JP2002508168A - Human tumor necrosis factor R2-like protein - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト腫瘍壊死因子R2様タンパク質（TR2P）並びにTR2Pを同定及びコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト、及びアンタゴニストを提供する。更に、本発明はTR2Pの発現に関わる疾患の治療または予防の方法を提供する。   (57) [Summary] The present invention provides human tumor necrosis factor R2-like protein (TR2P) and polynucleotides that identify and encode TR2P. The present invention also provides expression vectors, host cells, antibodies, agonists, and antagonists. Furthermore, the present invention provides a method for treating or preventing a disease associated with TR2P expression.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 技術分野 本発明は、ヒト腫瘍壊死因子R2様タンパク質(human tumor necrosis factor-R
2-like proteins)の核酸配列およびアミノ酸配列、並びに骨形成、発生、生殖、
免疫、及び潰瘍性の疾患の診断・予防・治療におけるこれらの配列の利用法に係
るものである。[0001] TECHNICAL FIELD The present invention is a human tumor necrosis factor R2-like protein (human tumor necrosis factor-R
2-like proteins) nucleic acid and amino acid sequences, and bone formation, development, reproduction,
The present invention relates to the use of these sequences in the diagnosis, prevention and treatment of immunity and ulcer disease.

【０００２】 発明の背景 多くの真核生物の細胞膜には、構造的支持を担い、細胞および組織の同一性を
供し、更に自己分泌、パラ分泌および周囲環境における細胞に対する隣接細胞分
泌(juxtacrine)特性を有するタンパク質が含まれる（McGowan,S.E.(1992) FASEB
J. 6:2895-2904）。膜タンパク質（MP）の多様な生化学的特徴として、個別の 各分子に起因する多くの（しばしば重複する）役割が示されている（Grant, D.S
.及びKleiranan, H.K. (1997) EXS 79:317-333）。多数のMPが単離されてきたが
、大半のMPが、互いに或いは細胞膜の中に存在する他の分子とどのように相互作
用するかは依然として不確かなままである。多くのMPは、組織の成長、細胞増殖
、組織・細胞の分化、及び細胞死に関係している（Taipale, J.及び Keski-Oja,
J. (1997) FASEB J.011:51-59；Eleftheriou, C.S. ら (1991) Mutat. Res. 25
6:127-138）。[0002] Background Many eukaryotic cell membrane of the invention is responsible for structural support, subjecting the identity of the cells and tissues, further autocrine, neighboring cell secretion for cells in paracrine and the surrounding environment (juxtacrine) properties (McGowan, SE (1992) FASEB
J. 6: 2895-2904). The diverse biochemical features of membrane proteins (MPs) have shown many (often overlapping) roles due to each individual molecule (Grant, DS
And Kleiranan, HK (1997) EXS 79: 317-333). Although a number of MPs have been isolated, it remains unclear how most MPs interact with each other or with other molecules present in the cell membrane. Many MPs are involved in tissue growth, cell proliferation, tissue / cell differentiation, and cell death (Taipale, J. and Keski-Oja,
J. (1997) FASEB J.011: 51-59; Eleftheriou, CS et al. (1991) Mutat. Res. 25
6: 127-138).

【０００３】 例えば、胎生の骨形成のプロセスには、組織の成熟の過程において石灰化する
細胞外基質の生成が含まれる。個々の基質は、その寿命までの間に、（石灰化さ
れた骨を形成する）骨芽細胞および（骨を再吸収する）破骨細胞の総合作用によ
って絶えず再構築（リモデリング）される。先天的疾患、後成的疾患、または感
染症の結果として生じる生化学的な変化は、MPの成分バランスや生じる骨の構造
を混乱させる原因となることがある（Francomano,C.A.ら(1996)Curr.Opin.Genet
. Dev. 6:301-308）。[0003] For example, the process of embryonic bone formation involves the production of extracellular matrix that becomes calcified during tissue maturation. The individual matrix is constantly remodeled (remodeled) during its lifetime by the combined action of osteoblasts (forming calcified bone) and osteoclasts (resorbing bone). Biochemical changes resulting from congenital, epigenetic, or infectious diseases can cause disruptions in the balance of MP components and the resulting bone structure (Francomano, CA et al. (1996) Curr. .Opin.Genet
Dev. 6: 301-308).

【０００４】 また、MPは炎症反応の重要な媒介物や制御因子として作用する。血管外遊出の
際に、白血球は配位子−受容体結合による炎症性媒介物およびサイトカインの生
成のために初回抗原刺激を受ける（Pakianathan, D.R. (1995) J. Leukoc. Biol
. 57:699-702）。腫瘍壊死因子（TNF）は、免疫の調節および炎症反応を媒介す る多面性サイトカインである。TNFが誘因となる細胞の応答は、2つの異なる細胞
表面受容体（TNF-R1 (55kDa) 及び TNF-R2 (75kDa)）との相互作用によって開始
される（Tartaglia, L.A.及びGoeddel, D.V. (1992) Immunol. Today 13:151-15
3）。両TNF受容体は、より大きなTNF受容体（TNFR）スーパーファミリーの一部 であり、その構成要素にはFas抗原、CD27、CD30、及びCD40が含まれ、細胞外ド メインにおいてシステインリッチの偽性反復(cysteine-rich pseudorepeats)を 共有し、またTNFR/NGFRファミリーのシステインリッチ領域のサイン(signature)
を共有する（Smith, C.A.ら (1994) Cell 76:959-962）。TNFに関連するサイト カインは、受容体モノマーの凝集を引き起こすことによって、分化、増殖、NF-k
B活性化、及び細胞死を含む部分的に重複する細胞応答を発生させる（Smithら；
前出）。両方のTNF受容体タイプはほとんどの細胞のタイプで発現されるが、TNF
-R1は大部分のTNF活性の主因である（Tartaglia及びGoeddel；前出）。TNF-R2の
寄与は、TNF-R2が隣接するTNF-R1分子（後者はシグナルを伝達している）に対し
てTNFを提供する配位子通過モデル(ligand passing model)によって部分的に説 明可能である（Tartaglia及びGoeddel；前出）。直接のTNF-R2のシグナル伝達は
、主にリンパ球に作用する（例えば、T細胞ハイブリドーマによる顆粒球／マク ロファージコロニー刺激因子分泌の誘発およびCT6 T細胞株の増殖）（Tartaglia
, L.A. ら (1993) Cell 74:845-853）。更に、TNF-R2の場合の独立したシグナル
伝達の役割は、幾つかの特異的な株化細胞におけるTNF媒介(TNF-mediated)の細 胞毒性作用において実証されている（Vandenabeele, P.ら(1995) Trends Cell B
iol. 5:392-399）。 TNF-R1とTNF-R2の細胞質内ドメインは配列相同性を欠いており、そのことはそれ
らが異なる活性化シグナルを発生することを示唆している。Beyaert, R.ら（199
5; J. Biol.Chem. 270:23292-23299）は、TNF-Rキナーゼをカゼインキナーゼ1（
CK-1）として同定し、TNF誘発のアポトーシスに対するTNF-R2媒介のシグナル伝 達は、CK-1によるリン酸化によって負の調節を受けることを観察した。不適正な
TNFの発現は、敗血症性ショックや自己免疫異常のような疾患の発生と関連して いる（Beyaert,R.ら；前出）。オステオプロテゲリン(osteoprotegerin)は、最 近になって骨吸収を調節するTNF-R2ファミリーの一員として確認された。オステ
オプロテゲリンは、ラットにおいて破骨細胞への前駆細胞の分化を防ぎ、また卵
巣切除関連の骨損失を防ぐ（Simonet, W.S.ら(1997) Cell 89:309-319）。[0004] MPs also act as important mediators and regulators of the inflammatory response. Upon extravasation, leukocytes undergo priming for production of inflammatory mediators and cytokines by ligand-receptor binding (Pakianathan, DR (1995) J. Leukoc. Biol.
57: 699-702). Tumor necrosis factor (TNF) is a pleiotropic cytokine that mediates immune regulation and the inflammatory response. The TNF-triggered cellular response is initiated by interaction with two different cell surface receptors, TNF-R1 (55 kDa) and TNF-R2 (75 kDa) (Tartaglia, LA and Goeddel, DV (1992). ) Immunol. Today 13: 151-15
3). Both TNF receptors are part of the larger TNF receptor (TNFR) superfamily, whose components include the Fas antigen, CD27, CD30, and CD40, and cysteine-rich pseudogenes in the extracellular domain. Share repeats (cysteine-rich pseudorepeats) and signature of the cysteine-rich region of the TNFR / NGFR family
(Smith, CA et al. (1994) Cell 76: 959-962). Cytokines associated with TNF cause differentiation, proliferation, NF-k
Generates partially overlapping cellular responses, including B activation and cell death (Smith et al .;
Supra). Both TNF receptor types are expressed on most cell types, but TNF
-R1 is the major cause of most TNF activity (Tartaglia and Goeddel; supra). The contribution of TNF-R2 is partially explained by a ligand passing model in which TNF-R2 provides TNF to neighboring TNF-R1 molecules (the latter transmitting signals). It is possible (Tartaglia and Goeddel; supra). Direct TNF-R2 signaling primarily affects lymphocytes (eg, induction of granulocyte / macrophage colony stimulating factor secretion by T cell hybridomas and expansion of CT6 T cell line) (Tartaglia
, LA et al. (1993) Cell 74: 845-853). Furthermore, the role of independent signaling in the case of TNF-R2 has been demonstrated in TNF-mediated cytotoxic effects in several specific cell lines (Vandenabeele, P. et al. 1995) Trends Cell B
iol. 5: 392-399). The cytoplasmic domains of TNF-R1 and TNF-R2 lack sequence homology, suggesting that they generate different activation signals. Beyaert, R. et al. (199
5; J. Biol. Chem. 270: 23292-23299) converts TNF-R kinase to casein kinase 1 (
CK-1), and observed that TNF-R2-mediated signaling of TNF-induced apoptosis was negatively regulated by phosphorylation by CK-1. Improper
TNF expression has been linked to the development of diseases such as septic shock and autoimmune disorders (Beyaert, R. et al., Supra). Osteoprotegerin (osteoprotegerin) was recently identified as a member of the TNF-R2 family that regulates bone resorption. Osteoprotegerin prevents progenitor cell differentiation into osteoclasts and prevents ovariectomy-related bone loss in rats (Simonet, WS et al. (1997) Cell 89: 309-319).

【０００５】 ヒト腫瘍壊死因子R2様タンパク質およびこれらのヒト腫瘍壊死因子R2様タンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドの開示は、骨形成、発生、生殖、免疫、及び
潰瘍性の疾患の診断・予防・治療に役立つ新たな組成物を提供して従来技術にお
ける要求を満たすものである。[0005] The disclosure of human tumor necrosis factor R2-like proteins and polynucleotides encoding these human tumor necrosis factor R2-like proteins is useful for the diagnosis, prevention and treatment of bone formation, development, reproduction, immunity, and ulcerative diseases. It provides a useful new composition to meet the needs in the prior art.

【０００６】 発明の概要 本発明は、実質的に精製されたポリペプチド、ヒト腫瘍壊死因子R2様タンパク
質（まとめて「TR2P」、個別には「TR2P-1」及び「TR2P-2」と称する）を特徴とするも
のである。一態様において、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1 の断片、およびSEQ ID NO:3の断片からなる一群より選択されたアミノ酸を含む 実質的に精製されたポリペプチド、TR2Pを提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a substantially purified polypeptide, a human tumor necrosis factor R2-like protein (collectively referred to as "TR2P", individually "TR2P-1" and "TR2P-2"). It is characterized by the following. In one embodiment, the present invention provides a substantially purified amino acid comprising an amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, a fragment of SEQ ID NO: 1, and a fragment of SEQ ID NO: 3. And TR2P.

【０００７】 また、本発明は、SEQ ID NO:1若しくはSEQ ID NO:3、又はこれらの配列の断片
のアミノ酸配列に対して少なくとも90%以上のアミノ酸同一性を有する実質的に 精製されたTR2Pの変異体を提供する。更に、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO
:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片からなる一群より選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離および精製されたポリヌクレ
オチド配列を提供する。更に、本発明には、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID
NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片からなる一群より選択されたアミノ酸配
列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90
%以上のポリヌクレオチド同一性を有する単離および精製されたポリヌクレオチ ド配列の変異配列が含まれる。[0007] The present invention also provides a substantially purified TR2P having at least 90% or more amino acid identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a fragment of these sequences. To provide variants. Further, the present invention provides a method of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
: 3, an isolated and purified polynucleotide sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of a fragment of SEQ ID NO: 1, and a fragment of SEQ ID NO: 3. Further, in the present invention, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 3
At least 90 to the polynucleotide sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of a fragment of NO: 1 and a fragment of SEQ ID NO: 3.
Mutant sequences of isolated and purified polynucleotide sequences having greater than or equal to% polynucleotide identity are included.

【０００８】 更に、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ
ID NO:3の断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。更に、本発明は、SE
Q ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片からな
る一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドに対して相補的な単離および精製されたポリヌクレオチド配列だけでなく
、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片か
らなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド配列と厳密な条件の下でハイブリダイズする単離および精製されたポ
リヌクレオチド配列を提供する。[0008] Further, the present invention relates to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, fragments of SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 1.
A composition comprising a polynucleotide sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of the fragments of ID NO: 3. Further, the present invention relates to SE
Complementary to a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of Q ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, a fragment of SEQ ID NO: 1, and a fragment of SEQ ID NO: 3 Selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, fragments of SEQ ID NO: 1, and fragments of SEQ ID NO: 3, as well as highly isolated and purified polynucleotide sequences. Provided are isolated and purified polynucleotide sequences that hybridize under stringent conditions to a polynucleotide sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence.

【０００９】 また、本発明は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2の断片、およびSEQ
ID NO:4の断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離お
よび精製されたポリヌクレオチド配列を提供する。更に、本発明は、SEQ ID NO:
2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2の断片、およびSEQ ID NO:4の断片からなる一群か
ら選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に対して相補的
な単離および精製されたポリヌクレオチド配列だけでなく、SEQ ID NO:2、SEQ I
D NO:4、SEQ ID NO:2の断片、およびSEQ ID NO:4の断片からなる一群から選択さ
れたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90% 以上のポリヌクレオチド同一性を有する単離および精製されたポリヌクレオチド
配列の変異配列を提供する。The present invention also relates to SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, fragments of SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 2.
Provided is an isolated and purified polynucleotide sequence comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of the fragments of ID NO: 4. Further, the present invention provides a method of SEQ ID NO:
2, isolated and purified complementary to a polynucleotide sequence comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, a fragment of SEQ ID NO: 2, and a fragment of SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 2, SEQ I
Has at least 90% polynucleotide identity to a polynucleotide sequence comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of D NO: 4, a fragment of SEQ ID NO: 2, and a fragment of SEQ ID NO: 4 Mutant sequences of the isolated and purified polynucleotide sequences are provided.

【００１０】 更に、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ
ID NO:3の断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含む発現ベクターを提供す
る。別の態様では、その発現ベクターは宿主細胞に包含される。[0010] Further, the present invention relates to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, fragments of SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 1.
An expression vector comprising at least a fragment of a polynucleotide sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments of ID NO: 3. In another aspect, the expression vector is contained in a host cell.

【００１１】 また、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ
ID NO:3の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法を提供し、その方
法には、（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で、TR2Pをコードするポ
リヌクレオチド配列の少なくとも断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養
する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する過程とが含
まれる。[0011] The present invention also relates to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, fragments of SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 1.
Provided is a method for producing a polypeptide comprising the amino acid sequence of a fragment of ID NO: 3, comprising: (a) at least a fragment of a polynucleotide sequence encoding TR2P under conditions suitable for expression of said polypeptide. And the step of (b) recovering the polypeptide from the culture medium of the host cell.

【００１２】 また、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ
ID NO:3の断片のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたTR2Pを適切な製薬用
担体と共に含む医薬品成分を提供する。[0012] The present invention also relates to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, fragments of SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 1.
Provided is a pharmaceutical composition comprising substantially purified TR2P having the amino acid sequence of the fragment of ID NO: 3 together with a suitable pharmaceutical carrier.

【００１３】 更に、本発明には、前記ポリペプチドに対する精製されたアゴニストおよび精
製されたアンタゴニストだけでなく、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1 の断片、およびSEQ ID NO:3の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合す る精製された抗体が含まれる。Further, the present invention includes purified agonists and purified antagonists to the polypeptides as well as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, fragments of SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 1. A purified antibody that binds to a polypeptide comprising the amino acid sequence of the NO: 3 fragment is included.

【００１４】 また、本発明は、所定の骨形成疾患の治療又は予防の方法を提供し、その方法
には、そのような治療が必要な被験者に対して実質的に精製されたTR2Pを含む医
薬品組成物を有効な量投与する過程が含まれる。The invention also provides a method of treating or preventing a given osteogenic disorder, the method comprising a medicament comprising TR2P substantially purified for a subject in need of such treatment. Administering an effective amount of the composition.

【００１５】 また、本発明は、所定の発生障害の治療又は予防の方法を提供し、その方法に
は、そのような治療が必要な被験者に対して実質的に精製されたTR2Pを含む医薬
品組成物を有効な量投与する過程が含まれる。The present invention also provides a method of treating or preventing a given developmental disorder, the method comprising a pharmaceutical composition comprising TR2P substantially purified for a subject in need of such treatment. Administering an effective amount of the substance.

【００１６】 また、本発明は、所定の生殖疾患の治療又は予防の方法を提供し、その方法に
は、そのような治療が必要な被験者に対して実質的に精製されたTR2Pを含む医薬
品組成物を有効な量投与する過程が含まれる。The invention also provides a method of treating or preventing a given reproductive disorder, the method comprising a pharmaceutical composition comprising TR2P substantially purified for a subject in need of such treatment. Administering an effective amount of the substance.

【００１７】 また、本発明は、所定の免疫疾患の治療又は予防の方法を提供し、その方法に
は、そのような治療が必要な被験者に対してTR2Pのアンタゴニストを有効な量投
与する過程が含まれる。The present invention also provides a method for treating or preventing a given immune disease, which comprises administering to a subject in need of such treatment an effective amount of a TR2P antagonist. included.

【００１８】 また、本発明は、所定の腫瘍性疾患の治療又は予防の方法を提供し、その方法
には、そのような治療が必要な被験者に対してTR2Pのアンタゴニストを有効な量
投与する過程が含まれる。The present invention also provides a method of treating or preventing a given neoplastic disease, the method comprising administering to a subject in need of such treatment an effective amount of a TR2P antagonist. Is included.

【００１９】 更に、本発明は、所定の免疫応答の治療又は予防の方法を提供し、その方法に
は、そのような治療が必要な被験者に対してTR2Pのアンタゴニストを有効な量投
与する過程が含まれる。Further, the present invention provides a method of treating or preventing a given immune response, comprising administering to a subject in need of such treatment an effective amount of a TR2P antagonist. included.

【００２０】 また、本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおけるTR2Pをコードするポリ
ヌクレオチドの検出方法を提供し、その検出方法には、（ａ）SEQ ID NO:1、SEQ
ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片を含むポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列の相補配列と生物学的サンプルの核酸の少なく
とも一部をハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過
程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が、生物学的サンプルに
おけるTR2Pをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有する、前記ハイブ
リダイゼーション複合体を検出する過程とが含まれる。一態様では、ハイブリダ
イゼーション過程の前に、ポリメラーゼ連鎖反応法により生物学的サンプルの核
酸を増幅する。The present invention also provides a method for detecting a polynucleotide encoding TR2P in a biological sample containing a nucleic acid, the method comprising: (a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
Hybridizing at least a portion of the nucleic acid of the biological sample with the complement of the polynucleotide sequence encoding ID NO: 3, the fragment of SEQ ID NO: 1, and the polypeptide comprising the fragment of SEQ ID NO: 3. Forming a hybridization complex, and (b) detecting the hybridization complex, wherein the presence of the hybridization complex is correlated with the presence of a polynucleotide encoding TR2P in a biological sample. Process. In one embodiment, the nucleic acid of the biological sample is amplified by the polymerase chain reaction prior to the hybridization process.

【００２１】 発明を実施するための形態 本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、
ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試薬に限定
されるものではなく、その実施形態は変更可能であることを理解されたい。また
、ここで使用した専門用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いたもので
あり、特許請求の範囲のみで限定される本発明の範囲を限定することを意図した
ものではないことも理解されたい。[0021] Proteins form the present invention for carrying out the invention, nucleic acid sequences, and before describing how the present invention,
It is to be understood that it is not limited to the particular methodology, protocols, cell lines, vectors, and reagents disclosed herein, but that embodiments thereof may vary. Also, the technical terms used herein are used only for the purpose of describing specific examples, and are not intended to limit the scope of the present invention, which is limited only by the appended claims. Please also understand.

【００２２】 請求の範囲を含む本明細書において、単数形の「或る」及び「その（この）」
の表記は、文脈からそうでないことが明らかである場合以外は、複数の意味も含
むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」の表記には、複数のそ
のような宿主細胞が含まれ、この「抗体」の表記は、１またはそれ以上の抗体及
び当業者に周知のその等価物なども表している。In this specification, including the claims, the singular forms “a” and “the”
Note that the notation also has multiple meanings unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, reference to "a host cell" includes a plurality of such host cells, and reference to "an antibody" includes reference to one or more antibodies and their equivalents well known to those of skill in the art. Represents.

【００２３】 特別に定義されていない限り、本明細書における全ての専門用語及び特定の用
語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に一般に理解され
るものと同じ意味を有する。ここで説明したものと類似あるいは等価な方法や材
料を本発明の実施や試験において使用可能であるが、本明細書においては好適な
方法、装置、材料を説明する。本発明で言及した全ての文献は、文献で報告され
た本発明に関して用いられ得る株化細胞、ベクター、及び方法論を説明・開示す
るために引用したものである。本明細書のあらゆる開示内容は、本発明が従来発
明によるそのような開示に先行し得ないことを認めるものと解釈してはならない
。Unless defined otherwise, all technical and specific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods or materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods, devices, and materials are described herein. All references mentioned in the present invention are cited to illustrate and disclose cell lines, vectors, and methodologies that can be used in connection with the present invention as reported in the literature. Nothing herein is to be construed as an admission that the present invention cannot precede such disclosure by the prior invention.

【００２４】 定義 ここで用いる「TR2P」は、任意の種、詳細にはウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウ
マ、及び好ましくをヒトを含む特定の哺乳類の種から得られたものであって、天
然、合成、半合成か、或いは組換え体を起源として得られた実質的に精製された
TR2Pのアミノ酸配列を指す。 Definitions As used herein, "TR2P" is derived from any species, particularly bovine, ovine, porcine, murine, equine, and, preferably, specific mammalian species, including humans, Substantially purified, synthetic, semi-synthetic or obtained from recombinant sources
Refers to the amino acid sequence of TR2P.

【００２５】 ここで用いる用語「アゴニスト」は、TR2Pと結合した場合にTR2Pの効果を高めた
り、その効果の持続時間を延ばす分子を指す。アゴニストには、TR2Pに結合して
その作用を調節するタンパク質、核酸、糖質、または任意の他の分子が含まれ得
る。The term “agonist,” as used herein, refers to a molecule that, when bound to TR2P, enhances the effect of TR2P or extends the duration of that effect. Agonists may include proteins, nucleic acids, carbohydrates, or any other molecules that bind to and modulate the action of TR2P.

【００２６】 ここで用いる「アレル」または「アレルの配列」は、TR2Pをコードする遺伝子の対
立形である。アレルは、核酸配列における少なくともひとつの突然変異に起因し
、変異したmRNA或いはポリペプチドが生ずるが、それらの構造又は機能は変化す
る場合と変化しない場合がある。与えられた任意の自然の遺伝子または組換え型
の遺伝子には、アレル形がないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するも
のがある。一般にアレルが生じる通常の変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付
加、または置換に因るものである。これらのタイプの変化の各々は、単独または
他の変化と組み合わされて、所定の配列において１またはそれ以上の回数で生じ
得る。As used herein, “allele” or “allele sequence” is an allelic form of a gene encoding TR2P. An allele results from at least one mutation in a nucleic acid sequence that results in a mutated mRNA or polypeptide, but their structure or function may or may not change. For any given natural or recombinant gene, there may be none, one, or many alleles. Common mutations that generally result in an allele are due to natural deletions, additions, or substitutions of nucleotides. Each of these types of changes, alone or in combination with other changes, can occur one or more times in a given sequence.

【００２７】 ここで用いるTR2Pをコードする「変異した（altered）」核酸配列には、結果と して同一のTR2PまたはTR2Pの機能的特徴の少なくとも1つをともなうポリペプチ ドをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿入、
または置換をともなうそれらの配列が含まれる。この定義には、TR2Pをコードす
るポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可
能な、或いは検出困難な多型と、またTR2Pをコードするポリヌクレオチド配列の
正常の染色体の位置とは別の所定の位置を有する、アレルに対する不適切な或い
は予期しないハイブリダイゼーションとが含まれる。コード化されたタンパク質
もまた「変異した」ものであり得て、サイレント変化（silent change）を生ずる アミノ酸残基の置換、欠失、または挿入を含み、結果的に機能的に等価TR2Pとな
るものである。意図的なアミノ酸置換は、TR2Pの生物学的または免疫学的活性が
保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および
／または両親媒性の性質についての類似性に基づき行なわれ得る。例えば、負に
荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に荷電し
たアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ、同様な親水性値を有する非電
荷の極性頭基(polar head groups)を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイ シン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレ
オニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。As used herein, an “altered” nucleic acid sequence encoding TR2P results in a polynucleotide encoding a polypeptide with the same TR2P or at least one of the functional features of TR2P. Various nucleotide deletions, insertions,
Or those sequences with substitutions. This definition includes polymorphisms that are readily detectable or difficult to detect using specific oligonucleotide probes of a polynucleotide encoding TR2P, and the normal chromosomal location of a polynucleotide sequence encoding TR2P. Improper or unexpected hybridization to an allele having another predetermined location is included. The encoded protein can also be "mutated", including substitutions, deletions, or insertions of amino acid residues that produce a silent change, resulting in a functionally equivalent TR2P. It is. Intentional amino acid substitutions may be similar to the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphipathic nature of the residues, as long as the biological or immunological activity of TR2P is retained. It can be done based on gender. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids include lysine and arginine, forming uncharged polar head groups with similar hydrophilicity values. Amino acids possessed include leucine, isoleucine, valine, glycine, alanine, asparagine, glutamine, serine, threonine, phenylalanine, and tyrosine.

【００２８】 ここで用いる「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチ ド、ポリペプチド、又はタンパク質の配列、またはそれらの何れかの断片であり
、自然発生又は合成の分子を指す。TR2Pの断片は、好ましくは約5〜約15個のア ミノ酸の長さを有し、TR2Pの生物的活性又は免疫学的活性を保持しているもので
ある。この文脈において、「断片」、「免疫原性の断片」、または「抗原性の断片」は
、好ましくは約5〜15のアミノ酸の長さであってTR2Pの生物学的活性または免疫 学的活性を保持するTR2Pの断片を指す。ここで「アミノ酸配列」は、自然発生タ
ンパク質分子のアミノ酸配列を指すものとして挙げているが、「アミノ酸配列」
や類似の用語は、列挙されたタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ
酸配列にアミノ酸配列を限定する意味で用いられるわけではない。As used herein, “amino acid” or “amino acid sequence” is the sequence of an oligopeptide, peptide, polypeptide, or protein, or any fragment thereof, and refers to a naturally occurring or synthetic molecule. The fragment of TR2P preferably has a length of about 5 to about 15 amino acids and retains the biological or immunological activity of TR2P. In this context, a "fragment", "immunogenic fragment", or "antigenic fragment" is preferably about 5-15 amino acids in length and has a biological or immunological activity of TR2P. Refers to a fragment of TR2P that carries The term "amino acid sequence" used herein refers to the amino acid sequence of a naturally-occurring protein molecule.
And similar terms are not used to limit the amino acid sequence to the complete, intact amino acid sequence associated with the recited protein molecule.

【００２９】 ここで用いる「増幅」は、核酸配列の追加の複製物を生成することであり、通
常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて実施される（Die
ffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer. a Laboratory Manual,p
p.1-5, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY参照）。[0029] As used herein, "amplification" refers to the production of additional copies of a nucleic acid sequence, usually performed using the polymerase chain reaction (PCR) technique well known to those skilled in the art (Die
ffenbach, CW and GS Dveksler (1995) PCR Primer.a Laboratory Manual , p
p.1-5, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY).

【００３０】 ここで用いる用語「アンタゴニスト」は、TR2Pに結合した場合にTR2Pの生物学
的又は免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、効果の持続時間を短縮する分
子を指す。アンタゴニストには、タンパク質、核酸、糖質、或いはTR2Pの作用を
低下させる任意の他の分子が含まれ得る。As used herein, the term “antagonist” refers to a molecule that, when bound to TR2P, reduces the extent of the effect or shortens the duration of the biological or immunological activity of TR2P. Antagonists may include proteins, nucleic acids, carbohydrates, or any other molecule that reduces the action of TR2P.

【００３１】 ここで用いる用語「抗体」は、完全な分子、並びに抗原決定基と結合し得るFa
、F(ab')₂、及びFvフラグメントのようなそれらの断片も指す。TR2Pポリペプチド
に結合する抗体は、無処置のポリペプチドを用いて、或いは免疫化する抗原とし
て関与する小型のペプチドを含むその断片を用いて調製することができる。動物
（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫化するのに用いるポリペプチ
ドまたはオリゴペプチドは、RNAの翻訳または化学的に合成されたものから得ら れ、必要ならば担体タンパク質と結合可能である。ペプチドと化学的に結合する
通常用いられる担体には、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホー
ルリンペットヘモシアニン（KLH）が含まれる。次に、この結合したペプチドを 用いて動物を免疫化する。As used herein, the term “antibody” refers to an intact molecule as well as a Fa that can bind an antigenic determinant.
, F (ab ') ₂ , and fragments thereof, such as Fv fragments. Antibodies that bind TR2P polypeptides can be prepared using intact polypeptides or using fragments containing small peptides that participate as antigens to immunize. The polypeptide or oligopeptide used to immunize an animal (eg, a mouse, rat, or rabbit) can be obtained from RNA translation or chemically synthesized and, if necessary, capable of binding to a carrier protein. is there. Commonly used carriers that bind chemically to the peptide include bovine serum albumin and thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin (KLH). Next, an animal is immunized with the conjugated peptide.

【００３２】 ここで用いる用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の断片（即ち
、エピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質の断片を用いてホストの動
物を免疫化する場合、このタンパク質の多くの領域が、抗原決定基（タンパク質
の所定の領域または三次元構造）と特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。
抗原決定基は抗体への結合について元の抗原（即ち、免疫応答を誘発するために
用いられる免疫原）と競合し得る。As used herein, the term “antigenic determinant” refers to a fragment of a molecule (ie, an epitope) that makes contact with a particular antibody. When a host animal is immunized with a protein or protein fragment, many regions of the protein trigger the production of antibodies that specifically bind to antigenic determinants (predetermined regions of the protein or three-dimensional structure). I can do it.
Antigenic determinants can compete with the original antigen (ie, the immunogen used to elicit the immune response) for binding to the antibody.

【００３３】 ここで用いる用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列と相補的な核酸配列を
含む任意の成分を指す。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に対して相補
的な核酸鎖に関して用いられる。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の
方法で作り出すことができる。この相補的ヌクレオチドは、一度細胞内に導入さ
れると、細胞によって作られた天然の配列と結合して2重鎖を形成し、転写や翻 訳を妨げる。「マイナス（−）」なる表現がアンチセンス鎖を指し、「プラス（
＋）」なる表現がセンス鎖を指すことがある。As used herein, the term “antisense” refers to any component that contains a nucleic acid sequence that is complementary to a specific nucleic acid sequence. The term "antisense strand" is used in reference to a nucleic acid strand that is complementary to the "sense" strand. Antisense molecules can be created by any method, including synthesis and transcription. Once introduced into a cell, this complementary nucleotide combines with the native sequence created by the cell to form a duplex, preventing transcription and translation. The expression "minus (-)" indicates the antisense strand, and "plus (-)
+) "May refer to the sense strand.

