JP2002504994A

JP2002504994A - 抗アロタイプモノクローナル抗体を使用するイムノアッセイ

Info

Publication number: JP2002504994A
Application number: JP55016998A
Authority: JP
Inventors: エイチ．バルロウ，イブ
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1997-05-19
Filing date: 1998-05-15
Publication date: 2002-02-12
Also published as: US6146836A; WO1998053315A1; US6589756B1; AU7072998A

Abstract

(57)【要約】本発明は、液体試料において分析物の存在を検出するための改良されたイムノアッセイ技法を提供する。本発明のイムノアッセイ方法は、目的の分析物に特異的な一次結合タンパク質の捕獲試薬として抗アロタイプモノクローナル抗体を利用する。モノクローナル抗体は、一次結合タンパク質上に存在するアロタイプ決定基に高度に特異的である。捕獲試薬としての抗アロタイプモノクローナル抗体の使用は、部分的に、試料における内在性免疫グロブリンからの妨害が著しく減少するので、イムノアッセイの特異性および正確性のレベルの改良を提供する。本発明はさらに、抗アロタイプモノクローナル抗体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】抗アロタイプモノクローナル抗体を使用するイムノアッセイ発明の背景本発明は、体液のような液体試料において、薬物、ホルモン、または抗原のような分析物についてのイムノアッセイに関する。より詳細には、本発明は、捕獲試薬としてまたは検出試薬としての抗アロタイプモノクローナル抗体を使用する体液中の分析物の検出方法に関する。多くのタイプのリガンド−レセプターアッセイは、尿または血液血清のような体液中の種々の物質の存在を検出するために使用されている。これらのアッセイは、代表的には、抗原−抗体反応、および酵素、蛍光、化学発光、または放射性標識を含む合成結合体を含む。これらのアッセイの大部分には、選択されたリガンド（例えば、分析物または抗原）に特異的であるレセプター（例えば、抗体）、および抗原−抗体反応産物の存在および／または量を検出するための手段が存在する。大部分の現在のテストは、定量的決定を行うために設計されるが、いくつかの状況では、必要とされるすべてのものは陽性／陰性指示である。これらのイムノアッセイは、テスト液体中の目的のリガンドがしばしば少ない濃度であるため、非常に感度が高くなければならない。しかし、体液のテスト試料は、多くの成分を含み、そのいくつかはイムノアッセイを妨害し得る。例えば、試料に存在する内在性免疫グロブリンまたは補体タンパク質は、テスト免疫グロブリンと反応し得、誤った結果を生じる。試料に存在する免疫グロブリンまたは補体タンパク質は、イムノアッセイの一部である捕獲抗体である、分析物特異的結合タンパク質（これは一次抗体であり得る）と反応し得、それによって結合タンパク質への分析物の付着、および／または抗体（これは標識されるかまたは固体支持体に付着されるかのいずれかであり得る）への結合タンパク質の付着を妨げる。さらに、テスト試料中の補体タンパク質は、テスト中に形成される分析物抗体複合体に結合し得、そして捕獲抗体または標識抗体への結合タンパク質の付着を妨げ得る。アッセイ結果が読まれそして解釈される場合、これらは、使用されるアッセイ形式に依存して、分析物の間違った高いまたは低い濃度を示し得る。このような間違った結果は、医師が疾患状態を不適切に診断すること、または間違った方針の処置を処方することを導き得る。これらの問題のため、競合イムノアッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、および他の免疫学的検出方法は、妨害を減少させるために種々の技法を利用する。しかし、これらの技法は、これらの検出方法において遭遇する問題のすべてを解決していない。本発明の目的は、試料中の内在性成分に対するより低い感度を有する改良されたイムノアッセイ、ならびに目的の分析物についてのより優れた正確性および識別を提供することである。発明の要旨本発明は、体液中の分析物の存在を検出するための、迅速な感度の高いイムノアッセイを提供する。この方法は、高い感度および正確性、ならびに試料中の内在性免疫グロブリンおよび補体タンパク質の存在に対してより低い感度を有する。本発明の方法の使用は、信頼できる結果を再生可能に得るイムノアッセイを提供する。本発明は、患者試料、特にヒト患者からの試料における分析物の量を決定するためのイムノアッセイの正確性を改良する方法を提供する。本発明の方法は、試料において内在性免疫グロブリンおよび補体タンパク質に対するアッセイの感度を減少または排除することによってイムノアッセイから得られる結果の正確性および特異性を改良する。この方法は、目的の分析物を検出するために使用される一次結合タンパク質におけるアロタイプ決定基に特異的な抗体を、捕獲試薬としてまたは検出可能標識として提供する工程を包含する。一次結合タンパク質は、代表的には、固相に付着されないが、捕獲抗体は、代表的には、固相に付着される。しかし、いくつかのアッセイ形式では、一次結合タンパク質は、固相上の抗原に結合され、そして標識された抗体によって検出され得る。患者試料は、例えば、血液血清または血漿、尿、リンパ液または脳脊髄液であり得る。１つの実施態様では、この方法は、(a)患者試料を、(i)分析物に特異的な一次結合タンパク質、および(ii)この結合タンパク質に特異的な検出可能に標識されたトレーサー分子の既知量を組み合わせる工程；(b)分析物およびトレーサー分子を結合タンパク質に競合的に結合させることを可能にするために十分な条件下で、この組み合わせをインキュベートする工程；(c)この組み合わせを、一次結合タンパク質アロタイプに特異的なアロタイプ特異的捕獲抗体を固定している固相と接触させる工程；(d)結合タンパク質を捕獲抗体と結合させることを可能にするために十分な条件下でこの組み合わせをインキュベートする工程；(e)固相を試料から分離する工程；および(f)固相に結合した標識されたトレーサー分子の量を検出する工程を包含する。この方法では、分析物は、結合タンパク質上の結合部位について標識されたトレーサー分子と競合する。それゆえに、試料中に存在する分析物の濃度が大きいほど、より少ないトレーサー分子が結合タンパク質に結合する。得られるシグナルは、試料中の分析物の量に反比例する。存在する分析物の量は、標準曲線に対して得られる結果を比較することによって決定され得る。他の実施態様では、一次結合タンパク質および抗アロタイプ捕獲抗体の両方とも、試料中では遊離であり得る。この実施態様では、抗アロタイプ捕獲抗体は、捕獲可能な種、例えば、ビオチンと結合され得る。