
すような下側ブロック54を有するピンアセンブリは、液体を16ウェルまで同
時に分配し得る。図4はまた、通常の大きさの1つの下側ブロック54を示す。
ブロック54の各サイドは通常22mmの長さであり、孔68間のピッチは約4
.5mmとなる。そのピッチは基体の使用に適当であり、その場合、図2の基体
90により例示するように液体を約500μm離した位置に分配する。図4はま
た、下側ブロック54が、図2に示すシールエレメント60のようなO-リング シールエレメントを受けるのに適当なO-リンググローブ94を所望により含む ことを示す。そのグローブエレメント94はシールエレメント60により形成さ
れる液体シールを促進し、改善し得ると理解される。
用いるピンアセンブリの使用に適当な、適当な大きさの1つの下側ブロック54
を示す。図4に示したように、下側ブロック54は、穴68の4×4のマトリク
スを含み、各ベシクルを受けるのに適当な16の孔を提供する。上記引用の図2
に記載したように、孔68間の距離は、典型的に、基体表面上のウェル間の距離
およびソースプレートのウェル間の距離の整数倍である。したがって、図4に示
すような下側ブロック54を有するピンアセンブリは、液体を16ウェルまで同
時に分配し得る。図4はまた、通常の大きさの1つの下側ブロック54を示す。
ブロック54の各サイドは通常22mmの長さであり、孔68間のピッチは約4
.5mmとなる。そのピッチは基体の使用に適当であり、その場合、図2の基体
90により例示するように液体を約500μm離した位置に分配する。図4はま
た、下側ブロック54が、図2に示すシールエレメント60のようなO-リング シールエレメントを受けるのに適当なO-リンググローブ94を所望により含む ことを示す。そのグローブエレメント94はシールエレメント60により形成さ
れる液体シールを促進し、改善し得ると理解される。
【0101】 ピンブロックはステンレススチールで製造され得る。ドリルでこの物質に正確
に約+25μmの孔を開けるためである。しかし、様々なプローブ物質もまた使
用し得、例えば、G10ラミネート、PMMAまたは他の適当な物質である。そ
のピンブロックは任意の数の孔を有し得、適所に16ピン有する16のレセプタ
クルが見られる。各ピンの指向精度を高めるため、所望による配列位置はブロッ
クの下にである。約6mmのピンチップを、マイクロタイタープレートのウェル
に浸すことができるようにさらしたままとするためである。図示したツールにお
けるプローブのレイアウトを設計し、384ウェルマイクロタイタープレートに
調整し、そのため、プローブの中心と中心の間隔は4.5mm内となる。4×4
プローブのアレイを選択した。1平方インチ未満でフィットするようにアレイを
作成するためであり、それは譲受人が使用するMALDI TOF MSのxyス
テージの範囲で動く。ピンツールアセンブリを、装置の上側を覆うステンレスス
チールで仕上げ、次いで、ロボットのZ-アーム上に取りつける。
に約+25μmの孔を開けるためである。しかし、様々なプローブ物質もまた使
用し得、例えば、G10ラミネート、PMMAまたは他の適当な物質である。そ
のピンブロックは任意の数の孔を有し得、適所に16ピン有する16のレセプタ
クルが見られる。各ピンの指向精度を高めるため、所望による配列位置はブロッ
クの下にである。約6mmのピンチップを、マイクロタイタープレートのウェル
に浸すことができるようにさらしたままとするためである。図示したツールにお
けるプローブのレイアウトを設計し、384ウェルマイクロタイタープレートに
調整し、そのため、プローブの中心と中心の間隔は4.5mm内となる。4×4
プローブのアレイを選択した。1平方インチ未満でフィットするようにアレイを
作成するためであり、それは譲受人が使用するMALDI TOF MSのxyス
テージの範囲で動く。ピンツールアセンブリを、装置の上側を覆うステンレスス
チールで仕上げ、次いで、ロボットのZ-アーム上に取りつける。
【0102】 図1および2に関し、ロボットアセンブリ16は、図2に示すピンツールアセ
ンブリ50と同様に形成したピンツールアセンブリ38を用いる。圧力コントロ
ーラー28はチャンバー58内の圧力を選択的に制御する。この態様では、制御
プログラムはデータプロセッサ12上で操作され、アセンブリ16が基体34上
のエレメントのアレイを提示する方法でロボットアセンブリ16を制御する。 最初の工程では(図2および5も参照)、プログラムによりロボットアセンブリ
16は命令され、ピンアセンブリ38を動かし、上記ソースプレート20上に配
置する。次いで、ロボットアセンブリ16により、ピンアセンブリがソースプレ
ート20に浸され、そのプレートは384ウェルDNAソースプレートであり得
る。図4に示すように、ピンアセンブリは16のピンを含み得、ピンアセンブリ
50により、16ピンが384ウェルDNAソースプレート20の16のウェル
に浸される。次に、データプロセッサ12により、動作コントローラー14は命
令され、ロボットアセンブリ16を操作し、基体34の表面上の位置にピンアセ
ンブリを移動する。基体34は、物質のサンプルを受けるのに適当な任意の基体
であり得、シリコン、プラスチック物質、または任意の他の適当な物質から形成
され得る。所望により、基体は平坦表面を有するが、他に、ピット表面、ウェル
でエッチングされた表面または任意の他の表面タイポグラフィーを含み、そして
、更に各ウェルの表面にビーズを含む。次いで、データプロセッサ12で操作さ
れるプログラムにより、ロボットアセンブリは命令され、動作コントローラー1
4を通して、圧力コントローラー28は命令され、内部チャンバー容積58内に
陽圧を生ずる。この実施では、正の内部圧力により、ベシクル62のホールディ
ングチャンバーからの液体に力が加えられ、ベシクルからの液体を噴射し、基体
90のそれぞれのウェル92に噴射する。
ンブリ50と同様に形成したピンツールアセンブリ38を用いる。圧力コントロ
ーラー28はチャンバー58内の圧力を選択的に制御する。この態様では、制御
プログラムはデータプロセッサ12上で操作され、アセンブリ16が基体34上
のエレメントのアレイを提示する方法でロボットアセンブリ16を制御する。 最初の工程では(図2および5も参照)、プログラムによりロボットアセンブリ
16は命令され、ピンアセンブリ38を動かし、上記ソースプレート20上に配
置する。次いで、ロボットアセンブリ16により、ピンアセンブリがソースプレ
ート20に浸され、そのプレートは384ウェルDNAソースプレートであり得
る。図4に示すように、ピンアセンブリは16のピンを含み得、ピンアセンブリ
50により、16ピンが384ウェルDNAソースプレート20の16のウェル
に浸される。次に、データプロセッサ12により、動作コントローラー14は命
令され、ロボットアセンブリ16を操作し、基体34の表面上の位置にピンアセ
ンブリを移動する。基体34は、物質のサンプルを受けるのに適当な任意の基体
であり得、シリコン、プラスチック物質、または任意の他の適当な物質から形成
され得る。所望により、基体は平坦表面を有するが、他に、ピット表面、ウェル
でエッチングされた表面または任意の他の表面タイポグラフィーを含み、そして
、更に各ウェルの表面にビーズを含む。次いで、データプロセッサ12で操作さ
れるプログラムにより、ロボットアセンブリは命令され、動作コントローラー1
4を通して、圧力コントローラー28は命令され、内部チャンバー容積58内に
陽圧を生ずる。この実施では、正の内部圧力により、ベシクル62のホールディ
ングチャンバーからの液体に力が加えられ、ベシクルからの液体を噴射し、基体
90のそれぞれのウェル92に噴射する。
【0103】 データプロセッサ12で操作するプログラムにより、コントローラー14も命
令され、圧力コントローラー28を制御し、ホールディングチャンバーがソース
プレート20のソース物質で充填されるのを制御する。圧力コントローラー28
により、ピンアセンブリの内部チャンバー容積58内に陰圧が生じ得る。これに
より、ベシクル62A-62Dのホールディングチャンバー中に液体を引き入れ る。圧力コントローラー28より、オープン-ループまたはクローズ-ループ制御
の何れかにより圧力が制御され得、ホールディングチャンバーにより液体が過剰
に引き入れられることを防ぎ、内部チャンバー容積58中に撒き散るのを防ぐ。
圧力を制御するループコントロールシステムは当分野で既知であり、任意の適当
なコントローラーが使用し得る。そのこぼれたものが相互汚染の原因となり、特
にソースプレート20から引き入れるソース物質がウェルからウェルへ変わる場
合にその原因となる。
令され、圧力コントローラー28を制御し、ホールディングチャンバーがソース
プレート20のソース物質で充填されるのを制御する。圧力コントローラー28
により、ピンアセンブリの内部チャンバー容積58内に陰圧が生じ得る。これに
より、ベシクル62A-62Dのホールディングチャンバー中に液体を引き入れ る。圧力コントローラー28より、オープン-ループまたはクローズ-ループ制御
の何れかにより圧力が制御され得、ホールディングチャンバーにより液体が過剰
に引き入れられることを防ぎ、内部チャンバー容積58中に撒き散るのを防ぐ。
圧力を制御するループコントロールシステムは当分野で既知であり、任意の適当
なコントローラーが使用し得る。そのこぼれたものが相互汚染の原因となり、特
にソースプレート20から引き入れるソース物質がウェルからウェルへ変わる場
合にその原因となる。
【0104】 他の態様では、各ホールディングチャンバー64A-64Dは非常に小さく、 チャンバーは毛管現象で充填される。その実施では、ピンアセンブリは、ステン
レススチールニードルのような細穴針(narrow bore needle)のアレイを含み得、
下側ブロック54の孔を通して伸びている。ソース溶液中に浸されるニードルは
毛管現象で充填される。ある実施では、気圧で充填されるキャピラリーの長さは
、 H=2γ/PGR [式中、Hは高さ、ガンマは表面張力、Pは溶液密度、Gは重力、そしてRはニ ードルの半経である。] でおおよそ決定する。そのため、各ベシクルにより保持される液体体積は、内部
の孔の大きさを選択することにより制御され得る。室温では、水は、半経100
μmのキャピラリーで15cmの高さに充填することがわかる。そのため、短穴
ナノリッター体積針(short bore nanoliter volume needle)は限界まで充填され
るが、溢れ出ることはない。毛管力(capillary force)が非常に小さすぎて、ニ ードルオリフィスの先端でメニスカスが形成できないと理解されるためである。
これは、こぼれたものによる相互汚染を防止する。ある態様では、ピンアセンブ
リのベシクルにより、種々の体積の液体を保持し分配する種々の大きさの内部チ
ャンバーが提供され得る。
レススチールニードルのような細穴針(narrow bore needle)のアレイを含み得、
下側ブロック54の孔を通して伸びている。ソース溶液中に浸されるニードルは
毛管現象で充填される。ある実施では、気圧で充填されるキャピラリーの長さは
、 H=2γ/PGR [式中、Hは高さ、ガンマは表面張力、Pは溶液密度、Gは重力、そしてRはニ ードルの半経である。] でおおよそ決定する。そのため、各ベシクルにより保持される液体体積は、内部
の孔の大きさを選択することにより制御され得る。室温では、水は、半経100
μmのキャピラリーで15cmの高さに充填することがわかる。そのため、短穴
ナノリッター体積針(short bore nanoliter volume needle)は限界まで充填され
るが、溢れ出ることはない。毛管力(capillary force)が非常に小さすぎて、ニ ードルオリフィスの先端でメニスカスが形成できないと理解されるためである。
これは、こぼれたものによる相互汚染を防止する。ある態様では、ピンアセンブ
リのベシクルにより、種々の体積の液体を保持し分配する種々の大きさの内部チ
ャンバーが提供され得る。
【0105】 他の実施では、ベシクルのホールディングチャンバー内に引き入れる液体の体
積を少なくするため、わずかな陽圧を圧力コントローラー28により内部チャン
バー容積58内に与える。陽圧により生ずる下方への力を用い、上方への毛管力
を相殺する。この方法では、ベシクルのホールディングチャンバー中への、毛管
力により引き入れられる液体体積が制御され得る。
積を少なくするため、わずかな陽圧を圧力コントローラー28により内部チャン
バー容積58内に与える。陽圧により生ずる下方への力を用い、上方への毛管力
を相殺する。この方法では、ベシクルのホールディングチャンバー中への、毛管
力により引き入れられる液体体積が制御され得る。
【0106】 図5Bは、ニードルのホールディングチャンバー内の液体が、スワジロック8
0を通して伸びる中心の穴88を通して導入されるわずかな陽圧により分配され
得ることを示している。内部チャンバー容積58中へ導入される圧力パルス(pre
ssure pulse)を制御することにより、液体は、ニードルの先端でスプレーか、水
滴形か、何れかで噴射され得る。分配速度、水滴対スプレーは、圧力コントロー
ラー28により適用される圧力に一部依存すると理解される。ある態様では、圧
力は、常圧である10と1,000Torrの間の範囲で適用される。
0を通して伸びる中心の穴88を通して導入されるわずかな陽圧により分配され
得ることを示している。内部チャンバー容積58中へ導入される圧力パルス(pre
ssure pulse)を制御することにより、液体は、ニードルの先端でスプレーか、水
滴形か、何れかで噴射され得る。分配速度、水滴対スプレーは、圧力コントロー
ラー28により適用される圧力に一部依存すると理解される。ある態様では、圧
力は、常圧である10と1,000Torrの間の範囲で適用される。
【0107】 このため、データプロセッサ12は、分配される液体体積を制御および調節す
るコンピュータープログラムを走らせることができる。プログラムはコントロー
ラー28に指令を与え、ベシクルの端でスプレーを生じるか、または水滴を形成
するか、何れかにより決められた体積の液体を噴射し、液体を分配する基体表面
とその液体を接触し得る。
るコンピュータープログラムを走らせることができる。プログラムはコントロー
ラー28に指令を与え、ベシクルの端でスプレーを生じるか、または水滴を形成
するか、何れかにより決められた体積の液体を噴射し、液体を分配する基体表面
とその液体を接触し得る。
【0108】 図5Cおよび5Dは、図5A-5Bで示された初期段階が再び行われ得ること を示し、このとき、当初の位置からオフセットした基体表面上に位置する。示さ
れた方法では、ピンツールは2つのウェル92の距離に相当する距離だけオフセ
ットされる。他のオフセットプリンティング技術(offset printing technique) を使用し得る。
れた方法では、ピンツールは2つのウェル92の距離に相当する距離だけオフセ
ットされる。他のオフセットプリンティング技術(offset printing technique) を使用し得る。
【0109】 図2に示すピンアセンブリの幾つかの利点が達成される。例えば、分配の間の
すすぎは、簡単であり、単一または多数のピンの充填を必要とするのみであり、
すすぎ溶液で空となる。更に、ホールディングチャンバーはすべて、限界まで充
填されるため、分配体積の精度はピン作成の際に注意深く制御され得るニードル
内部の大きさによってのみ変化する。更に、ニードルが非常に高価であるその装
置の費用効果がよく、しかし、表面との接触は必要ではないため、ニードルは物
理的歪みまたは圧力は少なく、交換は稀となり、長期間使用できる。
すすぎは、簡単であり、単一または多数のピンの充填を必要とするのみであり、
すすぎ溶液で空となる。更に、ホールディングチャンバーはすべて、限界まで充
填されるため、分配体積の精度はピン作成の際に注意深く制御され得るニードル
内部の大きさによってのみ変化する。更に、ニードルが非常に高価であるその装
置の費用効果がよく、しかし、表面との接触は必要ではないため、ニードルは物
理的歪みまたは圧力は少なく、交換は稀となり、長期間使用できる。
【0110】 他に、固体支持体表面上のサンプル物質の析出には、ブロックから伸びる固体
ピンエレメントを有するピンツールアセンブリを用いる技術を含み得、その場合
、ロボットアセンブリによりピンアセンブリの固体ピンエレメントがサンプル物
質のソース内に浸され、サンプル物質でピンの先端を濡らす。その後、ロボット
アセンブリにより、ピンアセンブリが基体上の位置に動かされ得、次いで、基体
の表面に対しピンアセンブリを低くし、個々の濡れたピンをその表面に接触させ
、基体表面に物質をスポットする。
ピンエレメントを有するピンツールアセンブリを用いる技術を含み得、その場合
、ロボットアセンブリによりピンアセンブリの固体ピンエレメントがサンプル物
質のソース内に浸され、サンプル物質でピンの先端を濡らす。その後、ロボット
アセンブリにより、ピンアセンブリが基体上の位置に動かされ得、次いで、基体
の表面に対しピンアセンブリを低くし、個々の濡れたピンをその表面に接触させ
、基体表面に物質をスポットする。
【0111】 固定化したプロモーター含有核酸を伴う固体ピンを有するピンツールアセンブ
リを、ハイブリダイゼーションおよび/またはRNA転写物を生ずるための反応
混合物を含むウェルに浸し得る。次いで、転写産物を有する液体を、上記考察し
たように、例えば基体表面上にサンプルをスポットしたピンツールアセンブリの
固体ピンを用いることにより、アレイに析出し得る。
リを、ハイブリダイゼーションおよび/またはRNA転写物を生ずるための反応
混合物を含むウェルに浸し得る。次いで、転写産物を有する液体を、上記考察し
たように、例えば基体表面上にサンプルをスポットしたピンツールアセンブリの
固体ピンを用いることにより、アレイに析出し得る。
【0112】 図6Aおよび6Bは、基体表面上にまたは表面に物質を分配する他の代わりの
システムを示す。特に、図6Aは、ジェットプリンティング装置110を示し、
それには、キャピラリーエレメント112、変換器エレメント114およびオリ
フィス(示さず)118、液体コンジット122および図1に示すロボットアーム
24のようなロボットアームアセンブリに連結するマウント124を含む。更に
図6Aに示すように、ジェットアセンブリ110は、サンプル物質を表面128
上に分配するため、一連の小滴120であるサンプル物質のオリフィス118か
らの噴射に適当である。
システムを示す。特に、図6Aは、ジェットプリンティング装置110を示し、
それには、キャピラリーエレメント112、変換器エレメント114およびオリ
フィス(示さず)118、液体コンジット122および図1に示すロボットアーム
24のようなロボットアームアセンブリに連結するマウント124を含む。更に
図6Aに示すように、ジェットアセンブリ110は、サンプル物質を表面128
上に分配するため、一連の小滴120であるサンプル物質のオリフィス118か
らの噴射に適当である。
【0113】 ジェットアセンブリ110のキャピラリー112は、ガラスキャピラリー、プ
ラスチックキャピラリー、または任意の他の適当なハウジングであり得、そのハ
ウジングは、液体サンプルを保有し得、液体サンプルを、変換器エレメント11
4のような変換器エレメントにより噴射し得るものである。図6Aに示す変換器
エレメント114は圧電変換器エレメントであり、キャピラリー112のパラメ
ーター周辺に形成され、ロボットアセンブリ16内のパルスジェネレイターから
受ける電気パルスを変換し得、液体をキャピラリー112のオリフィス118か
ら噴射する。圧電変換器エレメントを有するそういったジェットアセンブリは、
ドイツのMicroFab Technology,Inc.により製造されて いる。しかし、決められた、制御された液体体積の分配に適当な任意のジェット
アセンブリを、本明細書中で使用し得、それらには圧電変換器、電気的変換器、
電子制限的変換器(electrorestrictive transducer)、磁性制限的変換器(magnet
orestrictive transducer)、電気機械変換器(electromechanical transducer)、
または任意の他の適当な変換器エレメントを使用するものも含む。図示した態様
では、キャピラリー112は液体物質を受けるための液体コンジット122を有
する。所望の態様では、液体をキャピラリー中に、真空圧の作用により引き入れ
ることができ、それはオリフィス118を液体物質のソース中に沈めると、オリ
フィス118を通して液体を引き入れることができる。ジェットアセンブリ11
0の他の態様は、本発明によって、当該範囲から出発せずとも実施し得る。
ラスチックキャピラリー、または任意の他の適当なハウジングであり得、そのハ
ウジングは、液体サンプルを保有し得、液体サンプルを、変換器エレメント11
4のような変換器エレメントにより噴射し得るものである。図6Aに示す変換器
エレメント114は圧電変換器エレメントであり、キャピラリー112のパラメ
ーター周辺に形成され、ロボットアセンブリ16内のパルスジェネレイターから
受ける電気パルスを変換し得、液体をキャピラリー112のオリフィス118か
ら噴射する。圧電変換器エレメントを有するそういったジェットアセンブリは、
ドイツのMicroFab Technology,Inc.により製造されて いる。しかし、決められた、制御された液体体積の分配に適当な任意のジェット
アセンブリを、本明細書中で使用し得、それらには圧電変換器、電気的変換器、
電子制限的変換器(electrorestrictive transducer)、磁性制限的変換器(magnet
orestrictive transducer)、電気機械変換器(electromechanical transducer)、
または任意の他の適当な変換器エレメントを使用するものも含む。図示した態様
では、キャピラリー112は液体物質を受けるための液体コンジット122を有
する。所望の態様では、液体をキャピラリー中に、真空圧の作用により引き入れ
ることができ、それはオリフィス118を液体物質のソース中に沈めると、オリ
フィス118を通して液体を引き入れることができる。ジェットアセンブリ11
0の他の態様は、本発明によって、当該範囲から出発せずとも実施し得る。
【0114】 図6Bは、更に他のアセンブリを例示しており、図1に示すアセンブリ16の
ようなロボットアセンブリのロボットアームにおいて適当にp機能するアセンブ
リである。図6Bは130A-130Dを4つ同時につなげたアセンブリを示す 。図2のピンアセンブリと同様に、図6Bに示すジェットアセンブリは、液体物
質の平行分配に用いられ得る。各ジェットアセンブリ130A-130Dは他の ものとは独立して操作され得、選択した1つのジェットアセンブリから液体を選
択的に分配し得る。更に、各ジェットアセンブリ130A-130Dは独立して 制御し得、アセンブリ130A-130Dの各1点より分配される液体の体積を 選択し得る。他の修飾および変更が、本発明の範囲から出発せずとも図6Bに示
すアセンブリに行い得る。
ようなロボットアセンブリのロボットアームにおいて適当にp機能するアセンブ
リである。図6Bは130A-130Dを4つ同時につなげたアセンブリを示す 。図2のピンアセンブリと同様に、図6Bに示すジェットアセンブリは、液体物
質の平行分配に用いられ得る。各ジェットアセンブリ130A-130Dは他の ものとは独立して操作され得、選択した1つのジェットアセンブリから液体を選
択的に分配し得る。更に、各ジェットアセンブリ130A-130Dは独立して 制御し得、アセンブリ130A-130Dの各1点より分配される液体の体積を 選択し得る。他の修飾および変更が、本発明の範囲から出発せずとも図6Bに示
すアセンブリに行い得る。
【0115】 アレイは、上記考察した任意の技術により基体表面上に形成され得る。次いで
サンプルアレイをマススペクトロメトリーで分析し、アレイ中のサンプルの典型
的な組成物のスペクトルデータを回収する。上記方法により、素早く適確に分配
でき、測定対象物物質の体積を制御できるプロセスが提供されると理解される。
特に、これらのプロセスは、液体をナノリッター体積よりも小さく分配すること
ができる。これら小さい体積の析出技術により、マススペクトルによる分析に適
当なサンプルアレイウェルが作成できる。例えば、小さな体積により、蒸発速度
のようなスポット特性が再現され、室温および光のような気圧条件に応じて体積
を少なくする。
サンプルアレイをマススペクトロメトリーで分析し、アレイ中のサンプルの典型
的な組成物のスペクトルデータを回収する。上記方法により、素早く適確に分配
でき、測定対象物物質の体積を制御できるプロセスが提供されると理解される。
特に、これらのプロセスは、液体をナノリッター体積よりも小さく分配すること
ができる。これら小さい体積の析出技術により、マススペクトルによる分析に適
当なサンプルアレイウェルが作成できる。例えば、小さな体積により、蒸発速度
のようなスポット特性が再現され、室温および光のような気圧条件に応じて体積
を少なくする。
【0116】 図5に示す例に続いて、アレイは、異なるシークエンスまたは濃度のオリゴヌ
クレオチドを96ウェルマイクロタイターソースプレート20のウェルにのせる
ことにより調製され得、最初のウェルはマトリクス溶液を入れるために残してお
ける。ピットシリコンチップ基体のような基体34は、ロボットアセンブリ16
のステージ上に置くことができ、手動で並べて、一群の参照軸について、ウェル
のマトリクスを方向付け得る。データプロセッサ12上で実行する制御プログラ
ムは、ソースプレート20の最初のウェルの座標を認識し得る。ロボットアーム
24により、ピンアセンブリ38がソースプレート20中に浸され、そのため各
16のピンが1つのウェル中に浸される。各ベシクルは毛管現象により充填され
得、ホールディングチャンバーの全容積に液体が含まれる。所望により、データ
プロセッサ12上で実行するプログラムにより、圧力コントローラーに命令が与
えられ、ピンアセンブリ38の内部チャンバー58は陽バイアス圧(positive bi
as pressure)となり、毛管作用の力を部分的に相殺し、ホールディングチャンバ
ー内に引き入れられる液体体積を制限するかまたは減少する。
クレオチドを96ウェルマイクロタイターソースプレート20のウェルにのせる
ことにより調製され得、最初のウェルはマトリクス溶液を入れるために残してお
ける。ピットシリコンチップ基体のような基体34は、ロボットアセンブリ16
のステージ上に置くことができ、手動で並べて、一群の参照軸について、ウェル
のマトリクスを方向付け得る。データプロセッサ12上で実行する制御プログラ
ムは、ソースプレート20の最初のウェルの座標を認識し得る。ロボットアーム
24により、ピンアセンブリ38がソースプレート20中に浸され、そのため各
16のピンが1つのウェル中に浸される。各ベシクルは毛管現象により充填され
得、ホールディングチャンバーの全容積に液体が含まれる。所望により、データ
プロセッサ12上で実行するプログラムにより、圧力コントローラーに命令が与
えられ、ピンアセンブリ38の内部チャンバー58は陽バイアス圧(positive bi
as pressure)となり、毛管作用の力を部分的に相殺し、ホールディングチャンバ
ー内に引き入れられる液体体積を制限するかまたは減少する。
【0117】 所望により、ピンアセンブリ38は、ソースプレート20の同じ16ウェル中
に浸され、二次標的基体上にスポットし得る。このサイクルは望ましい標的基体
と同じ数だけ繰り返され得る。次に、ロボットアーム24は洗浄液にピンアセン
ブリ38を浸すことができ、次いで、ピンアセンブリをソースプレート20の1
6のウェル中に浸し、最初の一群の16スポットからの距離をオフセットした基
体標的上にスポットする。再び、これを、望ましい標的基体と同じだけ繰り返し
得る。全サイクルを繰り返し、各ベシクルから2×2アレイを作成し、8×8ア
レイのスポットを生ずる(2×2エレメント/ベシクル×16ベシクル=スポッ トしたエレメント合計64)。アレイの形成に適当な任意のプロセスを用い得る 。
に浸され、二次標的基体上にスポットし得る。このサイクルは望ましい標的基体
と同じ数だけ繰り返され得る。次に、ロボットアーム24は洗浄液にピンアセン
ブリ38を浸すことができ、次いで、ピンアセンブリをソースプレート20の1
6のウェル中に浸し、最初の一群の16スポットからの距離をオフセットした基
体標的上にスポットする。再び、これを、望ましい標的基体と同じだけ繰り返し
得る。全サイクルを繰り返し、各ベシクルから2×2アレイを作成し、8×8ア
レイのスポットを生ずる(2×2エレメント/ベシクル×16ベシクル=スポッ トしたエレメント合計64)。アレイの形成に適当な任意のプロセスを用い得る 。
【0118】 異なるシーケンスまたは濃度のオリゴヌクレオチドを3種類までの384-ウ ェルマイクロタイターソースプレートのウェルにのせる;一群の16ウェルをマ
トリクス溶液用に残しておける。2つのプレートのウェルを洗浄液で満たす。5
つのマイクロタイタープレートをロボットアセンブリ16のステージ上にのせる
ことができる。多数の標的基体を、ステージ26上に配置する所望の一群のバン
キングまたはレジストレーションピンに隣接して置き、一群の参照軸に沿って標
的基体を配置する。もしマトリクスおよびオリゴヌクレオチドを事前に混合しな
いならば、ピンアセンブリは、望ましい標的基体すべてにおける最初のスポット
マトリクス溶液に用いることができる。その後の段階では、オリゴヌクレオチド
溶液をマトリクス物質と同じパターンでスポットでき、マトリクスを再溶解でき
る。他に、サンプルアレイは、最初にウェハー上にオリゴヌクレオチド溶液を置
き、その後、マトリクス溶液を置くか、マトリクスおよびオリゴヌクレオチド溶
液を事前に混合することにより、作成し得る。
トリクス溶液用に残しておける。2つのプレートのウェルを洗浄液で満たす。5
つのマイクロタイタープレートをロボットアセンブリ16のステージ上にのせる
ことができる。多数の標的基体を、ステージ26上に配置する所望の一群のバン
キングまたはレジストレーションピンに隣接して置き、一群の参照軸に沿って標
的基体を配置する。もしマトリクスおよびオリゴヌクレオチドを事前に混合しな
いならば、ピンアセンブリは、望ましい標的基体すべてにおける最初のスポット
マトリクス溶液に用いることができる。その後の段階では、オリゴヌクレオチド
溶液をマトリクス物質と同じパターンでスポットでき、マトリクスを再溶解でき
る。他に、サンプルアレイは、最初にウェハー上にオリゴヌクレオチド溶液を置
き、その後、マトリクス溶液を置くか、マトリクスおよびオリゴヌクレオチド溶
液を事前に混合することにより、作成し得る。
【0119】 基体の表面上にサンプルアレイを置いた後、アレイを任意の様々の手段を用い
分析し得る(例えば、UV/VIS、IR、蛍光、化学ルミネセンスのような分 光技術、NMR分光法または質量分析法。例えば、各分配プロセスの後、基体に
のせたサンプルをMALDI-TOFソースプレート上にのせ、角度をつけたス クリューをマウントしたポリカーボネート支持体の一群と共に保持し得る。ある
実施では、プレートをプローブの端に移し、飛行時間マススペクトロメーターの
ソース領域中において1μm分解能、1”トラベルxyステージ(Newport)に保 持する。任意の適当な質量分析ツールを用いることができる。
分析し得る(例えば、UV/VIS、IR、蛍光、化学ルミネセンスのような分 光技術、NMR分光法または質量分析法。例えば、各分配プロセスの後、基体に
のせたサンプルをMALDI-TOFソースプレート上にのせ、角度をつけたス クリューをマウントしたポリカーボネート支持体の一群と共に保持し得る。ある
実施では、プレートをプローブの端に移し、飛行時間マススペクトロメーターの
ソース領域中において1μm分解能、1”トラベルxyステージ(Newport)に保 持する。任意の適当な質量分析ツールを用いることができる。
【0120】 本明細書に記載のアレイを用いる好ましい質量分析計形式には、マトリクスア
シストレーザー脱着(MALDI)、連続的またはパルス状のエレクトロスプレー
(ESI)および関係のある方法(例えば、イオンスプレーまたはサーモスプレー)
、ならびにマッシングクラスターインパクト(MCI)を含むがこれらに限らない
イオン化(I)技術を含む;これらのイオン源は、リニアまたは非リニアリフレク
トロン飛行時間(linear or non-linear reflectron time-of-flight)(TOF)、
シングルまたはマルチプルクワドループル、シングルまたはマルチプルマグネテ
ィックセクター、イオンサイクロトロン型フーリエ変換質量分析計(FTICR)
、イオントラップ型およびそれらの組合せを含む検出形式に適合し得る(例えば 、イオン-トラップ/飛行時間)。イオン化のために、多種のマトリクス/波長の
組合せ(MALDI)または溶媒の組合せ(ESI)を用い得る。タンパク質のサブ
アトムモル(subattomole)レベルは、例えばESI(Valaskovic, G. A. et al.,
(1996) Science 273:1199-1202)またはMALDI(Li, L. et al., (1996) J. A
m. Chem. Soc 118:1662-1663)質量分析を用い、検出される。
シストレーザー脱着(MALDI)、連続的またはパルス状のエレクトロスプレー
(ESI)および関係のある方法(例えば、イオンスプレーまたはサーモスプレー)
、ならびにマッシングクラスターインパクト(MCI)を含むがこれらに限らない
イオン化(I)技術を含む;これらのイオン源は、リニアまたは非リニアリフレク
トロン飛行時間(linear or non-linear reflectron time-of-flight)(TOF)、
シングルまたはマルチプルクワドループル、シングルまたはマルチプルマグネテ
ィックセクター、イオンサイクロトロン型フーリエ変換質量分析計(FTICR)
、イオントラップ型およびそれらの組合せを含む検出形式に適合し得る(例えば 、イオン-トラップ/飛行時間)。イオン化のために、多種のマトリクス/波長の
組合せ(MALDI)または溶媒の組合せ(ESI)を用い得る。タンパク質のサブ
アトムモル(subattomole)レベルは、例えばESI(Valaskovic, G. A. et al.,
(1996) Science 273:1199-1202)またはMALDI(Li, L. et al., (1996) J. A
m. Chem. Soc 118:1662-1663)質量分析を用い、検出される。
【0121】 従って、本明細書中で記載されるプロセスでは、完全な非接触、高圧スプレー
または部分的接触、低圧小滴形成モードを用いることができると理解される。後
者では、小滴と、基体34のウェルまたは親水性平坦表面の壁との間で接触が生
じるのみである。いずれの実施要件においても、ニードルチップと表面との間で
全く接触はない。
または部分的接触、低圧小滴形成モードを用いることができると理解される。後
者では、小滴と、基体34のウェルまたは親水性平坦表面の壁との間で接触が生
じるのみである。いずれの実施要件においても、ニードルチップと表面との間で
全く接触はない。
【0122】 典型的な態様 ある好ましい態様では、プロモーター配列をコードする二本鎖核酸配列が、天
然源から単離されるか(例えば、細菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物ま たは真核生物)、または合成配列とアセンブルする。コーディング鎖の3'末端の
少なくとも5ヌクレオチドの一本鎖領域が、当業者に既知の標準的な方法に使用
される(例えば、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York参照)。この一本鎖領域は、シーケ ンスされる核酸領域または2つの核酸分子間にあるシーケンス(例えば、制限エ ンドヌクレアーゼ部位)に相補的となるように設計される。
然源から単離されるか(例えば、細菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物ま たは真核生物)、または合成配列とアセンブルする。コーディング鎖の3'末端の
少なくとも5ヌクレオチドの一本鎖領域が、当業者に既知の標準的な方法に使用
される(例えば、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York参照)。この一本鎖領域は、シーケ ンスされる核酸領域または2つの核酸分子間にあるシーケンス(例えば、制限エ ンドヌクレアーゼ部位)に相補的となるように設計される。
【0123】 少なくとも部分的に一本鎖3'末端を含む、シーケンスされる核酸は、本明細 書中に記載する条件、好ましくは、高緊縮条件により、ハイブリダイズし、その
ため、5つの連続的マッチング塩基対が形成され、プロモーター含有DNAの相
補的配列が当業者に知られている。シーケンスされる核酸は、二本鎖であるか、
または好ましくは一本鎖である。2つの核酸分子のハイブリダイゼーションは、
隣接する核酸分子のジャンクションにおけるハイブリッド中に1またはそれ以上
の“ニック”を導入する。コーディングまたは非コーディング鎖、好ましくはコ
ーディング鎖中のニックは、転写開始前に適当な核酸リガーゼを添加することに
より連結される。核酸の連結方法は、当業者に既知であり(例えば、Sambrook et
al., (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory P
ress, New York)、DNAおよびRNAリガーゼは商業的に利用可能である(例え
ば、Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。
ため、5つの連続的マッチング塩基対が形成され、プロモーター含有DNAの相
補的配列が当業者に知られている。シーケンスされる核酸は、二本鎖であるか、
または好ましくは一本鎖である。2つの核酸分子のハイブリダイゼーションは、
隣接する核酸分子のジャンクションにおけるハイブリッド中に1またはそれ以上
の“ニック”を導入する。コーディングまたは非コーディング鎖、好ましくはコ
ーディング鎖中のニックは、転写開始前に適当な核酸リガーゼを添加することに
より連結される。核酸の連結方法は、当業者に既知であり(例えば、Sambrook et
al., (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory P
ress, New York)、DNAおよびRNAリガーゼは商業的に利用可能である(例え
ば、Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。
【0124】 転写は、リボヌクレオシド三リン酸の存在中、本明細書および他で記載の条件
下、適当なRNAポリメラーゼの添加によりプロモーターから開始される(例え ば、In RNA Polymerase and the Regulation of Transcription, Rezinkoff et