【００３４】 ここで用いる用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能、調節
機能、又は生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」
は、天然の、組換え体の、又は合成のTR2P、若しくはその任意のオリゴペプチド
の能力を指し、適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体
に結合する。As used herein, the term “biologically active” refers to a protein that has a structural, regulatory, or biochemical function of a naturally occurring molecule. Similarly "immunologically active"
Refers to the ability of natural, recombinant or synthetic TR2P, or any of its oligopeptides, to elicit a specific immune response in appropriate animals or cells and to bind to specific antibodies.

【００３５】 ここで用いる用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩類(permissive
salt)及び温度条件の下での塩基対によるポリヌクレオチド同士の自然な結合で ある。例えば、配列「A-G-T」は相補的配列「T-C-A」に結合する。2つの1本鎖分
子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合しているような「部分的」なものも、
或いは1本鎖分子間に完全な相補性が存在するような「完全」なものもある。核酸 鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの効率及び強さ
に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖同士の結合によって左右される増幅
反応や、ペプチド核酸（PNA）分子の設計及び使用において特に重要である。As used herein, the term “complementary” or “complementarity” refers to permissive salts.
It is the natural binding of polynucleotides by base pairing under salt and temperature conditions. For example, the sequence “AGT” binds to the complementary sequence “TCA”. The complementarity between two single-stranded molecules may be `` partial, '' such that only some nucleic acids are bound,
Alternatively, some are “perfect” such that there is complete complementarity between the single-stranded molecules. The degree of complementarity between nucleic acid strands greatly affects the efficiency and strength of hybridization between nucleic acid strands. This is particularly important in amplification reactions that depend on the binding of nucleic acid strands and in the design and use of peptide nucleic acid (PNA) molecules.

【００３６】 ここで用いる「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のア ミノ酸配列を含む組成物」とは、概して所定のポリヌクレオチド配列またはアミ ノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥した製剤、水溶液、
または無菌の組成物が含まれ得る。TR2PまたはTR2Pの断片をコードするポリヌク
レオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして利用でき
る。このプローブは凍結乾燥した形態で保存することができ、糖質のような安定
化剤と結合させることができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプロー
ブは、塩（例えば、NaCl）、界面活性剤（例えば、SDS）及び他の物質（例えば 、デンハート液、乾燥ミルク、サケ***DNA等）を含む水溶液に分散させること ができる。[0036] As used herein, "composition comprising a given polynucleotide sequence" or "composition comprising a given amino acid sequence" generally refers to any composition containing a given polynucleotide or amino acid sequence. Point to. The composition includes a dry formulation, an aqueous solution,
Or a sterile composition may be included. A composition comprising a polynucleotide sequence encoding TR2P or a fragment of TR2P can be used as a hybridization probe. The probe can be stored in lyophilized form and can be conjugated to a stabilizing agent such as a carbohydrate. In hybridization, the probe can be dispersed in an aqueous solution containing a salt (eg, NaCl), a surfactant (eg, SDS) and other substances (eg, Denhardt's solution, dried milk, salmon sperm DNA, etc.). .

【００３７】 ここで用いる用語「コンセンサス配列」は、再度配列決定して不要な塩基が分
離された核酸配列か、XL-PCR^TM(Perkin Elmer, Norwalk, CT)を用いて5’方向及
び／又は3’方向に伸長して再度配列決定した核酸配列か、或いはフラグメント の組み合わせのためのコンピュータプログラム（例えば、GELVIEW^TM Fragment A
ssembly system, GCG, Madison WI）を用いて2種以上のインサイト社クローンの
重複した配列から組み合わせて作られた核酸配列である。いくつかの配列が伸長
され、かつ組み合わされてコンセンサス配列が作られる。As used herein, the term “consensus sequence” refers to a nucleic acid sequence in which unnecessary bases have been separated by resequencing, or using a XL-PCR ^™ (Perkin Elmer, Norwalk, CT) in the 5 ′ direction and / or A nucleic acid sequence that has been extended and resequenced in the 3 ′ direction, or a computer program (eg, GELVIEW ^™ Fragment A)
ssembly system, GCG, Madison Wis.) is a nucleic acid sequence created by combining duplicate sequences of two or more Incyte clones. Some sequences are extended and combined to form a consensus sequence.

【００３８】 ここで用いる用語「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、ノーザ
ン解析によるTR2Pをコードする核酸配列と同一か又は関連する核酸の存在の検出
が、サンプル内のTR2Pをコードする核酸の存在を示しており、従ってTR2Pをコー
ドするポリヌクレオチドからの転写産物の発現と相関性を有している、というこ
とを表している。As used herein, the term “correlated with the expression of a polynucleotide” means that detection of the presence of a nucleic acid that is the same as or related to a nucleic acid sequence encoding TR2P by Northern analysis encodes TR2P in the sample. It indicates the presence of the nucleic acid and thus correlates with the expression of a transcript from the polynucleotide encoding TR2P.

【００３９】 ここで用いる「欠失」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化
であり、結果的に１個またはそれ以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基が欠
けることである。As used herein, a “deletion” is a change in the nucleotide or amino acid sequence, resulting in the deletion of one or more nucleotide or amino acid residues.

【００４０】 ここで用いる用語「誘導体」は、TR2P、TR2Pをコードするポリヌクレオチド配
列、またはTR2Pをコードするポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド
配列を化学修飾したものを指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば
、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換が含まれる。ポリヌク
レオチド誘導体は、自然発生の分子の生物学的又は免疫学的機能を保持している
ポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、グリコシル化、ポリエチレ
ングリコール化(pegylation)、または元のポリペプチドの生物学的又は免疫学的
機能を保持する別の任意のプロセスで修飾されたものである。As used herein, the term “derivative” refers to a chemically modified version of TR2P, a polynucleotide sequence encoding TR2P, or a polynucleotide sequence complementary to a polynucleotide sequence encoding TR2P. Chemical modifications of a polynucleotide sequence include, for example, replacement of hydrogen with an alkyl, acyl, or amino group. A polynucleotide derivative encodes a polypeptide that retains the biological or immunological functions of the naturally occurring molecule. Derivative polypeptides have been modified by glycosylation, polyethylene glycolation (pegylation), or any other process that retains the biological or immunological function of the original polypeptide.

【００４１】 ここで用いる用語「相同性」は、或る程度の相補性を意味する。部分的な相同
性と、完全な相同性の場合がある。用語「相同性」の代わりに「同一性」を用いるこ
とができる。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分
的に阻害する部分的に相補的な配列は、「実質的に相同な」ことを指す。完全に
相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、緩やかな厳密性
のもとで、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザン法またはノーザン法、溶液
ハイブリダイゼーション等）を用いて検定可能である。実質的に相同な配列また
はハイブリダイゼーションプローブは、緩やかな厳密性の下で完全に相同な配列
との結合について標的の配列と競合し、それを阻害する。このことは、緩やかな
厳密性の条件が、非特異的な結合を許容するようなものであるということを意味
するわけではなく、緩やかな厳密性の条件では2つの配列の相互の結合が特異的 （即ち選択的）相互作用であることが必要である。非特異的結合が存在しないこ
とを、部分的な程度の相補性（即ち約30%未満の同一性）さえも有していない第2
の標的配列を用いることにより検査することができる。非特異的結合が存在しな
い場合、概ね相同な配列またはプローブは第2の非相補的な標的配列とハイブリ ダイズしない。The term “homology” as used herein refers to a degree of complementarity. There may be partial homology or complete homology. "Identity" can be used in place of the term "homology". A partially complementary sequence that at least partially inhibits an identical sequence from hybridizing to a target nucleic acid refers to "substantially homologous." Inhibition of hybridization between the perfectly complementary sequence and the target sequence can be assayed under mild stringency using a hybridization assay (Southern or Northern method, solution hybridization, etc.). A substantially homologous sequence or hybridization probe competes with and inhibits the target sequence for binding to a completely homologous sequence under mild stringency. This does not mean that loose stringency conditions are such that they allow non-specific binding; under loose stringency conditions, the binding of two sequences to each other is specific. It is necessary to be a specific (ie, selective) interaction. The absence of non-specific binding indicates that the second lacks even a partial degree of complementarity (ie, less than about 30% identity).
Can be tested by using the target sequence of In the absence of non-specific binding, the substantially homologous sequence or probe will not hybridize to a second non-complementary target sequence.

【００４２】 「ヒト人工染色体」（HACs）は6kb〜10MbのサイズのDNA配列を含んでおり、安定
した有糸***染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小染色体
である(Harrington, J.J.ら (1997) Nat Genet. 15:345-355)。“Human artificial chromosomes” (HACs) are linear small chromosomes that contain a DNA sequence between 6 kb and 10 Mb in size and contain all the elements necessary for the separation and maintenance of stable mitotic chromosomes. (Harrington, JJ et al. (1997) Nat Genet. 15: 345-355).

【００４３】 ここで用いる用語「ヒト化抗体」は、抗体が本来の結合能力をそのまま保持し
ながらヒト抗体により近づくように、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列配列
を置換した抗体分子を指す。As used herein, the term “humanized antibody” refers to an antibody molecule in which the amino acid sequence in the non-antibody binding region has been replaced such that the antibody is closer to a human antibody while retaining its original binding ability.

【００４４】 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対合を介し
て相補鎖と結合する任意の過程を指す。As used herein, the term “hybridization” refers to any process by which a nucleic acid strand binds to a complementary strand through base pairing.

【００４５】 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基の間の
水素結合形成の効力によって、2つの核酸配列で形成された複合体を指す。ハイ ブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成されるか（例えば、C₀t又はR₀t解析
）、或いは核酸は溶液中に存在する一方の核酸と固体支持体（例えば、紙、メン
ブラン、フィルタ、ピン、またはスライドガラス、ポリマー、または細胞やその
核酸が固定される他の適切な基板）に固定されたもう一方の核酸との間で形成さ
れ得る。As used herein, the term “hybridization complex” refers to a complex formed between two nucleic acid sequences by virtue of the formation of hydrogen bonds between complementary bases. Hybridization complexes are formed in solution (eg, C ₀ t or R ₀ t analysis), or nucleic acids are combined with one nucleic acid present in solution with a solid support (eg, paper, membrane, filter, A pin, or another glass substrate, a glass slide, a polymer, or another suitable substrate to which the cells or their nucleic acids are fixed.

【００４６】 ここで用いる「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子にみられる配列に対
して、1個または2個以上のヌクレオチド、アミノ酸残基が各々加わるような、ヌ
クレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。As used herein, “insertion” or “addition” refers to a nucleotide sequence or amino acid sequence in which one or more nucleotides or amino acid residues are added to a sequence found in a naturally occurring molecule, respectively. Refers to the change.

【００４７】 「マイクロアレイ」とは、例えば紙、ナイロン、又は他のタイプのメンブラン
、フィルタ、チップ、スライドガラス、又は他の任意の適切な固体支持体のよう
な基板上に配列された個々のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを配列し
たものを指す。A “microarray” refers to an individual poly array arranged on a substrate such as, for example, paper, nylon, or other types of membranes, filters, chips, glass slides, or any other suitable solid support. Refers to an arrangement of nucleotides or oligonucleotides.

【００４８】 ここで用いる用語「調節(modulate)」は、TR2Pの活性の変化を指す。例えば、
調節によって、タンパク質活性の向上や低下、結合特性の変化、又はTR2Pの生物
学的、機能的、免疫学的特性等の他の変化がもたらされる。As used herein, the term “modulate” refers to a change in the activity of TR2P. For example,
Modulation results in increased or decreased protein activity, altered binding characteristics, or other changes in the biological, functional, or immunological properties of TR2P.

【００４９】 ここで用いる「核酸」または「核酸配列」は、1本鎖または2本鎖の、センス鎖又
はアンチセンス鎖である、ゲノム起源又は合成起源のDNA、RNAや、ヌクレオチド
、オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその任意の断片や、ペプチ
ド核酸（PNA）や、任意のDNA様もしくはRNA様材料を指す。「フラグメント（断 片）」は、長さが60ヌクレオチド以上の核酸配列であり、最も好ましくは、長さ
が100ヌクレオチド以上、又は1000ヌクレオチド以上、更には10,000ヌクレオチ ド以上の断片を指す。As used herein, “nucleic acid” or “nucleic acid sequence” refers to single-stranded or double-stranded, sense or antisense strands of genomic or synthetic DNA, RNA, nucleotides, oligonucleotides, Or, a polynucleotide and any fragment thereof, peptide nucleic acid (PNA), and any DNA-like or RNA-like material. A "fragment" is a nucleic acid sequence that is 60 nucleotides or more in length, most preferably a fragment that is 100 nucleotides or more, or 1000 nucleotides or more, and even 10,000 nucleotides or more.

【００５０】 ここで用いる「オリゴヌクレオチド」は、PCR増幅又はハイブリダイゼーショ ンアッセイ、またはマイクロアレイで用いることができる核酸配列であって、長
さが少なくとも約6ヌクレオチドから約60ヌクレオチド程度のもので、好適には1
5〜30ヌクレオチド、より好適には20〜25ヌクレオチドであるものを指す。ここ で用いる「オリゴヌクレオチド」は、当技術分野において一般に定義されている用
語「アンプライマー」、「プライマー」、「オリゴマー」、及び「プローブ」と
概ね同義である。As used herein, “oligonucleotide” is a nucleic acid sequence that can be used in a PCR amplification or hybridization assay, or a microarray, and has a length of at least about 6 nucleotides to about 60 nucleotides. Is 1
5 to 30 nucleotides, more preferably 20 to 25 nucleotides. As used herein, "oligonucleotide" is generally synonymous with the terms "amplimer", "primer", "oligomer", and "probe" as commonly defined in the art.

【００５１】 ここで用いる「ペプチド核酸」（PNA）は、リジンを末端とするアミノ酸残基 のペプチドバックボーンに結合した5ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレオ チドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤(anti-gene agent)を指す。末端の リジンがその組成に溶解性を賦与している。PNAは相補的な1本鎖DNAやRNAに優先
的に結合して転写物の伸長を止め、またPNAをポリエチレングリコール化して細 胞におけるPNAの寿命を延ばすことが可能である。（Nielsen, P.E.ら(1993) Ant
icancer Drug Des. 8:53-63）。As used herein, “peptide nucleic acid” (PNA) is an antisense molecule or an antigenic agent (antigen) containing an oligonucleotide having a length of 5 nucleotides or more bound to a peptide backbone of amino acid residues having a lysine terminal. -gene agent). Terminal lysine confers solubility to its composition. PNAs can preferentially bind to complementary single-stranded DNA or RNA and stop transcript elongation, and can also PNA-polyethylene glycol extend the life of PNAs in cells. (Nielsen, PE et al. (1993) Ant
icancer Drug Des. 8: 53-63).

【００５２】 ここで用いる用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。TR2Pをコ
ードする核酸、若しくはその断片、またTR2P自体を含む疑いのある生物学的サン
プルは、体液や、細胞から分離された染色体、細胞小器官、又は細胞膜からの抽
出物や、細胞や、（溶液中の、或いは固体支持体に結合した）ゲノムのDNA、RNA
、またはcDNAや、組織や、組織プリントその他を含み得る。As used herein, the term “sample” is used in its broadest sense. Nucleic acids encoding TR2P, or fragments thereof, or biological samples suspected of containing TR2P itself, can be obtained from body fluids, extracts from chromosomes, organelles, or cell membranes isolated from cells, cells, ( Genomic DNA, RNA in solution or bound to a solid support)
Or cDNA, tissue, tissue prints, and the like.

【００５３】 ここで用いる用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、抗体ならび
にタンパク質もしくはペプチド、抗体及びアンタゴニストの相互作用を指す。こ
の相互作用は、結合する分子が認識するタンパク質の特定の構造（即ち、抗原決
定基、つまりエピトープ）の存在に左右されることを意味している。例えば、抗
体がエピトープ「A」に対して特異的である場合、標識された遊離した「A」及び
その抗体を含む反応において、エピトープA（つまり遊離し、標識されていないA
）を含むポリヌクレオチドが存在することにより、抗体に結合した標識されたA の量が低下する。As used herein, the term “specific binding” or “specifically binds” refers to antibodies and the interaction of proteins or peptides, antibodies and antagonists. This interaction means that it depends on the presence of a specific structure of the protein (ie, an antigenic determinant, or epitope) recognized by the binding molecule. For example, if the antibody is specific for epitope "A", then in a reaction involving labeled free "A" and the antibody, epitope A (i.e., free, unlabeled A)
) Reduces the amount of labeled A attached to the antibody.

【００５４】 ここで用いる用語「厳密な条件」は、ポリヌクレオチド配列と要求されたポリ
ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが可能な条件を指す。適切な厳密
な条件は、例えば、プレハイブリダイゼーションにおける塩類またはホルムアミ
ドの濃度、ハイブリダイゼーション溶液、ハイブリダイゼーション温度によって
定義することが可能であり、これらの条件は当技術分野で周知である。特に、塩
類の濃度を低下させることや、ホルムアミドの濃度を上昇させることや、ハイブ
リダイゼーション温度を上昇させることによって厳密性が増す。As used herein, the term “strict conditions” refers to conditions under which hybridization between a polynucleotide sequence and a required polynucleotide sequence is possible. Suitable stringent conditions can be defined, for example, by the concentration of salts or formamide in the prehybridization, the hybridization solution, the hybridization temperature, and these conditions are well known in the art. In particular, decreasing the salt concentration, increasing the formamide concentration, and increasing the hybridization temperature increase the stringency.

【００５５】 例えば、高い厳密性の条件の下でのハイブリダイゼーションは、約37℃〜42℃
の約50%のホルムアミド中において起こり得る。またハイブリダイゼーションは 、約30℃〜35℃の約35%〜25%のホルムアミド中の緩やかな厳密性の条件下で起こ
り得る。特に、ハイブリダイゼーションは、42℃の50%のホルムアミド中、5X SS
PE、0.3%SDS、および200μg/mlの切断され変性したサケの***DNA、という高い 厳密性の条件下で起こり得る。また、ハイブリダイゼーションは、温度を35℃に
低下させた35%のホルムアミド中において、前述のような緩やかな厳密性の条件 下で起こり得る。特定のレベルの厳密性に対応する温度範囲は、対象物の核酸の
ピリミジンに対するプリンの割合を算出して、温度を調節することによってさら
に狭めることができる。上述の温度範囲および条件の変更例は、当業者には周知
である。For example, hybridization under conditions of high stringency is about 37 ° C. to 42 ° C.
Can occur in about 50% of formamide. Hybridization can also occur under mild stringency in about 35% to 25% formamide at about 30 ° C to 35 ° C. In particular, hybridization was performed at 5X SS in 50% formamide at 42 ° C.
It can occur under the high stringency conditions of PE, 0.3% SDS, and 200 μg / ml of cut and denatured salmon semen DNA. Hybridization can also take place in 35% formamide at a reduced temperature of 35 ° C., under mild stringent conditions as described above. The temperature range corresponding to a particular level of stringency can be further narrowed by calculating the ratio of purines to pyrimidines of the subject nucleic acids and adjusting the temperature. Modifications of the above temperature ranges and conditions are well known to those skilled in the art.

【００５６】 ここで用いる用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれた核酸配列
又はアミノ酸配列であって、天然にはそれが結合して存在する他の構成成分から
単離又は分離されて、その構成要素が60%以上、好ましくは75%以上、最も好まし
くは90%以上除去された核酸配列又はアミノ酸配列である。As used herein, the term “substantially purified” refers to a nucleic acid or amino acid sequence that has been removed from its natural environment and that is isolated or separated from other components with which it is naturally associated. A nucleic acid sequence or an amino acid sequence whose components have been removed by 60% or more, preferably 75% or more, and most preferably 90% or more.

【００５７】 ここで用いる「置換」は、それぞれ1個または2個以上のヌクレオチド或いはア
ミノ酸を、別のヌクレオチド或いはアミノ酸に各々置換することを指す。“Substitution,” as used herein, refers to the replacement of one or more nucleotides or amino acids, respectively, with another nucleotide or amino acid.

【００５８】 ここで用いる「形質転換」の定義は、外来性のDNAが入り込みレシピエント細 胞を変化させるプロセスを意味する。形質転換は、当業者に周知の種々の方法を
用いた天然または人工の条件の下で起こり、また外来性の核酸配列を原核細胞ま
たは真核細胞の宿主細胞に導入するための任意の既知の方法に基づき得る。形質
転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択され、以下に限定
はされないが、ウイルス感染、熱ショック、電気穿孔法（エレクトロポレーショ
ン）、リポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法が含まれる。このような「
形質転換された」細胞には、挿入されたDNAを自律的に複製するプラスミドとし て、または宿主の染色体の一部として複製が可能な安定的に形質転換された細胞
が含まれ、またそれは限られた時間で導入されたDNAやRNAを一過性に発現する細
胞を指す。As used herein, the definition of “transformation” refers to a process by which exogenous DNA enters and changes a recipient cell. Transformation can occur under natural or artificial conditions using a variety of methods well known to those of skill in the art, and any known method for introducing foreign nucleic acid sequences into prokaryotic or eukaryotic host cells. May be based on the method. Transformation methods are selected according to the type of host cell to be transformed and include, but are not limited to, viral infection, heat shock, electroporation, lipofection, and methods using microprojectile bombardment. It is. like this"
`` Transformed '' cells include, but are not limited to, stably transformed cells capable of replicating the inserted DNA autonomously or as part of the host chromosome. A cell that transiently expresses DNA or RNA introduced at a given time.

【００５９】 ここで用いるTR2Pの「変異体」は、1又は2以上のアミノ酸が変異したアミノ酸
配列である。この変異体は「保存的」変化を含むものであり得、この場合、例え
ばロイシンをイソロイシンで置き換えるように、置換されるアミノ酸が類似な構
造的及び化学的特性を有する。稀にではあるが、例えばグリシンがトリプトファ
ンで置換されるように、変異体が「非保存的」に変化する場合もある。類似した
小さい変化には、アミノ酸の欠失または挿入、或いはその両方が含まれる。例え
ばDNASTARソフトウエアのような周知のコンピュータプログラムを用いて、何れ のアミノ酸残基が生物学的或いは免疫学的活性を損なわずに置換、挿入、又は除
去可能であるということを決定するガイダンスを提供することができる。As used herein, a “mutant” of TR2P is an amino acid sequence in which one or more amino acids are mutated. The variants may contain "conservative" changes, wherein the substituted amino acid has similar structural and chemical properties, for example, replacing leucine with isoleucine. In rare cases, a variant may be changed "non-conservatively", for example, glycine is replaced by tryptophan. Similar small changes include amino acid deletions or insertions, or both. Provides guidance to determine which amino acid residues can be substituted, inserted, or removed without compromising biological or immunological activity using well-known computer programs, such as DNASTAR software can do.

【００６０】 発明 本発明は、ヒト腫瘍壊死因子R2様タンパク質（TR2P）、TR2Pをコードするポリ
ヌクレオチド、並びに骨形成、発生、生殖、免疫、及び潰瘍性の疾患の診断、予
防、又は治療のためのこれらの物質の使用法の発見に基づくものである。- 0060] INVENTION The present invention, human tumor necrosis factor-R2-like protein (TR2P), polynucleotides encoding TR2P, and bone formation, development, reproduction, immunity, and diagnosis of ulcerative disease, prevention, or treatment for Of the use of these materials.

【００６１】 本発明のTR2P-1をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントのためのコン
ピュータ検索を用い、脾臓cDNAライブラリー(SPLNNOT04)からのインサイト社ク ローン1533650に於いて初めて同定された。コンセンサス配列、SEQ ID NO:2は、
次に挙げる重複且つ／又は伸長された核酸配列、インサイト社クローン1533650 及び1559031(SPLNNOT04)、3219886 (COLNNON03) 、1339238 (COLNTUT03) 、1542
861 (PROSTUT04) 、3257322 (OVARTUN01)並びに2613221(SINIUCT01)から導出さ れた。The nucleic acid encoding TR2P-1 of the present invention was first identified in Incyte clone 1533650 from a spleen cDNA library (SPLNNOT04) using computer searches for amino acid sequence alignment. The consensus sequence, SEQ ID NO: 2,
The following duplicated and / or extended nucleic acid sequences, Insights clones 1533650 and 1559031 (SPLNNOT04), 3219886 (COLNNON03), 1339238 (COLNTUT03), 1542
Derived from 861 (PROSTUT04), 3257322 (OVARTUN01) and 2613221 (SINIUCT01).

【００６２】 一実施例において、本発明はSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むポリペプチド を包含する。TR2P-1は、245のアミノ酸の長さであり、またN-173の潜在的Nグル コシル化部位と、残基S-66の潜在的プロテインキナーゼA又はGリン酸化部位と、
残基S₁₆₃及びS₁₈₇の2つの潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位と、残基S₂₀₂ 及びS₂₂₅の2つの潜在的プロテインキナーゼCリン酸化部位と、残基Y₃₆の1つの潜
在的チロシンキナーゼリン酸化部位と、残基C₇₇及びC₁₁₃の間の1つのTNFR/NGFR ファミリーのシステインリッチ(cysteine-rich)領域のサインと、残基C₁₂₆及びC ₁₃₂ 並びにC₁₆₈及びC₁₇₄の間の2つのホスホリパーゼA₂活性部位サインとを有す る。図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃに示すように、TR2P-1は、ヒトオステオプロテ
グリン（GI 2072185, SEQ ID NO:5）及びヒトTNF-R2（GI 1469541, SEQ ID NO:6
）と化学的および構造的相同性を有する。詳細にはTR2P-1は、ヒトオステオプロ
テグリンと31%、ヒトTNF-R2と27%の同一性を有する。また、TR2P-1とヒトオステ
オプロテグリンは、1つの潜在的Nグルコシル化部位と、1つの潜在的プロテイン キナーゼCリン酸化部位と、1つのTNFR/NGFRファミリーのシステインリッチ領域 のサインと、2つのホスホリパーゼA₂活性部位のサインとを共有する。更に、TR2
P-1とヒトTNF-R2は、1つの潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位と、1つの潜 在的プロテインキナーゼCリン酸化部位と、1つのTNFR/NGFRファミリーのシステ インリッチ領域のサインと、1つのホスホリパーゼA₂活性部位のサインとを共有 し、また同様な等電点6.6及び5.9をそれぞれ有する。ノーザン分析は、種々のラ
イブラリーにおけるこの配列の発現を示し、これらのライブラリーの少なくとも
58%が不死化したもの、即ち癌性であり、少なくとも41%が免疫応答に関係するも
のである。特に注目すべきは、胃腸、生殖、造血、心血管、結合、及び胎性組織
にけるTR2P-1の発現である。In one embodiment, the invention encompasses a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. TR2P-1 is 245 amino acids long and has a potential N-glycosylation site at N-173, a potential protein kinase A or G phosphorylation site at residue S-66,
Residue S₁₆₃And S₁₈₇Two potential casein kinase II phosphorylation sites of₂₀₂ And S₂₂₅Two potential protein kinase C phosphorylation sites and a residue Y₃₆One of the subs
Local tyrosine kinase phosphorylation site and residue C₇₇And C₁₁₃Between the cysteine-rich region of one TNFR / NGFR family₁₂₆And C ₁₃₂ And C₁₆₈And C₁₇₄Two phospholipases A between_TwoWith the active site signature. As shown in FIGS. 3A, 3B and 3C, TR2P-1 is a human osteoprotein.
Gulin (GI 2072185, SEQ ID NO: 5) and human TNF-R2 (GI 1469541, SEQ ID NO: 6)
) And chemical and structural homology. Specifically, TR2P-1 is human osteopro
It has 31% identity with tegulin and 27% identity with human TNF-R2. In addition, TR2P-1
Oprotegrin has one potential N-glucosylation site, one potential protein kinase C phosphorylation site, one TNFR / NGFR family cysteine-rich region signature, and two phospholipase A_TwoShare with active site signature. In addition, TR2
P-1 and human TNF-R2 have one potential casein kinase II phosphorylation site, one potential protein kinase C phosphorylation site, and one TNFR / NGFR family cysteine-rich region signature, One phospholipase A_TwoIt shares the signature of the active site and has similar isoelectric points of 6.6 and 5.9, respectively. Northern analysis has been
Shows the expression of this sequence in the library and at least one of these libraries
58% are immortal, i.e. cancerous, and at least 41% are involved in the immune response.
It is. Of particular note are gastrointestinal, reproductive, hematopoietic, cardiovascular, connective, and fetal tissues.
Of TR2P-1 expression in E. coli.

【００６３】 本発明のTR2P-2をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントのためのコン
ピュータ検索を用い、腎臓cDNAライブラリー(KIDNTUT13)からのインサイト社ク ローン2581223に於いて初めて同定された。コンセンサス配列、SEQ ID NO:4は、
次に挙げる重複且つ／又は伸長された核酸配列、インサイト社クローン2581223(
KIDNTUT13)、260827 (HNT2RAT01) 、2482038 (SMCANOT01)、及び2623152(KERANO
T02)から導出された。 一実施例において、本発明はSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むポリペプチドを 包含する。TR2P-2は、393のアミノ酸の長さであり、また残基N₂₄、N₁₃₅、N₁₄₀、
N₁₆₁、N₁₇₂、及びN₃₂₂の6つの潜在的Nグルコシル化部位と、残基T₄₄及びS₂₅₇の2
つの潜在的プロテインキナーゼA又はGリン酸化部位と、残基T₁₀、T₄₄、T₅₈、S_{15 2} 、T₁₅₇、T₂₀₂、S₃₂₄、及びT₃₈₅の8つの潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位
と、残基T₁₀、S₁₄₄、S₁₆₄、S₂₅₂、S₂₅₆、T₂₅₉、S₃₂₄、T₃₅₀、及びT₃₈₉の9つの潜
在的プロテインキナーゼCリン酸化部位と、残基C₂₇及びC₃₃の間の1つのホスホリ
パーゼA₂活性部位のサインとを有する。図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃに示すよう
に、TR2P-2は、ヒトTNF-R2（切り詰められた配列、V₈₃〜S₄₆₁：GI 1469541, SEQ
ID NO:6）、及びヒトオステオプロテグリン（切り詰められた配列、L₉₀〜L₄₀₁ ：GI 2072185, SEQ ID NO:5）と化学的および構造的相同性を有する。詳細にはT
R2P-2は、ヒトTNF-R2と17%、ヒトオステオプロテグリンと18%の同一性を有する 。また、TR2P-2とヒトTNF-R2は、2つの潜在的プロテインキナーゼA又はGリン酸 化部位と、4つの潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位と、2つの潜在的プロテ
インキナーゼCリン酸化部位とを共有する。更に、TR2P-2とヒトオステオプロテ グリンは、2つの潜在的プロテインキナーゼCリン酸化部位と、1つのホスホリパ ーゼA₂活性部位のサインとを共有し、また同様な等電点8.8及び9.2をそれぞれ有
する。ノーザン分析は、種々のライブラリーにおけるこの配列の発現を示し、こ
れらのライブラリーの少なくとも93%が不死化したもの、即ち癌性であり、少な くとも29%が免疫応答に関係するものである。特に注目すべきは、皮膚、胃腸、 造血、生殖、神経、泌尿器、及び心血管組織にけるTR2P-2の発現である。A nucleic acid encoding TR2P-2 of the present invention was first identified in Incyte clone 2581223 from a kidney cDNA library (KIDNTUT13) using computer searches for amino acid sequence alignment. The consensus sequence, SEQ ID NO: 4,
The following duplicated and / or extended nucleic acid sequences, Insight Cyto 2581223 (
KIDNTUT13), 260827 (HNT2RAT01), 2482038 (SMCANOT01), and 2623152 (KERANO
T02). In one embodiment, the invention includes a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. TR2P-2 is 393 amino acids long and contains residues N ₂₄ , N ₁₃₅ , N ₁₄₀ ,
Six potential N-glucosylation sites at N ₁₆₁ , N ₁₇₂ , and N ₃₂₂ and two at residues T ₄₄ and S ₂₅₇
One of the potential protein kinase A or G phosphorylation sites, eight potential casein kinase II phosphorylation residues _{T 10, T 44, T 58} , S 15 2, T 157, T 202, S 324, and T ₃₈₅ And nine potential protein kinase C phosphorylation sites at residues T ₁₀ , S ₁₄₄ , S ₁₆₄ , S ₂₅₂ , S ₂₅₆ , T ₂₅₉ , S ₃₂₄ , T ₃₅₀ , and T ₃₈₉ , and residues C ₂₇ and and a sign of one of phospholipase a ₂ activity site between C _33. Figure 4A, as shown in FIGS. 4B and 4C,, TR2P-2 is human TNF-R2 (truncated _{sequences, V 83 ~S 461: GI 1469541} , SEQ
ID NO: 6), and human osteoprotegerin (truncated _{sequences, L 90 ~L 401: GI 2072185} , SEQ ID NO: 5) and having chemical and structural homology. T for details
R2P-2 has 17% identity with human TNF-R2 and 18% with human osteoprotegrin. TR2P-2 and human TNF-R2 also have two potential protein kinase A or G phosphorylation sites, four potential casein kinase II phosphorylation sites, and two potential protein kinase C phosphorylation sites. To share. Furthermore, TR2P-2 and human osteoprotegerin has two potential protein kinase C phosphorylation sites, share and one Hosuhoripa over peptidase A ₂ active site signature, also similar isoelectric points 8.8 and 9.2 Have each. Northern analysis shows the expression of this sequence in various libraries, at least 93% of these libraries are immortal, i.e. cancerous, and at least 29% are involved in the immune response . Of particular note is the expression of TR2P-2 in skin, gastrointestinal, hematopoietic, reproductive, nervous, urinary, and cardiovascular tissues.