一次結合タンパク質、抗アロタイプ抗体、および既知量の標識されたトレーサーは、試料と組み合わされる。トレーサーは、実際の分析物、または結合タンパク質に匹敵する親和性を有するその画分もしくはアナログのいずれかであり得る。混合物は、分析物またはトレーサー分子を結合タンパク質と結合させることを可能にするために十分な時間インキュベートされる。次いで、混合物は、捕獲可能な種に特異的な捕獲成分を固定した固相と接触され、例えば、捕獲可能な種がビオチンである場合、捕獲成分はアビジンまたはストレプトアビジンであり得る。次いで、固相は、試料と分離され、そしてシグナルは、上記のように測定される。捕獲モノクローナル抗体を固定するための、アビジン−ビオチンのような親和性結合の使用は、本明細書に記載の異なるアッセイ形式のいずれかで利用され得る。基本的アッセイの変更は可能である、例えば、一次結合タンパク質は、固相に付着されるアロタイプ特異的抗体から分離している、反応混合物に添加され得る。あるいは、分析物自身であり得る分析物アナログは、一次結合タンパク質を複合体化するために試料からの分析物と競合するために固相に付着され得、これが、標識されたアロタイプ特異的抗体と反応する場合、固相の分離後に測定され得る標識された複合体を得る。さらに、これらの方法のそれぞれでは、いくつかの試薬は予め混合され得る。例えば、抗アロタイプ試薬は、患者試料との反応の前に、一次結合タンパク質と予め混合され得る。本発明の方法は、従来のサンドイッチアッセイ形式または他のイムノアッセイ形式を利用するために設計され得る。例えば、サンドイッチ技法の１つの実施態様では、一次結合タンパク質は、複合体を形成するために目的の分析物に結合する。この複合体は、次いで、固定された捕獲タンパク質に結合し、この実施態様では、捕獲タンパク質は、結合タンパク質上のアロタイプ決定基に特異的な二次抗体を含み、固定された捕獲タンパク質−一次結合タンパク質−分析物複合体を形成し、次いでこれは、「サンドイッチ」を形成するために標識された抗体と反応される。結合した複合体を含む固相は、次いで、試料から除去され、そして標識の量が測定される。本発明はさらに、この方法を行うための試薬を含む。１つの局面では、試薬は、分析物特異的一次抗体上のアロタイプ決定基に特異的な抗アロタイプモノクローナル抗体を固定した固相を含む。他の局面では、本発明は、イムノアッセイ法における捕獲または二次抗体としての使用のための抗アロタイプモノクローナル抗体を含む。抗アロタイプモノクローナル抗体の使用は、試料中に存在する内在性免疫グロブリンおよび補体タンパク質による妨害を最小にする非常に感度の高いアッセイシステムのファミリーの構築を可能にする。図面の簡単な説明本発明は、以下の添付の図面を参照および例示として、ここでより詳細に記載するが、これらに限定されない：図１は、固相上に固定された抗アロタイプIgG_2a特異的モノクローナル抗体への結合に対するIgG_2aの種々の一次抗体についての結合曲線を示すグラフである。図２は、捕獲抗体としてポリクローナル抗血清（...）、および捕獲抗体として抗アロタイプモノクローナル抗体（）を使用する試料中のテオフィリンレベルについてのイムノアッセイに対する標準化された結合曲線のグラフである。図３は、捕獲抗体としてポリクローナル抗血清（...）、および捕獲抗体として抗アロタイプモノクローナル抗体（）を使用する試料中のDHEA-Sについてのイムノアッセイに対する標準化された結合曲線のグラフである。発明の詳細な説明本発明の方法は、患者からのテスト試料中の、薬物またはホルモンのような分析物の存在の正確な再現可能な指標を達成するためのモノクローナル抗アロタイプ抗体の使用を包含する。この方法およびデバイスは、血液血清または血漿、脳脊髄液、リンパ液、尿、粘液または他の体液のような液体試料中の、あるいは組織イムノアッセイにおける組織中の分析物の存在を検出するために使用され得る。本発明のイムノアッセイ方法は、特定の分析物の非常に少量の存在について液体または組織試料を信頼可能にアッセイすることを可能にするが、試料中の内因性免疫グロブリンまたは補体タンパク質からの妨害を避けている。広くは、本発明の方法は、公知のイムノアッセイ手順を使用してこれまでアッセイされているか、またはポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、そのフラグメント、または他の結合タンパク質を使用してこのような手順によって検出可能になる、任意の分析物を検出するために使用され得る。本発明の実施に有用な種々の特異的アッセイ形式またはプロトコル、試薬、および分析物は、それ自体公知である。本発明に従って行われるアッセイの優れた感度および再現性の原因であると考えられる特徴は、分析物特異的一次結合タンパク質を捕獲するための捕獲試薬、または分析物特異的一次結合タンパク質を検出するための標識試薬としての、抗アロタイプ抗体の使用である。アロタイプ特異的抗体は、一次結合タンパク質におけるアロタイプ決定基に非常に特異的である。本発明のイムノアッセイは、一般的に、目的の分析物に特異的である一次結合タンパク質を、体液、組織試料、または他のテスト物質と接触させる工程によって行われる。一次結合抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体であるが、必要な分析物結合特性、および捕獲抗体によって認識され得るアロタイプ決定基を有する抗体フラグメント、レセプター、または操作されたタンパク質であり得る。好ましい実施態様では、一次結合タンパク質は、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、または分析物に対して匹敵する親和性を有する一本鎖抗体もしくは結合部位である。一次結合タンパク質は、サブタイプＧ、Ｍ、Ａ、またはＥの免疫グロブリンであり得る。現在好ましい実施態様では、一次結合タンパク質は、免疫グロブリンＧイソタイプである。一次結合タンパク質は、少なくとも１つのアロタイプ決定基を含まなければならない。本明細書で使用される場合、用語「アロタイプ決定基」は、同じ種のメンバーのすべてではないがいくつかにおいて存在する、巨大分子、例えば、免疫グロブリンの免疫学的に活性なエピトープ、部位、または領域として定義される。次いで、分析物および結合タンパク質によって形成される複合体は、捕獲抗アロタイプ抗体と反応する。捕獲、または二次、抗アロタイプ抗体は、一次抗体上のアロタイプ決定基に非常に特異的である。捕獲抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体であり、これは、一次結合タンパク質と同じイソタイプである必要はない。現在好ましい実施態様において、捕獲抗体は固相に固定化されている。複合体は、固定された抗アロタイプモノクローナル抗体−結合タンパク質−分析物を含む捕獲部位で形成する。一次結合タンパク質および捕獲抗アロタイプ抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、またはヒトのような任意の適切な種に由来し得る。