JP2002508181A - トロポニンiおよびトロポニンcを含む一本鎖ポリペプチド - Google Patents
トロポニンiおよびトロポニンcを含む一本鎖ポリペプチドInfo
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Abstract
Description
子配列を含む組換え型として発現される一本鎖ポリペプチドに関する。
命に脅威とならない状況や消化不良のような非心臓性胸痛から、緊急の処置を必
要とする潜在的に致命的な発生を区別するために、遊離された心筋細胞内成分の
血液、血清または血漿中における、感度の高い特異的な検出および定量すること
に臨界的に依存している。初期の心電図変化は充分に特異的でもないし感度が高
くもない、それで医療専門家は、早期の診断に、心臓組織損傷の血清生化学マー
カーを当てにせねばならなくなる。はじめは、血清マーカー、クレアチニンキナ
ーゼ(CK)および、特に、心筋CK−MBアイソフォームが使われた、次いで
、心損傷のより感度の高い早期インディケーターとしてミオグロビンが使われた
。より最近には、心筋トロポニン複合体およびそのサブユニットが、それらの高
い特異性のゆえに心筋損傷のマーカーとして好ましいとされた。これらの試験は
、骨格筋損傷の他のマーカーに加えて、組合せて、診断の高い正確さをもたらし
た。もし救急室で実行されるなら、心筋損傷の早期かつ正確な診断は、心臓発作
の犠牲となる恐れに対し、大きな利点をもたらすことになる。
105およびNo.5,290,678に記載されている。それらおよび他の方
法は救急治療室設備において心筋梗塞を診断するに敏捷さを提供し、そして患者
に医療上の利便を提供している。体液中のトロポニンサブユニットまたは複合体
のレベルを測定する診断テストには、測定方法において使用される抗体調製物に
対する抗原として、精製トロポニンサブユニットあるいは複合体が、また測定を
行うために対照およびキャリブレーターとして使用される精製サブユニットある
いは複合体が、しばしば利用されている。測定キャリブレーターは、測定の操作
範囲を横切る標準曲線がつくられるように稀釈系列をつくるのに使われる;測定
対照は、前以て決められた試料の値がその値の周辺の許容範囲内になるように、
測定が行われることを確認するのに使用される。測定が適正に検定できるように
、トロポニン対照とキャリブレーターは安定に保たれねばならないし、抗体によ
って免疫検出される形でなければならない。
タンパク質である。トロポニンは、トロポミオシン上のトロポニン複合体として
局在する、非共有結合複合体の3つのサブユニット、即ち、カルシウム結合性サ
ブユニットであるアイソフォームトロポニンC、阻害性サブユニットであるトロ
ポニンI、およびトロポニンT、として心筋および骨格筋の両者に存在している
。適当な条件下のin vitroにおいて、トロポニンサブユニットは、自然
に会合して、非共有結合複合体、例えば、トロポニンIおよびC、ならびにトロ
ポニンI、CおよびT、を形成する。心筋と骨格筋トロポニンアイソフォームの
間には相異がある。
その敏感な検出は心臓発作の診断の助けとなり得る。トロポニンサブユニットの
心筋と骨格筋アイソフォームの間のアミノ酸配列の相異は、トロポニンサブユニ
ットおよび複合体の心筋アイソフォームを特異的に測定する診断テストにおいて
、利用される。心筋トロポニンIの診断テストが得られる。
試料に存在するプロテアーゼによりタンパク質分解の開裂を受けることになる。
体液マトリックスで調製されるトロポニンI標準品は、立体配座の変化および分
解を受け、そしてキャリブレーターあるいは対照としては不安定である。更に、
本質的により安定なトロポニン複合体は、保存において解離することが知られて
おり、そしてそれゆえにタンパク質分解開裂に感受性となる。トロポニンIの場
合において、その立体配座構造および安定性の保持を助けるために、トロポニン
Cと複合体とならねばらならい;しかしながら、複合体におけるサブユニットの
親和性の性質のゆえに、複合体の型で存在するトロポニンIの分画は濃度依存性
