JP2002500039A - 機能あるヒトリポタンパク質(a)を発現するトランスジェニックウサギ - Google Patents
機能あるヒトリポタンパク質(a)を発現するトランスジェニックウサギInfo
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Abstract
Description
、米国エネルギー局とカリフォルニア大学との契約第DE-AC03-76SF00098 号に基
づく政府の支持によってなされた。米国政府は、本発明にある種の権利を有する
。
らの優先権を主張する。 発明の分野 本発明は、ヒト疾患のモデル、及びこれらの疾患の治療に有効な化合物を同定
するために、これらのモデルを用いる方法に関する。詳細には、本発明は、ヒト
リポタンパク質(a)(La(a))のインビボ分析のための新規な実験的なモ
デルと、このリポタンパク質の高レベルと関連する健康上のリスクを減少させる
治療的戦略の開発に関する。
脂質を輸送する役目を荷うリポタンパク質の代謝における疾患である。それ故、
アテローム性動脈硬化などのリポタンパク質異常血症は、高コレステロール血症
、低コレステロール血症、高トリグリセライド血症に関連する生命を脅かす疾患
と関連する。
脂質や他の血液誘導体の沈積(脂質又はフィブロ−脂質プラーク)によって、組
織学的面上で定められる複雑なポリジェニックな疾患である。疾患の進行に従い
多かれ少なかれ石灰化されているプラークは、病巣と関連しえ、動脈において、
本質的にコレステロールエステルからなる脂肪沈積の蓄積に関連する。プラーク
は、平滑筋の肥大を伴う動脈壁の肥厚、泡沫細胞の出現、及び繊維組織の蓄積に
よって伴われる。プラークは、動脈壁で***し、狭窄、即ち、動脈が狭くなるこ
と、又はストリクチャ(狭窄)に至る。最悪の患者で、この狭窄は、アテローム
、血栓及び塞栓などの血管閉鎖の原因である。それ故、コレステロールの過剰の
蓄積(高コレステロール血症)は、心筋梗塞、突然死、心臓代償不全、脳血管疾
患などに至りうる。
織からコレステロールの流出(コレステロールの逆輸送)を刺激し、アテローム
プラークの形成においてコレステロールを蓄積した細胞からコレステロールを抜
き取る、直ちに利用できる治療をもつことは、特に重要である。コレステロール
は、種々のリポタンパク質(低密度リポタンパク質(LDL)や高密度リポタン
パク質(HDL)を含む)によって血液中で輸送される。LDLは肝臓で合成さ
れ、末梢組織にコレステロールを供給する役目を荷う。対照的に、HDLは、末
梢組織でコレステロールを拾い上げ、それを肝臓に輸送する。肝臓で、コレステ
ロールは保存され、及び/又は分解される。
臓血管疾患や脳卒中の発生の増加とを関連づけた(総説として、Utermann,G., S
cience(1989) 246,904-910;Mah er,V.M.G., and Brown、B.G., Curr.Opin.Lipid
ol. (1995) 6, 229-235)。リポタンパク質(a)は、脂質部分と2つのジスル フィド結合サブユニット、アポリポタンパク質B−100(apoB−100)
とアポリポタンパク質(a)(apo(a))からなる複雑な分子である。ap
o(a)、即ち、プラスミノーゲンに構造的に関連する親水性糖タンパク質の存
在は、Lp(a)を、低密度リポタンパク質(LDL)から分け、その特徴的な
生物的及び物理的性質を付与する。
267残基のプレプロタンパク質の形で合成されるタンパク質であり、分子量2
8,000ダルトンをもつ。ヒトにおいて、それは、肝臓と腸で特異的に合成さ
れ、それは、HDL粒子の基本的なタンパク質を構成する(重量でタンパク質の
70%)。それは、血漿で豊富である(1.0−1.2g/L)。その活性は、
レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)の活性化とし
て、生化学の観点から最も良く特徴づけられるが、多数の他の活性、例えば、特
に、細胞コレステロールの流出が、それに帰せられる。アポリポタンパク質AI
の生理的役割は、アポリポタンパク質AIIによって相殺されるように思われる
。というのは、ヒトにおいて、2つの血漿濃度の比(AII/AI)は、冠リス
クと非常に密接に関連するからである。アポリポタンパク質AIは、アテローム
性動脈硬化に対する抵抗性に主要な役割は果たす。その役割は、コレステロール
の逆輸送に恐らく連関する。というのは、トランスジェニックマウスにおけるこ
のタンパク質だけの発現により、大動脈における脂質沈積の表面が、対照マウス
と比較して40倍減少するからである(Rubin ら,1993 Science, vol 365 p76
2 )。長さが1863bpであるその遺伝子は、クローニングされ、配列決定さ
れた(Sharpe ら, Nucleic Acids Res. (1984) 12(9):3917) 。アポリポタンパク
質AI型活性を有する種々のタンパク質産物が同定された。これらの産物は、表
1で示されるように、従来技術で記載された種々の天然の変異体を含む。
LDL)、低密度タンパク質(LDL)及びリポタンパク質Lp(a)の主要タ
ンパク質構成分である。このタンパク質は、LDLレセプタの生理的リガンドで
あり、その血漿濃度は、アテローム性動脈硬化の発症と陽性に関連する(Brunze
llら, 1984 Arteriosclerosis 4, 79-93)。ApoB-100は、公知の最大のタンパク
質の一つであり、分子量は550kDaであり、4536個のアミノ酸を含む(
Chenら, 1986 J.Biol.Chem, 261, 12919-21 )。このリポタンパク質は肝臓での
み合成される。その血漿濃度は、1.0-1.2g/Lである。ApoB-100は、肝臓で合成さ
れるコレステロールを血漿を通り、生物の他の細胞に輸送するのに主要な役割を
荷う。apoBの別の型、即ち、apoB−48は、キロミクロンに存在する。
ヒトにおいて、apoB−48は、腸で合成される。ApoB−48は、260
kDaの分子量を有し、2152個のアミノ酸を含み、それは、直線的のapo
B−100のN末端の48%に対応する(Powellら, 1987, Cell 50, 831-40 )
。apoB−100のC末端部分は、apoB−100がLDLレセプターと結
合する領域を含むので、apoB−48は、LDLレセプターとは結合せず、代
謝的に異なるように振舞う。
質異常血症に関連する疾患のリスクと関連するタンパク質又はタンパク質複合体
を発現する動物モデルを利用できることには利点がある。このような動物モデル
は、これらの疾患を理解するために特に利点があるであろう。より詳細には、こ
れらのタンパク質又はタンパク質複合体が開始する調節機構を理解するために特
に利点があるであろう。このことは、該タンパク質の発現と関連する可能性のあ
る活性を検出する目的のために、治療薬又は化合物のかなりの数を、迅速に、イ
ンビボで試験することを可能とするだろう。更に、このようなモデルは、遺伝子
治療に基づく方法などの、これらの型の疾患を治療する新規で治療的方法を開発
することは興味があろう。ヒトにおける独立のアテローム性動脈硬化リスク因子
であるLp(a)のインビボ解析は、哺乳動物の間でその制限された分布によっ
て部分的に制限されてきた。Apo(a)は天然では、旧世界サル、ヒト、及び
一つの非霊長類種であるヨーロッパハリネズミに独占的に存在する。哺乳動物の
間でapo(a)のこのような限られた分布により、そのインビボ研究の限られ
た研究しかできない。
物モデルであって、これらの疾患、特にアテローム性動脈硬化の治療のための化
合物のスクリーニングと同定を可能とする上記動物モデルに関する。
物モデルである。それらは、操作しやすく、安価である。不幸にも、これらの小
哺乳動物は、必ずしも意図した適用に適合性ではない。というのは、それらは、
ヒト、及びヒトの代謝の代表ではない。チンパンジーは、AIDSや癌を含む種
々の疾患に対する治療薬やワクチンを試験するために使用される。しかし、モデ
ルシステムとして、チンパンジーを用いて招かれる非常な高価は、その使用に関
する主要な、強要的なハンディキャップである。
発現するトランスジェニックマウスの開発は、脈管構造に対するLp(a)の影
響を説明する仮説を試験する手段を提供する。詳細には、プラスミン生成の阻害
、及び関連する結果によって、アテローム発生を促進するapo(a)の能力を
試験するために、これらのマウスを用いた(Lawnら, Nature (1992) 360, 670-6
72;Graingerら, Nature (1994) 370, 460-462)。apo(a)トランスジェニ
ックマウスの研究からまた、以下の観察を含むLp(a)アッセンブリィへの洞
察が得られた。観察というのは、apo(a)は、マウスapoBを含むLDL
と共有結合を形成できなかったということである(Chiesaら, J Biol Chem (19
92) 267, 24369-24374 )。マウスが、ヒトLDLを導入されたとき、又はヒト
apoBトランス遺伝子を発現したとき、Lp(a)形成の証拠と合わせて(Li
ntonら, J Clin Invest (1993) 92, 3029-3037;Callowら, Proc Natl Acad Sci
, USA(1994) 91, 2130-2136 )、この結果は、マウスapoBは、Lp(a)ア
ッセンブリィに必要な構造的な要求を欠くことを示唆した。マウスにおいて、a
po(a)遺伝子が存在しないこと、及びヒトにおいて、Lp(a)アッセンブ
リィを仲介すると考えられているapo(a)とapoBとの間の配列特異的相
互作用から、上記のことは、完全に予期しない知見ではなかった。マウスにおい
て、ヒトapoBトランス遺伝子の部位特異的な変異誘発を用いる2つの研究は
、apo(a)のための結合の部位を提供する、ヒトapoBにおける唯一のシ
ステイン(Cys4326)の位置測定を報告した(Callow ,M.J. and Rubin,E
.M., J Biol Chem(1995) 270, 23914-23917;McCormicら, (1995) 92, 10147-10
151)。
含むトランスジェニックマウスで研究された(Frazerら, Nat Gen (1995) 9, 42
4-431 )。このトランス遺伝子は、apo(a)遺伝子、その天然プロモータ、
及び5′フランキングDNAの約60kb内と3′フランキングDNAの約80
kb内のシス作用要素を含んでいた。トランス遺伝子は、apo(a)cDAN
構築物を含むマウスで観察されるよりも効率的に発現され(即ち、作出された全
てのapo(a)トランス遺伝子ファウンダーは、完全なトランス遺伝子によっ
て発現されたapo(a)を含んでいた)、apo(a)cDAN構築物を含む
マウスで観察されるよりも有意に高い血漿apo(a)レベルが生じた。ヒトa
po(a)ゲノムトランス遺伝子を発現するマウスにおける驚くべき知見は、a
po(a)発現における、かなりの性ホルモン誘導変化であり、ヒトで観察され
るアンドロゲン及びエストロゲン関連変化の大きさをはるかにしのいだ。しかし
、これらの変化は、ヒトとトランスジェニックマウスにおいて定性的に同様であ
った。両方の場合に、これらのホルモンは、apo(a)血漿レベルを下げる。
的には、cDNA構築物の使用に対し幾つかの利点を有する。非常に重要なこと
だが、トランス遺伝子発現は適当な方法で制御され、その組み込み部位とは独立
である。しかし、非常に大きなゲノムクローンを操作する技術的な困難性と、他
の動物におけるトランス遺伝子のより小さな効力の故に、上記のアプローチは、
apo(a)などの大きな遺伝子のためのトランスジェニックマウスの作出に限
られた。
サイズ、及びマウスとヒトとの間のリポタンパク質プロフィールの差異によって
、種々の研究が妨げられた。それ故、ヒトにより近く、霊長類モデルシステムと
関連する高価性が避けられる動物モデルシステムを同定することが望ましい。
トLp(a)を発現するトランスジェニック動物の更なる必要性が当業界にある
。更に、真に有用であるために、トランスジェニック動物は、十分に高いレベル
で構成的なLp(a)を発現する必要があり、Lp(a)の生理的に適切なレベ
ルを産生するように、構成成分の共有結合を可能とする必要がある。現在まで、
このような動物を作出するのに技術的な困難性は、本発明まで克服されなかった
。
ック動物を提供することによって、従来技術のこれらの欠陥を克服する(このよ
うな発明を達成する困難性にもかかわらず)。
とヒトアポリポタンパク質B(apoB)遺伝子の両方を発現するトランスジェ
ニック動物に関する。これらの動物は、ヒトリポタンパク質(a)(Lp(a)
)、即ち、脂質部分と、apo(a)とapoBの2つのジスルフィド結合サブ
ユニットからなる複合体粒子を発現する。
ドとアポリポタンパク質Bポリペプチドをコードする配列を有するトランスジェ
ニックウサギが提供される。アポリポタンパク質(a)ポリペプチドとアポリポ
タンパク質Bポリペプチドは、結合してリポタンパク質(a)を産生できる。
を提供する。ウサギは、コレステロール豊富な食餌を与えられたとき、ヒトに似
たアテローム性動脈硬化病巣を発症する。
るトランスジェニックウサギを提供する。DNA配列は、ゲノムDNAとcDN
Aから選択されうる。
リポタンパク質(a)とアポリポタンパク質Bをコードする配列を有する。本発
明は、DNA配列を発現する肝細胞を有する、リポタンパク質(a)を産生でき
るトランスジェニックウサギ、及びDNA配列を発現する精巣細胞を有する、リ
ポタンパク質(a)を産生できるトランスジェニックウサギを提供する。
リペプチドの安定な血漿レベルを有するトランスジェニックウサギである。 本発明はまた、アポリポタンパク質(a)ポリペプチドとアポリポタンパク質
Bポリペプチドを発現できるトランスジェニックウサギを作出する方法であって
、第1のウサギの生殖ライン細胞を、第2のウサギの生殖ライン細胞と結合させ
ることを含む上記方法も提供する。第1のウサギの生殖ライン細胞は、アポリポ
タンパク質(a)を発現でき、第2のウサギの生殖ライン細胞は、アポリポタン