抗体はまたキメラ抗体であり得る。現在好ましい実施態様では、一次結合タンパク質および捕獲抗体の両方ともマウスモノクローナル抗体である。一次結合抗体として本発明に有用である目的の分析物に対して特異的結合特性および高親和性を有するモノクローナル抗体またはその画分は、公知および市販で入手可能であるか、または周知の細胞融合およびスクリーニング技法を使用して安定な細胞株から産生され得るかのいずれかである。文献は、タンパク質を産生および固定化するためのプロトコルで満ちている。例えば、Laboratory Techn iques in Biochemistry and Molecular Biology ，Tijssen，15巻，Practice and Theory of Enzyme immunoassays，13章，The Immobilization of Immunoreacta nts on Solid Phases，297-328頁、およびそれに引用される参考文献を参照のこと。抗アロタイプモノクローナル抗体はまた、上で参照されるものを含む周知の方法によって得られ得る。抗アロタイプモノクローナル抗体はまた、任意の適切な種からであり得るか、またはキメラであり得るが、一次結合タンパク質上のアロタイプ決定基の種およびサプタイプに特異的でなければならない。したがって、アロタイプ特異的モノクローナル抗体は、一次結合タンパク質に存在する特定のアロタイプ決定基を認識するために惹起されなければならない。これは、抗体を惹起するために使用される抗原および宿主動物の注意深い選択によって達成され得る。1つの実施態様では、抗アロタイプモノクローナル抗体は、以下のプロトコルに従って産生される：特定のマウス株に由来するプロテインＡ精製したマウスモノクローナル抗体（例えば、A/J株からのIgG2aまたはSJL株からのIgG₁）は、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）にカップリングされる。異なる株の宿主マウスは、得られる免疫原で免疫される。例えば、SJLマウスは、IgG_2a(Ighl^a)-KLH結合体で免疫され；そしてA/Jマウスは、IgG₁(Igh4^b)-KLH結合体で免疫される。代表的には、各マウスに、合計約３つの免疫処置を与える。最終免疫処置は、細胞融合の約４日前に投与される。細胞融合は、KohlerおよびMilstein(Nature，256巻，495頁(1975))に記載の方法に従って、免疫処置されたマウスからの脾臓細胞およびSP2-0ミエローマ細胞を使用して行われる。ハイブリドーマ上清は、例えば、化学発光アッセイを使用して、抗アロタイプモノクローナル抗体についてスクリーニングされる。この実施態様では、上清を、免疫処置するモノクローナル抗体と同じイソタイプおよびマウスの株からのアクリジニウムエステル標識したモノクローナル抗体を、免疫処置するモノクローナルと同じイソタイプおよび同じマウス株からの三次モノクローナル抗体が固定されている常磁性粒子に、連結する能力について、テストした。抗アロタイプモノクローナル抗体の特異性は、IgGサブタイプ起源のイソタイプおよび株が、免疫処置するモノクローナル抗体のものとは異なる場合、トレーサーおよび固相モノクローナルを連結することにおける効果を決定することによって確認され得る。イムノアッセイにおける妨害はまた、試料中の内因性補体タンパク質によって引き起こされ得る。試料に存在する補体タンパク質は、特に一次結合タンパク質が抗体である場合、一次結合タンパク質に結合し得、そのため捕獲抗体への一次結合タンパク質の付着を阻止し得る。補体タンパク質による妨害は、一次抗体の補体結合部位の一部に結合しない抗アロタイプ抗体を利用することによって最小化され得る。補体カスケードの最初のタンパク質であるCaqが、IgGのCH2領域に結合することは公知である。CH3ドメインに結合する抗アロタイプ抗体を選択することによって、試料中で形成され得る分析物一次抗体−補体複合体は、さらに、固相に固定されるこのような抗アロタイプ抗体によって捕獲される。本発明の現在好ましい実施態様では、一次抗体およびアロタイプ特異的抗体の両方とも、マウス起源、好ましくはIgGサブタイプからである。上記から、テスト手順の成功は、一次結合タンパク質と反応する試料に存在する分析物に、または一次結合タンパク質上の付着部位に対して分析物とトレーサー分子との間の再現性のある競合に、および捕獲アロタイプ特異的モノクローナル抗体に対する一次結合タンパク質の特異性の両方に依存的である。試料中の分析物の量を検出するために、検出可能な標識を有する成分が、アッセイに含まれる。検出可能な標識は、例えば、化学発光化合物、蛍光化合物、酵素、または放射性同位元素であり得る。現在好ましい実施態様では、化学発光アクリジニウムエステル標識は、米国特許第4,745,181号；第5,227,489号；第5,24 1,070号；および第5,395,752号に記載のように使用される。現在好ましい実施態様では、本発明のイムノアッセイは、患者の血流中の薬物またはホルモンの濃度を検出するために設計される。この実施態様では、結合タンパク質は、薬物またはホルモンに対するモノクローナル抗体である。捕獲抗体として使用され得る抗アロタイプモノクローナル抗体は、一次抗体上のアロタイプ決定基に対して特異的を有する抗体である。他の実施態様では、アッセイは、例えば、感染性因子のような他の分析物について検出するために適用され得る。捕獲抗アロタイプモノクローナル抗体は、好ましくは、一次結合抗体および抗アロタイプモノクローナル抗体によって形成される反応複合体の分離を容易にするために、固体基材上に固定される。任意の固相は、例えば、磁性粒子、ビーズ、クロマトグラフィー紙、濾紙、およびニトロセルロース紙を含むメンブラン、トレー、またはテストチューブを使用し得る。固体基材に抗体を固定する方法は、それ自体周知であり、そして本発明の一部を形成しない。好ましい実施態様では、本発明は、結合タンパク質アロタイプとは異なり、そのため捕獲モノクローナル抗体によって認識されないアロタイプを有する抗体を試薬混合物に添加する工程をさらに包含する。添加された抗体の量は、好ましくは、一次結合タンパク質の量よりも過剰である。これらの抗体の添加は、試料中に存在する内因性免疫グロブリンまたは補体タンパク質によるアッセイの妨害をさらに減少させる。例えば、多くのヒトは、起源が不明であるヒト抗マウス免疫グロブリン（HAMA）をその血流および組織に提示している。HAMAは、これらのヒトからの試料で行われるマウス抗体を利用するイムノアッセイを妨害しそしてその結果に影響を及ぼし得る。例えば、イムノアッセイは、しばしば、患者において治療薬物の血清レベルを決定するために使用される。患者血清中のHAMAは、アッセイを妨害し得、患者における薬物の正確ではない高いまたは低いレベルを示す結果を生じる。