である。このことは、測定キャリブレーターあるいは対照としての利用を限定す
ることになる。サブユニット間の相互作用の程度は解離定数、Kd、から計算で
きる[例えば、Biochemistry 33:12729(1994)に報
告されているように]。計算および実験的測定によって、トロポニンIのほんの
限定された量がトロポニンCに、特に、患者血清試料に結合する見出される範囲
を超えて、結合する、それゆえそのレベルではキャリブレーターおよび最小を使
わねばならない。例えば、殆どのトロポニンI測定の上限である、50ng/m
lにおいて、トロポニンIの、ほんの10%が、2つのサブユニットが1:1の
比率で存在するとき、トロポニンCと結合している。トロポニンIに対しトロポ
ニンCを10倍余計までで、そして2価の陽イオンが存在するとき、冷時に複合
体の安定性について、特許請求の範囲(Larueら、米国特許5,583,2
00では最小、即ち、「少なくとも1日」、である。複合体のより高い濃度を維
持すると、会合の度合いが増加する;しかし、測定を検定するに必要なレベルま
で稀釈した後は、サブユニットは解離し、そして免疫的に不安定になる。それで
、解離はサブユニットにタンパク分解攻撃を受けやすくし、更に、そのようなキ
ャリブレーターおよび対照の有用性を減じることになる。
照に対する、必要性が存在する。
トロポニンCを含んで、記載されている。MalnicおよびReinach(
1994,Eur.J.Biochem.,v.222,pp.49−54)は
、全3つのニワトリ骨格筋トロポニンサブユニットを、1またはそれ以上の発現
プラスミドにクローニングすることによって、in vivoで組換え複合体を
製造している。発現ベクター内で、各トロポニン遺伝子はそれ自体のプロモータ
ーを持っており、そしてタンパク質が個々のトロポニンサブユニットとして細菌
内で発現され、次いで細菌内で複合体を生成する。Fujita−Becker
ら(1993,J.Biochem.,v.114,pp.438−444)は
、E.coli内で発現した組換えサブユニットからウサギ骨格筋トロポニン複
合体の再構成を記載している。これらの組換え産物のいずれもが、診断テスト標
準品またはキャリブレーターとして使用される適当な安定性を有することは記載
されていない。上にあげたように、トロポニンサブユニットの複合体でさえ安定
でなく、どのような程度にでも溶液中で、結合して残留することはないのである
。
され、単一のポリペプチドとして細菌発現系で発現する、一本鎖ポリペプチドと
してのトロポニンIおよびトロポニンCを含む、測定およびその他の用途用の安
定なトロポニン調製物を提供するにある。本発明は、カルボジイミド架橋および
光架橋化学のような方法、例えばJhaら(1996,Biochemistr
y,vol.35,pp.11026−11035)、Kobayashiら(
1996,Biochem.Biophys.Acta,vol.1294,p
p.25−30)およびKobayashiら(1995,Biochemis
try,vol.34,pp.10946−10952)により記載されたよう
な方法を使って生化学研究用の化学的に架橋されたトロポニンサブユニットおよ
びそれらの断片とは、異なっている。これらの文献において、異なったトロポニ
ンタンパク質の特定の断片は、トロポニン複合体におけるサブユニットの立体配
座およびそれらの天然の相互作用をしらべるために、化学的に架橋されたもので
ある。
ブレーターとして使用される、安定性要件および精製が容易な調製物に合致する
ようなトロポニン物質に対する要望がある。普遍的に受け入れられる、トロポニ
ンについての対照またはキャリブレーターはないので、研究室あるいは装置間の
測定を標準化することは不可能であり、その対照およびキャリブレーターに沿っ
た各々特定のトロポニン測定として、その研究室および測定成分の選択に独特の
結果を生じることになる。それゆえ、全ての研究室および医師によって認められ
る、正常および異常の範囲を提供することは、今や、不可能である。これらに、
全ての入手し得る市販の測定装置で使用することができる、普遍的なキャリブレ
