JP2002508181A - トロポニンｉおよびトロポニンｃを含む一本鎖ポリペプチド - Google Patents
トロポニンｉおよびトロポニンｃを含む一本鎖ポリペプチドInfo
- Publication number
- JP2002508181A JP2002508181A JP2000539135A JP2000539135A JP2002508181A JP 2002508181 A JP2002508181 A JP 2002508181A JP 2000539135 A JP2000539135 A JP 2000539135A JP 2000539135 A JP2000539135 A JP 2000539135A JP 2002508181 A JP2002508181 A JP 2002508181A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- troponin
- sequence
- polypeptide
- linker
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、ヒト心筋トロポニンＩおよびトロポニンＣを含む一本鎖ポリペプチドおよびそれらの遺伝子配列に関する。一本鎖ポリペプチドは、組換え型として、そしてリンカーペプチドは、トロポニン配列の間に挟まっている。約６から約３０アミノ酸のリンカーペプチドが好ましい。一本鎖ポリペプチドは、トロポニン測定の対照またはキャリブレーターとして、トロポニンサブユニットの精製のため、および抗体調製用の抗原としての有用性を有している。
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は、トロポニンサブユニットＩおよびＣ、およびそれらの対応する遺伝
子配列を含む組換え型として発現される一本鎖ポリペプチドに関する。
子配列を含む組換え型として発現される一本鎖ポリペプチドに関する。
【０００２】 （背景技術） 急性心筋梗塞の疑いを早期にそして正確に評価するには、アンギナのような生
命に脅威とならない状況や消化不良のような非心臓性胸痛から、緊急の処置を必
要とする潜在的に致命的な発生を区別するために、遊離された心筋細胞内成分の
血液、血清または血漿中における、感度の高い特異的な検出および定量すること
に臨界的に依存している。初期の心電図変化は充分に特異的でもないし感度が高
くもない、それで医療専門家は、早期の診断に、心臓組織損傷の血清生化学マー
カーを当てにせねばならなくなる。はじめは、血清マーカー、クレアチニンキナ
ーゼ（ＣＫ）および、特に、心筋ＣＫ−ＭＢアイソフォームが使われた、次いで
、心損傷のより感度の高い早期インディケーターとしてミオグロビンが使われた
。より最近には、心筋トロポニン複合体およびそのサブユニットが、それらの高
い特異性のゆえに心筋損傷のマーカーとして好ましいとされた。これらの試験は
、骨格筋損傷の他のマーカーに加えて、組合せて、診断の高い正確さをもたらし
た。もし救急室で実行されるなら、心筋損傷の早期かつ正確な診断は、心臓発作
の犠牲となる恐れに対し、大きな利点をもたらすことになる。
命に脅威とならない状況や消化不良のような非心臓性胸痛から、緊急の処置を必
要とする潜在的に致命的な発生を区別するために、遊離された心筋細胞内成分の
血液、血清または血漿中における、感度の高い特異的な検出および定量すること
に臨界的に依存している。初期の心電図変化は充分に特異的でもないし感度が高
くもない、それで医療専門家は、早期の診断に、心臓組織損傷の血清生化学マー
カーを当てにせねばならなくなる。はじめは、血清マーカー、クレアチニンキナ
ーゼ（ＣＫ）および、特に、心筋ＣＫ−ＭＢアイソフォームが使われた、次いで
、心損傷のより感度の高い早期インディケーターとしてミオグロビンが使われた
。より最近には、心筋トロポニン複合体およびそのサブユニットが、それらの高
い特異性のゆえに心筋損傷のマーカーとして好ましいとされた。これらの試験は
、骨格筋損傷の他のマーカーに加えて、組合せて、診断の高い正確さをもたらし
た。もし救急室で実行されるなら、心筋損傷の早期かつ正確な診断は、心臓発作
の犠牲となる恐れに対し、大きな利点をもたらすことになる。
【０００３】 心筋マーカーを採用した診断テストは、例えば、米国特許Ｎｏ．５，６０４，
１０５およびＮｏ．５，２９０，６７８に記載されている。それらおよび他の方
法は救急治療室設備において心筋梗塞を診断するに敏捷さを提供し、そして患者
に医療上の利便を提供している。体液中のトロポニンサブユニットまたは複合体
のレベルを測定する診断テストには、測定方法において使用される抗体調製物に
対する抗原として、精製トロポニンサブユニットあるいは複合体が、また測定を
行うために対照およびキャリブレーターとして使用される精製サブユニットある
いは複合体が、しばしば利用されている。測定キャリブレーターは、測定の操作
範囲を横切る標準曲線がつくられるように稀釈系列をつくるのに使われる；測定
対照は、前以て決められた試料の値がその値の周辺の許容範囲内になるように、
測定が行われることを確認するのに使用される。測定が適正に検定できるように
、トロポニン対照とキャリブレーターは安定に保たれねばならないし、抗体によ
って免疫検出される形でなければならない。
１０５およびＮｏ．５，２９０，６７８に記載されている。それらおよび他の方
法は救急治療室設備において心筋梗塞を診断するに敏捷さを提供し、そして患者
に医療上の利便を提供している。体液中のトロポニンサブユニットまたは複合体
のレベルを測定する診断テストには、測定方法において使用される抗体調製物に
対する抗原として、精製トロポニンサブユニットあるいは複合体が、また測定を
行うために対照およびキャリブレーターとして使用される精製サブユニットある
いは複合体が、しばしば利用されている。測定キャリブレーターは、測定の操作
範囲を横切る標準曲線がつくられるように稀釈系列をつくるのに使われる；測定
対照は、前以て決められた試料の値がその値の周辺の許容範囲内になるように、
測定が行われることを確認するのに使用される。測定が適正に検定できるように
、トロポニン対照とキャリブレーターは安定に保たれねばならないし、抗体によ
って免疫検出される形でなければならない。
【０００４】 トロポニンは、筋肉収縮のカルシウム依存性調節に一体的に関与している筋肉
タンパク質である。トロポニンは、トロポミオシン上のトロポニン複合体として
局在する、非共有結合複合体の３つのサブユニット、即ち、カルシウム結合性サ
ブユニットであるアイソフォームトロポニンＣ、阻害性サブユニットであるトロ
ポニンＩ、およびトロポニンＴ、として心筋および骨格筋の両者に存在している
。適当な条件下のｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、トロポニンサブユニットは、自然
に会合して、非共有結合複合体、例えば、トロポニンＩおよびＣ、ならびにトロ
ポニンＩ、ＣおよびＴ、を形成する。心筋と骨格筋トロポニンアイソフォームの
間には相異がある。
タンパク質である。トロポニンは、トロポミオシン上のトロポニン複合体として
局在する、非共有結合複合体の３つのサブユニット、即ち、カルシウム結合性サ
ブユニットであるアイソフォームトロポニンＣ、阻害性サブユニットであるトロ
ポニンＩ、およびトロポニンＴ、として心筋および骨格筋の両者に存在している
。適当な条件下のｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、トロポニンサブユニットは、自然
に会合して、非共有結合複合体、例えば、トロポニンＩおよびＣ、ならびにトロ
ポニンＩ、ＣおよびＴ、を形成する。心筋と骨格筋トロポニンアイソフォームの
間には相異がある。
【０００５】 心筋損傷および壊死になると、トロポニンが心筋から循環へ漏出し、そこでの
その敏感な検出は心臓発作の診断の助けとなり得る。トロポニンサブユニットの
心筋と骨格筋アイソフォームの間のアミノ酸配列の相異は、トロポニンサブユニ
ットおよび複合体の心筋アイソフォームを特異的に測定する診断テストにおいて
、利用される。心筋トロポニンＩの診断テストが得られる。
その敏感な検出は心臓発作の診断の助けとなり得る。トロポニンサブユニットの
心筋と骨格筋アイソフォームの間のアミノ酸配列の相異は、トロポニンサブユニ
ットおよび複合体の心筋アイソフォームを特異的に測定する診断テストにおいて
、利用される。心筋トロポニンＩの診断テストが得られる。
【０００６】 しかしながら、トロポニンＩは本質的に貧弱な構造安定性を有しており、生物
試料に存在するプロテアーゼによりタンパク質分解の開裂を受けることになる。
体液マトリックスで調製されるトロポニンＩ標準品は、立体配座の変化および分
解を受け、そしてキャリブレーターあるいは対照としては不安定である。更に、
本質的により安定なトロポニン複合体は、保存において解離することが知られて
おり、そしてそれゆえにタンパク質分解開裂に感受性となる。トロポニンＩの場
合において、その立体配座構造および安定性の保持を助けるために、トロポニン
Ｃと複合体とならねばらならい；しかしながら、複合体におけるサブユニットの
親和性の性質のゆえに、複合体の型で存在するトロポニンＩの分画は濃度依存性
である。このことは、測定キャリブレーターあるいは対照としての利用を限定す
ることになる。サブユニット間の相互作用の程度は解離定数、Ｋｄ、から計算で
きる［例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１２７２９（１９９４）に報
告されているように］。計算および実験的測定によって、トロポニンＩのほんの
限定された量がトロポニンＣに、特に、患者血清試料に結合する見出される範囲
を超えて、結合する、それゆえそのレベルではキャリブレーターおよび最小を使
わねばならない。例えば、殆どのトロポニンＩ測定の上限である、５０ｎｇ／ｍ
ｌにおいて、トロポニンＩの、ほんの１０％が、２つのサブユニットが１：１の
比率で存在するとき、トロポニンＣと結合している。トロポニンＩに対しトロポ
ニンＣを１０倍余計までで、そして２価の陽イオンが存在するとき、冷時に複合
体の安定性について、特許請求の範囲（Ｌａｒｕｅら、米国特許５，５８３，２
００では最小、即ち、「少なくとも１日」、である。複合体のより高い濃度を維
持すると、会合の度合いが増加する；しかし、測定を検定するに必要なレベルま
で稀釈した後は、サブユニットは解離し、そして免疫的に不安定になる。それで
、解離はサブユニットにタンパク分解攻撃を受けやすくし、更に、そのようなキ
ャリブレーターおよび対照の有用性を減じることになる。