したがって、これらの結果に頼る医師は、患者への薬物の投与量を減少または増加させ得、これは副作用または毒性の増加、あるいは減少した効率のような、有害な作用を有し得る。本発明のイムノアッセイ方法は、HWAに対する減少した感度を提供し、したがって、より良好な正確性および再現性を提供する。本発明はまた、マウス以外の他の種に対する抗体が、例えば、ウサギ抗体を使用するイムノアッセイを妨害し得るヒト抗ウサギ抗体が、患者試料中に存在する場合に、使用され得る。添加された抗体は、好ましくは、捕獲抗体を産生するために使用される同じマウス株に由来し、そして好ましくは、一次結合タンパク質と同じイソタイプを有する。現在好ましい実施態様では、添加された抗体は、試料への一次結合タンパク質の添加前に、患者試料とプレインキュベートされる。本発明の現在好ましい実施態様では、患者試料中の分析物の量は、以下の方法に従って決定される：患者試料を、一次抗体と同じイソタイプを有し、そして捕獲抗体を産生するために使用されるマウスの同じ株に由来する、（一次抗体の量よりも）過剰のIgG抗体とプレインキュベートする。プレインキュベーション後、試料を、一次モノクローナル抗体および一次抗体に特異的なアクリジニウムエステル標識した分析物分子を含むトレーサーと合わせ、そして得られる組み合わせを、試料中の任意の分析物およびトレーサー分析物を一次抗体に結合させるために十分な条件下でインキュベートする。次いで、試料を、一次抗体アロタイプに特異的である捕獲抗アロタイプモノクローナル抗体を固定している常磁性粒子と接触させ、そして一次抗体を捕獲抗体と結合させるために十分な条件下で粒子および試料の混合物をインキュベートする。次いで、粒子を、試料から除去し、そしてあらゆる結合していないトレーサーおよび結合していない分析物を除去するために洗浄する。次いで、アクリジニウムエステル標識の量を決定し、そして検出された標識の量を、試料中に存在した分析物の量を決定するために標準結合曲線に相関させる。本発明のイムノアッセイを行うために使用される種々の試薬の量は、使用される抗体の力価に依存し、そして当業者によって経験的に容易に決定され得る。当業者には、試薬を滴定し、そして過度の実験を必要とせずにイムノアッセイを行うために必要な相対量を決定する方法は公知である。本発明は、以下の実施例を参照にしてさらに詳細に説明され、これは、いかなるようにも限定することを意図しない。実施例では、本発明は、上で簡単に説明されている添付の図面の図１〜３を参照して説明される。実施例１抗アロタイプモノクローナル抗体の産生目的：マウスIgG_2a(Ighl^a)およびマウスIgG₁(Igh4^b)のアロタイプに特異的であるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を開発すること。方法：免疫原の調製：プロテインＡ精製したモノクローナル抗体（A/J株からのIgG_2a またはSJLからのIgG₁）を、2mgのIgG/2mgのKLH（キーホールリンペットヘモシアニン）の比でグルタルアルデヒドを使用してKLHにカップリングした。マウスの免疫処置：マウスに、100μgの免疫原を１カ月の間隔で腹腔内に免疫処置した。１回目の注射を、完全フロイントアジュバントで行い；その後の注射を、不完全フロイントアジュバントで行った。SJLマウスを、IgG_2a(Ighl^a)-KLH 結合体で免疫処置し；A/Jマウスを、IgG₁(Igh4^b)-KLH結合体で免疫処置した。各マウスは、合計３回の免疫処置を受けた。最後の免疫処置を、生理食塩水で、細胞融合の４日前に，静脈内投与および腹腔内投与した。細胞融合：融合を、KohlerおよびMilsteinに記載される方法に従って、免疫処置されたマウスからの牌臓細胞およびSP2-0ミエローマ細胞を使用して行った。G ．KohlerおよびC．Milstein，Nature，256:495(1975)。ハイブリドーマ上清のスクリーニング：ハイブリドーマ上清を、化学発光アッセイを使用して抗アロタイプモノクローナル抗体についてスクリーニングした。上清を、免疫処置するモノクローナル抗体と同じイソタイプおよびマウスの株由来のアクリジニウムエステル標識したモノクローナルを、免疫処置するモノクローナルと同じイソタイプおよび同じマウス株からの三次モノクローナル抗体が固定されている常磁性粒子に、連結する能力について、テストした。抗アロタイプモノクローナル抗体の特異性を、IgG起源のイソタイプおよび株が、免疫処置するモノクローナル抗体のものとは異なる場合、トレーサーおよび固相モノクローナルを連結することにおける効果を決定することによって確認した。結果および論考：抗アロタイプモノクローナルを開発し、そして特異的であることを示した。クローン229-2D1.2A10（1997年4月29日にアメリカンタイプカノレチャーコレクション，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USAに寄託され、そして受託番号HB-12350として同定される）は、A/JおよびBalb/cマウスからのIgG_2a Mabと反応する。クローン240-10C12.1C12.2F11（1997年4月29日にアメリカンタイプカルチャーコレクション，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USAに寄託され、そしてATCC HB-12349として同定される）は、SJLおよび ICRマウスからのIgG₁と反応する。種々の特異性のモノクローナル抗体を有する抗アロタイプ固相229-2D1.2A10をテストすること目的：Ighl^aアロタイプを有する株からのIgG_2aに特異的であるモノクローナル抗体220-2D1.2Al0を使用して、抗アロタイプPMPが、A/JおよびBalb/cマウスからのIgG_2aモノクローナルと反応し得ることを証明すること。材料および方法：使用したモノクローナル抗体：抗体を、PBS、0.1％BSAで希釈した。トレーサー：アクリジニウムエステル（AE）標識したトレーサーを使用した： LH-AE、DNP-BSA-AE、PSA-AE、テオフィリン-AE、HIV env-AE。トレーサーを、PB S、0.1％BSAで希釈した。固相：常磁性粒子（PMP）にカップリングした229-2Dl.2A10を、200μg PMP/ml に希釈した。アッセイ：100μlのモノクローナル抗体および100μlのトレーサーを、室温にて１時間一緒にインキュベートした。500μlのPMPを添加し、そして室温にて10 分間インキュベートした。粒子を磁気分離し、そしてPBS、0.05％TRIRON X-100( Rohm & Haas)で２回洗浄した。粒子を、100μlの水に再懸濁し、そしてMLA 2中でカウントした。結果および論考：結合曲線を、特異性にかかわりなく、テストした一次モノクローナル抗体のすべてについて得た。図1を参照のこと。得られる最大結合の差は、異なる一次モノクローナル抗体の親和性および使用したアクリジニウムエステル標識したトレーサーの特異的活性を示す。