JP2002500863A - アポトーシスおよびネクローシスに関するスクリーニング法 - Google Patents

アポトーシスおよびネクローシスに関するスクリーニング法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞の非−、前−もしくは抗−アポトーシス状態およびネクローシス状態の決定法、マーカータンパク質をコードする新規に設計されたベクター、該ベクターでトランスフェクションされた細胞系、ならびに試験化合物の非−、前−もしくは抗−アポトーシス活性またはネクローシス活性のアッセイ方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、マーカータンパク質をコードする新規に設計されたベクター、かか
るベクターをトランスフェクションした細胞系を使用して、細胞の非−、前−も
しくは抗−（non-, pro- or anti-）アポトーシス状態およびネクローシス状態 を決定するための方法、ならびに試験化合物もしくは物理的刺激の非−、前−も
しくは抗−アポトーシス活性またはネクローシス活性をアッセイする方法に関す
る。
【０００２】 従来の技術 アポトーシスは発生、すなわち胚発生および正常細胞の代謝回転だけでなく、
疾患、例えば癌、ＡＩＤＳ、神経変性およびウイルス感染においても重要な役割
を担っている。ネクローシスとは異なって、アポトーシスは細胞の活性な遺伝子
指向性の自己破壊プロセスであり、かつ特徴的な形態学的変化および生化学的変
化に関連している1,2。核および原形質の凝縮ならびに死細胞の膜結合アポトー シス体への断片化はアポトーシスの典型的な特徴である。アポトーシス性の細胞
死の別の特徴は特異的なヌクレアーゼの活性化後の染色体ＤＮＡのオリゴヌクレ
オソーム断片への分解である3 ,4。
【０００３】 アポトーシスは、細胞表層分子Ｆａｓ（ＣＤ９５）とＦａｓ−リガンド（FasL
）との相互作用によって誘発され、その際、Ｆａｓを発現し、かつ感受性の細胞
はアポトーシスを引き起こす。ＦａｓはＩ型の膜タンパク質であり、これは腫瘍
壊死因子（ＴＮＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）受容体ファミリーに属する5- 7 。Ｆａｓの発現は広範な組織および細胞、例えば胸腺、肝臓、肺、卵巣、心臓 および骨髄細胞で見られる9-12。
【０００４】 ＦａｓＬの発現はリンパ球だけでなく、広範な組織および幾つかの腫瘍におい
て見られる13-19。膜結合ＦａｓＬおよびその可溶性形（ｓＦａｓＬ）の両者は Ｆａｓ陽性および感受性の細胞においてアポトーシスを誘発することが可能であ
る。種々のアポトーシスメディエーターのなかの他の形はパーフォリン／グラン
ザイム系、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ系36、サイトカイン欠乏（cytokine dep
rivation）（例えばＩＬ−３欠乏）および放射線照射を含む。
【０００５】 アポトーシスに対して、ネクローシスは細胞膜の化学的または物理的損傷なの
で非生理学的細胞死である。形態学的基準は細胞膨張および細胞溶解、リソソー
ムの漏洩ならびに細胞膜の完全な状態の消失である。
【０００６】 過去１０年間の間に、アポトーシスが幾つかの疾患における主要な役割を担う
ことが明確になってきた。アポトーシスはＡＩＤＳでは増加するが、癌および一
定の自己免疫性増殖疾患においては減少する。
【０００７】 フローサイトメトリーはアポトーシスを測定するための広範な種々の可能性を
提供する。種々の方法が確立および実現されており、その幾つかは細胞表面を染
色し、かつその幾つかは細胞内で染色される。
【０００８】 最初のアプローチの１つは、アポトーシス細胞が収縮し、かつより高い細胞内
顆粒性を有することの観察の他に、ＤＮＡ特異的蛍光色素（例えばプロピジウム
ヨージド［ＰＩ］、エチジウム ブロミド［ＥｔＢｒ］）で染色することである
。致死的な打撃が誘導されたらすぐに、該ＤＮＡはそのプロフィールの変化が始
まる。アポトーシスＤＮＡは断片化されたＤＮＡ（より短いバンド、いわゆるＤ
ＮＡラダーとしてアガロースゲル中で可視化される）からなるだけでなく、部分
的に単一のヌクレオチドにも分解されるので、ＰＩまたはＥｔＢｒのような蛍光
色素はＤＮＡを殆ど染色できない。このことは典型的に、ＦＡＣＳｃａｎTM（ベ
クトン ディキンソン（Becton Dickinson）、ＵＳＡ）における特異的蛍光色素 検出チャンネルでの左側への移行、すなわちサブ−Ｇ１ピーク（sub-G1 peak） で観察される。該方法の大きな欠点は、ＰＩ20のようなＤＮＡ特異的色素で染色
するためにエタノールのような試薬で細胞膜を透過性にする必要があることであ
る。該処理は時間および労力を費やし、かつ細胞の遊離および取り扱いの誤りの
危険が高い。更に、生細胞およびアポトーシス細胞の判別を標準化できず、かつ
大規模な実験を必要とする。
【０００９】 別の方法は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）に媒
介されるＤＮＡの鎖断片の末端標識（ＴＵＮＥＬ）である。ＴＵＮＥＬ法はアポ
トーシスを引き起こす細胞におけるＤＮＡ鎖断片を検出する。ＴｄＴは、二本鎖
または一本鎖の標準ＤＮＡの３’−ＯＨ末端へのデオキシリボヌクレオチド三燐
酸の付加を触媒する酵素である。正常細胞とは異なって、アポトーシス細胞の核
はＴｄＴの存在下に外因性ヌクレオチド（ｄＵＴＰ）−ＤＩＧを取り入れる。蛍
光色素を結合した抗ＤＩＧ抗体断片はアポトーシス細胞の可視化を可能にする。
アポトーシス細胞の増加はより多数のＤＮＡ断片をもたらし、従ってより明るく
蛍光を発する。該方法の利点は非常に高い特異性である21。該方法の欠点は、高
価であり、かつ時間を消費するので少量の試料一組にのみ使用できる。従って、
大量のスクリーニング計画のためには適用できない。
【００１０】 細胞膜の極性の消失ならびにアポトーシスの初期相の間の細胞膜外部でのホス
ファチジルセリン（ＰＳ）量の増加の現れはこれからの新規のアプローチに通じ
ている。アネキシンＶ（Annexin V）はＰＳに対して高い親和性を有するカルシ ウム依存性のリン脂質結合タンパク質である。細胞膜の完全性がネクローシスで
はなくアポトーシスの初期相および中期相で維持されるという事実から、アネキ
シンＶがＤＮＡ色素ＰＩと一緒に付随して使用される場合、アポトーシス細胞と
ネクローシス細胞とを区別することが可能である。初期および中期のアポトーシ
ス細胞はアネキシン−ＦＩＴＣの結合の増加を示し、かつ主にＰＩ染色に関して
陰性である。後期のアポトーシス段階およびネクローシス細胞は、表面上でのＰ
Ｓの現れならびに膜の不完全性からの細胞内核酸のＰＩ染色のため二重陽性にな
る22。また該方法は高価であり、かつ労力を消費する。
【００１１】 クラゲのアエクオレア ビクトリア（Aequora victria）からの緑色蛍光タンパ
ク質（ＧＦＰ）を遺伝子発現ならびにタンパク質の局在をモニタリングするため
に生きている生物中（インビボ）およびインビトロで使用することができる23-2 6 。ＧＦＰ蛍光は安定であり、生細胞中で細胞を冒さずにモニターでき、かつパ ラホルムアルデヒド固定した細胞中でも存続する。緑色蛍光タンパク質のＦＡＣ
Ｓに最適な変異体が開発されている8。これらの変異体の１種（ＧＦＰmut1）が ｐＥＧＦＰベクターに組み込まれて市販されている（クロンテックから）。該変
異体の大きな利点は、ＧＦＰmut1の最大励起ピークが４８８ｎｍであり、発光最
大値が５０７ｎｍであることである。慣用のフローサイトメーターは４８８ｎｍ
で発光するアルゴンレーザーを備えており、既に取り付けられている適当な検出
フィルターを有し、ＧＦＰmut1タンパク質をフローサイトメトリー研究および蛍
光鏡検のための理想的な候補である。
【００１２】 ＧＦＰは既に細胞形態、例えば細胞毒またはアポトーシスによって惹起される
水疱（blebbing）の変化を可視化するためのマーカー、またはトランスフェクシ
ョンマーカー（ＷＯ９７／１１０９４号）、または遺伝子発現を調節する因子の
スクリーニングのためのマーカー（ＷＯ９７／１４８１２号）として使用されて
いる。またＧＦＰはアポトーシス細胞の形態学的変化の進行の検出のためにマー
カータンパク質として使用されている37。
【００１３】 ＧＦＰは市販されているプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック（Clonte
ch））で一過性にトランスフェクションさせた細胞を検出するためにマーカータ
ンパク質として使用されている34。ラム他（Lamm et al）によれば34、アポトー
シスはアポトーシスの部分集団（subpopulation）においてＤＮＡ結合色素ＰＩ の蛍光の減少によって検出された。ＧＰＦ自体をアポトーシスのためのマーカー
として使用できることは認識されていない。ＰＩ染色の大きな欠点は、１つおよ
び同じ細胞の状態の変化をモニターできず、１つの特定の状態だけをモニターで
きることである。それというのもＰＩ染色のために細胞を透過性にさせ、かつ固
定することが必要だからである。
【００１４】 本発明による試験は、一過性トランスフェクションのための前記の従来技術で
使用されるｐＥＧＦＰ−Ｃ１（サイトメガロウイルスＣＭＶプロモーターを有す
る製造者クロンテックから入手）での真核細胞（例えばＡ２０．２Ｊ）の安定ト
ランスフェクションによってＧＦＰmut1遺伝子は殆どまたは全く発現されないこ
とを示している。
【００１５】 前記の理由から、細胞のアポトーシスおよびネクローシスを決定し、かつ特に
前アポトーシス活性または抗アポトーシス活性またはネクローシス活性に関して
化合物を効率的かつ廉価にアッセイするために使用できる新規かつ改善された方
法ならびに手段が必要である。
【００１６】 発明の開示 従って、本発明の課題は細胞のアポトーシスおよび／またはネクローシスの状
態の決定のための改善された方法、ならびに該方法のために有用な改善された手
段を提供することである。
【００１７】 本発明は、前記の議論された必要性を満たし、かつ試験生細胞のアポトーシス
および／またはネクローシスを決定するための方法に関する。該方法は、前記の
試験細胞中のマーカータンパク質のシグナルの変化またはその強度をそれぞれモ
ニタリングすることを含み、特にアポトーシスおよび／またはネクローシス状態
を非−、前−もしくは抗−アポトーシス的またはネクローシス的に活性な化合物
、および／または物理的刺激の存在下にモニターし、かつマーカータンパク質を
コードしかつ発現するＤＮＡでの前記の細胞の安定トランスフェクション後に試
験細胞中で選択的にマーカータンパク質が生産される方法である。
【００１８】 有利なマーカータンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその蛍光変
異体を有する蛍光マーカータンパク質であり、その際、例えばＧＦＰmut1が特に
有利である。
【００１９】 本発明の別の課題は、トランスフェクション、有利には前記のマーカータンパ
ク質、有利には蛍光タンパク質、特にＧＦＰまたはその変異体を高度に発現可能
な試験細胞の安定トランスフェクションのための新規のベクターである。公知の
ｈＥＦ−１αプロモーター、ならびにＣＭＶおよびＭｏＬＶ−ＬＴＲプロモータ
ーの新規の組合せがＧＦＰmut1遺伝子の転写の促進のために適していることが判
明した。
【００２０】 本発明の別の課題は、前記のベクターで安定にトランスフェクションされた生
細胞または生細胞系のそれぞれである。かかる細胞系は試験化合物の非−、前−
もしくは抗−アポトーシス活性もしくは抗アポトーシス活性またはネクローシス
活性を測定するためにアッセイで使用することができる。例えば異なるシグナル
の同時の検出のために、生細胞を異なるマーカー分子を有する１種より多いベク
ターでトランスフェクションすることも可能であるが、通常１つのマーカーが十
分である。
【００２１】 本発明の別の課題は、生細胞において試験化合物の非−、前−もしくは抗−ア
ポトーシス活性またはネクローシス活性をアッセイする方法である。該方法は、
マーカータンパク質をコードしかつ発現する少なくとも１種のベクターで前記の
