JP2002508192A - 核酸をシーケンスするための質量分析法 - Google Patents

核酸をシーケンスするための質量分析法

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Abstract

(57)【要約】 ＤＮＡ依存およびＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを含むＲＮＡポリメラーゼを用いる、核酸をシーケンスするための質量分析法を提供する。その方法には、ＲＮＡポリメラーゼを用い、ネストした一群のＲＮＡ転写産物を生成させ、それをマススペクトロメトリーで分析することを含む。転写ターミネーターおよびアテニュエーター配列を同定する方法をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連する応用 標題が“核酸をシーケンスするための質量分析法”であって、Changwon Kang 、Young-Soo Kwon、Young Tae Kim、Hubert Koester、Daniel Little、Maryanne
O'Donnell、Guobing Xiang、Charies CantorおよびDavid Loughによる１９９７
年１２月１５日付け米国特許出願番号０８／９９０，８５１に基づき優先権の利
益を請求する。許されるならば、この出願の対象物すべてを引用によりこの文書
に加える。
【０００２】 この出願の対象物は以下の仮特許出願、国際出願および特許に関係する。米国
特許出願番号５,６０５,７９８、５,６２２,８２４および５,５４７,８３５、５
,６９１,１４１、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２００１９、ＷＯ９８／２０１
６６およびＷＯ９７／４２３４８。許されるならば、これら出願および特許権の
対象物を引用によりこの文書に加える。
【０００３】 背景技術 核酸をシーケンスする方法は、遺伝子発現および調節を評価および理解するた
めの分子生物学者の技術の中で重要であり強力なツールである。ＤＮＡ分子をシ
ーケンスする方法には、化学的崩壊シーケンシング(chemical degradation sequ
encing)(Maxam et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560参照、また
Ambrose et al., (1987) Methods Enz. 152:522)およびチェーンターミネーショ
ンシーケンシング(Sanger et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:546
3)が含まれる。マキサム-ギルバートシーケンシング法は特異的切断ＤＮＡ断片 に基く分解的方法である。一方の端を放射標識したＤＮＡ断片を５回の化学反応
で部分的に切断する。各反応は塩基型および塩基に特異的であり、長さの異なる
標識断片の群が５つ生ずる。断片群をポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧ Ｅ)で分離する。
【０００４】 チェーンターミネーション法またはサンガー法は、ＤＮＡ合成に基づいている
。一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、標識したプライマーを用い、相補鎖の形成を
開始する。合成反応は、４つのデオキシヌクレオチド(ｄＮＴＰ)、ｄＡＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、ならびに４つのジデオキシヌクレオチド(ｄ ｄＮＴＰ)、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＧＴＰのうちの１ つの存在下に実施する。相補鎖は、ジデオキシヌクレオチドを伸張する鎖に加え
ることにより、完成前に終結する。４つのｄｄＮＴＰのうち１つをそれぞれ含む
４つの反応混合物で開始することにより、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴで終結する鎖の群
を生ずる。各反応混合物をポリアクリルアミドゲルの１レーンで電気泳動し、断
片を分離すると、１塩基の長さで違いが生じる。
【０００５】 これらの方法は、一本鎖ファージベクター内にクローニングするように、ＤＮ
Ａの変性および一本鎖の分離または他の方法により作成する一本鎖ＤＮＡをシー
ケンスするため主としてデザインされる。これらのシーケンス方法は、長さが１
塩基異なる断片のアレイを生ずる反応に基づき、同定可能な塩基で終結する。断
片はＰＡＧＥを用い大きさにより分離され、放射性同位体のような標識を用い検
出される。電気泳動ゲルのバンドの分離はＤＮＡ断片の長さが増加するにつれて
指数的に減少するため、これらの方法は、約３００から４００までのヌクレオチ
ドのシーケンスするＤＮＡ断片のみ可能である。
【０００６】 標的ＤＮＡはまた、ポリメラーゼ連鎖反応(例えば、Mullis et al., (1986) C
old Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263;Mullisらの米国特許出願番号4,
683,202)を用い増幅でき、その結果、増幅濃度の二重鎖標的ＤＮＡを生ずる。多
くの方法を用い、その後のシークエンス用にＰＣＲから直接一本鎖鋳型を生ずる
。例えば、一本鎖のみに特異的な放射標識プライマーが用い得る。他に、ＰＣＲ
は、１プライマーが限られた濃度である条件下で行い得る。限られた濃度である
プライマーが使い尽くされると、２番目の鎖が直線的な割合で次のサイクルで増
幅される(Gyllenstein et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:7652;Mihil
ovic et al., (1989) BioTechniques 7:14)。
【０００７】 多くの使用できるシーケンシングストラテジーがある。ストラテジーの選択は
、ＤＮＡをシーケンスする目的およびシーケンスする前のＤＮＡについての利用
し得る情報量に依存する。例えば、標的ＤＮＡを、特定の変異がＤＮＡ内に導入
されるていることを確認するためにシーケンスするならば、小領域のＤＮＡをシ
ーケンスすることのみが必要となる。ＤＮＡ断片は、配列を正確に決定しなけれ
ばならない未知の遺伝子または遺伝子部分であるならば、断片全体をシーケンス
する必要がある。シーケンスし得る断片の大きさは約４００塩基が限界であるた
め、この大きさよりも長いＤＮＡ断片は切断しなければならない。切断はランダ
ムでよく、標的ＤＮＡのセグメントのサブクローニングによる。次いで、オーバ
ーラップする断片を含むサブクローニングした断片をシーケンスし、コンピュー
タープログラムで並べる(例えば、Staden(1986) Nucl. Acids Res. 14:217参照)
。他に、ＤＮＡを、オーバーラップする変異かネストする変異を生じ、そして、
シーケンスすることにより、または他の整列アプローチにより、系統的にサブク
ローニングし得る。
【０００８】 サンガーチェーンターミネーション法および他のシーケンシング方法は、標的
ＤＮＡを一本鎖ファージェベクターにクローニングすることによる、一本鎖鋳型
の使用に依存する。しかし、標的ＤＮＡのためベクターとしてプラスミドを使用
することは、多くの理由からファージＤＮＡの使用よりも好ましく、それには、
種々の利用可能なプラスミド、プラスミドの操作容易性、およびファージベクタ
ーと比べて挿入ＤＮＡがプラスミド中でより安定であることを含む。したがって
、標的ＤＮＡを一本鎖ファージＤＮＡ以外のプラスミドＤＮＡにクローニングす
るシーケンシング方法(例えば、Wallance et al., (1981) Gene 16:21-26; Guo
et al., (1982) Nucl. Acids Res. 10:2065-2084;Vieira et al., (1982) Gene
19:259-268参照)が開発されている。
【０００９】 これらの方法は、同時に一本鎖標的ＤＮＡの配列決定するためにのみ設計され
る(例えば、Chen et al., (1985) DNA 4:165-170; Hattori et al., (1986) Ana
l. Biochem. 152:232-238; Mierendorf et al., (1987) Methods Enzymol. 152:
556;Mehra et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7013-7017参照)。 しかし、二本鎖ＤＮＡの使用により、一本鎖ＤＮＡ断片のサブクローニングまた
は単離が避けられ、それはジデオキシ鎖ターミネーターシーケンシング反応を使
用する。しかし、二本鎖ＤＮＡの使用が制限される。それは、変性させた二重鎖
ＤＮＡの鋳型としての性質が悪いからである。結果として、これらの方法からは
、一本鎖ベクターにＤＮＡをクローニングする方法と同程度に正確な配列データ
は得られなかった。
【００１０】 最近、鋳型の品質に伴う問題が、鎖特異的プライマーが効果的にハイブリダイ
ズし、挿入ＤＮＡの相補鎖に隣接する部位を含むプラスミドを使用する方法の開
発により解決された。これら方法の効果により、二本鎖ＤＮＡの各一本鎖は、直
接プラスミドＤＮＡから、事前にファージベクターへサブクローニングすること
もなく、シーケンスされ得る(例えば、Chen et al., (1985) DNA 4:165-170 お よび Chi et al., (1988) Nucl. Acids Res. 16:10382参照)。鎖特異的合成プラ
イマーを、共有結合で閉環し、熱またはアルカリで変性させたＤＮＡにアニール
し、その後、ジデオキシシーケンシング反応を行う。他に、プライマーをアルカ
リで変性した開環二本鎖プラスミドＤＮＡにアニールし、それを鋳型とした(Hat
tori et al., (1986) Anal. Biochem. 152:232-238参照)。二本鎖ＤＮＡをアル カリまたは熱により変性させ、その後、サンガー法を用いシーケンスする。それ
は３７℃またはそれ以上で行う。別の“フォワード”および“リバース”プライ
マーの使用も記載されており(Mehra et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 83:7013-7017参照)、λｇｔ１１中のＥｃｏＲＩ部位に隣接するｌａｃＺ配列
にそれぞれ相補的であり、λｇｔ１１にクローニングした各ＤＮＡ鎖を別々にシ
ーケンスする。
【００１１】 反対向きのプライマー領域を有するプラスミドは、転写を含む方法に使用され
、また、シーケンスされる標的ＤＮＡの媒体として使用される。各プロモーター
領域は、挿入ＤＮＡをシーケンスするため、明確な特異的プライミング部位とし
ての役割をする。そのプラスミドは商業的に利用可能である。例えば、二対のプ
ロモータープラスミドｐＧＥＭTMには、バクテリオファージＳＰ６およびＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼプロモーターが反対方向に含まれ(Mierendorf et al., (1987)
Meth. Enzymol. 152:556-562)、それにより、シーケンスするために転写産物を
生じ得る。
【００１２】 核酸をシーケンスする殆どの方法には、人工物をシーケンスし得るポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動(即ち、ＰＡＧＥ)の使用が必要であるか、または、放射性
同位元素、酵素、または蛍光または化学ルミネセンス部分のような検出可能な標
識が必要とされる。質量分析的検出を用いるＤＮＡのシーケンシング方法もまた
使用されている(米国特許出願番号5,547,835参照)。これらの方法は、本来、Ｄ ＮＡのシーケンシングに依存する。
【００１３】 ＤＮＡシーケンシング方法論を用い、ヒトゲノム配列全体を最終的に決定する
。ヒトゲノムＤＮＡの完全配列の知識は、ヒトの疾患の理解、診断、防止、およ
び処置の助けとなる。適度な時間枠で、そして経済的な方法で、約３０臆塩基対
のヒトゲノムの決定を成功させるため、迅速で、信頼性があり、感度がよく、安
価な方法であることが必要とされている。
【００１４】 したがって、本明細書の目的は、シーケンスするための更なる方法を提供する
ことである。特に、本明細書の目的は、ＲＮＡポリメラーゼを用い核酸をシーケ
ンスする質量分析法を提供することである。更に、本明細書の目的は、ＲＮＡポ
リメラーゼを用いアレイ形で核酸をシーケンスする方法であって、核酸プローブ
を高密度で支持体に固定化し質量分析的検出を促進する方法を提供することであ
る。また、本明細書の目的は、質量分析法を用い転写ターミネーター配列を同定
する方法を提供することである。
【００１５】 本発明の要旨 核酸、特にＤＮＡを、ＲＮＡ転写産物を用い、シーケンスする方法を提供する
。特に、ＲＮＡポリメラーゼを用い、核酸をシーケンスする方法であって、ＤＮ
Ａ依存およびＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ含む方法を提供する。ＲＮＡ転写産
物をマススペクトロメトリーで分析する。
【００１６】 本方法の実施では、プロモーターおよび操作可能となるようにプロモーターに
連結した標的核酸配列を含むＤＮＡ分子を、産生される標的を含む一群のネスト
したＲＮＡ転写産物を生ずる条件下、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラー
ゼで転写する。転写産物の分子量を、マススペクトロメトリーで測定し、そして
標的配列の核酸配列を決定する。核酸および標的を含むＤＮＡ分子は、好ましく
は固定化されている。
【００１７】 ある態様では、その方法は、標的ＤＮＡを含む分子を捕捉する、一端に一本鎖
領域を有し、プロモーターを含む二本鎖の断片を用いる。これらの態様では、標
的ＤＮＡは、好ましくは、一本鎖である。
【００１８】 好ましい態様では、プロモーターを含む核酸は、３'末端の非コーディング鎖 または５'末端のコーディング鎖を介して固相と共有結合する。結合は、当業者 に既知の任意の方法を用い、例えばチオール結合を用いる。例えば、５'-または
３'-チオール酸化ＤＮＡを調製し、アミノシラン処置固体支持体でに結合する。
結合は、直接か、またはリンカー基を介する。生じた固定化分子は好ましくはア
レイ形に並べられる。
【００１９】 プロモーターをコードしている二本鎖核酸分子は、任意の源から得られ、例え
ば細菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物および真核生物であり、または合
成プロトコールと合わせることができる。それを、用い、工作すると、生じた断
片はコーディング(センス)鎖の３'末端に少なくとも５ヌクレオチドの一本鎖領 域を含む。この一本鎖領域を、シーケンスされる核酸領域または通常のオーバー
ラッピング配列、例えば制限エンドヌクレアーゼ部位と相補的となるように設計
する。
【００２０】 シーケンスされる核酸領域を含む標的核酸は、一本鎖であるか二本鎖であるが
、一本鎖３'末端を含み、プロモーターを含むＤＮＡの相補的配列にハイブリダ イズする。ハイブリダイゼーションは固定化前または後何れかに行う。２つの核
酸分子のハイブリダイゼーションにより、１またはそれ以上の“ニック”がハイ
ブリッド中の隣接核酸分子のジャンクションの位置に導入される。ある態様では
、コーディングまたは非コーディング鎖、好ましくは、コーディング鎖中のニッ
クは、転写開始前に適当な核酸リガーゼの添加により連結される。
【００２１】 好ましくは、方法は、ネストしたＲＮＡ転写産物を生ずる任意の適当なストラ
テジーを採用する。好ましい方法は、修飾したサンガーシーケンシングストラテ
ジーに基づき、それは、ＲＮＡを用い、塩基特異的チェーンターミネーションに
より得られる一群のネストしたＲＮＡ転写産物を生じる。これらは、マススペク
トロメトリーにより分析される。修飾したギルバート-マキサムストラテジーも また考慮される。この方法において、転写産物は、塩基特異的ＲＮａｓｅを用い
切断され、塩基特異的に終結した断片を生じ、次いで、分子量はマススペクトロ
メトリーにより評価する。
【００２２】 転写は、適当なＲＮＡポリメラーゼの添加により、リボヌクレオシド三リン酸
および選択された塩基特異的チェーンターミネイティング３'-デオキシリボヌク
レオシド三リン酸の存在下、プロモーターから開始される。好ましい態様では、
転写混合物はまた、修飾されたリボヌクレオシド三リン酸およびリボヌクレオチ
ド類似体、リボヌクレオチド三リン酸類似体を含み、それらは、生ずるＲＮＡ転
写産物の二次構造を減少し、および／またはＲＮＡポリメラーゼ酵素の終結およ
びターンオーバーの忠実性を増加し、それによって分析に利用できるＲＮＡ転写
産物の量が増加する。これら類似体には、二次構造を減少させるイノシン５'-三
リン酸(ＩＴＰ)、ＲＮＡポリメラーゼ酵素の終結およびターンオーバーの忠実性
を増加しそれによって分析に利用可能なＲＮＡ転写産物の量を増加する４-チオ ウリジン５'-三リン酸(ＵＴＰ)および５-ブロモＵＴＰまたは５'-ヨードＣＴＰ が含まれるが、これらに限らない。生じたＲＮＡ転写産物は、マススペクトロメ
トリーで分析する。
【００２３】 他の態様では、サンプルは、マトリクス利用レーザー吸収／イオン化マススペ
クトロメトリー(ＭＡＬＤＩ)による分析としてのマススペクトロメトリー用のマ
トリクス物質を更に含み、好ましくは、更に、飛行時間(ＴＯＦ)分析に使用する
。核酸の配列は、４つのチェーンターミネイティング塩基をそれぞれ含むシーケ
ンシング反応から得られるチェーンターミネイテッドＲＮＡ転写産物の観察すべ
き質量を並べることにより得られる。
【００２４】 本明細書中で提供するシーケンスする方法は診断的適応に使用し得る。診断的
適応は、既知の標的核酸中の遺伝的な変化の存在を決定する方法を含む。例えば
、標的核酸領域を増幅し、非コーディング鎖に相当する核酸鎖を単離する。プロ
モーターを含む核酸プローブは、天然の源から単離されるか、またはプロモータ
ー配列を形成する２つの相補的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることに
より合成的に組合せることができる。シーケンスされる核酸の領域と、または通
常の配列と相補的な少なくとも５ヌクレオチドの一本鎖領域は、コーディング鎖
の３'末端の位置での組換え法により導入される。好ましい態様では、プロモー ターを含んでいる核酸は、非コーディング鎖の３'末端またはコーディング鎖の ５'末端を介し、固体支持体と共有結合し、更に好ましくは、５'-または３'-チ オール酸化ＤＮＡが高密度でアミノシラン処理固体支持体と連結する。その連結
は、リンカー基の非存在下、または存在下であり、好ましくはアレイ形に並べら
れる。
【００２５】 一本鎖または二本鎖形の、シーケンスされる核酸の一本鎖３'オーバーハング は、非コーディング鎖の相補的配列とハイブリダイズし、ある態様では、１また
はそれ以上の核酸鎖間のニックは転写される前に連結される。転写は、適当なＲ
ＮＡポリメラーゼを用い、リボースヌクレオシド三リン酸および選択された塩基
特異的チェーンターミネイティング３'-デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存
在下、開始される。好ましい態様では、転写混合物はまた、イノシン５'-三リン
酸および／または１もしくはそれ以上の修飾されたリボヌクレオシド三リン酸を
含み、ＲＮＡ転写の分析を促進する。ＲＮＡ転写は、マススペクトロメトリーに
より、好ましくは、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦを用い分析される。
【００２６】 アレイ形で用いられるとき、プロモーターを含む核酸プローブのパネルが構成
され、アレイ形で連結され、そのため、標的核酸は配列全体、例えば遺伝子のコ
ーディング配列が置換され、単一の反応配列の間、遺伝子全体の核酸配列を決定
することができる。
【００２７】 転写ターミネーターおよびアテニュエーター配列を同定する方法も提供される
。転写条件を修飾し、全長の転写産物を生ずることにより、ｒｈｏ-依存性およ びｒｈｏ-独立性ターミネーターのような転写ターミネーター配列が、マススペ クトロメトリー法を用い、同定され得る。その方法の実施では、一本鎖領域であ
るシーケンスされる標的核酸の３'末端が、相補的配列と、コーディング鎖、プ ロモーターを含む核酸プローブの３'末端でハイブリダイズする。好ましい態様 では、プロモーターを含む核酸は、非コーディング鎖の５'末端またはコーディ ング鎖の３'末端を介し、固体支持体と共有結合し、更に好ましくは、５'-また は３'-チオール酸化ＤＮＡは高密度でアミノシラン処理固体支持体と連結する。
連結はリンカー基の存在下または非存在下でされ得、好ましくはアレイ形に並べ
られる。
【００２８】 転写は、ＲＮＡポリメラーゼ終結の効率を、その４-チオＵＴＰ、５-ブロモＵ
ＴＰまたは５'-ヨードＣＴＰのようなターミネーター配列の位置で増加する修飾
ＲＮＡ三リン酸類似体の非存在下または存在下で開始される。ある態様では、１
またはそれ以上の鎖中のニックが、転写開始前に適当な核酸リガーゼの添加によ
り連結され得る(即ち、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼの添加)。終結したＲＮＡ転
写産物の質量がマススペクトロメトリーにより決定される。観察された質量は、
転写のターミネーター依存停止の位置を示し、明確なゲノム位置由来の転写終結
部位の直前にある配列の並びを比較することにより、ターミネーターおよびアテ
ニュエーター配列を種々のＲＮＡポリメラーゼと同定し得る。
【００２９】 詳細な説明および好ましい態様 定義 特に定義しなければ、本明細書中で用いる技術的および科学的語は、本発明が
属する技術の当業者が通常理解している意味と同じである。本明細書で言及する
特許および刊行物すべてを本明細書に引用により含める。
【００３０】 本明細書で使用したように、“核酸”という語は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)
およびリボ核酸(ＲＮＡ)のようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、
ならびにＲＮＡまたはＤＮＡの何れかの類似体について言及し、例えばそれはヌ
クレオチド類似体から作成され、何れの場合も一本鎖または二本鎖形であり、お
よびＰＮＡでもある。核酸分子は、合成し得るか、または特に生体サンプルから
、当分野に既知の任意の多くの方法を用い単離することができ、選択する特定の
方法を特定の生体サンプルにあわせる。
【００３１】 本明細書中で使用するとき、ヌクレオチドは、ヌクレトシドモノ-、ジ-および
三リン酸を含む。ヌクレオチドはまた、ホスホロチオネートヌクレオチドおよび
デアザプリンヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドを含む。完全な一群の鎖伸
張ヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型をを含む４種の塩基それぞれとハイブリダイズで
きる４種のヌクレオチドについて言及する。
【００３２】 本明細書中で使用するとき、核酸プロモーター含有プローブは、プロモーター
をコードする二本鎖領域を含む核酸断片、およびプロモーターに関連するコーデ
ィング(センス)鎖の３'末端位置に少なくとも５ヌクレオチドを含む一本鎖領域 について言及する。目的の標的核酸を含む核酸の３'末端位置の一本鎖領域に相 補的となるように少なくとも５ヌクレオチドが選択される。３'末端への言及は 、標的が二本鎖分子中に含まれる場合、アンチセンス鎖への言及となる。標的が
二本鎖であるとき、生じた分子はコーディングおよび非コーディング鎖にニック
を有する。
【００３３】 他に核酸プロモーター含有プローブの一本鎖領域は、非コーディング(アンチ センス)鎖(プロモーターに関連する)の５'末端に少なくとも約５ヌクレオチドを
含み、そのヌクレオチドは標的核酸のコーディング鎖の５'末端の少なくとも約 ５つのヌクレオチドに相補的である。この態様では、標的は二本鎖でなければな
らない。 ハイブリダイゼーション後、生じた分子はコーディングおよび非
コーディング鎖中にニックを有する。
【００３４】 すべての態様では、ニックは転写前に連結される。しかし、本明細書中で示す
ように、ニック間に十分な距離、好ましくは少なくとも約＋７ヌクレオチドがあ
れば、それらを連結する必要はない。
【００３５】 本明細書中で使用するとき、標的核酸はシーケンスされた核酸分子である。巨
大分子の一部であり得る。標的核酸を含む分子は、少なくとも約５ヌクレオチド
であって、プロモーターを含む捕捉プローブにおいて３'末端(または選択された
配置に依存する５'末端)でオーバー ハングする少なくとも５つの隣接ヌクレオ
チドと十分に相補的となるように配列が設計されたヌクレオチドを含み得るか、
当該ヌクレオチドを含むように修飾され得る。標的核酸は二本鎖であって、３' または５'一本鎖オーバーハングであるかまたは一本鎖であり得る。ＲＮＡポリ メラーゼは、特に、三重複合体が一旦形成されると、一本鎖分子を転写できるか
、または転写する。標的はまた、ＲＮＡまたはＰＮＡでもよい(アミノ酸バック ボーンに塩基を結合することにより形成されるタンパク質核酸；例えばNielsen
et al., (1991) Science 254; 1497参照)。
【００３６】 本明細書中で使用するとき、核酸合成は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌク
レオチドを生ずる任意の方法であって、化学的または酵素学的反応を含むがこれ
らに限らない方法を含む方法について言及する。
【００３７】 本明細書中で使用するとき、塩基特異的に終結するリボヌクレオチドは、転写
終結を生ずるヌクレオチドの組込みにより転写中に生じるものである。塩基特異
的に終結するリボヌクレオシドトリホフェートは、塩基特異的に終結するリボヌ
クレオチドを合成するものであって、当業者に既知である。塩基特異的に終結す
るリボヌクレオシド三リン酸の例は、３'-ｄＧＴＰのような３'-デオキシリボヌ
クレオシド三リン酸および本明細書に記載する他のものおよび当業者に既知の他
のものを含むがこれらに限らない。
【００３８】 本明細書中で使用するとき、２つのヌクレオチド配列について言及する際の相
補性は、２つのヌクレオチド配列が、反対のヌクレオチドとの間で、好ましくは
、２５％未満、更に好ましくは１５％未満、更に好ましくは５％未満のミスマッ
チで、最も好ましくはミスマッチなく、ハイブリダイズできることを意味する。
好ましくは、２つの分子は高緊縮条件下ハイブリダイズする。
【００３９】 本明細書中で使用するとき；ミスマッチの割合の測定におけるハイブリダイゼ
ーションの緊縮は以下の通りである。 １)高緊縮：０．１ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃ ２)中緊縮：０．２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ ３)低緊縮：１．０ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ 同等の緊縮が、他の緩衝液、塩および温度を用いて達成することができると理解
される。
【００４０】 本明細書中で使用するとき、“アレイ”という語は、要素(member)または位置
についての秩序正しい配列について言及する。アレイは、任意の多くの要素また
は位置を含み得、多様な形をし得る。好ましい態様では、アレイは二次元的であ
り、ｎ×ｍ要素[式中、ｍおよびｎは同一または異なる整数である。]を含む。特
に好ましい態様では、ｎおよびｍは何れも４であるか、その倍数である。
【００４１】 “架橋剤”という語は技術的に理解されており、本明細書中で使用するとき、
核酸を不溶性-支持体に、好ましくは共有結合を介して固定化する試薬について 言及する。したがって、本明細書中で使用する適当な“架橋剤”は、不溶性支持
体の表面上に存在する官能基および核酸分子中に存在する官能基と反応すること
ができる多様な試薬を含む。その反応ができる試薬にはホモ-およびヘテロ-二機
能性(bifunctional)試薬、当分野に既知の多くのものを含む。ヘテロ二機能性試
薬が好ましい。
【００４２】 本明細書中で使用するとき、“チオール反応性機能(functionality)”という 語は、急速にまたは好ましくは求核性チオール成分と反応し、ジスルフィド結合
またはチオエーテル結合のような共有結合を生ずる機能について言及する。通常
、チオール基は、良好な求核基であり、好ましいチオール反応性機能は反応的求
電子性である。多様なチオール反応性機能は当分野に既知であり、例えば、ハロ
アセチル(好ましくはヨードアセチル)、ジアゾケトン、エポキシケトン、α,β-
不飽和カルボニル(α,β-エノン(enone))および他の反応性ミカエル受容体(マレ
インイミドを含む)、酸ハリド、ベンジルハリドなどを含む。ある態様では、ジ スルフィドの遊離チオール基はジスルフィド交換を含むジスルフィド結合のよう
な形成により遊離チオール基と反応できる。本明細書中で使用するとき、“チオ
ール反応的”架橋試薬は、少なくとも１つのチオール反応性機能を含むか、含む
ように修飾できる架橋試薬(または表面)について言及する。チオール基の反応は
、当分野において通常である適当な保護基でのブロックにより一時的に妨げられ
得る(例えば、T.W. Greene and P.G.M. Wuts "Protective Groups in Organic S
ynthesis," 2nd ed. John Wiley & Sons, (1991)参照)。
【００４３】 本明細書中で使用するとき、選択的に切断可能なリンカーは、光開裂可能リン
カー、化学的切断可能リンカーおよび酵素学的切断可能リンカー(即ち、制限エ ンドヌクレアーゼ部位またはリボヌクレオチド／ＲＮａｓｅ消化)のような、選 択条件下、切断されるリンカーである。リンカーが、支持体と固定化ＤＮＡとの
間に介在する。
【００４４】 本明細書中で使用するとき、“タンパク質”、“ポリペプチド”および“ペプ
チド”という語は、遺伝子産物のような翻訳した核酸について言及するとき、相
互に置き換えて使用する。
【００４５】 本明細書中で使用するとき、“サンプル”は、検出される物質を含む組成物に
ついて言及する。好ましい態様では、サンプルは“生体サンプル”であって、そ
れは、動物、特にヒトを含む、哺乳類、植物、細菌、カビ、原生生物およびウイ
ルスを含むがこれらに限らない生物から得られる任意の物質について言及する。