抗アロタイプモノクローナル抗体、229-2D1.2A10の特異性を、固相にカップリングしたこの抗体がBalb/cおよびA/J IgG_2aMabおよびその特異的抗原の免疫複合体に結合し得るとして確認した。実施例２抗アロタイプ固相を使用するテオフィリンイムノアッセイ以下のプロトコルは、モデルとしてテオフィリンイムノアッセイを使用して遊離分析物から結合した分析物を分離するために、常磁性粒子にカップリングした抗アロタイプモノクローナル抗体を利用する。抗アロタイプモノクローナル抗体の性能は、二次または捕獲抗体としてのポリクローナルヤギ抗マウスIgと比較される。材料および方法：試薬：リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）、pH7.4中で0.4μg/mlに希釈した、一次抗テオフィリンモノクローナル抗体（Chiron Diag nostics Corp．クローン90-1A11）。標準−0、1.25、2.5、5、10μg/mlの濃度でテオフィリンでスパイク（spike）されたヒト血漿。トレーサー−テオフィリンに結合したジメチルアクリジニウムエステル。固相−160mgモノクローナル抗体/1gのPMPの比で常磁性粒子（PMP）にカップリングしたモノクローナル抗アロタイプIghl^a（Chiron Diagnostics Corp．クローン229-2D1，ATCC HB-12350）：または 160mgポリクローナル抗血清/1gのPMPの比で常磁性粒子にカップリングした、カプリル酸カットした、ヤギ抗マウスIg（ポリクローナル抗血清）。粒子を、アッセイでの使用のために、PBS、0.1％BSA中1mg/mlに希釈した。アッセイ：５マイクロリットルのテオフィリン標準、100マイクロリットルのトレーサー、100マイクロリットルのPBS緩衝液、および300マイクロリットルの一次抗体を、２連で試験管に連続してピペットで入れた。試薬を混合し、そして反応物を、 37℃にて５分間インキュベートした。100マイクロリットルの粒子を添加し、混合し、そして37℃にて2.5分間さらにインキュベートした。粒子を磁気分離し、そして500マイクロリットルのPBS、0.05％ TRITON X-100で２回洗浄した。粒子を100μlの脱イオン化水に再懸濁し、そして化学発光を、相対光単位（RLU）で、Magic Lite Analyzer 2(Chiron Corporation)を使用して測定した。各標準についての平均RLUを算出した。各標準についてのRLU（％Bstd.）を、０標準（％B Ostd.）（％Bstd/BOstd）について得られたRLUと比較した。結果：抗アロタイプPMPおよびヤギ抗マウスIg-PMPを使用して得られる標準曲線を、表１および図２に示す。表１．テオフィリン標準曲線標準化した結合曲線を、図２に示す。結論：抗アロタイプ固相は、このアッセイ形式においてポリクローナルヤギ抗マウス Ig-PMPと同等に役割を果たす。テオフィリンイムノアッセイにおける抗マウス抗体の妨害およびアロタイプミスマッチ株由来のIgGの添加による妨害の排除：目的：テオフィリンアッセイの正確性における抗マウスIg抗体の効果を決定すること。臨床試料の重要な数で見られるヒト抗マウスIg（HAMA）のモデルとして、ヤギ抗マウスIgをアッセイに添加して、イムノアッセイにおける効果を決定した。妨害を排除するために、一次抗体のアロタイプとは異なりそして交差反応しないアロタイプを有するマウスの系統からのマウスIgGを、トレーサー緩衝液に添加した。材料および方法試薬： PBS 0.1％BSA、pH7.4中0.4μg/mlに希釈した、一次抗テオフィリンモノクローナル抗体（Chiron Diagnostics corp．clone 90-1A11）。標準−0、1.25、2.5、5、10μg/mlの濃度でテオフィリンを加えたヒト血漿。トレーサー−PBS、0.1％BSA緩衝液で希釈したテオフィリンに結合したジメチルアクリジニウムエステル。 PBS、0.1％BSAで10μg/mlに希釈したヤギIgG（Sigma）。 PBS、0.1％BSAで10μg/mlに希釈したヤギ抗マウスIg（H&L，Bio-rad）。 SJL IgG（Chiron Diagnostics Corp．クローン216-18D9）を、200μg/mlの最終濃度でトレーサーに添加した。固相−160mgのモノクローナル/1gのPMPの比で常磁性粒子（PMP）にカップリングしたモノクローナル抗アロタイプIghl^a(Chiron Diagnostics Corp．clone 229 -2D1，ATCC HB-12350）；または 160mgのポリクローナル/1gのPMPの比で常磁性粒子にカップリングし、カプリル酸をカットしたヤギ抗マウスIg。粒子を、アッセイでの使用のためにPBS．0.1 ％BSA中1mg/mlに希釈した。アッセイ：５マイクロリットルのテオフィリン標準、100マイクロリットルのヤギIgGまたはヤギ抗マウスIg、100マイクロリットルのトレーサー、および300マイクロリットルの一次抗体を、２連で試験管に連続してピペットで入れた。試薬を混合し、そして反応物を、37℃にて５分間インキュベートした。100マイクロリットルの粒子を添加し、混合し、そして37℃にてさらに2.5分間インキュベートした。粒子を磁気分離し、そして500マイクロリットルのPBS、0.05％TRITON X-100で２回洗浄した。粒子を100μlの脱イオン化水に再懸濁し、そして化学発光を、相対光単位（RLU）で、Magic Lite Analyzer 2を使用して測定した。各標準についての平均RLUを算出した。各標準についてのRLUを、０標準（％Bstd/BOstd）について得られたRLUと比較した。アッセイにおけるヤギ抗マウスIgの妨害を決定するために、標準についてのテオフィリン用量および１μgのヤギ抗マウスIgを、標準曲線から決定した。結果：二次抗体または捕獲抗体として抗アロタイプPMPまたはポリクローナルヤギ抗マウスIgを使用して、いずれかのテオフィリンイムノアッセイへの１μgのヤギ抗マウスIgの添加は、標準実行においての用量の見かけの増加を生じた（表２）。表２．ヤギ抗マウスIg（HAMAアナログ）の添加はテオフィリン用量の増加を生じるテオフィリン標準についての用量回収を、算出によって決定した：両方の固相を使用して、見かけの用量回収は、ヤギ抗マウスIgをアッセイに添加した場合に、100％以上であった（表３）。用量の過度の回収は、抗アロタイプP MPを使用するアッセイに対するよりもポリクローナルPMPを使用するアッセイについてより大きかった。表３．ヤギ抗マウスIgの存在下での標準用量回収テオフィリンアッセイにおけるヤギ抗マウスIg（HAMAアナログ）による妨害を排除するために、SJLマウスから産生されたハイブリドーマからの20μgのIgG₁をトレーサー緩衝液中でテスト当たり添加した。表４に示すように、ヤギ抗マウス Igの存在下での回収用量を、抗アロタイプ固相で実行したテオフィリンアッセイのより正確なレベルまで低下させた。