al., eds, Elsevier, NY)。好ましい実施態様では、選択した塩基特異的チェー ンターミネイティング3'-デオキシリボヌクレオシド三リン酸および転写混合物
には、RNA産物の二次構造を少なくするイノシン5'-三リン酸、または、4- チオUTP、5-ブロモUTPまたは5'-ヨードCTPといったRNAポリメラ ーゼ酵素のターンオーバーを促進する修飾リボヌクレオシド三リン酸が含まれ、
それによって、分析に利用可能なRNA転写産物の量が増加する。
下、適当なRNAポリメラーゼの添加によりプロモーターから開始される(例え ば、In RNA Polymerase and the Regulation of Transcription, Rezinkoff et
al., eds, Elsevier, NY)。好ましい実施態様では、選択した塩基特異的チェー ンターミネイティング3'-デオキシリボヌクレオシド三リン酸および転写混合物
には、RNA産物の二次構造を少なくするイノシン5'-三リン酸、または、4- チオUTP、5-ブロモUTPまたは5'-ヨードCTPといったRNAポリメラ ーゼ酵素のターンオーバーを促進する修飾リボヌクレオシド三リン酸が含まれ、
それによって、分析に利用可能なRNA転写産物の量が増加する。
【0125】 好ましい態様では、核酸プロモーター含有プローブを、アミノ機能を有する支
持体の機能化により、共有結合的にシリカ支持体に固定化する(例えば、3-アミ
ノプロピル-トリエトキシシランのような試薬を伴う支持体の誘導により(Aldric
h Chemical Co., Milwaukee, WI);図7参照)。他の機能化オキシシランまたはオ
ルトシリケートを使用し得、商業的に利用可能である(例えば、Gelest, Inc., T
ullytown, PAから)。例えば、3-メルカプトプロピルトリエトキシシランを用い
、チオール基を有するシリコン表面を機能化できる。次いで、アミノ機能化シリ
カを、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)
(Pierce, Rockford, IL)のようなヘテロ二機能性試薬と反応し得る。使用し得る
他のホモ-およびヘテロ-二機能性試薬は、例えば、Pierceから利用可能である。
最終的に、チオール基で機能化される核酸(例えば、5'末端で)は、核酸分子の チオール機能を支持体のヨードアセチル機能と反応させることにより、誘導化さ
れたシリカ支持体に共有結合する。
持体の機能化により、共有結合的にシリカ支持体に固定化する(例えば、3-アミ
ノプロピル-トリエトキシシランのような試薬を伴う支持体の誘導により(Aldric
h Chemical Co., Milwaukee, WI);図7参照)。他の機能化オキシシランまたはオ
ルトシリケートを使用し得、商業的に利用可能である(例えば、Gelest, Inc., T
ullytown, PAから)。例えば、3-メルカプトプロピルトリエトキシシランを用い
、チオール基を有するシリコン表面を機能化できる。次いで、アミノ機能化シリ
カを、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)
(Pierce, Rockford, IL)のようなヘテロ二機能性試薬と反応し得る。使用し得る
他のホモ-およびヘテロ-二機能性試薬は、例えば、Pierceから利用可能である。
最終的に、チオール基で機能化される核酸(例えば、5'末端で)は、核酸分子の チオール機能を支持体のヨードアセチル機能と反応させることにより、誘導化さ
れたシリカ支持体に共有結合する。
【0126】 ある態様では、核酸は、架橋剤と反応し、架橋/核酸連結を形成し、次いでそ
れを、機能化支持体と反応すると、固定化核酸が生じる。他に、架橋は、核酸お
よび機能化固体支持体と1点で結合し、架橋剤と核酸および固体支持体との並発
反応を実質的に提供する。この態様では、ヘテロ二機能性架橋剤、即ち、核酸お
よび機能化固体支持体のそれぞれと選択的に反応し得る2種の反応的機能を有す
る架橋剤の使用を通常必要とする。
れを、機能化支持体と反応すると、固定化核酸が生じる。他に、架橋は、核酸お
よび機能化固体支持体と1点で結合し、架橋剤と核酸および固体支持体との並発
反応を実質的に提供する。この態様では、ヘテロ二機能性架橋剤、即ち、核酸お
よび機能化固体支持体のそれぞれと選択的に反応し得る2種の反応的機能を有す
る架橋剤の使用を通常必要とする。
【0127】 本明細書中に記載の下記の方法では、不溶性支持体上で固定化された核酸の、
空間的アドレス化アレイは、RNAポリメラーゼを用いる核酸のシーケンスに適
当であり、調製され得る。例えば、その方法が使用され、アレイ中に配列したピ
ン上に固定化した様々な核酸のアレイが提供される。他の態様では、不溶性支持
体上の光開裂保護基が、選択的に開裂し(例えば、ホトリトグラフィーにより)、
核酸の固定化を活性化する表面部分を提供する。例えば、チオール基を生ずる3
-メルカプトプロピルトリエトキシシランでの処理により修飾したシリコン表面 は、光開裂保護基(例えば、光開裂保護基、例えば、PCT公開番号WO92/10092、ま
たはMcCray et al., (1989) Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18:239-270参
照)で保護され得、選択された表面部分の照射により、例えばホトリトグラフィ ーマスクを用い選択的に非保護となり得る。次いで、チオール反応性基を含むよ
うに修飾された核酸プロモーター含有プローブを支持体に直接結合し得るか、ま
たは他に、チオール反応性架橋剤をチオール修飾支持体と反応させ、その後(ま たは実質的には同時に)、核酸と反応すると、固定化核酸が生ずる。核酸塩基ま たは配列を、一旦、本明細書に記載の方法に従い支持体に固定化すると、既知の
方法により更に修飾し得る。例えば、核酸分子は、コンビナトリアル技術を含む
通常の技術に従う固体相核酸合成の実施により伸張し得る。
空間的アドレス化アレイは、RNAポリメラーゼを用いる核酸のシーケンスに適
当であり、調製され得る。例えば、その方法が使用され、アレイ中に配列したピ
ン上に固定化した様々な核酸のアレイが提供される。他の態様では、不溶性支持
体上の光開裂保護基が、選択的に開裂し(例えば、ホトリトグラフィーにより)、
核酸の固定化を活性化する表面部分を提供する。例えば、チオール基を生ずる3
-メルカプトプロピルトリエトキシシランでの処理により修飾したシリコン表面 は、光開裂保護基(例えば、光開裂保護基、例えば、PCT公開番号WO92/10092、ま
たはMcCray et al., (1989) Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18:239-270参
照)で保護され得、選択された表面部分の照射により、例えばホトリトグラフィ ーマスクを用い選択的に非保護となり得る。次いで、チオール反応性基を含むよ
うに修飾された核酸プロモーター含有プローブを支持体に直接結合し得るか、ま
たは他に、チオール反応性架橋剤をチオール修飾支持体と反応させ、その後(ま たは実質的には同時に)、核酸と反応すると、固定化核酸が生ずる。核酸塩基ま たは配列を、一旦、本明細書に記載の方法に従い支持体に固定化すると、既知の
方法により更に修飾し得る。例えば、核酸分子は、コンビナトリアル技術を含む
通常の技術に従う固体相核酸合成の実施により伸張し得る。
【0128】 好ましい核酸は、不溶性支持体の表面と少なくとも1つの硫黄原子を介して共
有結合する。即ち、核酸は、少なくとも1つの硫黄原子を含むリンカー部分を介
してその表面と共有結合する。その共有結合した核酸は、本明細書に記載の方法
により容易に製造される。好ましい態様では、共有結合した核酸は、不溶性支持
体の表面上の存在であり得、少なくとも密度約20fmol/mm2、更に好ま しくは少なくとも約75fmol/mm2、更に好ましくは少なくとも約fmo l/mm2、より更に好ましくは少なくとも約100fmol/mm2、および最
も好ましくは少なくとも約150fmol/mm2である。
有結合する。即ち、核酸は、少なくとも1つの硫黄原子を含むリンカー部分を介
してその表面と共有結合する。その共有結合した核酸は、本明細書に記載の方法
により容易に製造される。好ましい態様では、共有結合した核酸は、不溶性支持
体の表面上の存在であり得、少なくとも密度約20fmol/mm2、更に好ま しくは少なくとも約75fmol/mm2、更に好ましくは少なくとも約fmo l/mm2、より更に好ましくは少なくとも約100fmol/mm2、および最
も好ましくは少なくとも約150fmol/mm2である。
【0129】 応用 本明細書中に記載の核酸をシーケンスする方法が種々の最終用途応用に使用さ
れる。例えば、その方法は、転位、塩基転換、欠損、挿入などの変異を同定する
診断の応用に使用される。その方法はまた使用され、多くの遺伝的疾患診断の助
力となり、遺伝的スクリーニング、または遺伝形質または組織もしくは器官適合
性の決定に使用され得る。
れる。例えば、その方法は、転位、塩基転換、欠損、挿入などの変異を同定する
診断の応用に使用される。その方法はまた使用され、多くの遺伝的疾患診断の助
力となり、遺伝的スクリーニング、または遺伝形質または組織もしくは器官適合
性の決定に使用され得る。
【0130】 シーケンスする方法は診断の応用として使用され、既知標的核酸中に遺伝的変
化の存在を検査する。例えば、標的核酸領域は、PCRまたは当業者に既知の他
の増幅方法のような、標準的方法を用い増幅し得る(例えば、Sambrook et al.,
(1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York参照)。増幅核酸は変性され、シーケンスされる鎖(非コーディング鎖は
、二本鎖分子として単離されるか、使用され得る。
化の存在を検査する。例えば、標的核酸領域は、PCRまたは当業者に既知の他
の増幅方法のような、標準的方法を用い増幅し得る(例えば、Sambrook et al.,
(1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York参照)。増幅核酸は変性され、シーケンスされる鎖(非コーディング鎖は
、二本鎖分子として単離されるか、使用され得る。
【0131】 既知標的核中の遺伝的変化の存在は、診断の応用において、生体サンプルの標
的核酸を単離(または増幅)し、プロモーター含有鋳型を生ずるプロモーター含有
捕捉プローブに標的をハイブリダイズすることにより、決定される。ネストした
一群のRNA転写産物が生じ、標的核酸の存在が決定され、野生型配列と比較し
て遺伝的変化が標的核酸中に生じているかどうか決定する。遺伝的変化の存在は
、当分野に既知の他の手段によりRNA転写産物から決定され得る(例えば、米 国特許番号5,605,798および国際PCT出願番号WO98/20019
)。
的核酸を単離(または増幅)し、プロモーター含有鋳型を生ずるプロモーター含有
捕捉プローブに標的をハイブリダイズすることにより、決定される。ネストした
一群のRNA転写産物が生じ、標的核酸の存在が決定され、野生型配列と比較し
て遺伝的変化が標的核酸中に生じているかどうか決定する。遺伝的変化の存在は
、当分野に既知の他の手段によりRNA転写産物から決定され得る(例えば、米 国特許番号5,605,798および国際PCT出願番号WO98/20019
)。
【0132】 転写ターミネーター配列を同定する方法 これまで知られていない転写ターミネーターおよびアテニュエーター配列を同
定する方法もまた提供する。転写ターミネーター配列は、RNA伸張の配列特異
的停止に応答し、種々の生物由来のターミネーター配列が報告されている。例え
ば、細菌性rho-独立性ターミネーター配列には2つの逆位反復が数塩基対離 れてあり、その後に5-10ntのポリTストレッチがある。これら配列を介す る転写において、生じたmRNA転写物により、RNAヘパリンステム-ループ 二次構造が、RNAポリメラーゼ分子後に形成され、RNAポリメラーゼのポー
ジング(pausign)を増加し、および/またはRNAポリメラーゼ-DNA鋳型相互
作用を不安定化し、DNAポリTストレッチ内の転写産物が停止する(例えば、W
ilson and von Hippel 19;Reynolds et al., (1992a) J. Mol. Biol. 224:53-63
; Reynolds et al., (1992b) J. Mol. Biol. 224:31-51; Telesnitsky et al.,(
1989) Biochemistry 28:5210-5218; d' Aubenton Carafa et al., (1990) J. Mo
l. Biol. 216: 835-858参照)。
定する方法もまた提供する。転写ターミネーター配列は、RNA伸張の配列特異
的停止に応答し、種々の生物由来のターミネーター配列が報告されている。例え
ば、細菌性rho-独立性ターミネーター配列には2つの逆位反復が数塩基対離 れてあり、その後に5-10ntのポリTストレッチがある。これら配列を介す る転写において、生じたmRNA転写物により、RNAヘパリンステム-ループ 二次構造が、RNAポリメラーゼ分子後に形成され、RNAポリメラーゼのポー
ジング(pausign)を増加し、および/またはRNAポリメラーゼ-DNA鋳型相互
作用を不安定化し、DNAポリTストレッチ内の転写産物が停止する(例えば、W
ilson and von Hippel 19;Reynolds et al., (1992a) J. Mol. Biol. 224:53-63
; Reynolds et al., (1992b) J. Mol. Biol. 224:31-51; Telesnitsky et al.,(
1989) Biochemistry 28:5210-5218; d' Aubenton Carafa et al., (1990) J. Mo
l. Biol. 216: 835-858参照)。
【0133】 細菌性rho-依存ターミネーターは、典型な逆位反復ステム-ループ構造を欠
失しており、更に、rhoタンパク質のような付加的因子を必要とし、転写を停
止する(例えば、Schmidt et al., (1984) J. Mol. Biol. 259:15000-15002参照)
。Rho-依存終結は、細菌種において、転写および翻訳の分離により熟成前終 結を生ずると信じられている。
失しており、更に、rhoタンパク質のような付加的因子を必要とし、転写を停
止する(例えば、Schmidt et al., (1984) J. Mol. Biol. 259:15000-15002参照)
。Rho-依存終結は、細菌種において、転写および翻訳の分離により熟成前終 結を生ずると信じられている。
【0134】 本明細書に記載の標準的転写条件を修飾することにより、転写ターミネーター
、例えば、rho-依存性およびrho-独立性ターミネーターが、質量分析法を
用いて同定され得る。その方法の実施では、シーケンスされる一本鎖領域の3' 末端核酸を、コーディング鎖、プロモーター含有核酸プローブの3'末端の相補 的配列にハイブリダイズさせる。好ましい態様では、プロモーター含有核酸を、
5'末端の非コーディング鎖または3'末端のコーディング鎖を介して、固体支持
体に共有結合し、更に好ましくは高密度でアミノシラン処理固体支持体に5'-ま
たは3'-チオール酸化DNA連結する。連結は、リンカー基の存在下または非存
在下にあり、好ましくはアレイ形に並べられる。
、例えば、rho-依存性およびrho-独立性ターミネーターが、質量分析法を
用いて同定され得る。その方法の実施では、シーケンスされる一本鎖領域の3' 末端核酸を、コーディング鎖、プロモーター含有核酸プローブの3'末端の相補 的配列にハイブリダイズさせる。好ましい態様では、プロモーター含有核酸を、
5'末端の非コーディング鎖または3'末端のコーディング鎖を介して、固体支持
体に共有結合し、更に好ましくは高密度でアミノシラン処理固体支持体に5'-ま
たは3'-チオール酸化DNA連結する。連結は、リンカー基の存在下または非存
在下にあり、好ましくはアレイ形に並べられる。
【0135】 転写は、修飾RNA三リン酸類似体存在下または非存在下で開始し、4-チオ UTP、5-ブロモUTPまたは5'-ヨードCTPのようなその類似体により、 ターミネーター配列におけるRNAポリメラーゼ転写の効率が増加する。特異的
に終結するRNA転写産物の質量が、マススペクトロメトリーにより検出され、
その場合、観察されるRNAの質量により転写のターミネーター依存停止の位置
が示される。幾つかの明確な遺伝的位置由来の転写終結部位直前の配列の並びを
比較することにより、今まで知られていないターミネーター配列が別のRNAポ
リメラーゼで同定され得る。
に終結するRNA転写産物の質量が、マススペクトロメトリーにより検出され、
その場合、観察されるRNAの質量により転写のターミネーター依存停止の位置
が示される。幾つかの明確な遺伝的位置由来の転写終結部位直前の配列の並びを
比較することにより、今まで知られていないターミネーター配列が別のRNAポ
リメラーゼで同定され得る。
【0136】 ある態様では、シーケンスされる核酸のハイブリダイズから生ずる1またはそ
れ以上の鎖中のニックが、転写開始前に適当な核酸リガーゼを添加することによ
り連結される(即ち、DNAまたはRNAリガーゼを加える)。
れ以上の鎖中のニックが、転写開始前に適当な核酸リガーゼを添加することによ
り連結される(即ち、DNAまたはRNAリガーゼを加える)。
【0137】 本発明を以下の実施例により更に説明する。その部分は単に詳しく説明するこ
とを目的とし、これらに制限するとして構成されるものではない。本出願を通し
て引用した参考文献(参考文献、発行された特許、公開された特許出願、および 仮出願特許出願を含む)のすべての内容全体を引用により特別にこの文書に加え る。
とを目的とし、これらに制限するとして構成されるものではない。本出願を通し
て引用した参考文献(参考文献、発行された特許、公開された特許出願、および 仮出願特許出願を含む)のすべての内容全体を引用により特別にこの文書に加え る。
【0138】 実施例1 シリコンウェハーに対する核酸の高密度結合 物質および方法 特記しない限り、すべての試薬は、Aldrich Chemical, Milwaukee, WIから得 た。
【0139】 シリコン表面の調製 シリコンウェハーをエタノールで洗浄し、ブンセンバーナーで焼き、トルエン
中の25%(体積)3-アミノプロピルトリエトキシシランの無水溶液に3時間浸 した。次いで、シラン溶液を除去し、ウェハーをトルエンで3回、ジメチルスル
ホキシド(DMSO)で3回洗浄した。次いで、ウェハーを、無水DMSO中のN
-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)(Pierce
Chemical, Rockford, IL)の10mM無水溶液中にインキュベーションした。反 応後、SIAB溶液を除去し、ウェハーを3回DMSOで洗浄した。
中の25%(体積)3-アミノプロピルトリエトキシシランの無水溶液に3時間浸 した。次いで、シラン溶液を除去し、ウェハーをトルエンで3回、ジメチルスル
ホキシド(DMSO)で3回洗浄した。次いで、ウェハーを、無水DMSO中のN
-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)(Pierce
Chemical, Rockford, IL)の10mM無水溶液中にインキュベーションした。反 応後、SIAB溶液を除去し、ウェハーを3回DMSOで洗浄した。
【0140】 SIABおよびアミノ基の濃縮がウェハーの固体支持体上である限りモニター
できないため、反応は溶液中で行い最適反応時間を決定した。薄層クロマトグラ
フィー(TLC)(254nm蛍光インジケーターであるガラスパックされたシリ カプレート)(Baker, Phillipsburg, NF)を、95:5 クロロホルム:メタノー ル(Baker, Phillipsburg, NJ)を用い行った。それは、2つの出発物質を分離す ることができる。長波長紫外線(302nm)の下、SIAB出発物質を視覚化できた ;3-アミノプロピルトリエトキシシランは紫外線の下では作用しないため、ニ ンヒドリン溶液をスプレーし、一級アミンと反応させると、加熱により紫のスポ
ットが表われた。クロロホルム/DMSO中で、3-アミノプロピルトリエトキ シシランと比べて僅かにモル過剰であるSIABを用いると微小規模の反応が生
じ、その反応を上記TLCでモニターした。
できないため、反応は溶液中で行い最適反応時間を決定した。薄層クロマトグラ
フィー(TLC)(254nm蛍光インジケーターであるガラスパックされたシリ カプレート)(Baker, Phillipsburg, NF)を、95:5 クロロホルム:メタノー ル(Baker, Phillipsburg, NJ)を用い行った。それは、2つの出発物質を分離す ることができる。長波長紫外線(302nm)の下、SIAB出発物質を視覚化できた ;3-アミノプロピルトリエトキシシランは紫外線の下では作用しないため、ニ ンヒドリン溶液をスプレーし、一級アミンと反応させると、加熱により紫のスポ
ットが表われた。クロロホルム/DMSO中で、3-アミノプロピルトリエトキ シシランと比べて僅かにモル過剰であるSIABを用いると微小規模の反応が生
じ、その反応を上記TLCでモニターした。
【0141】 オリゴヌクレオチド修飾 3'-または5'-ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド(Operon Techno
logies, Alameda, CA or Oligo Etc., Wilsonville, OR)のジスルフィドの還元 を逆相FPLC(Pharmacia, Piscataway, NJ)を用いモニターした;ジスルフィ ドの切断に際して、オリゴヌクレオチドのリテンションタイムのシフトが見られ
た。様々な還元方法が調査され、最適な条件が決定された。ある場合では、ジス
ルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド(31.5nmol, 0.5mM)をジチオスレイト ール(DTT)(Pierce Chemical, Rockford, IL)(6.2mmol, 100mM)と共に、pH 8.0および37℃でインキュベーションした。実質的な切断反応の完了と共に
、遊離チオール含有オリゴデオキシヌクレオチドを、Chromaspin-1 0カラム(Clontech, Palo Alto, CA)を用い単離した。DTTがその後の反応に 拮抗するからである。他に、トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCE P)(Pierce Chemical, Rockford, IL)が使用され、ジスルフィドを切断した。ジ
スルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド(7.2nmol, 0.36mM)をTCEPと共 に、pH4.5緩衝液中37℃でインキュベーションした。反応後に産物を単離
する必要はなかった。TCEPはヨードアセトアミド機能と拮抗的に反応しない
ためである。種々のTCEP濃度を切断反応に使用し、結合反応に最適な条件を
決定した。
logies, Alameda, CA or Oligo Etc., Wilsonville, OR)のジスルフィドの還元 を逆相FPLC(Pharmacia, Piscataway, NJ)を用いモニターした;ジスルフィ ドの切断に際して、オリゴヌクレオチドのリテンションタイムのシフトが見られ
た。様々な還元方法が調査され、最適な条件が決定された。ある場合では、ジス
ルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド(31.5nmol, 0.5mM)をジチオスレイト ール(DTT)(Pierce Chemical, Rockford, IL)(6.2mmol, 100mM)と共に、pH 8.0および37℃でインキュベーションした。実質的な切断反応の完了と共に
、遊離チオール含有オリゴデオキシヌクレオチドを、Chromaspin-1 0カラム(Clontech, Palo Alto, CA)を用い単離した。DTTがその後の反応に 拮抗するからである。他に、トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCE P)(Pierce Chemical, Rockford, IL)が使用され、ジスルフィドを切断した。ジ
スルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド(7.2nmol, 0.36mM)をTCEPと共 に、pH4.5緩衝液中37℃でインキュベーションした。反応後に産物を単離
する必要はなかった。TCEPはヨードアセトアミド機能と拮抗的に反応しない
ためである。種々のTCEP濃度を切断反応に使用し、結合反応に最適な条件を
決定した。
【0142】 プローブの結合 上記のとおりヨードアセトアミドを含むように誘導された各ウェハーに、10
0mMリン酸緩衝液、pH8中の遊離チオール含有オリゴデオキシヌクレオチド
の10mM水溶液を加えた;反応は、最低5時間、室温、湿度100%中で行っ
た。反応後、オリゴデオキシヌクレオチド溶液を除去し、ウェハーを、50%ホ
ルムアミド(USB, Cleveland, OH)を含む5×SSC緩衝液(75mM クエン酸ナトリ
ウム、750mM 塩化ナトリウム、pH7)で2回、65℃でそれぞれ1時間洗浄した。
0mMリン酸緩衝液、pH8中の遊離チオール含有オリゴデオキシヌクレオチド
の10mM水溶液を加えた;反応は、最低5時間、室温、湿度100%中で行っ
た。反応後、オリゴデオキシヌクレオチド溶液を除去し、ウェハーを、50%ホ
ルムアミド(USB, Cleveland, OH)を含む5×SSC緩衝液(75mM クエン酸ナトリ
ウム、750mM 塩化ナトリウム、pH7)で2回、65℃でそれぞれ1時間洗浄した。
【0143】 プローブ密度の放射化学的測定 表面に共有結合するDNA量またはハイブリダイズする相補的配列の量を測定
するため、放射標識プローブを用いた。5'-ジスルフィド含有オリゴデオキシヌ
クレオチドを固定化する場合、3'末端を、ターミナルトランスフェラーゼ酵素 および放射標識ジデオキシヌクレオシド三リン酸を用い放射標識した;標準的反
応では、5'-ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド15pmol(0. 6μM)を、(α-32P)ジデオキシアデノシン-5'三リン酸(ddATP)50μC
i(16.5pmol, 0.66μM)(Amersham, Arlington Height, IL)と共に、0.2mM
2-メルカプトエタノール存在下、インキュベーションした。40ユニットのタ ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素(USB, Cleveland, OH)
の添加後、反応は1時間37℃で行った。この後、この反応は、バイアルを75
℃の水浴に10分間浸すことにより停止し、その産物を、Chromaspin
-10カラム(Clontech, Palo Alto, CA)を用い単離した。同様に、5'-ジスルフ
ィド含有オリゴデオキシヌクレオチドを35Sで放射標識した。
するため、放射標識プローブを用いた。5'-ジスルフィド含有オリゴデオキシヌ
クレオチドを固定化する場合、3'末端を、ターミナルトランスフェラーゼ酵素 および放射標識ジデオキシヌクレオシド三リン酸を用い放射標識した;標準的反
応では、5'-ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド15pmol(0. 6μM)を、(α-32P)ジデオキシアデノシン-5'三リン酸(ddATP)50μC
i(16.5pmol, 0.66μM)(Amersham, Arlington Height, IL)と共に、0.2mM
2-メルカプトエタノール存在下、インキュベーションした。40ユニットのタ ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素(USB, Cleveland, OH)
の添加後、反応は1時間37℃で行った。この後、この反応は、バイアルを75
℃の水浴に10分間浸すことにより停止し、その産物を、Chromaspin
-10カラム(Clontech, Palo Alto, CA)を用い単離した。同様に、5'-ジスルフ
ィド含有オリゴデオキシヌクレオチドを35Sで放射標識した。
【0144】 3'-ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチドを固定化する場合、5'末 端を、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび放射標識したヌクレオシド三リン酸
を用い放射標識した。例えば、3'-ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチ
ド15pmol(0.6μM)を、(λ32P)アデノシン-5'三リン酸(ATP)(Amersha
m, Arlington Height, IL)50μCi(16.5pmol, 0.66μM)と共に、50mM T
ris-HCl, pH7.6,10mM MgCl2,10mM 2-メルカプトエ タノールの存在下、インキュベーションした。40ユニットのT4ポリヌクレオ
チドキナーゼの添加後、反応は1時間37℃で行った。反応は、バイアルを75
℃の水浴に10分間浸すことにより停止し、次いで、その産物を、Chroma
spin-10カラム(Clontech, Palo Alto, CA)を用い単離した。
を用い放射標識した。例えば、3'-ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチ
ド15pmol(0.6μM)を、(λ32P)アデノシン-5'三リン酸(ATP)(Amersha
m, Arlington Height, IL)50μCi(16.5pmol, 0.66μM)と共に、50mM T
ris-HCl, pH7.6,10mM MgCl2,10mM 2-メルカプトエ タノールの存在下、インキュベーションした。40ユニットのT4ポリヌクレオ
チドキナーゼの添加後、反応は1時間37℃で行った。反応は、バイアルを75
℃の水浴に10分間浸すことにより停止し、次いで、その産物を、Chroma
spin-10カラム(Clontech, Palo Alto, CA)を用い単離した。
【0145】 共有結合的に固定化したプローブの密度を測定するために、選択のジスルフィ
ド含有オリゴデオキシヌクレオチドを、上記で放射標識したのよりも同じ種の痕
跡量に加えた。ジスルフィドを切断し、プローブをヨードアセトアミド機能化ウ
ェハーに固定化し、ウェハーを洗浄し、次いで、ホスホイメージャースクリーン
(phosphorimager screen)(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)に照射した。そ
れぞれのオリゴデオキシヌクレオチドを用いる場合、オリゴデオキシヌクレオチ
ドのモル量が判っている参照スポットをポリスチレン上につくる;これら参照ス
ポットをホスホイメージャースクリーンにウェルとして照射した。スクリーンの
スキャンニングにおいて、各チップに結合したオリゴデオキシヌクレオチドの量
(モル)を、参照の特異活性とカウントを比較することにより測定した。
ド含有オリゴデオキシヌクレオチドを、上記で放射標識したのよりも同じ種の痕
跡量に加えた。ジスルフィドを切断し、プローブをヨードアセトアミド機能化ウ
ェハーに固定化し、ウェハーを洗浄し、次いで、ホスホイメージャースクリーン
(phosphorimager screen)(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)に照射した。そ
れぞれのオリゴデオキシヌクレオチドを用いる場合、オリゴデオキシヌクレオチ
ドのモル量が判っている参照スポットをポリスチレン上につくる;これら参照ス
ポットをホスホイメージャースクリーンにウェルとして照射した。スクリーンの
スキャンニングにおいて、各チップに結合したオリゴデオキシヌクレオチドの量
(モル)を、参照の特異活性とカウントを比較することにより測定した。
【0146】 ハイブリダイゼーションと効率 固定化プローブで機能化したウェハーに、1M NaClおよびTE緩衝液中 の相補的配列(10μM)の溶液を加えた。ウェハーおよび溶液を75℃に加熱し、 室温に3時間かけて冷却した。この後、溶液を除去し、ウェハーを2回TE緩衝
液で洗浄した。
液で洗浄した。
【0147】 ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの量を測定するため、プローブの固定
化を上記の通り最初に行った。ただし、プローブは32P以外の35Sで標識した。
固定化したプローブの密度をホスホイメージャーで測定した。次に、同じウェハ
ーを、TE緩衝液、1M NaCl、および32Pで放射標識したその相補鎖(10μ
M)中でインキュベーションした。ハイブリダイゼーションは以前から述べられて
いる通り行った。洗浄し、非特異的な結合を除去した後、ウェハーおよび参照を
、スクリーンとウェハーとの間に銅ホイル片を入れたホスホイメージャースクリ
ーンに照射した。銅ホイルは35Sからのシグナルを遮断し、その一方、32Pシグ
ナルを自由に通過させる。次いで、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのモ
ル量を測定し、ハイブリダイゼーション可能な共有結合的固定化プローブのパー
セントを示した。
化を上記の通り最初に行った。ただし、プローブは32P以外の35Sで標識した。
固定化したプローブの密度をホスホイメージャーで測定した。次に、同じウェハ
ーを、TE緩衝液、1M NaCl、および32Pで放射標識したその相補鎖(10μ
M)中でインキュベーションした。ハイブリダイゼーションは以前から述べられて
いる通り行った。洗浄し、非特異的な結合を除去した後、ウェハーおよび参照を
、スクリーンとウェハーとの間に銅ホイル片を入れたホスホイメージャースクリ
ーンに照射した。銅ホイルは35Sからのシグナルを遮断し、その一方、32Pシグ
ナルを自由に通過させる。次いで、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのモ
ル量を測定し、ハイブリダイゼーション可能な共有結合的固定化プローブのパー
セントを示した。
【0148】 MALDI-TOF質量分析 上記の通り、ウェハー含有非放射標識固定化オリゴデオキシヌクレオチド(名 前:TCUC;配列:GAATTCGAGCTCGGTACCCGG;分子量:6455Da;配列番号1)を合成し
、相補鎖(名前:MJM6;配列:CCGGGTACCGAGCTCGAATTC;分子量:6415Da;配列番号
2)をハイブリダイズした。ウェハーを、陽イオン交換のため50mM クエン酸
アンモニウム緩衝液で洗浄し、DNAバックボーン上のナトリウムイオンおよび
カリウムイオンを除去した(Pieles, U. et al., (1993) Nucl. Acids Res. 21:3
191-3196)。3-ヒドロキシピコリン酸のマトリクス溶液(3-HPA、50%アセトニト
リル、10%クエン酸アンモニウム中の0.7M;Wu, K.J., et al., (1993) Rapid Com
mun. Mass Spectrom. 7:142-146)をウェハー上にスポットし、室温で乾燥した。
ウェハーを、Finnigan MAT(Bremen, Germany)Vision 200 0 reflectron TOF質量分析計のサンプルプローブに、導電テープ
(conducting tape)を用い、直接結合した。リフレクトロン(reflectron)は5k eVイオン源および20keVポストアクセラレーションを有した;窒素原子レ
ーザーを用いた;そして、すべてのスペクトルを陽イオンモードで測定した。
、相補鎖(名前:MJM6;配列:CCGGGTACCGAGCTCGAATTC;分子量:6415Da;配列番号
2)をハイブリダイズした。ウェハーを、陽イオン交換のため50mM クエン酸
アンモニウム緩衝液で洗浄し、DNAバックボーン上のナトリウムイオンおよび
カリウムイオンを除去した(Pieles, U. et al., (1993) Nucl. Acids Res. 21:3
191-3196)。3-ヒドロキシピコリン酸のマトリクス溶液(3-HPA、50%アセトニト
リル、10%クエン酸アンモニウム中の0.7M;Wu, K.J., et al., (1993) Rapid Com
mun. Mass Spectrom. 7:142-146)をウェハー上にスポットし、室温で乾燥した。
ウェハーを、Finnigan MAT(Bremen, Germany)Vision 200 0 reflectron TOF質量分析計のサンプルプローブに、導電テープ
(conducting tape)を用い、直接結合した。リフレクトロン(reflectron)は5k eVイオン源および20keVポストアクセラレーションを有した;窒素原子レ
ーザーを用いた;そして、すべてのスペクトルを陽イオンモードで測定した。
【0149】 表面化学 標準的な二酸化シリコン修飾化学を用い、シリコンウェハーを3-アミノプロ ピルトリエトキシシランと反応させると、表面上に一級アミノ基の均一な層が生
ずる。次いで、図7に示したように、表面をヘテロ二機能性架橋剤にさらすと、
表面上にヨードアセトアミド基を生ずる。TLCを用い、溶液におけるこの反応
の所望の反応時間を測定することができる。SIAB架橋剤は、長波長の紫外線
(302nm)の下、視覚化され、Rf値0.58のスポットがみられた。3-アミノプ ロピルトリエトキシシランは紫外線の下では作用しないため、ニンヒドリンを用
いると、ベースラインに一級アミンの存在を示す紫のスポットがみられた。3- アミノプロピルトリエトキシシランと比べて僅かにモル過剰であるSIABを用
いると微小規模の反応が生じた;約1分の後、TLC分析により、長波長の紫外
線の下、Rf値0.28の新しいスポットが現れた。ニンヒドリンのスプレーに よる紫のスポットが見られなかったため、3-アミノプロピルトリエトキシシラ ン出発物質がその反応で消費された。UV線により、反応後に残存する過剰SI
ABもまたみられた。これらの結果から、反応は約1分間で終了することが判っ
た。すべての場合において、ヨードアセトアミド-機能化ウェハーを用いると、 不安定なヨードアセトアミド機能の加水分解が直ちに最小となった。加えて、す
べての更なるウェハー操作を暗室で行った。ヨードアセトアミド機能は光に感受
的だからである。
ずる。次いで、図7に示したように、表面をヘテロ二機能性架橋剤にさらすと、