細胞の群に安定にトランスフェクションすることを含む。トランスフェクション
された細胞を試験化合物を有する適当な培養培地で処理する。シグナルの変化お
よびシグナルの強度のそれぞれ、すなわち前記の細胞の群で発現したマーカータ
ンパク質の増減を慣用の方法でモニターし、かつ試験化合物に暴露していないが
、同様に処理した同じ細胞の並行群で観察された結果と比較する。試験化合物は
、例えば組合せ化学法から得られるような多様な化合物からなっていてよい。試
験化合物および／または物理的刺激の影響下での正常細胞および癌細胞のアポト
ーシス状態またはネクローシス状態に特に関心が持たれている。
【００２２】 本発明の方法の特定の態様において、試験細胞および細胞系は関心が持たれて
いるタンパク質、例えばアポトーシス阻害物質またはアポトーシス刺激物質を発
現する試験遺伝子でトランスフェクションする。
【００２３】 本発明の前記のおよび他の特徴、態様ならびに利点は、以下の本発明の実施様
式の記載、従属形式請求項および付属の図面を参照してより良好に理解されるは
ずである。
【００２４】 図面の簡単な説明 図１：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１プラスミド。ヒトの
ＥＦ−１αのプロモーターをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）ベクター（
ストラタジーン（Stratagen））にＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを使用してク ローニングした。
【００２５】 図２：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α＋ＧＦＰプラスミ
ド。ＧＦＰmut1（pEGFP-C1から、クロンテック）をコードする遺伝子をｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１αプラスミドにＸｂａＩおよびＳｓｐ
Ｉを使用してクローニングした。
【００２６】 図３：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲプラスミド。ＭｏＬＶ−ＬＴＲプ
ロモーターをｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（クロンテック）にＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＥｃｏＲＩを使用してクローニングした。
【００２７】 図４：トランスフェクションしていない生きているＡ２０とＧＦＰ−トランス
フェクションした生きているＡ２０ＧＦＰとの間でのＦＬ−１チャネルで測定し
た蛍光能力の差異を示しているＦＡＣＳ−ヒストグラム。
【００２８】 図５：トランスフェクションしていない生きているＢＰ３ｃとＧＦＰ−トラン
スフェクションした生きているＢＰ３ｃＧＦＰとの間でのＦＬ−１チャネルで測
定した蛍光能力の差異を示しているＦＡＣＳ−ヒストグラム。
【００２９】 図６ａ：トランスフェクションしていない生きているＪｕｒｋａｔとＧＦＰ−
トランスフェクションした生きているＪｕｒｋａｔＧＦＰとの間でのＦＬ−１チ
ャネルで測定した蛍光能力の差異を示しているＦＡＣＳ−ヒストグラム。
【００３０】 図６ｂ：アポトーシスＪｕｒｋａｔＧＦＰ（組み換えヒトＴＲＡＩＬで誘発し
た）と比較した生きているＪｕｒｋａｔＧＦＰの蛍光強度を示すＦＡＣＳ−ヒス
トグラム。
【００３１】 図７ａ：生きているＡ２０ＧＦＰの細胞寸法（ＦＳＣ）および粒状性（granul
arity）を示すＦＡＣＳドットプロット。
【００３２】 図７ｂ：生きているＡ２０ＧＦＰの典型的なＧＦＰ−関連の蛍光プロフィール
を示すＦＡＣＳ−ヒストグラム。
【００３３】 図８ａ：ｓＦａｓＬ ＳＮ処理された、従って主にアポトーシスＡ２０ＧＦＰ の収縮および顆粒密度（granular density）の増加を示すＦＡＣＳドットプロッ
ト。
【００３４】 図８ｂ：ｓＦａｓＬ ＳＮ処理された、従って主にアポトーシスＡ２０ＧＦＰ のＧＦＰ関連の蛍光の減少を示すＦＡＣＳ−ヒストグラム。
【００３５】 図８ｃ：蛍光が高い生きているＡ２０ＧＦＰ（Ｒ１）と蛍光が低いアポトーシ
スＡ２０ＧＦＰ（Ｒ２）との間の差異を示すＦＡＣＳドットプロット。
【００３６】 図８ｄ：蛍光が高い生きているＡ２０ＧＦＰ（図８ｃからのゲートＲ２）のＦ
ＡＣＳドットプロット。蛍光が高いＡ２０ＧＦＰ細胞（Ｒ１）は主に収縮せず、
かつ細胞集団の顆粒密度は高くない（典型的な生細胞のパターン）。
【００３７】 図８ｅ：蛍光が低いアポトーシスＡ２０ＧＦＰ（図８ｃからのゲートＲ２）の
ＦＡＣＳドットプロット。蛍光が低いＡ２０ＧＦＰ細胞は主に収縮し、かつ細胞
母集合は顆粒密度が高い（典型的なアポトーシス細胞の特徴）。
【００３８】 図９ａ：生きているＡ２０ＧＦＰ（エタノール処理およびＰＩ−染色した）の
細胞寸法および顆粒性パターンを示すＦＡＣＳドットプロット。
【００３９】 図９ｂ：ＰＩ染色した生きているＡ２０ＧＦＰの典型的なＤＮＡパターンを示
すＦＡＣＳ−ヒストグラム。
【００４０】 図１０ａ：ｓＦａｓＬ ＳＮ処理したＡ２０ＧＦＰ（エタノール処理およびＰ Ｉ−染色した）の収縮を示すＦＡＣＳドットプロット。
【００４１】 図１０ｂ：ｓＦａｓＬ ＳＮ処理したＡ２０ＧＦＰにおけるアポトーシスに関 する証明としてのＤＮＡの断片化（サブ−Ｇ１ピーク＝Ｍ１で表される）を示す
ＦＡＣＳ−ヒストグラム。
【００４２】 図１１：アポトーシスＡ２０ＧＦＰ、ネクローシスＡ２０ＧＦＰおよび生きて
いるトランスフェクションしていないＡ２０を比較した生きているＡ２０ＧＦＰ
の蛍光強度を示すＦＡＣＳ−ヒストグラム。
【００４３】 図１２ａ：Ａ２０ＧＦＰにおけるｓＦａｓＬ ＳＮによるアポトーシスの誘発 を示すＦＡＣＳ−ヒストグラム（対照実験は図１２ｂ）。
【００４４】 図１２ｂ：ＡｃｔＤおよびＣＨＸの存在下でのＡ２０ＧＦＰにおけるｓＦａｓ
Ｌ ＳＮによるアポトーシスの誘発を示すＦＡＣＳ−ヒストグラム。ＧＦＰ−関 連の蛍光の減少またはアポトーシスの阻害は両者とも観察できなかった。
【００４５】 図１３：ＩＬ−３処理の抗アポトーシス効果を示すＦＡＣＳ−ヒストグラム。
アポトーシスＰＢ３ｃＧＦＰ細胞は、ＩＬ−３処理された、従って生きているＰ
Ｂ３ｃＧＦＰと比較したより低いＧＦＰ−関連の蛍光強度を示す。
【００４６】 図１４：生きているＪｕｒｋａｔＧＦＰと比較したＧＦＰ−関連のアポトーシ
スＪｕｒｋａｔＧＦＰ細胞における蛍光の減少として可視化されたＪｕｒｋａｔ
ＧＦＰにおけるｓＦａｓＬ ＳＮの前アポトーシス効果を示すＦＡＣＳ−ヒスト グラム。
【００４７】 図１５：トランスフェクションしていない生きているＤＭとＧＦＰ−トランス
フェクションした生きているＤＭＧＦＰとの間でのＦＬ−１チャネルで測定した
蛍光能力の差異を示しているＦＡＣＳ−ヒストグラム。
【００４８】 図１６：ハイグロマイシン遺伝子（pREP4から、インビトロゲン）を有するｐ ＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲＭｏＬＶ−ＬＴＲプラスミド。ＭｏＬＶ−Ｌ
ＴＲプロモーター（pLXSNから、クロンテック）をｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（ クロンテック）にＳｍａＩおよびＳａｃＩＩを使用してクローニングした。ハイ
グロマイシン遺伝子（ＮｒｕＩで消化したｐＲＥＰ４から）をＡｓｅＩで前消化
したｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲベクターにクローニングした。
【００４９】 本発明の実施様式 細胞のアポトーシス状態および／またはネクローシス状態は物理的、例えば照
射によるか、または化学的、例えば前アポトーシス的もしくはネクローシス的に
活性な化合物または他の活性化合物での処理によっても誘発することができる。
【００５０】 該方法のために使用できるマーカータンパク質は、その物理的および／または
化学的特性、例えば少なくとも２回の種々の回数でシグナル、すなわちシグナル
の変化を測定可能にする蛍光によって検出可能なタンパク質である。更に適当な
マーカータンパク質は、生細胞およびアポトーシス状態の細胞および／またはネ
クローシス状態の細胞によってそのシグナルが変化する必要がある。これらは直
接細胞に導入するか、またはマーカータンパク質を発現するベクターでトランス
フェクションした後に内部で生産させることができる。マーカータンパク質の直
接の導入はこの分野で公知の方法、例えばリポソームの使用によって達成するこ
とができる。試験細胞は脂質、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥTM試薬で一過
性にトランスフェクションされるか、または遺伝子銃もしくは他の適当な方法で
、かつ有利にはエレクトロポレーションまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔ試薬によって
選択的に安定にトランスフェクションされる。有用なベクターはＲＮＡまたは、
有利にはＤＮＡ由来のベクターである。マーカータンパク質は、マーカータンパ
ク質をコードし、かつ発現するベクター、通常ＤＮＡベクターでのトランスフェ
クション後に試験細胞で生産される。有用なマーカータンパク質は公知であり、
かつ任意の検出可能なタンパク質、特に蛍光タンパク質、例えば青色蛍光タンパ
ク質（ＢＦＰ）、緑色蛍光タンパク質、例えばＧＦＰｕｖもしくはＧＦＰｗｔを
含む。有利なマーカータンパク質はＧＦＰmut1である。
【００５１】 細胞中に存在するインタクトなマーカータンパク質（マーカー機能）の量は物
理的および／または化学的特性またはマーカータンパク質の相互作用、有利には
蛍光によって可視化することができる。ネクローシス状態において、マーカータ
ンパク質はアポトーシス状態と比較してより迅速かつ完全にその機能を失う。ネ
クローシス状態において、マーカー機能は数時間以内（通常１００％のネクロー
シスは１〜２時間以内に得られる）に失われるが、一方では機能の消失はアポト
ーシス状態下では遅延する。ネクローシスに対して、アポトーシスは特定の細胞
系および特定のアポトーシス誘発物質に依存し、かつ通常８時間以上を費やす。
この時間の差異もまた前記の２種の細胞状態の判別を可能にする。
【００５２】 有用な可視化は生細胞において、有利には培養培地中の生細胞において、呈色
反応または優先的に蛍光測定によって実施可能である。検出装置はフローサイト
メトリー、例えばＦＡＣＳｃａｎTM、蛍光プレートリーダー（platereader）、 例えばＦＬＩＰＲTM、または任意の他の適当な検出装置を含む。使用される収集
装置はＦＡＣＳｃａｎTMである。以下のパラメーターを選択的に測定する： −細胞寸法の尺度としてのＦＳＣ高さ（FSC-Height）（前方散乱）、 −細胞の内部顆粒性（密度）の尺度としてのＳＳＣ高さ（SSC-Height）（側方散
乱）、 −緑色蛍光（例えばＧＦＰmut1の）をＦＡＣＳｃａｎTMにおいてＦＬ−１チャネ
ル（ＦＬ−１高さ）で可視化する。
【００５３】 この結果はドットプロットおよび／またはヒストグラムでの可視化（図４〜図
１５参照）の後に比較する。
【００５４】 有用な試験細胞は真核細胞および原核細胞を含む。原核細胞は細菌細胞および
藍細菌細胞を含む。真核細胞はホニュウ類細胞、菌類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞
、蠕虫細胞、魚類細胞、甲殻類細胞、は虫類細胞、両生類細胞および植物細胞な
らびにその細胞系を含む。該方法において使用できる試験細胞は任意の型の、選
択的に正常な、すなわち遺伝的に無変化の、例えばウイルス、寄生体、細菌もし
くはプリオンに感染した腫瘍細胞または遺伝的に操作または変化させられたヒト
もしくは動物由来の細胞であり、これらはマーカー遺伝子を発現するベクターを
有してインビトロで培養できるが、またマーカー遺伝子で形質転換された細菌は
抗生物質でのスクリーニングにおいて使用することができる。このような試験細
胞は、例えばリンパ球、例えばＡ２０．２Ｊ、Ｊｕｒｋａｔ、マスト細胞、例え