著しく違って、ヤギ抗マウスIg PMPを使用するアッセイにおけるテオフィリン標準用量の回収は、増加し続けた。表４．SJL IgGのテオフィリンアッセイへの添加の効果ヤギ抗マウスIgおよびSJL IgG₁の存在下で実行したテオフィリン標準についてのパーセント用量回収を、表５に示す。テオフィリンアッセイにおける標準用量についての平均回収は、抗アロタイプ固相については103％であり、そしてヤギ抗マウスIg固相については200〜624％の範囲であった。表５．ヤギ抗マウスIg（HAMAアナログ）およびSJL IgG₁の存在下で実行したテオフィリン標準についてのパーセント用量回収論考：ヒト血清／血漿試料中に存在するヒト抗マウス免疫グロブリン（HAMA）は、マウスモノクローナル抗体を利用するイムノアッセイにおいて妨害を生じることを示している。この妨害は、患者試料に存在する特定の分析物の正確でない決定によって現れる。この不正確性は、患者の誤診を導き得る。この問題を迂回するために、ほとんどのイムノアッセイは、アッセイに重要である特異的モノクローナル抗体への結合からHAMAをブロックするために、大量のマウス血清またはマウス Igを含む。しかし、イムノアッセイが、特異的免疫複合体を捕獲するために、種特異的抗体、例えば、ヤギ抗マウスIgに頼る場合、非特異的マウスIgの添加は、実行可能な代替ではない。アッセイ中に形成される免疫複合体を捕獲するために抗テオフィリン（一次）抗体上のアロタイプ決定基に非常に特異的なモノクローナル抗体を利用する、テオフィリンイムノアッセイのモデルシステムを開発した。抗アロタイプモノクローナル抗体を、常磁性粒子にカップリングし、そしてヒト血漿においてテオフィリンレベルを定量するために化学発光イムノアッセイで固相として使用した。このアッセイを、固相として常磁性粒子にカップリングしたポリクローナルヤギ抗マウスIgG捕獲抗体を利用する化学発光アッセイと比較した。両方のイムノアッセイとも、ヒト患者標本中のHAMAの存在を模倣するためにアッセイに添加したヤギ抗マウスIgの存在に対する感度があった。この結果は、抗アロタイプ固相を利用するアッセイが、妨害に対してほとんど感度がなかったことを示唆する。両方のアッセイにおいて、標準のテオフィリン用量が増加した。患者標本中の薬物の正確な量を決定することにおける誤差は、内科医に有害な効果を有する患者投与量を変更させ得る。抗アロタイプモノクローナル抗体は非常に特異的であるので、一次抗テオフィリン抗体であるアロタイプ決定基を共有しないマウス株からの非特異的Igを添加することによって、抗マウス免疫グロブリンの妨害の効果を排除し得る。これを、SJLマウス由来のIgGを添加することによってテオフィリンイムノアッセイで達成した。SJL IgGをアッセイに添加した場合、標準に対するテオフィリン用量は、回収を越えなかった。対照的に、ポリクローナル固相を使用するテオフィリンアッセイにおける抗マウスIgの妨害効果は、非特異性マウスIgGの添加で克服され得ず、そして実際にこの問題を悪化させた。実施例３抗アロタイプ固相を使用するDHEA Sイムノアッセイ目的：モデル系としてとしてデヒドロエピアンドロステロン硫酸（DHEA-S）アッセイを使用して遊離の分析物から結合した分析物を分離するために、常磁性粒子にカップリングした抗アロタイプモノクローナル抗体を使用すること。材料および方法：試薬： PBS、0.1％BSA、pH7.4中に0.2μg/mlに希釈した一次抗DHEA-Sモノクローナル抗体（Chiron Diag．Clone SS165-9A11）。標準−PBS，0.1％BSA、pH7.4中に10、50、100、および250ng/mlで希釈したDHE A-S トレーサー−DHEA-Sに結合したジメチルアクリジニウムエステル固相−160mgのモノクローナル/1gのPMPの比で常磁性粒子にカップリングしたモノクローナル抗アロタイプIgh4^b(Chiron Diag．Clone 240-10C12）、または16 0mgのポリクローナル/1gのPMPの比で常磁性粒子にカップリングした、カプリル酸をカットした、ヤギ抗マウスIg。粒子をアッセイでの使用のために、PBS．0.1 ％BSA中で100μg/mlに希釈した。アッセイ： 25マイクロリットルのDHEA-S標準、100マイクロリットルのトレーサー、100マイクロリットルの緩衝液、および100マイクロリットルの一次抗体を、２連で試験管に連続してピペットで入れた。試薬を混合し、そして反応物を、37℃にて５分間インキュベートした。500マイクロリットルの粒子を添加し、混合し、そして37℃にてさらに2.5分間インキュベートした。粒子を磁気分離し、そして500マイクロリットルのPBS、0.05％TRITON X-100で２回洗浄した。粒子を100μlのdH2 0に再懸濁し、そして化学発光を、相対光単位（RLU）で、Magic Lite Analyzer ２を使用して測定した。各標準についての平均RLUを算出した。各標準についてのRLUを、０標準（％Bstd/BOstd）について得られたRLUと比較した。結果：抗アロタイプPMPおよびヤギ抗マウスIg-PMPを使用して得られるDHEA-S標準曲線を、表６および図３に示す。表６．DHEA-S標準曲線標準化した結合曲線を、図３に示す。結論：抗アロタイプ固相は、ポリクローナルヤギ抗マウスIg-PMPと同等に行う。 DHEA-Sイムノアッセイにおける抗マウス抗体の妨害およびアロタイプミスマッチ株由来のIgGを添加することによる妨害の排除目的：DHEA-Sアッセイにおける抗マウスIg抗体の効果の決定。臨床試料の有意な数で見られるヒト抗マウスIgのモデルとして、ヤギ抗マウスIgFcをアッセイに添加して、効果を決定した。妨害を排除するために、一次抗体のアロタイプとは異なり、そして交差反応しないアロタイプを有するマウスの株由来のIgGを使用して、トレーサー緩衝液に添加した。材料および方法試薬： PBS、0.1％BSA，pH7.4中で0.2g/mlに希釈した、一次抗DHEA-Sモノクローナル抗体（Chiron Diag．clone SS165-9A11）。標準−PBS、0.1％BSA中で、10、20、100、250ng/mlの濃度で希釈したDHEA-S。トレーサー−PBS、0.1％BSA緩衝液で希釈したDHEA-Sに結合したジメチルアクリジニウムエステル。 PBS、0.1％BSAで10μg/mlに希釈したヤギIgG緩衝材（Sigma）。 PBS、0.1％BSAで10μg/mlに希釈したヤギ抗マウスIg Fc（Cappel）。 A/J IgG（Chiron Diag．クローン126-12C3）を、200μg/mlの最終濃度でトレーサーに添加した。固相−160mgモノクローナル/1gのPMPの比で常磁性粒子にカップリングしたモノクローナル抗アロタイプIgh4^b（Chiron Diag．clone 240-10C12）、または160 mgポリクローナル/1gのPMPの比で常磁性粒子にカップリングした、カプリン酸をカットしたヤギ抗マウスIg。