【００６４】 また本発明はTR2Pの変異体を含む。TR2P変異体は、TR2P アミノ酸配列に対し て好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少
なくとも95%以上のアミノ酸配列の同一性を有し、またTR2Pの機能的もしくは構 造的特徴の少なくとも１つを含むアミノ酸配列である。The present invention also includes mutants of TR2P. A TR2P variant preferably has at least 80%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% or more amino acid sequence identity to the TR2P amino acid sequence, and has a TR2P functional or structural An amino acid sequence comprising at least one of the features.

【００６５】 また本発明は、TR2Pをコードするポリヌクレオチドを含む。図１Ａ、図１Ｂ、
及び図１Ｃに示すように、特定の実施例において、本発明はTR2PをコードするSE
Q ID NO:2の配列を含むポリヌクレオチドを包含する。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ 、及び図２Ｄに示すように、更なる実施例において、本発明はTR2Pをコードする
SEQ ID NO:4の配列を含むポリヌクレオチドを包含する。The present invention also includes a polynucleotide encoding TR2P. 1A, 1B,
In certain embodiments, as shown in FIG. 1C and in FIG.
Includes a polynucleotide comprising the sequence of Q ID NO: 2. In a further embodiment, the present invention encodes TR2P, as shown in FIGS. 2A, 2B, 2C, and 2D.
Includes a polynucleotide comprising the sequence of SEQ ID NO: 4.

【００６６】 また本発明は、TR2Pをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。特
に、ポリヌクレオチド配列のそのような変異配列は、TR2Pをコードするポリヌク
レオチド配列に対して、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも9
0%、最も好ましくは少なくとも95%以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有す る。本発明の特定の態様においては、SEQ ID NO:2に対して、好ましくは少なく とも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%以上の ポリヌクレオチド配列の同一性を有するSEQ ID NO:2の変異配列を包含する。更 に、本発明は、SEQ ID NO:4に対して、好ましくは少なくとも80%、より好ましく
は少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%以上のポリヌクレオチド配列の
同一性を有するSEQ ID NO:4のポリヌクレオチド変異配列を包含する。上述の何 れのポリヌクレオチド変異配列も、TR2Pの機能的または構造的特徴の少なくとも
１つを含むアミノ酸配列をコードすることが可能である。The present invention also includes a mutant sequence of the polynucleotide sequence encoding TR2P. In particular, such variant sequences of the polynucleotide sequence preferably have at least 80%, more preferably at least 9%, relative to the polynucleotide sequence encoding TR2P.
It has 0%, most preferably at least 95% or more polynucleotide sequence identity. In certain embodiments of the present invention, SEQ ID NO: 2 is preferably at least 80%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% or more polynucleotide sequence identity to SEQ ID NO: 2. NO: 2 mutant sequence is included. Further, the present invention provides a method for producing a polynucleotide comprising SEQ ID NO: 4 having preferably at least 80%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% or more polynucleotide sequence identity to SEQ ID NO: 4. The polynucleotide variant sequence of Any of the polynucleotide variants described above can encode an amino acid sequence that includes at least one of the functional or structural features of TR2P.

【００６７】 遺伝暗号の縮重の結果、既知のの遺伝子及び自然発生の遺伝子のポリヌクレオ
チド配列に対する最小の相同性を有する幾つかのものを含め、多数のTR2Pをコー
ドするポリヌクレオチド配列が作り出されることが、当業者には理解されるであ
ろう。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せの選択により作り出
され得るポリヌクレオチド配列の可能な全ての変異を考慮している。これらの組
合せは自然発生のTR2Pのヌクレオチド配列に対し適用されるような標準のトリプ
レット遺伝暗号に従い作り出されるものであり、また全てのそのような変異はこ
こに明確に開示されると考えられたい。As a result of the degeneracy of the genetic code, a large number of polynucleotide sequences encoding TR2P are created, including those with minimal homology to known and naturally occurring gene polynucleotide sequences. It will be understood by those skilled in the art. Thus, the present invention contemplates all possible variations in the polynucleotide sequence that can be created by selecting combinations based on possible codon choices. These combinations are to be generated according to the standard triplet genetic code as applied to the nucleotide sequence of naturally occurring TR2P, and all such variations are to be considered specifically disclosed herein.

【００６８】 TR2Pをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適切に選択された厳
密性の条件下に於いて、好ましくは自然発生のTR2Pのヌクレオチド配列に対しハ
イブリダイズ可能であり、それは実質的に異なるコドンの用法を有するTR2P又は
その誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すのに有利である。特定のコ
ドンが宿主により利用される頻度に従い、真核生物又は原核生物の宿主に於いて
ペプチドの発現が起こる割合を高めるようにコドンを選択することができる。コ
ードされるアミノ酸配列を変化させることなしにTR2P及びその誘導体をコードす
るヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の配列から作り出
された転写物よりも長い半減期のようなより望ましい特性を有するRNA転写物を 作り出すためである。The nucleotide sequence encoding TR2P and its mutated sequences are preferably capable of hybridizing, under appropriately selected stringency conditions, to the nucleotide sequence of naturally occurring TR2P, It is advantageous to create nucleotide sequences encoding TR2P or derivatives thereof with different codon usage. Depending on the frequency with which particular codons are utilized by the host, codons can be selected to increase the rate at which expression of the peptide occurs in eukaryotic or prokaryotic hosts. Another reason to substantially alter the nucleotide sequence encoding TR2P and its derivatives without altering the encoded amino acid sequence is that it has a longer half-life than transcripts generated from naturally occurring sequences. This is to create an RNA transcript with the desired properties.

【００６９】 また本発明は、TR2P及びその誘導体をコードするDNA配列、またはその断片を 専ら合成化学によって作り出すことを含む。作製の後に、合成配列を当業者によ
って周知の試薬を用いて任意の多数の利用可能な発現ベクター及び細胞系に挿入
することが可能である。更に、合成化学を利用してTR2Pをコードする配列又はそ
れらの任意のフラグメントに突然変異を導入しうる。The present invention also includes the production of a DNA sequence encoding TR2P and its derivatives, or fragments thereof, exclusively by synthetic chemistry. After construction, the synthetic sequences can be inserted into any of a number of available expression vectors and cell lines using reagents well known to those of skill in the art. In addition, synthetic chemistry may be used to introduce mutations into the sequence encoding TR2P or any fragment thereof.

【００７０】 また本発明は、Wahl, G.M.及びS.L. Berger（1987; Methods Enzymol. 152:39
9-407）及びKimmel, A.R.（1987; Methods Enzymol. 152:507-511）によって教 示された種々の厳密な条件の下で、請求されるヌクレオチド配列、特にSEQ ID N
O:2、若しくはSEQ ID NO:2の断片、並びにSEQ ID NO:4、若しくはSEQ ID NO:4の
断片に示されたものに対してハイブリダイズが可能なポリヌクレオチド配列を含
む。The present invention also relates to Wahl, GM and SL Berger (1987; Methods Enzymol. 152: 39).
9-407) and Kimmel, AR (1987; Methods Enzymol. 152: 507-511), and under various stringent conditions, the claimed nucleotide sequence, especially SEQ ID NO.
O: 2, or fragments of SEQ ID NO: 2, as well as polynucleotide sequences capable of hybridizing to those set forth in SEQ ID NO: 4, or fragments of SEQ ID NO: 4.

【００７１】 DNA塩基配列決定方法は周知のものであり、一般に先行技術に於いても利用さ れ、本発明の任意の実施例においても利用されうる。その方法は、DNAポリメラ ーゼＩのクレノウフラグメント、Sequenase ^ョ（US Biochemical Corp, Clevelan d, OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、耐熱性T7ポリメラーゼ（Amersham
, Chicago, IL）、或いはGibco/BRL（Gaithersburg, MD）によって市販されるEL
ONGASE増幅システムに於いて発見されたようなプルーフリーディングエキソヌク
レアーゼ及びポリメラーゼの組合せのような酵素を使用する。そのプロセスは、
Hamilton Micro Lab 2200（Hamilton, Reno, NV）、Peltier Thermal Cycler（P
TC200; MJ Research, Watertown, MA）及びABI Catalyst及び373及び377 DNA se
quencers（Perkin Elmer）のような装置によって自動化することが好ましい。DNA sequencing methods are well known and are generally used in the prior art, and may be used in any of the embodiments of the present invention. The method Klenow fragment of DNA polymerase peptidase I, Sequenase ^® (US Biochemical Corp, Clevelan d, OH), Taq polymerase (Perkin Elmer), thermostable T7 polymerase (Amersham
EL marketed by Gibco / BRL (Gaithersburg, MD)
Use enzymes such as a combination of proofreading exonuclease and polymerase as found in the ONGASE amplification system. The process is
Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), Peltier Thermal Cycler (P
TC200; MJ Research, Watertown, MA) and ABI Catalyst and 373 and 377 DNA se
Preferably, it is automated by a device such as quencers (Perkin Elmer).

【００７２】 TR2Pをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列を用いて先行技術に
於いて周知の種々の方法で伸長し、プロモータ及び調節エレメントのような上流
の配列を検出することができる。例えば、用いられる方法の１つである制限部位
PCR法は、一般的なプライマーを使用し、既知の位置に隣接する未知の配列を検 索する（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322）。特にゲノムDNA
は、リンカーシークエンスに対するプライマー及び既知の領域に対して特異的な
プライマーの存在下に於いてまず増幅される。次に増幅された配列は、同様なリ
ンカープライマー及び最初のものの内に含まれる別の特異的プライマのを用いて
、2ラウンドのPCRを受ける。各ラウンドのPCRの生成物は、適切なRNAポリメラー
ゼを用いて転写され、逆転写酵素を用い配列決定される。The nucleic acid sequence encoding TR2P can be extended using the partial nucleotide sequence in various ways well known in the art to detect upstream sequences such as promoters and regulatory elements. For example, the restriction site, one of the methods used
The PCR method uses common primers to search for unknown sequences flanking known positions (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2: 318-322). Especially genomic DNA
Is first amplified in the presence of a primer for the linker sequence and a primer specific for the known region. The amplified sequence is then subjected to two rounds of PCR using similar linker primers and another specific primer contained within the first. The products of each round of PCR are transcribed using an appropriate RNA polymerase and sequenced using reverse transcriptase.

【００７３】 また逆PCR法（inverse PCR）を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを
用いた配列の増幅、または伸長を行なうこともできる。（Triglia, T.ら（1988 ）Nucleic Acids Res 16:8186）。プライマーは、市販のOLIGO 4.06プライマー 分析ソフトウエア（National Biosciences Inc.,Plymouth MN）や他の適切なプ ログラムを用いて、長さが22〜30ヌクレオチドで、50%以上のGC含量を有し、約6
8〜72℃の温度で標的配列をアニーリングするように設計する。その方法により 、いくつかの制限酵素を用いて遺伝子の既知領域における適当な断片を作り出す
。そこで、この断片を分子内連結反応により環状にし、PCR用の鋳型として使用 する。In addition, the sequence can be amplified or extended using various primers based on a known region by using an inverse PCR method (inverse PCR). (Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res 16: 8186). The primers were 22-30 nucleotides in length and had a GC content of 50% or greater using commercially available OLIGO 4.06 primer analysis software (National Biosciences Inc., Plymouth MN) or other suitable programs. About 6
Designed to anneal the target sequence at a temperature of 8-72 ° C. The method uses several restriction enzymes to create appropriate fragments in known regions of the gene. Therefore, this fragment is circularized by intramolecular ligation and used as a template for PCR.

【００７４】 使用できる別の方法には捕獲PCR法(capture PCR)があり、この方法には、ヒト
及び酵母菌人工染色体DNA内の既知の配列に隣接するDNA断片のPCR増幅が含まれ る（Lagerstrom, M.ら（1991）PCR Methods Applic 1:111-119）。またこの方法
では、PCRの前に、複数の制限酵素による消化及びライゲーションを用いて、DNA
分子の未知の断片に操作された2本鎖配列を配置することもできる。未知の配列 を引き出すために用いることができる別の方法として、Parker, J.D.らの方法（
1991; Nucleic Acids Res. 19:3055-3060）がある。更に、PCR、入れ子状態のプ
ライマー、PromoterFinder^TMライブラリーを用いて、ゲノムDNA歩行を行うこと ができる（Clontech, Palo Alto CA）。このプロセスは、ライブラリーのスクリ
ーニングが不要で、イントロン／エクソン接合部の発見に有用である。Another method that can be used is capture PCR, which involves PCR amplification of DNA fragments adjacent to known sequences in human and yeast artificial chromosomal DNA ( Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic 1: 111-119). In this method, DNA is digested with multiple restriction enzymes and ligated before PCR.
The engineered double-stranded sequence can also be placed on an unknown fragment of the molecule. Another method that can be used to extract unknown sequences is that of Parker, JD et al.
1991; Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060). Furthermore, genomic DNA walking can be performed using PCR, nested primers, and PromoterFinder ^™ library (Clontech, Palo Alto CA). This process eliminates the need for library screening and is useful for finding intron / exon junctions.

【００７５】 完全長cDNAをスクリーニングするとき、大きなcDNAを含むようにサイズ選択さ
れたライブラリーを用いることが好ましい。またランダムに準備刺激された(ran
dom primed)ライブラリーは、遺伝子の5’領域を含む配列をより多く含むという
点で好適である。ランダムに準備刺激されたライブラリーは、オリゴd(T)ライブ
ラリーで完全長cDNAが得られない場合には特に好適である。またゲノムライブラ
リーは、5’非転写領域における配列の伸長のために役立ち得る。When screening for full-length cDNAs, it is preferable to use libraries that have been size-selected to include large cDNAs. It was also randomly primed (ran
dom primed) libraries are preferred in that they will contain more sequences that include the 5 'region of the gene. Randomly primed libraries are particularly suitable when oligo d (T) libraries do not yield full-length cDNAs. Genomic libraries can also serve for extension of sequence in the 5 'non-transcribed region.

【００７６】 配列決定やPCRの産物のヌクレオチド配列のサイズ分析または確認のために、 市販のキャピラリー電気泳動法システムを用いることができる。特に、キャピラ
リーシークエンシングでは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザーで
活性化される4つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに対して1つ）、放射された
波長の検出を行うCCDカメラを使用する。出力／光強度は適切なソフトウエア（ 例えば、Perkin Elmer製のGenotyper^TM及びSequence Navigator^TM）を用いて電 気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ解析及び電子デー
タ表示までの全過程がコンピュータ制御され得る。キャピラリー電気泳動法は、
特定のサンプル内に限られた量だけ存在するDNAの小片の配列決定に特に好適で ある。A commercially available capillary electrophoresis system can be used for size analysis or confirmation of the nucleotide sequence of the product of sequencing or PCR. In particular, capillary sequencing uses a flowable polymer for electrophoretic separation, four different laser-activated fluorescent dyes (one for each nucleotide), and a CCD camera that detects the emitted wavelength. I do. Output / light intensity is converted to electrical signals using appropriate software (eg, Genotyper ^™ and Sequence Navigator ^{™ from} Perkin Elmer), and the entire process from sample loading to computer analysis and electronic data display is computer controlled. Can be done. Capillary electrophoresis is
It is particularly suitable for sequencing small pieces of DNA that are present in limited amounts in a particular sample.

【００７７】 本発明の別の実施例では、TR2Pをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子に用いて、TR2P、その断片またはその機能的等価物の適切 な宿主細胞内における発現を指向することができる。遺伝暗号の固有の縮重によ
って、実質的に同一、即ち機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のDNA配 列が作り出され、これらの配列はTR2Pのクローニングや発現のために用いること
ができる。In another embodiment of the present invention, a polynucleotide sequence encoding TR2P or a fragment thereof is used in a recombinant DNA molecule to express expression of TR2P, a fragment thereof or a functional equivalent thereof in a suitable host cell. Can be oriented. The inherent degeneracy of the genetic code creates other DNA sequences that encode substantially identical, ie, functionally equivalent, amino acid sequences that can be used for cloning and expression of TR2P. .

【００７８】 当業者に理解されるように、非自然発生コドンを有するTR2Pコーディング(enc
oding)ヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。例えば、特定の原核
生物或いは真核生物の宿主において選好されるコドンを選択することにより、タ
ンパク質の発現率を増大させたり、或いは自然発生配列から生成された転写物よ
りも長い半減期であるような望ましい特性を有するRNA転写物を作製することが 可能である。As will be appreciated by those skilled in the art, TR2P coding with non-naturally occurring codons (enc
Creating an oding nucleotide sequence can be beneficial. For example, selecting codons that are preferred in a particular prokaryotic or eukaryotic host may increase the expression of the protein or result in a longer half-life than transcripts generated from naturally occurring sequences. It is possible to produce RNA transcripts having desirable characteristics.

【００７９】 限定はしないが遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現を改
変すること等の種々の理由により、TR2Pをコードする配列を改変するために、本
発明のヌクレオチド配列を当業者に周知の方法を用いて操作可能である。ランダ
ムな断片化によるDNA混合や、遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのPCR再構
成を用いて、ヌクレオチド配列を操作できる。例えば、特異的部位の突然変異誘
発により、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選好の
変化、スプライシングバリアントの生成、及び突然変異の導入等をもたらすこと
ができる。The nucleotide sequence of the present invention may be modified to alter the sequence encoding TR2P by various techniques known to those of skill in the art, including, but not limited to, altering the cloning, processing and / or expression of the gene product. Operable using the method. The nucleotide sequence can be manipulated using DNA mixing by random fragmentation or PCR reconstitution of gene fragments and synthetic oligonucleotides. For example, mutagenesis of specific sites can result in the insertion of new restriction sites, altered glycosylation patterns, altered codon preferences, generation of splicing variants, introduction of mutations, and the like.

【００８０】 本発明の別の実施例では、TR2Pをコードする自然な、改変された、或いは組換
え型の核酸配列を、融合タンパク質をコードするために、非相同的な配列に結合
させうる。例えば、TR2P活性のインヒビターに対してペプチドライブラリーをス
クリーニングするために、市販の抗体により認識されるキメラTR2Pタンパク質を
コードすることが有用である。また、融合タンパク質はTR2Pコーディング配列と
非相同的なタンパク質配列との間の位置に切断部位を有するように操作可能であ
り、これによってTR2Pを切断して非相同的な部分から分けて精製することが可能
となる。In another embodiment of the invention, a natural, modified or recombinant nucleic acid sequence encoding TR2P may be joined to a heterologous sequence to encode a fusion protein. For example, to screen a peptide library for inhibitors of TR2P activity, it is useful to encode a chimeric TR2P protein that is recognized by a commercially available antibody. Also, the fusion protein can be engineered to have a cleavage site at a position between the TR2P coding sequence and the heterologous protein sequence, which allows the TR2P to be cleaved and purified separately from the heterologous portion. Becomes possible.

【００８１】 本発明の別の実施例では、当業者に周知の化学的手法（Caruthers. M.H.ら（1
980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn, T.ら（1980）Nucl. Acids
Res. Symp. Ser.225-232参照）を用いて、TR2Pをコードする配列の全体、或いは
その一部を合成することができる。或いは、化学的手法を用いてタンパク質自体
を作り出し、TR2Pのアミノ酸配列又はその一部を合成することができる。例えば
、種々の固相技術（Roberge, J.Y.ら(1995) Science 269:202-204）を用いてペ プチド合成を行うことができ、ABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）
を用いて合成の自動化を行なうことができる。In another embodiment of the present invention, chemical techniques well known to those skilled in the art (Caruthers. MH et al. (1
980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids.
Res. Symp. Ser. 225-232) can be used to synthesize the entire or a part of the sequence encoding TR2P. Alternatively, the protein itself can be produced using chemical techniques to synthesize the TR2P amino acid sequence or a portion thereof. For example, peptide synthesis can be performed using various solid phase techniques (Roberge, JY et al. (1995) Science 269: 202-204), and ABI 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer)
Can be used to automate the synthesis.

【００８２】 この新たに合成されたペプチドは、分離用の高速液体クロマトグラフィにより
実質的に精製することができる（Chiez, R.M.およびRegnier. F.Z. (1990) Meth
ods Enzymol. 182:392-421.）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或 いはシークエンシングにより確認することができる（the Edman degradation pr
ocedure described in Creighton, T. (1983) Proteins. Structures avd Molec ular Properties , WH Freeman and Co., New York, NY.）。更に、TR2Pのアミノ
酸配列もしくはその任意の部分を、直接の合成において改変することにより、並
びに／又は他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と結合させる
ことにより、変異体ポリペプチドを生成可能である。This newly synthesized peptide can be substantially purified by high performance liquid chromatography for separation (Chiez, RM and Regnier. FZ (1990) Meth
ods Enzymol. 182: 392-421.). The composition of the synthesized peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (the Edman degradation pr
ocedure described in Creighton, T. (1983) Proteins. Structures avd Molecular Properties , WH Freeman and Co., New York, NY.). In addition, variant polypeptides can be produced by modifying the amino acid sequence of TR2P or any portion thereof in direct synthesis and / or by binding to sequences derived from other proteins or any portion thereof. It is.

【００８３】 生物学的に活性なTR2Pを発現させるために、TR2Pまたはその誘導体をコードす
るヌクレオチド配列またはその機能的等価物を、適切な発現ベクター（即ち、挿
入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクター）に挿
入する。To express a biologically active TR2P, a nucleotide sequence encoding TR2P or a derivative thereof, or a functional equivalent thereof, is inserted into a suitable expression vector (ie, the transcription and translation of the inserted coding sequence). Vector containing the necessary elements).

【００８４】 TR2Pをコードする配列および適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベクター
を作製するために、当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in v itro 組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝的組換え技術が含まれる。この
ような技術は、Sambrook, J.らの文献（1989；Molecular Cloning, A Laborator y Manual , Cold Spring Harbor Press, Plainview,NY）及びAusubel, F.M.らの 文献（1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biol ogy , ch. 9. 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, NY）に開示されてい る。[0084] Methods known to those of skill in the art are used to construct expression vectors containing a sequence encoding TR2P and appropriate transcriptional and translational regulatory regions. These methods, in v Nitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination technology. Such techniques are described in Sambrook, J. et al. (1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY) and in Ausubel, FM et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biol ogy, ch. 9. 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, that has been disclosed in NY).

【００８５】 TR2Pをコードする配列を包含し、発現するために、種々の発現ベクター／宿主
系が利用できる。これらには、以下に限定しないが、組換え型のバクテリオファ
ージ、プラスミド或いはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌のような 微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌や、ウイルス発現ベクター
（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター
（例えば、カリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTM
V）或いは細菌の発現ベクター（例えば、TiまたはpBR322プラスミド）で形質転 換した植物細胞系や、或いは動物細胞系が含まれる。本発明は、利用される宿主
細胞によって限定されるものではない。A variety of expression vector / host systems are available for including and expressing the sequence encoding TR2P. These include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria transformed with recombinant bacteriophage, plasmid or cosmid DNA expression vectors, yeast transformed with yeast expression vectors, and viral expression vectors ( For example, an insect cell line infected with a baculovirus) or a virus expression vector (eg, cauliflower mosaic virus CaMV or tobacco mosaic virus ™)
V) or a plant cell line or an animal cell line transformed with a bacterial expression vector (eg, Ti or pBR322 plasmid). The present invention is not limited by the host cell utilized.

【００８６】 これらの系の「制御エレメント」或いは「調節配列」は、転写及び翻訳を実行
するために宿主細胞のタンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域（即ち、
エンハンサー、プロモーター並びに5′及び3′非翻訳領域）である。このような
エレメントの強さ及び特異性は様々である。利用されるベクター及び宿主に応じ
て、構成的及び誘導的プロモーターを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメ
ントを用いることができる。例えば、細菌系にクローニングする場合、Bluescri
ptョ ファージミド（Stratagene, LaJolla,CA）またはpSport1^TMプラスミド（Gib co BRL）等のハイブリッドlacZプロモーターのような誘導性のプロモーターを用
いることができる。昆虫細胞においてバキュロウイルスポリヘドリンプロモータ
ーを用いることができる。植物細胞のゲノムに由来するプロモーター或いはエン
ハンサ（例えば、熱ショック, RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）、若しくは 植物ウイルスに由来するプロモーター或いはエンハンサ（例えば、ウイルス性プ
ロモータまたはリーダー配列）をベクターにクローンニングできる。哺乳類細胞
系においては、哺乳類の遺伝子或いは哺乳類ウイルス由来のプロモーターが好ま
しい。TR2Pをコードする配列の多数の複製を含む細胞株を作る必要がある場合、
SV40或いはEBVに基づくベクターを適切な選択マーカーと共に用いることができ る。The “regulatory elements” or “regulatory sequences” of these systems are the untranslated regions (ie, the untranslated regions of the vector) that interact with host cell proteins to perform transcription and translation.
Enhancers, promoters and 5 'and 3' untranslated regions). The strength and specificity of such elements vary. Depending on the vector and host utilized, any number of suitable transcription and translation elements, including constitutive and inducible promoters, can be used. For example, when cloning into bacterial systems, Bluescri
An inducible promoter such as a hybrid lacZ promoter such as ptho phagemid (Stratagene, LaJolla, CA) or pSport1 ^™ plasmid (Gib co BRL) can be used. The baculovirus polyhedrin promoter can be used in insect cells. A promoter or enhancer from the genome of a plant cell (eg, heat shock, RUBISCO and storage protein genes), or a promoter or enhancer from a plant virus (eg, a viral promoter or leader sequence) can be cloned into the vector. In mammalian cell systems, promoters from mammalian genes or mammalian viruses are preferred. If you need to create a cell line that contains multiple copies of the sequence encoding TR2P,
Vectors based on SV40 or EBV can be used with appropriate selection markers.

【００８７】 細菌系では、TR2Pの用途に応じて多数の発現ベクターを選択することができる
。例えば、抗体の誘発のために大量のTR2Pが必要な場合は、容易に精製される融
合タンパク質を高レベルで発現するベクターを用いることができる。そのような
ベクターには、以下に限定しないが、TR2Pをコードする配列を、アミノ末端メチ
オニン及び後続のβ-ガラクトシダーゼの7残基の配列を備えたフレーム内におい
てベクターに結合してハイブリッドタンパク質を生成できるBluescriptョ（Strat agene）のような、多機能の大腸菌クローニング、発現ベクターや、pINベクター
（Van Heeke, G.及びS.M. Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-5509）等
が含まれる。またpGEXベクター（Promega、Madison WI）も、グルタチオンS-ト ランスファーゼ（GST）を伴う融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現す るため用いることができる。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であ
り、グルタチオンアガロースビーズへ吸着させた後に遊離グルタチオンの存在下
で溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製できる。そのような系
において生成されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン又はXA因子プロテアー
ゼ切断部位を含み、目的のクローン化ポリペプチドをGST部分から随意に放出さ せることができるように設計できる。[0087] In bacterial systems, a number of expression vectors may be selected depending upon the use of the TR2P. For example, if large amounts of TR2P are required for antibody induction, vectors that express high levels of fusion proteins that are easily purified can be used. Such vectors include, but are not limited to, the sequence encoding TR2P, which is ligated to the vector in frame with the amino-terminal methionine and subsequent 7-residue sequence of β-galactosidase to form a hybrid protein. Includes multifunctional E. coli cloning and expression vectors such as Bluescript (Stratgene), and pIN vectors (Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509). It is. PGEX vectors (Promega, Madison WI) can also be used to express heterologous polypeptides as fusion proteins with glutathione S-transferase (GST). Generally, such fusion proteins are soluble and can be readily purified from lysed cells by adsorption to glutathione agarose beads followed by elution in the presence of free glutathione. The protein produced in such a system can be designed to include a heparin, thrombin, or factor XA protease cleavage site, so that the cloned polypeptide of interest can be optionally released from the GST moiety.

【００８８】 酵母菌、Saccharomyces cerevisiaeでは、α因子、アルコールオキシダーゼ及
びPGHのような構成的或いは誘導的プロモーターを含む多数のベクターを用いる ことができる。レビューには、Ausubelら（前出）及びGrantらの文献（1987；Me
thods Enzymol.153:516-544）を参照されたい。In the yeast Saccharomyces cerevisiae , a number of vectors containing constitutive or inducible promoters such as α-factor, alcohol oxidase and PGH can be used. The review, Ausubel et al., (Supra) and Grant et al. (1987; Me
thods Enzymol. 153: 516-544).

【００８９】 植物発現ベクターを用いる場合には、TR2Pをコードする配列の発現は、多数の
プロモータの何れかで行なわれ得る。例えばCaMVの35S及び19Sプロモーターのよ
うなウイルスのプロモーターを単独で用いるか、或いはTMV（Takamatsu,N.ら（1
987）EMBO J.6:307-311）由来のオメガリーダー配列と併用することができる。 或いは、RUBISCOの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターのような植物 プロモーターを用いてもよい（Coruzzi, G.ら（1984）EMBO J.3:1671-1680）; B
roglie, R. ら（1984）Science 224:838-843; 及びWinter, J. ら（1991）Resul
ts Probl. Cell Differ. 17:85-105）。これらの作製物は、直接のDNA形質転換 または病原体が媒介した形質移入により植物細胞内に導入できる。このような技
術は一般に入手可能な多くの文献に記載されている（例えば、Hobbs, S.又はMur
ry, L.E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）McGraw
Hill New York,NY; pp.191-196を参照）。When using a plant expression vector, expression of the sequence encoding TR2P can be performed with any of a number of promoters. For example, viral promoters such as the 35S and 19S promoters of CaMV are used alone, or TMV (Takamatsu, N. et al.
987) It can be used in combination with the omega leader sequence derived from EMBO J. 6: 307-311). Alternatively, plant promoters such as the small subunit of RUBISCO or the heat shock promoter may be used (Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680);
roglie, R. et al. (1984) Science 224: 838-843; and Winter, J. et al. (1991) Resul.
ts Probl. Cell Differ. 17: 85-105). These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection. Such techniques are described in many publicly available references (eg, Hobbs, S. or Mur.
ry, LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw
Hill New York, NY; pp. 191-196).