生体サンプルは任意の形態であり得、組織、細胞および生検物質のような固体物
質、ならびに尿、血液、唾液、羊水、脳髄液および含嗽液(口内細胞を含む)を含
む体液を含む。好ましくは固体物質は液体と混合される。
【００４６】 本明細書中で使用するとき、“基体”または“固体支持体”は、サンプルが本
明細書に記載の物質のように沈殿する不溶性支持体を意味する。適当な基体の例
は、シリカゲルを含む(これに限らない)ビーズ、調節細孔ガラス(controlled po
re glass)、磁石、デキストラン、アガロースおよびセルロース、キャピラリー 、ガラスファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、ア ルミニウム、銅およびシリコン)、マルチウェルプレートを含むプラスチック物 質または膜(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニル インデンジフルオリド)のような平坦支持体、ピン、コンビナトリアル合成(comb
inatorial synthesis)もしくは分析に適当なピンのアレイのようなもの、または
ウェハー、特にシリコンウェハーのような平坦表面のピン中のビーズ(プレート を有するかまたは有しない)を含む。
【００４７】 本明細書中で使用するとき、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメ
ラーゼおよびＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼにつて言及する。任意のＲＮＡポリ
メラーゼは、特定プロモーター配列を認識し、転写開始およびＲＮＡ転写物の伸
張が可能であり、それらが本明細書の範囲となることを目的とする。本明細書で
提供される方法で使用する典型的なＲＮＡポリメラーゼは、１)Halobacterium、
Methanobacterium、Methanococcus、SulfolobalesおよびThermoplasmaのような 古細菌、２)グラム陰性細菌、例えばEscherichia coliおよびSalmonellaおよびS
higella、グラム陽性細菌、例えばBacillus subtilisおよびStaphlococcus aure
usのような真正細菌、３)Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、ニックの入ったＳＰ６およびＮ ４のようなバクテリオファージ、４)ＤＮＡウイルス、５)インフルエンザウイル
スのようなＲＮＡウイルス、６)小麦のような植物、ならびに７)カビから単離し
た真核性ＲＮＡポリメラーゼII、例えばSaccharomyces cerevisiaeおよび高等真
核生物、例えば哺乳類から得られるがこれらに限らないものを含む。ＲＮＡファ
ージＱβレプリカーゼ(国際ＰＣＴ出願番号PCT/US87/00880および5,270,184)は 本明細書中で使用するＲＮＡポリメラーゼの語の範囲に含まれている。植物およ
び動物を含む真核組織から単離されるものといった真核性ＲＮＡポリメラーゼは
、真核性細胞に感染するウイルス由来のウイルス性プロモーターを含む真核性プ
ロモーターを認識する。そのポリメラーゼをも本明細書の目的とする。Ｔ７、Ｔ
３、およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼはクローニングされており、配列およびそ
れを精製する方法ならびに細菌性ＲＮＡポリメラーゼを精製する方法および真核
性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼは既知である。加えて、多くのＲＮＡポリメラ
ーゼが、商業上多量に利用可能、商業的に利用可能なベクターから簡単に作成す
ることも可能である。上記ポリメラーゼおよび他のＲＮＡポリメラーゼ、それぞ
れ用のプロモーターの配列もまた当業者に既知である。
【００４８】 本明細書中で使用するとき、プロモーター領域は、ＤＮＡの発現を調節する遺
伝子のＤＮＡ部分であって、操作可能となるように連結されている部分について
言及する。プロモーター領域は、ＤＮＡの特定配列を含み、その配列はＲＮＡポ
リメラーゼ認識、結合および転写開始に重要である。プロモーター領域の部分を
プロモーターとして言及する。加えて、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラー
ゼの、この認識、結合および転写開始活性を修飾する配列を含む。これらの配列
は、シス作用性因子であるか、トランス作用性因子に応答し得る。調節の性質に
依存するプロモーターは構成されるか調製され得る。構造プロモーターは常にス
イッチが入っている。調節可能プロモーターは、スイッチを入れるかまたは切る
特定シグナルを必要とする。発生学的調節プロモーターは、発生の機能としてス
イッチを入れるかまたは切るプロモーターである。プロモーターは共通配列であ
り、または多様である。非野生型プロモーターを用いるとき、転写は、検出可能
な転写物の合成に十分である速さで生じ、そして、その転写は、典型的に、野生
型または天然プロモーターがＲＮＡポリメラーゼにより用いられインビトロで核
酸が転写される場合に生じる速さの少なくとも約５-１０％である。各種のＲＮ Ａポリメラーゼは、特定のプロモーター配列に特異的である。３つのバクテリオ
ファージＲＮＡポリメラーゼ(Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６)は、それぞれ自身の特
異的ＤＮＡプロモーター配列を有する。ＲＮＡポリメラーゼが鋳型のプロモータ
ー配列に結合し、転写が開始した後、プロモータ配列からＲＮＡポリメラーゼが
外れる。次いで、ＲＮＡポリメラーゼは、(１)ＲＮＡ出発物質を使い切り、(２)
転写反応が特定ヌクレオチド、ヌクレオシドまたは類似体により終結し、(３)Ｒ
ＮＡポリメラーゼと鋳型が解離し、転写が自然に停止し、または(４)ＤＮＡ鋳型
の最後に到達するまで、鋳型に沿って転写が継続する。
【００４９】 本明細書中で使用するとき、“プロモーターを含む核酸”は、ＲＮＡポリメラ
ーゼ分子の特異的結合を指示するヌクレオチドの配列を含む核酸であり、二本鎖
ＤＮＡに結合し解離し、リボヌクレオチド三リン酸の存在下ＲＮＡ合成を開始し
得るオープン転写開始複合体(open transcription initiation complex)を形成 する。更に、機能性(functional)プロモーター配列は、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメ
ラーゼが結合、解離、開始複合体の形成および転写開始するヌクレオチドの配列
である。プロモーターを含む核酸捕捉プローブは、二本鎖分子について言及し、
プロモーター領域、および標的核酸が特に高緊縮条件下ハイブリダイズする少な
くとも約５つのヌクレオチドの３'オーバーハングを含む。典型的に、そのハイ ブリダイゼーションは、標的とプロモーターを含む捕捉プローブとの間で同一の
約５つの隣接塩基対を必要とする。転写開始後、ＲＮＡポリメラーゼ(またはそ のサブユニット)は、ポリメラーゼ、ＤＮＡおよび発生ＲＮＡ転写産物を含む三 重複合体の一部である。
【００５０】 本明細書中で使用するとき、“コーディング鎖”は、プロモーターから開始し
た相当するｍＲＮＡ分子と同じ方向を有する、プロモーターを含む核酸の核酸鎖
について言及する。そのため、それはセンス鎖について言及する。非コーディン
グ鎖はＲＮＡポリメラーゼにより転写されるアンチセンス鎖である。
【００５１】 本明細書中で使用するとき、“天然のヌクレオシド(またはリボヌクレオシド)
三リン酸”または“天然のヌクレオチド”またはリボヌクレオチド三リン酸は、
天然に生ずるＲＮＡの通常の前駆体のうち何れか１つ、即ち、ＡＴＰ、ＧＴＰ、
ＣＴＰ、またはＵＴＰを意味する。“ヌクレオシド三リン酸類似体”または“ヌ
クレオチド類似体”は、天然のヌクレオチドに類似する任意のヌクレオシド三リ
ン酸であって、天然のヌクレオシドまたはヌクレオチドに比べ１またはそれ以上
の化学修飾を有するものを意味する。
【００５２】 本明細書中で使用するとき、“マトリクス物質”は、プロトン供与性、ＵＶ吸
収物質、通常有機酸であるマススペクトロメトリーで使用する物質について言及
し、その物質はＭＡＬＤＩの間に容易にイオン化する結晶化マトリクス核酸構造
を形成する。典型的なマトリクス物質は３-ヒドロキシピコリン酸溶液(３-ＨＰ Ａ、５０％アセトニトリル、１０％クエン酸アンモニウムにおいて０．７Ｍ)で ある。
【００５３】 本明細書中で使用するとき、“コンディショニング”は、質量分析前に、分析
する核酸を修飾し、例えば気化(volatization)に必要なレーザーエネルギーを減
少させ、および／または断片化を最少とするプロセスについて言及する。コンデ
ィショニングは、核酸、好ましくは固定化後行われ得る。コンディショニングの
例は、例えば陽イオン交換による核酸分子のホスホジエステルバックボーンの修
飾であり、ヌクレオチド単位あたりの結合する陽イオンにおける不均一により広
がるピークが除去される。核酸分子を、アルキルヨウ化物、ヨードアセトアミド
、ヨードエタノール、または２,３-エポキシ-１-プロパノールのようなアルキル
化剤と接触することにより、核酸分子のモノチオホスホジエステル結合はホスホ
トリエステル結合に変換する。同様に、ホスホジエステル結合を、トリアルキル
シリルクロリドを用い変換すると非電荷誘導体を生ずる。コンディショニングは
また、合成の間に修飾ヌクレオチドを核酸に組込むことにより行い得る。その修
飾ヌクレオチドは、Ｎ５-、Ｎ７-またはＮ９-デアザプリンヌクレオチドまたは リボヌクレオチドのようなプリン類似体により、脱プリン化の感度の減少(ＭＳ 間の断片化)に使用し得る。修飾ヌクレオチドはまた、アルキル化する、ＲＮＡ ビルディングブロック、オリゴヌクレオチドトリエステル、ホスホロチオネート
機能、またはＰＮＡのような偽オリゴヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチ
ドを有するコンディショニングしたＲＮＡ転写産物の調製では、選択されたＲＮ
Ａポリメラーゼが、修飾ヌクレオチドをＲＮＡ転写産物中に組込めなければなら
ない。
【００５４】 シーケンシングの方法 核酸をシーケンスする質量分析法を提供する。特に、シーケンスする方法は、
プロモーターをコードする二本鎖領域および標的核酸の相補的領域とハイブリダ
イズする一本鎖領域を含む、核酸を含むプローブを用いる。核酸プロモーターを
含む捕捉プローブは、好ましくは固体支持体に固定化される。一本鎖領域は、シ
ーケンスされる核酸およびプローブの５隣接一本鎖ヌクレオチドと同一の一本鎖
領域の少なくとも５ヌクレオチドを含む、標的核酸の相補的な部分とハイブリダ
イズする。
【００５５】 核酸プロモーター含有プローブに標的がハイブリダイズした後、核酸配列を、
プロモーターから開始され標的核酸を介して転写される一群のネストした塩基特
異的チェーンターミネイテッドＲＮＡ転写産物を生じることにより、決定する。
生じるネストしたＲＮＡ転写産物をマススペクトロメトリーを用い分析する。
【００５６】 ＤＮＡは時折、シーケンシングに好ましい媒体である一方、本明細書の方法は
により、ＲＮＡ転写産物がシーケンスされる。ＲＮＡ断片は、マトリクスアシス
トレーザー吸収/イオン化(ＭＡＬＤＩ)マススペクトロメトリーの間、ＤＮＡ断 片よりも安定する。理論によると結合しないが、促進された安定性は、ＲＮＡの
糖部分の２'-ヒドロキシル基の存在により生じ、ＭＡＬＤＩプロセスの間、脱プ
リン化の減少を助ける。
【００５７】 ＲＮＡポリメラーゼおよびプロモーター ＲＮＡ分子のインビトロの転写を目的とし得る任意のＲＮＡポリメラーゼは、
本明細書に記載の方法で使用することを目的とする。好ましいＲＮＡポリメラー
ゼは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼである。ＲＮＡポリメラーゼ分子を単離し
および精製する方法は、当業者に既知である：Ｑβレプリカーゼ(seee、例えば 米国特許番号5,696,249、再発行：35,443およびProcedures in Nucl. Acids Res
each, Cantoni and Davies, eds., Volume 2, pp. 829-839, Harper and Rowe,
NY中のEoyang et al., (1971))；細菌(例えばE.coli、Burgess and Jendrisak(1
975)Biochemistry 14:4634-4638およびHager et al., (1990)Biochemistry 29:7
890-7894参照；Leishmania、例えばSadhukhan et al., (1997)Mol. Cell. Bioch
em. 171; 105-114；Bacillus subtilis、Giacomoni(1980)Eur. J. Biochem. 106
:579-591)；ファージ(例えば、T7、McDonnell et al., (1977)J. Mol. Biol. 89
:719-736およびStudier et al., (1969) Virology 39:562-574;またHe et al.,
(1997) Protein Expr. Purif. 9:142-151)；ウイルス(例えば、rhabdovirus、Da
s et al., (1996) Methods Enzymol. 275:99-122参照；turnip mosiac virus, D
eidman et al., (1997)J.Viral Meth. 64:184-195参照;vaccinia、Gershon et a
l., (1996)Methods Enzymol. 275:35-57)；哺乳類(例えば、yeast polII, Koles
ke et al., (1996)Methods Enzymol. 273:176-184;ヒトpolII、Maldonado et al
., (1996) Methods Enzymol. 274:72-100)。加えて、多くの原核、真核、バクテ
リオファージおよびウイルスＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ３、Ｔ７およびＳＰ
６は、商業上利用可能であり(例えば、Stratage, La Jolla, CA; Boehringer Ma
nnheim, Indianapolis, IN;Pharmacia, Uppsala, Sweden;およびSigma Chemical
Corp, St. Louis, MO)、および／または既知である。プロモーターも既知であ り、容易に利用可能である(例えば、Promega, Madison WIより利用できるｐＧＥ
Ｍプラスミドシリーズ、米国特許番号4,766,072も参照。それはｐＧＥＭプラス ミドの構成について記載されている)。
【００５８】 方法の実施において、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼを使用し得る。例えば、本明細書中で提供される方法に使用し得る
ＲＮＡポリメラーゼには、１)Halobacterium、Methanobacterium、Methanococcu
s、SulfolobalesおよびThermoplasmaのような古細菌、２)グラム陰性細菌、例え
ばEscherichia coliおよびSalmonellaおよびShigella、グラム陽性細菌、例えば
Bacillus subtilisおよびStaphlococcus aureusのような真正細菌、３)Ｔ７、Ｔ
３、ＳＰ６およびＮ４のようなバクテリオファージ、４)ＤＮＡウイルス、５)イ
ンフルエンザウイルスのようなＲＮＡウイルス、６)小麦のような植物および植 物ウイルスおよびカブモシアックウイルス、ならびに７)カビから単離した真核 性ＲＮＡポリメラーゼII、例えばSaccharomyces cerevisiaeおよび高等真核生物
、例えば哺乳類(再検討のため、In RNA Polymerase and the Regulation of Tra
nscription, Rezinkoff et al., eds, Elsevier, NY参照)から得られたものを含
むがこれらに限らない。また、本明細書での使用に含まれるのは、ＱβＲＮＡフ
ァージのＱβレプリカーゼである(例えば、米国特許番号5,670,353、5,696,249 および再発行：35,443参照)。
【００５９】 シーケンスされる核酸および鋳型に適当なＲＮＡポリメラーゼの選択は、技術
者の技術の範囲内であり、シーケンスされる核酸分子および選択されたプロモー
ター領域により変化する。その選択は、当業者に既知の教えを用い従い経験的に
決定でき、それらには本明細書に記載のものを含む。シーケンスされる好ましい
核酸分子はＤＮＡ分子である。ＲＮＡおよび、特にＰＮＡ(タンパク質核酸)はま
た、適当なＲＮＡポリメラーゼの選択に応じてシーケンシングに影響を与える。
【００６０】 本明細書に記載したシーケンシング方法に使用する核酸プロモーター含有プロ
ーブ、それぞれにはプロモーターを含む。本明細書の方法に使用するプロモータ
ーは任意の源から得られ得、選択されたＲＮＡポリメラーゼにより認識される配
列を基にして合成的に調製され得る。例えば、プロモーターを含む核酸は、細菌
、ウイルス、ファージおよび真核性生物のような多種多様な生物から、クローニ
ングすることにより直接得られるか、または商業的に利用可能な発現ベクターか
ら得られる(例えば、Boehringer MannheimおよびPharmaciaのＴ７、Ｔ３、ＳＰ ６およびλPLおよびλPRプロモーター；ｂｌａまたはｌａｃプロモーター、ＲＳ
Ｖ-ＬＴＲプロモーターおよびＦ９-１プロモーター；Stratagene)。適当なプロ モーターの選択は、シーケンスされる核酸、シーケンシングの条件、および最も
重要であるのは転写用に選択するＲＮＡポリメラーゼに依存する。
【００６１】 プロモーターは、プロモーターのコーディングおよび非コーディングＤＮＡ鎖
をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより合成し得る( 実施例４参照)。核酸の別々の鎖は、好ましくは核酸合成技術により得られる。 プロモーターの集合に使用するオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション
後に標的ＤＮＡがハイブリダイズできるコーディング鎖の３'末端の位置に一本 鎖領域が存在するように設計する。
【００６２】 核酸プロモーター含有プローブの固定化 好ましい態様では、核酸プロモーター含有プローブを、直接か、架橋剤により
、本明細書中で提供する固体支持体に固定化する。プローブを、標的とハイブリ
ダイズする前、またはハイブリダイズした後、固定化し得る。好ましくは、そし
て、最も都合よくはハイブリダイゼーションは固体支持体に固定化した後行う。
プローブは、好ましくはコーディング鎖の５'末端または非コーディング鎖の３'
末端を介し固定化される。
【００６３】 他の態様では、プロモーターおよび下流標的核酸を、転写単位として、ゲノム
ＤＮＡから、プライマーによる増幅またはハイブリダイゼーションクローニング
技術により、単離することができる。次いで、プロモーターおよび標的をコード
するＤＮＡを、コーディング鎖(センス鎖)の５'末端または非コーディング鎖の ３'末端の終端ヌクレオチドを介し固体に固定化し得る。更に以下で考察するよ うに、連結基をＰＣＲプライマーに組込み、固相への有向固定化を行うプロモー
ター含有核酸鋳型の単離に使用し得る。プロモーターを認識する適当なＲＮＡポ
リメラーゼの使用により、チェーンターミネイティングヌクレオチドが存在し、
シーケンスを決定できる一群のネストした断片が生ずる。
【００６４】 好ましい支持体は核酸の連結を高密度で支持できるものであり、そのため、好
ましくは、共有結合した核酸が、基質上に、密度が少なくとも約２０ｆｍｏｌ／
ｍｍ2、より好ましくは少なくとも約７５ｆｍｏｌ／ｍｍ2、それでもより好まし
くは少なくとも約８５ｆｍｏｌ／ｍｍ2、またさらに好ましくは少なくとも約１ ００ｆｍｏｌ／ｍｍ2、および最も好ましくは少なくとも約１５０ｆｍｏｌ／ｍ ｍ2で存在する。基体のなかで、本明細書中で提供する基体に核酸を固定化する 特定の方法の使用に最も好ましい基体は、シリコンであり、その一方、あまり好
ましくない基体にはポリアクリルアミドのような重合体物質を含む。本明細書中
で提供するアレイを作成する方法に使用する基質には、任意の多様な不溶性支持
体物質を含み、それらには、シリカゲル、調節細孔ガラス、セルロース、ガラス
ファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、アルミニウ ム、シリコンおよび銅)、プラスチック物質(例えば、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリアミド、ポリビニルデンジフルオリド)およびシリコンを含むが、こ れらに限らない。
【００６５】 架橋試薬を用いない方法の態様では、修飾核酸は、直接、適当な機能化表面と
反応し、固定化核酸を生ずる。そのため、例えば、ヨードアセチル修飾表面(ま たは他のチオール反応性表面機能)は、チオール修飾核酸と反応し、固定化核酸 を提供することができる。
【００６６】 架橋試薬を使用する態様では、架橋試薬は、不溶性支持体上に固定化した核酸
が高密度となるように選択する。架橋試薬(および支持体表面または核酸分子の 機能化に使用する他の試薬)を選択し、支持体表面から固定化核酸分子を任意の 望ましい一定距離だけ離し、お互いから固定化核酸を任意の望ましい一定距離だ
け離す。そのため、核酸分子の立体的障害物を、適当な架橋剤の選択により減少
するか、除去することができる。ある態様では、架橋剤は、複数の核酸が単一の
架橋部分に結合するデンドライマー(dendrimer)合成に使用するとき複数の反応 機能を提供するように選択される。好ましくは、架橋剤は、核酸分子に高い反応
性があり、急速の、完全な、および／または選択的反応を提供するように選択さ
れる。好ましい態様では、試薬(例えば、チオール基試薬およびチオール反応機 能)の反応体積は小さい。
【００６７】 修飾核酸プロモーター含有プローブおよびリンカー 本明細書中で使用するための、好ましい核酸プロモーター含有プローブは、“
チオール修飾核酸”、即ち、少なくとも１つの反応性チオール部分を含むように
誘導された核酸である。更に下記実施例１で詳細したように、少なくとも１つの
反応性チオールを含む核酸を、３'または５'ジスルフィドを含む核酸を好ましく
は後の反応で拮抗しない(即ち、ヨードアセトイミド機能と反応しない)還元剤で
処理することにより、好ましくは合成する。ジスルフィド誘導性核酸は様々な方
法で合成され得る。例えば、核酸は、ジスルフィド含有修飾試薬との反応により
３'または５'末端で修飾され得る。他に、チオール酸プライマーは、酵素学的に
、または非酵素学的に連結する核酸によりなり得る。５'ホスホロアミデイト機 能はまたチオールまたはジスルフィド含有シトシンまたはデオキシシトシンへの
結合点を提供し得る。ジスルフィド修飾核酸の還元に適当な還元剤の例には、ト
リス-(２-カルボキシエチル)ホスフィン(ＴＣＥＰ)(好ましくは１-１００ｍＭの
範囲の濃度(最も好ましくは約１０ｍＭ))がｐＨ３-６の範囲(最も好ましくは約 ４．５)、温度２０-４５℃の範囲(最も好ましくは約３７℃)で、約１ないし約１
０時間(最も好ましくは約５時間)反応すること、ジチオスレイトール(好ましく は２５ないし１００ｍＭの濃度範囲(反応物が単離されるかどうかに依存する)) がｐＨ６-１０(最も好ましくは約８)および温度２５-４５℃(最も好ましくは約 ３７℃)で、約１ないし約１０時間(最も好ましくは５時間)反応することを含む 。ＴＣＥＰは、反応し得る低ｐＨで利点がある。この低いｐＨは、チオールを効
率的にプロトン化し、そのため、チオールの求核反応を抑制し、高いｐＨで使用
する他のジスルフィド還元剤を有する場合よりも副作用が少ない。
【００６８】 以下の実施例１で更に記載するような、好ましい二機能性架橋剤は、Ｎ-スク シンイミジル(４-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(ＳＩＡＢ)である。他の 架橋剤には、ジマレイミド、ジチオ-ビス-ニトロ安息香酸(ＤＴＮＢ)、Ｎ-スク シンイミジル-Ｓ-アセチル-チオアセテート(ＳＡＴＡ)、Ｎ-スクシンイミジル- ３-(２-ピリジルジチオールプロピオネート)(ＳＰＤＰ)、４-(Ｎ-マレイミドメ チル)シクロヘキサン-１-カルボン酸スクシンイミジル(ＳＭＣＣ)および６-ヒド
ラジノニコチンイミド(nicotimide)(ＨＹＮＩＣ)が含まれるが、これらに限らず
、新規プロセスにも使用され得る。架橋剤の更なる例は、例えばWong "Chemistr
y of Protein Conjugation and Cross-Linking, " CRC Press (1991), and Herm
anson, "Bioconjugate Techniques" Academic Press (1995)参照。
【００６９】 他の態様では、核酸を、マススペクトロメトリーで切断する光開裂可能または
光に不安定なリンカー部分を用い固定化する。典型的な光に不安定な架橋リンカ
ーには、３-アミノ-(２-ニトロフェニル)プロピオン酸(Brown et al.(1995) Mol
ecular Diversity, pp.4-12 and Rothschild et al., (1996) Nucl. Acids Res.
24:361-66)を含むがこれらに限らない。また国際特許出願番号ＷＯ９８/２００
１９参照。
【００７０】 核酸プロモーター含有プローブを、固体支持体に、標的核酸分子(Ｔ)の適当な
機能(Ｌ')と捕捉分子の適当な機能(Ｌ)との間の可逆性または不可逆性連結を介 して直接結合させる。その形式は米国特許番号５，５０３，９８０に示され多も
のに類似する。可逆性連結には、マススペクトロメトリー条件下で切断される連
結を含む。これらには、電荷移動複合体のような光開裂可能結合、および比較的
安定な有機性基間で形成された不安定結合が含まれるが、これらに限らない。
【００７１】 更に、連結は４級アンモニウム基であるＬ'で形成され得、その場合、固体支 持体の表面は好ましくは陰性の電荷を有し、陰性電荷の核酸バックボーンと反発
する。そのため、質量分析計の分析に必要な脱着を促進する。脱着は、レーザー
パルスにより生ずる熱によるか、および／または、Ｌ'に依存する、Ｌ'発色団と
共鳴するレーザーエネルギーの特定吸収によるか、何れかにより生ずる。
【００７２】 そのため、Ｌ-Ｌ'化学的性質はジスルフィド結合の型であり得(例えば、メル カプトエタノールまたはジチオエリトロールにより化学的切断可能、ビオチン／
ストレプトアビジンシステム、トリチルエーテル基のヘテロ二機能性誘導体、例
えばKoester et al.,(1990)"A Versatile Acid-Labile Linker for Modificatio
n of Synthetic Biomolecules, " Tetrahedron Letters 31:7095参照)、その結 合は、穏やかな酸性条件下およびマススペクトロメトリー条件下、レブリニル基
を切断し得る殆ど中性のヒドラジニウム／酢酸緩衝液を有する条件下であって、
トリプシンのようなエンドペプチダーゼ酵素により切断可能なアルギニン−アル
ギニンまたはリシン-リシン結合またはピロホスファターゼにより切断可能なピ ロリン酸結合、または例えばリボヌクレアーゼまたはアルカリにより切断可能な
オリゴデオキシヌクレオチド配列間のリボヌクレオチド結合を有する条件下、切
断され得る。
【００７３】 機能、ＬおよびＬ'はまた、電荷移動複合体を形成し得、そのため、一時的な Ｌ-Ｌ'連結を形成する。多くの場合、“電荷移動バンド”は、ＵＶ／ｖｉｓスペ
クトロメトリー(例えば、Organic Charge Transfer Complexes by R. Foster, A
cademic Press, 1969)により決定され得るため、レーザーエネルギーは、電荷移
動波長の相当するエネルギーに変化し得、そのため、固体支持体から特定の脱着
が開始し得る。幾つかの組み合わせが本目的であり、ドナー機能が固体支持体か
または検出される核酸分子に結合するか、またはその逆か、何れかであると当業
者は認識する。
【００７４】 他のアプローチでは、可逆性Ｌ-Ｌ'連結は、比較的適当な基を均等に形成する
ことにより生じ得る。レーザーパルスの影響のもと、脱着(上記考察したような)
およびイオン化が基の位置で生ずる。他の有機性基群が選択され得、それらの間
の結合を均等に切断するために必要な解離エネルギーに関し、相当するレーザー
波長が選択され得る(例えば、Reactive Molecules by C. Wentrup, John Wiley
& Sons, 1984参照)と当業者は認識する。
【００７５】 既述のように、固定化を含む方法の幾つかの態様を本明細書の目的とする。こ
れらには、１)プライマー核酸が固体支持体に固定化され、標的核酸がハイブリ ダイズし、プロモーター配列を形成すること、２)プロモーターをコードする二 本鎖核酸(増幅または単離した)を、連結を介して、事前に決定した鎖に固定化し
、インビトロの転写を事前に決定したデオキシ リボヌクレオチド存在下開始す
ること、および３)利用可能な配列情報がある場合に増幅され得る標的核酸が３'
オーバーハングを有する二本鎖核酸補足プローブとハイブリダイズし、生じたハ
イブリッドを固定化することが含まれるが、これらの態様に限らない。
【００７６】 プライマー核酸を固体支持体に固定化し、標的核酸をそれにハイブリダイズす
る場合の態様では、切断可能リンカーの含有により、プライマーＤＮＡを５'末 端で固定化する。そのため遊離３'-ＯＨは、遊離ＤＮＡ鎖に標的ＤＮＡ“ハイブ
リダイズ”し、転写を開始させるのに有用となる。
【００７７】 核酸を固体支持体に固定化するための、当業者に既知の任意のリンカーを、本
明細書中で使用し、核酸を固体支持体に連結する。本明細書中の好ましいリンカ
ーは、選択的に切断されるリンカーであり、特に本明細書中で例示するものであ
る。他のリンカーには、ビスマレイミデオトキシプロパンのような酸切断可能リ
ンカーおよび酸に不安定なトリチルリンカーを含む。酸切断可能リンカー、光開
裂および熱感受性リンカーをも使用し、特にその場合、容易に反応をする標的試
薬を切断する必要がある。
【００７８】 酸切断可能リンカー 酸切断可能リンカーには、ビスマレイミデオトキシプロパン、およびアジピン
酸ジヒドラジドリンカー(例えば、Fattom et al., (1992) Infection & Immun.