ーターおよび対照に対する必要性が存在する。
は安定であり、前記した目的について有用性を有することが、今や見出された。
更に、製品は当業者によって容易に製造されねばならない。この製造の容易さは
、本発明の製品の再現性を最大化するものである。
プチドを提供するにある。同一ポリペプチド鎖にトロポニンIおよびトロポニン
Cが存在することは、産物に対する立体配座安定性および免疫的安定性を付与す
る。一本鎖ポリペプチドは、好ましくは、トロポニンIおよびトロポニンCの配
座の間に挟まれた、リンカー配列を包含する。リンカーペプチドの配列は、製品
の三次元構造を阻害しないで、それゆえ、前記した有用性を有するように選択さ
れる。トロポニンIおよびトロポニンCがつながって、所望によりリンカーペプ
チドを通してつながった、一本鎖ポリペプチドは、トロポニン測定の開発のため
の、安定で、再現性のある、そして容易に精製し得る物質、トロポニン抗体を調
製するための抗原、ならびに、トロポニン測定のための対照およびキャリブレー
ターとして使用される物質、を提供する。
ラスミドのような複製し得るクローニングまたは発現ベヒクルを構築し、E.c
oliのような宿主細胞をベヒクルまたはプラスミドで形質転換し、そして宿主
細胞によってポリペプチドを発現することによる、組換え技術によって最も容易
に調整される。一本鎖構造は、好ましくは、組換え手段によって導入された配列
のような、トロポニンIとトロポニンCアミノ酸配列の間にリンカーペプチド配
列を含有する。宿主細胞でのポリペプチドの発現を改良するために、ポリペプチ
ドのアミノ酸配列の結果において変更を加えまたは加えないで、トロポニン分子
の遺伝子配列にある種の修飾がなされてもよい。これらの変化は、前記した目的
における使用のための、一本鎖ポリペプチドの有用性を変更しない。
本鎖ポリペプチドの遺伝子配列を提供するにある。遺伝子配列は、トロポニンI
とトロポニンCの遺伝子配列の間に挟まれたリンカー遺伝子配列を含むこともで
きる。宿主細胞は、前記した遺伝子配列を含有する複製し得るクローニングまた
は発現ベヒクルで形質転換され得る。上記したように、トロポニンの遺伝子配列
のいくつかの変化は宿主細胞における発現を促進するために行うこともできる。
む一本鎖ポリペプチドに対する遺伝子配列をもったクローニングまたは発現ベヒ
クルまたはプラスミドを含有し、そしてトロポニンIおよびトロポニンCを含む
一本鎖ポリペプチドを発現することができる、宿主細胞を提供するにある。
することによって、よりよく理解できるであろう。
り場合の早期かつ特異的インディケーターであることが証明されている。それで
、血液中のトロポニンおよびそのサブユニットを迅速にそして正確に検出する方
法は緊急の状態において心臓発作を診断するために開発されてきたし、されつつ
もあり、その結果として、数え切れない生命が救われたし、救われることになる
であろう。しかしながら、正確な信頼できる診断測定を開発し、測定対照および
キャリブレーターを使用したこれらの測定の有効性を保証するために、ヒト心筋
トロポニンおよびキャリブレーターの高品質が、対照および試験目的、ならびに
測定のために上昇する抗体に対するトロポニン抗原、が臨界となる。更に、トロ
ポニンを測定する商品は開発されてはいるが、また開発されつつあるが、これら
の測定は、同じ試料でも異なった結果を与える。トロポニンの普遍的な標準品が
ないというのと組合せにおいて、トロポニン用の種々の測定器および測定方法は
、トロポニンレベルの広範に受け入れられる正常および異常範囲の開発を阻害し
てきた、かくして心筋マーカーを含む研究室の結果の解釈を不明確にし、研究室
間の臨床研究を阻害してきたのである。これらの欠点は、普遍的なトロポニン対
照およびキャリブレーターが得られれば解消できるであろう。普遍的な対照およ
びキャリブレーターは、全ての得られる測定により検出可能となり、全てのトロ
ポニン測定によって読み出されたものを標準化するのに使用できる。
遊離トロポニンIの固有の立体配座の不安定さおよびタンパク分解に敏感である
こと、およびトロポニンI−トロポニンC複合体に伴う不安定さを改良する。改