パク質Bを発現できる。生殖ライン細胞は、例えば、卵子と***を含む。
ンパク質Bポリペプチドを発現できるトランスジェニックウサギを作出する方法
であって、第1のウサギを、別のウサギと交配させることを含む上記方法も提供
する。第1のウサギは、アポリポタンパク質(a)を発現でき、別のウサギは、
アポリポタンパク質Bを発現できる。
な方法において、アポリポタンパク質Bタンパク質を発現するウサギは、ヒトア
ポリポタンパク質B遺伝子を含むファージミドをウサギ胚に注入することによっ
て提供される。
な方法において、アポリポタンパク質(a)を発現するウサギは、ヒトアポリポ
タンパク質(a)遺伝子を含む酵母人工染色体をウサギ胚に注入することによっ
て提供される。
別の方法において、アポリポタンパク質(a)を発現するウサギは、アポリポタ
ンパク質(a)タンパク質をコードする少なくとも一つのヒトDNA断片をウサ
ギ胚性幹細胞に注入し、胚性幹細胞をウサギ胚盤胞と一緒にし、胚をレシピエン
トのメスウサギに移すことによって提供される。
別の方法において、アポリポタンパク質Bを発現するウサギは、アポリポタンパ
ク質Bタンパク質をコードする少なくとも一つのヒトDNA断片をウサギ胚性幹
細胞に注入し、胚性幹細胞をウサギ胚盤胞と一緒にし、胚をレシピエントのメス
ウサギに移すことによって提供される。
別の方法において、アポリポタンパク質(a)を荷い、発現するウサギは、アポ
リポタンパク質(a)タンパク質をコードする少なくとも一つのヒトDNA断片
を含むレトロウイルスでウサギ卵割球に感染させ、卵割球をレシピエントのメス
ウサギに移すことによって提供される。
別の方法において、アポリポタンパク質Bを荷い、発現するウサギは、アポリポ
タンパク質Bタンパク質をコードする少なくとも一つのヒトDNA断片を含むレ
トロウイルスでウサギ卵割球に感染させ、卵割球をレシピエントのメスウサギに
移すことによって提供される。
阻害できるかどうかを決定する方法であって、ヒトリポタンパク質(a)を産生
でき、ヒトリポタンパク質(a)に関連する疾患を表し、該化合物で治療された
第1のトランスジェニックウサギを、ヒトリポタンパク質(a)を産生でき、ヒ
トリポタンパク質(a)に関連する疾患を表すが、該化合物で治療されなかった
第2のトランスジェニックウサギと比較することを含む上記方法を提供する。本
発明はまた、疾患が、アテローム性動脈硬化、心臓血管疾患、虚血、脳卒中、再
発狭窄症、冠動脈疾患、末梢閉塞性動脈疾患、心筋梗塞、血栓、及び望ましくな
い脂質プロフィールからなる群から選択される場合に上記の方法を用いることも
提供する。
できるかどうかを決定する方法であって、該化合物で治療され、ヒトリポタンパ
ク質(a)を産生できる第1のトランスジェニックウサギにおけるリポタンパク
質(a)産生のレベルを、該化合物で治療されず、ヒトリポタンパク質(a)を
産生できる第2のトランスジェニックウサギにおけるリポタンパク質(a)産生
のレベルと比較することを含む上記方法を提供する。本発明はまた、化合物が、
アンチセンス核酸、及び細胞内結合タンパク質からなる群から選択される場合の
本方法を用いることも提供する。
の適当な動物モデルを提供する。ウサギは、高レベルで構成的なリポタンパク質
(a)タンパク質を発現し、構成成分の共有結合的結合を容易にし、生理的に適
切なレベルのリポタンパク質(a)を産生する。このウサギは、部分的には、血
管傷害や再発狭窄症の研究を容易にするウサギのより大きなサイズのために、ト
ランスジェニックマウスに対しかなりの利点を提供する。更に、ウサギは、アポ
リポタンパク質(a)とリポタンパク質(a)を欠く点でマウスと同様であるが
、ウサギのリポタンパク質プロフィールは、主要な血漿タンパク質としてLDL
をもつヒトのそれとより密接に似ている。更に、ウサギはまた、コレステロール
豊富な食餌を与えられたとき、よく特徴づけされたヒト様アテローム性動脈硬化
を発症する。
役立つはずである。 “ポリペプチド”は、共有結合したアミノ酸残基からなる重合化合物である。
アミノ酸は以下の一般構造をもつ。
(OH)を有する側鎖、(3)硫黄原子を有する側鎖、(4)酸性基又はアミド
基を有する側鎖、(5)塩基性基を有する側鎖、(6)芳香族環を有する側鎖、
(7)プロリン、即ち、側鎖がアミノ基と融合したイミノ酸。
である。本発明の意味内で、“リポタンパク質(a)複合体”という命名は、ア
ポリポタンパク質(a)とB、及びLp(a)とLp(a)活性をもつ他の全て
のタンパク質産物をカバーするように理解される。好ましくは、タンパク質産物
という用語は、アポリポタンパク質の少なくとも一つの生物学的性質をもつ変異
体、断片もしくはペプチド、及びアポリポタンパク質の天然の変異体を示す。本
発明のポリペプチド又はタンパク質は、グリコシル化されうるか、又はグリコシ
ル化されえない。
来で、そのポリペプチド又はタンパク質の少なくとも一つの生物学的性質を保持
するアナログ、断片、誘導体、突然変異体である。ポリペプチド又はタンパク質
の異なる変異体は、天然に存在しうる。これらの変異体は、タンパク質をコード
する構造遺伝子のヌクレオチド配列の差によって特徴づけられるアレル変異であ
りうるし、又は差別的なスプライシングもしくは翻訳後修飾を含みうる。変異体
は、実質的に同一の生物活性をもつが、異なる種から得られた関連タンパク質も
含む。
体を作出できる。これらの変異体は、とりわけ以下のものを含みうる。(a)1
個以上のアミノ酸が保存的又は非保存的アミノ酸で置換された変異体、(b)1
個以上のアミノ酸が、ポリペプチド又はタンパク質に付加された変異体、(c)
1個以上のアミノ酸が、置換基を含む変異体、及び(d)ポリペプチド又はタン
パク質が、血清アルブミンなどの別のポリペプチドと融合した変異体。遺伝学的
(サプレッション、欠失、突然変異など)、化学的、及び酵素的技術を含むこれ
らの変異体を得る技術は、当業者に公知である。
飾形を含む、このようなアレル変異体、アナログ、断片、誘導体、突然変異体、
及び修飾により、ポリペプチドの生物学的性質のいずれかをもつポリペプチドの
誘導体が得られるならば、それらは、本発明の範囲内に含まれるものとする。
合化合物である。核酸は、ポリリボ核酸(RNA)とポリデオキシ核酸(DNA
)を含むが、その両方とも一重鎖又は二重鎖でありうる。DNAは、cDNA、
ゲノムDNA、合成DNA、及び半合成DNAを含む。タンパク質をコードする
ヌクレオチド配列は、センス配列といわれる。“apo(a)遺伝子”は、アポ
リポタンパク質(a)タンパク質をコードする遺伝子である。“apoB遺伝子
”は、アポリポタンパク質Bタンパク質をコードする遺伝子である。好適なap
o(a)遺伝子とapoB遺伝子は、ヒトapo(a)タンパク質とヒトapo
Bタンパク質をコードする。
ンパク質(例えば、免疫グロブリンスーパーファミリィ)や異なる種からの相同
タンパク質(例えば、ミオシン軽鎖など)を含む、“共通の進化的起源”を有す
るタンパク質間の関係を指す(Reeck ら, 1987, Cell 50:667 )。このようなタ
ンパク質(及びそれらをコードする遺伝子)は、高程度の配列類似性によって反
映される配列相同性を有する。
ちえない核酸又はタンパク質のアミノ酸配列の間の同一性又は対応性の程度を指
す(Reeck ら、上記参照)。しかし、共通の使用法及び本明細書において、“高
度な”のような修飾語で修飾されたとき、“相同的”という用語は、配列類似性
を指すが、共通の進化的起源を指さない。
くとも約75%、最適には、少なくとも約90%又は95%)が、DNA 配列の定
められた長さにわたって一致するとき、2つのDNA 配列は“実質的に相同”又は
“実質的に類似”である。実質的に相同である配列は、配列データバンクで利用
できる標準的なソフトウエアを用いて配列を比較することによって、又は、例え
ば、特別の系のために定められたストリンジェント条件下、サザンハイブリダイ
ゼーションで、同定されることができる。適当なハイブリダイゼーション条件の
決定は、当業界の技術内である。例えば、Maniatisら, 上記;DNA C loning, Vo
ls. I and II, 上記;Nucleic Acid Hybridization, 上記;参照。
約60%超が類似であるとき(機能的には同一)、2つのアミノ酸配列は、“実
質的に相同”又は“実質的に類似”である。好ましくは、類似又は相同の配列は
、例えば、GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Pa
ckage, Version 7, Madison, Wisconsin)pileup プログラムを用いて、アラ インメントによって同定される。
定されるその分子と同一であろうと、異なろうと、類似又は相同の配列を指すた
めに使用される。核酸又はアミノ酸配列アラインメントは、スペースを含みうる
。即ち、“対応する”という用語は、配列類似性を指し、アミノ酸残基又はヌク
レオチド塩基の番号付けを指さない。
むトランスジェニック動物、即ち、ウサギに関する。アポリポタンパク質のアナ
ログ及び誘導体は、アポリポタンパク質、及び他の種からのその相同体と同一の
、又は相同の機能的活性を有する。アポリポタンパク質に関する誘導体及びアナ
ログの製造と使用は、本発明の範囲内にある。特別の実施形態では、誘導体又は
アナログは、機能的に活性である。即ち、本発明の完全長で、野生型のアポリポ
タンパク質と関連する1つ以上の機能的活性を発揮できる。特に、本発明のアポ
リポタンパク質誘導体は、機能あるヒトLp(a)粒子を形成できる。
は欠失によって、コーディング核酸配列を変化させることによって、作出される
ことができる。好ましくは、天然アポリポタンパク質、即ちapo(a)及びa
poBに対し増大した機能的活性を有する誘導体が作出される。本明細書で使用
する“アポリポタンパク質”は、apo(a)又はapoBを指す。
実質的に同一のアミノ酸配列をコードする他のDNA配列も本発明の実施で使用
できる。これらは、アレル遺伝子、他の種からの相同な遺伝子、及び配列内で同
一のアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変化する、即ちサイ
レント変化を生み出すアポリポタンパク質遺伝子の全て又は一部を含むヌクレオ
チド配列を含むが、これらに限定されない。同様に、本発明のアポリポタンパク
質誘導体は、一次アミノ酸配列として、変化した配列を含むアポリポタンパク質
のアミノ酸の全部又は一部を含むものを含むが、それらに限定されない。ここで
は、変化した配列では、機能的に等価なアミノ酸残基が、配列内の残基の代わっ
て置換され、保存的アミノ酸置換が得られる。例えば、配列内の1個以上のアミ
ノ酸残基が、類似の極性の別のアミノ酸によって置換されうる。類似の極性の別
のアミノ酸は、機能的等価物として働き、サイレント変化が起る。配列内のアミ
ノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されうる。例え
ば、非極性(疎水性)アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン
、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンを含む。芳香
族環構造を含むアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン
である。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チ
ロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含む。陽性荷電(塩基性)アミノ酸は
、アルギニン、リシン、及びヒスチジンを含む。陰性荷電(酸性)アミノ酸は、
アスパラギン酸やグルタミン酸を含む。このような変化は、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動又は等電点によって測定される見かけの分子量に影響しないと予期
される。特に好適な置換は、以下のようである。即ち、−Argの代わりにLy
s、及びその逆。陽性荷電が維持できる。−Aspの代わりにGlu、及びその
逆。陰性荷電が維持できる。−Thrの代わりにSer。遊離の−OHが維持で
きる。−Asnの代わりにGln。遊離のCONH2が維持できる。
されうる。例えば、Cysは、別のCysとのジスルフィドブリッジの可能性あ
る部位に導入されることができる。Hisは、特別な“触媒”部位として導入さ
れることができる(即ち、Hisは、酸又は塩基として作用でき、生化学的触媒
の最も普通のアミノ酸である)。Proは、その特別の平面構造の故に導入され
ることができる。Proは、タンパク質構造にβ−ターンを誘導する。
公知の種々の方法で製造できる。それらを製造できる操作は、遺伝子又はタンパ
ク質レベルで行ないうる。例えば、クローニングされたアポリポタンパク質遺伝
子配列は、当業界公知の多数の戦略のいずれかによって修飾できる(Sambrookら
,1989, 上記)。配列は、制限エンドヌクレアーゼによって適当な部位で切断さ
れえ、続いて、所望ならば、更なる酵素的修飾を行ない、単離し、インビトロで
連結されることができる。アポリポタンパク質の誘導体又はアナログをコードす
る遺伝子の製造において、所望の活性がコードされている遺伝子領域で、翻訳終
始信号によって妨害されず、天然のアポリポタンパク質遺伝子と同じ翻訳読み枠
内に、修飾遺伝子が留まるように、注意を払うべきである。
で変異誘発され、翻訳配列、開始配列、及び/又は終止配列を作出/破壊でき、
又はコード領域での変異を作出でき、及び/又は新規制限エンドヌクレアーゼ部
位を作出でき、又は既に存在している制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊でき、
インビトロ修飾を更に容易にできる。好ましくは、このような変異は、変異アポ
リポタンパク質遺伝子産物の機能的活性を増大させる。当業界公知の変異誘発の
技術を使用できる。該技術は、インビトロ部位特異的変異誘発(Hutchinson,C.