表面上にヨードアセトアミド基を生ずる。TLCを用い、溶液におけるこの反応
の所望の反応時間を測定することができる。SIAB架橋剤は、長波長の紫外線
(302nm)の下、視覚化され、Rf値0.58のスポットがみられた。3-アミノプ ロピルトリエトキシシランは紫外線の下では作用しないため、ニンヒドリンを用
いると、ベースラインに一級アミンの存在を示す紫のスポットがみられた。3- アミノプロピルトリエトキシシランと比べて僅かにモル過剰であるSIABを用
いると微小規模の反応が生じた;約1分の後、TLC分析により、長波長の紫外
線の下、Rf値0.28の新しいスポットが現れた。ニンヒドリンのスプレーに よる紫のスポットが見られなかったため、3-アミノプロピルトリエトキシシラ ン出発物質がその反応で消費された。UV線により、反応後に残存する過剰SI
ABもまたみられた。これらの結果から、反応は約1分間で終了することが判っ
た。すべての場合において、ヨードアセトアミド-機能化ウェハーを用いると、 不安定なヨードアセトアミド機能の加水分解が直ちに最小となった。加えて、す
べての更なるウェハー操作を暗室で行った。ヨードアセトアミド機能は光に感受
的だからである。
【0150】 修飾オリゴヌクレオチドのジスルフィド還元を、逆相FPLCにおけるリテン
ションタイムのシフトを観察することにより、モニターした。その測定によると
、DTT(100mM)またはTCEP(10mM)存在下、5時間後、ジスルフィドは遊離 チオールに完全に還元された。DTT反応がもっと長時間生じているならば、オ
リゴヌクレオチドダイマーが形成され、遊離チオールの対が反応する。そのダイ
マー化はまた、切断反応完了後DTTが除去されたとき、観察された。このダイ
マー化は、TCEPを切断試薬として用いる際には観察されなかった。この反応
をpH4.5で実施するためであり、そのため、遊離チオールが完全にプロトン
化され、ダイマー化を阻害したためである。
ションタイムのシフトを観察することにより、モニターした。その測定によると
、DTT(100mM)またはTCEP(10mM)存在下、5時間後、ジスルフィドは遊離 チオールに完全に還元された。DTT反応がもっと長時間生じているならば、オ
リゴヌクレオチドダイマーが形成され、遊離チオールの対が反応する。そのダイ
マー化はまた、切断反応完了後DTTが除去されたとき、観察された。このダイ
マー化は、TCEPを切断試薬として用いる際には観察されなかった。この反応
をpH4.5で実施するためであり、そのため、遊離チオールが完全にプロトン
化され、ダイマー化を阻害したためである。
【0151】 ジスルフィド結合切断直後、修飾オリゴヌクレオチドをヨードアセトアミド機
能化ウェハーと共にインキュベーションした。チオール脱プロトン化を確実とす
るため、結合反応はpH8.0で行った。シリコンウェハーの化学により達成さ
れるプローブ表面密度は、放射性標識プローブおよびホスホイメージャーを用い
分析された。プローブ表面密度は、ジスルフィド切断反応において使用するTC
EP濃度の関数としてもモニターし得る(図8)。ジスルフィドを切断するための
10mM TCEPおよび上記の他の反応条件を用い、表面mm平方あたり25 0fmolの表面密度を再現することができた。上記と同一の実験を行った。た
だし、オリゴヌクレオチドプローブはチオール修飾を欠いており、表面mm平方
あたり5fmol未満の表面密度により、非特異的結合は最小となり、プローブ
結合は殆ど図7に示したように生じた。
能化ウェハーと共にインキュベーションした。チオール脱プロトン化を確実とす
るため、結合反応はpH8.0で行った。シリコンウェハーの化学により達成さ
れるプローブ表面密度は、放射性標識プローブおよびホスホイメージャーを用い
分析された。プローブ表面密度は、ジスルフィド切断反応において使用するTC
EP濃度の関数としてもモニターし得る(図8)。ジスルフィドを切断するための
10mM TCEPおよび上記の他の反応条件を用い、表面mm平方あたり25 0fmolの表面密度を再現することができた。上記と同一の実験を行った。た
だし、オリゴヌクレオチドプローブはチオール修飾を欠いており、表面mm平方
あたり5fmol未満の表面密度により、非特異的結合は最小となり、プローブ
結合は殆ど図7に示したように生じた。
【0152】 ハイブリダイゼーション 上記のように、35S標識プローブをウェハー表面に結合させ、結合密度を測定
した後、32P標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行った;ハイ
ブリダイゼーション効率および密度はホスホイメージャーおよび銅ホイルを用い
測定した。銅ホイルは98.4%の35Sシグナルを阻害し、その一方で32Pシグ
ナルを十分検出できることが実験的に確認された。相補的配列は再現的にハイブ
リダイズし、表面mm平方あたり105fmolを生じた;これは、ハイブリダ
イゼーション可能な結合プローブの約40%に相当する。同様に、非相補的配列
をこの概要で用い、非特異的結合は表面mm平方あたり5fmol未満となった
。
した後、32P標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行った;ハイ
ブリダイゼーション効率および密度はホスホイメージャーおよび銅ホイルを用い
測定した。銅ホイルは98.4%の35Sシグナルを阻害し、その一方で32Pシグ
ナルを十分検出できることが実験的に確認された。相補的配列は再現的にハイブ
リダイズし、表面mm平方あたり105fmolを生じた;これは、ハイブリダ
イゼーション可能な結合プローブの約40%に相当する。同様に、非相補的配列
をこの概要で用い、非特異的結合は表面mm平方あたり5fmol未満となった
。
【0153】 平坦表面に強固にパックされたオリゴヌクレオチドの間のステアリン酸阻害に
より、40%を超えるハイブリダイゼーション効率が阻害されると仮定された。
この点を考慮し、スペーサー分子を、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシ
ョン領域の端と支持体との間に組込んだ。選択されたスペーサーは一連のポリd
T配列であり、長さ3から25の範囲であった。放射標識およびホスホイメージ
ャーを伴うこれらサンプルの調査において、達成し得る最大ハイブリダイゼーシ
ョンはそれでも40%あった。
より、40%を超えるハイブリダイゼーション効率が阻害されると仮定された。
この点を考慮し、スペーサー分子を、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシ
ョン領域の端と支持体との間に組込んだ。選択されたスペーサーは一連のポリd
T配列であり、長さ3から25の範囲であった。放射標識およびホスホイメージ
ャーを伴うこれらサンプルの調査において、達成し得る最大ハイブリダイゼーシ
ョンはそれでも40%あった。
【0154】 MALDI-TOF MS分析 ウェハーはプローブで機能化され、相補的配列をハイブリダイズし、そのサン
プルを、上記の標準的MALDI条件下分析した。分析により示されたのは、ア
ニール鎖(MJM6)のみが、実験的な電荷に対する質量比6415.4の質量ス
ペクトルが観察され、理論的な電荷に対する質量比は6415である(図9)。電
荷に対する質量の比が6455であるシグナルがみられなかったため、ウェハー
結合鎖(TCUC)は脱着できず、そのため、レーザーに耐え未処理のままとなる
に充分な程度に、ヨードアセトアミド連結が安定となることが確認された。更な
るシグナルにより電荷に対する質量の比が6262.0であると観察された。こ
のシグナルはグアノシンの脱プリン化による結果であり、MALDIプロセスの
間にプリン塩基がDNAにより減損し得ると知られているためである(Nordoff,
E., et al., (1992) Rapid Commun. Mass Spectrom. 6:771-776)。ウェハー上の
サンプル結晶は均一に分布せず、そのため、良好なスポットを捜す必要があった
。この非均一性が原因で、質量の分解能は変化するが、脱着したオリゴヌクレオ
チドでは質量スペクトルは通常、200-300の範囲であった。ある一群の実 験では、非相補的配列はウェハーとハイブリダイズした;上記のように洗浄後の
MALDI-TOF MSの分析によると、非特異的アニーリングは最小となった
。シグナルが検出されなかったためである。
プルを、上記の標準的MALDI条件下分析した。分析により示されたのは、ア
ニール鎖(MJM6)のみが、実験的な電荷に対する質量比6415.4の質量ス
ペクトルが観察され、理論的な電荷に対する質量比は6415である(図9)。電
荷に対する質量の比が6455であるシグナルがみられなかったため、ウェハー
結合鎖(TCUC)は脱着できず、そのため、レーザーに耐え未処理のままとなる
に充分な程度に、ヨードアセトアミド連結が安定となることが確認された。更な
るシグナルにより電荷に対する質量の比が6262.0であると観察された。こ
のシグナルはグアノシンの脱プリン化による結果であり、MALDIプロセスの
間にプリン塩基がDNAにより減損し得ると知られているためである(Nordoff,
E., et al., (1992) Rapid Commun. Mass Spectrom. 6:771-776)。ウェハー上の
サンプル結晶は均一に分布せず、そのため、良好なスポットを捜す必要があった
。この非均一性が原因で、質量の分解能は変化するが、脱着したオリゴヌクレオ
チドでは質量スペクトルは通常、200-300の範囲であった。ある一群の実 験では、非相補的配列はウェハーとハイブリダイズした;上記のように洗浄後の
MALDI-TOF MSの分析によると、非特異的アニーリングは最小となった
。シグナルが検出されなかったためである。
【0155】 実施例2 連続および平行分配ツールを用いるDNAアレイの調製 ロボットが操縦する連続および平行pL-nL分配ツールを用いると、マトリ クスアシストレーザー脱着イオン化質量分析用の平坦な表面または幾何学的に変
化した(例えば、ウェルを有する)表面を有する1"平方未満のチップにおいて1 0-103のエレメントDNAを生じた。最初に、'圧電ピペット(piezoelectric
pipette)'(70μm id キャピラリー)により、マトリクスの0.2nL以下の小滴
を単一および多数分配し、次いで、測定対象物をチップに分配した;0.2fm
olぐらいの低濃度の36-mer DNAからのスペクトルがこのプロセスに必
要であった。急速な蒸発(<5秒)にも拘わらず、測定対象物を含む3-ヒドロキ シピコリン酸マトリクスの微小結晶をルーチンで作成すると、より大きな体積調
製で通常得られる場合よりも高い再現性が得られた;800μmウェル中の23
-merのスポット5fmol、100個すべてにおいて質量スペクトルへ容易 に変換され、ノイズに対するシグナルの比が5を超えるイオンシグナルを有して
いたものが100のうち99あった。2番目のアプローチでは、384ウェルマ
イクロタイタープレートからのプローブを、スプリングロードピンのアレイを用
いチップウェルまたは平坦表面上に、同時に16に分配し、20nL以下をチッ
プに表面接触により移す;平行法で置かれたアレイエレメントのMS分析は、連
続法で得られた感度および分解能に関し、一致する。
化した(例えば、ウェルを有する)表面を有する1"平方未満のチップにおいて1 0-103のエレメントDNAを生じた。最初に、'圧電ピペット(piezoelectric
pipette)'(70μm id キャピラリー)により、マトリクスの0.2nL以下の小滴
を単一および多数分配し、次いで、測定対象物をチップに分配した;0.2fm
olぐらいの低濃度の36-mer DNAからのスペクトルがこのプロセスに必
要であった。急速な蒸発(<5秒)にも拘わらず、測定対象物を含む3-ヒドロキ シピコリン酸マトリクスの微小結晶をルーチンで作成すると、より大きな体積調
製で通常得られる場合よりも高い再現性が得られた;800μmウェル中の23
-merのスポット5fmol、100個すべてにおいて質量スペクトルへ容易 に変換され、ノイズに対するシグナルの比が5を超えるイオンシグナルを有して
いたものが100のうち99あった。2番目のアプローチでは、384ウェルマ
イクロタイタープレートからのプローブを、スプリングロードピンのアレイを用
いチップウェルまたは平坦表面上に、同時に16に分配し、20nL以下をチッ
プに表面接触により移す;平行法で置かれたアレイエレメントのMS分析は、連
続法で得られた感度および分解能に関し、一致する。
【0156】 圧電連続ディスペンサーの詳細 実験システムは、Microdrop GmbH、Norderstedt G
ermanyから購入したシステムから開発し、それには、圧電エレメントドラ
イバであって、ドライバに結合した圧電エレメントにパルスシグナルを送り、分
配した溶液を保持するガラスキャピラリーを取り巻くドライバ;キャピラリーに
ロード(陰圧により)するかまたはキャピラリーを空とする(陽圧により)圧力変換
器;ローディング、アンローディング、ディスペンシングおよびクリーニングの
ために動作するロボットXYZステージおよびロボットドライバ、ストロボスコ
ープおよびピエゾエレメントにより'懸濁'小滴の特性が見られる頻度でパルスす
るドライバ;ソース用の分離ステージおよび指定プレートまたはサンプル標的( 即ち、Siチップ);指定プレートへのローディングを観察するロボットアーム にマウントしたカメラ;ならびに圧力単位、xyzロボットおよび圧電ドライバ
を制御するデータステーションを含む。
ermanyから購入したシステムから開発し、それには、圧電エレメントドラ
イバであって、ドライバに結合した圧電エレメントにパルスシグナルを送り、分
配した溶液を保持するガラスキャピラリーを取り巻くドライバ;キャピラリーに
ロード(陰圧により)するかまたはキャピラリーを空とする(陽圧により)圧力変換
器;ローディング、アンローディング、ディスペンシングおよびクリーニングの
ために動作するロボットXYZステージおよびロボットドライバ、ストロボスコ
ープおよびピエゾエレメントにより'懸濁'小滴の特性が見られる頻度でパルスす
るドライバ;ソース用の分離ステージおよび指定プレートまたはサンプル標的( 即ち、Siチップ);指定プレートへのローディングを観察するロボットアーム にマウントしたカメラ;ならびに圧力単位、xyzロボットおよび圧電ドライバ
を制御するデータステーションを含む。
【0157】 平行ディスペンサーの詳細 ロボットピンツールには、プローブブロック中に収めたプローブおよびX、Y
、Zロボットステージ上にマウントしたプローブが16含まれる。ロボットステ
ージは、ロボットのアームの下にサンプルトレイを位置し得る構台システムであ
った。構台ユニット自体がXおよびYアームを構成し、リニアオプティカルエン
コーダーにより位置フィードバックするブラッシュレスなリニアサーボモーター
でガイドされて、それぞれ、250および400mm移動する。Z軸を作動する
リードスクリュー(50mm垂直移動)を、構台ユニットのXY軸スライドにマウ
ントし、モーターをマウントした回転光学エンコーダーにより位置フィードバッ
クするライン回転サーボモーターにより制御する。システムの動作領域にスライ
ド-アウトツーリングプレートを装備し、5つのマイクロタイタープレート(殆ど
の場合、洗浄溶液に2プレートおよび最大1152種類のオリゴヌクレオチド溶
液用のサンプルに3プレート)および10以下の20×20mmウェハーを固定 する。ウェハーを2つのバンキングピンに対しプレート中に正確に位置させ、真
空により確保する。システム全体を安全のためにプレクシグラス中に収め、熱お
よび振動を減らすためにスチール支持体フレームにマウントした。作動の制御は
、3軸サーボコントローラーであり、コンピューターに組み入れられている(特 定の応用のためにプログラミングコードを必要に応じて書く)工業用作動コント ローラーを用いることにより行いる。
、Zロボットステージ上にマウントしたプローブが16含まれる。ロボットステ
ージは、ロボットのアームの下にサンプルトレイを位置し得る構台システムであ
った。構台ユニット自体がXおよびYアームを構成し、リニアオプティカルエン
コーダーにより位置フィードバックするブラッシュレスなリニアサーボモーター
でガイドされて、それぞれ、250および400mm移動する。Z軸を作動する
リードスクリュー(50mm垂直移動)を、構台ユニットのXY軸スライドにマウ
ントし、モーターをマウントした回転光学エンコーダーにより位置フィードバッ
クするライン回転サーボモーターにより制御する。システムの動作領域にスライ
ド-アウトツーリングプレートを装備し、5つのマイクロタイタープレート(殆ど
の場合、洗浄溶液に2プレートおよび最大1152種類のオリゴヌクレオチド溶
液用のサンプルに3プレート)および10以下の20×20mmウェハーを固定 する。ウェハーを2つのバンキングピンに対しプレート中に正確に位置させ、真
空により確保する。システム全体を安全のためにプレクシグラス中に収め、熱お
よび振動を減らすためにスチール支持体フレームにマウントした。作動の制御は
、3軸サーボコントローラーであり、コンピューターに組み入れられている(特 定の応用のためにプログラミングコードを必要に応じて書く)工業用作動コント ローラーを用いることにより行いる。
【0158】 サンプルを、(1)Thermo Bioanalysis Vision 20 00における通常の使用で提供されるときの平坦ステンレススチールサンプル標
的、(2)マイクロマシン化ナノピット(nanopit)を有する同一設計のステンレス スチール標的、(3)平坦シリコン(Si)ウェハー、(4)磨きをかけた平坦Siウ
ェハー、(5)粗い(3-6pLm特徴)ピットを有するSiウェハー、(6)化学的 にエッチングしたウェルの(a)10×10(または(b)16×16)アレイを有す
る(a)12×12または((b)18×18)mm Siチップ、それぞれ、800 ×8001lmであり、サイドは99-400(または(b)では120)マイクロ メーター、ピッチ(a)は1.0(または(b)では1.125)mmである、(7)化
学的にエッチングしたウェルの28×28アレイを有する15×15mm Si チップ、それぞれ、サイドは450×450マイクロメーターであり、48-3 00マイクロメーターの範囲の深さであり、0.5mmのピッチを有する、(8)
平坦なポリカーボネートまたは他のプラスチック、(9)金および他の金属、(1 0)膜、(11)金または他の伝導性物質でスプッターしたプラスチック表面を含 むMALDI TOF分析において標的となる幾つかの表面の連続システムに分 配した。分配体積を、分配する小滴数を調節することにより、10-10から10- 6 に調節する。
的、(2)マイクロマシン化ナノピット(nanopit)を有する同一設計のステンレス スチール標的、(3)平坦シリコン(Si)ウェハー、(4)磨きをかけた平坦Siウ
ェハー、(5)粗い(3-6pLm特徴)ピットを有するSiウェハー、(6)化学的 にエッチングしたウェルの(a)10×10(または(b)16×16)アレイを有す
る(a)12×12または((b)18×18)mm Siチップ、それぞれ、800 ×8001lmであり、サイドは99-400(または(b)では120)マイクロ メーター、ピッチ(a)は1.0(または(b)では1.125)mmである、(7)化
学的にエッチングしたウェルの28×28アレイを有する15×15mm Si チップ、それぞれ、サイドは450×450マイクロメーターであり、48-3 00マイクロメーターの範囲の深さであり、0.5mmのピッチを有する、(8)
平坦なポリカーボネートまたは他のプラスチック、(9)金および他の金属、(1 0)膜、(11)金または他の伝導性物質でスプッターしたプラスチック表面を含 むMALDI TOF分析において標的となる幾つかの表面の連続システムに分 配した。分配体積を、分配する小滴数を調節することにより、10-10から10- 6 に調節する。
【0159】 サンプル調製および分配 1.連続 種々の配列または濃度のオリゴヌクレオチド(0.1-50ng/マイクロタイ
ターを96ウェルマイクロタイタープレートにのせた;最初のウェルをマトリク
ス溶液として残した。穴をあけたチップ(MALDI標的のセクションにおける 標的6a)をステージ上にのせ、手動で並べる。ロボット制御ソフトウェア(ウイ
ンドウズ)中に、最初のウェルの座標、アレイの大きさ(即ち、xおよびyのスポ
ット数)およびエレメント間の距離、およびアレイエレメントあたりの0.2n L小滴の数を入れた。キャピラリーを10μL以下のリンスH2Oで満たし、連 続パルスモードの間のチップの完全性および清浄性を確認するためストロボ光照
射カメラが見える位置に自動的に移動し、空とした。次いで、キャピラリーをマ
トリクス溶液で満たし、再び、ストロボスコープで確認し、次いで、平坦の表面
または穴をあけた表面上のアレイへのスポットに使用した。別のMSモードにお
ける再現性の研究のために、10×10アレイに0.2−20nLの小滴を典型
的に分配した。キャピラリーを陽圧の適用により空とし、所望によりH2Oでリ ンスし、ソースオリゴプレートに移動し、5μL以下の0.05-2.0μM合 成オリゴを引き入れた。次いで、キャピラリーを、各マトリクススポット上に連
続してラスターし、0.2-20nL水溶液をそれぞれに加えた。
ターを96ウェルマイクロタイタープレートにのせた;最初のウェルをマトリク
ス溶液として残した。穴をあけたチップ(MALDI標的のセクションにおける 標的6a)をステージ上にのせ、手動で並べる。ロボット制御ソフトウェア(ウイ
ンドウズ)中に、最初のウェルの座標、アレイの大きさ(即ち、xおよびyのスポ
ット数)およびエレメント間の距離、およびアレイエレメントあたりの0.2n L小滴の数を入れた。キャピラリーを10μL以下のリンスH2Oで満たし、連 続パルスモードの間のチップの完全性および清浄性を確認するためストロボ光照
射カメラが見える位置に自動的に移動し、空とした。次いで、キャピラリーをマ
トリクス溶液で満たし、再び、ストロボスコープで確認し、次いで、平坦の表面
または穴をあけた表面上のアレイへのスポットに使用した。別のMSモードにお
ける再現性の研究のために、10×10アレイに0.2−20nLの小滴を典型
的に分配した。キャピラリーを陽圧の適用により空とし、所望によりH2Oでリ ンスし、ソースオリゴプレートに移動し、5μL以下の0.05-2.0μM合 成オリゴを引き入れた。次いで、キャピラリーを、各マトリクススポット上に連
続してラスターし、0.2-20nL水溶液をそれぞれに加えた。
【0160】 2.平行 平行プログラムは、オフセットプリンティングにより作成されるアレイを調節
するように書かれていた;10ウェハー上に64エレメントあるアレイを作成す
るために、例えば、ツールを3 84ウェルDNAソースプレートの16ウェル
に浸し、標的(例えば、Si、プラスチック、金属)に移動し、サンプルを表面接
触によりスポットした。次いで、ツールを同じ16ウェルに浸し、2番目の標的
にスポットし、このサイクルを10のウェハーすべてにおいて繰り返した。次に
、ツールを洗浄溶液に浸し、次いで、16種のソースプレートのウェルに浸し、
そして最初の一群の16スポットから標的2.25mmオフセット上にスポット
した;再び、これを10のウェハーすべてにおいて繰り返した;すべてのサイク
ルを繰り返し、各ピンから2×2アレイを作成し、8×8アレイのスポットを作
成した(2×2エレメント/ピン×16ピン=スポットしたエレメントは合計6 4)。
するように書かれていた;10ウェハー上に64エレメントあるアレイを作成す
るために、例えば、ツールを3 84ウェルDNAソースプレートの16ウェル
に浸し、標的(例えば、Si、プラスチック、金属)に移動し、サンプルを表面接
触によりスポットした。次いで、ツールを同じ16ウェルに浸し、2番目の標的
にスポットし、このサイクルを10のウェハーすべてにおいて繰り返した。次に
、ツールを洗浄溶液に浸し、次いで、16種のソースプレートのウェルに浸し、
そして最初の一群の16スポットから標的2.25mmオフセット上にスポット
した;再び、これを10のウェハーすべてにおいて繰り返した;すべてのサイク
ルを繰り返し、各ピンから2×2アレイを作成し、8×8アレイのスポットを作
成した(2×2エレメント/ピン×16ピン=スポットしたエレメントは合計6 4)。
【0161】 MS分析用のアレイを作成するため、配列または濃度の異なるオリゴヌクレオ
チドを、3種類以下の384ウェルマイクロタイタープレートのウェルにのせ、
一群の16ウェルをマトリクス溶液に残した。2つのプレートのウェルを洗浄液
で満たした。5つのマイクロタイタープレートをスライドアウトツーリングプラ
ートにのせた。10のウェハーを、ツーリングプレート上のバンキングピンに隣
接する用に位置させ、真空とした。マトリクスおよびオリゴヌクレオチドを事前
に混合しない場合、ピンツールを用い、10ウェハーの望ましいアレイエレメン
トすべてにマトリクス溶液を最初にスポットした。この例として、16×16ア
レイを作成する。そのため、ツールを、1.125mmのオフセットで各10ウ
ェハーに16回スポットしなければならない。次に、オリゴヌクレオチド溶液を
同じパターンにスポットし、マトリクスを再溶解した。同様に、オリゴヌクレオ
チド溶液をウェハー上に最初に置き、その後、マトリクス溶液を置くことにより
アレイを作成するか、またはマトリクスおよびオリゴヌクレオチド溶液を事前に
混合しアレイを作成する。
チドを、3種類以下の384ウェルマイクロタイタープレートのウェルにのせ、
一群の16ウェルをマトリクス溶液に残した。2つのプレートのウェルを洗浄液
で満たした。5つのマイクロタイタープレートをスライドアウトツーリングプラ
ートにのせた。10のウェハーを、ツーリングプレート上のバンキングピンに隣
接する用に位置させ、真空とした。マトリクスおよびオリゴヌクレオチドを事前
に混合しない場合、ピンツールを用い、10ウェハーの望ましいアレイエレメン
トすべてにマトリクス溶液を最初にスポットした。この例として、16×16ア
レイを作成する。そのため、ツールを、1.125mmのオフセットで各10ウ
ェハーに16回スポットしなければならない。次に、オリゴヌクレオチド溶液を
同じパターンにスポットし、マトリクスを再溶解した。同様に、オリゴヌクレオ
チド溶液をウェハー上に最初に置き、その後、マトリクス溶液を置くことにより
アレイを作成するか、またはマトリクスおよびオリゴヌクレオチド溶液を事前に
混合しアレイを作成する。
【0162】 マススペクトロメトリー 各分配概要の後、ロードしたチップを、ポリカーボネート支持体をマウントす
る一群のベベル化スクリューでMALDI-TOFソースプレート上に保持した 。プレートをプローブの端に移動させ、飛行時間質量分析計のソース領域におい
て1μm分解能、1"トラベルxyステージ(Newport)に保持した。18-26k V抽出で通常操作される器械を、直線状か曲線状のフィールドリフレクトロンモ
ードで操作し、そして連続的か遅延抽出モードで操作し得る。
る一群のベベル化スクリューでMALDI-TOFソースプレート上に保持した 。プレートをプローブの端に移動させ、飛行時間質量分析計のソース領域におい
て1μm分解能、1"トラベルxyステージ(Newport)に保持した。18-26k V抽出で通常操作される器械を、直線状か曲線状のフィールドリフレクトロンモ
ードで操作し、そして連続的か遅延抽出モードで操作し得る。
【0163】 圧電ピペットを用いる連続分配 飽和3HPA溶液の送達により、キャピラリーと空気の界面蒸発で溶媒がチッ
プに詰まる一方、DNAとマトリクスを事前に混合することによりマトリクスを
十分に希釈し、そのため、溶液中に残存する一方で、キャピラリーが空となるま
で保持され得る安定なスプレーが得られた;1:1希釈した(H2Oで)マトリク ス溶液は10分以上連続してスプレーが可能であった。キャピラリーを5分間以
上作用しないようにピエゾエレメントのスイッチを切り、ピエゾエレメントを再
度作用することによってもキャプラリーが詰らない。
プに詰まる一方、DNAとマトリクスを事前に混合することによりマトリクスを
十分に希釈し、そのため、溶液中に残存する一方で、キャピラリーが空となるま
で保持され得る安定なスプレーが得られた;1:1希釈した(H2Oで)マトリク ス溶液は10分以上連続してスプレーが可能であった。キャピラリーを5分間以
上作用しないようにピエゾエレメントのスイッチを切り、ピエゾエレメントを再
度作用することによってもキャプラリーが詰らない。
【0164】 Finnigan Vision 2000 MALDI-TOFシステムにより
提供されるステンレススチールサンプル標的を用いる最初の実験は、リフレクト
ロンモードで行い、マトリクスとDNAを事前に混合した溶液を使用し、その後
サンプル標的に分配する。単一のマイクロタイターウェルでは、飽和マトリクス
溶液50μL、12-mer(ATCG)3(配列番号3)溶液51μLのうち25 μL、および28-mer(ATCG)7(配列番号4)溶液51μLのうち25μ Lを混合した。0.6μL小滴の一群の10×10アレイを、Finnigan Vision 2000サンプル標的ディスク上に直接分配した;MALDI- TOF質量スペクトルは、750アトムモルの各2オリゴヌクレオチドを含む単
一のアレイエレメントから得られた。変換した質量スペクトルが、この方法を用
い、53-mer(350amolをロードした。示さず)の大きさのDNA分子 から得られた。
提供されるステンレススチールサンプル標的を用いる最初の実験は、リフレクト
ロンモードで行い、マトリクスとDNAを事前に混合した溶液を使用し、その後
サンプル標的に分配する。単一のマイクロタイターウェルでは、飽和マトリクス
溶液50μL、12-mer(ATCG)3(配列番号3)溶液51μLのうち25 μL、および28-mer(ATCG)7(配列番号4)溶液51μLのうち25μ Lを混合した。0.6μL小滴の一群の10×10アレイを、Finnigan Vision 2000サンプル標的ディスク上に直接分配した;MALDI- TOF質量スペクトルは、750アトムモルの各2オリゴヌクレオチドを含む単
一のアレイエレメントから得られた。変換した質量スペクトルが、この方法を用
い、53-mer(350amolをロードした。示さず)の大きさのDNA分子 から得られた。
【0165】 質量スペクトルは、シリコンチップのウェルに微小分配したDNA分子からも
得られた。図10は、化学的にエッジングした100のウェルを有する12×1
2mmシリコンチップを示す;マスクの大きさおよびエッジング時間をセットす
ると円錐台(fustum)(即ち、インバーテッドフラットトップピラミッド(inverted
flat top pyramidal))幾何学ウェルは800×800μm(上表面)および10 0μmの深さとなった。所望により、ウェルを粗くし、穴をあけ得る。上記の通
り、チップの端をステージの一段高い表面に並べ、キャピラリーに関しxおよび
y座標システムを決めた(他には、光学的配置、人工知能パターン認識ルーチン 、手動配置に基づくドエル-ピンを含む。)。各ウェルに、測定対象物を含まない
20小滴(〜5nL)の3-HPAマトリクス溶液を分配した;50%CH3CN溶
液を用いる場合、各小滴の蒸発時間は5-10秒のオーダーであった。溶媒蒸発 において、120×ステレオミクロスコープで観察する各微小分配マトリクス小
滴は、非晶および乳状平坦ディスクとしてみられた;その様子は小滴からなり、
図3bスペクトルが得られた。チップを空とすること、洗浄すること、23-m erDNA(Mr(計算値)=6967Da)の1.4μm水溶液で再度満たすこと において、キャピラリーを100スポットのマトリクス上に向け、5nLのDN
A水溶液をマトリクス水滴の上部に直接分配した。CCDカメラを用いる視覚化
を使用すると、マトリクスと水性測定対象物溶液が混合し、マトリクスが再溶解
することがわかった(室温および湿度で10秒以内で完全に蒸発する)。非晶マト
リクス表面を変換し、1μm未満のオーダーの結晶特性を有する真性微小結晶表
面に変換した。
得られた。図10は、化学的にエッジングした100のウェルを有する12×1
2mmシリコンチップを示す;マスクの大きさおよびエッジング時間をセットす
ると円錐台(fustum)(即ち、インバーテッドフラットトップピラミッド(inverted
flat top pyramidal))幾何学ウェルは800×800μm(上表面)および10 0μmの深さとなった。所望により、ウェルを粗くし、穴をあけ得る。上記の通
り、チップの端をステージの一段高い表面に並べ、キャピラリーに関しxおよび
y座標システムを決めた(他には、光学的配置、人工知能パターン認識ルーチン 、手動配置に基づくドエル-ピンを含む。)。各ウェルに、測定対象物を含まない
20小滴(〜5nL)の3-HPAマトリクス溶液を分配した;50%CH3CN溶
液を用いる場合、各小滴の蒸発時間は5-10秒のオーダーであった。溶媒蒸発 において、120×ステレオミクロスコープで観察する各微小分配マトリクス小
滴は、非晶および乳状平坦ディスクとしてみられた;その様子は小滴からなり、
図3bスペクトルが得られた。チップを空とすること、洗浄すること、23-m erDNA(Mr(計算値)=6967Da)の1.4μm水溶液で再度満たすこと において、キャピラリーを100スポットのマトリクス上に向け、5nLのDN
A水溶液をマトリクス水滴の上部に直接分配した。CCDカメラを用いる視覚化
を使用すると、マトリクスと水性測定対象物溶液が混合し、マトリクスが再溶解
することがわかった(室温および湿度で10秒以内で完全に蒸発する)。非晶マト
リクス表面を変換し、1μm未満のオーダーの結晶特性を有する真性微小結晶表
面に変換した。
【0166】 マトリクスを再溶解する方法により得られる改善した結晶と一致して、得られ
る質量スペクトルには、事前に混合したマトリクスと測定対象物溶液を合わせた
溶液よりも再現性があるように思われた;23-merのスポット5fmol、 100スポットにより、変換された質量スペクトルが生じ(図11)、100のイ
オンシグナルのうち99においてノイズに対するシグナルの比が5を超える;そ
の再現性はまた平坦シリコンおよび試験済み金属表面(示さず)で得られた。図1
1のスペクトルは26kVで操作する線形TOF器械で得られた。一倍および二
倍電荷の分子イオンを用い、上部左のスペクトル(ウェル'k1')を内部較正し、
この較正ファイルを他の99のスペクトルに対し外部較正として適用(図12)す
ると、平均分子量から9Da未満の標準偏差が得られ、それは0.1%未満の相
対標準偏差に相当した。
る質量スペクトルには、事前に混合したマトリクスと測定対象物溶液を合わせた
溶液よりも再現性があるように思われた;23-merのスポット5fmol、 100スポットにより、変換された質量スペクトルが生じ(図11)、100のイ
オンシグナルのうち99においてノイズに対するシグナルの比が5を超える;そ
の再現性はまた平坦シリコンおよび試験済み金属表面(示さず)で得られた。図1
1のスペクトルは26kVで操作する線形TOF器械で得られた。一倍および二
倍電荷の分子イオンを用い、上部左のスペクトル(ウェル'k1')を内部較正し、
この較正ファイルを他の99のスペクトルに対し外部較正として適用(図12)す
ると、平均分子量から9Da未満の標準偏差が得られ、それは0.1%未満の相
対標準偏差に相当した。
【0167】 ロボットピンツールを用いる平行分配 アレイは上記オフセットプリンティングで作成した。XおよびYステージの速
度は35インチ/秒、およびZステージの速度は5.5インチ/秒である。Xお
よびYステージを最大速度で移動させることができ、サイクル時間を短くするこ
とができるが、Zステージの速さは、ウェハーとの表面接触の前に遅くなり、ウ
ェハーの損傷を避ける。その軸速度で、10のウェハーすべてにおける16のエ
レメントにスポットするおおよそのサイクル時間(同一溶液に一つのツールイン プレッション)は20秒であり、そのため、256エレメントのアレイでは5. 3分未満となる。種々のオリゴヌクレオチド溶液をアレイ上に置くと、付加的洗
浄段階を多く組込み、他の溶液に浸す前にチップを洗浄しなければならず、その
ため、サイクル時間は、25秒となり、10ウェハーでは6.7分かかった。
度は35インチ/秒、およびZステージの速度は5.5インチ/秒である。Xお
よびYステージを最大速度で移動させることができ、サイクル時間を短くするこ
とができるが、Zステージの速さは、ウェハーとの表面接触の前に遅くなり、ウ
ェハーの損傷を避ける。その軸速度で、10のウェハーすべてにおける16のエ
レメントにスポットするおおよそのサイクル時間(同一溶液に一つのツールイン プレッション)は20秒であり、そのため、256エレメントのアレイでは5. 3分未満となる。種々のオリゴヌクレオチド溶液をアレイ上に置くと、付加的洗
浄段階を多く組込み、他の溶液に浸す前にチップを洗浄しなければならず、その
ため、サイクル時間は、25秒となり、10ウェハーでは6.7分かかった。
【0168】 ツールによるサンプル送達を、上記のような放射標識溶液およびホスホイメー
ジャーを用い調査した;各ピンは約1nLの液体を送達することが判明した。ス
ポットからスポットへの再現性は高い。種々の配列および濃度の256オリゴヌ
クレオチドエレメントのアレイを、平坦シリコンウェハー上に、ピンツールを用
い作成し、そのウェハーをMALDI-TOF MSにより分析した。
ジャーを用い調査した;各ピンは約1nLの液体を送達することが判明した。ス
ポットからスポットへの再現性は高い。種々の配列および濃度の256オリゴヌ
クレオチドエレメントのアレイを、平坦シリコンウェハー上に、ピンツールを用
い作成し、そのウェハーをMALDI-TOF MSにより分析した。
【0169】 実施例3 核酸アレイの作成に用いる高密度核酸固定 実施例1に記載の高密度結合方法を用い、MALDI-TOF質量分析できる DNAオリゴマーのアレイを、表面上に多数の位置(location)、例えば凹部また
はパッチを有するシリコンウェハー上に作成した。アレイを得るため、遊離チオ
ールを含むオリゴヌクレオチドプライマーをウェハーの選択位置にのみに固定化
した(例えば、図13参照)。アレイの各位置には、3種のオリゴマーのうち1つ
を含んでいた。種々の固定化オリゴマーが別々に検出され、識別され得ることを
説明するため、3つのオリゴマーのうち1つに相補的である種々の長さの3種の
オリゴヌクレオチドを、ウェハー上のアレイにハイブリダイズし、MALDI- TOFマススペクトロメトリーにより分析した。
はパッチを有するシリコンウェハー上に作成した。アレイを得るため、遊離チオ
ールを含むオリゴヌクレオチドプライマーをウェハーの選択位置にのみに固定化
した(例えば、図13参照)。アレイの各位置には、3種のオリゴマーのうち1つ
を含んでいた。種々の固定化オリゴマーが別々に検出され、識別され得ることを
説明するため、3つのオリゴマーのうち1つに相補的である種々の長さの3種の
オリゴヌクレオチドを、ウェハー上のアレイにハイブリダイズし、MALDI- TOFマススペクトロメトリーにより分析した。
【0170】 オリゴデオキシヌクレオチド 3つの群の相補的オリゴデオキシヌクレオチド対を合成し、その相補的オリゴ
ヌクレオチド対の1つには、3'-または5'-ジスルフィド連結(Operon Technolo
gies of Oligos, Etc.から購入した)が含まれる。例えば、オリゴマー1(d(C TGATGCGTCGGATCATCTTTTTT-SS);配列番号5)は、3'
-ジスルフィド連結を含む一方、オリゴマー2(d(SS-CCTCTTGGGAA
CTGTGTAGTATT)、配列番号6の5'-ジスルフィド誘導体およびオリ ゴマー3(d(SS-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG);配列番号1
の5'-ジスルフィド誘導体)、それぞれには5'-ジスルフィド連結が含まれる。
ヌクレオチド対の1つには、3'-または5'-ジスルフィド連結(Operon Technolo
gies of Oligos, Etc.から購入した)が含まれる。例えば、オリゴマー1(d(C TGATGCGTCGGATCATCTTTTTT-SS);配列番号5)は、3'
-ジスルフィド連結を含む一方、オリゴマー2(d(SS-CCTCTTGGGAA
CTGTGTAGTATT)、配列番号6の5'-ジスルフィド誘導体およびオリ ゴマー3(d(SS-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG);配列番号1
の5'-ジスルフィド誘導体)、それぞれには5'-ジスルフィド連結が含まれる。
【0171】 オリゴマー1-3に相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、MALDI-TOF MS分析の間に互いから容易に分離できる種々の長さとする。例えば、23-m
erオリゴヌクレオチド(配列番号7)を合成しオリゴマー1の部分に相補的とし
、12-merオリゴヌクレオチド(配列番号8)を合成しオリゴヌクレオチド2 の部分に相補的とし、そして、21-mer(配列番号2;実施例1では“MJM
6”と述べた配列)を合成しオリゴマー3の部分に相補的とした。加えて、4つ 目の29-merオリゴヌクレオチド(配列番号9)を、3つのオリゴマーのうち 何れとも相補性を欠くように合成した。この4つ目のオリゴヌクレオチドを陰性
対照として用いた。
erオリゴヌクレオチド(配列番号7)を合成しオリゴマー1の部分に相補的とし
、12-merオリゴヌクレオチド(配列番号8)を合成しオリゴヌクレオチド2 の部分に相補的とし、そして、21-mer(配列番号2;実施例1では“MJM
6”と述べた配列)を合成しオリゴマー3の部分に相補的とした。加えて、4つ 目の29-merオリゴヌクレオチド(配列番号9)を、3つのオリゴマーのうち 何れとも相補性を欠くように合成した。この4つ目のオリゴヌクレオチドを陰性
対照として用いた。
【0172】 シリコン表面化学およびDNA固定化 (a)4×4(16-位置)アレイ 265個の凹部またはウェルを有し、16×16ウェルアレイ形の2×2cm 2 シリコンを商業上の供給者から購入した(Accelerator Technology Corp., Coll
ege Station, Texas)。ウェルは1.125のピッチ上で800×800μm2、
120μmの深さであった。シリコンウェハーを3-アミノプロピルトリエトキ シシランと反応させ、均一な層の一級アミンを表面上に作成し、次いで、ヘテロ
二機能性架橋剤SIABにさらし、表面上にヨードアセトアミド機能性を生じさ
せる(例えば、図7参照)。
ege Station, Texas)。ウェルは1.125のピッチ上で800×800μm2、
120μmの深さであった。シリコンウェハーを3-アミノプロピルトリエトキ シシランと反応させ、均一な層の一級アミンを表面上に作成し、次いで、ヘテロ
二機能性架橋剤SIABにさらし、表面上にヨードアセトアミド機能性を生じさ
せる(例えば、図7参照)。
【0173】 種々の位置のシリコンアレイに結合するためのオリゴマーを調製するため、各
オリゴマーのジスルフィド結合を、実施例1に記載のように10mM TCEP を用い十分に還元し、DNAを100mM リン酸緩衝液、pH8.0の溶液で 最終濃度10μMに再懸濁した。ジスルフィド結合の還元直後、オリゴマーの遊
離チオール基を、上記実施例7に実質的に記載のプローブ結合条件を用いウェハ
ー上の16の位置でヨードアセトアミド機能と組合せた。ウェハー上の16の位
置において別々の結合を実施するため、ウェハーの表面全体をオリゴヌクレオチ
ド溶液で勢いよく洗い流さず、代わりに、事前に測定した修飾オリゴマーの30
nl以下のアリコートを、ウェハー上の265ウェルの各16位置(即ち、凹部)
に平行に加え、本明細書に記載のとおりにピンツールを用い4×4アレイの固定
化DNAを作成した(例えば、本明細書中の詳細な説明および実施例4参照)。
オリゴマーのジスルフィド結合を、実施例1に記載のように10mM TCEP を用い十分に還元し、DNAを100mM リン酸緩衝液、pH8.0の溶液で 最終濃度10μMに再懸濁した。ジスルフィド結合の還元直後、オリゴマーの遊
離チオール基を、上記実施例7に実質的に記載のプローブ結合条件を用いウェハ
ー上の16の位置でヨードアセトアミド機能と組合せた。ウェハー上の16の位
置において別々の結合を実施するため、ウェハーの表面全体をオリゴヌクレオチ
ド溶液で勢いよく洗い流さず、代わりに、事前に測定した修飾オリゴマーの30
nl以下のアリコートを、ウェハー上の265ウェルの各16位置(即ち、凹部)
に平行に加え、本明細書に記載のとおりにピンツールを用い4×4アレイの固定
化DNAを作成した(例えば、本明細書中の詳細な説明および実施例4参照)。
【0174】 そのため、実施例13に示したように、修飾オリゴマー1-3のうち1つを、 シリコンウェハー上の256ウェルの各16種のウェルに共有結合的に固定化し
、それによって4×4アレイの固定化DNAを作成した。例えば、オリゴマー1
を4×4アレイの上端左手のコーナーのウェル位置で結合させ、オリゴマー2を
隣接位置などに結合させた。完成したアレイの解説を図13で示している。
、それによって4×4アレイの固定化DNAを作成した。例えば、オリゴマー1
を4×4アレイの上端左手のコーナーのウェル位置で結合させ、オリゴマー2を
隣接位置などに結合させた。完成したアレイの解説を図13で示している。
【0175】 ハイブリダイゼーション反応の実施において、3つの相補的オリゴヌクレオチ
ドおよび陰性対照オリゴヌクレオチドを、1M NaClを加えたTE緩衝液(1
0mM Tris-HCl, pH8.0、1mM EDTA)1ml中の各オリゴヌ
クレオチドを最終濃度10μMで混合し、その溶液を65℃で10分間加熱した
。その直後、シリコンウェハーの表面全体を加熱オリゴヌクレオチド溶液800
μlで勢いよく洗い流した。相補的オリゴヌクレオチドを、1時間室温でシリコ
ンアレイをインキュベーションし、その後、少なくとも10分間4℃でインキュ
ベーションすることにより、固定化オリゴマーにアニールさせた。他に、オリゴ
ヌクレオチド溶液をウェハーに加え、次いで、加熱し、ハイブリダイゼーション
のために冷却する。各位置に共有結合的に固定化した特定オリゴマーにアニール
した相補的オリゴヌクレオチドの解説を図14に示す。
ドおよび陰性対照オリゴヌクレオチドを、1M NaClを加えたTE緩衝液(1
0mM Tris-HCl, pH8.0、1mM EDTA)1ml中の各オリゴヌ
クレオチドを最終濃度10μMで混合し、その溶液を65℃で10分間加熱した
。その直後、シリコンウェハーの表面全体を加熱オリゴヌクレオチド溶液800
μlで勢いよく洗い流した。相補的オリゴヌクレオチドを、1時間室温でシリコ
ンアレイをインキュベーションし、その後、少なくとも10分間4℃でインキュ
ベーションすることにより、固定化オリゴマーにアニールさせた。他に、オリゴ
ヌクレオチド溶液をウェハーに加え、次いで、加熱し、ハイブリダイゼーション
のために冷却する。各位置に共有結合的に固定化した特定オリゴマーにアニール
した相補的オリゴヌクレオチドの解説を図14に示す。
【0176】 次いで、ハイブリダイゼーションアレイを陽イオン交換用クエン酸アンモニウ
ム溶液50mMで洗浄し、DNAバックボーンのナトリウムおよびカリウムイオ
ンを除去した(Pieles, U. et al., (1993) Nucleic Acids Res. 21:3191-3196)
。6-nlアリコートの3-ヒドロキシピコリン酸のマトリクス溶液(50%アセ トニトリル中の0.7M 3-ヒドロキシピコリン酸-10%クエン酸アンモニウ ム;Wu et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 7:142-146(1993))を、上記の圧
電ピペットを用い各位置のアレイに加えた。
ム溶液50mMで洗浄し、DNAバックボーンのナトリウムおよびカリウムイオ
ンを除去した(Pieles, U. et al., (1993) Nucleic Acids Res. 21:3191-3196)
。6-nlアリコートの3-ヒドロキシピコリン酸のマトリクス溶液(50%アセ トニトリル中の0.7M 3-ヒドロキシピコリン酸-10%クエン酸アンモニウ ム;Wu et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 7:142-146(1993))を、上記の圧
電ピペットを用い各位置のアレイに加えた。
【0177】 溶液を室温で乾燥し得、その後、6-nlアリコートの水を、圧電ピペットを 用い各位置に加え、乾燥マトリクスDNA複合体を再懸濁し、そのため、室温で
の乾燥においてマトリクスDNA複合体により各位置の下部表面に均一の結晶表
面が形成された。
の乾燥においてマトリクスDNA複合体により各位置の下部表面に均一の結晶表
面が形成された。
【0178】 MALDI-TOF MS分析 MALDI-TOF MS分析は、各16位置のハイブリダイゼーションアレイ
において連続して行われる。それは、実施例1に記載のように図14に実質的に
解説している。オリゴヌクレオチドの生じた質量スペクトルは、DNAハイブリ
ダイゼーションアレイの各16位置にハイブリダイズする。それを図15に示し
ている。質量スペクトルにより、各位置で特定のシグナルが見られ、その典型的
な位置において、実験的な電荷に対する質量比が観察され、それは、特定の相補
的ヌクレオチド配列に相当する。
において連続して行われる。それは、実施例1に記載のように図14に実質的に
解説している。オリゴヌクレオチドの生じた質量スペクトルは、DNAハイブリ
ダイゼーションアレイの各16位置にハイブリダイズする。それを図15に示し
ている。質量スペクトルにより、各位置で特定のシグナルが見られ、その典型的
な位置において、実験的な電荷に対する質量比が観察され、それは、特定の相補
的ヌクレオチド配列に相当する。
【0179】 例えば、オリゴマー1のみが結合する位置では、質量スペクトルにより、優位
なシグナルが見られ、実験的な電荷に対する質量比は7072.4と観察され、
おおよそ23-merの場合に相当する;23-merにおける理論的な電荷に対
する質量比は7072.6Daである。同様に、アレイに12-merオリゴヌ クレオチドが特異的にハイブリダイズすることにより、実験的な電荷に対する質
量比は3618.33Da(理論値3622.4Da)であると観察され、その特
異的ハイブリダイゼーションは、オリゴマー2と結合した位置でのみ検出された
。その一方、MJM6の特異的ハイブリダイゼーション(実験的な電荷に対する 質量比は6415.4であると観察された)はオリゴマー3(理論値6407.2
Da)と結合したアレイの位置でのみ検出された。
なシグナルが見られ、実験的な電荷に対する質量比は7072.4と観察され、
おおよそ23-merの場合に相当する;23-merにおける理論的な電荷に対
する質量比は7072.6Daである。同様に、アレイに12-merオリゴヌ クレオチドが特異的にハイブリダイズすることにより、実験的な電荷に対する質
量比は3618.33Da(理論値3622.4Da)であると観察され、その特
異的ハイブリダイゼーションは、オリゴマー2と結合した位置でのみ検出された
。その一方、MJM6の特異的ハイブリダイゼーション(実験的な電荷に対する 質量比は6415.4であると観察された)はオリゴマー3(理論値6407.2
Da)と結合したアレイの位置でのみ検出された。
【0180】 陰性対照29-merオリゴヌクレオチド(理論的な電荷に対する質量比は89
74.8)に相当するシグナルを示すアレイ位置はなく、これにより示されるの は、特異的標的DNA分子が、シリコンアレイの表面上の特定位置に共有結合的
に固定化されたオリゴマーとハイブリダイズし得、多数のハイブリダイゼーショ
ンアッセイが、MALDI-TOF MS分析を用い個々にモニターされることで
ある。
74.8)に相当するシグナルを示すアレイ位置はなく、これにより示されるの は、特異的標的DNA分子が、シリコンアレイの表面上の特定位置に共有結合的
に固定化されたオリゴマーとハイブリダイズし得、多数のハイブリダイゼーショ
ンアッセイが、MALDI-TOF MS分析を用い個々にモニターされることで
ある。
【0181】 (b)8×8(64-位置)アレイ 16×16アレイのウェルを形成する256個の凹部またはウェルを有する2
×2cm2シリコンウェハーを、商業上の供給者(Accelerator Technology Corp.
, College Station, Texas)から購入した。ウェルは1.125のピッチ上で8 00×800μm2、120μmの深さであった。シリコンウェハーを3-アミノ
プロピルトリエトキシシランと反応させ、均一な層の一級アミンを表面上に作成
し、次いで、ヘテロ二機能性架橋剤SIABにさらし、表面上にヨードアセトア
ミド機能を生じさせる(例えば、図7参照)。
×2cm2シリコンウェハーを、商業上の供給者(Accelerator Technology Corp.
, College Station, Texas)から購入した。ウェルは1.125のピッチ上で8 00×800μm2、120μmの深さであった。シリコンウェハーを3-アミノ
プロピルトリエトキシシランと反応させ、均一な層の一級アミンを表面上に作成
し、次いで、ヘテロ二機能性架橋剤SIABにさらし、表面上にヨードアセトア
ミド機能を生じさせる(例えば、図7参照)。
【0182】 16-位置DNAアレイの調製する上記の方法に従い、オリゴマー1-3を64
-位置に固定化し、256ウェルシリコンウェハー上に8×8アレイを形成し、 相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、MALDI-TOF MS分析法
により分析した。図16は、MALDI-TOF分析により連続分析する64-位
置DNAアレイの質量スペクトルを示す。16-位置アレイとして示すように、 相補的オリゴヌクレオチドを各固定化チオール含有オリゴマーにハイブリダイズ
し、各位置のDNAアレイで観察した。
-位置に固定化し、256ウェルシリコンウェハー上に8×8アレイを形成し、 相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、MALDI-TOF MS分析法
により分析した。図16は、MALDI-TOF分析により連続分析する64-位
置DNAアレイの質量スペクトルを示す。16-位置アレイとして示すように、 相補的オリゴヌクレオチドを各固定化チオール含有オリゴマーにハイブリダイズ
し、各位置のDNAアレイで観察した。
【0183】 実施例4 一本鎖ニックDNA鋳型のRNA転写 この実施例では、効率におけるコーディング鎖ニック置換の効果を評価し、そ
れによってRNA転写産物を生じ、シーケンス用のRNA転写物を生ずる光学的
条件も提供する。
れによってRNA転写産物を生じ、シーケンス用のRNA転写物を生ずる光学的
条件も提供する。
【0184】 1.鋳型およびプライマー配列の設計 プライマーすべてを、商業的に利用できるDNAシンセサイザーで、通常のホ
スホロアミデイト化学(Sinha et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:4539)を 用い合成した。インビトロのRNA転写を合成55ヌクレオチド二本鎖DNA鋳
型で行った。鋳型を、3つのプライマー配列;55ヌクレオチド非コーディング
鎖(配列番号10)およびコーディング鎖(配列番号11および12)を形成する2
つの更なるプライマーを用いアセンブルした。図17に示すように、コーディン
グ鎖中のニックの特定位置は各コーディング鎖プライマーの長さによる定義であ
る。転写のためのこの構成の使用により、この位置でのニックが実質的に転写を
減衰しないことを示す。
スホロアミデイト化学(Sinha et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:4539)を 用い合成した。インビトロのRNA転写を合成55ヌクレオチド二本鎖DNA鋳
型で行った。鋳型を、3つのプライマー配列;55ヌクレオチド非コーディング
鎖(配列番号10)およびコーディング鎖(配列番号11および12)を形成する2
つの更なるプライマーを用いアセンブルした。図17に示すように、コーディン
グ鎖中のニックの特定位置は各コーディング鎖プライマーの長さによる定義であ
る。転写のためのこの構成の使用により、この位置でのニックが実質的に転写を
減衰しないことを示す。
【0185】 2.プライマーハイブリダイゼーションおよびRNA転写 一本鎖ニック鋳型は3つの一本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーショ
ンを作成し、その全DNA濃度は、10mM MgCl2中10μM(鋳型よりも プライマーは2倍多い)であり、70℃で10分間反応混合物を加熱し、少なく とも4時間かけて室温に冷却することにより作成する。ニックの位置は、2つの
コーディング鎖(5'-3')DNAオリゴヌクレオチドの相当する長さにより決定 される。
ンを作成し、その全DNA濃度は、10mM MgCl2中10μM(鋳型よりも プライマーは2倍多い)であり、70℃で10分間反応混合物を加熱し、少なく とも4時間かけて室温に冷却することにより作成する。ニックの位置は、2つの
コーディング鎖(5'-3')DNAオリゴヌクレオチドの相当する長さにより決定 される。
【0186】 SP6RNAポリメラーゼ転写 ニックDNA鋳型のインビトロの転写を、40mM Tris-HCl(pH7 .0)、6mM MgCl2、2mM スペルミジン、10mM NaCl、10m M ジチオスレイトール、1unit/μl RNasin(Promega)、5mM rNTP
、5μCi[α-32P]rCTP、1unit/μl SP6 RNAポリメラーゼ(Amer
sham, Arlington Heights, IL)の反応20μl中で、37℃で30分間行った。
不完全および全長のRNA転写産物を、ゲル電気泳動により分離し、ポリアクリ
ルアミドゲルを乾燥し個々のRNA断片の放射活性を測定することにより、そし
てPhosphoImager(Molecular Dynamics, Inc.)を用い既知標準と放射活性を比べ 測定することにより、定量した。ニックDNA鋳型の全長RNA転写の効率を、
ニックを含まないDNA鋳型から転写した全長RNAのパーセントモルとして算
出した。ニックDNA鋳型の通過効率によりニックを、モル全長のRNA転写物
およびニックでストールしたRNA転写産物のモルのパーセントとして算出した
。
、5μCi[α-32P]rCTP、1unit/μl SP6 RNAポリメラーゼ(Amer
sham, Arlington Heights, IL)の反応20μl中で、37℃で30分間行った。
不完全および全長のRNA転写産物を、ゲル電気泳動により分離し、ポリアクリ
ルアミドゲルを乾燥し個々のRNA断片の放射活性を測定することにより、そし
てPhosphoImager(Molecular Dynamics, Inc.)を用い既知標準と放射活性を比べ 測定することにより、定量した。ニックDNA鋳型の全長RNA転写の効率を、
ニックを含まないDNA鋳型から転写した全長RNAのパーセントモルとして算
出した。ニックDNA鋳型の通過効率によりニックを、モル全長のRNA転写物
およびニックでストールしたRNA転写産物のモルのパーセントとして算出した
。
【0187】 表1に説明するように、全長RNAの転写は、転写開始点から+7、+8、+
9または+19のヌクレオチド以後のコーディング鎖中にニックを組み込むと、
88-94%の効率で生じる。
9または+19のヌクレオチド以後のコーディング鎖中にニックを組み込むと、
88-94%の効率で生じる。
【表1】 表1
【0188】 実施例5 T7RNAポリメラーゼを用いるDNAシーケンシング 1.鋳型およびプライマー配列の設計 プライマーすべてを、商業的に利用できるDNAシンセサイザーで、通常のホ
スホロアミデイト化学(Sinha et al., (1984) Nucleic Acid Res. 12:453)を用 い合成した。インビトロのRNA転写を合成276ヌクレオチド二本鎖DNA鋳
型(T7プロモーターを含む配列番号13)で行った。
スホロアミデイト化学(Sinha et al., (1984) Nucleic Acid Res. 12:453)を用 い合成した。インビトロのRNA転写を合成276ヌクレオチド二本鎖DNA鋳
型(T7プロモーターを含む配列番号13)で行った。
【0189】 2.DNAシーケンシング 標的DNA鋳型のDNAシーケンシングを、40mM Tris-HCl(pH 7.9)、6mM MgCl2、2mM 中性化スペルミジン、5mM ジチオスレ イトール、300nM rCTP、300nM rATP、300nM rUTP 、300nM rITP、600nM rGMP、10μCi(α-32P)rCTP またはUTP、10-300、通常10-50μM 3'-デオキシヌクレオチド、 0.5-1.0pmol 直鎖状またはスーパーコイルのDNA鋳型、4ユニット
のRNasin(Promega)、10unit/μl T7RNAポリメラーゼ(USB)の反
応10μl中で、37℃30分間行った。チェーンターミネーション断片RNA
転写産物を、8%または13%ポリアクリルアミドゲルを用いるゲル電気泳動に
より分離した。
のRNasin(Promega)、10unit/μl T7RNAポリメラーゼ(USB)の反
応10μl中で、37℃30分間行った。チェーンターミネーション断片RNA
転写産物を、8%または13%ポリアクリルアミドゲルを用いるゲル電気泳動に
より分離した。
【0190】 RNA終結断片のDNAシーケンシングラダーが180-200塩基までで生 じた。この例により示されるのは、T7RNAポリメラーゼが、塩基特異的チェ
ーンターミネーターとして修飾3'-デオキシリボヌクレオシドを特異的に組込み
得、核酸をシーケンスするためのネストしたRNA転写物を生じ得る。
ーンターミネーターとして修飾3'-デオキシリボヌクレオシドを特異的に組込み
得、核酸をシーケンスするためのネストしたRNA転写物を生じ得る。
【0191】 修飾が当業者にとって容易であるため、本発明を添付の特許請求の範囲にのみ
に限定される。
に限定される。
【0192】
【配列表】
【図1】 図1は、分析用のサンプル物質のアレイを調製するためのシステ
ムを示す。
ムを示す。
【図2】 図2は、図1に示すシステムでの使用に適当なピンアセンブリを
示し、基体表面に物質を分配する平行プロセスを実行する。
示し、基体表面に物質を分配する平行プロセスを実行する。
【図3】 図3は、図2に示すアセンブリの下部分を示す。
【図4】 図4は、図2に示すピンアセンブリの下部分の別角度の様子を示
す。
す。
【図5】 図5A-5Dは、サンプル物質のアレイを調製する方法を示す。
【図6】 図6A-6Bは、基体表面に物質を分配する他のアセンブリを示 す。
【図7】 図7は、本明細書で記載するような、オリゴデオキシヌクレオチ
ドによる二酸化シリコン表面への共有結合を示す概要図である。特に、二酸化シ
リコンは3-アミノプロピルトリエトキシシランと反応し、表面上に一級アミノ 基の均一な層を生ずる。次いで、ヘテロ二機能性架橋剤を一級アミンと反応し、
ヨードアセトアミド基を組込む。3'-または5'-ジスルフィドを含むオリゴデオ
キシヌクレオチド(5'に示すように)を、トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフ ィン(TCEP)で処理すると、ジスルフィドは遊離チオールに還元し、次いで、
ヨードアセトアミド表面と結合した。
ドによる二酸化シリコン表面への共有結合を示す概要図である。特に、二酸化シ
リコンは3-アミノプロピルトリエトキシシランと反応し、表面上に一級アミノ 基の均一な層を生ずる。次いで、ヘテロ二機能性架橋剤を一級アミンと反応し、
ヨードアセトアミド基を組込む。3'-または5'-ジスルフィドを含むオリゴデオ
キシヌクレオチド(5'に示すように)を、トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフ ィン(TCEP)で処理すると、ジスルフィドは遊離チオールに還元し、次いで、
ヨードアセトアミド表面と結合した。
【図8】 図8は、シリコン表面へのオリゴデオキシヌクレオチドプローブ
の結合を、ジスルフィド還元に用いるTCEP濃度の関数としてプロットしたグ
ラフである。
の結合を、ジスルフィド還元に用いるTCEP濃度の関数としてプロットしたグ
ラフである。
【図9】 図9は、図7に示すように実質的に共有結合した“TCUC”( 5'-GAATTCGAGC TCGGTACCCG G-3';配列番号1)で示されるオリゴデオキシヌク
レオチド配列、およびそれにハイブリダイズする“MJM6”(5'-CCGGGTACCG
AGCTCGAATT C-3';配列番号2)で示されるオリゴデオキシヌクレオチド配列を 有するシリコンウェハーのマトリクスアシストレーザー吸収/イオン化-飛行時 間(MALDI-TOF)質量スペクトルである。
レオチド配列、およびそれにハイブリダイズする“MJM6”(5'-CCGGGTACCG
AGCTCGAATT C-3';配列番号2)で示されるオリゴデオキシヌクレオチド配列を 有するシリコンウェハーのマトリクスアシストレーザー吸収/イオン化-飛行時 間(MALDI-TOF)質量スペクトルである。
【図10】 図10は、ウェルをエッチングした、ある態様の基体であって
、分析の物質を受けるのに適する。
、分析の物質を受けるのに適する。
【図11】 図11は、線形飛行時間型質量分析および図10に示す基体表
面上のサンプル物質の典型的な物質の組成から得られるスペクトルの1例を示す
。
面上のサンプル物質の典型的な物質の組成から得られるスペクトルの1例を示す
。
【図12】 図12は、図11と同一のスペクトルを有するサンプル物質を
について測定した分子量を示す。
について測定した分子量を示す。
【図13】 図13は、実施例2に記載したように実質的にシリコンウェハ
ー表面上の16位置と共有結合する“オリゴマー1”(5'- CTGGATGCGTC GGATCA
TCTT TTTT -(S)-3';配列番号5)、オリゴマー2(5'-(S) CCTCTTGGGA ACTGTGT
AGT ATT -3';配列番号6)および“オリゴマー3”(配列番号1;実施例1の遊
離チオール誘導体“TCUC”オリゴヌクレオチド)で示されるチオールを含む オリゴヌクレオチド分子を有する、シリコンウェハー表面上の4×4(16位置)
DNAアレイの概要図である。
ー表面上の16位置と共有結合する“オリゴマー1”(5'- CTGGATGCGTC GGATCA
TCTT TTTT -(S)-3';配列番号5)、オリゴマー2(5'-(S) CCTCTTGGGA ACTGTGT
AGT ATT -3';配列番号6)および“オリゴマー3”(配列番号1;実施例1の遊
離チオール誘導体“TCUC”オリゴヌクレオチド)で示されるチオールを含む オリゴヌクレオチド分子を有する、シリコンウェハー表面上の4×4(16位置)
DNAアレイの概要図である。
【図14】 図14は、図13のDNAハイブリダイゼーションアレイの個
々の16位置に特異的なオリゴヌクレオチドが、オリゴマー1に結合するオリゴ
マー1相補的オリゴヌクレオチド(5'-GATGATCCGA CGCATCAGAA TGT-3';配列番
号7)およびオリゴマー2に結合するオリゴマー2相補的オリゴヌクレオチド(5
'-AATACTACAC AG-3';配列番号8)およびオリゴマー3に結合するオリゴマー3
相補的オリゴヌクレオチド(5'-CCGGGTACCG AGCTCGAATT C-3';配列番号2)に ハイブリダイズする概要図である。
々の16位置に特異的なオリゴヌクレオチドが、オリゴマー1に結合するオリゴ
マー1相補的オリゴヌクレオチド(5'-GATGATCCGA CGCATCAGAA TGT-3';配列番
号7)およびオリゴマー2に結合するオリゴマー2相補的オリゴヌクレオチド(5
'-AATACTACAC AG-3';配列番号8)およびオリゴマー3に結合するオリゴマー3
相補的オリゴヌクレオチド(5'-CCGGGTACCG AGCTCGAATT C-3';配列番号2)に ハイブリダイズする概要図である。
【図15】 図15は、図15に図示するシリコンウェハー上の4×4(1 6位置)DNAアレイの典型的なMALDI-TOF質量スペクトルを示す。スペ
クトルは、特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに相当するそれぞれ
の位置での実験的な電荷に対する質量比の単一の優勢シグナルを示す。2+は、
MADLI-TOF MS分析の間の参照標準として使用する二倍電荷の分子の位
置を示す。*は、洗浄後のチップ表面に残る汚染オリゴヌクレオチドの残余量を
示す。*記号の相対的位置は、おおよその汚染オリゴヌクレオチドの大きさを示
す。
クトルは、特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに相当するそれぞれ
の位置での実験的な電荷に対する質量比の単一の優勢シグナルを示す。2+は、
MADLI-TOF MS分析の間の参照標準として使用する二倍電荷の分子の位
置を示す。*は、洗浄後のチップ表面に残る汚染オリゴヌクレオチドの残余量を
示す。*記号の相対的位置は、おおよその汚染オリゴヌクレオチドの大きさを示
す。
【図16】 図16は、8×8(64位置)DNAアレイの典型的なMALD
I-TOF質量スペクトルを示す。スペクトルは、予想される特異的ハイブリダ イズオリゴヌクレオチドの位置に相当する実験的な電荷に対する質量比の単一の
優勢シグナルを示す。*は、洗浄後のウェハー表面に残る汚染オリゴヌクレオチ
ドの残余量を示す。*記号の相対的位置は、おおよその汚染オリゴヌクレオチド
の大きさを示す。
I-TOF質量スペクトルを示す。スペクトルは、予想される特異的ハイブリダ イズオリゴヌクレオチドの位置に相当する実験的な電荷に対する質量比の単一の
優勢シグナルを示す。*は、洗浄後のウェハー表面に残る汚染オリゴヌクレオチ
ドの残余量を示す。*記号の相対的位置は、おおよその汚染オリゴヌクレオチド
の大きさを示す。
【図17】 図17は、55-merオリゴヌクレオチドが相補的25-me
rオリゴヌクレオチド(配列番号11)および相補的30-merオリゴヌクレオ チド(配列番号12)にハイブリダイズすることにより、集合するDNA分子(配 列番号10)のヌクレオチド配列を示す。生じた二本鎖DNAは、SP6プロモ ーター(配列番号10のnt1-18)をコードし、分子のコーディング鎖中、S P6プロモーターの転写開始位置からnt+7の位置において、単一のニックを
有する。ニックの位置およびSP6プロモーターの転写開始位置を示す。
rオリゴヌクレオチド(配列番号11)および相補的30-merオリゴヌクレオ チド(配列番号12)にハイブリダイズすることにより、集合するDNA分子(配 列番号10)のヌクレオチド配列を示す。生じた二本鎖DNAは、SP6プロモ ーター(配列番号10のnt1-18)をコードし、分子のコーディング鎖中、S P6プロモーターの転写開始位置からnt+7の位置において、単一のニックを
有する。ニックの位置およびSP6プロモーターの転写開始位置を示す。
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成12年2月14日(2000.2.14)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項43
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0004
【補正方法】変更
【補正内容】
【0004】 チェーンターミネーション法またはサンガー法は、DNA合成に基づいている
。一本鎖DNAを鋳型として用い、標識したプライマーを用い、相補鎖の形成を
開始する。合成反応は、4つのデオキシヌクレオチド(dNTP)、dATP、d
TTP、dCTPおよびdGTP、ならびに4つのジデオキシヌクレオチド(d dNTP)、ddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTPのうちの1 つの存在下に実施する。相補鎖は、ジデオキシヌクレオチドを伸張する鎖に加え
ることにより、完成前に終結する。4つのddNTPのうち1つをそれぞれ含む
4つの反応混合物で開始することにより、A、C、GおよびTで終結する鎖の群
を生ずる。各反応混合物をポリアクリルアミドゲルの1レーンで電気泳動し、断
片を分離すると、1塩基の長さで違いが生じる。
。一本鎖DNAを鋳型として用い、標識したプライマーを用い、相補鎖の形成を
開始する。合成反応は、4つのデオキシヌクレオチド(dNTP)、dATP、d
TTP、dCTPおよびdGTP、ならびに4つのジデオキシヌクレオチド(d dNTP)、ddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTPのうちの1 つの存在下に実施する。相補鎖は、ジデオキシヌクレオチドを伸張する鎖に加え
ることにより、完成前に終結する。4つのddNTPのうち1つをそれぞれ含む
4つの反応混合物で開始することにより、A、C、GおよびTで終結する鎖の群
を生ずる。各反応混合物をポリアクリルアミドゲルの1レーンで電気泳動し、断
片を分離すると、1塩基の長さで違いが生じる。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0007
【補正方法】変更
【補正内容】
【0007】 多くの使用できるシーケンシングストラテジーがある。ストラテジーの選択は
、DNAをシーケンスする目的およびシーケンスする前のDNAについての利用
し得る情報量に依存する。例えば、標的DNAを、特定の変異がDNA内に導入
されるていることを確認するためにシーケンスするならば、小領域のDNAをシ
ーケンスすることのみが必要となる。DNA断片は、配列を正確に決定しなけれ
ばならない未知の遺伝子または遺伝子部分であるならば、断片全体をシーケンス
する必要がある。シーケンスし得る断片の大きさは約400塩基が限界であるた
め、この大きさよりも長いDNA断片は切断しなければならない。切断はランダ
ムでよく、その後、標的DNAのセグメントのサブクローニングする。次いで、
オーバーラップする断片を含むサブクローニングした断片をシーケンスし、コン
ピュータープログラムで並べる(例えば、Staden(1986) Nucl. Acids Res. 14:21
7参照)。また、DNAを、オーバーラップする変異かネストする変異を生じ、そ
して、シーケンスすることにより、または他の整列アプローチにより、系統的に
サブクローニングし得る。
、DNAをシーケンスする目的およびシーケンスする前のDNAについての利用
し得る情報量に依存する。例えば、標的DNAを、特定の変異がDNA内に導入
されるていることを確認するためにシーケンスするならば、小領域のDNAをシ
ーケンスすることのみが必要となる。DNA断片は、配列を正確に決定しなけれ
ばならない未知の遺伝子または遺伝子部分であるならば、断片全体をシーケンス
する必要がある。シーケンスし得る断片の大きさは約400塩基が限界であるた
め、この大きさよりも長いDNA断片は切断しなければならない。切断はランダ
ムでよく、その後、標的DNAのセグメントのサブクローニングする。次いで、
オーバーラップする断片を含むサブクローニングした断片をシーケンスし、コン
ピュータープログラムで並べる(例えば、Staden(1986) Nucl. Acids Res. 14:21
7参照)。また、DNAを、オーバーラップする変異かネストする変異を生じ、そ
して、シーケンスすることにより、または他の整列アプローチにより、系統的に
サブクローニングし得る。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0008
【補正方法】変更
【補正内容】
【0008】 サンガーチェーンターミネーション法および他のシーケンシング方法は、標的
DNAを一本鎖ファージェベクターにクローニングすることによる、一本鎖鋳型
の使用に依存する。しかし、標的DNAのためベクターとしてプラスミドを使用
することは、多くの理由からファージDNAの使用よりも好ましく、それには、
種々の利用可能なプラスミド、プラスミドの操作容易性、およびファージベクタ
ーと比べて挿入DNAがプラスミド中でより安定であることを含む。したがって
、標的DNAを一本鎖ファージDNA以外のプラスミドDNAにクローニングす
るシーケンシング方法(例えば、Wallace et al., (1981) Gene 16:21-26; Guo e
t al., (1982) Nucl. Acids Res. 10:2065-2084;Vieira et al., (1982) Gene 1
9:259-268参照)が開発されている。
DNAを一本鎖ファージェベクターにクローニングすることによる、一本鎖鋳型
の使用に依存する。しかし、標的DNAのためベクターとしてプラスミドを使用
することは、多くの理由からファージDNAの使用よりも好ましく、それには、
種々の利用可能なプラスミド、プラスミドの操作容易性、およびファージベクタ
ーと比べて挿入DNAがプラスミド中でより安定であることを含む。したがって
、標的DNAを一本鎖ファージDNA以外のプラスミドDNAにクローニングす
るシーケンシング方法(例えば、Wallace et al., (1981) Gene 16:21-26; Guo e
t al., (1982) Nucl. Acids Res. 10:2065-2084;Vieira et al., (1982) Gene 1
9:259-268参照)が開発されている。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0009
【補正方法】変更
【補正内容】
【0009】 これらの方法は、同時に一本鎖標的DNAの配列決定するためにのみ設計され
る(例えば、Chen et al., (1985) DNA 4:165-170; Hattori et al., (1986) Ana
l. Biochem. 152:232-238; Mierendorf et al., (1987) Methods Enzymol. 152:
556;Mehra et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7013-7017参照)。 二本鎖DNAの使用により、一本鎖DNA断片のサブクローニングまたは単離が
避けられ、それはジデオキシ鎖ターミネーターシーケンシング反応を使用する。
しかし、二本鎖DNAの使用が制限される。それは、変性させた二重鎖DNAの
鋳型としての性質が悪いからである。結果として、これらの方法からは、一本鎖
ベクターにDNAをクローニングする方法により提供される程度の正確な配列デ
ータは得られなかった。
る(例えば、Chen et al., (1985) DNA 4:165-170; Hattori et al., (1986) Ana
l. Biochem. 152:232-238; Mierendorf et al., (1987) Methods Enzymol. 152:
556;Mehra et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7013-7017参照)。 二本鎖DNAの使用により、一本鎖DNA断片のサブクローニングまたは単離が
避けられ、それはジデオキシ鎖ターミネーターシーケンシング反応を使用する。
しかし、二本鎖DNAの使用が制限される。それは、変性させた二重鎖DNAの
鋳型としての性質が悪いからである。結果として、これらの方法からは、一本鎖
ベクターにDNAをクローニングする方法により提供される程度の正確な配列デ
ータは得られなかった。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0013
【補正方法】変更
【補正内容】
【0013】 シーケンシング方法論を用い、ヒトゲノム配列全体を最終的に決定する。ヒト
ゲノムDNAの完全配列の知識は、ヒトの疾患の理解、診断、防止、および処置
の助けとなる。適度な時間枠で、そして経済的な方法で、約30臆塩基対のヒト
ゲノムの配列決定を成功させるため、迅速で、信頼性があり、感度がよく、安価
な方法であることが必要とされている。
ゲノムDNAの完全配列の知識は、ヒトの疾患の理解、診断、防止、および処置
の助けとなる。適度な時間枠で、そして経済的な方法で、約30臆塩基対のヒト
ゲノムの配列決定を成功させるため、迅速で、信頼性があり、感度がよく、安価
な方法であることが必要とされている。
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0016
【補正方法】変更
【補正内容】
【0016】 本方法の実施では、プロモーターおよび操作可能となるようにプロモーターに
連結した標的核酸配列を含むDNA分子を、標的を含む一群のネストしたRNA
転写産物を生ずる条件下、プロモーターを認識するRNAポリメラーゼで転写す
る。転写産物の分子量を、マススペクトロメトリーで測定し、そして標的配列の
核酸配列を決定する。プロモーターおよび標的を含むDNA分子は、好ましくは
固定化されている。
連結した標的核酸配列を含むDNA分子を、標的を含む一群のネストしたRNA
転写産物を生ずる条件下、プロモーターを認識するRNAポリメラーゼで転写す
る。転写産物の分子量を、マススペクトロメトリーで測定し、そして標的配列の
核酸配列を決定する。プロモーターおよび標的を含むDNA分子は、好ましくは
固定化されている。
【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0018
【補正方法】変更
【補正内容】
【0018】 好ましい態様では、プロモーターを含む核酸は、3'末端の非コーディング鎖 または5'末端のコーディング鎖を介して固相と共有結合する。結合は、当業者 に既知の任意の方法を用い、例えばチオール結合を用いる。例えば、5'-または
3'-チオール酸化DNAを調製し、アミノシラン処置固体支持体に結合する。結
合は、直接か、またはリンカー基を介する。生じた固定化分子は好ましくはアレ
イ形に並べられる。
3'-チオール酸化DNAを調製し、アミノシラン処置固体支持体に結合する。結
合は、直接か、またはリンカー基を介する。生じた固定化分子は好ましくはアレ
イ形に並べられる。
【手続補正9】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0019
【補正方法】変更
【補正内容】
【0019】 プロモーターをコードしている二本鎖核酸分子は、任意の源から得られ、例え
ば細菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物および真核生物であり、または合
成プロトコールと合わせることができる。それを工作すると、生じた断片はコー
ディング(センス)鎖の3'末端に少なくとも5ヌクレオチドの一本鎖領域を含む 。この一本鎖領域を、シーケンスされる核酸領域または通常のオーバーラッピン
グ配列、例えば制限エンドヌクレアーゼ部位と相補的となるように設計する。
ば細菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物および真核生物であり、または合
成プロトコールと合わせることができる。それを工作すると、生じた断片はコー
ディング(センス)鎖の3'末端に少なくとも5ヌクレオチドの一本鎖領域を含む 。この一本鎖領域を、シーケンスされる核酸領域または通常のオーバーラッピン
グ配列、例えば制限エンドヌクレアーゼ部位と相補的となるように設計する。
【手続補正10】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0020
【補正方法】変更
【補正内容】
【0020】 シーケンスされる核酸領域を含む標的核酸は、一本鎖であるか二本鎖であるが
、一本鎖3'末端を含み、そして、プロモーターを含むDNAの相補的配列にハ イブリダイズする。ハイブリダイゼーションは固定化前または後何れかに行う。
2つの核酸分子のハイブリダイゼーションにより、1またはそれ以上の“ニック
”がハイブリッド中の隣接核酸分子のジャンクションの位置に導入される。ある
態様では、コーディングまたは非コーディング鎖、好ましくは、コーディング鎖
中のニックは、転写開始前に適当な核酸リガーゼの添加により連結される。
、一本鎖3'末端を含み、そして、プロモーターを含むDNAの相補的配列にハ イブリダイズする。ハイブリダイゼーションは固定化前または後何れかに行う。
2つの核酸分子のハイブリダイゼーションにより、1またはそれ以上の“ニック
”がハイブリッド中の隣接核酸分子のジャンクションの位置に導入される。ある
態様では、コーディングまたは非コーディング鎖、好ましくは、コーディング鎖
中のニックは、転写開始前に適当な核酸リガーゼの添加により連結される。
【手続補正11】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0021
【補正方法】変更
【補正内容】
【0021】 好ましくは、方法は、ネストしたRNA転写産物を生ずる任意の適当なストラ
テジーを採用する。好ましい方法は、修飾したサンガーシーケンシングストラテ
ジーに基づき、それは、RNAを用い、塩基特異的チェーンターミネーションに
より得られる一群のネストしたRNA転写産物を生じる。これらは、マススペク
トロメトリーにより分析される。修飾したギルバート-マキサムストラテジーも また考慮される。この方法において、転写産物は、塩基特異的RNaseを用い
切断され、塩基特異的に終結した断片を生じ、次いで、分子量はマススペクトロ
メトリーにより評価される。
テジーを採用する。好ましい方法は、修飾したサンガーシーケンシングストラテ
ジーに基づき、それは、RNAを用い、塩基特異的チェーンターミネーションに
より得られる一群のネストしたRNA転写産物を生じる。これらは、マススペク
トロメトリーにより分析される。修飾したギルバート-マキサムストラテジーも また考慮される。この方法において、転写産物は、塩基特異的RNaseを用い
切断され、塩基特異的に終結した断片を生じ、次いで、分子量はマススペクトロ
メトリーにより評価される。
【手続補正12】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0022
【補正方法】変更
【補正内容】
【0022】 転写は、適当なRNAポリメラーゼの添加により、リボヌクレオシド三リン酸
および選択された塩基特異的チェーンターミネイティング3'-デオキシリボヌク
レオシド三リン酸の存在下、プロモーターから開始される。好ましい態様では、
転写混合物はまた、修飾されたリボヌクレオシド三リン酸を含み、そして、リボ
ヌクレオチド類似体は、生ずるRNA転写産物の二次構造を減少し、および/ま
たはRNAポリメラーゼ酵素の終結およびターンオーバーの忠実性を増加し、そ
れによって分析に利用できるRNA転写産物の量が増加する。これら類似体には
、二次構造を減少させるイノシン5'-三リン酸(ITP)、RNAポリメラーゼ酵
素の終結およびターンオーバーの忠実性を増加しそれによって分析に利用可能な
RNA転写産物の量を増加する4-チオウリジン5'-三リン酸(UTP)および5-
ブロモUTPまたは5'-ヨードCTPが含まれるが、これらに限らない。生じた
RNA転写産物は、マススペクトロメトリーで分析する。
および選択された塩基特異的チェーンターミネイティング3'-デオキシリボヌク
レオシド三リン酸の存在下、プロモーターから開始される。好ましい態様では、
転写混合物はまた、修飾されたリボヌクレオシド三リン酸を含み、そして、リボ
ヌクレオチド類似体は、生ずるRNA転写産物の二次構造を減少し、および/ま
たはRNAポリメラーゼ酵素の終結およびターンオーバーの忠実性を増加し、そ
れによって分析に利用できるRNA転写産物の量が増加する。これら類似体には
、二次構造を減少させるイノシン5'-三リン酸(ITP)、RNAポリメラーゼ酵
素の終結およびターンオーバーの忠実性を増加しそれによって分析に利用可能な
RNA転写産物の量を増加する4-チオウリジン5'-三リン酸(UTP)および5-
ブロモUTPまたは5'-ヨードCTPが含まれるが、これらに限らない。生じた
RNA転写産物は、マススペクトロメトリーで分析する。
【手続補正13】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0023
【補正方法】変更
【補正内容】
【0023】 他の態様では、サンプルは、マトリクス利用レーザー吸収/イオン化マススペ
クトロメトリー(MALDI)による分析としてのマススペクトロメトリー用のマ
トリクス物質を更に含み、好ましくは、更に、飛行時間(TOF)分析に使用する
。核酸の配列は、4つのチェーンターミネイティング塩基をそれぞれ含むシーケ
ンシング反応から得られるチェーンターミネイテッドRNA転写産物の観察すべ
き質量を並べることにより得られる。
クトロメトリー(MALDI)による分析としてのマススペクトロメトリー用のマ
トリクス物質を更に含み、好ましくは、更に、飛行時間(TOF)分析に使用する
。核酸の配列は、4つのチェーンターミネイティング塩基をそれぞれ含むシーケ
ンシング反応から得られるチェーンターミネイテッドRNA転写産物の観察すべ
き質量を並べることにより得られる。
【手続補正14】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0027
【補正方法】変更
【補正内容】
【0027】 転写ターミネーターおよびアテニュエーター配列を同定する方法も提供される
。転写条件を修飾し、全長の転写産物を生ずることにより、rho-依存性およ びrho-独立性ターミネーターのような転写ターミネーター配列が、マススペ クトロメトリー法を用い、同定され得る。その方法の実施では、一本鎖領域であ
るシーケンスされる標的核酸の3'末端が、相補的配列と、プロモーターを含む 核酸プローブのコーディング鎖の3'末端でハイブリダイズする。好ましい態様 では、プロモーターを含む核酸は、非コーディング鎖の5'末端またはコーディ ング鎖の3'末端を介し、固体支持体と共有結合し、更に好ましくは、5'-また は3'-チオール酸化DNAは高密度でアミノシラン処理固体支持体と連結する。
連結はリンカー基の存在下または非存在下でされ得、好ましくはアレイ形に並べ
られる。
。転写条件を修飾し、全長の転写産物を生ずることにより、rho-依存性およ びrho-独立性ターミネーターのような転写ターミネーター配列が、マススペ クトロメトリー法を用い、同定され得る。その方法の実施では、一本鎖領域であ
るシーケンスされる標的核酸の3'末端が、相補的配列と、プロモーターを含む 核酸プローブのコーディング鎖の3'末端でハイブリダイズする。好ましい態様 では、プロモーターを含む核酸は、非コーディング鎖の5'末端またはコーディ ング鎖の3'末端を介し、固体支持体と共有結合し、更に好ましくは、5'-また は3'-チオール酸化DNAは高密度でアミノシラン処理固体支持体と連結する。
連結はリンカー基の存在下または非存在下でされ得、好ましくはアレイ形に並べ
られる。
【手続補正15】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0030
【補正方法】変更
【補正内容】
【0030】 本明細書で使用したように、“核酸”という語は、デオキシリボ核酸(DNA)
およびリボ核酸(RNA)のようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、
ならびにRNAまたはDNAの何れかの類似体について言及し、例えばそれはヌ
クレオチド類似体から作成され、何れの場合も一本鎖または二本鎖形であり、お
よびプロテイン核酸(protein nucleic acid)(PNA)でもある。核酸分子は、合
成し得るか、または特に生体サンプルから、当分野に既知の任意の多くの方法を
用い単離することができ、選択する特定の方法を特定の生体サンプルにあわせる
。
およびリボ核酸(RNA)のようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、
ならびにRNAまたはDNAの何れかの類似体について言及し、例えばそれはヌ
クレオチド類似体から作成され、何れの場合も一本鎖または二本鎖形であり、お
よびプロテイン核酸(protein nucleic acid)(PNA)でもある。核酸分子は、合
成し得るか、または特に生体サンプルから、当分野に既知の任意の多くの方法を
用い単離することができ、選択する特定の方法を特定の生体サンプルにあわせる
。
【手続補正16】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0033
【補正方法】変更
【補正内容】
【0033】 他に核酸プロモーター含有プローブの一本鎖領域は、非コーディング(アンチ センス)鎖(プロモーターに関連する)の5'末端に少なくとも約5ヌクレオチドを
含み、そのヌクレオチドは標的核酸のコーディング鎖の5'末端の少なくとも約 5つのヌクレオチドに相補的である。この態様では、標的は二本鎖でなければな
らない。ハイブリダイゼーション後、生じた分子はコーディングおよび非コーデ
ィング鎖中にニックを有する。
含み、そのヌクレオチドは標的核酸のコーディング鎖の5'末端の少なくとも約 5つのヌクレオチドに相補的である。この態様では、標的は二本鎖でなければな
らない。ハイブリダイゼーション後、生じた分子はコーディングおよび非コーデ
ィング鎖中にニックを有する。
【手続補正17】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0035
【補正方法】変更
【補正内容】
【0035】 本明細書中で使用するとき、標的核酸はシーケンスされた核酸分子である。巨
大分子の一部であり得る。標的核酸を含む分子は、少なくとも約5ヌクレオチド
であって、プロモーターを含む捕捉プローブにおいて3'末端(または選択された
配置に依存する5'末端)でオーバーハングする少なくとも5つの隣接ヌクレオチ
ドと十分に相補的となるように配列が設計されたヌクレオチドを含み得るか、当
該ヌクレオチドを含むように修飾され得る。標的核酸は二本鎖であって、3'ま たは5'一本鎖オーバーハングであるかまたは一本鎖であり得る。RNAポリメ ラーゼは、特に、三重複合体が一旦形成されると、一本鎖分子を転写できるか、
または転写する。標的はまた、RNAまたはPNAでもよい(アミノ酸バックボ ーンに塩基を結合することにより形成されるタンパク質核酸;例えばNielsen et
al., (1991) Science 254; 1497参照)。
大分子の一部であり得る。標的核酸を含む分子は、少なくとも約5ヌクレオチド
であって、プロモーターを含む捕捉プローブにおいて3'末端(または選択された
配置に依存する5'末端)でオーバーハングする少なくとも5つの隣接ヌクレオチ
ドと十分に相補的となるように配列が設計されたヌクレオチドを含み得るか、当
該ヌクレオチドを含むように修飾され得る。標的核酸は二本鎖であって、3'ま たは5'一本鎖オーバーハングであるかまたは一本鎖であり得る。RNAポリメ ラーゼは、特に、三重複合体が一旦形成されると、一本鎖分子を転写できるか、
または転写する。標的はまた、RNAまたはPNAでもよい(アミノ酸バックボ ーンに塩基を結合することにより形成されるタンパク質核酸;例えばNielsen et
al., (1991) Science 254; 1497参照)。
【手続補正18】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0037
【補正方法】変更
【補正内容】
【0037】 本明細書中で使用するとき、塩基特異的に終結するリボヌクレオチドは、転写
の際の組込みおいて、転写終結を生ずるヌクレオチドを生成するものである。塩
基特異的に終結するリボヌクレオシド三リン酸は、塩基特異的に終結するリボヌ
クレオチドを合成するものであって、当業者に既知である。塩基特異的に終結す
るリボヌクレオシド三リン酸の例は、3'-dGTPのような3'-デオキシリボヌ
クレオシド三リン酸および本明細書に記載する他のものおよび当業者に既知の他
のものを含むがこれらに限らない。
の際の組込みおいて、転写終結を生ずるヌクレオチドを生成するものである。塩
基特異的に終結するリボヌクレオシド三リン酸は、塩基特異的に終結するリボヌ
クレオチドを合成するものであって、当業者に既知である。塩基特異的に終結す
るリボヌクレオシド三リン酸の例は、3'-dGTPのような3'-デオキシリボヌ
クレオシド三リン酸および本明細書に記載する他のものおよび当業者に既知の他
のものを含むがこれらに限らない。
【手続補正19】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0039
【補正方法】変更
【補正内容】
【0039】 本明細書中で使用するとき、ミスマッチの割合の測定におけるハイブリダイゼ
ーションの緊縮は以下の通りである。 1)高緊縮:0.1xSSPE、0.1%SDS、65℃ 2)中緊縮:0.2xSSPE、0.1%SDS、50℃ 3)低緊縮:1.0xSSPE、0.1%SDS、50℃ 同等の緊縮が、他の緩衝液、塩および温度を用いて達成することができると理解
される。
ーションの緊縮は以下の通りである。 1)高緊縮:0.1xSSPE、0.1%SDS、65℃ 2)中緊縮:0.2xSSPE、0.1%SDS、50℃ 3)低緊縮:1.0xSSPE、0.1%SDS、50℃ 同等の緊縮が、他の緩衝液、塩および温度を用いて達成することができると理解
される。
【手続補正20】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0041
【補正方法】変更
【補正内容】
【0041】 “架橋剤”という語は技術的に理解されており、本明細書中で使用するとき、
核酸を不溶性支持体に、好ましくは共有結合を介して固定化する試薬について言
及する。したがって、本明細書中で使用する適当な“架橋剤”は、不溶性支持体
の表面上に存在する官能基および核酸分子中に存在する官能基と反応することが
できる多様な試薬を含む。その反応ができる試薬にはホモ-およびヘテロ-二機能
性(bifunctional)試薬、当分野に既知の多くのものを含む。ヘテロ二機能性試薬
が好ましい。
核酸を不溶性支持体に、好ましくは共有結合を介して固定化する試薬について言
及する。したがって、本明細書中で使用する適当な“架橋剤”は、不溶性支持体
の表面上に存在する官能基および核酸分子中に存在する官能基と反応することが
できる多様な試薬を含む。その反応ができる試薬にはホモ-およびヘテロ-二機能
性(bifunctional)試薬、当分野に既知の多くのものを含む。ヘテロ二機能性試薬
が好ましい。
【手続補正21】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0045
【補正方法】変更
【補正内容】
【0045】 本明細書中で使用するとき、“サンプル”は、検出される物質を含む組成物に
ついて言及する。好ましい態様では、サンプルは“生体サンプル”であって、そ
れは、動物、特にヒトを含む哺乳類、植物、細菌、カビ、原生生物およびウイル
スを含むがこれらに限らない生物から得られる任意の物質について言及する。生
体サンプルは任意の形態であり得、組織、細胞および生検物質のような固体物質
、ならびに尿、血液、唾液、羊水、脳髄液および含嗽液(口内細胞を含む)を含む
体液を含む。好ましくは、固体物質は液体と混合される。
ついて言及する。好ましい態様では、サンプルは“生体サンプル”であって、そ
れは、動物、特にヒトを含む哺乳類、植物、細菌、カビ、原生生物およびウイル
スを含むがこれらに限らない生物から得られる任意の物質について言及する。生
体サンプルは任意の形態であり得、組織、細胞および生検物質のような固体物質
、ならびに尿、血液、唾液、羊水、脳髄液および含嗽液(口内細胞を含む)を含む
体液を含む。好ましくは、固体物質は液体と混合される。
【手続補正22】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0046
【補正方法】変更
【補正内容】
【0046】 本明細書中で使用するとき、“基体”または“固体支持体”は、サンプルが本
明細書に記載の物質のように沈殿する不溶性支持体を意味する。適当な基体の例
は、シリカゲルを含む(これに限らない)ビーズ、調節細孔ガラス(controlled po
re glass)、磁石、デキストラン、アガロースおよびセルロース、キャピラリー 、ガラスファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、ア ルミニウム、銅およびシリコン)、マルチウェルプレートを含むプラスチック物 質または膜(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニル インデンジフルオリド)のような平坦支持体、ピン、コンビナトリアル合成(comb
inatorial synthesis)もしくは分析に適当なピンのアレイのようなもの、または
ウェハー、特にシリコンウェハーのような平坦表面のピン中のビーズ(プレート を有するかまたは有しない)を含む。
明細書に記載の物質のように沈殿する不溶性支持体を意味する。適当な基体の例
は、シリカゲルを含む(これに限らない)ビーズ、調節細孔ガラス(controlled po
re glass)、磁石、デキストラン、アガロースおよびセルロース、キャピラリー 、ガラスファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、ア ルミニウム、銅およびシリコン)、マルチウェルプレートを含むプラスチック物 質または膜(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニル インデンジフルオリド)のような平坦支持体、ピン、コンビナトリアル合成(comb
inatorial synthesis)もしくは分析に適当なピンのアレイのようなもの、または
ウェハー、特にシリコンウェハーのような平坦表面のピン中のビーズ(プレート を有するかまたは有しない)を含む。
【手続補正23】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0047
【補正方法】変更
【補正内容】
【0047】 本明細書中で使用するとき、RNAポリメラーゼは、DNA依存RNAポリメ
ラーゼおよびRNA依存RNAポリメラーゼにつて言及する。任意のRNAポリ
メラーゼは、特定プロモーター配列を認識し、転写開始およびRNA転写物の伸
張が可能であり、それらが本明細書の範囲となることを目的とする。本明細書で
提供される方法で使用する典型的なRNAポリメラーゼは、1)Halobacterium、
Methanobacterium、Methanococcus、SulfolobalesおよびThermoplasmaのような 古細菌、2)グラム陰性細菌、例えばEscherichia coliおよびSalmonellaおよびS
higella、グラム陽性細菌、例えばBacillus subtilisおよびStaphlococcus aure
usのような真正細菌、3)T7、T3、SP6、ニックの入ったSP6およびN 4のようなバクテリオファージ、4)DNAウイルス、5)インフルエンザウイル
スのようなRNAウイルス、6)小麦のような植物、ならびに7)カビから単離し
た真核性RNAポリメラーゼII、例えばSaccharomyces cerevisiaeおよび高等真
核生物、例えば哺乳類から得られるがこれらに限らないものを含む。RNAファ
ージQβレプリカーゼ(国際PCT出願番号PCT/US87/00880および5,270,184)は 本明細書中で使用するRNAポリメラーゼの語の範囲に含まれている。植物およ
び動物を含む真核組織から単離されるものといった真核性RNAポリメラーゼは
、真核性細胞に感染するウイルス由来のウイルス性プロモーターを含む真核性プ
ロモーターを認識する。そのポリメラーゼをも本明細書の目的とする。T7、T
3、およびSP6RNAポリメラーゼはクローニングされており、配列およびそ
れを精製する方法ならびに細菌性RNAポリメラーゼを精製する方法および真核
性DNA依存RNAポリメラーゼは既知である。加えて、多くのRNAポリメラ
ーゼが、商業上多量に利用可能であり、商業的に利用可能なベクターから簡単に
作成することも可能である。上記ポリメラーゼおよび他のRNAポリメラーゼ、
それぞれ用のプロモーターの配列もまた当業者に既知である。
ラーゼおよびRNA依存RNAポリメラーゼにつて言及する。任意のRNAポリ
メラーゼは、特定プロモーター配列を認識し、転写開始およびRNA転写物の伸
張が可能であり、それらが本明細書の範囲となることを目的とする。本明細書で
提供される方法で使用する典型的なRNAポリメラーゼは、1)Halobacterium、
Methanobacterium、Methanococcus、SulfolobalesおよびThermoplasmaのような 古細菌、2)グラム陰性細菌、例えばEscherichia coliおよびSalmonellaおよびS
higella、グラム陽性細菌、例えばBacillus subtilisおよびStaphlococcus aure
usのような真正細菌、3)T7、T3、SP6、ニックの入ったSP6およびN 4のようなバクテリオファージ、4)DNAウイルス、5)インフルエンザウイル
スのようなRNAウイルス、6)小麦のような植物、ならびに7)カビから単離し
た真核性RNAポリメラーゼII、例えばSaccharomyces cerevisiaeおよび高等真
核生物、例えば哺乳類から得られるがこれらに限らないものを含む。RNAファ
ージQβレプリカーゼ(国際PCT出願番号PCT/US87/00880および5,270,184)は 本明細書中で使用するRNAポリメラーゼの語の範囲に含まれている。植物およ
び動物を含む真核組織から単離されるものといった真核性RNAポリメラーゼは
、真核性細胞に感染するウイルス由来のウイルス性プロモーターを含む真核性プ
ロモーターを認識する。そのポリメラーゼをも本明細書の目的とする。T7、T
3、およびSP6RNAポリメラーゼはクローニングされており、配列およびそ
れを精製する方法ならびに細菌性RNAポリメラーゼを精製する方法および真核
性DNA依存RNAポリメラーゼは既知である。加えて、多くのRNAポリメラ
ーゼが、商業上多量に利用可能であり、商業的に利用可能なベクターから簡単に
作成することも可能である。上記ポリメラーゼおよび他のRNAポリメラーゼ、
それぞれ用のプロモーターの配列もまた当業者に既知である。
【手続補正24】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0049
【補正方法】変更
【補正内容】
【0049】 本明細書中で使用するとき、“プロモーターを含む核酸”は、RNAポリメラ
ーゼ分子の特異的結合を指示するヌクレオチドの配列を含む核酸であり、二本鎖
DNAに結合し解離し、リボヌクレオチド三リン酸の存在下RNA合成を開始し
得るオープン転写開始複合体(open transcription initiation complex)を形成 する。更に、機能性(functional)プロモーター配列は、DNA依存RNAポリメ
ラーゼが結合、解離、開始複合体の形成および転写開始するヌクレオチドの配列
である。プロモーターを含む核酸捕捉プローブは、プロモーター領域、および標
的核酸が特に高緊縮条件下ハイブリダイズする少なくとも約5つのヌクレオチド
の3'オーバーハングを含む二本鎖分子について言及する。典型的に、そのハイ ブリダイゼーションは、標的とプロモーターを含む捕捉プローブとの間で同一の
約5つの隣接塩基対を必要とする。転写開始後、RNAポリメラーゼ(またはそ のサブユニット)は、ポリメラーゼ、DNAおよび発生RNA転写産物を含む三 重複合体の一部である。
ーゼ分子の特異的結合を指示するヌクレオチドの配列を含む核酸であり、二本鎖
DNAに結合し解離し、リボヌクレオチド三リン酸の存在下RNA合成を開始し
得るオープン転写開始複合体(open transcription initiation complex)を形成 する。更に、機能性(functional)プロモーター配列は、DNA依存RNAポリメ
ラーゼが結合、解離、開始複合体の形成および転写開始するヌクレオチドの配列
である。プロモーターを含む核酸捕捉プローブは、プロモーター領域、および標
的核酸が特に高緊縮条件下ハイブリダイズする少なくとも約5つのヌクレオチド
の3'オーバーハングを含む二本鎖分子について言及する。典型的に、そのハイ ブリダイゼーションは、標的とプロモーターを含む捕捉プローブとの間で同一の
約5つの隣接塩基対を必要とする。転写開始後、RNAポリメラーゼ(またはそ のサブユニット)は、ポリメラーゼ、DNAおよび発生RNA転写産物を含む三 重複合体の一部である。
【手続補正25】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0053
【補正方法】変更
【補正内容】
【0053】 本明細書中で使用するとき、“コンディショニング”は、質量分析前に、分析
する核酸を修飾し、例えば気化(volatization)に必要なレーザーエネルギーを減
少させ、および/または断片化を最少とするプロセスについて言及する。コンデ
ィショニングは、核酸、好ましくは固定化後行われ得る。コンディショニングの
例は、例えば陽イオン交換による核酸分子のホスホジエステルバックボーンの修
飾であり、それによって、ヌクレオチド単位あたりの結合する陽イオンにおける
不均一により広がるピークが除去される。核酸分子を、アルキルヨウ化物、ヨー
ドアセトアミド、ヨードエタノール、または2,3-エポキシ-1-プロパノールの
ようなアルキル化剤と接触することにより、核酸分子のモノチオホスホジエステ
ル結合はホスホトリエステル結合に変換する。同様に、ホスホジエステル結合を
、トリアルキルシリルクロリドを用い変換すると非電荷誘導体を生ずる。コンデ
ィショニングはまた、合成の間に修飾ヌクレオチドを核酸に組込むことにより行
い得る。その修飾ヌクレオチドは、N5-、N7-またはN9-デアザプリンヌク レオチドまたはリボヌクレオチドのようなプリン類似体により、脱プリン化の感
度の減少(MS間の断片化)に使用し得る。修飾ヌクレオチドはまた、アルキル化
する、RNAビルディングブロック、オリゴヌクレオチドトリエステル、ホスホ
ロチオネート機能、またはPNAのような偽オリゴヌクレオチドを含み得る。修
飾ヌクレオチドを有するコンディショニングしたRNA転写産物の調製では、選
択されたRNAポリメラーゼが、修飾ヌクレオチドをRNA転写産物中に組込め
なければならない。
する核酸を修飾し、例えば気化(volatization)に必要なレーザーエネルギーを減
少させ、および/または断片化を最少とするプロセスについて言及する。コンデ
ィショニングは、核酸、好ましくは固定化後行われ得る。コンディショニングの
例は、例えば陽イオン交換による核酸分子のホスホジエステルバックボーンの修
飾であり、それによって、ヌクレオチド単位あたりの結合する陽イオンにおける
不均一により広がるピークが除去される。核酸分子を、アルキルヨウ化物、ヨー
ドアセトアミド、ヨードエタノール、または2,3-エポキシ-1-プロパノールの
ようなアルキル化剤と接触することにより、核酸分子のモノチオホスホジエステ
ル結合はホスホトリエステル結合に変換する。同様に、ホスホジエステル結合を
、トリアルキルシリルクロリドを用い変換すると非電荷誘導体を生ずる。コンデ
ィショニングはまた、合成の間に修飾ヌクレオチドを核酸に組込むことにより行
い得る。その修飾ヌクレオチドは、N5-、N7-またはN9-デアザプリンヌク レオチドまたはリボヌクレオチドのようなプリン類似体により、脱プリン化の感
度の減少(MS間の断片化)に使用し得る。修飾ヌクレオチドはまた、アルキル化
する、RNAビルディングブロック、オリゴヌクレオチドトリエステル、ホスホ
ロチオネート機能、またはPNAのような偽オリゴヌクレオチドを含み得る。修
飾ヌクレオチドを有するコンディショニングしたRNA転写産物の調製では、選
択されたRNAポリメラーゼが、修飾ヌクレオチドをRNA転写産物中に組込め
なければならない。
【手続補正26】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0054
【補正方法】変更
【補正内容】
【0054】 シーケンシングの方法 核酸をシーケンスする質量分析法を提供する。特に、シーケンスする方法は、
プロモーターをコードする二本鎖領域および標的核酸の相補的領域とハイブリダ
イズする一本鎖領域を含む、核酸を含むプローブを用いる。核酸プロモーターを
含む捕捉プローブは、好ましくは固体支持体に固定化される。一本鎖領域は、シ
ーケンスされる核酸およびプローブの5隣接一本鎖ヌクレオチドと同一の一本鎖
領域の少なくとも5ヌクレオチドを含む、標的核酸の相補的領域とハイブリダイ
ズする。
プロモーターをコードする二本鎖領域および標的核酸の相補的領域とハイブリダ
イズする一本鎖領域を含む、核酸を含むプローブを用いる。核酸プロモーターを
含む捕捉プローブは、好ましくは固体支持体に固定化される。一本鎖領域は、シ
ーケンスされる核酸およびプローブの5隣接一本鎖ヌクレオチドと同一の一本鎖
領域の少なくとも5ヌクレオチドを含む、標的核酸の相補的領域とハイブリダイ
ズする。
【手続補正27】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0056
【補正方法】変更
【補正内容】
【0056】 DNAは時折、シーケンシングに好ましい媒体である一方、本明細書の方法は
により、RNA転写産物をシーケンスする。RNA断片は、マトリクスアシスト
レーザー吸収/イオン化(MALDI)マススペクトロメトリーの間、DNA断片 よりも安定する。理論によると結合しないが、促進された安定性は、RNAの糖
部分の2'-ヒドロキシル基の存在により生じ、MALDIプロセスの間、脱プリ
ン化の減少を助ける。
により、RNA転写産物をシーケンスする。RNA断片は、マトリクスアシスト
レーザー吸収/イオン化(MALDI)マススペクトロメトリーの間、DNA断片 よりも安定する。理論によると結合しないが、促進された安定性は、RNAの糖
部分の2'-ヒドロキシル基の存在により生じ、MALDIプロセスの間、脱プリ
ン化の減少を助ける。
【手続補正28】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0057
【補正方法】変更
【補正内容】
【0057】 RNAポリメラーゼおよびプロモーター RNA分子のインビトロの転写を目的とし得る任意のRNAポリメラーゼは、
本明細書に記載の方法で使用することを目的とする。好ましいRNAポリメラー
ゼは、DNA依存RNAポリメラーゼである。RNAポリメラーゼ分子を単離し
および精製する方法は、当業者に既知である:Qβレプリカーゼ(例えば米国特 許番号5,696,249、再発行:35,443およびProcedures in Nucl. Acids Reseach,
Cantoni and Davies, eds., Volume 2, pp. 829-839, Harper and Rowe, NY中の
Eoyang et al., (1971)参照);細菌(例えばE.coli、Burgess and Jendrisak(197
5)Biochemistry 14:4634-4638およびHager et al., (1990)Biochemistry 29:789
0-7894参照;Leishmania、例えばSadhukhan et al., (1997)Mol. Cell. Biochem
. 171; 105-114;Bacillus subtilis、Giacomoni(1980)Eur. J. Biochem. 106:5
79-591);ファージ(例えば、T7、McDonnell et al., (1977)J. Mol. Biol. 89:7
19-736およびStudier et al., (1969) Virology 39:562-574;またHe et al., (1
997) Protein Expr. Purif. 9:142-151);ウイルス(例えば、rhabdovirus、Das
et al., (1996) Methods Enzymol. 275:99-122参照;turnip mosiac virus, Dei
dman et al., (1997)J.Viral Meth. 64:184-195参照;vaccinia、Gershon et al.
, (1996)Methods Enzymol. 275:35-57);哺乳類(例えば、yeast polII, Koleske
et al., (1996)Methods Enzymol. 273:176-184;ヒトpolII、Maldonado et al.,
(1996) Methods Enzymol. 274:72-100)。加えて、多くの原核、真核、バクテリ
オファージおよびウイルスRNAポリメラーゼ、例えばT3、T7およびSP6
は、商業上利用可能であり(例えば、Stratage, La Jolla, CA; Boehringer Mann
heim, Indianapolis, IN;Pharmacia, Uppsala, Sweden;およびSigma Chemical C
orp, St. Louis, MO)、および/または既知である。プロモーターも既知であり 、容易に利用可能である(例えば、Promega, Madison WIより利用できるpGEM
プラスミドシリーズ、米国特許番号4,766,072も参照。それはpGEMプラスミ ドの構成について記載されている)。
本明細書に記載の方法で使用することを目的とする。好ましいRNAポリメラー
ゼは、DNA依存RNAポリメラーゼである。RNAポリメラーゼ分子を単離し
および精製する方法は、当業者に既知である:Qβレプリカーゼ(例えば米国特 許番号5,696,249、再発行:35,443およびProcedures in Nucl. Acids Reseach,
Cantoni and Davies, eds., Volume 2, pp. 829-839, Harper and Rowe, NY中の
Eoyang et al., (1971)参照);細菌(例えばE.coli、Burgess and Jendrisak(197
5)Biochemistry 14:4634-4638およびHager et al., (1990)Biochemistry 29:789
0-7894参照;Leishmania、例えばSadhukhan et al., (1997)Mol. Cell. Biochem
. 171; 105-114;Bacillus subtilis、Giacomoni(1980)Eur. J. Biochem. 106:5
79-591);ファージ(例えば、T7、McDonnell et al., (1977)J. Mol. Biol. 89:7
19-736およびStudier et al., (1969) Virology 39:562-574;またHe et al., (1
997) Protein Expr. Purif. 9:142-151);ウイルス(例えば、rhabdovirus、Das
et al., (1996) Methods Enzymol. 275:99-122参照;turnip mosiac virus, Dei
dman et al., (1997)J.Viral Meth. 64:184-195参照;vaccinia、Gershon et al.
, (1996)Methods Enzymol. 275:35-57);哺乳類(例えば、yeast polII, Koleske
et al., (1996)Methods Enzymol. 273:176-184;ヒトpolII、Maldonado et al.,
(1996) Methods Enzymol. 274:72-100)。加えて、多くの原核、真核、バクテリ
オファージおよびウイルスRNAポリメラーゼ、例えばT3、T7およびSP6
は、商業上利用可能であり(例えば、Stratage, La Jolla, CA; Boehringer Mann
heim, Indianapolis, IN;Pharmacia, Uppsala, Sweden;およびSigma Chemical C
orp, St. Louis, MO)、および/または既知である。プロモーターも既知であり 、容易に利用可能である(例えば、Promega, Madison WIより利用できるpGEM
プラスミドシリーズ、米国特許番号4,766,072も参照。それはpGEMプラスミ ドの構成について記載されている)。
【手続補正29】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0058
【補正方法】変更
【補正内容】
【0058】 方法の実施において、DNA依存RNAポリメラーゼおよびRNA依存RNA
ポリメラーゼを使用し得る。例えば、本明細書中で提供される方法に使用し得る
RNAポリメラーゼには、1)Halobacterium、Methanobacterium、Methanococcu
s、SulfolobalesおよびThermoplasmaのような古細菌、2)グラム陰性細菌、例え
ばEscherichia coliおよびSalmonellaおよびShigella、グラム陽性細菌、例えば
Bacillus subtilisおよびStaphlococcus aureusのような真正細菌、3)T7、T
3、SP6およびN4のようなバクテリオファージ、4)DNAウイルス、5)イ
ンフルエンザウイルスのようなRNAウイルス、6)小麦のような植物および植 物ウイルスおよびカブモザイクウイルス、ならびに7)カビから単離した真核性 RNAポリメラーゼII、例えばSaccharomyces cerevisiaeおよび高等真核生物、
例えば哺乳類(再検討のため、RNA Polymerase and the Regulation of Transcri
ption, Reznikoff et al., eds, Elsevier, NY参照)から得られたものを含むが これらに限らない。また、本明細書での使用に含まれるのは、QβRNAファー
ジのQβレプリカーゼである(例えば、米国特許番号5,670,353、5,696,249およ び再発行:35,443参照)。
ポリメラーゼを使用し得る。例えば、本明細書中で提供される方法に使用し得る
RNAポリメラーゼには、1)Halobacterium、Methanobacterium、Methanococcu
s、SulfolobalesおよびThermoplasmaのような古細菌、2)グラム陰性細菌、例え
ばEscherichia coliおよびSalmonellaおよびShigella、グラム陽性細菌、例えば
Bacillus subtilisおよびStaphlococcus aureusのような真正細菌、3)T7、T
3、SP6およびN4のようなバクテリオファージ、4)DNAウイルス、5)イ
ンフルエンザウイルスのようなRNAウイルス、6)小麦のような植物および植 物ウイルスおよびカブモザイクウイルス、ならびに7)カビから単離した真核性 RNAポリメラーゼII、例えばSaccharomyces cerevisiaeおよび高等真核生物、
例えば哺乳類(再検討のため、RNA Polymerase and the Regulation of Transcri
ption, Reznikoff et al., eds, Elsevier, NY参照)から得られたものを含むが これらに限らない。また、本明細書での使用に含まれるのは、QβRNAファー
ジのQβレプリカーゼである(例えば、米国特許番号5,670,353、5,696,249およ び再発行:35,443参照)。
【手続補正30】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0059
【補正方法】変更
【補正内容】
【0059】 シーケンスされる核酸および鋳型に適当なRNAポリメラーゼの選択は、技術
者の技術の範囲内であり、シーケンスされる核酸分子および選択されたプロモー
ター領域により変化する。その選択は、当業者に既知の教えに従い経験的に決定
でき、それらには本明細書に記載のものを含む。シーケンスされる好ましい核酸
分子はDNA分子である。RNAおよび、特にPNA(タンパク質核酸)はまた、
適当なRNAポリメラーゼの選択に応じてシーケンシングに影響を与える。
者の技術の範囲内であり、シーケンスされる核酸分子および選択されたプロモー
ター領域により変化する。その選択は、当業者に既知の教えに従い経験的に決定
でき、それらには本明細書に記載のものを含む。シーケンスされる好ましい核酸
分子はDNA分子である。RNAおよび、特にPNA(タンパク質核酸)はまた、
適当なRNAポリメラーゼの選択に応じてシーケンシングに影響を与える。
【手続補正31】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0060
【補正方法】変更
【補正内容】
【0060】 本明細書に記載したシーケンシング方法に使用する核酸プロモーター含有プロ
ーブ、それぞれにはプロモーターを含む。本明細書の方法に使用するプロモータ
ーは任意の源から得られ得、選択されたRNAポリメラーゼにより認識される配
列を基にして合成的に調製され得る。例えば、プロモーターを含む核酸は、細菌
、ウイルス、ファージおよび真核生物のような多種多様な生物から、クローニン
グにより直接得られるか、または商業的に利用可能な発現ベクターから直接得ら
れる(例えば、Boehringer MannheimおよびPharmaciaのT7、T3、SP6およ びλPLおよびλPRプロモーター;blaまたはlacプロモーター、RSV
-LTRプロモーターおよびF9-1プロモーター;Stratageneより)。適当なプ ロモーターの選択は、シーケンスされる核酸、シーケンシングの条件、および最
も重要であるのは転写用に選択するRNAポリメラーゼに依存する。
ーブ、それぞれにはプロモーターを含む。本明細書の方法に使用するプロモータ
ーは任意の源から得られ得、選択されたRNAポリメラーゼにより認識される配
列を基にして合成的に調製され得る。例えば、プロモーターを含む核酸は、細菌
、ウイルス、ファージおよび真核生物のような多種多様な生物から、クローニン
グにより直接得られるか、または商業的に利用可能な発現ベクターから直接得ら
れる(例えば、Boehringer MannheimおよびPharmaciaのT7、T3、SP6およ びλPLおよびλPRプロモーター;blaまたはlacプロモーター、RSV
-LTRプロモーターおよびF9-1プロモーター;Stratageneより)。適当なプ ロモーターの選択は、シーケンスされる核酸、シーケンシングの条件、および最
も重要であるのは転写用に選択するRNAポリメラーゼに依存する。
【手続補正32】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0062
【補正方法】変更
【補正内容】
【0062】 核酸プロモーター含有プローブの固定化 好ましい態様では、核酸プロモーター含有プローブを、直接か、架橋剤により
、本明細書中で提供する固体支持体に固定化する。プローブを、標的とハイブリ
ダイズする前、またはハイブリダイズした後、固定化し得る。好ましくは、そし
て、最も都合よくは、ハイブリダイゼーションは固体支持体に固定化した後行う
。プローブは、好ましくはコーディング鎖の5'末端または非コーディング鎖の 3'末端を介し固定化される。
、本明細書中で提供する固体支持体に固定化する。プローブを、標的とハイブリ
ダイズする前、またはハイブリダイズした後、固定化し得る。好ましくは、そし
て、最も都合よくは、ハイブリダイゼーションは固体支持体に固定化した後行う
。プローブは、好ましくはコーディング鎖の5'末端または非コーディング鎖の 3'末端を介し固定化される。
【手続補正33】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0063
【補正方法】変更
【補正内容】
【0063】 他の態様では、プロモーターおよび下流標的核酸を、転写単位として、ゲノム
DNAから、プライマーによる増幅またはハイブリダイゼーションクローニング
技術により、単離することができる。次いで、プロモーターおよび標的をコード
するDNAを、コーディング鎖(センス鎖)の5'末端または非コーディング鎖の 3'末端の終端ヌクレオチドを介し固体支持体に固定化し得る。更に以下で考察 するように、連結基をPCRプライマーに組込み、固相への有向固定化を行うプ
ロモーター含有核酸鋳型の単離に使用し得る。プロモーターを認識する適当なR
NAポリメラーゼの使用により、チェーンターミネイティングヌクレオチドが存
在下で、シーケンスを決定できる一群のネストした断片が生ずる。
DNAから、プライマーによる増幅またはハイブリダイゼーションクローニング
技術により、単離することができる。次いで、プロモーターおよび標的をコード
するDNAを、コーディング鎖(センス鎖)の5'末端または非コーディング鎖の 3'末端の終端ヌクレオチドを介し固体支持体に固定化し得る。更に以下で考察 するように、連結基をPCRプライマーに組込み、固相への有向固定化を行うプ
ロモーター含有核酸鋳型の単離に使用し得る。プロモーターを認識する適当なR
NAポリメラーゼの使用により、チェーンターミネイティングヌクレオチドが存
在下で、シーケンスを決定できる一群のネストした断片が生ずる。
【手続補正34】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0065
【補正方法】変更
【補正内容】
【0065】 架橋試薬を用いない方法の態様では、修飾核酸は、直接、適当な機能化表面と
反応し、固定化核酸を生ずる。そのため、例えば、ヨードアセチル修飾表面(ま たは他のチオール反応性表面機能)は、チオール修飾核酸と反応し、固定化核酸 を提供することができる。
反応し、固定化核酸を生ずる。そのため、例えば、ヨードアセチル修飾表面(ま たは他のチオール反応性表面機能)は、チオール修飾核酸と反応し、固定化核酸 を提供することができる。
【手続補正35】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0067
【補正方法】変更
【補正内容】
【0067】 修飾核酸プロモーター含有プローブおよびリンカー 本明細書中で使用するための、好ましい核酸プロモーター含有プローブは、“
チオール修飾核酸”、即ち、少なくとも1つの反応性チオール部分を含むように
誘導された核酸である。更に下記実施例1で詳細したように、少なくとも1つの
反応性チオールを含む核酸を、3'または5'ジスルフィドを含む核酸を好ましく
は後の反応で拮抗しない(即ち、ヨードアセトイミド機能と反応しない)還元剤で
処理することにより、好ましくは合成する。ジスルフィド誘導性核酸は様々な方
法で合成され得る。例えば、核酸は、ジスルフィド含有修飾試薬との反応により
3'または5'末端で修飾され得る。他に、チオール酸プライマーは酵素学的に、
または非酵素学的に核酸に結合され得る。5'ホスホロアミデイト機能はまたチ オールまたはジスルフィド含有シトシンまたはデオキシシトシンへの結合点を提
供し得る。ジスルフィド修飾核酸の還元に適当な還元剤の例には、トリス-(2- カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(好ましくは1-100mMの範囲の濃 度(最も好ましくは約10mM))がpH3-6の範囲(最も好ましくは約4.5)、
温度20-45℃の範囲(最も好ましくは約37℃)で、約1ないし約10時間(最
も好ましくは約5時間)反応すること、ジチオスレイトール(好ましくは25ない
し100mMの濃度範囲(反応物が単離されるかどうかに依存する))がpH6-1
0(最も好ましくは約8)および温度25-45℃(最も好ましくは約37℃)で、 約1ないし約10時間(最も好ましくは5時間)反応することを含む。TCEPは
、反応し得る低pHで利点がある。この低いpHは、チオールを効率的にプロト
ン化し、そのため、チオールの求核反応を抑制し、高いpHで使用する他のジス
ルフィド還元剤を有する場合よりも副作用が少ない。
チオール修飾核酸”、即ち、少なくとも1つの反応性チオール部分を含むように
誘導された核酸である。更に下記実施例1で詳細したように、少なくとも1つの
反応性チオールを含む核酸を、3'または5'ジスルフィドを含む核酸を好ましく
は後の反応で拮抗しない(即ち、ヨードアセトイミド機能と反応しない)還元剤で
処理することにより、好ましくは合成する。ジスルフィド誘導性核酸は様々な方
法で合成され得る。例えば、核酸は、ジスルフィド含有修飾試薬との反応により
3'または5'末端で修飾され得る。他に、チオール酸プライマーは酵素学的に、
または非酵素学的に核酸に結合され得る。5'ホスホロアミデイト機能はまたチ オールまたはジスルフィド含有シトシンまたはデオキシシトシンへの結合点を提
供し得る。ジスルフィド修飾核酸の還元に適当な還元剤の例には、トリス-(2- カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(好ましくは1-100mMの範囲の濃 度(最も好ましくは約10mM))がpH3-6の範囲(最も好ましくは約4.5)、
温度20-45℃の範囲(最も好ましくは約37℃)で、約1ないし約10時間(最
も好ましくは約5時間)反応すること、ジチオスレイトール(好ましくは25ない
し100mMの濃度範囲(反応物が単離されるかどうかに依存する))がpH6-1
0(最も好ましくは約8)および温度25-45℃(最も好ましくは約37℃)で、 約1ないし約10時間(最も好ましくは5時間)反応することを含む。TCEPは
、反応し得る低pHで利点がある。この低いpHは、チオールを効率的にプロト
ン化し、そのため、チオールの求核反応を抑制し、高いpHで使用する他のジス
ルフィド還元剤を有する場合よりも副作用が少ない。
【手続補正36】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0068
【補正方法】変更
【補正内容】
【0068】 以下の実施例1で更に記載するような、好ましい二機能性架橋剤は、N-スク シンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)である。他の 架橋剤には、ジマレイミド、ジチオ-ビス-ニトロ安息香酸(DTNB)、N-スク シンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、N-スクシンイミジル- 3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、4-(N-マレイミドメ チル)シクロヘキサン-1-カルボン酸スクシンイミジル(SMCC)および6-ヒド
ラジノニコチンイミド(nicotimide)(HYNIC)が含まれるが、これらに限らず
、新規プロセスにも使用され得る。架橋剤の更なる例は、例えばWong "Chemistr
y of Protein Conjugation and Cross-Linking, " CRC Press (1991), and Herm
anson, "Bioconjugate Techniques" Academic Press (1995)参照。
ラジノニコチンイミド(nicotimide)(HYNIC)が含まれるが、これらに限らず
、新規プロセスにも使用され得る。架橋剤の更なる例は、例えばWong "Chemistr
y of Protein Conjugation and Cross-Linking, " CRC Press (1991), and Herm
anson, "Bioconjugate Techniques" Academic Press (1995)参照。
【手続補正37】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0069
【補正方法】変更
【補正内容】
【0069】 他の態様では、核酸を、マススペクトロメトリーで切断する光開裂可能または
光に不安定なリンカー部分を用い固定化する。典型的な光に不安定な架橋リンカ
ーには、3-アミノ-(2-ニトロフェニル)プロピオン酸(Brown et al.(1995) Mol
ecular Diversity, pp.4-12 and Rothschild et al., (1996) Nucl. Acids Res.
24:361-66)を含むがこれらに限らない。また国際特許出願番号WO98/200
19参照。
光に不安定なリンカー部分を用い固定化する。典型的な光に不安定な架橋リンカ
ーには、3-アミノ-(2-ニトロフェニル)プロピオン酸(Brown et al.(1995) Mol
ecular Diversity, pp.4-12 and Rothschild et al., (1996) Nucl. Acids Res.
24:361-66)を含むがこれらに限らない。また国際特許出願番号WO98/200
19参照。
【手続補正38】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0075
【補正方法】変更
【補正内容】
【0075】 既述のように、固定化を含む方法の幾つかの態様を本明細書の目的とする。こ
れらには、1)プライマー核酸が固体支持体に固定化され、標的核酸がハイブリ ダイズし、プロモーター配列を形成すること、2)プロモーターをコードする二 本鎖核酸(増幅または単離した)を、連結を介して、事前に決定した鎖に固定化し
、インビトロの転写を事前に決定したデオキシリボヌクレオチド存在下開始する
こと、および3)利用可能な配列情報がある場合に増幅され得る標的核酸が3'オ
ーバーハングを有する二本鎖核酸補足プローブとハイブリダイズし、生じたハイ
ブリッドを固定化することが含まれるが、これらの態様に限らない。
れらには、1)プライマー核酸が固体支持体に固定化され、標的核酸がハイブリ ダイズし、プロモーター配列を形成すること、2)プロモーターをコードする二 本鎖核酸(増幅または単離した)を、連結を介して、事前に決定した鎖に固定化し
、インビトロの転写を事前に決定したデオキシリボヌクレオチド存在下開始する
こと、および3)利用可能な配列情報がある場合に増幅され得る標的核酸が3'オ
ーバーハングを有する二本鎖核酸補足プローブとハイブリダイズし、生じたハイ
ブリッドを固定化することが含まれるが、これらの態様に限らない。
【手続補正39】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0076
【補正方法】変更
【補正内容】
【0076】 プライマー核酸を固体支持体に固定化し、標的核酸をそれにハイブリダイズす
る場合の態様では、切断可能リンカーの含有により、プライマーDNAを5'末 端で固定化する。そのため遊離3'-OHは、遊離DNA鎖に標的DNA“ハイブ
リダイズ”し、転写を開始させるのに有用となる。
る場合の態様では、切断可能リンカーの含有により、プライマーDNAを5'末 端で固定化する。そのため遊離3'-OHは、遊離DNA鎖に標的DNA“ハイブ
リダイズ”し、転写を開始させるのに有用となる。
【手続補正40】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0080
【補正方法】変更
【補正内容】
【0080】 化学的に切断可能リンカー 様々な化学的切断可能リンカーを用い、固定化核酸と固体支持体との間に切断
可能な結合を導入する。酸に不安定なリンカーには、マススペクトロメトリー、
特にMALDI-TOF MS用の化学的に切断可能リンカーが今のところ好まし
い。酸に不安定な結合が、3-HPAマトリクス溶液の添加による核酸のコンデ ィショニングの間に切断されるためである。酸に不安定な結合は、別のリンカー
基、例えば酸に不安定なトリチル基として導入されるか、または1またはそれ以
上のシリルインターヌクレオシドブリッジを、ジイソプロピルシリル誘導ヌクレ
オチドを用い導入することにより合成核酸リンカー中に組み入れられ、ジイソプ
ロピルシリル-連結オリゴヌクレオチド類似体を形成する。ジイソプロピルシリ ルブリッジが、DNAバックボーン中のホスホジエステル結合に、1.5%トリ
フルオロ酢酸(TFA)または3-HPA/1%TFA MALDI-TOFマトリ クス溶液のような穏やかな酸性条件下で置換されると、DNA分子中に1または
それ以上の鎖内部ブレイクが導入される。ジイソプロピルシリル連結オリゴヌク
レオチド前駆体および類似体を調製する方法は当業者に既知である(例えば、Sah
a et al., (1993) J. Org. Chem. 58:7827-7831)。これらオリゴヌクレオチド類
似体は、ジイソプロピルシリル誘導デオキシリボヌクレオシドを用いる固体状態
オリゴヌクレオチド合成方法を用い容易に調製される。
可能な結合を導入する。酸に不安定なリンカーには、マススペクトロメトリー、
特にMALDI-TOF MS用の化学的に切断可能リンカーが今のところ好まし
い。酸に不安定な結合が、3-HPAマトリクス溶液の添加による核酸のコンデ ィショニングの間に切断されるためである。酸に不安定な結合は、別のリンカー
基、例えば酸に不安定なトリチル基として導入されるか、または1またはそれ以
上のシリルインターヌクレオシドブリッジを、ジイソプロピルシリル誘導ヌクレ
オチドを用い導入することにより合成核酸リンカー中に組み入れられ、ジイソプ
ロピルシリル-連結オリゴヌクレオチド類似体を形成する。ジイソプロピルシリ ルブリッジが、DNAバックボーン中のホスホジエステル結合に、1.5%トリ
フルオロ酢酸(TFA)または3-HPA/1%TFA MALDI-TOFマトリ クス溶液のような穏やかな酸性条件下で置換されると、DNA分子中に1または
それ以上の鎖内部ブレイクが導入される。ジイソプロピルシリル連結オリゴヌク
レオチド前駆体および類似体を調製する方法は当業者に既知である(例えば、Sah
a et al., (1993) J. Org. Chem. 58:7827-7831)。これらオリゴヌクレオチド類
似体は、ジイソプロピルシリル誘導デオキシリボヌクレオシドを用いる固体状態
オリゴヌクレオチド合成方法を用い容易に調製される。
【手続補正41】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0083
【補正方法】変更
【補正内容】
【0083】 B.他の修飾RNA類似体 本明細書中に記載する方法の実施において、一群のネストした塩基特異的チェ
ーンターミネイテッドRNA転写物は、修飾塩基特異的チェーンターミネイティ
ングリボヌクレオチド類似体の組込みによる転写の間に生ずる(または修飾マキ サム-ギルバートストラテジーにおけるRNaseにより特異的に切断される)。
RNAポリメラーゼによるRNA分子への組込みにおいて転写伸張の配列特異的
停止を生ずる任意のリボヌクレオシド三リン酸類似体は、本明細書中の方法に使
用し得る。現在、好ましいリボヌクレオチド類似体は3'-デオキシリボヌクレオ
チドであり、転写の塩基特異的に終結に使用する(例えば、Axelrod et al., (19
85) Biochemistry 24:5716-5723;Tyagarajan et al., (1985) Biochemistry 30:
10920-10924)。
ーンターミネイテッドRNA転写物は、修飾塩基特異的チェーンターミネイティ
ングリボヌクレオチド類似体の組込みによる転写の間に生ずる(または修飾マキ サム-ギルバートストラテジーにおけるRNaseにより特異的に切断される)。
RNAポリメラーゼによるRNA分子への組込みにおいて転写伸張の配列特異的
停止を生ずる任意のリボヌクレオシド三リン酸類似体は、本明細書中の方法に使
用し得る。現在、好ましいリボヌクレオチド類似体は3'-デオキシリボヌクレオ
チドであり、転写の塩基特異的に終結に使用する(例えば、Axelrod et al., (19
85) Biochemistry 24:5716-5723;Tyagarajan et al., (1985) Biochemistry 30:
10920-10924)。
【手続補正42】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0085
【補正方法】変更
【補正内容】
【0085】 加えて、修飾リボヌクレオチド類似体を転写混合物に加え、転写終結および/
または転写産物放出の効率を増加し、酵素のターンオーバーの速度を促進し得る
。例えば、4-チオUTP、5-ブロモUTP、5-ヨードCTPの添加は、少な くとも幾つかのRNAポリメラーゼにより、転写終結および転写物放出を促進す
る核酸の水素結合を変化する。
または転写産物放出の効率を増加し、酵素のターンオーバーの速度を促進し得る
。例えば、4-チオUTP、5-ブロモUTP、5-ヨードCTPの添加は、少な くとも幾つかのRNAポリメラーゼにより、転写終結および転写物放出を促進す
る核酸の水素結合を変化する。
【手続補正43】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0088
【補正方法】変更
【補正内容】
【0088】 DNAアレイの調製 好ましい態様では、標的核酸とのハイブリダイゼーション前または後の核酸プ
ロモーター含有プローブを、アレイ形の固体支持体の表面に固定化する。これら
DNAアレイ形成に特に適当な方法は、本明細書中で記載したものおよび米国特
許出願番号08/746,053、08/787,639および08/786,
988に記載されたものである。これらそれぞれの仮米国特許出願の対象物を引
用により本明細書にすべて加え、以下のような要約する。
ロモーター含有プローブを、アレイ形の固体支持体の表面に固定化する。これら
DNAアレイ形成に特に適当な方法は、本明細書中で記載したものおよび米国特
許出願番号08/746,053、08/787,639および08/786,
988に記載されたものである。これらそれぞれの仮米国特許出願の対象物を引
用により本明細書にすべて加え、以下のような要約する。
【手続補正44】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0089
【補正方法】変更
【補正内容】
【0089】 図1は、診断ツールによる分析用サンプル物質のアレイを調製する1つのシス
テムを示している。図1は、データプロセッサ12、動作コントローラー14、
ロボットアームアセンブリ16、モニターエレメント18A、中央処理装置18
B、ソース素材20のマイクロタイタープレート、ステージハウジング22、ロ
ボットアーム24、ステージ26、圧力コントローラー28、コンジット30、
マウンティングアセンブリ32、ピンアセンブリ38および基体エレメント34
を含むシステム10を示す。図1でみられる図では、ロボットアセンブリ16は
可動性マウントエレメント40および水平スライドグローブ42を含み得るとも
説明される。ロボットアーム24はピン36を中心として回転し得、アーム24
の可動範囲を広げ、そのため、アーム24によりソースプレート20上にピンア
センブリ38が配置され得る。
テムを示している。図1は、データプロセッサ12、動作コントローラー14、
ロボットアームアセンブリ16、モニターエレメント18A、中央処理装置18
B、ソース素材20のマイクロタイタープレート、ステージハウジング22、ロ
ボットアーム24、ステージ26、圧力コントローラー28、コンジット30、
マウンティングアセンブリ32、ピンアセンブリ38および基体エレメント34
を含むシステム10を示す。図1でみられる図では、ロボットアセンブリ16は
可動性マウントエレメント40および水平スライドグローブ42を含み得るとも
説明される。ロボットアーム24はピン36を中心として回転し得、アーム24
の可動範囲を広げ、そのため、アーム24によりソースプレート20上にピンア
センブリ38が配置され得る。
【手続補正45】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0093
【補正方法】変更
【補正内容】
【0093】 図示したロボットアセンブリ16は、電気工学の分野に既知の原理から導かれ
、図示した基体34およびソースプレート20のような基体およびソースプレー
ト上の位置へピンアセンブリを移動させるのに適当なロボットアセンブリの一例
である。したがって、他のロボットシステムを、本明細書の記載に従い、当該分
野から出発することなく、実施し得る。
、図示した基体34およびソースプレート20のような基体およびソースプレー
ト上の位置へピンアセンブリを移動させるのに適当なロボットアセンブリの一例
である。したがって、他のロボットシステムを、本明細書の記載に従い、当該分
野から出発することなく、実施し得る。
【手続補正46】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0095
【補正方法】変更
【補正内容】
【0095】 図2は、ピンアセンブリ50の一態様を示し、圧力コントローラー28を含む
図1に示すシステムの実施に適当である。図示した態様では、ピンアセンブリ5
0には、上側部分52および下側部分54から形成され、スクリュー56Aおよ
び56Bにより合わされ一緒になり、内部チャンバー容積58が決定されるハウ
ジングを含む。更に、内部チャンバー容積58を流体工学的にシールするため、
ハウジングには、図2に示すシールエレメントが、上側ブロック52および下側
ブロック54の間に位置し内部チャンバー容積58の周囲を完全に取巻くO-リ ングガスケット60として含まれ得ることを図2は示す。さらに図2では、ピン
アセンブリ50は多数のベシクル62A-62Dを含み、それぞれ、軸穴(axial
bore)を含み、そこを通して伸びており、図示するホールディングチャンバー6 4A-64Dを形成する。それぞれ図示したベシクルは、それぞれ、孔68A-6
8Dを通して伸びており、ハウジングの下側54内に配列している。
図1に示すシステムの実施に適当である。図示した態様では、ピンアセンブリ5
0には、上側部分52および下側部分54から形成され、スクリュー56Aおよ
び56Bにより合わされ一緒になり、内部チャンバー容積58が決定されるハウ
ジングを含む。更に、内部チャンバー容積58を流体工学的にシールするため、
ハウジングには、図2に示すシールエレメントが、上側ブロック52および下側
ブロック54の間に位置し内部チャンバー容積58の周囲を完全に取巻くO-リ ングガスケット60として含まれ得ることを図2は示す。さらに図2では、ピン
アセンブリ50は多数のベシクル62A-62Dを含み、それぞれ、軸穴(axial
bore)を含み、そこを通して伸びており、図示するホールディングチャンバー6 4A-64Dを形成する。それぞれ図示したベシクルは、それぞれ、孔68A-6
8Dを通して伸びており、ハウジングの下側54内に配列している。
【手続補正47】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0098
【補正方法】変更
【補正内容】
【0098】 上記し、図2に図示したピンアセンブリ50を、基体90の上側表面にエッチ
ングされた多数のウェル92を含む基体エレメント90上に配置する。図2によ
り例示されるように、ベシクル62A-62Dのピッチとは次の通りである。各 ベシクルは、隣りのベシクルとある程度の距離があり、その距離は、基体90の
上側表面にエッチングされたウェル92間のピッチ距離の整数倍である。以下の
記載からわかるように、この間隔は液体の平行分配を促進し、液体を多数のウェ
ルに一度の操作で分配し得る。各ベシクルは、ステンレススチール、シリカ、ポ
リマー物質または液体サンプルの保持に適当な任意の他の物質から作成され得る
。ある実施例では、16ベシクルをあわせて用いる。それらは、硬化したベリリ
ウム銅、金メッキしたニッケルプレートを用い作成する。それらは43.2mm
の長さであり、ベシクルのシャフトは外径0.46mmに徐々に変化し、凹状チ
ップとなる。そのピンは、指向精度が約501マイクロメーターとなり得るよう
に、選択した。任意の適当なピン形を装置に使用し得、平坦、星形、凹状、尖頭
固体(pointed solid)、尖頭半中空(pointed semi-hollow)、一端または両端の角
(angled on one or both side)、他の幾何学構造を含むがこれらに限らない。
ングされた多数のウェル92を含む基体エレメント90上に配置する。図2によ
り例示されるように、ベシクル62A-62Dのピッチとは次の通りである。各 ベシクルは、隣りのベシクルとある程度の距離があり、その距離は、基体90の
上側表面にエッチングされたウェル92間のピッチ距離の整数倍である。以下の
記載からわかるように、この間隔は液体の平行分配を促進し、液体を多数のウェ
ルに一度の操作で分配し得る。各ベシクルは、ステンレススチール、シリカ、ポ
リマー物質または液体サンプルの保持に適当な任意の他の物質から作成され得る
。ある実施例では、16ベシクルをあわせて用いる。それらは、硬化したベリリ
ウム銅、金メッキしたニッケルプレートを用い作成する。それらは43.2mm
の長さであり、ベシクルのシャフトは外径0.46mmに徐々に変化し、凹状チ
ップとなる。そのピンは、指向精度が約501マイクロメーターとなり得るよう
に、選択した。任意の適当なピン形を装置に使用し得、平坦、星形、凹状、尖頭
固体(pointed solid)、尖頭半中空(pointed semi-hollow)、一端または両端の角
(angled on one or both side)、他の幾何学構造を含むがこれらに限らない。
【手続補正48】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0100
【補正方法】変更
【補正内容】
【0100】 図4は、図2に示すピンアセンブリ50による使用に適当な1つの下側ブロッ
ク54の通常構造および大きさの上からの透視図を示す。図4に示したように、
下側ブロック54は、穴68の4×4のマトリクスを含み、各ベシクルを受ける
のに適当な16の孔を提供する。上記引用の図2に記載したように、孔68間の
距離は、典型的に、基体表面上のウェル間の距離およびソースプレートのウェル
間の距離の整数倍である。したがって、図4に示すような下側ブロック54を有
するピンアセンブリは、液体を16ウェルまで同時に分配し得る。図4はまた、
通常の大きさの1つの下側ブロック54を示す。ブロック54の各サイドは通常
22mmの長さであり、孔68間のピッチは約4.5mmとなる。そのピッチは
基体の使用に適当であり、その場合、図2の基体90により例示するように液体
を約500μm離した位置に分配する。図4はまた、下側ブロック54が、図2
に示すシールエレメント60のようなO-リングシールエレメントを受けるのに 適当なO-リンググローブ94を所望により含むことを示す。そのグローブエレ メント94はシールエレメント60により形成される液体シールを促進し、改善
し得ると理解される。
ク54の通常構造および大きさの上からの透視図を示す。図4に示したように、
下側ブロック54は、穴68の4×4のマトリクスを含み、各ベシクルを受ける
のに適当な16の孔を提供する。上記引用の図2に記載したように、孔68間の
距離は、典型的に、基体表面上のウェル間の距離およびソースプレートのウェル
間の距離の整数倍である。したがって、図4に示すような下側ブロック54を有
するピンアセンブリは、液体を16ウェルまで同時に分配し得る。図4はまた、
通常の大きさの1つの下側ブロック54を示す。ブロック54の各サイドは通常
22mmの長さであり、孔68間のピッチは約4.5mmとなる。そのピッチは
基体の使用に適当であり、その場合、図2の基体90により例示するように液体
を約500μm離した位置に分配する。図4はまた、下側ブロック54が、図2
に示すシールエレメント60のようなO-リングシールエレメントを受けるのに 適当なO-リンググローブ94を所望により含むことを示す。そのグローブエレ メント94はシールエレメント60により形成される液体シールを促進し、改善
し得ると理解される。
【手続補正49】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0101
【補正方法】変更
【補正内容】
【0101】 ピンブロックはステンレススチールで製造され得る。ドリルでこの物質に正確
に約+25μmの孔を開けるためである。しかし、様々なプローブ物質もまた使
用し得、例えば、G10ラミネート、PMMAまたは他の適当な物質である。そ
のピンブロックは任意の数の孔を有し得、適所に16ピン有する16のレセプタ
クルが見られる。各ピンの指向精度を高めるため、所望による配列位置はブロッ
クの下にである。約6mmのピンチップを、マイクロタイタープレートのウェル
に浸すことができるようにさらしたままとするためである。図示したツールにお
けるプローブのレイアウトを設計し、384ウェルマイクロタイタープレートに
調整し、そのため、プローブの中心と中心の間隔は4.5mmとなる。4×4プ
ローブのアレイを選択した。1平方インチ未満でフィットするようにアレイを作
成するためであり、それは譲受人が使用するMALDI TOF MSのxyステ
ージの範囲で動く。ピンツールアセンブリを、装置の上側を覆うステンレススチ
ールで仕上げ、次いで、ロボットのZ-アーム上に取りつける。
に約+25μmの孔を開けるためである。しかし、様々なプローブ物質もまた使
用し得、例えば、G10ラミネート、PMMAまたは他の適当な物質である。そ
のピンブロックは任意の数の孔を有し得、適所に16ピン有する16のレセプタ
クルが見られる。各ピンの指向精度を高めるため、所望による配列位置はブロッ
クの下にである。約6mmのピンチップを、マイクロタイタープレートのウェル
に浸すことができるようにさらしたままとするためである。図示したツールにお
けるプローブのレイアウトを設計し、384ウェルマイクロタイタープレートに
調整し、そのため、プローブの中心と中心の間隔は4.5mmとなる。4×4プ
ローブのアレイを選択した。1平方インチ未満でフィットするようにアレイを作
成するためであり、それは譲受人が使用するMALDI TOF MSのxyステ
ージの範囲で動く。ピンツールアセンブリを、装置の上側を覆うステンレススチ
ールで仕上げ、次いで、ロボットのZ-アーム上に取りつける。
【手続補正50】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0102
【補正方法】変更
【補正内容】
【0102】 図1および2に関し、ロボットアセンブリ16は、図2に示すピンツールアセ
ンブリ50と同様に形成したピンツールアセンブリ38を用いる。圧力コントロ
ーラー28はチャンバー58内の圧力を選択的に制御する。この態様では、制御
プログラムはデータプロセッサ12上で操作され、アセンブリ16が基体34上
のエレメントのアレイを提示する方法でロボットアセンブリ16を制御する。最
初の工程では(図2および5も参照)、プログラムによりロボットアセンブリ16
は命令され、ピンアセンブリ38を動かし、上記ソースプレート20上に配置す
る。次いで、ロボットアセンブリ16により、ピンアセンブリがソースプレート
20に浸され、そのプレートは384ウェルDNAソースプレートであり得る。
図4に示すように、ピンアセンブリは16のピンを含み得、ピンアセンブリ50
により、16ピンが384ウェルDNAソースプレート20の16のウェルに浸
される。次に、データプロセッサ12により、動作コントローラー14は命令さ
れ、ロボットアセンブリ16を操作し、基体34の表面上の位置にピンアセンブ
リを移動する。基体34は、物質のサンプルを受けるのに適当な任意の基体であ
り得、シリコン、プラスチック物質、または任意の他の適当な物質から形成され
得る。所望により、基体は平坦表面を有するが、他に、ピット表面、ウェルでエ
ッチングされた表面または任意の他の適当な表面トポグラフィーを含み、そして
、更に各ウェルの表面にビーズを含む。次いで、データプロセッサ12で操作さ
れるプログラムにより、ロボットアセンブリは命令され、動作コントローラー1
4を通して、圧力コントローラー28は命令され、内部チャンバー容積58内に
陽圧を生ずる。この実施では、正の内部圧力により、ベシクル62のホールディ
ングチャンバーからの液体に力が加えられ、ベシクルからの液体を噴射し、基体
90のそれぞれのウェル92に噴射する。
ンブリ50と同様に形成したピンツールアセンブリ38を用いる。圧力コントロ
ーラー28はチャンバー58内の圧力を選択的に制御する。この態様では、制御
プログラムはデータプロセッサ12上で操作され、アセンブリ16が基体34上
のエレメントのアレイを提示する方法でロボットアセンブリ16を制御する。最
初の工程では(図2および5も参照)、プログラムによりロボットアセンブリ16
は命令され、ピンアセンブリ38を動かし、上記ソースプレート20上に配置す
る。次いで、ロボットアセンブリ16により、ピンアセンブリがソースプレート
20に浸され、そのプレートは384ウェルDNAソースプレートであり得る。
図4に示すように、ピンアセンブリは16のピンを含み得、ピンアセンブリ50
により、16ピンが384ウェルDNAソースプレート20の16のウェルに浸
される。次に、データプロセッサ12により、動作コントローラー14は命令さ
れ、ロボットアセンブリ16を操作し、基体34の表面上の位置にピンアセンブ
リを移動する。基体34は、物質のサンプルを受けるのに適当な任意の基体であ
り得、シリコン、プラスチック物質、または任意の他の適当な物質から形成され
得る。所望により、基体は平坦表面を有するが、他に、ピット表面、ウェルでエ
ッチングされた表面または任意の他の適当な表面トポグラフィーを含み、そして
、更に各ウェルの表面にビーズを含む。次いで、データプロセッサ12で操作さ
れるプログラムにより、ロボットアセンブリは命令され、動作コントローラー1
4を通して、圧力コントローラー28は命令され、内部チャンバー容積58内に
陽圧を生ずる。この実施では、正の内部圧力により、ベシクル62のホールディ
ングチャンバーからの液体に力が加えられ、ベシクルからの液体を噴射し、基体
90のそれぞれのウェル92に噴射する。
【手続補正51】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0113
【補正方法】変更
【補正内容】
【0113】 ジェットアセンブリ110のキャピラリー112は、ガラスキャピラリー、プ
ラスチックキャピラリー、または任意の他の適当なハウジングであり得、そのハ
ウジングは、液体サンプルを保有し得、液体サンプルを、変換器エレメント11
4のような変換器エレメントにより噴射し得るものである。図6Aに示す変換器
エレメント114は圧電変換器エレメントであり、キャピラリー112のパラメ
ーター周辺に形成され、ロボットアセンブリ16内のパルスジェネレイターから
受ける電気パルスを変換し得、液体をキャピラリー112のオリフィス118か
ら噴射する。圧電変換器エレメントを有するそういったジェットアセンブリは、
ドイツのMicroFab Technology,Inc.により製造されて いる。しかし、決められた、制御された液体体積の分配に適当な任意のジェット
アセンブリを、本明細書中で使用し得、それらには圧電変換器、電気的変換器、
電子制限的変換器(electrorestrictive transducer)、磁性制限的変換器(magnet
orestrictive transducer)、電気機械変換器(electromechanical transducer)、
または任意の他の適当な変換器エレメントを使用するものも含む。図示した態様
では、キャピラリー112は液体物質を受けるための液体コンジット122を有
する。所望の態様では、液体をキャピラリー中に、真空圧の作用により引き入れ
ることができ、それはオリフィス118を液体物質のソース中に沈めると、オリ
フィス118を通して液体を引き入れることができる。ジェットアセンブリ11
0の他の態様は、本発明によって、当該範囲から出発せずとも実施し得る。
ラスチックキャピラリー、または任意の他の適当なハウジングであり得、そのハ
ウジングは、液体サンプルを保有し得、液体サンプルを、変換器エレメント11
4のような変換器エレメントにより噴射し得るものである。図6Aに示す変換器
エレメント114は圧電変換器エレメントであり、キャピラリー112のパラメ
ーター周辺に形成され、ロボットアセンブリ16内のパルスジェネレイターから
受ける電気パルスを変換し得、液体をキャピラリー112のオリフィス118か
ら噴射する。圧電変換器エレメントを有するそういったジェットアセンブリは、
ドイツのMicroFab Technology,Inc.により製造されて いる。しかし、決められた、制御された液体体積の分配に適当な任意のジェット
アセンブリを、本明細書中で使用し得、それらには圧電変換器、電気的変換器、
電子制限的変換器(electrorestrictive transducer)、磁性制限的変換器(magnet
orestrictive transducer)、電気機械変換器(electromechanical transducer)、
または任意の他の適当な変換器エレメントを使用するものも含む。図示した態様
では、キャピラリー112は液体物質を受けるための液体コンジット122を有
する。所望の態様では、液体をキャピラリー中に、真空圧の作用により引き入れ
ることができ、それはオリフィス118を液体物質のソース中に沈めると、オリ
フィス118を通して液体を引き入れることができる。ジェットアセンブリ11
0の他の態様は、本発明によって、当該範囲から出発せずとも実施し得る。
【手続補正52】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0114
【補正方法】変更
【補正内容】
【0114】 図6Bは、更に他のアセンブリを例示しており、図1に示すアセンブリ16の
ようなロボットアセンブリのロボットアームにおいて適当に機能するアセンブリ
である。図6Bは130A-130Dを4つ同時につなげたアセンブリを示す。 図2のピンアセンブリと同様に、図6Bに示すジェットアセンブリは、液体物質
の平行分配に用いられ得る。各ジェットアセンブリ130A-130Dは他のも のとは独立して操作され得、選択した1つのジェットアセンブリから液体を選択
的に分配し得る。更に、各ジェットアセンブリ130A-130Dは独立して制 御し得、アセンブリ130A-130Dの各1点より分配される液体の体積を選 択し得る。他の修飾および変更が、本発明の範囲から出発せずとも図6Bに示す
アセンブリに行い得る。
ようなロボットアセンブリのロボットアームにおいて適当に機能するアセンブリ
である。図6Bは130A-130Dを4つ同時につなげたアセンブリを示す。 図2のピンアセンブリと同様に、図6Bに示すジェットアセンブリは、液体物質
の平行分配に用いられ得る。各ジェットアセンブリ130A-130Dは他のも のとは独立して操作され得、選択した1つのジェットアセンブリから液体を選択
的に分配し得る。更に、各ジェットアセンブリ130A-130Dは独立して制 御し得、アセンブリ130A-130Dの各1点より分配される液体の体積を選 択し得る。他の修飾および変更が、本発明の範囲から出発せずとも図6Bに示す
アセンブリに行い得る。
【手続補正53】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0119
【補正方法】変更
【補正内容】
【0119】 基体の表面上にサンプルアレイを置いた後、アレイを任意の様々の手段を用い
分析し得る(例えば、UV/VIS、IR、蛍光、化学ルミネセンスのような分 光技術、NMR分光法または質量分析法)。例えば、各分配プロセスの後、基体 にのせたサンプルをMALDI-TOFソースプレート上にのせ、角度をつけた スクリューをマウントしたポリカーボネート支持体の一群と共に保持し得る。あ
る実施では、プレートをプローブの端に移し、飛行時間マススペクトロメーター
のソース領域中において1μm分解能、1”トラベルxyステージ(Newport)に 保持する。任意の適当な質量分析ツールを用いることができる。
分析し得る(例えば、UV/VIS、IR、蛍光、化学ルミネセンスのような分 光技術、NMR分光法または質量分析法)。例えば、各分配プロセスの後、基体 にのせたサンプルをMALDI-TOFソースプレート上にのせ、角度をつけた スクリューをマウントしたポリカーボネート支持体の一群と共に保持し得る。あ
る実施では、プレートをプローブの端に移し、飛行時間マススペクトロメーター
のソース領域中において1μm分解能、1”トラベルxyステージ(Newport)に 保持する。任意の適当な質量分析ツールを用いることができる。
【手続補正54】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0122
【補正方法】変更
【補正内容】
【0122】 典型的な態様 ある好ましい態様では、プロモーター配列をコードする二本鎖核酸配列が、天
然源から単離されるか(例えば、細菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物ま たは真核生物)、または合成配列とアセンブルする。コーディング鎖の3'末端の
少なくとも5ヌクレオチドの一本鎖領域が、当業者に既知の標準的な方法に使用
される(例えば、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York参照)。この一本鎖領域は、シーケ ンスされる核酸領域または2つの核酸分子間にあるシーケンス(例えば、制限エ ンドヌクレアーゼ部位)に相補的となるように設計される。
然源から単離されるか(例えば、細菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物ま たは真核生物)、または合成配列とアセンブルする。コーディング鎖の3'末端の
少なくとも5ヌクレオチドの一本鎖領域が、当業者に既知の標準的な方法に使用
される(例えば、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York参照)。この一本鎖領域は、シーケ ンスされる核酸領域または2つの核酸分子間にあるシーケンス(例えば、制限エ ンドヌクレアーゼ部位)に相補的となるように設計される。
【手続補正55】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0123
【補正方法】変更
【補正内容】
【0123】 少なくとも部分的に一本鎖3'末端を含む、シーケンスされる核酸は、本明細 書中に記載する条件、好ましくは、当業者に既知の高緊縮条件により、ハイブリ
ダイズし、そのため、5つの連続的マッチング塩基対がプロモーター含有DNA
の相補的配列により形成される。シーケンスされる核酸は、二本鎖であるか、ま
たは好ましくは一本鎖である。2つの核酸分子のハイブリダイゼーションは、隣
接する核酸分子のジャンクションにおけるハイブリッド中に1またはそれ以上の
“ニック”を導入する。コーディングまたは非コーディング鎖、好ましくはコー
ディング鎖中のニックは、転写開始前に適当な核酸リガーゼを添加することによ
り連結される。核酸の連結方法は、当業者に既知であり(例えば、Sambrook et a
l., (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, New York)、DNAおよびRNAリガーゼは商業的に利用可能である(例えば
、Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。
ダイズし、そのため、5つの連続的マッチング塩基対がプロモーター含有DNA
の相補的配列により形成される。シーケンスされる核酸は、二本鎖であるか、ま
たは好ましくは一本鎖である。2つの核酸分子のハイブリダイゼーションは、隣
接する核酸分子のジャンクションにおけるハイブリッド中に1またはそれ以上の
“ニック”を導入する。コーディングまたは非コーディング鎖、好ましくはコー
ディング鎖中のニックは、転写開始前に適当な核酸リガーゼを添加することによ
り連結される。核酸の連結方法は、当業者に既知であり(例えば、Sambrook et a
l., (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, New York)、DNAおよびRNAリガーゼは商業的に利用可能である(例えば
、Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。
【手続補正56】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0124
【補正方法】変更
【補正内容】
【0124】 転写は、リボヌクレオシド三リン酸の存在中、本明細書および他で記載の条件
下、適当なRNAポリメラーゼの添加によりプロモーターから開始される(例え ば、In RNA Polymerase and the Regulation of Transcription, Rezinkoff et
al., eds, Elsevier, NY)。好ましい実施態様では、転写混合物には、選択した 塩基特異的チェーンターミネイティング3'-デオキシリボヌクレオシド三リン酸
および、また、RNA産物の二次構造を少なくするイノシン5'-三リン酸、また
は、4-チオUTP、5-ブロモUTPまたは5'-ヨードCTPといったRNAポ
リメラーゼ酵素のターンオーバーを促進する修飾リボヌクレオシド三リン酸が含
まれ、それによって、分析に利用可能なRNA転写産物の量が増加する。
下、適当なRNAポリメラーゼの添加によりプロモーターから開始される(例え ば、In RNA Polymerase and the Regulation of Transcription, Rezinkoff et
al., eds, Elsevier, NY)。好ましい実施態様では、転写混合物には、選択した 塩基特異的チェーンターミネイティング3'-デオキシリボヌクレオシド三リン酸
および、また、RNA産物の二次構造を少なくするイノシン5'-三リン酸、また
は、4-チオUTP、5-ブロモUTPまたは5'-ヨードCTPといったRNAポ
リメラーゼ酵素のターンオーバーを促進する修飾リボヌクレオシド三リン酸が含
まれ、それによって、分析に利用可能なRNA転写産物の量が増加する。
【手続補正57】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0128
【補正方法】変更
【補正内容】
【0128】 好ましい核酸は、不溶性支持体の表面と少なくとも1つの硫黄原子を介して共
有結合する。即ち、核酸は、少なくとも1つの硫黄原子を含むリンカー部分を介
してその表面と共有結合する。その共有結合した核酸は、本明細書に記載の方法
により容易に製造される。好ましい態様では、共有結合した核酸は、不溶性支持
体の表面上に、少なくとも密度約20fmol/mm2、更に好ましくは少なく
とも約75fmol/mm2、更に好ましくは少なくとも約fmol/mm2、
より更に好ましくは少なくとも約100fmol/mm2、および最も好ましく
は少なくとも約150fmol/mm2で存在し得る。
有結合する。即ち、核酸は、少なくとも1つの硫黄原子を含むリンカー部分を介
してその表面と共有結合する。その共有結合した核酸は、本明細書に記載の方法
により容易に製造される。好ましい態様では、共有結合した核酸は、不溶性支持
体の表面上に、少なくとも密度約20fmol/mm2、更に好ましくは少なく
とも約75fmol/mm2、更に好ましくは少なくとも約fmol/mm2、
より更に好ましくは少なくとも約100fmol/mm2、および最も好ましく
は少なくとも約150fmol/mm2で存在し得る。
【手続補正58】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0130
【補正方法】変更
【補正内容】
【0130】 シーケンスする方法は診断の応用として使用され、既知標的核酸中に遺伝的変
化の存在を検査する。例えば、標的核酸領域は、PCRまたは当業者に既知の他
の増幅方法のような、標準的方法を用い増幅し得る(例えば、Sambrook et al.,
(1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York参照)。増幅核酸は変性され、シーケンスされる鎖(非コーディング鎖) は、二本鎖分子として単離されるか、使用され得る。
化の存在を検査する。例えば、標的核酸領域は、PCRまたは当業者に既知の他
の増幅方法のような、標準的方法を用い増幅し得る(例えば、Sambrook et al.,
(1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York参照)。増幅核酸は変性され、シーケンスされる鎖(非コーディング鎖) は、二本鎖分子として単離されるか、使用され得る。
【手続補正59】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0131
【補正方法】変更
【補正内容】
【0131】 既知標的核酸中の遺伝的変化の存在は、診断の応用において、生体サンプルの
標的核酸を単離(または増幅)し、プロモーター含有鋳型を生ずるプロモーター含
有捕捉プローブに標的をハイブリダイズすることにより、決定される。ネストし
た一群のRNA転写産物が生じ、標的核酸の存在が決定され、野生型配列と比較
して遺伝的変化が標的核酸中に生じているかどうか決定する。遺伝的変化の存在
は、当分野に既知の他の手段によりRNA転写産物から決定され得る(例えば、 米国特許番号5,605,798および国際PCT出願番号WO98/2001
9)。
標的核酸を単離(または増幅)し、プロモーター含有鋳型を生ずるプロモーター含
有捕捉プローブに標的をハイブリダイズすることにより、決定される。ネストし
た一群のRNA転写産物が生じ、標的核酸の存在が決定され、野生型配列と比較
して遺伝的変化が標的核酸中に生じているかどうか決定する。遺伝的変化の存在
は、当分野に既知の他の手段によりRNA転写産物から決定され得る(例えば、 米国特許番号5,605,798および国際PCT出願番号WO98/2001
9)。
【手続補正60】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0132
【補正方法】変更
【補正内容】
【0132】 転写ターミネーター配列を同定する方法 これまで知られていない転写ターミネーターおよびアテニュエーター配列を同
定する方法もまた提供する。転写ターミネーター配列は、RNA伸張の配列特異
的停止に応答し、種々の生物由来のターミネーター配列が報告されている。例え
ば、細菌性rho-独立性ターミネーター配列には2つの逆位反復が数塩基対離 れてあり、その後に5-10ntのポリTストレッチがある。これら配列を介す る転写において、生じたmRNA転写物により、RNAヘパリンステム-ループ 二次構造が、RNAポリメラーゼ分子後に形成され、RNAポリメラーゼのポー
ジング(pausign)を増加し、および/またはRNAポリメラーゼ-DNA鋳型相互
作用を不安定化し、DNAポリTストレッチ内の転写産物が停止する(例えば、W
ilson and von Hippel 19;Reynolds et al., (1992a) J. Mol. Biol. 224:53-63
; Reynolds et al., (1992b) J. Mol. Biol. 224:31-51; Telesnitsky et al.,(
1989) Biochemistry 28:5210-5218; d' Aubenton Carafa et al., (1990) J. Mo
l. Biol. 216: 835-858参照)。
定する方法もまた提供する。転写ターミネーター配列は、RNA伸張の配列特異
的停止に応答し、種々の生物由来のターミネーター配列が報告されている。例え
ば、細菌性rho-独立性ターミネーター配列には2つの逆位反復が数塩基対離 れてあり、その後に5-10ntのポリTストレッチがある。これら配列を介す る転写において、生じたmRNA転写物により、RNAヘパリンステム-ループ 二次構造が、RNAポリメラーゼ分子後に形成され、RNAポリメラーゼのポー
ジング(pausign)を増加し、および/またはRNAポリメラーゼ-DNA鋳型相互
作用を不安定化し、DNAポリTストレッチ内の転写産物が停止する(例えば、W
ilson and von Hippel 19;Reynolds et al., (1992a) J. Mol. Biol. 224:53-63
; Reynolds et al., (1992b) J. Mol. Biol. 224:31-51; Telesnitsky et al.,(
1989) Biochemistry 28:5210-5218; d' Aubenton Carafa et al., (1990) J. Mo
l. Biol. 216: 835-858参照)。
【手続補正61】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0134
【補正方法】変更
【補正内容】
【0134】 本明細書に記載の標準的転写条件を修飾することにより、転写ターミネーター
、例えば、rho-依存性およびrho-独立性ターミネーターが、質量分析法を
用いて同定され得る。その方法の実施では、シーケンスされる一本鎖領域の3' 末端核酸を、プロモーター含有核酸プローブのコーディング鎖の3'末端の相補 的配列にハイブリダイズさせる。好ましい態様では、プロモーター含有核酸を、
5'末端の非コーディング鎖または3'末端のコーディング鎖を介して、固体支持
体に共有結合し、更に好ましくは高密度でアミノシラン処理固体支持体に5'-ま
たは3'-チオール酸化DNA連結する。連結は、リンカー基の存在下または非存
在下にあり、好ましくはアレイ形に並べられる。
、例えば、rho-依存性およびrho-独立性ターミネーターが、質量分析法を
用いて同定され得る。その方法の実施では、シーケンスされる一本鎖領域の3' 末端核酸を、プロモーター含有核酸プローブのコーディング鎖の3'末端の相補 的配列にハイブリダイズさせる。好ましい態様では、プロモーター含有核酸を、
5'末端の非コーディング鎖または3'末端のコーディング鎖を介して、固体支持
体に共有結合し、更に好ましくは高密度でアミノシラン処理固体支持体に5'-ま
たは3'-チオール酸化DNA連結する。連結は、リンカー基の存在下または非存
在下にあり、好ましくはアレイ形に並べられる。
【手続補正62】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0136
【補正方法】変更
【補正内容】
【0136】 ある態様では、シーケンスされる核酸のハイブリダイズから生ずる1またはそ
れ以上の鎖中のニックが、転写開始前に適当な核酸リガーゼを添加することによ
り連結される(即ち、DNAまたはRNAリガーゼを加える)。
れ以上の鎖中のニックが、転写開始前に適当な核酸リガーゼを添加することによ
り連結される(即ち、DNAまたはRNAリガーゼを加える)。
【手続補正63】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0137
【補正方法】変更
【補正内容】
【0137】 本発明を以下の実施例により更に説明する。その部分は単に詳しく説明するこ
とを目的とし、これらに制限するとして構成されるものではない。本出願を通し
て引用したすべての参考文献(参考文献、発行された特許、公開された特許出願 、および仮出願特許出願を含む)の内容全体を引用により特別にこの文書に加え る。
とを目的とし、これらに制限するとして構成されるものではない。本出願を通し
て引用したすべての参考文献(参考文献、発行された特許、公開された特許出願 、および仮出願特許出願を含む)の内容全体を引用により特別にこの文書に加え る。
【手続補正64】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0145
【補正方法】変更
【補正内容】
【0145】 共有結合的に固定化したプローブの密度を測定するために、選択のジスルフィ
ド含有オリゴデオキシヌクレオチドを、上記で放射標識したのと同じ種の痕跡量
に加えた。ジスルフィドを切断し、プローブをヨードアセトアミド機能化ウェハ
ーに固定化し、ウェハーを洗浄し、次いで、ホスホイメージャースクリーン(pho
sphorimager screen)(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)に照射した。それぞ
れのオリゴデオキシヌクレオチドを用いる場合、オリゴデオキシヌクレオチドの
モル量が判っている参照スポットをポリスチレン上につくる;これら参照スポッ
トをホスホイメージャースクリーンにウェルとして照射した。スクリーンのスキ
ャンニングにおいて、各チップに結合したオリゴデオキシヌクレオチドの量(モ ル)を、参照の特異活性とカウントを比較することにより測定した。
ド含有オリゴデオキシヌクレオチドを、上記で放射標識したのと同じ種の痕跡量
に加えた。ジスルフィドを切断し、プローブをヨードアセトアミド機能化ウェハ
ーに固定化し、ウェハーを洗浄し、次いで、ホスホイメージャースクリーン(pho
sphorimager screen)(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)に照射した。それぞ
れのオリゴデオキシヌクレオチドを用いる場合、オリゴデオキシヌクレオチドの
モル量が判っている参照スポットをポリスチレン上につくる;これら参照スポッ
トをホスホイメージャースクリーンにウェルとして照射した。スクリーンのスキ
ャンニングにおいて、各チップに結合したオリゴデオキシヌクレオチドの量(モ ル)を、参照の特異活性とカウントを比較することにより測定した。
【手続補正65】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0153
【補正方法】変更
【補正内容】
【0153】 平坦表面に強固にパックされたオリゴヌクレオチドの間のステアリン酸阻害に
より、40%を超えるハイブリダイゼーション効率が阻害されると仮定された。
この点を考慮し、スペーサー分子を、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシ
ョン領域の端と支持体との間に組込んだ。選択されたスペーサーは一連のポリd
T配列であり、長さ3から25の範囲であった。放射標識およびホスホイメージ
ャーを伴うこれらサンプルの調査において、達成し得る最大ハイブリダイゼーシ
ョンはそれでも40%あった。
より、40%を超えるハイブリダイゼーション効率が阻害されると仮定された。
この点を考慮し、スペーサー分子を、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシ
ョン領域の端と支持体との間に組込んだ。選択されたスペーサーは一連のポリd
T配列であり、長さ3から25の範囲であった。放射標識およびホスホイメージ
ャーを伴うこれらサンプルの調査において、達成し得る最大ハイブリダイゼーシ
ョンはそれでも40%あった。
【手続補正66】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0154
【補正方法】変更
【補正内容】
【0154】 MALDI-TOF MS分析 ウェハーはプローブで機能化され、相補的配列をハイブリダイズし、そのサン
プルを、上記の標準的MALDI条件下分析した。分析により示されたのは、ア
ニール鎖(MJM6)のみが、実験的な電荷に対する質量比6415.4の質量ス
ペクトルが観察され、理論的な電荷に対する質量比は6415である(図9)。電
荷に対する質量の比が6455であるシグナルがみられなかったため、ウェハー
結合鎖(TCUC)は脱着できず、そのため、レーザーに耐え未処理のままとなる
に充分な程度に、ヨードアセトアミド連結が安定となることが確認された。更な
るシグナルにより電荷に対する質量の比が6262.0であると観察された。こ
のシグナルはグアノシンの脱プリン化による結果であり、MALDIプロセスの
間にプリン塩基がDNAにより減損し得ると知られているためである(Nordhoff,
E., et al., (1992) Rapid Commun. Mass Spectrom. 6:771-776)。ウェハー上 のサンプル結晶は均一に分布せず、そのため、良好なスポットを捜す必要があっ
た。この非均一性が原因で、質量の分解能は変化するが、脱着したオリゴヌクレ
オチドでは質量スペクトルは通常、200-300の範囲であった。ある一群の 実験では、非相補的配列はウェハーとハイブリダイズした;上記のように洗浄後
のMALDI-TOF MSの分析によると、非特異的アニーリングは最小となっ
た。シグナルが検出されなかったためである。
プルを、上記の標準的MALDI条件下分析した。分析により示されたのは、ア
ニール鎖(MJM6)のみが、実験的な電荷に対する質量比6415.4の質量ス
ペクトルが観察され、理論的な電荷に対する質量比は6415である(図9)。電
荷に対する質量の比が6455であるシグナルがみられなかったため、ウェハー
結合鎖(TCUC)は脱着できず、そのため、レーザーに耐え未処理のままとなる
に充分な程度に、ヨードアセトアミド連結が安定となることが確認された。更な
るシグナルにより電荷に対する質量の比が6262.0であると観察された。こ
のシグナルはグアノシンの脱プリン化による結果であり、MALDIプロセスの
間にプリン塩基がDNAにより減損し得ると知られているためである(Nordhoff,
E., et al., (1992) Rapid Commun. Mass Spectrom. 6:771-776)。ウェハー上 のサンプル結晶は均一に分布せず、そのため、良好なスポットを捜す必要があっ
た。この非均一性が原因で、質量の分解能は変化するが、脱着したオリゴヌクレ
オチドでは質量スペクトルは通常、200-300の範囲であった。ある一群の 実験では、非相補的配列はウェハーとハイブリダイズした;上記のように洗浄後
のMALDI-TOF MSの分析によると、非特異的アニーリングは最小となっ
た。シグナルが検出されなかったためである。
【手続補正67】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0155
【補正方法】変更
【補正内容】
【0155】 実施例2 連続および平行分配ツールを用いるDNAアレイの調製 ロボットが操縦する連続および平行pL-nL分配ツールを用いると、マトリ クスアシストレーザー脱着イオン化質量分析用の平坦な表面または幾何学的に変
化した(例えば、ウェルを有する)表面を有する1"平方未満のチップにおいて1 0-103のエレメントDNAを生じた。最初に、'圧電ピペット(piezoelectric
pipette)'(70μm id キャピラリー)により、マトリクスの0.2nL以下の小 滴を単一および多数分配し、次いで、測定対象物をチップに分配した;0.2f
molぐらいの低濃度の36-mer DNAからのスペクトルがこのプロセスに
必要であった。急速な蒸発(<5秒)にも拘わらず、測定対象物を含む3-ヒドロ キシピコリン酸マトリクスの微小結晶をルーチンで作成すると、より大きな体積
調製で通常得られる場合よりも高い再現性が得られた;800μmウェル中の2
3-merのスポット5fmol、100個すべてにおいて質量スペクトルへ容 易に変換され、ノイズに対するシグナルの比が5を超えるイオンシグナルを有し
ていたものが100のうち99あった。2番目のアプローチでは、384ウェル
マイクロタイタープレートからのプローブを、スプリングロードピンのアレイを
用いチップウェルまたは平坦表面上に、同時に16に分配し、20nL以下をチ
ップに表面接触により移す;平行法で置かれたアレイエレメントのMS分析は、
連続法で得られた感度および分解能に関し、一致する。
化した(例えば、ウェルを有する)表面を有する1"平方未満のチップにおいて1 0-103のエレメントDNAを生じた。最初に、'圧電ピペット(piezoelectric
pipette)'(70μm id キャピラリー)により、マトリクスの0.2nL以下の小 滴を単一および多数分配し、次いで、測定対象物をチップに分配した;0.2f
molぐらいの低濃度の36-mer DNAからのスペクトルがこのプロセスに
必要であった。急速な蒸発(<5秒)にも拘わらず、測定対象物を含む3-ヒドロ キシピコリン酸マトリクスの微小結晶をルーチンで作成すると、より大きな体積
調製で通常得られる場合よりも高い再現性が得られた;800μmウェル中の2
3-merのスポット5fmol、100個すべてにおいて質量スペクトルへ容 易に変換され、ノイズに対するシグナルの比が5を超えるイオンシグナルを有し
ていたものが100のうち99あった。2番目のアプローチでは、384ウェル
マイクロタイタープレートからのプローブを、スプリングロードピンのアレイを
用いチップウェルまたは平坦表面上に、同時に16に分配し、20nL以下をチ
ップに表面接触により移す;平行法で置かれたアレイエレメントのMS分析は、
連続法で得られた感度および分解能に関し、一致する。
【手続補正68】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0158
【補正方法】変更
【補正内容】
【0158】 サンプルを、(1)Thermo Bioanalysis Vision 20 00における通常の使用で提供されるときの平坦ステンレススチールサンプル標
的、(2)マイクロマシン化ナノピット(nanopit)を有する同一設計のステンレス スチール標的、(3)平坦シリコン(Si)ウェハー、(4)磨きをかけた平坦Siウ
ェハー、(5)粗い(3-6pLm特徴)ピットを有するSiウェハー、(6)化学的 にエッチングしたウェルの(a)10×10(または(b)16×16)アレイを有す
る(a)12×12(または(b)18×18)mm Siチップ、それぞれ、800 ×800μmであり、サイドは99-400(または(b)では120)マイクロメ ーター、ピッチ(a)は1.0(または(b)では1.125)mmである、(7)化学
的にエッチングしたウェルの28×28アレイを有する15×15mm Siチ ップ、それぞれ、サイドは450×450マイクロメーターであり、48-30 0マイクロメーターの範囲の深さであり、0.5mmのピッチを有する、(8)平
坦なポリカーボネートまたは他のプラスチック、(9)金および他の金属、(10)
膜、(11)金または他の伝導性物質でスプッターしたプラスチック表面を含むM
ALDI TOF分析において標的となる幾つかの表面の連続システムに分配し た。分配体積を、分配する小滴数を調節することにより、10−10から10−
6に調節する。
的、(2)マイクロマシン化ナノピット(nanopit)を有する同一設計のステンレス スチール標的、(3)平坦シリコン(Si)ウェハー、(4)磨きをかけた平坦Siウ
ェハー、(5)粗い(3-6pLm特徴)ピットを有するSiウェハー、(6)化学的 にエッチングしたウェルの(a)10×10(または(b)16×16)アレイを有す
る(a)12×12(または(b)18×18)mm Siチップ、それぞれ、800 ×800μmであり、サイドは99-400(または(b)では120)マイクロメ ーター、ピッチ(a)は1.0(または(b)では1.125)mmである、(7)化学
的にエッチングしたウェルの28×28アレイを有する15×15mm Siチ ップ、それぞれ、サイドは450×450マイクロメーターであり、48-30 0マイクロメーターの範囲の深さであり、0.5mmのピッチを有する、(8)平
坦なポリカーボネートまたは他のプラスチック、(9)金および他の金属、(10)
膜、(11)金または他の伝導性物質でスプッターしたプラスチック表面を含むM
ALDI TOF分析において標的となる幾つかの表面の連続システムに分配し た。分配体積を、分配する小滴数を調節することにより、10−10から10−
6に調節する。
【手続補正69】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0159
【補正方法】変更
【補正内容】
【0159】 サンプル調製および分配 1.連続 種々の配列または濃度のオリゴヌクレオチド(0.1-50ng/マイクロタイ
ター)を96ウェルマイクロタイタープレートにのせた;最初のウェルをマトリ クス溶液として残した。穴をあけたチップ(MALDI標的のセクションにおけ る標的6a)をステージ上にのせ、手動で並べる。ロボット制御ソフトウェア(ウ
インドウズ)中に、最初のウェルの座標、アレイの大きさ(即ち、xおよびyのス
ポット数)およびエレメント間の距離、およびアレイエレメントあたりの0.2 nL小滴の数を入れた。キャピラリーを10μL以下のリンスH2Oで満たし、
連続パルスモードの間のチップの完全性および清浄性を確認するためストロボ光
照射カメラが見える位置に自動的に移動し、空とした。次いで、キャピラリーを
マトリクス溶液で満たし、再び、ストロボスコープで確認し、次いで、平坦の表
面または穴をあけた表面上のアレイへのスポットに使用した。別のMSモードに
おける再現性の研究のために、10×10アレイに0.2−20nLの小滴を典
型的に分配した。キャピラリーを陽圧の適用により空とし、所望によりH2Oで
リンスし、ソースオリゴプレートに移動し、5μL以下の0.05-2.0μM 合成オリゴを引き入れた。次いで、キャピラリーを、各マトリクススポット上に
連続してラスターし、0.2-20nL水溶液をそれぞれに加えた。
ター)を96ウェルマイクロタイタープレートにのせた;最初のウェルをマトリ クス溶液として残した。穴をあけたチップ(MALDI標的のセクションにおけ る標的6a)をステージ上にのせ、手動で並べる。ロボット制御ソフトウェア(ウ
インドウズ)中に、最初のウェルの座標、アレイの大きさ(即ち、xおよびyのス
ポット数)およびエレメント間の距離、およびアレイエレメントあたりの0.2 nL小滴の数を入れた。キャピラリーを10μL以下のリンスH2Oで満たし、
連続パルスモードの間のチップの完全性および清浄性を確認するためストロボ光
照射カメラが見える位置に自動的に移動し、空とした。次いで、キャピラリーを
マトリクス溶液で満たし、再び、ストロボスコープで確認し、次いで、平坦の表
面または穴をあけた表面上のアレイへのスポットに使用した。別のMSモードに
おける再現性の研究のために、10×10アレイに0.2−20nLの小滴を典
型的に分配した。キャピラリーを陽圧の適用により空とし、所望によりH2Oで
リンスし、ソースオリゴプレートに移動し、5μL以下の0.05-2.0μM 合成オリゴを引き入れた。次いで、キャピラリーを、各マトリクススポット上に
連続してラスターし、0.2-20nL水溶液をそれぞれに加えた。
【手続補正70】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0160
【補正方法】変更
【補正内容】
【0160】 2.平行 平行プログラムは、オフセットプリンティングにより作成されるアレイを調節
するように書かれていた;10ウェハー上に64エレメントあるアレイを作成す
るために、例えば、ツールを384ウェルDNAソースプレートの16ウェルに
浸し、標的(例えば、Si、プラスチック、金属)に移動し、サンプルを表面接触
によりスポットした。次いで、ツールを同じ16ウェルに浸し、2番目の標的に
スポットし、このサイクルを10のウェハーすべてにおいて繰り返した。次に、
ツールを洗浄溶液に浸し、次いで、16種のソースプレートのウェルに浸し、そ
して最初の一群の16スポットから標的2.25mmオフセット上にスポットし
た;再び、これを10のウェハーすべてにおいて繰り返した;すべてのサイクル
を繰り返し、各ピンから2×2アレイを作成し、8×8アレイのスポットを作成
した(2×2エレメント/ピン×16ピン=スポットしたエレメントは合計64)
。
するように書かれていた;10ウェハー上に64エレメントあるアレイを作成す
るために、例えば、ツールを384ウェルDNAソースプレートの16ウェルに
浸し、標的(例えば、Si、プラスチック、金属)に移動し、サンプルを表面接触
によりスポットした。次いで、ツールを同じ16ウェルに浸し、2番目の標的に
スポットし、このサイクルを10のウェハーすべてにおいて繰り返した。次に、
ツールを洗浄溶液に浸し、次いで、16種のソースプレートのウェルに浸し、そ
して最初の一群の16スポットから標的2.25mmオフセット上にスポットし
た;再び、これを10のウェハーすべてにおいて繰り返した;すべてのサイクル
を繰り返し、各ピンから2×2アレイを作成し、8×8アレイのスポットを作成
した(2×2エレメント/ピン×16ピン=スポットしたエレメントは合計64)
。
【手続補正71】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0165
【補正方法】変更
【補正内容】
【0165】 質量スペクトルは、シリコンチップのウェルに微小分配したDNA分子からも
得られた。図10は、化学的にエッジングした100のウェルを有する12×1
2mmシリコンチップを示す;マスクの大きさおよびエッジング時間をセットす
ると円錐台(fustum)(即ち、インバーテッドフラットトップピラミッド(inverted
flat top pyramidal))幾何学ウェルは800×800μm(上表面)および10 0μmの深さとなった。所望により、ウェルを粗くし、穴をあけ得る。上記の通
り、チップの端をステージの一段高い表面に並べ、キャピラリーに関しxおよび
y座標システムを決めた(他には、光学的配置、人工知能パターン認識ルーチン 、手動配置に基づくドエル-ピンを含む。)。各ウェルに、測定対象物を含まない
20小滴(〜5nL)の3-HPAマトリクス溶液を分配した;50%CH3CN 溶液を用いる場合、各小滴の蒸発時間は5-10秒のオーダーであった。溶媒蒸 発において、120×ステレオミクロスコープで観察する各微小分配マトリクス
小滴は、非晶および乳状平坦ディスクとしてみられた;その様子は小滴からなり
、図3bスペクトルが得られた。チップを空とすること、洗浄すること、23- merDNA(Mr(計算値)=6967Da)の1.4μM水溶液で再度満たすこ
とにおいて、キャピラリーを100スポットのマトリクス上に向け、5nLのD
NA水溶液をマトリクス水滴の上部に直接分配した。CCDカメラを用いる視覚
化を使用すると、マトリクスと水性測定対象物溶液が混合し、マトリクスが再溶
解することがわかった(室温および湿度で10秒以内で完全に蒸発する)。非晶マ
トリクス表面を変換し、1μm未満のオーダーの結晶特性を有する真性微小結晶
表面に変換した。
得られた。図10は、化学的にエッジングした100のウェルを有する12×1
2mmシリコンチップを示す;マスクの大きさおよびエッジング時間をセットす
ると円錐台(fustum)(即ち、インバーテッドフラットトップピラミッド(inverted
flat top pyramidal))幾何学ウェルは800×800μm(上表面)および10 0μmの深さとなった。所望により、ウェルを粗くし、穴をあけ得る。上記の通
り、チップの端をステージの一段高い表面に並べ、キャピラリーに関しxおよび
y座標システムを決めた(他には、光学的配置、人工知能パターン認識ルーチン 、手動配置に基づくドエル-ピンを含む。)。各ウェルに、測定対象物を含まない
20小滴(〜5nL)の3-HPAマトリクス溶液を分配した;50%CH3CN 溶液を用いる場合、各小滴の蒸発時間は5-10秒のオーダーであった。溶媒蒸 発において、120×ステレオミクロスコープで観察する各微小分配マトリクス
小滴は、非晶および乳状平坦ディスクとしてみられた;その様子は小滴からなり
、図3bスペクトルが得られた。チップを空とすること、洗浄すること、23- merDNA(Mr(計算値)=6967Da)の1.4μM水溶液で再度満たすこ
とにおいて、キャピラリーを100スポットのマトリクス上に向け、5nLのD
NA水溶液をマトリクス水滴の上部に直接分配した。CCDカメラを用いる視覚
化を使用すると、マトリクスと水性測定対象物溶液が混合し、マトリクスが再溶
解することがわかった(室温および湿度で10秒以内で完全に蒸発する)。非晶マ
トリクス表面を変換し、1μm未満のオーダーの結晶特性を有する真性微小結晶
表面に変換した。
【手続補正72】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0184
【補正方法】変更
【補正内容】
【0184】 1.鋳型およびプライマー配列の設計 プライマーすべてを、商業的に利用できるDNAシンセサイザーで、通常のホ
スホロアミデイト化学(Sinha et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:4539)を 用い合成した。インビトロのRNA転写を合成55ヌクレオチド二本鎖DNA鋳
型で行った。鋳型を、3つのプライマー配列;55ヌクレオチド非コーディング
鎖(配列番号10)およびコーディング鎖(配列番号11および12)を形成する2
つの更なるプライマーを用いアセンブルした。図17に示すように、コーディン
グ鎖中のニックの特定位置は各コーディング鎖プライマーの長さにより決まる。
転写のためのこの構成の使用により、この位置でのニックが実質的に転写を減衰
しないことを示す。
スホロアミデイト化学(Sinha et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:4539)を 用い合成した。インビトロのRNA転写を合成55ヌクレオチド二本鎖DNA鋳
型で行った。鋳型を、3つのプライマー配列;55ヌクレオチド非コーディング
鎖(配列番号10)およびコーディング鎖(配列番号11および12)を形成する2
つの更なるプライマーを用いアセンブルした。図17に示すように、コーディン
グ鎖中のニックの特定位置は各コーディング鎖プライマーの長さにより決まる。
転写のためのこの構成の使用により、この位置でのニックが実質的に転写を減衰
しないことを示す。
【手続補正73】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0185
【補正方法】変更
【補正内容】
【0185】 2.プライマーハイブリダイゼーションおよびRNA転写 一本鎖ニック鋳型は、3つの一本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシ
ョンにより作成され、その全DNA濃度は、10mM MgCl2中10μM(鋳
型よりもプライマーは2倍多い)であり、70℃で10分間反応混合物を加熱し 、少なくとも4時間かけて室温に冷却することにより作成する。ニックの位置は
、2つのコーディング鎖(5'-3')DNAオリゴヌクレオチドの相当する長さに より決定される。
ョンにより作成され、その全DNA濃度は、10mM MgCl2中10μM(鋳
型よりもプライマーは2倍多い)であり、70℃で10分間反応混合物を加熱し 、少なくとも4時間かけて室温に冷却することにより作成する。ニックの位置は
、2つのコーディング鎖(5'-3')DNAオリゴヌクレオチドの相当する長さに より決定される。
【手続補正74】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0186
【補正方法】変更
【補正内容】
【0186】 SP6RNAポリメラーゼ転写 ニックDNA鋳型のインビトロの転写を、40mM Tris-HCl(pH7 .0)、6mM MgCl2、2mM スペルミジン、10mM NaCl、10m
M ジチオスレイトール、1unit/μl RNasin(Promega)、5mM rNTP
、5μCi[α-32P]rCTP、1unit/μl SP6 RNAポリメラーゼ(Amer
sham, Arlington Heights, IL)の反応20μl中で、37℃で30分間行った。
不完全および全長のRNA転写産物を、ゲル電気泳動により分離し、ポリアクリ
ルアミドゲルを乾燥し個々のRNA断片の放射活性を測定することにより、そし
てPhosphoImager(Molecular Dynamics, Inc.)を用い既知標準と放射活性を比べ 測定することにより、定量した。ニックDNA鋳型の全長RNA転写の効率を、
ニックを含まないDNA鋳型から転写した全長RNAのモルのパーセントとして
算出した。ニックDNA鋳型の通過効率によりニックを、全長のRNA転写産物
のモルおよびニックでストールしたRNA転写産物のモルのパーセントとして算
出した。
M ジチオスレイトール、1unit/μl RNasin(Promega)、5mM rNTP
、5μCi[α-32P]rCTP、1unit/μl SP6 RNAポリメラーゼ(Amer
sham, Arlington Heights, IL)の反応20μl中で、37℃で30分間行った。
不完全および全長のRNA転写産物を、ゲル電気泳動により分離し、ポリアクリ
ルアミドゲルを乾燥し個々のRNA断片の放射活性を測定することにより、そし
てPhosphoImager(Molecular Dynamics, Inc.)を用い既知標準と放射活性を比べ 測定することにより、定量した。ニックDNA鋳型の全長RNA転写の効率を、
ニックを含まないDNA鋳型から転写した全長RNAのモルのパーセントとして
算出した。ニックDNA鋳型の通過効率によりニックを、全長のRNA転写産物
のモルおよびニックでストールしたRNA転写産物のモルのパーセントとして算
出した。
【手続補正75】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0189
【補正方法】変更
【補正内容】
【0189】 2.DNAシーケンシング 標的DNA鋳型のDNAシーケンシングを、40mM Tris-HCl(pH 7.9)、6mM MgCl2、2mM 中性化スペルミジン、5mM ジチオスレ
イトール、300nM rCTP、300nM rATP、300nM rUTP 、300nM rITP、600nM rGMP、10μCi(α-32P)rCT PまたはUTP、10-300、通常10-50μM 3'-デオキシヌクレオチド 、0.5-1.0pmol 直鎖状またはスーパーコイルのDNA鋳型、4ユニッ
トのRNasin(Promega)、10unit/μl T7RNAポリメラーゼ(USB)の
反応10μl中で、37℃30分間行った。RNA転写産物のチェーンターミネ
ーション断片を、8%または13%ポリアクリルアミドゲルを用いるゲル電気泳
動により分離した。
イトール、300nM rCTP、300nM rATP、300nM rUTP 、300nM rITP、600nM rGMP、10μCi(α-32P)rCT PまたはUTP、10-300、通常10-50μM 3'-デオキシヌクレオチド 、0.5-1.0pmol 直鎖状またはスーパーコイルのDNA鋳型、4ユニッ
トのRNasin(Promega)、10unit/μl T7RNAポリメラーゼ(USB)の
反応10μl中で、37℃30分間行った。RNA転写産物のチェーンターミネ
ーション断片を、8%または13%ポリアクリルアミドゲルを用いるゲル電気泳
動により分離した。
【手続補正76】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0190
【補正方法】変更
【補正内容】
【0190】 180-200塩基までのRNA終結断片のDNAシーケンシングラダーを生 成した。この例により示されるのは、T7RNAポリメラーゼが、塩基特異的チ
ェーンターミネーターとして修飾3'-デオキシリボヌクレオシドを特異的に組込
み得、核酸をシーケンスするためのネストしたRNA転写物を生成し得る。
ェーンターミネーターとして修飾3'-デオキシリボヌクレオシドを特異的に組込
み得、核酸をシーケンスするためのネストしたRNA転写物を生成し得る。
【手続補正書】
【提出日】平成13年11月14日(2001.11.14)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM ,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM) ,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG, BR,BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,D K,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM ,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE, KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,L T,LU,LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX ,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE, SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,U A,UG,US,UZ,VN,YU,ZW (72)発明者 メアリーアン・ジェイ・オドネル アメリカ合衆国02110マサチューセッツ州 ボストン、インディア・ロー65番、アパー トメント・サーティエイス・フロアー (72)発明者 チャンウォン・カン 大韓民国305−390タエジョン、ユソング、 ジョンミンドン464−1番、エクスポ・ア パートメント305−401 (72)発明者 ヨンスー・クオン 大韓民国500−500クワンジュ・プクグ、マ ンウォルドン25−2番 (72)発明者 ヨンテー・キム 大韓民国138−172ソウル、ソンパグ、ソン パ−2ドン162番、スンウォン・アパート メント2−204 (72)発明者 フーベルト・ケースター アメリカ合衆国92037カリフォルニア州 ラ・ホラ、ビア・マローカ・ドライブ8636 −シー番 (72)発明者 ダニエル・ピー・リトル アメリカ合衆国18668ペンシルベニア州パ ットン、グレンデイル・レイク・ロード 393番 (72)発明者 グオビン・シアン アメリカ合衆国92121カリフォルニア州サ ンディエゴ、アンドロメダ・ロード8655番 (72)発明者 デイビッド・エム・ロウ イギリス、ティディ14・55エイ、バーウィ ックシャー、アイマス、ディーンヘッド・ ロード32番 (72)発明者 チャールズ・カンター アメリカ合衆国02215マサチューセッツ州 ボストン、ベイ・ステイト・ロード・ナン バー6、11番 Fターム(参考) 4B024 AA19 AA20 CA01 CA11 HA14 HA19 4B063 QA13 QQ42 QR08 QR32 QR35 QR42 QR56 QR84 QS16 QS34 QS36 QS39 QX07
Claims (44)
- 【請求項1】 a)プロモーターおよび操作可能となるようにプロモーター に連結した標的核酸配列を含むDNA分子であって、固体支持体上に固定化した
核酸分子を提供すること、 b)プロモーターを含む核酸分子を、標的からのネストした一群のRNA転写産 物を生ずる条件下、プロモーターを認識するRNAポリメラーゼで転写すること
、 c)転写産物の分子量値をマススペクトロメトリーで測定し、そして標的分子の の核酸配列を決定すること、 を含む標的核酸分子の配列を決定する方法。 - 【請求項2】 5'末端のコーディング鎖または3'末端の非コーディング鎖
を介して、プロモーターを含む核酸分子を固定化する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 核酸がDNAまたはPNAである、請求項1に記載の方法。
- 【請求項4】 コーディングおよび非コーディング鎖を有する核酸プロモー
ター含有プローブによる、標的核酸配列を含む核酸分子へのハイブリダイズであ
って、当該ハイブリダイゼーションはプロモーター含有プローブの一本鎖領域と
相補的一本鎖領域との間で、標的を含む分子の一端で生ずるハイブリダイズによ
り、プロモーターおよび標的を含む核酸分子を調製する、請求項1-3の何れか に記載の方法。 - 【請求項5】 標的を含む分子が一本鎖であり、相補的一本鎖領域を含む部
分が標的を含む分子の3'末端に位置し、 そしてプロモーターを含むプローブ分子が二本鎖であり少なくとも5ヌクレオチ
ドの一本鎖領域をコーディング鎖の3'末端に有し、当該少なくとも5つの隣接 ヌクレオチドが標的を含む分子の一本鎖部分に相補的である、請求項4に記載の
方法。 - 【請求項6】 標的を含んでいる分子が、プロモーターを含む分子の一本鎖
部分に相補的である少なくとも5つの隣接ヌクレオチドを一端に含む一本鎖領域
を除き、二本鎖であること、そして プロモーターを含む分子の一本鎖部分がプロモーターに対し同じ端であり、一本
鎖領域が、標的を含む分子上にある、 請求項4に記載の方法。 - 【請求項7】 プロモーターを含む分子を固体支持体上に固定化し、その後
、標的を含む分子をハイブリダイゼーションさせる、請求項4-6の何れかに記 載の方法。 - 【請求項8】 ハイブリダイゼーション後、プロモーターを含む分子を固体
支持体上に固定化する、請求項4-6の何れかに記載の方法。 - 【請求項9】 生じた分子中のニックを連結した後、RNAポリメラーゼに
より転写する、請求項4-8の何れかに記載の方法。 - 【請求項10】 プロモーターおよび標的核酸を含んでいる核酸分子がRN
Aポリメラーゼにより転写され、多くの塩基特異的終結RNA転写産物を生成さ
せる、請求項1-9の何れかに記載の方法。 - 【請求項11】 プロモーターおよび標的核酸を含んでいる核酸分子がRN
Aポリメラーゼにより転写され、一群のRNA転写産物を生成させ、次いで、塩
基特異的リボヌクレアーゼにより特異的に切断し、一群の切断断片を生成させ、
その分子量の値をマススペクトロメトリーにより測定する、請求項1-9の何れ かに記載の方法。 - 【請求項12】 標的核酸のすべておよび一部の配列を、分子量によるRN
A転写産物により測定する、請求項1-11の何れかに記載の方法。 - 【請求項13】 プロモーターまたはプロモーターの相補体を含む一本鎖分
子を固定化し、その相補体を含む断片をハイブリダイズすることにより、プロモ
ーターを含んでいる核酸分子を作成し、それによって、生成した分子には、プロ
モーターおよび少なくとも5ヌクレオチドの一本鎖部分が含まれる二本鎖領域を
含む、請求項1-12の何れかに記載の方法。 - 【請求項14】 プロモーターを、ファージ、真核性および原核性プロモー
ターからなる群から選択する、請求項1-13の何れかに記載の方法。 - 【請求項15】 プロモーターを、古細菌、真性細菌、バクテリオファージ
、DNAウイルス、RNAウイルス、植物、植物ウイルスおよび動物プロモータ
ーから選択する、請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】 RNAポリメラーゼがDNA依存RNAポリメラーゼまた
はRNA依存RNAポリメラーゼである、請求項1-15の何れかに記載の方法 。 - 【請求項17】 RNAポリメラーゼを、ファージ、真核性および原核性ポ
リメラーゼからなる群より選択する、請求項1-16の何れかに記載の方法。 - 【請求項18】 ポリメラーゼを、古細菌、真性細菌、バクテリオファージ
、DNAウイルス、RNAウイルス、植物、植物ウイルスおよび動物ポリメラー
ゼから選択する、請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】 RNAポリメラーゼを、Escherichia coliRNAポリメラ
ーゼ、T7RNAポリメラーゼ、SP6RNAポリメラーゼ、T3RNAポリメ
ラーゼおよびQβレプリカーゼからなる群より選択する、請求項1-18の何れ かに記載の方法。 - 【請求項20】 核酸の固定化前に、支持体の表面をアミノシランと反応さ
せて支持体の表面上に一級アミンを生成させることにより誘導化する、請求項1
-19の何れかに記載の方法。 - 【請求項21】 アミノシランが3-アミノプロピルトリエトキシシランで ある、請求項20に記載の方法。
- 【請求項22】 支持体の表面上の一級アミンをチオール反応性架橋剤と反
応させ、チオール反応性固体支持体を形成することを含む、請求項21に記載の
方法。 - 【請求項23】 チオール反応性架橋剤がN-スクシンイミジル(4-ヨード アセチル)アミノベンゾエート(SIAB)である、請求項22に記載の方法。
- 【請求項24】 固体支持体への核酸プローブの固定化が、遊離5'-または
3'-チオール基を有する核酸プローブとチオール反応性固体支持体を反応させる
ことにより、効率的となり、それによって、チオール基とチオール反応性固体支
持体との間に共有結合が形成される、請求項22に記載の方法。 - 【請求項25】 核酸分子を、少なくとも20fmol/mm2の密度で固 体支持体の表面に共有結合により固定化する、請求項1-21の何れかに記載の 方法。
- 【請求項26】 核酸を、固体支持体の表面にアレイ形で固定化する、請求
項1-25の何れかに記載の方法。 - 【請求項27】 固体支持体がシリコンまたはシリコンで被覆されている、
請求項1-26の何れかに記載の方法。 - 【請求項28】 表面が、固定化核酸分子を含む多数のウェルを含む、請求
項1-27の何れかに記載の方法。 - 【請求項29】 ウェルが粗い内部表面を有する、請求項28に記載の方法
。 - 【請求項30】 固体支持体が粗い表面を有する、請求項28に記載の方法
。 - 【請求項31】 ウェルの表面に穴をあける、請求項28に記載の方法。
- 【請求項32】 転写反応をリボヌクレオシド三リン酸類似体存在下で行い
、それによって、生じたRNA転写物が二次構造を少なくするか、またはRNA
ポリメラーゼ酵素の終結およびターンオーバーの忠実性が、リボヌクレオシドト
リホスファターゼから形成されるRNA転写産物と比べ、増加する、請求項1- 31の何れかに記載の方法。 - 【請求項33】 転写反応には、イノシン5'-三リン酸(ITP)、4-チオ ウリジン5'トリホスフェート(UTP)、5-ブロモUTPおよび5'-ヨードCT
Pから選択される1つまたはそれ以上の類似体が含まれる、請求項32に記載の
方法。 - 【請求項34】 核酸を、固体支持体にリンカーを介して固定化する、請求
項1-33の何れかに記載の方法。 - 【請求項35】 リンカーにより形成される連結が可逆性である、請求項3
4に記載の方法。 - 【請求項36】 リンカーにより形成される連結が不可逆性である、請求項
34に記載の方法。 - 【請求項37】 リンカーにより形成される連結が、光に不安定であり、酸
に不安定であり、または化学的に切断可能である、請求項34に記載の方法。 - 【請求項38】 転写が、1つまたはそれ以上の3'-デオキシリボヌクレオ
チド存在下、行われる、請求項1-37の何れかに記載の方法。 - 【請求項39】 核酸の固定化前または後に、マススペクトロメトリー用の
マトリクス物質を支持体の表面に加えることを更に含む、請求項1-38の何れ かに記載の方法。 - 【請求項40】 RNA転写産物を、マススペクトロメトリーを行う前に、
条件付けする、請求項1-39の何れかに記載の方法。 - 【請求項41】 標的配列を含んでいる核酸によるプロモーター含有分子へ
のハイブリダイゼーションにより、コーディング鎖中にニックが形成され、それ
はプロモーターから転写の開始から+6の位置に相当する、請求項1-4の何れ かに記載の方法。 - 【請求項42】 ニックが、+7、+8、+9または+19の位置である、
請求項24に記載の方法。 - 【請求項43】 a)標的核酸の3'-末端の一本鎖領域に相補的なコーディ ング鎖の3'-末端に少なくとも5ヌクレオチドを含む核酸プロモーター含有プロ
ーブを固体支持体上に固定化すること、 b)シーケンスする核酸を、固定化核酸プローブにハイブリダイズすること、 c)標的核酸をRNAポリメラーゼ(当該RNAポリメラーゼはプロモーターを認
識する)で転写し、多数の塩基特異的終結RNA転写産物を生成させること、そ して d)マススペクトロメトリーで各塩基特異的終結RNA転写物の分子量の値を測 定すること、 を含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項44】 a)標的核酸の3'-末端の一本鎖領域に相補的なコーディ ング鎖の3'-末端に少なくとも5ヌクレオチドを含む核酸プロモーター含有プロ
ーブを固体支持体上に固定化すること、 b)シーケンスする核酸を、固定化核酸プローブにハイブリダイズすること、 c)標的核酸をRNAポリメラーゼ(当該RNAポリメラーゼはプロモーターを認
識する)で転写し、配列-終結RNA転写産物を生成させること、そして d)マススペクトロメトリーでRNA転写物の分子量の値を測定すること、それ によって、ターミネーター配列またはアテニュエーター配列を同定すること、 を含む、転写ターミネーター配列またはアテニュエーター配列を同定する方法。
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