良は、ヒト心筋トロポニンIおよび心筋トロポニンCを含む一本鎖ポリペプチド
からなる。トロポニンサブユニットは、ペプチド結合を通じて共有結合し、同じ
直線ポリペプチドにある。このポリペプチドは工業の要求に合うように安定なト
ロポニンI−トロポニンC複合体を提供する。一本鎖ポリペプチドは、組換え技
術によって調製され、好ましくは、トロポニンIとトロポニンCの間に挟まれた
リンカーポリペプチド配列を包含する。このリンカー配列の長さおよび配列は、
生成物の免疫検出およびその他の前記した有用性を妨害しない、ことにのみ限定
されている。
ロポニンI配列のC末端がトロポニンC配列のN末端をペプチド結合で結ばれた
、ポリペプチドのN末端にトロポニンI配列があるものを含む。リンカーペプチ
ド配列がトロポニンIとトロポニンCの間に挟まれた、第二の好ましい実施態様
においては、一つの好ましい配置は、ポリペプチドのN末端部にトロポニンI配
列があって、そのC末端がリンカーペプチドのN末端とペプチド結合で結ばれて
おり、そしてリンカーペプチドのC末端がトロポニンC配列のN末端とペプチド
結合でつながれている、ことを含む。この構造の一例は、SEQ ID NO:
4に描かれたアミノ酸配列である。この例では、リンカーのアミノ酸配列は、S
EQ ID NO:2に代表される。このものは19アミノ酸を含有している。
チド配列に対応する。第一の例の遺伝子配列は、cDNAの5′末端におけるト
ロポニンI遺伝子配列、その3′末端はトロポニンC遺伝子配列の5′末端に直
ぐに続いている、ことを含んでいる。リンカーがトロポニンIとトロポニンC配
列の間に挟まれた、好ましい実施態様においては、cDNA配列の5′はトロポ
ニンI遺伝子配列で始まり、その3′末端に任意の挟まれたリンカー遺伝子配列
の5′末端が続き、そしてその3′末端にトロポニンC遺伝子配列の5′末端が
続き、cDNAの3′末端で終わる。上記の特別の例では、遺伝子配列はSEQ
ID NO:3に代表されている。リンカーのcDNA配列はSEQ ID
NO:1に示されている。
択は、一本鎖ポリペプチドにおけるトロポニンIとトロポニンCの免疫検出性を
阻害してはならないように限定されるだけである。適当なリンカー配列では、一
本鎖ポリペプチドのトロポニンIおよびトロポニンCセグメントは、非共有結合
トロポニンI−トロポニンC複合体におけると同様な様式で互いに会合し、そし
て一本鎖ポリペプチドにおけるサブユニットの付着は会合の立体配座およびその
結果のトロポニンと矛盾しない免疫検出性が保持される、と信じられる。更に、
このようにして安定化したトロポニンI−トロポニンC複合体は、体液およびそ
の他の成分の存在でタンパク質分解攻撃に感受性でない。この好ましい実施態様
内で、約6から約50アミノ酸(および対応するcDNAのコドンの数)のリン
カーが、調製物の容易さおよび経済性のために、好ましい。
カーセグメントで製造することが好ましい、なぜなら、そのような製品では、産
物の三次構造の阻害が少ないか、あるいは、ない、からである。それゆえ、既に
得られている抗体との反応に対するエピトープの得られやすさに阻害が少ないか
、ないことになる。通常のトロポニンI−トロポニンC複合体において、トロポ
ニンI成分のアミノ末端はトロポニンC成分のカルボキシ末端に非常に接近して
いる。しかしながら、もしそれらがリンカーなしに形成されたら、この接近は妨
害され、得られた三次元構造の歪みは反応ができないようになるエピトープを生
み出す。同様にして、長すぎるリンカーも三次元構造を修飾し、あるいはリンカ
ーそれ自体がエピトープを隠すことになる。
2つのサブユニットが会合するように柔軟なペプチド配列を提供する。リンカー
と遺伝子配列を構築するために、所望の一本鎖ポリペプチドの遺伝子構造を創り
出すのに独特の制限部位を提供するために必要とされる、2コドンが付加的にリ
ンカーの各末端に存在している。一例として、リンカーのN末端にあるSerお
よびC末端にあるAla−Cysが含まれる。かくして、適当な19残基のリン
カーが造られる(遺伝子配列SEQ ID NO:1およびペプチドSEQ I