【００９０】 昆虫系もTR2Pの発現に用いることができる。例えば、そのような系の一つにお
いては、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼生において外来遺 伝子を発現するためのベクターとして、Autographa californica多核角体病ウイ
ルス（AcNPV）を用いる。TR2Pをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子のよう なウイルスの非必須な領域にクローン化され、ポリヘドリンプロモーターの制御
下に置くことができる。TR2Pコーディング配列の挿入の成功により、ポリヘドリ
ン遺伝子が不活性になり、コートタンパク質膜が欠如した組換え型のウイルスが
生成される。そこで、この組換え型のウイルスを用いて、例えばS.frugiperda細
胞またはTrichoplusiaの幼生へ感染させ、その中でTR2Pを発現させることができ
る（Engelhard, E.K.ら（1994）Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227）。[0090] An insect system can also be used for expression of TR2P. For example, in one such system, Autographa californica polynuclear keratopathy virus (AcNPV) is used as a vector for expressing foreign genes in Spodoptera frugiperda cells or Trichoplusia larvae. The sequence encoding TR2P can be cloned into non-essential regions of the virus, such as the polyhedrin gene, and placed under the control of the polyhedrin promoter. Successful insertion of the TR2P coding sequence renders the polyhedrin gene inactive and produces a recombinant virus lacking the coat protein membrane. Thus, this recombinant virus can be used to infect, for example, S. frugiperda cells or Trichoplusia larvae and express TR2P therein (Engelhard, EK et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 3224-3227).

【００９１】 哺乳類の宿主細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用すること
ができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合、TR2Pをコード
する配列が、後発のプロモータ及び三連のリーダー配列からなるアデノウイルス
転写／翻訳複合体の中に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須E1又はE3領域
における挿入により、感染した宿主細胞においてTR2Pを発現可能である生存可能
なウイルスが得られる（Logan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sc
i. 81:3655-3659）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーのような
転写エンハンサーを、哺乳類の宿主細胞内の発現を増大させるために用いること
ができる。[0091] In mammalian host cells, a number of viral-based expression systems are available. If an adenovirus is used as an expression vector, the sequence encoding TR2P can be ligated into an adenovirus transcription / translation complex consisting of the late promoter and tripartite leader sequence. Insertion in a nonessential E1 or E3 region of the viral genome results in a viable virus capable of expressing TR2P in infected host cells (Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad . Sc
i. 81: 3655-3659). In addition, transcription enhancers such as the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells.

【００９２】 また、ヒト人工染色体（HAC）を用いることにより、プラスミドに含まれ発現 され得るものに比べてより大きなDNAの断片を供給することもできる。治療を目 的とし、6kb〜10MbのHACを構築して従来のデリバリー方法（リポソーム、ポリカ
チオンのアミノポリマー、又は小胞）を介して供給することができる。[0092] By using a human artificial chromosome (HAC), it is possible to supply a larger DNA fragment than that contained in a plasmid and capable of being expressed. For therapeutic purposes, 6 kb to 10 Mb of HAC can be constructed and delivered via conventional delivery methods (liposomes, polycationic amino polymers, or vesicles).

【００９３】 また、特定の開始シグナルを用いて、TR2Pをコードする配列のより効率的な翻
訳を行なうことができる。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接する 配列が含まれる。TR2Pをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切
な発現ベクター内に挿入された場合、追加の転写または翻訳の制御シグナルは不
要である。しかし、コーディング配列又はその一部のみが挿入される場合には、
ATG開始コドンを含む外来性の翻訳制御シグナルを与えなければならない。さら に、全てのインサートの転写を確実にするために、開始コドンは正しい読み枠に
存在しなければならない。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び
合成の両方の種々の起源に由来するものであり得る。文献（Scharf,D.ら（1994 ）Results Probl. Cell Differ. 20:125-162）に記載のように、用いられる特定
の細胞系に適切なエンハンサーを含めることで、発現の効率を高めることができ
る。[0093] In addition, a specific initiation signal can be used for more efficient translation of a sequence encoding TR2P. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences. If the sequence encoding TR2P, its initiation codon and upstream sequences are inserted into the appropriate expression vector, no additional transcriptional or translational control signals are required. However, if only the coding sequence or a part thereof is inserted,
Exogenous translational control signals, including the ATG start codon, must be provided. In addition, the start codon must be in the correct reading frame to ensure transcription of all inserts. Exogenous translational elements and initiation codons can be from a variety of sources, both natural and synthetic. As described in the literature (Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162), it is possible to increase the efficiency of expression by including appropriate enhancers in the particular cell line used. it can.

【００９４】 さらに宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する能力や、発現したタン
パク質を望ましい形にプロセシングする能力によって選択可能である。このよう
なポリペプチドの修飾には、以下に限定しないが、アセチル化、カルボキシル化
、グリコシル化、リン酸化、リピド化(lipidation)及びアシル化が含まれる。ま
たタンパク質の「プレプロ」形を切り離す翻訳後のプロセシングを用いて、正し
い挿入、折り畳み、及び／又は機能することを促進できる。翻訳後の活性のため
の特定の細胞器械及び特徴的な機構を有している種々の宿主細胞（例えば、CHO 、HeLa、MDCK293、WI38）は、American Type Culture Collection（ATCC; Bethe
sda, MD）より入手可能であり、これらを外来タンパク質の正しい修飾やプロセ シングを確実に行なうために選択してもよい。In addition, host cell strains can be selected for their ability to modulate the expression of the inserted sequences and to process the expressed protein in the desired fashion. Such modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation, and acylation. Post-translational processing that separates the "prepro" form of the protein can also be used to facilitate correct insertion, folding, and / or functioning. A variety of host cells (eg, CHO, HeLa, MDCK293, WI38) having specific cellular machinery and characteristic mechanisms for post-translational activity are available from the American Type Culture Collection (ATCC; Bethe).
sda, MD) and may be selected to ensure correct modification and processing of the foreign protein.

【００９５】 組換え型タンパク質の高収率の産生を長期間にわたり確保するためには安定し
た発現が好ましい。例えば、ウイルス起源の複製及び／若しくは内在性発現エレ
メント並びに選択可能なマーカー遺伝子を同一のベクター上、又は別々のベクタ
ー上に含む発現ベクターを用いて、TR2Pを安定的に発現可能な株化細胞を形質転
換することができる。ベクターの導入の後、選択培地に切り替える前に濃縮培地
内で細胞を1〜2日間増殖させる。選択可能なマーカーの目的は、選択のための耐
性を与えることであり、またその存在によって導入された配列をうまく発現する
細胞の増殖および回収が可能とすることである。安定的に形質転換された細胞の
耐性クローンは、その細胞の型に適した組織培養技術を用いて増殖することがで
きる。[0095] Stable expression is preferred to ensure long-term, high-yield production of recombinant proteins. For example, using an expression vector containing a replication and / or endogenous expression element of viral origin and a selectable marker gene on the same vector or on a separate vector, a cell line capable of stably expressing TR2P is used. Can be transformed. After the introduction of the vector, the cells are allowed to grow for 1-2 days in a concentrated medium before switching to a selective medium. The purpose of a selectable marker is to confer resistance for selection and to allow the growth and recovery of cells that successfully express the introduced sequence due to their presence. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques appropriate for the cell type.

【００９６】 形質転換された細胞株を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。これらには、以下に限定しないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ
遺伝子（Wigler, M.ら（1977）Cell 11:223-32）及びアデニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ遺伝子（Lowy, I. ら（1980）Cell 22:817-23）が含まれ、そ れぞれは、tk^-及びapr^-細胞において用いられる。また代謝拮抗剤、抗生剤或い は除草剤への耐性を選択の基礎として用いることが可能で、例えばdhfrはメトト
レキセートに対する耐性を与え（Wigler, M.ら(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77:35
67-70）、nptはアミノグリコシドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え（C
olberre-Garapin, F. ら（1981）J.Mol.Biol.150:1-14）、als或いはpatはクロ ルスルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラ ーゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える（Murry, 前 出 ）。さらに選択可能な遺伝子として、例えば、細胞がトリプトファンの代わり
にインドールを利用できるようにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチ
ノール（histinol）を利用できるようにするhisDが文献に記載されている（Hart
man, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51）。 最近では、例えば、アントシアニン、β-グルクロニダーゼ及びその基質GUS、及
びルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンのようなマーカーと共に可視マーカ
ーがよく利用されるようになった。これらのマーカーは形質転換体を同定するだ
けでなく、特定のベクター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発現の量
を定量するために広く用いられる（Rhodes, C.A. ら（1995）Methods Mol. Biol
. 55:121-131）。[0096] Any number of selection systems can be used to recover transformed cell lines. These include, but are not limited to, the herpes simplex virus thymidine kinase gene (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-32) and the adenine phosphoribosyltransferase gene (Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-23) contains, their respective is, tk ^- used in cell ^- and apr. Also, resistance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as a basis for selection, for example, dhfr confers resistance to methotrexate (Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. .77: 35
67-70), npt confers resistance to the aminoglycoside neomycin and G-418 (C
olberre-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14), als or pat confers resistance to chlorsulfuron, phosphinotricin acetyltransferase ( Murry, supra). Further selectable genes are described in the literature, for example, trpB, which allows cells to use indole instead of tryptophan, and hisD, which allows cells to use histinol instead of histidine (Hart
man, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8047-51). Recently, visible markers have become popular with markers such as, for example, anthocyanins, β-glucuronidase and its substrate GUS, and luciferase and its substrate luciferin. These markers are widely used not only to identify transformants, but also to quantify the amount of transient or stable protein expression by a particular vector system (Rhodes, CA et al. (1995) Methods Mol. Biol
55: 121-131).

【００９７】 マーカー遺伝子発現の存在／非存在によって目的の遺伝子の存在も示唆される
が、その遺伝子の存在及び発現の確認を必要とすることもある。例えばTR2Pをコ
ードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、TR2Pをコードする配列
を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子の機能が存在しないことにより同
定できる。或いは、単一のプロモータの制御下において、マーカー遺伝子をTR2P
をコードする配列と直列に配置することができる。選択または誘導に応じた標識
遺伝子の発現は、通常直列に配置された配列の発現も同様に示す。The presence / absence of marker gene expression may also indicate the presence of the gene of interest, but may require confirmation of the presence and expression of that gene. For example, if a sequence encoding TR2P is inserted within a marker gene sequence, transformed cells containing the sequence encoding TR2P can be identified by the absence of marker gene function. Alternatively, the marker gene is TR2P under the control of a single promoter.
Can be placed in series with the sequence encoding Expression of a marker gene in response to selection or induction usually indicates expression of sequences arranged in tandem as well.

【００９８】 或いは、当業者に周知の様々な方法により、TR2Pをコードする核酸配列を含み
TR2Pを発現する宿主細胞を同定できる。このような方法には、以下に限定しない
が、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーション並びに、核酸とタンパク質
配列を検出及び／若しくは定量するための技術に基づく膜、溶液、若しくはチッ
プを含むタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイが含まれる。Alternatively, the nucleic acid sequence encoding TR2P may be included by various methods well known to those of skill in the art.
Host cells that express TR2P can be identified. Such methods include, but are not limited to, DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, and protein biotechnology, including membranes, solutions, or chips based on techniques for detecting and / or quantifying nucleic acid and protein sequences. Assays or immunoassays.

【００９９】 TR2Pをコードするポリヌクレオチドの断片またはプローブ若しくは断片を用い
るDNA−DNA又はDNA−RNAハイブリダイゼーション又は増幅により、TR2Pをコード
するポリヌクレオチド配列の存在を検出できる。TR2PをコードするDNA或いはRNA
を含む形質転換体を検出するために、核酸増幅に基づくアッセイは、TR2Pをコー
ドする核酸配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーの使用を含む。The presence of a polynucleotide sequence encoding TR2P can be detected by DNA-DNA or DNA-RNA hybridization or amplification using a fragment or probe or fragment of a polynucleotide encoding TR2P. DNA or RNA encoding TR2P
Nucleic acid amplification-based assays for detecting transformants that include the use of oligonucleotides or oligomers based on the nucleic acid sequence encoding TR2P.

【０１００】 TR2Pの発現を検出・測定するための種々のプロトコルは、このタンパク質に特
異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれかを用い、また当業
者に周知のものである。そのような技術の例には、酵素結合免疫検定法（ELISA ）、ラジオイムノアッセイ（RIA）及び蛍光細胞分析分離（FACS）が含まれる。T
R2P上において２つの非干渉エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を 利用する二部位のモノクローナルベースのイムノアッセイ（two-site, monoclon
al-based immunoassay）が好ましいが、競合的結合実験も用いられうる。これら
アッセイおよび他のアッセイは、例えばHampton, R.らの文献（1990; Serologic al Methods, a Laboratory Manual , Section IV, APS Press, St Paul ,MN）及 びMaddox, D.E.らの文献（（1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216）に詳細に記載
されている。Various protocols for detecting and measuring TR2P expression use either polyclonal or monoclonal antibodies specific for this protein and are well known to those skilled in the art. Examples of such techniques include enzyme linked immunoassays (ELISA), radioimmunoassays (RIA) and fluorescent cell analysis separations (FACS). T
Two-site, monoclon based immunoassays utilizing monoclonal antibodies reactive to two non-interfering epitopes on R2P
al-based immunoassay) is preferred, but competitive binding experiments can also be used. These and other assays are described, for example, in Hampton, R. et al. (1990; Serologic al Methods, a Laboratory Manual , Section IV, APS Press, St Paul, MN) and Maddox, DE et al. ((1983; J. Exp. Med. 158: 1211-1216).

【０１０１】 多様なラベル及び結合技術が当業者には周知であり、そして種々の核酸及びア
ミノ酸のアッセイにおいて用いることができる。TR2Pをコードするポリヌクレオ
チドに関係する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプロ
ーブやPCRプローブを作製するための手段には、オリゴ標識（oligolabeling）、
ニックトランスレーション法、末端標識（end-labeling）、或いは標識ヌクレオ
チドを用いるPCR増幅などが含まれる。或いは、TR2Pをコードする配列、又はそ の任意の断片を、mRNAプローブの作製のためのベクターにクローン化できる。そ
のようなベクターは当業者に周知で、また市販されており、これを用いて、例え
ばT7、T3或いはSP6のような適切なRNAポリメラーゼ及び標識したヌクレオチドを
加えることによってin vitroでRNAプローブを合成することができる。これらの 方法は、種々の市販のキット（Pharmacia & Upjohn（Kalamazoo, MI）；Promega
（Madison WI）；及びU.S. Biochemical Corp.,Cleveland, OH提供）を用いて実
施することができる。検出を容易にするために用いる適切なレポーター分子、即
ち標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色素生産剤や、基質
、コファクター、インヒビター、磁性粒子等が含まれる。A wide variety of labels and conjugation techniques are known by those skilled in the art and can be used in various nucleic and amino acid assays. Means for producing labeled hybridization probes and PCR probes for detecting sequences related to the polynucleotide encoding TR2P include oligolabeling,
This includes nick translation, end-labeling, or PCR amplification using labeled nucleotides. Alternatively, the sequence encoding TR2P, or any fragment thereof, can be cloned into a vector for the production of an mRNA probe. Such vectors are well known to those of skill in the art and are commercially available, and are used to synthesize RNA probes in vitro by adding a suitable RNA polymerase, such as, for example, T7, T3 or SP6, and labeled nucleotides. can do. These methods are described in various commercially available kits (Pharmacia & Upjohn (Kalamazoo, MI); Promega
(Madison WI); and US Biochemical Corp., Cleveland, OH). Suitable reporter molecules or labels used to facilitate detection include radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent or dye-producing agents, substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and the like.

【０１０２】 細胞培養からのタンパク質の回収および発現に適した条件下において、TR2Pを
コードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を培養することができる
。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いられる配列及び／ま
たはベクターに応じて分泌される、つまり細胞内に含まれるようにすることがで
きる。当業者に理解されるように、TR2Pをコードするポリヌクレオチドを含む発
現ベクターは、原核生物か真核生物の細胞膜を通してTR2P分泌を指向するシグナ
ル配列を含むように設計することができる。また他の作製物を用いることにより
、TR2Pをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドド
メインをコードするヌクレオチド配列に結合することができる。そのような精製
を容易にするドメインには、以下に限定しないが、固定化金属上での精製を可能
にするヒスチジントリプトファンモジュールのような金属キレート化ペプチド類
、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインAドメイン、及びFLA
GS延長／アフィニティー精製システムにおいて用いられるドメイン（Immunex Co
rp., Seattle WA）が含まれる。精製ドメインとTR2Pコーディング配列の間にお けるXA因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego CA）に対して特異
的な配列のような切断可能なリンカー配列の包含により、精製が容易になる。こ
のような発現ベクターの１つは、TR2Pおよびチオレドキシン及びエンテロキナー
ゼ切断部位に先行する6個のヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパ ク質を発現する。ヒスチジン残基が固定化金属イオンアフィニティクロマトグラ
フィー（IMAC；Porath, Jら (1992) Prot. Exp. Purif. 3:263-281に記載）での
精製を促進する一方、エンテロキナーゼ切断部位が融合タンパク質からのTR2Pの
精製のための手段を与える。融合タンパク質を含むベクターについての解説は、
Kroll, D.J.ら（1993; DNA Cell Biol. 12:441-453）に記載されている。[0102] Host cells transformed with a nucleotide sequence encoding TR2P can be cultured under conditions suitable for the recovery and expression of the protein from cell culture. The protein produced by the transformed cell can be secreted, ie, contained within the cell, depending on the sequence and / or the vector used. As will be appreciated by those skilled in the art, expression vectors containing a polynucleotide encoding TR2P can be designed to include a signal sequence that directs TR2P secretion through prokaryotic or eukaryotic cell membranes. Also, using other constructs, the sequence encoding TR2P can be linked to a nucleotide sequence encoding a polypeptide domain that facilitates purification of soluble proteins. Domains that facilitate such purification include, but are not limited to, metal-chelating peptides such as the histidine tryptophan module, which allow for purification on immobilized metals, and purification on immobilized immunoglobulins. Enables protein A domain and FLA
Domains used in GS extension / affinity purification systems (Immunex Co.
rp., Seattle WA). The inclusion of a cleavable linker sequence such as a sequence specific for factor XA or enterokinase (Invitrogen, San Diego CA) between the purification domain and the TR2P coding sequence facilitates purification. One such expression vector expresses a fusion protein containing a nucleic acid encoding TR2P and the six histidine residues preceding the thioredoxin and enterokinase cleavage site. Histidine residues facilitate purification by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC; described in Porath, J et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281), while the enterokinase cleavage site facilitates fusion protein Provides a means for purification of TR2P from E. coli. For a commentary on vectors containing fusion proteins,
Kroll, DJ et al. (1993; DNA Cell Biol. 12: 441-453).

【０１０３】 組換え体の生成だけでなく、固相技術を用いた直接のペプチド合成によって、
TR2Pの断片を作り出すことができる（Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc.
85:2149-2154参照）。タンパク質合成は手作業または自動で行なうことができ る。自動化された合成は、例えば、Applied Biosystem 431Aペプチドシンセサイ
ザ（Perkin Elmer）を用いて行うことができる。TR2Pの種々の断片を個別に合成
して、次に結合させて完全長分子を作り出すことも可能である。Not only by recombinant production, but also by direct peptide synthesis using solid phase technology,
TR2P fragments can be produced (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc.
85: 2149-2154). Protein synthesis can be performed manually or automatically. Automated synthesis can be performed, for example, using an Applied Biosystem 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer). Various fragments of TR2P can be synthesized separately and then combined to create the full-length molecule.

【０１０４】 治療 TR2P-1と、ヒトオステオプロテグリン（GI 2072185）及びヒトTNF-R2（GI 146
9541）との間に化学的および構造的相同性が存在する。更にTR2P-1は、腫瘍、免
疫、胃腸、生殖、造血、心血管、結合、及び胎生組織において発現される。従っ
てTR2P-1は、骨形成、発生、生殖、免疫、及び潰瘍性の疾患において所定の役割
を担っていると考えられる。 Therapeutic TR2P-1, human osteoprotegrin (GI 2072185) and human TNF-R2 (GI 146
9541) and chemical and structural homology. In addition, TR2P-1 is expressed in tumor, immunity, gastrointestinal, reproductive, hematopoietic, cardiovascular, connective, and fetal tissues. Thus, TR2P-1 appears to play a role in bone formation, development, reproduction, immunity, and ulcer disease.

【０１０５】 TR2P-2と、ヒトTNF-R2（GI 1469541）及びヒトオステオプロテグリン（GI 207
2185）との間に化学的及び構造的相同性が存在する。更にTR2P-2は、腫瘍、免疫
、皮膚、胃腸、造血、生殖、神経、泌尿器、及び心血管の組織において発現され
る。従ってTR2P-2は、生殖、免疫、及び潰瘍性の疾患において所定の役割を担っ
ていると考えられる。TR2P-2, human TNF-R2 (GI 1469541) and human osteoprotegrin (GI 207
2185) and chemical and structural homology. In addition, TR2P-2 is expressed in tumor, immunity, skin, gastrointestinal, hematopoietic, reproductive, neural, urinary, and cardiovascular tissues. Thus, TR2P-2 appears to play a role in reproductive, immune, and ulcerative diseases.

【０１０６】 従って、一実施例においては、骨形成疾患の治療または予防のためにTR2P又は
フラグメント又はその誘導体を被験者に投与することがある。そのような腫瘍性
疾患には、以下に限定はしないが、軟骨形成不全、キャフィー病、頭蓋骨幹端異
形成不全症、大理石骨病、骨粗鬆症-偽性神経膠腫症候群、骨ページェット病、 易捻挫性小人症(parastremmatic dwarfism)、及び多骨性溶骨性異形成症が含ま れる。Accordingly, in one embodiment, TR2P or a fragment or derivative thereof may be administered to a subject for the treatment or prevention of an osteogenic disorder. Such neoplastic disorders include, but are not limited to, chondrodysplasia, Caffy's disease, skull metaphyseal dysplasia, osteopetrosis, osteoporosis-pseudoglioma syndrome, bone Paget's disease, Includes parastremmatic dwarfism, and polyosteolytic dysplasia.

【０１０７】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む骨形成疾患の治療ま
たは予防のために、TR2P又はフラグメント又はその誘導体を発現可能なベクター
を被験者に投与することがある。In another example, a vector capable of expressing TR2P or a fragment or derivative thereof may be administered to a subject for the treatment or prevention of an osteogenic disorder, including but not limited to those described above.

【０１０８】 また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む骨形成疾患の治
療または予防のために、適切な医薬用担体と共にTR2Pを含む医薬品組成物を被験
者に投与することがある。In another embodiment, a pharmaceutical composition comprising TR2P together with a suitable pharmaceutical carrier may be administered to a subject for the treatment or prevention of an osteogenic disorder, including but not limited to those described above. is there.

【０１０９】 更に別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む骨形成疾患の治
療または予防のために、TR2Pの活性を調節するアゴニストを被験者に投与するこ
とがある。In yet another embodiment, an agonist that modulates the activity of TR2P may be administered to a subject for the treatment or prevention of an osteogenic disorder, including but not limited to those described above.

【０１１０】 一実施例においては、発生障害の治療または予防のためにTR2P又はフラグメン
ト又はその誘導体を被験者に投与することがある。ここで用語「発生障害」は、被
験者の組織、器官、又は系（例えば、脳、副腎、腎臓、骨格または生殖系等）の
発育および機能と関係する任意の疾患を指す。そのような疾患には、以下に限定
はしないが、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全小
人症、デュシェンヌ及びベッカー筋ジストロフィー、てんかん、生殖腺発育異常
、WAGR症候群、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シ
ャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症のような遺伝性神経障害、甲状腺
機能低下症、水頭症、シドナム舞踏病および脳性麻痺のような発作障害、二分脊
椎、及び先天性緑内障、白内障、又は感音性聴力損失が含まれる。In one embodiment, TR2P or a fragment or derivative thereof may be administered to a subject for the treatment or prevention of a developmental disorder. As used herein, the term "developmental disorder" refers to any disease associated with the development and function of a subject's tissues, organs, or systems (eg, brain, adrenal gland, kidney, skeleton, or reproductive system). Such disorders include, but are not limited to, tubular acidosis, anemia, Cushing's syndrome, chondrodysplasia dwarfism, Duchenne and Becker muscular dystrophy, epilepsy, gonadal dysgenesis, WAGR syndrome, myelodysplastic syndrome, Seizures such as hereditary mucosal epithelial dysplasia, hereditary keratosis, Charcot-Marie-Tooth disease and neurofibromatosis, hypothyroidism, hydrocephalus, Sidnam chorea and cerebral palsy Disorders, spina bifida, and congenital glaucoma, cataracts, or sensory hearing loss.

【０１１１】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む発生障害の治療また
は予防のために、TR2P又はフラグメント又はその誘導体を発現可能なベクターを
被験者に投与することがある。In another example, a vector capable of expressing TR2P or a fragment or derivative thereof may be administered to a subject for the treatment or prevention of a developmental disorder, including but not limited to those described above.

【０１１２】 また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む発生障害の治療
または予防のために、適切な医薬用担体と共にTR2Pを含む医薬品組成物を被験者
に投与することがある。In another embodiment, a subject may be administered a pharmaceutical composition comprising TR2P together with a suitable pharmaceutical carrier for the treatment or prevention of a developmental disorder, including but not limited to those described above. .

【０１１３】 更に別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む発生障害の治療
または予防のために、TR2Pの活性を調節するアゴニストを被験者に投与すること
がある。In yet another embodiment, an agonist that modulates the activity of TR2P may be administered to a subject for the treatment or prevention of a developmental disorder, including but not limited to those described above.

【０１１４】 一実施例においては、生殖障害の治療または予防のためにTR2P又はフラグメン
ト又はその誘導体を被験者に投与することがある。そのような疾患には、以下に
限定はしないが、プロラクチン産生異常、卵管異常・***異常・子宮内膜症を含
む不妊症、発情周期の混乱、月経周期の混乱、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激
症候群、子宮内膜や卵巣の腫瘍、自己免疫異常、異所的妊娠、及び奇形発生、乳
房の癌、***線維嚢胞病、及び溢乳、***形成の混乱、異常性***生理、精巣の
癌、前立腺の癌、良性の前立腺肥大症、及び前立腺炎、男性の***や女性化***
の癌が含まれる。In one embodiment, TR2P or a fragment or derivative thereof may be administered to a subject for treatment or prevention of a reproductive disorder. Such disorders include, but are not limited to, abnormal prolactin production, infertility including abnormal fallopian tubes, ovulation, and endometriosis, disrupted estrous cycle, disrupted menstrual cycle, polycystic ovary syndrome, Ovarian hyperstimulation syndrome, endometrial and ovarian tumors, autoimmune abnormalities, ectopic pregnancy, and teratogenesis, breast cancer, breast fibrocystic disease, and breast milk, disrupted spermatogenesis, abnormal sperm physiology, testicular Includes cancer, prostate cancer, benign prostatic hyperplasia, and prostatitis, cancer of male breasts and gynecomastia.

【０１１５】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む生殖障害の治療また
は予防のために、TR2P又はフラグメント又はその誘導体を発現可能なベクターを
被験者に投与することがある。In another example, a vector capable of expressing TR2P or a fragment or derivative thereof may be administered to a subject for the treatment or prevention of a reproductive disorder, including but not limited to those described above.

【０１１６】 また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む生殖障害の治療
または予防のために、適切な医薬用担体と共にTR2Pを含む医薬品組成物を被験者
に投与することがある。In another example, a subject may be administered a pharmaceutical composition comprising TR2P together with a suitable pharmaceutical carrier for the treatment or prevention of a reproductive disorder, including but not limited to those described above. .

【０１１７】 更に別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む生殖障害の治療
または予防のために、TR2Pの活性を調節するアゴニストを被験者に投与すること
がある。In yet another embodiment, an agonist that modulates the activity of TR2P may be administered to a subject for the treatment or prevention of a reproductive disorder, including but not limited to those described above.

【０１１８】 更なる実施例においては、免疫疾患の治療または予防のためにTR2P又はフラグ
メント又はその誘導体を被験者に投与することがある。そのような疾患には、以
下に限定はしないが、AIDS、アジソン病、成人呼吸困難症候群、アレルギー、貧
血、喘息、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大
腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎
、糸球体腎炎、痛風、グレーブス病、過剰好酸球増加症、被刺激性の腸シンドロ
ーム、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心臓周囲の
炎症、骨関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェー
グレーン症候群、ウェルナー症候群、自己免疫性の甲状腺炎、癌・血液透析・体
外循環の合併症、潰瘍性・細菌性・真菌・寄生虫・原生動物・寄生虫様の感染症
、及び心的外傷が含まれる。一態様では、TR2Pと特異的に結合する抗体をアンタ
ゴニストとして直接用いるか、或いはTR2Pを発現する細胞や組織に薬剤をもたら
す送達機構またはターゲティングとして間接的に用いることができる。In a further embodiment, TR2P or a fragment or derivative thereof may be administered to a subject for the treatment or prevention of an immune disorder. Such diseases include, but are not limited to, AIDS, Addison's disease, adult respiratory distress syndrome, allergy, anemia, asthma, atherosclerosis, bronchitis, cholecystitis, Crohn's disease, ulcerative colitis, Atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, gout, Graves' disease, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, lupus erythematosus, multiple sclerosis, Myasthenia gravis, inflammation of the myocardium or pericardium, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, Werner syndrome, autoimmune thyroiditis, cancer, hemodialysis, extracorporeal Includes circulatory complications, ulcerative, bacterial, fungal, parasite, protozoan, parasite-like infections, and trauma. In one embodiment, antibodies that specifically bind TR2P can be used directly as antagonists, or indirectly as a delivery mechanism or targeting to bring the agent to cells or tissues that express TR2P.

【０１１９】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む免疫疾患の治療また
は予防のために、TR2Pをコードするポリヌクレオチドのポリヌクレオチドの相補
配列を発現するベクターを被験者に対して投与することがある。In another embodiment, a vector expressing the polynucleotide complement of a polynucleotide encoding TR2P is administered to a subject for treatment or prevention of an immune disease, including but not limited to those described above. May be administered.

【０１２０】 更なる実施例においては、腫瘍性疾患の治療または予防のためにTR2Pのアンタ
ゴニストを被験者に投与することがある。そのような疾患には、以下に限定はし
ないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫、並びに特
に、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、***、頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓
、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓
、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。一態様では、TR2Pと特異的に
結合する抗体をアンタゴニストとして直接用いるか、或いはTR2Pを発現する細胞
や組織に薬剤をもたらす送達機構またはターゲティングとして間接的に用いるこ
とができる。In a further embodiment, an antagonist of TR2P may be administered to a subject for the treatment or prevention of a neoplastic disease. Such diseases include, but are not limited to, adenocarcinoma, leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, teratocarcinoma, and especially adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder , Ganglia, gastrointestinal tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, and uterine cancer. In one embodiment, antibodies that specifically bind TR2P can be used directly as antagonists, or indirectly as a delivery mechanism or targeting to bring the agent to cells or tissues that express TR2P.

【０１２１】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む腫瘍性疾患の治療ま
たは予防のために、TR2Pをコードするポリヌクレオチドのポリヌクレオチドの相
補配列を発現するベクターを被験者に対して投与することがある。In another example, a vector expressing the complement of the polynucleotide of a polynucleotide encoding TR2P is administered to a subject for the treatment or prevention of a neoplastic disease, including but not limited to those described above. May be administered.

【０１２２】 他の実施例においては、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、
アゴニスト、相補的配列またはベクターを、他の適切な治療薬と組合せて投与す
ることもできる。従来の製薬の原理に基づき、当業者は併用療法で使用するため
の適切な薬剤を選択することができるであろう。治療薬を組み合わせることによ
り、上述の種々の反応の治療又は予防に効果を与える相乗作用をしうる。この方
法を用いることにより、各薬剤の少ない投与量で治療効果を上げることができ、
従って副作用の可能性を低下させることができる。In another embodiment, any of the proteins, antagonists, antibodies,
Agonists, complementary sequences or vectors can also be administered in combination with other suitable therapeutic agents. Based on conventional pharmaceutical principles, one of skill in the art would be able to select appropriate agents for use in combination therapy. The combination of therapeutic agents can have a synergistic effect that has an effect on the treatment or prevention of the various reactions described above. By using this method, the therapeutic effect can be increased with a small dose of each drug,
Therefore, the possibility of side effects can be reduced.

【０１２３】 TR2Pのアンタゴニストは、当業者に周知の方法を用いて製造することができる
。詳細には、精製されたTR2Pを用いて、抗体を作り出し、或いはTR2Pに特異的に
結合するものを同定するために、薬剤のライブラリーをスクリーニングすること
ができる。TR2Pに対する抗体は、当業者によく知られた方法を用いて産生するこ
とができる。このような抗体には、以下に限定されないが、ポリクローナル抗体
、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現
ライブラリーにより作られたフラグメントが含まれる。中和抗体（即ち、二量体
形成を阻害するもの）は治療の用途に特に好適である。An antagonist of TR2P can be produced using methods well known to those skilled in the art. In particular, purified TR2P can be used to generate antibodies or to screen libraries of drugs to identify those that specifically bind to TR2P. Antibodies to TR2P can be produced using methods well known to those skilled in the art. Such antibodies include, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments, and fragments produced by Fab expression libraries. Neutralizing antibodies (ie, those that inhibit dimer formation) are particularly suitable for therapeutic use.

【０１２４】 抗体を産生するために、TR2Pか、免疫学的特性を有するその任意の断片或いは
そのオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、
ヒト等を含む種々の宿主を免疫化することができる。宿主の種に応じて、免疫学
的反応を増強するために種々のアジュバントを用いることができる。そのような
アジュバントには、以下に限定しないが、フロイントのアジュバント、アルミニ
ウムの水酸化物ようなミネラルゲルアジュバント、リゾレシチンのような界面活
性剤アジュバント、プルロニックポリオール(pluronic polyols)アジュバント、
ポリアニオンアジュバント、ペプチドアジュバント、オイルエマルジョンアジュ
バント、KLHアジュバント及びジニトロフェノールアジュバントが含まれる。ヒ トで使用するアジュバントのなかで、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリ ネバクテリウム−パルヴム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。To produce antibodies, goats, rabbits, rats, mice, or goats can be injected by injecting TR2P or any fragment thereof having immunological properties or oligopeptides thereof.
Various hosts including humans can be immunized. Depending on the species of the host, various adjuvants can be used to enhance the immunological response. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gel adjuvants such as aluminum hydroxide, surfactant adjuvants such as lysolecithin, pluronic polyols adjuvants,
Includes polyanion adjuvants, peptide adjuvants, oil emulsion adjuvants, KLH adjuvants and dinitrophenol adjuvants. Among the adjuvants used in humans, BCG (bacilli Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum are particularly preferred.

【０１２５】 TR2Pに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド類、
またはその断片は、好ましくは少なくとも5個のアミノ酸、より好ましくは少な くとも10個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。またこれらのオリゴペプ
チド、ペプチド、または断片は、自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一で
、小形の自然発生の分子の全アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。TR2Pア
ミノ酸の短い伸展部が、KLHのような別のタンパク質の伸展部と融合し、 キメラ分子に対する抗体が産生され得る。Oligopeptides, peptides used to elicit antibodies against TR2P,
Alternatively, a fragment thereof has an amino acid sequence preferably consisting of at least 5 amino acids, more preferably at least 10 amino acids. It is also preferred that these oligopeptides, peptides or fragments are identical to a portion of the amino acid sequence of the natural protein and include the entire amino acid sequence of a small, naturally occurring molecule. Short stretches of TR2P amino acids can be fused with stretches of another protein, such as KLH, to produce antibodies against the chimeric molecule.

【０１２６】 TR2Pのモノクローナル抗体は、培養における連続的な株化細胞によって抗体分
子を産生させる任意の技術を用いて調製できる。このような技術には、以下に限
定しないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV-ハ イブリドーマ技術（Kohler, G.ら(1975) Nature 256:495-497；Kozbor, D. ら(1
985) Immunol. Methods 81 :31-42；Cote, R.J. ら(1983) Proc. Natl. Acad. S
ci. 80:2026-2030；Cole, S.P. ら(1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120）が含ま
れる。[0126] Monoclonal antibodies to TR2P can be prepared using any technique that provides for the production of antibody molecules by continuous cell lines in culture. Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (Kohler, G. et al. (1975) Nature 256: 495-497; Kozbor, D. et al. 1
985) Immunol. Methods 81: 31-42; Cote, RJ et al. (1983) Proc. Natl. Acad. S
ci. 80: 2026-2030; Cole, SP et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62: 109-120).

【０１２７】 さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を備えた分子を得るために、「キメ
ラ抗体」の産生、ヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングのため
に開発された技術が用いられる（Morrison,S.L.ら(1984)Proc. Natl. Acad. Sci
. 81:6851-6855;Neuberger, M.S. ら(1984)Nature 312:604-608;Takeda, S. ら(
1985)Nature 314:452-454）。或いは、当業者に周知の方法を用いて単鎖の抗体 の生成のための技術を適用して、TR2P-特異的単鎖抗体を作り出すことができる 。関連する特異性を有し、イディオタイプ組成が異なる抗体は、ランダムな組み
合わせの免疫グロブリンライブラリーからの鎖混合(chain shuffling)によって 産生することができる（Burton D.R.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-
3）。In addition, techniques developed for the production of “chimeric antibodies” and for splicing mouse antibody genes to human antibody genes are used to obtain molecules with appropriate antigen specificity and biological activity ( Morrison, SL et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.
81: 6851-6855; Neuberger, MS et al. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda, S. et al.
1985) Nature 314: 452-454). Alternatively, techniques for the production of single-chain antibodies can be applied using methods well known to those skilled in the art to create TR2P-specific single-chain antibodies. Antibodies with related specificities and differing idiotypic compositions can be produced by chain shuffling from random combinations of immunoglobulin libraries (Burton DR (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 11120-
3).

【０１２８】 また文献（Orlandi, R.ら(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837；Wi
nter, G.ら(1991) Nature 349:293-299）に開示されているように、抗体は、免 疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニ
ングすることにより、或いはリンパ球集団でのin vivo産生を誘導することによ り産生することができる。In addition, literature (Orlandi, R. et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833-3837; Wi
Antibodies can be screened through an immunoglobulin library or a panel of highly specific binding reagents, or as disclosed in Nter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299). It can be produced by inducing production in vivo in a population.

【０１２９】 またTR2Pに対する特異的な結合部位を含む抗体フラグメントも作り出すことが
できる。例えば、このような断片には、以下に限定はしないが、抗体分子のペプ
シン消化により生成することができるF(ab’)₂フラグメントや、F(ab’)₂フラグ
メントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるFabフラグ メントが含まれる。或いは、所望の特異性を備えたモノクローナルFabフラグメ ントを迅速かつ容易に識別可能なように、Fab発現ライブラリーを構成しうる（H
use, W.D.ら(1989)Science 254:1275-1281）。[0129] Antibody fragments which contain specific binding sites for TR2P can also be generated. For example, such fragments include, but are not limited to, F (ab ') ₂ fragments that can be generated by pepsin digestion of antibody molecules, and by reducing disulfide bridges in F (ab') ₂ fragments. Includes Fab fragments that can be generated. Alternatively, a Fab expression library can be constructed so that monoclonal Fab fragments with the desired specificity can be quickly and easily identified (H
use, WD et al. (1989) Science 254: 1275-1281).

【０１３０】 種々のイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を識別するためのスクリ
ーニングに用いることができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体のいずれかを用いる、競合的結合アッセイ或いは免疫
放射線測定法の多数のプロトコルが、当技術分野で周知である。このようなイム
ノアッセイには、一般にTR2Pとその特異的な抗体との間の複合体の形成の測定が
含まれる。2つの非干渉TR2Pエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を 用いる二部位のモノクローナル抗体ベースのイムノアッセイ（two sites monocl
onal based immunoassay）が好適であるが、競合的結合アッセイも用いられうる
（Maddox , 前出）。[0130] A variety of immunoassays can be used for screening to identify antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for competitive binding assays or immunoradiometric assays using either monoclonal or polyclonal antibodies with established specificity are well known in the art. Such immunoassays generally involve the measurement of the formation of a complex between TR2P and its specific antibody. A two-site monoclonal antibody-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering TR2P epitopes.
Onal based immunoassays are preferred, but competitive binding assays can also be used (Maddox, supra ).

【０１３１】 本発明の別の実施例では、TR2Pをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片や相補配列を、治療を目的として用いることができる。一態様では、mR
NAの転写を阻害することが望ましい状況において、TR2Pをコードするポリヌクレ
オチドに対する相補配列を用いることができる。詳細には、TR2Pをコードするポ
リヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質転換することができる。従って、TR
2Pの活性を調節する、或いは遺伝子の機能を調節するために、相補的な分子また
は断片を用いることができる。現在このような技術は周知であり、センス又はア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きな断片が、TR2Pをコードする配
列のコード領域や調節領域に従う様々な位置から設計可能である。In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding TR2P, or any fragment or complement thereof, can be used for therapeutic purposes. In one aspect, the mR
In situations where it is desirable to inhibit transcription of NA, a sequence complementary to the polynucleotide encoding TR2P can be used. In particular, cells can be transformed with sequences complementary to a polynucleotide encoding TR2P. Therefore, TR
Complementary molecules or fragments can be used to regulate 2P activity or to regulate gene function. At present, such techniques are well known, and sense or antisense oligonucleotides, or larger fragments, can be designed from various locations according to the coding and regulatory regions of the sequence encoding TR2P.

【０１３２】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルスに由来
する、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の器官、
組織、即ち細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられ得る。当業者に
周知の方法を用いて、TR2Pをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な核
酸配列を発現するベクターを産生することができる。これらの技術は、例えばSa
mbrook（前出）及びAusubel（前出）に記載されている。Expression vectors derived from retroviruses, adenoviruses, herpes or vaccinia viruses, or derived from various bacterial plasmids, can be used to target organs,
It can be used for delivery of nucleotide sequences to a tissue, ie, a group of cells. Vectors expressing a nucleic acid sequence complementary to the polynucleotide of the gene encoding TR2P can be produced using methods well known to those skilled in the art. These technologies are, for example, Sa
mbrook ( supra ) and Ausubel ( supra ).

【０１３３】 TR2Pをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現する発現
ベクターで細胞または組織を形質転換させることによって、TR2Pをコードする遺
伝子を作り出すことができる。このような作製物は、翻訳不能なセンス配列或い
はアンチセンス配列を細胞に導入するために用いることができる。DNAへ組み込 みが存在しない場合でも、このようなベクターは、それらが内在性のヌクレアー
ゼにより無能となるまで、RNA分子を転写し続けうる。一過性の発現は、非複製 ベクターでも1ヶ月以上、適切な複製エレメントがベクター系の一部である場合 にはさらに長い期間持続し得る。A gene encoding TR2P can be created by transforming a cell or tissue with an expression vector that expresses a polynucleotide or fragment thereof that encodes TR2P at high levels. Such constructs can be used to introduce non-translatable sense or antisense sequences into cells. Even in the absence of integration into DNA, such vectors can continue to transcribe RNA molecules until they are disabled by endogenous nucleases. Transient expression can last for a month or more with non-replicating vectors, and even longer if appropriate replication elements are part of the vector system.

【０１３４】 前述のように、TR2Pをコードする遺伝子の制御、5’、即ち調節領域に対する 相補配列、つまりアンチセンス分子（DNA、RNAまたはPNA）を設計することによ って、遺伝子発現の修飾を行なうことができる。転写開始点、例えば開始部位か
ら+10〜-10の位置に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重ら
せん体」塩基対形成方法論を用いて、阻害を達成することができる。ポリメラー
ゼ、転写制御因子、或いは調節分子の結合のために二重らせんが十分にほどける
能力を阻害するので、三重らせん対合は有用である。三重のDNAを用いた最近の 治療の進歩については、文献（Gee, J.E.ら(1994)In: Huber, B.E.及びB.I. Car
r, Molecular and Immunologic Approaches, pp.163-177, Futura Publishing C
o., Mt.Kisco,NY）に記載されている。転写物のリボソームへの結合を阻止する ことによりmRNAの転写を阻害するために、相補的配列、即ちアンチセンス分子を
設計し得る。As mentioned above, the regulation of the gene encoding TR2P, 5 ', ie, the design of a complementary sequence to the regulatory region, ie, an antisense molecule (DNA, RNA or PNA), modifies gene expression. Can be performed. Oligonucleotides derived from the transcription start site, eg, from +10 to -10 from the start site, are preferred. Similarly, inhibition can be achieved using a “triple helix” base-pairing methodology. Triple helix pairing is useful because it inhibits the ability of the double helix to unwind sufficiently for binding of a polymerase, transcription factor, or regulatory molecule. Recent advances in treatment with triple DNA have been described in the literature (Gee, JE et al. (1994) In: Huber, BE and BI Car
r, Molecular and Immunologic Approaches , pp.163-177, Futura Publishing C
o., Mt. Kisco, NY). Complementary sequences, ie, antisense molecules, can be designed to inhibit mRNA transcription by preventing transcript binding to ribosomes.

【０１３５】 リボザイム、酵素RNA分子はRNAの特異的切断を触媒することができる。リボザ
イム作用機構では、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列の特異的ハイブリ ダイゼーションが行われ、その後ヌクレオチド鎖切断が行なわれる。例えば、操
作されたハンマーヘッド(hammerhead)モチーフリボザイム分子は、TR2Pをコード
する配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効果的に触媒し得る。Ribozymes, enzymatic RNA molecules, can catalyze the specific cleavage of RNA. In the mechanism of ribozyme action, specific hybridization of the sequence of the ribozyme molecule to complementary target RNA is performed, followed by nucleotide strand cleavage. For example, engineered hammerhead motif ribozyme molecules can specifically and effectively catalyze nucleotide strand breaks in sequences encoding TR2P.

【０１３６】 任意の潜在的なRNA標的物内の特異的なリボザイム切断部位は、最初、後続す る配列GUA、GUU並びにGUCを含むリボザイム切断部位に対する標的分子を走査す ることによって同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領
域に対応する15〜20個のリボヌクレオチドの間の短いRNA配列は、そのオリゴヌ クレオチドを動作不能(inoperable)とする2次の構造的特徴について評価するこ とができる。また候補の標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用い
、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する接触性(acc
essibility)の検査により評価することができる。[0136] Specific ribozyme cleavage sites within any potential RNA target are first identified by scanning the target molecule for ribozyme cleavage sites that include the following sequences GUA, GUU, and GUC. Once identified, a short RNA sequence between 15 and 20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site may have a secondary structural feature that renders the oligonucleotide inoperable. Can be evaluated. The suitability of the candidate target can also be determined using a ribonuclease protection assay to determine the accessibility to hybridization with complementary oligonucleotides (acc.
essibility) can be evaluated.

【０１３７】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子を合成するのための
当技術分野で周知の方法により作り出すことができる。これらには、固相ホスホ
ラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学的合成のための技術が含
まれる。或いは、RNA分子は、TR2PをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo の転写により作り出すことができる。このようなDNA配列は、T7或いはSP6のよう
な適切なRNAポリメラーゼプロモーターを伴う多様なベクターに取り込むことが できる。或いは、構成的または誘導的に相補的なRNAを合成するこれらのcDNA作 製物は、株化細胞、細胞または組織内に導入することができる。[0137] Complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the present invention can be produced by methods well known in the art for synthesizing nucleic acid molecules. These include techniques for the chemical synthesis of oligonucleotides, such as solid phase phosphoramidite chemical synthesis. Alternatively, RNA molecules can be created by in vitro and in vivo transcription of a DNA sequence encoding TR2P. Such DNA sequences can be incorporated into a variety of vectors with appropriate RNA polymerase promoters, such as T7 or SP6. Alternatively, these cDNA products that synthesize constitutively or inducibly complementary RNA can be introduced into cell lines, cells or tissues.

【０１３８】 細胞内の安定性を高め、また半減期を長くするために、RNA分子は修飾するこ とができる。可能な修飾としては、以下に限定しないが、その分子の5′末端及 び／又は3′末端でのフランキング配列の付加や、分子のバックボーン内におけ るホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート或いは2′O-メチルを 使用を含む。この概念はPNA生成において固有のものであり、内在性エンドヌク レアーゼにより容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及
びウリジンの、アセチル−、メチル−、チオ−、及び類似の修飾形態だけでなく
、イノシン、クエオシン(queosine)、及びワイブトシン(wybutosine)のような従
来よりあまり用いられない塩基を含めることにより、これら全ての分子にに拡張
可能である。[0138] RNA molecules can be modified to increase intracellular stability and half-life. Possible modifications include, but are not limited to, the addition of flanking sequences at the 5 'and / or 3' end of the molecule, phosphorothionate or phosphothioesterase bonds rather than phosphodiesterase linkages in the backbone of the molecule. Including the use of 2'O-methyl. This concept is unique in PNA production, as well as acetyl-, methyl-, thio-, and similar modified forms of adenine, cytidine, guanine, thymine, and uridine that are not readily recognized by endogenous endonucleases. It can be extended to all these molecules by including less commonly used bases such as, inosine, queosine, and wybutosine.

【０１３９】 細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能で、同様
にin vivo、in vitro、及びex vivoでの使用にも適している。ex vivoでの治療 法のに対し、ベクターを患者から採取された幹細胞に導入し、自己移植して同じ
患者に戻すためにクローンとして増殖させることができる。トランスフェクショ
ンによるデリバリー、或いはリポソーム注入またはポリカチオンアミノポリマー
によるデリバリーは、当技術分野でよく知られた方法を用いて実施することがで
きる（Goldman, C.K.ら(1997) Nature Biotechnology 15:462-466）。Many methods are available for introducing vectors into cells or tissues, and are also suitable for use in vivo , in vitro , and ex vivo . For ex vivo treatments, the vector can be introduced into stem cells taken from a patient and propagated as a clone for autologous transplantation and return to the same patient. Delivery by transfection or delivery by liposome injection or polycationic amino polymer can be performed using methods well known in the art (Goldman, CK et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 462-466). .

【０１４０】 前述の治療法は何れも、例えばイヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及
び最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む治療が必要な任意の対象に適用する
ことができる。Any of the above treatments can be applied to any subject in need of treatment, including, for example, dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, and most preferably mammals, such as humans.

【０１４１】 本発明の更なる実施例では、前述の任意の治療効果のために、医薬成分を薬剤
上受け入れられる担体とともに投与する。このような医薬成分は、TR2P、TR2Pの
抗体、TR2Pの擬態(mimetics)、アゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビター
からなるものでありうる。この成分は、単体或いは例えば安定化する配合ような
1以上の他の薬剤とともに、任意の無菌の生体適合性の医薬用担体に投与され、 その担体には、以下に限定しないが、生理食塩水、バッファー食塩水、ブドウ糖
或いは水が含まれる。このような組成物は、単体或いは他の薬剤、ドラッグやホ
ルモンと結合した形で患者に投与されうる。In a further embodiment of the present invention, the pharmaceutical ingredient is administered with a pharmaceutically acceptable carrier for any of the aforementioned therapeutic effects. Such pharmaceutical ingredients may consist of TR2P, antibodies to TR2P, mimetics of TR2P, agonists, antagonists or inhibitors. This component can be used alone or as a stabilizing formulation, for example.
It is administered with one or more other drugs to any sterile, biocompatible pharmaceutical carrier, which includes, but is not limited to, saline, buffered saline, dextrose or water. Such compositions may be administered to the patient alone or in combination with other drugs, drugs or hormones.

【０１４２】 本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路には、以下に限定されないが、経
口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下腔内投与、
脳室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局所的
投与、舌下投与、或いは直腸投与が含まれうる。[0142] The administration route of the pharmaceutical composition used in the present invention is not limited to the following, but may be oral administration, intravenous administration, intramuscular administration, intraarterial administration, intramedullary administration, intrathecal administration,
Intraventricular, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual, or rectal administration may be included.

【０１４３】 活性成分に加えて、これらの医薬成分は、活性化合物を医薬上使用できる製剤
にするための処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含む、適切な医薬上認
められる担体を含みうる。更に、製剤或いは投与に関する技術の詳細は、Reming ton's Pharmaceutical Sciences （Maack Publishing Co., Easton,PA）の最新版
に記載されている。In addition to the active ingredient, these pharmaceutical ingredients will contain suitable pharmaceutically acceptable carriers, including excipients and adjuvants that facilitate the processing of the active compound into pharmaceutically usable formulations. sell. Further details on techniques for formulation or administration can be found in the latest edition of Reming ton's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA).

【０１４４】 経口投与のための医薬成分は、当技術分野でよく知られる医薬上認められる担
体を用いて、経口投与に適当な投与量に配合される。このような担体により、医
薬成分を、患者に摂取させるための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液体剤、
ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等に処方できる。Pharmaceutical ingredients for oral administration are formulated in dosages suitable for oral administration using pharmaceutically acceptable carriers well known in the art. With such a carrier, the pharmaceutical ingredient is made into a tablet, pill, dragee, capsule, liquid, or the like for the patient to take.
It can be formulated into gels, syrups, slurries, suspensions and the like.

【０１４５】 経口投与に用いるための製剤は、活性化合物と固形の賦形剤とを配合すること
によって得られるが、必要に応じて適切な補助剤を添加した後に、また（所望に
より、得られた混合物を粉砕した後に）顆粒の混合物を処理し、錠剤或いは糖衣
丸コア(dragee core)を作ることができる。必要ならば、適切な添加物が加えら れる。適切な医薬品添加物には、ラクトース、スクロース、マンニトール或いは
ソルビトールを含む砂糖のような糖質またはタンパク質賦形剤、トウモロコシ、
コムギ、コメ、ジャガイモ等からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプ
ロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのよう
なセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントゴムのようなゴム、並びにゼラ
チン或いはコラーゲンのようなタンパク質が含まれる。必要ならば、クロスリン
クしたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸
、又はその塩のような、崩壊剤(disintegrating agents)或いは可溶化剤が加え られる。Formulations for use in oral administration can be obtained by mixing the active compound with solid excipients, but if necessary after the addition of suitable adjuvants and (optionally The mixture of granules can be processed to produce tablets or dragee cores (after grinding the resulting mixture). If necessary, appropriate additives are added. Suitable excipients include carbohydrate or protein excipients such as lactose, sucrose, mannitol or sugars including sorbitol, corn,
Starches from wheat, rice, potatoes and the like, cellulose such as methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose or sodium carboxymethylcellulose, gums such as gum arabic or tragacanth, and proteins such as gelatin or collagen. If necessary, disintegrating agents or solubilizing agents are added, such as cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, alginic acid such as sodium alginate, or a salt thereof.

【０１４６】 糖衣丸コアは、濃縮糖液のような適切なコーティングと結合するが、溶液には
アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤(carbopol ge
l)、ポリエチレングリコール及び／又はチタンの二酸化物、ラッカー溶液及び適
切な有機溶剤或いは溶剤の混合物を含みうる。錠剤の識別のため、或いは活性化
合物の量（即ち投与量）を特徴づけるために、染料或いは色素を錠剤或いは糖衣
錠皮に加えることができる。Dragee cores are combined with suitable coatings, such as concentrated sugar solutions, but with solutions containing gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, carbopol gel.
l), polyethylene glycol and / or titanium dioxide, lacquer solutions and suitable organic solvents or solvent mixtures. Dyestuffs or pigments may be added to the tablets or dragees for tablet identification or to characterize the amount of active compound (ie, dosage).

【０１４７】 経口投与できる製剤には、ゼラチンからなるプッシュフィット(push-fit)カプ
セル、ゼラチンからなる柔らかくシールされたカプセル及びグリセロール或いは
ソルビトールのようなコーティングが含まれる。プッシュフィットカプセルは、
ラクトース或いはデンプンのような賦形剤または結合剤、タルク或いはステアリ
ン酸マグネシウムのような潤滑剤、及び所望により安定剤と混合された活性成分
を含みうる。柔らかいカプセルにおいて、活性化合物は、安定剤とともに或いは
安定剤なしに、脂肪性の油、液体、または液状ポリエチレングリコールのような
適切な液体に溶解或いは懸濁される。Formulations that can be administered orally include push-fit capsules made of gelatin, as well as soft, sealed capsules made of gelatin and a coating, such as glycerol or sorbitol. Push-fit capsules
It may contain excipients or binders such as lactose or starch, lubricants such as talc or magnesium stearate, and, if desired, the active ingredient mixed with a stabilizer. In soft capsules, the active compounds are dissolved or suspended in suitable liquids, such as fatty oils, liquids, or liquid polyethylene glycol, with or without stabilizers.

【０１４８】 非経口投与用の製剤は、水溶液中、好適にはハンク溶液(Hanks's solution)、
リンゲル溶液或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合するバッファーの中
で配合することができる。水性の注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロース
ナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘性を高める物
質を含みうる。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製
される。適切な親油性の溶媒或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪性の油や、オ
レイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステル
を含む。また非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、送達のために用いられる。
所望により、懸濁液は化合物の溶解度を増加させて濃縮度の高い溶液の調製を可
能にする適切な安定剤または薬剤を含んでもよい。Formulations for parenteral administration may be prepared in aqueous solution, preferably in Hanks's solution,
It can be formulated in a physiologically compatible buffer such as Ringer's solution or physiological buffered saline. Aqueous injection suspensions may contain substances which increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, or dextran. Additionally, suspensions of the active compounds may be prepared as appropriate oily injection suspensions. Suitable lipophilic solvents or vehicles include fatty oils such as sesame oil and synthetic fatty acid esters such as ethyl oleate, triglycerides or liposomes. Also, non-lipid polycationic amino polymers are used for delivery.
If desired, the suspensions may also contain suitable stabilizers or agents which increase the solubility of the compounds to allow for the preparation of highly concentrated solutions.

【０１４９】 局所または経鼻投与用には、浸透する特定の障壁に対して適切な浸透剤が調合
に用いられる。このような浸透剤は、当技術分野において周知のものである。For topical or nasal administration, penetrants appropriate to the particular barrier to be permeated are used in the formulation. Such penetrants are well-known in the art.

【０１５０】 本発明の医薬組成物は周知の方法、例えば通常の混合処理、溶解処理、顆粒化
処理、糖衣形成処理、湿式粉砕処理(levigating)、乳化処理、カプセル化処理、
エントラップ処理(entrapping)或いは凍結乾燥処理により製造される。The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by a known method, for example, a usual mixing treatment, dissolution treatment, granulation treatment, sugar coating formation treatment, wet grinding treatment (levigating), emulsification treatment, encapsulation treatment,
It is manufactured by entrapping or freeze-drying.

【０１５１】 この医薬組成物は塩類として提供されることもあり、以下に限定しないが、塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む多くの酸とともに
形成することができる。塩は水性或いはプロトニック溶剤において、対応する遊
離塩基形態であるよりも溶解性が高くなる傾向がある。別のケースにおいて、好
適な製剤としては、1mM〜50mMのヒスチジン、0.1%〜2%のショ糖、使用前に緩衝 剤と結合させたpH4.5〜5.5の範囲にある2%〜7%のマンニトールの何れか、或いは
全てを含む凍結乾燥粉末でもよい。The pharmaceutical composition may be provided as salts and may be formed with many acids, including but not limited to hydrochloric, sulfuric, acetic, lactic, tartaric, malic, succinic, and the like. . Salts tend to be more soluble in aqueous or protonic solvents than in the corresponding free base form. In another case, a suitable formulation would be 1 mM to 50 mM histidine, 0.1% to 2% sucrose, 2% to 7% in a pH range 4.5 to 5.5, combined with a buffer prior to use. A lyophilized powder containing any or all of mannitol may be used.

【０１５２】 医薬組成物は、調製された後に適切な容器内に入れられて、示された状態の治
療のためにラベル付けされうる。TR2Pの投与の場合では、このようなラベルには
、投与量、投与頻度、投与方法が表示される。After the pharmaceutical compositions have been prepared, they can be placed in an appropriate container and labeled for treatment of an indicated condition. In the case of TR2P administration, such labels indicate the dosage, frequency of administration, and method of administration.

【０１５３】 本発明において使用するのに適切な医薬組成物は、所望の目的を達成するため
に、活性成分を効果的な量だけ含む成分を含んでいる。有効量の決定は、当業者
の能力の範囲内で十分行うことができる。Pharmaceutical compositions suitable for use in the present invention include those that contain the active ingredient in effective amounts to achieve the desired purpose. Determination of an effective amount can be made well within the capabilities of those skilled in the art.

【０１５４】 任意の化合物の場合、治療に有効な量は、例えば最初は腫瘍性細胞の細胞培養
のアッセイにおいて見積もられ、或いは一般にマウス、ウサギ、イヌ、ブタのよ
うな動物モデルにおいて見積もられる。そこで、このような情報を利用して、ヒ
トにおける有効な量や投与経路を決定することができる。For any compound, the therapeutically effective amount is estimated, for example, initially in cell culture assays of neoplastic cells, or generally in animal models such as mice, rabbits, dogs, pigs. Thus, using such information, an effective amount and administration route in humans can be determined.

【０１５５】 治療的に有効な量とは、例えば、症状や状態を回復させるTR2Pまたはその断片
、TR2Pの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの活性成分の量
である。治療的な効力および毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な
製薬方法により、例えばED50(母集団の50%における治療的な有効投与量）または
LD50(母集団の50%の致死投与量)統計量を計算することによって決定することが できる。毒性と治療的な有効性との間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の 比として表すことができる。医薬組成物は大きな治療指数を示すことが好ましい
。細胞培養のアッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトの使用のための
投与量の範囲をまとめるのに用いることができる。そのような成分の用量は、毒
性少ないか或いは全く毒性がなく、ED50を含む循環する濃度の範囲内にあること
が好ましい。使用する剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じて、投与量はこ
の範囲内で変化する。A therapeutically effective amount is, for example, the amount of an active ingredient of TR2P or a fragment thereof, an antibody, agonist, antagonist or inhibitor of TR2P that ameliorates a symptom or condition. Therapeutic efficacy and toxicity can be determined by standard pharmaceutical methods in cell culture or experimental animals, eg, ED50 (therapeutically effective dose in 50% of the population) or
It can be determined by calculating the LD50 (50% lethal dose of the population) statistic. The dose ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index and it can be expressed as the ratio LD50 / ED50. Preferably, the pharmaceutical composition exhibits a large therapeutic index. The data obtained from cell culture assays and animal studies can be used in formulating a range of dosage for human use. The dosage of such components is preferably within a range of circulating concentrations that include the ED50 with little or no toxicity. Depending on the dosage form employed, the sensitivity of the patient and the route of administration, the dosage will vary within this range.

【０１５６】 正確な用量は、治療が必要な被験者に関連する要因の観点から医師が決定する
。投与及び投薬量は、十分なレベルの活性成分を与える、即ち所定の効果を維持
するために調節される。考慮すべき要因としては、疾病状態の重症度、被験者の
通常の健康、年齢、体重、性別、食餌、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反
応感受性、および治療への耐性／反応が含まれる。長時間作用性の医薬組成物は
３〜４日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の製剤のクリアランス速度に
応じて２週間に１度投与してもよい。The exact dose will be determined by the practitioner, in light of factors related to the subject that requires treatment. Dosage and administration are adjusted to provide sufficient levels of the active ingredient, ie, to maintain the desired effect. Factors to consider include the severity of the disease state, the subject's normal health, age, weight, sex, diet, time and frequency of administration, concomitant medications, response sensitivity, and tolerance / response to treatment . Long acting pharmaceutical compositions may be administered every 3 to 4 days, every week, or once every two weeks depending on half-life and clearance rate of the particular formulation.