ら,1978, J.Biol.Chem. 253:6551 ;Zoller and Smith, 1984, DNA 3:479-488
;Oliphantら,1986, Gene 44:1 77 ;Hutchinson,C. ら,1986, Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 83:710)、TABリンカー(Pharmacia )の使用などがある が、これらに限定されない。PCR技術は、部位特異的変異誘発のために好適で
ある(Higuchi, 1989, “Using PCR to Engineer DNA ”in PCR Technology :
Principles and Applications for DNA Amplicatoin, H.Erlich, ed., Stockto
n Press, Chapter 6,pp・61-70)。
調節領域の選別は、当業者のレベル内のルーチンな事項である。“調節領域”は
、第2の核酸配列の発現を制御する核酸配列を意味する。調節領域は、特別の核
酸(相同領域)を発現するのに天然で責を負う配列を含みうるし、又は異なる起
源の配列(異なるタンパク質又は合成タンパク質でさえ、発現するのに責を負う
)を含みうる。特に、配列は、特異的方法又は非特異的方法で、及び誘導様式又
は非誘導様式で、遺伝子の転写を刺激又は抑制する真核細胞の遺伝子又はウイル
ス遺伝子の配列あるいはそれらから由来する配列でありうる。調節領域は、複製
起点、RNAスプライス部位、エンハンサー、転写終止配列、ポリペプチドを標
的細胞の分泌パスウエイに向わせるシグナル配列、及びプロモーターを含む。
又は他の細胞型における機能的転写のためのプロモータ領域、及び問題の遺伝子
の3′に位置し、転写の終止のための信号及びポリアデニル化部位を指定する領
域を含みうる。全てのこれらの要素は、発現カセットを構成する。
型)の両方を含む。プロモータは、天然で、核酸の発現の役割を荷いうる。それ
はまた、ヘテロローガスな源からでありうる。特に、それは、真核細胞遺伝子又
はウイルス遺伝子のプロモータ配列でありうる。例えば、それは、感染するのが
望まれる細胞のゲノム由来のプロモータ配列でありうる。同様に、それは、使用
されるアデノウイルスを含むウイルスのゲノム由来のプロモータ配列でありうる
。この点で、例えば、E1A、MLP、CMV、RSV遺伝子などのプロモータ
を挙げることができる。好ましく使用される非ウイルスプロモータ配列は、Ap
oAIプロモータ、又はApoEの肝エンハンサ、又はapoCIIIの腸エン
ハンサである。当然、これらの発現配列は、活性化配列、調節配列などを付加す
ることによって、更に修飾できる。ゲノムDNAはまた、P1ベクターなどの大
容量発現ベクター、YAC、コスミッド又はプラスミドベクターに含ませること
ができる。
現を可能とする配列(エノラーゼプロモータ及びGFAPプロモータなど)の付
加によって修飾されることができる。更に、核酸がプロモータ配列を含まないと
き、それは、このような配列の下流のウイルスゲノム中へのように、挿入される
ことができる。
RT、ビメンチン、アクチン、チューブリン)、中間フィラメントプロモータ(
例えば、デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAP)、治療遺伝子
プロモータ(例えば、MDR型、CFTR、第VIII因子)、組織特異的プロ
モータ(例えば、平滑筋細胞のアクチンプロモータ)、***細胞で優先的に活性
化されるプロモータ、刺激物質に応答するプロモータ(例えば、ステロイドホル
モンレセプタ、レチノイン酸レセプタ)、テトラサイクリンで調節される転写モ
ジュレータ、サイトメガロウイルス中間−初期プロモータ、レトロウイルスLT
Rプロモータ、メタロチオネインプロモータ、SV−40プロモータ、E1aプ
ロモータ、及びMLPプロモータである。テトラサイクリンで調節される転写モ
ジュレータとCMVプロモータは、WO96/01313、米国特許第5,16
8,062号及び第5,385,839号に記載されている。それらの内容は、
引用により本明細書に含まれるものとする。
わされていない調節領域である。ヘテロローガス調節領域には、異なる種からの
調節領域、異なる遺伝子からの調節領域、ハイブリッド調節配列、及び天然では
存在しない調節配列が含まれるが、それらは、当業者によって設計される。
クター”という用語は、核酸を細胞にインビトロ、エクスビボ、又はインビトロ
で導入するためのウイルス手段及び非ウイルス手段の両方を含む。非ウイルスベ
クターは、プラスミド、ファージミド、BAC、PAC、YAC、P1、リポソ
ーム、電気荷電脂質(サイトフェクチン)、DNA−タンパク質複合体、及びバ
イオポリマーを含む。本発明の核酸を含むベクターは、プラスミド、ファージミ
ド、P1、BAC、PAC、YAC又はコスミドベクターを含む。本発明に特に
関心のあるベクターは、大きなDNA配列を収容できるものを含むが(即ち、フ
ァージミド、プラスミド、P1、BAC、PAC、YAC、又はコスミドベクタ
ー)、特に、本発明に関するゲノムDNAの場合には、そうである。本発明の核
酸に加えて、ベクターはまた、1個以上の調節領域、及び/又は核酸移転結果(
どの組織への移転、発現の持続など)を選別し、測定し、モニターするのに有用
な選択可能なマーカーを含みうる。
グリセライド、リポタンパク質コレステロール、及び他の脂質の濃度のセットを
意味する。
又はリポタンパク質コレステロールの濃度が、年齢と性で調整したレファレンス
範囲の外にある状態である。一般的には、総コレステロールの濃度200mg/
dL超、血漿トリグリセライドの濃度200mg/dL超、LDLコレステロー
ルの濃度130mg/dL超、HDLコレステロールの濃度39mg/dL未満
、又は総コレステロールとHDLコレステロールの比4.0超は、望ましくない
脂質プロフィールと考えられている。望ましくない脂質プロフィールは、高脂血
症、糖尿病、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び冠動脈疾患の
他の型を含む種々の生理的条件と関連する。
ル又は転写レベルで達成できる。好ましくは、本発明のアンチセンス核酸は、ア
ポリポタンパク質(a)もしくはBをコードする核酸又は対応するメッセンジャ
ーRNAと特異的にハイブリダイズできる核酸断片である。これらのアンチセン
ス核酸は、合成オリゴヌクレオチドでありうる。それらの安定性と選択性を改良
するために、場合によっては修飾された合成オリゴヌクレオチドでありうる。そ
れらはまた、DNA配列の細胞における発現が、アポリポタンパク質(a)又は
BをコードするmRNAの全部又は一部に相補的なRNAを産生するそのDNA
配列でもありうる。アンチセンス核酸は、欧州特許第140308号に記載のよ
うに、反対方向で、アポリポタンパク質(a)又はBをコードする核酸の全部又
は一部の発現によって製造されることができる。アンチセンス核酸が、アポリポ
タンパク質(a)又はBの発現をダウンレギュレーションすることができる、又
はブロックすることができる限り、アンチセンス配列のいずれの長さも本発明の
実施のために適切である。好ましくは、アンチセンス配列は、長さで最低20ヌ
クレオチドである。アンチセンス核酸、アンチセンスRNAをコードするDNA
の製造と使用、及びオリゴと遺伝子的なアンチセンスの使用は、WO92/15
680に開示されている。その内容は、引用により本明細書に含まれるものとす
る。
り、滅菌してあり、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて処方された水性
又は油性の懸濁液でありうる希釈剤及び充填剤を含む。特定の医薬として許容可
能な担体及び活性化合物と担体の比は、組成物の溶解性と化学的性質、投与の特
定の型、及び標準的医薬実務によって決定される。
似ているリポタンパク質プロフィールを有するトランスジェニック動物が得られ
る、タンパク質発現、即ちLp(a)産生のレベルを指すために、本明細書では
使用される。特に、トランスジェニック動物が、コレステロール豊富な食餌を与
えられたとき、良く特徴づけされたヒト様アテローム性動脈硬化病巣を発症でき
る。特別の実施形態では、トランスジェニック動物におけるLp(a)のレベル
は、ヒトで見出された範囲内にある。
含むように、本明細書では使用される。それはまた、胚段階及び胎仔段階を含む
発生の全ての段階での個々の動物を含む。ミクロインジェクション又は組換えウ
イルスによる感染のように、細胞下レベルで計画的な遺伝子操作によって、直接
的又は間接的に、受取った遺伝子情報をもつ1個以上の細胞を含む動物である。
この導入されたDNA分子は染色体に組込まれうるし、又は染色体外で複製する
DNAでありうる。“生殖細胞ライントランスジェニック動物”は、遺伝子情報
が生殖ライン細胞に導入され、子孫へその情報を伝達する能力をもつトランスジ
ェニック動物を指す。実際にこのような子孫が、その情報の一部又は全部をもつ
ならば、その子孫はまた、トランスジェニック動物である。
る。特に、ヒトリポタンパク質(a)のインビボ解析のための実験モデルを提供
することは重要である。本出願人は、リポタンパク質(a)を提供できるトラン
スジェニックウサギを、当業界では初めて得た。
用されるアプローチを示し、リポタンパク質代謝とアテローム発生に対するイン
パクトを示す(Fan ら,Arterioscler Thromb Vasc Biol(1995) 15, 1889-1899
;Duvergerら,Arterioscler Thro mb Vasc Biol(1996) 16, 1424-1429 )。マ ウスと比較して、この動物の利点は、一部には、比較的大きなサイズに関連し、
血管傷害と再発狭窄症の容易な研究を可能とする。更に、ウサギは、apo(a
)とLp(a)を欠く点でマウスと同様であるが、ウサギのリポタンパク質プロ
フィールは、主要な血漿リポタンパク質としてLDLをもつ点で、ヒトのそれに
より密接に似ている(Chapman,M.J., in Methods in Enzymology, vol.128 :Pl
asama Lipoprote ins, Part A, Preparation, Structure, and Molecular Biolo
gy, Segrest,J.P., and Albers,J.J., Eds. (Academic Press, Inc., New York,
1986), vol.128, pp.70-143 )。ウサギはまた、コレステロール豊富な食餌を 与えられたとき、良く特徴づけられたヒト様アテローム性動脈硬化病巣を発症す
る。
リポタンパク質に関連するこの動物の疾患の広範な知識が存在する。ウサギは、
“LDL哺乳動物”として分類される動物であり、即ち、ラットやマウスとは反
対に、ヒトにおけるように、LDLは、血漿コレステロールの主要な輸送体であ
る。ラットやマウスは、“HDL哺乳動物”として分類される動物である。更に
、多数の遺伝的変異体が、ウサギ系列内で、リポタンパク質に存在する。例えば
、LDLレセプターが不足しているWHHLウサギ(Watanabe 遺伝性高脂血症
ウサギ)又はLDLを過剰生産する“St Thomas Hosp ital”ウサギ(Rosenfeld
ら, 1990, Arteriosclerosis 10, 680-687;Sedon ら, 1987, Arteriosclerosi
s 7, 113-124 )。
方含むウサギの形態で、Lp(a)の生物学的性質を研究するための新規で、比
較的大きい動物モデルを提供する。該ウサギは、両方のヒトトランス遺伝子の効
率的な組織特異的発現と、Lp(a)粒子のアッセンブリィを示す。更に、ap
o(a)は、インビボでウサギapoBと共有結合的に相互作用し、トランスジ
ェニックウサギモデルは、この新規な相互作用を特徴づける手段であることを示