ばＰＢ−３ｃ、またはメラノーマ細胞、例えばＤＭであり、これらにＤＮＡベク
ターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α＋ＥＧＦＰまた
はｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲのそれぞれをトランスフェクションし、
名称Ａ２０ＧＦＰ、ＰＢ３ｃＧＦＰ、ＪｕｒｋａｔＧＦＰもしくはＤＭＧＦＰの
生細胞系が得られる。
【００５５】 転写および翻訳の調節、例えば阻害は本発明の方法には必要ないことが判明し
た。
【００５６】 同じ理由のため、マーカータンパク質の直接の導入または一過性にトランスフ
ェクションした細胞でのマーカータンパク質の発現は良好な結果をもたらす。
【００５７】 しかしながら、再現的研究を含む研究のため、安定にトランスフェクションし
た細胞系の使用は更に有利である。長期にわたり高度にかつ安定に発現する安定
に形質転換させた細胞系は前記のＤＮＡベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α＋ＥＧＦＰおよびｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−Ｌ
ＴＲもしくは他の選択マーカー、例えばハイグロマイシンをコードする遺伝子（
例えば図１６参照）および／または試験すべきタンパク質、例えば可能な、また
は公知のアポトーシス阻害剤もしくは刺激物を発現する遺伝子を有するその変異
体を使用して得ることができる。
【００５８】 前記の１つのベクターを有する安定にトランスフェクションした細胞を使用し
て、非常に信頼性があり、かつ非常に良好に再現可能な結果が、検出可能な％の
範囲の差異で得られた。
【００５９】 有利な方法において、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその蛍光変異体（
例えばＧＦＰmut1）の存在を蛍光強度を測定するフローサイトメーターによって
モニタリングする。一般に、２つの群の試験細胞を使用し、規定数の細胞（例え
ば癌細胞）のそれぞれを本発明によるＤＮＡベクターでトランスフェクションす
る。検出装置に依存して、試験管中の試験細胞の数は１〜５０００００００，通
常５〜５０００００００であるが、フローサイトメトリーのためには１００００
〜５０００００が有利に使用される。有利な方法において、２つの群の試験細胞
が使用され、規定数の細胞（例えば癌細胞）のそれぞれを本発明による任意のベ
クターでトランスフェクションし、培養培地中で１つの群を試験化合物と一緒に
インキュベートし、両者の群の細胞を、通常高エネルギーの波長を有する励起ビ
ーム、特にアルゴンレーザーで刺激し、各群の細胞の蛍光強度をフローサイトメ
ーターによって、目下のＦＬ−１チャネル（ＦＬ−１高さ）で測定し、かつ２つ
の群の細胞の得られた蛍光強度を比較する。
【００６０】 本発明の別の態様は前記の方法において有用なベクターに関する。本発明によ
るベクターは、１種以上の強力なプロモーター、有利にはｈＥＦ−１αプロモー
ター、ＭｏＬＶ−ＬＴＲプロモーターまたはＣＭＶとＭｏＬＶ−ＬＴＲプロモー
ターとの組合せに操作して結合され、かつマーカータンパク質をコードする遺伝
子を有している。ＥＦ−１α（伸長因子−１α）染色体遺伝子のプロモーターは
効率的にインビトロ転写を刺激する28。ＥＦ−１αはアミノアシル−ｔＲＮＡの
リボソームへのＧＴＰ依存性結合を真核細胞において促進する。ＥＦ−１αは真
核細胞において最も豊富なタンパク質の１つであり、かつ殆ど全ての種類のホニ
ュウ類細胞で発現している。ＭｏＬＶ−ＬＴＲ（モロニー白血病ウイルスの末端
反復配列）は非常に効率的なプロモーターである33。前記のことから、ＥＦ−１
αおよびＭｏＬＶ−ＬＴＲプロモーターは所望の遺伝子の転写を促進する有利な
候補であることが判明した。
【００６１】 有利なベクターはＧＦＰまたはその蛍光変異体をコードする遺伝子を有する。
これらは、特にマーカータンパク質であるＧＦＰmut1を発現することが可能であ
る。このようなベクターは、特にプラスミドのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ
（＋）＋ＥＦ−１α＋ＥＧＦＰまたはｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲであ
る。
【００６２】 有利には、１種以上の強力なプロモーターを有するベクターを使用して、マー
カータンパク質、有利にはＧＦＰmut1をコードする遺伝子の高度の発現が得られ
る。
【００６３】 前記のベクターはこの分野に公知の方法によって製造される。
【００６４】 本発明の別の態様は前記の方法に有用な生細胞系に関する。有利な生細胞系を
本発明による有利なベクターでトランスフェクションし、かつこれらをＡ２０Ｇ
ＦＰ、ＰＢ３ｃＧＦＰ、ＪｕｒｋａｔＧＦＰまたはＤＭＧＦＰと呼称する。
【００６５】 Ａ２０．２Ｊは選択的にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α
＋ＥＧＦＰベクターでトランスフェクションするが、Ｊｕｒｋａｔ、ＰＢ−３ｃ
およびＤＭはｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲベクターでトランスフェクシ
ョンする。細胞にトランスフェクションさせる適当な方法は当業者に公知であり
、例えばエレクトロポレーションであるか、またはＳｕｐｅｒＦｅｃｔ試薬を使
用するものである。トランスフェクションした細胞を単個細胞アッセイ（single
cell assay）によって選択し、トランスフェクションした細胞系をクローン的 かつ安定に得る。選択法は、相同の高度にＧＦＰを発現する細胞系を得るための
選択された細胞の狭い範囲での高度のＧＦＰ発現（高い蛍光強度）ならびにＧＦ
Ｐ蛍光を含む。
【００６６】 また本発明の方法に適当な細胞または細胞系は試験遺伝子、すなわちアポトー
シスまたはアポトーシス状態におけるその効果が研究されているべき遺伝子、例
えばアポトーシス阻害物または刺激物、また抗アポトーシス遺伝子または前アポ
トーシス遺伝子とも呼ばれる遺伝子でトランスフェクションした細胞または細胞
系である。また前記細胞もしくは細胞系は薬剤スクリーニング法におけるか、ま
たは該細胞もしくは細胞系に適用される試験物質の効果を測定するために適切に
使用できる。
【００６７】 抗アポトーシス遺伝子は、例えばｂｃｌ−２、ｂｃｌｘLおよびＦＬＩＰ（Ｆ ＬＩＣＥ阻害タンパク質）であり、かつ前アポトーシス遺伝子は、例えばｂａｘ
、ｂｃｌ−Ｘsおよびｂａｄである。
【００６８】 トランスフェクションされた細胞を製造するための方法およびベクターは当業
者に公知であり、かつ本発明のために適当でありかつ抗アポトーシス遺伝子もし
くは前アポトーシス遺伝子でトランスフェクションさせた細胞または細胞系のそ
れぞれの製造のために適用可能である。
【００６９】 一方、ＧＦＰでのトランスフェクションに関しては、本発明のベクターが有利
であるが、抗アポトーシス遺伝子または前アポトーシス遺伝子でのトランスフェ
クションは、有利には安定なトランスフェクションのために適当な任意のベクタ
ーを使用して実施できる。
【００７０】 別の態様においては、本発明は新規または公知の試験化合物の非−、前−もし
くは抗−アポトーシスまたはネクローシスの活性を測定するためのアッセイに関
する。該試験は、規定数のトランスフェクションしかつ選択された細胞を試験化
合物および／または物理的刺激、例えばソニケーションまたは照射と共に適当な
培養培地中でインキュベートして実施する。選択的に、条件あたり２５００００
細胞が使用される。細胞が生存し、かつ／または増殖する任意の培養培地を使用
できる。有利な培養培地は、例えばＡ２０ＧＦＰおよびＤＭＧＦＰのためにはＩ
ｓｃｏｖｅの培養培地（Iscove's）、ＰＢ３ｃＧＦＰのためにはＩｓｃｏｖｅの
培養培地＋ＩＬ−３、かつＪｕｒｋａｔＧＦＰのためにはＲＰＭＩを含む。
【００７１】 比較および標準化の目的のために、有用なアポトーシス化合物は、例えばタン
パク質、例えばＦａｓＬ、脂肪酸、例えばセラミド、ステロイド、例えばコルチ
ゾール、抗生物質、例えばブレオマイシンならびにその他である。Ａ２０ＧＦＰ
のための有利なアポトーシス物質はＦａｓＬである。ＪｕｒｋａｔＧＦＰのため
の有利なアポトーシス物質はＦａｓＬもしくはＴＲＡＩＬである。ＰＢ３ｃＧＦ
Ｐのための抗アポトーシス物質はＩＬ−３である。毒性およびそれによるネクロ
ーシスは広範な物質により誘発されうる。ネクローシスの有利な誘発はＡ２０Ｇ
ＦＰ上での抗体＋補体の使用を含む。
【００７２】 細胞を種々の温度で培養できるが、アッセイのためには試験細胞を有利にはア
ッセイの時間の間３７℃で培養する。
【００７３】 ＦＡＣＳ分析において、１００００個の細胞を通常２５００００細胞のプール
から評価する。
【００７４】 トランスフェクションされた生細胞は、トランスフェクションされたアポトー
シス細胞と比較して高レベルの特定の蛍光強度を示すが、一方アポトーシス細胞
は数時間後にその蛍光能力の部分を失う（蛍光検出チャネルＦＬ−１で測定して
左に移行する）。他方ではネクローシス細胞は２時間以内にその全ての蛍光能力
を失い、かつその時点でトランスフェクションしていない細胞との区別が不可能
になる。
【００７５】 実験の設定を単一のパラメーター（マーカータンパク質、例えばＧＦＰmut1）
に減らすこと、ならびに標準化の可能性は本発明を有用にし、非−、前−もしく
は抗−アポトーシス物質およびネクローシス物質および／または物理的刺激のス
クリーニング法を改善する。標準化は、トランスフェクションおよび選択の方法
、蛍光測定、トランスフェクションされた細胞の数、使用される試験化合物の量
、物理的刺激の種類および強度、ならびに他の標準化パラメーター、例えばフロ
ーサイトメーターおよび／または任意の他の適当なスクリーニング装置、例えば
蛍光プレートリーダーの設定に関して可能にする。
【００７６】 本発明はその一定の有利な態様に関して相当詳細に記載しているが、他の態様
または様式も可能であることを留意すべきである。特定の細胞系、例えば特異的
な癌細胞系、例えばヒトの胸、肺、脳、結腸、前立腺の悪性腫瘍およびその類似
物における、例えば非−、前−もしくは抗−アポトーシス的またはネクローシス
的に活性な化合物の効果の検出のために、関連の細胞系を本発明のベクターで安
定にトランスフェクションするか、または他の容易に検出可能なタンパク質をコ
ードするベクターを構築し、かつトランスフェクションのために使用してよい。
従って、本発明の請求の範囲の精神および範囲は本明細書に含まれる有利な様式
の記載に制限されるべきでない。
【００７７】 以下の実施例は本発明をより詳細に記載するが、これらは本発明の制限として
解釈すべきでない。
【００７８】 例１：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α＋ＥＧＦＰの構築 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α＋ＥＧＦＰプラスミド（
図２参照）の構築のために、ヒトのＥＦ−１α（ｐＥＦ−ＢＯＳから、Ｓ．Ｎａ
ｇａｔａ27のご好意による）のプロモーターならびにＧＦＰmut1（ｐＥＧＦＰ−
Ｃ１から、クロンテック）をコードする遺伝子ＥＧＦＰ＋ＳＶ４０ポリＡをｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）ベクター（ストラタジーン）にクローニング
した。
【００７９】 第１工程で、ヒトのＥＦ−１α（ｐＥＦ−ＢＯＳから）のプロモーターをＸｂ
ａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで事前に消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（
＋）ベクターにクローニングした。
【００８０】 得られたＥＦ−１αプロモーター断片は、ｐＥＦ−ＢＯＳのＨｉｎｄＩＩＩお
よびＸｂａＩ消化後に、１１８８ｂｐの長さを有するが、他の得られた断片はｐ
ＥＦ−ＢＯＳ骨格に相当する。