60:584-589)および細胞内トランスフェリンサイクリング経路に導入する重要な トランスフェリン部分を含む酸に不安定なトランスフェリンコンジュゲート(例 えば、Welhoener et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:4309-4314)を含むがこれ
らに限らない。
【００７９】 光開裂リンカー 光開列リンカーは、光にさらされることにより切断され(例えば、Goldmacher
et al., (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107参照)、光にさらされることにより標
的試薬を放出するリンカーである。光にさらされることにより切断する光開裂リ
ンカーは、光にさらされることにより標的試薬を放出することが知られている( 例えば、Hazum et al., (1981)、システインの光開裂保護基としてニトロベンジ
ル基の使用を記載しているPept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt,
K(Ed), pp.105-110、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体、グリシン 共重合体、フルオレセイン共重合体およびメチルローダミン共重合体を含む水溶
性光開裂共重合体について記載するYen et al., (1989) Makromol. Chem 190:69
-82、ＵＶ光(350nm)近辺にさらすことにより光分解する架橋リンカーおよび試薬
について記載するGoldmacher et al., (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107、およ
び光開裂可能な連結を作成するニトロベンジルオキシカルボニルクロリド架橋連
結試薬について記載するSenter et al., (1985) Photochem. Photobiol 42:231-
237)。好ましい態様では、核酸は、マススペクトロメトリーの間に切断される光
切断可能リンカー部分を用い固定化される。
【００８０】 化学的に切断可能リンカー 様々な化学的切断可能リンカーを用い、固定化核酸と固体支持体との間に切断
可能な結合を導入する。酸に不安定なリンカーには、マススペクトロメトリー、
特にＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ用の化学的に切断可能リンカーが今のところ好まし
い。酸に不安定な結合が、３-ＨＰＡマトリクス溶液の添加による核酸のコンデ ィショニングの間に切断されるためである。酸に不安定な結合は、別のリンカー
基、例えば酸に不安定なトリチル基として導入されるか、または１またはそれ以
上のシリルインターヌクレオシドブリッジを、ジイソプロピルシリルを用い導入
することにより合成核酸リンカー中に組み入れられ、ジイソプロピルシリル-連 結オリゴヌクレオチド類似体を形成する。ジイソプロピルシリルブリッジが、Ｄ
ＮＡバックボーン中のホスホジエステル結合に、１．５％トリフルオロ酢酸(Ｔ ＦＡ)または３-ＨＰＡ／１％ＴＦＡ ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦマトリクス溶液のような
穏やかな酸性条件下で置換されると、ＤＮＡ分子中に１またはそれ以上の鎖内部
ブレイクが導入される。ジイソプロピルシリル連結オリゴヌクレオチド前駆体お
よび類似体を調製する方法は当業者に既知である(例えば、Saha et al., (1993)
J. Org. Chem. 58:7827-7831)。これらオリゴヌクレオチド類似体は、ジイソプ
ロピルシリル誘導デオキシリボヌクレオシドを用いる固体状態オリゴヌクレオチ
ド合成方法を用い容易に調製される。
【００８１】 核酸の修飾 Ａ．質量修飾 ある態様では、３'-または５'-末端以外の位置での核酸修飾が使用し得る。３
'および５'位以外の位置のヌクレオチド糖部分の修飾が、通常の方法を通して可
能である。また、核酸塩基は、例えば、F. Eckstein, ed., "Oligonucleotides
and Analogues: A Practical Approach, " IRL Press (1991)に記載のように修 飾され得る。そのリンカーアームは修飾されチオール部分を含み得る。他に、チ
オール基が、修飾リン酸バックボーンにより提供される窒素原子中心に結合し得
るため、バックボーン修飾核酸が使用され得る。
【００８２】 好ましい態様では、上記のような核酸の修飾は、核酸分子のその相補体へのハ
イブリダイズ能を事実上損なわない。そのため、任意の修飾では、Watson-Crick
塩基対を要因とする核酸の機能を実質的に修飾することは避けるべきである。核
酸は、非末端チオール基が存在するために修飾され、支持体に固定化されるとき
核酸は自己相補的塩基対が可能となり、二重領域を有する“ヘアピン”構造を形
成する。
【００８３】 Ｂ．他の修飾ＲＮＡ類似体 本明細書中に記載する方法の実施において、一群のネストした塩基特異的チェ
ーンターミネイテッドＲＮＡ転写物は、修飾塩基特異的チェーンターミネイティ
ングリボヌクレオチド類似体の組込みによる転写の間に生ずる(または修飾マキ サム-ギルバートストラテジーにおけるＲＮａｓｅにより特異的に切断される)。
ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子への組込みにおいて転写伸張の配列特異的
停止を生ずる任意のリボヌクレオシド三リン酸類似体は、本明細書中の方法に使
用し得る。現在、好ましいリボヌクレオチド類似体は３'-デオキシリボヌクレオ
チドであり、転写の塩基特異的に終結する(例えば、Axelrod et al., (1985) Bi
ochemistry 24:5716-5723;Tyagarajan et al., (1985) Biochemistry 30:10920-
10924)。
【００８４】 ある態様では、塩基特異的チェーンターミネイティングリボヌクレオシド三リ
ン酸類似体に加えて、付加的リボヌクレオチド類似体を加え、生ずるＲＮＡ転写
物の二次構造を少なくするか、および／または成熟前の転写終結を防止または停
止するかまたはＲＮＡ切断を防止または停止し得る。例えば、イノシン５'-三リ
ン酸を用いるリボイノシンの組込みにより、ＲＮＡ産物の二次構造が少なくなる
ことが知られている。ジヌクレオチドグアニンイニシエーターの存在下、イノシ
ン５'-三リン酸は、インビトロ転写反応においてＧＴＰに効率的に置換され得る
(例えば、Axelrod et al., (1985) Biochemistry 24:5716-5723)。
【００８５】 加えて、修飾リボヌクレオチド類似体を転写混合物に加え、転写終結および／
または転写産物放出の効率を増加し、速度酵素ターンオーバー(rate enzyme tur
nover)を促進し得る。例えば、４-チオＵＴＰ、５-ブロモＵＴＰ、５-ヨードＣ ＴＰの添加は、少なくとも幾つかのＲＮＡポリメラーゼにより、転写終結および
転写物放出を促進する核酸の水素結合を変化する。
【００８６】 固体支持体および基質 本明細書中で使用する不溶性支持体および基体には、シリカゲル、調節細孔ガ
ラス、磁性ビーズ、デキストランおよびアガロース(Sephadex および Sepharose
)ビーズ、セルロースビーズならびに他のもののようなビーズ、キャピラリー、 ガラスファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、アル ミニウム、シリコンおよび銅)、マルチウェルプレートを含むプラスチック物質 または膜(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニルデ ンジフルオリド)のような平坦支持体、ウェハーのような(例えば、シリコンウェ
ハー)平坦表面のピット中のウェファー、コーム、ピン(例えば、コンビナトリア
ル合成または分析に適当なピンのアレイ)またはビーズであって、フィルタープ レートを有するものまたは有さないものが含まれるが、これらに限らない。
【００８７】 マススペクトロメトリー 転写が完了すると、ＲＮＡ転写産物は、任意の様々な手段により分析され得、
その手段には、例えばＵＶ／ＶＩＳ、ＩＲ、蛍光、化学ルミネセンスまたはＮＭ
Ｒ分光法のような分光技術、質量分析法、ゲル電気泳動および当分野に既知の他
の方法、またはそれらの組合せを含む。ここではマススペクトロメトリーが好ま
しい。質量分析計形式には、マトリクスアシストレーザー脱着(ＭＡＬＤＩ)のよ
うなイオン化(Ｉ)技術、連続的またはパルス状のエレクトロスプレー(ＥＳＩ)お
よび関係のある方法(例えば、イオンスプレーまたはサーモスプレー)、ならびに
マッシングクラスターインパクト(massive cluster impact)(ＭＣＩ)を含み、こ
れらのイオン源は、リニアまたはリフレクトロン飛行時間(linear or reflectro
n time-of-flight)(ＴＯＦ)、シングルまたはマルチプルクワドループル(single
or multiple quadruple)、シングルまたはマルチプルマグネティックセクター(
single or multiple magnetic sector)、イオンサイクロトロン型フーリエ変換 質量分析計(Fourier Transform ion cyclotron resonance)(ＦＴＩＣＲ)、イオ ントラップ型およびそれらの組合せを含む検出形式と調和し得、ハイブリッド検
出器を生ずる(例えば、イオン-トラップ／飛行時間)。イオン化のために、多種 のマトリクス／波長の組合せ(ＭＡＬＤＩ)または溶媒の組合せ(ＥＳＩ)が用いら
れる。
【００８８】 ＤＮＡアレイの調製 好ましい態様では、標的核酸とのハイブリダイゼーション前または後の核酸プ
ロモーター含有プローブを、アレイ形の固体支持体の表面にで固定化する。これ
らＤＮＡアレイ形成に特に適当な方法は、本明細書中で記載したものおよび米国
特許出願番号０８／７４６，０５３、０８／７８７，６３９および０８／７８６
，９８８に記載されたものである。各仮米国特許出願の対象物を引用により本明
細書にすべて加え、以下のような要約する。
【００８９】 図１は、診断ツールによる分析用サンプル物質のアレイを調製する１つのシス
テムを示している。図１は、データプロセッサ１２、動作コントローラー１４、
ロボットアームアセンブリ１６、モニターエレメント１８Ａ、中央処理装置１８
Ｂ、ソース素材２０のマイクロタイタープレート、ステージハウジング２２、ロ
ボットアーム２４、ステージ２６、圧力コントローラー２８、コンジット３０、
マウンティングアセンブリ３２、ピンアセンブリ３８および基体エレメント３４
を含むシステム１０を示す。図１でみられる図では、ロボットアセンブリ１６は
可動性マウントエレメント４０および水平スライドグローブ４２を含み得るとも
説明される。ロボットアーム２４はピン３６を中心として回転し得、アーム２４
の可動範囲を広げ、そのため、アーム２４によりソースプレート２０上にピンア
センブリ３８が配置され得る。
【００９０】 図１で示されるデータプロセッサ１２は、ＩＢＭ ＰＣ互換性コンピューター システムのような通常のデジタルデータプロセッシングシステムであって、ロボ
ットアセンブリ１６の移動および操作を調節する情報を提供する、データのプロ
セッシングおよびプログラム命令の実行に適当であるシステムであり得る。デー
タプロセッサユニット１２は任意の型のシステムであり、命令シグナルのプログ
ラムのプロセッシングに適当であり、ロボットハウジング１６に組込まれるロボ
ットアセンブリを操作する。所望により、データプロセッサ１２は、ロボットハ
ウジング１６に組込まれ、微小制御アセンブリとなり得る。更なる他の態様では
、システム１０をプログラム化する必要はなく、ロボットアセンブリ１６を操作
する命令を蓄積するファームウェアメモリを有するシングルボード・コンピュー
タであり得る。
【００９１】 図１に示した態様では、データプロセッサ１２とロボットアセンブリ１６との
間を電気的につなぐコントローラー１４がある。図示したコントローラー１４は
動作コントローラーであり、選択された位置でロボットアーム２４のポジショニ
ングするロボットアセンブリ１６のモーターエレメントを操作する。加えて、コ
ントローラー１４は、圧力コントローラー２８に指令するロボットアセンブリ１
６に命令を与え、図示したピンアセンブリ３８の個々のピンエレメントから噴射
する液体の体積を制御する。図示した動作コントローラー１４のデザインおよび
構成は電気工学において既知の原理から導かれ、ロボットアセンブリ１６の操作
に適当な任意のコントローラーエレメントはその範囲から出発することなく実施
し得る。
【００９２】 図１に示したロボットアセンブリ１６はコントローラー１４と電子光学的につ
ながる。図示したロボットアセンブリ１６は構台システムであり、ロボットアー
ムによりＸＹ面について移動するＸＹテーブルを含み、さらにロボットアームを
当該ＸＹ面に対し直交的に動かすＺ軸作動装置を含む。図１に示すロボットアセ
ンブリ１６は、ＸＹステージにマウントするアーム２４を含み、ＸＹアクセスに
より決まる面内でアームが動く。図示した態様では、ＸＹテーブルをＺ作動装置
にマウントし、ＸＹ面と直交するＺ軸に沿ってテーブル全体を動かす。この方法
で、ロボットアセンブリは３方向の自由度を提供し、ピンアセンブリ３８を基体
３４上の任意の位置に退け得、ステージ２６に装備する図１に示したソースプレ
ート２０をロボットアセンブリ１６にマウントする。
【００９３】 図示したロボットアセンブリ１６は、電気工学の分野に既知の原理から導かれ
、ピンアセンブリを基体および図示した基体３４のようなソースプレートの隣接
位置への移動に適当なロボットアセンブリの一例である。したがって、他のロボ
ットシステムを、本明細書の記載に従い、当該分野から出発することなく、実施
し得る。
【００９４】 図１はロボットアセンブリ１６の態様を示し、圧力コントローラー２８を、コ
ンジット３０を通じてマウント３２に連結し、ピンアセンブリ３８と連結する。
この態様では、マウント３２には、コンジット３０をピンアセンブリ３８に流体
結合(fluidic coupling)する内部チャンネルがある。したがって、圧力コントロ
ーラー２８はコンジット３０と、マウント３２はピンアセンブリ３８と流体的に
連結する。この方法では、コントローラー１４は、シグナルを圧力コントローラ
ー２８に送り、ピンアセンブリ３８に伝える液体圧力を選択的に制御する。
【００９５】 図２は、ピンアセンブリ５０の一態様を示し、圧力コントローラー２８を含む
図１に示すシステムの実施に適当である。図示した態様では、ピンアセンブリ５
０には、上側部分５２および下側部分５４から形成され、クルー５６Ａおよび５
６Ｂにより合わされ一緒になり、内部チャンバー容積５８が決定されるハウジン
グを含む。更に、内部チャンバー容積５８を流体工学的にシールするため、ハウ
ジングには、図２に示すシールエレメントが、上側ブロックおよび下側ブロック
５４の間に位置し内部チャンバー容積５８の周囲を完全に取巻くＯ-リングガス ケット６０として含まれ得ることを図２は示す。さらに図２では、ピンアセンブ
リ５０は多数のベシクル６２Ａ-６２Ｄを含み、それぞれ、軸穴(axial bore)を 含み、そこを通して伸びており、図示するホールディングチャンバー６４Ａ-６ ４Ｄを形成する。それぞれ図示したベシクルは、それぞれ、孔６８Ａ-６８Ｄを 通して伸びており、ハウジングの下側５４内に配列している。
【００９６】 図示した態様でさらに示すように、それぞれのベシクル６２Ａ-６２Ｄは上側 フランジ部分を有し、シールエレメント７０Ａ-７０Ｄを位置付け、ベシクルと 下側ブロック５４との間に流体を通さないシールを形成し、液体が孔６８Ａ-６ ８Ｄを通過することを防ぐ。シールの堅固性を維持するため、図示したピンアセ
ンブリ５０は、スプリングとして図２に示す一群のバイアシング(biasing)エレ メント７４Ａ-７４Ｄを含み、図示した態様では、ベシクル６２Ａ-６２Ｄのフラ
ンジエレメントをそれぞれのシールエレメント７０Ａ-７０Ｄに押しつけ圧迫し た状態である。図２に示したように、バイアシングエレメント７４Ａ-７４Ｄは 、ベシクルと上側ブロック５２の間で伸びている。各スプリング７４Ａ-７４Ｄ は、マウンティングパッド７６Ａ-７６Ｄにマウントして固定され得、その場合 、スプリングエレメントが上側ブロック５２に結合し得る。上側ブロック５２は
、更に図２に示す孔７８を含む。それは、中央に位置する孔であって、回転して
孔７８にマウントし得るスワジロック８０を受けるためねじを切っている。
【００９７】 更に図２に示したように、コンジットによりスワジロック８０をバルブ８２に
連結し、そのバルブ８２はスワジロック８０をコンジット８４に連結し、そのコ
ンジット８４を圧力源に連結し得えるか、または、他にスワジロック８０を、内
部５８のガス抜きとして提供されるコンジット８６に連結し得る。中央の穴８８
はスワジロック８０を通して伸び、そしてチュービングエレメントにつながり、
そのチュービングエレメントはさらにバルブ８２につながり、そのため、流体工
学的および選択的に内部チャンバー容積５８を圧力源か、ガス抜きアウトレット
の何れかに連結する。
【００９８】 上記し、図２に図示したピンアセンブリ５０が、基体９０の上側表面にエッチ
ングされた多数のウェル９２を含む基体エレメント９０上に配置する。図２によ
り例示されるように、ベシクル６２Ａ-６２Ｄのピッチとは次の通りである。各 ベシクルは、隣りのベシクルとある程度の距離があり、その距離は、基体９０の
上側表面にエッチングされたウェル９２間のピッチ距離の整数倍である。以下の
記載からわかるように、この間隔は液体の平行分配を促進し、液体を多数のウェ
ルに一度の操作で分配し得る。各ベシクルは、ステンレススチール、シリカ、ポ
リマー物質または液体サンプルの保持に適当な任意の他の物質から作成され得る
。ある実施例では、１６ベシクルをあわせて用いる。それらは、硬化したベリリ
ウム銅、金メッキしたニッケルプレートを用い作成する。それらは４３．２ｍｍ
の長さであり、ベシクルのシャフトは外径０．４６ｍｍに徐々に変化し、凹状チ
ップとなる。そのピンは、指向精度が約５０１マイクロメーターとなり得るよう
に、選択した。任意の適当なピン形を装置に使用し得、平坦、星形、凹状、尖頭
固体(pointed solid)、尖頭半中空(pointed semi-hollow)、一端または両端の角
(angled on one or both side)、他の幾何学構造を含むがこれらに限らない。
【００９９】 図３は、図２に示すピンアセンブリ５０の下側ブロック５４の横からの透視図
を示す。図３は、適当な大きさの１つのビンアセンブリを示す。図示すように下
側ブロック５４は下部プレート９８および周囲ショルダー１００を有する。下部
プレート９８は約３ｍｍの厚さであり、ショルダー１００は約５ｍｍの厚さであ
る。
【０１００】 図４は、通常構造の上からの透視図を示し、図２に示すピンアセンブリ５０に
用いるピンアセンブリの使用に適当な、適当な大きさの１つの下側ブロック５４
を示す。図４に示したように、下側ブロック５４は、穴６８の４×４のマトリク
スを含み、各ベシクルを受けるのに適当な１６の孔を提供する。上記引用の図２
に記載したように、孔６８間の距離は、典型的に、基体表面上のウェル間の距離
およびソースプレートのウェル間の距離の整数倍である。したがって、図４に示
すような下側ブロック５４を有するピンアセンブリは、液体を１６ウェルまで同
時に分配し得る。図４はまた、通常の大きさの１つの下側ブロック５４を示す。
ブロック５４の各サイドは通常２２ｍｍの長さであり、孔６８間のピッチは約４
．５ｍｍとなる。そのピッチは基体の使用に適当であり、その場合、図２の基体
９０により例示するように液体を約５００μｍ離した位置に分配する。図４はま
た、下側ブロック５４が、図２に示すシールエレメント６０のようなＯ-リング シールエレメントを受けるのに適当なＯ-リンググローブ９４を所望により含む ことを示す。そのグローブエレメント９４はシールエレメント６０により形成さ
れる液体シールを促進し、改善し得ると理解される。
【０１０１】 ピンブロックはステンレススチールで製造され得る。ドリルでこの物質に正確
に約＋２５μｍの孔を開けるためである。しかし、様々なプローブ物質もまた使
用し得、例えば、Ｇ１０ラミネート、ＰＭＭＡまたは他の適当な物質である。そ
のピンブロックは任意の数の孔を有し得、適所に１６ピン有する１６のレセプタ
クルが見られる。各ピンの指向精度を高めるため、所望による配列位置はブロッ
クの下にである。約６ｍｍのピンチップを、マイクロタイタープレートのウェル
に浸すことができるようにさらしたままとするためである。図示したツールにお
けるプローブのレイアウトを設計し、３８４ウェルマイクロタイタープレートに
調整し、そのため、プローブの中心と中心の間隔は４．５ｍｍ内となる。４×４
プローブのアレイを選択した。１平方インチ未満でフィットするようにアレイを
作成するためであり、それは譲受人が使用するＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳのｘｙス
テージの範囲で動く。ピンツールアセンブリを、装置の上側を覆うステンレスス
チールで仕上げ、次いで、ロボットのＺ-アーム上に取りつける。
【０１０２】 図１および２に関し、ロボットアセンブリ１６は、図２に示すピンツールアセ
ンブリ５０と同様に形成したピンツールアセンブリ３８を用いる。圧力コントロ
ーラー２８はチャンバー５８内の圧力を選択的に制御する。この態様では、制御
プログラムはデータプロセッサ１２上で操作され、アセンブリ１６が基体３４上
のエレメントのアレイを提示する方法でロボットアセンブリ１６を制御する。 最初の工程では(図２および５も参照)、プログラムによりロボットアセンブリ
１６は命令され、ピンアセンブリ３８を動かし、上記ソースプレート２０上に配
置する。次いで、ロボットアセンブリ１６により、ピンアセンブリがソースプレ
ート２０に浸され、そのプレートは３８４ウェルＤＮＡソースプレートであり得
る。図４に示すように、ピンアセンブリは１６のピンを含み得、ピンアセンブリ
５０により、１６ピンが３８４ウェルＤＮＡソースプレート２０の１６のウェル
に浸される。次に、データプロセッサ１２により、動作コントローラー１４は命
令され、ロボットアセンブリ１６を操作し、基体３４の表面上の位置にピンアセ
ンブリを移動する。基体３４は、物質のサンプルを受けるのに適当な任意の基体
であり得、シリコン、プラスチック物質、または任意の他の適当な物質から形成
され得る。所望により、基体は平坦表面を有するが、他に、ピット表面、ウェル
でエッチングされた表面または任意の他の表面タイポグラフィーを含み、そして
、更に各ウェルの表面にビーズを含む。次いで、データプロセッサ１２で操作さ
れるプログラムにより、ロボットアセンブリは命令され、動作コントローラー１
４を通して、圧力コントローラー２８は命令され、内部チャンバー容積５８内に
陽圧を生ずる。この実施では、正の内部圧力により、ベシクル６２のホールディ
ングチャンバーからの液体に力が加えられ、ベシクルからの液体を噴射し、基体
９０のそれぞれのウェル９２に噴射する。
【０１０３】 データプロセッサ１２で操作するプログラムにより、コントローラー１４も命
令され、圧力コントローラー２８を制御し、ホールディングチャンバーがソース
プレート２０のソース物質で充填されるのを制御する。圧力コントローラー２８
により、ピンアセンブリの内部チャンバー容積５８内に陰圧が生じ得る。これに
より、ベシクル６２Ａ-６２Ｄのホールディングチャンバー中に液体を引き入れ る。圧力コントローラー２８より、オープン-ループまたはクローズ-ループ制御
の何れかにより圧力が制御され得、ホールディングチャンバーにより液体が過剰
に引き入れられることを防ぎ、内部チャンバー容積５８中に撒き散るのを防ぐ。
圧力を制御するループコントロールシステムは当分野で既知であり、任意の適当
なコントローラーが使用し得る。そのこぼれたものが相互汚染の原因となり、特
にソースプレート２０から引き入れるソース物質がウェルからウェルへ変わる場
合にその原因となる。
【０１０４】 他の態様では、各ホールディングチャンバー６４Ａ-６４Ｄは非常に小さく、 チャンバーは毛管現象で充填される。その実施では、ピンアセンブリは、ステン
レススチールニードルのような細穴針(narrow bore needle)のアレイを含み得、
下側ブロック５４の孔を通して伸びている。ソース溶液中に浸されるニードルは
毛管現象で充填される。ある実施では、気圧で充填されるキャピラリーの長さは
、 Ｈ＝２γ／ＰＧＲ [式中、Ｈは高さ、ガンマは表面張力、Ｐは溶液密度、Ｇは重力、そしてＲはニ ードルの半経である。] でおおよそ決定する。そのため、各ベシクルにより保持される液体体積は、内部
の孔の大きさを選択することにより制御され得る。室温では、水は、半経１００
μｍのキャピラリーで１５ｃｍの高さに充填することがわかる。そのため、短穴
ナノリッター体積針(short bore nanoliter volume needle)は限界まで充填され
るが、溢れ出ることはない。毛管力(capillary force)が非常に小さすぎて、ニ ードルオリフィスの先端でメニスカスが形成できないと理解されるためである。
これは、こぼれたものによる相互汚染を防止する。ある態様では、ピンアセンブ
リのベシクルにより、種々の体積の液体を保持し分配する種々の大きさの内部チ
ャンバーが提供され得る。
【０１０５】 他の実施では、ベシクルのホールディングチャンバー内に引き入れる液体の体
積を少なくするため、わずかな陽圧を圧力コントローラー２８により内部チャン
バー容積５８内に与える。陽圧により生ずる下方への力を用い、上方への毛管力
を相殺する。この方法では、ベシクルのホールディングチャンバー中への、毛管
力により引き入れられる液体体積が制御され得る。
【０１０６】 図５Ｂは、ニードルのホールディングチャンバー内の液体が、スワジロック８
０を通して伸びる中心の穴８８を通して導入されるわずかな陽圧により分配され
得ることを示している。内部チャンバー容積５８中へ導入される圧力パルス(pre
ssure pulse)を制御することにより、液体は、ニードルの先端でスプレーか、水
滴形か、何れかで噴射され得る。分配速度、水滴対スプレーは、圧力コントロー
ラー２８により適用される圧力に一部依存すると理解される。ある態様では、圧
力は、常圧である１０と１，０００Ｔｏｒｒの間の範囲で適用される。
【０１０７】 このため、データプロセッサ１２は、分配される液体体積を制御および調節す
るコンピュータープログラムを走らせることができる。プログラムはコントロー
ラー２８に指令を与え、ベシクルの端でスプレーを生じるか、または水滴を形成
するか、何れかにより決められた体積の液体を噴射し、液体を分配する基体表面
とその液体を接触し得る。
【０１０８】 図５Ｃおよび５Ｄは、図５Ａ-５Ｂで示された初期段階が再び行われ得ること を示し、このとき、当初の位置からオフセットした基体表面上に位置する。示さ
れた方法では、ピンツールは２つのウェル９２の距離に相当する距離だけオフセ
ットされる。他のオフセットプリンティング技術(offset printing technique) を使用し得る。
【０１０９】 図２に示すピンアセンブリの幾つかの利点が達成される。例えば、分配の間の
すすぎは、簡単であり、単一または多数のピンの充填を必要とするのみであり、
すすぎ溶液で空となる。更に、ホールディングチャンバーはすべて、限界まで充
填されるため、分配体積の精度はピン作成の際に注意深く制御され得るニードル
内部の大きさによってのみ変化する。更に、ニードルが非常に高価であるその装
置の費用効果がよく、しかし、表面との接触は必要ではないため、ニードルは物
理的歪みまたは圧力は少なく、交換は稀となり、長期間使用できる。
【０１１０】 他に、固体支持体表面上のサンプル物質の析出には、ブロックから伸びる固体
ピンエレメントを有するピンツールアセンブリを用いる技術を含み得、その場合
、ロボットアセンブリによりピンアセンブリの固体ピンエレメントがサンプル物
質のソース内に浸され、サンプル物質でピンの先端を濡らす。その後、ロボット
アセンブリにより、ピンアセンブリが基体上の位置に動かされ得、次いで、基体
の表面に対しピンアセンブリを低くし、個々の濡れたピンをその表面に接触させ
、基体表面に物質をスポットする。
【０１１１】 固定化したプロモーター含有核酸を伴う固体ピンを有するピンツールアセンブ
リを、ハイブリダイゼーションおよび／またはＲＮＡ転写物を生ずるための反応
混合物を含むウェルに浸し得る。次いで、転写産物を有する液体を、上記考察し
たように、例えば基体表面上にサンプルをスポットしたピンツールアセンブリの
固体ピンを用いることにより、アレイに析出し得る。
【０１１２】 図６Ａおよび６Ｂは、基体表面上にまたは表面に物質を分配する他の代わりの
システムを示す。特に、図６Ａは、ジェットプリンティング装置１１０を示し、
それには、キャピラリーエレメント１１２、変換器エレメント１１４およびオリ
フィス(示さず)１１８、液体コンジット１２２および図１に示すロボットアーム
２４のようなロボットアームアセンブリに連結するマウント１２４を含む。更に
図６Ａに示すように、ジェットアセンブリ１１０は、サンプル物質を表面１２８
上に分配するため、一連の小滴１２０であるサンプル物質のオリフィス１１８か
らの噴射に適当である。
【０１１３】 ジェットアセンブリ１１０のキャピラリー１１２は、ガラスキャピラリー、プ
ラスチックキャピラリー、または任意の他の適当なハウジングであり得、そのハ
ウジングは、液体サンプルを保有し得、液体サンプルを、変換器エレメント１１
４のような変換器エレメントにより噴射し得るものである。図６Ａに示す変換器
エレメント１１４は圧電変換器エレメントであり、キャピラリー１１２のパラメ
ーター周辺に形成され、ロボットアセンブリ１６内のパルスジェネレイターから
受ける電気パルスを変換し得、液体をキャピラリー１１２のオリフィス１１８か
ら噴射する。圧電変換器エレメントを有するそういったジェットアセンブリは、
ドイツのＭｉｃｒｏＦａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．により製造されて いる。しかし、決められた、制御された液体体積の分配に適当な任意のジェット
アセンブリを、本明細書中で使用し得、それらには圧電変換器、電気的変換器、
電子制限的変換器(electrorestrictive transducer)、磁性制限的変換器(magnet
orestrictive transducer)、電気機械変換器(electromechanical transducer)、
または任意の他の適当な変換器エレメントを使用するものも含む。図示した態様
では、キャピラリー１１２は液体物質を受けるための液体コンジット１２２を有
する。所望の態様では、液体をキャピラリー中に、真空圧の作用により引き入れ