試料に存在するプロテアーゼによりタンパク質分解の開裂を受けることになる。
体液マトリックスで調製されるトロポニンＩ標準品は、立体配座の変化および分
解を受け、そしてキャリブレーターあるいは対照としては不安定である。更に、
本質的により安定なトロポニン複合体は、保存において解離することが知られて
おり、そしてそれゆえにタンパク質分解開裂に感受性となる。トロポニンＩの場
合において、その立体配座構造および安定性の保持を助けるために、トロポニン
Ｃと複合体とならねばらならい；しかしながら、複合体におけるサブユニットの
親和性の性質のゆえに、複合体の型で存在するトロポニンＩの分画は濃度依存性
である。このことは、測定キャリブレーターあるいは対照としての利用を限定す
ることになる。サブユニット間の相互作用の程度は解離定数、Ｋｄ、から計算で
きる［例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１２７２９（１９９４）に報
告されているように］。計算および実験的測定によって、トロポニンＩのほんの
限定された量がトロポニンＣに、特に、患者血清試料に結合する見出される範囲
を超えて、結合する、それゆえそのレベルではキャリブレーターおよび最小を使
わねばならない。例えば、殆どのトロポニンＩ測定の上限である、５０ｎｇ／ｍ
ｌにおいて、トロポニンＩの、ほんの１０％が、２つのサブユニットが１：１の
比率で存在するとき、トロポニンＣと結合している。トロポニンＩに対しトロポ
ニンＣを１０倍余計までで、そして２価の陽イオンが存在するとき、冷時に複合
体の安定性について、特許請求の範囲（Ｌａｒｕｅら、米国特許５，５８３，２
００では最小、即ち、「少なくとも１日」、である。複合体のより高い濃度を維
持すると、会合の度合いが増加する；しかし、測定を検定するに必要なレベルま
で稀釈した後は、サブユニットは解離し、そして免疫的に不安定になる。それで
、解離はサブユニットにタンパク分解攻撃を受けやすくし、更に、そのようなキ
ャリブレーターおよび対照の有用性を減じることになる。
【０００７】 それゆえ、産業の要請に合った安定なトロポニンのキャリブレーターおよび対
照に対する、必要性が存在する。
照に対する、必要性が存在する。
【０００８】 多くの、天然および組換え源の両者からのトロポニン製剤が、トロポニンＩと
トロポニンＣを含んで、記載されている。ＭａｌｎｉｃおよびＲｅｉｎａｃｈ（
１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖ．２２２，ｐｐ．４９−５４）は
、全３つのニワトリ骨格筋トロポニンサブユニットを、１またはそれ以上の発現
プラスミドにクローニングすることによって、ｉｎ ｖｉｖｏで組換え複合体を
製造している。発現ベクター内で、各トロポニン遺伝子はそれ自体のプロモータ
ーを持っており、そしてタンパク質が個々のトロポニンサブユニットとして細菌
内で発現され、次いで細菌内で複合体を生成する。Ｆｕｊｉｔａ−Ｂｅｃｋｅｒ
ら（１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖ．１１４，ｐｐ．４３８−４４４）は
、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現した組換えサブユニットからウサギ骨格筋トロポニン複
合体の再構成を記載している。これらの組換え産物のいずれもが、診断テスト標
準品またはキャリブレーターとして使用される適当な安定性を有することは記載
されていない。上にあげたように、トロポニンサブユニットの複合体でさえ安定
でなく、どのような程度にでも溶液中で、結合して残留することはないのである
。
トロポニンＣを含んで、記載されている。ＭａｌｎｉｃおよびＲｅｉｎａｃｈ（
１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖ．２２２，ｐｐ．４９−５４）は
、全３つのニワトリ骨格筋トロポニンサブユニットを、１またはそれ以上の発現
プラスミドにクローニングすることによって、ｉｎ ｖｉｖｏで組換え複合体を
製造している。発現ベクター内で、各トロポニン遺伝子はそれ自体のプロモータ
ーを持っており、そしてタンパク質が個々のトロポニンサブユニットとして細菌
内で発現され、次いで細菌内で複合体を生成する。Ｆｕｊｉｔａ−Ｂｅｃｋｅｒ
ら（１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖ．１１４，ｐｐ．４３８−４４４）は
、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現した組換えサブユニットからウサギ骨格筋トロポニン複
合体の再構成を記載している。これらの組換え産物のいずれもが、診断テスト標
準品またはキャリブレーターとして使用される適当な安定性を有することは記載
されていない。上にあげたように、トロポニンサブユニットの複合体でさえ安定
でなく、どのような程度にでも溶液中で、結合して残留することはないのである
。
【０００９】 以下で明らかになるように、本発明の主要な目的は、組換え構造体として調製
され、単一のポリペプチドとして細菌発現系で発現する、一本鎖ポリペプチドと
してのトロポニンＩおよびトロポニンＣを含む、測定およびその他の用途用の安
定なトロポニン調製物を提供するにある。本発明は、カルボジイミド架橋および
光架橋化学のような方法、例えばＪｈａら（１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，ｖｏｌ．３５，ｐｐ．１１０２６−１１０３５）、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（
１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，ｖｏｌ．１２９４，ｐ
ｐ．２５−３０）およびＫｏｂａｙａｓｈｉら（１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，ｖｏｌ．３４，ｐｐ．１０９４６−１０９５２）により記載されたよう
な方法を使って生化学研究用の化学的に架橋されたトロポニンサブユニットおよ
びそれらの断片とは、異なっている。これらの文献において、異なったトロポニ
ンタンパク質の特定の断片は、トロポニン複合体におけるサブユニットの立体配
座およびそれらの天然の相互作用をしらべるために、化学的に架橋されたもので
ある。
され、単一のポリペプチドとして細菌発現系で発現する、一本鎖ポリペプチドと
してのトロポニンＩおよびトロポニンＣを含む、測定およびその他の用途用の安
定なトロポニン調製物を提供するにある。本発明は、カルボジイミド架橋および
光架橋化学のような方法、例えばＪｈａら（１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，ｖｏｌ．３５，ｐｐ．１１０２６−１１０３５）、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（
１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，ｖｏｌ．１２９４，ｐ
ｐ．２５−３０）およびＫｏｂａｙａｓｈｉら（１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，ｖｏｌ．３４，ｐｐ．１０９４６−１０９５２）により記載されたよう
な方法を使って生化学研究用の化学的に架橋されたトロポニンサブユニットおよ
びそれらの断片とは、異なっている。これらの文献において、異なったトロポニ
ンタンパク質の特定の断片は、トロポニン複合体におけるサブユニットの立体配
座およびそれらの天然の相互作用をしらべるために、化学的に架橋されたもので
ある。
【００１０】 それゆえ、トロポニン測定において、抗原として、ならびに対照およびキャリ
ブレーターとして使用される、安定性要件および精製が容易な調製物に合致する
ようなトロポニン物質に対する要望がある。普遍的に受け入れられる、トロポニ
ンについての対照またはキャリブレーターはないので、研究室あるいは装置間の
測定を標準化することは不可能であり、その対照およびキャリブレーターに沿っ
た各々特定のトロポニン測定として、その研究室および測定成分の選択に独特の
結果を生じることになる。それゆえ、全ての研究室および医師によって認められ
る、正常および異常の範囲を提供することは、今や、不可能である。これらに、
全ての入手し得る市販の測定装置で使用することができる、普遍的なキャリブレ
ーターおよび対照に対する必要性が存在する。
ブレーターとして使用される、安定性要件および精製が容易な調製物に合致する
ようなトロポニン物質に対する要望がある。普遍的に受け入れられる、トロポニ
ンについての対照またはキャリブレーターはないので、研究室あるいは装置間の
測定を標準化することは不可能であり、その対照およびキャリブレーターに沿っ
た各々特定のトロポニン測定として、その研究室および測定成分の選択に独特の
結果を生じることになる。それゆえ、全ての研究室および医師によって認められ
る、正常および異常の範囲を提供することは、今や、不可能である。これらに、
全ての入手し得る市販の測定装置で使用することができる、普遍的なキャリブレ
ーターおよび対照に対する必要性が存在する。
【００１１】 ヒト心筋トロポニンＩおよびヒト心筋トロポニンＣを含む一本鎖ポリペプチド
は安定であり、前記した目的について有用性を有することが、今や見出された。
更に、製品は当業者によって容易に製造されねばならない。この製造の容易さは
、本発明の製品の再現性を最大化するものである。
は安定であり、前記した目的について有用性を有することが、今や見出された。
更に、製品は当業者によって容易に製造されねばならない。この製造の容易さは
、本発明の製品の再現性を最大化するものである。
【００１２】 （発明の概要） 本発明の主要な目的は、トロポニンＩおよびトロポニンＣを含む一本鎖ポリペ
プチドを提供するにある。同一ポリペプチド鎖にトロポニンＩおよびトロポニン
Ｃが存在することは、産物に対する立体配座安定性および免疫的安定性を付与す
る。一本鎖ポリペプチドは、好ましくは、トロポニンＩおよびトロポニンＣの配
座の間に挟まれた、リンカー配列を包含する。リンカーペプチドの配列は、製品
の三次元構造を阻害しないで、それゆえ、前記した有用性を有するように選択さ
れる。トロポニンＩおよびトロポニンＣがつながって、所望によりリンカーペプ
チドを通してつながった、一本鎖ポリペプチドは、トロポニン測定の開発のため
の、安定で、再現性のある、そして容易に精製し得る物質、トロポニン抗体を調