D NO:2)。
列を調製するのに、および宿主細胞に配列を導入するのに使用され、そして標準
的発現方法が、組換えポリペプチドを発現し精製するのに使用される。これらの
方法は、2つの代謝共役酵母酵素、クエン酸シンターゼおよびリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ、について記載された(Lindbladhら、Biochemist
ry,33:11692−11698[1994]);抗体の抗原結合部位を含
む一本鎖ポリペプチドの調製において(米国特許4,946,778);および
ファージ提示融合タンパク質の調製(米国特許5,516,637)のような、
融合タンパク質の調製に使用されたのと類似の方法である。これらの方法は、当
業者に知られている。
cDNA配列は、例えば、ヒト心筋トロポニンTにおけるまれなコドンが同義主
要コドンで置換される、Huら(1996,「タンパク質の発現と精製」、7:
289−293)によって記載されたように、部分的に重複したプライマーのペ
アを使用するSOEing法のような公知の適当な技術で一致させられる。これ
らの方法も、また、当業者に知られている。
製され、そして発現のため宿主細胞に導入される。組換えタンパク質の発現方法
は公知である。一度発現されると、一本鎖ポリペプチドは標準的タンパク質精製
法により精製される。
いて一本鎖ポリペプチドの発現を改良するために修飾される。これら遺伝子変換
は、ポリペプチドのアミノ酸配列を変更したりしなかったりする。よく知られて
いるように、発現ベヒクルに存在するある種のまれなコドンは、発現効率を減じ
る、そしてこれらコドンを同義の主要なコドンに変更することによって、細菌の
発現が改善される(例えば、1997年5月23日出願の、同時継続出願Ser
.No.08/862,613、および参照することによりここにとり入れられ
ている、トロポニンIについて記載されているように;および、Huら、前記、
の方法、これもまた参照することによりここにとり入れられている)。更に、ト
ロポニンIcDNAの5′末端への短いヌクレオチド配列を含むと(例えば、S
er.No.08/862,613に記載されているように)細菌の発現を増加
し、6つのN末端アミノ酸を付加したトロポニンIポリペプチドを提供する。細
菌の発現を増加するこれら任意の修飾は、前記の目的の一本鎖ポリペプチドの有
用性を減じることはない。
ォーマット、装置、および測定対照およびキャリブレーターを用いて操作する。
例えば、Dade社からのストレイタス(Stratus)(R)トロポニンI
測定は、モノクローナル捕捉体およびモノクロ−ナル検出抗体を利用する。キャ
リブレーター/対照物質はヒト心筋トロポニンIからのN末端ペプチドである。
測定の操作範囲は、0−50ng/ml、感度0.6ng/ml、カットオフ値
1.5ng/ml。Sanofi社からのアクセス(Access)(R)トロ
ポニンI測定は、また、モノクローナル捕捉体およびモノクロ−ナル検出抗体を
利用する、しかし、そのキャリブレーター/対照物質は、天然の心筋トロポニン
IおよびトロポニンCの複合体である。この測定では、測定範囲0−50ng/
ml、感度0.03ng/ml、およびカットオフ値0.1ng/ml。Beh
ring社からのオーピーユーエス(Opus)(R)トロポニンI測定では、
捕捉体および検出体としてポリクローナル抗体を利用し、測定範囲0−300n
g/ml、感度1ng/mlおよびカットオフ値2ng/ml。
ーター/対照は測定間で相互交換性がない。例えば、心筋トロポニンIからのN
末端ペプチドを使用する、Stratus(R)キャリブレーター/対照はAc
cess(R)およびOpus(R)測定では検出できない、と云うのは、後者
の測定の抗体は対照/キャリブレーターに使用されたトロポニンIの同じN末端
ペプチド部分に向けられていないからである。反対に、Access(R)測定
の対照は、これはAccess(R)測定において、3つの測定系のなかで最高
の感度のレベルとカットオフ値を有して検出されるが、Opus(R)測定にお