ることができ、それはオリフィス１１８を液体物質のソース中に沈めると、オリ
フィス１１８を通して液体を引き入れることができる。ジェットアセンブリ１１
０の他の態様は、本発明によって、当該範囲から出発せずとも実施し得る。
【０１１４】 図６Ｂは、更に他のアセンブリを例示しており、図１に示すアセンブリ１６の
ようなロボットアセンブリのロボットアームにおいて適当にｐ機能するアセンブ
リである。図６Ｂは１３０Ａ-１３０Ｄを４つ同時につなげたアセンブリを示す 。図２のピンアセンブリと同様に、図６Ｂに示すジェットアセンブリは、液体物
質の平行分配に用いられ得る。各ジェットアセンブリ１３０Ａ-１３０Ｄは他の ものとは独立して操作され得、選択した１つのジェットアセンブリから液体を選
択的に分配し得る。更に、各ジェットアセンブリ１３０Ａ-１３０Ｄは独立して 制御し得、アセンブリ１３０Ａ-１３０Ｄの各１点より分配される液体の体積を 選択し得る。他の修飾および変更が、本発明の範囲から出発せずとも図６Ｂに示
すアセンブリに行い得る。
【０１１５】 アレイは、上記考察した任意の技術により基体表面上に形成され得る。次いで
サンプルアレイをマススペクトロメトリーで分析し、アレイ中のサンプルの典型
的な組成物のスペクトルデータを回収する。上記方法により、素早く適確に分配
でき、測定対象物物質の体積を制御できるプロセスが提供されると理解される。
特に、これらのプロセスは、液体をナノリッター体積よりも小さく分配すること
ができる。これら小さい体積の析出技術により、マススペクトルによる分析に適
当なサンプルアレイウェルが作成できる。例えば、小さな体積により、蒸発速度
のようなスポット特性が再現され、室温および光のような気圧条件に応じて体積
を少なくする。
【０１１６】 図５に示す例に続いて、アレイは、異なるシークエンスまたは濃度のオリゴヌ
クレオチドを９６ウェルマイクロタイターソースプレート２０のウェルにのせる
ことにより調製され得、最初のウェルはマトリクス溶液を入れるために残してお
ける。ピットシリコンチップ基体のような基体３４は、ロボットアセンブリ１６
のステージ上に置くことができ、手動で並べて、一群の参照軸について、ウェル
のマトリクスを方向付け得る。データプロセッサ１２上で実行する制御プログラ
ムは、ソースプレート２０の最初のウェルの座標を認識し得る。ロボットアーム
２４により、ピンアセンブリ３８がソースプレート２０中に浸され、そのため各
１６のピンが１つのウェル中に浸される。各ベシクルは毛管現象により充填され
得、ホールディングチャンバーの全容積に液体が含まれる。所望により、データ
プロセッサ１２上で実行するプログラムにより、圧力コントローラーに命令が与
えられ、ピンアセンブリ３８の内部チャンバー５８は陽バイアス圧(positive bi
as pressure)となり、毛管作用の力を部分的に相殺し、ホールディングチャンバ
ー内に引き入れられる液体体積を制限するかまたは減少する。
【０１１７】 所望により、ピンアセンブリ３８は、ソースプレート２０の同じ１６ウェル中
に浸され、二次標的基体上にスポットし得る。このサイクルは望ましい標的基体
と同じ数だけ繰り返され得る。次に、ロボットアーム２４は洗浄液にピンアセン
ブリ３８を浸すことができ、次いで、ピンアセンブリをソースプレート２０の１
６のウェル中に浸し、最初の一群の１６スポットからの距離をオフセットした基
体標的上にスポットする。再び、これを、望ましい標的基体と同じだけ繰り返し
得る。全サイクルを繰り返し、各ベシクルから２×２アレイを作成し、８×８ア
レイのスポットを生ずる(２×２エレメント／ベシクル×１６ベシクル＝スポッ トしたエレメント合計６４)。アレイの形成に適当な任意のプロセスを用い得る 。
【０１１８】 異なるシーケンスまたは濃度のオリゴヌクレオチドを３種類までの３８４-ウ ェルマイクロタイターソースプレートのウェルにのせる；一群の１６ウェルをマ
トリクス溶液用に残しておける。２つのプレートのウェルを洗浄液で満たす。５
つのマイクロタイタープレートをロボットアセンブリ１６のステージ上にのせる
ことができる。多数の標的基体を、ステージ２６上に配置する所望の一群のバン
キングまたはレジストレーションピンに隣接して置き、一群の参照軸に沿って標
的基体を配置する。もしマトリクスおよびオリゴヌクレオチドを事前に混合しな
いならば、ピンアセンブリは、望ましい標的基体すべてにおける最初のスポット
マトリクス溶液に用いることができる。その後の段階では、オリゴヌクレオチド
溶液をマトリクス物質と同じパターンでスポットでき、マトリクスを再溶解でき
る。他に、サンプルアレイは、最初にウェハー上にオリゴヌクレオチド溶液を置
き、その後、マトリクス溶液を置くか、マトリクスおよびオリゴヌクレオチド溶
液を事前に混合することにより、作成し得る。
【０１１９】 基体の表面上にサンプルアレイを置いた後、アレイを任意の様々の手段を用い
分析し得る(例えば、ＵＶ／ＶＩＳ、ＩＲ、蛍光、化学ルミネセンスのような分 光技術、ＮＭＲ分光法または質量分析法。例えば、各分配プロセスの後、基体に
のせたサンプルをＭＡＬＤＩ-ＴＯＦソースプレート上にのせ、角度をつけたス クリューをマウントしたポリカーボネート支持体の一群と共に保持し得る。ある
実施では、プレートをプローブの端に移し、飛行時間マススペクトロメーターの
ソース領域中において１μｍ分解能、１”トラベルｘｙステージ(Newport)に保 持する。任意の適当な質量分析ツールを用いることができる。
【０１２０】 本明細書に記載のアレイを用いる好ましい質量分析計形式には、マトリクスア
シストレーザー脱着(ＭＡＬＤＩ)、連続的またはパルス状のエレクトロスプレー
(ＥＳＩ)および関係のある方法(例えば、イオンスプレーまたはサーモスプレー)
、ならびにマッシングクラスターインパクト(ＭＣＩ)を含むがこれらに限らない
イオン化(Ｉ)技術を含む；これらのイオン源は、リニアまたは非リニアリフレク
トロン飛行時間(linear or non-linear reflectron time-of-flight)(ＴＯＦ)、
シングルまたはマルチプルクワドループル、シングルまたはマルチプルマグネテ
ィックセクター、イオンサイクロトロン型フーリエ変換質量分析計(ＦＴＩＣＲ)
、イオントラップ型およびそれらの組合せを含む検出形式に適合し得る(例えば 、イオン-トラップ／飛行時間)。イオン化のために、多種のマトリクス／波長の
組合せ(ＭＡＬＤＩ)または溶媒の組合せ(ＥＳＩ)を用い得る。タンパク質のサブ
アトムモル(subattomole)レベルは、例えばＥＳＩ(Valaskovic, G. A. et al.,
(1996) Science 273:1199-1202)またはＭＡＬＤＩ(Li, L. et al., (1996) J. A
m. Chem. Soc 118:1662-1663)質量分析を用い、検出される。
【０１２１】 従って、本明細書中で記載されるプロセスでは、完全な非接触、高圧スプレー
または部分的接触、低圧小滴形成モードを用いることができると理解される。後
者では、小滴と、基体３４のウェルまたは親水性平坦表面の壁との間で接触が生
じるのみである。いずれの実施要件においても、ニードルチップと表面との間で
全く接触はない。
【０１２２】 典型的な態様 ある好ましい態様では、プロモーター配列をコードする二本鎖核酸配列が、天
然源から単離されるか(例えば、細菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物ま たは真核生物)、または合成配列とアセンブルする。コーディング鎖の３'末端の
少なくとも５ヌクレオチドの一本鎖領域が、当業者に既知の標準的な方法に使用
される(例えば、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York参照)。この一本鎖領域は、シーケ ンスされる核酸領域または２つの核酸分子間にあるシーケンス(例えば、制限エ ンドヌクレアーゼ部位)に相補的となるように設計される。
【０１２３】 少なくとも部分的に一本鎖３'末端を含む、シーケンスされる核酸は、本明細 書中に記載する条件、好ましくは、高緊縮条件により、ハイブリダイズし、その
ため、５つの連続的マッチング塩基対が形成され、プロモーター含有ＤＮＡの相
補的配列が当業者に知られている。シーケンスされる核酸は、二本鎖であるか、
または好ましくは一本鎖である。２つの核酸分子のハイブリダイゼーションは、
隣接する核酸分子のジャンクションにおけるハイブリッド中に１またはそれ以上
の“ニック”を導入する。コーディングまたは非コーディング鎖、好ましくはコ
ーディング鎖中のニックは、転写開始前に適当な核酸リガーゼを添加することに
より連結される。核酸の連結方法は、当業者に既知であり(例えば、Sambrook et
al., (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory P
ress, New York)、ＤＮＡおよびＲＮＡリガーゼは商業的に利用可能である(例え
ば、Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。
【０１２４】 転写は、リボヌクレオシド三リン酸の存在中、本明細書および他で記載の条件
下、適当なＲＮＡポリメラーゼの添加によりプロモーターから開始される(例え ば、In RNA Polymerase and the Regulation of Transcription, Rezinkoff et
al., eds, Elsevier, NY)。好ましい実施態様では、選択した塩基特異的チェー ンターミネイティング３'-デオキシリボヌクレオシド三リン酸および転写混合物
には、ＲＮＡ産物の二次構造を少なくするイノシン５'-三リン酸、または、４- チオＵＴＰ、５-ブロモＵＴＰまたは５'-ヨードＣＴＰといったＲＮＡポリメラ ーゼ酵素のターンオーバーを促進する修飾リボヌクレオシド三リン酸が含まれ、
それによって、分析に利用可能なＲＮＡ転写産物の量が増加する。
【０１２５】 好ましい態様では、核酸プロモーター含有プローブを、アミノ機能を有する支
持体の機能化により、共有結合的にシリカ支持体に固定化する(例えば、３-アミ
ノプロピル-トリエトキシシランのような試薬を伴う支持体の誘導により(Aldric
h Chemical Co., Milwaukee, WI);図７参照)。他の機能化オキシシランまたはオ
ルトシリケートを使用し得、商業的に利用可能である(例えば、Gelest, Inc., T
ullytown, PAから)。例えば、３-メルカプトプロピルトリエトキシシランを用い
、チオール基を有するシリコン表面を機能化できる。次いで、アミノ機能化シリ
カを、Ｎ-スクシンイミジル(４-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(ＳＩＡＢ)
(Pierce, Rockford, IL)のようなヘテロ二機能性試薬と反応し得る。使用し得る
他のホモ-およびヘテロ-二機能性試薬は、例えば、Pierceから利用可能である。
最終的に、チオール基で機能化される核酸(例えば、５'末端で)は、核酸分子の チオール機能を支持体のヨードアセチル機能と反応させることにより、誘導化さ
れたシリカ支持体に共有結合する。
【０１２６】 ある態様では、核酸は、架橋剤と反応し、架橋／核酸連結を形成し、次いでそ
れを、機能化支持体と反応すると、固定化核酸が生じる。他に、架橋は、核酸お
よび機能化固体支持体と１点で結合し、架橋剤と核酸および固体支持体との並発
反応を実質的に提供する。この態様では、ヘテロ二機能性架橋剤、即ち、核酸お
よび機能化固体支持体のそれぞれと選択的に反応し得る２種の反応的機能を有す
る架橋剤の使用を通常必要とする。
【０１２７】 本明細書中に記載の下記の方法では、不溶性支持体上で固定化された核酸の、
空間的アドレス化アレイは、ＲＮＡポリメラーゼを用いる核酸のシーケンスに適
当であり、調製され得る。例えば、その方法が使用され、アレイ中に配列したピ
ン上に固定化した様々な核酸のアレイが提供される。他の態様では、不溶性支持
体上の光開裂保護基が、選択的に開裂し(例えば、ホトリトグラフィーにより)、
核酸の固定化を活性化する表面部分を提供する。例えば、チオール基を生ずる３
-メルカプトプロピルトリエトキシシランでの処理により修飾したシリコン表面 は、光開裂保護基(例えば、光開裂保護基、例えば、PCT公開番号WO92/10092、ま
たはMcCray et al., (1989) Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18:239-270参
照)で保護され得、選択された表面部分の照射により、例えばホトリトグラフィ ーマスクを用い選択的に非保護となり得る。次いで、チオール反応性基を含むよ
うに修飾された核酸プロモーター含有プローブを支持体に直接結合し得るか、ま
たは他に、チオール反応性架橋剤をチオール修飾支持体と反応させ、その後(ま たは実質的には同時に)、核酸と反応すると、固定化核酸が生ずる。核酸塩基ま たは配列を、一旦、本明細書に記載の方法に従い支持体に固定化すると、既知の
方法により更に修飾し得る。例えば、核酸分子は、コンビナトリアル技術を含む
通常の技術に従う固体相核酸合成の実施により伸張し得る。
【０１２８】 好ましい核酸は、不溶性支持体の表面と少なくとも１つの硫黄原子を介して共
有結合する。即ち、核酸は、少なくとも１つの硫黄原子を含むリンカー部分を介
してその表面と共有結合する。その共有結合した核酸は、本明細書に記載の方法
により容易に製造される。好ましい態様では、共有結合した核酸は、不溶性支持
体の表面上の存在であり得、少なくとも密度約２０ｆｍｏｌ／ｍｍ2、更に好ま しくは少なくとも約７５ｆｍｏｌ／ｍｍ2、更に好ましくは少なくとも約ｆｍｏ ｌ／ｍｍ2、より更に好ましくは少なくとも約１００ｆｍｏｌ／ｍｍ2、および最
も好ましくは少なくとも約１５０ｆｍｏｌ／ｍｍ2である。
【０１２９】 応用 本明細書中に記載の核酸をシーケンスする方法が種々の最終用途応用に使用さ
れる。例えば、その方法は、転位、塩基転換、欠損、挿入などの変異を同定する
診断の応用に使用される。その方法はまた使用され、多くの遺伝的疾患診断の助
力となり、遺伝的スクリーニング、または遺伝形質または組織もしくは器官適合
性の決定に使用され得る。
【０１３０】 シーケンスする方法は診断の応用として使用され、既知標的核酸中に遺伝的変
化の存在を検査する。例えば、標的核酸領域は、ＰＣＲまたは当業者に既知の他
の増幅方法のような、標準的方法を用い増幅し得る(例えば、Sambrook et al.,
(1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York参照)。増幅核酸は変性され、シーケンスされる鎖(非コーディング鎖は
、二本鎖分子として単離されるか、使用され得る。
【０１３１】 既知標的核中の遺伝的変化の存在は、診断の応用において、生体サンプルの標
的核酸を単離(または増幅)し、プロモーター含有鋳型を生ずるプロモーター含有
捕捉プローブに標的をハイブリダイズすることにより、決定される。ネストした
一群のＲＮＡ転写産物が生じ、標的核酸の存在が決定され、野生型配列と比較し
て遺伝的変化が標的核酸中に生じているかどうか決定する。遺伝的変化の存在は
、当分野に既知の他の手段によりＲＮＡ転写産物から決定され得る(例えば、米 国特許番号５，６０５，７９８および国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２００１９
)。
【０１３２】 転写ターミネーター配列を同定する方法 これまで知られていない転写ターミネーターおよびアテニュエーター配列を同
定する方法もまた提供する。転写ターミネーター配列は、ＲＮＡ伸張の配列特異
的停止に応答し、種々の生物由来のターミネーター配列が報告されている。例え
ば、細菌性ｒｈｏ-独立性ターミネーター配列には２つの逆位反復が数塩基対離 れてあり、その後に５-１０ｎｔのポリＴストレッチがある。これら配列を介す る転写において、生じたｍＲＮＡ転写物により、ＲＮＡヘパリンステム-ループ 二次構造が、ＲＮＡポリメラーゼ分子後に形成され、ＲＮＡポリメラーゼのポー
ジング(pausign)を増加し、および／またはＲＮＡポリメラーゼ-ＤＮＡ鋳型相互
作用を不安定化し、ＤＮＡポリＴストレッチ内の転写産物が停止する(例えば、W
ilson and von Hippel 19;Reynolds et al., (1992a) J. Mol. Biol. 224:53-63
; Reynolds et al., (1992b) J. Mol. Biol. 224:31-51; Telesnitsky et al.,(
1989) Biochemistry 28:5210-5218; d' Aubenton Carafa et al., (1990) J. Mo
l. Biol. 216: 835-858参照)。
【０１３３】 細菌性ｒｈｏ-依存ターミネーターは、典型な逆位反復ステム-ループ構造を欠
失しており、更に、ｒｈｏタンパク質のような付加的因子を必要とし、転写を停
止する(例えば、Schmidt et al., (1984) J. Mol. Biol. 259:15000-15002参照)
。Ｒｈｏ-依存終結は、細菌種において、転写および翻訳の分離により熟成前終 結を生ずると信じられている。
【０１３４】 本明細書に記載の標準的転写条件を修飾することにより、転写ターミネーター
、例えば、ｒｈｏ-依存性およびｒｈｏ-独立性ターミネーターが、質量分析法を
用いて同定され得る。その方法の実施では、シーケンスされる一本鎖領域の３' 末端核酸を、コーディング鎖、プロモーター含有核酸プローブの３'末端の相補 的配列にハイブリダイズさせる。好ましい態様では、プロモーター含有核酸を、
５'末端の非コーディング鎖または３'末端のコーディング鎖を介して、固体支持
体に共有結合し、更に好ましくは高密度でアミノシラン処理固体支持体に５'-ま
たは３'-チオール酸化ＤＮＡ連結する。連結は、リンカー基の存在下または非存
在下にあり、好ましくはアレイ形に並べられる。
【０１３５】 転写は、修飾ＲＮＡ三リン酸類似体存在下または非存在下で開始し、４-チオ ＵＴＰ、５-ブロモＵＴＰまたは５'-ヨードＣＴＰのようなその類似体により、 ターミネーター配列におけるＲＮＡポリメラーゼ転写の効率が増加する。特異的
に終結するＲＮＡ転写産物の質量が、マススペクトロメトリーにより検出され、
その場合、観察されるＲＮＡの質量により転写のターミネーター依存停止の位置
が示される。幾つかの明確な遺伝的位置由来の転写終結部位直前の配列の並びを
比較することにより、今まで知られていないターミネーター配列が別のＲＮＡポ
リメラーゼで同定され得る。
【０１３６】 ある態様では、シーケンスされる核酸のハイブリダイズから生ずる１またはそ
れ以上の鎖中のニックが、転写開始前に適当な核酸リガーゼを添加することによ
り連結される(即ち、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを加える)。
【０１３７】 本発明を以下の実施例により更に説明する。その部分は単に詳しく説明するこ
とを目的とし、これらに制限するとして構成されるものではない。本出願を通し
て引用した参考文献(参考文献、発行された特許、公開された特許出願、および 仮出願特許出願を含む)のすべての内容全体を引用により特別にこの文書に加え る。
【０１３８】 実施例１ シリコンウェハーに対する核酸の高密度結合 物質および方法 特記しない限り、すべての試薬は、Aldrich Chemical, Milwaukee, WIから得 た。
【０１３９】 シリコン表面の調製 シリコンウェハーをエタノールで洗浄し、ブンセンバーナーで焼き、トルエン
中の２５％(体積)３-アミノプロピルトリエトキシシランの無水溶液に３時間浸 した。次いで、シラン溶液を除去し、ウェハーをトルエンで３回、ジメチルスル
ホキシド(ＤＭＳＯ)で３回洗浄した。次いで、ウェハーを、無水ＤＭＳＯ中のＮ
-スクシンイミジル(４-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(ＳＩＡＢ)(Pierce
Chemical, Rockford, IL)の１０ｍＭ無水溶液中にインキュベーションした。反 応後、ＳＩＡＢ溶液を除去し、ウェハーを３回ＤＭＳＯで洗浄した。
【０１４０】 ＳＩＡＢおよびアミノ基の濃縮がウェハーの固体支持体上である限りモニター
できないため、反応は溶液中で行い最適反応時間を決定した。薄層クロマトグラ
フィー(ＴＬＣ)(２５４ｎｍ蛍光インジケーターであるガラスパックされたシリ カプレート)(Baker, Phillipsburg, NF)を、９５：５ クロロホルム：メタノー ル(Baker, Phillipsburg, NJ)を用い行った。それは、２つの出発物質を分離す ることができる。長波長紫外線(302nm)の下、ＳＩＡＢ出発物質を視覚化できた ；３-アミノプロピルトリエトキシシランは紫外線の下では作用しないため、ニ ンヒドリン溶液をスプレーし、一級アミンと反応させると、加熱により紫のスポ
ットが表われた。クロロホルム／ＤＭＳＯ中で、３-アミノプロピルトリエトキ シシランと比べて僅かにモル過剰であるＳＩＡＢを用いると微小規模の反応が生
じ、その反応を上記ＴＬＣでモニターした。
【０１４１】 オリゴヌクレオチド修飾 ３'-または５'-ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド(Operon Techno
logies, Alameda, CA or Oligo Etc., Wilsonville, OR)のジスルフィドの還元 を逆相ＦＰＬＣ(Pharmacia, Piscataway, NJ)を用いモニターした；ジスルフィ ドの切断に際して、オリゴヌクレオチドのリテンションタイムのシフトが見られ
た。様々な還元方法が調査され、最適な条件が決定された。ある場合では、ジス
ルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド(31.5nmol, 0.5mM)をジチオスレイト ール(ＤＴＴ)(Pierce Chemical, Rockford, IL)(6.2mmol, 100mM)と共に、ｐＨ ８．０および３７℃でインキュベーションした。実質的な切断反応の完了と共に
、遊離チオール含有オリゴデオキシヌクレオチドを、Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ-１ ０カラム(Clontech, Palo Alto, CA)を用い単離した。ＤＴＴがその後の反応に 拮抗するからである。他に、トリス-(２-カルボキシエチル)ホスフィン(ＴＣＥ Ｐ)(Pierce Chemical, Rockford, IL)が使用され、ジスルフィドを切断した。ジ
スルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド(7.2nmol, 0.36mM)をＴＣＥＰと共 に、ｐＨ４．５緩衝液中３７℃でインキュベーションした。反応後に産物を単離
する必要はなかった。ＴＣＥＰはヨードアセトアミド機能と拮抗的に反応しない
ためである。種々のＴＣＥＰ濃度を切断反応に使用し、結合反応に最適な条件を
決定した。
【０１４２】 プローブの結合 上記のとおりヨードアセトアミドを含むように誘導された各ウェハーに、１０
０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８中の遊離チオール含有オリゴデオキシヌクレオチド
の１０ｍＭ水溶液を加えた；反応は、最低５時間、室温、湿度１００％中で行っ
た。反応後、オリゴデオキシヌクレオチド溶液を除去し、ウェハーを、５０％ホ
ルムアミド(USB, Cleveland, OH)を含む５×ＳＳＣ緩衝液(75mM クエン酸ナトリ
ウム、750mM 塩化ナトリウム、pH7)で２回、６５℃でそれぞれ１時間洗浄した。
【０１４３】 プローブ密度の放射化学的測定 表面に共有結合するＤＮＡ量またはハイブリダイズする相補的配列の量を測定
するため、放射標識プローブを用いた。５'-ジスルフィド含有オリゴデオキシヌ
クレオチドを固定化する場合、３'末端を、ターミナルトランスフェラーゼ酵素 および放射標識ジデオキシヌクレオシド三リン酸を用い放射標識した；標準的反
応では、５'-ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド１５ｐｍｏｌ(０． ６μＭ)を、(α-32Ｐ)ジデオキシアデノシン-５'三リン酸(ｄｄＡＴＰ)５０μＣ
ｉ(16.5pmol, 0.66μM)(Amersham, Arlington Height, IL)と共に、０．２ｍＭ
２-メルカプトエタノール存在下、インキュベーションした。４０ユニットのタ ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素(USB, Cleveland, OH)
の添加後、反応は１時間３７℃で行った。この後、この反応は、バイアルを７５
℃の水浴に１０分間浸すことにより停止し、その産物を、Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ
-１０カラム(Clontech, Palo Alto, CA)を用い単離した。同様に、５'-ジスルフ
ィド含有オリゴデオキシヌクレオチドを35Ｓで放射標識した。
【０１４４】 ３'-ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチドを固定化する場合、５'末 端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび放射標識したヌクレオシド三リン酸
を用い放射標識した。例えば、３'-ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチ
ド１５ｐｍｏｌ(0.6μM)を、(λ32Ｐ)アデノシン-５'三リン酸(ＡＴＰ)(Amersha
m, Arlington Height, IL)５０μＣｉ(16.5pmol, 0.66μM)と共に、５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ-ＨＣｌ, ｐＨ７．６，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ ２-メルカプトエ タノールの存在下、インキュベーションした。４０ユニットのＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼの添加後、反応は１時間３７℃で行った。反応は、バイアルを７５
℃の水浴に１０分間浸すことにより停止し、次いで、その産物を、Ｃｈｒｏｍａ
ｓｐｉｎ-１０カラム(Clontech, Palo Alto, CA)を用い単離した。
【０１４５】 共有結合的に固定化したプローブの密度を測定するために、選択のジスルフィ
ド含有オリゴデオキシヌクレオチドを、上記で放射標識したのよりも同じ種の痕
跡量に加えた。ジスルフィドを切断し、プローブをヨードアセトアミド機能化ウ
ェハーに固定化し、ウェハーを洗浄し、次いで、ホスホイメージャースクリーン
(phosphorimager screen)(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)に照射した。そ
れぞれのオリゴデオキシヌクレオチドを用いる場合、オリゴデオキシヌクレオチ
ドのモル量が判っている参照スポットをポリスチレン上につくる；これら参照ス
ポットをホスホイメージャースクリーンにウェルとして照射した。スクリーンの
スキャンニングにおいて、各チップに結合したオリゴデオキシヌクレオチドの量
(モル)を、参照の特異活性とカウントを比較することにより測定した。
【０１４６】 ハイブリダイゼーションと効率 固定化プローブで機能化したウェハーに、１Ｍ ＮａＣｌおよびＴＥ緩衝液中 の相補的配列(10μM)の溶液を加えた。ウェハーおよび溶液を７５℃に加熱し、 室温に３時間かけて冷却した。この後、溶液を除去し、ウェハーを２回ＴＥ緩衝
液で洗浄した。
【０１４７】 ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの量を測定するため、プローブの固定
化を上記の通り最初に行った。ただし、プローブは32Ｐ以外の35Ｓで標識した。
固定化したプローブの密度をホスホイメージャーで測定した。次に、同じウェハ
ーを、ＴＥ緩衝液、１Ｍ ＮａＣｌ、および32Ｐで放射標識したその相補鎖(10μ
M)中でインキュベーションした。ハイブリダイゼーションは以前から述べられて
いる通り行った。洗浄し、非特異的な結合を除去した後、ウェハーおよび参照を
、スクリーンとウェハーとの間に銅ホイル片を入れたホスホイメージャースクリ
ーンに照射した。銅ホイルは35Ｓからのシグナルを遮断し、その一方、32Ｐシグ
ナルを自由に通過させる。次いで、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのモ
ル量を測定し、ハイブリダイゼーション可能な共有結合的固定化プローブのパー
セントを示した。
【０１４８】 ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析 上記の通り、ウェハー含有非放射標識固定化オリゴデオキシヌクレオチド(名 前:ＴＣＵＣ;配列:GAATTCGAGCTCGGTACCCGG;分子量:6455Da;配列番号１)を合成し
、相補鎖(名前:ＭＪＭ６;配列:CCGGGTACCGAGCTCGAATTC;分子量:6415Da;配列番号
２)をハイブリダイズした。ウェハーを、陽イオン交換のため５０ｍＭ クエン酸
アンモニウム緩衝液で洗浄し、ＤＮＡバックボーン上のナトリウムイオンおよび
カリウムイオンを除去した(Pieles, U. et al., (1993) Nucl. Acids Res. 21:3
191-3196)。３-ヒドロキシピコリン酸のマトリクス溶液(３-HPA、50%アセトニト
リル、10%クエン酸アンモニウム中の0.7M;Wu, K.J., et al., (1993) Rapid Com
mun. Mass Spectrom. 7:142-146)をウェハー上にスポットし、室温で乾燥した。
ウェハーを、Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ(Bremen, Germany)Ｖｉｓｉｏｎ ２００ ０ ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ ＴＯＦ質量分析計のサンプルプローブに、導電テープ
(conducting tape)を用い、直接結合した。リフレクトロン(reflectron)は５ｋ ｅＶイオン源および２０ｋｅＶポストアクセラレーションを有した；窒素原子レ
ーザーを用いた；そして、すべてのスペクトルを陽イオンモードで測定した。
【０１４９】 表面化学 標準的な二酸化シリコン修飾化学を用い、シリコンウェハーを３-アミノプロ ピルトリエトキシシランと反応させると、表面上に一級アミノ基の均一な層が生