製するための抗原、ならびに、トロポニン測定のための対照およびキャリブレー
ターとして使用される物質、を提供する。
プチドを提供するにある。同一ポリペプチド鎖にトロポニンＩおよびトロポニン
Ｃが存在することは、産物に対する立体配座安定性および免疫的安定性を付与す
る。一本鎖ポリペプチドは、好ましくは、トロポニンＩおよびトロポニンＣの配
座の間に挟まれた、リンカー配列を包含する。リンカーペプチドの配列は、製品
の三次元構造を阻害しないで、それゆえ、前記した有用性を有するように選択さ
れる。トロポニンＩおよびトロポニンＣがつながって、所望によりリンカーペプ
チドを通してつながった、一本鎖ポリペプチドは、トロポニン測定の開発のため
の、安定で、再現性のある、そして容易に精製し得る物質、トロポニン抗体を調
製するための抗原、ならびに、トロポニン測定のための対照およびキャリブレー
ターとして使用される物質、を提供する。
【００１３】 本発明の一本鎖ポリペプチドは、一本鎖ポリペプチドの遺伝子配列をもったプ
ラスミドのような複製し得るクローニングまたは発現ベヒクルを構築し、Ｅ．ｃ
ｏｌｉのような宿主細胞をベヒクルまたはプラスミドで形質転換し、そして宿主
細胞によってポリペプチドを発現することによる、組換え技術によって最も容易
に調整される。一本鎖構造は、好ましくは、組換え手段によって導入された配列
のような、トロポニンＩとトロポニンＣアミノ酸配列の間にリンカーペプチド配
列を含有する。宿主細胞でのポリペプチドの発現を改良するために、ポリペプチ
ドのアミノ酸配列の結果において変更を加えまたは加えないで、トロポニン分子
の遺伝子配列にある種の修飾がなされてもよい。これらの変化は、前記した目的
における使用のための、一本鎖ポリペプチドの有用性を変更しない。
ラスミドのような複製し得るクローニングまたは発現ベヒクルを構築し、Ｅ．ｃ
ｏｌｉのような宿主細胞をベヒクルまたはプラスミドで形質転換し、そして宿主
細胞によってポリペプチドを発現することによる、組換え技術によって最も容易
に調整される。一本鎖構造は、好ましくは、組換え手段によって導入された配列
のような、トロポニンＩとトロポニンＣアミノ酸配列の間にリンカーペプチド配
列を含有する。宿主細胞でのポリペプチドの発現を改良するために、ポリペプチ
ドのアミノ酸配列の結果において変更を加えまたは加えないで、トロポニン分子
の遺伝子配列にある種の修飾がなされてもよい。これらの変化は、前記した目的
における使用のための、一本鎖ポリペプチドの有用性を変更しない。
【００１４】 本発明の別の目的は、トロポニンＩおよびトロポニンＣの遺伝子配列を含む一
本鎖ポリペプチドの遺伝子配列を提供するにある。遺伝子配列は、トロポニンＩ
とトロポニンＣの遺伝子配列の間に挟まれたリンカー遺伝子配列を含むこともで
きる。宿主細胞は、前記した遺伝子配列を含有する複製し得るクローニングまた
は発現ベヒクルで形質転換され得る。上記したように、トロポニンの遺伝子配列
のいくつかの変化は宿主細胞における発現を促進するために行うこともできる。
本鎖ポリペプチドの遺伝子配列を提供するにある。遺伝子配列は、トロポニンＩ
とトロポニンＣの遺伝子配列の間に挟まれたリンカー遺伝子配列を含むこともで
きる。宿主細胞は、前記した遺伝子配列を含有する複製し得るクローニングまた
は発現ベヒクルで形質転換され得る。上記したように、トロポニンの遺伝子配列
のいくつかの変化は宿主細胞における発現を促進するために行うこともできる。
【００１５】 本発明の更に別の目的は、トロポニンＩおよびトロポニンＣの遺伝子配列を含
む一本鎖ポリペプチドに対する遺伝子配列をもったクローニングまたは発現ベヒ
クルまたはプラスミドを含有し、そしてトロポニンＩおよびトロポニンＣを含む
一本鎖ポリペプチドを発現することができる、宿主細胞を提供するにある。
む一本鎖ポリペプチドに対する遺伝子配列をもったクローニングまたは発現ベヒ
クルまたはプラスミドを含有し、そしてトロポニンＩおよびトロポニンＣを含む
一本鎖ポリペプチドを発現することができる、宿主細胞を提供するにある。
【００１６】 本発明の、これらおよびその他の観点は、以下の図面および詳細な説明を参照
することによって、よりよく理解できるであろう。
することによって、よりよく理解できるであろう。
【００１７】 （発明の詳細な説明） 心筋関連タンパクトロポニンの循環における測定は、急性心筋梗塞の疑いのあ
り場合の早期かつ特異的インディケーターであることが証明されている。それで
、血液中のトロポニンおよびそのサブユニットを迅速にそして正確に検出する方
法は緊急の状態において心臓発作を診断するために開発されてきたし、されつつ
もあり、その結果として、数え切れない生命が救われたし、救われることになる
であろう。しかしながら、正確な信頼できる診断測定を開発し、測定対照および
キャリブレーターを使用したこれらの測定の有効性を保証するために、ヒト心筋
トロポニンおよびキャリブレーターの高品質が、対照および試験目的、ならびに
測定のために上昇する抗体に対するトロポニン抗原、が臨界となる。更に、トロ
ポニンを測定する商品は開発されてはいるが、また開発されつつあるが、これら
の測定は、同じ試料でも異なった結果を与える。トロポニンの普遍的な標準品が
ないというのと組合せにおいて、トロポニン用の種々の測定器および測定方法は
、トロポニンレベルの広範に受け入れられる正常および異常範囲の開発を阻害し
てきた、かくして心筋マーカーを含む研究室の結果の解釈を不明確にし、研究室
間の臨床研究を阻害してきたのである。これらの欠点は、普遍的なトロポニン対
照およびキャリブレーターが得られれば解消できるであろう。普遍的な対照およ
びキャリブレーターは、全ての得られる測定により検出可能となり、全てのトロ
ポニン測定によって読み出されたものを標準化するのに使用できる。
り場合の早期かつ特異的インディケーターであることが証明されている。それで
、血液中のトロポニンおよびそのサブユニットを迅速にそして正確に検出する方
法は緊急の状態において心臓発作を診断するために開発されてきたし、されつつ
もあり、その結果として、数え切れない生命が救われたし、救われることになる
であろう。しかしながら、正確な信頼できる診断測定を開発し、測定対照および
キャリブレーターを使用したこれらの測定の有効性を保証するために、ヒト心筋
トロポニンおよびキャリブレーターの高品質が、対照および試験目的、ならびに
測定のために上昇する抗体に対するトロポニン抗原、が臨界となる。更に、トロ
ポニンを測定する商品は開発されてはいるが、また開発されつつあるが、これら
の測定は、同じ試料でも異なった結果を与える。トロポニンの普遍的な標準品が
ないというのと組合せにおいて、トロポニン用の種々の測定器および測定方法は
、トロポニンレベルの広範に受け入れられる正常および異常範囲の開発を阻害し
てきた、かくして心筋マーカーを含む研究室の結果の解釈を不明確にし、研究室
間の臨床研究を阻害してきたのである。これらの欠点は、普遍的なトロポニン対
照およびキャリブレーターが得られれば解消できるであろう。普遍的な対照およ
びキャリブレーターは、全ての得られる測定により検出可能となり、全てのトロ
ポニン測定によって読み出されたものを標準化するのに使用できる。
【００１８】 トロポニン測定用の安定なキャリブレーターおよび対照のために、本発明は、
遊離トロポニンＩの固有の立体配座の不安定さおよびタンパク分解に敏感である
こと、およびトロポニンＩ−トロポニンＣ複合体に伴う不安定さを改良する。改
良は、ヒト心筋トロポニンＩおよび心筋トロポニンＣを含む一本鎖ポリペプチド
からなる。トロポニンサブユニットは、ペプチド結合を通じて共有結合し、同じ
直線ポリペプチドにある。このポリペプチドは工業の要求に合うように安定なト
ロポニンＩ−トロポニンＣ複合体を提供する。一本鎖ポリペプチドは、組換え技
術によって調製され、好ましくは、トロポニンＩとトロポニンＣの間に挟まれた
リンカーポリペプチド配列を包含する。このリンカー配列の長さおよび配列は、
生成物の免疫検出およびその他の前記した有用性を妨害しない、ことにのみ限定
されている。
遊離トロポニンＩの固有の立体配座の不安定さおよびタンパク分解に敏感である
こと、およびトロポニンＩ−トロポニンＣ複合体に伴う不安定さを改良する。改
良は、ヒト心筋トロポニンＩおよび心筋トロポニンＣを含む一本鎖ポリペプチド
からなる。トロポニンサブユニットは、ペプチド結合を通じて共有結合し、同じ
直線ポリペプチドにある。このポリペプチドは工業の要求に合うように安定なト
ロポニンＩ−トロポニンＣ複合体を提供する。一本鎖ポリペプチドは、組換え技
術によって調製され、好ましくは、トロポニンＩとトロポニンＣの間に挟まれた
リンカーポリペプチド配列を包含する。このリンカー配列の長さおよび配列は、
生成物の免疫検出およびその他の前記した有用性を妨害しない、ことにのみ限定
されている。
【００１９】 例えば、トロポニンＩ−トロポニンＣ一本鎖ポリペプチドの一実施態様は、ト
ロポニンＩ配列のＣ末端がトロポニンＣ配列のＮ末端をペプチド結合で結ばれた
、ポリペプチドのＮ末端にトロポニンＩ配列があるものを含む。リンカーペプチ
ド配列がトロポニンＩとトロポニンＣの間に挟まれた、第二の好ましい実施態様
においては、一つの好ましい配置は、ポリペプチドのＮ末端部にトロポニンＩ配
列があって、そのＣ末端がリンカーペプチドのＮ末端とペプチド結合で結ばれて
おり、そしてリンカーペプチドのＣ末端がトロポニンＣ配列のＮ末端とペプチド
結合でつながれている、ことを含む。この構造の一例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
４に描かれたアミノ酸配列である。この例では、リンカーのアミノ酸配列は、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に代表される。このものは１９アミノ酸を含有している。
ロポニンＩ配列のＣ末端がトロポニンＣ配列のＮ末端をペプチド結合で結ばれた
、ポリペプチドのＮ末端にトロポニンＩ配列があるものを含む。リンカーペプチ
ド配列がトロポニンＩとトロポニンＣの間に挟まれた、第二の好ましい実施態様
においては、一つの好ましい配置は、ポリペプチドのＮ末端部にトロポニンＩ配
列があって、そのＣ末端がリンカーペプチドのＮ末端とペプチド結合で結ばれて
おり、そしてリンカーペプチドのＣ末端がトロポニンＣ配列のＮ末端とペプチド
結合でつながれている、ことを含む。この構造の一例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