けるより約4倍高く測定できる。対照的に、Opus(R)測定対照はStra
tus(R)測定によっては貧弱にしか検出されない。これらの結果は、測定間
で測定キャリブレーター/対照に相互交換性は不可能であり、一つの製造会社の
測定の対照によって提供された価は、同じ測定において動く測定を解釈するのに
しか使えない。この貧弱な関係は、更に、図2に示したグラフによって支えられ
る、それは、Access(R)、Stratus(R)およびOpus(R)
測定を使って心臓発作を受けている患者において、一連のトロポニンIレベルを
測定したものを描いている。図示したように、3測定とも全て、1時間目と6時
間目の間のトロポニンIレベルにおいて顕著な上昇と下降を示しているが、各時
間点でのトロポニンIの絶対値は非常に異なっている。これらの広い相異は、上
に詳述したように、測定の個性とそれらのキャリブレーター/対照に帰せられる
。
ポニンIまたはトロポニンCに対し親和性を有する、抗体をふくめたタンパク質
およびその他の物質の生成に使用することができる。例えば、本発明の一本鎖ポ
リペプチドは、不溶性マトリックスまたはポリマーに共有結合させ、クロマトグ
ラフィカラムに位置される。トロポニンに結合する物質を含むと思われる細胞ま
たは組織抽出物、あるいはトロポニンに対してあげられた抗体調製物、をカラム
に通過させ、共有結合したポリペプチドに吸着させる。マトリックスを洗浄後、
吸着した物質は濃塩類溶液、カオトロピック試薬、あるいはタンパク質精製に使
われる他の標準方法、を用いて溶出され得る。
的方法を使用して、モノクローナルまたはポリクローナル抗トロポニン抗体の調
製に使用することができる。
のあるトロポニン測定のための調製物、およびそのような測定の補正に有用であ
る。以下の非限定的実施例からみられるように、一本鎖ポリペプチドは、他のト
ロポニンキャリブレーターに比較するとき優れた性能を示す。
発現 ヒト心筋トロポニンIおよびトロポニンCcDNAsを、公知の心筋トロポニ
ンIcDNA配列(Vallinsら、FEBS Letters,270,5
7−61[1990])およびトロポニンC配列(GenBank AC:X0
7897)からデザインしたプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応(PC
R)によってクローニングした。トロポニンIcDNAのC末端を、各末端に独
特の制限部位を遺伝子工学処理した(Gly4Ser)3をコードする合成リン
カー[それぞれ、SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2の遺伝
子およびペプチド配列]を通じてトロポニンCcDNAのN末端に連結した。一
本鎖トロポニンI−CcDNA構造体は、DNAシーケンシングによって確認し
、発現ベクターpET21(Novagen)にクローニングされた。Nova
genから得たE.coliBL21(DE3)細胞を、得られたプラスミドで
形質転換し、タンパク質発現をSDS−PAGEおよびイムノアッセイの両者に
よって実証した。上記した一本鎖ポリペプチドは分子量43,700ダルトンを
有する。遺伝子およびポリペプチド配列は、それぞれSEQ ID NO:3お
よびSEQ ID NO:4に示す。
寄託され、ATCC番号 を有する。
トロポニンCから形成した複合体を、Stratus(R)、およびAcces
s(R)測定法で、各測定の製造者の指示手順に従って、評価した。結果は、以
下の通りであった。
は、天然の心筋トロポニンI−トロポニンC複合体と類似した測定結果を与え、
そこにおいて、Stratus(R)測定は類似した高値を、そしてAcces
s(R)測定は同様の低値をつくった。
調製物は、(1)標準法で調製した組換えトロポニンI;(2)組換えトロポニ
ンIおよび組換えCの非共有結合複合体、および(3)SEQ ID NO:4
に示すような、間に挟まれたリンカーペプチドを有するトロポニンIおよびトロ
ポニンCを含む一本鎖ポリペプチド、であった。組換えトロポニンIおよび組換
えトロポニンCの非共有結合複合体は、ここに文献として取り入れられている、
同時継続および普通に所有されている出願、Ser.No. (代理人
整理番号No.1112−1−044CIP)、1997年10月31日出願、
の方法によって調製された。簡単に云うと、ヒト心筋トロポニンCおよび修飾ト
ロポニンIをE.coliで発現させた。トロポニンIは、その発現を増加させ
るために、6つの付加的N末端アミノ酸残基と組替え産物として遺伝子工学処理
した。尿素の存在下、修飾トロポニンIは、トロポニンC、CaCl2およびM
gCl2と結合させた、そしてトロポニンI−トロポニンC複合体の形成を促進
するためゆっくりと振とうした。
usII(R)測定を使って測定した。
に亙って変化しやすい測定性を示し、前者は最初上昇し、そして下降した、およ
び後者は試験期間中に亙ってゆっくりと上昇した。これらの調製物は、それゆえ
、不安定である。対照的に、一本鎖トロポニンI−トロポニンCペプチドは、試
験期間中に亙って、一定した免疫検出性を保ち、物質の安定性を明らかに示した
。
ことによって、ここに記載され、説明されたが、本発明は、特定の物質、物質の
組み合わせ、およびその目的のために選択された方法、に制限されるものではな
いと理解される。実際、ここに記載されたのに加えて本発明の種々の変形は、先
の記載および付属する図から当業者に明らかになるであろう。そのような変形は
付属する特許請求の範囲内にあるものと意図される。
らはここにその全部を参照することによってとり入れられている。
IおよびトロポニンCを含む一本鎖ポリペプチドの、DNAおよびアミノ酸配列
(それぞれSEC ID NO:3およびSEQ ID NO:4)を示したも
のである。ヌクレオチド1から630はトロポニンIを含み、ヌクレオチド63
1から687はリンカーペプチド配列を含み、そしてヌクレオチド688から1
170はトロポニンCの配列を含む。
定結果を示す。トロポニンIはStratus(R)、Access(R)およ
びOpus(R)測定法を使用して測定された。
る安定性を示す:組換えトロポニンI、トロポニンIとトロポニンCの非共有結
合複合体、およびトロポニンIおよびトロポニンCを含む本発明の一本鎖ポリペ
プチド。
Claims (16)
- 【請求項1】 心筋トロポニンIおよび心筋トロポニンCを含む一本鎖ポリ
ペプチドをコードする遺伝子配列。 - 【請求項2】 リンカーポリペプチド配列に対するリンカー遺伝子配列が、
心筋トロポニンIと心筋トロポニンCの遺伝子配列の間に挟まれている、請求項
1記載の遺伝子配列。 - 【請求項3】 請求項1または2記載の遺伝子配列を含む複製し得るクロー
ニングまたは発現ベヒクル。 - 【請求項4】 プラスミドである請求項3記載のベヒクル。
- 【請求項5】 請求項3記載のベヒクルで形質転換された宿主細胞。
- 【請求項6】 請求項1または2記載の遺伝子配列を含む複製し得るクロー
ニングまたは発現ベヒクルで形質転換されたE.coli。 - 【請求項7】 (SEQ ID NO:3)として同定された請求項2記載
の遺伝子配列。 - 【請求項8】 (SEQ ID NO:3)に示された配列を有する複製し
得るクローニングまたは発現ベヒクル。 - 【請求項9】 請求項8記載のベヒクルで形質転換された宿主細胞。
- 【請求項10】 E.coliである請求項9記載の宿主細胞。
- 【請求項11】 ATCC として同定された請求項10記載のE.c
oli。 - 【請求項12】 遺伝子リンカー配列が、約18から約150ヌクレオチド
を含む請求項2記載の遺伝子配列。 - 【請求項13】 心筋トロポニンIと心筋トロポニンCを含む一本鎖ポリペ
プチド。 - 【請求項14】 ペプチドリンカー配列が、心筋トロポニンIと心筋トロポ
ニンCの間に挟まれた、請求項13記載のポリペプチド。 - 【請求項15】 (SEQ ID NO:4)に記載のアミノ酸配列を有す
る請求項14記載のポリペプチド。 - 【請求項16】 ペプチドリンカー配列が約6乃至50のアミノ酸を有する
請求項13記載のポリペプチド。
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