す。本出願人は、アポリポタンパク質(a)タンパク質とアポリポタンパク質B
タンパク質をコードする外来ゲノムDNA配列が挿入されたゲノムをもつトラン
スジェニックウサギを作出した。アポリポタンパク質(a)タンパク質とアポリ
ポタンパク質Bタンパク質は、リポタンパク質(a)複合体を形成する。
加えて、本発明によって与えられたLp(a)トランスジェニックウサギの幾つ
かの特徴は、Lp(a)を研究するために現在利用できる動物モデルに対し、改
良を示す。これらの動物は、ヒトのリポタンパク質プロフィールに非常に似たリ
ポタンパク質プロフィールをもち、コレステロール豊富な食餌を与えられたとき
、良く特徴づけられたヒト様アテローム性動脈硬化病巣を発症する。また、比較
的に大きなサイズのために、該ウサギを血管傷害や再発狭窄症研究に使用して成
功した。従って、これらのトランスジェニックウサギは、Lp(a)レベルに影
響を与える因子と、アテローム性動脈硬化と血管疾患の進行に対するLp(a)
の影響を研究するための価値ある手段を提供する。
好ましくは、ウサギは、ホモジーニアスな実験室系であり、それらは、Charles
River 又はJackson Laboratories(Bar Harbor, Maine)などの動物源から得るこ
とができる。特定の実施形態では(下記)、ウサギはニュージーランドホワイト
ウサギである。あるいは、本発明のWatan abe 高脂血症トランスジェニックウ サギを作出できる。
て、ウサギ胚に、リポタンパク質(a)複合体を形成するapo(a)タンパク
質又はapoBタンパク質をコードする外来ゲノムDNA配列を注入し、その胚
をレシピエントウサギに移し、誕生後、新生仔ウサギのゲノム中に上記ゲノムD
NA配列の存在を検討する上記方法を提供する。次いで、apo(a)トランス
ジェニックウサギとapoBトランスジェニックウサギを交配して、Lp(a)
を発現するapo(a)−apoBトランスジェニックウサギを作出する。
載されている。このような方法の実行は、ミクロインジェクションの技術、及び
胚の取出しや移殖、並びに動物飼育に精通している当業者には何の困難もない。
現するトランスジェニックウサギを作出するために、ヒトapo(a)遺伝子を
有する270kbの酵母人工染色体(YAC)クローンと、ヒトapoB遺伝子
を有する90kbのP1ファージミドクローンの使用に関する。本発明のトラン
スジェニックウサギは、肝臓で優勢に局在化されている両方のトランス遺伝子の
組織特異的発現を示す。apo(a)トランスジェニックマウスでの観察とは対
照的に、本発明では、ウサギの性的成熟中、安定であるapo(a)血漿レベル
が観察される。更に、apo(a)は、内因性ウサギapoBと共有結合を形成
できる。ヒトapoBとの結合よりも効率は低いけれども。このLp(a)トラ
ンスジェニックウサギモデルの発明は、Lp(a)アッセンブリィのための構造
的な必要性と、apo(a)発現の調節への新規な洞察を提供する。更に、これ
らのトランスジェニックウサギは、Lp(a)のインビボ解析と、このリポタン
パク質の高レベルと関連したアテローム性動脈硬化リスクを減少させる治療的戦
略の開発のための新規な実験モデルを示す。
の変異体を有するトランスジェニックウサギを提供する。該ウサギは、これらの
遺伝子を発現でき、リポタンパク質(a)が形成される。
の種には外来でありうるし(即ち、外因性)、特定の個々のレシピエントにのみ
外来でありうるし(即ち、外因性)、又はレシピエントによって既に所有された
遺伝情報でありうる。最後の場合に、導入された遺伝子は、天然の内因性遺伝子
と比較して異なるように発現されうる。
型からcDNAを調製することによって、合成によって、又はそれらの組合せに
よって得ることができる。本発明の好適な実施形態では、ヒトapo(a)遺伝
子とヒトapoB遺伝子は、ゲノムDNAからクローニングされ、トランス遺伝
子発現は、適当な方法で制御され、トランスジェニック動物の染色体DNAへの
組み込みの部位とは独立である。
、又はある割合の細胞にのみ組込むことができる。後者の場合には、モザイクと
命名される。一般的に、ゲノムDNA配列は、細胞全ての中に組込まれる。本発
明の挿入されたゲノムDNA配列は、リポタンパク質(a)複合体形成及び/又
は代謝に含まれるタンパク質の全て又は活性部分をコードする。これらのゲノム
DNA配列はまた、必要があれば、クラスター形態で組織化されている幾つかの
遺伝子を含みうる。
は、アポリポタンパク質(a)、B、又はこれらのアポリポタンパク質の変異体
もしくは誘導体の全て又は活性部分をコードし、Lp(a)複合体を形成する遺
伝子である。
プロモータなどの調節領域を用いて、遺伝子の発現を増加させ、減少させ、調節
し、又は遺伝子の発現を、ある組織もしくは発生のある段階に指定することがで
きる。プロモータは天然に存在するプロモータである必要はない。本発明の“ト
ランスジェニック非ヒト動物”は、非ヒト動物の生殖細胞ライン中に“トランス
遺伝子”を導入することによって作出される。細胞中にDNAの導入を可能とす
る方法は一般的に利用でき、当業界周知である。トランス遺伝子を導入する異な
る方法が利用できる。一般的に、接合子は、ミクロインジェクションのための好
適な標的である。遺伝子導入のための標的として接合子の使用は、主要な利点を
有する。大部分の場合に、注入されたDNAは、第1の切断前に、宿主遺伝子に
組込まれる(Brinsterら,(1985) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82, 4438-4442)。
それ故、トランスジェニック非ヒト動物のほとんど全ての細胞は、組込まれたト
ランス遺伝子をもつであろう。一般的に、これによりまた、ファウンダーの子孫
へのトランス遺伝子の効率的な伝達が起る。というのは、生殖細胞の50%がト
ランス遺伝子をもつであろうからである。接合子のミクロインジェクションは、
本発明を実施することにおいてトランス遺伝子を組込むための好適な方法である
。
用されることができる。発生している非ヒト胚は、胚盤胞段階までインビトロで
培養されることができる。この時間の間に、卵割球は、レトロウイルス感染の標
的でありうる(Jaenich,R. (1976) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 73, 1260-1264 )
。卵割球の効率的な感染は、透明帯を除去するために酵素的処理によって得られ
る(Hogan ら, (1986) in Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。トランス遺伝子を導入する
ために使用されるウイルスベクターシステムは典型的には、トランス遺伝子をも
つ複製欠陥のレトロウイルスである(Jahnerら, (1985) Proc.Natl.Acad.Sci. U
SA 82,6927-6931 ;Van der Putte nら, (1985)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82,61
48-6152)。トランスフェクションは、ウイルス産生細胞の単層上で卵割球を培 養することによって容易に、効率的に行なえる(Van der Puttenら, (1985)Proc
.Natl.Acad.Sci. USA 82,6148-6152;Stewart ら,(1987) EMBO J. 6:383-388)
。あるいは、感染はより後の段階で行なえる。ウイルス又はウイルス産生細胞は
、分割腔中に注入できる(Jahnerら,(1982 ) Nature 298:623-628)。ファウン ダー動物の大部分は、トランス遺伝子に関しモザイクであろう。というのは、組
み込みは、トランスジェニック非ヒト動物を形成した細胞のサブセットのみで起
るからである。更に、ファウンダー動物は、ゲノムの種々の位置で、トランス遺
伝子のレトロウイルス挿入を有しうる。これらは一般的には、子孫では分離する
。更に、生殖細胞ライン中にトランス遺伝子を導入することも可能である。もっ
とも、それは、妊娠中期の胚の子宮内レトロウイルス感染によって低い効率であ
る(Jahnerら,(198 2) Nature 298: 623-628)。
る。ES細胞は、インビトロで培養された移殖前胚から得られる(Evans,M.J.ら
, (1981)Nature 292, 154-156 ;Bradley,A.ら, (1984) Nature 309, 255-258;
Gossler ら,(1986) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,9065-9060;Robertson ら,(1
986) Nature 322,445-448 )。トランス遺伝子は、DNAトランスフェクション
又はレトロウイルス媒介形質導入によって、ES細胞に効率的に導入されること
ができる。その後、得られた形質転換ES細胞は、非ヒト動物からの胚盤胞と一
緒にできる。ES細胞は、胚に導入され、得られるキメラ動物の生殖細胞ライン
に貢献する(総説として、Jaenisch,R. (1988) Science 240, 1468-1474 )。
き、当業界周知である。このような方法は、外来DNAを検出するために、DN
A(サザン)ハイブリダイゼーション、DNA、RNA、及びタンパク質を検出
するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動(PAGE)及びウエスタンブロットを含むが、これらに限定されない。
コードする配列をもつウサギは、生殖細胞ラインDNAを含むゲノムDNAにヒ
トアポリポタンパク質Bをもつウサギと交配される。特定の実施形態では、WO
95/25793及び認可された米国特許出願第08/704,582号、現在
では米国特許第5,792,902号(1998年8 月11日発行)(その明細書の全
部が引用により本明細書に含まれるものとする)に記載されているように、ap
oBを発現するトランスジェニックウサギは、apo(a)の生理的レベルを発
現するトランスジェニックウサギと交配することができる。次いで、得られた子
孫は、リポタンパク質(a)が産生されるように、アポリポタンパク質(a)と
アポリポタンパク質Bを発現するウサギを同定するためにスクリーニングされる
。
ヒトの介入によって非ヒト動物の生殖細胞ライン中に導入されたDNA配列であ
る。
異体をコードする遺伝子を含む核酸配列を有し、これらの遺伝子を発現でき、リ
ポタンパク質(a)複合体を形成できる。核酸は、天然起源又は人工起源であり
うる。核酸は、ゲノムDNA(gDNA)、相補DNA(cDNA)、ハイブリ
ッド配列、又は合成もしくは半合成配列でありうる。核酸は、ヒト、動物、植物
、細菌、又はウイルスなどの起源でありうる。核酸は、当業者に公知の技術によ
って得られうる。特に、ライブラリィをスクリーニングすることにより、化学合
成により、又はライブラリィをスクリーニングすることにより得られた配列の化
学的もしくは酵素的修飾を含む混合方法により得られうる。
定された(Sharpeら,Nucleic Acids Res. (1984)12(9):3917 )。更に、ヒトa
po(a)遺伝子を有するYACクローン(CEPHライブラリィでクローン3
66H2)が以前に記載された(Frazer,K.A., Narla,G., Zhang,J.L., and Rub
in,E.M., Nat Gen (1995) 9, 424-431)。ヒトapo(a)遺伝子を単離するた
めに、パルスフィールド電気泳動によって、酵母染色体からYACは分離される
ことができる。次いで、YACを含むバンドが、SeaPlaque GTG アガロース(FM
C, Rockland,MD)から切り出され、ベータ−アガロース(NEB, Beverly, MA)で
処理され、0.1M NaCl、10mM Tris、0.1mM EDTAに
