JP2002501188A - 有核の赤血球の識別方法 - Google Patents
有核の赤血球の識別方法Info
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Abstract
Description
/975,846号の部分継続出願である。 発明の属する分野 本発明は有核の(nucleated)赤血球の識別のための方法に関する。
さらに、この方法は適切な電気的測定及び光学的測定による血液細胞標本中の白
血球の同時識別方法を提供する。
RBC)または赤芽球は、未成熟赤血球である。それらは、通常、骨髄に生じる
が末梢血液には生じない。しかしながら、特定の病気、たとえば、貧血及び白血
病においては、NRBCは末梢血にも生じる。したがって、NRBCを測定する
ことは臨床的に重要である。伝統的にNRBCの識別及び数え上げは手動で行な
われている。その工程は、血液標本の顕微鏡のスライド上への塗り付け及びスラ
イドの染色に続いて、個々のスライドの手動の目視による分析を包含する。NR
BCの濃度は100個の白血球当りのNRBCの数として報告される。通常、2
00個の白血球と同じ領域の血液塗抹に存在するNRBCの数を数え、その数を
2で割って、100個の白血球当りのNRBCの数としてNRBC濃度を表わす
。このアプローチは、非常に時間がかかると同時に個々のスライドの分析の解釈
に依存する。
発されてきた。これらの方法は、電気的または光学的性質に基づいてNRBCを
識別することが容易でないという理由で、他の細胞集団からNRBCを区別する
ために特異的核染色技術を利用する。 米国特許第5,298,426号(Inami他に対する)は、NRBCを識別する
ための蛍光方法を開示している。この方法は、酸性の低血圧の蛍光染料溶液であ
る第1流体及び第1流体のオスモル濃度及びpHを変える第2流体を用いる2工程
染色を用いる。イナミ(Inami)他は、第1流体が、有核の赤血球中に拡散して、
その核を特異的に染色する赤芽球染色染料を含有し、次いで、2次元プロットで
NRBCの群を他の細胞群から分離して、それによりNRBC識別の結果をコン
ピュータ化することを教示している。同時に白血球の亜集団を識別するために、
第1流体は、2つの追加の蛍光染料、すなわち、好酸球/好塩基球染色染料及び
白血球染色染料もこれらの細胞型の特異的染色のために含有する。
フローサイトメトリー分析方法を開示する。この方法は、全血標本から赤血球及
びNRBC細胞質を溶解して、NRBCの核を生体核染色剤にさらすこと及び白
血球への生体核染色剤の浸透を最小限にすること並びに蛍光及び2つの角度の光
散乱を測定することによる標本の分析を含む。この方法は、デブリ(蛍光性及び
非蛍光性の)からのシグナルを阻止し、ALLトリガーの下であるが、NRBC
として蛍光トリガー(FL3)の上に落ちるシグナルを同定する三重トリガー方
法を特色とする。ALLは光の光軸損失または入射光から0°で検出された光散
乱シグナルである。したがって、1次元より大きい予備ゲーティングシグナルが
NRBC集団の同定のためのこの方法に必要となる。白血球も有核の細胞である
から、蛍光測定への干渉を回避するために、これらの細胞の染色を防止すること
が必要である。白血球膜の維持及び核染色剤の白血球への浸透を最小限にするこ
とは、赤血球の溶解の間に脂肪族アルデヒドで白血球を同時に固定することによ
り達成される。アルデヒド同定剤は危険な化学薬品として知られている。さらに
、この方法はNRBCと白血球の識別を得るために試薬を42℃まで加熱する必
要がある。
中の有核赤血球または網状赤血球及び細胞表面抗原を数え及び識別するための自
動化方法を開示する。この方法は、フローセル中の溶解した血液標本から多角度
光散乱及び蛍光シグナルを検出する。米国特許第5,559,037号(Kim 他
に対する) と同様に、この方法は、蛍光染料を用いる核染色により生産された有
核赤血球または網状赤血球からの蛍光シグナルの検出を必要とする。
上げることができる。しかしながら、蛍光測定は複雑で高価な検出方法である。 最近の自動血液分析機、たとえば、Abbott Cell−Dyn(登録商
標)3500、COULTER(登録商標)STKS(登録商標)、Techn
icon H* 1(登録商標)及びTOA Sysmex(商標)NE−800