４に描かれたアミノ酸配列である。この例では、リンカーのアミノ酸配列は、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に代表される。このものは１９アミノ酸を含有している。
【００２０】 上記の例のアミノ酸配列は、これらポリペプチドに対するｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列に対応する。第一の例の遺伝子配列は、ｃＤＮＡの５′末端におけるト
ロポニンＩ遺伝子配列、その３′末端はトロポニンＣ遺伝子配列の５′末端に直
ぐに続いている、ことを含んでいる。リンカーがトロポニンＩとトロポニンＣ配
列の間に挟まれた、好ましい実施態様においては、ｃＤＮＡ配列の５′はトロポ
ニンＩ遺伝子配列で始まり、その３′末端に任意の挟まれたリンカー遺伝子配列
の５′末端が続き、そしてその３′末端にトロポニンＣ遺伝子配列の５′末端が
続き、ｃＤＮＡの３′末端で終わる。上記の特別の例では、遺伝子配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３に代表されている。リンカーのｃＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１に示されている。
チド配列に対応する。第一の例の遺伝子配列は、ｃＤＮＡの５′末端におけるト
ロポニンＩ遺伝子配列、その３′末端はトロポニンＣ遺伝子配列の５′末端に直
ぐに続いている、ことを含んでいる。リンカーがトロポニンＩとトロポニンＣ配
列の間に挟まれた、好ましい実施態様においては、ｃＤＮＡ配列の５′はトロポ
ニンＩ遺伝子配列で始まり、その３′末端に任意の挟まれたリンカー遺伝子配列
の５′末端が続き、そしてその３′末端にトロポニンＣ遺伝子配列の５′末端が
続き、ｃＤＮＡの３′末端で終わる。上記の特別の例では、遺伝子配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３に代表されている。リンカーのｃＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１に示されている。
【００２１】 上記したように、任意のリンカーポリペプチドの長さ、および特異的配列の選
択は、一本鎖ポリペプチドにおけるトロポニンＩとトロポニンＣの免疫検出性を
阻害してはならないように限定されるだけである。適当なリンカー配列では、一
本鎖ポリペプチドのトロポニンＩおよびトロポニンＣセグメントは、非共有結合
トロポニンＩ−トロポニンＣ複合体におけると同様な様式で互いに会合し、そし
て一本鎖ポリペプチドにおけるサブユニットの付着は会合の立体配座およびその
結果のトロポニンと矛盾しない免疫検出性が保持される、と信じられる。更に、
このようにして安定化したトロポニンＩ−トロポニンＣ複合体は、体液およびそ
の他の成分の存在でタンパク質分解攻撃に感受性でない。この好ましい実施態様
内で、約６から約５０アミノ酸（および対応するｃＤＮＡのコドンの数）のリン
カーが、調製物の容易さおよび経済性のために、好ましい。
択は、一本鎖ポリペプチドにおけるトロポニンＩとトロポニンＣの免疫検出性を
阻害してはならないように限定されるだけである。適当なリンカー配列では、一
本鎖ポリペプチドのトロポニンＩおよびトロポニンＣセグメントは、非共有結合
トロポニンＩ−トロポニンＣ複合体におけると同様な様式で互いに会合し、そし
て一本鎖ポリペプチドにおけるサブユニットの付着は会合の立体配座およびその
結果のトロポニンと矛盾しない免疫検出性が保持される、と信じられる。更に、
このようにして安定化したトロポニンＩ−トロポニンＣ複合体は、体液およびそ
の他の成分の存在でタンパク質分解攻撃に感受性でない。この好ましい実施態様
内で、約６から約５０アミノ酸（および対応するｃＤＮＡのコドンの数）のリン
カーが、調製物の容易さおよび経済性のために、好ましい。
【００２２】 本発明の一本鎖トロポニンＩ−トロポニンＣポリペプチドは、比較的短いリン
カーセグメントで製造することが好ましい、なぜなら、そのような製品では、産
物の三次構造の阻害が少ないか、あるいは、ない、からである。それゆえ、既に
得られている抗体との反応に対するエピトープの得られやすさに阻害が少ないか
、ないことになる。通常のトロポニンＩ−トロポニンＣ複合体において、トロポ
ニンＩ成分のアミノ末端はトロポニンＣ成分のカルボキシ末端に非常に接近して
いる。しかしながら、もしそれらがリンカーなしに形成されたら、この接近は妨
害され、得られた三次元構造の歪みは反応ができないようになるエピトープを生
み出す。同様にして、長すぎるリンカーも三次元構造を修飾し、あるいはリンカ
ーそれ自体がエピトープを隠すことになる。
カーセグメントで製造することが好ましい、なぜなら、そのような製品では、産
物の三次構造の阻害が少ないか、あるいは、ない、からである。それゆえ、既に
得られている抗体との反応に対するエピトープの得られやすさに阻害が少ないか
、ないことになる。通常のトロポニンＩ−トロポニンＣ複合体において、トロポ
ニンＩ成分のアミノ末端はトロポニンＣ成分のカルボキシ末端に非常に接近して
いる。しかしながら、もしそれらがリンカーなしに形成されたら、この接近は妨
害され、得られた三次元構造の歪みは反応ができないようになるエピトープを生
み出す。同様にして、長すぎるリンカーも三次元構造を修飾し、あるいはリンカ
ーそれ自体がエピトープを隠すことになる。
【００２３】 例えば、有用なリンカーポリペプチド配列は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３で、これは
２つのサブユニットが会合するように柔軟なペプチド配列を提供する。リンカー
と遺伝子配列を構築するために、所望の一本鎖ポリペプチドの遺伝子構造を創り
出すのに独特の制限部位を提供するために必要とされる、２コドンが付加的にリ
ンカーの各末端に存在している。一例として、リンカーのＮ末端にあるＳｅｒお
よびＣ末端にあるＡｌａ−Ｃｙｓが含まれる。かくして、適当な１９残基のリン
カーが造られる（遺伝子配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびペプチドＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２）。
２つのサブユニットが会合するように柔軟なペプチド配列を提供する。リンカー
と遺伝子配列を構築するために、所望の一本鎖ポリペプチドの遺伝子構造を創り
出すのに独特の制限部位を提供するために必要とされる、２コドンが付加的にリ
ンカーの各末端に存在している。一例として、リンカーのＮ末端にあるＳｅｒお
よびＣ末端にあるＡｌａ−Ｃｙｓが含まれる。かくして、適当な１９残基のリン
カーが造られる（遺伝子配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびペプチドＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２）。
【００２４】 組換え法がトロポニンサブユニットおよび任意のリンカー配列を含むＤＮＡ配
列を調製するのに、および宿主細胞に配列を導入するのに使用され、そして標準
的発現方法が、組換えポリペプチドを発現し精製するのに使用される。これらの
方法は、２つの代謝共役酵母酵素、クエン酸シンターゼおよびリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ、について記載された（Ｌｉｎｄｂｌａｄｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，３３：１１６９２−１１６９８［１９９４］）；抗体の抗原結合部位を含
む一本鎖ポリペプチドの調製において（米国特許４，９４６，７７８）；および
ファージ提示融合タンパク質の調製（米国特許５，５１６，６３７）のような、
融合タンパク質の調製に使用されたのと類似の方法である。これらの方法は、当
業者に知られている。
列を調製するのに、および宿主細胞に配列を導入するのに使用され、そして標準
的発現方法が、組換えポリペプチドを発現し精製するのに使用される。これらの
方法は、２つの代謝共役酵母酵素、クエン酸シンターゼおよびリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ、について記載された（Ｌｉｎｄｂｌａｄｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，３３：１１６９２−１１６９８［１９９４］）；抗体の抗原結合部位を含
む一本鎖ポリペプチドの調製において（米国特許４，９４６，７７８）；および
ファージ提示融合タンパク質の調製（米国特許５，５１６，６３７）のような、
融合タンパク質の調製に使用されたのと類似の方法である。これらの方法は、当
業者に知られている。
【００２５】 リンカー配列を必要としない例においては、トロポニンＩおよびトロポニンＣ
ｃＤＮＡ配列は、例えば、ヒト心筋トロポニンＴにおけるまれなコドンが同義主
要コドンで置換される、Ｈｕら（１９９６，「タンパク質の発現と精製」、７：
２８９−２９３）によって記載されたように、部分的に重複したプライマーのペ
アを使用するＳＯＥｉｎｇ法のような公知の適当な技術で一致させられる。これ
らの方法も、また、当業者に知られている。
ｃＤＮＡ配列は、例えば、ヒト心筋トロポニンＴにおけるまれなコドンが同義主
要コドンで置換される、Ｈｕら（１９９６，「タンパク質の発現と精製」、７：
２８９−２９３）によって記載されたように、部分的に重複したプライマーのペ
アを使用するＳＯＥｉｎｇ法のような公知の適当な技術で一致させられる。これ
らの方法も、また、当業者に知られている。
【００２６】 組換え構築は、発現またはクローニングベヒクル、またはプラスミドとして調
製され、そして発現のため宿主細胞に導入される。組換えタンパク質の発現方法
は公知である。一度発現されると、一本鎖ポリペプチドは標準的タンパク質精製
法により精製される。
製され、そして発現のため宿主細胞に導入される。組換えタンパク質の発現方法
は公知である。一度発現されると、一本鎖ポリペプチドは標準的タンパク質精製
法により精製される。
【００２７】 さらに、トロポニンＩおよびトロポニンＣの遺伝子配列は、細菌の発現系にお
いて一本鎖ポリペプチドの発現を改良するために修飾される。これら遺伝子変換
は、ポリペプチドのアミノ酸配列を変更したりしなかったりする。よく知られて
いるように、発現ベヒクルに存在するある種のまれなコドンは、発現効率を減じ
る、そしてこれらコドンを同義の主要なコドンに変更することによって、細菌の
発現が改善される（例えば、１９９７年５月２３日出願の、同時継続出願Ｓｅｒ