ずる。次いで、図７に示したように、表面をヘテロ二機能性架橋剤にさらすと、
表面上にヨードアセトアミド基を生ずる。ＴＬＣを用い、溶液におけるこの反応
の所望の反応時間を測定することができる。ＳＩＡＢ架橋剤は、長波長の紫外線
(302nm)の下、視覚化され、Ｒf値０．５８のスポットがみられた。３-アミノプ ロピルトリエトキシシランは紫外線の下では作用しないため、ニンヒドリンを用
いると、ベースラインに一級アミンの存在を示す紫のスポットがみられた。３- アミノプロピルトリエトキシシランと比べて僅かにモル過剰であるＳＩＡＢを用
いると微小規模の反応が生じた；約１分の後、ＴＬＣ分析により、長波長の紫外
線の下、Ｒf値０．２８の新しいスポットが現れた。ニンヒドリンのスプレーに よる紫のスポットが見られなかったため、３-アミノプロピルトリエトキシシラ ン出発物質がその反応で消費された。ＵＶ線により、反応後に残存する過剰ＳＩ
ＡＢもまたみられた。これらの結果から、反応は約１分間で終了することが判っ
た。すべての場合において、ヨードアセトアミド-機能化ウェハーを用いると、 不安定なヨードアセトアミド機能の加水分解が直ちに最小となった。加えて、す
べての更なるウェハー操作を暗室で行った。ヨードアセトアミド機能は光に感受
的だからである。
【０１５０】 修飾オリゴヌクレオチドのジスルフィド還元を、逆相ＦＰＬＣにおけるリテン
ションタイムのシフトを観察することにより、モニターした。その測定によると
、ＤＴＴ(100mM)またはＴＣＥＰ(10mM)存在下、５時間後、ジスルフィドは遊離 チオールに完全に還元された。ＤＴＴ反応がもっと長時間生じているならば、オ
リゴヌクレオチドダイマーが形成され、遊離チオールの対が反応する。そのダイ
マー化はまた、切断反応完了後ＤＴＴが除去されたとき、観察された。このダイ
マー化は、ＴＣＥＰを切断試薬として用いる際には観察されなかった。この反応
をｐＨ４．５で実施するためであり、そのため、遊離チオールが完全にプロトン
化され、ダイマー化を阻害したためである。
【０１５１】 ジスルフィド結合切断直後、修飾オリゴヌクレオチドをヨードアセトアミド機
能化ウェハーと共にインキュベーションした。チオール脱プロトン化を確実とす
るため、結合反応はｐＨ８．０で行った。シリコンウェハーの化学により達成さ
れるプローブ表面密度は、放射性標識プローブおよびホスホイメージャーを用い
分析された。プローブ表面密度は、ジスルフィド切断反応において使用するＴＣ
ＥＰ濃度の関数としてもモニターし得る(図８)。ジスルフィドを切断するための
１０ｍＭ ＴＣＥＰおよび上記の他の反応条件を用い、表面ｍｍ平方あたり２５ ０ｆｍｏｌの表面密度を再現することができた。上記と同一の実験を行った。た
だし、オリゴヌクレオチドプローブはチオール修飾を欠いており、表面ｍｍ平方
あたり５ｆｍｏｌ未満の表面密度により、非特異的結合は最小となり、プローブ
結合は殆ど図７に示したように生じた。
【０１５２】 ハイブリダイゼーション 上記のように、35Ｓ標識プローブをウェハー表面に結合させ、結合密度を測定
した後、32Ｐ標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行った；ハイ
ブリダイゼーション効率および密度はホスホイメージャーおよび銅ホイルを用い
測定した。銅ホイルは９８．４％の35Ｓシグナルを阻害し、その一方で32Ｐシグ
ナルを十分検出できることが実験的に確認された。相補的配列は再現的にハイブ
リダイズし、表面ｍｍ平方あたり１０５ｆｍｏｌを生じた；これは、ハイブリダ
イゼーション可能な結合プローブの約４０％に相当する。同様に、非相補的配列
をこの概要で用い、非特異的結合は表面ｍｍ平方あたり５ｆｍｏｌ未満となった
。
【０１５３】 平坦表面に強固にパックされたオリゴヌクレオチドの間のステアリン酸阻害に
より、４０％を超えるハイブリダイゼーション効率が阻害されると仮定された。
この点を考慮し、スペーサー分子を、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシ
ョン領域の端と支持体との間に組込んだ。選択されたスペーサーは一連のポリｄ
Ｔ配列であり、長さ３から２５の範囲であった。放射標識およびホスホイメージ
ャーを伴うこれらサンプルの調査において、達成し得る最大ハイブリダイゼーシ
ョンはそれでも４０％あった。
【０１５４】 ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ分析 ウェハーはプローブで機能化され、相補的配列をハイブリダイズし、そのサン
プルを、上記の標準的ＭＡＬＤＩ条件下分析した。分析により示されたのは、ア
ニール鎖(ＭＪＭ６)のみが、実験的な電荷に対する質量比６４１５．４の質量ス
ペクトルが観察され、理論的な電荷に対する質量比は６４１５である(図９)。電
荷に対する質量の比が６４５５であるシグナルがみられなかったため、ウェハー
結合鎖(ＴＣＵＣ)は脱着できず、そのため、レーザーに耐え未処理のままとなる
に充分な程度に、ヨードアセトアミド連結が安定となることが確認された。更な
るシグナルにより電荷に対する質量の比が６２６２．０であると観察された。こ
のシグナルはグアノシンの脱プリン化による結果であり、ＭＡＬＤＩプロセスの
間にプリン塩基がＤＮＡにより減損し得ると知られているためである(Nordoff,
E., et al., (1992) Rapid Commun. Mass Spectrom. 6:771-776)。ウェハー上の
サンプル結晶は均一に分布せず、そのため、良好なスポットを捜す必要があった
。この非均一性が原因で、質量の分解能は変化するが、脱着したオリゴヌクレオ
チドでは質量スペクトルは通常、２００-３００の範囲であった。ある一群の実 験では、非相補的配列はウェハーとハイブリダイズした；上記のように洗浄後の
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳの分析によると、非特異的アニーリングは最小となった
。シグナルが検出されなかったためである。
【０１５５】 実施例２ 連続および平行分配ツールを用いるＤＮＡアレイの調製 ロボットが操縦する連続および平行ｐＬ-ｎＬ分配ツールを用いると、マトリ クスアシストレーザー脱着イオン化質量分析用の平坦な表面または幾何学的に変
化した(例えば、ウェルを有する)表面を有する１"平方未満のチップにおいて１ ０-１０3のエレメントＤＮＡを生じた。最初に、'圧電ピペット(piezoelectric
pipette)'(70μm id キャピラリー)により、マトリクスの０．２ｎＬ以下の小滴
を単一および多数分配し、次いで、測定対象物をチップに分配した；０．２ｆｍ
ｏｌぐらいの低濃度の３６-ｍｅｒ ＤＮＡからのスペクトルがこのプロセスに必
要であった。急速な蒸発(＜５秒)にも拘わらず、測定対象物を含む３-ヒドロキ シピコリン酸マトリクスの微小結晶をルーチンで作成すると、より大きな体積調
製で通常得られる場合よりも高い再現性が得られた；８００μｍウェル中の２３
-ｍｅｒのスポット５ｆｍｏｌ、１００個すべてにおいて質量スペクトルへ容易 に変換され、ノイズに対するシグナルの比が５を超えるイオンシグナルを有して
いたものが１００のうち９９あった。２番目のアプローチでは、３８４ウェルマ
イクロタイタープレートからのプローブを、スプリングロードピンのアレイを用
いチップウェルまたは平坦表面上に、同時に１６に分配し、２０ｎＬ以下をチッ
プに表面接触により移す；平行法で置かれたアレイエレメントのＭＳ分析は、連
続法で得られた感度および分解能に関し、一致する。
【０１５６】 圧電連続ディスペンサーの詳細 実験システムは、Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ ＧｍｂＨ、Ｎｏｒｄｅｒｓｔｅｄｔ Ｇ
ｅｒｍａｎｙから購入したシステムから開発し、それには、圧電エレメントドラ
イバであって、ドライバに結合した圧電エレメントにパルスシグナルを送り、分
配した溶液を保持するガラスキャピラリーを取り巻くドライバ；キャピラリーに
ロード(陰圧により)するかまたはキャピラリーを空とする(陽圧により)圧力変換
器；ローディング、アンローディング、ディスペンシングおよびクリーニングの
ために動作するロボットＸＹＺステージおよびロボットドライバ、ストロボスコ
ープおよびピエゾエレメントにより'懸濁'小滴の特性が見られる頻度でパルスす
るドライバ；ソース用の分離ステージおよび指定プレートまたはサンプル標的( 即ち、Ｓｉチップ)；指定プレートへのローディングを観察するロボットアーム にマウントしたカメラ；ならびに圧力単位、ｘｙｚロボットおよび圧電ドライバ
を制御するデータステーションを含む。
【０１５７】 平行ディスペンサーの詳細 ロボットピンツールには、プローブブロック中に収めたプローブおよびＸ、Ｙ
、Ｚロボットステージ上にマウントしたプローブが１６含まれる。ロボットステ
ージは、ロボットのアームの下にサンプルトレイを位置し得る構台システムであ
った。構台ユニット自体がＸおよびＹアームを構成し、リニアオプティカルエン
コーダーにより位置フィードバックするブラッシュレスなリニアサーボモーター
でガイドされて、それぞれ、２５０および４００ｍｍ移動する。Ｚ軸を作動する
リードスクリュー(５０ｍｍ垂直移動)を、構台ユニットのＸＹ軸スライドにマウ
ントし、モーターをマウントした回転光学エンコーダーにより位置フィードバッ
クするライン回転サーボモーターにより制御する。システムの動作領域にスライ
ド-アウトツーリングプレートを装備し、５つのマイクロタイタープレート(殆ど
の場合、洗浄溶液に２プレートおよび最大１１５２種類のオリゴヌクレオチド溶
液用のサンプルに３プレート)および１０以下の２０×２０ｍｍウェハーを固定 する。ウェハーを２つのバンキングピンに対しプレート中に正確に位置させ、真
空により確保する。システム全体を安全のためにプレクシグラス中に収め、熱お
よび振動を減らすためにスチール支持体フレームにマウントした。作動の制御は
、３軸サーボコントローラーであり、コンピューターに組み入れられている(特 定の応用のためにプログラミングコードを必要に応じて書く)工業用作動コント ローラーを用いることにより行いる。
【０１５８】 サンプルを、(１)Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ Ｖｉｓｉｏｎ ２０ ００における通常の使用で提供されるときの平坦ステンレススチールサンプル標
的、(２)マイクロマシン化ナノピット(nanopit)を有する同一設計のステンレス スチール標的、(３)平坦シリコン(Ｓｉ)ウェハー、(４)磨きをかけた平坦Ｓｉウ
ェハー、(５)粗い(３-６ｐＬｍ特徴)ピットを有するＳｉウェハー、(６)化学的 にエッチングしたウェルの(ａ)１０×１０(または(ｂ)１６×１６)アレイを有す
る(ａ)１２×１２または((ｂ)１８×１８)ｍｍ Ｓｉチップ、それぞれ、８００ ×８００１ｌｍであり、サイドは９９-４００(または(ｂ)では１２０)マイクロ メーター、ピッチ(ａ)は１．０(または(ｂ)では１．１２５)ｍｍである、(７)化
学的にエッチングしたウェルの２８×２８アレイを有する１５×１５ｍｍ Ｓｉ チップ、それぞれ、サイドは４５０×４５０マイクロメーターであり、４８-３ ００マイクロメーターの範囲の深さであり、０．５ｍｍのピッチを有する、(８)
平坦なポリカーボネートまたは他のプラスチック、(９)金および他の金属、(１ ０)膜、(１１)金または他の伝導性物質でスプッターしたプラスチック表面を含 むＭＡＬＤＩ ＴＯＦ分析において標的となる幾つかの表面の連続システムに分 配した。分配体積を、分配する小滴数を調節することにより、１０-10から１０- 6 に調節する。
【０１５９】 サンプル調製および分配 １．連続 種々の配列または濃度のオリゴヌクレオチド(０．１-５０ｎｇ／マイクロタイ
ターを９６ウェルマイクロタイタープレートにのせた；最初のウェルをマトリク
ス溶液として残した。穴をあけたチップ(ＭＡＬＤＩ標的のセクションにおける 標的６ａ)をステージ上にのせ、手動で並べる。ロボット制御ソフトウェア(ウイ
ンドウズ)中に、最初のウェルの座標、アレイの大きさ(即ち、ｘおよびｙのスポ
ット数)およびエレメント間の距離、およびアレイエレメントあたりの０．２ｎ Ｌ小滴の数を入れた。キャピラリーを１０μＬ以下のリンスＨ2Ｏで満たし、連 続パルスモードの間のチップの完全性および清浄性を確認するためストロボ光照
射カメラが見える位置に自動的に移動し、空とした。次いで、キャピラリーをマ
トリクス溶液で満たし、再び、ストロボスコープで確認し、次いで、平坦の表面
または穴をあけた表面上のアレイへのスポットに使用した。別のＭＳモードにお
ける再現性の研究のために、１０×１０アレイに０．２−２０ｎＬの小滴を典型
的に分配した。キャピラリーを陽圧の適用により空とし、所望によりＨ2Ｏでリ ンスし、ソースオリゴプレートに移動し、５μＬ以下の０．０５-２．０μＭ合 成オリゴを引き入れた。次いで、キャピラリーを、各マトリクススポット上に連
続してラスターし、０．２-２０ｎＬ水溶液をそれぞれに加えた。
【０１６０】 ２．平行 平行プログラムは、オフセットプリンティングにより作成されるアレイを調節
するように書かれていた；１０ウェハー上に６４エレメントあるアレイを作成す
るために、例えば、ツールを３ ８４ウェルＤＮＡソースプレートの１６ウェル
に浸し、標的(例えば、Ｓｉ、プラスチック、金属)に移動し、サンプルを表面接
触によりスポットした。次いで、ツールを同じ１６ウェルに浸し、２番目の標的
にスポットし、このサイクルを１０のウェハーすべてにおいて繰り返した。次に
、ツールを洗浄溶液に浸し、次いで、１６種のソースプレートのウェルに浸し、
そして最初の一群の１６スポットから標的２．２５ｍｍオフセット上にスポット
した；再び、これを１０のウェハーすべてにおいて繰り返した；すべてのサイク
ルを繰り返し、各ピンから２×２アレイを作成し、８×８アレイのスポットを作
成した(２×２エレメント／ピン×１６ピン＝スポットしたエレメントは合計６ ４)。
【０１６１】 ＭＳ分析用のアレイを作成するため、配列または濃度の異なるオリゴヌクレオ
チドを、３種類以下の３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルにのせ、
一群の１６ウェルをマトリクス溶液に残した。２つのプレートのウェルを洗浄液
で満たした。５つのマイクロタイタープレートをスライドアウトツーリングプラ
ートにのせた。１０のウェハーを、ツーリングプレート上のバンキングピンに隣
接する用に位置させ、真空とした。マトリクスおよびオリゴヌクレオチドを事前
に混合しない場合、ピンツールを用い、１０ウェハーの望ましいアレイエレメン
トすべてにマトリクス溶液を最初にスポットした。この例として、１６×１６ア
レイを作成する。そのため、ツールを、１．１２５ｍｍのオフセットで各１０ウ
ェハーに１６回スポットしなければならない。次に、オリゴヌクレオチド溶液を
同じパターンにスポットし、マトリクスを再溶解した。同様に、オリゴヌクレオ
チド溶液をウェハー上に最初に置き、その後、マトリクス溶液を置くことにより
アレイを作成するか、またはマトリクスおよびオリゴヌクレオチド溶液を事前に
混合しアレイを作成する。
【０１６２】 マススペクトロメトリー 各分配概要の後、ロードしたチップを、ポリカーボネート支持体をマウントす
る一群のベベル化スクリューでＭＡＬＤＩ-ＴＯＦソースプレート上に保持した 。プレートをプローブの端に移動させ、飛行時間質量分析計のソース領域におい
て１μｍ分解能、１"トラベルｘｙステージ(Newport)に保持した。１８-２６ｋ Ｖ抽出で通常操作される器械を、直線状か曲線状のフィールドリフレクトロンモ
ードで操作し、そして連続的か遅延抽出モードで操作し得る。
【０１６３】 圧電ピペットを用いる連続分配 飽和３ＨＰＡ溶液の送達により、キャピラリーと空気の界面蒸発で溶媒がチッ
プに詰まる一方、ＤＮＡとマトリクスを事前に混合することによりマトリクスを
十分に希釈し、そのため、溶液中に残存する一方で、キャピラリーが空となるま
で保持され得る安定なスプレーが得られた；１：１希釈した(Ｈ2Ｏで)マトリク ス溶液は１０分以上連続してスプレーが可能であった。キャピラリーを５分間以
上作用しないようにピエゾエレメントのスイッチを切り、ピエゾエレメントを再
度作用することによってもキャプラリーが詰らない。
【０１６４】 Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｖｉｓｉｏｎ ２０００ ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦシステムにより
提供されるステンレススチールサンプル標的を用いる最初の実験は、リフレクト
ロンモードで行い、マトリクスとＤＮＡを事前に混合した溶液を使用し、その後
サンプル標的に分配する。単一のマイクロタイターウェルでは、飽和マトリクス
溶液５０μＬ、１２-ｍｅｒ(ＡＴＣＧ)３(配列番号３)溶液５１μＬのうち２５ μＬ、および２８-ｍｅｒ(ＡＴＣＧ)７(配列番号４)溶液５１μＬのうち２５μ Ｌを混合した。０．６μＬ小滴の一群の１０×１０アレイを、Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｖｉｓｉｏｎ ２０００サンプル標的ディスク上に直接分配した；ＭＡＬＤＩ- ＴＯＦ質量スペクトルは、７５０アトムモルの各２オリゴヌクレオチドを含む単
一のアレイエレメントから得られた。変換した質量スペクトルが、この方法を用
い、５３-ｍｅｒ(３５０ａｍｏｌをロードした。示さず)の大きさのＤＮＡ分子 から得られた。
【０１６５】 質量スペクトルは、シリコンチップのウェルに微小分配したＤＮＡ分子からも
得られた。図１０は、化学的にエッジングした１００のウェルを有する１２×１
２ｍｍシリコンチップを示す；マスクの大きさおよびエッジング時間をセットす
ると円錐台(fustum)(即ち、インバーテッドフラットトップピラミッド(inverted
flat top pyramidal))幾何学ウェルは８００×８００μｍ(上表面)および１０ ０μｍの深さとなった。所望により、ウェルを粗くし、穴をあけ得る。上記の通
り、チップの端をステージの一段高い表面に並べ、キャピラリーに関しｘおよび
ｙ座標システムを決めた(他には、光学的配置、人工知能パターン認識ルーチン 、手動配置に基づくドエル-ピンを含む。)。各ウェルに、測定対象物を含まない
２０小滴(〜５ｎＬ)の３-ＨＰＡマトリクス溶液を分配した；５０％ＣＨ3ＣＮ溶
液を用いる場合、各小滴の蒸発時間は５-１０秒のオーダーであった。溶媒蒸発 において、１２０×ステレオミクロスコープで観察する各微小分配マトリクス小
滴は、非晶および乳状平坦ディスクとしてみられた；その様子は小滴からなり、
図３ｂスペクトルが得られた。チップを空とすること、洗浄すること、２３-ｍ ｅｒＤＮＡ(Ｍr(計算値)＝６９６７Ｄａ)の１．４μｍ水溶液で再度満たすこと において、キャピラリーを１００スポットのマトリクス上に向け、５ｎＬのＤＮ
Ａ水溶液をマトリクス水滴の上部に直接分配した。ＣＣＤカメラを用いる視覚化
を使用すると、マトリクスと水性測定対象物溶液が混合し、マトリクスが再溶解
することがわかった(室温および湿度で１０秒以内で完全に蒸発する)。非晶マト
リクス表面を変換し、１μｍ未満のオーダーの結晶特性を有する真性微小結晶表
面に変換した。
【０１６６】 マトリクスを再溶解する方法により得られる改善した結晶と一致して、得られ
る質量スペクトルには、事前に混合したマトリクスと測定対象物溶液を合わせた
溶液よりも再現性があるように思われた；２３-ｍｅｒのスポット５ｆｍｏｌ、 １００スポットにより、変換された質量スペクトルが生じ(図１１)、１００のイ
オンシグナルのうち９９においてノイズに対するシグナルの比が５を超える；そ
の再現性はまた平坦シリコンおよび試験済み金属表面(示さず)で得られた。図１
１のスペクトルは２６ｋＶで操作する線形ＴＯＦ器械で得られた。一倍および二
倍電荷の分子イオンを用い、上部左のスペクトル(ウェル'ｋ１')を内部較正し、
この較正ファイルを他の９９のスペクトルに対し外部較正として適用(図１２)す
ると、平均分子量から９Ｄａ未満の標準偏差が得られ、それは０．１％未満の相
対標準偏差に相当した。
【０１６７】 ロボットピンツールを用いる平行分配 アレイは上記オフセットプリンティングで作成した。ＸおよびＹステージの速
度は３５インチ／秒、およびＺステージの速度は５．５インチ／秒である。Ｘお
よびＹステージを最大速度で移動させることができ、サイクル時間を短くするこ
とができるが、Ｚステージの速さは、ウェハーとの表面接触の前に遅くなり、ウ
ェハーの損傷を避ける。その軸速度で、１０のウェハーすべてにおける１６のエ
レメントにスポットするおおよそのサイクル時間(同一溶液に一つのツールイン プレッション)は２０秒であり、そのため、２５６エレメントのアレイでは５． ３分未満となる。種々のオリゴヌクレオチド溶液をアレイ上に置くと、付加的洗
浄段階を多く組込み、他の溶液に浸す前にチップを洗浄しなければならず、その
ため、サイクル時間は、２５秒となり、１０ウェハーでは６．７分かかった。
【０１６８】 ツールによるサンプル送達を、上記のような放射標識溶液およびホスホイメー
ジャーを用い調査した；各ピンは約１ｎＬの液体を送達することが判明した。ス
ポットからスポットへの再現性は高い。種々の配列および濃度の２５６オリゴヌ
クレオチドエレメントのアレイを、平坦シリコンウェハー上に、ピンツールを用
い作成し、そのウェハーをＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳにより分析した。
【０１６９】 実施例３ 核酸アレイの作成に用いる高密度核酸固定 実施例１に記載の高密度結合方法を用い、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析できる ＤＮＡオリゴマーのアレイを、表面上に多数の位置(location)、例えば凹部また
はパッチを有するシリコンウェハー上に作成した。アレイを得るため、遊離チオ
ールを含むオリゴヌクレオチドプライマーをウェハーの選択位置にのみに固定化
した(例えば、図１３参照)。アレイの各位置には、３種のオリゴマーのうち１つ
を含んでいた。種々の固定化オリゴマーが別々に検出され、識別され得ることを
説明するため、３つのオリゴマーのうち１つに相補的である種々の長さの３種の
オリゴヌクレオチドを、ウェハー上のアレイにハイブリダイズし、ＭＡＬＤＩ- ＴＯＦマススペクトロメトリーにより分析した。
【０１７０】 オリゴデオキシヌクレオチド ３つの群の相補的オリゴデオキシヌクレオチド対を合成し、その相補的オリゴ
ヌクレオチド対の１つには、３'-または５'-ジスルフィド連結(Operon Technolo
gies of Oligos, Etc.から購入した)が含まれる。例えば、オリゴマー１(ｄ(Ｃ ＴＧＡＴＧＣＧＴＣＧＧＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＴＴ-ＳＳ)；配列番号５)は、３'
-ジスルフィド連結を含む一方、オリゴマー２(ｄ(ＳＳ-ＣＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡ
ＣＴＧＴＧＴＡＧＴＡＴＴ)、配列番号６の５'-ジスルフィド誘導体およびオリ ゴマー３(ｄ(ＳＳ-ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧ)；配列番号１
の５'-ジスルフィド誘導体)、それぞれには５'-ジスルフィド連結が含まれる。
【０１７１】 オリゴマー１-３に相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ分析の間に互いから容易に分離できる種々の長さとする。例えば、２３-ｍ
ｅｒオリゴヌクレオチド(配列番号７)を合成しオリゴマー１の部分に相補的とし
、１２-ｍｅｒオリゴヌクレオチド(配列番号８)を合成しオリゴヌクレオチド２ の部分に相補的とし、そして、２１-ｍｅｒ(配列番号２；実施例１では“ＭＪＭ
６”と述べた配列)を合成しオリゴマー３の部分に相補的とした。加えて、４つ 目の２９-ｍｅｒオリゴヌクレオチド(配列番号９)を、３つのオリゴマーのうち 何れとも相補性を欠くように合成した。この４つ目のオリゴヌクレオチドを陰性
対照として用いた。
【０１７２】 シリコン表面化学およびＤＮＡ固定化 (ａ)４×４(１６-位置)アレイ ２６５個の凹部またはウェルを有し、１６×１６ウェルアレイ形の２×２ｃｍ 2 シリコンを商業上の供給者から購入した(Accelerator Technology Corp., Coll
ege Station, Texas)。ウェルは１．１２５のピッチ上で８００×８００μｍ2、
１２０μｍの深さであった。シリコンウェハーを３-アミノプロピルトリエトキ シシランと反応させ、均一な層の一級アミンを表面上に作成し、次いで、ヘテロ
二機能性架橋剤ＳＩＡＢにさらし、表面上にヨードアセトアミド機能性を生じさ
せる(例えば、図７参照)。
【０１７３】 種々の位置のシリコンアレイに結合するためのオリゴマーを調製するため、各
オリゴマーのジスルフィド結合を、実施例１に記載のように１０ｍＭ ＴＣＥＰ を用い十分に還元し、ＤＮＡを１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ８．０の溶液で 最終濃度１０μＭに再懸濁した。ジスルフィド結合の還元直後、オリゴマーの遊
離チオール基を、上記実施例７に実質的に記載のプローブ結合条件を用いウェハ
ー上の１６の位置でヨードアセトアミド機能と組合せた。ウェハー上の１６の位
置において別々の結合を実施するため、ウェハーの表面全体をオリゴヌクレオチ
ド溶液で勢いよく洗い流さず、代わりに、事前に測定した修飾オリゴマーの３０
ｎｌ以下のアリコートを、ウェハー上の２６５ウェルの各１６位置(即ち、凹部)
に平行に加え、本明細書に記載のとおりにピンツールを用い４×４アレイの固定
化ＤＮＡを作成した(例えば、本明細書中の詳細な説明および実施例４参照)。
【０１７４】 そのため、実施例１３に示したように、修飾オリゴマー１-３のうち１つを、 シリコンウェハー上の２５６ウェルの各１６種のウェルに共有結合的に固定化し
、それによって４×４アレイの固定化ＤＮＡを作成した。例えば、オリゴマー１
を４×４アレイの上端左手のコーナーのウェル位置で結合させ、オリゴマー２を
隣接位置などに結合させた。完成したアレイの解説を図１３で示している。
【０１７５】 ハイブリダイゼーション反応の実施において、３つの相補的オリゴヌクレオチ
ドおよび陰性対照オリゴヌクレオチドを、１Ｍ ＮａＣｌを加えたＴＥ緩衝液(１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ, ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ)１ｍｌ中の各オリゴヌ
クレオチドを最終濃度１０μＭで混合し、その溶液を６５℃で１０分間加熱した
。その直後、シリコンウェハーの表面全体を加熱オリゴヌクレオチド溶液８００
μｌで勢いよく洗い流した。相補的オリゴヌクレオチドを、１時間室温でシリコ
ンアレイをインキュベーションし、その後、少なくとも１０分間４℃でインキュ
ベーションすることにより、固定化オリゴマーにアニールさせた。他に、オリゴ
ヌクレオチド溶液をウェハーに加え、次いで、加熱し、ハイブリダイゼーション
のために冷却する。各位置に共有結合的に固定化した特定オリゴマーにアニール
した相補的オリゴヌクレオチドの解説を図１４に示す。
【０１７６】 次いで、ハイブリダイゼーションアレイを陽イオン交換用クエン酸アンモニウ
ム溶液５０ｍＭで洗浄し、ＤＮＡバックボーンのナトリウムおよびカリウムイオ
ンを除去した(Pieles, U. et al., (1993) Nucleic Acids Res. 21:3191-3196)
。６-ｎｌアリコートの３-ヒドロキシピコリン酸のマトリクス溶液(５０％アセ トニトリル中の０．７Ｍ ３-ヒドロキシピコリン酸-１０％クエン酸アンモニウ ム；Wu et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 7:142-146(1993))を、上記の圧
電ピペットを用い各位置のアレイに加えた。
【０１７７】 溶液を室温で乾燥し得、その後、６-ｎｌアリコートの水を、圧電ピペットを 用い各位置に加え、乾燥マトリクスＤＮＡ複合体を再懸濁し、そのため、室温で
の乾燥においてマトリクスＤＮＡ複合体により各位置の下部表面に均一の結晶表
面が形成された。
【０１７８】 ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ分析 ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ分析は、各１６位置のハイブリダイゼーションアレイ
において連続して行われる。それは、実施例１に記載のように図１４に実質的に
解説している。オリゴヌクレオチドの生じた質量スペクトルは、ＤＮＡハイブリ
ダイゼーションアレイの各１６位置にハイブリダイズする。それを図１５に示し
ている。質量スペクトルにより、各位置で特定のシグナルが見られ、その典型的
な位置において、実験的な電荷に対する質量比が観察され、それは、特定の相補
的ヌクレオチド配列に相当する。
【０１７９】 例えば、オリゴマー１のみが結合する位置では、質量スペクトルにより、優位
なシグナルが見られ、実験的な電荷に対する質量比は７０７２．４と観察され、
おおよそ２３-ｍｅｒの場合に相当する；２３-ｍｅｒにおける理論的な電荷に対
する質量比は７０７２．６Ｄａである。同様に、アレイに１２-ｍｅｒオリゴヌ クレオチドが特異的にハイブリダイズすることにより、実験的な電荷に対する質
量比は３６１８．３３Ｄａ(理論値３６２２．４Ｄａ)であると観察され、その特
異的ハイブリダイゼーションは、オリゴマー２と結合した位置でのみ検出された
。その一方、ＭＪＭ６の特異的ハイブリダイゼーション(実験的な電荷に対する 質量比は６４１５．４であると観察された)はオリゴマー３(理論値６４０７．２
Ｄａ)と結合したアレイの位置でのみ検出された。
【０１８０】 陰性対照２９-ｍｅｒオリゴヌクレオチド(理論的な電荷に対する質量比は８９
７４．８)に相当するシグナルを示すアレイ位置はなく、これにより示されるの は、特異的標的ＤＮＡ分子が、シリコンアレイの表面上の特定位置に共有結合的
に固定化されたオリゴマーとハイブリダイズし得、多数のハイブリダイゼーショ
ンアッセイが、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ分析を用い個々にモニターされることで
ある。
【０１８１】 (ｂ)８×８(６４-位置)アレイ １６×１６アレイのウェルを形成する２５６個の凹部またはウェルを有する２
×２ｃｍ2シリコンウェハーを、商業上の供給者(Accelerator Technology Corp.