【０１５７】 通常の投与量は0.1〜100,000μgの範囲であり、最大約1gの総投与量まで、投 与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは送達の方法のガイダンスは文献に
おいて提供され、通常当技術分野の医師に利用可能である。当業者は、ヌクレオ
チドに対しては、タンパク質やインヒビター用の製剤とは異なる製剤を採用する
ことができる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の
細胞、状態、位置等に対して特異的でありうる。Normal dosage amounts range from 0.1 to 100,000 μg, and vary according to the route of administration, up to a total dose of about 1 g. Guidance on specific dosages or methods of delivery is provided in the literature and is generally available to physicians in the art. One skilled in the art can employ different formulations for nucleotides than for proteins and inhibitors. Similarly, delivery of a polynucleotide or polypeptide can be specific for a particular cell, condition, location, etc.

【０１５８】 診断 別の実施例においては、TR2Pに特異的に結合する抗体を、TR2Pの発現によって
特徴づけられる状態や疾病の診断や、TR2P又はTR2Pのアゴニスト、アンタゴニス
ト、インヒビターで治療を受けている患者のモニタリングのためのアッセイに用
いることができる。診断目的に対し有用な抗体は、前述の治療のためのものと同
様の方法で作製することができる。TR2Pの診断のアッセイには、ヒトの体液、細
胞或いは組織の抽出物においてTR2Pを検出するために抗体および標識を用いる方
法が含まれる。抗体は修飾しても、修飾なしでも用いることができ、また共有結
合或いは非共有結合かのいずれかによりリポーター分子と結合させて標識するこ
とができる。当業者に周知の多様なリポーター分子が用いられ、その幾つかにつ
いては前述の通りである。 Diagnosis In another embodiment, an antibody that specifically binds to TR2P is being diagnosed with a condition or disease characterized by TR2P expression, or is being treated with TR2P or a TR2P agonist, antagonist, or inhibitor. It can be used in assays for patient monitoring. Antibodies useful for diagnostic purposes can be made in a manner similar to that for therapeutics described above. Assays for the diagnosis of TR2P include methods using antibodies and labels to detect TR2P in extracts of human body fluids, cells or tissues. The antibodies can be used with or without modification, and can be labeled by binding, either covalently or non-covalently, to a reporter molecule. A variety of reporter molecules known to those of skill in the art may be used, some of which are described above.

【０１５９】 ELISA、RIA及びFACSを含む、TR2Pを測定するための種々のプロトコルが当技術 分野では周知であり、またこれによりTR2P発現の変化や異常性のレベルを診断す
るための基礎が得られる。TR2Pの発現の正常値、即ち標準値は、複合体形成に適
した条件下で、哺乳類、好ましくはヒトの正常な被験者から得られる体液或いは
細胞抽出物とTR2Pに対する抗体を結合させることによって確立できる。標準の複
合体形成量は、種々の方法、好ましくは測光の手段を用いて定量化できる。被験
者の生検組織からの調節及び疾病サンプルにおいて発現されたTR2Pの量を、標準
値と比較する。標準値と被験者の値との偏差から、疾病診断のためのパラメータ
が確立される。Various protocols for measuring TR2P, including ELISA, RIA and FACS, are well known in the art and provide the basis for diagnosing changes in TR2P expression or levels of abnormalities . Normal, or standard, values for expression of TR2P can be established by combining an antibody against TR2P with a body fluid or cell extract obtained from a normal mammal, preferably a human, under conditions suitable for complex formation. . Standard complex formation can be quantified using various methods, preferably using photometric means. The amount of TR2P expressed in the control and disease samples from the subject's biopsy tissue is compared to a standard value. From the deviation between the standard value and the subject's value, parameters for diagnosing the disease are established.

【０１６０】 本発明の別の実施例において、TR2Pをコードするポリヌクレオチドを、診断目
的で用いることができる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチ
ド配列、相補的RNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチドは 、TR2Pの発現が疾病と関連するような生検組織における遺伝子発現を検出および
定量するために用いられる。診断アッセイは、TR2Pが存在、非存在、過剰発現の
いずれの状態かを識別したり、治療の処置の際にTR2Pレベルの調節をモニタリン
グするために用いることができる。In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding TR2P can be used for diagnostic purposes. Polynucleotides used include oligonucleotide sequences, complementary RNA and DNA molecules, and PNAs. This polynucleotide is used to detect and quantify gene expression in biopsy tissue where expression of TR2P is associated with disease. Diagnostic assays can be used to identify the presence, absence, or overexpression of TR2P and to monitor modulation of TR2P levels during therapeutic treatment.

【０１６１】 一態様では、TR2Pまたは近い関連の分子をコードする、ゲノム配列を含むポリ
ヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブとのハイブリダイゼーションを用い て、TR2Pをコードする核酸配列を同定することができる。そのプローブの特異性
、つまりそのプローブが非常に高度に特異的な領域（例えば、5′調節領域）に 由来するか、或いはより特異性の度合いの低い領域（例えば、特に3′コーディ ング領域）の何れに由来するかによって、またハイブリダイゼーション或いは増
幅（最大の、高い、中程度の或いは低い）の厳密性によって、そのプローブがTR
2Pをコードする自然発生の配列のみを同定するか、或いはアレルや関連する配列
も同定するかということが決定される。In one embodiment, nucleic acid sequences encoding TR2P can be identified using hybridization with a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence, including a genomic sequence, encoding TR2P or a closely related molecule. . The specificity of the probe, that is, the region from which the probe is derived from a very highly specific region (eg, the 5 'regulatory region) or a less specific region (eg, especially the 3' coding region) And the stringency of hybridization or amplification (maximum, high, medium or low),
It is determined whether to identify only the naturally occurring sequence encoding 2P, or to identify alleles and related sequences.

【０１６２】 プローブは関連する配列を検出するためにも用いることができ、また好ましく
はTR2Pをコードする任意の配列からのヌクレオチドを少なくとも50%含むべきで ある。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、DNAやRNAか、またSEQ ID N
O:2、SEQ ID NO:4のヌクレオチド配列に由来するものか、或いは自然発生TR2Pの
イントロン、エンハンサーエレメント、及びプロモータを含むゲノムの配列に由
来するものでもよい。[0162] Probes can also be used to detect related sequences and should preferably contain at least 50% nucleotides from any sequence encoding TR2P. The hybridization probe of the present invention is DNA or RNA, or SEQ ID N
O: 2, may be derived from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, or may be derived from the sequence of the genome including introns, enhancer elements and promoters of naturally occurring TR2P.

【０１６３】 TR2PをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブを作 製するための手段には、mRNAプローブを作り出すために、TR2P又はTR2P誘導体を
コードするポリヌクレオチド配列をベクターにクローンニングする方法がある。
このようなベクターは当業者に周知であり、また市販されており、適切なRNAポ リメラーゼや適切な標識されたヌクレオチドを付加することにより、in vitroで
RNAプローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプ ローブは種々のリポータグループにより標識され、例えば、この標識には、³²P や³⁵Sのような放射性核種によるものや、アビジン／ビオチン結合系を介してプ ローブに結合するアルカリホスファターゼのような酵素による標識等が含まれる
。[0163] Means for creating a hybridization probe specific for DNA encoding TR2P include cloning a polynucleotide sequence encoding TR2P or a TR2P derivative into a vector to create an mRNA probe. There is a way.
Such vectors are well known to those of skill in the art and are commercially available, and can be added in vitro by adding appropriate RNA polymerase or appropriate labeled nucleotides.
It can be used to synthesize RNA probes. Hybridization probes can be labeled with various reporter groups, including, for example, those with radionuclides such as ³² P and ³⁵ S, or alkaline phosphatase that binds to the probe via the avidin / biotin binding system. Such a label with an enzyme is included.

【０１６４】 TR2Pをコードするポリヌクレオチド配列を、TR2Pの発現に関係する疾患の診断
のために用いることができる。そのような疾患の例には、以下に限定はしないが
、軟骨形成不全、キャフィー病、頭蓋骨幹端異形成不全症、大理石骨病、骨粗鬆
症-偽性神経膠腫症候群、骨ページェット病、易捻挫性小人症、及び多骨性溶骨 性異形成症等のような骨形成疾患や、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング
症候群、軟骨形成不全小人症、デュシェンヌ及びベッカー筋ジストロフィー、て
んかん、生殖腺発育異常、WAGR症候群、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異
形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症のような
遺伝性神経障害、甲状腺機能低下症、水頭症、シドナム舞踏病および脳性麻痺の
ような発作障害、二分脊椎、及び先天性緑内障、白内障、又は感音性聴力損失等
のような発生障害や、プロラクチン産生異常、卵管異常・***異常・子宮内膜症
を含む不妊症、発情周期の混乱、月経周期の混乱、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過
刺激症候群、子宮内膜や卵巣の腫瘍、自己免疫異常、異所的妊娠、及び奇形発生
、***の癌、***線維嚢胞病、及び溢乳、***形成の混乱、異常性***生理、精
巣の癌、前立腺の癌、良性の前立腺肥大症、及び前立腺炎、男性の***や女性化
***の癌等のような生殖障害や、AIDS、アジソン病、成人呼吸困難症候群、アレ
ルギー、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病
、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、
萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風、グレーブス病、過剰好酸球増加症、被刺激性の
腸シンドローム、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または
心臓周囲の炎症、骨関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、関節リウマチ、強皮
症、シェーグレーン症候群、ウェルナー症候群、自己免疫性の甲状腺炎、癌・血
液透析・体外循環の合併症、潰瘍性・細菌性・真菌・寄生虫・原生動物・寄生虫
様の感染症、及び心的外傷等のような免疫疾患や、腺癌、白血病、リンパ腫、黒
色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫、並びに特に、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、***
、頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲
状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌
等のような腫瘍性疾患が含まれる。TR2Pをコードするポリヌクレオチド配列を、
患者の生検組織や体液を利用するサザンブロットまたはノーザン分析、ドットブ
ロット法或いは他の膜ベース(membrane-based)技術や、PCR技術や、ディップス ティック試験法(dipstick)、ピン、ELISAアッセイまたはマイクロアレイにおい て用いて、TR2P発現の変化を検出することができる。このような定性的または定
量的試験法は当業者に周知のものである。A polynucleotide sequence encoding TR2P can be used for diagnosis of a disease associated with TR2P expression. Examples of such diseases include, but are not limited to, chondrodysplasia, Cuffy's disease, skull metaphyseal dysplasia, osteopetrosis, osteoporosis-pseudoglioma syndrome, bone Paget's disease, Osteogenic diseases such as sprained dwarfism and polyosteolytic dysplasia, tubular acidosis, anemia, Cushing's syndrome, chondrodysplasia dwarfism, Duchenne and Becker muscular dystrophy, epilepsy, gonads Hereditary neuropathy such as abnormal development, WAGR syndrome, myelodysplastic syndrome, hereditary mucosal epithelial dysplasia, hereditary keratosis, Charcot-Marie-Tooth disease and neurofibromatosis, hypothyroidism, hydrocephalus Seizure disorders such as Syndham's chorea and cerebral palsy, developmental disorders such as spina bifida and congenital glaucoma, cataract, or sensorineural hearing loss, abnormal prolactin production, fallopian tubes・ Infertility including ovulation abnormality ・ Infertility including endometriosis, disruption of the estrous cycle, disruption of the menstrual cycle, polycystic ovary syndrome, ovarian hyperstimulation syndrome, tumor of the endometrium and ovaries, abnormal autoimmunity, ectopic pregnancy And teratogenesis, breast cancer, fibrocystic breast disease, and hypertrophy, disrupted spermatogenesis, abnormal sperm physiology, testicular cancer, prostate cancer, benign prostatic hyperplasia, and prostatitis, male breasts and women Reproductive disorders such as cancer of the breast, AIDS, Addison's disease, adult respiratory distress syndrome, allergy, anemia, asthma, atherosclerosis, bronchitis, cholecystitis, Crohn's disease, ulcerative colitis, atopic Dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, erythema nodosum,
Atrophic gastritis, glomerulonephritis, gout, Graves' disease, hypereosinophilia, irritable intestinal syndrome, lupus erythematosus, multiple sclerosis, myasthenia gravis, inflammation of the myocardium or around the heart, osteoarthritis, osteoporosis , Pancreatitis, polymyositis, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, Werner's syndrome, autoimmune thyroiditis, cancer, hemodialysis, extracorporeal circulation complications, ulcer, bacterial, fungal, parasite, Immune diseases such as protozoan / parasite-like infections and trauma, adenocarcinoma, leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, teratocarcinoma, and especially adrenal gland, bladder, bone, bone marrow , Brain, breast, neck, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, and uterus Neoplastic diseases such as cancer It is included. A polynucleotide sequence encoding TR2P,
Southern blot or northern analysis using patient biopsies or body fluids, dot blot or other membrane-based techniques, PCR techniques, dipsticks, pins, ELISA assays or microarrays In this manner, changes in TR2P expression can be detected. Such qualitative or quantitative test methods are well known to those skilled in the art.

【０１６５】 特定の態様では、特に上述のような関連する疾患の存在を検出するアッセイに
おいて、TR2Pをコードするヌクレオチド配列は有用であり得る。TR2Pをコードす
るヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識され、またハイブリダイゼーション
複合体の形成に適した条件下で、患者からの体液や組織サンプルに加えることが
できる。適当なインキュベーション期間の後、そのサンプルは洗浄され、シグナ
ルが定量されて標準値と比較される。患者のサンプルにおけるシグナルの量が、
比較できる対照サンプルから有意に変化している場合、そのヌクレオチド配列は
サンプルのヌクレオチド配列とハイブリダイズしており、またサンプルのなかの
TR2Pをコードするヌクレオチド配列のレベルの変化するということは、関連する
疾患の存在を示している。また、このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床
試験、または個々の患者の治療のモニタリングにおける特定の治療学的な処置法
の有効性を評価することもできる。In certain embodiments, the nucleotide sequence encoding TR2P may be useful, particularly in assays that detect the presence of a related disease as described above. The nucleotide sequence encoding TR2P can be labeled by standard methods and added to a body fluid or tissue sample from a patient under conditions suitable for forming a hybridization complex. After an appropriate incubation period, the sample is washed and the signal is quantified and compared to a standard value. If the amount of signal in the patient sample is
If there is a significant change from a comparable control sample, the nucleotide sequence has hybridized to the nucleotide sequence of the sample and
Altered levels of the nucleotide sequence encoding TR2P indicate the presence of a related disease. Such assays can also be used to evaluate the effectiveness of a particular therapeutic treatment in animal studies, clinical trials, or monitoring the treatment of an individual patient.

【０１６６】 TR2Pの発現に関連する疾病の診断のための基礎を提供するために、正常な、即
ち標準の発現のプロフィールを確立する。これは、ハイブリダイゼーション或い
は増幅に適した条件下で、動物またはヒト何れかの正常な被験者から採取された
体液或いは細胞抽出物を、TR2Pをコードする配列又はその断片と結合させること
により達成される。標準のハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得られ
る値と、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験から
得られる値とを比較することにより定量しうる。正常なサンプルから得られた標
準値は、疾病の徴候がある患者のサンプルから得られる値と比較することができ
る。標準値からの偏差を用いて疾病の存在を証明する。To provide a basis for the diagnosis of diseases associated with TR2P expression, a normal, ie, standard, expression profile is established. This is achieved by combining a body fluid or cell extract taken from a normal subject, either an animal or a human, with the sequence encoding TR2P or a fragment thereof under conditions suitable for hybridization or amplification. . Standard hybridization can be quantified by comparing the value obtained from a normal subject to a value obtained from an experiment in which a known amount of a substantially purified polynucleotide is used. Standard values obtained from a normal sample can be compared to values obtained from a sample of a patient with signs of disease. Deviation from standard values is used to prove the presence of the disease.

【０１６７】 一旦疾患の存在が確認され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼ
ーションアッセイが定期的に繰り返され、患者の発現のレベルが正常な患者にお
いて観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価することができる。連続的な
アッセイから得られる結果を用いて、数日から数ヶ月にわたる治療の効果を示す
ことができる。Once the presence of the disease has been confirmed and the treatment protocol initiated, the hybridization assay is repeated periodically to determine whether the level of expression in the patient has begun to approach the level observed in normal patients. Can be evaluated. The results from successive assays can be used to show the efficacy of treatment over days to months.

【０１６８】 癌に関しては、個体からの生検組織における比較的多量の転写物の存在が、疾
病の発生の素因を示し、つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出するた
めの手段となり得る。このタイプのより決定的な診断により、健康の専門家が予
防的処置を講じたり、より早期に積極的な治療を行なうことが可能となり、故に
癌の発生や更なる進行を予防することができる。For cancer, the presence of relatively high amounts of transcripts in biopsy tissue from an individual indicates a predisposition to the development of the disease, ie, a means for detecting the disease before actual clinical symptoms appear. obtain. This type of more conclusive diagnosis allows health professionals to take preventive measures and provide more aggressive treatment earlier, and thus prevent the development and further progression of cancer .

【０１６９】 TR2Pをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの付加的な診断のた
めの使用法には、PCR法の利用が含まれる。これらのオリゴマーは化学的に合成 され、酵素を用いて作製され、またはin vitroで作製されてもよい。オリゴマー
は、好ましくはTR2Pをコードするポリヌクレオチドの断片、またはTR2Pをコード
するポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、特定の遺伝子
或いは状態を識別するための最適化された条件の下で用いられる。また深く関わ
るDNAまたはRNA配列の検出及び／又は定量のために、オリゴマーは緩やかな厳密
性の条件で用いることができる。[0169] Additional diagnostic uses for oligonucleotides designed from sequences encoding TR2P include the use of PCR. These oligomers may be chemically synthesized, made using enzymes, or made in vitro . The oligomer preferably comprises a fragment of a polynucleotide encoding TR2P, or a fragment of a polynucleotide complementary to a polynucleotide encoding TR2P, under optimized conditions to identify a particular gene or condition. Used. Oligomers can also be used under mild stringency conditions for the detection and / or quantification of deeply involved DNA or RNA sequences.

【０１７０】 またTR2P発現を定量するために用いられる方法には、放射標識或いはビオチン
化したヌクレオチドの利用、対照核酸の同時増幅(coamplification)の利用、及 び標準の検量線で補間する実験結果の利用が含まれる（Melby, P.C.ら(1993) J.
Immunol. Methods, 159:235-244；Duplaa, C. ら(1993) Anal. Biochem. 229-2
36）。多数のサンプルの定量の速度は、目的のオリゴマーが様々な希釈溶液中に
存在し、分光光度法または比色定量応答により迅速に定量するELISA形式におい てアッセイを実施することによって加速することができる。Methods used to quantify TR2P expression also include the use of radiolabeled or biotinylated nucleotides, the use of co-amplification of control nucleic acids, and the use of experimental results interpolated with a standard calibration curve. Use (Melby, PC et al. (1993) J.
Immunol. Methods, 159: 235-244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 229-2.
36). The rate of quantification of large numbers of samples can be accelerated by performing the assay in an ELISA format where the oligomer of interest is present in various dilute solutions and is quickly quantified by spectrophotometric or colorimetric response. .

【０１７１】 別の実施例においては、ここに開示した任意のポリヌクレオチド配列に由来す
るオリゴヌクレオチド又はより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いることができる。マイクロアレイを用いて、同時に多くの遺伝子の発現レベ
ルをモニタし（転写物イメージを生成する）、また遺伝子の変異配列、変異及び
多形性を同定することができる。この情報は、遺伝子機能の決定、疾病の遺伝的
基礎の理解、疾病の診断、並びに治療薬の開発およびその活性のモニタリングに
おいて有用である。In another embodiment, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences disclosed herein can be used as targets in a microarray. Microarrays can be used to simultaneously monitor the expression levels of many genes (generate transcript images) and identify mutated sequences, mutations and polymorphisms in genes. This information is useful in determining gene function, understanding the genetic basis of disease, diagnosing disease, and developing therapeutics and monitoring their activity.

【０１７２】 一実施例においては、PCT出願WO95/11995（Cheeら）、Lockhart, D. J. ら （
1996; Nat.Biotech. 14: 1675-1680）及びSchena, M.ら（1996; Proc. Natl. Ac
ad. Sci. 93: 10614-10619）に記載のような当業者に周知の方法に従いマイクロ
アレイを準備して利用する。これらの文献はここで言及することにより本明細書
の一部とする。In one embodiment, PCT applications WO 95/11995 (Chee et al.), Lockhart, DJ et al.
1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680) and Schena, M. et al. (1996; Proc. Natl. Ac).
ad. Sci. 93: 10614-10619). These documents are hereby incorporated by reference.

【０１７３】 マイクロアレイは、固形支持体に固定された、一般に合成アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドまたはcDNAの断片の何れかの、数多くの独特の1本鎖の核酸配列か ら好ましくは構成される。そのオリゴヌクレオチドは、好ましくは約6〜60個の ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約15〜30個のヌクレオチドの長さ、最も好
ましくは約20〜25個のヌクレオチドの長さをなす。マイクロアレイの一定のタイ
プに対しては、約7〜10個のヌクレオチドの長さしかないオリゴヌクレオチドを 用いるのが好ましいことがあり得る。マイクロアレイは、既知の5’又は3’配列
をカバーするオリゴヌクレオチドや、完全長配列をカバーする連続的なオリゴヌ
クレオチドや、或いは配列の長さに沿った特定の領域から選択された独特のオリ
ゴヌクレオチドを含み得る。マイクロアレイで用いられるポリヌクレオチドは、
少なくとも配列の断片が既知である目的の遺伝子又は遺伝子群に特異的なオリゴ
ヌクレオチドか、特定の細胞または組織のタイプ、または正常、発生的若しくは
疾患状態に対して共通な１またはそれ以上の未同定のcDNAに特異的なオリゴヌク
レオチドであり得る。所定の状況においては、マイクロアレイにおいて対をなす
オリゴヌクレオチドを用いることが適当である。その対は、配列の中央に好まし
くは位置する1つのヌクレオチドを除けば、同一のものである。その対における 第2のオリゴヌクレオチド（１つのヌクレオチドは一致していない）は、調節に 役立つ。対をなすオリゴヌクレオチドの数は、約2〜1,000,000の範囲である。Microarrays are preferably composed of a number of unique single-stranded nucleic acid sequences, generally either synthetic antisense oligonucleotides or fragments of cDNA, immobilized on a solid support. The oligonucleotide is preferably about 6 to 60 nucleotides in length, more preferably about 15 to 30 nucleotides in length, and most preferably about 20 to 25 nucleotides in length. For certain types of microarrays, it may be preferable to use oligonucleotides that are only about 7-10 nucleotides in length. Microarrays are oligonucleotides that cover known 5 'or 3' sequences, contiguous oligonucleotides that cover the full-length sequence, or unique oligonucleotides selected from specific regions along the length of the sequence May be included. The polynucleotide used in the microarray is
Oligonucleotides specific for the gene or genes of interest for which at least a fragment of the sequence is known, or one or more unidentified common to a particular cell or tissue type or normal, developmental or disease state May be an oligonucleotide specific to the cDNA of In certain situations, it is appropriate to use paired oligonucleotides in a microarray. The pairs are identical except for one nucleotide, which is preferably located in the middle of the sequence. The second oligonucleotide in the pair (one nucleotide does not match) serves for regulation. The number of paired oligonucleotides ranges from about 2 to 1,000,000.

【０１７４】 マイクロアレイのための既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを作製するた
めに、コンピュータアルゴリズムを用いて、ヌクレオチド配列の5’またはより 好ましくは3’末端から始めて、目的の遺伝子を調査する。このアルゴリズムに より、その遺伝子に独特な、ハイブリダイゼーションに適した範囲のGC含量を有
する、ハイブリダイゼーションを妨げうる予想された二次構造のない、限定され
た長さのオリゴマーを同定する。ある局面においては、オリゴマーは、光照射(l
ight-directed)化学プロセスを用いて、基板上の指定された領域において合成さ
れる。その基板は、紙、ナイロン、又は他のタイプのメンブラン、フィルタ、チ
ップ、スライドガラス、又は他の適切な任意の固形支持体であり得る。To generate oligonucleotides against known sequences for a microarray, a computer algorithm is used to interrogate the gene of interest starting at the 5 'or more preferably the 3' end of the nucleotide sequence. This algorithm identifies oligomers of limited length, having a GC content in the range appropriate for hybridization, unique to the gene, without the expected secondary structure that could interfere with hybridization. In one aspect, the oligomer is exposed to light (l
It is synthesized in designated areas on the substrate using a ight-directed) chemical process. The substrate can be a paper, nylon, or other type of membrane, filter, chip, glass slide, or any other suitable solid support.

【０１７５】 別の局面では、オリゴヌクレオチドを基板表面上で、PCT出願WO95/251116 （B
aldeschweilerら）に記載のような化学結合プロシージャ及びインクジェット装 置を用いて合成することができる。前記PCT出願はここで言及することにより本 明細書の一部とする。また別の局面では、ドットブロット又はスロットブロット
（HYBRIDOT^ョ apparatus, IBCO/BRL）に類似のグリッドアレイを用い、真空シス テム、熱、UV、機械的又は化学的結合プロシージャを利用してcDNA断片又はオリ
ゴヌクレオチドを基板の表面に対して配置及び結合することができる。更に別の
態様では、アレイは、手作業或いは市販の装置で、材料、及び機械（Brinkmann^ョ マルチチャネルピペッターまたはロボット装置を含む）を用いることにより製
作することができ、また市販の器具を効果的に使用できる8、24、96、384、1536、又 は6144個のオリゴヌクレオチド、或いは2個から100万個の範囲の任意の数のオリ
ゴヌクレオチドを含み得る。In another aspect, oligonucleotides are deposited on a substrate surface in PCT application WO 95/251116 (B
aldeschweiler et al.) and can be synthesized using a chemical bonding procedure and an ink jet device. The PCT application is incorporated herein by reference. In another aspect, dot blot or slot blot (HYBRIDOT ^® apparatus, IBCO / BRL) using similar grid array, a vacuum system, thermal, UV, cDNA fragments or by using a mechanical or chemical bond Procedure Oligonucleotides can be placed and bound to the surface of the substrate. In yet another embodiment, the array manually or by commercially available equipment, materials, and mechanical (Brinkmann ^® including multichannel pipettor or robotic device) can be manufactured by using, also effective commercial instrument 8, 24, 96, 384, 1536, or 6144 oligonucleotides or any number of oligonucleotides in the range of 2 to 1 million that can be used.

【０１７６】 マイクロアレイを用いてサンプル解析を実施するために、ポリヌクレオチドが
生物学的サンプルから抽出される。生物学的サンプルは、任意の体液（血液、尿
、唾液、痰、胃液など）、培養細胞、生検材料、または他の組織標本から得られ
る。プローブを作製するために、サンプルから抽出されたポリヌクレオチドは、
マイクロアレイ上の核酸と相補的な核酸配列を作るのに用いられる。マイクロア
レイがcDNAからなる場合、アンチセンスRNA（aRNA）がプローブに適している。 従って、ある局面においては、mRNAを用いてcDNAを生成し、次に蛍光性ヌクレオ
チドの存在下において、cDNA用いてフラグメントまたはオリゴヌクレオチドaRNA
プローブを作製する。これらの蛍光性に標識されたプローブをマイクロアレイと
共にインキュベートし、プローブ配列がマイクロアレイのcDNAオリゴヌクレオチ
ドとハイブリダイズすようにする。別の態様では、プローブとして用いられる核
酸配列には、ハイブリダイズ技術として当業者に周知の制限酵素、PCR技術およ びオリゴラべリング(Oligolabeling)またはTransProbe kits (Pharmacia & Upjo
hn)を用いて作り出されたポリヌクレオチド、断片、および相補的配列もしくは アンチセンス配列が含まれる。To perform sample analysis using a microarray, polynucleotides are extracted from a biological sample. Biological samples can be obtained from any bodily fluid (blood, urine, saliva, sputum, gastric juice, etc.), cultured cells, biopsies, or other tissue specimens. To make a probe, a polynucleotide extracted from a sample is:
Used to create nucleic acid sequences that are complementary to nucleic acids on a microarray. If the microarray consists of cDNA, antisense RNA (aRNA) is suitable for the probe. Thus, in one aspect, mRNA is used to generate cDNA and then, in the presence of fluorescent nucleotides, using cDNA to generate fragments or oligonucleotides aRNA.
Make a probe. These fluorescently labeled probes are incubated with the microarray such that the probe sequences hybridize to the microarray cDNA oligonucleotides. In another embodiment, nucleic acid sequences used as probes include restriction enzymes, PCR techniques and oligolabeling or TransProbe kits (Pharmacia & Upjo
hn), including polynucleotides, fragments, and complementary or antisense sequences.

【０１７７】 インキュベーションの条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相補的一致を
伴い起こるか、或いはより低い相補性の種々のレベルで起こるように調節される
。ハイブリダイズしていないプローブを取り除いた後、スキャナーを用いて、蛍
光のレベル及びパターンを決定する。マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド
配列の相補性の程度及び相対的な量を決定するために、スキャンされたイメージ
を調べる。検出システムを用いて、全ての個別の配列に対して同時にハイブリダ
イゼーションの非存在、存在、及び量を測定することができる。このデータは、
サンプル中の配列、突然変異、変異体、又は多形体におけるラージスケールの相
関性の研究、または機能分析のために用いることができる（Heller. R.A.ら (19
97) Proc.Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155.）。Incubation conditions are adjusted so that hybridization occurs with precise complementarity or with varying levels of lower complementarity. After removing the unhybridized probe, the level and pattern of fluorescence are determined using a scanner. The scanned images are examined to determine the degree of complementarity and the relative amount of each oligonucleotide sequence on the microarray. The detection system can be used to determine the absence, presence, and amount of hybridization for all individual sequences simultaneously. This data is
It can be used to study large-scale correlations of sequences, mutations, variants, or polymorphisms in a sample, or for functional analysis (Heller. RA et al. (19)
97) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2150-2155.).

【０１７８】 本発明の別の実施例においては、TR2Pをコードする核酸配列を用いて、自然発
生のゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブ
を作り出すこともできる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の領域、又
は人工染色体作製物にマッピングすることができ、その人工染色体作製物には、
Price, C.M. の文献（1993；Blood Rev. 7:127-134） 及びTrask, B.J. の文献 （1991；Trends Genet. 7:149-154）に記載のように、ヒト人工染色体（HACs） 、酵母菌人工染色体（YACs）、細菌人工染色体（BACs）、細菌性P1作製物又は1 本鎖染色体cDNAライブラリーがある。In another embodiment of the present invention, a nucleic acid sequence encoding TR2P may be used to generate hybridization probes useful for mapping naturally occurring genomic sequences. This sequence can be mapped to a particular chromosome, a particular region of the chromosome, or an artificial chromosome product, wherein the artificial chromosome product comprises:
As described in Price, CM (1993; Blood Rev. 7: 127-134) and Trask, BJ (1991; Trends Genet. 7: 149-154), human artificial chromosomes (HACs), yeast There are artificial chromosomes (YACs), bacterial artificial chromosomes (BACs), bacterial P1 products or single-stranded chromosomal cDNA libraries.

【０１７９】 蛍光性インサイチューハイブリダイゼーション（FISH. 、Heinz-Ulrichら (19
95) in Meyers, R.A. (ed.) Molecular Biology and Biotechnology, pp. 965-9
68, VCH Publishers New York, NY.に記載）は、他の物理的な染色体マッピング
技術及び遺伝地図データと関連し得る。遺伝地図データの例は、種々の科学誌、
またはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）部位に見られる。物理的 な染色体地図上のTR2Pをコードする配列の位置および特定の疾病、もしくは特定
の疾病の素因との関連性の助けにより、疾患に関係するDNAの領域の範囲を定め ることができる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者とキャリア、即ち
発症した個体との遺伝子配列の違いを検出することができる。Fluorescent in situ hybridization (FISH., Heinz-Ulrich et al. (19
95) in Meyers, RA (ed.) Molecular Biology and Biotechnology , pp. 965-9
68, described in VCH Publishers New York, NY.) May be associated with other physical chromosome mapping techniques and genetic map data. Examples of genetic map data include various scientific journals,
Or found in the Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) site. With the help of the location of the TR2P-encoding sequence on the physical chromosomal map and its association with a particular disease, or with a predisposition to a particular disease, regions of the DNA associated with the disease can be demarcated. By using the nucleotide sequence of the present invention, it is possible to detect a difference in gene sequence between a normal person and a carrier, that is, an affected individual.