．Ｎｏ．０８／８６２，６１３、および参照することによりここにとり入れられ
ている、トロポニンＩについて記載されているように；および、Ｈｕら、前記、
の方法、これもまた参照することによりここにとり入れられている）。更に、ト
ロポニンＩｃＤＮＡの５′末端への短いヌクレオチド配列を含むと（例えば、Ｓ
ｅｒ．Ｎｏ．０８／８６２，６１３に記載されているように）細菌の発現を増加
し、６つのＮ末端アミノ酸を付加したトロポニンＩポリペプチドを提供する。細
菌の発現を増加するこれら任意の修飾は、前記の目的の一本鎖ポリペプチドの有
用性を減じることはない。
いて一本鎖ポリペプチドの発現を改良するために修飾される。これら遺伝子変換
は、ポリペプチドのアミノ酸配列を変更したりしなかったりする。よく知られて
いるように、発現ベヒクルに存在するある種のまれなコドンは、発現効率を減じ
る、そしてこれらコドンを同義の主要なコドンに変更することによって、細菌の
発現が改善される（例えば、１９９７年５月２３日出願の、同時継続出願Ｓｅｒ
．Ｎｏ．０８／８６２，６１３、および参照することによりここにとり入れられ
ている、トロポニンＩについて記載されているように；および、Ｈｕら、前記、
の方法、これもまた参照することによりここにとり入れられている）。更に、ト
ロポニンＩｃＤＮＡの５′末端への短いヌクレオチド配列を含むと（例えば、Ｓ
ｅｒ．Ｎｏ．０８／８６２，６１３に記載されているように）細菌の発現を増加
し、６つのＮ末端アミノ酸を付加したトロポニンＩポリペプチドを提供する。細
菌の発現を増加するこれら任意の修飾は、前記の目的の一本鎖ポリペプチドの有
用性を減じることはない。
【００２８】 いくつかのトロポニンＩ測定は、市販されており、これらの全ては異なったフ
ォーマット、装置、および測定対照およびキャリブレーターを用いて操作する。
例えば、Ｄａｄｅ社からのストレイタス（Ｓｔｒａｔｕｓ）（Ｒ）トロポニンＩ
測定は、モノクローナル捕捉体およびモノクロ−ナル検出抗体を利用する。キャ
リブレーター／対照物質はヒト心筋トロポニンＩからのＮ末端ペプチドである。
測定の操作範囲は、０−５０ｎｇ／ｍｌ、感度０．６ｎｇ／ｍｌ、カットオフ値
１．５ｎｇ／ｍｌ。Ｓａｎｏｆｉ社からのアクセス（Ａｃｃｅｓｓ）（Ｒ）トロ
ポニンＩ測定は、また、モノクローナル捕捉体およびモノクロ−ナル検出抗体を
利用する、しかし、そのキャリブレーター／対照物質は、天然の心筋トロポニン
ＩおよびトロポニンＣの複合体である。この測定では、測定範囲０−５０ｎｇ／
ｍｌ、感度０．０３ｎｇ／ｍｌ、およびカットオフ値０．１ｎｇ／ｍｌ。Ｂｅｈ
ｒｉｎｇ社からのオーピーユーエス（Ｏｐｕｓ）（Ｒ）トロポニンＩ測定では、
捕捉体および検出体としてポリクローナル抗体を利用し、測定範囲０−３００ｎ
ｇ／ｍｌ、感度１ｎｇ／ｍｌおよびカットオフ値２ｎｇ／ｍｌ。
ォーマット、装置、および測定対照およびキャリブレーターを用いて操作する。
例えば、Ｄａｄｅ社からのストレイタス（Ｓｔｒａｔｕｓ）（Ｒ）トロポニンＩ
測定は、モノクローナル捕捉体およびモノクロ−ナル検出抗体を利用する。キャ
リブレーター／対照物質はヒト心筋トロポニンＩからのＮ末端ペプチドである。
測定の操作範囲は、０−５０ｎｇ／ｍｌ、感度０．６ｎｇ／ｍｌ、カットオフ値
１．５ｎｇ／ｍｌ。Ｓａｎｏｆｉ社からのアクセス（Ａｃｃｅｓｓ）（Ｒ）トロ
ポニンＩ測定は、また、モノクローナル捕捉体およびモノクロ−ナル検出抗体を
利用する、しかし、そのキャリブレーター／対照物質は、天然の心筋トロポニン
ＩおよびトロポニンＣの複合体である。この測定では、測定範囲０−５０ｎｇ／
ｍｌ、感度０．０３ｎｇ／ｍｌ、およびカットオフ値０．１ｎｇ／ｍｌ。Ｂｅｈ
ｒｉｎｇ社からのオーピーユーエス（Ｏｐｕｓ）（Ｒ）トロポニンＩ測定では、
捕捉体および検出体としてポリクローナル抗体を利用し、測定範囲０−３００ｎ
ｇ／ｍｌ、感度１ｎｇ／ｍｌおよびカットオフ値２ｎｇ／ｍｌ。
【００２９】 上にあげた測定法の間の方法論および成分における相異のゆえに、キャリブレ
ーター／対照は測定間で相互交換性がない。例えば、心筋トロポニンＩからのＮ
末端ペプチドを使用する、Ｓｔｒａｔｕｓ（Ｒ）キャリブレーター／対照はＡｃ
ｃｅｓｓ（Ｒ）およびＯｐｕｓ（Ｒ）測定では検出できない、と云うのは、後者
の測定の抗体は対照／キャリブレーターに使用されたトロポニンＩの同じＮ末端
ペプチド部分に向けられていないからである。反対に、Ａｃｃｅｓｓ（Ｒ）測定
の対照は、これはＡｃｃｅｓｓ（Ｒ）測定において、３つの測定系のなかで最高
の感度のレベルとカットオフ値を有して検出されるが、Ｏｐｕｓ（Ｒ）測定にお
けるより約４倍高く測定できる。対照的に、Ｏｐｕｓ（Ｒ）測定対照はＳｔｒａ
ｔｕｓ（Ｒ）測定によっては貧弱にしか検出されない。これらの結果は、測定間
で測定キャリブレーター／対照に相互交換性は不可能であり、一つの製造会社の
測定の対照によって提供された価は、同じ測定において動く測定を解釈するのに
しか使えない。この貧弱な関係は、更に、図２に示したグラフによって支えられ
る、それは、Ａｃｃｅｓｓ（Ｒ）、Ｓｔｒａｔｕｓ（Ｒ）およびＯｐｕｓ（Ｒ）
測定を使って心臓発作を受けている患者において、一連のトロポニンＩレベルを
測定したものを描いている。図示したように、３測定とも全て、１時間目と６時
間目の間のトロポニンＩレベルにおいて顕著な上昇と下降を示しているが、各時
間点でのトロポニンＩの絶対値は非常に異なっている。これらの広い相異は、上
に詳述したように、測定の個性とそれらのキャリブレーター／対照に帰せられる
。
ーター／対照は測定間で相互交換性がない。例えば、心筋トロポニンＩからのＮ
末端ペプチドを使用する、Ｓｔｒａｔｕｓ（Ｒ）キャリブレーター／対照はＡｃ
ｃｅｓｓ（Ｒ）およびＯｐｕｓ（Ｒ）測定では検出できない、と云うのは、後者
の測定の抗体は対照／キャリブレーターに使用されたトロポニンＩの同じＮ末端
ペプチド部分に向けられていないからである。反対に、Ａｃｃｅｓｓ（Ｒ）測定
の対照は、これはＡｃｃｅｓｓ（Ｒ）測定において、３つの測定系のなかで最高
の感度のレベルとカットオフ値を有して検出されるが、Ｏｐｕｓ（Ｒ）測定にお
けるより約４倍高く測定できる。対照的に、Ｏｐｕｓ（Ｒ）測定対照はＳｔｒａ
ｔｕｓ（Ｒ）測定によっては貧弱にしか検出されない。これらの結果は、測定間
で測定キャリブレーター／対照に相互交換性は不可能であり、一つの製造会社の
測定の対照によって提供された価は、同じ測定において動く測定を解釈するのに
しか使えない。この貧弱な関係は、更に、図２に示したグラフによって支えられ
る、それは、Ａｃｃｅｓｓ（Ｒ）、Ｓｔｒａｔｕｓ（Ｒ）およびＯｐｕｓ（Ｒ）
測定を使って心臓発作を受けている患者において、一連のトロポニンＩレベルを
測定したものを描いている。図示したように、３測定とも全て、１時間目と６時
間目の間のトロポニンＩレベルにおいて顕著な上昇と下降を示しているが、各時
間点でのトロポニンＩの絶対値は非常に異なっている。これらの広い相異は、上
に詳述したように、測定の個性とそれらのキャリブレーター／対照に帰せられる
。
【００３０】 トロポニンＩおよびトロポニンＣを含む本発明の一本鎖ポリペプチドは、トロ
ポニンＩまたはトロポニンＣに対し親和性を有する、抗体をふくめたタンパク質
およびその他の物質の生成に使用することができる。例えば、本発明の一本鎖ポ
リペプチドは、不溶性マトリックスまたはポリマーに共有結合させ、クロマトグ
ラフィカラムに位置される。トロポニンに結合する物質を含むと思われる細胞ま
たは組織抽出物、あるいはトロポニンに対してあげられた抗体調製物、をカラム
に通過させ、共有結合したポリペプチドに吸着させる。マトリックスを洗浄後、
吸着した物質は濃塩類溶液、カオトロピック試薬、あるいはタンパク質精製に使
われる他の標準方法、を用いて溶出され得る。
ポニンＩまたはトロポニンＣに対し親和性を有する、抗体をふくめたタンパク質
およびその他の物質の生成に使用することができる。例えば、本発明の一本鎖ポ
リペプチドは、不溶性マトリックスまたはポリマーに共有結合させ、クロマトグ
ラフィカラムに位置される。トロポニンに結合する物質を含むと思われる細胞ま
たは組織抽出物、あるいはトロポニンに対してあげられた抗体調製物、をカラム
に通過させ、共有結合したポリペプチドに吸着させる。マトリックスを洗浄後、
吸着した物質は濃塩類溶液、カオトロピック試薬、あるいはタンパク質精製に使
われる他の標準方法、を用いて溶出され得る。
【００３１】 本発明の一本鎖ポリペプチドは、動物の免疫またはハイブリドーマ調製の標準
的方法を使用して、モノクローナルまたはポリクローナル抗トロポニン抗体の調
製に使用することができる。
的方法を使用して、モノクローナルまたはポリクローナル抗トロポニン抗体の調
製に使用することができる。
【００３２】 トロポニンＩおよびトロポニンＣを含む本発明の一本鎖ポリペプチドは、感度
のあるトロポニン測定のための調製物、およびそのような測定の補正に有用であ
る。以下の非限定的実施例からみられるように、一本鎖ポリペプチドは、他のト
ロポニンキャリブレーターに比較するとき優れた性能を示す。
のあるトロポニン測定のための調製物、およびそのような測定の補正に有用であ
る。以下の非限定的実施例からみられるように、一本鎖ポリペプチドは、他のト
ロポニンキャリブレーターに比較するとき優れた性能を示す。
【００３３】 実施例１ Ｅ．ｃｏｌｉでの一本鎖ヒト心筋トロポニンＩ−トロポニンＣポリペプチドの
発現 ヒト心筋トロポニンＩおよびトロポニンＣｃＤＮＡｓを、公知の心筋トロポニ
ンＩｃＤＮＡ配列（Ｖａｌｌｉｎｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２７０，５
７−６１［１９９０］）およびトロポニンＣ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣ：Ｘ０
７８９７）からデザインしたプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）によってクローニングした。トロポニンＩｃＤＮＡのＣ末端を、各末端に独
特の制限部位を遺伝子工学処理した（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３をコードする合成リン
カー［それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の遺伝
子およびペプチド配列］を通じてトロポニンＣｃＤＮＡのＮ末端に連結した。一
本鎖トロポニンＩ−ＣｃＤＮＡ構造体は、ＤＮＡシーケンシングによって確認し
、発現ベクターｐＥＴ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングされた。Ｎｏｖａ