, College Station, Texas)から購入した。ウェルは１．１２５のピッチ上で８ ００×８００μｍ2、１２０μｍの深さであった。シリコンウェハーを３-アミノ
プロピルトリエトキシシランと反応させ、均一な層の一級アミンを表面上に作成
し、次いで、ヘテロ二機能性架橋剤ＳＩＡＢにさらし、表面上にヨードアセトア
ミド機能を生じさせる(例えば、図７参照)。
【０１８２】 １６-位置ＤＮＡアレイの調製する上記の方法に従い、オリゴマー１-３を６４
-位置に固定化し、２５６ウェルシリコンウェハー上に８×８アレイを形成し、 相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ分析法
により分析した。図１６は、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ分析により連続分析する６４-位
置ＤＮＡアレイの質量スペクトルを示す。１６-位置アレイとして示すように、 相補的オリゴヌクレオチドを各固定化チオール含有オリゴマーにハイブリダイズ
し、各位置のＤＮＡアレイで観察した。
【０１８３】 実施例４ 一本鎖ニックＤＮＡ鋳型のＲＮＡ転写 この実施例では、効率におけるコーディング鎖ニック置換の効果を評価し、そ
れによってＲＮＡ転写産物を生じ、シーケンス用のＲＮＡ転写物を生ずる光学的
条件も提供する。
【０１８４】 １．鋳型およびプライマー配列の設計 プライマーすべてを、商業的に利用できるＤＮＡシンセサイザーで、通常のホ
スホロアミデイト化学(Sinha et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:4539)を 用い合成した。インビトロのＲＮＡ転写を合成５５ヌクレオチド二本鎖ＤＮＡ鋳
型で行った。鋳型を、３つのプライマー配列；５５ヌクレオチド非コーディング
鎖(配列番号１０)およびコーディング鎖(配列番号１１および１２)を形成する２
つの更なるプライマーを用いアセンブルした。図１７に示すように、コーディン
グ鎖中のニックの特定位置は各コーディング鎖プライマーの長さによる定義であ
る。転写のためのこの構成の使用により、この位置でのニックが実質的に転写を
減衰しないことを示す。
【０１８５】 ２．プライマーハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ転写 一本鎖ニック鋳型は３つの一本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーショ
ンを作成し、その全ＤＮＡ濃度は、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2中１０μＭ(鋳型よりも プライマーは２倍多い)であり、７０℃で１０分間反応混合物を加熱し、少なく とも４時間かけて室温に冷却することにより作成する。ニックの位置は、２つの
コーディング鎖(５'-３')ＤＮＡオリゴヌクレオチドの相当する長さにより決定 される。
【０１８６】 ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ転写 ニックＤＮＡ鋳型のインビトロの転写を、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７ ．０)、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ スペルミジン、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍ Ｍ ジチオスレイトール、１unit/μl ＲＮａｓｉｎ(Promega)、５ｍＭ ｒＮＴＰ
、５μＣｉ[α-３２Ｐ]ｒＣＴＰ、１unit/μl ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ(Amer
sham, Arlington Heights, IL)の反応２０μｌ中で、３７℃で３０分間行った。
不完全および全長のＲＮＡ転写産物を、ゲル電気泳動により分離し、ポリアクリ
ルアミドゲルを乾燥し個々のＲＮＡ断片の放射活性を測定することにより、そし
てPhosphoImager(Molecular Dynamics, Inc.)を用い既知標準と放射活性を比べ 測定することにより、定量した。ニックＤＮＡ鋳型の全長ＲＮＡ転写の効率を、
ニックを含まないＤＮＡ鋳型から転写した全長ＲＮＡのパーセントモルとして算
出した。ニックＤＮＡ鋳型の通過効率によりニックを、モル全長のＲＮＡ転写物
およびニックでストールしたＲＮＡ転写産物のモルのパーセントとして算出した
。
【０１８７】 表１に説明するように、全長ＲＮＡの転写は、転写開始点から＋７、＋８、＋
９または＋１９のヌクレオチド以後のコーディング鎖中にニックを組み込むと、
８８-９４％の効率で生じる。
【表１】 表１
【０１８８】 実施例５ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡシーケンシング １．鋳型およびプライマー配列の設計 プライマーすべてを、商業的に利用できるＤＮＡシンセサイザーで、通常のホ
スホロアミデイト化学(Sinha et al., (1984) Nucleic Acid Res. 12:453)を用 い合成した。インビトロのＲＮＡ転写を合成２７６ヌクレオチド二本鎖ＤＮＡ鋳
型(Ｔ７プロモーターを含む配列番号１３)で行った。
【０１８９】 ２．ＤＮＡシーケンシング 標的ＤＮＡ鋳型のＤＮＡシーケンシングを、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ ７．９)、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ 中性化スペルミジン、５ｍＭ ジチオスレ イトール、３００ｎＭ ｒＣＴＰ、３００ｎＭ ｒＡＴＰ、３００ｎＭ ｒＵＴＰ 、３００ｎＭ ｒＩＴＰ、６００ｎＭ ｒＧＭＰ、１０μＣｉ(α-32Ｐ)ｒＣＴＰ またはＵＴＰ、１０-３００、通常１０-５０μＭ ３'-デオキシヌクレオチド、 ０．５-１．０ｐｍｏｌ 直鎖状またはスーパーコイルのＤＮＡ鋳型、４ユニット
のＲＮａｓｉｎ(Promega)、１０unit/μl Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ(ＵＳＢ)の反
応１０μｌ中で、３７℃３０分間行った。チェーンターミネーション断片ＲＮＡ
転写産物を、８％または１３％ポリアクリルアミドゲルを用いるゲル電気泳動に
より分離した。
【０１９０】 ＲＮＡ終結断片のＤＮＡシーケンシングラダーが１８０-２００塩基までで生 じた。この例により示されるのは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、塩基特異的チェ
ーンターミネーターとして修飾３'-デオキシリボヌクレオシドを特異的に組込み
得、核酸をシーケンスするためのネストしたＲＮＡ転写物を生じ得る。
【０１９１】 修飾が当業者にとって容易であるため、本発明を添付の特許請求の範囲にのみ
に限定される。
【０１９２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、分析用のサンプル物質のアレイを調製するためのシステ
ムを示す。
【図２】 図２は、図１に示すシステムでの使用に適当なピンアセンブリを
示し、基体表面に物質を分配する平行プロセスを実行する。
【図３】 図３は、図２に示すアセンブリの下部分を示す。
【図４】 図４は、図２に示すピンアセンブリの下部分の別角度の様子を示
す。
【図５】 図５Ａ-５Ｄは、サンプル物質のアレイを調製する方法を示す。
【図６】 図６Ａ-６Ｂは、基体表面に物質を分配する他のアセンブリを示 す。
【図７】 図７は、本明細書で記載するような、オリゴデオキシヌクレオチ
ドによる二酸化シリコン表面への共有結合を示す概要図である。特に、二酸化シ
リコンは３-アミノプロピルトリエトキシシランと反応し、表面上に一級アミノ 基の均一な層を生ずる。次いで、ヘテロ二機能性架橋剤を一級アミンと反応し、
ヨードアセトアミド基を組込む。３'-または５'-ジスルフィドを含むオリゴデオ
キシヌクレオチド(５'に示すように)を、トリス-(２-カルボキシエチル)ホスフ ィン(ＴＣＥＰ)で処理すると、ジスルフィドは遊離チオールに還元し、次いで、
ヨードアセトアミド表面と結合した。
【図８】 図８は、シリコン表面へのオリゴデオキシヌクレオチドプローブ
の結合を、ジスルフィド還元に用いるＴＣＥＰ濃度の関数としてプロットしたグ
ラフである。
【図９】 図９は、図７に示すように実質的に共有結合した“ＴＣＵＣ”( ５'-GAATTCGAGC TCGGTACCCG G-３'；配列番号１)で示されるオリゴデオキシヌク
レオチド配列、およびそれにハイブリダイズする“ＭＪＭ６”(５'-CCGGGTACCG
AGCTCGAATT C-３'；配列番号２)で示されるオリゴデオキシヌクレオチド配列を 有するシリコンウェハーのマトリクスアシストレーザー吸収／イオン化-飛行時 間(ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ)質量スペクトルである。
【図１０】 図１０は、ウェルをエッチングした、ある態様の基体であって
、分析の物質を受けるのに適する。
【図１１】 図１１は、線形飛行時間型質量分析および図１０に示す基体表
面上のサンプル物質の典型的な物質の組成から得られるスペクトルの１例を示す
。
【図１２】 図１２は、図１１と同一のスペクトルを有するサンプル物質を
について測定した分子量を示す。
【図１３】 図１３は、実施例２に記載したように実質的にシリコンウェハ
ー表面上の１６位置と共有結合する“オリゴマー１”(５'- CTGGATGCGTC GGATCA
TCTT TTTT -(S)-３'；配列番号５)、オリゴマー２(５'-(S) CCTCTTGGGA ACTGTGT
AGT ATT -３'；配列番号６)および“オリゴマー３”(配列番号１；実施例１の遊
離チオール誘導体“ＴＣＵＣ”オリゴヌクレオチド)で示されるチオールを含む オリゴヌクレオチド分子を有する、シリコンウェハー表面上の４×４(１６位置)
ＤＮＡアレイの概要図である。
【図１４】 図１４は、図１３のＤＮＡハイブリダイゼーションアレイの個
々の１６位置に特異的なオリゴヌクレオチドが、オリゴマー１に結合するオリゴ
マー１相補的オリゴヌクレオチド(５'-GATGATCCGA CGCATCAGAA TGT-３'；配列番
号７)およびオリゴマー２に結合するオリゴマー２相補的オリゴヌクレオチド(５
'-AATACTACAC AG-３'；配列番号８)およびオリゴマー３に結合するオリゴマー３
相補的オリゴヌクレオチド(５'-CCGGGTACCG AGCTCGAATT C-３'；配列番号２)に ハイブリダイズする概要図である。
【図１５】 図１５は、図１５に図示するシリコンウェハー上の４×４(１ ６位置)ＤＮＡアレイの典型的なＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量スペクトルを示す。スペ
クトルは、特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに相当するそれぞれ
の位置での実験的な電荷に対する質量比の単一の優勢シグナルを示す。２＋は、
ＭＡＤＬＩ-ＴＯＦ ＭＳ分析の間の参照標準として使用する二倍電荷の分子の位
置を示す。＊は、洗浄後のチップ表面に残る汚染オリゴヌクレオチドの残余量を
示す。＊記号の相対的位置は、おおよその汚染オリゴヌクレオチドの大きさを示
す。
【図１６】 図１６は、８×８(６４位置)ＤＮＡアレイの典型的なＭＡＬＤ
Ｉ-ＴＯＦ質量スペクトルを示す。スペクトルは、予想される特異的ハイブリダ イズオリゴヌクレオチドの位置に相当する実験的な電荷に対する質量比の単一の
優勢シグナルを示す。＊は、洗浄後のウェハー表面に残る汚染オリゴヌクレオチ
ドの残余量を示す。＊記号の相対的位置は、おおよその汚染オリゴヌクレオチド
の大きさを示す。
【図１７】 図１７は、５５-ｍｅｒオリゴヌクレオチドが相補的２５-ｍｅ
ｒオリゴヌクレオチド(配列番号１１)および相補的３０-ｍｅｒオリゴヌクレオ チド(配列番号１２)にハイブリダイズすることにより、集合するＤＮＡ分子(配 列番号１０)のヌクレオチド配列を示す。生じた二本鎖ＤＮＡは、ＳＰ６プロモ ーター(配列番号１０のｎｔ１-１８)をコードし、分子のコーディング鎖中、Ｓ Ｐ６プロモーターの転写開始位置からｎｔ＋７の位置において、単一のニックを
有する。ニックの位置およびＳＰ６プロモーターの転写開始位置を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年２月１４日（２０００．２．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４３
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００４】 チェーンターミネーション法またはサンガー法は、ＤＮＡ合成に基づいている
。一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、標識したプライマーを用い、相補鎖の形成を
開始する。合成反応は、４つのデオキシヌクレオチド(ｄＮＴＰ)、ｄＡＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、ならびに４つのジデオキシヌクレオチド(ｄ ｄＮＴＰ)、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＧＴＰのうちの１ つの存在下に実施する。相補鎖は、ジデオキシヌクレオチドを伸張する鎖に加え
ることにより、完成前に終結する。４つのｄｄＮＴＰのうち１つをそれぞれ含む
４つの反応混合物で開始することにより、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴで終結する鎖の群
を生ずる。各反応混合物をポリアクリルアミドゲルの１レーンで電気泳動し、断
片を分離すると、１塩基の長さで違いが生じる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】 多くの使用できるシーケンシングストラテジーがある。ストラテジーの選択は
、ＤＮＡをシーケンスする目的およびシーケンスする前のＤＮＡについての利用
し得る情報量に依存する。例えば、標的ＤＮＡを、特定の変異がＤＮＡ内に導入
されるていることを確認するためにシーケンスするならば、小領域のＤＮＡをシ
ーケンスすることのみが必要となる。ＤＮＡ断片は、配列を正確に決定しなけれ
ばならない未知の遺伝子または遺伝子部分であるならば、断片全体をシーケンス
する必要がある。シーケンスし得る断片の大きさは約４００塩基が限界であるた
め、この大きさよりも長いＤＮＡ断片は切断しなければならない。切断はランダ
ムでよく、その後、標的ＤＮＡのセグメントのサブクローニングする。次いで、
オーバーラップする断片を含むサブクローニングした断片をシーケンスし、コン
ピュータープログラムで並べる(例えば、Staden(1986) Nucl. Acids Res. 14:21
7参照)。また、ＤＮＡを、オーバーラップする変異かネストする変異を生じ、そ
して、シーケンスすることにより、または他の整列アプローチにより、系統的に
サブクローニングし得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】 サンガーチェーンターミネーション法および他のシーケンシング方法は、標的
ＤＮＡを一本鎖ファージェベクターにクローニングすることによる、一本鎖鋳型
の使用に依存する。しかし、標的ＤＮＡのためベクターとしてプラスミドを使用
することは、多くの理由からファージＤＮＡの使用よりも好ましく、それには、
種々の利用可能なプラスミド、プラスミドの操作容易性、およびファージベクタ
ーと比べて挿入ＤＮＡがプラスミド中でより安定であることを含む。したがって
、標的ＤＮＡを一本鎖ファージＤＮＡ以外のプラスミドＤＮＡにクローニングす
るシーケンシング方法(例えば、Wallace et al., (1981) Gene 16:21-26; Guo e
t al., (1982) Nucl. Acids Res. 10:2065-2084;Vieira et al., (1982) Gene 1
9:259-268参照)が開発されている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】 これらの方法は、同時に一本鎖標的ＤＮＡの配列決定するためにのみ設計され
る(例えば、Chen et al., (1985) DNA 4:165-170; Hattori et al., (1986) Ana
l. Biochem. 152:232-238; Mierendorf et al., (1987) Methods Enzymol. 152:
556;Mehra et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7013-7017参照)。 二本鎖ＤＮＡの使用により、一本鎖ＤＮＡ断片のサブクローニングまたは単離が
避けられ、それはジデオキシ鎖ターミネーターシーケンシング反応を使用する。
しかし、二本鎖ＤＮＡの使用が制限される。それは、変性させた二重鎖ＤＮＡの
鋳型としての性質が悪いからである。結果として、これらの方法からは、一本鎖
ベクターにＤＮＡをクローニングする方法により提供される程度の正確な配列デ
ータは得られなかった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】 シーケンシング方法論を用い、ヒトゲノム配列全体を最終的に決定する。ヒト
ゲノムＤＮＡの完全配列の知識は、ヒトの疾患の理解、診断、防止、および処置
の助けとなる。適度な時間枠で、そして経済的な方法で、約３０臆塩基対のヒト
ゲノムの配列決定を成功させるため、迅速で、信頼性があり、感度がよく、安価
な方法であることが必要とされている。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】 本方法の実施では、プロモーターおよび操作可能となるようにプロモーターに
連結した標的核酸配列を含むＤＮＡ分子を、標的を含む一群のネストしたＲＮＡ
転写産物を生ずる条件下、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼで転写す
る。転写産物の分子量を、マススペクトロメトリーで測定し、そして標的配列の
核酸配列を決定する。プロモーターおよび標的を含むＤＮＡ分子は、好ましくは
固定化されている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】 好ましい態様では、プロモーターを含む核酸は、３'末端の非コーディング鎖 または５'末端のコーディング鎖を介して固相と共有結合する。結合は、当業者 に既知の任意の方法を用い、例えばチオール結合を用いる。例えば、５'-または
３'-チオール酸化ＤＮＡを調製し、アミノシラン処置固体支持体に結合する。結
合は、直接か、またはリンカー基を介する。生じた固定化分子は好ましくはアレ
イ形に並べられる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】 プロモーターをコードしている二本鎖核酸分子は、任意の源から得られ、例え
ば細菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物および真核生物であり、または合
成プロトコールと合わせることができる。それを工作すると、生じた断片はコー
ディング(センス)鎖の３'末端に少なくとも５ヌクレオチドの一本鎖領域を含む 。この一本鎖領域を、シーケンスされる核酸領域または通常のオーバーラッピン
グ配列、例えば制限エンドヌクレアーゼ部位と相補的となるように設計する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】 シーケンスされる核酸領域を含む標的核酸は、一本鎖であるか二本鎖であるが
、一本鎖３'末端を含み、そして、プロモーターを含むＤＮＡの相補的配列にハ イブリダイズする。ハイブリダイゼーションは固定化前または後何れかに行う。
２つの核酸分子のハイブリダイゼーションにより、１またはそれ以上の“ニック
”がハイブリッド中の隣接核酸分子のジャンクションの位置に導入される。ある
態様では、コーディングまたは非コーディング鎖、好ましくは、コーディング鎖
中のニックは、転写開始前に適当な核酸リガーゼの添加により連結される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】 好ましくは、方法は、ネストしたＲＮＡ転写産物を生ずる任意の適当なストラ
テジーを採用する。好ましい方法は、修飾したサンガーシーケンシングストラテ
ジーに基づき、それは、ＲＮＡを用い、塩基特異的チェーンターミネーションに
より得られる一群のネストしたＲＮＡ転写産物を生じる。これらは、マススペク
トロメトリーにより分析される。修飾したギルバート-マキサムストラテジーも また考慮される。この方法において、転写産物は、塩基特異的ＲＮａｓｅを用い
切断され、塩基特異的に終結した断片を生じ、次いで、分子量はマススペクトロ
メトリーにより評価される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】 転写は、適当なＲＮＡポリメラーゼの添加により、リボヌクレオシド三リン酸
および選択された塩基特異的チェーンターミネイティング３'-デオキシリボヌク
レオシド三リン酸の存在下、プロモーターから開始される。好ましい態様では、
転写混合物はまた、修飾されたリボヌクレオシド三リン酸を含み、そして、リボ
ヌクレオチド類似体は、生ずるＲＮＡ転写産物の二次構造を減少し、および／ま
たはＲＮＡポリメラーゼ酵素の終結およびターンオーバーの忠実性を増加し、そ
れによって分析に利用できるＲＮＡ転写産物の量が増加する。これら類似体には
、二次構造を減少させるイノシン５'-三リン酸(ＩＴＰ)、ＲＮＡポリメラーゼ酵
素の終結およびターンオーバーの忠実性を増加しそれによって分析に利用可能な
ＲＮＡ転写産物の量を増加する４-チオウリジン５'-三リン酸(ＵＴＰ)および５-
ブロモＵＴＰまたは５'-ヨードＣＴＰが含まれるが、これらに限らない。生じた
ＲＮＡ転写産物は、マススペクトロメトリーで分析する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】 他の態様では、サンプルは、マトリクス利用レーザー吸収／イオン化マススペ
クトロメトリー(ＭＡＬＤＩ)による分析としてのマススペクトロメトリー用のマ
トリクス物質を更に含み、好ましくは、更に、飛行時間(ＴＯＦ)分析に使用する
。核酸の配列は、４つのチェーンターミネイティング塩基をそれぞれ含むシーケ
ンシング反応から得られるチェーンターミネイテッドＲＮＡ転写産物の観察すべ
き質量を並べることにより得られる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】 転写ターミネーターおよびアテニュエーター配列を同定する方法も提供される
。転写条件を修飾し、全長の転写産物を生ずることにより、ｒｈｏ-依存性およ びｒｈｏ-独立性ターミネーターのような転写ターミネーター配列が、マススペ クトロメトリー法を用い、同定され得る。その方法の実施では、一本鎖領域であ
るシーケンスされる標的核酸の３'末端が、相補的配列と、プロモーターを含む 核酸プローブのコーディング鎖の３'末端でハイブリダイズする。好ましい態様 では、プロモーターを含む核酸は、非コーディング鎖の５'末端またはコーディ ング鎖の３'末端を介し、固体支持体と共有結合し、更に好ましくは、５'-また は３'-チオール酸化ＤＮＡは高密度でアミノシラン処理固体支持体と連結する。
連結はリンカー基の存在下または非存在下でされ得、好ましくはアレイ形に並べ
られる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】 本明細書で使用したように、“核酸”という語は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)
およびリボ核酸(ＲＮＡ)のようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、
ならびにＲＮＡまたはＤＮＡの何れかの類似体について言及し、例えばそれはヌ
クレオチド類似体から作成され、何れの場合も一本鎖または二本鎖形であり、お
よびプロテイン核酸(protein nucleic acid)(ＰＮＡ)でもある。核酸分子は、合
成し得るか、または特に生体サンプルから、当分野に既知の任意の多くの方法を
用い単離することができ、選択する特定の方法を特定の生体サンプルにあわせる
。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】 他に核酸プロモーター含有プローブの一本鎖領域は、非コーディング(アンチ センス)鎖(プロモーターに関連する)の５'末端に少なくとも約５ヌクレオチドを
含み、そのヌクレオチドは標的核酸のコーディング鎖の５'末端の少なくとも約 ５つのヌクレオチドに相補的である。この態様では、標的は二本鎖でなければな
らない。ハイブリダイゼーション後、生じた分子はコーディングおよび非コーデ
ィング鎖中にニックを有する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】 本明細書中で使用するとき、標的核酸はシーケンスされた核酸分子である。巨
大分子の一部であり得る。標的核酸を含む分子は、少なくとも約５ヌクレオチド
であって、プロモーターを含む捕捉プローブにおいて３'末端(または選択された
配置に依存する５'末端)でオーバーハングする少なくとも５つの隣接ヌクレオチ
ドと十分に相補的となるように配列が設計されたヌクレオチドを含み得るか、当
該ヌクレオチドを含むように修飾され得る。標的核酸は二本鎖であって、３'ま たは５'一本鎖オーバーハングであるかまたは一本鎖であり得る。ＲＮＡポリメ ラーゼは、特に、三重複合体が一旦形成されると、一本鎖分子を転写できるか、
または転写する。標的はまた、ＲＮＡまたはＰＮＡでもよい(アミノ酸バックボ ーンに塩基を結合することにより形成されるタンパク質核酸；例えばNielsen et
al., (1991) Science 254; 1497参照)。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】 本明細書中で使用するとき、塩基特異的に終結するリボヌクレオチドは、転写
の際の組込みおいて、転写終結を生ずるヌクレオチドを生成するものである。塩
基特異的に終結するリボヌクレオシド三リン酸は、塩基特異的に終結するリボヌ
クレオチドを合成するものであって、当業者に既知である。塩基特異的に終結す
るリボヌクレオシド三リン酸の例は、３'-ｄＧＴＰのような３'-デオキシリボヌ
クレオシド三リン酸および本明細書に記載する他のものおよび当業者に既知の他
のものを含むがこれらに限らない。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】 本明細書中で使用するとき、ミスマッチの割合の測定におけるハイブリダイゼ
ーションの緊縮は以下の通りである。 １)高緊縮：０．１ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃ ２)中緊縮：０．２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ ３)低緊縮：１．０ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ 同等の緊縮が、他の緩衝液、塩および温度を用いて達成することができると理解
される。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】 “架橋剤”という語は技術的に理解されており、本明細書中で使用するとき、
核酸を不溶性支持体に、好ましくは共有結合を介して固定化する試薬について言
及する。したがって、本明細書中で使用する適当な“架橋剤”は、不溶性支持体
の表面上に存在する官能基および核酸分子中に存在する官能基と反応することが
できる多様な試薬を含む。その反応ができる試薬にはホモ-およびヘテロ-二機能
性(bifunctional)試薬、当分野に既知の多くのものを含む。ヘテロ二機能性試薬
が好ましい。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４５】 本明細書中で使用するとき、“サンプル”は、検出される物質を含む組成物に
ついて言及する。好ましい態様では、サンプルは“生体サンプル”であって、そ
れは、動物、特にヒトを含む哺乳類、植物、細菌、カビ、原生生物およびウイル
スを含むがこれらに限らない生物から得られる任意の物質について言及する。生
体サンプルは任意の形態であり得、組織、細胞および生検物質のような固体物質
、ならびに尿、血液、唾液、羊水、脳髄液および含嗽液(口内細胞を含む)を含む
体液を含む。好ましくは、固体物質は液体と混合される。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４６】 本明細書中で使用するとき、“基体”または“固体支持体”は、サンプルが本
明細書に記載の物質のように沈殿する不溶性支持体を意味する。適当な基体の例
は、シリカゲルを含む(これに限らない)ビーズ、調節細孔ガラス(controlled po
re glass)、磁石、デキストラン、アガロースおよびセルロース、キャピラリー 、ガラスファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、ア ルミニウム、銅およびシリコン)、マルチウェルプレートを含むプラスチック物 質または膜(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニル インデンジフルオリド)のような平坦支持体、ピン、コンビナトリアル合成(comb
inatorial synthesis)もしくは分析に適当なピンのアレイのようなもの、または
ウェハー、特にシリコンウェハーのような平坦表面のピン中のビーズ(プレート を有するかまたは有しない)を含む。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４７】 本明細書中で使用するとき、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメ
ラーゼおよびＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼにつて言及する。任意のＲＮＡポリ
メラーゼは、特定プロモーター配列を認識し、転写開始およびＲＮＡ転写物の伸
張が可能であり、それらが本明細書の範囲となることを目的とする。本明細書で
提供される方法で使用する典型的なＲＮＡポリメラーゼは、１)Halobacterium、
Methanobacterium、Methanococcus、SulfolobalesおよびThermoplasmaのような 古細菌、２)グラム陰性細菌、例えばEscherichia coliおよびSalmonellaおよびS
higella、グラム陽性細菌、例えばBacillus subtilisおよびStaphlococcus aure
usのような真正細菌、３)Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、ニックの入ったＳＰ６およびＮ ４のようなバクテリオファージ、４)ＤＮＡウイルス、５)インフルエンザウイル
スのようなＲＮＡウイルス、６)小麦のような植物、ならびに７)カビから単離し
た真核性ＲＮＡポリメラーゼII、例えばSaccharomyces cerevisiaeおよび高等真
核生物、例えば哺乳類から得られるがこれらに限らないものを含む。ＲＮＡファ
ージＱβレプリカーゼ(国際ＰＣＴ出願番号PCT/US87/00880および5,270,184)は 本明細書中で使用するＲＮＡポリメラーゼの語の範囲に含まれている。植物およ
び動物を含む真核組織から単離されるものといった真核性ＲＮＡポリメラーゼは
、真核性細胞に感染するウイルス由来のウイルス性プロモーターを含む真核性プ
ロモーターを認識する。そのポリメラーゼをも本明細書の目的とする。Ｔ７、Ｔ
３、およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼはクローニングされており、配列およびそ
れを精製する方法ならびに細菌性ＲＮＡポリメラーゼを精製する方法および真核
性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼは既知である。加えて、多くのＲＮＡポリメラ
ーゼが、商業上多量に利用可能であり、商業的に利用可能なベクターから簡単に
作成することも可能である。上記ポリメラーゼおよび他のＲＮＡポリメラーゼ、
それぞれ用のプロモーターの配列もまた当業者に既知である。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４９】 本明細書中で使用するとき、“プロモーターを含む核酸”は、ＲＮＡポリメラ
ーゼ分子の特異的結合を指示するヌクレオチドの配列を含む核酸であり、二本鎖
ＤＮＡに結合し解離し、リボヌクレオチド三リン酸の存在下ＲＮＡ合成を開始し
得るオープン転写開始複合体(open transcription initiation complex)を形成 する。更に、機能性(functional)プロモーター配列は、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメ
ラーゼが結合、解離、開始複合体の形成および転写開始するヌクレオチドの配列
である。プロモーターを含む核酸捕捉プローブは、プロモーター領域、および標
的核酸が特に高緊縮条件下ハイブリダイズする少なくとも約５つのヌクレオチド
の３'オーバーハングを含む二本鎖分子について言及する。典型的に、そのハイ ブリダイゼーションは、標的とプロモーターを含む捕捉プローブとの間で同一の
約５つの隣接塩基対を必要とする。転写開始後、ＲＮＡポリメラーゼ(またはそ のサブユニット)は、ポリメラーゼ、ＤＮＡおよび発生ＲＮＡ転写産物を含む三 重複合体の一部である。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５３】 本明細書中で使用するとき、“コンディショニング”は、質量分析前に、分析
する核酸を修飾し、例えば気化(volatization)に必要なレーザーエネルギーを減
少させ、および／または断片化を最少とするプロセスについて言及する。コンデ
ィショニングは、核酸、好ましくは固定化後行われ得る。コンディショニングの
例は、例えば陽イオン交換による核酸分子のホスホジエステルバックボーンの修
飾であり、それによって、ヌクレオチド単位あたりの結合する陽イオンにおける
不均一により広がるピークが除去される。核酸分子を、アルキルヨウ化物、ヨー
ドアセトアミド、ヨードエタノール、または２,３-エポキシ-１-プロパノールの
ようなアルキル化剤と接触することにより、核酸分子のモノチオホスホジエステ
ル結合はホスホトリエステル結合に変換する。同様に、ホスホジエステル結合を
、トリアルキルシリルクロリドを用い変換すると非電荷誘導体を生ずる。コンデ
ィショニングはまた、合成の間に修飾ヌクレオチドを核酸に組込むことにより行
い得る。その修飾ヌクレオチドは、Ｎ５-、Ｎ７-またはＮ９-デアザプリンヌク レオチドまたはリボヌクレオチドのようなプリン類似体により、脱プリン化の感
度の減少(ＭＳ間の断片化)に使用し得る。修飾ヌクレオチドはまた、アルキル化
する、ＲＮＡビルディングブロック、オリゴヌクレオチドトリエステル、ホスホ
ロチオネート機能、またはＰＮＡのような偽オリゴヌクレオチドを含み得る。修
飾ヌクレオチドを有するコンディショニングしたＲＮＡ転写産物の調製では、選
択されたＲＮＡポリメラーゼが、修飾ヌクレオチドをＲＮＡ転写産物中に組込め
なければならない。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５４】 シーケンシングの方法 核酸をシーケンスする質量分析法を提供する。特に、シーケンスする方法は、
プロモーターをコードする二本鎖領域および標的核酸の相補的領域とハイブリダ
イズする一本鎖領域を含む、核酸を含むプローブを用いる。核酸プロモーターを
含む捕捉プローブは、好ましくは固体支持体に固定化される。一本鎖領域は、シ
ーケンスされる核酸およびプローブの５隣接一本鎖ヌクレオチドと同一の一本鎖
領域の少なくとも５ヌクレオチドを含む、標的核酸の相補的領域とハイブリダイ
ズする。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５６】 ＤＮＡは時折、シーケンシングに好ましい媒体である一方、本明細書の方法は
により、ＲＮＡ転写産物をシーケンスする。ＲＮＡ断片は、マトリクスアシスト
レーザー吸収/イオン化(ＭＡＬＤＩ)マススペクトロメトリーの間、ＤＮＡ断片 よりも安定する。理論によると結合しないが、促進された安定性は、ＲＮＡの糖
部分の２'-ヒドロキシル基の存在により生じ、ＭＡＬＤＩプロセスの間、脱プリ
ン化の減少を助ける。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５７】 ＲＮＡポリメラーゼおよびプロモーター ＲＮＡ分子のインビトロの転写を目的とし得る任意のＲＮＡポリメラーゼは、
本明細書に記載の方法で使用することを目的とする。好ましいＲＮＡポリメラー
ゼは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼである。ＲＮＡポリメラーゼ分子を単離し
および精製する方法は、当業者に既知である：Ｑβレプリカーゼ(例えば米国特 許番号5,696,249、再発行：35,443およびProcedures in Nucl. Acids Reseach,
Cantoni and Davies, eds., Volume 2, pp. 829-839, Harper and Rowe, NY中の
Eoyang et al., (1971)参照)；細菌(例えばE.coli、Burgess and Jendrisak(197
5)Biochemistry 14:4634-4638およびHager et al., (1990)Biochemistry 29:789
0-7894参照；Leishmania、例えばSadhukhan et al., (1997)Mol. Cell. Biochem
. 171; 105-114；Bacillus subtilis、Giacomoni(1980)Eur. J. Biochem. 106:5
79-591)；ファージ(例えば、T7、McDonnell et al., (1977)J. Mol. Biol. 89:7
19-736およびStudier et al., (1969) Virology 39:562-574;またHe et al., (1
997) Protein Expr. Purif. 9:142-151)；ウイルス(例えば、rhabdovirus、Das
et al., (1996) Methods Enzymol. 275:99-122参照；turnip mosiac virus, Dei
dman et al., (1997)J.Viral Meth. 64:184-195参照;vaccinia、Gershon et al.
, (1996)Methods Enzymol. 275:35-57)；哺乳類(例えば、yeast polII, Koleske
et al., (1996)Methods Enzymol. 273:176-184;ヒトpolII、Maldonado et al.,
(1996) Methods Enzymol. 274:72-100)。加えて、多くの原核、真核、バクテリ
オファージおよびウイルスＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ３、Ｔ７およびＳＰ６
は、商業上利用可能であり(例えば、Stratage, La Jolla, CA; Boehringer Mann
heim, Indianapolis, IN;Pharmacia, Uppsala, Sweden;およびSigma Chemical C
orp, St. Louis, MO)、および／または既知である。プロモーターも既知であり 、容易に利用可能である(例えば、Promega, Madison WIより利用できるｐＧＥＭ
プラスミドシリーズ、米国特許番号4,766,072も参照。それはｐＧＥＭプラスミ ドの構成について記載されている)。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５８】 方法の実施において、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼを使用し得る。例えば、本明細書中で提供される方法に使用し得る
ＲＮＡポリメラーゼには、１)Halobacterium、Methanobacterium、Methanococcu
s、SulfolobalesおよびThermoplasmaのような古細菌、２)グラム陰性細菌、例え
ばEscherichia coliおよびSalmonellaおよびShigella、グラム陽性細菌、例えば
Bacillus subtilisおよびStaphlococcus aureusのような真正細菌、３)Ｔ７、Ｔ
３、ＳＰ６およびＮ４のようなバクテリオファージ、４)ＤＮＡウイルス、５)イ
ンフルエンザウイルスのようなＲＮＡウイルス、６)小麦のような植物および植 物ウイルスおよびカブモザイクウイルス、ならびに７)カビから単離した真核性 ＲＮＡポリメラーゼII、例えばSaccharomyces cerevisiaeおよび高等真核生物、
例えば哺乳類(再検討のため、RNA Polymerase and the Regulation of Transcri
ption, Reznikoff et al., eds, Elsevier, NY参照)から得られたものを含むが これらに限らない。また、本明細書での使用に含まれるのは、ＱβＲＮＡファー
ジのＱβレプリカーゼである(例えば、米国特許番号5,670,353、5,696,249およ び再発行：35,443参照)。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５９】 シーケンスされる核酸および鋳型に適当なＲＮＡポリメラーゼの選択は、技術
者の技術の範囲内であり、シーケンスされる核酸分子および選択されたプロモー
ター領域により変化する。その選択は、当業者に既知の教えに従い経験的に決定
でき、それらには本明細書に記載のものを含む。シーケンスされる好ましい核酸
分子はＤＮＡ分子である。ＲＮＡおよび、特にＰＮＡ(タンパク質核酸)はまた、
適当なＲＮＡポリメラーゼの選択に応じてシーケンシングに影響を与える。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６０】 本明細書に記載したシーケンシング方法に使用する核酸プロモーター含有プロ
ーブ、それぞれにはプロモーターを含む。本明細書の方法に使用するプロモータ
ーは任意の源から得られ得、選択されたＲＮＡポリメラーゼにより認識される配
列を基にして合成的に調製され得る。例えば、プロモーターを含む核酸は、細菌
、ウイルス、ファージおよび真核生物のような多種多様な生物から、クローニン
グにより直接得られるか、または商業的に利用可能な発現ベクターから直接得ら
れる(例えば、Boehringer MannheimおよびPharmaciaのＴ７、Ｔ３、ＳＰ６およ びλＰＬおよびλＰＲプロモーター；ｂｌａまたはｌａｃプロモーター、ＲＳＶ
-ＬＴＲプロモーターおよびＦ９-１プロモーター；Stratageneより)。適当なプ ロモーターの選択は、シーケンスされる核酸、シーケンシングの条件、および最
も重要であるのは転写用に選択するＲＮＡポリメラーゼに依存する。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６２】 核酸プロモーター含有プローブの固定化 好ましい態様では、核酸プロモーター含有プローブを、直接か、架橋剤により
、本明細書中で提供する固体支持体に固定化する。プローブを、標的とハイブリ
ダイズする前、またはハイブリダイズした後、固定化し得る。好ましくは、そし
て、最も都合よくは、ハイブリダイゼーションは固体支持体に固定化した後行う
。プローブは、好ましくはコーディング鎖の５'末端または非コーディング鎖の ３'末端を介し固定化される。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６３】 他の態様では、プロモーターおよび下流標的核酸を、転写単位として、ゲノム
ＤＮＡから、プライマーによる増幅またはハイブリダイゼーションクローニング
技術により、単離することができる。次いで、プロモーターおよび標的をコード
するＤＮＡを、コーディング鎖(センス鎖)の５'末端または非コーディング鎖の ３'末端の終端ヌクレオチドを介し固体支持体に固定化し得る。更に以下で考察 するように、連結基をＰＣＲプライマーに組込み、固相への有向固定化を行うプ
ロモーター含有核酸鋳型の単離に使用し得る。プロモーターを認識する適当なＲ
ＮＡポリメラーゼの使用により、チェーンターミネイティングヌクレオチドが存
在下で、シーケンスを決定できる一群のネストした断片が生ずる。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６５】 架橋試薬を用いない方法の態様では、修飾核酸は、直接、適当な機能化表面と
反応し、固定化核酸を生ずる。そのため、例えば、ヨードアセチル修飾表面(ま たは他のチオール反応性表面機能)は、チオール修飾核酸と反応し、固定化核酸 を提供することができる。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６７】 修飾核酸プロモーター含有プローブおよびリンカー 本明細書中で使用するための、好ましい核酸プロモーター含有プローブは、“
チオール修飾核酸”、即ち、少なくとも１つの反応性チオール部分を含むように
誘導された核酸である。更に下記実施例１で詳細したように、少なくとも１つの
反応性チオールを含む核酸を、３'または５'ジスルフィドを含む核酸を好ましく
は後の反応で拮抗しない(即ち、ヨードアセトイミド機能と反応しない)還元剤で
処理することにより、好ましくは合成する。ジスルフィド誘導性核酸は様々な方
法で合成され得る。例えば、核酸は、ジスルフィド含有修飾試薬との反応により
３'または５'末端で修飾され得る。他に、チオール酸プライマーは酵素学的に、
または非酵素学的に核酸に結合され得る。５'ホスホロアミデイト機能はまたチ オールまたはジスルフィド含有シトシンまたはデオキシシトシンへの結合点を提
供し得る。ジスルフィド修飾核酸の還元に適当な還元剤の例には、トリス-(２- カルボキシエチル)ホスフィン(ＴＣＥＰ)(好ましくは１-１００ｍＭの範囲の濃 度(最も好ましくは約１０ｍＭ))がｐＨ３-６の範囲(最も好ましくは約４．５)、
温度２０-４５℃の範囲(最も好ましくは約３７℃)で、約１ないし約１０時間(最
も好ましくは約５時間)反応すること、ジチオスレイトール(好ましくは２５ない
し１００ｍＭの濃度範囲(反応物が単離されるかどうかに依存する))がｐＨ６-１
０(最も好ましくは約８)および温度２５-４５℃(最も好ましくは約３７℃)で、 約１ないし約１０時間(最も好ましくは５時間)反応することを含む。ＴＣＥＰは
、反応し得る低ｐＨで利点がある。この低いｐＨは、チオールを効率的にプロト
ン化し、そのため、チオールの求核反応を抑制し、高いｐＨで使用する他のジス
ルフィド還元剤を有する場合よりも副作用が少ない。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６８】 以下の実施例１で更に記載するような、好ましい二機能性架橋剤は、Ｎ-スク シンイミジル(４-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(ＳＩＡＢ)である。他の 架橋剤には、ジマレイミド、ジチオ-ビス-ニトロ安息香酸(ＤＴＮＢ)、Ｎ-スク シンイミジル-Ｓ-アセチル-チオアセテート(ＳＡＴＡ)、Ｎ-スクシンイミジル- ３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、４-(Ｎ-マレイミドメ チル)シクロヘキサン-１-カルボン酸スクシンイミジル(ＳＭＣＣ)および６-ヒド
ラジノニコチンイミド(nicotimide)(ＨＹＮＩＣ)が含まれるが、これらに限らず
、新規プロセスにも使用され得る。架橋剤の更なる例は、例えばWong "Chemistr
y of Protein Conjugation and Cross-Linking, " CRC Press (1991), and Herm
anson, "Bioconjugate Techniques" Academic Press (1995)参照。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６９】 他の態様では、核酸を、マススペクトロメトリーで切断する光開裂可能または
光に不安定なリンカー部分を用い固定化する。典型的な光に不安定な架橋リンカ
ーには、３-アミノ-(２-ニトロフェニル)プロピオン酸(Brown et al.(1995) Mol
ecular Diversity, pp.4-12 and Rothschild et al., (1996) Nucl. Acids Res.
24:361-66)を含むがこれらに限らない。また国際特許出願番号ＷＯ９８/２００
１９参照。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７５】 既述のように、固定化を含む方法の幾つかの態様を本明細書の目的とする。こ
れらには、１)プライマー核酸が固体支持体に固定化され、標的核酸がハイブリ ダイズし、プロモーター配列を形成すること、２)プロモーターをコードする二 本鎖核酸(増幅または単離した)を、連結を介して、事前に決定した鎖に固定化し
、インビトロの転写を事前に決定したデオキシリボヌクレオチド存在下開始する
こと、および３)利用可能な配列情報がある場合に増幅され得る標的核酸が３'オ
ーバーハングを有する二本鎖核酸補足プローブとハイブリダイズし、生じたハイ
ブリッドを固定化することが含まれるが、これらの態様に限らない。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７６】 プライマー核酸を固体支持体に固定化し、標的核酸をそれにハイブリダイズす
る場合の態様では、切断可能リンカーの含有により、プライマーＤＮＡを５'末 端で固定化する。そのため遊離３'-ＯＨは、遊離ＤＮＡ鎖に標的ＤＮＡ“ハイブ
リダイズ”し、転写を開始させるのに有用となる。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８０】 化学的に切断可能リンカー 様々な化学的切断可能リンカーを用い、固定化核酸と固体支持体との間に切断
可能な結合を導入する。酸に不安定なリンカーには、マススペクトロメトリー、
特にＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ用の化学的に切断可能リンカーが今のところ好まし
い。酸に不安定な結合が、３-ＨＰＡマトリクス溶液の添加による核酸のコンデ ィショニングの間に切断されるためである。酸に不安定な結合は、別のリンカー
基、例えば酸に不安定なトリチル基として導入されるか、または１またはそれ以
上のシリルインターヌクレオシドブリッジを、ジイソプロピルシリル誘導ヌクレ
オチドを用い導入することにより合成核酸リンカー中に組み入れられ、ジイソプ
ロピルシリル-連結オリゴヌクレオチド類似体を形成する。ジイソプロピルシリ ルブリッジが、ＤＮＡバックボーン中のホスホジエステル結合に、１．５％トリ
フルオロ酢酸(ＴＦＡ)または３-ＨＰＡ／１％ＴＦＡ ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦマトリ クス溶液のような穏やかな酸性条件下で置換されると、ＤＮＡ分子中に１または
それ以上の鎖内部ブレイクが導入される。ジイソプロピルシリル連結オリゴヌク
レオチド前駆体および類似体を調製する方法は当業者に既知である(例えば、Sah
a et al., (1993) J. Org. Chem. 58:7827-7831)。これらオリゴヌクレオチド類
似体は、ジイソプロピルシリル誘導デオキシリボヌクレオシドを用いる固体状態
オリゴヌクレオチド合成方法を用い容易に調製される。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８３】 Ｂ．他の修飾ＲＮＡ類似体 本明細書中に記載する方法の実施において、一群のネストした塩基特異的チェ
ーンターミネイテッドＲＮＡ転写物は、修飾塩基特異的チェーンターミネイティ
ングリボヌクレオチド類似体の組込みによる転写の間に生ずる(または修飾マキ サム-ギルバートストラテジーにおけるＲＮａｓｅにより特異的に切断される)。
ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子への組込みにおいて転写伸張の配列特異的
停止を生ずる任意のリボヌクレオシド三リン酸類似体は、本明細書中の方法に使
用し得る。現在、好ましいリボヌクレオチド類似体は３'-デオキシリボヌクレオ
チドであり、転写の塩基特異的に終結に使用する(例えば、Axelrod et al., (19
85) Biochemistry 24:5716-5723;Tyagarajan et al., (1985) Biochemistry 30:
10920-10924)。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８５】 加えて、修飾リボヌクレオチド類似体を転写混合物に加え、転写終結および／
または転写産物放出の効率を増加し、酵素のターンオーバーの速度を促進し得る
。例えば、４-チオＵＴＰ、５-ブロモＵＴＰ、５-ヨードＣＴＰの添加は、少な くとも幾つかのＲＮＡポリメラーゼにより、転写終結および転写物放出を促進す
る核酸の水素結合を変化する。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８８】 ＤＮＡアレイの調製 好ましい態様では、標的核酸とのハイブリダイゼーション前または後の核酸プ
ロモーター含有プローブを、アレイ形の固体支持体の表面に固定化する。これら
ＤＮＡアレイ形成に特に適当な方法は、本明細書中で記載したものおよび米国特
許出願番号０８／７４６，０５３、０８／７８７，６３９および０８／７８６，
９８８に記載されたものである。これらそれぞれの仮米国特許出願の対象物を引
用により本明細書にすべて加え、以下のような要約する。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８９】 図１は、診断ツールによる分析用サンプル物質のアレイを調製する１つのシス
テムを示している。図１は、データプロセッサ１２、動作コントローラー１４、
ロボットアームアセンブリ１６、モニターエレメント１８Ａ、中央処理装置１８
Ｂ、ソース素材２０のマイクロタイタープレート、ステージハウジング２２、ロ
ボットアーム２４、ステージ２６、圧力コントローラー２８、コンジット３０、
マウンティングアセンブリ３２、ピンアセンブリ３８および基体エレメント３４
を含むシステム１０を示す。図１でみられる図では、ロボットアセンブリ１６は
可動性マウントエレメント４０および水平スライドグローブ４２を含み得るとも
説明される。ロボットアーム２４はピン３６を中心として回転し得、アーム２４
の可動範囲を広げ、そのため、アーム２４によりソースプレート２０上にピンア
センブリ３８が配置され得る。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９３】 図示したロボットアセンブリ１６は、電気工学の分野に既知の原理から導かれ
、図示した基体３４およびソースプレート２０のような基体およびソースプレー
ト上の位置へピンアセンブリを移動させるのに適当なロボットアセンブリの一例
である。したがって、他のロボットシステムを、本明細書の記載に従い、当該分
野から出発することなく、実施し得る。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９５】 図２は、ピンアセンブリ５０の一態様を示し、圧力コントローラー２８を含む
図１に示すシステムの実施に適当である。図示した態様では、ピンアセンブリ５
０には、上側部分５２および下側部分５４から形成され、スクリュー５６Ａおよ
び５６Ｂにより合わされ一緒になり、内部チャンバー容積５８が決定されるハウ
ジングを含む。更に、内部チャンバー容積５８を流体工学的にシールするため、
ハウジングには、図２に示すシールエレメントが、上側ブロック５２および下側
ブロック５４の間に位置し内部チャンバー容積５８の周囲を完全に取巻くＯ-リ ングガスケット６０として含まれ得ることを図２は示す。さらに図２では、ピン
アセンブリ５０は多数のベシクル６２Ａ-６２Ｄを含み、それぞれ、軸穴(axial
bore)を含み、そこを通して伸びており、図示するホールディングチャンバー６ ４Ａ-６４Ｄを形成する。それぞれ図示したベシクルは、それぞれ、孔６８Ａ-６
８Ｄを通して伸びており、ハウジングの下側５４内に配列している。
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９８】 上記し、図２に図示したピンアセンブリ５０を、基体９０の上側表面にエッチ
ングされた多数のウェル９２を含む基体エレメント９０上に配置する。図２によ
り例示されるように、ベシクル６２Ａ-６２Ｄのピッチとは次の通りである。各 ベシクルは、隣りのベシクルとある程度の距離があり、その距離は、基体９０の
上側表面にエッチングされたウェル９２間のピッチ距離の整数倍である。以下の
記載からわかるように、この間隔は液体の平行分配を促進し、液体を多数のウェ
ルに一度の操作で分配し得る。各ベシクルは、ステンレススチール、シリカ、ポ
リマー物質または液体サンプルの保持に適当な任意の他の物質から作成され得る
。ある実施例では、１６ベシクルをあわせて用いる。それらは、硬化したベリリ
ウム銅、金メッキしたニッケルプレートを用い作成する。それらは４３．２ｍｍ
の長さであり、ベシクルのシャフトは外径０．４６ｍｍに徐々に変化し、凹状チ
ップとなる。そのピンは、指向精度が約５０１マイクロメーターとなり得るよう
に、選択した。任意の適当なピン形を装置に使用し得、平坦、星形、凹状、尖頭
固体(pointed solid)、尖頭半中空(pointed semi-hollow)、一端または両端の角
(angled on one or both side)、他の幾何学構造を含むがこれらに限らない。
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１００】 図４は、図２に示すピンアセンブリ５０による使用に適当な１つの下側ブロッ
ク５４の通常構造および大きさの上からの透視図を示す。図４に示したように、
下側ブロック５４は、穴６８の４×４のマトリクスを含み、各ベシクルを受ける
のに適当な１６の孔を提供する。上記引用の図２に記載したように、孔６８間の
距離は、典型的に、基体表面上のウェル間の距離およびソースプレートのウェル
間の距離の整数倍である。したがって、図４に示すような下側ブロック５４を有
するピンアセンブリは、液体を１６ウェルまで同時に分配し得る。図４はまた、
通常の大きさの１つの下側ブロック５４を示す。ブロック５４の各サイドは通常
２２ｍｍの長さであり、孔６８間のピッチは約４．５ｍｍとなる。そのピッチは
基体の使用に適当であり、その場合、図２の基体９０により例示するように液体
を約５００μｍ離した位置に分配する。図４はまた、下側ブロック５４が、図２
に示すシールエレメント６０のようなＯ-リングシールエレメントを受けるのに 適当なＯ-リンググローブ９４を所望により含むことを示す。そのグローブエレ メント９４はシールエレメント６０により形成される液体シールを促進し、改善
し得ると理解される。
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０１】 ピンブロックはステンレススチールで製造され得る。ドリルでこの物質に正確
に約＋２５μｍの孔を開けるためである。しかし、様々なプローブ物質もまた使
用し得、例えば、Ｇ１０ラミネート、ＰＭＭＡまたは他の適当な物質である。そ
のピンブロックは任意の数の孔を有し得、適所に１６ピン有する１６のレセプタ
クルが見られる。各ピンの指向精度を高めるため、所望による配列位置はブロッ
クの下にである。約６ｍｍのピンチップを、マイクロタイタープレートのウェル
に浸すことができるようにさらしたままとするためである。図示したツールにお
けるプローブのレイアウトを設計し、３８４ウェルマイクロタイタープレートに
調整し、そのため、プローブの中心と中心の間隔は４．５ｍｍとなる。４×４プ
ローブのアレイを選択した。１平方インチ未満でフィットするようにアレイを作
成するためであり、それは譲受人が使用するＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳのｘｙステ
ージの範囲で動く。ピンツールアセンブリを、装置の上側を覆うステンレススチ
ールで仕上げ、次いで、ロボットのＺ-アーム上に取りつける。
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０２】 図１および２に関し、ロボットアセンブリ１６は、図２に示すピンツールアセ
ンブリ５０と同様に形成したピンツールアセンブリ３８を用いる。圧力コントロ
ーラー２８はチャンバー５８内の圧力を選択的に制御する。この態様では、制御
プログラムはデータプロセッサ１２上で操作され、アセンブリ１６が基体３４上
のエレメントのアレイを提示する方法でロボットアセンブリ１６を制御する。最
初の工程では(図２および５も参照)、プログラムによりロボットアセンブリ１６
は命令され、ピンアセンブリ３８を動かし、上記ソースプレート２０上に配置す
る。次いで、ロボットアセンブリ１６により、ピンアセンブリがソースプレート
２０に浸され、そのプレートは３８４ウェルＤＮＡソースプレートであり得る。
図４に示すように、ピンアセンブリは１６のピンを含み得、ピンアセンブリ５０
により、１６ピンが３８４ウェルＤＮＡソースプレート２０の１６のウェルに浸
される。次に、データプロセッサ１２により、動作コントローラー１４は命令さ
れ、ロボットアセンブリ１６を操作し、基体３４の表面上の位置にピンアセンブ
リを移動する。基体３４は、物質のサンプルを受けるのに適当な任意の基体であ
り得、シリコン、プラスチック物質、または任意の他の適当な物質から形成され
得る。所望により、基体は平坦表面を有するが、他に、ピット表面、ウェルでエ
ッチングされた表面または任意の他の適当な表面トポグラフィーを含み、そして
、更に各ウェルの表面にビーズを含む。次いで、データプロセッサ１２で操作さ
れるプログラムにより、ロボットアセンブリは命令され、動作コントローラー１
４を通して、圧力コントローラー２８は命令され、内部チャンバー容積５８内に
陽圧を生ずる。この実施では、正の内部圧力により、ベシクル６２のホールディ
ングチャンバーからの液体に力が加えられ、ベシクルからの液体を噴射し、基体
９０のそれぞれのウェル９２に噴射する。
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１３】 ジェットアセンブリ１１０のキャピラリー１１２は、ガラスキャピラリー、プ
ラスチックキャピラリー、または任意の他の適当なハウジングであり得、そのハ
ウジングは、液体サンプルを保有し得、液体サンプルを、変換器エレメント１１
４のような変換器エレメントにより噴射し得るものである。図６Ａに示す変換器
エレメント１１４は圧電変換器エレメントであり、キャピラリー１１２のパラメ
ーター周辺に形成され、ロボットアセンブリ１６内のパルスジェネレイターから
受ける電気パルスを変換し得、液体をキャピラリー１１２のオリフィス１１８か
ら噴射する。圧電変換器エレメントを有するそういったジェットアセンブリは、
ドイツのＭｉｃｒｏＦａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．により製造されて いる。しかし、決められた、制御された液体体積の分配に適当な任意のジェット
アセンブリを、本明細書中で使用し得、それらには圧電変換器、電気的変換器、
電子制限的変換器(electrorestrictive transducer)、磁性制限的変換器(magnet
orestrictive transducer)、電気機械変換器(electromechanical transducer)、
または任意の他の適当な変換器エレメントを使用するものも含む。図示した態様
では、キャピラリー１１２は液体物質を受けるための液体コンジット１２２を有
する。所望の態様では、液体をキャピラリー中に、真空圧の作用により引き入れ
ることができ、それはオリフィス１１８を液体物質のソース中に沈めると、オリ
フィス１１８を通して液体を引き入れることができる。ジェットアセンブリ１１
０の他の態様は、本発明によって、当該範囲から出発せずとも実施し得る。
【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１４】 図６Ｂは、更に他のアセンブリを例示しており、図１に示すアセンブリ１６の
ようなロボットアセンブリのロボットアームにおいて適当に機能するアセンブリ
である。図６Ｂは１３０Ａ-１３０Ｄを４つ同時につなげたアセンブリを示す。 図２のピンアセンブリと同様に、図６Ｂに示すジェットアセンブリは、液体物質
の平行分配に用いられ得る。各ジェットアセンブリ１３０Ａ-１３０Ｄは他のも のとは独立して操作され得、選択した１つのジェットアセンブリから液体を選択
的に分配し得る。更に、各ジェットアセンブリ１３０Ａ-１３０Ｄは独立して制 御し得、アセンブリ１３０Ａ-１３０Ｄの各１点より分配される液体の体積を選 択し得る。他の修飾および変更が、本発明の範囲から出発せずとも図６Ｂに示す
アセンブリに行い得る。
【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１９】 基体の表面上にサンプルアレイを置いた後、アレイを任意の様々の手段を用い
分析し得る(例えば、ＵＶ／ＶＩＳ、ＩＲ、蛍光、化学ルミネセンスのような分 光技術、ＮＭＲ分光法または質量分析法)。例えば、各分配プロセスの後、基体 にのせたサンプルをＭＡＬＤＩ-ＴＯＦソースプレート上にのせ、角度をつけた スクリューをマウントしたポリカーボネート支持体の一群と共に保持し得る。あ
る実施では、プレートをプローブの端に移し、飛行時間マススペクトロメーター
のソース領域中において１μｍ分解能、１”トラベルｘｙステージ(Newport)に 保持する。任意の適当な質量分析ツールを用いることができる。
【手続補正５４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１２２】 典型的な態様 ある好ましい態様では、プロモーター配列をコードする二本鎖核酸配列が、天
然源から単離されるか(例えば、細菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物ま たは真核生物)、または合成配列とアセンブルする。コーディング鎖の３'末端の
少なくとも５ヌクレオチドの一本鎖領域が、当業者に既知の標準的な方法に使用
される(例えば、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York参照)。この一本鎖領域は、シーケ ンスされる核酸領域または２つの核酸分子間にあるシーケンス(例えば、制限エ ンドヌクレアーゼ部位)に相補的となるように設計される。
【手続補正５５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１２３】 少なくとも部分的に一本鎖３'末端を含む、シーケンスされる核酸は、本明細 書中に記載する条件、好ましくは、当業者に既知の高緊縮条件により、ハイブリ
ダイズし、そのため、５つの連続的マッチング塩基対がプロモーター含有ＤＮＡ
の相補的配列により形成される。シーケンスされる核酸は、二本鎖であるか、ま
たは好ましくは一本鎖である。２つの核酸分子のハイブリダイゼーションは、隣
接する核酸分子のジャンクションにおけるハイブリッド中に１またはそれ以上の
“ニック”を導入する。コーディングまたは非コーディング鎖、好ましくはコー
ディング鎖中のニックは、転写開始前に適当な核酸リガーゼを添加することによ
り連結される。核酸の連結方法は、当業者に既知であり(例えば、Sambrook et a
l., (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, New York)、ＤＮＡおよびＲＮＡリガーゼは商業的に利用可能である(例えば
、Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。
【手続補正５６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１２４】 転写は、リボヌクレオシド三リン酸の存在中、本明細書および他で記載の条件
下、適当なＲＮＡポリメラーゼの添加によりプロモーターから開始される(例え ば、In RNA Polymerase and the Regulation of Transcription, Rezinkoff et
al., eds, Elsevier, NY)。好ましい実施態様では、転写混合物には、選択した 塩基特異的チェーンターミネイティング３'-デオキシリボヌクレオシド三リン酸
および、また、ＲＮＡ産物の二次構造を少なくするイノシン５'-三リン酸、また
は、４-チオＵＴＰ、５-ブロモＵＴＰまたは５'-ヨードＣＴＰといったＲＮＡポ
リメラーゼ酵素のターンオーバーを促進する修飾リボヌクレオシド三リン酸が含
まれ、それによって、分析に利用可能なＲＮＡ転写産物の量が増加する。
【手続補正５７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１２８】 好ましい核酸は、不溶性支持体の表面と少なくとも１つの硫黄原子を介して共
有結合する。即ち、核酸は、少なくとも１つの硫黄原子を含むリンカー部分を介
してその表面と共有結合する。その共有結合した核酸は、本明細書に記載の方法
により容易に製造される。好ましい態様では、共有結合した核酸は、不溶性支持
体の表面上に、少なくとも密度約２０ｆｍｏｌ／ｍｍ２、更に好ましくは少なく
とも約７５ｆｍｏｌ／ｍｍ２、更に好ましくは少なくとも約ｆｍｏｌ／ｍｍ２、
より更に好ましくは少なくとも約１００ｆｍｏｌ／ｍｍ２、および最も好ましく
は少なくとも約１５０ｆｍｏｌ／ｍｍ２で存在し得る。
【手続補正５８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３０】 シーケンスする方法は診断の応用として使用され、既知標的核酸中に遺伝的変
化の存在を検査する。例えば、標的核酸領域は、ＰＣＲまたは当業者に既知の他
の増幅方法のような、標準的方法を用い増幅し得る(例えば、Sambrook et al.,
(1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York参照)。増幅核酸は変性され、シーケンスされる鎖(非コーディング鎖) は、二本鎖分子として単離されるか、使用され得る。
【手続補正５９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３１】 既知標的核酸中の遺伝的変化の存在は、診断の応用において、生体サンプルの
標的核酸を単離(または増幅)し、プロモーター含有鋳型を生ずるプロモーター含
有捕捉プローブに標的をハイブリダイズすることにより、決定される。ネストし
た一群のＲＮＡ転写産物が生じ、標的核酸の存在が決定され、野生型配列と比較
して遺伝的変化が標的核酸中に生じているかどうか決定する。遺伝的変化の存在
は、当分野に既知の他の手段によりＲＮＡ転写産物から決定され得る(例えば、 米国特許番号５，６０５，７９８および国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２００１
９)。
【手続補正６０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３２】 転写ターミネーター配列を同定する方法 これまで知られていない転写ターミネーターおよびアテニュエーター配列を同
定する方法もまた提供する。転写ターミネーター配列は、ＲＮＡ伸張の配列特異
的停止に応答し、種々の生物由来のターミネーター配列が報告されている。例え
ば、細菌性ｒｈｏ-独立性ターミネーター配列には２つの逆位反復が数塩基対離 れてあり、その後に５-１０ｎｔのポリＴストレッチがある。これら配列を介す る転写において、生じたｍＲＮＡ転写物により、ＲＮＡヘパリンステム-ループ 二次構造が、ＲＮＡポリメラーゼ分子後に形成され、ＲＮＡポリメラーゼのポー