【００８１】 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）は唯一のＸｂａＩ制限部位（位置６７
７）および唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（位置７１９）を有している。Ｘｂａ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化後に得られる２つの断片はそれぞれ２９１９ｂｐお
よび４２ｂｐの長さを有する。
【００８２】 ｐＥＦ−ＢＯＳベクター３μｇをエッペンドルフチューブ（チューブａ）中で
１μｌのＨｉｎｄＩＩＩ（ベーリンガーマンハイム、１２Ｕ／μｌ）、１μｌの
ＸｂａＩ（ニューイングランドバイオラブス（New England Biolabs）、２００ ００Ｕ／ｍｌ）、制限酵素のための１０×インキュベーションバッファーＢ（ベ
ーリンガーマンハイム）３μｌならびに最終容量３０μｌに合わせるための再蒸
留水２０μｌと一緒に混合した。別のエッペンドルフチューブ（チューブｂ）に
おいて、３μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）を１μｌのＨｉｎｄＩ
ＩＩ、１μｌのＸｂａＩ、制限酵素のための１０×インキュベーションバッファ
ーＢ３μｌならびに最終容量３０μｌに合わせるための再蒸留水２０μｌと一緒
にピペッティングした。両方のエッペンドルフチューブ（チューブａおよびｂ）
を３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後に、１１μｌのＤ
ＮＡローディングバッファー（水中のシグマ社の０．２５％のブロモフェノール
ブルー、シグマ社の０．２５％のキシレンシアノールおよびファルマシア社の１
５％のフィコール（Ficoll）タイプ４００）を両方のチューブに添加し、その後
に内容物を０．６％の低融点（ＬＭＰ）アガロース（ベテスダ リサーチ ラボラ
トリーズ（Bethesda Research Laboratories））ゲル上の別々のスロットにロー
ドした。３番目のスロットに、１ｋｂのＤＮＡラダー（プロメガ）の１：３でＤ
ＮＡローディングバッファーで希釈した９μｌをゲル上にロードした。０．６％
のＬＭＰアガロースゲルを、１×ＴＡＥ（５０×ＴＡＥの濃縮ストック溶液（１
リットルあたり）：トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（メルク）２４
２ｇ、氷酢酸（メルク）５７．１ｍｌ、０．５ＭのＥＤＴＡ（シグマ）１００ｍ
ｌならびに最終容量１リットルにするための再蒸留水）５０ｍｌ中でＬＭＰアガ
ロース０．３ｇを混合し、溶解するまで混合物を加熱し、かつ最終濃度１μｇ／
ｍｌまでエチジウムブロミド溶液（シグマ）を添加することによって製造した。
ゲル泳動は６０〜９０分間６０〜７０ボルトで実施する。ゲル中のエチジウムブ
ロミド染色されたＤＮＡバンドを３００ｎｍのＵＶ光で可視化し、かつそのサイ
ズを１ｋｂのＤＮＡラダーと比較して決定した。消化したｐＥＦ−ＢＯＳベクタ
ーからの１１８８ｂｐ長の断片（ＥＦ−１αプロモーター）を有するＤＮＡバン
ドならびに消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）からの２９１９ｂｐ
長の断片を有するＤＮＡバンドをＬＭＰアガロースゲルから切り出し、かつ２つ
の異なるエッペンドルフチューブに入れた。両方のチューブを簡単に遠心分離し
、６５℃で５分間インキュベートした。その後、２９１９ｂｐ長の断片（Ｈｉｎ
ｄＩＩＩおよびＸｂａＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋））３．
５μｌを別々のエッペンドルフチューブ中で１１８８ｂｐ長の断片（ＨｉｎｄＩ
ＩＩおよびＸｂａＩ消化したｐＥＦ−ＢＯＳからのＥＦ−１αプロモーター）７
μｌと一緒に混合し、簡単に遠心分離した。該混合物を３７℃で冷却し、６５℃
で５分間インキュベートし、次いで以下のライゲーション混合物を添加した：１
０×ライゲーションバッファー（アプリジーン（Appligene）、Ｔ４ＤＮＡリガ ーゼ）２μｌ、再蒸留水７．５μｌならびにＴ４ＤＮＡリガーゼ（アプリジーン
、５Ｕ／μｌ）１μｌ。ライゲーション反応物を１５℃で一晩インキュベートし
た。
【００８３】 新たにライゲーションしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１
αをワンショット（One shot）TMコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（インビトロゲン）
中にインビトロゲンの製造者のプロトコールに従って形質転換させた。
【００８４】 ライゲーション反応物１０μｌをコンピテントＥ．ｃｏｌｉの形質転換のため
に使用した。形質転換混合物５０、１００および２００μｌを種々のアンピシリ
ン含有ＬＢアガープレート（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０
ｇ、バクトアガー（ディフコ ラボラトリーズ（Difco Laboratories）、デトロ イト、ミシガン）２０ｇ、ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整し、水で最終容量を１
リットルに合わせ、オートクレーブし、該アガー培地を５５℃に冷却し、アンピ
シリンを添加して最終濃度５０μｇ／ｍｌにし、かつプレートに１０〜１５ｍｌ
／プレートで注いだ）上にプレーティングした。次いでプレート／形質転換混合
物を３７℃で一晩インキュベートした。翌日、種々の細菌コロニーを、小規模の
プラスミドＤＮＡ単離（マニアティス他（Maniatis et al）32に記載されるアル
カリ分解法によって）による組み換えＤＮＡクローンの更なる分析のために採取
した。
【００８５】 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）中にクローニングされたＥＦ−１αプ
ロモーター断片の存在を確認するために、単離したＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＸｂａＩ制限酵素消化を実施し（制限酵素のための１０×インキュベーション
バッファーＢ３μｌ、アルカリ分解法からのプラスミドＤＮＡ５μｌ、再蒸留水
２２μｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ１μｌ、ＸｂａＩ１μｌを一緒にエッペンドルフチュ
ーブ中で混合し、３７℃で３時間インキュベートした）、１％のアガロース（バ
イオラッド）ゲル上にロードし、引き続き３００ｎｍのＵＶ光で可視化し、かつ
分析した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ消化後に予想される１１８８ｂｐ長の
断片を観察し、従ってクローニングした断片の存在が確認された（図１参照）。
【００８６】 新たに構築したプラスミドを大量に得るために、大規模のプラスミドＤＮＡ単
離をキアゲン プラスミド マキシ プロトコール（Qiagen Plasmid Maxi Protoco
l）に従って実施した。
【００８７】 第２工程で、ＥＧＦＰ＋ＳＶ４０ポリＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｃ１由来）をＸｂａＩ
およびＳｓｐＩで事前に消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ
−１α中にクローニングした。
【００８８】 ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（クロンテック）は唯一のＮｈｅＩ制限部位（位置
５９２）および２個のＳｓｐＩ制限部位（位置１６６４および位置２２１７）を
有している。ＮｈｅＩおよびＳｓｐＩ消化後に得られる３つの断片はそれぞれ３
１０６ｂｐ、１０７２ｂｐおよび５５３ｂｐの長さを有する。
【００８９】 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α（図１参照）は１つのＸ
ｂａＩおよび２つのＳｓｐＩ制限部位を有しＸｂａＩおよびＳｓｐＩ消化後に得
られる３つの断片はそれぞれ３３１９ｂｐ、６５８ｂｐおよび１３０ｂｐの長さ
を有する。
【００９０】 ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターのうち、４．２μｇをエッペンドルフチューブ（チ
ューブ１）中でＮｈｅＩ（ニューイングランドバイオラブス、４０００Ｕ／ｍｌ
）１μｌ、ＳｓｐＩ（ベーリンガーマンハイム、１０Ｕ／μｌ）１μｌ、制限酵
素のための１０×インキュベーションバッファーＭ（ベーリンガーマンハイム）
３μｌならびに最終容量３０μｌにする再蒸留水１８μｌと一緒に混合した。別
のエッペンドルフ（チューブ２）中で、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）
＋ＥＦ−１α３〜４μｇを、ＸｂａＩ１μｌ、ＳｓｐＩ１μｌ、制限酵素のため
の１０×インキュベーションバッファーＨ（ベーリンガーマンハイム）３μｌな
らびに最終容量３０μｌにする再蒸留水１８μｌと一緒にピペッティングした。
両方のエッペンドルフチューブ（チューブ１および２）を３７℃で４時間インキ
ュベートした。インキュベート後に、１１μｌのＤＮＡローディングバッファー
を両方のチューブに添加し、かつその後に内容物を０．６％の低融点（ＬＭＰ）
アガロースゲル上の別々のスロットにロードした。３番目のスロットに、１ｋｂ
のＤＮＡラダーをＤＮＡローディングバッファーで１：３希釈した９μｌをゲル
上にロードした。ゲル泳動は６０〜７０ボルトで６０〜９０分間実施した。ゲル
中のエチジウムブロミド染色されたＤＮＡバンドを３００ｎｍのＵＶ光で可視化
し、かつそのサイズを１ｋｂのＤＮＡラダーと比較して決定した。消化したｐＥ
ＧＦＰ−Ｃ１ベクターからの１０７２ｂｐ長の断片を有するＤＮＡバンドならび
に消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１αからの３３１９
ｂｐ長の断片を有するＤＮＡバンドをＬＭＰアガロースゲルから切り出し、かつ
２つの異なるエッペンドルフチューブに入れた。両方のチューブを簡単に遠心分
離し、かつ６５℃で５分間インキュベートした。その後に、３３１９ｂｐ長の断
片（ＸｂａＩおよびＳｓｐＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋
ＥＦ−１α）３．５μｌを別々のエッペンドルフチューブ中で１０７２ｂｐ長の
断片（ＮｈｅＩおよびＳｓｐＩ消化したｐＥＧＦＰ−Ｃ１からのＥＧＦＰ＋ＳＶ
４０ポリＡ）７μｌと一緒に混合し、６５℃で５分間インキュベートし、かつ簡
単に遠心分離した。該混合物を３７℃に冷却し、次いで以下のライゲーション混
合物を添加した：１０×のライゲーションバッファー２μｌ、再蒸留水７．５μ
ｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ。ライゲーション反応物を１５℃で一晩イン
キュベートした。
【００９１】 新たにライゲーションさせたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−
１α＋ＥＧＦＰをワンショットTMコンピテント細胞のＥ．ｃｏｌｉ（インビトロ
ゲン）中にインビトロゲンの製造者のプロトコールに従って形質転換した。ライ
ゲーション反応物１０μｌをコンピテントのＥ．ｃｏｌｉの形質転換のために使
用した。形質転換混合物５０、１００および２００μｌの形質転換混合物を種々
のアンピシリン含有ＬＢプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュ
ベートした。翌日、種々の細菌コロニーを小規模のプラスミドＤＮＡ単離（マニ
アティス他7に記載されるアルカリ分解法に従って）によって組み換えＤＮＡク ローンの更なる分析のために採取した。