ｇｅｎから得たＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、得られたプラスミドで
形質転換し、タンパク質発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノアッセイの両者に
よって実証した。上記した一本鎖ポリペプチドは分子量４３，７００ダルトンを
有する。遺伝子およびポリペプチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３お
よびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す。
発現 ヒト心筋トロポニンＩおよびトロポニンＣｃＤＮＡｓを、公知の心筋トロポニ
ンＩｃＤＮＡ配列（Ｖａｌｌｉｎｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２７０，５
７−６１［１９９０］）およびトロポニンＣ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣ：Ｘ０
７８９７）からデザインしたプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）によってクローニングした。トロポニンＩｃＤＮＡのＣ末端を、各末端に独
特の制限部位を遺伝子工学処理した（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３をコードする合成リン
カー［それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の遺伝
子およびペプチド配列］を通じてトロポニンＣｃＤＮＡのＮ末端に連結した。一
本鎖トロポニンＩ−ＣｃＤＮＡ構造体は、ＤＮＡシーケンシングによって確認し
、発現ベクターｐＥＴ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングされた。Ｎｏｖａ
ｇｅｎから得たＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、得られたプラスミドで
形質転換し、タンパク質発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノアッセイの両者に
よって実証した。上記した一本鎖ポリペプチドは分子量４３，７００ダルトンを
有する。遺伝子およびポリペプチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３お
よびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す。
【００３４】 一本鎖トロポニンＩ−トロポニンＣポリペプチドを発現するＥ．ｃｏｌｉ株は
寄託され、ＡＴＣＣ番号 を有する。
寄託され、ＡＴＣＣ番号 を有する。
【００３５】 実施例２ トロポニン測定におけるポリペプチドの安定性および有用性 実施例１記載の一本鎖トロポニンＩ−Ｃおよび天然の心筋トロポニンＩおよび
トロポニンＣから形成した複合体を、Ｓｔｒａｔｕｓ（Ｒ）、およびＡｃｃｅｓ
ｓ（Ｒ）測定法で、各測定の製造者の指示手順に従って、評価した。結果は、以
下の通りであった。
トロポニンＣから形成した複合体を、Ｓｔｒａｔｕｓ（Ｒ）、およびＡｃｃｅｓ
ｓ（Ｒ）測定法で、各測定の製造者の指示手順に従って、評価した。結果は、以
下の通りであった。
【００３６】
【表１】
【００３７】 これらの結果は、トロポニンＩおよびトロポニンＣを含む一本鎖ポリペプチド
は、天然の心筋トロポニンＩ−トロポニンＣ複合体と類似した測定結果を与え、
そこにおいて、Ｓｔｒａｔｕｓ（Ｒ）測定は類似した高値を、そしてＡｃｃｅｓ
ｓ（Ｒ）測定は同様の低値をつくった。
は、天然の心筋トロポニンＩ−トロポニンＣ複合体と類似した測定結果を与え、
そこにおいて、Ｓｔｒａｔｕｓ（Ｒ）測定は類似した高値を、そしてＡｃｃｅｓ
ｓ（Ｒ）測定は同様の低値をつくった。
【００３８】 実施例３ 一本鎖トロポニンＩ−Ｃポリペプチドの安定性 トロポニンＩを含む３つの調製物の安定性を４℃、７日間貯蔵の間、行った。
調製物は、（１）標準法で調製した組換えトロポニンＩ；（２）組換えトロポニ
ンＩおよび組換えＣの非共有結合複合体、および（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
に示すような、間に挟まれたリンカーペプチドを有するトロポニンＩおよびトロ
ポニンＣを含む一本鎖ポリペプチド、であった。組換えトロポニンＩおよび組換
えトロポニンＣの非共有結合複合体は、ここに文献として取り入れられている、
同時継続および普通に所有されている出願、Ｓｅｒ．Ｎｏ． （代理人
整理番号Ｎｏ．１１１２−１−０４４ＣＩＰ）、１９９７年１０月３１日出願、
の方法によって調製された。簡単に云うと、ヒト心筋トロポニンＣおよび修飾ト
ロポニンＩをＥ．ｃｏｌｉで発現させた。トロポニンＩは、その発現を増加させ
るために、６つの付加的Ｎ末端アミノ酸残基と組替え産物として遺伝子工学処理
した。尿素の存在下、修飾トロポニンＩは、トロポニンＣ、ＣａＣｌ２およびＭ
ｇＣｌ２と結合させた、そしてトロポニンＩ−トロポニンＣ複合体の形成を促進
するためゆっくりと振とうした。
調製物は、（１）標準法で調製した組換えトロポニンＩ；（２）組換えトロポニ
ンＩおよび組換えＣの非共有結合複合体、および（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
に示すような、間に挟まれたリンカーペプチドを有するトロポニンＩおよびトロ
ポニンＣを含む一本鎖ポリペプチド、であった。組換えトロポニンＩおよび組換
えトロポニンＣの非共有結合複合体は、ここに文献として取り入れられている、
同時継続および普通に所有されている出願、Ｓｅｒ．Ｎｏ． （代理人
整理番号Ｎｏ．１１１２−１−０４４ＣＩＰ）、１９９７年１０月３１日出願、
の方法によって調製された。簡単に云うと、ヒト心筋トロポニンＣおよび修飾ト
ロポニンＩをＥ．ｃｏｌｉで発現させた。トロポニンＩは、その発現を増加させ
るために、６つの付加的Ｎ末端アミノ酸残基と組替え産物として遺伝子工学処理
した。尿素の存在下、修飾トロポニンＩは、トロポニンＣ、ＣａＣｌ２およびＭ
ｇＣｌ２と結合させた、そしてトロポニンＩ−トロポニンＣ複合体の形成を促進
するためゆっくりと振とうした。
【００３９】 ３つの調製物は普通のヒト血清に貯蔵した。トロポニンはＤａｄｅＳｔｒａｔ
ｕｓＩＩ（Ｒ）測定を使って測定した。
ｕｓＩＩ（Ｒ）測定を使って測定した。
【００４０】 図３に示すように、組換えトロポニンＩおよび組換え複合体は、７日間の期間
に亙って変化しやすい測定性を示し、前者は最初上昇し、そして下降した、およ
び後者は試験期間中に亙ってゆっくりと上昇した。これらの調製物は、それゆえ
、不安定である。対照的に、一本鎖トロポニンＩ−トロポニンＣペプチドは、試
験期間中に亙って、一定した免疫検出性を保ち、物質の安定性を明らかに示した
。
に亙って変化しやすい測定性を示し、前者は最初上昇し、そして下降した、およ
び後者は試験期間中に亙ってゆっくりと上昇した。これらの調製物は、それゆえ
、不安定である。対照的に、一本鎖トロポニンＩ−トロポニンＣペプチドは、試
験期間中に亙って、一定した免疫検出性を保ち、物質の安定性を明らかに示した
。
【００４１】 本発明は、特定の実施態様、種々の特定の物質、方法および実施例を参照する
ことによって、ここに記載され、説明されたが、本発明は、特定の物質、物質の
組み合わせ、およびその目的のために選択された方法、に制限されるものではな
いと理解される。実際、ここに記載されたのに加えて本発明の種々の変形は、先
の記載および付属する図から当業者に明らかになるであろう。そのような変形は
付属する特許請求の範囲内にあるものと意図される。
ことによって、ここに記載され、説明されたが、本発明は、特定の物質、物質の
組み合わせ、およびその目的のために選択された方法、に制限されるものではな
いと理解される。実際、ここに記載されたのに加えて本発明の種々の変形は、先
の記載および付属する図から当業者に明らかになるであろう。そのような変形は
付属する特許請求の範囲内にあるものと意図される。
【００４２】 先行文献にたいする種々の引用は、本明細書を通してあげられてきたが、それ
らはここにその全部を参照することによってとり入れられている。
らはここにその全部を参照することによってとり入れられている。
【図１】 図１は、１９アミノ酸残基のリンカーペプチドによって分離されたトロポニン
ＩおよびトロポニンＣを含む一本鎖ポリペプチドの、ＤＮＡおよびアミノ酸配列
（それぞれＳＥＣ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を示したも
のである。ヌクレオチド１から６３０はトロポニンＩを含み、ヌクレオチド６３
１から６８７はリンカーペプチド配列を含み、そしてヌクレオチド６８８から１
１７０はトロポニンＣの配列を含む。
ＩおよびトロポニンＣを含む一本鎖ポリペプチドの、ＤＮＡおよびアミノ酸配列
（それぞれＳＥＣ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を示したも
のである。ヌクレオチド１から６３０はトロポニンＩを含み、ヌクレオチド６３
１から６８７はリンカーペプチド配列を含み、そしてヌクレオチド６８８から１
１７０はトロポニンＣの配列を含む。
【図２】 図２は、心臓発作を受けた患者からのトロポニンＩについて、１時間ごとの測
定結果を示す。トロポニンＩはＳｔｒａｔｕｓ（Ｒ）、Ａｃｃｅｓｓ（Ｒ）およ
びＯｐｕｓ（Ｒ）測定法を使用して測定された。
定結果を示す。トロポニンＩはＳｔｒａｔｕｓ（Ｒ）、Ａｃｃｅｓｓ（Ｒ）およ
びＯｐｕｓ（Ｒ）測定法を使用して測定された。
【図３】 図３は、トロポニンＩを含有する、異なった調製物の４℃における、時間に亙
る安定性を示す：組換えトロポニンＩ、トロポニンＩとトロポニンＣの非共有結
合複合体、およびトロポニンＩおよびトロポニンＣを含む本発明の一本鎖ポリペ
プチド。
る安定性を示す：組換えトロポニンＩ、トロポニンＩとトロポニンＣの非共有結
合複合体、およびトロポニンＩおよびトロポニンＣを含む本発明の一本鎖ポリペ