【０１８０】 遺伝地図を広げるために、染色体作製物のin situハイブリダイゼーション及 び確立された染色体マーカーを用いる連鎖解析のような物理的なマッピング技術
を用いることができる。場合によっては、特定のヒト染色体の数やアームが未知
であっても、マウスのような別の哺乳類の染色体上の遺伝子配置によって関連す
るマーカーが明らかになる。物理的なマッピングによって、新たな配列を染色体
のアーム、或いはその一部へ割当てることができる。これにより、位置クローニ
ングまたは別の遺伝子発見技術を用いて、疾病遺伝子を検索する研究者に価値あ
る情報を提供できる。ひとたび疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えば
AT to 11q22-23（Gatti, R.A.ら（1988）Nature 336:577-580）への遺伝連鎖に よって不完全な局所化がなされると、その領域にマッピングされる任意の配列は
、さらなる研究のための関連する遺伝子または調節遺伝子を表し得る。また、本
発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者の染色体の位置と、キャリア、即ち発
症した個体の、転座、逆位等によって生じた染色体の位置との違いを検出するこ
ともできる。To expand the genetic map, physical mapping techniques such as in situ hybridization of chromosomal constructs and linkage analysis using established chromosomal markers can be used. In some cases, even though the number or arm of a particular human chromosome is unknown, the placement of genes on the chromosome of another mammal, such as a mouse, reveals relevant markers. New sequences can be assigned to chromosomal arms, or parts thereof, by physical mapping. This can provide valuable information to researchers searching for disease genes using positional cloning or other gene discovery techniques. Once a disease or syndrome has a specific genomic region, for example,
When incomplete localization is achieved by genetic linkage to AT to 11q22-23 (Gatti, RA et al. (1988) Nature 336: 577-580), any sequences that map to that region may be further studied. Related genes or regulatory genes. Further, using the nucleotide sequence of the present invention, it is also possible to detect a difference between the position of a chromosome of a normal person and the position of a chromosome caused by translocation, inversion, or the like of a carrier, that is, an affected individual.

【０１８１】 本発明の別の実施例においては、TR2Pや、その触媒作用性または免疫原性断片
、即ちそれらのオリゴペプチドを、種々の薬剤スクリーニング技術における化合
物のライブラリーのスクリーニングのために用いることができる。そのようなス
クリーニングにおいて用いられる断片は、溶液中で遊離しているか、固体支持体
へ付着しているか、細胞表面へ付着しているか、或いは細胞内に位置しているも
のでありうる。TR2Pと検定する薬剤との結合複合体の形成を測定することができ
る。In another embodiment of the present invention, the use of TR2P or its catalytic or immunogenic fragments, ie, oligopeptides thereof, for screening libraries of compounds in various drug screening techniques. Can be. The fragments used in such a screen can be free in solution, attached to a solid support, attached to a cell surface, or located intracellularly. The formation of a binding complex between TR2P and the agent to be assayed can be measured.

【０１８２】 用いることのできる別の薬物スクリーニング技術として、公開されたPCT出願W
O84/03564（Geysenら）に記載のような、目的のタンパク質に対する適切な結合 親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングが提供される。この方法
において、多くの異なる小形の試験化合物が、プラスチックピン或いは別の表面
のような固体基質において合成される。試験化合物をTR2P又はその断片と反応さ
せ、そして洗浄する。次に、当技術分野で周知の方法で結合TR2Pを検出する。ま
た、前述の薬剤スクリーニング技術において使用するために、精製されたTR2Pを
プレート上に直接コーティングすることもできる。或いは、非中和性抗体を用い
て、ペプチドを捕捉して固体支持体上に固定することができる。As another drug screening technique that can be used, the published PCT application W
High throughput screening is provided for compounds with appropriate binding affinity for the protein of interest, as described in O84 / 03564 (Geysen et al.). In this method, many different miniature test compounds are synthesized on a solid substrate such as a plastic pin or another surface. The test compound is reacted with TR2P or a fragment thereof and washed. Next, bound TR2P is detected by methods well known in the art. Also, purified TR2P can be directly coated on a plate for use in the aforementioned drug screening techniques. Alternatively, the peptide can be captured and immobilized on a solid support using a non-neutralizing antibody.

【０１８３】 別の実施例においては、TR2P結合のためにTR2Pと結合可能な中和抗体が試験化
合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを用いることができ
る。この方法において、抗体を用いて、1またはそれ以上の抗原決定基をTR2Pと 共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。In another example, a competitive drug screening assay can be used in which neutralizing antibodies capable of binding TR2P specifically compete with the test compound for TR2P binding. In this way, antibodies can be used to detect the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with TR2P.

【０１８４】 さらに別の実施例においては、その新技術が、以下に限らないが、トリプレッ
ト遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用のようなものを含む特性の現在周知のヌ
クレオチド配列の特性に基づくものであれば、TR2Pをコードするヌクレオチド配
列を、未だ開発されていない分子生物学的技術に用いることができる。In yet another embodiment, the new technology is based on the properties of currently known nucleotide sequences, including but not limited to those such as the triplet genetic code and specific base pairing interactions. If so, the nucleotide sequence encoding TR2P can be used for molecular biology techniques that have not yet been developed.

【０１８５】 以下に示す実施例は本発明の例示であって、本発明を限定しようとするもので
はない。The following examples are illustrative of the present invention and are not intended to limit the present invention.

【０１８６】[0186]

【実施例】【Example】

１ SPLNNOT04 cDNAライブラリーの作製 SPLNNOT04 SPLNNOT04 cDNAライブラリーは、脳無酸素症で死亡した2歳のスペイン人の男 児から得られた正常な脾臓の微視的組織から作製された（specimen #RU95-09-06
64; International Institute for the Advancement of Medicine,Exton,PA）。
患者の血清学および過去の病歴には注目すべきものはなかった。 1. Preparation of SPLNNOT04 cDNA Library The SPLNNOT04 SPLNNOT04 cDNA library was prepared from normal spleen microscopic tissue obtained from a 2-year-old Spanish boy who died of cerebral anoxia (specimen # RU95- 09-06
64; International Institute for the Advancement of Medicine, Exton, PA).
There were no notable serologic and past medical histories of the patients.

【０１８７】 グアニジニウムイソチオシアネート溶液中で凍結組織をBrinkmann Homogenize
r Polytron PT-3000（Brinkmann Instruments,Westbury,NJ）を用いて均質化お よび溶解した。溶解産物は、Beckman L8-70M超遠心機のBeckman SW28ローター（
Beckman Instruments）を用いて、室温において25,000rpmで18時間、5.7MのCsCl
クッションで遠心分離した。RNAを酸性フェノール（pH4.7）で抽出し、0.3Mの酢
酸ナトリウム及び2.5倍量のエタノールを用いて沈殿させ、RNAseフリーの水に再
懸濁させ、37℃においてDNaseで処理した。前述のようにRNAを抽出し、沈殿させ
た。mRNAをQiagen Oligotex kit（QIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA）を用いて単離し
てSPLNNOT04 cDNAライブラリーの作製に使用した。[0187] Frozen tissue is Brinkmann Homogenize in guanidinium isothiocyanate solution.
r Homogenized and dissolved using Polytron PT-3000 (Brinkmann Instruments, Westbury, NJ). The lysate was transferred to the Beckman SW28 rotor (Beckman L8-70M ultracentrifuge).
Beckman Instruments) at room temperature for 18 hours at 25,000 rpm, 5.7 M CsCl
Centrifuge on cushion. RNA was extracted with acidic phenol (pH 4.7), precipitated using 0.3 M sodium acetate and 2.5 volumes of ethanol, resuspended in RNAse-free water, and treated with DNase at 37 ° C. RNA was extracted and precipitated as described above. mRNA was isolated using a Qiagen Oligotex kit (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA) and used to construct the SPLNNOT04 cDNA library.

【０１８８】 KIDNTUT13 KIDNTUT13 cDNAライブラリーは、腎尿管切除の際に51歳の白人女性から得られ
た左の腎臓の上側の極の組織から作製された。左の腎臓の病理報告は、グレード
3の腎臓明細胞癌が、莢膜(capsule)に対して付着性である出血性および嚢胞性の
上側の極の塊(upper pole mass)を形成していることを示している。腎静脈には 腫瘍がなかった。非腫瘍性腎臓の実質組織および副腎には注目すべきものはなか
った。尿管の縁は腫瘍に対して陰性であった。患者は背部痛を呈していた。患者
の病歴には、抑うつ障害、パニックを伴う広場恐怖、低血糖、機能性下痢、嚥下
障害、複数の関節における関節痛、子宮内膜症、正常分娩、成人***症候群が含
まれていた。既往手術には、全体の腹式子宮切除およびアデノイド口蓋扁桃摘出
が含まれていた。患者の投薬には、トリアムテレン、プロプラノロール ハイド ロクロライド、Prilosec^ョ （オメプラゾール; Astra/Merck Group,Wayne,PA）、 ビタミンE、C及びβカロチン、Questran^ョ Light（Cholestyramine for Oral Sus pension; Bristol-Myers Squibb Company,Princeton,NJ）、Trazadone Hydrochl
oride、プロテインサプリメントが含まれる。家族歴には、祖父（母）のタイプI
I糖尿病、悪性の結腸腫瘍、良性の高血圧症、父親の不安状態および開胸冠動脈 血管形成、並びに母親、父親、同胞の腎臓結石が含まれる。KIDNTUT13 The KIDNTUT13 cDNA library was generated from the upper polar tissue of the left kidney obtained from a 51 year old Caucasian woman during nephroureterectomy. Left kidney pathology report grade
Three renal clear cell carcinomas have been shown to form a hemorrhagic and cystic upper pole mass that is adherent to the capsule. There were no tumors in the renal vein. None of the parenchyma and non-neoplastic kidney tissue was remarkable. The ureteral margin was negative for the tumor. The patient had back pain. The patient's medical history included depressive disorder, agoraphobia with panic, hypoglycemia, functional diarrhea, dysphagia, joint pain in multiple joints, endometriosis, normal labor, and adult abuse syndrome. Previous surgery included a total abdominal hysterectomy and adenoid palatine tonsillectomy. Dosage patients, triamterene, propranolol Hyde Rokuroraido, Prilosec ^® (omeprazole; Astra / Merck Group, Wayne, PA), vitamin E, C and β-carotene, Questran ^® Light (Cholestyramine for Oral Sus pension; Bristol-Myers Squibb Company , Princeton, NJ), Trazadone Hydrochl
oride, protein supplements included. Family history includes grandfather (mother) type I
I Includes diabetes, malignant colon tumors, benign hypertension, paternal anxiety and open coronary angioplasty, and maternal, paternal and sibling kidney stones.

【０１８９】 凍結組織をBrinkmann Homogenizer Polytron PT-3000（Brinkmann Instrument
s）を用いて均質化し、Trizol試薬（1g tissue/10ml Trizol;Cat.#10296-028;Gm
co-BRL,Gaithersburg,MD）、フェノール及びグアニジニウムイソチオシアネート
のモノプラスチック(monoplastic)溶液 中に溶解した。氷上での短いインキュ ベーションの後に、クロロフォルム（1:5 v/v）を添加して溶解産物を遠心分離 した。上側のクロロフォルム層を未使用のチューブに移し、RNAをイソプロパノ ールで抽出し、DEPC処置水に再懸濁させ、37℃で25分間Dnaseで処理した。前述 のようにRNAを抽出し、沈殿させた。mRNAをQiagen Oligotex kit（QIAGEN,Inc. ）を用いて単離してKIDNTUT13 cDNAライブラリーの作製に使用した。[0189] Frozen tissues were prepared using Brinkmann Homogenizer Polytron PT-3000 (Brinkmann Instrument
s) and homogenized using Trizol reagent (1 g tissue / 10 ml Trizol; Cat. # 10296-028; Gm
co-BRL, Gaithersburg, MD), dissolved in a monoplastic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate. After a short incubation on ice, chloroform (1: 5 v / v) was added and the lysate was centrifuged. The upper chloroform layer was transferred to a fresh tube and the RNA was extracted with isopropanol, resuspended in DEPC-treated water and treated with Dnase at 37 ° C for 25 minutes. RNA was extracted and precipitated as described above. mRNA was isolated using a Qiagen Oligotex kit (QIAGEN, Inc.) and used for the preparation of a KIDNTUT13 cDNA library.

【０１９０】 両方のライブラリーからのRNAは、SuperScript Plasmid Systemの推奨プロト コル(Catalog #18248-013.GIBCO-BRL)に従って取扱った。cDNA合成は、NotI-oli
go d(T)プライマーで開始した。2本鎖cDNAを平滑末端化し、EcoRIアダプタと結 合させ、NotIで消化し、セファロースCL4Bカラム(Cat. #275105-01;Pharmacia) において分別し、400bpを超えるこれらのcDNAをpINCYベクター（インサイト社）
のNotI 及びEcoRI 部位と結びつけた。続いて両方のライブラリーに対するプラ スミドpINCYをDH5α^TMコンピテント細胞（Cat.#18258-012,GIBCO-BRL）に形質転
換した。RNA from both libraries was handled according to the SuperScript Plasmid System recommended protocol (Catalog # 18248-013.GIBCO-BRL). cDNA synthesis, NotI-oli
Started with the go d (T) primer. The double-stranded cDNA was blunt-ended, ligated with EcoRI adapter, digested with NotI, fractionated on Sepharose CL4B column (Cat. # 275105-01; Pharmacia), and these cDNAs exceeding 400 bp were converted into pINCY vector (Incyte Company)
NotI and EcoRI sites. Subsequently, the plasmid pINCY for both libraries was transformed into DH5α ^™ competent cells (Cat. # 18258-012, GIBCO-BRL).

【０１９１】 ２ cDNAクローンの単離および配列決定 両方のライブリーの場合において、プラスミドDNAを細胞から遊離し、REAL Pr
ep 96 Plasmid (Catalog #26173,QIAGEN,Inc.)を用いて精製した。推奨プロトコ
ルを用いたが、以下の点を変更した。１）細菌は、25mg/Lのカルベニシリン及び
0.4%のグリセロールと共に1mlの滅菌Terrific Broth(Catalog #22711,GIBCO-BRL
)において培養した。２）接種の後、培養株を19時間インキュベートし、インキ ュベーションの終了時に細胞を0.3mlの溶解バッファーで溶解した。３）イソプ ロパノール沈殿の後に、プラスミドDNAペレッを0.1mlの蒸留水中に再懸濁した。
プロトコルの最終ステップの終了後に、サンプルを96穴ブロックに移して4℃で 保管した。 2 In both cases of library isolation and sequencing of cDNA clones , the plasmid DNA was released from the cells and the REAL Pr
Purification was performed using ep 96 Plasmid (Catalog # 26173, QIAGEN, Inc.). The recommended protocol was used, with the following changes. 1) Bacteria are 25mg / L carbenicillin and
1 ml of sterile Terrific Broth (Catalog # 22711, GIBCO-BRL with 0.4% glycerol)
). 2) After inoculation, the culture was incubated for 19 hours and at the end of the incubation, the cells were lysed with 0.3 ml of lysis buffer. 3) After precipitation with isopropanol, the plasmid DNA pellet was resuspended in 0.1 ml of distilled water.
After completion of the final step of the protocol, samples were transferred to a 96-well block and stored at 4 ° C.

【０１９２】 Peltier Thermal Cyclers （PTC200 from MJ Research, Watertown,MA）並び にApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systems及びHamilton Micro Lab 22
00 （Hamilton,Reno,NV）を組み合わせて用いて、Sangerら（1975,J.Mol.Biol.9
4:441f）の方法によってこのcDNAの配列決定を行ない、読み枠を画定した。Peltier Thermal Cyclers (PTC200 from MJ Research, Watertown, Mass.) And Applied Biosystems 377 DNA Sequencing Systems and Hamilton Micro Lab 22
00 (Hamilton, Reno, NV) in combination with Sanger et al. (1975, J. Mol. Biol. 9
4: 441f), and the reading frame was defined by sequencing this cDNA.

【０１９３】 ３ cDNAクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索 GenBank、SwissProt、BLOCKS、及びPima IIデータベースにおいて、配列表の ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いた。
これらのデータベースには既に同定された注釈付きの配列が含まれており、BLAS
T(Basic Local Alignment Search Tool)を用いて相同性を有する領域をこのデー
タベースの中から検索した（Altschul.S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；及び
Altschulら(1990)J.Mol.Biol.215:403-10）。 3 Homology search of cDNA clones and their analogous proteins In the GenBank, SwissProt, BLOCKS, and Pima II databases, the nucleotide sequence and / or amino acid sequence in the sequence listing was used as a query sequence.
These databases contain annotated sequences already identified, and are
Regions having homology were searched from this database using T (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul.SF (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; and
Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10).

【０１９４】 BLASTはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成し、配列 類似性を判定する。そのアライメントの局部的性質のため、BLASTは厳密な一致 を判定する、即ち原核生物（細菌）又は真核生物（動物、真菌、植物）起源のホ
モログを同定する際に特に有効である。他のアルゴリズム、例えばSmith,Tら(19
92, Protein Engineering 5:35-51)に記載のアルゴリズムを、一次配列パターン
及び二次的な構造ギャップペナルティを取り扱う際に用いることができる。本明
細書に開示された配列は、少なくとも49ヌクレオチドの長さであり、不要な塩基
は12%未満である（ここでは、A、C、G、TではなくNが記録される）。BLAST generates both nucleotide and amino acid sequence alignments to determine sequence similarity. Due to the local nature of the alignment, BLAST is particularly useful in determining exact matches, ie, identifying homologs of prokaryotic (bacterial) or eukaryotic (animal, fungal, plant) origin. Other algorithms, such as Smith, T et al. (19
92, Protein Engineering 5: 35-51) can be used in handling primary sequence patterns and secondary structural gap penalties. The sequences disclosed herein are at least 49 nucleotides in length and have less than 12% of unnecessary bases (here N is recorded instead of A, C, G, T).

【０１９５】 BLASTアプローチは、問い合わせ配列とデータベースの配列の一致を検索する 。また、BLASTは、発見されたあらゆる配列の一致の統計的有意性を評価して、 ユーザが選択した有意性のしきい値を満たすそれらの一致のみを報告する。本出
願でのしきい値は、ヌクレオチドで10^-25、ペプチドで10^-14に設定した。The BLAST approach searches for a match between the query sequence and the sequence in the database. BLAST also evaluates the statistical significance of any sequence matches found and reports only those matches that meet a user-selected significance threshold. The thresholds in this application were set at 10 ^{-25 for} nucleotides and 10 ^-14 for peptides.

【０１９６】 インサイト社のヌクレオチド配列を、霊長類（pri）、げっ歯類（rod）、及び
他の哺乳類配列（mam）のGenBankデータベースで検索し、そして同じクローンか
ら類推されたアミノ酸配列を、GenBankの機能性タンパク質データベース、哺乳 類（mamp）、脊椎動物（vrtp）、及び真核生物（eukp）で、相同性について検索
した。The nucleotide sequence of Incyte was searched in the GenBank database of primates (pri), rodents (rod), and other mammalian sequences (mam), and the amino acid sequence deduced from the same clone was GenBank functional protein databases, mammals (mamp), vertebrates (vrtp), and eukaryotes (eukp) were searched for homology.

【０１９７】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織に由来するRNAが結合されている膜への標識 されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（Sambrookら、前出,
ch.7並びにAusubel, F.M.ら前出, ch.4および16.）。 4 Northern Analysis Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of a gene transcript, in which RNA from a particular cell type or tissue is labeled on a membrane. With nucleotide sequence hybridization (Sambrook et al., Supra ,
ch.7 and Ausubel, supra FM et al, ch.4 and 16.).

【０１９８】 BLAST（Altschul,S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300; Altschul,S.F.ら(1990)
J.Mol.Evol. 215:403-410）を使用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenB
ank或いはLIFESEQ^TM データベース（インサイト社）のようなヌクレオチドデー
タベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブ
リダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更
して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れとして分類され
るかを決定することができる。検索の基準は、以下で定義される積スコア（prod
uct score）である。 （%配列同一性×%最大BLASTスコア）／100 積スコアは、2つの配列間の類似度及び配列一致の長さの両方を考慮に入れる。 例えば、積スコア40の場合、その一致は1〜2%誤差の範囲内の正確さであり、積ス
コア70の場合は正確な一致となる。相同性分子は通常、15〜40間の積スコアを示す
分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでも関連した分子
が同定される場合もある。BLAST (Altschul, SF (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul, SF et al. (1990)
J. Mol. Evol. 215: 403-410) using a similar computer technology to generate GenB
Search for identical or related molecules in nucleotide databases such as ank or LIFESEQ ^™ database (Insight). This analysis is much faster than many membrane-based hybridizations. In addition, the sensitivity of the computer search can be modified to determine whether any particular match is classified as an exact match or a homologous match. The search is based on the product score (prod
uct score). (% Sequence identity x% max BLAST score) / 100 The product score takes into account both the similarity between the two sequences and the length of the sequence match. For example, for a product score of 40, the match is accurate to within 1-2% error, and for a product score of 70, it is an exact match. Homologous molecules are usually identified by selecting a molecule that exhibits a product score between 15 and 40, although lower scores may identify related molecules.

【０１９９】 ノーザン分析の結果は、TR2Pをコードする転写物が発生するライブラリのリス
トとして報告される。また存在量及び存在比も報告される。存在量は、特定の転
写物がcDNAライブラリ内に現れる回数を正に表すものであり、存在率は、存在量
をcDNAライブラリ内で試験された配列の全数で割った値である。The results of the Northern analysis are reported as a list of libraries in which transcripts encoding TR2P are generated. Abundance and abundance are also reported. Abundance is a positive measure of the number of times a particular transcript appears in the cDNA library, and abundance is the abundance divided by the total number of sequences tested in the cDNA library.

【０２００】 ５ TR2Pをコードするポリヌクレオチドの伸長 インサイト社クローン1533650、2581223の核酸配列を用いて、部分ヌクレオチ
ド配列を完全長まで伸長するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
各核酸配列に対して、一方のプライマーを合成してアンチセンスポリヌクレオチ
ドの伸長を開始し、他方のプライマーを合成してセンスポリヌクレオチドの配列
を伸長を開始した。プライマーを用いることにより、対象の領域に対する新たな
未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生させる既知の配列
の伸長を容易にした。初期のプライマーを、OLIGO4.06 (National Biosciences)
或いは他の適切なプログラムを用いて、約22〜30ヌクレオチドからなる長さで、
50%以上のGC含有物を有し、且つ約68〜72℃の温度で標的配列にアニーリングす るようにcDNAから設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー2量体を 生ずるようなヌクレオチドの如何なる伸展も避けた。 5 Extension of Polynucleotide Encoding TR2P Using the nucleic acid sequence of Incyte clones 1533650 and 2581223, oligonucleotide primers for extending a partial nucleotide sequence to full length were designed.
For each nucleic acid sequence, one primer was synthesized to initiate extension of the antisense polynucleotide, and the other primer was synthesized to initiate extension of the sense polynucleotide sequence. The use of primers facilitated the extension of a known sequence that generated an "outside" amplicon containing a new unknown nucleotide sequence for the region of interest. Initial primers were used at OLIGO 4.06 (National Biosciences)
Alternatively, using other suitable programs, in a length of about 22-30 nucleotides,
The cDNA was designed to have a GC content of 50% or more and anneal to the target sequence at a temperature of about 68-72 ° C. Any extension of the nucleotides resulting in a hairpin structure and primer-primer dimer was avoided.

【０２０１】 選択されたヒトcDNAライブラリ(Gibco/BRL)を用いて配列を伸長した。２つ以 上の伸長が必要である、もしくは望まれる場合には、さらに別のプライマの組を
設計して既知領域をさらに伸長させる。The sequence was extended using a selected human cDNA library (Gibco / BRL). If more than one extension is necessary or desired, another set of primers is designed to further extend the known region.

【０２０２】 XL-PCR kit (Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、酵素及び反応混合物を完 全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られた。PCRはPeltier Thermal
Cycler (PTC200; M.J.Research, Watertown,MA)を用いて実施され、以下のパラ
メータで、40pmolの各プライマおよびキットの他の全ての成分を推奨された濃度
で開始した。 ステップ1 94℃で1分間(初期変性） ステップ2 65℃で1分間 ステップ3 68℃で6分間 ステップ4 94℃で15秒間 ステップ5 65℃で1分間 ステップ6 68℃で7分間 ステップ7 ステップ4〜6をさらに15サイクル繰返す ステップ8 94℃で15秒間 ステップ9 65℃で1分間 ステップ10 68℃で7分15秒間 ステップ11 ステップ8〜10を12サイクル繰返す ステップ12 72℃で8分間 ステップ13 4℃（保持する） 反応混合物の5〜10μlのアリコットを低濃度（約0.6〜0.8%）アガロースミニ ゲル上で電気泳動法により分析し、どの反応物が配列の伸長に成功したかを判定
した。最も大きな生成物を含むと考えられるバンドをゲルから切出し、QIA Quic
k^TM （QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA）を用いて精製し、クレノウ酵素を用いてオ ーバーハングを切除して、再連結及びクローニングを容易にした。[0202] High fidelity amplification was obtained by thoroughly mixing the enzyme and reaction mixture according to the instructions for the XL-PCR kit (Perkin Elmer). PCR is Peltier Thermal
Performed using a Cycler (PTC200; MJResearch, Watertown, MA), starting 40 pmol of each primer and all other components of the kit at the recommended concentrations with the following parameters. Step 1 1 minute at 94 ° C (initial denaturation) Step 2 65 ° C for 1 minute Step 3 68 ° C for 6 minutes Step 4 94 ° C for 15 seconds Step 5 65 ° C for 1 minute Step 6 68 ° C for 7 minutes Step 7 Step 4 Repeat Steps 6 to 15 for further 15 cycles Step 8 94 ° C for 15 seconds Step 9 65 ° C for 1 minute Step 10 68 ° C for 7 minutes 15 seconds Step 11 Repeat Steps 8 to 10 for 12 cycles Step 12 72 ° C for 8 minutes Step 134 C. (hold) An aliquot of 5-10 μl of the reaction mixture was analyzed by electrophoresis on a low-concentration (about 0.6-0.8%) agarose minigel to determine which reaction was successful in extending the sequence. The band most likely to contain the largest product was excised from the gel and QIA Quic
Purified using k ^™ (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA) and the overhang was excised using Klenow enzyme to facilitate religation and cloning.

【０２０３】 エタノール沈殿の後、その生成物を13μlの連結緩衝液中に再溶解し、1μlT4-
DNAリガーゼ（15単位)及び1μlT4ポリヌクレオチドキナーゼが加えて、その混合
物を2〜3時間室温で、或いは16℃で一晩インキュベートした。コンピテントE.col i 細胞(40μlの適切な培養液中の）を3μlの連結混合物を用いて形質転換し、80μ
lのSOC培養液で培養した（Sambrook、前出,Appendix A, p.2）。37℃で1時間イ ンキュベートした後、E.coli混合物を、2x Carbを含むLuria Bertani (LB)-agar
(Sambrook、前出,Appendix A, p.1)上で培養した（plated）。翌日、いくつか のコロニーを各プレートから無作為に選択して、適切な市販の滅菌96穴マイクロ
タイタープレートの個々のウエル内に置かれた150μlの液体LB/2xCarb培地で培 養した。その翌日、終夜培養した各5μlの培養物を非滅菌の96穴プレートに移し
、水で1:10に希釈した後、各サンプルから5μlをのPCRアレイに移した。After ethanol precipitation, the product was redissolved in 13 μl ligation buffer and 1 μl T4-
DNA ligase (15 units) and 1 μl T4 polynucleotide kinase were added and the mixture was incubated for 2-3 hours at room temperature or at 16 ° C. overnight. Competent E. Col i cells (in a suitable culture medium of 40 [mu] l) using 3μl of ligation mixture was transformed, 80 [mu]
The cells were cultured in 1 l of SOC culture medium (Sambrook, supra, Appendix A, p.2). After incubation for 1 hour at 37 ° C, the E. coli mixture was lubricated with Luria Bertani (LB) -agar containing 2x Carb.
(Plated) (Sambrook, supra, Appendix A, p. 1). The next day, several colonies were randomly selected from each plate and grown in 150 μl of liquid LB / 2xCarb medium in individual wells of an appropriate commercially available sterile 96-well microtiter plate. The next day, 5 μl of each overnight culture was transferred to a non-sterile 96-well plate, diluted 1:10 with water, and then 5 μl from each sample was transferred to a PCR array.

【０２０４】 PCR増幅の場合、4単位のrTthDNAポリメラーゼ、ベクタプライマー、及び伸長 反応のために用いられる１つ或いは両方の遺伝子特異的プライマーを含む18μl の濃縮PCR反応混合物(3.3x)が各ウエルに加えられた。増幅は、以下の条件で実 施した。 ステップ1 94℃で60秒間 ステップ2 94℃で20秒間 ステップ3 55℃で30秒間 ステップ4 72℃で90秒間 ステップ5 ステップ2〜4をさらに29サイクル繰返す ステップ6 72℃で180秒間 ステップ7 4℃（保持する） PCR反応物のアリコットを、分子量マーカと共にアガロースゲル上で移動させ た。PCR生成物の大きさを元の部分cDNAと比較し、適切なクローンを選択し、プ ラスミドに結合させて、配列決定した。For PCR amplification, 18 μl of the enriched PCR reaction mixture (3.3 ×) containing 4 units of rTth DNA polymerase, vector primers, and one or both gene-specific primers used for the extension reaction were added to each well. Added. Amplification was performed under the following conditions. Step 1 94 ° C for 60 seconds Step 2 94 ° C for 20 seconds Step 3 55 ° C for 30 seconds Step 4 72 ° C for 90 seconds Step 5 Repeat steps 2 to 4 for another 29 cycles Step 6 72 ° C for 180 seconds Step 7 4 ° C An aliquot of the PCR reaction (retained) was run on an agarose gel with a molecular weight marker. The size of the PCR product was compared to the original partial cDNA, the appropriate clone was selected, ligated to the plasmid and sequenced.

【０２０５】 同様に、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4のヌクレオチド配列を用いて、上記手
順、5´伸長用に設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを 用いる5´調節配列を得る。Similarly, the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 are used to obtain the above procedure, 5 ′ regulatory sequences using oligonucleotides designed for 5 ′ extension and an appropriate genomic library. .

【０２０６】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用 SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4に由来するハイブリダイゼーションプローブを
用いて、cDNA、ゲノムDNA、又はmRNAをスクリーニングする。約２０塩基対から なるオリゴヌクレオチドの標識化について特に記載するが、より大きなヌクレオ
チドフラグメントにも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO 4.
06 (National Biosciences)のような現状の技術分野のソフトウエアを用いて設 計し、50pmolの各オリゴマーと250μCiの[γ-³²P]アデノシン三リン酸 (Amersha
m)及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN^ョ, Boston MA)とを組み合わせる ことにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、Sephadex G-25超精細 樹脂カラム(Pharmacia＆Upjohn)を用いて実質的に精製する。毎分10⁷カウントの
標識されたプローブを含むアリコットを、エンドヌクレアーゼ（Ase I, Bgl II,
Eco RI, Pst I, Xba 1.或いは Pvu II(DuPont NEN^ョ)）の1つで消化されたヒト
ゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析に用いる。 6 Labeling and Use of Individual Hybridization Probes cDNA, genomic DNA, or mRNA is screened using hybridization probes from SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4. Although the labeling of oligonucleotides of about 20 base pairs is specifically described, generally the same procedure is used for larger nucleotide fragments. Oligonucleotide 4.
06 (National Biosciences), designed using current technology software, 50 pmol of each oligomer and 250 μCi of [γ- ³² P] adenosine triphosphate (Amersha
m) and T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN ^®, labeled by combining Boston MA) and. The labeled oligonucleotide is substantially purified using a Sephadex G-25 ultra-fine resin column (Pharmacia & Upjohn). Aliquots containing 10 ⁷ counts of labeled probe per minute were used for endonuclease (Ase I, Bgl II,
Eco RI, Pst I, used to Xba 1. or typical membrane based hybridization analysis of digested human genomic DNA in one of the Pvu II (DuPont NEN ^®)).