粒子をアッセイでの使用のために、PBS、0.1％BSA 中で125μg/mlに希釈した。アッセイ： 25マイクロリットルのDHEA-S標準、100マイクロリットルのヤギIgGまたはヤギ抗マウスIgFc、100マイクロリットルのトレーサー、および100マイクロリットルの一次抗体を、試験管に２連で連続してピペットで入れた。試薬を混合し、そして反応物を、37℃にて５分間インキュベートした。500マイクロリットルの粒子を添加し、混合し、そして37℃にてさらに2.5分間インキュベートした。粒子を磁気分離し、そして500マイクロリットルのPBS、0.05％TRITON X-100で２回洗浄した。粒子を100μlのdH20に再懸濁し、そして化学発光を、相対光単位（RLU）で、Magic Lite Analyzer 2を使用して測定した。各標準についての平均RLUを算出した。各標準についてのRLUを、０標準（％Bstd/BOstd）について得られたRLU と比較した。アッセイにおけるヤギ抗マウスIgFcの妨害を決定するために、標準についてのDHEA-S用量および１μgのヤギ抗マウスIgFcを、標準曲線から決定した。結果：抗アロタイプPMPまたはポリクローナルヤギ抗マウスIgを使用して、いずれかのDHEA-Sイムノアッセイへの１μgのヤギ抗マウスIgの添加は、標準実行において用量の見かけの増加を生じた（表７）。表７．ヤギ抗マウスIg（HAMAアナログ）の添加はDHEA-S用量の増加を生じる DHEA-S標準についての用量回収を、算出によって決定した：両方の固相を使用して、用量回収は、ヤギ抗マウスIgFcをアッセイに添加した場合に、100％以上であった（表８）。用量の過度の回収は、抗アロタイプPMPよりもポリクローナルPMPについてより大きかった。表８．ヤギ抗マウスIgFcの存在下での標準用量回収 DHEA-Sアッセイにおけるヤギ抗マウスIgFc（HAMAアナログ）による妨害を排除するために、トレーサー緩衝液中でテスト当たり、A/Jマウスから産生されるハイブリドーマ由来の20μgのIgG₁を添加した。A/J IgGを含むトレーサーを、DHEA -Sおよびヤギ抗マウスIgGFc（HAMAアナログ）を含む試料に添加し、そして37℃ で５分間インキュベートした。次いで、一次抗DHEA-Sモノクローナル抗体を添加し、そして反応物を37℃にてさらに５分間インキュベートした。固相、抗アロタイプPMPまたはヤギ抗マウスIg PMPのいずれかを添加し、そして37℃にて2.5分間インキュベートした。表９に示すように、ヤギ抗マウスIgFcの存在下での標準用量を、抗アロタイプ固相で実行したDHEA-Sアッセイの受容可能なレベルまで低下させた。著しく違って、ヤギ抗マウスIg PMPを使用するアッセイにおけるDHEA- S標準用量は、増加し続けた。表９．A/J IgGのDHEA-Sアッセイへの添加の効果ヤギ抗マウスIgおよびA/J IgG₁の存在下で実行されるDHEA-S標準についてのパーセント用量回収を、表10に示す。DHEA-Sアッセイにおける標準用量についての平均回復は、抗アロタイプ固相については105％であり、そしてヤギ抗マウスIg 固相については200〜＞2500％の範囲であった。表10．ヤギ抗マウスIgFc（HAMAアナログ）およびA/J IgGの存在下で実行したDHE A-S標準についてのパーセント用量回収論考：ヒト血清／血漿試料に存在する抗マウス免疫グロブリン（HAMA）は、マウスモノクローナル抗体を利用するイムノアッセイにおいて妨害を引き起こすことが示されている。この妨害は、患者試料に存在する特定の分析物の正確でない決定によって現れる。この不正確性は、患者の誤診を導き得る。この問題を迂回するために、ほとんどのイムノアッセイは、アッセイに重要である特異的モノクローナル抗体への結合からHAMAをブロックするために、大量のマウス血清またはマウス Igを含む。しかし、イムノアッセイが、特異的免疫複合体を捕獲するために、種特異的抗体、すなわち、ヤギ抗マウスIgに頼る場合、非特異的マウスIgの添加は、実行可能な代替ではない。アッセイ中に形成される免疫複合体を捕獲するために抗DHEA-S（一次）抗体上のアロタイプ決定基に非常に特異的なモノクローナル抗体を利用する、DHEA-Sイムノアッセイのモデルシステムを開発した。抗アロタイプモノクローナル抗体を、常磁性粒子にカップリングし、そしてヒト血漿においてDHEA-Sを定量するための化学発光イムノアッセイで固相として使用した。このアッセイを、固相として常磁性粒子にカップリングしたポリクローナルヤギ抗マウスIgGを利用する化学発光アッセイと比較した。両方のイムノアッセイとも、患者標本中のHAMAの存在を模倣するためにアッセイに添加したヤギ抗マウスIgFcの存在について感度があった。この結果は、抗アロタイプ固相を利用するアッセイが、妨害に対してほとんど感度がなかったことを示唆する。両方のアッセイにおいて、標準のDHEA-S用量が増加した。患者標本中のホルモンの正確な量を決定することにおける誤差は、医師に有害な効果を伴って患者の診断に変化させ得る。抗アロタイプモノクローナル抗体は非常に特異的であるので、一次抗DHEA-S抗体とともにアロタイプ決定基を共有しないマウス系統由来の非特異的Igを添加することによって、抗マウス免疫グロブリンの妨害の効果を排除し得る。これを、 A/JマウスからのIgGを添加することによってDHEA-Sイムノアッセイで達成した。 A/J IgGをアッセイに添加した場合、標準に対するDHEA-S用量は回収を越えなかった。対照的に、ポリクローナル固相を使用するDHEA-Sアッセイにおける抗マウスIgの妨害効果は、非特異的マウスIgGの添加では克服され得ず、そして実際にこの問題を悪化させた。同等物上記の説明から、当業者は、本発明の本質的特徴を容易に確認し得、そして本発明の意図および範囲から逸脱することなく、種々の用途および条件にこれを適合させるための種々の変化および改変を行い得る。このような実施態様は、以下の請求の範囲内に含まれるべきことが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．患者試料において分析物の量を決定する方法であって：ａ．該患者試料を、該分析物に特異的な結合タンパク質、および該結合タンパク質に特異的な検出可能な標識されたトレーサー分子と組み合わせる工程；ｂ．該分析物および該標識されたトレーサー分子を該結合タンパク質に結合させることを可能にするために十分な条件下で、工程(a)で形成される組み合わせをインキュベートする工程；ｃ．該組み合わせを、該結合タンパク質アロタイプに特異的な捕獲抗体を固定した固相と接触させる工程；ｄ．該結合タンパク質を該捕獲抗体と結合させることを可能にするために十分な条件下で、工程(c)で形成される組み合わせをインキュベートする工程；ｅ．該試料から該固相を分離する工程；およびｆ．該固相に結合した該標識されたトレーサー分子の量を検出する工程；を包含し、ここで、検出された該標識されたトレーサーの量が、該試料に存在する分析物の量を示す、方法。２．