【００９２】 新たに構築したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α＋ＥＧＦ
Ｐベクター（図２参照）は２つのＳａｌＩ制限部位を有し、１つはｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）骨格中に、かつもう１つはクローニングしたＥＧＦＰ
＋ＳＶ４０ポリＡ断片中に有する。
【００９３】 ＳａｌＩ消化後に得られる２つの断片はそれぞれ１９８１ｂｐおよび２４１０
ｂｐの長さを有する。
【００９４】 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α中にクローニングされた
ＥＧＦＰ＋ＳＶ４０ポリＡ断片の存在を確認するために、単離したＤＮＡのＳａ
ｌＩ制限酵素消化を実施し（１０×の制限酵素のためのインキュベーションバッ
ファーＨ３μｌ、アルカリ分解法からのプラスミドＤＮＡ５μｌ、再蒸留水２２
μｌ、ＳａｌＩ（アプリジーン、１０Ｕ／μｌ）１μｌを一緒にエッペンドルフ
チューブ中で混合し、かつ３７℃で３時間インキュベートする）、１％のアガロ
ースゲル上にロードし、引き続き３００ｎｍのＵＶ光で可視化し、かつ分析した
。ＳａｌＩ消化後に予想される１９８１ｂｐおよび２４１０ｂｐ長の２つの断片
を観察し、従ってクローニングした断片の存在が確認された。
【００９５】 新たに構築したプラスミド（図２参照）を大量に得るために、大規模のプラス
ミドＤＮＡ単離をキアゲン プラスミド マキシ プロトコールに従って実施した 。
【００９６】 この時点で、新たに構築したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−
１α＋ＥＧＦＰプラスミドの機能性を確認するために、ＣＯＳ−１細胞（ＣＯＳ
−１は、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０からのＣＶ−１サル細胞（ＡＴＴＣ ＣＣＬ７
０から樹立した繊維芽細胞様細胞である）をストラタジーンのホニュウ類トラン
スフェクションキット（Mammalian Transfection Kit）からのＤＥＡＥ−デキス
トラントランスフェクションプロトコール（DEAE-Dextran Transfection Protoc
ol）に従ってプラスミド２μｇで一過性にトランスフェクションした。３７℃で
の１〜３日のインキュベーション後に、一過性にトランスフェクションされたＣ
ＯＳ−１細胞を蛍光顕微鏡下で分析し、高度に蛍光を発するＧＦＰ陽性ＣＯＳ−
１細胞が観察され、これは構築されたＧＦＰ含有プラスミドが機能的であること
を示している。
【００９７】 例２：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲの構築 ｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲプラスミド（図３参照）の構築のために
、ＭｏＬＶ−ＬＴＲプロモーター33（ＧｅｍＭｏＬＶ−ＬＴＲから）をＨｉｎｄ
ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで事前に消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（クロンテ
ック）中にクローニングした。
【００９８】 ＭｏＬＶ−ＬＴＲプロモーター33をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを使用し
てｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ベクター（プロメガ）中にクローニングした。Ｇｅｍ
ＭｏＬＶ−ＬＴＲは唯一のＨｉｎｄＩＩＩおよび唯一のＥｃｏＲＩ制限部位を有
する。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化後に得られるＭｏＬＶ−ＬＴＲプロ
モーター断片は６９７ｂｐの長さを有するが、他の得られた断片はｐＧＥＭ−３
Ｚｆ（＋）骨格に相当する。
【００９９】 ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック）は唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（位置６
２３）および唯一のＥｃｏＲＩ制限部位（位置６３０）を有する。ＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＥｃｏＲＩ消化後に得られる２つの断片はそれぞれ４７２６ｂｐおよび
７ｂｐの長さを有する。
【０１００】 ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のうち、７．３μｇをエッペンドルフチューブ（チューブＡ
）中で、ＨｉｎｄＩＩＩ１μｇ、１０×の制限酵素のためのインキュベーション
バッファーＢ（ベーリンガーマンハイム）３μｌおよび最終容量３０μｌにする
ための再蒸留水２１μｌと一緒にピペッティングした。該チューブを３７℃で３
時間インキュベートした。その後に、それを６５℃で５分間インキュベートし、
３７℃で冷却し、かつ再蒸留水９μｌ、１０×の制限酵素のためのインキュベー
ションバッファーＢ１μｌならびにＥｃｏＲＩ１μｌを前記混合物に添加して最
終容量４０μｌにした。別のエッペンドルフチューブ（チューブＢ）に、Ｇｅｍ
ＭｏＬＶ−ＬＴＲ３μｇをＨｉｎｄＩＩＩ１μｌ、ＥｃｏＲＩ（ベーリンガーマ
ンハイム、１０Ｕ／μｌ）１μｌ、１０×の制限酵素のためのインキュベーショ
ンバッファーＢ３μｌならびに最終容量３０μｌにするための再蒸留水２０μｌ
と一緒に混合した。両方のエッペンドルフチューブ（チューブＡおよびＢ）を３
７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後に、ＤＮＡローディン
グバッファー１４μｌを両方のチューブに添加し、かつその後に内容物を０．６
％の低融点（ＬＭＰ）アガロースゲル上の別々のスロットにロードした。３番目
のスロットに、１ｋｂのＤＮＡラダー（プロメガ）をＤＮＡローディングバッフ
ァーで１：３に希釈した１５μｌをゲル上にロードした。ゲル泳動を６０〜７０
ボルトで６０〜９０分間実施した。ゲル中のエチジウムブロミド染色したＤＮＡ
バンドを３００ｎｍのＵＶ光で可視化し、かつそのサイズを１ｋｂのＤＮＡラダ
ーと比較して決定した。消化したＧｅｍＭｏＬＶ−ＬＴＲベクターからの６９７
ｂｐの長い断片を有するＤＮＡバンドならびに消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１からの
４７２６ｂｐ長の断片を有するＤＮＡバンドをＬＭＰアガロースゲルから切り出
し、かつ２つの異なるエッペンドルフチューブに入れた。両方のチューブを簡単
に遠心分離し、６５℃で５分間インキュベートした。その後に、４７２６ｂｐ長
の断片（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１）３．５μ
ｌを別々のエッペンドルフチューブ中で６９７ｂｐ長の断片（ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＥｃｏＲＩ消化したＧｅｍＭｏＬＶ−ＬＴＲからのＭｏＬＶ−ＬＴＲプロモ
ーター）７μｌと一緒に混合し、６５℃で５分間インキュベートし、かつ簡単に
遠心分離した。混合物を３７℃で冷却し、次いで以下のライゲーション混合物を
添加した：１０×のライゲーションバッファー２μｌ、再蒸留水７．５μｌおよ
びＴ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ。ライゲーション反応物を１５℃で一晩インキュベ
ートした。
【０１０１】 新たにライゲーションしたｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲをワンショッ
トTMコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（インビトロゲン）中に、インビトロゲンの製造
者のプロトコールに従って形質転換した。
【０１０２】 ライゲーション反応物１０μｌをコンピテントＥ．ｃｏｌｉの形質転換のため
に使用した。形質転換混合物５０、１００および２００μｌを種々のカナマイシ
ン含有ＬＢアガープレート（カナマイシンの最終濃度：５０μｇ／ｍｌ）上にプ
レーティングし、次いで該プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、
種々の細菌コロニーを小規模のプラスミドＤＮＡ単離（マニアティス他7に記載 されているアルカリ分解法に従って）によって組み換えＤＮＡクローンの更なる
分析のために採取した。
【０１０３】 ｐＥＧＦＰ−Ｎ１中にクローニングしたＭｏＬＶ−ＬＴＲプロモーター断片の
存在を確認するために、単離したＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限
酵素消化を実施し（制限酵素のための１０×のインキュベーションバッファーＢ
３μｌ、アルカリ分解法からのプラスミドＤＮＡ５μｌ、再蒸留水２２μｌ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ１μｌ、ＥｃｏＲＩ１μｌをエッペンドルフチューブ中で一緒に混
合し、かつ３７℃で３時間インキュベートする）、１％のアガロースゲル上にロ
ードし、引き続き３００ｎｍのＵＶ光を使用して可視化し、かつ分析した。Ｈｉ
ｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化後に予想される６９７ｂｐ長の断片が観察され
、従ってクローニングした断片（図３参照）の存在が確認された。
【０１０４】 新たに構築したプラスミドを大量に得るため、大規模のプラスミドＤＮＡの単
離をキアゲン プラスミド マキシ プロトコールに従って実施した。
【０１０５】 実質的に、同様の方法を、ハイグロマイシン遺伝子を有しかつ以下の変化を有
するｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲベクター（図１６）の構築のために使
用した。第一に、ＭｏＬＶ−ＬＴＲプロモーター（ｐＬＸＳＮから、クロンテッ
ク）をＳｍａＩおよびＳａｃＩＩを有するｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター中にクロー
ニングした。第二に、ＴＫプロモーターおよびＴＫポリＡを含むハイグロマイシ
ン遺伝子（ＮｒｕＩで消化したｐＲＥＰ４（インビトロゲン）から）をＡｓｅＩ
で事前に消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲベクター中にクローニン
グした。
【０１０６】 例３：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α＋ＥＧＦＰによる マウス細胞系Ａ２０．２Ｊのエレクトロポレーションによる細胞系Ａ２０ＧＦＰ の製造 Ａ２０．２Ｊ細胞系（Ａ２０．２ＪはＡＴＣＣ ＴＩＢ２０８（American Type
Culture Collection）からのＢＡＬＢ／ｃのＢ細胞リンパ腫である29-30）をｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α＋ＥＧＦＰおよびｐＳＶ２ne
o（薬剤Ｇ４１８に耐性を付与するｎｅｏ遺伝子を有するプラスミド）によって 同時エレクトロポレーションした。３×１０7の細胞（Ａ２０．２Ｊ）をエレク トロポレーションのために必要とし、かつ新鮮な完全培地（５％の胎児の仔ウシ
血清（ギブコＢＲＬ）、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール（ギブコＢＲ
Ｌ）および２ｍＭのＬ−グルタミン（ギブコＢＲＬ）を補ったＩｓｃｏｖｅ改変
ダルベッコ培地（ギブコＢＲＬ））上にポレーションの前に１日プレーティング
した。エレクトロポレーションの前に、細胞を氷冷のＣａ2+／Ｍｇ2+不含のＰＢ
Ｓ（燐酸緩衝させた生理食塩水：再蒸留水８００ｍｌ中のＮａＣｌ８ｇ、ＫＣｌ
０．２ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4１．４４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4０．２４ｇ、ＨＣｌでｐＨを７
．４に調整し、かつ再蒸留水を最終容量が１リットルになるまで添加した）中で
３回洗浄し、計数し、かつ３×１０7の細胞を氷冷ＰＢＳ８００μｌ中で再懸濁 した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α＋ＥＧＦＰ６０μｇ
およびｐＳＶ２neo６μｇをＡ２０．２Ｊの同時エレクトロポレーションのため にエレクトロポレーションキュベット中にアリコートを添加した。冷却した細胞
をエレクトロポレーションキュベット中のＤＮＡ溶液に添加した。細胞およびＤ
ＮＡ溶液をピペッティングによって混合し、氷上で１５分間インキュベートした
。インキュベーション後に、ＤＮＡ細胞懸濁液にバイオラッドＧｅｎｅ Ｐｕｌ ｓｅｒTMによって出力された９６０μＦおよび３００Ｖの電気的パルスを与えた
。エレクトロポレーション後に、細胞を氷上に１５分間保持し、引き続き室温で
１５分間インキュベートした。エレクトロポレーションしたＡ２０．２Ｊ細胞を
培養培地（完全培地）に移し、２４時間増殖させ、次いで形質転換体をＧ４１８
（１ｍｇ／ｍｌ、ギブコＢＲＬ）を補った完全培地中で選択した。
【０１０７】 エレクトロポレーションした細胞を選択培地（Ｇ４１８を補った完全培地）中
で２〜４週間培養し、蛍光顕微鏡下で分析し、次いで単個細胞アッセイを実施し
て、クローン的かつ安定にＧＦＰをトランスフェクションさせた細胞系を得て、
これをＡ２０ＧＦＰと名付けた。
【０１０８】 例４：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲでのマウス細胞系ＰＢ−３ｃのエ レクトロポレーションによる細胞系ＰＢ３ｃＧＦＰの製造 ＰＢ−３ｃ細胞系（ＤＢＡ／２マウス31の骨髄から単離したクローニングされ
、かつ厳密にＩＬ−３依存性であり、非腫瘍形成性のマスト細胞）をｐＥＧＦＰ
−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲでエレクトロポレーションした。３×１０7の細胞（ ＰＢ−３ｃ）をエレクトロポレーションのために必要とし、かつ新鮮な培地（２
％のＩＬ−３を補った完全培地）にポレーションの前に１日プレーティングした
。エレクトロポレーション前に、細胞を細胞を氷冷のＣａ2+／Ｍｇ2+不含のＰＢ
Ｓ中で３回洗浄し、計数し、かつ３×１０7の細胞を氷冷ＰＢＳ８００μｌ中で 再懸濁した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲ１０μｇをＰＢ−３ｃのエレ
クトロポレーションのためにエレクトロポレーションキュベット中にアリコート
を添加した。冷却した細胞をエレクトロポレーションキュベット中のＤＮＡ溶液
に添加した。細胞およびＤＮＡ溶液をピペッティングによって混合し、氷上で１
５分間インキュベートした。インキュベーション後に、ＤＮＡ細胞懸濁液にバイ
オラッドＧｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒTMによって出力された９６０μＦおよび３００ Ｖの電気的パルスを与えた。エレクトロポレーション後に、細胞を氷上に１５分
間保持し、引き続き室温で１５分間インキュベートした。エレクトロポレーショ
ンしたＰＢ−３ｃ細胞を培養培地（２％のＩＬ−３を補った完全培地）に移し、
４８時間増殖させ、次いで形質転換体を２％のＩＬ−３およびＧ４１８（１ｍｇ
／ｍｌ、ギブコＢＲＬ）を補った完全培地中で選択した。
【０１０９】 エレクトロポレーションした細胞を選択培地中で２〜４週間培養し、蛍光顕微
鏡下で分析し、次いで単個細胞アッセイを実施して、クローン的かつ安定にＧＦ
Ｐをトランスフェクションさせた細胞系を得、これをＰＢ３ｃＧＦＰと名付けた
。
【０１１０】 例５：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲでのヒト細胞系Ｊｕｒｋａｔのエ レクトロポレーションによる細胞系ＪｕｒｋａｔＧＦＰの製造 Ｊｕｒｋａｔ細胞系（ＪｕｒｋａｔはＡＴＣＣ ＴＩＢ１５２からのヒトの急 性Ｔ細胞性白血病である）をｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲによってエレ
クトロポレーションした。３×１０7の細胞（Ｊｕｒｋａｔ）をエレクトロポレ ーションのために必要とし、かつ新鮮なＲＰＭＩ培地（５％の胎児の仔ウシ血清
（ギブコＢＲＬ）、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール（ギブコＢＲＬ）
および２ｍＭのＬ−グルタミン（ギブコＢＲＬ）を補ったＲＰＭＩ１６４０培地
（ギブコＢＲＬ））上にポレーションの前に１日プレーティングした。エレクト
ロポレーションの前に、細胞を氷冷のＣａ2+／Ｍｇ2+不含のＰＢＳ中で３回洗浄
し、計数し、かつ３×１０7の細胞を氷冷ＰＢＳ８００μｌ中で再懸濁した。ｐ ＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲ１０μｇをＪｕｒｋａｔのエレクトロポレー
ションのためにエレクトロポレーションキュベット中にアリコートを添加した。
冷却した細胞をエレクトロポレーションキュベット中のＤＮＡ溶液に添加した。
細胞およびＤＮＡ溶液をピペッティングによって混合し、氷上で１５分間インキ
ュベートした。インキュベーション後に、ＤＮＡ細胞懸濁液にバイオラッドＧｅ
ｎｅ ＰｕｌｓｅｒTMによって出力された９６０μＦおよび３００Ｖの電気的パ ルスを与えた。エレクトロポレーション後に、細胞を氷上に１５分間保持し、引
き続き室温で１５分間インキュベートした。エレクトロポレーションしたＪｕｒ
ｋａｔ細胞を培養培地（ＲＰＭＩ培地）に移し、４８時間増殖させ、次いで形質
転換体をＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ、ギブコＢＲＬ）を補ったＲＰＭＩ培地中で選
択した。
【０１１１】 エレクトロポレーションした細胞を選択培地（Ｇ４１８を補ったＲＰＭＩ培地
）中で２〜４週間培養し、蛍光顕微鏡下で分析し、次いで単個細胞アッセイを実
施して、クローン的かつ安定にＧＦＰをトランスフェクションさせた細胞系を得
、これをＪｕｒｋａｔＧＦＰと名付けた。
【０１１２】 例６：トランスフェクションしていない細胞およびＧＦＰトランスフェクショ ンした細胞の蛍光能力の比較 ４種の関連していない細胞系（Ａ２０．２Ｊ、ＰＢ−３ｃ、Ｊｕｒｋａｔおよ
びＤＭ）を蛍光発光能力の研究のために選択した。
【０１１３】 ＧＦＰを有するベクターによる４種の異なる細胞系の安定トランスフェクショ
ン後に、トランスフェクションさせていない細胞と各細胞系のＧＦＰトランスフ
ェクションした細胞とを、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン ディキンソン、サンジョ ーズ、ＵＳＡ）中でのフローサイトメトリー分析によって測定されるその蛍光発
光能力の代わりに比較した。ソフトウェアプログラムＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ（ベ クトン ディキンソン）を使用してデータを取得した。ＦＡＣＳｃａｎを取得の 前にベクトン ディキンソンからのカリブライトビーズ（Calibrite beads）で較
正した。以下のパラメーターを測定した： −細胞寸法の測定としてＦＳＣ高さ（前方散乱）、 −細胞の内部顆粒度（密度）の測定としてＳＳＣ高さ（側方散乱）、 −緑色蛍光（例えばＧＦＰmut1）をＦＡＣＳｃａｎにおいてＦＬ−１チャネルで
可視化した、 −橙色蛍光（例えばプロピジウムヨージド）をＦＡＣＳｃａｎにおいてＦＬ−２
チャネルで可視化した。
【０１１４】 測定のために、１００００個の細胞を２５００００個の細胞を含有する各ＦＡ
ＣＳチューブから取得した。
【０１１５】 ２つの意想外なことが見いだされた： １つ目は、ＧＦＰトランスフェクションした細胞の蛍光強度がトランスフェク
ションされていない細胞の自己蛍光（autofluorescence）と比較して高いこと（
図４〜６および図１５）。
【０１１６】 ２つ目は全てのＧＦＰトランスフェクションした生細胞系の蛍光範囲（ＦＡＣ
ＳｃａｎにおいてＦＬ−１で可視化した）が狭いことである（図参照）：Ａ２０
ＧＦＰ（図４）、ＰＢ３ｃＧＦＰ（図５）、ＪｕｒｋａｔＧＦＰ（図６）および
ＤＭＧＦＰ（図１５）。このことはＧＦＰ発現物の高低の問題を排除する。
【０１１７】 例７：アポトーシスアッセイ：ｓＦａｓＬによるＡ２０ＧＦＰにおけるアポト ーシス誘発 アポトーシスをｓＦａｓＬ上清（ｓＦａｓＬ ＳＮはＡ．フォンタナ（A. Font
ana）、大学病院、チューリヒ、スイスによって提供されたＦａｓＬトランスフ ェクションされたＮ２ａ細胞によって製造された）によるＡ２０ＧＦＰの８時間
のインキュベートによって誘発した。ネガティブコントロールとして、完全培地
中でインキュベートしたＡ２０ＧＦＰを使用した。
【０１１８】 Ａ２０ＧＦＰ細胞をＰＢＳで洗浄した後に、２つのＦＡＣＳチューブ（ファル
コン）を準備した。これらはそれぞれ２５００００個の細胞を含有している。第
１のチューブ（チューブ１）中の細胞をネガティブコントロールとして５００μ
ｌの通常の完全培地中で再懸濁し、一方で第２のチューブ（チューブ２）中の細
胞をアポトーシス誘発性の可溶性ＦａｓＬｉｇａｎｄ上清１００μｌおよび最終
容量５００μｌにするための完全培地４００μｌ中で再懸濁した。両方のチュー
ブを３７℃で８時間インキュベートした。インキュベートした後に、該細胞をＰ
ＢＳで洗浄し、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳ５００μｌ中に取り
、かつＦＡＣＳｃａｎ中で測定した。
【０１１９】 コントロールチューブ（チューブ１）中で、細胞の大多数は高いＧＦＰ関連の
蛍光を示したが（図７ａおよび７ｂ）、一方ｓＦａｓＬ ＳＮ処理した細胞を含 有するチューブ（チューブ２）においては、８時間のインキュベーション後に大
多数の細胞が低い蛍光発光を示していた（図８ａおよび８ｂ）これらの蛍光発光
の低い細胞は収縮したアポトーシス細胞集団に相当し（図８ｃおよび８ｅ）、蛍
光発光の高い細胞に対して、これらは主により大きい顆粒およびより小さい顆粒
の生細胞集団に見られた（図８ｃおよび８ｄ）。
【０１２０】 更に蛍光発光の低い細胞集団が収縮細胞集団に相当することを示しかつ確認す
るために、細胞内ＤＮＡのためのプロピジウムヨージド染色を前記に測定したチ
ューブ（チューブ１および２）の残余細胞を使用して実施した。細胞をまずＰＢ
Ｓで洗浄し、次いで７０％エタノール中で−２０℃で２時間インキュベートし、
再度ＰＢＳで洗浄し、かつＰＩ−溶液（１ｍｌのＰＢＳ中の５０μｇのＰＩ）で
３７℃で３０分間染色した。ＰＩ染色した細胞を含有する両方のチューブ（チュ
ーブ１および２）をＦＡＣＳｃａｎ中で直ちに測定した。
【０１２１】 アポトーシス誘発性のｓＦａｓＬ ＳＮで処理した細胞（チューブ２）のＤＮ Ａプロフィールは８時間のインキュベーション後に相当変化した（図１０ａおよ
び１０ｂ）。大多数のＤＮＡはコントロール（チューブ１、図９ａおよび９ｂ参
照）と比較して断片化され（ＦＡＣＳｃａｎにおいてＦＬ−２でサブ−Ｇ１ピー
クとして可視化される、図１０ｂ）、ｓＦａｓＬ ＳＮによって誘発された大規 模なアポトーシスの結果が確認された。
【０１２２】 更に、断片化されたＤＮＡを有する細胞集団は収縮したアポトーシス細胞およ
び蛍光発光の低い細胞の群に相当する。
【０１２３】 最後に、アポトーシス細胞は収縮し、これは主に（完全にではないが）ＧＦＰ
関連の蛍光を失い、かつ断片化されたＤＮＡ（アポトーシスの特異的な特徴）を
有する。更に、ＰＩ法で見いだされたアポトーシス細胞の量はＧＦＰ法（データ
示さず）で検出された量と比較可能である。
【０１２４】 例８：毒性アッセイ：Ａ２０ＧＦＰのネクローシスの誘発 Ａ２０ＧＦＰ細胞をまずＰＢＳで洗浄し、次いで２５００００個の細胞を、抗
Ａ２０ポリクローナル抗体１００μｌと一緒にＦＡＣＳチューブ中で４℃で６０
分間インキュベートした。インキュベート後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ウサギ
補体（Readysysem）５０μｌ中で再懸濁し、３７℃の水浴中で１時間インキュベ
ートした。細胞を再度ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ５００μｌ中で再懸濁し、かつＦ
ＡＣＳｃａｎ中で直ちに測定した。コントロールとして、未処理の（補体不含）
のＡ２０ＧＦＰおよびＡ２０細胞を使用した。
【０１２５】 補体の結合は標的細胞におけるネクローシスを誘発する。このように該アッセ
イを実施して、ネクローシス細胞の蛍光発光能力を評価する。ネクローシス細胞
が１時間以内にそのＧＦＰ関連の蛍光能力を完全に失うことは興味を引くもので
あった。従って、補体処理したＡ２０ＧＦＰ細胞はトランスフェクションされて
いないＡ２０生細胞とほとんど区別することができない（図１１）。ネクローシ
ス細胞はアポトーシス細胞と区別することができ、後者は依然として低い蛍光発
光能力を示す（例えば前記の例に示されるようなｓＦａｓＬ ＳＮ処理の８時間 後）。このことからＧＦＰアッセイはネクローシス、アポトーシスおよび生きて
いるＧＦＰトランスフェクションされた細胞を区別するための有用な手段となる
。
【０１２６】 例９：アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）によるデノボＲＮＡ合成の阻害、シク ロヘキシミド（ＣＨＸ）によるタンパク質合成の阻害ならびにＡ２０ＧＦＰにお けるＧＦＰアポトーシスアッセイを妨げる潜在的役割（potential role） Ａ２０ＧＦＰの蛍光および例７に示したＧＦＰアポトーシスアッセイがデノボ
転写およびタンパク質合成に依存するのかを見いだすために、ＡｃｔＤ（大学病
院の調剤部、バーゼル）、ＲＮＡ合成阻害剤、およびシクロヘキシミド（シグマ
）、タンパク質合成阻害剤を本願の試験プロトコールで試験した。Ａ２０ＧＦＰ
細胞のＰＢＳでの洗浄後に、２５００００個の細胞をＦＡＣＳチューブ中にアリ
コートで添加し、かつ： ａ）チューブ１（コントロール）：５００μｌの完全培地（ＭＣ） ｂ）チューブ２：１００μｌのｓＦａｓＬ ＳＮおよび４００μｌのＭＣ ｃ）チューブ３：５００μｌのＭＣおよび５μｇ／ｍｌのＡｃｔＤ ｄ）チューブ４：４００μｌのＭＣ、１００μｌのｓＦａｓＬ ＳＮ、５μｇ／ ｍｌのＡｃｔＤ ｅ）チューブ５：５００μｌのＭＣおよび１０μｇ／ｍｌのＣＨＸ ｆ）チューブ６：４００μｌのＭＣ、１００μｌのｓＦａｓＬ ＳＮおよび１０ μｇ／ｍｌのＣＨＸ ｇ）チューブ７：５００μｌのＭＣ、５μｇ／ｍｌのＡｃｔＤおよび１０μｇ／
ｍｌのＣＨＸ ｈ）チューブ８：４００μｌのＭＣ、１００μｌのｓＦａｓＬ ＳＮ、５μｇ／ ｍｌのＡｃｔＤおよび１０μｇ／ｍｌのＣＨＸ を使用してインキュベートした。
【０１２７】 チューブ１〜チューブ８（ａ〜ｈ）を３７℃で１０分間インキュベートした。
細胞の蛍光状態を後処理の１０時間後にアッセイした。
【０１２８】 図１２ａおよび１２ｂに見られるように、未処理のＡ２０ＧＦＰ（図１２ａ）
の蛍光強度はＡｃｔＤおよび／またはＣＨＸで処理したＡ２０ＧＦＰ（図１２ｂ
）と比較して差異はなかった。Ａ２０ＧＦＰのｓＦａｓＬ ＳＮ処理は、細胞が ＡｃｔＤおよび／またはＣＨＸで処理されたかまたはされていないにかかわらず
、アポトーシスを同程度まで誘発した。最後に、ＡｃｔＤおよび／またはＣＨＸ
は、単独または一緒であっても、実質的にＡ２０ＧＦＰの蛍光発光能力を妨害し
ないか、または処理の１０時間後にｓＦａｓＬ ＳＮ誘発性のアポトーシスを阻 害しない。従って、Ａ２０ＧＦＰは蛍光のため、１０時間の間にデノボ転写およ
び翻訳を必要としない。
【０１２９】 例１０：アポトーシスアッセイ：インターロイキン−３欠乏（deprivation） によるＰＢ３ｃＧＦＰにおけるアポトーシス誘発 ＰＢ３ｃＧＦＰはインターロイキン−３（ＩＬ−３）依存性の細胞系である。
培養培地（完全培地）へのＩＬ−３の添加はＰＢ３ｃＧＦＰのアポトーシス発生
を防ぐ（抗アポトーシス化合物としてのＩＬ−３）。反対に、ＩＬ−３の欠乏の
後に、１２時間以内に強いアポトーシス応答が見られる。
【０１３０】 該試験のために、２５００００個のＰＢＳ洗浄したＰＢ３ｃＧＦＰ細胞を２つ
の異なるＦＡＣＳチューブ中にアリコートを添加した。
【０１３１】 チューブＡ：細胞およびＩＬ−３を補ったＭＣを含有する。
【０１３２】 チューブＢ：細胞およびＩＬ−３不含のＭＣを含有する。
【０１３３】 両方のチューブを３７℃で１２時間インキュベートした。
【０１３４】 ＰＢ３ｃＧＦＰ細胞のＧＦＰ関連の蛍光をＩＬ−３欠乏の１２時間後に測定し
た。
【０１３５】 予想され、かつＡ２０ＧＦＰに関して見られるように、ＰＢ３ｃＧＦＰによっ
て非常に類似の結果が得られた。ＩＬ−３を補ったＭＣ中で培養したＰＢ３ｃＧ
ＦＰ（チューブＡ）は高いＧＦＰ関連の蛍光を示すが、一方ＩＬ−３欠乏させた
ＰＢ３ｃＧＦＰ細胞（チューブＢ）はアポトーシスを引き起こし、かつ低いＧＦ
Ｐ関連の蛍光強度を示し、このことによってＰＢ３ｃＧＦＰ生細胞とＰＢ３ｃ生
細胞とを明確に区別可能である（図１３）。これらの所見はＡ２０ＧＦＰ細胞に
関して記載したように（データは図示せず）、ＰＩ染色法によって確認されてい
る。
【０１３６】 例１１：アポトーシスアッセイ：ｓＦａｓＬ ＳＮによるＪｕｒｋａｔＧＦＰ におけるアポトーシスの誘発 該アポトーシスアッセイもまたｓＦａｓＬ ＳＮ（Ｊｕｒｋａｔ細胞における 公知の細胞死誘発物）を使用して実施した。２５００００個のＰＢＳ洗浄したＪ
ｕｒｋａｔＧＦＰ細胞を２つの異なるＦＡＣＳチューブにアリコートを添加した
。
【０１３７】 チューブ１（コントロール）：細胞を５００μｌのＲＰＭＩ培地でインキュベ
ートした。
【０１３８】 チューブ２：細胞を１００μｌのｓＦａｓＬ ＳＮおよび４００μｌのＲＰＭ Ｉ培地でインキュベートした。
【０１３９】 両方のチューブを３７℃で１８時間インキュベートした。この試験においては
、細胞はＰＢＳによる前洗浄をせずにインキュベート後に直ちに測定した。
【０１４０】 予想され、かつＡ２０ＧＦＰおよびＰＢ３ｃＧＦＰ細胞で見られるように、類
似の結果が得られた。
【０１４１】 図１４に示されるように、ｓＦａｓＬ ＳＮはアポトーシスを誘発した。ＧＦ Ｐ関連の蛍光は生きているＪｕｒｋａｔＧＦＰにおいては高く、一方アポトーシ
スＪｕｒｋａｔＧＦＰ細胞は顕著に低減されたＧＦＰ関連の蛍光を有したが、依
然としてトランスフェクションされていない生きているＪｕｒｋａｔ細胞とを区
別可能である。これらの所見はＰＩ染色法によって確認されている。
【０１４２】 以前の試験に対して、目下の結果は測定前にＰＢＳで細胞を洗浄する必要がな
いことを示している。これは、個々のチューブを別々に洗浄できない大規模なス
クリーニングアッセイに関しては特に有用である場合がある。
【０１４３】 例１２：アポトーシスアッセイ：組み換えヒトＴＲＡＩＬによるＪｕｒｋａｔ ＧＦＰにおけるアポトーシスの誘発 該アポトーシスアッセイは組み換えヒトＴＲＡＩＬ（Ｊｕｒｋａｔ細胞におけ
る公知の細胞死インデューサー）を使用して実施した。２５００００個のＪｕｒ
ｋａｔ細胞を２つの異なるＦＡＣＳチューブにアリコートで添加した。
【０１４４】 チューブ１：（コントロール）：細胞を５００μｌのＲＰＭＩ培地でインキュ
ベートした。
【０１４５】 チューブ２：細胞を２５μｌの組み換えヒトＴＲＡＩＬおよび４７５μｌのＲ
ＰＭＩ培地を使用してインキュベートした。
【０１４６】 両方のチューブを３７℃で１８時間インキュベートした。インキュベート後に
、試験チューブを前洗浄しないで直ちに測定した。
【０１４７】 ｓＦａｓＬ ＳＮのように、組み換えヒトＴＲＡＩＬは用量に依存してＪｕｒ ｋａｔＧＦＰ細胞（図６ｂ）においてアポトーシスを誘発した（データ示さず）
。図６ｂは、ｓＦａｓＬ ＳＮまたはＩＬ−３欠乏のそれぞれによるアポトーシ スの誘発後にＡ２０ＧＦＰ（図１１）およびＰＢ３ｃＧＦＰ（図１３）で既に観
察されているような類似のプロフィールを示す。
【０１４８】 例１３：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲでのヒトのメラノーマ細胞系Ｄ Ｍのトランスフェクションによる細胞系ＤＭＧＦＰの製造 ヒトのメラノーマ細胞系ＤＭ35をｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲでトラ
ンスフェクションした。
【０１４９】 １０6個のＤＭ細胞を１０％ＦＣＳを含む完全培地を含有する１０ｃｍの直径 の培養皿中でトランスフェクションさせる前に１日プレーティングした。１０μ
ｇのｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲをＳｕｐｅｒＦｅｃｔ試薬（キアゲン
ＡＧ、スイス）２０μｌおよび１２０μｌの完全培地ｗ／ｏＦＣＳと一緒に混合
し、かつ室温で３０分間インキュベートした。インキュベート後に、ＦＣＳを含
有する１ｍｌの完全培地を添加し、かつ全混合物を１０ｍｌの完全培地中にＤＭ
細胞を既に含有している皿上に注入した。トランスフェクションの４８時間後に
、細胞を完全培地で１回洗浄し、かつ更に１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコＢＲ
Ｌ）を含有する選択培地中で、単クローンが目に見えるようになるまで３週間培
養した。これらのクローンを蛍光顕微鏡下で分析した。ポジティブクローンを更
に２４ウェルプレート中で選択培地で培養し、かつ導入遺伝子の発現に関して再
度分析した。次いで単個細胞アッセイを実施して、ＧＦＰ導入遺伝子を安定に発
現する単クローンを得た。
【０１５０】 略語 以下の略語を発明の詳細な説明で使用した： ＡｃｔＤ アクチノマイシンＤ ｂｐ 塩基対 ＣＨＸ シクロヘキシミド ＤＩＧ ジゴキシゲニン ｄｓＤＮＡ 二本鎖ＤＮＡ ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＥＦ−１α 伸長因子−１α ＦＡＣＳ 蛍光活性化セルソーター ＦＣＳ 胎児の仔ウシ血清 ＦＩＴＣ フルオレセインイソチオシアネート ＦＬ−１ 蛍光チャネル１（５３０（±２５）ｎｍの範囲の蛍光発光を検出） ＦＳＣ 前方散乱（細胞寸法） ＧＦＰ 緑色蛍光タンパク質 ＩＬ−３ インターロイキン−３ ＬＭＰ 低融点 ＭＣ 完全培地 ＰＢＳ 燐酸緩衝された生理食塩水 ＰＩ プロピジウムヨージド ｓＦａｓＬ 可溶性ＦａｓＬｉｇａｎｄ ＳＮ 上清 ＳＳＣ 側方散乱（細胞の顆粒性） ｓｓＤＮＡ 一本鎖ＤＮＡ ＴＡＥ トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン ＴＮＦ 腫瘍壊死因子 ＴＲＡＩＬ ＴＮＦ関連のアポトーシス誘発リガンド ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＴＮＦ関連のアポトーシス誘発リガンド受容体 ＴＵＮＥＬ ＴｄＴ媒介性のＤＮＡ末端標識 文献
【０１５１】
【外１】
【０１５２】
【外２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１プラスミドを示して
いる。
【図２】 図２はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α＋ＧＦＰプラスミ
ドを示している。
【図３】 図３はｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲプラスミドを示している。
【図４】 図４はトランスフェクションしていない生きているＡ２０とＧＦＰ−トランス
フェクションした生きているＡ２０ＧＦＰとの間でのＦＬ−１チャネルで測定し
た蛍光能力の差異を示しているＦＡＣＳ−ヒストグラムである。
【図５】 図５はトランスフェクションしていない生きているＢＰ３ｃとＧＦＰ−トラン
スフェクションした生きているＢＰ３ｃＧＦＰとの間でのＦＬ−１チャネルで測
定した蛍光能力の差異を示しているＦＡＣＳ−ヒストグラムである。
【図６】 図６ａはトランスフェクションしていない生きているＪｕｒｋａｔとＧＦＰ−
トランスフェクションした生きているＪｕｒｋａｔＧＦＰとの間でのＦＬ−１チ
ャネルで測定した蛍光能力の差異を示しているＦＡＣＳ−ヒストグラムであり、
図６ｂはアポトーシスＪｕｒｋａｔＧＦＰ（組み換えヒトＴＲＡＩＬで誘発した
）と比較した生きているＪｕｒｋａｔＧＦＰの蛍光強度を示すＦＡＣＳ−ヒスト
グラムである。
【図７】 図７ａは生きているＡ２０ＧＦＰの細胞寸法（ＦＳＣ）および粒状性を示すＦ
ＡＣＳドットプロットであり、図７ｂは生きているＡ２０ＧＦＰの典型的なＧＦ
Ｐ−関連の蛍光プロフィールを示すＦＡＣＳ−ヒストグラムである。
【図８】 図８ａはｓＦａｓＬ ＳＮ処理された、従って主にアポトーシスＡ２０ＧＦＰ の収縮および顆粒密度の増加を示すＦＡＣＳドットプロットであり（縦軸はＳＳ
Ｃ高さを表し、横軸はＦＳＣ高さを表す）、図８ｂはｓＦａｓＬ ＳＮ処理され た、従って主にアポトーシスＡ２０ＧＦＰのＧＦＰ関連の蛍光の減少を示すＦＡ
ＣＳ−ヒストグラムであり（縦軸はカウントを表し、横軸はＦＬ１高さを表す）
、図８ｃは蛍光が高い生きているＡ２０ＧＦＰ（Ｒ１）と蛍光が低いアポトーシ
スＡ２０ＧＦＰ（Ｒ２）との間の差異を示すＦＡＣＳドットプロットであり（縦
軸はＦＬ１高さを表し、横軸はＦＳＣ高さを表す）、図８ｄは蛍光が高い生きて
いるＡ２０ＧＦＰのＦＡＣＳドットプロットであり（縦軸はＳＳＣ高さを表し、
横軸はＦＳＣ高さを表す）、図８ｅは蛍光が低いアポトーシスＡ２０ＧＦＰのＦ
ＡＣＳドットプロットである（縦軸はＳＳＣ高さを表し、横軸はＦＳＣ高さを表
す）。
【図９】 図９ａは生きているＡ２０ＧＦＰ（エタノール処理およびＰＩ−染色した）の
細胞寸法および顆粒性パターンを示すＦＡＣＳドットプロットであり、図９ｂは
ＰＩ染色した生きているＡ２０ＧＦＰの典型的なＤＮＡパターンを示すＦＡＣＳ
−ヒストグラムである。
【図１０】 図１０ａはｓＦａｓＬ ＳＮ処理したＡ２０ＧＦＰ（エタノール処理およびＰ Ｉ−染色した）の収縮を示すＦＡＣＳドットプロットであり、図１０ｂはｓＦａ
ｓＬ ＳＮ処理したＡ２０ＧＦＰにおけるアポトーシスに関する証明としてのＤ ＮＡの断片化（サブ−Ｇ１ピーク＝Ｍ１で表される）を示すＦＡＣＳ−ヒストグ
ラムである。
【図１１】 図１１はアポトーシスＡ２０ＧＦＰ、ネクローシスＡ２０ＧＦＰおよび生きて
いるトランスフェクションしていないＡ２０を比較した生きているＡ２０ＧＦＰ
の蛍光強度を示すＦＡＣＳ−ヒストグラムである。
【図１２】 図１２ａはＡ２０ＧＦＰにおけるｓＦａｓＬ ＳＮによるアポトーシスの誘発 を示すＦＡＣＳ−ヒストグラムであり、図１２ｂはＡｃｔＤおよびＣＨＸの存在
下でのＡ２０ＧＦＰにおけるｓＦａｓＬ ＳＮによるアポトーシスの誘発を示す ＦＡＣＳ−ヒストグラムである。
【図１３】 図１３はＩＬ−３処理の抗アポトーシス効果を示すＦＡＣＳ−ヒストグラムで
ある。
【図１４】 図１４は生きているＪｕｒｋａｔＧＦＰと比較したＧＦＰ−関連のアポトーシ
スＪｕｒｋａｔＧＦＰ細胞における蛍光の減少として可視化されたＪｕｒｋａｔ
ＧＦＰにおけるｓＦａｓＬ ＳＮの前アポトーシス効果を示すＦＡＣＳ−ヒスト グラムである。
【図１５】 図１５はトランスフェクションしていない生きているＤＭとＧＦＰ−トランス
フェクションした生きているＤＭＧＦＰとの間でのＦＬ−１チャネルで測定した
蛍光能力の差異を示しているＦＡＣＳ−ヒストグラムである。
【図１６】 図１６はハイグロマイシン遺伝子を有するｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴ
ＲＭｏＬＶ−ＬＴＲプラスミドを示している。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月２７日（２０００．３．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１７
【補正方法】変更
【補正内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/53 5/00 Ｂ (72)発明者 ペーター エルプ スイス国 バーゼル ゴットハルトシュト ラーセ 78 (72)発明者 ジヌーエ ハーン スイス国 ブックテン アーデルガッセ ５ Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA34 AA35 AA40 CB01 FA11 FA29 FA37 FB07 FB12 GC15 JA01 4B024 AA11 AA20 CA04 DA02 EA04 GA11 HA20 4B063 QA05 QR48 QR60 QR72 QR80 4B065 AA90X AA90Y AC14 BA01 CA24 CA46

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試験生細胞のアポトーシス状態および／またはネクローシス
    状態の決定方法において、該細胞におけるマーカータンパク質のシグナルの変化
    をモニタリングすることを特徴とする、試験生細胞のアポトーシス状態および／
    またはネクローシス状態の決定方法。
  2. 【請求項２】 シグナルの変化を非−、前−もしくは抗−アポトーシス的ま
    たはネクローシス的に活性な化合物および／または物理的刺激の存在下にモニタ
    リングする、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 マーカータンパク質が試験細胞中で、マーカータンパク質を
    コードしかつ発現するＤＮＡで前記細胞をトランスフェクションされた後に産生
    される、請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 試験細胞が安定にトランスフェクションされている、請求項
    ３記載の方法。
  5. 【請求項５】 マーカータンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または
    その蛍光変異体である、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】 ＧＦＰまたはその蛍光変異体のシグナルにおける変化を蛍光
    強度を測定するフローサイトメーターまたはプレートリーダーによってモニタリ
    ングする、請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 ２群の試験細胞を使用して、規定数の各細胞を蛍光マーカー
    タンパク質、例えばＧＦＰまたはその蛍光変異体をコードするＤＮＡベクターで
    トランスフェクションし、１群を培養培地中で試験化合物と一緒にインキュベー
    トし、両方の群の細胞を励起ビームで刺激し、各群の細胞の蛍光強度をフローサ
    イトメーターによって測定し、かつ２群の細胞の蛍光強度の変化を比較する、請
    求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
  8. 【請求項８】 ＧＦＰを、ＤＮＡベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ
    （＋）＋ＥＦ−１α＋ＥＧＦＰまたはｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲによ
    って細胞に導入する、請求項５から７までのいずれか１項記載の方法。
  9. 【請求項９】 １つ以上の強力なプロモーター、例えばｈＥＦ１−αプロモ
    ーター、ＭｏＬＶ−ＬＴＲプロモーターまたはＣＭＶとＭｏＬＶ−ＬＴＲプロモ
    ーターとの組合せに操作によって結合されたマーカータンパク質をコードする遺
    伝子を有するベクター。
  10. 【請求項１０】 遺伝子がＧＦＰまたはその蛍光変異体をコードする、請求
    項９記載のベクター。
  11. 【請求項１１】 遺伝子がマーカータンパク質ＧＦＰmut1をコードする、請
    求項１０記載のベクター。
  12. 【請求項１２】 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）＋ＥＦ−１α＋Ｅ
    ＧＦＰまたはｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲである、請求項９から１１ま
    でのいずれか１項記載のベクター。
  13. 【請求項１３】 請求項９から１２までのいずれか１項記載のベクターでト
    ランスフェクションした生細胞。
  14. 【請求項１４】 請求項１２記載のベクターでトランスフェクションした、
    Ａ２０ＧＦＰ、ＰＢ３ｃＧＦＰ、ＪｕｒｋａｔＧＦＰまたはＤＭＧＦＰである生
    細胞系。
  15. 【請求項１５】 試験生細胞における試験化合物および／または物理的刺激
    の非−、前−もしくは抗−アポトーシス活性またはネクローシス活性のアッセイ
    方法において、該細胞中のマーカータンパク質のシグナルの変化をモニタリング
    することを特徴とする、試験生細胞における試験化合物および／または物理的刺
    激の非−、前−もしくは抗−アポトーシス活性またはネクローシス活性のアッセ
    イ方法。
  16. 【請求項１６】 細胞の群をマーカータンパク質をコードしかつ発現するベ
    クターでトランスフェクションし、トランスフェクションされた細胞を適当な培
    養培地中で試験化合物とで処理し、該細胞群中の発現したマーカータンパク質の
    シグナルの変化をモニタリングし、かつ結果を、試験化合物で処理していない同
    じ試験細胞の並行群で観察される結果と比較する、請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 試験化合物が、例えば組合せ化学的方法から得られるよう
    な多数の化合物を含む、請求項１５または１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 細胞が正常細胞、感染細胞または癌細胞である、請求項１
    ５から１７までのいずれか１項記載の方法。
  19. 【請求項１９】 試験細胞を請求項９から１２までのいずれか１項記載のベ
    クターでトランスフェクションする、請求項１５から１８までのいずれ１項記載
    の方法。
  20. 【請求項２０】 試験細胞をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋
    ）＋ＥＦ−１α＋ＥＧＦＰまたはｐＥＧＦＰ−Ｎ１＋ＭｏＬＶ−ＬＴＲでトラン
    スフェクションする、請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 試験細胞が、トランスフェクションされた細胞系Ａ２０Ｇ
    ＦＰ、ＰＢ３ｃＧＦＰ、ＪｕｒｋａｔＧＦＰまたはＤＭＧＦＰからの細胞である
    、請求項１９または２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 モニタリングをフローサイトメーター、例えばＦＡＣＳｃ
    ａｎTMを使用して実施する、請求項１５から２１までのいずれか１項記載の方法
    。
  23. 【請求項２３】 モニタリングをパラメーターのＦＳＣ高さ、ＳＳＣ高さお
    よびマーカータンパク質の蛍光を測定し、かつドットプロットおよび／またはヒ
    ストグラム可視化後の結果を比較することによって実施する、請求項１５から２
    １までのいずれか１項記載の方法。
  24. 【請求項２４】 薬剤スクリーニング法、高処理量のスクリーニング法およ
    び／または大規模のスクリーニング法である請求項１から８および請求項１５か
    ら２３までのいずれか１項記載の方法。
  25. 【請求項２５】 薬剤スクリーニング、高処理量のスクリーニングおよび／
    または大規模のスクリーニングのための、請求項１から８および請求項１５から
    ２３までのいずれか１項記載の方法。
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