【０２０７】 各消化物からのDNAを、0.7%アガロースゲルに上で分画して、ナイロン膜(Nytr
an Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に転写する。ハイブリダイゼーシ ョンは40℃で16時間実施する。非特異的シグナルを除去するために、0.1×クエ ン酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムまでの徐々に厳密性を増
す条件下で、ブロットを室温にて連続的に洗浄する。XOMAT AR^TM フィルム (Kod
ak, Rochester,NY)が数時間Phosphoimager cassette (Molecular Dynamics, Syn
nyvale,CA)内でブロットに露光された後、ハイブリダイゼーションパターンを視
覚的に比較する。The DNA from each digest was fractionated on a 0.7% agarose gel and run on a nylon membrane (Nytr
an Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C for 16 hours. The blot is washed sequentially at room temperature under increasingly stringent conditions up to 0.1 × sodium citrate saline and 0.5% sodium dodecyl sulfate to remove non-specific signals. XOMAT AR ^TM film (Kod
ak, Rochester, NY) for several hours with a Phosphoimager cassette (Molecular Dynamics, Syn
nyvale, CA), the hybridization patterns are visually compared after exposure to the blots.

【０２０８】 ７ マイクロアレイ マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを作り出すために、本発明のヌクレオ
チド配列を、そのヌクレオチド配列の3´末端から開始して、所定のコンピュー タアルゴリズムを用いて調べる。そのアルゴリズムによって、その遺伝子に固有
で、ハイブリダイゼーションに適した範囲内のGC含有物を有し、ハイブリダイゼ
ーションに妨げとなるような予測された二次的構造がない特定の長さのオリゴマ
を同定する。そのアルゴリズムは、長さが約20ヌクレオチドからなる（20量体)2
0個の特異な配列のオリゴヌクレオチドを同定する。各配列の中央の1つのヌクレ
オチドが変化していることを除いて一致したオリゴヌクレオチドの組を形成する
。このプロセスはマイクロアレイ内の各遺伝子に対して繰返され、20個の20量体
からなる組の2つが、光配向（light-directed）化学処理（Chee (前出)に記載）
を用いてシリコンチップの表面上で合成及び配列される。 7 Microarrays To create oligonucleotides for microarrays, a nucleotide sequence of the present invention is examined using a predetermined computer algorithm, starting from the 3 'end of the nucleotide sequence. The algorithm identifies oligomers of a specific length that have a GC content that is specific to the gene, within the appropriate range for hybridization, and has no predicted secondary structure that would interfere with hybridization. I do. The algorithm consists of about 20 nucleotides in length (20 mer) 2
Identify 0 unique sequence oligonucleotides. A matched set of oligonucleotides is formed except that the central one nucleotide of each sequence is changed. This process is repeated for each gene in the microarray, and two sets of 20 20-mers are used for light-directed chemical treatment (described in Chee, supra ).
Are synthesized and arranged on the surface of the silicon chip.

【０２０９】 別法として、化学的結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いることに
より、基板の表面上でオリゴマを合成する（Baldeschweiler,前出）。さらに別 の方法では、ドットブロット又はスロットブロット法に類似のグリッドアレイを
用いて、真空システムまたは熱、紫外線（UV）、機械的或いは化学的結合プロシ
ージャを利用して、基板の表面にcDNAフラグメント或いはオリゴヌクレオチドを
配列及び結合させる。一般にアレイは手動で或いは市販の道具及び装置を用いて
、8ドット、24ドット、96ドット、384ドット、1536ドット或いは6144ドットのグ
リッドを含むように製造できる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを
洗浄してハイブリダイズしていないプローブを除去し、スキャナーを用いて蛍光
のレベル及びパターンを判定する。スキャナーで読取られた画像が検査して、マ
イクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の度合及び相対的な存在量
／発現レベルを判定する。Alternatively, oligomers are synthesized on the surface of the substrate by using a chemical coupling procedure and an inkjet device (Baldeschweiler, supra ). Yet another method uses a grid array similar to the dot blot or slot blot method, using a vacuum system or a thermal, ultraviolet (UV), mechanical or chemical binding procedure to attach cDNA fragments or The oligonucleotides are sequenced and linked. In general, arrays can be manufactured to include a grid of 8, 24, 96, 384, 1536, or 6144 dots, either manually or using commercially available tools and equipment. After hybridization, the microarray is washed to remove unhybridized probes, and the level and pattern of fluorescence are determined using a scanner. The images read by the scanner are examined to determine the degree of complementarity and relative abundance / expression level of each oligonucleotide sequence on the microarray.

【０２１０】 ８ 相補的ポリヌクレオチド TR2Pをコードする配列に相補的な配列或いはその任意の一部を用いて、自然発
生TR2Pの発現を検出して低下させ、即ち抑制する。約15〜約30塩基対を含むオリ
ゴヌクレオチドの使用について記載するが、より小さな、或いはより大きな配列
フラグメントの場合でも概ね同じ方法が用いられる。Oligo4.06ソフトウエア及びT R2Pコーディング配列を用いて適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を抑 制するために、相補オリゴヌクレオチドを最も独特の5´配列から設計し、プロ モーターのコーディング配列への結合を防止するために用いる。翻訳を抑制する
ために、相補的なオリゴヌクレオチドを、リボソームのTR2Pをコードする転写物
への結合を防ぐように設計する。 8 A sequence complementary to the sequence encoding the complementary polynucleotide TR2P, or any portion thereof, is used to detect and reduce, ie, suppress, expression of naturally occurring TR2P. Although the use of oligonucleotides containing about 15 to about 30 base pairs is described, generally the same method is used for smaller or larger sequence fragments. Design the appropriate oligonucleotides using Oligo 4.06 software and the TR2P coding sequence. To repress transcription, complementary oligonucleotides are designed from the most unique 5 'sequence and used to prevent promoter binding to the coding sequence. To suppress translation, complementary oligonucleotides are designed to prevent binding of the ribosome to the transcript encoding TR2P.

【０２１１】 ９ TR2Pの発現 TR2Pの発現は、cDNAを適切なベクタにサブクローニングし、ベクターを宿主細
胞に形質転換することにより行われる。この場合には、クローニングベクターを
用いて、E.coliにおいてTR2Pを発現させる。クローニング部位の上流では、この
ベクターはβ-ガラクトシダーゼのためのプロモータを含み、それにアミノ末端M
et及びそれに後続するβ-ガラクトシダーゼの7残基を含む配列が続く。直後のこ
れら8残基は、転写のために有用なバクテリオファージプロモータ及び多くの特 有の制限部位を含むリンカーである。9. Expression of TR2P Expression of TR2P is carried out by subcloning cDNA into an appropriate vector and transforming the vector into a host cell. In this case, the cloning vector is used to express TR2P in E. coli . Upstream of the cloning site, this vector contains a promoter for β-galactosidase, which contains the amino-terminal M
followed by et and a sequence containing 7 residues of β-galactosidase. Immediately after these eight residues are a linker containing a bacteriophage promoter useful for transcription and a number of unique restriction sites.

【０２１２】 単離され、標準的な方法を用いてIPTG (isopropyil beta-D-thiogalactopyran
oside)と転換された菌種の誘発により、β-ガラクトシダーゼの最初の8残基、リ
ンカーの約5〜15残基及び完全長タンパク質からなる融合タンパク質を生成する 。このシグナル残基により細菌増殖培地へのTR2Pの分泌が促され、この培地を後
述の活性のためのアッセイにおいて直接用いることができる。The isolated and purified IPTG (isopropyil beta-D-thiogalactopyran) using standard methods
Oside) and induction of the transformed strain produces a fusion protein consisting of the first 8 residues of β-galactosidase, about 5 to 15 residues of the linker and the full-length protein. This signal residue promotes the secretion of TR2P into the bacterial growth medium, which can be used directly in assays for activity described below.

【０２１３】 １０ TR2P活性の実証 ヒトの胎児腎臓293株化細胞を全ての形質移入実験に用いる。ウエスタンブロ ット法、免疫共沈降実験、及びルシフェラーゼレポーターアッセイのための一過
性の形質移入は、先行技術（Hsu,H.ら(1995)Cell 81:495-504）に記載のCaPO₄法
によって実施する。また、ルシフェラーゼレポーターアッセイは前述の文献（Hs
u,H.ら；前出）に記載のように実施する。形質移入の24時間後、100mmプレート 当たり約2×10⁶ の293細胞を5mMのEDTAを含むpH7.4の氷冷のリン酸緩衝食塩水（
PBS）中で一度洗浄する。タンパク質は、氷上において30分間、0.5mlの溶解バッ
ファー-250（50mMのTris, pH7.4, 250mMのNaC1, 0.1%ノニデットP-40, 10%グリ セロール, 50mMのNaF, 1mMのsodium orthovanadate, 1mMのジチオスレイトール,
1mM phenylmethylsulfonyl fluoride,10μg/mlのアプロチニン, 10μg/mlのロ イペプチン, 及び10μg/mlのペプスタチンA）中の各プレートから抽出される。 細胞の残留物は遠心分離で除去する。上澄みには10μMのZnCl₂が補充され、10μ
lのプロテインA-セファロース（Pharmacia）に移され、2%のウシ血清アルブミン
（Boehringer Mannheim）で遮断され、またanti-FLAG（1μl）又は anti-TR2P細
胞外ドメイン （1μl）に事前結合(prebound)され、4℃で3時間インキュベート される。ビーズを溶解バッファー-250中で5回洗浄し、結合したタンパク質を10%
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロース上にブロッ ティングする（Schleicher & Schuell）。ウエスタン分析の場合、ブロットされ
たニトロセルロース膜を、0.05% Tween 20含有PBS（PBS containing 0.05% Twee
n 20；PBST）の5%脱脂乳中で室温で1時間のインキュベーションによって遮断し 、またanti-HA（1%ゼラチンPBSTで2000倍希釈）、anti-FLAG（300倍希釈）、又 はanti-TR2P（700倍希釈）で1時間インキュベートする。ブロットをPBST中で3度
洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した3000倍希釈のプロテインAにお いてインキュベートし、次にECL化学発光検出システム（Amersham Corp.）で可 視化する。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイ（Bio-Rad）によって 決定する。 Demonstration of 10 TR2P Activity The human fetal kidney 293 cell line is used for all transfection experiments. Western blots method, co-immunoprecipitation experiments, and transient transfection for luciferase reporter assay, the prior art (Hsu, H et al (1995) Cell 81:. 495-504 ) CaPO 4 method described in Performed by The luciferase reporter assay is described in the literature (Hs
u, H. et al., supra). Twenty-four hours after transfection, approximately 2 × 10 ⁶ 293 cells per 100 mm plate were ice-cold phosphate buffered saline (pH 7.4) containing 5 mM EDTA.
Wash once in PBS). The protein was incubated on ice for 30 minutes in 0.5 ml lysis buffer-250 (50 mM Tris, pH 7.4, 250 mM NaC1, 0.1% nonidet P-40, 10% glycerol, 50 mM NaF, 1 mM sodium orthovanadate, 1 mM Dithiothreitol,
Extracted from each plate in 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 μg / ml aprotinin, 10 μg / ml loipeptin, and 10 μg / ml pepstatin A). Cell residues are removed by centrifugation. The supernatant is supplemented with 10 μM ZnCl _{2 and} 10 μM
of protein A-Sepharose (Pharmacia), blocked with 2% bovine serum albumin (Boehringer Mannheim), and prebound to anti-FLAG (1 μl) or anti-TR2P extracellular domain (1 μl) And incubated at 4 ° C for 3 hours. Wash beads 5 times in Lysis Buffer-250 to reduce bound protein by 10%
Separate by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and blot on nitrocellulose (Schleicher & Schuell). In the case of Western analysis, the blotted nitrocellulose membrane was washed with PBS containing 0.05% Tween 20 (PBS containing 0.05% Tween 20).
n20; PBST) in 5% nonfat milk at room temperature for 1 hour, and blocked with anti-HA (diluted 2000-fold with 1% gelatin PBST), anti-FLAG (diluted 300-fold), or anti-HAG. Incubate with TR2P (700-fold dilution) for 1 hour. The blot is washed three times in PBST, incubated in 3000-fold diluted protein A conjugated to horseradish peroxidase, and then visualized with an ECL chemiluminescence detection system (Amersham Corp.). Protein concentration is determined by the Bradford assay (Bio-Rad).

【０２１４】 １１ TR2P特異的抗体の産生 PAGE電気泳動法（Harrington,M.G.(1990)Methods Enzymol.182:488-495）、或
いは他の精製技術を用いて実質的に精製されたTR2Pを用いて、ウサギを免疫化し
、標準的なプロトコルを使用して抗体を生成する。アミノ酸配列を、DNASTAR so
ftware （DNASTAR Inc）を用いて分析して、免疫原性の高い領域を判定し、対応
するオリゴポリペプチドを合成し、これを用いて当業者に知られた方法により抗
体を作り出す。C-末端付近、或いは親水性領域内のエピトープのような適切なエ
ピトープの選択については、Ausubel F.M.らの文献（1995,定期的に増補；Curre
nt Protocols in Molecular Biology,ch. 11, John Wiley & Sons, New York,
NY）などに記載される。 11 Production of TR2P-Specific Antibodies Using PAGE electrophoresis (Harrington, MG (1990) Methods Enzymol. 182: 488-495) or TR2P substantially purified using other purification techniques, Rabbits are immunized and antibodies are generated using standard protocols. Change the amino acid sequence to DNASTAR so
Analysis is performed using ftware (DNASTAR Inc) to determine a region having high immunogenicity, and a corresponding oligopolypeptide is synthesized, and is used to generate an antibody by a method known to those skilled in the art. For the selection of appropriate epitopes, such as those near the C-terminus or in hydrophilic regions, see Ausubel FM et al. (1995, periodically supplemented; Curre
nt Protocols in Molecular Biology, ch. 11, John Wiley & Sons, New York,
NY).

【０２１５】 通常、オリゴペプチドは15残基の長さであり、fmoc法の化学作用を利用するApp
lied Biosystems Peptide Synthesizer Model 431Aを用いて合成し、MBS（M-mal
eimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester : Ausubelら、前出）を用いた反応
によりKLH(Sigma, St.Louis, MO)に結合させる。ウサギは、完全なフロイントの
アジュバントにおけるオリゴペプチド-KLH複合体で免疫化する。その結果生じる
抗血清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合させ、1%BSAでブロッキング し、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウ
サギIgGと反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。Usually, an oligopeptide is 15 residues long, and uses an fmoc method chemistry
lied Biosystems Peptide Synthesizer Model 431A, MBS (M-mal
eimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester: bound to KLH (Sigma, St. Louis, MO) by reaction using Ausubel et al., supra). Rabbits are immunized with the oligopeptide-KLH complex in complete Freund's adjuvant. The resulting antiserum can be raised, for example, by binding the peptide to plastic, blocking with 1% BSA, reacting with rabbit antiserum, washing, and reacting with radioiodine-labeled goat anti-rabbit IgG. Tested for peptide activity.

【０２１６】 １２ 特異的抗体を用いる自然発生TR2Pの精製 TR2Pに対して特異な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィによ
り、自然発生或いは組換えTR2Pを実質的に精製する。イムノアフィニティーカラ
ムは、TR2P抗体を、CnBr-activated Sepharose (Pharmacia＆Upjohn)のような活
性化されたクロマトグラフィー用樹脂に共有結合させることにより作製する。結
合の後、製造者の取扱説明書に従って樹脂をブロック及び洗浄する。 12 Purification of naturally occurring TR2P using specific antibodies Naturally occurring or recombinant TR2P is substantially purified by immunoaffinity chromatography using antibodies specific for TR2P. Immunoaffinity columns are made by covalently binding a TR2P antibody to an activated chromatography resin such as CnBr-activated Sepharose (Pharmacia & Upjohn). After bonding, block and wash the resin according to the manufacturer's instructions.

【０２１７】 TR2Pを含む培養液を免疫親和性カラムに通し、そのカラムをTR2Pを優先的に吸
着させる条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度のバッファ
ー）で洗浄する。抗体／TR2P結合を***させる条件下（例えば、pH2〜3のバッフ
ァー、又は尿素もしくはチオシアン酸塩イオンのような高濃度のカオトロープ(c
haotrope)）でカラムを溶出させ、TR2Pを回収する。The culture containing TR2P is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that preferentially adsorb TR2P (eg, a high ionic strength buffer in the presence of a detergent). Conditions that disrupt antibody / TR2P binding (e.g., buffers at pH 2-3 or high concentrations of chaotrope (c) such as urea or thiocyanate ions
elute the column with haotrope)) and collect TR2P.

【０２１８】 １３ TR2Pと相互作用する分子の同定 ¹²⁵I Bolton-Hunter試薬(Boltonら(1973) Biochem.J.133:529)を用いて、TR2P
或いはその生物学的に活性な断片を標識する。マルチウエルプレートのウエル内
に予め配列した候補分子を、標識されたTR2Pでインキュベートし、洗浄し、標識
されたTR2P複合体を有する任意のウエルを検定する。種々のTR2P濃度で得られた
データを用いて、数、親和性及びTR2Pと候補分子との会合についての値を計算す
る。 13 Identification of molecules that interact with TR2P. Using the ¹²⁵ I Bolton-Hunter reagent (Bolton et al. (1973) Biochem. J. 133: 529), TR2P
Alternatively, the biologically active fragment is labeled. Candidate molecules pre-sequenced in the wells of a multiwell plate are incubated with labeled TR2P, washed, and any wells with labeled TR2P complexes are assayed. The data obtained at the various TR2P concentrations is used to calculate values for number, affinity and association of TR2P with the candidate molecule.

【０２１９】 上記の刊行物および特許出願の全ては、ここで言及することにより本明細書の
一部とする。当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本明細書に
記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。本発明を
特定の好適実施例に関して説明してきたが、請求する発明がそのような特定の実
施例に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、記載した本
発明の実施のための方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の当業
者には明らかであり、請求の範囲内に含まれることを意図するものである。[0219] All of the above publications and patent applications are incorporated herein by reference. Those skilled in the art will be able to make various modifications of the methods and systems described herein without departing from the scope and spirit of the invention. Although the present invention has been described with respect to particular preferred embodiments, it should be understood that the invention as claimed should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention that are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are intended to be within the scope of the claims.

【配列表】[Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１Ａ】 TR2P-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）および核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す
図である（図１Ａ乃至図１Ｃの配列アライメントの作成にはMacDNASIS PROTMソ フトウエア(Hitach Software Engineering Co.Ltd.,San Bruno,CA)を使用した）
。FIG. 1A shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 2) of TR2P-1 (MacDNASIS PRO ™ software (for preparing the sequence alignments of FIGS. 1A to 1C)). Hitach Software Engineering Co. Ltd., San Bruno, CA)
.

【図１Ｂ】 TR2P-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）および核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す
図である。FIG. 1B shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 2) of TR2P-1.

【図１Ｃ】 TR2P-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）および核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す
図である。FIG. 1C shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 2) of TR2P-1.

【図２Ａ】 TR2P-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）および核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
図である（図２Ａ乃至図２Ｄの配列アライメントの作成にはMacDNASIS PROTM so
ftware (Hitach Software Engineering Co.Ltd.,San Bruno,CA)を使用した）。FIG. 2A shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) and the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 4) of TR2P-2 (MacDNASIS PROTM so
ftware (Hitach Software Engineering Co. Ltd., San Bruno, CA) was used).

【図２Ｂ】 TR2P-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）および核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
図である。FIG. 2B shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) and the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 4) of TR2P-2.

【図２Ｃ】 TR2P-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）および核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
図である。FIG. 2C shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) and the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 4) of TR2P-2.

【図２Ｄ】 TR2P-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）および核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
図である。FIG. 2D shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) and the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 4) of TR2P-2.

【図３Ａ】 TR2P-1（1542861; SEQ ID NO:1）、ヒトオステオプロテグリン(human osteopr
otegrin)（GI 2072185, SEQ ID NO:5）、及びヒトTNF-R2（GI 1469541, SEQ ID
NO:6）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である（図３Ａ乃至図３Ｃの配
列アライメントはDNASTAR^TM software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシー
ケンスアライメントプログラムを用いて作成）。FIG. 3A: TR2P-1 (1542861; SEQ ID NO: 1), human osteoprotegrin (human osteopregrin)
otegrin) (GI 2072185, SEQ ID NO: 5), and human TNF-R2 (GI 1469541, SEQ ID NO: 5).
FIG. 3C is a diagram showing an amino acid sequence alignment during the NO: 6) (the sequence alignments in FIGS. 3A to 3C are prepared using a multi-sequence alignment program of DNASTAR ^™ software (DNASTAR Inc, Madison WI)).

【図３Ｂ】 TR2P-1（1542861; SEQ ID NO:1）、ヒトオステオプロテグリン（GI 2072185,
SEQ ID NO:5）、及びヒトTNF-R2（GI 1469541, SEQ ID NO:6）の間のアミノ酸配
列アライメントを示す図である。FIG. 3B: TR2P-1 (1542861; SEQ ID NO: 1), human osteoprotegrin (GI 2072185,
FIG. 2 shows an amino acid sequence alignment between SEQ ID NO: 5) and human TNF-R2 (GI 1469541, SEQ ID NO: 6).

【図３Ｃ】 TR2P-1（1542861; SEQ ID NO:1）、ヒトオステオプロテグリン（GI 2072185,
SEQ ID NO:5）、及びヒトTNF-R2（GI 1469541, SEQ ID NO:6）の間のアミノ酸配
列アライメントを示す図である。FIG. 3C: TR2P-1 (1542861; SEQ ID NO: 1), human osteoprotegrin (GI 2072185,
FIG. 2 shows an amino acid sequence alignment between SEQ ID NO: 5) and human TNF-R2 (GI 1469541, SEQ ID NO: 6).

【図４Ａ】 TR2P-2（2581223; SEQ ID NO:3）、ヒトTNF-R2（切り詰められた配列、V-83〜
S-461：GI 1469541, SEQ ID NO:6）、およびヒトオステオプロテグリン（切り詰
められた配列、L-90〜L-401：GI 2072185, SEQ ID NO:5）の間のアミノ酸配列ア
ライメントを示す図である（図４Ａ乃至図４Ｃの配列アライメントはDNASTAR^TM
software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプログラ
ムを用いて作成）。FIG. 4A: TR2P-2 (2581223; SEQ ID NO: 3), human TNF-R2 (truncated sequence, V-83 to
2 shows the amino acid sequence alignment between S-461: GI 1469541, SEQ ID NO: 6) and human osteoprotegrin (truncated sequence, L-90-L-401: GI 2072185, SEQ ID NO: 5). 4A to 4C show DNASTAR ^™
software (DNASTAR Inc, Madison WI).)

【図４Ｂ】 TR2P-2（2581223; SEQ ID NO:3）、ヒトTNF-R2（切り詰められた配列、V-83〜
S-461：GI 1469541, SEQ ID NO:6）、およびヒトオステオプロテグリン（切り詰
められた配列、L-90〜L-401：GI 2072185, SEQ ID NO:5）の間のアミノ酸配列ア
ライメントを示す図である。FIG. 4B: TR2P-2 (2581223; SEQ ID NO: 3), human TNF-R2 (truncated sequence, V-83 to
2 shows the amino acid sequence alignment between S-461: GI 1469541, SEQ ID NO: 6) and human osteoprotegrin (truncated sequence, L-90-L-401: GI 2072185, SEQ ID NO: 5). FIG.

【図４Ｃ】 TR2P-2（2581223; SEQ ID NO:3）、ヒトTNF-R2（切り詰められた配列、V-83〜
S-461：GI 1469541, SEQ ID NO:6）、およびヒトオステオプロテグリン（切り詰
められた配列、L-90〜L-401：GI 2072185, SEQ ID NO:5）の間のアミノ酸配列ア
ライメントを示す図である。FIG. 4C: TR2P-2 (2581223; SEQ ID NO: 3), human TNF-R2 (truncated sequence, V-83 to
2 shows the amino acid sequence alignment between S-461: GI 1469541, SEQ ID NO: 6) and human osteoprotegrin (truncated sequence, L-90-L-401: GI 2072185, SEQ ID NO: 5). FIG.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 ４Ｈ０４５ 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/525 43/00 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/525 16/24 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/24 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃12・モンロードライ ブ 230 (72)発明者 オウ−ヤング、ジャニス アメリカ合衆国カリフォルニア州94702・ バークレイ・カインズアベニュー 1419 (72)発明者 タング、トム・ワイ アメリカ合衆国カリフォルニア州95118・ サンノゼ・ランウィックコート 4230 (72)発明者 カイザー、マシュー・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94546− 1017・カストロバレー・ユーイングロード 4793 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA28 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA01 HA17 4B063 QA01 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B064 AG07 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA01 AA06 AA07 AA27 BA01 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 DA25 NA14 ZA812 ZA962 ZB022 ZB262 ZC422 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA22 EA22 EA28 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 35/00 A61P 43/00 4H045 37/00 C07K 14/525 43/00 14/705 C07K 14/525 16 / 24 14/705 C12N 1/15 16/24 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12Q 1/68 A 5/10 C12N 15/00 ZNAA C12P 21/02 A61K 37/02 C12Q 1/68 C12N 5/00 A (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC , NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, S Z, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC , LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Hillman, Jennifer El. Mountain View # 12, Monrode Drive 230, California, 94040 (72) Inventor Au-Young, Janice America Berkeley Caines Avenue, CA 94702, USA 1419 (72) Inventor Tang, Tom Wy 95118, California, United States of America San Jose Runwick Court 4230 (72) Inventor, Kaiser, Matthew Earl, CA 94546-1017, Castro, USA Valley Ewing Road 4793 F-term (Reference) 4B024 AA01 BA28 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA01 HA17 4B063 QA01 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B064 AG07 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA01 A08BA53 CA56 DA25 NA14 ZA812 ZA962 ZB022 ZB262 ZC422 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA22 EA22 EA28 FA74

Claims (24)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびS
EQ ID NO:3の断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含む、ヒト腫瘍壊
死因子R2様タンパク質（TR2P）。Claims 1. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, fragments of SEQ ID NO: 1, and S
A human tumor necrosis factor R2-like protein (TR2P) comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments of EQ ID NO: 3. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列に対して少なくとも90%以上のア ミノ酸同一性を有する実質的に精製されたABBRの変異体。2. A substantially purified variant of ABBR having at least 90% amino acid identity to the amino acid sequence of claim 1. 【請求項３】 請求項１のTR2Pをコードする単離され精製されたポリヌク
レオチド配列。3. An isolated and purified polynucleotide sequence encoding the TR2P of claim 1. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90% 以上のポリヌクレオチド同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの
変異配列。4. A mutated sequence of an isolated and purified polynucleotide having at least 90% or more polynucleotide identity to the polynucleotide sequence of claim 3. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチド配列を含む所定の組成物。5. A predetermined composition comprising the polynucleotide sequence of claim 3. 【請求項６】 厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチド配列とハイ
ブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド配列。6. An isolated and purified polynucleotide sequence which hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide sequence of claim 3. 【請求項７】 請求項３のポリヌクレオチド配列に対して相補的な、単離
され精製されたポリヌクレオチド配列。7. An isolated and purified polynucleotide sequence that is complementary to the polynucleotide sequence of claim 3. 【請求項８】 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2の断片、およびS
EQ ID NO:4の断片からなる一群より選択されたポリヌクレオチド配列を含む、単
離され精製されたポリヌクレオチド配列。8. The method of claim 8, wherein SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, a fragment of SEQ ID NO: 2, and S
An isolated and purified polynucleotide sequence comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of the fragments of EQ ID NO: 4. 【請求項９】 請求項８のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90% 以上のポリヌクレオチド同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの
変異配列。9. A mutated sequence of an isolated and purified polynucleotide having at least 90% or more polynucleotide identity to the polynucleotide sequence of claim 8. 【請求項１０】 請求項８のポリヌクレオチド配列に対して相補的な、単
離され精製されたポリヌクレオチド配列。10. An isolated and purified polynucleotide sequence that is complementary to the polynucleotide sequence of claim 8. 【請求項１１】 請求項３のポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含
む発現ベクター。An expression vector comprising at least a fragment of the polynucleotide sequence of claim 3. 【請求項１２】 請求項１１の発現ベクターを含む宿主細胞。12. A host cell comprising the expression vector according to claim 11. 【請求項１３】 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およ びSEQ ID NO:3の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項１２の宿主細胞を
培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
を特徴とするポリペプチドの製造方法。13. A method for producing a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, a fragment of SEQ ID NO: 1, and a fragment of SEQ ID NO: 3, comprising: a) culturing the host cell of claim 12 under conditions suitable for expression of the polypeptide; and (b) recovering the polypeptide from the culture medium of the host cell. For producing a polypeptide. 【請求項１４】 適切な医薬用担体と共に請求項１のTR2Pを含む医薬品組
成物。14. A pharmaceutical composition comprising the TR2P of claim 1 together with a suitable pharmaceutical carrier. 【請求項１５】 請求項１のTR2Pに特異的に結合する精製された抗体。15. A purified antibody that specifically binds to TR2P of claim 1. 【請求項１６】 請求項１のTR2Pの精製されたアゴニスト。16. A purified agonist of TR2P according to claim 1. 【請求項１７】 請求項１のTR2Pの精製されたアンタゴニスト。17. A purified antagonist of TR2P of claim 1. 【請求項１８】 骨形成疾患の治療方法または予防方法であって、 そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１４の医薬品組成物
を投与する過程を含む方法。18. A method of treating or preventing an osteogenic disorder, the method comprising administering to a patient in need of such treatment an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 14. 【請求項１９】 発生障害の治療方法または予防方法であって、 そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１４の医薬品組成物
を投与する過程を含む方法。19. A method of treating or preventing a developmental disorder, comprising administering to a patient in need of such treatment an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 14. 【請求項２０】 生殖疾患の治療方法または予防方法であって、 そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１４の医薬品組成物
を投与する過程を含む方法。20. A method of treating or preventing a reproductive disorder, comprising administering to a patient in need of such treatment an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 14. 【請求項２１】 免疫疾患の治療方法または予防方法であって、 そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１７のアンタゴニス
トを投与する過程を含む方法。21. A method of treating or preventing an immune disease comprising administering to a patient in need of such treatment an effective amount of the antagonist of claim 17. 【請求項２２】 腫瘍性疾患の治療方法または予防方法であって、 そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１７のアンタゴニス
トを投与する過程を含む方法。22. A method of treating or preventing a neoplastic disorder, comprising administering to a patient in need of such treatment an effective amount of the antagonist of claim 17. 【請求項２３】 核酸を含む生物学的サンプルにおけるTR2Pをコードする
ポリヌクレオチドの検出方法であって、 （ａ）請求項７のポリヌクレオチドを生物学的サンプルの少なくとも１つの核
酸材料とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と
、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、該複合体
の存在が、前記生物学的サンプルにおけるTR2Pをコードするポリヌクレオチドの
存在と相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とするTR2Pの検出方法。23. A method for detecting a polynucleotide encoding TR2P in a biological sample containing nucleic acids, comprising: (a) hybridizing the polynucleotide of claim 7 with at least one nucleic acid material of the biological sample. Forming a hybridization complex; and (b) detecting the hybridization complex, wherein the presence of the complex correlates with the presence of a polynucleotide encoding TR2P in the biological sample. A method for detecting TR2P, comprising: 【請求項２４】 ハイブリダイゼーションの前に、前記生物学的サンプル
の核酸をポリメラーゼ連鎖反応法によって増幅することを特徴とする請求項２３
に記載の方法。24. The method according to claim 23, wherein the nucleic acid of the biological sample is amplified by polymerase chain reaction before the hybridization.
The method described in.