前記結合タンパク質が、抗体またはレセプターを含む、請求項１に記載の方法。３．前記結合タンパク質が、サブタイプＧ、Ｍ、Ａ、またはＥの免疫グロブリンである、請求項２に記載の方法。４．前記結合タンパク質が、免疫グロブリンＧイソタイプである、請求項３に記載の方法。５．前記結合タンパク質が、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、またはヒトからなる群より選択される種に由来する、請求項１に記載の方法。６．前記結合タンパク質および前記捕獲抗体が、マウス起源である、請求項５に記載の方法。７．前記患者試料が、血清、血漿、尿、リンパ液、脳脊髄液、または組織である、請求項１に記載の方法。８．前記検出可能な標識が、化学発光標識、蛍光標識、酵素、または放射性同位元素である、請求項１に記載の方法。９．前記標識が、アクリジニウムエステルである、請求項７に記載の方法。１０．前記固相が、磁性粒子、ビーズ、メンブラン、トレー、またはテストチューブである、請求項１に記載の方法。１１．前記標識されたトレーサー分子が、検出可能な標識と結合した分析物分子を含む、請求項１に記載の方法。１２．前記トレーサー分子が、前記結合タンパク質と結合するために前記試料中の分析物と競合する、請求項１１に記載の方法。１３．前記結合タンパク質アロタイプとは異なるアロタイプを有する抗体を、工程(a)における組み合わせに添加する工程をさらに包含し、ここで該アロタイプが固定されたモノクローナル抗体によって認識されない、請求項１に記載の方法。１４．前記添加された抗体が、前記結合タンパク質と同じイソタイプを有する、請求項１３に記載の方法。１５．前記添加された抗体が、前記捕獲抗体と同じマウス株に由来する、請求項１３に記載の方法。１６．前記分析物が、デヒドロエピアンドロステロン硫酸またはテオフィリンである、請求項１に記載の方法。１７．前記捕獲抗体が、ハイブリドーマ細胞株ATCC HB-12349から得られる、請求項１に記載の方法。１８．前記捕獲抗体が、ハイブリドーマ細胞株ATCC HB-12350から得られる、請求項１に記載の方法。１９．ハイブリドーマ細胞株ATCC HB−12349から得られるモノクローナル抗体を固定した固相を含む、試薬。２０．ハイブリドーマ細胞株ATCC HB−12350から得られるモノクローナル抗体を固定した固相を含む、試薬。２１．前記固相が、磁性粒子、ビーズ、メンブラン、トレー、またはテストチューブを含む、請求項１９または２０に記載の試薬。２２．ハイブリドーマ細胞株ATCC HB-12349から得られるモノクローナル抗体。２３．ハイブリドーマ細胞株ATCC HB−12350から得られるモノクローナル抗体。２４．試料中の内在性ヒト抗体または補体タンパク質からの妨害を減少させながらヒト患者試料中の分析物の量を決定するためのイムノアッセイの正確性を改良する方法であって、ここで、該イムノアッセイは、一次抗体および分析物を組み合わせることによって形成される複合体中で該一次抗体に特異的な捕獲抗体を利用し、該方法が、該一次抗体上のアロタイプ決定基に特異的であるモノクローナル抗体を、該イムノアッセイにおける捕獲抗体として提供する工程を包含する、方法。２５．前記捕獲抗体が、前記一次抗体の免疫グロブリンアロタイプに特異的である、請求項２４に記載の方法。２６．前記一次抗体および前記捕獲抗体がマウス抗体である、請求項２４に記載の方法。２７．前記妨害が、ヒト抗マウス免疫グロブリン抗体または補体に起因する、請求項２４に記載の方法。２８．妨害が、ヒト抗マウス免疫グロブリン抗体に起因する、請求項２４に記載の方法。２９．前記一次抗体アロタイプとは異なるアロタイプを有する抗体を、前記試料に添加する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。３０．前記添加された抗体が、前記一次抗体と同じイソタイプである、請求項２９に記載の方法。３１．前記添加された抗体が、前記捕獲抗アロタイプ抗体と同じマウス株に由来する、請求項３０に記載の方法。３２．患者試料において分析物の量を決定する方法であって：ａ．該患者試料を、一次モノクローナル抗体、およびトレーサーを該一次抗体に特異的なアクリジニウム−エステル−標識された分析物分子と組み合わせる工程；ｂ．該分析物および該トレーサーを該一次抗体に結合させることを可能にするために十分な条件下で、工程(a)で形成される組み合わせをインキュベートする工程；ｃ．該組み合わせを、一次モノクローナル抗体アロタイプに特異的な捕獲抗アロタイプモノクローナル抗体を固定した常磁性粒子と接触させる工程；ｄ．該一次モノクローナル抗体を該捕獲抗体と結合させることを可能にするために十分な条件下で、工程(c)で形成される組み合わせをインキュベートする工程；ｅ．該試料、結合していないトレーサー、および結合していない分析物から固相を分離する工程；およびｆ．該固相に結合したトレーサーの量を検出する工程；を包含し、ここで、標識された分析物分子の量が、該試料に存在する分析物の量を示す、方法。３３．前記一次抗体および前記捕獲抗体の両方がマウスに由来する、請求項３２に記載の方法。３４．前記一次抗体と同じイソタイプを有するマウス抗体の一次抗体の量よりも過剰を、工程(a)の前に前記試料に添加する工程をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。３５．前記添加された抗体が、前記捕獲抗体と同じマウス株に由来する、請求項３４に記載の方法。３６．前記添加された抗体が、前記患者試料とプレインキュベートされる、請求項３４に記載の方法。３７．患者試料において分析物の量を決定する方法であって：ａ．該患者試料を、該分析物に特異的な結合タンパク質、および固相に付着された分析物アナログと組み合わせる工程；ｂ．該分析物および該分析物アナログを該結合タンパク質に結合させることを可能にするために十分な条件下で、工程(a)で形成される組み合わせをインキュベートする工程；ｃ．該組み合わせを、標識されたアロタイプ特異的抗体と接触させる工程；ｄ．該結合タンパク質を該標識された抗体と結合させることを可能にするために十分な条件下で、工程(c)で形成される組み合わせをインキュベートする工程；ｅ．該試料から該固相を分離する工程；およびｆ．該固相に結合した標識されたトレーサー分子の量を検出する工程；を包含し、ここで、検出された標識されたトレーサーの量が、該試料に存在する分析物の量を示す、方法。３８．前記結合タンパク質が、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、またはヒトからなる群より選択される種に由来する、請求項３７に記載の方法。３９．前記添加された抗体が前記結合タンパク質と同じイソタイプを有し、そして前記標識された抗体と同じマウス株に由来する、請求項３７に記載の方法。４０．前記標識された抗体が、ハイブリドーマ細胞株ATCC HB-12349またはハイブリドーマ細胞株ATCC HB-12350から得られる、請求項１に記載の方法。