プチド。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ソン，キアンーリイ カナダ国、エム３シイ ３エイ３ オンタ リオ、ノースヨーク、エッジクリフ ゴル フウェイ 10、アパートメント 1905 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 DA13 DA36 FB02 FB03 FB05 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA07 CA10 CA20 DA06 EA04 GA11 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA40 EA20 EA50 FA74
Claims (16)
- 【請求項１】 心筋トロポニンＩおよび心筋トロポニンＣを含む一本鎖ポリ
ペプチドをコードする遺伝子配列。 - 【請求項２】 リンカーポリペプチド配列に対するリンカー遺伝子配列が、
心筋トロポニンＩと心筋トロポニンＣの遺伝子配列の間に挟まれている、請求項
１記載の遺伝子配列。 - 【請求項３】 請求項１または２記載の遺伝子配列を含む複製し得るクロー
ニングまたは発現ベヒクル。 - 【請求項４】 プラスミドである請求項３記載のベヒクル。
- 【請求項５】 請求項３記載のベヒクルで形質転換された宿主細胞。
- 【請求項６】 請求項１または２記載の遺伝子配列を含む複製し得るクロー
ニングまたは発現ベヒクルで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ。 - 【請求項７】 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）として同定された請求項２記載
の遺伝子配列。 - 【請求項８】 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示された配列を有する複製し
得るクローニングまたは発現ベヒクル。 - 【請求項９】 請求項８記載のベヒクルで形質転換された宿主細胞。
- 【請求項１０】 Ｅ．ｃｏｌｉである請求項９記載の宿主細胞。
- 【請求項１１】 ＡＴＣＣ として同定された請求項１０記載のＥ．ｃ
ｏｌｉ。 - 【請求項１２】 遺伝子リンカー配列が、約１８から約１５０ヌクレオチド
を含む請求項２記載の遺伝子配列。 - 【請求項１３】 心筋トロポニンＩと心筋トロポニンＣを含む一本鎖ポリペ
プチド。 - 【請求項１４】 ペプチドリンカー配列が、心筋トロポニンＩと心筋トロポ
ニンＣの間に挟まれた、請求項１３記載のポリペプチド。 - 【請求項１５】 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に記載のアミノ酸配列を有す
る請求項１４記載のポリペプチド。 - 【請求項１６】 ペプチドリンカー配列が約６乃至５０のアミノ酸を有する
請求項１３記載のポリペプチド。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/993,380 | 1997-12-18 | ||
| US08/993,380 US6077676A (en) | 1997-12-18 | 1997-12-18 | Single-chain polypeptides comprising troponin I and troponin C |
| PCT/IB1998/002095 WO1999031235A1 (en) | 1997-12-18 | 1998-12-18 | Single-chain polypeptides comprising troponin i and troponin c |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002508181A true JP2002508181A (ja) | 2002-03-19 |
| JP2002508181A5 JP2002508181A5 (ja) | 2006-01-05 |
| JP4328019B2 JP4328019B2 (ja) | 2009-09-09 |
Family
ID=25539476
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000539135A Expired - Lifetime JP4328019B2 (ja) | 1997-12-18 | 1998-12-18 | トロポニンｉおよびトロポニンｃを含む一本鎖ポリペプチド |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6077676A (ja) |
| EP (1) | EP1037976B1 (ja) |
| JP (1) | JP4328019B2 (ja) |
| AT (1) | ATE309351T1 (ja) |
| AU (1) | AU1444699A (ja) |
| CA (1) | CA2315282C (ja) |
| DE (1) | DE69832299T2 (ja) |
| ES (1) | ES2253835T3 (ja) |
| WO (1) | WO1999031235A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2756827B1 (fr) * | 1996-12-05 | 1999-01-29 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Composes synthetiques biepitopiques utilisables comme etalons dans les dosages biologiques de la troponine i |
| US6475785B1 (en) * | 1997-12-18 | 2002-11-05 | Spectral Diagnostics, Inc. | Single-chain polypeptides comprising troponin I N-terminal fragments and troponin C |
| AU6117099A (en) | 1998-10-21 | 2000-05-08 | Spectral Diagnostics Inc. | Cardiac troponin i polypeptide fragments and uses in diagnostics |
| US7078486B2 (en) * | 1999-12-10 | 2006-07-18 | Spectral Diagnostics, Inc. | Single-chain polypeptides comprising troponin I and troponin C |
| US20070141710A1 (en) * | 2005-12-20 | 2007-06-21 | Beckman Coulter, Inc. | Stable calibrators for immunoassays |
| US20110306148A1 (en) | 2010-06-14 | 2011-12-15 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Composition for use as an assay reagent |
| CN107245103A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-10-13 | 广西壮族自治区药用植物园 | 抗肿瘤重组蛋白ifti及其编码基因与应用 |
| CN107245102A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-10-13 | 广西壮族自治区药用植物园 | 抗肿瘤重组蛋白gpti及其编码基因与应用 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4892827A (en) * | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
| US5604105B1 (en) * | 1990-10-12 | 1999-08-24 | Spectral Diagnostics Inc | Method and device for diagnosingand distinguishing chest pain in early onset thereof |
| CA2027434C (en) * | 1990-10-12 | 1999-01-05 | George Jackowski | Diagnostic kit for diagnosing and distinguishing chest pain in early onset thereof |
| EP0651805B1 (en) * | 1992-07-17 | 2006-12-13 | Dana Farber Cancer Institute | Method of intracellular binding of target molecules |
| FR2701954B1 (fr) * | 1993-02-23 | 1995-07-07 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Composition stabilisée de troponine pour immunoessais et procédé de stabilisation de troponine pour immunoessais. |
| DE805821T1 (de) * | 1995-11-29 | 1998-05-14 | Dade Int Inc | MENSCHLICHES HERZ-CNBr TROPONIN I-ISOFORM UND DESSEN VERWENDUNG |
| FI104857B (fi) * | 1996-01-15 | 2000-04-14 | Hytest Oy | Sydänlihaksen soluvaurioiden asteen mittaus immunokemiallisella menetelmällä sisältäen menetelmään soveliaat vasta-aineet |
| WO1997039132A1 (en) * | 1996-04-16 | 1997-10-23 | University Of Miami | Stabilized preparations of human troponins and modifications thereof, diagnostic assay methods and assay kits |