0は、機器がヒストグラムの赤血球デブリ領域の近くに増加量のシグナルを感じ
た時、分析血液標本中における、NRBCの存在の可能性についてのNRBCの
フラッグ付け(flagging)のみを提供できる。しかしながら、このよう
な技術は、多くの他の血液の異常性が同じ領域に、増大したシグナル、たとえば
血小板のかたまり及び鎌状赤血球並びに不十分な溶解化血液標本からの赤血球デ
ブリを引き起こすから、しばしば、誤った陽性のフラッグ付けを生じさせる。こ
れらの方法ではNRBCは同定されない。代りに、ヒストグラムまたは点プロッ
トにおける、単なる共通のNRBC標本分布パターンが、上記他の原因により生
じた同様のパターンと容易に混同し得る機器により認識される。誤った陽性のフ
ラッグを包含する、フラッグを付された標本について、手動方法による標本の再
検査が臨床試験所で必要になる。標本を含有するNRBCについての他の問題は
、血液分析機により報告された白血球の総数(WBC)は、NRBCは白血球と
誤同定されることによりWBCを上昇させることがあるだろうから、これらの標
本について正確でないことである。他方、全血標本からの白血球集団の分析は、
病理学の多様性に関する診断手順の必須の部分である。自動化方法で白血球の主
要な亜集団を分析する能力は、単一血液標本の急速診断及び多くの標本の同時の
急速処理のために必須である。 米国特許第5,155,044号(Ledis他に対する)は全血標本からの
白血球の単離及び分析方法を開示し、それは、自動血液分析機で一工程測定にお
いて白血球を5つの亜集団に識別することを可能にする。この検出技術は、同時
光散乱測定と、DC(直流)及びRF(高周波)の両方におけるインピーダンス
測定を含む。この方法は単純で速いが、NRBCの識別を提供できない。
り白血球を5つの亜集団に識別する溶解剤系及び方法を記載している。この方法
は3つの溶解試薬、3つの分離標本調製物並びに、リンパ球集団及び単球集団に
加えて、好酸球集団、好中球集団、好塩基球集団の同一性のための測定を必要と
する。ハマグチ他は、溶解試薬系及びDC対RF検出方法を用いる、単に異常な
白血球集団と有核赤血球の観察を記載している。しかしながら、この方法はいく
つかの異常な細胞型の存在を観察するだけで、NRBCを識別または数え上げる
ことができない。
工程で白血球を5つの亜集団に識別するための溶解化試薬系及び方法を記載して
いる。溶解試薬系は、エトキシル化長鎖アミン化合物を含む溶解試薬及び溶解試
薬のpHを2.0〜3.6の範囲内に調整するための酸並びに高張アルカリ性安定
化剤を含む。この特許は白血球亜集団の識別のための試薬及び方法を教示するが
、有核赤血球の識別を教示しない。 先の記載に基づいて、NRBCを識別及び数え上げるための簡単で費用の少な
い方法についての必要性がある。
核赤血球の識別を可能とする方法を提供することである。この方法は分析のため
の血液標本を供給し、前記血液標本から成熟赤血球を溶解し、2つの角度の光散
乱測定により前記血液標本を分析して、有核赤血球を識別し、そこで、第2光散
乱シグナルは中角度の光散乱シグナルまたは直角の光散乱シグナルであり、そし
て、血液細胞標本中の有核赤血球を報告することを含む。 本発明の他の目的は有核赤血球と白血球の同時識別を可能とする方法を提供す
ることである。この方法は、分析のための血液標本を供給し、前記血液標本から
成熟赤血球を溶解し、DC測定及び光散乱測定により前記血液標本を分析して、
有核赤血球及び白血球亜集団を識別し、そこで、有核赤血球を識別するための前
記光散乱測定が2つの角度の光散乱シグナルを用いて行なわれ、有核赤血球を識
別するための第2光散乱シグナルが中角度光散乱シグナルまたは直角の光散乱シ
グナルであり、そして、血液細胞標本中の有核赤血球及び白血球亜集団を報告す
ることを含む。 後の発明の好ましい態様の詳細な説明からよりよく分かるように、本発明は、
核染色及び複雑な蛍光検出方法を用いることなく、光散乱を用いて有核赤血球の
識別を与える点で従来の技術に比較して特に有益である。本発明の追加の特徴は
、標本調製物の加熱を必要とせず、室温で最適に働くことである。本発明は後の
好ましい態様の記載からよりよく理解されるだろう。
本中の白血球の同時識別を提供する。 第1の態様では、本発明の方法は、血液細胞標本を成熟赤血球を溶解する試薬
系にさらし、続いて、光散乱測定を用いて流動セル中で前記標本混合物を分析し
て、NRBCを識別し、前記血液細胞標本中のNRBCを報告することを含む。 本発明のために適当な1つの試薬系は、一般式:
ニル基であり、m及びnは各々1以上であり、m+nは20〜40の間である)
で表わされるエトキシル化長鎖アミン化合物を含む溶解試薬及び溶解試薬のpHを
2.0〜3.6の範囲内に調整するための酸並びに高張アルカリ性安定化試薬を
含む。
包含させることができる。典型的には溶解化剤はポリオキシエチレン及びポリオ
キシプロピレンコポリマー並びに16以上のHLBを有するエトキシル化アルコ
ールである。適当なコポリマーはPluronicコポリマー(BASFコーポ
レイション、ニュージャージー州、パーシッパニー)、たとえばPluroni
c F38及びPluronic 25R8を含むが、これらに限定されない。
適当なエトキシル化アルコールはPlurafac A38(BASF)及びH
etoxol STA30(Heterene, Inc. ニュージャージー州、パタソン)を
含むが、これらに限定されない。
主要機能性成分と相溶性である濃度で含ませることもできる。これらの添加剤の
中では、組成物の棚寿命を増加するための、酸化防止性を有する保存剤、及び抗
微生物性を有する保存剤である。抗酸化性を有する保存剤はEDTA及びブチル
メチルフェノールを含むが、これらに限定されない。抗微生物活性を有する保存
剤は、ジメチロールジメチルヒダントイン、ヨードプロピニルブチルカーバメー
ト及びイソチオゾロン誘導体を含むが、これらに限定されない。
4号に開示されている。この試薬系は、赤血球を選択的に溶解するために低張酸
溶解を利用し、続いて、溶解化活性を遅延し、識別分析のために白血球を保護す
るために、急冷(quenching)溶液を加える。 NRBCの識別分析は光散乱測定を用いて外筒流体を用いる流動セル中で実施
する。粒子、たとえば血液細胞が流動セルの開口を通過する時、レーザービーム
からの入射光を全方向に散乱させる。光散乱シグナルは0〜180°の間の入射
光に呼応する種々の角度で光検出器により検出できる。各細胞集団は大きいか小
さいかのいずれかで異なった光散乱特性を有し、異なった細胞集団の識別のため
に利用し得ることが分かった。入射光から10°未満で検出される光散乱シグナ
ルは一般に低角度光散乱と呼ばれる。入射光から約10°〜約70°で検出され
る光散乱シグナルは中角度光散乱と呼ばれ、入射光の約90°で検出される光散
乱シグナルは直角の光散乱と呼ばれる。光散乱シグナルの特徴は細胞のサイズ、
細胞の量及び細胞の表面特性により影響を受ける。 流動セルを通過する粒子または細胞からの光散乱シグナルを本発明の目的のた
めに用いる。好ましくは、2つの角度の光散乱シグナルをNRBCの識別に用い
る。より好ましくは、光散乱の角度の一方は10°未満である低角度光散乱シグ
ナルである。低角度光散乱シグナルの好ましい範囲は約0°〜約4°である。第
2の光散乱角度は低、中または直角光散乱シグナルである。 図1〜4は、例Iに記載された手順に従って処理し、分析された11NRBC
/100WBCを含有する、臨床的全血標本の一連の散布図を示す。これらの散
布図、図1におけるLS1(約1°〜約3°)対LS2(約4°〜約6°)、図
2におけるLS1対LS4(約6°〜約8°)、図3におけるLS1対LS5(
約9°〜約11°)及び図4におけるLS1対LS3(約24°〜約35°)に
おいては、NRBCは、NRBCの下に記される赤血球デブリから明確に識別さ
れ、かつ白血球(この散布図の範囲の外にある)から明確に識別されるクラスタ
ーを形成する。DCのスケールでは、図1〜4に記載されたNRBC集団は、通
常は図5で示されるようなデブリ領域と考えられる領域中でリンパ球の下にある
。NRBCを識別するための最良のモードは、血液標本中に高い網状赤血球が存
在する時に、第2光散乱シグナルのために低角度光散乱シグナルを用いることで
ある。光散乱測定によるNRBCの識別は単純で、簡単である。それは、NRB
Cを他の細胞型から識別するために、定例の二次元点プロットまたは散布図を用
いる。LS1におけるNRBCのクラスター上の細胞集団は総白血球(WBC)
として数えられる。さらに他の方法は総白血球(WBC)を決定するのに用いら
れる。DC検出装置も用いられるなら、リンパ球の最小DC体積より上の細胞集
団は総白血球として数えることができる。これらの方法の両方で得られたWBC
はNRBCの干渉がなく、補正されたWBCと等しく、それは、NRBCの寄与
を含有する総白血球数からNRBC総数を引き去ることにより生じる。
中に数えた細胞の数を数えた総白血球(WBC)により割り、そして、その商に
100を掛けることにより計算できる。NRBC濃度はNRBC/100WBC
の数として報告することができ、それは、手動の報告単位と同じであるか、また
は1μlの全血に対する絶対NRBCとして報告することができる。
施できる。識別分析は同じ試薬系及び1つの標本調製物を用いて、電気的及び光
学的分析を用いて1工程で実施できる。電気的及び光学的分析は光散乱測定及び
インピーダンス測定を含む。自動血液分析機による白血球分析に用いられるDC
インピーダンス測定装置は当業者に知られており、一般にRodriguez 他に対する
米国特許第5,125,737号に記載されており、その全体を参照により本明
細書に組み入れる。NRBC及び白血球の識別分析のために、流動セルを通過す
る粒子または細胞からの多角度光散乱シグナルを検出可能な光散乱検出器が用い
られる。
には示されていない。しかしながら、白血球の識別及びNRBCの識別のための
標本分析を一工程測定で実施できる。両方の識別のためのデータ分析は、一工程
の測定から得られた異なったパラメータを用いて同時に実施できる。 図5は、例II(例Iで用いられたのと同じ試薬及び手順)にしたがって処理さ
れた新鮮な正常全血標本から得られたDC対LS3(中角度散乱、約24°〜約
35°)散布図である。図5は白血球亜集団である、リンパ球、単球、好中球及
び好酸球の4つの別個のクラスターを示す。標本を一つの標本調製物において処
理し、NRBCの識別と同時に分析した。DC対LS3散布図においては、リン
パ球集団の最小DC体積より上のすべての細胞集団を総白血球(WBC)として
数え、それは、LS1対LS2散布図におけるNRBCクラスターより上の集団
に等しい。
え上げを報告する。核染色の除去は、染料汚染のための、器械及び流体系維持の
減少、試薬持ち越しに対する系の感度の減少及び高価な蛍光染料による試薬のコ
ストの減少における利点を提供する。本発明の方法は、速く、確かで自動化血液
分析に適当である。さらに、この検出技術は蛍光方法に比較して複雑でなく、高
価でない。
も提供する。従来技術の方法は白血球亜集団またはNRBCの識別のために上昇
した温度で操作する。この上昇温度の必要性は、反応を自動温度調節しなければ
ならないから、著るしくより複雑で、コストのかかる分析機械を必要とする。そ
れは、分析下の生物学的細胞のためによりストレスの多い状態を生じる。
液標本の識別分析のためのその利用性である。 本発明の方法は、さらに次の例を参照することにより理解できる。しかしなが
ら、本発明が記載された例に限定されないことが分かるだろう。
%の式:
長鎖アミン、溶解化剤としての1.4%のPlurafac A38及び保存剤
を含む、417μlの溶解試薬を加え、血液分析機の混合室で約4秒間混合した
。次いで、1.4%のNaCl、3.2%のNa2 SO4 及び0.66%のNa 2 CO3 を含み、pH11.0である、180μlの安定化試薬を加えて、混合し
、溶解反応を遅延させた。
実験用血液分析機の、外筒流体であるISOTON(登録商標)III 希釈剤(フ
ロリダ州、マイアミのCoulter Corporation の製品) を有する流動セルに、NR
BC及び白血球の識別分析のために供給した。光散乱検出器は、いくつかの範囲
の角度、すなわち、約1°〜約3°(LS1)、約4°〜約6°(LS2)、約
6°〜約8°(LS4)、約9°〜約11°(LS5)、約24°〜約35°(
LS3)及びさらに高い角度で、流動セルを通過する細胞からの光散乱シグナル
を検出する。
LS4、LS1対LS5及びLS1対LS3散布図において、赤血球デブリ(下
)及び白血球(上、しかし、散布図の範囲の外)から識別されたNRBCのクラ
スターを示す。 分析された標本のNRBC濃度は、同定されたNRBCクラスターにおいて数
えた細胞の数(図1〜4)を数えた総白血球(WBC)で割り、その商に100
を掛けることにより計算する。NRBC濃度はNRBC/100WBCの数とし
て報告され、それは手動の報告単位と同じである。この標本について、手動の参
考方法は11NRBC/100WBCを報告し、上記方法は12NRBC/10
0WBCを報告した。
本混合物を、白血球の識別及びNRBCの識別のための例Iで用いたのと同じ血
液分析機の流動セルで同時に分析した。図5は得られたDC対LS3散布図であ
り、それは白血球亜集団、すなわち、リンパ球、単球、好中球及び好酸球の4つ
の別個のクラスターを示す。
0.07%のサポニンからなる449μlの溶解試薬を加え、血液分析機の混合
室中で約5秒間混合した。次いで177μlの例Iに記載されたのと同じ安定化
試薬を加えて、混合し、溶解反応を阻止した。
の、外筒流体であるISOTON(登録商標)III 希釈剤を有する流動セルに、
NRBC及び白血球識別分析のために供給した。図6は得られたLS1対LS2
散布図(図1と同じスケールの)で、それはNRBCクラスターが他の細胞型か
ら分離されていることを示す。
動で約4秒間混合した。1.8mlの例Iの安定化試薬を加え、標本混合物を手動
で混合し、例Iに記載した血液分析機に導入した。図7は、得られたLS1対L
S5散布図である。明らかなようにNRBCははっきりとしたクラスターを形成
した。 本発明を特に好ましい態様に関連して記載してきた。しかしながら、種々の変
更を本発明の精神を離れることなくなすことができ、そのような変更は添付の請
求の範囲内に入ることを意図することは明らかであろう。
Claims (16)
- 【請求項1】 有核の赤血球を識別する方法であって (a)分析のための血液標本を供給し、 (b)前記血液標本から成熟赤血球を溶解し、 (c)2つの角度の光散乱測定により前記血液標本を分析して有核の赤血球を
識別し、そこで、第2の光散乱シグナルは、中角度の光散乱または直角の光散乱
シグナルであり、そして、 (d)前記血液細胞標本中の有核の赤血球を報告すること を含む前記方法。 - 【請求項2】 第1の光散乱シグナルが低角度光散乱シグナルである請求項
1の方法。 - 【請求項3】 第2の光散乱シグナルが中角度光散乱シグナルである請求項
1の方法。 - 【請求項4】 第2の光散乱シグナルが直角の光散乱シグナルである請求項
1の方法。 - 【請求項5】 第1の光散乱シグナルの範囲が約0℃〜約4℃である請求項
2の方法。 - 【請求項6】 前記有核の赤血球の報告が、100個の白血球当りの有核の
赤血球の数であるかまたは、単位体積の血液細胞標本当りの有核の赤血球の絶対
数でである請求項1の方法。 - 【請求項7】 前記血液細胞標本が、ヒトの末梢血液、非ヒトの末梢血液、
ヒトの骨髄、非ヒトの骨髄から選択される請求項1の方法。 - 【請求項8】 有核の赤血球及び白血球を識別する方法であって、 (a)分析のための血液標本を供給し、 (b)前記血液標本から成熟赤血球を溶解し、 (c)前記血液標本をDC及び光散乱測定により分析して、有核の赤血球及び
白血球亜集団を識別し、そこで、有核の赤血球を識別するための前記光散乱測定
が2つの角度の光散乱シグナルを用いて行なわれ、有核の赤血球を識別するため
の第2の光散乱シグナルが中角度光散乱シグナルまたは直角の光散乱シグナルで
あり、そして、 (d)前記血液細胞標本中の有核の赤血球及び白血球亜集団を報告すること を含む前記方法。 - 【請求項9】 第1の光散乱シグナルが低角度光散乱シグナルである請求項
8に記載の方法。 - 【請求項10】 第2の光散乱シグナルが中角度光散乱シグナルである請求
項8に記載の方法。 - 【請求項11】 第2の光散乱シグナルの直角の光散乱シグナルである請求
項8に記載の方法。 - 【請求項12】 第1の光散乱シグナルの範囲が約0°〜約4°である請求
項9の方法。 - 【請求項13】 前記白血球亜集団が、リンパ球、単球、好中球及び好酸球
から選択される請求項8に記載の方法。 - 【請求項14】 前記白血球亜集団の報告が、前記血液標本の単位体積当り
の絶対数または前記血液標本中の総白血球のパーセントでである請求項8の方法
。 - 【請求項15】 前記有核の赤血球の報告が100個の白血球当りの有核の
赤血球の数または血液細胞標本の単位体積当りの有核の赤血球の絶対数でである
請求項8の方法。 - 【請求項16】 前記血液細胞標本がヒトの末梢血、非ヒトの末梢血、ヒト
の骨髄、非ヒトの骨髄から選択される請求項8の方法。
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