JP2002504368A - Human channel-related molecules - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトチャネル関連分子（HCRM）並びにHCRMを同定及びコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト、及びアンタゴニストを提供する。更に、本発明はHCRMの発現に関わる疾患の治療または予防の方法を提供する。 (57) Abstract The present invention provides human channel-associated molecules (HCRMs) and polynucleotides that identify and encode HCRMs. The present invention also provides expression vectors, host cells, antibodies, agonists, and antagonists. Furthermore, the present invention provides a method for treating or preventing a disease associated with the expression of HCRM.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 技術分野 本発明は、ヒトチャネル関連分子の核酸配列およびアミノ酸配列、並びに細胞
増殖性の障害および輸送障害の診断・予防・治療におけるこれらの配列の利用法
に関するものである。[0001] Technical Field The present invention relates to nucleic acid and amino acid sequences of the human channel related molecules, as well as to the uses of these sequences in the diagnosis, prevention and treatment of cell proliferative disorders and transportation failure.

【０００２】 発明の背景 チャネルタンパク質は、脂質2重層を穿孔し得る水性の細孔を形成することに よって親水性の分子の膜を横切る移動を促進する。多くのチャネルは複数のサブ
ユニットの集合によって形成されるタンパク質複合体からなり、そのうちの少な
くとも1つは細孔の形成に寄与する必須の膜タンパク質である。場合によっては 、細孔はただ1つの分子若しくは少数の分子種の通過を選択的に可能にするよう に構成される。分布、細孔の直径、及び選択性が非常に異なるチャネルの個別の
タイプには、（１）原形質膜および細胞内のコンパートメントを横切るイオンの
流入または流出を促進するイオンチャネル、（２）隣接する細胞間の小さな有機
分子やイオンの拡散を促進するギャップ結合、及び（３）核膜を通過する巨大分
子の能動輸送や小さな分子の拡散を促進する核膜孔複合体（NPC）が含まれる。 BACKGROUND channel proteins of the invention promote the movement across the membrane of the thus hydrophilic molecules to form pores aqueous capable of piercing the lipid bilayer. Many channels consist of a protein complex formed by the assembly of multiple subunits, at least one of which is an essential membrane protein that contributes to pore formation. In some cases, the pores are configured to selectively allow passage of only one molecule or a small number of molecular species. Distinct types of channels with very different distributions, pore diameters, and selectivities include (1) ion channels that facilitate the entry or exit of ions across the plasma membrane and compartments within cells, (2) adjacent Gap junctions that promote the diffusion of small organic molecules and ions between living cells, and (3) Nuclear pore complex (NPC) that promotes the active transport of macromolecules through the nuclear membrane and the diffusion of small molecules .

【０００３】 イオンチャネルは、種々の膜を通過するイオンの流れを調節する小さく高度に
選択的な細孔である。例えば、Na⁺チャネルは直径が約0.4nmの細孔を形成し、ア
ニオンの通過を遮断するために選択バリアとして作用する負に荷電された内部領
域を有する。多くの場合、イオンチャネルの開閉は、特定の刺激（例えば、電位
変化、力学的応力、又は特異的なイオン、ヌクレオチド、若しくは神経伝達物質
の存在など）によって調節、即ち「ゲートで制御」される。場合によって特定のイ
オンチャネルのゲート開閉特性（即ち、開閉の持続時間およびその閾値）は、補
助的なチャネルタンパク質との関連及び／又はリン酸化のような翻訳後の修飾に
よって変化する。種々のゲート機構を通過するイオン流れの制御の能力によって
、イオンチャネルが多様なシグナル伝達や、ニューロン及び内分泌のシグナル伝
達、筋収縮、受精、並びにイオン及びpHバランス調節の恒常性機能を媒介するこ
とが可能になる。ゲートイオンチャネルの例には、例えばNa⁺チャネル、K⁺チャ ネル、Ca⁺チャネル、及びCl^-チャネルのような電位依存型イオンチャネルや、例
えばアセチルコリン-、セロトニン-、及びグルタミン酸-ゲートカチオンチャネ ル、並びにGABA-及びグリシン-ゲート塩素イオンチャネルのような神経伝達物質
作動性イオンチャネルが含まれる。電圧依存型および伝達物質作動性カチオンチ
ャネルのサブユニットを形成する細孔は、保存されたマルチパス(multipass)膜 タンパク質の2つの異なるスーパーファミリーを形成する。[0003] Ion channels are small, highly selective pores that regulate the flow of ions through various membranes. For example, Na ⁺ channels form pores of about 0.4 nm in diameter and have negatively charged internal regions that act as selective barriers to block the passage of anions. In many cases, the opening and closing of ion channels is regulated, or "gated," by specific stimuli (eg, potential changes, mechanical stress, or the presence of specific ions, nucleotides, or neurotransmitters). . In some cases, the gating properties of a particular ion channel (ie, the duration of the gating and its threshold) are altered by association with auxiliary channel proteins and / or by post-translational modifications such as phosphorylation. The ability of ion channels to mediate diverse signaling and neuronal and endocrine signaling, muscle contraction, fertilization, and homeostatic functions of ion and pH balance regulation, with the ability to control ion flow through various gating mechanisms Becomes possible. Examples of gated ion channels, such as Na ⁺ channel, K ⁺ channel, Ca ⁺ channels, and Cl ^- voltage-gated ion channels or like channels, for example acetylcholine -, serotonin -, and glutamate - gate cationic channelization Le And neurotransmitter-gated ion channels such as GABA- and glycine-gated chloride channels. The pores that form the subunits of voltage-gated and transmitter-gated cation channels form two distinct superfamilies of conserved multipass membrane proteins.

【０００４】 電圧依存型Na⁺チャネルは、ニューロン、骨格筋、心臓、及び神経内分泌組織 の電気的興奮性の主因である。例えば、電圧依存型Na⁺チャネルの一連の開閉に よって、下方のニューロンの軸索への活動電位の伝播が生じる。ラットの脳組織
から単離されたNa⁺チャネルは、2つのより小さな補助的なサブユニット（β1及 びβ2）に関連するαサブユニットを形成する260 kDaの細孔からなるヘテロ3量 体の複合体である。β2サブユニットは、細胞外のIgドメインを含む必須の膜糖 タンパク質であり、それとα及びβサブユニットとの関連性は、膜表面領域の増
加による細胞全体のキャパシタンスの増大だけでなく、チャネルの機能的発現の
増大やそのゲート開閉特性の変化と互いに関係がある（Isom, L.L.ら (1995) Ce
ll 83:433-442）。[0004] Voltage-gated Na ⁺ channels are a major cause of electrical excitability in neurons, skeletal muscle, heart, and neuroendocrine tissues. For example, a series of opening and closing of voltage-gated Na ⁺ channels results in the propagation of action potentials to axons of underlying neurons. Na ⁺ channels isolated from rat brain tissue are heterotrimeric, consisting of a 260 kDa pore that forms the α subunit associated with two smaller auxiliary subunits (β1 and β2). Complex. The β2 subunit is an essential membrane glycoprotein containing an extracellular Ig domain, and its association with the α and β subunits not only increases the overall cell capacitance due to the increase in membrane surface area, but also the channel Correlation with increased functional expression and changes in its gate opening and closing characteristics (Isom, LL et al. (1995) Ce
ll 83: 433-442).

【０００５】 Cl^-チャネルは体内の実質的に全ての細胞の原形質膜において見られ、それら はイオンバランス、pH、及び電位の調節を含む多くの機能を媒介する。個別のCl ^- チャネルが、筋肉、ニューロン、線維芽細胞、上皮細胞、及びリンパ球におい て発見されている。嚢胞性線維症の膜コンダクタンス制御因子（CFTR）は嚢胞性
線維症（ヒトにおける共通の致命的な遺伝的障害）に対する遺伝子によってコー
ドされる塩素イオンチャネルである。CFTR遺伝子における変異は、多くの病理学
的な症状を生じさせるイオンバランスの変化を引き起こす。[0005] Cl^-Channels are found in the plasma membrane of virtually every cell in the body, and they mediate many functions, including regulation of ion balance, pH, and potential. Individual Cl ^- Channels have been found in muscle, neurons, fibroblasts, epithelial cells, and lymphocytes. Cystic Fibrosis Membrane Conductance Regulator (CFTR) Is Cystic
The gene for fibrosis (a common fatal genetic disorder in humans)
Is a chloride ion channel. Mutations in the CFTR gene can cause many pathologies
Causes a change in the ion balance, which can cause typical symptoms.

【０００６】 イオンチャンネルを形成することで知られる最も小さい膜タンパク質の1つは 、PLM (Phospholemman)である。PLMは72のアミノ酸のタンパク質であり、酸性の
細胞外アミノ末端ドメイン、単一の無電荷膜貫通ドメイン、及び極度に塩基性の
細胞質のC末端ドメインからなる。PLMはプロテインキナーゼC（PKC）及びcAMP- 依存性プロテインキナーゼ（cAMPK）に対する主要な原形質膜基質である。心筋 において、PLMのリン酸化はα-又はβ-アドレナリン受容体の何れかの活性化の 後に生じ、またそれは筋肉の収縮性の増大と互いに関係する（Lindemann J.P. (
1986) J. Biol. Chem. 261:4860-4867）。[0006] One of the smallest membrane proteins known to form ion channels is PLM (Phospholemman). PLM is a 72 amino acid protein that consists of an acidic extracellular amino-terminal domain, a single uncharged transmembrane domain, and an extremely basic cytoplasmic C-terminal domain. PLM is the major plasma membrane substrate for protein kinase C (PKC) and cAMP-dependent protein kinase (cAMPK). In the myocardium, phosphorylation of PLM occurs after activation of either α- or β-adrenergic receptors, and is correlated with increased muscle contractility (Lindemann JP
1986) J. Biol. Chem. 261: 4860-4867).

【０００７】 2つのPLM関連タンパク質であるMat8及びRIC（イオンチャネルに関連）は種々 の形質転換細胞系におけるそれらの発現の上昇に基づきクローン化された。RIC は、残基134−167の間にイオンチャネル相同性ドメインを含む178のアミノ酸の タンパク質であり、それは塩基性残基のどちらかの側面に位置する19の疎水性残
基の推定上の膜貫通領域からなる。このドメインは、PLM、Mat8、CHIF、及びNa/
K ATPアーゼのγサブユニットのような幾つかの互いに異なるイオンチャネルの 間で保存される。RICは、E2a-Pbx1腫瘍性タンパク質によって形質転換されたマ ウス3T3細胞におけるその発現の上昇に基づき同定される。また、RICの発現は、
幾つかの別の腫瘍性タンパク質だけでなく発癌性のRas及びNeuでの形質転換によ
って誘発されることが明らかにされている。第2のPLM関連タンパク質であるMat-
8は、細胞の腫瘍性の形質転換に関係する。Mat8は、Neu又はRas腫瘍性タンパク 質によって形質転換されたマウスの***腫瘍細胞株において発現され、またMat8
のヒト相同体は、主要な***腫瘍および***腫瘍細胞株の両方で発現される。PL
Mと同様に、アフリカツメガエルの卵母細胞におけるMat-8の発現が電位活性化Cl ^- 電流を誘発することが明らかにされており、それはMat-8がCl^-チャネルとして 機能するという考えを支持するものである（Morrison, B.W.ら (1995) J. Biol.
Chem. 270:2176-2182; Fu, X.及びKamps, M.P. (1997) Mol. Biol. Cell 17(3)
: 1503-1512）。Mat8及びRICの発現と細胞の腫瘍性の形質転換との関連性は、イ
オンチャネルが癌および他の細胞増殖性の疾患において重要な役割を担っている
ことを示唆している。[0007] Two PLM-related proteins, Mat8 and RIC (associated with ion channels), have been cloned based on their increased expression in various transformed cell lines. RIC is a 178 amino acid protein containing the ion channel homology domain between residues 134-167, consisting of 19 hydrophobic residues flanking either side of the basic residue.
It consists of a putative transmembrane region. This domain contains PLM, Mat8, CHIF, and Na /
It is conserved between several distinct ion channels, such as the γ subunit of KATPase. RIC is identified based on its increased expression in mouse 3T3 cells transformed by the E2a-Pbx1 oncoprotein. The expression of RIC is
Transformation with oncogenic Ras and Neu as well as several other oncoproteins
It is clear that it is induced. Mat-, a second PLM-related protein
8 is involved in neoplastic transformation of cells. Mat8 is expressed in a mouse mammary tumor cell line transformed with Neu or Ras oncoprotein, and
Is expressed in both major breast tumors and breast tumor cell lines. PL
Similar to M, the expression of Mat-8 in Xenopus oocytes is ^- It has been shown to induce an electric current, which means that Mat-8^-Supports the idea of functioning as a channel (Morrison, B.W. et al. (1995) J. Biol.
 Chem. 270: 2176-2182; Fu, X. and Kamps, M.P. (1997) Mol. Biol. Cell 17 (3)
: 1503-1512). The relationship between the expression of Mat8 and RIC and the neoplastic transformation of cells
On-channel plays a key role in cancer and other cell proliferative disorders
Suggest that.

【０００８】 ギャップ結合は中間のサイズのチャネルでコネクソンと称され、多くの組織に
おいて隣接する細胞の細胞質を化学的および電気的に結合させるために機能する
。各コネクソンは、6つの同一のサブユニットであるコネキシンからなる。更に 、各コネキシンは、4つの推定上の膜貫通αへリックスからなる。ギャップ結合 の効果的な細孔サイズは約1.5nmであり、これにより例えば1000ダルトン未満の 小さな分子が細孔を通過して自由に拡散することが可能となる。同様の構造を有
する異なるギャップ結合タンパク質が殆どの組織において生じ、そこでそれらは
細胞の伝達を媒介する。例えばCa⁺及びcAMPのようなセカンドメッセンジャー及 びイオンを隣接する細胞の中に拡散可能とすることによって、ギャップ結合は、
心臓および平滑筋収縮の同期化、神経の伝達速度の増加、並びに細胞外のシグナ
ルの伝播を助長する。また、それらは発育における細胞挙動の協調のために重要
である。イオンチャネルと同様に、ギャップ結合は、例えばpH又はカルシウムイ
オンのような特定の刺激に応じて開閉し得る。ギャップ結合を閉じることは、細
胞の損傷の影響を抑えるのに重要である可能性がある。[0008] Gap junctions, termed connexons, are intermediate-sized channels that function in many tissues to chemically and electrically connect the cytoplasm of adjacent cells. Each connexon is composed of six identical subunits, connexin. In addition, each connexin consists of four putative transmembrane α-helices. The effective pore size of the gap junction is about 1.5 nm, which allows small molecules, for example, less than 1000 daltons, to freely diffuse through the pore. Different gap junction proteins with similar structures occur in most tissues, where they mediate cell transmission. By allowing second messengers and ions, such as Ca ⁺ and cAMP, to diffuse into neighboring cells, gap junctions
Helps synchronize heart and smooth muscle contraction, increases nerve transmission speed, and propagates extracellular signals. They are also important for the coordination of cell behavior in development. Like ion channels, gap junctions can open and close in response to specific stimuli, such as, for example, pH or calcium ions. Closing gap junctions can be important in reducing the effects of cell damage.

【０００９】 最も大きな既知のチャネルは核膜孔複合体（NPC）であり、全ての真核生物の 細胞の核膜で見られる。NPCの直径は約50nmであるが、自由な拡散のための効果 的な細孔サイズは約9nmと推定される。例えば5kDa未満のイオン及び小さな分子 は、これらの細孔を通過して自由に拡散可能である。より大きなタンパク質およ
びリボ核タンパク質（RNP）は、GTPase、Ranを必要とするエネルギ依存機構によ
ってNPCを通して輸送される。NPCは125,000,000ダルトンの質量であり、約100の
異なるポリペプチド（核タンパク質）が含まれると推定され、その幾つかはチャ
ネルプロパーの形成に寄与し、また幾つかは補助的な要素として作用する。[0009] The largest known channel is the nuclear pore complex (NPC), found in the nuclear envelope of all eukaryotic cells. Although the diameter of the NPC is about 50 nm, the effective pore size for free diffusion is estimated to be about 9 nm. For example, ions of less than 5 kDa and small molecules are free to diffuse through these pores. Larger proteins and ribonucleoproteins (RNPs) are transported through NPCs by an energy-dependent mechanism that requires GTPase, Ran. NPCs have a mass of 125,000,000 daltons and are estimated to contain about 100 different polypeptides (nucleoproteins), some of which contribute to the formation of channel proper and some which act as auxiliary elements.

【００１０】 NPCは、核からのRNAの移出だけでなく細胞質からの核のタンパク質の活発な移
入を媒介する。このプロセスにおいては核タンパク質(nucleoporin) p62に関連 することが最近明らかになったが、mRNAを移出する機構は十分に理解されてはい
ない。また、核タンパク質 p62は細胞質からのタンパク質の移出に必須であり、
真核生物の間で保存されていることが知られている少数の核タンパク質の1つで ある（Wang, Z.Q.ら(1994) Biol. Reprod. 51:1022-1030; Dargemont, C.ら(199
5) J. Cell Sci. 108:257-263）。[0010] NPCs mediate the active import of nuclear proteins from the cytoplasm as well as the export of RNA from the nucleus. Although this process has recently been shown to involve the nucleoporin p62, the mechanism of mRNA export is poorly understood. In addition, the nuclear protein p62 is essential for the export of proteins from the cytoplasm,
It is one of the few nuclear proteins known to be conserved among eukaryotes (Wang, ZQ et al. (1994) Biol. Reprod. 51: 1022-1030; Dargemont, C. et al. (199
5) J. Cell Sci. 108: 257-263).

【００１１】 NPCを横切るタンパク質とRPNの移入は、輸送されたタンパク質で運ばれる核局
在化配列（nuclear localization sequence; NLS）を必要とする。NLSは短いペ プチド配列（標準的には4〜8の残基の間）であり、厳格なコンセンサスには従わ
ないが、通常は塩基性アミノ酸の1以上のクラスターによって特徴づけられ、多 くの場合プロリン残基を含む。NSLはタンパク質の任意の場所に存在して、非相 同的タンパク質と融合したときに核局在化し得る。NLS含有基質タンパク質のNPC
に対するターゲティングは、NLS受容体として機能するimportinαとNPCに対する
ドッキングを媒介するimportinβとからなるヘテロ2量体のタンパク質複合体に よって媒介される。種々のNLS含有タンパク質基質に対して多数の受容体が存在 することが明らかにされている。[0011] Transport of proteins and RPN across an NPC requires a nuclear localization sequence (NLS) carried in the transported protein. NLS are short peptide sequences (typically between 4 and 8 residues) that do not follow a strict consensus, but are usually characterized by one or more clusters of basic amino acids. Cases include proline residues. NSL can be located anywhere on a protein and nuclear localize when fused to a heterologous protein. NPC for NLS-containing substrate protein
Is mediated by a heterodimeric protein complex consisting of importinα, which functions as an NLS receptor, and importinβ, which mediates docking to NPCs. Many receptors have been shown to exist for various NLS-containing protein substrates.

【００１２】 不完全な核の輸送は、癌において一定の役割を果たしている可能性がある。BR
CA1タンパク質にはimportinαと相互作用する3つの潜在的NLSが含まれ、importi
n/NPC経路によって核の中に輸送される。乳癌細胞において、BRCA1タンパク質は
細胞質内に異常に局在化する。6つの異なる乳癌細胞株で発現された野生型BRCA1
タンパク質は細胞質内に局在化する。しかし、4つの非乳癌細胞株において発現 される野生型BRCA1タンパク質は核内に局在し、それは乳癌細胞におけるBRCA1タ
ンパク質の誤局在(mislocation)がNPC核内移行経路における欠陥の結果であり得
ることを示唆している（Chen, C.F.ら (1996) J. Biol. Chem. 271:32863-32868
）。[0012] Incomplete nuclear transport may play a role in cancer. BR
The CA1 protein contains three potential NLSs that interact with importinα,
Transported into the nucleus by the n / NPC route. In breast cancer cells, the BRCA1 protein is abnormally localized in the cytoplasm. Wild-type BRCA1 expressed in six different breast cancer cell lines
The protein is localized in the cytoplasm. However, wild-type BRCA1 protein expressed in four non-breast cancer cell lines is localized in the nucleus, and mislocation of BRCA1 protein in breast cancer cells may be the result of a defect in the NPC nuclear translocation pathway (Chen, CF et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 32863-32868).
).

【００１３】 27件中10件の乳癌の研究において、p53腫瘍サプレッサータンパク質が細胞質 中に発見されている。細胞質のp53タンパク質と共に乳癌から得られたp53 cDNA の大半は野生型であった。対照的に、核のp53タンパク質と共に乳癌から得られ たp53 cDNAには、種々のミスセンスの変異とナンセンスの変異が含まれていた。
そのことは、幾つかの乳癌においては、細胞の核における作用部位から離れた細
胞質中のタンパク質の隔離によってp53の腫瘍抑制活性が不活性化されることを 示している。また、細胞質の野生型p53はヒトの頸部癌の細胞株において発見さ れている（Moll, U.M.ら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7262-7266; 及
びLiang, X.H.ら(1993) Oncogene 8:2645-2652）。In 10 out of 27 breast cancer studies, the p53 tumor suppressor protein was found in the cytoplasm. Most of the p53 cDNA obtained from breast cancer with cytoplasmic p53 protein was wild-type. In contrast, p53 cDNA obtained from breast cancer along with nuclear p53 protein contained various missense and nonsense mutations.
That indicates that in some breast cancers, sequestration of proteins in the cytoplasm distant from the site of action in the nucleus of the cells inactivates the tumor suppressor activity of p53. In addition, cytoplasmic wild-type p53 has been found in human cervical cancer cell lines (Moll, UM et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7262-7266; and Liang, XH et al. (1993) Oncogene 8: 2645-2652).

【００１４】 細胞間および細胞内のシグナル伝達経路ならびに恒常性プロセスにおけるそれ
らの種々の効果によって、チャネルタンパク質及びそれらの補助的因子は、多く
の疾患において重要な役割を果たしている。新規なヒトチャネル関連分子及びこ
れらの分子をコードするポリヌクレオチドの開示は、細胞増殖性の疾患及び輸送
障害の診断・治療・予防に役立つ新たな組成物を提供して当業者の要求を満たす
ものである。[0014] Due to their intercellular and intracellular signaling pathways and their various effects on homeostatic processes, channel proteins and their cofactors play important roles in many diseases. Disclosure of novel human channel-related molecules and polynucleotides encoding these molecules will provide new compositions useful for the diagnosis, treatment, and prevention of cell proliferative diseases and transport disorders to meet the needs of those skilled in the art. It is.

【００１５】 発明の概要 本発明は、まとめて「HCRM」と、また個別には「HCRM-1」、「HCRM-2」、「HCRM-3」と
称される実質的に精製されたポリペプチドであるヒトチャネル関連分子を特徴と
する。一態様において、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、及びSEQ ID NO:5 、並びにSEQ ID NO:1の断片、SEQ ID NO:3の断片、及び及びSEQ ID NO:5の断片 からなるグループより選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペ
プチドを提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to substantially purified polypeptides, collectively referred to as "HCRM" and individually as "HCRM-1,""HCRM-2," and "HCRM-3." Or a human channel-related molecule. In one aspect, the invention relates to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5, and fragments of SEQ ID NO: 1, fragments of SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5. A substantially purified polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

【００１６】 また、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列、又 はこれらの配列の任意の断片に対して少なくとも90%以上のアミノ酸同一性を有 する実質的に精製された変異体を提供する。更に本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID
NO:3、若しくはSEQ ID NO:5、又はSEQ ID NO:1の断片、SEQ ID NO:3の断片、若 しくはSEQ ID NO:5の断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を含む ポリペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。更
に本発明にはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1の断片、SE
Q ID NO:3の断片、及びSEQ ID NO:5の断片からなるグループより選択されたアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも
90%以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌク レオチドの変異配列が含まれる。The present invention also relates to the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or at least 90% amino acid identity to any fragment of these sequences. A substantially purified variant is provided. Further, the present invention relates to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO.
NO: 3, or SEQ ID NO: 5, or a fragment of SEQ ID NO: 1, a fragment of SEQ ID NO: 3, or a polymorph comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments of SEQ ID NO: 5. Provided is an isolated and purified polynucleotide encoding a peptide. Furthermore, the present invention provides SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, fragments of SEQ ID NO: 1, SE
Q ID NO: 3 fragment, and at least a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments of SEQ ID NO: 5
Mutant sequences of isolated and purified polynucleotides having 90% or more polynucleotide sequence identity are included.

【００１７】 更に、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1の断片
、SEQ ID NO:3の断片、及びSEQ ID NO:5の断片からなるグループより選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して相補的
な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチドだけでなく、SEQ ID NO:1 、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1の断片、SEQ ID NO:3の断片、及びSE
Q ID NO:5の断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を含むポリペプ チドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条件の下でハイブリダイズする単離
され精製されたポリヌクレオチドを提供する。Furthermore, the present invention relates to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, fragments of SEQ ID NO: 1, fragments of SEQ ID NO: 3, and fragments of SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, as well as isolated and purified polynucleotides having a sequence complementary to a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: , SEQ ID NO: 5, fragment of SEQ ID NO: 1, fragment of SEQ ID NO: 3, and SE
Provided is an isolated and purified polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments of Q ID NO: 5.

【００１８】 更に、本発明はSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:2の断片
、SEQ ID NO:4の断片、及びSEQ ID NO:6の断片からなるグループより選択された
ポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
更に本発明はSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:2の断片、SE
Q ID NO:4の断片、及びSEQ ID NO:6の断片からなるグループより選択されたポリ
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有する単離さ
れ精製されたポリヌクレオチドだけでなく、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID
NO:6、SEQ ID NO:2の断片、SEQ ID NO:4の断片、及びSEQ ID NO:6の断片からな
るグループより選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに対し
て少なくとも90%以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製さ れたポリヌクレオチドの変異配列を提供する。Furthermore, the present invention relates to SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, fragments of SEQ ID NO: 2, fragments of SEQ ID NO: 4, and fragments of SEQ ID NO: 6. Providing an isolated and purified polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of:
Furthermore, the present invention relates to SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, fragments of SEQ ID NO: 2, SE
Not only an isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of a fragment of Q ID NO: 4, and a fragment of SEQ ID NO: 6, but also , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID
NO: 6, a fragment of SEQ ID NO: 2, a fragment of SEQ ID NO: 4, and at least 90% or more relative to a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of fragments of SEQ ID NO: 6. Provided are mutant sequences of the isolated and purified polynucleotide having polynucleotide sequence identity.

【００１９】 更に、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1の断片
、SEQ ID NO:3の断片、及びSEQ ID NO:5の断片からなるグループより選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも断
片を含む発現ベクターを提供する。別の態様では、その発現ベクターは宿主細胞
に包含される。Furthermore, the present invention relates to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, fragments of SEQ ID NO: 1, fragments of SEQ ID NO: 3, and fragments of SEQ ID NO: 5. An expression vector comprising at least a fragment of a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: In another aspect, the expression vector is contained in a host cell.

【００２０】 更に、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1の断片
、SEQ ID NO:3の断片、及びSEQ ID NO:5の断片からなるグループより選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法を提供し、その方法には、（ａ）前
記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、前記ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する過
程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する過程とが含まれる
。Furthermore, the present invention relates to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, fragments of SEQ ID NO: 1, fragments of SEQ ID NO: 3, and fragments of SEQ ID NO: 5. A method for producing a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: (a) providing a polynucleotide encoding the polypeptide under conditions suitable for expression of the polypeptide; The method includes the steps of culturing a host cell containing an expression vector containing at least a fragment, and (b) recovering the polypeptide from the medium of the host cell.

【００２１】 更に、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1の断片
、SEQ ID NO:3の断片、及びSEQ ID NO:5の断片からなるグループより選択された
のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを適切な製薬用担体と
共に含む医薬品成分を提供する。Furthermore, the present invention relates to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, fragments of SEQ ID NO: 1, fragments of SEQ ID NO: 3, and fragments of SEQ ID NO: 5. A pharmaceutical component comprising a substantially purified polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of: and a suitable pharmaceutical carrier.

【００２２】 更に、本発明には前記ポリペプチドの精製されたアゴニストおよび精製された
アンタゴニストだけでなく、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID
NO:1の断片、SEQ ID NO:3の断片、及びSEQ ID NO:5の断片からなるグループより
選択されたのアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する精製された抗体が含ま
れる。Further, the present invention includes not only purified agonists and purified antagonists of the polypeptide, but also SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 5.
Purified antibodies that bind to a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of a fragment of NO: 1, a fragment of SEQ ID NO: 3, and a fragment of SEQ ID NO: 5 are included.

【００２３】 更に、本発明は細胞増殖性の障害の治療又は予防の方法を提供し、その方法に
は、そのような治療が必要な被験者に対してSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID
NO:5、SEQ ID NO:1の断片、SEQ ID NO:3の断片、及びSEQ ID NO:5の断片からな
るグループより選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタゴニスト
を有効な量投与する過程が含まれる。Further, the present invention provides a method of treating or preventing a cell proliferative disorder, the method comprising the steps of providing a subject in need of such treatment with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3. , SEQ ID
Administering an effective amount of an antagonist of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of NO: 5, a fragment of SEQ ID NO: 1, a fragment of SEQ ID NO: 3, and a fragment of SEQ ID NO: 5. Is included.

【００２４】 更に、本発明はHCRMの活性または発現の低下に関連する輸送障害の治療又は予
防の方法を提供し、その方法には、そのような治療が必要な被験者に対してSEQ
ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1の断片、SEQ ID NO:3の断片 、及びSEQ ID NO:5の断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を有す る実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を有効な量投与する過程
が含まれる。Further, the present invention provides a method for treating or preventing a transport disorder associated with reduced activity or expression of HCRM, the method comprising the steps of providing a subject in need of such treatment with a SEQ.
An amino acid sequence selected from the group consisting of ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, a fragment of SEQ ID NO: 1, a fragment of SEQ ID NO: 3, and a fragment of SEQ ID NO: 5 Administering an effective amount of a pharmaceutical composition comprising a substantially purified polypeptide having the formula:

【００２５】 更に、本発明はHCRMの活性または発現の増大に関連する輸送障害の治療又は予
防の方法を提供し、その方法には、そのような治療が必要な被験者に対してSEQ
ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1の断片、SEQ ID NO:3の断片 、及びSEQ ID NO:5の断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を有す るポリペプチドのアンタゴニストを有効な量投与する過程が含まれる。Further, the present invention provides a method of treating or preventing a transport disorder associated with increased activity or expression of HCRM, the method comprising the steps of providing a subject in need of such treatment with a SEQ.
An amino acid sequence selected from the group consisting of ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, a fragment of SEQ ID NO: 1, a fragment of SEQ ID NO: 3, and a fragment of SEQ ID NO: 5 And administering an effective amount of an antagonist of the polypeptide having

【００２６】 更に、本発明は核酸を含む生物学的サンプルにおけるSEQ ID NO:1、SEQ ID NO
:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1の断片、SEQ ID NO:3の断片、及びSEQ ID NO:5の
断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドの検出方法を提供し、その検出方法には、（ａ）生物学的
サンプルの少なくとも1つの核酸と、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、
SEQ ID NO:1の断片、SEQ ID NO:3の断片、及びSEQ ID NO:5の断片からなるグル ープより選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド配列の相補配列とをハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体
を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程で
あって、該ハイブリダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルにおけ
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有するような検
出過程とが含まれる。一態様においては、前記ハイブリダイゼーション過程の前
にポリメラーゼ連鎖反応法により生物学的サンプルの核酸を増幅する。Further, the present invention provides a method for preparing a biological sample comprising nucleic acids comprising the steps of:
: 3, SEQ ID NO: 5, a fragment of SEQ ID NO: 1, a fragment of SEQ ID NO: 3, and a polypeptide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments of SEQ ID NO: 5. A method for detecting nucleotides is provided, comprising: (a) at least one nucleic acid of a biological sample with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5,
A fragment of SEQ ID NO: 1, a fragment of SEQ ID NO: 3, and a complementary sequence of a polynucleotide sequence encoding a polypeptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments of SEQ ID NO: 5. Hybridizing to form a hybridization complex; and (b) detecting the hybridization complex, wherein the presence of the hybridization complex encodes a polypeptide in the biological sample. A detection process that correlates with the presence of the polynucleotide. In one embodiment, the nucleic acid of the biological sample is amplified by the polymerase chain reaction prior to the hybridization step.

【００２７】 発明を実施するための形態 本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、
ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試薬に限定
されるものではなく、その実施形態は変更可能であることを理解されたい。また
、ここで使用した専門用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いたもので
あり、特許請求の範囲のみで限定される本発明の範囲を限定することを意図した
ものではないことも理解されたい。[0027] Proteins form the present invention for carrying out the invention, nucleic acid sequences, and before describing how the present invention,
It is to be understood that it is not limited to the particular methodology, protocols, cell lines, vectors, and reagents disclosed herein, but that embodiments thereof may vary. Also, the technical terms used herein are used only for the purpose of describing specific examples, and are not intended to limit the scope of the present invention, which is limited only by the appended claims. Please also understand.

【００２８】 請求の範囲を含む本明細書において、単数形の「或る」及び「その（この）」
の表記は、文脈からそうでないことが明らかである場合以外は、複数の意味も含
むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」の表記には、複数のそ
のような宿主細胞が含まれ、この「抗体」の表記は、１またはそれ以上の抗体及
び当業者に周知のその等価物なども表している。As used herein, including the claims, the singular forms “a” and “the”
Note that the notation also has multiple meanings unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, reference to "a host cell" includes a plurality of such host cells, and reference to "an antibody" includes reference to one or more antibodies and their equivalents well known to those of skill in the art. Represents.

【００２９】 特別に定義されていない限り、本明細書における全ての専門用語及び特定の用
語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に一般に理解され
るものと同じ意味を有する。ここで説明したものと類似あるいは等価な方法や材
料を本発明の実施や試験において使用可能であるが、本明細書においては好適な
方法、装置、材料を説明する。本発明で言及した全ての文献は、文献で報告され
た本発明に関して用いられ得る株化細胞、ベクター、及び方法論を説明・開示す
るために引用したものである。本明細書のあらゆる開示内容は、本発明が従来発
明によるそのような開示に先行し得ないことを認めるものと解釈してはならない
。Unless defined otherwise, all technical and specific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods or materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods, devices, and materials are described herein. All references mentioned in the present invention are cited to illustrate and disclose cell lines, vectors, and methodologies that can be used in connection with the present invention as reported in the literature. Nothing herein is to be construed as an admission that the present invention cannot precede such disclosure by the prior invention.

【００３０】 定義 ここで用いる「HCRM」は、任意の種、詳細にはウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウ
マ、及び好ましくをヒトを含む特定の哺乳類の種から得られたものであって、天
然、合成、半合成か、或いは組換え体を起源として得られた実質的に精製された
HCRMのアミノ酸配列を指す。 Definitions As used herein, "HCRM" refers to any species, particularly bovine, ovine, porcine, murine, equine, and preferably from a particular mammalian species, including humans, Substantially purified, synthetic, semi-synthetic or obtained from recombinant sources
Refers to the amino acid sequence of HCRM.

【００３１】 ここで用いる用語「アゴニスト」は、HCRMと結合した場合にHCRMの効果を高めた
り、その効果の持続時間を延ばす分子を指す。アゴニストには、HCRMに結合して
その作用を調節するタンパク質、核酸、糖質、または任意の他の分子が含まれ得
る。As used herein, the term “agonist” refers to a molecule that, when bound to HCRM, enhances the effect of HCRM or extends the duration of the effect. Agonists may include proteins, nucleic acids, carbohydrates, or any other molecules that bind to and modulate the action of HCRM.

【００３２】 ここで用いる「アレル」または「アレルの配列」は、HCRMをコードする遺伝子の対
立形である。アレルは、核酸配列における少なくともひとつの突然変異に起因し
、変異したmRNA或いはポリペプチドが生ずるが、それらの構造又は機能は変化す
る場合と変化しない場合がある。与えられた任意の自然の遺伝子または組換え型
の遺伝子には、アレル形がないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するも
のがある。一般にアレルが生じる通常の変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付
加、または置換に因るものである。これらのタイプの変化の各々は、単独または
他の変化と組み合わされて、所定の配列において１またはそれ以上の回数で生じ
得る。As used herein, “allele” or “sequence of allele” is an allelic form of the gene encoding HCRM. An allele results from at least one mutation in a nucleic acid sequence that results in a mutated mRNA or polypeptide, but their structure or function may or may not change. For any given natural or recombinant gene, there may be none, one, or many alleles. Common mutations that generally result in an allele are due to natural deletions, additions, or substitutions of nucleotides. Each of these types of changes, alone or in combination with other changes, can occur one or more times in a given sequence.

【００３３】 ここで用いるHCRMをコードする「変異した（altered）」核酸配列には、結果と して同一のHCRMまたはHCRMの機能的特徴の少なくとも1つをともなうポリペプチ ドをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿入、
または置換をともなうそれらの配列が含まれる。この定義には、HCRMをコードす
るポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可
能な、或いは検出困難な多型と、またHCRMをコードするポリヌクレオチド配列の
正常の染色体の位置とは別の所定の位置を有する、アレルに対する不適切な或い
は予期しないハイブリダイゼーションとが含まれる。コード化されたタンパク質
もまた「変異した」ものであり得て、サイレント変化(silent change)を生ずるア ミノ酸残基の置換、欠失、または挿入を含み、結果的に機能的に等価HCRMとなる
ものである。意図的なアミノ酸置換は、HCRMの生物学的または免疫学的活性が保
持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／
または両親媒性の性質についての類似性に基づき行なわれ得る。例えば、負に荷
電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に荷電した
アミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ、同様な親水性値を有する非電荷
の極性頭基(polar head groups)を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシ ン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオ
ニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。As used herein, an “altered” nucleic acid sequence encoding HCRM results in a polynucleotide encoding the same HCRM or a polypeptide having at least one of the functional characteristics of HCRM. Various nucleotide deletions, insertions,
Or those sequences with substitutions. This definition includes polymorphisms that are readily detectable or difficult to detect using specific oligonucleotide probes of the polynucleotide encoding HCRM, and the normal chromosomal location of the polynucleotide sequence encoding HCRM. Improper or unexpected hybridization to an allele having another predetermined location is included. The encoded protein can also be `` mutated, '' including substitutions, deletions, or insertions of amino acid residues that produce a silent change, resulting in a functionally equivalent HCRM. It becomes. Intentional amino acid substitutions may result in residue polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or so long as the biological or immunological activity of HCRM is retained.
Alternatively, it can be done on the basis of similarity for the amphiphilic nature. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids include lysine and arginine, forming uncharged polar head groups with similar hydrophilicity values. Amino acids having leucine, isoleucine, valine, glycine, alanine, asparagine, glutamine, serine, threonine, phenylalanine, and tyrosine.

【００３４】 ここで用いる「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド
、ポリペプチド、又はタンパク質の配列、またはそれらの何れかの断片であり、
自然発生又は合成の分子を指す。HCRMの断片は、好ましくは約5〜約15個のアミ ノ酸の長さを有し、HCRMの生物的活性又は免疫学的活性を保持しているものであ
る。この文脈において、「断片」、「免疫原性の断片」、または「抗原性の断片」は、
好ましくは約5〜15のアミノ酸の長さであってHCRMの生物学的活性または免疫学 的活性を保持するHCRMの断片を指す。ここで「アミノ酸配列」は、自然発生タン
パク質分子のアミノ酸配列を指すものとして挙げているが、「アミノ酸配列」や
類似の用語は、列挙されたタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸
配列にアミノ酸配列を限定する意味で用いられるわけではない。As used herein, “amino acid” or “amino acid sequence” is the sequence of an oligopeptide, peptide, polypeptide, or protein, or any fragment thereof,
Refers to naturally occurring or synthetic molecules. Fragments of HCRM preferably have a length of about 5 to about 15 amino acids and retain the biological or immunological activity of HCRM. In this context, a "fragment", "immunogenic fragment", or "antigenic fragment" is
Refers to fragments of HCRM that are preferably about 5 to 15 amino acids in length and that retain the biological or immunological activity of HCRM. Although the term "amino acid sequence" is used herein to refer to the amino acid sequence of a naturally occurring protein molecule, "amino acid sequence" and similar terms refer to the complete, intact amino acid sequence associated with the listed protein molecule. Is not used to limit the amino acid sequence.

【００３５】 ここで用いる「増幅」は、核酸配列の追加の複製物を生成することであり、通
常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて実施される（Die
ffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer. a Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY,pp.1-5参照）。As used herein, “amplification” refers to the production of additional copies of a nucleic acid sequence, usually performed using the polymerase chain reaction (PCR) technique well known to those skilled in the art (Die
ffenbach, CW and GS Dveksler (1995) PCR Primer.a Laboratory Manual ,
Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, pp. 1-5).

【００３６】 ここで用いる用語「アンタゴニスト」は、HCRMに結合した場合にHCRMの生物学
的又は免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、効果の持続時間を短縮する分
子を指す。アンタゴニストには、タンパク質、核酸、糖質、或いはHCRMの作用を
低下させる任意の他の分子が含まれ得る。As used herein, the term “antagonist” refers to a molecule that, when bound to HCRM, reduces the extent of the effect of the biological or immunological activity of HCRM or shortens the duration of the effect. Antagonists may include proteins, nucleic acids, carbohydrates, or any other molecule that reduces the effects of HCRM.

【００３７】 ここで用いる用語「抗体」は、完全な分子、並びに抗原決定基と結合し得るFa
、F(ab)₂、及びFvフラグメントのようなそれらの断片も指す。HCRMポリペプチド に結合する抗体は、無処置のポリペプチドを用いて、或いは免疫化する抗原とし
て関与する小型のペプチドを含むその断片を用いて調製することができる。動物
（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫化するのに用いるポリペプチ
ドまたはオリゴペプチドは、RNAの翻訳または化学的に合成されたものから得ら れ、必要ならば担体タンパク質と結合可能である。ペプチドと化学的に結合する
通常用いられる担体には、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホー
ルリンペットヘモシアニン（KLH）が含まれる。次に、この結合したペプチドを 用いて動物を免疫化する。As used herein, the term “antibody” refers to an intact molecule as well as a Fa that can bind an antigenic determinant.
, F (ab) ₂ , and fragments thereof, such as Fv fragments. Antibodies that bind HCRM polypeptides can be prepared using intact polypeptides or using fragments thereof containing small peptides that participate as antigens to immunize. The polypeptide or oligopeptide used to immunize an animal (eg, a mouse, rat, or rabbit) can be obtained from RNA translation or chemically synthesized and, if necessary, capable of binding to a carrier protein. is there. Commonly used carriers that bind chemically to the peptide include bovine serum albumin and thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin (KLH). Next, an animal is immunized with the conjugated peptide.

【００３８】 ここで用いる用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の断片（即ち
、エピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質の断片を用いてホストの動
物を免疫化する場合、このタンパク質の多くの領域が、抗原決定基（タンパク質
の所定の領域または三次元構造）と特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。
抗原決定基は抗体への結合について元の抗原（即ち、免疫応答を誘発するために
用いられる免疫原）と競合し得る。As used herein, the term “antigenic determinant” refers to a fragment of a molecule (ie, an epitope) that makes contact with a particular antibody. When a host animal is immunized with a protein or protein fragment, many regions of the protein trigger the production of antibodies that specifically bind to antigenic determinants (predetermined regions of the protein or three-dimensional structure). I can do it.
Antigenic determinants can compete with the original antigen (ie, the immunogen used to elicit the immune response) for binding to the antibody.

【００３９】 ここで用いる用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列と相補的な核酸配列を
含む任意の成分を指す。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に対して相補
的な核酸鎖に関して用いられる。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の
方法で作り出すことができる。この相補的ヌクレオチドは、一度細胞内に導入さ
れると、細胞によって作られた天然の配列と結合して2重鎖を形成し、転写や翻 訳を妨げる。「マイナス（−）」なる表現がアンチセンス鎖を指し、「プラス（
＋）」なる表現がセンス鎖を指すことがある。As used herein, the term “antisense” refers to any component that contains a nucleic acid sequence that is complementary to a specific nucleic acid sequence. The term "antisense strand" is used in reference to a nucleic acid strand that is complementary to the "sense" strand. Antisense molecules can be created by any method, including synthesis and transcription. Once introduced into a cell, this complementary nucleotide combines with the native sequence created by the cell to form a duplex, preventing transcription and translation. The expression "minus (-)" indicates the antisense strand, and "plus (-)
+) "May refer to the sense strand.

【００４０】 ここで用いる用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能、調節
機能、又は生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」
は、天然の、組換え体の、又は合成のHCRM、若しくはその任意のオリゴペプチド
の能力を指し、適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体
に結合する。As used herein, the term “biologically active” refers to a protein that has a structural, regulatory, or biochemical function of a naturally occurring molecule. Similarly "immunologically active"
Refers to the ability of natural, recombinant or synthetic HCRM, or any of its oligopeptides, to elicit a specific immune response in appropriate animals or cells and to bind to specific antibodies.

【００４１】 ここで用いる用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩類(permissive
salt)及び温度条件の下での塩基対によるポリヌクレオチド同士の自然な結合で ある。例えば、配列「A-G-T」は相補的配列「T-C-A」に結合する。2つの1本鎖分
子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合しているような「部分的」なものも、
或いは1本鎖分子間に完全な相補性が存在するような「完全」なものもある。核酸 鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの効率及び強さ
に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖同士の結合によって左右される増幅
反応や、ペプチド核酸（PNA）分子の設計及び使用において特に重要である。As used herein, the term “complementary” or “complementarity” refers to permissive salts (permissive salts).
It is the natural binding of polynucleotides by base pairing under salt and temperature conditions. For example, the sequence “AGT” binds to the complementary sequence “TCA”. The complementarity between two single-stranded molecules may be `` partial, '' such that only some nucleic acids are bound,
Alternatively, some are “perfect” such that there is complete complementarity between the single-stranded molecules. The degree of complementarity between nucleic acid strands greatly affects the efficiency and strength of hybridization between nucleic acid strands. This is particularly important in amplification reactions that depend on the binding of nucleic acid strands and in the design and use of peptide nucleic acid (PNA) molecules.

【００４２】 ここで用いる「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のア ミノ酸配列を含む組成物」とは、概して所定のポリヌクレオチド配列またはアミ ノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥した製剤、水溶液、
または無菌の組成物が含まれ得る。HCRMまたはHCRMの断片をコードするポリヌク
レオチドを含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして利用できる。
このプローブは凍結乾燥した形態で保存することができ、糖質のような安定化剤
と結合させることができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプローブは
、塩（例えば、NaCl）、界面活性剤（例えば、SDS）及び他の物質（例えば、デ ンハート液、乾燥ミルク、サケ***DNA等）を含む水溶液に分散させることがで きる。As used herein, “composition comprising a given polynucleotide sequence” or “composition comprising a given amino acid sequence” generally refers to any composition containing a given polynucleotide or amino acid sequence. Point to. The composition includes a dry formulation, an aqueous solution,
Or a sterile composition may be included. A composition comprising a polynucleotide encoding HCRM or a fragment of HCRM can be used as a hybridization probe.
The probe can be stored in lyophilized form and can be conjugated to a stabilizing agent such as a carbohydrate. In hybridization, the probe can be dispersed in an aqueous solution containing salts (eg, NaCl), detergents (eg, SDS) and other substances (eg, Denhart's solution, dried milk, salmon sperm DNA, etc.). it can.

【００４３】 ここで用いる用語「コンセンサス配列」は、再度配列決定して不要な塩基が分
離された核酸配列か、XL-PCR^TM(Perkin Elmer, Norwalk, CT)を用いて5‘方向及
び／又は3’方向に伸長して再度配列決定した核酸配列か、或いはフラグメント の組み合わせのためのコンピュータプログラム（例えば、GELVIEW^TM Fragment A
ssembly system, GCG, Madison WI）を用いて2種以上のインサイト社クローンの
重複した配列から組み合わせて作られた核酸配列である。いくつかの配列が伸長
され、かつ組み合わされてコンセンサス配列が作られる。As used herein, the term “consensus sequence” refers to a nucleic acid sequence in which unnecessary bases have been separated by resequencing, or 5 ′ direction and / or using XL-PCR ^™ (Perkin Elmer, Norwalk, CT). A nucleic acid sequence that has been extended and resequenced in the 3 ′ direction, or a computer program (eg, GELVIEW ^™ Fragment A)
ssembly system, GCG, Madison Wis.) is a nucleic acid sequence created by combining duplicate sequences of two or more Incyte clones. Some sequences are extended and combined to form a consensus sequence.

【００４４】 ここで用いる用語「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、ノーザ
ン解析によるHCRMをコードする核酸配列と同一か又は関連する核酸の存在の検出
が、サンプル内のHCRMをコードする核酸の存在を示しており、従ってHCRMをコー
ドするポリヌクレオチドからの転写産物の発現と相関性を有している、というこ
とを表している。As used herein, the term “correlated with the expression of a polynucleotide” means that detection of the presence or absence of a nucleic acid that is the same as or related to a nucleic acid sequence encoding HCRM by Northern analysis encodes HCRM in the sample. It indicates the presence of the nucleic acid and thus correlates with the expression of a transcript from the polynucleotide encoding HCRM.

【００４５】 ここで用いる「欠失」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化
であり、結果的に１個またはそれ以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基が欠
けることである。As used herein, “deletion” is a change in the nucleotide or amino acid sequence, resulting in the deletion of one or more nucleotide or amino acid residues.

【００４６】 ここで用いる用語「誘導体」は、HCRM、HCRMをコードするポリヌクレオチド配
列、またはHCRMをコードするポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド
配列を化学修飾したものを指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば
、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換が含まれる。ポリヌク
レオチド誘導体は、自然発生の分子の生物学的又は免疫学的機能を保持している
ポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、グリコシル化、ポリエチレ
ングリコール化(pegylation)、または元のポリペプチドの生物学的又は免疫学的
機能を保持する別の任意のプロセスで修飾されたものである。As used herein, the term “derivative” refers to a chemically modified version of HCRM, a polynucleotide sequence encoding HCRM, or a polynucleotide sequence complementary to a polynucleotide sequence encoding HCRM. Chemical modifications of a polynucleotide sequence include, for example, replacement of hydrogen with an alkyl, acyl, or amino group. A polynucleotide derivative encodes a polypeptide that retains the biological or immunological functions of the naturally occurring molecule. Derivative polypeptides have been modified by glycosylation, polyethylene glycolation (pegylation), or any other process that retains the biological or immunological function of the original polypeptide.

【００４７】 ここで用いる用語「相同性」は、或る程度の相補性を意味する。部分的な相同
性と、完全な相同性の場合がある。用語「相同性」の代わりに「同一性」を用いるこ
とができる。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分
的に阻害する部分的に相補的な配列は、「実質的に相同な」ことを指す。完全に
相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、緩やかな厳密性
のもとで、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザン法またはノーザン法、溶液
ハイブリダイゼーション等）を用いて検定可能である。実質的に相同な配列また
はハイブリダイゼーションプローブは、緩やかな厳密性の下で完全に相同な配列
との結合について標的の配列と競合し、それを阻害する。このことは、緩やかな
厳密性の条件が、非特異的な結合を許容するようなものであるということを意味
するわけではなく、緩やかな厳密性の条件では2つの配列の相互の結合が特異的 （即ち選択的）相互作用であることが必要である。非特異的結合が存在しないこ
とを、部分的な程度の相補性（即ち約30%未満の同一性）さえも有していない第2
の標的配列を用いることにより検査することができる。非特異的結合が存在しな
い場合、概ね相同な配列またはプローブは第2の非相補的な標的配列とハイブリ ダイズしない。The term “homology” as used herein refers to a degree of complementarity. There may be partial homology or complete homology. "Identity" can be used in place of the term "homology". A partially complementary sequence that at least partially inhibits an identical sequence from hybridizing to a target nucleic acid refers to "substantially homologous." Inhibition of hybridization between the perfectly complementary sequence and the target sequence can be assayed under mild stringency using a hybridization assay (Southern or Northern method, solution hybridization, etc.). A substantially homologous sequence or hybridization probe competes with and inhibits the target sequence for binding to a completely homologous sequence under mild stringency. This does not mean that loose stringency conditions are such that they allow non-specific binding; under loose stringency conditions, the binding of two sequences to each other is specific. It is necessary to be a specific (ie, selective) interaction. The absence of non-specific binding indicates that the second lacks even a partial degree of complementarity (ie, less than about 30% identity).
Can be tested by using the target sequence of In the absence of non-specific binding, the substantially homologous sequence or probe will not hybridize to a second non-complementary target sequence.

【００４８】 ここで用いる用語「同一性のパーセント」又は「同一性の%」は、2以上のアミノ酸
または核酸配列の比較において見出された配列の類似性の百分率を指す。同一性
のパーセントは、例えばMegAlignプログラム（DNASTAR,Inc.,Madison WI）を用 いることによって電子的に決定できる。MegAlignプログラムは、例えばClustal
Method.（例えば、Higgins,D.G.及びSharp,P.M.(1988)Gene 73:237-244参照）の
ような種々の方法に従い、2以上の配列の間のアライメントを作成することがで きる。Clustalアルゴリズムは、全てのペアの間の距離を調べることによって配 列をクラスターに分類する。クラスターはペアでアライメントされ、次にグルー
プにおいてアライメントされる。2つのアミノ酸配列（例えば、配列A及び配列B ）の間の類似性のパーセンテージは、（配列Aと配列Bとの間で一致する残基の総
数）／（配列Aの長さ−配列Aにおけるギャップ残基(gap residues)の数−配列B におけるギャップ残基の数）×100によって計算する。2つのアミノ酸の間の低い
相同性または非相同性のギャップは、類似性のパーセンテージの測定に含まれな
い。また、核酸配列の間の同一性のパーセントは、例えばJotun Hein Methodの ような当業者に周知の他の方法により計算、即ちカウントできる（例えばHein,
J.(1990) Methods Enzymol. 183:626-645参照）。更に配列間の同一性は、例え ばハイブリダイゼーション条件を変更することによる当業者に周知の別の方法に
よって測定可能である。As used herein, the term “percent identity” or “% identity” refers to the percentage of sequence similarity found in a comparison of two or more amino acid or nucleic acid sequences. Percent identity can be determined electronically, for example, by using the MegAlign program (DNASTAR, Inc., Madison WI). The MegAlign program is, for example, Clustal
According to various methods, such as Method. (See, eg, Higgins, DG and Sharp, PM (1988) Gene 73: 237-244), an alignment between two or more sequences can be made. The Clustal algorithm classifies sequences into clusters by examining the distance between all pairs. Clusters are aligned in pairs and then in groups. The percentage of similarity between two amino acid sequences (eg, sequence A and sequence B) is (the total number of matching residues between sequence A and sequence B) / (length of sequence A-sequence A Calculated by (number of gap residues−number of gap residues in sequence B) × 100. Low homology or heterology gaps between the two amino acids are not included in determining similarity percentages. Also, the percent identity between nucleic acid sequences can be calculated or counted by other methods well known to those skilled in the art, for example, the Jotun Hein Method (eg, Hein,
J. (1990) Methods Enzymol. 183: 626-645). Furthermore, identity between sequences can be measured by other methods well known to those skilled in the art, for example, by changing hybridization conditions.

【００４９】 「ヒト人工染色体」（HACs）は6kb〜10MbのサイズのDNA配列を含んでおり、安定
した有糸***染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小染色体
である（Harrington, J.J.ら (1997) Nat Genet. 15:345-355参照）。“Human artificial chromosomes” (HACs) are linear small chromosomes that contain a DNA sequence of between 6 kb and 10 Mb in size and contain all the elements necessary for the separation and maintenance of stable mitotic chromosomes. (See Harrington, JJ et al. (1997) Nat Genet. 15: 345-355).

【００５０】 ここで用いる用語「ヒト化抗体」は、抗体が本来の結合能力をそのまま保持し
ながらヒト抗体により近づくように、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列配列
を置換した抗体分子を指す。As used herein, the term “humanized antibody” refers to an antibody molecule in which the amino acid sequence in the non-antibody binding region has been replaced such that the antibody is closer to a human antibody while retaining its original binding ability.

【００５１】 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対合を介し
て相補鎖と結合する任意の過程を指す。As used herein, the term “hybridization” refers to any process by which a nucleic acid strand binds to a complementary strand through base pairing.

【００５２】 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基の間の
水素結合形成の効力によって、2つの核酸配列で形成された複合体を指す。ハイ ブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成されるか（例えば、C₀t又はR₀t解析
）、或いは核酸は溶液中に存在する一方の核酸と固体支持体（例えば、紙、メン
ブラン、フィルタ、ピン、またはスライドガラス、ポリマー、または細胞やその
核酸が固定される他の適切な基板）に固定されたもう一方の核酸との間で形成さ
れ得る。As used herein, the term “hybridization complex” refers to a complex formed between two nucleic acid sequences by virtue of the formation of hydrogen bonds between complementary bases. Hybridization complexes are formed in solution (eg, C ₀ t or R ₀ t analysis), or nucleic acids are combined with one nucleic acid present in solution with a solid support (eg, paper, membrane, filter, A pin, or another glass substrate, a glass slide, a polymer, or another suitable substrate to which the cells or their nucleic acids are fixed.

【００５３】 ここで用いる「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子にみられる配列に対
して、1個または2個以上のヌクレオチド、アミノ酸残基が各々加わるような、ヌ
クレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。As used herein, “insertion” or “addition” refers to a nucleotide or amino acid sequence in which one or more nucleotides or amino acid residues are added to a sequence found in a naturally occurring molecule, respectively. Refers to the change.

【００５４】 「免疫応答」は、炎症、心的外傷、免疫不全、又は伝染性もしくは遺伝性の疾患
に関連する容態を指す。これらの容態は、細胞および全身の防御系に作用する種
々の因子（例えばサイトカイン、ケモカイン、及び他のシグナル伝達分子）の発
現によって特徴づけられる。“Immune response” refers to a condition associated with inflammation, trauma, immunodeficiency, or an infectious or hereditary disease. These conditions are characterized by the expression of various factors that act on cellular and systemic defense systems, such as cytokines, chemokines, and other signaling molecules.

【００５５】 「マイクロアレイ」とは、例えば紙、ナイロン、又は他のタイプのメンブラン
、フィルタ、チップ、スライドガラス、又は他の任意の適切な固体支持体のよう
な基板上に配列された個々のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを配列し
たものを指す。A “microarray” refers to an individual polymer arranged on a substrate such as, for example, paper, nylon, or other types of membranes, filters, chips, glass slides, or any other suitable solid support. Refers to an arrangement of nucleotides or oligonucleotides.

【００５６】 ここでマイクロアレイコンテキスト用いる用語「エレメント」又は「アレイエレ メント」は、支持体（基板）の表面に配置されたハイブリダイズ可能なポリヌク レオチドを指す。The term “element” or “array element” as used herein in the microarray context refers to a hybridizable polynucleotide located on the surface of a support (substrate).

【００５７】 ここで用いる用語「調節(modulate)」は、HCRMの活性の変化を指す。例えば、
調節によって、タンパク質活性の向上や低下、結合特性の変化、又はHCRMの生物
学的、機能的、免疫学的特性等の他の変化がもたらされる。As used herein, the term “modulate” refers to a change in the activity of HCRM. For example,
Modulation results in increased or decreased protein activity, altered binding characteristics, or other changes, such as the biological, functional, or immunological properties of HCRM.

【００５８】 ここで用いる「核酸」または「核酸配列」は、1本鎖または2本鎖の、センス鎖又
はアンチセンス鎖である、ゲノム起源又は合成起源のDNA、RNAや、ヌクレオチド
、オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその任意の断片や、ペプチ
ド核酸（PNA）や、任意のDNA様もしくはRNA様材料を指す。「フラグメント（断 片）」は、長さが60ヌクレオチド以上の核酸配列であり、最も好ましくは、長さ
が100ヌクレオチド以上、又は1000ヌクレオチド以上、更には10,000ヌクレオチ ド以上の断片を指す。As used herein, “nucleic acid” or “nucleic acid sequence” refers to single-stranded or double-stranded, sense or antisense strands of genomic or synthetic DNA, RNA, nucleotides, oligonucleotides, Or, a polynucleotide and any fragment thereof, peptide nucleic acid (PNA), or any DNA-like or RNA-like material. A "fragment" is a nucleic acid sequence that is 60 nucleotides or more in length, most preferably a fragment that is 100 nucleotides or more, or 1000 nucleotides or more, and even 10,000 nucleotides or more.

【００５９】 ここで用いる用語「操作可能に関連する」、即ち「操作可能に連結する」は、機能
的に関係した核酸配列を指す。プロモーターがコードされたポリペプチドの転写
を制御する場合、プロモーターはコード配列と操作可能に関連する、即ち操作可
能に連結する。操作可能に関連した、即ち操作可能に連結した核酸配列が、読み
枠に存在あるいは近接する際に、所定の遺伝因子（例えば、リプレッサー遺伝子
）は、コードされたポリペプチドには連続的に連結せずに、それでもポリペプチ
ドの発現を制御するオペレーター配列に結合する。As used herein, the term “operably linked”, ie, “operably linked”, refers to a nucleic acid sequence that is operatively related. A promoter is operably associated with, ie, operably linked to, a coding sequence when the promoter controls the transcription of the encoded polypeptide. A given genetic element (eg, a repressor gene) is continuously linked to the encoded polypeptide when the operably-related, ie, operably linked, nucleic acid sequence is at or near the reading frame. Instead, it binds to an operator sequence that still controls expression of the polypeptide.

【００６０】 ここで用いる「オリゴヌクレオチド」は、PCR増幅又はハイブリダイゼーショ ンアッセイ、またはマイクロアレイで用いることができる核酸配列であって、長
さが少なくとも約6ヌクレオチドから約60ヌクレオチド程度のもので、好適には1
5〜30ヌクレオチド、より好適には20〜25ヌクレオチドであるものを指す。ここ で用いる「オリゴヌクレオチド」は、当技術分野において一般に定義されている用
語「アンプライマー」、「プライマー」、「オリゴマー」、及び「プローブ」と
概ね同義である。As used herein, “oligonucleotide” is a nucleic acid sequence that can be used in a PCR amplification or hybridization assay, or a microarray, and has a length of at least about 6 nucleotides to about 60 nucleotides. Is 1
5 to 30 nucleotides, more preferably 20 to 25 nucleotides. As used herein, "oligonucleotide" is generally synonymous with the terms "amplimer", "primer", "oligomer", and "probe" as commonly defined in the art.

【００６１】 ここで用いる「ペプチド核酸」（PNA）は、リジンを末端とするアミノ酸残基 のペプチドバックボーンに結合した5ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレオ チドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤(anti-gene agent)を指す。末端の リジンがその組成に溶解性を賦与している。PNAは相補的な1本鎖DNAやRNAに優先
的に結合して転写物の伸長を止め、またPNAをポリエチレングリコール化して細 胞におけるPNAの寿命を延ばすことが可能である。（Nielsen, P.E.ら(1993) Ant
icancer Drug Des. 8:53-63）。As used herein, “peptide nucleic acid” (PNA) refers to an antisense molecule or an antigenic agent (antisense molecule) containing an oligonucleotide having a length of 5 nucleotides or more linked to a peptide backbone of lysine-terminated amino acid residues. -gene agent). Terminal lysine confers solubility to its composition. PNAs can preferentially bind to complementary single-stranded DNA or RNA and stop transcript elongation, and can also PNA-polyethylene glycol extend the life of PNAs in cells. (Nielsen, PE et al. (1993) Ant
icancer Drug Des. 8: 53-63).

【００６２】 ここで用いる用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。HCRMをコ
ードする核酸、若しくはその断片、またHCRM自体を含む疑いのある生物学的サン
プルは、体液や、細胞から分離された染色体、細胞小器官、又は細胞膜からの抽
出物や、細胞や、（溶液中の、或いは固体支持体に結合した）ゲノムのDNA、RNA
、またはcDNAや、組織や、組織プリントその他を含み得る。As used herein, the term “sample” is used in its broadest sense. Biological samples suspected of containing the HCRM-encoding nucleic acid, or fragment thereof, or HCRM itself, can be obtained from body fluids, chromosomes isolated from cells, organelles, or extracts from cell membranes, cells, ( Genomic DNA or RNA (in solution or bound to a solid support)
Or cDNA, tissue, tissue prints, and the like.

【００６３】 ここで用いる用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、抗体ならび
にタンパク質もしくはペプチド、抗体及びアンタゴニストの相互作用を指す。こ
の相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば、結合する分子が認識する抗原
決定基、つまりエピトープ）の存在に左右されることを意味している。例えば、
抗体がエピトープ「A」に対して特異的である場合、標識された遊離した「A」及
びその抗体を含む反応において、エピトープA（つまり遊離し、標識されていな いA）を含むポリヌクレオチドが存在することにより、抗体に結合した標識され たAの量が低下する。As used herein, the term “specific binding” or “specifically binds” refers to antibodies and the interaction of proteins or peptides, antibodies and antagonists. This interaction means that it depends on the presence of a particular structure of the protein (eg, an antigenic determinant or epitope recognized by the binding molecule). For example,
If the antibody is specific for epitope "A", then in a reaction involving labeled free "A" and the antibody, a polynucleotide comprising epitope A (i.e., free and unlabeled A) may be used. The presence reduces the amount of labeled A bound to the antibody.

【００６４】 ここで用いる用語「厳密（ストリンジェント）な条件」は、ポリヌクレオチド
配列と要求されたポリヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが可能な条
件を指す。適切な厳密な条件は、例えば、プレハイブリダイゼーションにおける
塩類またはホルムアミドの濃度、ハイブリダイゼーション溶液、ハイブリダイゼ
ーション温度によって定義することが可能であり、これらの条件は当技術分野で
周知である。特に、塩類の濃度を低下させることや、ホルムアミドの濃度を上昇
させることや、ハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって厳密性が
増す。As used herein, the term “stringent conditions” refers to conditions that permit hybridization of a polynucleotide sequence with a required polynucleotide sequence. Suitable stringent conditions can be defined, for example, by the concentration of salts or formamide in the prehybridization, the hybridization solution, the hybridization temperature, and these conditions are well known in the art. In particular, decreasing the salt concentration, increasing the formamide concentration, and increasing the hybridization temperature increase the stringency.

【００６５】 例えば、高い厳密性の条件の下でのハイブリダイゼーションは、約37℃〜42℃
の約50%のホルムアミド中において起こり得る。またハイブリダイゼーションは 、約30℃〜35℃の約35%〜25%のホルムアミド中の緩やかな厳密性の条件下で起こ
り得る。特に、ハイブリダイゼーションは、42℃の50%のホルムアミド中、5X SS
PE、0.3%SDS、および200μg/mlの切断され変性したサケの***DNA、という高い 厳密性の条件下で起こり得る。また、ハイブリダイゼーションは、温度を35℃に
低下させた35%のホルムアミド中において、前述のような緩やかな厳密性の条件 下で起こり得る。特定のレベルの厳密性に対応する温度範囲は、対象物の核酸の
ピリミジンに対するプリンの割合を算出して、温度を調節することによってさら
に狭めることができる。上述の温度範囲および条件の変更例は、当業者には周知
である。For example, hybridization under conditions of high stringency is about 37 ° C. to 42 ° C.
Can occur in about 50% of formamide. Hybridization can also occur under mild stringency in about 35% to 25% formamide at about 30 ° C to 35 ° C. In particular, hybridization was performed at 5X SS in 50% formamide at 42 ° C.
It can occur under the high stringency conditions of PE, 0.3% SDS, and 200 μg / ml of cut and denatured salmon semen DNA. Hybridization can also take place in 35% formamide at a reduced temperature of 35 ° C., under mild stringent conditions as described above. The temperature range corresponding to a particular level of stringency can be further narrowed by calculating the ratio of purines to pyrimidines of the subject nucleic acids and adjusting the temperature. Modifications of the above temperature ranges and conditions are well known to those skilled in the art.

【００６６】 ここで用いる用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれた核酸配列
又はアミノ酸配列であって、天然にはそれが結合して存在する他の構成成分から
単離又は分離されて、その構成要素が60%以上、好ましくは75%以上、最も好まし
くは90%以上除去された核酸配列又はアミノ酸配列である。As used herein, the term “substantially purified” is a nucleic acid or amino acid sequence that has been removed from its natural environment and is isolated or separated from other components with which it is naturally associated. A nucleic acid sequence or amino acid sequence whose components have been removed by 60% or more, preferably 75% or more, and most preferably 90% or more.

【００６７】 ここで用いる「置換」は、それぞれ1個または2個以上のヌクレオチド或いはア
ミノ酸を、別のヌクレオチド或いはアミノ酸に各々置換することを指す。As used herein, “substitution” refers to the replacement of one or more nucleotides or amino acids, respectively, with another nucleotide or amino acid.

【００６８】 ここで用いる「形質転換」の定義は、外来性のDNAが入り込みレシピエント細 胞を変化させるプロセスを意味する。形質転換は、当業者に周知の種々の方法を
用いた天然または人工の条件の下で起こり、また外来性の核酸配列を原核細胞ま
たは真核細胞の宿主細胞に導入するための任意の既知の方法に基づき得る。形質
転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択され、以下に限定
はされないが、ウイルス感染、熱ショック、電気穿孔法（エレクトロポレーショ
ン）、リポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法が含まれる。このような「
形質転換された」細胞には、挿入されたDNAを自律的に複製するプラスミドとし て、または宿主の染色体の一部として複製が可能な安定的に形質転換された細胞
が含まれ、またそれは限られた時間で導入されたDNAやRNAを一過性に発現する細
胞を指す。As used herein, the term “transformation” refers to the process by which exogenous DNA enters and changes a recipient cell. Transformation can occur under natural or artificial conditions using a variety of methods well known to those of skill in the art, and any known method for introducing foreign nucleic acid sequences into prokaryotic or eukaryotic host cells. May be based on the method. Transformation methods are selected according to the type of host cell to be transformed and include, but are not limited to, viral infection, heat shock, electroporation, lipofection, and methods using microprojectile bombardment. It is. like this"
`` Transformed '' cells include, but are not limited to, stably transformed cells capable of replicating the inserted DNA autonomously or as part of the host chromosome. A cell that transiently expresses DNA or RNA introduced at a given time.

【００６９】 ここで用いるHCRMの「変異体」は、1又は2以上のアミノ酸が変異したアミノ酸
配列である。この変異体は「保存的」変化を含むものであり得、この場合、例え
ばロイシンをイソロイシンで置き換えるように、置換されるアミノ酸が類似な構
造的及び化学的特性を有する。稀にではあるが、例えばグリシンがトリプトファ
ンで置換されるように、変異体が「非保存的」に変化する場合もある。類似した
小さい変化には、アミノ酸の欠失または挿入、或いはその両方が含まれる。例え
ばDNASTARソフトウエアのような周知のコンピュータプログラムを用いて、何れ のアミノ酸残基が生物学的或いは免疫学的活性を損なわずに置換、挿入、又は除
去可能であるということを決定するガイダンスを提供することができる。As used herein, a “variant” of HCRM is an amino acid sequence in which one or more amino acids are mutated. The variants may contain "conservative" changes, wherein the substituted amino acid has similar structural and chemical properties, for example, replacing leucine with isoleucine. In rare cases, a variant may be changed "non-conservatively", for example, glycine is replaced by tryptophan. Similar small changes include amino acid deletions or insertions, or both. Provides guidance to determine which amino acid residues can be substituted, inserted, or removed without compromising biological or immunological activity using well-known computer programs, such as DNASTAR software can do.

【００７０】 発明 本発明は、新規のヒトチャネル関連分子（HCRM）、HCRMをコードするポリヌク
レオチド、並びに細胞増殖性の障害および輸送障害の診断、予防、又は治療のた
めのこれらの組成物の使用法の発見に基づくものである。[0070] INVENTION The present invention relates to the use of novel human channel related molecules (HCRM), polynucleotides encoding HCRM, and diagnosis of cell proliferative disorders and transport disorders, prevention, or their compositions for the treatment It is based on the discovery of the law.

【００７１】 本発明のHCRM-1をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントのためのコン
ピュータ検索を用い、前立腺腫瘍cDNAライブラリーPROSTUT10からのインサイト 社クローン1690887に於いて初めて同定された。コンセンサス配列、SEQ ID NO:2
は、次に挙げる重複且つ／又は伸長された核酸配列、インサイト社クローン1690
887 (PROSTUT10)、2450043 (ENDANOT01)、1319369 (BLADNOT04)、並びにショッ トガン配列 SAJA00674及びSAJA00766から導出された。The nucleic acid encoding HCRM-1 of the present invention was first identified in Incyte clone 1690887 from the prostate tumor cDNA library PROSTUT10 using computer searches for amino acid sequence alignment. Consensus sequence, SEQ ID NO: 2
Is a duplicated and / or extended nucleic acid sequence listed below, Incyte clone 1690
887 (PROSTUT10), 2450043 (ENDANOT01), 1319369 (BLADNOT04), and derived from the shotgun sequences SAJA00674 and SAJA00766.

【００７２】 一実施例において、本発明は図１に示すSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むポ リペプチドを包含する。HCRM-1は、215のアミノ酸の長さであり、残基N₃₉及びN_{1 18} の2つの潜在的Nグルコシル化部位と、残基S₂₀₈の潜在的cAMP及びcGMP依存性の
プロテインキナーゼリン酸化部位と、残基S₁₉₅の潜在的カゼインキナーゼIIリン
酸化部位と、残基S₆、T₃₁、S₈₈、及びT₁₄₅の4つの潜在的プロテインキナーゼCリ
ン酸化部位とを有する。図４Ａに示すように、疎水性分析はN末端のシグナルペ プチド（残基M1からL21までの間）及び1つの膜貫通ドメイン（概ね残基151と175
の間）を予測している。およそヌクレオチド400からヌクレオチド432までのSEQ
ID NO:2の断片は、ハイブリダイゼーションプローブに有用である。図１に示す ように、HCRM-1は、ラットのナトリウムチャネルβ2サブユニット（GI 1086497;
SEQ ID NO:7）と化学的および構造的相同性を有する。詳述すると、HCRM-1とラ
ットタンパク質は長さが等しく、22%のアミノ酸同一性を共有する。更に、図４ Ａ及び図４Ｂに示すように、2つのタンパク質は類似の等電点（各々6.8及び6.4 ）と疎水性プロットを有する。特に、それらのタンパク質は共にC末端ハーフ(C-
terminal half)における類似の位置に潜在的N末端シグナルペプチド及び1つの潜
在的膜貫通ドメインを含む。また、それらのタンパク質は共にN末端ハーフにお ける1つの予測された免疫グロブリンの折畳み(fold)（HCRM-1の残基40から125の
間）を含み、またHCRM-1の残基N₃₉の潜在的Nグルコシル化部位を共有する。ノー
ザン分析は、種々のライブラリーにおけるこの配列の発現を示し、これらの少な
くとも70%が不死化、即ち癌性であり、少なくとも18%が免疫応答に関与するもの
である。注目すべきは、生殖（36%）、心血管（18%）、胃腸（14%）、及び神経 （14%）の組織におけるHCRM-1の発現である。In one embodiment, the invention encompasses a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 shown in FIG. HCRM-1 is 215 in length of the amino acid, and two potential N glycosylation site residues N ₃₉ and N _{1 18,} potential cAMP and cGMP dependent protein kinase phosphorylation of residues S ₂₀₈ has a site, a potential casein kinase II phosphorylation sites residues S _195, and four potential protein kinase C phosphorylation sites at residue _{S 6, T 31, S 88} , and T _145. As shown in FIG. 4A, the hydrophobicity analysis revealed an N-terminal signal peptide (from residue M1 to L21) and one transmembrane domain (approximately residues 151 and 175).
Between). SEQ ID from about nucleotide 400 to nucleotide 432
Fragments of ID NO: 2 are useful for hybridization probes. As shown in FIG. 1, HCRM-1 is a rat sodium channel β2 subunit (GI 1086497;
SEQ ID NO: 7) has chemical and structural homology. Specifically, HCRM-1 and the rat protein are equal in length and share 22% amino acid identity. Furthermore, as shown in FIGS. 4A and 4B, the two proteins have similar isoelectric points (6.8 and 6.4, respectively) and a hydrophobicity plot. In particular, both proteins are C-terminal half (C-
A similar position in the terminal half) contains a potential N-terminal signal peptide and one potential transmembrane domain. Also, both proteins contain one predicted immunoglobulin fold in the N-terminal half (between residues 40 and 125 of HCRM-1), and residues N _{39 of} HCRM-1. Share a potential N-glycosylation site. Northern analysis shows the expression of this sequence in various libraries, at least 70% of which are immortal, ie cancerous, and at least 18% are involved in the immune response. Of note is the expression of HCRM-1 in reproductive (36%), cardiovascular (18%), gastrointestinal (14%), and neural (14%) tissues.

【００７３】 本発明のHCRM-2をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントのためのコン
ピュータ検索を用い、***腫瘍cDNAライブラリーBRSTTUT03からのインサイト社 クローン1998015に於いて初めて同定された。コンセンサス配列、SEQ ID NO:4は
、次に挙げる重複且つ／又は伸長された核酸配列、インサイト社クローン199801
5 (BRSTTUT03)、1673587 (BLADNOT05)、201937 (MPHGNOT02)、及び1365048 (SCO
RNON02)から導出された。The nucleic acid encoding HCRM-2 of the present invention was first identified in Insights clone 1998015 from the breast tumor cDNA library BRSTTUT03 using computer searches for amino acid sequence alignment. The consensus sequence, SEQ ID NO: 4, is a duplicated and / or extended nucleic acid sequence listed below, Insights clone 199801.
5 (BRSTTUT03), 1673587 (BLADNOT05), 201937 (MPHGNOT02), and 1365048 (SCO
RNON02).

【００７４】 別の実施例において、本発明は図２に示すSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む ポリペプチドを包含する。HCRM-2は、178のアミノ酸の長さであり、残基T₂₃、S_{3 1} 、T₃₆、T₈₇、及びT₁₀₆の5つの潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位と、残基
S₄、T₂₃、T₉₁、S₉₄、S₁₀₈、T₁₂₃、T₁₄₁、及びS₁₆₃の8つの潜在的プロテインキナ
ーゼCリン酸化部位と、残基Y₅₁の1つの潜在的チロシンリン酸化部位とを有する 。図５Ａに示すように、疎水性分析は潜在的N末端のシグナルペプチド（残基M₁ −G₂₁の間）及び1つの潜在的膜貫通ドメイン（概ね残基146−164の間）を予測し
ている。およそヌクレオチド466からヌクレオチド495までのSEQ ID NO:4の断片 は、ハイブリダイゼーションプローブに有用である。図２に示すように、HCRM-2
は、マウスのイオンチャネルホモログRIC（GI 1872491; SEQ ID NO:8）と化学的
および構造的相同性を有する。詳述すると、HCRM-2とマウスタンパク質は長さが
等しく、44%のアミノ酸同一性を共有する。更に、図５Ａ及び図５Ｂに示すよう にHCRM-2とマウスタンパク質は良く似た疎水性プロットを有する。それらのタン
パク質は共にC末端付近の類似の位置に1つの潜在的膜貫通ドメイン及び潜在的N 末端シグナルペプチドを有する。特に、2つのタンパク質は、膜貫通領域を囲む3
7のアミノ酸残基（残基134−167）に亘って92％の同一性を共有する。この領域 はイオンチャネルの作用として知られる他の幾つかのタンパク質の間で保存され
、「イオンチャネルホモロジードメイン」と称されている（Fu及びKamps, 前出） 。更に、2つのタンパク質は共にリン酸化のための多数の潜在的部位を含み、そ れらの幾つかは保存されている（例えば、T₁₀₆、S₄、T₂₃、T₁₄₁、及びS₁₆₃）。 ノーザン分析は、種々のライブラリーにおけるこの配列の発現を示し、これらの
少なくとも47%が不死化、即ち癌性であり、少なくとも34%が免疫応答に関与する
ものである。注目すべきは、造血／免疫（23%）、生殖（22%）、神経（14%）、 心血管（12%）、及び胃腸（12%）の組織におけるHCRM-2の発現である。In another embodiment, the invention encompasses a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 shown in FIG. HCRM-2 is 178 in length of the amino acid, and five potential Casein kinase II phosphorylation sites residues _{T 23, S 3 1, T} 36, T 87, and T _106, residues
_{S 4, T 23, T 91} , S 94, S 108, T 123, T 141, and eight potential protein kinase C phosphorylation sites S _163, 1 single potential tyrosine phosphorylation sites of residues Y ₅₁ And. As shown in FIG. 5A, hydrophobicity analysis predicted a potential N-terminal signal peptide (between residues M ₁ -G ₂₁ ) and one potential transmembrane domain (generally between residues 146-164). ing. A fragment of SEQ ID NO: 4 from about nucleotide 466 to nucleotide 495 is useful for hybridization probes. As shown in FIG.
Has chemical and structural homology to the mouse ion channel homolog RIC (GI 1872491; SEQ ID NO: 8). Specifically, HCRM-2 and the mouse protein are equal in length and share 44% amino acid identity. Further, as shown in FIGS. 5A and 5B, HCRM-2 and the mouse protein have similar hydrophobicity plots. Both of these proteins have one potential transmembrane domain and a potential N-terminal signal peptide at similar positions near the C-terminus. In particular, two proteins surround the transmembrane region 3
Shares 92% identity over 7 amino acid residues (residues 134-167). This region is conserved among several other proteins known to act as ion channels and has been termed the "ion channel homology domain" (Fu and Kamps, supra ). Furthermore, both proteins contain a number of potential sites for phosphorylation, some of which are conserved (eg, T ₁₀₆ , S ₄ , T ₂₃ , T ₁₄₁ , and S ₁₆₃ ). . Northern analysis indicates expression of this sequence in various libraries, at least 47% of which are immortalized, ie, cancerous, and at least 34% are involved in the immune response. Of note is the expression of HCRM-2 in hematopoietic / immune (23%), reproductive (22%), neural (14%), cardiovascular (12%), and gastrointestinal (12%) tissues.

【００７５】 本発明のHCRM-3をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントのためのコン
ピュータ検索を用い、卵巣腫瘍cDNAライブラリーOVARTUT01からのインサイト社 クローン2252446に於いて初めて同定された。コンセンサス配列、SEQ ID NO:6は
、次に挙げる重複且つ／又は伸長された核酸配列、インサイト社クローン225244
6 (OVARTUT01)、3565127 (SKINNOT05)、2361202 (LUNGFET05)、2187234 (PROSNO
T26)、及び2195293 (THYRTUT03)から導出された。The nucleic acid encoding HCRM-3 of the present invention was first identified in Incyte clone 2252446 from the ovarian tumor cDNA library OVARTUT01 using computer searches for amino acid sequence alignment. The consensus sequence, SEQ ID NO: 6, is a duplicated and / or extended nucleic acid sequence listed below, Insight clone 225244
6 (OVARTUT01), 3565127 (SKINNOT05), 2361202 (LUNGFET05), 2187234 (PROSNO
T26), and 2195293 (THYRTUT03).

【００７６】 別の実施例において、本発明は図３Ａ及び図３Ｂに示すSEQ ID NO:5のアミノ 酸配列を含むポリペプチドを包含する。HCRM-3は、229のアミノ酸の長さであり 、残基S₉、T₁₆、S₂₃、S₂₅、T₈₀、及びT₉₆の6つの潜在的カゼインキナーゼIIリン
酸化部位と、残基T₂₀、S₄₉、T₉₂、T₁₁₂、及びS₁₅₈の5つの潜在的プロテインキナ
ーゼCリン酸化部位とを有する。およそヌクレオチド868からヌクレオチド900ま でのSEQ ID NO:6の断片は、ハイブリダイゼーションプローブに有用である。図 ３Ａ及び図３Ｂに示すように、HCRM-3は、ラットの精巣からの核タンパク質 p62
様タンパク質（GI 913246; SEQ ID NO:9）と化学的および構造的相同性を有する
。詳述すると、HCRM-3とラットタンパク質は24%の同一性を共有する。特に、HCR
M-3の残基79−109の間の31の残基の領域は、ラットタンパク質と84%の同一性を 共有する。更に、HCRM-3とラットタンパク質は、類似の高度に塩基性の等電点（
各々8.9と9.0）を有し、HCRM-3の残基T₈₀、T₉₂、及びT₉₆の潜在的リン酸化部位 を共有する。ノーザン分析は、種々のライブラリーにおけるこの配列の発現を示
し、これらの少なくとも47%が不死化、即ち癌性であり、少なくとも21%が胎生ま
たは増殖細胞に由来するものであり、少なくとも16%が免疫応答に関与するもの である。注目すべきは、生殖（42%）及び発育性（16%）の組織におけるHCRM-3の
発現である。In another embodiment, the invention encompasses a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 as shown in FIGS. 3A and 3B. HCRM-3 is 229 in length of the amino acid residues _{S 9, T 16, S 23} , S 25, T 80, and six potential casein kinase II phosphorylation sites T _96, residues T ₂₀ , S ₄₉ , T ₉₂ , T ₁₁₂ , and S ₁₅₈ with five potential protein kinase C phosphorylation sites. Fragments of SEQ ID NO: 6 from about nucleotide 868 to nucleotide 900 are useful for hybridization probes. As shown in FIGS. 3A and 3B, HCRM-3 is a nuclear protein from rat testis p62.
And chemical and structural homology with GI-like protein (GI 913246; SEQ ID NO: 9). Specifically, HCRM-3 and the rat protein share 24% identity. In particular, HCR
A region of 31 residues between residues 79-109 of M-3 shares 84% identity with the rat protein. Furthermore, HCRM-3 and rat proteins have similar highly basic isoelectric points (
8.9 and 9.0), respectively, and share potential phosphorylation sites at residues T ₈₀ , T ₉₂ , and T ₉₆ of HCRM-3. Northern analysis shows expression of this sequence in various libraries, at least 47% of which are immortalized, i.e., cancerous, at least 21% are derived from embryonic or proliferating cells, and at least 16% It is involved in the immune response. Of note is the expression of HCRM-3 in reproductive (42%) and developmental (16%) tissues.

【００７７】 また、本発明はHCRMの変異体を含む。HCRM変異体は、HCRMアミノ酸配列に対し
て好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少
なくとも95%以上のアミノ酸配列の同一性を有し、またHCRMの機能的もしくは構 造的特徴の少なくとも１つを含むアミノ酸配列である。The present invention also includes variants of HCRM. The HCRM variant preferably has at least 80%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% or more amino acid sequence identity to the HCRM amino acid sequence, and has a functional or structural An amino acid sequence comprising at least one of the features.

【００７８】 さらに、本発明はHCRMをコードするポリヌクレオチドを包含する。特定の実施
例において、本発明はHCRM-1をコードするSEQ ID NO:2の配列を含むポリヌクレ オチド配列を包含する。別の実施例において、本発明はHCRM-2をコードするSEQ
ID NO:4の配列を含むポリヌクレオチド配列を包含する。更なる実施例において 、本発明はHCRM-3をコードするSEQ ID NO:6の配列を含むポリヌクレオチド配列 を包含する。Further, the present invention includes a polynucleotide encoding HCRM. In certain embodiments, the invention encompasses a polynucleotide sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 2 that encodes HCRM-1. In another embodiment, the present invention provides a SEQ ID NO: encoding HCRM-2.
Includes polynucleotide sequences comprising the sequence of ID NO: 4. In a further embodiment, the invention encompasses a polynucleotide sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 6 encoding HCRM-3.

【００７９】 さらに、本発明はHCRMをコードするポリヌクレオチドの変異配列を含む。特に
、そのようなポリヌクレオチドの変異配列は、HCRMをコードするポリヌクレオチ
ド配列に対して少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは
少なくとも95%以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する。本発明の特定の 態様には、SEQ ID NO:2の変異配列が含まれ、それはSEQ ID NO:2対して少なくと
も80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%以上のポ リヌクレオチド配列の同一性を有する。また本発明にはSEQ ID NO:4の変異配列 が含まれ、それはSEQ ID NO:4対して少なくとも80%、より好ましくは少なくとも
90%、最も好ましくは少なくとも95%以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有す
る。更に本発明にはSEQ ID NO:6の変異配列が含まれ、それはSEQ ID NO:6対して
少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95% 以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する。上記のポリヌクレオチドの変異
配列は何れもHCRMの機能的または構造的特徴の少なくとも1つを含むアミノ酸配 列をコードすることが可能である。Further, the present invention includes a mutant sequence of a polynucleotide encoding HCRM. In particular, such polynucleotide variant sequences will have at least 80%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% or more polynucleotide sequence identity to the polynucleotide sequence encoding HCRM. Certain embodiments of the present invention include a mutant sequence of SEQ ID NO: 2, which comprises at least 80%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% or more polypeptides relative to SEQ ID NO: 2. Has nucleotide sequence identity. The invention also includes a variant sequence of SEQ ID NO: 4, which comprises at least 80%, more preferably at least 80%, relative to SEQ ID NO: 4.
It has 90%, most preferably at least 95% or more, polynucleotide sequence identity. The invention further includes a variant sequence of SEQ ID NO: 6, which comprises at least 80%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% or more polynucleotide sequence identity to SEQ ID NO: 6. Having. Any of the above mutant sequences of the polynucleotide can encode an amino acid sequence containing at least one of the functional or structural characteristics of HCRM.

【００８０】 遺伝暗号の縮重の結果、既知のの遺伝子及び自然発生の遺伝子のポリヌクレオ
チド配列に対する最小の相同性を有する幾つかのものを含め、多数のHCRMをコー
ドするポリヌクレオチド配列が作り出されることが、当業者には理解されるであ
ろう。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せの選択により作り出
され得るポリヌクレオチド配列の可能な全ての変異を考慮している。これらの組
合せは自然発生のHCRMのヌクレオチド配列に対し適用されるような標準のトリプ
レット遺伝暗号に従い作り出されるものであり、また全てのそのような変異はこ
こに明確に開示されると考えられたい。The degeneracy of the genetic code results in the production of a large number of HCRM-encoding polynucleotide sequences, including those with minimal homology to known and naturally occurring gene polynucleotide sequences. It will be understood by those skilled in the art. Thus, the present invention contemplates all possible variations in the polynucleotide sequence that can be created by selecting combinations based on possible codon choices. These combinations are to be generated according to the standard triplet genetic code as applied to the nucleotide sequence of the naturally occurring HCRM, and all such variations are to be considered specifically disclosed herein.

【００８１】 HCRMをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適切に選択された厳
密性の条件下に於いて、好ましくは自然発生のHCRMのヌクレオチド配列に対しハ
イブリダイズ可能であり、それは実質的に異なるコドンの用法を有するHCRM又は
その誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すのに有利である。特定のコ
ドンが宿主により利用される頻度に従い、真核生物又は原核生物の宿主に於いて
ペプチドの発現が起こる割合を高めるようにコドンを選択することができる。コ
ードされるアミノ酸配列を変化させることなしにHCRM及びその誘導体をコードす
るヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の配列から作り出
された転写物よりも長い半減期のようなより望ましい特性を有するRNA転写物を 作り出すためである。The nucleotide sequence encoding HCRM and its mutated sequences are preferably capable of hybridizing under appropriately selected stringency conditions to the nucleotide sequence of naturally occurring HCRM, It is advantageous to create nucleotide sequences encoding HCRM or derivatives thereof with different codon usage. Depending on the frequency with which particular codons are utilized by the host, codons can be selected to increase the rate at which expression of the peptide occurs in eukaryotic or prokaryotic hosts. Another reason to substantially alter the nucleotide sequence encoding HCRM and its derivatives without altering the encoded amino acid sequence is that it has a longer half-life than transcripts created from naturally occurring sequences. This is to create an RNA transcript with the desired properties.

【００８２】 また本発明は、HCRM及びその誘導体をコードするDNA配列、またはその断片を 専ら合成化学によって作り出すことを含む。作製の後に、合成配列を当業者によ
って周知の試薬を用いて任意の多数の利用可能な発現ベクター及び細胞系に挿入
することが可能である。更に、合成化学を利用してHCRMをコードする配列又はそ
れらの任意のフラグメントに突然変異を導入しうる。The present invention also includes the production of DNA sequences encoding HCRM and its derivatives, or fragments thereof, exclusively by synthetic chemistry. After construction, the synthetic sequences can be inserted into any of a number of available expression vectors and cell lines using reagents well known to those of skill in the art. In addition, synthetic chemistry can be used to introduce mutations into the HCRM-encoding sequence or any fragment thereof.

【００８３】 また本発明に包含されるものには、種々の厳密な条件の下で、特に以下の請求
されたポリヌクレオチド配列、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ I
D NO:2の断片、SEQ ID NO:4の断片、又はSEQ ID NO:6の断片に対してハイブリダ
イズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Ber
ger(1987) Methods Enzymol.152:399-407；Kimmel, A.R.(1987)Methods Enzymol
.152:507-511参照）。Also included in the invention are the following claimed polynucleotide sequences under various stringent conditions, in particular: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 , SEQ I
Includes polynucleotide sequences that are capable of hybridizing to a fragment of D NO: 2, a fragment of SEQ ID NO: 4, or a fragment of SEQ ID NO: 6 (eg, Wahl, GM and SL Ber.
ger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407; Kimmel, AR (1987) Methods Enzymol.
.152: 507-511).

【００８４】 DNA塩基配列決定方法は周知のものであり、一般に先行技術に於いても利用さ れ、本発明の任意の実施例においても利用されうる。その方法は、DNAポリメラ ーゼＩのクレノウフラグメント、Sequenase ^ョ（US Biochemical Corp,Cleveland ,OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、耐熱性T7ポリメラーゼ（Amersham,
Chicago,IL）、或いはELONGASE増幅システム（GIBCO/BRL,Gaithersburg,MD）に 於いて発見されたようなプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ及びポリメラ
ーゼの組合せのような酵素を使用する。そのプロセスは、Hamilton Micro Lab 2
200（Hamilton,Reno,NV）、Peltier Thermal Cycler（PTC200; MJ Research,Wat
ertown,MA）及びABI Catalyst及び373及び377 DNA sequencers（Perkin Elmer）
のような装置によって自動化することが好ましい。[0084] DNA sequencing methods are well known and are generally used in the prior art, and may be used in any of the embodiments of the present invention. The method Klenow fragment of DNA polymerase peptidase I, Sequenase ^® (US Biochemical Corp, Cleveland, OH ), Taq polymerase (Perkin Elmer), thermostable T7 polymerase (Amersham,
Enzymes such as proofreading exonuclease and polymerase combinations as found in the ELONGASE amplification system (GIBCO / BRL, Gaithersburg, MD). The process is based on Hamilton Micro Lab 2
200 (Hamilton, Reno, NV), Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Wat
ertown, MA) and ABI Catalyst and 373 and 377 DNA sequencers (Perkin Elmer)
It is preferred to automate by such a device.

【００８５】 HCRMをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列を用いて先行技術に
於いて周知の種々の方法で伸長し、プロモータ及び調節エレメントのような上流
の配列を検出することができる。例えば、用いられる方法の１つである制限部位
PCR法は、一般的なプライマーを使用し、既知の位置に隣接する未知の配列を検 索する（例えば、Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic.2:318-322参照）。特
にゲノムDNAは、ベクターの中のリンカー配列に対して相補的なプライマー及び ヌクレオチド配列の領域に対して特異的なプライマーの存在下に於いてまず増幅
される。次に増幅された配列は、同様なリンカープライマー及び最初のものの内
に含まれる別の特異的プライマのを用いて、2ラウンドのPCRを受ける。各ラウン
ドのPCRの生成物は、適切なRNAポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用
い配列決定される。The nucleic acid sequence encoding HCRM can be extended using the partial nucleotide sequence in a variety of ways well known in the prior art to detect upstream sequences such as promoters and regulatory elements. For example, the restriction site, one of the methods used
The PCR method uses common primers to search for unknown sequences flanking known positions (see, eg, Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2: 318-322). In particular, genomic DNA is first amplified in the presence of a primer complementary to the linker sequence in the vector and a primer specific to a region of the nucleotide sequence. The amplified sequence is then subjected to two rounds of PCR using similar linker primers and another specific primer contained within the first. The products of each round of PCR are transcribed using an appropriate RNA polymerase and sequenced using reverse transcriptase.

【００８６】 また逆PCR法(inverse PCR)を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを用
いた配列の増幅、または伸長を行なうこともできる。（例えば、Triglia,T.ら（
1988）Nucleic Acids Res 16:8186参照）。プライマーは、市販のOLIGO 4.06プ ライマー分析ソフトウエア（National Biosciences Inc.,Plymouth MN）や他の 適切なプログラムを用いて、長さが22〜30ヌクレオチドで、50%以上のGC含量を 有し、約68〜72℃の温度で標的配列をアニーリングするように設計する。その方
法により、いくつかの制限酵素を用いて遺伝子の既知領域における適当な断片を
作り出す。そこで、この断片を分子内連結反応により環状にし、PCR用の鋳型と して使用する。In addition, the sequence can be amplified or extended using various primers based on a known region using an inverse PCR method (inverse PCR). (For example, Triglia, T. et al. (
1988) Nucleic Acids Res 16: 8186). The primers are 22-30 nucleotides in length, have a GC content of 50% or more, using commercially available OLIGO 4.06 primer analysis software (National Biosciences Inc., Plymouth MN) or other suitable programs. Designed to anneal the target sequence at a temperature of about 68-72 ° C. By that method, several restriction enzymes are used to create appropriate fragments in known regions of the gene. Therefore, this fragment is circularized by intramolecular ligation and used as a template for PCR.

【００８７】 使用できる別の方法には捕獲PCR法(capture PCR)があり、この方法には、ヒト
及び酵母菌人工染色体DNA内の既知の配列に隣接するDNA断片のPCR増幅が含まれ る（例えば、Lagerstrom, M.ら（1991）PCR Methods Applic 1:111-119参照）。
またこの方法では、PCRの前に、複数の制限酵素による消化及びライゲーション を用いて、DNA分子の未知の断片に操作された2本鎖配列を配置することもできる
。未知の配列を引き出すために用いることができる別の方法が長業者に周知であ
る（例えば、Parker, J.D.ら(1991) Nucleic Acids Res.19:3055-3060）。更に 、PCR、入れ子状態のプライマー、PromoterFinder^TMライブラリーを用いて、ゲ ノムDNA歩行を行うことができる（Clontech, Palo Alto CA）。このプロセスは 、ライブラリーのスクリーニングが不要で、イントロン／エクソン接合部の発見
に有用である。Another method that can be used is capture PCR, which involves PCR amplification of DNA fragments adjacent to known sequences in human and yeast artificial chromosomal DNA ( See, for example, Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic 1: 111-119).
In this method, prior to PCR, the engineered double-stranded sequence can also be placed on an unknown fragment of the DNA molecule using digestion and ligation with multiple restriction enzymes. Other methods that can be used to derive unknown sequences are well known to the skilled artisan (eg, Parker, JD et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060). Furthermore, genomic DNA walking can be performed using PCR, nested primers, and PromoterFinder ^™ library (Clontech, Palo Alto CA). This process eliminates the need for library screening and is useful for finding intron / exon junctions.

【００８８】 完全長cDNAをスクリーニングするとき、大きなcDNAを含むようにサイズ選択さ
れたライブラリーを用いることが好ましい。またランダムに準備刺激された(ran
dom primed)ライブラリーは、遺伝子の5‘領域を含む配列をより多く含むという
点で好適である。ランダムに準備刺激されたライブラリーは、oligo d(T)ライブ
ラリーで完全長cDNAが得られない場合には特に好適である。またゲノムライブラ
リーは、5’非転写領域における配列の伸長のために役立ち得る。When screening for full-length cDNAs, it is preferable to use libraries that have been size-selected to include large cDNAs. It was also randomly primed (ran
dom primed) libraries are preferred in that they will contain more sequences that include the 5 'region of the gene. Randomly primed libraries are particularly preferred when the oligo d (T) library does not yield full-length cDNA. Genomic libraries can also serve for extension of sequence in the 5 'non-transcribed region.

【００８９】 配列決定やPCRの産物のヌクレオチド配列のサイズ分析または確認のために、 市販のキャピラリー電気泳動法システムを用いることができる。特に、キャピラ
リーシークエンシングでは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザーで
活性化される4つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに対して1つ）、放射された
波長の検出を行うCCDカメラを使用する。出力／光強度は適切なソフトウエア（ 例えば、Perkin Elmer製のGenotyper^TM及びSequence Navigator^TM）を用いて電 気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ解析及び電子デー
タ表示までの全過程がコンピュータ制御され得る。キャピラリー電気泳動法は、
特定のサンプル内に限られた量だけ存在するDNAの小片の配列決定に特に好適で ある。A commercially available capillary electrophoresis system can be used for size analysis or confirmation of the nucleotide sequence of the product of sequencing or PCR. In particular, capillary sequencing uses a flowable polymer for electrophoretic separation, four different laser-activated fluorescent dyes (one for each nucleotide), and a CCD camera that detects the emitted wavelength. I do. Output / light intensity is converted to electrical signals using appropriate software (eg, Genotyper ^™ and Sequence Navigator ^{™ from} Perkin Elmer), and the entire process from sample loading to computer analysis and electronic data display is computer controlled. Can be done. Capillary electrophoresis is
It is particularly suitable for sequencing small pieces of DNA that are present in limited amounts in a particular sample.

【００９０】 本発明の別の実施例では、HCRMをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子に用いて、HCRM、その断片またはその機能的等価物の適切 な宿主細胞内における発現を指向することができる。遺伝暗号の固有の縮重によ
って、実質的に同一、即ち機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のDNA配 列が作り出され、これらの配列はHCRMのクローニングや発現のために用いること
ができる。In another embodiment of the present invention, a polynucleotide sequence encoding HCRM, or a fragment thereof, is used in a recombinant DNA molecule to express HCRM, a fragment thereof, or a functional equivalent thereof, in a suitable host cell. Can be oriented. The inherent degeneracy of the genetic code creates other DNA sequences that encode substantially identical, ie, functionally equivalent, amino acid sequences, which can be used for cloning and expression of HCRM. .

【００９１】 当業者に理解されるように、非自然発生コドンを有するHCRMをコード化するヌ
クレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。例えば、特定の原核生物或い
は真核生物の宿主において選好されるコドンを選択することにより、タンパク質
の発現率を増大させたり、或いは自然発生配列から生成された転写物よりも長い
半減期であるような望ましい特性を有するRNA転写物を作製することが可能であ る。As will be appreciated by those skilled in the art, it may be beneficial to create a nucleotide sequence that encodes HCRM with non-naturally occurring codons. For example, selecting a preferred codon in a particular prokaryotic or eukaryotic host may increase the expression of the protein or result in a longer half-life than transcripts generated from the naturally occurring sequences. It is possible to produce RNA transcripts having desirable characteristics.

【００９２】 限定はしないが遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現を改
変すること等の種々の理由により、HCRMをコードする配列を改変するために、本
発明のヌクレオチド配列を当業者に周知の方法を用いて操作可能である。ランダ
ムな断片化によるDNA混合や、遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのPCR再構
成を用いて、ヌクレオチド配列を操作できる。例えば、特異的部位の突然変異誘
発により、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選好の
変化、スプライシングバリアントの生成、及び突然変異の導入等をもたらすこと
ができる。[0092] In order to modify the sequence encoding HCRM, for various reasons including, but not limited to, altering the cloning, processing and / or expression of the gene product, the nucleotide sequence of the present invention can be modified by techniques known to those of skill in the art. Operable using the method. The nucleotide sequence can be manipulated using DNA mixing by random fragmentation or PCR reconstitution of gene fragments and synthetic oligonucleotides. For example, mutagenesis of specific sites can result in the insertion of new restriction sites, altered glycosylation patterns, altered codon preferences, generation of splicing variants, introduction of mutations, and the like.

【００９３】 本発明の別の実施例では、HCRMをコードする自然な、改変された、或いは組換
え型の核酸配列を、融合タンパク質をコードするために、非相同的な配列に結合
させうる。例えば、HCRM活性のインヒビターに対してペプチドライブラリーをス
クリーニングするために、市販の抗体により認識されるキメラHCRMタンパク質を
コードすることが有用である。また、融合タンパク質はHCRMコーディング配列と
非相同的なタンパク質配列との間の位置に切断部位を有するように操作可能であ
り、これによってHCRMを切断して非相同的な部分から分けて精製することが可能
となる。In another embodiment of the invention, a natural, modified or recombinant nucleic acid sequence encoding HCRM may be joined to a heterologous sequence to encode a fusion protein. For example, to screen a peptide library for inhibitors of HCRM activity, it is useful to encode a chimeric HCRM protein that is recognized by a commercially available antibody. Also, the fusion protein can be manipulated to have a cleavage site at a position between the HCRM coding sequence and the heterologous protein sequence, which allows the HCRM to be cleaved and purified separately from the heterologous portion. Becomes possible.

【００９４】 本発明の別の実施例では、当業者に周知の化学的手法を用いて、HCRMをコード
する配列の全体、或いはその一部を合成することができる（例えば、Caruthers.
M.H.ら(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn,T.ら(1980)Nucl.Acids R
es.Symp.Ser.225-232参照）。或いは、化学的手法を用いてタンパク質自体を作 り出し、HCRMのアミノ酸配列又はその一部を合成することができる。例えば、種
々の固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（例えば、Roberge, J.Y
.ら(1995) Science 269:202-204参照）。また、ABI 431Aペプチドシンセサイザ （Perkin Elmer）を用いて合成の自動化を行なうことができる。更に、HCRMのア
ミノ酸配列もしくはその任意の部分を、直接の合成において改変することにより
、並びに／又は他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と結合さ
せることにより、変異体ポリペプチドを生成可能である。In another embodiment of the present invention, the entire HCRM-encoding sequence, or a portion thereof, can be synthesized using chemical techniques well known to those of skill in the art (eg, Caruthers.
MH et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn, T. et al. (1980) Nucl.
es.Symp.Ser.225-232). Alternatively, the protein itself can be produced using a chemical technique, and the amino acid sequence of HCRM or a part thereof can be synthesized. For example, peptide synthesis can be performed using various solid phase techniques (eg, Roberge, JY
(1995) Science 269: 202-204). In addition, the synthesis can be automated using ABI 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer). In addition, variant polypeptides can be produced by modifying the amino acid sequence of HCRM or any portion thereof in direct synthesis and / or binding to sequences derived from other proteins or any portion thereof. It is.

【００９５】 そのペプチドは、分離用の高速液体クロマトグラフィにより実質的に精製する
ことができる（例えば、Chiez, R.M.およびRegnier. F.Z. (1990) Methods Enzy
mol. 182:392-421参照）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或いは配
列決定法により確認することができる（Creighton,T.(1983) Proteins. Structu res avd Molecular Properties ,WH Freeman and Co.,New York,NY）。The peptides can be substantially purified by preparative high performance liquid chromatography (eg, Chiez, RM and Regnier. FZ (1990) Methods Enzy
mol. 182: 392-421). The composition of the synthesized peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (Creighton, T. (1983) Proteins. Structures avd Molecular Properties , WH Freeman and Co., New York, NY).

【００９６】 生物学的に活性なHCRMを発現させるために、HCRMまたはその誘導体をコードす
るヌクレオチド配列またはその機能的等価物を、適切な発現ベクター（即ち、挿
入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクター）に挿
入する。To express a biologically active HCRM, a nucleotide sequence encoding HCRM or a derivative thereof, or a functional equivalent thereof, is inserted into a suitable expression vector (ie, the transcription and translation of the inserted coding sequence). Vector containing the necessary elements).

【００９７】 HCRMをコードする配列および適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベクター
を作製するために、当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in v itro 組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝的組換え技術が含まれる（例え
ば、Sambrook, J.ら(1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Cold Spri
ng Harbor Press,Plainview,NY,ch.4,8,及び16-17；Ausubel,F.M.ら(1995,and p
eriodic supplements)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley &
Sons,New York,NY,ch.9,13,及び16参照）。To create an expression vector containing a sequence encoding HCRM and appropriate transcriptional and translational regulatory regions, methods well known to those of skill in the art are used. These methods include in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination techniques (see, eg, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spri.
ng Harbor Press, Plainview, NY, ch. 4, 8, and 16-17; Ausubel, FM et al. (1995, and p.
eriodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley &
Sons, New York, NY, ch. 9, 13, and 16).

【００９８】 HCRMをコードする配列を包含し、発現するために、種々の発現ベクター／宿主
系が利用できる。これらには、以下に限定しないが、組換え型のバクテリオファ
ージ、プラスミド或いはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌のような 微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌や、ウイルス発現ベクター
（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター
（例えば、カリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTM
V）或いは細菌の発現ベクター（例えば、TiまたはpBR322プラスミド）で形質転 換した植物細胞系や、或いは動物細胞系が含まれる。本発明は、利用される宿主
細胞によって限定されるものではない。A variety of expression vector / host systems are available for including and expressing sequences encoding HCRM. These include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria transformed with recombinant bacteriophage, plasmid or cosmid DNA expression vectors, yeast transformed with yeast expression vectors, and viral expression vectors ( For example, an insect cell line infected with a baculovirus) or a virus expression vector (eg, cauliflower mosaic virus CaMV or tobacco mosaic virus ™)
V) or a plant cell line or an animal cell line transformed with a bacterial expression vector (eg, Ti or pBR322 plasmid). The present invention is not limited by the host cell utilized.

【００９９】 これらの系の「制御エレメント」或いは「調節配列」は、転写及び翻訳を実行
するために宿主細胞のタンパク質と相互作用するHCRMをコードするポリヌクレオ
チド配列及びベクターの非翻訳領域（例えば、エンハンサー、プロモーター並び
に5‘及び3’非翻訳領域）である。このようなエレメントの強さ及び特異性は様
々である。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及び誘導的プロモータ
ーを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントを用いることができる。例え
ば、細菌系にクローニングする場合、誘導性のプロモーター（例えば、Bluescri
ptョ ファージミド(Stratagene, LaJolla,CA)またはpSport1^TMプラスミド(Gibco BRL)のハイブリッドlacZプロモーター）を用いることができる。昆虫細胞におい
てバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを用いることができる。植物細胞
のゲノムに由来するプロモーター或いはエンハンサ（例えば、熱ショック, RUBI
SCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）、若しくは植物ウイルスに由来するプロモータ ー或いはエンハンサ（例えば、ウイルス性プロモータまたはリーダー配列）をベ
クターにクローンニングできる。哺乳類細胞系においては、哺乳類の遺伝子或い
は哺乳類ウイルス由来のプロモーターが好ましい。HCRMをコードする配列の多数
の複製を含む細胞株を作る必要がある場合、SV40或いはEBVに基づくベクターを 適切な選択マーカーと共に用いることができる。The “control elements” or “regulatory sequences” of these systems include polynucleotide sequences encoding HCRM that interact with host cell proteins to perform transcription and translation, and untranslated regions of vectors (eg, Enhancers, promoters and 5 'and 3' untranslated regions). The strength and specificity of such elements vary. Depending on the vector and host utilized, any number of suitable transcription and translation elements, including constitutive and inducible promoters, can be used. For example, when cloning into bacterial systems, inducible promoters (eg, Bluescri
Pt phagemid (Stratagene, LaJolla, CA) or the hybrid lacZ promoter of pSport1 ^™ plasmid (Gibco BRL) can be used. The baculovirus polyhedrin promoter can be used in insect cells. Promoters or enhancers derived from plant cell genomes (eg, heat shock, RUBI
Promoters or enhancers (eg, viral promoters or leader sequences) from plant viruses or SCO and storage protein genes can be cloned into vectors. In mammalian cell systems, promoters from mammalian genes or mammalian viruses are preferred. If it is necessary to generate a cell line that contains multiple copies of the sequence encoding HCRM, vectors based on SV40 or EBV can be used with an appropriate selectable marker.

【０１００】 細菌系では、HCRMの用途に応じて多数の発現ベクターを選択することができる
。例えば、抗体の誘発のために大量のHCRMが必要な場合は、容易に精製される融
合タンパク質を高レベルで発現するベクターを用いることができる。そのような
ベクターには、以下に限定しないが、HCRMをコードする配列を、アミノ末端メチ
オニン及び後続のβ-ガラクトシダーゼの7残基の配列を備えたフレーム内におい
てベクターに結合してハイブリッドタンパク質を生成できるBluescriptョ（Strat agene）のような、多機能の大腸菌クローニング、発現ベクター等が含まれる（ 例えば、Van Heeke, G.及びS.M. Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-55
09参照）。またpGEXベクター（Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden）も、グルタ
チオンS-トランスファーゼ（GST）を伴う融合タンパク質として異種ポリペプチ ドを発現するため用いることができる。一般的に、そのような融合タンパク質は
可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへ吸着させた後に遊離グルタチオ
ンの存在下で溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製できる。そ
のような系において生成されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン又はXA因子
プロテアーゼ切断部位を含み、目的のクローン化ポリペプチドをGST部分から随 意に放出させることができるように設計できる。In bacterial systems, a number of expression vectors may be selected depending on the use of the HCRM. For example, if large amounts of HCRM are required for antibody induction, vectors that express high levels of fusion proteins that are easily purified can be used. Such vectors include, but are not limited to, joining the HCRM-encoding sequence to the vector in frame with the amino-terminal methionine and the subsequent 7-residue sequence of β-galactosidase to form a hybrid protein. Multifunctional Escherichia coli cloning, expression vectors, etc., such as Bluescript (Stratgene) which can be used (for example, Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-55)
09). PGEX vectors (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) can also be used to express heterologous polypeptides as fusion proteins with glutathione S-transferase (GST). Generally, such fusion proteins are soluble and can be readily purified from lysed cells by adsorption to glutathione agarose beads followed by elution in the presence of free glutathione. The protein produced in such a system can be designed to include a heparin, thrombin, or factor XA protease cleavage site to allow for the optional release of the cloned polypeptide of interest from the GST moiety.

【０１０１】 酵母菌、Saccharomyces cerevisiaeでは、α因子、アルコールオキシダーゼ及
びPGHのような構成的或いは誘導的プロモーターを含む多数のベクターを用いる ことができる（例えばAusubelら前出; 及びGrantら(1987)Methods Enzymol. 153
:516-544参照）。[0102] yeast, the Saccharomyces cerevisiae, alpha factor, can be used a number of vectors containing constitutive or inducible promoters such as alcohol oxidase and PGH (e.g. supra Ausubel et al; and Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153
: 516-544).

【０１０２】 植物発現ベクターを用いる場合には、HCRMをコードする配列の発現は、多数の
プロモータの何れかで行なわれ得る。例えばCaMVの35S及び19Sプロモーターのよ
うなウイルスのプロモーターを単独で用いるか、或いはTMV（Takamatsu,N.ら(19
87)EMBO J.6:307-311）由来のオメガリーダー配列と併用することができる。或 いは、RUBISCOの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターのような植物プ ロモーターを用いてもよい（例えば、Coruzzi,G.ら（1984）EMBO J.3:1671-1680
）; Broglie,R.ら(1984)Science 224:838-843; 及びWinter,J.ら(1991)Results
Probl.Cell Differ.17:85-105参照）。これらの作製物は、直接のDNA形質転換ま
たは病原体が媒介した形質移入により植物細胞内に導入できる。このような技術
は一般に入手可能な多くの文献に記載されている（例えば、Hobbs, S.又はMurry
, L.E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）McGraw H
ill New York,NY; pp.191-196を参照）。When using a plant expression vector, expression of the sequence encoding HCRM can be performed with any of a number of promoters. For example, viral promoters such as the 35S and 19S promoters of CaMV are used alone, or TMV (Takamatsu, N. et al.
87) It can be used in combination with the omega leader sequence derived from EMBO J.6: 307-311). Alternatively, plant promoters such as the small subunit of RUBISCO or the heat shock promoter may be used (eg, Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680).
Broglie, R. et al. (1984) Science 224: 838-843; and Winter, J. et al. (1991) Results.
Probl. Cell Differ. 17: 85-105). These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection. Such techniques are described in many publicly available references (eg, Hobbs, S. or Murry).
, LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw H
ill New York, NY; pp. 191-196).

【０１０３】 昆虫系もHCRMの発現に用いることができる。例えば、そのような系の一つにお
いては、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼生において外来遺 伝子を発現するためのベクターとして、Autographa californica多核角体病ウイ
ルス（AcNPV）を用いる。HCRMをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子のよう なウイルスの非必須な領域にクローン化され、ポリヘドリンプロモーターの制御
下に置くことができる。HCRMをコードする配列の挿入の成功により、ポリヘドリ
ン遺伝子が不活性になり、コートタンパク質膜が欠如した組換え型のウイルスが
生成される。そこで、この組換え型のウイルスを用いて、例えばS.frugiperda細
胞またはTrichoplusiaの幼生へ感染させ、その中でHCRMを発現させることができ
る（例えば、Engelhard, E.K.ら(1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227参
照）。[0103] An insect system can also be used to express HCRM. For example, in one such system, Autographa californica polynuclear keratopathy virus (AcNPV) is used as a vector for expressing foreign genes in Spodoptera frugiperda cells or Trichoplusia larvae. Sequences encoding HCRM can be cloned into non-essential regions of the virus, such as the polyhedrin gene, and placed under the control of the polyhedrin promoter. Successful insertion of the HCRM-encoding sequence renders the polyhedrin gene inactive and produces a recombinant virus lacking the coat protein membrane. Thus, this recombinant virus can be used to infect, for example, S. frugiperda cells or Trichoplusia larvae and express HCRM therein (for example, Engelhard, EK et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 3224-3227).

【０１０４】 哺乳類の宿主細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用すること
ができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合、HCRMをコード
する配列が、後発のプロモータ及び三連のリーダー配列からなるアデノウイルス
転写／翻訳複合体の中に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須E1又はE3領域
における挿入により、感染した宿主細胞においてHCRMを発現可能である生存可能
なウイルスが得られる（例えば、Logan,J.及びShenk,T.(1984)Proc.Natl.Acad.S
ci.81:3655-3659参照）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーのよ
うな転写エンハンサーを、哺乳類の宿主細胞内の発現を増大させるために用いる
ことができる。[0104] In mammalian host cells, a number of viral-based expression systems are available. When an adenovirus is used as an expression vector, the sequence encoding HCRM can be ligated into an adenovirus transcription / translation complex consisting of the late promoter and tripartite leader sequence. Insertion at a non-essential E1 or E3 region of the viral genome results in a viable virus capable of expressing HCRM in infected host cells (eg, Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. .Acad.S
ci. 81: 3655-3659). In addition, transcription enhancers such as the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells.

【０１０５】 また、ヒト人工染色体（HAC）を用いることにより、プラスミドに含まれ発現 され得るものに比べてより大きなDNAの断片を供給することもできる。治療を目 的とし、6kb〜10MbのHACを構築して従来のデリバリー方法（リポソーム、ポリカ
チオンのアミノポリマー、又は小胞）を介して供給することができる。Further, by using a human artificial chromosome (HAC), it is possible to supply a larger DNA fragment than that which can be contained and expressed in a plasmid. For therapeutic purposes, 6 kb to 10 Mb of HAC can be constructed and delivered via conventional delivery methods (liposomes, polycationic amino polymers, or vesicles).

【０１０６】 また、特定の開始シグナルを用いて、HCRMをコードする配列のより効率的な翻
訳を行なうことができる。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接する 配列が含まれる。HCRMをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切
な発現ベクター内に挿入された場合、追加の転写または翻訳の制御シグナルは不
要である。しかし、コーディング配列又はその一部のみが挿入される場合には、
ATG開始コドンを含む外来性の翻訳制御シグナルを与えなければならない。さら に、全てのインサートの転写を確実にするために、開始コドンは正しい読み枠に
存在しなければならない。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び
合成の両方の種々の起源に由来するものであり得る。用いられる特定の細胞系に
適切なエンハンサーを含めることで、発現の効率を高めることができる（例えば
、Scharf,D.ら(1994)Results Probl.Cell Differ.20:125-162を参照）。In addition, a specific initiation signal can be used for more efficient translation of a sequence encoding HCRM. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences. If the sequence encoding HCRM, its initiation codon and upstream sequences are inserted into the appropriate expression vector, no additional transcriptional or translational control signals are required. However, if only the coding sequence or a part thereof is inserted,
Exogenous translational control signals, including the ATG start codon, must be provided. In addition, the start codon must be in the correct reading frame to ensure transcription of all inserts. Exogenous translational elements and initiation codons can be from a variety of sources, both natural and synthetic. Inclusion of appropriate enhancers in the particular cell line used can increase the efficiency of expression (see, eg, Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162).

【０１０７】 さらに宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する能力や、発現したタン
パク質を望ましい形にプロセシングする能力によって選択可能である。このよう
なポリペプチドの修飾には、以下に限定しないが、アセチル化、カルボキシル化
、グリコシル化、リン酸化、リピド化(lipidation)及びアシル化が含まれる。ま
たタンパク質の「プレプロ」形を切り離す翻訳後のプロセシングを用いて、正し
い挿入、折り畳み、及び／又は機能することを促進できる。翻訳後の活性のため
の特定の細胞器械及び特徴的な機構を有している種々の宿主細胞（例えば、CHO 、HeLa、MDCK293、WI38）は、American Type Culture Collection（ATCC; Bethe
sda, MD）より入手可能であり、これらを外来タンパク質の正しい修飾やプロセ シングを確実に行なうために選択してもよい。Further, host cell strains can be selected for their ability to modulate the expression of the inserted sequences and to process the expressed protein in the desired manner. Such modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation, and acylation. Post-translational processing that separates the "prepro" form of the protein can also be used to facilitate correct insertion, folding, and / or functioning. A variety of host cells (eg, CHO, HeLa, MDCK293, WI38) having specific cellular machinery and characteristic mechanisms for post-translational activity are available from the American Type Culture Collection (ATCC; Bethe).
sda, MD) and may be selected to ensure correct modification and processing of the foreign protein.

【０１０８】 組換え型タンパク質の高収率の産生を長期間にわたり確保するためには安定し
た発現が好ましい。例えば、ウイルス起源の複製及び／若しくは内在性発現エレ
メント並びに選択可能なマーカー遺伝子を同一のベクター上、又は別々のベクタ
ー上に含む発現ベクターを用いて、HCRMを安定的に発現可能な株化細胞を形質転
換することができる。ベクターの導入の後、選択培地に切り替える前に濃縮培地
内で細胞を1〜2日間増殖させる。選択可能なマーカーの目的は、選択のための耐
性を与えることであり、またその存在によって導入された配列をうまく発現する
細胞の増殖および回収が可能とすることである。安定的に形質転換された細胞の
耐性クローンは、その細胞の型に適した組織培養技術を用いて増殖することがで
きる。Stable expression is preferred to ensure long-term, high-yield production of recombinant proteins. For example, a cell line capable of stably expressing HCRM using an expression vector containing a replication and / or endogenous expression element of viral origin and a selectable marker gene on the same vector or on a separate vector is used. Can be transformed. After the introduction of the vector, the cells are allowed to grow for 1-2 days in a concentrated medium before switching to a selective medium. The purpose of a selectable marker is to confer resistance for selection and to allow the growth and recovery of cells that successfully express the introduced sequence due to their presence. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques appropriate for the cell type.

【０１０９】 形質転換された細胞株を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。これらには、以下に限定しないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ
遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞ
れは、tk^-及びapr^-細胞において用いられる（例えば、Wigler,M.ら(1977)Cell 1
1:223-32；Lowy,I.ら(1980)Cell 22:817-23参照）。また代謝拮抗剤、抗生剤或 いは除草剤への耐性を選択の基礎として用いることが可能で、例えばdhfrはメト
トレキセートに対する耐性を与え、nptはアミノグリコシドネオマイシン及びG-4
18に対する耐性を与え、als或いはpatはクロルスルフロン(chlorsulfuron)、ホ スフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(phosphinotricin acetyltransfe
rase)に対する耐性を与える（例えば、Wigler, M.ら(1980) Proc. Natl. Acad.
Sci. 77:3567-70；Colberre-Garapin, F. ら(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14；M
urry,前出を参照）。さらに選択可能な遺伝子として、例えば、細胞がトリプト ファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、細胞がヒスチジンの
代わりにヒスチノール(histinol)を利用できるようにするhisDが文献に記載され
ている（例えば、Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan(1988) Proc. Natl. Acad. S
ci. 85:8047-8051参照）。例えば、アントシアニン、β-グルクロニダーゼ及び その基質GUS、ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンのような可視マーカー を利用できる。また緑色蛍光タンパク質（GFP）（Clontech, Palo Alto, CA）も
用いることができる。これらのマーカーは形質転換体を同定するだけでなく、特
定のベクター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定量するた
めに広く用いられる（例えば、Rhodes, C.A.ら(1995)Methods Mol. Biol.55:121
-131参照）。[0109] Any number of selection systems can be used to recover transformed cell lines. These include, but are not limited to, the herpes simplex virus thymidine kinase gene and the adenine phosphoribosyltransferase gene, each of which is used in tk ⁻ and apr ⁻ cells (eg, Wigler, M. et al. (1977) Cell 1
1: 223-32; Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-23). Also, resistance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as the basis for selection, for example, dhfr confers resistance to methotrexate, npt indicates aminoglycoside neomycin and G-4
Als or pat is chlorsulfuron, phosphinotricin acetyltransferase
rase) (see, eg, Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad.
Sci. 77: 3567-70; Colberre-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14; M
urry, supra). Further selectable genes are described in the literature, for example, trpB, which allows cells to use indole instead of tryptophan, and hisD, which allows cells to use histinol instead of histidine ( For example, Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. S
ci. 85: 8047-8051). For example, visible markers such as anthocyanins, β-glucuronidase and its substrate GUS, luciferase and its substrate luciferin can be used. Green fluorescent protein (GFP) (Clontech, Palo Alto, CA) can also be used. These markers are widely used not only to identify transformants, but also to quantify the amount of transient or stable protein expression by a particular vector system (eg, Rhodes, CA et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55: 121
-131).

【０１１０】 マーカー遺伝子発現の存在／非存在によって目的の遺伝子の存在も示唆される
が、その遺伝子の存在及び発現の確認を必要とすることもある。例えばHCRMをコ
ードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、HCRMをコードする配列
を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子の機能が存在しないことにより同
定できる。或いは、単一のプロモータの制御下において、HCRMをコードする配列
とマーカー遺伝子を直列に配置することができる。選択または誘導に応じた標識
遺伝子の発現は、通常直列に配置された配列の発現も同様に示す。The presence / absence of marker gene expression also indicates the presence of the gene of interest, but may require confirmation of the presence and expression of that gene. For example, if a sequence encoding HCRM is inserted within a marker gene sequence, transformed cells containing the sequence encoding HCRM can be identified by the absence of marker gene function. Alternatively, a sequence encoding HCRM and a marker gene can be placed in tandem under the control of a single promoter. Expression of a marker gene in response to selection or induction usually indicates expression of sequences arranged in tandem as well.

【０１１１】 或いは、当業者に周知の様々な方法により、HCRMをコードする核酸配列を含み
HCRMを発現する宿主細胞を同定できる。このような方法には、以下に限定しない
が、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーション並びに、核酸とタンパク質
配列を検出及び／若しくは定量するための技術に基づく膜、溶液、若しくはチッ
プを含むタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイが含まれる。[0111] Alternatively, the nucleic acid sequence encoding HCRM may be included by various methods well known to those of skill in the art.
Host cells that express HCRM can be identified. Such methods include, but are not limited to, DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, and protein biotechnology, including membranes, solutions, or chips based on techniques for detecting and / or quantifying nucleic acid and protein sequences. Assays or immunoassays.

【０１１２】 HCRMをコードするポリヌクレオチドの断片またはプローブ若しくは断片を用い
るDNA−DNA又はDNA−RNAハイブリダイゼーション又は増幅により、HCRMをコード
するポリヌクレオチド配列の存在を検出できる。HCRMをコードするDNA或いはRNA
を含む形質転換体を検出するために、核酸増幅に基づくアッセイは、HCRMをコー
ドする核酸配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーの使用を含む。The presence of a polynucleotide sequence encoding HCRM can be detected by DNA-DNA or DNA-RNA hybridization or amplification using a fragment or probe or fragment of the polynucleotide encoding HCRM. DNA or RNA encoding HCRM
Nucleic acid amplification-based assays for detecting transformants that include the use of oligonucleotides or oligomers based on the nucleic acid sequence encoding HCRM.

【０１１３】 HCRMの発現を検出・測定するための種々のプロトコルは、このタンパク質に特
異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれかを用い、また当業
者に周知のものである。そのような技術の例には、酵素結合免疫検定法（ELISA ）、ラジオイムノアッセイ（RIAs）及び蛍光細胞分析分離（FACS）が含まれる。
HCRM上において２つの非干渉エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を
利用する二部位のモノクローナルベースのイムノアッセイ（two-site, monoclon
al-based immunoassay）が好ましいが、競合的結合実験も用いられうる。これら
アッセイおよび他のアッセイは、当業者によって開示されている（例えばHampto
n,R.ら(1990);Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press,St Paul
,MN Section IV；及びMaddox, D.E.ら(1983); J.Exp.Med.158:1211-1216参照） 。Various protocols for detecting and measuring HCRM expression use either polyclonal or monoclonal antibodies specific for this protein and are well known to those skilled in the art. Examples of such techniques include enzyme linked immunoassays (ELISA), radioimmunoassays (RIAs) and fluorescent cell analysis separations (FACS).
A two-site, monoclonal-based immunoassay utilizing monoclonal antibodies reactive to two non-interfering epitopes on HCRM (two-site, monoclon
al-based immunoassay) is preferred, but competitive binding experiments can also be used. These and other assays are disclosed by those skilled in the art (eg, Hampto).
n, R. et al. (1990); Serological Methods, a Laboratory Manual , APS Press, St Paul
, MN Section IV; and Maddox, DE et al. (1983); J. Exp. Med. 158: 1211-1216).

【０１１４】 多様なラベル及び結合技術が当業者には周知であり、そして種々の核酸及びア
ミノ酸のアッセイにおいて用いることができる。HCRMをコードするポリヌクレオ
チドに関係する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプロ
ーブやPCRプローブを作製するための手段には、オリゴ標識（oligolabeling）、
ニックトランスレーション法、末端標識（end-labeling）、或いは標識ヌクレオ
チドを用いるPCR増幅などが含まれる。或いは、HCRMをコードする配列、又はそ の任意の断片を、mRNAプローブの作製のためのベクターにクローン化できる。そ
のようなベクターは当業者に周知で、また市販されており、これを用いて、例え
ばT7、T3或いはSP6のような適切なRNAポリメラーゼ及び標識したヌクレオチドを
加えることによってin vitroでRNAプローブを合成することができる。これらの 方法は、種々の市販のキット（Pharmacia & Upjohn (Kalamazoo, MI)；Promega
(Madison WI)；及びU.S. Biochemical Corp.,Cleveland, OH提供）を用いて実施
することができる。検出を容易にするために用いる適切なレポーター分子、即ち
標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色素生産剤や、基質、
コファクター、インヒビター、磁性粒子等が含まれる。A wide variety of labels and conjugation techniques are known by those skilled in the art and can be used in various nucleic and amino acid assays. Means for producing labeled hybridization or PCR probes for detecting sequences related to the polynucleotide encoding HCRM include oligolabeling,
This includes nick translation, end-labeling, or PCR amplification using labeled nucleotides. Alternatively, the sequence encoding HCRM, or any fragment thereof, can be cloned into a vector for the production of an mRNA probe. Such vectors are well known to those of skill in the art and are commercially available, and are used to synthesize RNA probes in vitro by adding a suitable RNA polymerase, such as, for example, T7, T3 or SP6, and labeled nucleotides. can do. These methods are described in various commercially available kits (Pharmacia & Upjohn (Kalamazoo, MI); Promega
(Madison WI); and US Biochemical Corp., Cleveland, OH). Suitable reporter molecules, ie, labels, used to facilitate detection include radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent or chromogenic agents, substrates,
Cofactors, inhibitors, magnetic particles and the like are included.

【０１１５】 細胞培養からのタンパク質の回収および発現に適した条件下において、HCRMを
コードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を培養することができる
。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いられる配列及び／ま
たはベクターに応じて分泌される、つまり細胞内に含まれるようにすることがで
きる。当業者に理解されるように、HCRMをコードするポリヌクレオチドを含む発
現ベクターは、原核生物か真核生物の細胞膜を通してHCRM分泌を指向するシグナ
ル配列を含むように設計することができる。また他の作製物を用いることにより
、HCRMをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドド
メインをコードするヌクレオチド配列に結合することができる。そのような精製
を容易にするドメインには、以下に限定しないが、固定化金属上での精製を可能
にするヒスチジントリプトファンモジュールのような金属キレート化ペプチド類
、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインAドメイン、及びFLA
GS延長／アフィニティー精製システムにおいて用いられるドメイン（Immunex Co
rp., Seattle WA）が含まれる。精製ドメインとHCRMコーディング配列の間にお けるXA因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego CA）に対して特異
的な配列のような切断可能なリンカー配列の包含により、精製が容易になる。こ
のような発現ベクターの１つは、HCRMおよびチオレドキシン及びエンテロキナー
ゼ切断部位に先行する6個のヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパ ク質を発現する。ヒスチジン残基が固定化金属イオンアフィニティクロマトグラ
フィー（IMAC）での精製を促進する（例えば、Porath,Jら (1992)Prot.Exp.Puri
f.3:263-281参照）。エンテロキナーゼ切断部位が融合タンパク質からのHCRMの 精製のための手段を与える（例えば、Kroll,D.J.ら(1993)DNA Cell Biol.12:441
-453参照）。[0115] Host cells transformed with a nucleotide sequence encoding HCRM can be cultured under conditions suitable for the recovery and expression of the protein from cell culture. The protein produced by the transformed cell can be secreted, ie, contained within the cell, depending on the sequence and / or the vector used. As will be appreciated by those skilled in the art, expression vectors containing polynucleotides encoding HCRM can be designed to include signal sequences that direct HCRM secretion through prokaryotic or eukaryotic cell membranes. Using other constructs, the HCRM-encoding sequence can be linked to a nucleotide sequence encoding a polypeptide domain that facilitates purification of soluble proteins. Domains that facilitate such purification include, but are not limited to, metal-chelating peptides such as the histidine tryptophan module, which allow for purification on immobilized metals, and purification on immobilized immunoglobulins. Enables protein A domain and FLA
Domains used in GS extension / affinity purification systems (Immunex Co.
rp., Seattle WA). The inclusion of a cleavable linker sequence such as a sequence specific for factor XA or enterokinase (Invitrogen, San Diego CA) between the purification domain and the HCRM coding sequence facilitates purification. One such expression vector expresses a fusion protein comprising a nucleic acid encoding HCRM and six histidine residues preceding the thioredoxin and enterokinase cleavage site. Histidine residues facilitate purification by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) (see, eg, Porath, J et al. (1992) Prot. Exp. Puri
f.3: 263-281). Enterokinase cleavage sites provide a means for purification of HCRM from fusion proteins (eg, Kroll, DJ et al. (1993) DNA Cell Biol. 12: 441).
-453).

【０１１６】 組換え体の生成だけでなく、固相技術を用いた直接のペプチド合成によって、
HCRMの断片を作り出すことができる（Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc.
85:2149-2154参照）。タンパク質合成は手作業または自動で行なうことができ る。自動化された合成は、例えば、Applied Biosystem 431Aペプチドシンセサイ
ザ（Perkin Elmer）を用いて行うことができる。HCRMの種々の断片を個別に合成
して、次に結合させて完全長分子を作り出すことも可能である。Not only by recombinant production but also by direct peptide synthesis using solid phase technology,
HCRM fragments can be produced (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc.
85: 2149-2154). Protein synthesis can be performed manually or automatically. Automated synthesis can be performed, for example, using an Applied Biosystem 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer). The various fragments of HCRM can be synthesized separately and then combined to create the full length molecule.

【０１１７】 治療 HCRM-1とラット由来のナトリウムチャネルβ2サブユニット（GI 1086499）と の間には化学的および構造的相同性が存在する。さらに、HCRM-1は癌組織におい
て発現される。従って、HCRMは細胞増殖性の障害および輸送障害において一定の
役割を果たしていると考えられる。There is chemical and structural homology between the therapeutic HCRM-1 and the rat-derived sodium channel β2 subunit (GI 1086499). Furthermore, HCRM-1 is expressed in cancer tissues. Thus, HCRM appears to play a role in cell proliferative and transport disorders.

【０１１８】 HCRM-2と形質転換された細胞におけるその発現の増加によって同定されるタン
パク質であるマウス由来のイオンチャネルホモログRIC（GI 1872491）との間に は化学的および構造的相同性が存在する。さらに、HCRM-2は癌組織において発現
される。従って、HCRM-2は細胞増殖性の障害および輸送障害において一定の役割
を果たしていると考えられる。There is chemical and structural homology between HCRM-2 and the mouse ion channel homolog RIC (GI 1872491), a protein identified by its increased expression in transformed cells. . Furthermore, HCRM-2 is expressed in cancer tissues. Thus, HCRM-2 appears to play a role in cell proliferative and transport disorders.

【０１１９】 HCRM-3とNPCの構成成分であるラット由来の核タンパク質 p62ホモログ（GI 91
3246）との間には化学的および構造的相同性が存在する。さらに、HCRM-3は癌組
織において発現される。従って、HCRM-3は細胞増殖性の障害および輸送障害にお
いて一定の役割を果たしていると考えられる。A rat-derived nuclear protein p62 homolog (GI 91, a component of HCRM-3 and NPC)
3246) has chemical and structural homology. In addition, HCRM-3 is expressed in cancer tissues. Thus, HCRM-3 appears to play a role in cell proliferative and transport disorders.

【０１２０】 従って、一実施例においては、細胞増殖性の疾患の治療または予防のためにHC
RMのアンタゴニストを被験者に投与することができる。そのような細胞増殖性の
疾患には、以下に限定しないが、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包
炎、肝硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間血色素
尿症、真正赤血球増加症、乾癬、原発性血小板血症や、腺癌、白血病、リンパ腫
、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌腫を含む癌や、特に、副腎、膀胱、骨、骨
髄、脳、***、頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣
、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、
及び子宮の癌が含まれる。Thus, in one embodiment, HC for the treatment or prevention of a cell proliferative disorder
An RM antagonist can be administered to the subject. Such cell proliferative disorders include, but are not limited to, atherosclerosis, atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, seizures Nocturnal hemoglobinuria, eukaryotic polycytosis, psoriasis, primary thrombocythemia, adenocarcinoma, leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, and especially adrenal gland, bladder, bone , Bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid,
And uterine cancer.

【０１２１】 一態様では、HCRMと特異的に結合する抗体をアンタゴニストとして直接用いる
か、或いはHCRMを発現する細胞や組織に薬剤をもたらす送達機構またはターゲテ
ィングとして間接的に用いることができる。In one embodiment, antibodies that specifically bind HCRM can be used directly as antagonists or indirectly as a delivery mechanism or targeting to bring the agent to cells or tissues that express HCRM.

【０１２２】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む細胞増殖性の障害の
治療または予防のために、HCRMをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現
するベクターを被験者に投与してもよい。In another embodiment, a vector expressing the complement of a polynucleotide encoding HCRM is administered to a subject for the treatment or prevention of a cell proliferative disorder, including but not limited to those described above. You may.

【０１２３】 更なる実施例においては、HCRMの活性または発現の低下に関連する輸送障害の
治療または予防のために、HCRM又はフラグメント若しくはその誘導体を被験者に
投与してもよい。そのような輸送障害には、以下に限定しないが、 アキネジア、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調、嚢胞性線維症、ベ
ッカー筋ジストロフィー、ベル麻痺、シャルコー‐マリー‐ツース病、糖尿病、
尿崩症、糖尿病性神経障害、デュシェンヌ筋ジストロフィー、高カリウム血性周
期性麻痺、正常カリウム血性周期性四肢麻痺、パーキンソン病、悪性高熱症、多
剤耐性、重症筋無力症、筋緊張性ジストロフィー、緊張病、遅発性ジスキネジア
、ジストニア、末梢性の神経障害、大脳の腫瘍、前立腺の癌や、輸送に関連する
心臓の障害（例えば、アンギナ、bradyarrythmia、tachyarrythmia、高血圧症、
遺伝性QT延長症候群、心筋炎、心筋症、ネマリンミオパシーラネマリン筋障害、
脂質ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、甲状腺中毒性ミオパシー、エタノ
ールミオパチー、皮膚筋炎、封入体筋炎、伝染性筋炎、多発性筋炎等）や、輸送
に関連する神経性障害（例えば、アルツハイマー病、健忘症、双極性障害、痴呆
、うつ病、癲癇、トゥーレット障害、妄想性精神病、及び精神***病等）や、更
に輸送に関連する他の疾患（例えば、神経線維腫症、帯状疱疹後の神経痛、３叉
神経の神経障害、サルコイドーシス、鎌形赤血球貧血、及びウィルソン病等）が
含まれる。In a further embodiment, HCRM or a fragment or derivative thereof may be administered to a subject for the treatment or prevention of a transport disorder associated with reduced activity or expression of HCRM. Such transport disorders include, but are not limited to, akinesia, amyotrophic lateral sclerosis, ataxia telangiectasia, cystic fibrosis, Becker muscular dystrophy, Bell's palsy, Charcot-Marie-Tooth disease, diabetes ,
Diabetes insipidus, diabetic neuropathy, Duchenne muscular dystrophy, hyperkalemia periodic paralysis, normokalemia periodic limb paralysis, Parkinson's disease, malignant hyperthermia, multidrug resistance, myasthenia gravis, myotonic dystrophy, catatonia , Dyskinesia, dystonia, peripheral neuropathy, cerebral tumors, prostate cancer, and transport-related heart disorders (eg, angina, bradyarrythmia, tachyarrythmia, hypertension,
Hereditary long QT syndrome, myocarditis, cardiomyopathy, nemarin myopathy lanemarin myopathy,
Lipid myopathy, mitochondrial myopathy, thyrotoxic myopathy, ethanol myopathy, dermatomyositis, inclusion body myositis, infectious myositis, polymyositis, etc., and transport-related neurological disorders (eg, Alzheimer's disease, amnesia, bipolar) Disorders, dementia, depression, epilepsy, Tourette's disorder, paranoid psychiatry, and schizophrenia, and other transport-related disorders (eg, neurofibromatosis, postherpetic neuralgia, trigeminal nerves) Neuropathy, sarcoidosis, sickle cell anemia, and Wilson's disease).

【０１２４】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むHCRMの活性または発
現の低下に関連する輸送障害の治療または予防のために、HCRM、又はHCRMのフラ
グメント若しくは誘導体を発現可能なベクターを被験者に投与してもよい。In another example, HCRM, or a fragment or derivative of HCRM, can be expressed for the treatment or prevention of a transport disorder associated with reduced activity or expression of HCRM, including but not limited to those described above. The appropriate vector may be administered to the subject.

【０１２５】 また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む輸送障害の治療
または予防のために、適切な医薬用担体と共に実質的に精製されたHCRMを含む医
薬品組成物を被験者に投与してもよい。In yet another embodiment, a pharmaceutical composition comprising substantially purified HCRM with a suitable pharmaceutical carrier for treating or preventing a transport disorder, including but not limited to those described above, is administered to a subject. May be administered.

【０１２６】 更に別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む輸送障害の治療
または予防のために、HCRMの活性を調節するアゴニストを被験者に投与してもよ
い。In yet another embodiment, an agonist that modulates the activity of HCRM may be administered to a subject for the treatment or prevention of a transport disorder, including but not limited to those described above.

【０１２７】 更に別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む、HCRMの活性ま
たは発現の増大に関連する輸送障害の治療または予防のために、HCRM活性を調節
するアンタゴニストを被験者に投与してもよい。In yet another embodiment, an antagonist that modulates HCRM activity is administered to a subject for the treatment or prevention of a transport disorder associated with increased activity or expression of HCRM, including but not limited to those described above. May be administered.

【０１２８】 他の実施例においては、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的配列またはベクターの何れかを、他の適切な治療薬と組合せて投与
することもできる。当業者は従来の製薬の原理に基づいて併用療法で使用するた
めの適切な薬剤を選択することができるであろう。治療薬を組み合わせることに
より、上述の種々の反応の治療又は予防に効果を与えるように相乗剤的に機能し
得る。この方法を用いることにより、より少ない各薬剤の投与量で治療効果を上
げることができ、従って副作用の可能性を低下させることができる。In other embodiments, any of the proteins, antagonists, antibodies, agonists, complementary sequences or vectors of the invention may be administered in combination with other suitable therapeutic agents. One of skill in the art would be able to select appropriate agents for use in combination therapy based on conventional pharmaceutical principles. The combination of therapeutic agents can act synergistically to effect treatment or prevention of the various reactions described above. By using this method, the therapeutic effect can be increased with a smaller dose of each drug, and thus the possibility of side effects can be reduced.

【０１２９】 HCRMのアンタゴニストは、当業者に周知の方法を用いて製造することができる
。詳細には、精製されたHCRMを用いて抗体を作り出したり、或いはHCRMに特異的
に結合するものを同定するために、薬剤のライブラリーをスクリーニングするこ
とができる。HCRMの抗体は、当業者によく知られた方法を用いて産生することが
できる。このような抗体には、以下に限定されないが、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現ライ
ブラリーにより作られたフラグメントが含まれる。中和抗体（即ち、二量体形成
を阻害するもの）は治療の用途に特に好適である。An antagonist of HCRM can be produced using methods well known to those skilled in the art. In particular, a library of drugs can be screened to generate antibodies using purified HCRM or to identify those that specifically bind to HCRM. Antibodies to HCRM can be produced using methods well known to those skilled in the art. Such antibodies include, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments, and fragments produced by Fab expression libraries. Neutralizing antibodies (ie, those that inhibit dimer formation) are particularly suitable for therapeutic use.

【０１３０】 抗体を産生するために、HCRMか、免疫学的特性を有するその任意の断片或いは
そのオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、
ヒト等を含む種々の宿主を免疫化することができる。宿主の種に応じて、免疫学
的反応を増強するために種々のアジュバントを用いることができる。そのような
アジュバントには、以下に限定しないが、フロイントのアジュバント、アルミニ
ウムの水酸化物ようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性剤、プルロ
ニックポリオール(pluronic polyols)、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマル
ジョン、KLH及びジニトロフェノールが含まれる。ヒトで使用するアジュバント の中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びCorynebacterium parvumが特に 好ましい。To produce antibodies, goats, rabbits, rats, mice, or goats can be injected by injecting HCRM or any fragment thereof having immunological properties or oligopeptides thereof.
Various hosts including humans can be immunized. Depending on the species of the host, various adjuvants can be used to enhance the immunological response. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, KLH And dinitrophenol. Among adjuvants used in humans, BCG (bacilli Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum are particularly preferred.

【０１３１】 HCRMの抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、またはそ
の断片は、好ましくは少なくとも5個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも10 個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。またこれらのオリゴペプチド、ペ
プチド、または断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一で、小形
の自然発生の分子の全アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。HCRMアミノ酸
の短い伸展部が、KLHのような別のタンパク質の伸展部と融合し、キメラ分子の 抗体が産生され得る。The oligopeptide, peptide, or fragment thereof used to elicit antibodies to HCRM preferably has an amino acid sequence consisting of at least 5 amino acids, more preferably at least 10 amino acids. It is also preferred that these oligopeptides, peptides, or fragments are identical to a portion of the amino acid sequence of the native protein and include the entire amino acid sequence of a small, naturally occurring molecule. Short stretches of HCRM amino acids can be fused with stretches of another protein, such as KLH, to produce chimeric molecule antibodies.

【０１３２】 HCRMのモノクローナル抗体は、培養における持続的な細胞株によって抗体分子
を産生させる任意の技術を用いて調製できる。このような技術には、以下に限定
しないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV-ハイ ブリドーマ技術が含まれる（例えば、Kohler, G.ら(1975) Nature 256:495-497 ；Kozbor, D. ら(1985) Immunol. Methods 81 :31-42；Cote, R.J. ら(1983) Pr
oc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030；Cole, S.P. ら(1984) Mol. Cell Biol. 6
2:109-120参照）。[0132] Monoclonal antibodies to HCRM can be prepared using any technique that produces antibody molecules by continuous cell lines in culture. Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (eg, Kohler, G. et al. (1975) Nature 256: 495-497; Kozbor (1985) Immunol. Methods 81: 31-42; Cote, RJ et al. (1983) Pr.
oc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030; Cole, SP et al. (1984) Mol. Cell Biol. 6
2: 109-120).

【０１３３】 さらに、適切な抗原特異性および生物活性を備えた分子を得るために、ヒト抗
体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングする技術のような「キメラ抗体
」の産生のために開発された技術を用いることができる（例えば、Morrison,S.L
.ら(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855;Neuberger, M.S. ら(1984)Nat
ure 312:604-608;Takeda, S. ら(1985)Nature 314:452-454参照）。或いは、当 業者に周知の方法を用いて単鎖の抗体の生成のための技術を適用して、HCRMに特
異的な単鎖抗体を産生することができる。関連する特異性を有するがイディオタ
イプ組成が異なる抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリー
からの鎖混合(chain shuffling)によって産生することができる（例えば、Burto
n D.R.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:10134-10137参照）。In addition, techniques developed for the production of “chimeric antibodies”, such as the technique of splicing a mouse antibody gene to a human antibody gene, in order to obtain molecules with appropriate antigen specificity and biological activity (For example, Morrison, SL
Natl.Acad.Sci. 81: 6851-6855; Neuberger, MS et al. (1984) Nat.
ure 312: 604-608; Takeda, S. et al. (1985) Nature 314: 452-454). Alternatively, techniques for the production of single-chain antibodies can be applied using methods well known to those skilled in the art to produce single-chain antibodies specific for HCRM. Antibodies with related specificities but differing idiotypic compositions can be produced by chain shuffling from random combinations of immunoglobulin libraries (eg, Burto
n DR (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 10134-10137).

【０１３４】 抗体は、免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネル
をスクリーニングすることにより、或いはリンパ球集団でのin vivoの産生を誘 導することにより産生することができる（例えば、Orlandi,R.ら(1989), Proc.
Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837；Winter, G.ら(1991) Nature 349:293-299参照
）。Antibodies can be produced by screening an immunoglobulin library or panel of highly specific binding reagents, or by inducing production in a lymphocyte population in vivo (eg, Orlandi, R. et al. (1989), Proc.
Natl. Acad. Sci. 86: 3833-3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299).

【０１３５】 またHCRMに対する特異的な結合部位を含む抗体フラグメントも作り出すことが
できる。例えばこのような断片には、以下に限定はしないが、抗体分子のペプシ
ン消化により生成することができるF(ab‘)₂フラグメントや、F(ab’)₂フラグメ
ントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるFabフラグメ ントが含まれる。或いは、所望の特異性を備えたモノクローナルFabフラグメン トを迅速かつ容易に同定可能なように、Fab発現ライブラリーを構成し得る（例 えば、Huse,W.D.ら(1989) Science 246:1275-1281参照）。[0135] Antibody fragments which contain specific binding sites for HCRM can also be generated. For example, such fragments include, but are not limited to, F (ab ') ₂ fragments that can be generated by pepsin digestion of antibody molecules, and F (ab') ₂ fragments that are generated by reducing disulfide bridges. Fab fragment that can be included. Alternatively, a Fab expression library can be constructed so that monoclonal Fab fragments with the desired specificity can be identified quickly and easily (see, for example, Huse, WD et al. (1989) Science 246: 1275-1281). ).

【０１３６】 種々のイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリ
ーニングに用いることができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体の何れかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射
線測定法の多数のプロトコルが、当技術分野で周知である。このようなイムノア
ッセイには、一般にHCRMとその特異的な抗体との間の複合体の形成の測定が含ま
れる。2つの非干渉HCRMエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用い る2部位のモノクローナル抗体ベースのイムノアッセイ（two sites monoclonal
based immunoassay）が好適であるが、競合的結合アッセイも用いられ得る（Mad
dox , 前出）。[0136] A variety of immunoassays can be used for screening to identify antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for competitive binding assays or immunoradiometric assays using either monoclonal or polyclonal antibodies with established specificity are well known in the art. Such immunoassays generally involve the measurement of the formation of a complex between HCRM and its specific antibody. Two-site monoclonal antibody-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering HCRM epitopes
based immunoassay) are preferred, but competitive binding assays can also be used (Mad
dox, supra ).

【０１３７】 本発明の別の実施例では、HCRMをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片や相補配列を、治療を目的として用いることができる。一態様では、mR
NAの転写を阻害することが望ましい状況において、HCRMをコードするポリヌクレ
オチドに対する相補配列を用いることができる。詳細には、HCRMをコードするポ
リヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質転換することができる。従って、HC
RMの活性を調節する、或いは遺伝子の機能を調節するために、相補的な分子また
は断片を用いることができる。現在このような技術は周知であり、センス又はア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きな断片を、HCRMをコードする配
列のコード領域や調節領域に従って様々な位置から設計可能である。In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding HCRM, or any fragment or complement thereof, can be used for therapeutic purposes. In one aspect, the mR
In situations in which it is desirable to inhibit transcription of NA, a complementary sequence to a polynucleotide encoding HCRM can be used. In particular, cells can be transformed with sequences complementary to the polynucleotide encoding HCRM. Therefore, HC
Complementary molecules or fragments can be used to modulate the activity of RM or to regulate gene function. At present such techniques are well known and sense or antisense oligonucleotides, or larger fragments, can be designed from various locations according to the coding and regulatory regions of the sequence encoding HCRM.

【０１３８】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルスに由来
する、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の器官、
組織、即ち細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられ得る。当業者に
周知の方法を用いて、HCRMをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な核
酸配列を発現するベクターを産生することができる（例えば、Sambrook,前出、 及びAusubel,前出 参照）。[0138] Expression vectors derived from retroviruses, adenoviruses, herpes or vaccinia viruses, or from various bacterial plasmids, can be used to target organs,
It can be used for delivery of nucleotide sequences to a tissue, ie, a group of cells. Vectors expressing nucleic acid sequences complementary to the polynucleotide of the gene encoding HCRM can be produced using methods well known to those of skill in the art (see, eg, Sambrook, supra , and Ausubel, supra ).

【０１３９】 HCRMをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現する発現
ベクターで細胞または組織を形質転換させることによって、HCRMをコードする遺
伝子を作り出すことができる。このような作製物は、翻訳不能なセンス配列或い
はアンチセンス配列を細胞に導入するために用いることができる。DNAへ組み込 みが存在しない場合でも、このようなベクターは、それらが内在性のヌクレアー
ゼにより無能となるまで、RNA分子を転写し続けうる。一過性の発現は、非複製 ベクターでも1ヶ月以上、適切な複製エレメントがベクター系の一部である場合 にはさらに長い期間持続し得る。A gene encoding HCRM can be created by transforming a cell or tissue with an expression vector that expresses polynucleotides or fragments thereof that encode HCRM at high levels. Such constructs can be used to introduce non-translatable sense or antisense sequences into cells. Even in the absence of integration into DNA, such vectors can continue to transcribe RNA molecules until they are disabled by endogenous nucleases. Transient expression can last for a month or more with non-replicating vectors, and even longer if appropriate replication elements are part of the vector system.

【０１４０】 前述のように、HCRMをコードする遺伝子の制御、5‘、又は調節領域に対する 相補配列、つまりアンチセンス分子（DNA、RNAまたはPNA）を設計することによ って、遺伝子発現を変更することができる。転写開始点（例えば、開始部位から
+10〜-10の位置）に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、三重らせ
ん体の塩基対形成方法論を用いて、阻害を達成することができる。ポリメラーゼ
、転写制御因子、或いは調節分子の結合のために二重らせんが十分にほどける能
力を阻害するので、三重らせん対合は有用である（例えば、Gee, J.E.ら(1994)I
n: Huber, B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futur
a Publishing Co.,Mt.Kisco,NY,pp.163-177参照）。転写物のリボソームへの結 合を阻止することによりmRNAの転写を阻害するために、相補的配列、即ちアンチ
センス分子を設計し得る。As described above, altering gene expression by designing a sequence complementary to the regulatory, 5 ′, or regulatory regions of the gene encoding HCRM, ie, an antisense molecule (DNA, RNA or PNA), can do. Transcription start point (for example, from the start site
Oligonucleotides from positions +10 to -10) are preferred. Similarly, inhibition can be achieved using triple helix base-pairing methodology. Triple helix pairing is useful because it inhibits the ability of the double helix to unwind sufficiently for binding of polymerases, transcription factors, or regulatory molecules (eg, Gee, JE et al. (1994) I
n: Huber, BE and BI Carr, Molecular and Immunologic Approaches , Futur
a Publishing Co., Mt. Kisco, NY, pp. 163-177). Complementary sequences, ie, antisense molecules, can be designed to inhibit mRNA transcription by preventing transcript binding to ribosomes.

【０１４１】 リボザイム、つまり酵素RNA分子を用いてRNAの特異的切断を触媒することがで
きる。リボザイム作用機構は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列の特異 的ハイブリダイゼーションに関与し、その後のヌクレオチド鎖切断が行なわれる
。例えば、操作されたハンマーヘッド(hammerhead)モチーフリボザイム分子は、
HCRMをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効果的に触媒し得る。A ribozyme, an enzymatic RNA molecule, can be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action involves specific hybridization of the sequence of the ribozyme molecule to complementary target RNA, followed by nucleotide strand breaks. For example, an engineered hammerhead motif ribozyme molecule
It can specifically and effectively catalyze nucleotide strand cleavage of the sequence encoding HCRM.

【０１４２】 任意の潜在的なRNA標的物内の特異的なリボザイム切断部位は、最初、後続す る配列GUA、GUU並びにGUCを含むリボザイム切断部位に対する標的分子を走査す ることによって同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領
域に対応する15〜20個のリボヌクレオチドの間の短いRNA配列は、そのオリゴヌ クレオチドを動作不能(inoperable)とする2次の構造的特徴について評価するこ とができる。また候補の標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイ(ribon
uclease protection assay)を用い、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリ ダイゼーションに対する接触性(accessibility)の検査により評価することがで きる。[0142] Specific ribozyme cleavage sites within any potential RNA target are initially identified by scanning the target molecule for ribozyme cleavage sites that include the following sequences GUA, GUU and GUC. Once identified, a short RNA sequence between 15 and 20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site may have a secondary structural feature that renders the oligonucleotide inoperable. Can be evaluated. The suitability of the candidate target is determined by a ribonuclease protection assay (ribonase
uclease protection assay) and can be evaluated by inspection of the accessibility to hybridization with a complementary oligonucleotide.

【０１４３】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子を合成するのための
当技術分野で周知の方法により作り出すことができる。これらには、固相ホスホ
ラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学的合成のための技術が含
まれる。或いは、RNA分子は、HCRMをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo の転写により作り出すことができる。このようなDNA配列は、T7或いはSP6のよう
な適切なRNAポリメラーゼプロモーターを伴う多様なベクターに取り込むことが できる。或いは、構成的または誘導的に相補的なRNAを合成するこれらのcDNA作 製物は、株化細胞、細胞または組織内に導入することができる。[0143] Complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the present invention can be produced by methods well known in the art for synthesizing nucleic acid molecules. These include techniques for the chemical synthesis of oligonucleotides, such as solid phase phosphoramidite chemical synthesis. Alternatively, RNA molecules can be created by in vitro and in vivo transcription of a DNA sequence encoding HCRM. Such DNA sequences can be incorporated into a variety of vectors with appropriate RNA polymerase promoters, such as T7 or SP6. Alternatively, these cDNA products that synthesize constitutively or inducibly complementary RNA can be introduced into cell lines, cells or tissues.

【０１４４】 細胞内の安定性を高め、また半減期を長くするために、RNA分子は修飾するこ とができる。可能な修飾としては、以下に限定しないが、その分子の5′末端及 び／又は3′末端でのフランキング配列の付加や、分子のバックボーン内におけ るホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート或いは2′O-メチルを 使用を含む。この概念はPNA生成において固有のものであり、内在性エンドヌク レアーゼにより容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及
びウリジンの、アセチル−、メチル−、チオ−、及び類似の修飾形態だけでなく
、イノシン、クエオシン(queosine)、及びワイブトシン(wybutosine)のような従
来よりあまり用いられない塩基を含めることにより、これら全ての分子にに拡張
可能である。[0144] RNA molecules can be modified to increase intracellular stability and half-life. Possible modifications include, but are not limited to, the addition of flanking sequences at the 5 'and / or 3' end of the molecule, phosphorothionate or phosphothioesterase bonds rather than phosphodiesterase linkages in the backbone of the molecule. Including the use of 2'O-methyl. This concept is unique in PNA production, as well as acetyl-, methyl-, thio-, and similar modified forms of adenine, cytidine, guanine, thymine, and uridine that are not readily recognized by endogenous endonucleases. It can be extended to all these molecules by including less commonly used bases such as, inosine, queosine, and wybutosine.

【０１４５】 細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能で、同様
にin vivo、in vitro、及びex vivoでの使用にも適している。ex vivoでの治療 法のに対し、ベクターを患者から採取された幹細胞に導入し、自己移植して同じ
患者に戻すためにクローンとして増殖させることができる。トランスフェクショ
ンによるデリバリー、或いはリポソーム注入またはポリカチオンアミノポリマー
によるデリバリーは、当技術分野でよく知られた方法を用いて実施することがで
きる（例えば、Goldman, C.K.ら(1997) Nature Biotechnology 15:462-466参照 ）。A number of methods are available for introducing vectors into cells or tissues, and are also suitable for use in vivo , in vitro , and ex vivo . For ex vivo treatments, the vector can be introduced into stem cells taken from a patient and propagated as a clone for autologous transplantation and return to the same patient. Delivery by transfection, or liposome injection or delivery by polycationic amino polymer can be performed using methods well known in the art (eg, Goldman, CK et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 462-). See page 466).

【０１４６】 前述の治療法は何れも、例えばイヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及
び最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む治療が必要な任意の対象に適用する
ことができる。Any of the above treatments can be applied to any subject in need of treatment, including, for example, mammals such as dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, and most preferably humans.

【０１４７】 本発明の更なる実施例では、前述の任意の治療効果のために、医薬成分を薬剤
上受け入れられる担体とともに投与する。このような医薬成分は、HCRM、HCRMの
抗体、HCRMの擬態(mimetics)、アゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビター
からなるものでありうる。この成分は、単体或いは例えば安定化する配合ような
1以上の他の薬剤とともに、任意の無菌の生体適合性の医薬用担体に投与され、 その担体には、以下に限定しないが、生理食塩水、バッファー食塩水、ブドウ糖
或いは水が含まれる。このような組成物は、単体或いは他の薬剤、ドラッグやホ
ルモンと結合した形で患者に投与されうる。In a further embodiment of the present invention, the pharmaceutical ingredient is administered with a pharmaceutically acceptable carrier for any of the aforementioned therapeutic effects. Such a pharmaceutical ingredient may consist of HCRM, antibodies of HCRM, mimetics of HCRM, agonists, antagonists or inhibitors. This component can be used alone or as a stabilizing formulation, for example.
It is administered with one or more other drugs to any sterile, biocompatible pharmaceutical carrier, which includes, but is not limited to, saline, buffered saline, dextrose or water. Such compositions may be administered to the patient alone or in combination with other drugs, drugs or hormones.

【０１４８】 本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路には、以下に限定されないが、経
口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下腔内投与、
脳室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局所的
投与、舌下投与、或いは直腸投与が含まれうる。The route of administration of the pharmaceutical composition used in the present invention is not limited to the following, but may be oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal,
Intraventricular, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual, or rectal administration may be included.

【０１４９】 有効成分に加えて、これらの医薬成分は、有効成分を医薬上使用できる製剤に
するための処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含む、適切な医薬上認め
られる担体を含みうる。更に、製剤或いは投与に関する技術の詳細は、Remingto ns Pharmaceutical Sciences （Maack Publishing Co., Easton,PA）の最新版に 記載されている。In addition to the active ingredient, these pharmaceutical ingredients include suitable pharmaceutically acceptable carriers, including excipients and adjuvants that facilitate the processing of the active ingredient into pharmaceutically usable formulations. sell. Further details of formulation or administration techniques can be found in the latest edition of Remingtons Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA).

【０１５０】 経口投与のための医薬品組成物は、当技術分野でよく知られる医薬上認められ
る担体を用いて、経口投与に適当な投与量に配合される。このような担体により
、医薬品組成物を患者に摂取させるための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液
体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等に調剤できる。Pharmaceutical compositions for oral administration are formulated using pharmaceutically acceptable carriers well known in the art in dosages suitable for oral administration. With such a carrier, the pharmaceutical composition can be prepared into tablets, pills, dragees, capsules, liquids, gels, syrups, slurries, suspensions and the like for ingestion by the patient.

【０１５１】 経口投与用の医薬製剤は、有効成分と固形の賦形剤とを配合して、（所望によ
り、粉砕した後に）得られた顆粒の混合物を処理して錠剤或いは糖衣剤コア(dra
gee core)を作ることによって得られる。必要ならば、適切な添加物が加えるこ とができる。適切な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトール或いは
ソルビトールを含む砂糖のような糖質またはタンパク質賦形剤や、トウモロコシ
、コムギ、コメ、ジャガイモ等からのデンプンや、メチルセルロース、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムの
ようなセルロースや、アラビアゴム或いはトラガカントゴムのようなゴムや、並
びにゼラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質が含まれる。必要ならば、架
橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムの
ようなその塩のような崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。Pharmaceutical preparations for oral administration are prepared by mixing the active ingredient with solid excipients and, if desired, after grinding, treating the resulting mixture of granules in tablets or dragee cores.
gee core). If necessary, appropriate additives can be added. Suitable excipients include sugar or protein excipients such as sugars including lactose, sucrose, mannitol or sorbitol, starch from corn, wheat, rice, potatoes, etc., methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose or carboxyl. Cellulose, such as sodium methylcellulose; gums, such as gum arabic or tragacanth; and proteins, such as gelatin or collagen. If desired, disintegrating or solubilizing agents may be added, such as the cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, alginic acid, or a salt thereof such as sodium alginate.

【０１５２】 糖衣丸コアは、濃縮糖液のような適切な剤皮と共に用いられるが、それらには
アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤(carbopol ge
l)、ポリエチレングリコール及び／又はチタンの二酸化物、ラッカー溶液及び適
切な有機溶剤或いは溶剤の混合物等が含まれる。錠剤の識別のため、或いは有効
成分の量（即ち投与量）を特徴づけるために、染料或いは色素を錠剤或いは糖衣
錠皮に加えることができる。Dragee cores are used with suitable shells, such as concentrated sugar solutions, and include gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, carbopol gel.
l), polyethylene glycol and / or titanium dioxide, lacquer solutions and suitable organic solvents or solvent mixtures and the like. Dyestuffs or pigments may be added to the tablets or dragees for tablet identification or to characterize the amount of active ingredient (ie, dosage).

【０１５３】 経口投与できる製剤には、ゼラチンからなるプッシュフィット(push-fit)カプ
セル、ゼラチンからなる軟性のシールされたカプセル及びグリセロール或いはソ
ルビトールのような錠皮が含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース
或いはデンプンのような賦形剤または結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネ
シウムのような潤滑剤、及び所望により安定剤と混合された有効成分を含みうる
。軟性カプセルにおいて、有効成分は、安定剤とともに或いは安定剤なしに、脂
肪性の油、液体、または液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解
或いは懸濁される。Formulations that can be administered orally include push-fit capsules made of gelatin, as well as soft, sealed capsules made of gelatin and a tablet, such as glycerol or sorbitol. Push-fit capsules can contain the active ingredient in admixture with excipients or binders such as lactose or starch, lubricants such as talc or magnesium stearate, and, optionally, stabilizers. In soft capsules, the active ingredients may be dissolved or suspended in suitable liquids, such as fatty oils, liquids, or liquid polyethylene glycol, with or without stabilizers.

【０１５４】 非経口投与に適した医薬製剤は、水溶液中で、好適にはハンク溶液(Hankss so
lution)、リンゲル溶液或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合するバッ ファーの中で配合することができる。水性の注射懸濁液は、カルボキシルメチル
セルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘性
を高める物質を含みうる。更に、有効成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液と
して調製してもよい。適切な親油性の溶媒或いは賦形剤には、胡麻油のような脂
肪性の油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成
脂肪酸エステルが含まれる。また非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、送達の
ために用いられる。所望により、懸濁液は化合物の溶解度を増加させて濃縮度の
高い溶液の調製を可能にする適切な安定剤または薬剤を含んでもよい。Pharmaceutical formulations suitable for parenteral administration include solutions in aqueous solutions, preferably in Hanks's solution.
lution), Ringer's solution, or physiologically buffered saline such as saline. Aqueous injection suspensions may contain substances which increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, or dextran. Additionally, suspensions of the active ingredients may be prepared as appropriate oily injection suspensions. Suitable lipophilic solvents or excipients include fatty oils such as sesame oil, and synthetic fatty acid esters such as ethyl oleate, triglycerides or liposomes. Also, non-lipid polycationic amino polymers are used for delivery. If desired, the suspensions may also contain suitable stabilizers or agents which increase the solubility of the compounds to allow for the preparation of highly concentrated solutions.

【０１５５】 局所または経鼻投与用には、浸透する特定の障壁に対して適切な浸透剤が調合
に用いられる。このような浸透剤は、当技術分野において周知のものである。For topical or nasal administration, penetrants appropriate to the particular barrier to be permeated are used in the formulation. Such penetrants are well-known in the art.

【０１５６】 本発明の医薬組成物は周知の方法、例えば通常の混合処理、溶解処理、顆粒化
処理、糖衣形成処理、湿式粉砕処理(levigating)、乳化処理、カプセル化処理、
エントラップ処理(entrapping)或いは凍結乾燥処理により製造される。 この医薬組成物は塩類として提供されることもあり、以下に限定しないが、塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む多くの酸とともに
形成することができる。塩は水性或いはプロトニック溶剤において、対応する遊
離塩基形態よりも溶解性が高くなる傾向がある。別のケースでは、好適な製剤と
しては、使用前に緩衝剤配合したpH4.5〜5.5の範囲にある1mM〜50mMのヒスチジ ン、0.1%〜2%のショ糖、2%〜7%のマンニトールの何れか、或いは全てを含む凍結
乾燥粉末でもよい。The pharmaceutical composition of the present invention may be prepared by a known method, for example, a usual mixing treatment, dissolution treatment, granulation treatment, sugar coating formation treatment, wet grinding treatment (levigating), emulsification treatment, encapsulation treatment,
It is manufactured by entrapping or freeze-drying. The pharmaceutical composition may be provided as salts and may be formed with a number of acids including, but not limited to, hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid, and the like. Salts tend to be more soluble in aqueous or protonic solvents than the corresponding free base forms. In other cases, suitable formulations include 1 mM to 50 mM histidine, 0.1% to 2% sucrose, 2% to 7% mannitol, buffered before use, in the range of pH 4.5 to 5.5. A freeze-dried powder containing any or all of the above may be used.

【０１５７】 医薬組成物は調製された後に適切な容器内に入れられて、指示された状態の治
療のためにラベル付けできる。HCRMの投与の場合では、このようなラベルには、
投与量、投与頻度、投与方法が表示される。After the pharmaceutical composition has been prepared, it can be placed in a suitable container and labeled for treatment of an indicated condition. In the case of HCRM administration, such labels include
The dosage, administration frequency, and administration method are displayed.

【０１５８】 本発明において使用するのに適する医薬品組成物は、所望の目的を達成するた
めに有効成分を効果的な量だけ含む成分を含んでいる。有効量の決定は、当業者
の能力の範囲内で十分行うことができる。Pharmaceutical compositions suitable for use in the present invention include those that contain the active ingredient in an effective amount to achieve the desired purpose. Determination of an effective amount can be made well within the capabilities of those skilled in the art.

【０１５９】 任意の化合物の場合、治療に有効な量は、最初は例えばマウス、ウサギ、イヌ
、ブタのような動物モデルまたは腫瘍性細胞の何れかの細胞培養のアッセイにお
いて見積もることができる。また、適切な濃度範囲および投与経路を決定するた
めに動物モデルを用いることができる。次にこのような情報を利用して、ヒトに
おける投与量や投与経路を決定することができる。For any compound, the therapeutically effective amount can be estimated initially either in animal models such as, for example, mice, rabbits, dogs, pigs or in cell culture assays of neoplastic cells. In addition, animal models can be used to determine the appropriate concentration range and route of administration. Such information can then be used to determine dosages and routes for administration in humans.

【０１６０】 治療的に有効な量とは、例えば、症状や状態を回復させるHCRMまたはその断片
、HCRMの抗体、HCRMのアゴニスト、HCRMのアンタゴニスト、又はHCRMのインヒビ
ターの有効成分の量を指す。治療的な効力および毒性は、細胞培養或いは実験動
物における標準的な製薬方法により、例えばED50(母集団の50%における治療的な
有効投与量)またはLD50(母集団の50%の致死投与量)統計量を計算することによっ
て決定することができる。毒性に対する治療効果の用量比が治療指数であり、ED
50/ LD50の比として表すことができる。医薬品組成物は大きな治療指数を示すこ
とが好ましい。細胞培養のアッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトの
使用のための投与量の範囲をまとめるのに用いることができる。そのような成分
の投与量は、毒性が少ないか或いは全く毒性がなく、ED50を含む循環する濃度の
範囲内にあることが好ましい。使用する剤形、患者の感受性並びに投与経路に応
じて、投与量はこの範囲内で変化する。A therapeutically effective amount refers to, for example, an amount of an active ingredient of HCRM or a fragment thereof, an antibody of HCRM, an agonist of HCRM, an antagonist of HCRM, or an inhibitor of HCRM that ameliorates a symptom or condition. Therapeutic efficacy and toxicity can be determined by standard pharmaceutical methods in cell culture or experimental animals, e.g., ED50 (therapeutically effective dose in 50% of the population) or LD50 (lethal dose in 50% of the population). It can be determined by calculating statistics. The dose ratio of therapeutic effect to toxicity is the therapeutic index and the ED
It can be expressed as a ratio of 50 / LD50. Preferably, the pharmaceutical composition exhibits a large therapeutic index. The data obtained from cell culture assays and animal studies can be used in formulating a range of dosage for human use. The dosage of such components is preferably within a range of circulating concentrations that include the ED50 with little or no toxicity. Depending on the dosage form employed, the sensitivity of the patient and the route of administration, the dosage will vary within this range.

【０１６１】 正確な用量は、治療が必要な被験者に関連する要因を考慮して医師が決定する
。投与及び投薬量は、十分なレベルの有効成分を与える、即ち所定の効果を維持
するために調節される。考慮すべき要因としては、疾病状態の重症度、全般的な
被験者の健康、年齢、体重、性別や、食餌、投与の時間及び頻度や、併用する薬
剤、反応感受性、および治療への反応が含まれる。長時間作用性の医薬品組成物
は、半減期及び特定の製剤のクリアランス率に応じて3〜4日毎に、1週間毎に、或
いは2週間に1度投与してもよい。The exact dosage will be determined by the practitioner, in light of factors related to the subject that requires treatment. Dosage and administration are adjusted to provide sufficient levels of the active ingredient, ie, to maintain the desired effect. Factors to consider include disease severity, overall subject health, age, weight, gender, diet, time and frequency of administration, concomitant medications, sensitivity, and response to treatment. It is. Long acting pharmaceutical compositions may be administered every 3 to 4 days, every week, or once every two weeks depending on half-life and clearance rate of the particular formulation.

【０１６２】 通常の投与量は0.1〜100,000μgの範囲であり、最大約1gの総投与量まで、投 与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは送達の方法のガイダンスは文献に
おいて提供され、通常当技術分野の医師に利用可能である。当業者は、ヌクレオ
チドに対しては、タンパク質やインヒビター用の製剤とは異なる製剤を採用する
ことができる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の
細胞、状態、位置等に対して特異的でありうる。Typical dosages range from 0.1 to 100,000 μg, and vary according to the route of administration, up to a total dose of about 1 g. Guidance on specific dosages or methods of delivery is provided in the literature and is generally available to physicians in the art. One skilled in the art can employ different formulations for nucleotides than for proteins and inhibitors. Similarly, delivery of a polynucleotide or polypeptide can be specific for a particular cell, condition, location, etc.

【０１６３】 診断 別の実施例においては、HCRMに特異的に結合する抗体を、HCRMの発現によって
特徴づけられる状態や疾病の診断や、HCRM又はHCRMのアゴニスト、アンタゴニス
ト、インヒビターで治療を受けている患者のモニタリングのためのアッセイに用
いることができる。診断目的に対して有用な抗体は、前述の治療のためのものと
同様の方法で作製することができる。HCRMの診断のアッセイには、ヒトの体液、
細胞或いは組織の抽出物においてHCRMを検出するために抗体および標識を用いる
方法が含まれる。抗体は修飾しても、修飾なしでも用いることができ、また共有
結合或いは非共有結合かのいずれかによりリポーター分子と結合させて標識する
ことができる。当業者に周知の多様なリポーター分子が用いられ、そのうちの幾
つかについては前述の通りである。 Diagnosis In another embodiment, an antibody that specifically binds to HCRM is being diagnosed with a condition or disease characterized by expression of HCRM, or is being treated with HCRM or an agonist, antagonist, or inhibitor of HCRM. It can be used in assays for patient monitoring. Antibodies useful for diagnostic purposes can be made in a manner similar to that for therapeutics described above. HCRM diagnostic assays include human body fluids,
Methods include the use of antibodies and labels to detect HCRM in cell or tissue extracts. The antibodies can be used with or without modification, and can be labeled by binding, either covalently or non-covalently, to a reporter molecule. A variety of reporter molecules known to those of skill in the art may be used, some of which are described above.

【０１６４】 ELISA、RIA及びFACSを含む、HCRMを測定するための種々のプロトコルが当技術 分野では周知であり、またこれによりHCRM発現の変化や異常性のレベルを診断す
るための基礎が得られる。HCRMの発現の正常値、即ち標準値は、複合体形成に適
した条件下で、哺乳類、好ましくはヒトの正常な被験者から得られる体液或いは
細胞抽出物とHCRMの抗体を結合させることによって確立できる。標準の複合体形
成量は、種々の方法、好ましくは測光手段を用いて定量化できる。被験者の生検
組織からの対照サンプル及び患部サンプルにおいて発現されたHCRMの量を、標準
値と比較する。標準値と被験者の値との偏差によって疾病診断のためのパラメー
タを確立する。A variety of protocols for measuring HCRM, including ELISA, RIA and FACS, are well known in the art and provide the basis for diagnosing changes in HCRM expression or levels of abnormality. . Normal, or standard, values of HCRM expression can be established by combining HCRM antibodies with body fluids or cell extracts obtained from normal mammals, preferably humans, under conditions suitable for complex formation. . Standard complex formation can be quantified using various methods, preferably using photometric means. The amount of HCRM expressed in control and diseased samples from the subject's biopsy tissue is compared to a standard value. The parameter for disease diagnosis is established by the deviation between the standard value and the value of the subject.

【０１６５】 本発明の別の実施例において、HCRMをコードするポリヌクレオチドを、診断の
目的で用いることができる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオ
チド配列、相補的RNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチド は、HCRMの発現が疾病と関連するであろう生検組織における遺伝子発現の検出や
定量のために用いられる。診断アッセイは、HCRMが存在、非存在、過剰発現の何
れの状態かを識別したり、治療の処置の際にHCRMレベルの調節をモニタリングす
るために用いることができる。In another embodiment of the invention, polynucleotides encoding HCRM can be used for diagnostic purposes. Polynucleotides used include oligonucleotide sequences, complementary RNA and DNA molecules, and PNAs. This polynucleotide is used to detect and quantify gene expression in biopsy tissues where HCRM expression may be associated with disease. Diagnostic assays can be used to identify whether HCRM is present, absent, or overexpressed, and to monitor modulation of HCRM levels during therapeutic treatment.

【０１６６】 一態様では、HCRMまたは密接に関連分子をコードする、ゲノム配列を含むポリ
ヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブとのハイブリダイゼーションを用い て、HCRMをコードする核酸配列を同定することができる。そのプローブの特異性
、つまりそのプローブが非常に高度に特異的な領域（例えば、5’調節領域）に 由来するか、或いはより特異性の度合いの低い領域（例えば、保存されたモチー
フ）の何れに由来するかによって、またハイブリダイゼーション或いは増幅の（
最大の、高い、中程度の、或いは低い）厳密性によって、そのプローブがHCRMを
コードする自然発生の配列のみを同定するか、或いはアレルや関連する配列も同
定するかが決定される。In one aspect, nucleic acid sequences encoding HCRM can be identified using hybridization with PCR probes capable of detecting polynucleotide sequences, including genomic sequences, encoding HCRM or closely related molecules. . The specificity of the probe, ie, whether the probe is derived from a very highly specific region (eg, the 5 'regulatory region) or a less specific region (eg, a conserved motif) Of hybridization or amplification (
The stringency (maximum, high, medium, or low) determines whether the probe identifies only naturally occurring sequences that encode HCRM, or alleles and related sequences.

【０１６７】 プローブは関連する配列を検出するためにも用いることができ、また好ましく
はHCRMをコードする任意の配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有するべ きである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、DNA若しくはRNAか、ま
たSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、及びSEQ ID NO:6の配列に由来するものか、或い はHCRM遺伝子のイントロン、エンハンサー、及びプロモータを含むゲノムの配列
に由来するものでもよい。Probes can also be used to detect related sequences, and should preferably have at least 50% sequence identity to any sequence encoding HCRM. The hybridization probe of the present invention may be DNA or RNA, or derived from the sequences of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6, or an intron, an enhancer, or an HCRM gene. And a sequence derived from a genome including a promoter.

【０１６８】 HCRMをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブを作 製するための手段には、mRNAプローブを作り出すために、HCRM又はHCRM誘導体を
コードするポリヌクレオチド配列をベクターにクローンニングする方法がある。
このようなベクターは当業者に周知であり、また市販されており、適切なRNAポ リメラーゼや適切な標識されたヌクレオチドを付加することにより、in vitroで
RNAプローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプ ローブは種々のリポータグループにより標識され、例えば、この標識には、³²P や³⁵Sのような放射性核種によるものや、アビジン／ビオチン結合系を介してプ ローブに結合するアルカリホスファターゼのような酵素による標識等が含まれる
。Means for generating hybridization probes specific for the DNA encoding HCRM include cloning a polynucleotide sequence encoding HCRM or an HCRM derivative into a vector to create an mRNA probe. There is a way.
Such vectors are well known to those of skill in the art and are commercially available, and can be added in vitro by adding appropriate RNA polymerase or appropriate labeled nucleotides.
It can be used to synthesize RNA probes. Hybridization probes can be labeled with various reporter groups, including, for example, those with radionuclides such as ³² P and ³⁵ S, or alkaline phosphatase that binds to the probe via the avidin / biotin binding system. Such a label with an enzyme is included.

【０１６９】 HCRMをコードするポリヌクレオチド配列を、HCRMの発現に関連する疾患の診断
のために用いることができる。そのような疾患の例には、以下に限定はしないが
、細胞増殖性の疾患（例えば、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎
、肝硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間血色素尿
症、真正赤血球増加症、乾癬、原発性血小板血症や、腺癌、白血病、リンパ腫、
黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌腫を含む癌や、特に、副腎、膀胱、骨、骨髄
、脳、***、頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、
膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及
び子宮の癌等）や、輸送障害（例えば、アキネジア、筋萎縮性側索硬化症、毛細
血管拡張性運動失調、嚢胞性線維症、ベッカー筋ジストロフィー、ベル麻痺、シ
ャルコー‐マリー‐ツース病、糖尿病、尿崩症、糖尿病性神経障害、デュシェン
ヌ筋ジストロフィー、高カリウム血性周期性麻痺、正常カリウム血性周期性四肢
麻痺、パーキンソン病、悪性高熱症、多剤耐性、重症筋無力症、筋緊張性ジスト
ロフィー、緊張病、遅発性ジスキネジア、ジストニア、末梢性の神経障害、大脳
の腫瘍、前立腺の癌や、輸送に関連する心臓の障害（アンギナ、bradyarrythmia
、tachyarrythmia、高血圧症、遺伝性QT延長症候群、心筋炎、心筋症、ネマリン
ミオパシーラネマリン筋障害、脂質ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、甲
状腺中毒性ミオパシー、エタノールミオパチー、皮膚筋炎、封入体筋炎、伝染性
筋炎、多発性筋炎等）や、輸送に関連する神経性障害（アルツハイマー病、健忘
症、双極性障害、痴呆、うつ病、癲癇、トゥーレット障害、妄想性精神病、及び
精神***病等）や、更に輸送に関連する他の疾患（神経線維腫症、帯状疱疹後の
神経痛、３叉神経の神経障害、サルコイドーシス、鎌形赤血球貧血、及びウィル
ソン病等）等）が含まれる。HCRMをコードするポリヌクレオチド配列を、患者の
生検組織や体液を利用するサザンブロットまたはノーザン分析、ドットブロット
法或いは他の膜ベース(membrane-based)技術や、PCR技術や、ディップスティッ ク試験法(dipstick)、ピン、ELISAアッセイまたはマイクロアレイにおいて用い て、HCRM発現の変化を検出することができる。このような定性的または定量的試
験法は当業者に周知のものである。A polynucleotide sequence encoding HCRM can be used for diagnosis of a disease associated with expression of HCRM. Examples of such diseases include, but are not limited to, cell proliferative diseases (eg, arteriosclerosis, atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD ), Myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, eukaryotic polycytosis, psoriasis, primary thrombocythemia, adenocarcinoma, leukemia, lymphoma,
Cancer, including melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, and especially adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, Ovaries,
Pancreatic, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, and uterine cancer, etc., and transport disorders (eg, axinea, amyotrophic lateral sclerosis, ataxia telangiectasia) Cystic fibrosis, Becker muscular dystrophy, Bell's palsy, Charcot-Marie-Tooth disease, diabetes, diabetes insipidus, diabetic neuropathy, Duchenne muscular dystrophy, hyperkalemia-periodic paralysis, normokalemia-periodic paralysis, Parkinson's disease Malignant hyperthermia, multidrug resistance, myasthenia gravis, myotonic dystrophy, catatonia, tardive dyskinesia, dystonia, peripheral neuropathy, cerebral tumors, prostate cancer, and transport-related cardiac Disability (angina, bradyarrythmia
, Tachyarrythmia, hypertension, hereditary long QT syndrome, myocarditis, cardiomyopathy, nemarin myopathy lanemarin myopathy, lipid myopathy, mitochondrial myopathy, thyroid toxic myopathy, ethanol myopathy, dermatomyositis, inclusion body myositis, infectious myositis , Polymyositis, etc.), transport-related neurological disorders (Alzheimer's disease, amnesia, bipolar disorder, dementia, depression, epilepsy, Tourette's disorder, paranoid psychosis, schizophrenia, etc.), and more Other transport-related disorders (such as neurofibromatosis, postherpetic neuralgia, trigeminal neuropathy, sarcoidosis, sickle cell anemia, and Wilson's disease) are included. Polynucleotide sequences encoding HCRM can be analyzed by Southern or Northern analysis using patient biopsies or body fluids, dot blots or other membrane-based techniques, PCR techniques, or dipstick assays. (dipstick), pins, ELISA assays or microarrays can be used to detect changes in HCRM expression. Such qualitative or quantitative test methods are well known to those skilled in the art.

【０１７０】 特定の態様では、特に上述のような関連する疾患の存在を検出するアッセイに
おいて、HCRMをコードするヌクレオチド配列は有用であり得る。HCRMをコードす
るヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識され、またハイブリダイゼーション
複合体の形成に適した条件下で、患者からの体液や組織サンプルに加えることが
できる。適当なインキュベーション期間の後、そのサンプルは洗浄され、シグナ
ルが定量されて標準値と比較される。患者のサンプルにおけるシグナルの量が、
対照サンプルに比べて有意に変化している場合、サンプルのなかのHCRMをコード
するヌクレオチド配列のレベルの変化は、関連する疾患の存在を示している。ま
た、このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、または個々の患者の治
療のモニタリングにおける特定の治療学的な処置法の有効性を評価することもで
きる。In certain embodiments, the nucleotide sequence encoding HCRM may be useful, particularly in assays that detect the presence of related disorders as described above. The nucleotide sequence encoding HCRM can be labeled by standard methods and added to body fluids or tissue samples from patients under conditions suitable for forming hybridization complexes. After an appropriate incubation period, the sample is washed and the signal is quantified and compared to a standard value. If the amount of signal in the patient sample is
A change in the level of the nucleotide sequence encoding HCRM in the sample, if significantly altered relative to the control sample, is indicative of the presence of the associated disease. Such assays can also be used to evaluate the effectiveness of a particular therapeutic treatment in animal studies, clinical trials, or monitoring the treatment of an individual patient.

【０１７１】 HCRMの発現に関連する疾病の診断のための基礎を提供するために、正常な、即
ち標準の発現のプロフィールを確立する。これは、ハイブリダイゼーション或い
は増幅に適した条件下で、動物またはヒト何れかの正常な被験者から採取された
体液或いは細胞抽出物を、HCRMをコードする配列又はその断片と結合させること
により達成される。標準のハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得られ
る値と、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験から
得られる値とを比較することにより定量し得る。このように正常なサンプルから
得られた標準値は、疾病の徴候がある患者のサンプルから得られる値と比較する
ことができる。標準値からの偏差を用いて疾病の存在を証明する。To provide a basis for the diagnosis of diseases associated with HCRM expression, a normal, ie, standard, expression profile is established. This is accomplished by combining a body fluid or cell extract taken from a normal subject, either an animal or a human, with a sequence encoding HCRM or a fragment thereof under conditions suitable for hybridization or amplification. . Standard hybridization can be quantified by comparing the value obtained from a normal subject to a value obtained from an experiment in which a known amount of a substantially purified polynucleotide is used. The standard values thus obtained from a normal sample can be compared to values obtained from a sample of a patient with signs of disease. Deviation from standard values is used to prove the presence of the disease.

【０１７２】 一旦疾患の存在が確認され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼ
ーションアッセイが定期的に繰り返され、患者の発現のレベルが正常な患者にお
いて観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価することができる。連続的な
アッセイから得られる結果を用いて、数日から数ヶ月にわたる治療の効果を示す
ことができる。[0172] Once the presence of the disease has been confirmed and the treatment protocol initiated, the hybridization assay is repeated periodically to determine whether the level of expression in the patient has begun to approach that observed in normal patients. Can be evaluated. The results from successive assays can be used to show the efficacy of treatment over days to months.

【０１７３】 癌に関しては、個体からの生検組織における比較的多量の転写物の存在が、疾
病の発生の素因を示し、つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出するた
めの手段となり得る。このタイプのより決定的な診断により、健康の専門家が予
防的処置を講じたり、より早期に積極的な治療を行なうことが可能となり、故に
癌の発生や更なる進行を予防することができる。For cancer, the presence of relatively high amounts of transcripts in biopsy tissue from an individual indicates a predisposition to the development of the disease, ie, a means for detecting the disease before actual clinical symptoms appear. obtain. This type of more conclusive diagnosis allows health professionals to take preventive measures and provide more aggressive treatment earlier, and thus prevent the development and further progression of cancer .

【０１７４】 HCRMをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの付加的な診断のた
めの使用法には、PCR法の利用が含まれる。これらのオリゴマーは化学的に合成 され、酵素を用いて作製され、またはin vitroで作製されてもよい。オリゴマー
は、好ましくはHCRMをコードするポリヌクレオチドの断片、またはHCRMをコード
するポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、特定の遺伝子
或いは状態を識別するための最適化された条件の下で用いられる。また深く関わ
るDNAまたはRNA配列の検出及び／又は定量のために、オリゴマーは緩やかな厳密
性の条件で用いることができる。[0174] Additional diagnostic uses for oligonucleotides designed from sequences encoding HCRM include the use of PCR. These oligomers may be chemically synthesized, made using enzymes, or made in vitro . The oligomer preferably comprises a fragment of the polynucleotide encoding HCRM, or a fragment of the polynucleotide complementary to the polynucleotide encoding HCRM, under optimized conditions to identify a particular gene or condition. Used. Oligomers can also be used under mild stringency conditions for the detection and / or quantification of deeply involved DNA or RNA sequences.

【０１７５】 またHCRM発現を定量するために用いられる方法には、放射標識或いはビオチン
化したヌクレオチドの利用、対照核酸の同時増幅(coamplification)の利用、及 び標準の検量線で補間する実験結果の利用が含まれる（例えば、Melby, P.C.ら(
1993) J. Immunol. Methods, 159:235-244；Duplaa, C. ら(1993) Anal. Bioche
m. 229-236参照）。多数のサンプルの定量の速度は、目的のオリゴマーが様々な
希釈溶液中に存在し、分光光度法または比色定量応答により迅速に定量するELIS
A形式においてアッセイを実施することによって加速することができる。Methods used to quantify HCRM expression also include the use of radiolabeled or biotinylated nucleotides, the use of coamplification of control nucleic acids, and the use of experimental results interpolated with a standard calibration curve. Usage (eg, Melby, PC et al. (
(1993) J. Immunol. Methods, 159: 235-244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Bioche.
m. 229-236). The rate of quantitation of large numbers of samples is determined by the ELIS, where the oligomer of interest is present in various dilute solutions and is quickly quantified by spectrophotometric or colorimetric response
It can be accelerated by performing the assay in format A.

【０１７６】 別の実施例においては、ここに開示した任意のポリヌクレオチド配列に由来す
るオリゴヌクレオチド又はより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いることができる。マイクロアレイを用いて、同時に多くの遺伝子の発現レベ
ルをモニタし、また遺伝子の変異配列、変異及び多形性を同定することができる
。この情報は、遺伝子機能の決定、疾病の遺伝的基礎の理解、疾病の診断、並び
に治療薬の開発およびその活性のモニタリングにおいて有用である。In another example, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences disclosed herein can be used as targets in a microarray. Microarrays can be used to simultaneously monitor the expression levels of many genes and identify mutated sequences, mutations and polymorphisms in genes. This information is useful in determining gene function, understanding the genetic basis of disease, diagnosing disease, and developing therapeutics and monitoring their activity.

【０１７７】 マイクロアレイが準備され、当業者に周知の方法を用いて分析される（例えば
、Brennan, T.M.ら(1995) U.S. Patent NO. 5,474,796; Schena, M.ら(1996) Pr
oc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweilerら(1995) PCT applicat
ion WO95/251116; Shalom D.ら (1995) PCT application WO95/35505: Heller.
R.A. ら(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 並びにHeller. M.J.ら
(1997) U.S. Patent No.5,605,662を参照）。[0177] Microarrays are prepared and analyzed using methods well known to those skilled in the art (eg, Brennan, TM et al. (1995) US Patent NO. 5,474,796; Schena, M. et al. (1996) Pr.
oc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619; Baldeschweiler et al. (1995) PCT applicat.
ion WO95 / 251116; Shalom D. et al. (1995) PCT application WO95 / 35505: Heller.
RA et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2150-2155; and Heller. MJ et al.
(1997) US Patent No. 5,605,662).

【０１７８】 本発明の別の実施例においては、HCRMをコードする核酸配列を用いて、自然発
生のゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブ
を作り出すこともできる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の領域、又
は人工染色体作製物にマッピングすることができ、その人工染色体作製物には、
例えば、ヒト人工染色体（HACs）、酵母菌人工染色体（YACs）、細菌人工染色体
（BACs）、細菌性P1作製物又は1本鎖染色体cDNAライブラリーがある（例えば、P
rice, C.M.(1993) Blood Rev.7:127-134）；及びTrask, B. J. (1991) Trends G
enet.7:149-154参照）。In another embodiment of the present invention, nucleic acid sequences encoding HCRM can be used to generate hybridization probes useful for mapping naturally occurring genomic sequences. This sequence can be mapped to a particular chromosome, a particular region of the chromosome, or an artificial chromosome product, wherein the artificial chromosome product comprises:
For example, there are human artificial chromosomes (HACs), yeast artificial chromosomes (YACs), bacterial artificial chromosomes (BACs), bacterial P1 products or single-stranded chromosomal cDNA libraries (eg, P
rice, CM (1993) Blood Rev. 7: 127-134); and Trask, BJ (1991) Trends G
enet. 7: 149-154).

【０１７９】 蛍光性インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的な染色
体マッピング技術及び遺伝地図データと関連し得る（例えば、Heinz-Ulrichら(1
995)in Meyers,R.A.(ed.)Molecular Biology and Biotechnology,VCH Publisher
s New York,NY,pp.965-968参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学誌、また
はOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）部位に見られる。物理的な染 色体地図上のHCRMをコードする配列の位置および特定の疾病、もしくは特定の疾
病の素因との関連性の助けにより、疾患に関係するDNAの領域の範囲を定めるこ とができる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者とキャリア、及び発症
した個体の間の遺伝子配列の違いを検出することができる。Fluorescent in situ hybridization (FISH) may be associated with other physical chromosome mapping techniques and genetic map data (eg, Heinz-Ulrich et al. (1.
995) in Meyers, RA (ed.) Molecular Biology and Biotechnology , VCH Publisher
s New York, NY, pp. 965-968). Examples of genetic map data can be found in various scientific journals or in the Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) site. With the help of the location of the HCRM-encoding sequence on the physical chromosome map and its association with a particular disease or a predisposition to a particular disease, regions of the DNA associated with the disease can be delimited . The nucleotide sequence of the present invention can be used to detect differences in gene sequences between normal individuals, carriers, and affected individuals.

【０１８０】 遺伝地図を広げるために、染色体作製物のin situハイブリダイゼーション及 び確立された染色体マーカーを用いる連鎖解析のような物理的なマッピング技術
を用いることができる。場合によっては、特定のヒト染色体の数やアームが未知
であっても、マウスのような別の哺乳類の染色体上の遺伝子配置によって関連す
るマーカーが明らかになる。物理的なマッピングによって、新たな配列を染色体
のアーム、或いはその一部へ割当てることができる。これにより、位置クローニ
ングまたは別の遺伝子発見技術を用いて、疾病遺伝子を検索する研究者に価値あ
る情報を提供できる。ひとたび疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えば
AT to 11q22-23への遺伝連鎖によって不完全な局所化がなされると、その領域に
マッピングされる任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子または調
節遺伝子を表し得る（例えば、Gatti, R.A.ら（1988）Nature 336:577-580参照 ）。また、本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者の染色体の位置と、キャ
リア、即ち発症した個体の、転座、逆位等によって生じた染色体の位置との違い
を検出することもできる。To expand the genetic map, physical mapping techniques such as in situ hybridization of chromosomal constructs and linkage analysis using established chromosomal markers can be used. In some cases, even though the number or arm of a particular human chromosome is unknown, the placement of genes on the chromosome of another mammal, such as a mouse, reveals relevant markers. New sequences can be assigned to chromosomal arms, or parts thereof, by physical mapping. This can provide valuable information to researchers searching for disease genes using positional cloning or other gene discovery techniques. Once a disease or syndrome has a specific genomic region, for example,
When incomplete localization is achieved by genetic linkage to AT to 11q22-23, any sequence mapped to that region may represent a relevant or regulatory gene for further study (eg, Gatti, RA et al. (1988) Nature 336: 577-580). Further, using the nucleotide sequence of the present invention, it is also possible to detect a difference between the position of a chromosome of a normal person and the position of a chromosome caused by translocation, inversion, or the like of a carrier, that is, an affected individual.

【０１８１】 本発明の別の実施例においては、HCRMや、その触媒作用性または免疫原性断片
、即ちそれらのオリゴペプチドを、種々の薬剤スクリーニング技術における化合
物のライブラリーのスクリーニングのために用いることができる。そのようなス
クリーニングにおいて用いられる断片は、溶液中で遊離しているか、固体支持体
へ付着しているか、細胞表面へ付着しているか、或いは細胞内に位置しているも
のでありうる。HCRMと検定する薬剤との結合複合体の形成を測定することができ
る。In another embodiment of the present invention, the use of HCRM and its catalytic or immunogenic fragments, ie, oligopeptides thereof, for screening libraries of compounds in various drug screening techniques. Can be. The fragments used in such a screen can be free in solution, attached to a solid support, attached to a cell surface, or located intracellularly. The formation of a binding complex between HCRM and the agent to be assayed can be measured.

【０１８２】 別の薬物スクリーニング技術として、目的のタンパク質に対する適切な結合親
和性を有する化合物の高スループットスクリーニングが提供される（例えば、Ge
ysenら(1984) PCT出願WO84/03564参照）。この方法において、多くの異なる小形
の試験化合物が、プラスチックピン或いは別の表面のような固体基質において合
成される。試験化合物をHCRM又はその断片と反応させ、そして洗浄する。次に、
当技術分野で周知の方法で結合HCRMを検出する。また、前述の薬剤スクリーニン
グ技術において使用するために、精製されたHCRMをプレート上に直接コーティン
グすることもできる。或いは、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉して固体
支持体上に固定することができる。As another drug screening technique, high-throughput screening for compounds with appropriate binding affinity for the protein of interest is provided (eg, Ge
(see ysen et al. (1984) PCT application WO 84/03564). In this method, many different miniature test compounds are synthesized on a solid substrate such as a plastic pin or another surface. The test compound is reacted with HCRM or a fragment thereof and washed. next,
Bound HCRM is detected by methods well known in the art. Also, purified HCRM can be coated directly on a plate for use in the aforementioned drug screening techniques. Alternatively, the peptide can be captured and immobilized on a solid support using a non-neutralizing antibody.

【０１８３】 別の実施例においては、HCRM結合のためにHCRMと結合可能な中和抗体が試験化
合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを用いることができ
る。この方法において、抗体を用いて、1またはそれ以上の抗原決定基をHCRMと 共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。In another example, a competitive drug screening assay can be used in which neutralizing antibodies capable of binding HCRM specifically compete with a test compound for HCRM binding. In this way, antibodies can be used to detect the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with HCRM.

【０１８４】 さらに別の実施例においては、その新技術が、以下に限らないが、トリプレッ
ト遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用のようなものを含む特性の現在周知のヌ
クレオチド配列の特性に基づくものであれば、HCRMをコードするヌクレオチド配
列を、未だ開発されていない分子生物学的技術に用いることができる。In yet another embodiment, the new technology is based on the properties of currently known nucleotide sequences, including but not limited to those such as the triplet genetic code and specific base pairing interactions. If so, the nucleotide sequence encoding HCRM can be used in molecular biology techniques that have not yet been developed.

【０１８５】 以下に示す実施例は本発明の例示であって、本発明を限定しようとするもので
はない。The following examples are illustrative of the present invention and are not intended to limit the present invention.

【０１８６】[0186]

【実施例】【Example】

１ cDNAライブラリーの作製 （PROSTUT10） PROSTUT10 cDNAライブラリーは、66歳の白人男性から得られた前立腺の腫瘍組
織から作製された。組織は患者が根治的前立腺切除および局所性リンパ節切除を
受けた際に切除された。病理学報告は、左右の中枢系(centrally)に関連する前 立腺腫瘍Gleason grade(2+3)を示していた。腫瘍は限られており、被膜には影響
を及ぼしていない。神経周囲の浸潤は存在しなかった。最初に患者は前立腺の特
異的抗原（PSA）の上昇を呈した。患者の病歴には、良性の高血圧症および飲酒 が含まれていた。患者の家族歴には、患者の父親の前立腺の悪性腫瘍並びに骨お
よび関節軟骨の悪性腫瘍、患者の同胞の良性の高血圧症が含まれていた。 1. Preparation of cDNA Library (PROSTUT10) The PROSTUT10 cDNA library was prepared from prostate tumor tissue obtained from a 66-year-old white male. Tissue was removed when the patient underwent radical prostatectomy and local lymphadenectomy. Pathology reports indicated a prostate tumor Gleason grade (2 + 3) associated with the left and right centrally. The tumor is limited and does not affect the capsule. There was no perineural infiltration. Initially, the patient presented with elevated prostate specific antigen (PSA). The patient's medical history included benign hypertension and drinking. The patient's family history included a prostate malignancy of the patient's father and bone and articular cartilage, and a benign hypertension of the patient's siblings.

【０１８７】 （OVARTUT01） OVARTUT01 cDNAライブラリーは、悪性腫瘍を患う43歳の白人女性から得られた
腫瘍状の卵巣組織から作製された。患者の病歴には、以前の正常分娩、膣式子宮
摘出が示されていた。また、患者の病歴には、以前の肝炎の診断、脳血管性の疾
患、アテローム性動脈硬化症、僧帽弁疾患が報告されていたが、手術の際にはこ
れらの何れの症状に対しても薬剤投与を受けることはなかった。OVARTUT01 The OVARTUT01 cDNA library was generated from tumorous ovarian tissue obtained from a 43 year old Caucasian woman with malignancy. The patient's medical history indicated a previous normal delivery, vaginal hysterectomy. In addition, the patient's medical history reported a previous diagnosis of hepatitis, cerebrovascular disease, atherosclerosis, and mitral valve disease. Received no medication.

【０１８８】 （BRSTTUT03） BRSTTUT03 cDNAライブラリーは、多中心性で浸潤性のグレード4の乳腺小葉癌 の診断の後に片側のみ拡大された単純***切除術を受けた58歳の女性から得られ
た癌性の***組織から作製された。病理報告は、単一の主な腫瘤を形成する左の
***上側の外側4分の1区分で癌細胞が同定されたことを示していた。また、3つ の個別の小結節を形成する左の***下側の外側4分の1区分でも癌細胞が同定され
た。外科的縁は腫瘍に対して陰性であることが分かった。皮膚、乳頭、及び筋膜
は影響を受けていなかった。血管の侵襲の証拠は発見されなかった。8つの中央 下部の腋窩のリンパ節および2つの上部左側の腋窩のリンパ節は、腫瘍に対して 陰性であった。手術の前に患者は皮膚癌、脳血管性の疾患、アテローム性動脈硬
化症、リウマチ性心疾患、及び変性関節疾患と診断されていた。患者の家族歴に
は、患者の母親の乳癌および患者の兄弟の前立腺の癌が含まれていた。 （PROSTUT10、OVARTUT01、及びBRSTTUT03） グアニジニウムイソチオシアネート溶液中で凍結組織をBrinkmann Homogenize
r Polytron PT-3000（Brinkmann Instruments, Westbury, NJ）を用いて均質化 および溶解した。溶解産物は、Beckman L8-70M超遠心機のBeckman SW28ローター
（Beckman Instruments）を用いて、室温において25,000rpmで18時間、5.7MのCs
Clクッションで遠心分離した。RNAを酸性フェノール（pH4.7）で抽出し、0.3Mの
酢酸ナトリウム及び2.5倍量のエタノールを用いて沈殿させ、RNAseフリーの水に
再懸濁させ、37℃においてDNaseで処理した。RNAを抽出および沈殿を前述のよう
に繰返した。mRNAをQiagen Oligotex kit（QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA）を 用いて単離してcDNAライブラリーの作製に使用した。(BRSTTUT03) The BRSTTUT03 cDNA library is a cancer obtained from a 58-year-old woman who underwent unilateral enlargement of a simple mastectomy after diagnosis of a multicentric, invasive grade 4 lobular carcinoma of the breast. Made from sexual breast tissue. Pathological reports indicated that cancer cells were identified in the outer quadrant above the left breast, forming a single major mass. Cancer cells were also identified in the outer quadrant below the left breast, forming three individual nodules. The surgical margin was found to be negative for the tumor. Skin, papillae, and fascia were not affected. No evidence of vascular invasion was found. Eight lower middle axillary lymph nodes and two upper left axillary lymph nodes were negative for the tumor. Prior to surgery, the patient had been diagnosed with skin cancer, cerebrovascular disease, atherosclerosis, rheumatic heart disease, and degenerative joint disease. The patient's family history included breast cancer in her mother and prostate cancer in her brother. (PROSTUT10, OVARTUT01, and BRSTTUT03) Brinkmann Homogenize frozen tissue in guanidinium isothiocyanate solution
r Homogenized and dissolved using Polytron PT-3000 (Brinkmann Instruments, Westbury, NJ). Lysates were analyzed using a Beckman SW28 rotor (Beckman Instruments) in a Beckman L8-70M ultracentrifuge at 25,000 rpm for 18 hours at room temperature for 5.7M Cs.
Centrifuged on a Cl cushion. RNA was extracted with acidic phenol (pH 4.7), precipitated using 0.3 M sodium acetate and 2.5 volumes of ethanol, resuspended in RNAse-free water, and treated with DNase at 37 ° C. RNA extraction and precipitation was repeated as described above. mRNA was isolated using a Qiagen Oligotex kit (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA) and used to construct a cDNA library.

【０１８９】 mRNAは、SuperScript Plasmid Systemの推奨プロトコル(Cat. #18248-013, GI
BCO/BRL, Gaithersburg, MD)に従って取扱った。PROSTUT10 cDNAをセファロース
CL4Bカラム（Cat. #275105-01, Pharmacia)において分別し、400bpを超えるこれ
らのcDNAをクローニングベクター、pINCY (PROSTUT10) 又は pSPORT (OVARTUT01
及びBRSTTUT03)と結びつけ、続いて系統DH5α^TMのコンピテント細胞（Cat. # 18
258-012. Gibco/BRL; PROSTUT10及びOVARTUT01）またはDH12S （Cat. #18312-01
7, Gibco/BRL; BRSTTUT03）に形質転換した。The mRNA was prepared according to the recommended protocol of the SuperScript Plasmid System (Cat. # 18248-013, GI
(BCO / BRL, Gaithersburg, MD). PROSTUT10 cDNA Sepharose
After fractionating on a CL4B column (Cat. # 275105-01, Pharmacia), these cDNAs exceeding 400 bp were cloned into a cloning vector, pINCY (PROSTUT10) or pSPORT (OVARTUT01).
And BRSTTUT03), followed by competent cells of line DH5α ^™ (Cat. # 18
258-012. Gibco / BRL; PROSTUT10 and OVARTUT01) or DH12S (Cat. # 18312-01)
7, Gibco / BRL; BRSTTUT03).

【０１９０】 ２ cDNAクローンの単離および配列決定 プラスミドDNAを細胞から遊離し、REAL Prep 96 Plasmid Kit（Catalog #2617
3, QIAGEN, Inc）を用いて精製した。推奨プロトコルを用いたが、以下の点を変
更した。（１）細菌は、25mg/Lのカルベニシリン及び0.4%のグリセロールと共に
1mlの滅菌Terrific Broth(Catalog #22711,GIBCO/BRL)において培養した。（２ ）接種の後、培養株を19時間インキュベートし、インキュベーションの終了時に
細胞を0.3mlの溶解バッファーで溶解した。（３）イソプロパノール沈殿の後に 、プラスミドDNAペレッを0.1mlの蒸留水中に再懸濁した。プロトコルの最終ステ
ップの終了後に、サンプルを96穴ブロックに移して4℃で保管した。 2 Isolation and Sequencing of cDNA Clones Plasmid DNA was released from cells and the REAL Prep 96 Plasmid Kit (Catalog # 2617)
3, QIAGEN, Inc.). The recommended protocol was used, with the following changes. (1) Bacteria, together with 25mg / L carbenicillin and 0.4% glycerol
Cultured in 1 ml sterile Terrific Broth (Catalog # 22711, GIBCO / BRL). (2) After inoculation, the culture was incubated for 19 hours, and at the end of the incubation, the cells were lysed with 0.3 ml of lysis buffer. (3) After isopropanol precipitation, the plasmid DNA pellet was resuspended in 0.1 ml of distilled water. After completion of the final step of the protocol, samples were transferred to a 96-well block and stored at 4 ° C.

【０１９１】 Peltier Thermal Cyclers（PTC200 from MJ Research, Watertown, MA）、及 びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing SystemsとHamilton Micro Lab 2200
（Hamilton, Reno, NV）とを組み合わせて用いて、Sangerら（1975, J. Mol. B
iol. 94:441f）の方法によってcDNAの配列決定を行ない、読み枠を画定した。Peltier Thermal Cyclers (PTC200 from MJ Research, Watertown, MA), and Applied Biosystems 377 DNA Sequencing Systems and Hamilton Micro Lab 2200
(Hamilton, Reno, NV) in combination with Sanger et al. (1975, J. Mol. B
iol. 94: 441f), and the reading frame was demarcated by sequencing the cDNA.

【０１９２】 ３ cDNAクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索 GenBank、SwissProt、BLOCKS、及びPima IIデータベースにおいて、配列表の ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いた。
これらのデータベースには既に同定された注釈付きの配列が含まれており、BLAS
T(Basic Local Alignment Search Tool)を用いて相同性を有する領域をこのデー
タベースの中から検索した（例えば、Altschul. S.F.(1993) J. Mol. Evol. 36:
290-300；及びAltschulら(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410参照）。 3 Homology search for cDNA clones and their analogous proteins The nucleotide sequence and / or amino acid sequence in the sequence listing was used as a query sequence in the GenBank, SwissProt, BLOCKS, and Pima II databases.
These databases contain annotated sequences already identified, and are
A region having homology was searched from this database using T (Basic Local Alignment Search Tool) (for example, Altschul. SF (1993) J. Mol. Evol. 36:
290-300; and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410).

【０１９３】 BLASTはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成し、配列 類似性を判定する。そのアライメントの局部的性質のため、BLASTは厳密な一致 を判定する、即ち原核生物（細菌）又は真核生物（動物、真菌、植物）起源のホ
モログを同定する際に特に有効である。他のアルゴリズムを、一次配列パターン
及び二次的な構造ギャップペナルティを取り扱う際に用いることができる（例え
ば、Smith,Tら(1992) Protein Engineering 5:35-51参照）。本明細書に開示さ れた配列は、少なくとも49ヌクレオチドの長さであり、不要な塩基は12%未満で ある（ここでは、A、C、G、TではなくNが記録される）。BLAST generates both nucleotide and amino acid sequence alignments to determine sequence similarity. Due to the local nature of the alignment, BLAST is particularly useful in determining exact matches, ie, identifying homologs of prokaryotic (bacterial) or eukaryotic (animal, fungal, plant) origin. Other algorithms can be used in handling primary sequence patterns and secondary structural gap penalties (see, eg, Smith, T et al. (1992) Protein Engineering 5: 35-51). The sequences disclosed herein are at least 49 nucleotides in length and have less than 12% of unnecessary bases (N is recorded here, not A, C, G, T).

【０１９４】 BLASTアプローチは、問い合わせ配列とデータベースの配列の一致を検索する 。また、BLASTは、発見されたあらゆる配列の一致の統計的有意性を評価して、 ユーザが選択した有意性のしきい値を満たすそれらの一致のみを報告する。本出
願でのしきい値は、ヌクレオチドで10^{- 25}、ペプチドで10^{- 8}に設定した。The BLAST approach searches for a match between the query sequence and the sequence in the database. BLAST also evaluates the statistical significance of any sequence matches found and reports only those matches that meet a user-selected significance threshold. Threshold in this application, nucleotides 10 ^{- 25,} 10 peptide ^- was set to ^8.

【０１９５】 インサイト社のヌクレオチド配列を、霊長類（pri）、げっ歯類（rod）、及び
他の哺乳類配列（mam）のGenBankデータベースで検索し、そして同じクローンか
ら類推されたアミノ酸配列を、GenBankの機能性タンパク質データベース、哺乳 類（mamp）、脊椎動物（vrtp）、及び真核生物（eukp）で、相同性について検索
した。The nucleotide sequence of Incyte was searched in the GenBank database of primates (pri), rodents (rod), and other mammalian sequences (mam), and the amino acid sequence deduced from the same clone was GenBank functional protein databases, mammals (mamp), vertebrates (vrtp), and eukaryotes (eukp) were searched for homology.

【０１９６】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織に由来するRNAが結合されている膜への標識 されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（例えば、Sambrookら
、前出, ch.7；並びにAusubel, F.M.ら前出, ch.4および16.参照）。 4 Northern Analysis Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of a gene transcript, in which RNA from a particular cell type or tissue is labeled on a membrane. involving hybridization of nucleotide sequences (e.g., Sambrook et al., supra, ch.7; supra and Ausubel, FM et al., see ch.4 and 16.).

【０１９７】 BLAST（Altschul,S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300; Altschul,S.F.ら(1990) J.Mol.Evol. 215:403-410）を使用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenB
ank或いはLIFESEQ^TM データベース（インサイト社）のようなヌクレオチドデー
タベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブ
リダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更
して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れとして分類され
るかを決定することができる。検索の基準は、以下で定義される積スコア（prod
uct score）である。 （%配列同一性×%最大BLASTスコア）／100 積スコアは、2つの配列間の類似度及び配列一致の長さの両方を考慮に入れる。 例えば、積スコア40の場合、その一致は1〜2%誤差の範囲内の正確さであり、積ス
コア70の場合は正確な一致となる。相同性分子は通常、15〜40間の積スコアを示す
分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでも関連した分子
が同定される場合もある。A similar computer technique using BLAST (Altschul, SF (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul, SF et al. (1990) J. Mol. Evol. 215: 403-410). Using GenB
Search for identical or related molecules in nucleotide databases such as ank or LIFESEQ ^™ database (Insight). This analysis is much faster than many membrane-based hybridizations. In addition, the sensitivity of the computer search can be modified to determine whether any particular match is classified as an exact match or a homologous match. The search is based on the product score (prod
uct score). (% Sequence identity x% max BLAST score) / 100 The product score takes into account both the similarity between the two sequences and the length of the sequence match. For example, for a product score of 40, the match is accurate to within 1-2% error, and for a product score of 70, it is an exact match. Homologous molecules are usually identified by selecting a molecule that exhibits a product score between 15 and 40, although lower scores may identify related molecules.

【０１９８】 ノーザン分析の結果は、HCRMをコードする転写物が発生するライブラリのリス
トとして報告される。また存在量及び存在比も報告される。存在量は、特定の転
写物がcDNAライブラリ内に現れる回数を正に表すものであり、存在率は、存在量
をcDNAライブラリ内で試験された配列の全数で割った値である。The results of the Northern analysis are reported as a list of libraries in which transcripts encoding HCRM are generated. Abundance and abundance are also reported. Abundance is a positive measure of the number of times a particular transcript appears in the cDNA library, and abundance is the abundance divided by the total number of sequences tested in the cDNA library.

【０１９９】 ５ HCRMをコードするポリヌクレオチドの伸長 インサイト社クローン1690887、1998015、及び2252446の核酸配列を用いて、 部分ヌクレオチド配列を完全長まで伸長するためのオリゴヌクレオチドプライマ
ーを設計した。各核酸配列に対して、一方のプライマーを合成してアンチセンス
ポリヌクレオチドの伸長を開始し、他方のプライマーを合成してセンスポリヌク
レオチドの配列を伸長を開始した。プライマーを用いることにより、対象の領域
に対する新たな未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生さ
せる既知の配列の伸長を容易にした。初期のプライマーを、OLIGO4.06 (Nationa
l Biosciences,Plymouth,MN)或いは他の適切なプログラムを用いて、約22〜30ヌ
クレオチドからなる長さで、50%以上のGC含有物を有し、且つ約68〜72℃の温度 で標的配列にアニーリングするようにcDNAから設計した。ヘアピン構造及びプラ
イマー−プライマー2量体を生ずるようなヌクレオチドの如何なる伸展も避けた 。 5 Extension of polynucleotide encoding HCRM Using the nucleic acid sequences of Incyte clones 1690887, 1998015, and 2252446, oligonucleotide primers were designed to extend the partial nucleotide sequence to full length. For each nucleic acid sequence, one primer was synthesized to initiate extension of the antisense polynucleotide, and the other primer was synthesized to initiate extension of the sense polynucleotide sequence. The use of primers facilitated the extension of a known sequence that generated an "outside" amplicon containing a new unknown nucleotide sequence for the region of interest. The initial primer was used with OLIGO 4.06 (Nationa
l Biosciences, Plymouth, MN) or other suitable program, with a length of about 22-30 nucleotides, with a GC content of 50% or more, and a target sequence at a temperature of about 68-72 ° C. Designed to anneal to the cDNA. Any extension of the nucleotides resulting in a hairpin structure and primer-primer dimer was avoided.

【０２００】 選択されたヒトcDNAライブラリ(Gibco/BRL)を用いて配列を伸長した。２つ以 上の伸長が必要である、もしくは望まれる場合には、さらに別のプライマの組を
設計して既知領域をさらに伸長させる。The sequence was extended using a selected human cDNA library (Gibco / BRL). If more than one extension is necessary or desired, another set of primers is designed to further extend the known region.

【０２０１】 XL-PCR kit (Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、酵素及び反応混合物を完 全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られた。PCRはPeltier Thermal
Cycler (PTC200; M.J.Research, Watertown,MA)を用いて実施され、以下のパラ
メータで、40pmolの各プライマおよびキットの他の全ての成分を推奨された濃度
で開始した。 ステップ1 94℃で1分間(初期変性) ステップ2 65℃で1分間 ステップ3 68℃で6分間 ステップ4 94℃で15秒間 ステップ5 65℃で1分間 ステップ6 68℃で7分間 ステップ7 ステップ4〜6をさらに15サイクル繰返す ステップ8 94℃で15秒間 ステップ9 65℃で1分間 ステップ10 68℃で7分15秒間 ステップ11 ステップ8〜10を12サイクル繰返す ステップ12 72℃で8分間 ステップ13 4℃（保持する） 反応混合物の5〜10μlのアリコットを低濃度（約0.6〜0.8%）アガロースミニ ゲル上で電気泳動法により分析し、どの反応物が配列の伸長に成功したかを判定
した。最も大きな生成物を含むと考えられるバンドをゲルから切出し、QIA Quic
k^TM （QIAGEN Inc., Chatsworth, CA）を用いて精製し、クレノウ酵素を用いて オーバーハングを切除して、再連結及びクローニングを容易にした。High fidelity amplification was obtained by thorough mixing of the enzyme and reaction mixture according to the instructions for the XL-PCR kit (Perkin Elmer). PCR is Peltier Thermal
Performed using a Cycler (PTC200; MJResearch, Watertown, MA), starting 40 pmol of each primer and all other components of the kit at the recommended concentrations with the following parameters. Step 1 94 ° C for 1 minute (initial denaturation) Step 2 65 ° C for 1 minute Step 3 68 ° C for 6 minutes Step 4 94 ° C for 15 seconds Step 5 65 ° C for 1 minute Step 6 68 ° C for 7 minutes Step 7 Step 4 Repeat Steps 6 to 15 for further 15 cycles Step 8 94 ° C for 15 seconds Step 9 65 ° C for 1 minute Step 10 68 ° C for 7 minutes 15 seconds Step 11 Repeat Steps 8 to 10 for 12 cycles Step 12 72 ° C for 8 minutes Step 134 C. (hold) An aliquot of 5-10 μl of the reaction mixture was analyzed by electrophoresis on a low concentration (about 0.6-0.8%) agarose mini gel to determine which reaction was successful in extending the sequence. The band most likely to contain the largest product was excised from the gel and QIA Quic
Purified using k ^™ (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA) and the overhang was excised using Klenow enzyme to facilitate religation and cloning.

【０２０２】 エタノール沈殿の後、その生成物を13μlの連結緩衝液中に再溶解し、1μlT4-
DNAリガーゼ（15単位）及び1μlT4ポリヌクレオチドキナーゼが加えて、その混 合物を2〜3時間室温で、或いは16℃で一晩インキュベートした。コンピテントE.c oli 細胞(40μlの適切な培養液中の)を3μlの連結混合物を用いて形質転換し、80 μlのSOC培養液で培養した（例えば、Sambrook、前出,Appendix A, p.2参照）。
37℃で1時間インキュベートした後、E.coli混合物を、2x Carbを含むLuria Bert
ani (LB)-agar (例えば、Sambrook、前出,Appendix A, p.1参照)上で培養した（
plated）。翌日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択して、適切
な市販の滅菌96穴マイクロタイタープレートの個々のウエル内に置かれた150μl
の液体LB/2xCarb培地で培養した。その翌日、終夜培養した各5μlの培養物を非 滅菌の96穴プレートに移し、水で1:10に希釈した後、各サンプルから5μlをのPCR
アレイに移した。After ethanol precipitation, the product was redissolved in 13 μl ligation buffer and 1 μl T4-
DNA ligase (15 units) and 1 μl T4 polynucleotide kinase were added and the mixture was incubated for 2-3 hours at room temperature or at 16 ° C. overnight. Competent E. With c oli cells (in a suitable culture medium of 40 [mu] l) of the ligation mixture of 3μl transformed and cultured in SOC broth of 80 [mu] l (e.g., Sambrook, supra, Appendix A, p .2).
After incubating for 1 hour at 37 ° C, the E. coli mixture was washed with Luria Bert containing 2x Carb.
cultured on ani (LB) -agar (see, eg, Sambrook, supra, Appendix A, p. 1) (
plated). The next day, several colonies were randomly selected from each plate and 150 μl placed in individual wells of an appropriate commercially available sterile 96-well microtiter plate
In a liquid LB / 2xCarb medium. The next day, transfer 5 μl of each overnight culture to a non-sterile 96-well plate, dilute 1:10 with water, and use 5 μl of PCR from each sample.
Transferred to array.

【０２０３】 PCR増幅の場合、4単位のrTthDNAポリメラーゼ、ベクタプライマー、及び伸長 反応のために用いられる1つ或いは両方の遺伝子特異的プライマーを含む18μlの
濃縮PCR反応混合物(3.3x)が各ウエルに加えられた。増幅は、以下の条件で実施 した。 ステップ1 94℃で60秒間 ステップ2 94℃で20秒間 ステップ3 55℃で30秒間 ステップ4 72℃で90秒間 ステップ5 ステップ2〜4をさらに29サイクル繰返す ステップ6 72℃で180秒間 ステップ7 4℃（保持する） PCR反応物のアリコットを、分子量マーカと共にアガロースゲル上で移動させ た。PCR生成物の大きさを元の部分cDNAと比較し、適切なクローンを選択し、プ ラスミドに結合させて、配列決定した。For PCR amplification, 18 μl of a concentrated PCR reaction mixture (3.3 ×) containing 4 units of rTth DNA polymerase, vector primers, and one or both gene-specific primers used for the extension reaction were added to each well. Added. Amplification was performed under the following conditions. Step 1 94 ° C for 60 seconds Step 2 94 ° C for 20 seconds Step 3 55 ° C for 30 seconds Step 4 72 ° C for 90 seconds Step 5 Repeat steps 2 to 4 for another 29 cycles Step 6 72 ° C for 180 seconds Step 7 4 ° C An aliquot of the PCR reaction (retained) was run on an agarose gel with a molecular weight marker. The size of the PCR product was compared to the original partial cDNA, appropriate clones were selected, ligated to the plasmid and sequenced.

【０２０４】 同様に、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、及びSEQ ID NO:6のヌクレオチド配列を 用いて、上記手順、5’伸長用に設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノ ムライブラリを用いる5’調節配列を得る。Similarly, using the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6, the above procedure, oligonucleotides designed for 5 ′ extension and appropriate genomic libraries To obtain the 5 'regulatory sequence.

【０２０５】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、及びSEQ ID NO:6に由来するハイブリダイゼーシ ョンプローブを用いて、cDNA、ゲノムDNA、又はmRNAをスクリーニングする。約2
0塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識化について特に記載するが、より大 きなヌクレオチドフラグメントにも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチド
を、OLIGO 4.06 （National Biosciences）のような現状の技術分野のソフトウ エアを用いて設計し、50pmolの各オリゴマーと250μCiの[γ-³²P]アデノシン三 リン酸 （Amersham,Chicago,IL）及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN^ョ , Boston MA)とを組み合わせることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオ チドを、Sephadex G-25超精細樹脂カラム（Pharmacia＆Upjohn,Kalamazoo,MI） を用いて実質的に精製する。毎分10⁷カウントの標識されたプローブを含むアリ コットを、エンドヌクレアーゼ（Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst I, Xba 1.或いは
Pvu II(DuPont NEN^ョ,Boston,MA)）の1つで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な 膜ベースのハイブリダイゼーション解析に用いる。 6 Labeling and Use of Individual Hybridization Probes Using hybridization probes derived from SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6, cDNA, genomic DNA, or Screen for mRNA. About 2
Although the labeling of oligonucleotides consisting of zero base pairs is specifically described, generally the same procedure is used for larger nucleotide fragments. Oligonucleotides were designed using current state of the art software such as OLIGO 4.06 (National Biosciences), and 50 pmol of each oligomer and 250 μCi of [γ- ³² P] adenosine triphosphate (Amersham, Chicago, IL) and T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN ^®, Boston MA) labeled by combining the. The labeled oligonucleotide is substantially purified using a Sephadex G-25 ultra-fine resin column (Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI). Aliquots containing 10 ⁷ counts of labeled probe per minute were used for endonuclease (Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst I, Xba 1. or
Pvu II (DuPont NEN ^®, Boston, MA)) typical membrane-based used in hybridization analysis of one-digested human genomic DNA.

【０２０６】 各消化物からのDNAを、0.7%アガロースゲルに上で分画して、ナイロン膜(NyHC
RMlus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に転写する。ハイブリダイゼーショ ンは40℃で16時間実施する。非特異的シグナルを除去するために、0.1×クエン 酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムまでの徐々に厳密性を増す
条件下で、ブロットを室温にて連続的に洗浄する。XOMAT AR^TMフィルム (Kodak,
Rochester,NY)を数時間ブロットに対して露光した後、ハイブリダイゼーション
パターンを視覚的に比較する。The DNA from each digest was fractionated on a 0.7% agarose gel and run on a nylon membrane (NyHC
RMlus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C for 16 hours. The blot is washed continuously at room temperature under increasingly stringent conditions up to 0.1 × sodium citrate saline and 0.5% sodium dodecyl sulfate to remove non-specific signals. XOMAT AR ^TM film (Kodak,
Rochester, NY) is exposed to the blots for several hours and the hybridization patterns are compared visually.

【０２０７】 ７ マイクロアレイ 化学的結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いることにより、基板の
表面上でアレイエレメントを合成することができる。（例えば、Baldeschweiler
, 前出 参照）。また、ドットブロット又はスロットブロット法に類似の所定の アレイを用いて、熱、UV、機械的もしくは化学的結合プロシージャ、又は減圧装
置を利用して、基板の表面にエレメントを配列及び結合させることができる。標
準的なアレイは手動で或いは市販の道具及び装置を用いて、任意の適切な数のエ
レメントを含むように製造できる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズ
していないプローブを除去し、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを
判定する。マイクロアレイ上のエレメントとハイブリダイズする各プローブの相
補性の度合及び相対的な存在量は、スキャナーで読取られた画像を解析すること
によって評価する。 7 The array elements can be synthesized on the surface of the substrate by using a microarray chemical coupling procedure and an inkjet device. (For example, Baldeschweiler
, Supra). Also, using predetermined arrays similar to dot blot or slot blot methods, the elements can be arranged and bonded to the surface of the substrate using thermal, UV, mechanical or chemical bonding procedures, or vacuum devices. it can. Standard arrays can be manufactured to contain any suitable number of elements, either manually or using commercially available tools and equipment. After hybridization, unhybridized probes are removed and the level and pattern of fluorescence are determined using a scanner. The degree of complementarity and relative abundance of each probe that hybridizes to an element on the microarray is assessed by analyzing the image read by the scanner.

【０２０８】 或いは、完全長cDNA、発現された配列タグ（EST）、又はそれらのフラグメン トは、マイクロアレイのエレメントを含む。ハイブリダイゼーションに適切なフ
ラグメントは、LASERGENE^TMのような当業者に周知のソフトウェアを用いて選択 可能である。本発明のヌクレオチド配列の1つに対応する、即ち本発明に関連す るcDNAライブラリーから無作為に選択された完全長cDNA、EST、若しくはそれら のフラグメントを、例えばスライドガラスのような適切な支持体に配列させる。
例えばUVクロスリンクの後の熱的および化学的処置に続いて乾燥を行なうことに
よって、cDNAはスライドガラスに固定される（例えば、Schena, M.ら (1995) Sc
ience 270:467-470; 並びにShalon, D.ら(1996) Genome Res. 6:639-645参照） 。蛍光プローブが準備され、支持体上のエレメントとのハイブリダイゼーション
に用いられる。支持体は前述の方法によって分析される。Alternatively, the full-length cDNA, expressed sequence tag (EST), or fragment thereof, comprises a microarray element. Suitable fragments for hybridization can be selected using software well known to those skilled in the art, such as LASERGENE ^™ . A full-length cDNA, EST, or fragment thereof corresponding to one of the nucleotide sequences of the invention, i.e., randomly selected from a cDNA library relevant to the invention, is placed in a suitable support such as a glass slide. Arrange in the body.
The cDNA is fixed to a glass slide, for example by performing drying following thermal and chemical treatment after UV cross-linking (eg, Schena, M. et al. (1995) Sc.
ience 270: 467-470; and Shalon, D. et al. (1996) Genome Res. 6: 639-645). A fluorescent probe is prepared and used for hybridization with the element on the support. The support is analyzed by the method described above.

【０２０９】 ポリペプチドを含むシグナル配列をコードする遺伝子に共通の保存されたタン
パク質モチーフを伴う配列を見出すために、種々のcDNAライブラリーからの多数
のクローンをスクリーニングすることによってマイクロアレイのためのプローブ
配列を選択できる。一実施例において、cDNAライブラリーから同定された配列は
、例えばBlock 2 Bioanalysis Program（Incyte, Palo Alto, CA）のような適切
な分析プログラムを用いて、保存されたタンパク質モチーフを伴うこれらの遺伝
子配列を同定するために分析される。このモチーフ分析プログラムは、Swiss-Pr
otデータベース及びPROSITEに含まれる配列情報に基づき遺伝子またはcDNA配列 から翻訳された特性を決定されていないタンパク質の機能を決定する方法の1つ である（例えば、Bairoch, A.ら(1997) Nucleic Acids Res. 25:217-221; 及びA
ttwood, T. K.ら(1997) J. Chem. Inf. Comput. Sci. 37:417-424）。PROSITEは
、極端な配列の相違のために保存されたモチーフを用いて検出不能な機能的もし
くは構造的ドメインを同定するのに用いることができる。その方法は荷重行列に
基づいている。次にこの方法で同定されたモチーフは、突合わせの偶然の分布の
目安を得るためにSWISS-PROTデータベースに対して較正される。Probe sequences for microarrays by screening a large number of clones from various cDNA libraries to find sequences with conserved protein motifs common to genes encoding signal sequences including polypeptides Can be selected. In one embodiment, the sequences identified from the cDNA library are converted to those gene sequences with conserved protein motifs using an appropriate analysis program such as, for example, the Block 2 Bioanalysis Program (Incyte, Palo Alto, CA). Is analyzed to identify This motif analysis program is based on Swiss-Pr
It is one of the methods to determine the function of a protein whose characteristic has not been determined from a gene or cDNA sequence based on the sequence information contained in the ot database and PROSITE (for example, Bairoch, A. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 217-221; and A
ttwood, TK et al. (1997) J. Chem. Inf. Comput. Sci. 37: 417-424). PROSITE can be used to identify undetectable functional or structural domains using motifs conserved due to extreme sequence differences. The method is based on a weight matrix. The motifs identified in this way are then calibrated against the SWISS-PROT database to give an indication of the random distribution of the matches.

【０２１０】 別の実施例においては、共有のモチーフ、特定のコンセンサス配列の発見にHi
dden Markovモデル（HMM）を用いてもよい（例えば、Pearson, W.R.及びD.J. Li
pman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.85:2444-2448; 並びにSmith, T.F.及びM.S
. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197参照）。最初HMMはスピーチ認識
パターンの調査のために発達したが、現在はモデルタンパク質構造だけでなくタ
ンパク質や核酸配列の分析のための生物学的なコンテキストに用いられている（
例えば、Krogh, A.ら(1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531; 並びにCollin, M. ら(1993) Protein Sci. 2:305-314参照）。HMMは形式的な確立的基礎を有し、ア
ミノ酸またはヌクレオチドに対して位置特異性スコアを用いる。そのアルゴリズ
ムは、モチーフ分析性能を向上させるために、新規に同定された配列から情報を
取込み続ける。In another example, the discovery of shared motifs, specific consensus sequences,
dden Markov model (HMM) may be used (eg, Pearson, WR and DJ Li
pman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-2448; and Smith, TF and MS
Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197). Initially HMMs were developed for the study of speech recognition patterns, but are now being used in biological contexts for the analysis of protein and nucleic acid sequences as well as model protein structures (
See, for example, Krogh, A. et al. (1994) J. Mol. Biol. 235: 1501-1531; and Collin, M. et al. (1993) Protein Sci. 2: 305-314). HMMs have a formal, established basis and use position specificity scores for amino acids or nucleotides. The algorithm continues to capture information from newly identified sequences to improve motif analysis performance.

【０２１１】 ８ 相補的ポリヌクレオチド HCRMをコードする配列に相補的な配列或いはその任意の一部を用いて、自然発
生HCRMの発現を検出して低下させ、即ち抑制する。約15〜約30塩基対を含むオリ
ゴヌクレオチドの使用について記載するが、より小さな、或いはより大きな配列
フラグメントの場合でも概ね同じ方法が用いられる。Oligo4.06ソフトウエア及びH CRMコーディング配列を用いて適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を抑 制するために、相補オリゴヌクレオチドを最も独特の5´配列から設計し、プロ モーターのコーディング配列への結合を防止するために用いる。翻訳を抑制する
ために、相補的なオリゴヌクレオチドを、リボソームのHCRMをコードする転写物
への結合を防ぐように設計する。 8 Complementary Polynucleotides A sequence complementary to the sequence encoding HCRM, or any portion thereof, is used to detect and reduce, ie, suppress, expression of naturally occurring HCRM. Although the use of oligonucleotides containing about 15 to about 30 base pairs is described, generally the same method is used for smaller or larger sequence fragments. Design appropriate oligonucleotides using Oligo 4.06 software and H CRM coding sequence. To repress transcription, complementary oligonucleotides are designed from the most unique 5 'sequence and used to prevent promoter binding to the coding sequence. To suppress translation, complementary oligonucleotides are designed to prevent ribosomes from binding to transcripts encoding HCRM.

【０２１２】 ９ HCRMの発現 HCRMの発現は、cDNAを適切なベクタにサブクローニングし、ベクターを宿主細
胞に形質転換することにより行われる。このベクターは、cDNAに操作可能に連結
する、例えばクローニング部位の上流のβガラクトシダーゼのような、適切なプ
ロモーターを含む（例えば、Sambrook,前出,pp.404-433；及びRosenberg,M.ら(1
983) Methods Enzymol.101:123-138参照）。 9 HCRM Expression HCRM is expressed by subcloning the cDNA into an appropriate vector and transforming the vector into a host cell. This vector contains a suitable promoter operably linked to the cDNA, for example, β-galactosidase upstream of the cloning site (see, eg, Sambrook, supra , pp. 404-433; and Rosenberg, M. et al. 1
983) Methods Enzymol. 101: 123-138).

【０２１３】 単離され、標準的な方法を用いてIPTG (isopropyil beta -D-thiogalactopyra
noside)と転換された菌種の誘発により、β-ガラクトシダーゼの最初の8残基、 リンカーの約5〜15残基及び完全長タンパク質からなる融合タンパク質を生成す る。このシグナル残基により細菌増殖培地へのHCRMの分泌が促され、この培地を
後述の活性のためのアッセイにおいて直接用いることができる。The isolated and purified IPTG (isopropyil beta -D-thiogalactopyra) using standard methods
Induction of the transformed strain produces a fusion protein consisting of the first 8 residues of β-galactosidase, about 5 to 15 residues of the linker and the full-length protein. This signal residue promotes secretion of HCRM into the bacterial growth medium, which can be used directly in assays for activity described below.

【０２１４】 １０ HCRM活性の実証 HCRM-1若しくは HCRM-2活性は、イオンコンダクタンスのための電気生理学的 アッセイを用いて実証される。HCRM-1若しくは HCRM-2は、これらをコードする 真核生物の発現ベクターでCOS7、HeLa又はCHOのような哺乳類の細胞株を形質転 換することによって発現可能である。真核生物の発現ベクターは商業的に入手可
能であり、またそれらを細胞に導入する技術は当業者に周知のものである。βガ
ラクトシダーゼのような多数の標識遺伝子の何れか1つを発現する少量の第2のプ
ラスミドは、外来性のDNAを受取り発現するこれらの細胞の迅速な同定を可能に するために細胞の中に同時形質転換される。形質転換の後に細胞株に適した条件
下で細胞を48〜72時間インキュベートし、HCRM-1若しくは HCRM-2及びβガラク トシダーゼの発現および蓄積を可能にする。 10 Demonstration of HCRM activity HCRM-1 or HCRM-2 activity is demonstrated using an electrophysiological assay for ion conductance. HCRM-1 or HCRM-2 can be expressed by transforming a mammalian cell line such as COS7, HeLa or CHO with a eukaryotic expression vector encoding them. Eukaryotic expression vectors are commercially available and techniques for introducing them into cells are well known to those skilled in the art. A small amount of a second plasmid expressing any one of a number of marker genes, such as β-galactosidase, can be incorporated into cells to allow rapid identification of those cells that receive and express exogenous DNA. Co-transformed. After transformation, the cells are incubated under conditions appropriate for the cell line for 48-72 hours to allow expression and accumulation of HCRM-1 or HCRM-2 and β-galactosidase.

【０２１５】 当業者に周知の条件下で適切な比色基質を培地に添加した場合、βガラクトシ
ダーゼを発現する形質転換された細胞は青色に染まる。着色した細胞は、当業者
に周知の電気生理学的技術によって種々のイオンによる膜コンダクタンスの違い
が検査される。形質転換されなかった細胞および／またはベクター配列のみ若し
くはβガラクトシダーゼ配列のみで形質転換された細胞が制御手段として用いら
れ、また同時に検査される。制御細胞に関して、HCRM-1を発現する細胞はより高
いカチオンコンダクタンスを有し、一方でHCRM-2を発現する細胞はより高いアニ
オンコンダクタンスを有する。カチオン及びアニオンコンダクタンスの各々に対
するHCRM-1若しくは HCRM-2の寄与は、HCRM-1若しくは HCRM-2の何れかに特異的
な抗体を用いて細胞をインキュベートすることによって確認できる。各々の抗体
は、HCRM-1若しくは HCRM-2の何れかの細胞外の側面に結合し、従ってイオンチ ャネル中の細孔、及び関連するコンダクタンスをブロックする。Transformed cells expressing β-galactosidase stain blue when the appropriate colorimetric substrate is added to the medium under conditions well known to those skilled in the art. Colored cells are examined for differences in membrane conductance by various ions by electrophysiological techniques well known to those skilled in the art. Cells which have not been transformed and / or which have been transformed only with the vector sequence or only with the β-galactosidase sequence are used as control means and are examined simultaneously. With respect to control cells, cells expressing HCRM-1 have higher cation conductance, while cells expressing HCRM-2 have higher anion conductance. The contribution of HCRM-1 or HCRM-2 to each of the cation and anion conductances can be confirmed by incubating the cells with an antibody specific for either HCRM-1 or HCRM-2. Each antibody binds to the extracellular aspect of either HCRM-1 or HCRM-2, thus blocking the pores in the ion channel, and the associated conductance.

【０２１６】 HCRM-3の核内移行活性は、Gorlich, D.ら （1994; Cell 79:767-778）の記載 のように評価分析される。移入基質は、SV40 T-抗原 NLSまたは代替のNLS（例え
ば、Gorlich及びMattaj (1996)において作表されたようなもの, 前出）を含むペ
プチドとBSAとの抱合と、その後のBSA-NLSのフルオレセン抱合によって調製され
る。HeLa細胞は、原形質膜を透過性にして核膜を無傷のままにするジギトニンに
よって透過化処理される。移入反応には、HCRM-3、HeLaサイトゾル（importin特
異性抗体での免疫沈降による予めのimportinの欠乏）、移入基質、及びGorlich ら（前出）の記載のような他の成分が含まれる。移入反応は、ジギトニン透過化
処理された細胞の添加によって開始され、室温で60分間進行させる。移入活性は
蛍光顕微鏡によって評価される。[0216] The nuclear import activity of HCRM-3 is assayed as described by Gorlich, D. et al. (1994; Cell 79: 767-778). The import substrate may be a peptide comprising the SV40 T-antigen NLS or an alternative NLS (eg, as tabulated in Gorlich and Mattaj (1996), supra ) conjugated to BSA, followed by BSA-NLS. Prepared by fluorescein conjugation. HeLa cells are permeabilized with digitonin, which permeabilizes the plasma membrane and leaves the nuclear membrane intact. The transfer reaction include other components such as described in HCRM-3, HeLa cytosolic (lack of advance of importin by immunoprecipitation with importin-specific antibody), transfer substrate, and Gorlich et al., Supra . The transfer reaction is initiated by the addition of digitonin permeabilized cells and proceeds at room temperature for 60 minutes. Transfer activity is assessed by fluorescence microscopy.

【０２１７】 １１ HCRM特異的抗体の産生 PAGE電気泳動法（例えば、Harrington,M.G.(1990)Methods Enzymol. 182:488-
495参照）、或いは他の精製技術を用いて実質的に精製されたHCRMを用いて、ウ サギを免疫化し、標準的なプロトコルを使用して抗体を生成する。アミノ酸配列
を、DNASTAR software （DNASTAR Inc）を用いて分析して、免疫原性の高い領域
を判定し、対応するオリゴポリペプチドを合成し、これを用いて当業者に知られ
た方法により抗体を作り出す。C-末端付近、或いは親水性領域内のエピトープの
ような適切なエピトープの選択方法の詳細については当業者の文献に記載されて
いる（例えば、Ausubelら 前出,ch.11参照）。 11 Production of HCRM-Specific Antibody PAGE electrophoresis (eg, Harrington, MG (1990) Methods Enzymol. 182: 488-
495), or using HCRM substantially purified using other purification techniques to immunize rabbits and generate antibodies using standard protocols. The amino acid sequence is analyzed using DNASTAR software (DNASTAR Inc) to determine the region with high immunogenicity, to synthesize the corresponding oligopolypeptide, and to use this to synthesize an antibody by a method known to those skilled in the art. produce. Near C- terminal, or for more information about a method of selecting appropriate epitopes, such as epitopes of the hydrophilic regions are described by those skilled in the literature (e.g., supra Ausubel et al., See ch.11).

【０２１８】 通常、オリゴペプチドは15の残基の長さであり、fmoc法の化学作用を利用するA
pplied Biosystems Peptide Synthesizer Model 431Aを用いて合成し、MBS（N-m
aleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）を用いた反応によりKLH(Sigma,
St.Louis, MO)に結合させて免疫抗原性を増強させる（例えば、Ausubelら 前出 参照）。ウサギは、完全なフロイントのアジュバントにおけるオリゴペプチド-
KLH複合体で免疫化する。その結果生じる抗血清は、例えば、プラスチックにペ プチドを結合させ、1%BSAでブロッキングし、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し 、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させることにより、抗 ペプチド活性に対して検査される。Typically, oligopeptides are 15 residues long and use the chemistry of the fmoc method to
Synthesized using pplied Biosystems Peptide Synthesizer Model 431A, MBS (Nm
aleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) by reaction with KLH (Sigma,
St.Louis, by binding to MO) enhance immunogenicity (see, e.g., supra Ausubel et al). Rabbits were treated with oligopeptides in complete Freund's adjuvant
Immunize with KLH complex. The resulting antiserum can be obtained, for example, by binding the peptide to plastic, blocking with 1% BSA, reacting with rabbit antiserum, washing, and reacting with radioactive iodine-labeled goat anti-rabbit IgG. Tested for anti-peptide activity.

【０２１９】 １２ 特異的抗体を用いる自然発生HCRMの精製 HCRMに対して特異な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィによ
り、自然発生或いは組換えHCRMを実質的に精製する。イムノアフィニティーカラ
ムは、HCRM抗体を、CnBr-activated Sepharose (Pharmacia＆Upjohn)のような活
性化されたクロマトグラフィー用樹脂に共有結合させることにより作製する。結
合の後、製造者の取扱説明書に従って樹脂をブロック及び洗浄する。 12 Purification of naturally occurring HCRM using specific antibodies Naturally occurring or recombinant HCRM is substantially purified by immunoaffinity chromatography using antibodies specific for HCRM. Immunoaffinity columns are made by covalently attaching an HCRM antibody to an activated chromatography resin such as CnBr-activated Sepharose (Pharmacia & Upjohn). After bonding, block and wash the resin according to the manufacturer's instructions.

【０２２０】 HCRMを含む培養液を免疫親和性カラムに通し、そのカラムをHCRMを優先的に吸
着させる条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度のバッファ
ー）で洗浄する。抗体／HCRM結合を***させる条件下（例えば、pH2〜3のバッフ
ァー、又は尿素もしくはチオシアン酸塩イオンのような高濃度のカオトロープ(c
haotrope)）でカラムを溶出させ、HCRMを回収する。The culture containing HCRM is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that preferentially adsorb HCRM (eg, a high ionic strength buffer in the presence of a detergent). Conditions that disrupt antibody / HCRM binding (e.g., buffers at pH 2-3, or high concentrations of chaotrope (c) such as urea or thiocyanate ions
elute the column with haotrope)) and collect HCRM.

【０２２１】 １３ HCRMと相互作用する分子の同定 ¹²⁵I Bolton-Hunter試薬を用いて、HCRM或いはその生物学的に活性な断片を標
識する（例えば、Boltonら(1973) Biochem.J.133:529参照）。マルチウエルプレ
ートのウエル内に予め配列した候補分子を、標識されたHCRMでインキュベートし
、洗浄し、標識されたHCRM複合体を有する任意のウエルを検定する。種々のHCRM
濃度で得られたデータを用いて、数、親和性及びHCRMと候補分子との会合につい
ての値を計算する。 13 Identification of Molecules That Interact with HCRM Label HCRM or a biologically active fragment thereof with ¹²⁵ I Bolton-Hunter reagent (eg, Bolton et al. (1973) Biochem. J. 133: 529). reference). Candidate molecules pre-sequenced in the wells of a multiwell plate are incubated with labeled HCRM, washed, and any wells with labeled HCRM complexes are assayed. Various HCRM
The data obtained at the concentrations are used to calculate values for the number, affinity and association of the HCRM with the candidate molecule.

【０２２２】 上記の刊行物および特許出願の全ては、ここで言及することにより本明細書の
一部とする。当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本明細書に
記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。本発明を
特定の好適実施例に関して説明してきたが、請求する発明がそのような特定の実
施例に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、記載した本
発明の実施のための方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の当業
者には明らかであり、請求の範囲内に含まれることを意図するものである。[0222] All of the above publications and patent applications are incorporated herein by reference. Those skilled in the art will be able to make various modifications of the methods and systems described herein without departing from the scope and spirit of the invention. Although the present invention has been described with respect to particular preferred embodiments, it should be understood that the invention as claimed should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention that are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are intended to be within the scope of the claims.

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 HCRM-1（1690887;SEQ ID NO:1）とラットのナトリウムチャネルβ2サブユニッ
ト（GI 1086497;SEQ ID NO:7）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である
。FIG. 1 shows an amino acid sequence alignment between HCRM-1 (1690887; SEQ ID NO: 1) and rat sodium channel β2 subunit (GI 1086497; SEQ ID NO: 7).

【図２】 HCRM-2（1998015;SEQ ID NO:3）とマウスのイオンチャネルホモログRIC（GI 1
872491;SEQ ID NO:8）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。FIG. 2. HCRM-2 (1998015; SEQ ID NO: 3) and mouse ion channel homolog RIC (GI 1
872491; SEQ ID NO: 8) shows the amino acid sequence alignment between

【図３Ａ】 HCRM-3（2252446;SEQ ID NO:5）とラットの核タンパク質p62相同体（GI 91324
6;SEQ ID NO:9）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。FIG. 3A. HCRM-3 (2252446; SEQ ID NO: 5) and rat nuclear protein p62 homolog (GI 91324).
FIG. 6 shows an amino acid sequence alignment between 6; SEQ ID NO: 9).

【図３Ｂ】 HCRM-3（2252446;SEQ ID NO:5）とラットの核タンパク質p62相同体（GI 91324
6;SEQ ID NO:9）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。FIG. 3B. HCRM-3 (2252446; SEQ ID NO: 5) and rat nuclear protein p62 homolog (GI 91324).
FIG. 6 shows an amino acid sequence alignment between 6; SEQ ID NO: 9).

【図４Ａ】 HCRM-1（1690887;SEQ ID NO:1）の疎水性プロットを示す図である。FIG. 4A shows a hydrophobicity plot of HCRM-1 (1690887; SEQ ID NO: 1).

【図４Ｂ】 ラットのナトリウムチャネルβ2サブユニット（GI 1086497;SEQ ID NO:7）の 疎水性プロットを示す図である。FIG. 4B shows a hydrophobicity plot of rat sodium channel β2 subunit (GI 1086497; SEQ ID NO: 7).

【図５Ａ】 HCRM-2（1998015;SEQ ID NO:3）の疎水性プロットを示す図である。FIG. 5A shows a hydrophobicity plot of HCRM-2 (1998015; SEQ ID NO: 3).

【図５Ｂ】 マウスのイオンチャネルホモログRIC（GI 1872491;SEQ ID NO:8）の疎水性プ ロットを示す図である。 アライメントの作成にはDNASTARTMソフトウエア（DNASTAR Inc, Madison WI）
のマルチシーケンスアライメントプログラムを使用した。疎水性プロットの場合
、Ｘ軸は正の方向にアミノ酸位置を表し、Ｙ軸は負の方向に疎水性レベル表す（
MacDNASIS PROソフトウエア）。FIG. 5B shows a hydrophobic plot of the mouse ion channel homolog RIC (GI 1872491; SEQ ID NO: 8). DNASTARTM software (DNASTAR Inc, Madison WI) for creating alignments
Was used. For a hydrophobicity plot, the X-axis represents amino acid positions in the positive direction and the Y-axis represents hydrophobicity levels in the negative direction (
MacDNASIS PRO software).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/16 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｈ０４５ 25/28 43/00 １１１ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 43/00 １１１ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 ラル、プリーティ アメリカ合衆国カリフォルニア州95054・ サンタクララ・ラスドライブ 2382 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 オウ−ヤング、ジャニス アメリカ合衆国カリフォルニア州94702・ バークレイ・カインズアベニュー 1419 (72)発明者 タング、ワイ・トム アメリカ合衆国カリフォルニア州95118・ サンノゼ・ランウィックコート 4230 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 Ｆターム(参考） 4B024 BA44 BA63 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 HA14 4B063 QA01 QQ42 QR32 QR55 QR62 QS34 4B064 AG01 AG27 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 4C084 AA17 BA02 BA08 BA17 BA18 BA20 BA22 BA23 CA18 DA01 MA02 NA14 ZA452 ZA752 ZA812 ZA962 ZB021 ZB051 ZB112 ZB212 ZB262 ZB272 ZC022 ZC411 4H045 AA10 BA10 BA41 CA40 DA50 EA28 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 25/16 A61P 35/00 4H045 25/28 43/00 111 35/00 C07K 14/705 43/00 111 16/18 C07K 14/705 C12N 1/15 16/18 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12Q 1/68 A 5/10 C12N 15/00 ZNAA C12P 21 / 02 A61K 37/02 C12Q 1/68 C12N 5/00 A (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU , MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, K) E, LS, M W, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Yue, Henry Sunnyvale Lewis Avenue 94087, California, United States of America 826 (72) Inventor Lal Pleity, California, United States 95054 Santa Clara Las Drive 2382 (72) Inventor Korey, Neil Sea, CA 94040, Mountain View # 30, Dale Avenue 1240 (72) Inventor Ou-Young, Janice 94702, Berkeley, California, USA Cains Avenue 1419 (72) Inventor Tongue, Wye Tom 95118, California, United States San Jose Runwick Court 4230 (72) Inventor Bogun, Mariah Earl, San Leandro Santiago Road, 94577, California, USA 14244 F-term (reference) 4B024 BA44 BA63 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 HA14 4B063 QA01 QQ42 QR32 QR55 QR62 QS34 4B064 AG01 AG27 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 4C084 AA02 BA18 Z17 ZA962 ZB021 ZB051 ZB112 ZB21 2 ZB262 ZB272 ZC022 ZC411 4H045 AA10 BA10 BA41 CA40 DA50 EA28 FA74

Claims (21)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1の
断片、SEQ ID NO:3の断片、及びSEQ ID NO:5の断片からなる一群より選択された
アミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチド。1. A group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, a fragment of SEQ ID NO: 1, a fragment of SEQ ID NO: 3, and a fragment of SEQ ID NO: 5. A substantially purified polypeptide comprising a more selected amino acid sequence. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列に対して少なくとも90%以上のア ミノ酸同一性を有する実質的に精製された変異体。2. A substantially purified variant having at least 90% amino acid identity to the amino acid sequence of claim 1. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製された
ポリヌクレオチド。3. An isolated and purified polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドに対して少なくとも90%以上 のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド
の変異配列。4. A mutated sequence of an isolated and purified polynucleotide having at least 90% or more polynucleotide sequence identity to the polynucleotide of claim 3. 【請求項５】 厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリ
ダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。5. An isolated and purified polynucleotide which hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide of claim 3. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有す
る単離され精製されたポリヌクレオチド。6. An isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide of claim 3. 【請求項７】 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:2の
断片、SEQ ID NO:4の断片、及びSEQ ID NO:6の断片からなる一群より選択された
ポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。7. A group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, a fragment of SEQ ID NO: 2, a fragment of SEQ ID NO: 4, and a fragment of SEQ ID NO: 6. An isolated and purified polynucleotide comprising a more selected polynucleotide sequence. 【請求項８】 請求項７のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90% 以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオ
チドの変異配列。8. A mutant sequence of an isolated and purified polynucleotide having at least 90% or more polynucleotide sequence identity to the polynucleotide sequence of claim 7. 【請求項９】 請求項７のポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有す
る単離され精製されたポリヌクレオチド。9. An isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide of claim 7. 【請求項１０】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発
現ベクター。10. An expression vector comprising at least a fragment of the polynucleotide of claim 3. 【請求項１１】 請求項１０の発現ベクターを含む宿主細胞。11. A host cell comprising the expression vector according to claim 10. 【請求項１２】 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1
の断片、SEQ ID NO:3の断片、及びSEQ ID NO:5の断片からなる一群より選択され
たアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項１１の宿主細胞を
培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
を特徴とする製造方法。(12) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 1
A polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: a fragment of SEQ ID NO: 3, a fragment of SEQ ID NO: 3, and a fragment of SEQ ID NO: 5; 12. A production method comprising: culturing the host cell according to claim 11 under conditions; and (b) recovering the polypeptide from a culture medium of the host cell. 【請求項１３】 適切な医薬用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む
医薬品組成物。13. A pharmaceutical composition comprising the polypeptide of claim 1 together with a suitable pharmaceutical carrier. 【請求項１４】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された
抗体。14. A purified antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 1. 【請求項１５】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。15. A purified agonist of the polypeptide of claim 1. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。16. A purified antagonist of the polypeptide of claim 1. 【請求項１７】 増殖性の疾患の治療方法または予防方法であって、その
ような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１６のアンタゴニストを投
与する過程を含む方法。17. A method of treating or preventing a proliferative disease, comprising administering to a patient in need of such treatment an effective amount of the antagonist of claim 16. 【請求項１８】 輸送障害の治療方法または予防方法であって、そのよう
な治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１５の医薬品組成物を投与する
過程を含む方法。18. A method of treating or preventing a transport disorder comprising administering to a patient in need of such treatment an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 15. 【請求項１９】 輸送障害の治療方法または予防方法であって、そのよう
な治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１６のアンタゴニストを投与す
る過程を含む方法。19. A method of treating or preventing a transport disorder comprising administering to a patient in need of such treatment an effective amount of the antagonist of claim 16. 【請求項２０】 所定の生物学的サンプルにおいて、SEQ ID NO:1、SEQ I
D NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1の断片、SEQ ID NO:3の断片、及びSEQ ID NO
:5の断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドの検出方法であって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドを前記生物学的サンプルの少なくとも1つ の核酸とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と
、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、該ハイブ
リダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルにおける前記ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有するような検出過程とを含
むことを特徴とする検出方法。20. In a given biological sample, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
D NO: 3, SEQ ID NO: 5, fragment of SEQ ID NO: 1, fragment of SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO
: 5. A method for detecting a polynucleotide encoding a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of the following fragments: (a) applying the polynucleotide of claim 6 to at least one nucleic acid of the biological sample; And (b) detecting the hybridization complex, wherein the presence of the hybridization complex encodes the polypeptide in the biological sample. A detection process having a correlation with the presence of the polynucleotide to be detected. 【請求項２１】 ハイブリダイゼーションの前に、前記生物学的サンプル
の核酸をポリメラーゼ連鎖反応法によって増幅することを特徴とする請求項２０
に記載の方法。21. The method according to claim 20, wherein the nucleic acid of the biological sample is amplified by polymerase chain reaction before the hybridization.
The method described in.