対し透析された(Couto,L.B., Spangler,E.A. and Rubin,E.M., Nuc Acid Res (
1989) 17(19), 8010)。
Callowら,Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1994) 91, 2130-2136)。あるいは、それ
自身のプロモータの制御下にヒトapo(a)又はapoBをコードする核酸配
列を含むDNA断片は、ヒトゲノム又はcDNA発現ライブラリィをスクリーニ
ングすることにより、得ることができる。これを行なうために、ヒトアポリポタ
ンパク質(a)又はapoBに相補的であったDNAプローブによるハイブリダ
イゼーションによってスクリーニングされる。次いで、このスクリーニングで単
離されたapo(a)又はapoB DNA含有クローンは、AI/CII/A
IVゲノムコンプレックスのための報告された制限地図と比較して(S.K.Karath
anasisら,Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1983)80, 6147-6151;S.K.Karathanasis ら,Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1985) 82, 6374-6378 )、又はそれぞれの報告さ
れた配列と比較して(Sharpeら, Nucleic Acids Res. (1984) 12(9):3917;Fraz
er,K.A., Narla,G., Zhang,J.L. and Rubin,E.M., Nat Gen (1995) 9,424-431;
Callowら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1994) 91, 2130-2136 )解析される。
、1つ以上の調節領域に連結される。適切な調節領域の選別は、当業者のレベル
内であるルーチンな仕事である。
位置する領域を含みうる。3′に位置する領域は、転写の終止のための信号とポ
リアデニル化部位を定める。全てのこれらの要素は、発現カセットを構成する。
た(誘導型)プロモータの両方を含む。勿論、プロモータは、核酸の発現の役割
を荷いうる。プロモータはまた、ヘテロローガスな源からでありうるし、真核細
胞の遺伝子又はウイルス遺伝子のプロモータ配列でありうる。例えば、プロモー
タは、感染するのが望ましい細胞のゲノム由来のプロモータ配列でありうる。同
様に、プロモータは、アデノウイルスを含むウイルスのゲノム由来のプロモータ
配列でありうる。この点に関し、例えば、E1A、MLP、HCMV及びRSV
遺伝子などのプロモータを挙げることができる。更に、プロモータは、活性化配
列又は調節配列、又は組織特異的もしくは優勢な発現を可能とする配列の添加に
よって修飾されることができる。組織特異的プロモータは、種々の疾患のモデリ
ングのための手段を提供する。核酸がプロモータ配列を含まないとき、プロモー
タ配列は挿入されることができる。
ビメンチン、アクチン、チューブリン、中間フィラメント、デスミン、ニューロ
フィラメント、ケラチン、及びGFAPプロモータ;分割細胞で優先的に活性化
される治療遺伝子プロモータMDR、CFTR、及びVIII因子プロモータ;
ステロイドホルモンレセプターやレチノイン酸レセプタープロモータなどの刺激
物質に応答するプロモータ;テトラサイクリンで調節される転写モジュレータ;
サイトメガロウイルス中間−初期;レトロウイルスLTR、メタロチオネイン;
SV40、E1a及びMLPプロモータである。テトラサイクリンで調節される
転写モジュレータとCMVプロモータは、WO96/01313、米国特許第5
,168,062号と第5,385,839号に記載されている。それらの内容
は、引用により本明細書に含まれるものとする。
はそれらの変異体は、強力なプロモータ、例えば、ヒトサイトメガロウイルス(
HCMV)に機能可能に連結され、トランス遺伝子発現の高レベルが達成される
。このような構築物を含むトランスジェニック動物は、ヒトリポタンパク質(a
)発現のモデルを提供し、それ故、アテローム性動脈硬化、脳卒中、虚血、再発
狭窄症、心臓血管系疾患、冠動脈疾患、末梢閉塞性動脈疾患、心筋梗塞、望まし
くない脂質プロフィール、及び血栓のモデルを提供するだろう。
、組織特異的プロモータに機能可能に連結され、特定の細胞にトランス遺伝子の
過剰発現を局在化する。好適な組織特異的プロモータは、バスキュレーション(
vasculation )細胞と内皮細胞を含む。
ド又はエステロゲンレセプターからの突然変異したリガンド結合ドメインをコー
ドする配列に機能可能に連結された該遺伝子を過剰発現させることも可能である
。この実施形態では、該遺伝子の発現は、グルココルチコイド又はタモキシフェ
ンによって調節される。
なベクターは、プラスミド及びウイルスベクター、例えばレトロウイルスである
。
好ましくは、ウイルスベクターは複製欠陥である。即ち、ウイルスベクターは、
標的細胞で自律的に複製できない。一般的に、本発明の範囲内で使用される複製
欠陥ウイルスベクターのゲノムは、感染細胞でウイルスの複製に必要な少なくと
も一つの領域を欠く。これらの領域は、当業者に公知の技術によって、除去され
ることができ(全体又は部分)、又は機能がないようにされることができる。こ
れらの技術は、全部の除去、置換(他の配列によって、特に挿入された核酸によ
って)、部分的欠失、又は必須(複製のために)領域への1個以上の塩基の添加
を含む。このような技術は、遺伝子操作の技術を用いて、又は変異誘発剤による
処理によって、インビトロ(単離DNAに対して)又はin situ で行なうことが
できる。
ゲノムの配列を保持する。 レトロウイルスは、分割細胞に感染するインテグレーティングウイルスである
。レトロウイルスゲノムは、2個のLTR、カプシド化配列、及び3つのコーデ
ィング領域(gag、pol、env)を含む。組換えレトロウイルスベクター
の構築は、記載されている。特に、欧州特許第453242号、欧州特許178
220号、Bernstein ら,Genet. Eng. (1985) 7:235;McCormick, BioTechnolo
gy (1985) 3:689 などを参照。組換えレトロウイルスベクターにおいて、一般的
に、gag、pol、env遺伝子は、全体又は部分が欠失され、問題の異種の
核酸配列で置換えられる。これらのベクターは、異なる型のレトロウイルス、例
えば、HIV、MoMuLV(“Moloney murine leukemia virus ”)、MSV (
“murine Mol oney sarcoma virus”)、HaSV(“Harvey sarcoma virus” )、SNN(“splenn necrosis virus ”)、RSV(“Rous sarcoma virus”
)及びフレンドウイルスから構築されることができる。欠陥レトロウイルスベク
ターはWO95/02697に開示されている。
カプシド化配列、コーディング配列を含むプラスミドが構築される。この構築物
を用いて、パッキング細胞ラインにトランスフェクトする。パッキング細胞ライ
ンは、該プラスミド上で欠陥のレトロウイルス機能をトランスで供給できる。一
般的に、パッキング細胞ラインは、gag、pol、env遺伝子を発現できる
。このようなパッキング細胞ラインは、従来技術で記載されている。特に、細胞
ラインPA317(米国特許第4,861,719号)、PsiCRIP細胞ラ
イン(WO90/02806)、GP+EnvAm−12細胞ライン(WO89
/07150)が記載されている。更に、組換えレトロウイルスベクターは、転
写活性を抑制するためにLTR内に修飾を含むことができ、gag遺伝子の一部
を含みうる広範なカプシド化配列を含むことができる(Benderら,J.Virol. (19
87) 61:1639 )。組換えレトロウイルスは、当業者公知の標準的な技術によって
精製される。
するトランスジェニック動物は、薬剤スクリーニングアッセイに有用である。こ
れらのアッセイは、アテローム性動脈硬化、脳卒中、虚血、再発狭窄症、心臓血
管系疾患、冠動脈疾患、末梢閉塞性動脈疾患、心筋梗塞、望ましくない脂質プロ
フィール、及び血栓などの疾患の治療に有効な化合物を同定するのに有用である
。
を調節する化合物の能力を決定する方法を提供する。好適な方法は、発現され、
ヒトリポタンパク質(a)複合体を形成するヒトapo(a)遺伝子とヒトap
oB遺伝子又はそれらの変異体を有するトランスジェニック非ヒト動物に化合物
を投与し、対照動物に対しトランスジェニック動物における化合物の可能性のあ
る治療効果を比較することを含む。Lp(a)発現と関連し、Lp(a)発現に
よって誘導される、及び/又は悪化する疾患、例えば、アテローム性動脈硬化、
再発狭窄症、脳卒中、虚血、再発狭窄症、心臓血管系疾患、冠動脈疾患、末梢閉
塞性動脈疾患、心筋梗塞、望ましくない脂質プロフィール、及び血栓などを予防
し、及び/又は治療する可能性のある治療化合物が決定できる。
ジェニックウサギの使用、又は、Lp(a)発現に関連した疾患を予防及び/又
は治療することの観点をもった治療方法、並びにこのウサギを用いて新規化合物
を検出する方法、及び特徴づけられる化合物に関する。このトランスジェニック
ウサギは動物モデルシステムは、Lp(a)発現及び/又は代謝と関連する疾患
の疾患の治療及び/又は予防のための特定の治療剤/化合物を検出するのに特に
有利である。特に、アテローム性動脈硬化、心臓血管系疾患、冠動脈疾患、脳卒
中、虚血、末梢閉塞性動脈疾患、再発狭窄症、血栓、心筋梗塞、狭心症、突然死
、望ましくない脂質プロフィール、心臓代償不全などの心臓血管系疾患、又は脳
血管系疾患の分野で特にそうである。
症、心臓血管系疾患、冠動脈疾患、末梢閉塞性動脈疾患、心筋梗塞、望ましくな
い脂質プロフィール、及び血栓などのLp(a)発現と関連し、Lp(a)発現
によって誘導され、及び/又は悪化する疾患の治療のために有効な化合物を同定
する方法を提供する。このような方法は、ヒトapo(a)遺伝子とヒトapo
B遺伝子又はそれらの変異体を有するトランスジェニック非ヒト動物(トランス
遺伝子は発現され、ヒトリポタンパク質(a)複合体を形成する)に化合物を投
与し、対照トランスジェニック動物に対しトランスジェニック動物において化合
物の可能性ある治療効果を比較することを含む。
異体を有するトランスジェニック非ヒト動物(トランス遺伝子は発現され、ヒト
リポタンパク質(a)複合体を形成する)に化合物を投与し、対照トランスジェ
ニック動物に対し、治療されたトランスジェニック動物においてヒトLp(a)
レベル及び/又は生物活性をモニターすることによって、細胞内でヒトLp(a
)アッセンブリィを調節できる化合物を同定する方法を提供する。本発明の好適
な面では、細胞は、Lp(a)発現と関連し、Lp(a)発現によって誘導され
、及び/又は悪化する疾患を患う動物の細胞であり、方法は、該疾患を予防し、
及び/又は治療するために、Lp(a)機能を調節できる化合物を動物の細胞に
投与することを含む。このような疾患は、アテローム性動脈硬化、再発狭窄症、
脳卒中、虚血、再発狭窄症、心臓血管系疾患、冠動脈疾患、末梢閉塞性動脈疾患
、心筋梗塞、望ましくない脂質プロフィール、及び血栓などを含む。
規模スクリーニングは、apo(a)とapoBトランス遺伝子を発現する脈管
構造又は他の組織の眼で見る観察、及び対照動物との比較を含む。例えば、トラ
ンスジェニック動物体内のヒトLp(a)産生により、血管におけるアテローム
性動脈硬化プラークが生じるならば、観察者は、非治療動物に対し、このプラー
クの形成を減少させる能力に基づき候補薬剤を評価する。
の変異体によって変化する、プロモータに機能可能に連結されたリポーター遺伝
子をも含む本発明のトランスジェニック動物が作出できる。例えば、β−ガラク
トシダーゼ遺伝子(LacZ)に機能可能に連結されたこのようなプロモータは
、LP(a)発現のために矯正的な治療の存在又は非存在に依存して、それぞれ
非誘導であるか、又は誘導されるであろう。
イは、生検、並びに組織学的解析及び/又は免疫組織化学的解析を含む。これら
の特徴は、実務者によって組織学的に評価することができる。免疫組織化学的解
析は、アテローム性動脈硬化、脳卒中、虚血、再発狭窄症、心臓血管系疾患、冠
動脈疾患、末梢閉塞性動脈疾患、心筋梗塞、望ましくない脂質プロフィール、及
び血栓などのマーカーを用いて行なえる。
のどちらか又は両方の発現を阻害できる、又はダウンレギュレーションできる化
合物、細胞内で、Lp(a)複合体の形成もしくはLp(a)の生物活性を阻害
できる化合物、又はリポタンパク質(a)の血漿レベルを減少させることができ
る化合物を含む。このような化合物は、トランスジェニック動物や本明細書記載
のアッセイを用いて同定された抗体や天然又は合成の化合物を含む、アンチセン
ス核酸、細胞内結合タンパク質を含む。
の製造と使用、及びオリゴヌクレオチドと遺伝子的アンチセンスの使用は、WO
92/15680に開示されている。その内容全部は引用により本明細書に含ま
れるものとする。好ましくは、本発明の使用のための核酸は、apo(a)遺伝
子及び/又はapoB遺伝子、又は対応するメッセンジャーRNAの全部又は一
部と特異的にハイブリダイズできるRNAである。アンチセンス配列は、細胞内
の発現が、apo(a)遺伝子及び/又はapoB遺伝子の全部又は一部と相補
的なRNAを産生するDNA配列から得られうる。これらのアンチセンス配列は
、反対方向に、apo(a)及び/又はapoBをコードする配列の全部又は一
部の発現させることによって作出されることができる。アンチセンス配列の任意
の長さが、apo(a)遺伝子及び/又はapoB遺伝子の発現をダウンレギュ
レーションできるか、又はブロックできる限り、アンチセンス配列の任意の長さ
が、本発明の実務のために適切である。好ましくは、アンチセンス配列は、長さ
が少なくとも20ヌクレオチドである。
、核酸は、核酸配列の発現を可能とする適切な調節領域(上記)に機能可能に連
結され、ベクターが細胞に導入されたとき、アンチセンス核酸を発現する、好ま
しくは組換えベクター構築物を用いる細胞中に導入される。適切なベクターの例
は、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(WO91/18088
;WO93/09239;米国特許第4,797,368号、米国特許第第5,
139,941号、欧州特許第488528号参照)、レトロウイルス(上記参
照)、及びヘルペスウイルスである。治療遺伝子の送達のために、好ましくはベ
クターはアデノウイルスである。
飾できる真核細胞のDNAウイルスである。 アデノウイルスの種々の血清型が存在する。これらの血清型のうち、好ましく
は、本発明の範囲内で、2型もしくは5型ヒトアデノウイルス(Ad2又はAd
5)又は動物起源のアデノウイルスを用いる。本発明の範囲内で使用できる動物
起源のアデノウイルスは、イヌ、ウシ、マウス、ヒツジ、ブタ、トリ及びサル(
例:SAV)起源である。好ましくは、動物起源のアデノウイルスは、イヌアデ
ノウイルス、より好ましくはCAV2アデノウイルスである(例えば、Manhatta
n 又はA26/61株(ATCC VR−800))。
ITRs、カプシド化配列及び問題の核酸を含む。更により好ましくは、アデノ
ウイルスベクターの少なくともE1領域は機能をもたない。好ましくは、E1領
域の欠失は、Ad5アデノウイルスの配列でヌクレオチド455乃至3329(
PvuII−BglII断片)又は382乃至3446(HinfII−Sau
3A断片)である。他の領域も修飾できる。特にE3領域(WO95/0269
7)、E2領域(WO94/28938)、E4領域(WO94/28152、
WO94/12649、WO95/02697)、又は後期遺伝子L1−L5の
いずれかがそうである。
d1.0)。E1欠失アデノウイルスの例は、欧州特許第185,573号に開
示されている。その内容は、引用により本明細書に含まれるものとする。別の好
適実施形態では、アデノウイルスベクターは、E1及びE4領域に欠失を有する
(Ad3.0)。E1/E4欠失アデノウイルスベクターは、WO95/026
97とWO96/22378に開示されている。その内容は、引用により本明細
書に含まれるものとする。更に別の好適実施形態では、アデノウイルスベクター
はE1領域に欠失を有し、その中にE4領域と核酸配列が挿入されている(仏国
特許94 13355参照、その内容は、引用により本明細書に含まれるものと
する。)
ero ら,(1991)Gene 101,195;欧州特許第185573号;Graham, (1984)
EMBO J. 3, 2917 )。特に、それらは、アデノウイルスと、とりわけ問題のDN
A配列を有するプラスミドとの間の相同組換えによって作出できる。相同組換え
は、適当な細胞ライン中に、上記アデノウイルスとプラスミドの共トランスフェ
クション後、生じる。好ましくは、使用される細胞ラインは、(i)該要素によ
って形質転換できるべきであり、(ii)組換えの危険を避けるために、好まし
くは組込まれた形態で、複製欠陥アデノウイルスのゲノムの一部を補完できる配
列を含むべきである。使用できる細胞ラインの例は、ヒト胚腎細胞ライン293
(Grahamら,(1977) J.Gen.Viol. 36, 59 )(それは、そのゲノムに組込まれた
Ad5アデノウイルスのゲノムの左手部分(12%)を有する)と、E1とE4
機能を補完できる細胞ラインである(WO94/26914とWO95/026
97に記載されている)。当業者周知の標準的分子生物学技術を用いて、組換え
アデノウイルスは、回収され、精製される。
トランスフェクトされた細胞内でapo(a)、apoB、及び/又はLp(a
)複合体と選択的に相互作用できる細胞内結合タンパク質をコードする核酸配列
の発現によってLp(a)機能を阻害することを含む。WO94/29446と
WO94/02610(それらの全部の内容が引用により本明細書に含まれるも
のとする)は、細胞内結合タンパク質をコードする遺伝子による細胞トランスフ
ェクションを開示する。細胞内結合タンパク質は、それが発現される細胞内で、
ヒトapo(a)、apoB及び/又はLp(a)を含む、apo(a)、ap
oB及び/又はLp(a)複合体と選択的に相互作用できる又は結合でき、結合
apo(a)、apoB及び/又はLp(a)の機能を中和できるタンパク質を
含む。好ましくは、細胞内結合タンパク質は、抗体又は抗体の断片である。好ま
しくは、細胞内結合タンパク質は、一本鎖抗体である。抗体は、モノクローナル
又はポリクローナルでありうる。
を開示する。apo(a)、apoB又はLp(a)複合体タンパク質又はそれ
らの断片を用い、apo(a)、apoB又はLp(a)に特異的なモノクロー
ナル抗体は、当業者公知の技術に従い、作出される。次いで、細胞内結合タンパ
ク質又はその一部をコードし、宿主細胞で発現できる核酸を含むベクターは、本
発明の方法で使用されるために作出される。apo(a)、apoB及び/又は
Lp(a)を含む細胞に、細胞内結合タンパク質をコードする核酸を送達する適
切なベクターと方法は、アンチセンス核酸の送達のための上記のものを含む。
細胞内結合タンパク質をコードする核酸配列は更に、1)細胞内結合タンパク質
とその標的分子との相互作用を可能とするために、その細胞内結合タンパク質を
適当な細胞内局在を目標とするための局在化信号、及び/又は2)形質膜でその
細胞内結合タンパク質の挿入を可能とする配列、をコードする配列を含む。局在
化信号又は挿入配列は、apo(a)、apoB及び/又はLp(a)と結合す
る細胞内結合タンパク質の能力を妨害しないかぎり、細胞内結合タンパク質のど
こにでも局在化信号又は挿入配列は位置することができる。局在化信号の例は、
WO94/02610に開示されている。
物とアッセイを用いて同定されたアンチセンス核酸、細胞内結合タンパク質、及
び化合物である。
ブロックできるアンチセンス核酸構築物は、病気の細胞に送達されることができ
る。ベクター又は裸のDNAの形態で、核酸は、注入可能組成物のために1つ以
上の医薬として許容可能な担体と一緒にできる。核酸は、特に、等張、滅菌、生
理食塩水(リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合
物)中にありうるし、又は乾燥、特に凍結乾燥組成物中にありうる。凍結乾燥組
成物では、場合によっては、滅菌水又は生理食塩水の添加によって、注入溶液の
構成が可能となる。
希釈剤中の溶液又は懸濁液でありうる。医薬として許容可能な担体の例は、生理
食塩水、緩衝化生理食塩水、等張化生理食塩水(例えば、リン酸一ナトリウム又
はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩
化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物)、リンゲル溶液、ブドウ糖、
水、滅菌水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組合せである。1,3−
ブタンジオールや滅菌固定油は、溶媒又は懸濁媒質として便利にも使用される。
合成モノ−又はジグリセライドを含むマイルドな固定油を使用することができる
。オレイン酸などの脂肪酸も、注入可能な組成物中で使用できる。
きる。特に、考えられる投与部位、注入数、発現される遺伝子、又は治療の望ま
れる持続時間の関数として適合できる。一般的には、組換えアデノウイルスは、
104乃至1014pfu、好ましくは106乃至1011pfuの投与量の形態で処
方され、投与される。pfu(プラーク形成単位)という用語は、ウイルス溶液
の感染性に対応し、適当な細胞培養液に感染させ、一般的に15日後、感染細胞
のプラークの数を測定することによって決定される。ウイルス溶液のpfu力価
を決定する技術は、文献に良く記載されている。
、裸のDNAとして投与されることができる。裸のDNAを処方して、哺乳動物
筋肉組織に投与する方法は、米国特許第5,580,859号と第5,589,
466号に開示されている。それらの内容は引用により本明細書に含まれるもの
とする。
発明を説明する。 一般的な分子生物学 本発明では、通常の分子生物学、微生物学、当業界の技術内にある組換えDN
A技術を用いることができる。このような技術は、文献で十分に説明されている
。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laborator
y Manual, Sec ond Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Co
ld Spring Harbor, New York (本明細書では、“Sambrookら, 1989”);DNA C
loning: A Practical Approach, Volumes Iand II(D.N.Glover ed. 1985 );Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait ed. 1984 );Nucleic Acid Hybri
dizat ion(B.D.Hames and S.J.Ehiggins eds. (1985));Transcription And T
ranslation ( B.D.Hames and S.J.Higgins, eds. (1984) );Animal Cell Cul
ture(R.I.Freshney ed.(1986)) ;Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press
(1986));B.Eperbal, A Practical Guide To Molecular Clo ning(1984) ;F.
M.Ausubel ら(eds.),Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
& Sons, Inc.(1994) 参照。
ローン366H2)は、以前に記載された(Frazer,K.A., Narla,G., Zhang,J.L
., and Rubin,E.M., Nat Gen (1995) 9, 424-431;WO95/25793;認可さ
れた米国特許出願第08/704,582号)。パルスフィールド電気泳動によ
って、YACは、酵母染色体から分離された。YACを含むバンドは、SeaPlaqu
e GTG アガロース(FMC ,Rockland, MD)から切り出され、ベータ−アガロース
(NEB,Beverly, MA )で処理し、次いで、0.1M NaCl、10mM
Tris, 0.1mM EDTAに対し透析された(Couto,L.B., Spangler,E
.A. and Rubin,E.M., Nuc Acid Res (1989) 17(19), 8010)。ヒトapoB遺伝
子を含む90kb P1ファージミドは、以前に記載された(Callowら,Proc N
atl Acad Sci, USA (1994) 91, 2130-2136)。
sc Biol (1996) 16,1424-1429 )によって以前に記載された方法を用いた。要約
する。ニュージーランドホワイト成獣メスウサギを過剰***させ、同じ日に交配
し、黄体化ホルモンを注射した。胚を17時間後に集めた。胚注入、偽妊娠メス
への導入、及び動物飼育は、以前に報告された通りであった(Fan ら,Arterios
cler Thromb Vasc Biol(1995) 15,1889-1899;Duvergerら,Arteriosc ler Thro
mb Vasc Biol(1996)16,1424-1429 )。ヒトapo(a)YAC又はヒトapo B P1ファージミドを含む1ng/mLのDNA溶液約2pLをオス前核に注
入した。
インジェクトされた胚を偽妊娠メスに導入し、17匹の生きて産まれたウサギを
得た。耳の生検から抽出したウサギDNAを、以前に記載された方法とプライマ
ー(Frazerら,Nat Gen(1995)9,424-431)を用いて、PCRによってヒトapo
(a)の存在をスクリーニングした。2匹のメスウサギがトランスジェニックで
あった。最高のapo(a)血漿レベルの動物を次の研究に用いた。PCRスク
リーニングを用いて、トランス遺伝子を含むウサギを同定し、apo(a)遺伝
子とそのフランキング領域の完全な組み込みを確認した(図1)。クローンの全
長をスキャンする4つの異なるPCR反応によって決定されたように、apo(
a)ファウンダーウサギは、完全なYACゲノムクローンの完全なコピーを有し
た。apoBトランスジェニック動物を作出するために、780個のミクロイン
ジェクトされた胚を偽妊娠メスに導入した。20匹の生きて産まれたウサギのう
ち、2匹のapoBトランスジェニック動物を、耳生検DNA、PCR、及びヒ
トapoB特異的プライマーを用いて同定された。ヒトapoB特異的プライマ
ーは、該遺伝子のプロモータ領域からであった。5′−AGAAGGTTCCAGATGTCTATGA
GG(配列番号1)と5′−TCCAAGTATCTGTCTTCAAGAAACC (配列番号2)。最高の
apoB遺伝子血漿レベルの動物を次の研究に用いた。ヒトapoB遺伝子は、
プロモータ領域でヒト配列に特異的な単一PCR反応によって検出された。ap
o(a)とapoBのファウンダー動物の子孫は、適当なマーカーについて陽性
であり、2つのトランス遺伝子の伝達のメンデリアン・パターンを示した。ap
o(a)とapoBトランスジェニックファウンダーの間の交配は、本発明の主
題である予測されたゲノタイプのウサギを産生した。
スジェニックウサギ組織から全RNAを抽出し、DNAse処理にかけ、次いで
逆転写を行なった(5μgRNAが、12μLの体積で、65℃、10分間、1
0ng apo(a)RTプライマー:5′−GATGACCAAGCTTGGCAGGTTCTTCC−3
′(配列番号3)、又はapoB M46プライマー:5′−CCACATTTTGAATCCA
GGATGCAGTACTACT −3′(配列番号4)とインキュベートされ、次いでSuperscr
ipt II/緩衝液を補充した(GibcoBRL,Bethesda,MD))。次いで、第1鎖cDN
A をRNAseで処理し、フェノール/クロロホルムで抽出した。RT産物5μ
Lを、Taqポリメラーゼ(Boehringer Manheim, Indianapolis, IN)のための
標準的条件下、PCRにかけた。各プライマーは50pmole を用い、次のような温
度サイクルを用いた(94℃30秒、62℃30秒、次いで72℃90秒−25
サイクル)。apo(a)cDNAは、プライマー(a)Kr1F:5′−ACCT
GAGCAAAGCCATGTG −3′(配列番号5)と(a)Kr1R:5′−AG TACTCCCAC
CTGACACCG−3′(配列番号6)を用いて検出された。apoB cDNAは、 ヒト及びウサギ特異的PCRプライマーを用いて検出された(M49/M50ヒ
ト又はM49/M50ウサギ、Hughes,S.D. ら、Hum.Gene Ther., 7,39-49(1996
) )。PCR産物は、1.5%アガロースゲルで分析された。ゲノムDNAの汚
染の無いことを示すために、RNA調製物は直接、同じPCR条件にかけた。産
物は増幅されなかった。
の組織(肝、精巣、小腸、腎、脳、肺)からのRNR調製物を、トランス遺伝子
発現の定性的測定としてRT−PCRにかけた(図2)。apo(a)RNAは
、肝と精巣で検出され、より感度の高い条件下(PCRサイクル数を25から3
0に増加)では、脳でも観察された。肝と精巣はまた、ヒトapoBトランス遺
伝子の発現の主要部位でもあった。比較的弱い信号(肝の信号の5%未満)が小
腸で検出された。apoB mRNAアッセイの種特異性、及びRNAの質のた
めの対照として、RT−PCRを用いて、ウサギapoBを特異的に検出した。
予期されたように、ウサギapoB mRNAは、試験した全ての組織で検出さ
れた。トランスジェニックマウスでの研究と一致して、ヒトapo(a)とap
oBトランス遺伝子の両方は、同定されたファウンダーウサギの全てで、有意の
レベルで、及び適切な組織で発現され、cDNAトランス遺伝子と比較して、こ
れらのゲノムトランス遺伝子の高効率及び組織特異的発現が示された(Chiesaら
,J Biol Chem (1992)267,24369-24374 ;Chiesaら,J Biol Chem (1993)268,23
747-23750 )。
とはやや違った。トランスジェニックウサギでの低レベルのヒトapoB腸発現
は、ヒトapoBプロモータからの基礎レベルの転写がウサギ腸で起るが、発現
は、腸の内因性apoBの発現よりずっと低いことを示し、この組織での発現に
必要な制御要素が、apoBゲノム構成物には存在しなかったことを示唆した。
この後者の点は、同一のapoBトランス遺伝子を含むマウスの2つの独立の報
告の結論と矛盾しない(Callowら, Proc Natl Acad Sci,USA(1994)91,2130-2136
;Purcell-Huynh ら,J Clin Invest(1995)95,2246-2257 )。更に、トランスジ
ェニックウサギの血漿でヒトapoB−48を検出しなかった。この結果は、(
Fan ら,Arterioscler Thromb Vasc Biol(1995)15,1889-1899 )の知見と一致し
、ヒトapoBタンパク質産生は、トランスジェニックウサギの腸で殆ど、又は
全く起らないことを示唆する。
関連したapo(a)血漿レベルでのかなりの減少のために、トランスジェニッ
クウサギのapo(a)血漿レベルに対する性成熟の影響を試験した。齢が3月
、6月、9月でのウサギ(ウサギは齢6月で性成熟する)から集められた血漿サ
ンプルが、免疫ブロッティングによって、apo(a)レベルの変化について評
価された(図3)。この解析によると、トランスジェニックウサギでは、性成熟
の過程でapo(a)レベルの有意な変化はなかった。
ったが、発現の発生制御は、これらの2つの生物の間で有意に異なった。トラン
スジェニックマウスにおけるapo(a)血漿レベルに対する性成熟の顕著な影
響とは異なって、ウサギにおけるapo(a)レベルは、性成熟によって変化し
なかった。apo(a)の血漿レベルは、主に合成速度によって決定されるので
、apo(a)トランス遺伝子を含むウサギの性成熟に伴うapo(a)血漿レ
ベルの減少の欠如は、性ホルモンは、これらの動物におけるトランス遺伝子発現
に強力な効果をもたないことを示唆する。ウサギにおけるapo(a)転写に対
するこれらのホルモンの影響は、ヒトにおいて記載されたようにわずかでありう
る。
94) 91,2130-2136)によって、ウサギ血漿サンプルから全リポタンパク質分画(
r:1.21g/mL未満)を調製した。Lp(a)とヒトapoB濃度は、サ
ンドイッチELISAアッセイによって、ウサギ血漿及びリポタンパク質分画に
おいて測定した。Lp(a)については、ヒトアポリポタンパク質(a)に対す
るヤギポリクローナル抗血清から調製された精製IgG(International Immuno
logy Corp.,Murrieta,CA)を、捕捉抗体としてミクロタイタープレートウエルに
結合させた。該抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を用い、クロモジェニ
ックな基質O−フェニレンジアミンの添加後、apo(a)を検出した。方法の
標準化は、市販の標準化Lp(a)ELISAキット(Straregic Diagnostics,
Newark,DE)を用い独立に測定されたインハウス ヒトリポタンパク質カリブレ
ーターに基づいた。ヒトapoB(B48+B100)のアッセイは、マウス抗
ヒトapoB抗体(Genzyme, Cambridge,MA )を用いた。標準曲線は、Logit-Lo
g データ変換を用い、適切なブランクと対照によって計算された。全ての報告さ
れた濃度は、3重分析から計算した。
ギから分離された血漿を、(Laemmli,E.K., Nature(1970)227,680-685 )に従い
、4%ポリアクリルアミドゲル上でのSDS-PAGEによって分離し、(Towbinら,Pr
oc Natl Acad Sci, USA(1979)6,4350-4354)に従い、免疫ブロッティングによっ
てミリポアニトロセルロース膜に移した。サンプルは、2−2.5%メルカプト
エタノールを含む変性サンプル緩衝液の添加によって還元し、100℃で5分間
インキュベートした。apo(a)はヤギ抗apo(a)(Valb iotech, Paris
)、続いてHPR 結合ウサギ抗ヤギ(BioRad,Hercules,CA)によって検出した。 ヒトapoBは、HRP結合ポリクローナルウサギ抗ヒトapoB(C.Fievetか
ら贈られる)を用い検出した。タンパク質バンドは、増大ケミルミネセンスキッ
ト(Amersham,Arlington Heights,IL )によって示され、Hoefer GS トランス
ミッタンス スキャニング デンシトメーターを用いスキャンした。主要ピーク
の面積を用いて、遊離及びapoBと結合しているapo(a)の相対的割合を
評価した(Gabel ら,Arterio. Thromb. Vasc. Biol.(1996)16,1559-1567 )。見
かけの分子量は、前染色された標準品(BioRad)の使用によって測定された。対
照ヒト血清は、ヒトタンパク質の発現のために陽性対照として用いた。
po(a)トランスジェニックウサギからの血漿は、2本のバンドを示した(図
4A)。即ち、apoB/apo(a)複合体に対応する高分子量バンドと、遊
離apo(a)に対応する低分子量バンド。高分子量apo(a)バンドの存在
は、apoB/apo(a)トランスジェニックウサギにおけるLp(a)のア
ッセンブリィを示し、apo(a)のみのトランスジェニックウサギにおけるa
po(a)とウサギapoBの間のある程度の共有相互作用を示した。この結果
は、免疫ブロッティング還元血漿サンプルによって確認された(図4B)。その
実験では、同じヒトapo(a)抗血清を用いて、apo(a)を示す唯一のバ
ンドが、トランスジェニックウサギの両方の型で検出された。トランスジェニッ
クウサギにおけるapo(a)の見かけの分子量は約200kDであった。これ
は、約9つのクリングル4様リピートを含むapo(a)タンパク質に対応する
、この同じapo(a)ゲノム構築物を含むトランスジェニックマウスで観察さ
れたapo(a)サイズと同様である。ヒト特異的apoB抗血清でブロットさ
れたサンプル(図4C)は、ヒトapoBのためにPCRによって陽性に試験さ
れたウサギの血漿で独占的に、ヒトapoB−100を示す550kDの唯一の
バンドを示した。トランスジェニックウサギにおいてapo(a)とapoBの
濃度はELISAによって評価された。トランスジェニックウサギにおけるヒト
apoBの平均濃度は17.6mg/dLであった。血漿における平均全apo
(a)濃度は2.5mg/dLであった。apo(a)のみとヒトapoB/a
po(a)トランスジェニックウサギとの間に有意な差は無かった。
po(a)とヒトapoBとの間のジスルフィド結合は、リポタンパク質を単離
するために使用される超遠心の条件に耐えることが示され、非共有結合で会合し
たapo(a)は、より密度の大きい血漿タンパク質と共に分画される(Uterma
nn,G., and Weber,W., FEBS Let (1983) 154,357-361)。apo(a)トランス
ジェニックウサギとapoB/apo(a)トランスジェニックウサギから分離