| US6072040A (en) * | 1996-10-15 | 2000-06-06 | Medical Analysis Systems, Inc. | Stabilized conjugates of uncomplexed subunits of multimeric proteins |
| US5834210A (en) * | 1997-05-23 | 1998-11-10 | Spectral Diagnostics, Inc. | Stable troponin subunits and complexes |
| WO1998054219A1 (en) * | 1997-05-29 | 1998-12-03 | Medical Analysis Systems Inc. | Covalently coupled troponin complexes |
-
1997
- 1997-12-18 US US08/993,380 patent/US6077676A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-12-18 AT AT98958383T patent/ATE309351T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-12-18 EP EP98958383A patent/EP1037976B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 WO PCT/IB1998/002095 patent/WO1999031235A1/en active IP Right Grant
- 1998-12-18 JP JP2000539135A patent/JP4328019B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 AU AU14446/99A patent/AU1444699A/en not_active Abandoned
- 1998-12-18 CA CA2315282A patent/CA2315282C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 ES ES98958383T patent/ES2253835T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 DE DE69832299T patent/DE69832299T2/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69832299D1 (de) | 2005-12-15 |
| ATE309351T1 (de) | 2005-11-15 |
| CA2315282C (en) | 2012-10-23 |
| US6077676A (en) | 2000-06-20 |
| EP1037976A1 (en) | 2000-09-27 |
| EP1037976B1 (en) | 2005-11-09 |
| JP4328019B2 (ja) | 2009-09-09 |
| CA2315282A1 (en) | 1999-06-24 |
| WO1999031235A1 (en) | 1999-06-24 |
| AU1444699A (en) | 1999-07-05 |
| DE69832299T2 (de) | 2006-08-10 |
| ES2253835T3 (es) | 2006-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Katus et al. | Development and in vitro characterization of a new immunoassay of cardiac troponin T | |
| Johnson et al. | A fluorescent probe study of Ca2+ binding to the Ca2+-specific sites of cardiac troponin and troponin C. | |
| JP3745380B2 (ja) | プリオンタンパク質に結合し、イソ型ＰｒＰ▲上ｃ▼とＰｒＰ▲上ｓｃ▼を識別することが可能なシャペロン | |
| US20220098248A1 (en) | Unstructured non-repetitive polypeptides having lcst behavior | |
| JP3360826B2 (ja) | コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの検出用のイムノアッセイ | |
| Barakat et al. | Mapping of epitopes on Ul snRNP polypeptide A with synthetic peptides and autoimmune sera | |
| US6268481B1 (en) | Covalently coupled troponin complexes | |
| JP4328019B2 (ja) | トロポニンｉおよびトロポニンｃを含む一本鎖ポリペプチド | |
| US6060278A (en) | Stable troponin subunits and complexes | |
| CA2381439C (en) | Single-chain polypeptides comprising troponin i n-terminal fragments and troponin c | |
| US7479278B2 (en) | Troponin I polypeptide fragments and uses thereof | |
| US7078486B2 (en) | Single-chain polypeptides comprising troponin I and troponin C | |
| WO2022075485A1 (ja) | コラーゲン様改変タンパク質及びその使用 | |
| WO1998054219A1 (en) | Covalently coupled troponin complexes | |
| JPH09218203A (ja) | 杭原Ｓｍ−Ｄのペプチドおよびその利用、特にＳＬＥの診断法への利用 | |
| JPH10513484A (ja) | ヒト心臓ＣＮＢｒトロポニンＩアイソ型及びその使用 | |
| US10689446B2 (en) | Recombinant CD74 polypeptides | |
| JP3824173B2 (ja) | 自己抗原 | |
| Sui et al. | Interaction of insulin-like growth factor binding protein-4, Miz-1, leptin, lipocalin-type prostaglandin D synthase, and granulin precursor with the N-terminal half of type III hexokinase | |
| US11492381B2 (en) | Quantitative enzyme-linked immunoassay (ELISA) to approximate complement fixing antibody titers in serum from patients with coccidioidomycosis | |
| JP2000304748A (ja) | 抗原蛋白質の検出方法 | |
| WO1999040204A1 (en) | Single-chain polypeptides comprising creatine kinase m and creatine kinase b | |
| AU782962B2 (en) | Compositions and methods for detecting stress-inducible proteins | |
| JPH01147369A (ja) | Ｓｍ−Ｂ／Ｂ’抗原、Ｓｍ−Ｂ／Ｂ’抗源のクローニングとＳｍ−Ｂ／Ｂ’抗源もしくはＳｍ−Ｂ／Ｂ’抗源とＳｍ−Ｄ抗源の混合物を使用した全身性紅斑性狼瘡の検出 | |
| WO1998049556A1 (fr) | Anticoprs reconnaissant des fragments de collagene |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050830 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050830 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080610 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080908 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080916 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081010 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20081010 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090120 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090416 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090423 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090511 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090609 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090612 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120619 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130619 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |