CN107245103A - 抗肿瘤重组蛋白ifti及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤重组蛋白IFTI及其编码基因与应用，提供抗肿瘤重组蛋白及其编码基因，以及高效表达该蛋白的方法，所述重组蛋白IFTI为心肌肌钙蛋白I的氨基端氨基酸残基与具有SEQ ID No.2中的氨基酸残基序列的人工短肽的羧基端氨基酸残基序列部分或全部相融合的蛋白质。本发明可作为药物在临床上用于治疗多种实体恶性肿瘤，具有高效、广谱、毒副作用小等特点，有望成为全新的抗肿瘤药物。

Description

抗肿瘤重组蛋白IFTI及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域。更具体地说，本发明涉及一种抗肿瘤重组蛋白IFTI及其编码基因与应用。

背景技术

恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。目前治疗癌症的常用方法有：外科手术治疗、化学药物疗法、放射治疗、生物疗法和中医中药疗法。其中以外科手术治疗、化学药物疗法、放射治疗最为常用。外科手术治疗作为大多数肿瘤治疗的首选和主要方案，使无数肿瘤患者得以康复、延长寿命或者提高了生活质量。但是，在肿瘤治疗方面，外科手术治疗只适用于一定条件和范围的病人，而且由于肿瘤可复发和转移的原因，手术切除并不都能达到根治的目的。化学药物疗法和放射治疗的运用在肿瘤的治疗方面也发挥着非常重要和必不可少的作用，并且也在不断的发展。但是，目前应用的化疗药物疗法和放射治疗对身体中所有活跃的增殖细胞都有侵害，如造血***、胃肠道等，所以放化疗的病人常有血象降低、胃肠道出血、恶心、呕吐等症状。而且，由于受到病人机体和精神方面承受力及肿瘤细胞出现耐药性等多方面原因的限制，放化疗并不能杀死所有的肿瘤细胞，为肿瘤的复发和转移及疾病的恶化留下了隐患。生物疗法和中医中药疗法也是抗肿瘤的合理的方法，但仍需继续研究以提高疗效。因此，开发有明显治疗效果、安全的抗肿瘤药物已经成为医药界面临的一项迫在眉睫的任务。

研究表明，恶性实体肿瘤的无限制侵袭性生长及其转移依赖于新血管的不断生成，所以抑制血管生成能显著地抑制肿瘤的生长。抑制血管生成,阻断瘤体血液供应是不同于常规抗肿瘤治疗的新策略，也称为“肿瘤饥饿疗法”,已经成为抗肿瘤治疗研究的热点。正常生理状态下,除了女性生殖***在***，黄体生成，怀孕等过程，有短暂的新生血管生成过程外，成年人的脉管***增生处于相对静止状态。但是在肿瘤组织中,为适应瘤组织的快速生长,血管生成非常活跃,以及时为瘤组织生长供应血液。肿瘤组织中的微血管来源有两种：一种是肿瘤细胞等产生的血管内皮生长因子，诱导瘤体生成微血管；另一种是残存于瘤体的宿主血管逐渐变为肿瘤血管，既宿主血管的肿瘤化。与正常血管不同，肿瘤血管的血管内皮细胞不完整，基底膜稀疏且易于泄露。肿瘤血管生成后不再进一步分化改建成动脉及静脉，无平滑肌及神经末梢，属于被动血管，其血流完全依赖于体循环。新生的微血管是肿瘤浸润和转移的第一站，肿瘤细胞通过肿瘤微血管壁进入血液循环向远处转移。

实体肿瘤生长需要大量的血液供应。许多实验研究证实抑制动物体内新血管生成，可有效地切断为肿瘤生长提供养分的血液供应，使瘤体萎缩以至消失。抗新生血管药物TNP-470以及抗bFGF、VEGF单克隆抗体的应用，突变型VEGF受体FlK-1竞争性阻断VEGF信号传导，αVβ3过度表达诱导内皮细胞凋亡、以及Angiostatin特异抑制肿瘤新生血管形成等，均可抑制肿瘤生长,是一种新型的、有前途的抗肿瘤药物,可以弥补当前临床肿瘤治疗手段的局限并取代部分治疗手段。由于这类药物是通过抑制新生血管的形成来达到抑制肿瘤生长的，而人的正常组织细胞的生长不依赖于新生血管的生成，所以对正常组织几乎没有毒副作用。这类药物不直接作用于肿瘤细胞，故抑制肿瘤具有广谱性而不产生抗药性，是当前国际上公认的有效、安全、有前途的抗肿瘤药物。它主要用于原位和转移实体瘤的治疗和辅助肿瘤的手术治疗，也可以用来防止肿瘤的复发和转移。因此，开发具有血管增生抑制作用的抗肿瘤药物，在恶性肿瘤的防治方面，具有重要的临床意义。

心肌肌钙蛋白I是心肌肌钙蛋白的亚基，目前常被用作心肌梗塞诊断的标志物，心肌肌钙蛋白I是序列表中的SEQ ID No.1，由210个氨基酸残基组成，现已通过实验研究(中国专利：ZL03109861.4)证实心肌肌钙蛋白I具有明显的抑制血管内皮细胞生长和抗肿瘤作用。

大肠杆菌表达***是用于表达外源蛋白的最成功的表达***之一，近年来发展非常迅速，目前已有几百种蛋白在该表达***中得以表达，其生长迅速，培养条件简单，可以高密度连续培养，技术已相当成熟，是工业生产中常用的高表达菌种。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗肿瘤重组蛋白IFTI及其编码基因与应用，提供抗肿瘤重组蛋白及其编码基因，以及高效表达该蛋白的方法，所述重组蛋白IFTI为心肌肌钙蛋白I的氨基端氨基酸残基与具有SEQ ID No.2中的氨基酸残基序列的人工短肽的羧基端氨基酸残基序列部分或全部相融合的蛋白质，本发明的重组蛋白IFTI可作为药物在临床上用于治疗多种实体恶性肿瘤，具有高效、广谱、毒副作用小等特点，有望成为全新的抗肿瘤药物。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种抗肿瘤重组蛋白IFTI，所述重组蛋白IFTI为心肌肌钙蛋白I的氨基端氨基酸残基与具有SEQ ID No.2中的氨基酸残基序列的人工短肽的羧基端氨基酸残基序列部分或全部相融合的蛋白质。

优选的是，所述重组蛋白IFTI为心肌肌钙蛋白I的第一个氨基酸的氨基与具有SEQID No.2中的氨基酸残基序列的人工短肽的末端氨基酸的羧基结合形成的蛋白质。

优选的是，所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI中，所述心肌肌钙蛋白I为SEQ ID No.1中的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.1中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有与SEQ ID No.1中的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No.4中的氨基酸残基序列衍生的蛋白质。

优选的是，所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI中，所述人工短肽为SEQ ID No.2中的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.2中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有与SEQ ID No.2中相同活性的由SEQ ID No.2衍生的短肽。

优选的是，所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI中，所述心肌肌钙蛋白I为氨基端氨基酸残基的起始位点在SEQ ID No.1中的序列1-152中的任意部位的氨基酸残基。

优选的是，所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI中，所述人工短肽为氨基端氨基酸残基的起始位点在SEQ ID No.2中的序列1-20中的任意部位的氨基酸残基。

优选的是，所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI中，所述心肌肌钙蛋白I和所述人工短肽通过甘氨酸和丝氨酸形成的二肽连接，所述二肽的基因编码序列为GGATCC。

一种抗肿瘤重组蛋白IFTI的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

a、编码序列表中SEQ ID No.1蛋白质序列的多核苷酸或与其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

b、编码序列表中SEQ ID No.2蛋白质序列的多核苷酸或与其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

c、含有所述a和所述b中的基因的表达载体及细胞系。

一种抗肿瘤重组蛋白IFTI在大肠杆菌中的高效表达方法，包括以下步骤：

步骤一、选用大肠杆菌优选密码子，设计并合成SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的部分或全部序列的融合蛋白基因序列；

步骤二、将步骤一中合成的基因片段分别与载体pET21b连接，得到表达质粒，转化大肠杆菌后获得表达工程菌；

步骤三、培养步骤二中得到的工程菌，表达产物，获得目标蛋白。

优选的是，所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI在大肠杆菌中的高效表达方法中，所述大肠杆菌优选为BL21-DE3大肠杆菌。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明的重组蛋白IFTI的毒副作用小，引入肿瘤饥饿疗法的全新概念，通过特异性抑制血管内皮细胞的增生，阻断新血管的生成，从而使瘤细胞缺乏营养，不能生长进而死亡,对正常组织无影响；同时由于其为蛋白类药物，毒副作用小，明显区别于目前临床使用的抗肿瘤药物。

本发明的重组蛋白IFTI的抗肿瘤活性高，抑瘤率高达86％，并导致部分瘤体消失。

本发明的重组蛋白IFTI的抗瘤谱广：本发明可用于所有的实体肿瘤，无组织选择性，因此其适用范围很广，包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、***肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、依汶氏瘤、平滑肌肉瘤、眼眶横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、麟状上皮细胞癌、基质细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳突腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、***细胞瘤、胚胎上皮癌、肾母细胞瘤、子***、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮细胞癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听觉神经瘤、少突胶质细胞瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

本发明提供的的表达方法得到的抗肿瘤重组蛋白占培养液总蛋白的30-70％，表达过程操作简单，产品成本较低，可用于规模化生产，对于开发新的抗肿瘤药物具有重要意义。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的IPTG诱导后的BL21-DE3大肠杆菌培养液初纯产物IFTI电泳图谱。

具体实施方式

一种抗肿瘤重组蛋白IFTI，所述重组蛋白IFTI为心肌肌钙蛋白I的氨基端氨基酸残基与具有SEQ ID No.2中的氨基酸残基序列的人工短肽的羧基端氨基酸残基序列部分或全部相融合的蛋白质。

所述重组蛋白IFTI为心肌肌钙蛋白I的第一个氨基酸的氨基与具有SEQ ID No.2中的氨基酸残基序列的人工短肽的末端氨基酸的羧基结合形成的蛋白质。

所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI中，所述心肌肌钙蛋白I为SEQ ID No.1中的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.1中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有与SEQ ID No.1中的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No.4中的氨基酸残基序列衍生的蛋白质。

所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI中，所述人工短肽为SEQ ID No.2中的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.2中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有与SEQ ID No.2中相同活性的由SEQ ID No.2衍生的短肽。

所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI中，所述心肌肌钙蛋白I为氨基端氨基酸残基的起始位点在SEQ ID No.1中序列1-152中的任意部位的氨基酸残基；例如以下组合：心肌肌钙蛋白I的氨基端氨基酸残基的起始位点在SEQ ID No.1中序列1-210，其与由SEQ ID No.2衍生的短肽的羧基端氨基酸残基与SEQ ID No.1中序列1的氨基端氨基酸残基相融合形成的人工短肽融合形成融合蛋白；心肌肌钙蛋白I的氨基端氨基酸残基的起始位点在SEQ ID No.1中序列101-210，其与由SEQ ID No.2衍生的短肽的羧基端氨基酸残基与SEQ ID No.101中序列1的氨基端氨基酸残基相融合形成的人工短肽融合形成融合蛋白；所述心肌肌钙蛋白I的氨基端氨基酸残基的起始位点在SEQ ID No.1中序列153-210，其与由SEQ ID No.2衍生的短肽的羧基端氨基酸残基与SEQ ID No.1中序列153的氨基端氨基酸残基相融合形成的人工短肽融合形成融合蛋白。

所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI中，所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI中，所述人工短肽为氨基端氨基酸残基的起始位点在SEQ ID No.2中的序列1-20中的任意部位的氨基酸残基；例如以下组合：SEQ ID No.1中的氨基端氨基酸残基与SEQ ID No.2中序列1-23的羧基端氨基酸残基相融合形成心肌肌钙蛋白I，其与SEQ ID No.2中序列1-23的氨基酸残基融合形成融合蛋白；SEQ ID No.1中的氨基端氨基酸残基与SEQ ID No.2中序列16-23的羧基端氨基酸残基相融合形成心肌肌钙蛋白I，其与SEQ ID No.2中序列16-23的氨基酸残基融合形成融合蛋白；SEQ ID No.1中的氨基端氨基酸残基与SEQ ID No.2中序列20-23的羧基端氨基酸残基相融合形成心肌肌钙蛋白I，其与SEQ ID No.2中序列20-23的氨基酸残基融合形成融合蛋白；

所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI中，所述心肌肌钙蛋白I和所述人工短肽通过甘氨酸和丝氨酸形成的二肽连接，所述二肽的基因编码序列为GGATCC。

一种抗肿瘤重组蛋白IFTI的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

a、编码序列表中SEQ ID No.1蛋白质序列的多核苷酸或与其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

b、编码序列表中SEQ ID No.2蛋白质序列的多核苷酸或与其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

c、含有所述a和所述b中的基因的表达载体及细胞系。

一种抗肿瘤重组蛋白IFTI在大肠杆菌中的高效表达方法，包括以下步骤：

步骤一、选用大肠杆菌优选密码子，设计并合成SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的部分或全部序列的融合蛋白基因序列；

步骤二、将步骤一中合成的基因片段分别与载体pET21b连接，得到表达质粒，转化大肠杆菌后获得表达工程菌；

步骤三、培养步骤二中得到的工程菌，表达产物，获得目标蛋白。

所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI在大肠杆菌中的高效表达方法中，所述大肠杆菌优选为BL21-DE3大肠杆菌。

本技术方案将心肌肌钙蛋白I的部分或全部分子结构和人工短肽进行融合,合成新的具有抗肿瘤活性的蛋白质融和体。该融合体具有明显的抗小鼠实体肿瘤的作用，在恶性肿瘤的治疗方面，具有重要意义。

本技术方案得到的重组蛋白IFTI可用于治疗多种实体恶性肿瘤，包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、***肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、依汶氏瘤、平滑肌肉瘤、眼眶横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、麟状上皮细胞癌、基质细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳突腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、***细胞瘤、胚胎上皮癌、肾母细胞瘤、子***、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮细胞癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听觉神经瘤、少突胶质细胞瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

本技术方案中，需要的时候，在以上述抗肿瘤重组蛋白为活性成分的药物中，还可以加入一种或多种药学上可接受的载体，包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等，同时也可以制成注射液、冻干粉针剂等多种形式，上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

<实施例1>

抗肿瘤重组蛋白的大肠杆菌体外表达：

1、人工基因的合成：人工合成序列表中SEQ ID No.3(心肌肌钙蛋白I的编码基因)的部分或全长序列，并在其5’端加上BamH I、3’端加上NotI酶切位点，得到序列表中SEQ IDNo.3的克隆序列。设计并合成序列表中SEQ ID No.2人工短肽氨基酸残基编码基因的部分或全部核酸序列，并在其5’端加上NdeI、3’端加上BamH I酶切位点，得到序列表中SEQ IDNo.4的克隆序列。用BamH I分别酶切合成的人工短肽氨基酸残基编码基因的核酸序列和心肌肌钙蛋白I氨基酸残基编码基因的核酸序列，纯化、连接，合成融合蛋白的核酸序列。

2、抗肿瘤重组蛋白体外表达纯化

(1)将上述人工合成的全序列分别装入pGEM-T-EASY质粒内，构建pGEM-IFTIx克隆载体。

(2)表达质粒的构建

采用购自美国Novagen公司的高效表达质粒pET21b，用SnabI和NotI分别酶切pGEM-IFTI质粒和pET21b质粒，凝胶电泳收集目标片段，用T4DNA连接酶16℃过夜连接。经常规方法的转化，挑菌，扩增获得表达质粒pET-IFTIx。

(3)分别将质粒pET-IFTI经转化导入BL21-DE3大肠杆菌内，经培养，挑选，筛选等过程，获得单克隆菌。

(4)挑选的单克隆菌，接种于5ml培养基中，37℃过夜，然后转入1000ml培养基中，继续培养至OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度为1％、37℃诱导表达4小时。

(5)将培养的菌液8000g离心20分钟，收集菌体，每升菌液收集的菌体加入50ml裂解缓冲液(其中：Tris-HCl的浓度为50mmol/L，EDTA的浓度为1mmol/L，2-巯基乙醇的浓度为20mmol/L，氯化钠的浓度为100mmol/L)，室温放置30分钟，然后加入10％Triton-X-1002.5ml，加入0.1M PMSF0.25ml，37℃孵育15分钟，进行超声破碎，之后20000g离心20分钟，弃上清，沉淀加入20ml浓度为8mol/L尿素裂解缓冲液，搅拌30分钟，离心，收集上清。将含有cTnI的上清液在溶液A(其中：TEA/HCl Ph7.5的浓度为25mmol/L，尿素的浓度为8mol/L，EDTA的浓度为2mmol/L，DTT的浓度为1mmol/L)中室温下透析2-3小时，12000g 4℃离心30分钟。用溶液A平衡DEAE Sepharose柱，然后将离心上清液上样，以吸附杂蛋白，收集流出液。再用溶液A平衡CM Sepharose柱,用所收集的流出液上样，此时目的蛋白将被吸附在填料上，然后用溶液B(溶液A中加入氯化钠，其中氯化钠的浓度为1mol/L)将目的蛋白洗出。用分光光度法测定蛋白质含量。取纯化后的蛋白质溶液5ug，用12％SDS-PAGE电泳，并经考马斯亮兰染色。IFTI1(短肽20-23、GS二肽和心肌肌钙蛋白I全序列的融合蛋白)的结果如图1所示，所得的目的蛋白的纯度为96％。

<实施例2>

本发明抗肿瘤重组蛋白对培养血管内皮细胞增值功能的影响：

人脐静脉内皮细胞EVC304细胞株购自解放军军事医学科学院；RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Hyclone公司，其他试剂均购自Sigma公司，抗肿瘤重组蛋白(IFTI1)为纯度为96％的表达纯化产物。

ECV304细胞按内皮细胞常规法进行培养，将培养的生长正常的ECV304细胞按每孔5*104细胞分别接种于96孔板，37℃培养12小时后換含有序列IFTI 1的表达提纯的抗肿瘤重组蛋白5μg/ml的新鲜培养液，空白对照換含有等体积生理盐水的新鲜培养液，37℃继续培养36小时，用MTT法测定细胞增殖状态。取出96孔培养板，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续培养4小时后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔的吸光值。结果与空白对照组相比，IFTI的表达提纯的抗肿瘤重组蛋白5μg/ml的细胞增殖抑制率分别为86±7％。

<实施例3>

本发明抗肿瘤重组蛋白的小鼠体内抑瘤实验：取24只昆明小鼠，分为磷酸盐缓冲液和表达提纯液组,分别颈部皮下接种S180腹水细胞瘤株，三天后分别皮下注射磷酸盐缓冲液和表达提纯液1.0mg蛋白/kg,每隔12小时注射一次，连续注射7天。观察并切取瘤组织，称重，结果磷酸盐缓冲液和表达提纯液序列IFTI组瘤体重分别为1.09±0.31克和0.15±0.05克，抑瘤率为86.2％。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

<110>广西药用植物园

<120>抗肿瘤重组蛋白IFTI及其编码基因与应用

<160>16

<210>1

<211>210

<212>PRT

<213>人属人（Homo sapiens）

<220>

<223>

<400>1

Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala

1 5 10 15

Pro Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala

20 25 30

Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg

35 40 45

Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys Gln Glu

50 55 60

Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala

65 70 75

Leu Ser Thr Arg Cys Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe

80 85 90

Ala Glu Leu Gln Asp Leu Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp

95 100 105

Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr Asp Ile Glu Ala Lys Val Thr Lys

110 115 120

Asn Ile Thr Glu Ile Ala Asp Leu Thr Gln Lys Ile Phe Asp Leu

125 130 135

Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu Arg Arg Val Arg Ile Ser

140 145 150

Ala Asp Ala Met Met Gln Ala Leu Leu Gly Ala Arg Ala Lys Glu

155 160 165

Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val Lys Lys Glu Asp

170 175 180

Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg Lys Asn Ile

185 190 195

Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe Glu Ser

200 205 210

<210>2

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

EDKSPVPNEQCEKENSANEMASM

<210>3

<211>717

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

atgtcccgcc ctctttcaga ccaggataag agaaagcaaa tcagcgttcg tggcttagcc 60

ggagtggaaa atgtgtcggg atccatggcg gatgggagca gcgatgcggc tagggaacct 120

cgccctgcac cagccccaat cagacgccgc tcctccaact accgcgctta tgccacggag 180

ccgcacgcca agaaaaaatc taagatctcc gcctcgagaa aattgcagct gaagactctg 240

ctgctgcaga ttgcaaagca agagctggag cgagaggcgg aggagcggcg cggagagaag 300

gggcgcgctc tgagcacccg ctgccagccg ctggagttgg ccgggctggg cttcgcggag 360

ctgcaggact tgtgccgaca gctccacgcc cgtgtggaca aggtggatga agagagatac 420

gacatagagg caaaagtcac caagaacatc acggagattg cagatctgac tcagaagatc 480

tttgaccttc gaggcaagtt taagcggccc accctgcgga gagtgaggat ctctgcagat 540

gccatgatgc aggcgctgct gggggcccgg gctaaggagt ccctggacct gcgggcccac 600

ctcaagcagg tgaagaagga ggacaccgag aaggaaaacc gggaggtggg agactggcgc 660

aagaacatcg atgcactgag tggaatggag ggccgcaaga aaaagtttga gagctga 717

<210>4

<211>351

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

GAGGACAAGA GCCCCGTGCC TAACGAACAG TGCGAAAAGG AGAACTCCGC CAACGAAATGGCTAGCATG

Claims (10)

1.一种抗肿瘤重组蛋白IFTI，其特征在于，所述重组蛋白IFTI为心肌肌钙蛋白I的氨基端氨基酸残基序列与具有SEQ ID No.2中的氨基酸残基序列的人工短肽的羧基端氨基酸残基序列部分或全部相融合的蛋白质。

2.如权利要求1所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI，其特征在于，所述重组蛋白IFTI为心肌肌钙蛋白I的第一个氨基酸的氨基与具有SEQ ID No.2中的氨基酸残基序列的人工短肽的末端氨基酸的羧基结合形成的蛋白质。

3.如权利要求1所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI，其特征在于，所述心肌肌钙蛋白I为SEQID No.1中的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.1中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有与SEQ ID No.1中的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No.4中的氨基酸残基序列衍生的蛋白质。

4.如权利要求1所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI，其特征在于，所述人工短肽为SEQ IDNo.2中的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.2中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有与SEQ ID No.2中相同活性的由SEQ ID No.2衍生的短肽。

5.如权利要求3所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI，其特征在于，所述心肌肌钙蛋白I为氨基端氨基酸残基的起始位点在SEQ ID No.1中的序列1-152中的任意部位的氨基酸残基。

6.如权利要求4所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI，其特征在于，所述人工短肽为氨基端氨基酸残基的起始位点在SEQ ID No.2中的序列1-20中的任意部位的氨基酸残基。

7.如权利要求1所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI，其特征在于，所述心肌肌钙蛋白I和所述人工短肽通过甘氨酸和丝氨酸形成的二肽连接，所述二肽的基因编码序列为GGATCC。

8.一种如权利要求1-7中任一所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI的编码基因，其特征在于，是下列核苷酸序列之一：

a、编码序列表中SEQ ID No.1蛋白质序列的多核苷酸或与其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

b、编码序列表中SEQ ID No.2蛋白质序列的多核苷酸或与其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

c、含有所述a和所述b中的基因的表达载体及细胞系。

9.一种如权利要求1-7中任一所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI在大肠杆菌中的高效表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、选用大肠杆菌优选密码子，设计并合成SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的部分或全部序列的融合蛋白基因序列；

步骤二、将步骤一中合成的基因片段分别与载体pET21b连接，得到表达质粒，转化大肠杆菌后获得表达工程菌；

步骤三、培养步骤二中得到的工程菌，表达产物，获得目标蛋白。

10.如权利要求9所述的抗肿瘤重组蛋白IFTI在大肠杆菌中的高效表达方法，其特征在于，所述大肠杆菌优选为BL21-DE3大肠杆菌。