ジング(pausign)を増加し、および／またはＲＮＡポリメラーゼ-ＤＮＡ鋳型相互
作用を不安定化し、ＤＮＡポリＴストレッチ内の転写産物が停止する(例えば、W
ilson and von Hippel 19;Reynolds et al., (1992a) J. Mol. Biol. 224:53-63
; Reynolds et al., (1992b) J. Mol. Biol. 224:31-51; Telesnitsky et al.,(
1989) Biochemistry 28:5210-5218; d' Aubenton Carafa et al., (1990) J. Mo
l. Biol. 216: 835-858参照)。
【手続補正６１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３４】 本明細書に記載の標準的転写条件を修飾することにより、転写ターミネーター
、例えば、ｒｈｏ-依存性およびｒｈｏ-独立性ターミネーターが、質量分析法を
用いて同定され得る。その方法の実施では、シーケンスされる一本鎖領域の３' 末端核酸を、プロモーター含有核酸プローブのコーディング鎖の３'末端の相補 的配列にハイブリダイズさせる。好ましい態様では、プロモーター含有核酸を、
５'末端の非コーディング鎖または３'末端のコーディング鎖を介して、固体支持
体に共有結合し、更に好ましくは高密度でアミノシラン処理固体支持体に５'-ま
たは３'-チオール酸化ＤＮＡ連結する。連結は、リンカー基の存在下または非存
在下にあり、好ましくはアレイ形に並べられる。
【手続補正６２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３６】 ある態様では、シーケンスされる核酸のハイブリダイズから生ずる１またはそ
れ以上の鎖中のニックが、転写開始前に適当な核酸リガーゼを添加することによ
り連結される(即ち、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを加える)。
【手続補正６３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３７】 本発明を以下の実施例により更に説明する。その部分は単に詳しく説明するこ
とを目的とし、これらに制限するとして構成されるものではない。本出願を通し
て引用したすべての参考文献(参考文献、発行された特許、公開された特許出願 、および仮出願特許出願を含む)の内容全体を引用により特別にこの文書に加え る。
【手続補正６４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１４５】 共有結合的に固定化したプローブの密度を測定するために、選択のジスルフィ
ド含有オリゴデオキシヌクレオチドを、上記で放射標識したのと同じ種の痕跡量
に加えた。ジスルフィドを切断し、プローブをヨードアセトアミド機能化ウェハ
ーに固定化し、ウェハーを洗浄し、次いで、ホスホイメージャースクリーン(pho
sphorimager screen)(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)に照射した。それぞ
れのオリゴデオキシヌクレオチドを用いる場合、オリゴデオキシヌクレオチドの
モル量が判っている参照スポットをポリスチレン上につくる；これら参照スポッ
トをホスホイメージャースクリーンにウェルとして照射した。スクリーンのスキ
ャンニングにおいて、各チップに結合したオリゴデオキシヌクレオチドの量(モ ル)を、参照の特異活性とカウントを比較することにより測定した。
【手続補正６５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１５３】 平坦表面に強固にパックされたオリゴヌクレオチドの間のステアリン酸阻害に
より、４０％を超えるハイブリダイゼーション効率が阻害されると仮定された。
この点を考慮し、スペーサー分子を、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシ
ョン領域の端と支持体との間に組込んだ。選択されたスペーサーは一連のポリｄ
Ｔ配列であり、長さ３から２５の範囲であった。放射標識およびホスホイメージ
ャーを伴うこれらサンプルの調査において、達成し得る最大ハイブリダイゼーシ
ョンはそれでも４０％あった。
【手続補正６６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１５４】 ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ分析 ウェハーはプローブで機能化され、相補的配列をハイブリダイズし、そのサン
プルを、上記の標準的ＭＡＬＤＩ条件下分析した。分析により示されたのは、ア
ニール鎖(ＭＪＭ６)のみが、実験的な電荷に対する質量比６４１５．４の質量ス
ペクトルが観察され、理論的な電荷に対する質量比は６４１５である(図９)。電
荷に対する質量の比が６４５５であるシグナルがみられなかったため、ウェハー
結合鎖(ＴＣＵＣ)は脱着できず、そのため、レーザーに耐え未処理のままとなる
に充分な程度に、ヨードアセトアミド連結が安定となることが確認された。更な
るシグナルにより電荷に対する質量の比が６２６２．０であると観察された。こ
のシグナルはグアノシンの脱プリン化による結果であり、ＭＡＬＤＩプロセスの
間にプリン塩基がＤＮＡにより減損し得ると知られているためである(Nordhoff,
E., et al., (1992) Rapid Commun. Mass Spectrom. 6:771-776)。ウェハー上 のサンプル結晶は均一に分布せず、そのため、良好なスポットを捜す必要があっ
た。この非均一性が原因で、質量の分解能は変化するが、脱着したオリゴヌクレ
オチドでは質量スペクトルは通常、２００-３００の範囲であった。ある一群の 実験では、非相補的配列はウェハーとハイブリダイズした；上記のように洗浄後
のＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳの分析によると、非特異的アニーリングは最小となっ
た。シグナルが検出されなかったためである。
【手続補正６７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１５５】 実施例２ 連続および平行分配ツールを用いるＤＮＡアレイの調製 ロボットが操縦する連続および平行ｐＬ-ｎＬ分配ツールを用いると、マトリ クスアシストレーザー脱着イオン化質量分析用の平坦な表面または幾何学的に変
化した(例えば、ウェルを有する)表面を有する１"平方未満のチップにおいて１ ０-１０３のエレメントＤＮＡを生じた。最初に、'圧電ピペット(piezoelectric
pipette)'(70μm id キャピラリー)により、マトリクスの０．２ｎＬ以下の小 滴を単一および多数分配し、次いで、測定対象物をチップに分配した；０．２ｆ
ｍｏｌぐらいの低濃度の３６-ｍｅｒ ＤＮＡからのスペクトルがこのプロセスに
必要であった。急速な蒸発(＜５秒)にも拘わらず、測定対象物を含む３-ヒドロ キシピコリン酸マトリクスの微小結晶をルーチンで作成すると、より大きな体積
調製で通常得られる場合よりも高い再現性が得られた；８００μｍウェル中の２
３-ｍｅｒのスポット５ｆｍｏｌ、１００個すべてにおいて質量スペクトルへ容 易に変換され、ノイズに対するシグナルの比が５を超えるイオンシグナルを有し
ていたものが１００のうち９９あった。２番目のアプローチでは、３８４ウェル
マイクロタイタープレートからのプローブを、スプリングロードピンのアレイを
用いチップウェルまたは平坦表面上に、同時に１６に分配し、２０ｎＬ以下をチ
ップに表面接触により移す；平行法で置かれたアレイエレメントのＭＳ分析は、
連続法で得られた感度および分解能に関し、一致する。
【手続補正６８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１５８】 サンプルを、(１)Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ Ｖｉｓｉｏｎ ２０ ００における通常の使用で提供されるときの平坦ステンレススチールサンプル標
的、(２)マイクロマシン化ナノピット(nanopit)を有する同一設計のステンレス スチール標的、(３)平坦シリコン(Ｓｉ)ウェハー、(４)磨きをかけた平坦Ｓｉウ
ェハー、(５)粗い(３-６ｐＬｍ特徴)ピットを有するＳｉウェハー、(６)化学的 にエッチングしたウェルの(ａ)１０×１０(または(ｂ)１６×１６)アレイを有す
る(ａ)１２×１２(または(ｂ)１８×１８)ｍｍ Ｓｉチップ、それぞれ、８００ ×８００μｍであり、サイドは９９-４００(または(ｂ)では１２０)マイクロメ ーター、ピッチ(ａ)は１．０(または(ｂ)では１．１２５)ｍｍである、(７)化学
的にエッチングしたウェルの２８×２８アレイを有する１５×１５ｍｍ Ｓｉチ ップ、それぞれ、サイドは４５０×４５０マイクロメーターであり、４８-３０ ０マイクロメーターの範囲の深さであり、０．５ｍｍのピッチを有する、(８)平
坦なポリカーボネートまたは他のプラスチック、(９)金および他の金属、(１０)
膜、(１１)金または他の伝導性物質でスプッターしたプラスチック表面を含むＭ
ＡＬＤＩ ＴＯＦ分析において標的となる幾つかの表面の連続システムに分配し た。分配体積を、分配する小滴数を調節することにより、１０−１０から１０−
６に調節する。
【手続補正６９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１５９】 サンプル調製および分配 １．連続 種々の配列または濃度のオリゴヌクレオチド(０．１-５０ｎｇ／マイクロタイ
ター)を９６ウェルマイクロタイタープレートにのせた；最初のウェルをマトリ クス溶液として残した。穴をあけたチップ(ＭＡＬＤＩ標的のセクションにおけ る標的６ａ)をステージ上にのせ、手動で並べる。ロボット制御ソフトウェア(ウ
インドウズ)中に、最初のウェルの座標、アレイの大きさ(即ち、ｘおよびｙのス
ポット数)およびエレメント間の距離、およびアレイエレメントあたりの０．２ ｎＬ小滴の数を入れた。キャピラリーを１０μＬ以下のリンスＨ２Ｏで満たし、
連続パルスモードの間のチップの完全性および清浄性を確認するためストロボ光
照射カメラが見える位置に自動的に移動し、空とした。次いで、キャピラリーを
マトリクス溶液で満たし、再び、ストロボスコープで確認し、次いで、平坦の表
面または穴をあけた表面上のアレイへのスポットに使用した。別のＭＳモードに
おける再現性の研究のために、１０×１０アレイに０．２−２０ｎＬの小滴を典
型的に分配した。キャピラリーを陽圧の適用により空とし、所望によりＨ２Ｏで
リンスし、ソースオリゴプレートに移動し、５μＬ以下の０．０５-２．０μＭ 合成オリゴを引き入れた。次いで、キャピラリーを、各マトリクススポット上に
連続してラスターし、０．２-２０ｎＬ水溶液をそれぞれに加えた。
【手続補正７０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１６０】 ２．平行 平行プログラムは、オフセットプリンティングにより作成されるアレイを調節
するように書かれていた；１０ウェハー上に６４エレメントあるアレイを作成す
るために、例えば、ツールを３８４ウェルＤＮＡソースプレートの１６ウェルに
浸し、標的(例えば、Ｓｉ、プラスチック、金属)に移動し、サンプルを表面接触
によりスポットした。次いで、ツールを同じ１６ウェルに浸し、２番目の標的に
スポットし、このサイクルを１０のウェハーすべてにおいて繰り返した。次に、
ツールを洗浄溶液に浸し、次いで、１６種のソースプレートのウェルに浸し、そ
して最初の一群の１６スポットから標的２．２５ｍｍオフセット上にスポットし
た；再び、これを１０のウェハーすべてにおいて繰り返した；すべてのサイクル
を繰り返し、各ピンから２×２アレイを作成し、８×８アレイのスポットを作成
した(２×２エレメント／ピン×１６ピン＝スポットしたエレメントは合計６４)
。
【手続補正７１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１６５】 質量スペクトルは、シリコンチップのウェルに微小分配したＤＮＡ分子からも
得られた。図１０は、化学的にエッジングした１００のウェルを有する１２×１
２ｍｍシリコンチップを示す；マスクの大きさおよびエッジング時間をセットす
ると円錐台(fustum)(即ち、インバーテッドフラットトップピラミッド(inverted
flat top pyramidal))幾何学ウェルは８００×８００μｍ(上表面)および１０ ０μｍの深さとなった。所望により、ウェルを粗くし、穴をあけ得る。上記の通
り、チップの端をステージの一段高い表面に並べ、キャピラリーに関しｘおよび
ｙ座標システムを決めた(他には、光学的配置、人工知能パターン認識ルーチン 、手動配置に基づくドエル-ピンを含む。)。各ウェルに、測定対象物を含まない
２０小滴(〜５ｎＬ)の３-ＨＰＡマトリクス溶液を分配した；５０％ＣＨ３ＣＮ 溶液を用いる場合、各小滴の蒸発時間は５-１０秒のオーダーであった。溶媒蒸 発において、１２０×ステレオミクロスコープで観察する各微小分配マトリクス
小滴は、非晶および乳状平坦ディスクとしてみられた；その様子は小滴からなり
、図３ｂスペクトルが得られた。チップを空とすること、洗浄すること、２３- ｍｅｒＤＮＡ(Ｍｒ(計算値)＝６９６７Ｄａ)の１．４μＭ水溶液で再度満たすこ
とにおいて、キャピラリーを１００スポットのマトリクス上に向け、５ｎＬのＤ
ＮＡ水溶液をマトリクス水滴の上部に直接分配した。ＣＣＤカメラを用いる視覚
化を使用すると、マトリクスと水性測定対象物溶液が混合し、マトリクスが再溶
解することがわかった(室温および湿度で１０秒以内で完全に蒸発する)。非晶マ
トリクス表面を変換し、１μｍ未満のオーダーの結晶特性を有する真性微小結晶
表面に変換した。
【手続補正７２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８４】 １．鋳型およびプライマー配列の設計 プライマーすべてを、商業的に利用できるＤＮＡシンセサイザーで、通常のホ
スホロアミデイト化学(Sinha et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:4539)を 用い合成した。インビトロのＲＮＡ転写を合成５５ヌクレオチド二本鎖ＤＮＡ鋳
型で行った。鋳型を、３つのプライマー配列；５５ヌクレオチド非コーディング
鎖(配列番号１０)およびコーディング鎖(配列番号１１および１２)を形成する２
つの更なるプライマーを用いアセンブルした。図１７に示すように、コーディン
グ鎖中のニックの特定位置は各コーディング鎖プライマーの長さにより決まる。
転写のためのこの構成の使用により、この位置でのニックが実質的に転写を減衰
しないことを示す。
【手続補正７３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８５】 ２．プライマーハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ転写 一本鎖ニック鋳型は、３つの一本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシ
ョンにより作成され、その全ＤＮＡ濃度は、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中１０μＭ(鋳
型よりもプライマーは２倍多い)であり、７０℃で１０分間反応混合物を加熱し 、少なくとも４時間かけて室温に冷却することにより作成する。ニックの位置は
、２つのコーディング鎖(５'-３')ＤＮＡオリゴヌクレオチドの相当する長さに より決定される。
【手続補正７４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８６】 ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ転写 ニックＤＮＡ鋳型のインビトロの転写を、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７ ．０)、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ スペルミジン、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍ
Ｍ ジチオスレイトール、１unit/μl ＲＮａｓｉｎ(Promega)、５ｍＭ ｒＮＴＰ
、５μＣｉ[α-３２Ｐ]ｒＣＴＰ、１unit/μl ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ(Amer
sham, Arlington Heights, IL)の反応２０μｌ中で、３７℃で３０分間行った。
不完全および全長のＲＮＡ転写産物を、ゲル電気泳動により分離し、ポリアクリ
ルアミドゲルを乾燥し個々のＲＮＡ断片の放射活性を測定することにより、そし
てPhosphoImager(Molecular Dynamics, Inc.)を用い既知標準と放射活性を比べ 測定することにより、定量した。ニックＤＮＡ鋳型の全長ＲＮＡ転写の効率を、
ニックを含まないＤＮＡ鋳型から転写した全長ＲＮＡのモルのパーセントとして
算出した。ニックＤＮＡ鋳型の通過効率によりニックを、全長のＲＮＡ転写産物
のモルおよびニックでストールしたＲＮＡ転写産物のモルのパーセントとして算
出した。
【手続補正７５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８９】 ２．ＤＮＡシーケンシング 標的ＤＮＡ鋳型のＤＮＡシーケンシングを、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ ７．９)、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ 中性化スペルミジン、５ｍＭ ジチオスレ
イトール、３００ｎＭ ｒＣＴＰ、３００ｎＭ ｒＡＴＰ、３００ｎＭ ｒＵＴＰ 、３００ｎＭ ｒＩＴＰ、６００ｎＭ ｒＧＭＰ、１０μＣｉ(α-３２Ｐ)ｒＣＴ ＰまたはＵＴＰ、１０-３００、通常１０-５０μＭ ３'-デオキシヌクレオチド 、０．５-１．０ｐｍｏｌ 直鎖状またはスーパーコイルのＤＮＡ鋳型、４ユニッ
トのＲＮａｓｉｎ(Promega)、１０unit/μl Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ(ＵＳＢ)の
反応１０μｌ中で、３７℃３０分間行った。ＲＮＡ転写産物のチェーンターミネ
ーション断片を、８％または１３％ポリアクリルアミドゲルを用いるゲル電気泳
動により分離した。
【手続補正７６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１９０】 １８０-２００塩基までのＲＮＡ終結断片のＤＮＡシーケンシングラダーを生 成した。この例により示されるのは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、塩基特異的チ
ェーンターミネーターとして修飾３'-デオキシリボヌクレオシドを特異的に組込
み得、核酸をシーケンスするためのネストしたＲＮＡ転写物を生成し得る。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１１月１４日（２００１．１１．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 メアリーアン・ジェイ・オドネル アメリカ合衆国02110マサチューセッツ州 ボストン、インディア・ロー65番、アパー トメント・サーティエイス・フロアー (72)発明者 チャンウォン・カン 大韓民国305−390タエジョン、ユソング、 ジョンミンドン464−１番、エクスポ・ア パートメント305−401 (72)発明者 ヨンスー・クオン 大韓民国500−500クワンジュ・プクグ、マ ンウォルドン25−２番 (72)発明者 ヨンテー・キム 大韓民国138−172ソウル、ソンパグ、ソン パ−２ドン162番、スンウォン・アパート メント２−204 (72)発明者 フーベルト・ケースター アメリカ合衆国92037カリフォルニア州 ラ・ホラ、ビア・マローカ・ドライブ8636 −シー番 (72)発明者 ダニエル・ピー・リトル アメリカ合衆国18668ペンシルベニア州パ ットン、グレンデイル・レイク・ロード 393番 (72)発明者 グオビン・シアン アメリカ合衆国92121カリフォルニア州サ ンディエゴ、アンドロメダ・ロード8655番 (72)発明者 デイビッド・エム・ロウ イギリス、ティディ14・55エイ、バーウィ ックシャー、アイマス、ディーンヘッド・ ロード32番 (72)発明者 チャールズ・カンター アメリカ合衆国02215マサチューセッツ州 ボストン、ベイ・ステイト・ロード・ナン バー６、11番 Ｆターム(参考） 4B024 AA19 AA20 CA01 CA11 HA14 HA19 4B063 QA13 QQ42 QR08 QR32 QR35 QR42 QR56 QR84 QS16 QS34 QS36 QS39 QX07

Claims (44)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ)プロモーターおよび操作可能となるようにプロモーター に連結した標的核酸配列を含むＤＮＡ分子であって、固体支持体上に固定化した
    核酸分子を提供すること、 ｂ)プロモーターを含む核酸分子を、標的からのネストした一群のＲＮＡ転写産 物を生ずる条件下、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼで転写すること
    、 ｃ)転写産物の分子量値をマススペクトロメトリーで測定し、そして標的分子の の核酸配列を決定すること、 を含む標的核酸分子の配列を決定する方法。
  2. 【請求項２】 ５'末端のコーディング鎖または３'末端の非コーディング鎖
    を介して、プロモーターを含む核酸分子を固定化する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 核酸がＤＮＡまたはＰＮＡである、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 コーディングおよび非コーディング鎖を有する核酸プロモー
    ター含有プローブによる、標的核酸配列を含む核酸分子へのハイブリダイズであ
    って、当該ハイブリダイゼーションはプロモーター含有プローブの一本鎖領域と
    相補的一本鎖領域との間で、標的を含む分子の一端で生ずるハイブリダイズによ
    り、プロモーターおよび標的を含む核酸分子を調製する、請求項１-３の何れか に記載の方法。
  5. 【請求項５】 標的を含む分子が一本鎖であり、相補的一本鎖領域を含む部
    分が標的を含む分子の３'末端に位置し、 そしてプロモーターを含むプローブ分子が二本鎖であり少なくとも５ヌクレオチ
    ドの一本鎖領域をコーディング鎖の３'末端に有し、当該少なくとも５つの隣接 ヌクレオチドが標的を含む分子の一本鎖部分に相補的である、請求項４に記載の
    方法。
  6. 【請求項６】 標的を含んでいる分子が、プロモーターを含む分子の一本鎖
    部分に相補的である少なくとも５つの隣接ヌクレオチドを一端に含む一本鎖領域
    を除き、二本鎖であること、そして プロモーターを含む分子の一本鎖部分がプロモーターに対し同じ端であり、一本
    鎖領域が、標的を含む分子上にある、 請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】 プロモーターを含む分子を固体支持体上に固定化し、その後
    、標的を含む分子をハイブリダイゼーションさせる、請求項４-６の何れかに記 載の方法。
  8. 【請求項８】 ハイブリダイゼーション後、プロモーターを含む分子を固体
    支持体上に固定化する、請求項４-６の何れかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 生じた分子中のニックを連結した後、ＲＮＡポリメラーゼに
    より転写する、請求項４-８の何れかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 プロモーターおよび標的核酸を含んでいる核酸分子がＲＮ
    Ａポリメラーゼにより転写され、多くの塩基特異的終結ＲＮＡ転写産物を生成さ
    せる、請求項１-９の何れかに記載の方法。
  11. 【請求項１１】 プロモーターおよび標的核酸を含んでいる核酸分子がＲＮ
    Ａポリメラーゼにより転写され、一群のＲＮＡ転写産物を生成させ、次いで、塩
    基特異的リボヌクレアーゼにより特異的に切断し、一群の切断断片を生成させ、
    その分子量の値をマススペクトロメトリーにより測定する、請求項１-９の何れ かに記載の方法。
  12. 【請求項１２】 標的核酸のすべておよび一部の配列を、分子量によるＲＮ
    Ａ転写産物により測定する、請求項１-１１の何れかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 プロモーターまたはプロモーターの相補体を含む一本鎖分
    子を固定化し、その相補体を含む断片をハイブリダイズすることにより、プロモ
    ーターを含んでいる核酸分子を作成し、それによって、生成した分子には、プロ
    モーターおよび少なくとも５ヌクレオチドの一本鎖部分が含まれる二本鎖領域を
    含む、請求項１-１２の何れかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】 プロモーターを、ファージ、真核性および原核性プロモー
    ターからなる群から選択する、請求項１-１３の何れかに記載の方法。
  15. 【請求項１５】 プロモーターを、古細菌、真性細菌、バクテリオファージ
    、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、植物、植物ウイルスおよび動物プロモータ
    ーから選択する、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼまた
    はＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１-１５の何れかに記載の方法 。
  17. 【請求項１７】 ＲＮＡポリメラーゼを、ファージ、真核性および原核性ポ
    リメラーゼからなる群より選択する、請求項1-１６の何れかに記載の方法。
  18. 【請求項１８】 ポリメラーゼを、古細菌、真性細菌、バクテリオファージ
    、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、植物、植物ウイルスおよび動物ポリメラー
    ゼから選択する、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ＲＮＡポリメラーゼを、Escherichia coliＲＮＡポリメラ
    ーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメ
    ラーゼおよびＱβレプリカーゼからなる群より選択する、請求項１-１８の何れ かに記載の方法。
  20. 【請求項２０】 核酸の固定化前に、支持体の表面をアミノシランと反応さ
    せて支持体の表面上に一級アミンを生成させることにより誘導化する、請求項１
    -１９の何れかに記載の方法。
  21. 【請求項２１】 アミノシランが３-アミノプロピルトリエトキシシランで ある、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 支持体の表面上の一級アミンをチオール反応性架橋剤と反
    応させ、チオール反応性固体支持体を形成することを含む、請求項２１に記載の
    方法。
  23. 【請求項２３】 チオール反応性架橋剤がＮ-スクシンイミジル(４-ヨード アセチル)アミノベンゾエート(ＳＩＡＢ)である、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 固体支持体への核酸プローブの固定化が、遊離５'-または
    ３'-チオール基を有する核酸プローブとチオール反応性固体支持体を反応させる
    ことにより、効率的となり、それによって、チオール基とチオール反応性固体支
    持体との間に共有結合が形成される、請求項２２に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 核酸分子を、少なくとも２０ｆｍｏｌ／ｍｍ2の密度で固 体支持体の表面に共有結合により固定化する、請求項１-２１の何れかに記載の 方法。
  26. 【請求項２６】 核酸を、固体支持体の表面にアレイ形で固定化する、請求
    項１-２５の何れかに記載の方法。
  27. 【請求項２７】 固体支持体がシリコンまたはシリコンで被覆されている、
    請求項１-２６の何れかに記載の方法。
  28. 【請求項２８】 表面が、固定化核酸分子を含む多数のウェルを含む、請求
    項１-２７の何れかに記載の方法。
  29. 【請求項２９】 ウェルが粗い内部表面を有する、請求項２８に記載の方法
    。
  30. 【請求項３０】 固体支持体が粗い表面を有する、請求項２８に記載の方法
    。
  31. 【請求項３１】 ウェルの表面に穴をあける、請求項２８に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 転写反応をリボヌクレオシド三リン酸類似体存在下で行い
    、それによって、生じたＲＮＡ転写物が二次構造を少なくするか、またはＲＮＡ
    ポリメラーゼ酵素の終結およびターンオーバーの忠実性が、リボヌクレオシドト
    リホスファターゼから形成されるＲＮＡ転写産物と比べ、増加する、請求項１- ３１の何れかに記載の方法。
  33. 【請求項３３】 転写反応には、イノシン５'-三リン酸(ＩＴＰ)、４-チオ ウリジン５'トリホスフェート(ＵＴＰ)、５-ブロモＵＴＰおよび５'-ヨードＣＴ
    Ｐから選択される１つまたはそれ以上の類似体が含まれる、請求項３２に記載の
    方法。
  34. 【請求項３４】 核酸を、固体支持体にリンカーを介して固定化する、請求
    項１-３３の何れかに記載の方法。
  35. 【請求項３５】 リンカーにより形成される連結が可逆性である、請求項３
    ４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 リンカーにより形成される連結が不可逆性である、請求項
    ３４に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 リンカーにより形成される連結が、光に不安定であり、酸
    に不安定であり、または化学的に切断可能である、請求項３４に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 転写が、１つまたはそれ以上の３'-デオキシリボヌクレオ
    チド存在下、行われる、請求項１-３７の何れかに記載の方法。
  39. 【請求項３９】 核酸の固定化前または後に、マススペクトロメトリー用の
    マトリクス物質を支持体の表面に加えることを更に含む、請求項１-３８の何れ かに記載の方法。
  40. 【請求項４０】 ＲＮＡ転写産物を、マススペクトロメトリーを行う前に、
    条件付けする、請求項１-３９の何れかに記載の方法。
  41. 【請求項４１】 標的配列を含んでいる核酸によるプロモーター含有分子へ
    のハイブリダイゼーションにより、コーディング鎖中にニックが形成され、それ
    はプロモーターから転写の開始から＋６の位置に相当する、請求項１-４の何れ かに記載の方法。
  42. 【請求項４２】 ニックが、＋７、＋８、＋９または＋１９の位置である、
    請求項２４に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 ａ)標的核酸の３'-末端の一本鎖領域に相補的なコーディ ング鎖の３'-末端に少なくとも５ヌクレオチドを含む核酸プロモーター含有プロ
    ーブを固体支持体上に固定化すること、 ｂ)シーケンスする核酸を、固定化核酸プローブにハイブリダイズすること、 ｃ)標的核酸をＲＮＡポリメラーゼ(当該ＲＮＡポリメラーゼはプロモーターを認
    識する)で転写し、多数の塩基特異的終結ＲＮＡ転写産物を生成させること、そ して ｄ)マススペクトロメトリーで各塩基特異的終結ＲＮＡ転写物の分子量の値を測 定すること、 を含む請求項１に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 ａ)標的核酸の３'-末端の一本鎖領域に相補的なコーディ ング鎖の３'-末端に少なくとも５ヌクレオチドを含む核酸プロモーター含有プロ
    ーブを固体支持体上に固定化すること、 ｂ)シーケンスする核酸を、固定化核酸プローブにハイブリダイズすること、 ｃ)標的核酸をＲＮＡポリメラーゼ(当該ＲＮＡポリメラーゼはプロモーターを認
    識する)で転写し、配列-終結ＲＮＡ転写産物を生成させること、そして ｄ)マススペクトロメトリーでＲＮＡ転写物の分子量の値を測定すること、それ によって、ターミネーター配列またはアテニュエーター配列を同定すること、 を含む、転写ターミネーター配列またはアテニュエーター配列を同定する方法。
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