されたリポタンパク質分画が、ELISAによってapo(a)の存在について
試験された。トランスジェニックウサギの両方の型のリポタンパク質分画でap
o(a)が検出され、apo(a)は、ヒトとウサギの両方のapoBとの間で
ジスルフィド結合を形成したことを示す。しかし、血漿におけるLp(a)とa
po(a)の相対的な割合は、ウサギapoB−apo(a)複合体は、ヒトa
poBで観察されるよりも比較的小さい効率でインビボで形成されたことを示唆
する。apo(a)トランスジェニックウサギとapoB/apo(a)トラン
スジェニックウサギとの間のapo(a)のパターンを比較すると(図4A)、
ウサギapoBだけが存在するとき、非共有結合で結合したapo(a)のより
大きい割合が示された。トランスジェニックウサギにおけるapo(a)の異な
る分子形態の相対的な比は、ケミルミネセントフィルムのデンシトメーターによ
るスキャンによって免疫ブロットから推定された。apoB/apo(a)トラ
ンスジェニックウサギにおいて、apo(a)の約20%が遊離apo(a)と
一致して移動し(n=3)、残りの80%は、ヒト又はウサギapoBと共有結
合した。apo(a)トランスジェニックウサギにおいて、逆の分布が観察され
た(遊離タンパク質80%及びウサギapoBと結合したもの20%;n=3)
。これらの比は厳格に定量的ではないけれど、同じapo(a)トランス遺伝子
及び同様の全apo(a)レベルを含むトランスジェニックウサギの2群の間の
一致した差は、apo(a)は、ウサギapoBよりもヒトapoBとより効率
的にジスルフィド結合を形成することを示唆する。
動物からのapoBとのヒトapo(a)相互作用を試験するインビトロ研究に
よって初めて示唆された。その研究は、ある条件下、ウサギapoBは、ヒトa
po(a)と共有相互作用を形成できることを示した(Trieu,V., and McConath
y,W.J., Biochem.J. (199 5)309,899-904)。apo(a)トランス遺伝子のみ を発現するウサギにおいて、Lp(a)アッセンブリィの証明は、インビボ条件
下この相互作用を実証する。比較して、ヒトapoBとapo(a)トランス遺
伝子の両方を含むウサギは、Lp(a)形態でapo(a)のずっと大きな割合
を含んでいた。しかし、apoB/apo(a)トランスジェニックウサギにお
ける十分なレベルのヒトapoBにもかかわらず、apo(a)の約20%は、
非共有結合の結合状態に留まった。これは、ヒトにおける状態とは対照的である
。ヒトでは、apo(a)の全てがapoBと共有結合している。遊離apo(
a)の存在は、無β−リポタンパク質血症のまれな場合のみ観察された(Menzel
ら,J Bio Che m(1990) 265,981-986)。
ーミエーションクロマトグラフィによって分画した。血漿100μLをカラムに
注入し、GF2緩衝液(20mM Tris pH8.0, 0.27mM EDTA
、150mM NaCl)中流速40μL/分でアイソクラティックな条件下行
なった。流出液を280nmの吸光度でモニターし、50μL分画をラン中、集
め、次いで、市販のコレステロールアッセイキット(Boehringer-Mannheim )を
用い、コレステロールをアッセイした。コレステロール含有分画の20μLアリ
コートを用い、上記のように電気泳動と免疫ブロッティングを用い、apo(a
)とLp(a)の存在を検出した。
更に特徴づけるために、ゲル濾過クロマトグラフィによってリポタンパク質をサ
イズ分画した。密度勾配遠心法とは対照的に、クロマトグラフィ法では、弱い非
共有結合相互作用によって結合したタンパク質を含むリポタンパク質複合体を単
離できる。この方法で分画された血漿の免疫ブロッティングは、apo(a)は
、ヒトapoB/apo(a)トランスジェニックウサギ(図5A)とapo(
a)トランスジェニックウサギ(図5B)の両方で、LDL分画に主に存在する
ことを示した。ヒトapoB/apo(a)トランスジェニックウサギのLDL
分画は、ヒトapoB/apo(a)複合体とウサギapoB/apo(a)複
合体に対応する2つの異なる高分子量バンドを含んでいた。ヒトapoB/ap
o(a)複合体とウサギapoB/apo(a)複合体は、ウサギapoB−1
00(320kD)のより小さい分子量を基に分けられる。全血漿の免疫ブロッ
トでは存在したけれども、非共有結合で結合したapo(a)は、ヒトapoB
/apo(a)トランスジェニックウサギのLDL分画では検出されなかった。
apo(a)トランスジェニックウサギのLDL分画は、電気泳動条件下、LD
Lから解離した比較的多量のapo(a)(遊離apo(a)と定められた)に
よって伴われたウサギapoB/apo(a)複合体を示すブロードバンドを含
んでいた(図5B)。この分析により、ヒトとウサギのapoBの両方を含むリ
ポタンパク質とのapo(a)の結合が確認された。もっとも、ウサギapoB
の場合、粒子のずっと小さな割合で、apo(a)は、ジスルフィド結合により
結合した。
非共有結合相互作用を示した。これは、apo(a)とapoBとの間の高度に
保存されたアフィニティを示唆する。このことは、幾つかの他の種のapoBと
のapo(a)相互作用の以前の研究の結果と同様である(Chiesaら,J Biol C
hem (1993) 268,23747-23750;Trieu,V., and McConathy,W.J., Biochem.J.(199
5)309,899-904 )。このことは、apo(a)トランスジェニックウサギのLD
L分画における非共有結合で結合したapo(a)の観察によって支持される。
apo(a)とapoBとの間のこのような非共有結合相互作用は、システイン
残基を、ジスルフィド結合形成の位置にもってくることによって、Lp(a)ア
ッセンブリィを容易にすることが提案された(Trieu,V., and McConathy,W.J.,
J. Biol. Chem.(1995) 270,15471-15474)。apoB/apo(a)トランスジ
ェニックウサギの血漿中で、apo(a)は、この非共有結合で結合した形態に
留まりうる。というのは、最初の結合段階でapo(a)を有効に捕捉するウサ
ギapoBの能力が存在するからである。一方、この中間体からのジスルフィド
結合はずっと小さい効率で進行する。というのは、共有結合は、非共有結合相互
作用により最良には位置しないシステイン残基の間で起らなければならないから
である。
形成できるというウサギapoBの驚くべき能力の故に、ヒトapoBにおける
apo(a)結合の部位と相同な領域内のウサギapoBのアミノ酸配列の比較
を行なった。ウサギapoBの関連部分は報告されていないので、ウサギapo
B cDNAクローンのカルボキシ末端領域の配列決定を行なった。ウサギap
oBの得られたタンパク質配列を図6に示す。それは、ヒトを含む4つの他の報
告されたapoB配列(配列番号7乃至11)と有意に相同な領域内に整列して
ある。げっ歯類とブタにおけるように、apoBが示された2つの哺乳動物は、
インビトロでヒトapo(a)と共有結合を形成できなく、ウサギapoBはま
た、ヒトapoBにおけるapo(a)結合部位(cys4326)と相同な位
置にシステインを欠く。この位置のシステイン残基は、apo(a)との共有結
合相互作用に必要であるということを示唆する2つの以前の報告(Callow,M.J.
and Rubin,E.M., J Biol Chem(1995)270,23914-23917;McCormick,S.P.A., Ng,J
.K., Taylor,S., Flynn,L.M., Hammer,R.E., and Young, S.G. (1995)92,10147-
10151 )とは対照的に、上記の結果は、ウサギapoB分子中の他のシステイン
が、apo(a)と共有結合相互作用できることを示す。
。 本発明は、上記目的を行なうのに、及び記載され、本発明に固有の結果と利点
を得るのに十分に適していることを、当業者は容易に理解しよう。本明細書記載
のトランスジェニック動物、方法、手順及び技術は、好適な実施形態の代表とし
て記載され、例であるものとし、本発明の範囲に対する限定とするものではない
。本発明の思想内に包含され、特許請求の範囲によって定められる変更や他の使
用を、当業者は考えるであろう。
のPCR解析;ファウンダー動物と、apo(a)とapoBトランスジェニッ
ク動物の交配から得られた子孫から調製したゲノムDNAを、ポリメラーゼ連鎖
反応(PCR)にかけた。4つの異なるプライマーセットによる増幅で判定され
るように、apo(a)トランスジェニックファウンダー(サンプル2)は、完
全なapo(a)ゲノムクローンを有した。プラスミノーゲン5′領域(PMG
5′)、apo(a)5′、apo(a)3′、及びapo(a)様遺伝子3′
(ゲノムクローンの図の下に示された位置)。ApoBトランスジェニックファ
ウンダー(サンプル1)は、ヒト配列のために特異的な単一PCR反応を用いて
検出された。apo(a)/apoB交配からの代表的な子孫(サンプル3と4
で示される(それぞれapo(a)のみ、及びapo(a)/apoB))の解
析により、トランス遺伝子伝達が確認された。各プライマーセットのために、a
po(a)又はapoBゲノムクローンDNAは、陽性対照として含まれていた
(サンプル5)。
(a)(パネルA)とヒトapoB(パネルB)の発現が、逆転写酵素−ポリメ
ラーゼ連鎖反応(RT−PCR)解析によって、対照(c)ウサギとトランスジ
ェニック(tg)ウサギの示した組織で解析された。ヒトapoB特異性とサン
プルの質のための対照として、種特異的プライマー(パネルC)を用いて、ウサ
ギapoB mRNAも増幅された。
過;誕生後、3時点、即ち、3月、6月、9月で、オスとメスのapo(a)ト
ランスジェニックウサギから、血漿サンプルを採った。各サンプル1μLを、還
元条件下、SDS−PAGEにかけ、apo(a)に対し作出された抗体を用い
て免疫ブロッティングを行なった。
o(a)トランスジェニックウサギ(1)、ヒトapoB/apo(a)トラン
スジェニックウサギ(2)、及びヒトapoBトランスジェニックウサギ(3)
からの等体積の血漿(1μL)を、SDS−PAGEでサイズ分画した。ゲルは
、非還元条件(パネルA)と還元条件(パネルB及びC)で電気泳動された。a
po(a)に対し作出された抗体(パネルA及びB)及びヒトapoBに対し作
出された抗体(パネルC)を用いて、免疫ブロッティングを行なった。ヒト血漿
は、対照として含められた。(前染色された泳動した分子量標準品)対(泳動距
離)の曲線を用いて、観察されたタンパク質のサイズを評価した。
ッティング;ヒトapoB/apo(a)トランスジェニックウサギ(A)又は
apo(a)トランスジェニックウサギ(B)からの血漿100μLは、Supero
se 6 カラム上でのクロマトグラフィによってサイズ分画された。偶数番の分画
(6乃至40)を、非還元条件下SDS−PAGEにかけ、apo(a)に対し
作出された抗体を用いて免疫ブロッティングを行なった。分画のコレステロール
アッセイで測定されたリポタンパク質サイズ範囲は、パネルAとBの間のバー中
に示される。
列(配列番号8)、ラット(配列番号9)、ブタ(配列番号10)、ニワトリ(
配列番号11)の相同領域と整列させたウサギapoB(残基4315-4364 ;配列
番号7)のタンパク質配列。配列同一は、大文字で示す。配列上の番号づけは、
ヒトapoB配列に対応する。★は、ヒトapoBへのapo(a)結合の部位
を示す。
Claims (23)
- 【請求項1】 結合してリポタンパク質(a)を産生できるアポリポタンパ
ク質(a)ポリペプチドとアポリポタンパク質Bポリペプチドをコードする配列
を、ゲノムDNAに有するトランスジェニックウサギ。 - 【請求項2】 コレステロール豊富な食餌を与えられたとき、上記ウサギは
、ヒト様アテローム性動脈硬化病巣を発症することを特徴とする請求項1に記載
のウサギ。 - 【請求項3】 外来ヒトDNA配列を有することを特徴とする請求項1に記
載のウサギ。 - 【請求項4】 外来ヒトDNA配列を有することを特徴とする請求項2に記
載のウサギ。 - 【請求項5】 ゲノムDNA及びcDNAからなる群から選択される外来D
NA配列を有することを特徴とする請求項1に記載のウサギ。 - 【請求項6】 ゲノムDNA及びcDNAからなる群から選択される外来D
NA配列を有することを特徴とする請求項2に記載のウサギ。 - 【請求項7】 上記配列を発現する肝細胞を有することを特徴とする請求項
1に記載のウサギ。 - 【請求項8】 上記配列を発現する肝細胞を有することを特徴とする請求項
2に記載のウサギ。 - 【請求項9】 上記配列を発現する精巣細胞を有することを特徴とする請求
項1に記載のウサギ。 - 【請求項10】 上記配列を発現する精巣細胞を有することを特徴とする請
求項2に記載のウサギ。 - 【請求項11】 性的成熟中、安定な血漿レベルのアポリポタンパク質(a
)ポリペプチドを有することを特徴とする請求項1に記載のウサギ。 - 【請求項12】 アポリポタンパク質(a)ポリペプチドとアポリポタンパ
ク質Bポリペプチドを発現できるトランスジェニックウサギの作出方法であって
、 アポリポタンパク質(a)を発現できる第1のウサギの生殖ライン細胞を、アポ
リポタンパク質Bを発現できる第2のウサギの生殖ライン細胞と結合させること
を特徴とする上記方法。 - 【請求項13】 アポリポタンパク質(a)ポリペプチドとアポリポタンパ
ク質Bポリペプチドを発現できるトランスジェニックウサギの作出方法であって
、 アポリポタンパク質(a)を発現できる第1のウサギを、アポリポタンパク質B
を発現できる別のウサギと交配することを特徴とする上記方法。 - 【請求項14】 アポリポタンパク質Bタンパク質を発現できるウサギは、
ヒトアポリポタンパク質B遺伝子を有するファージミドを、ウサギ胚に注入する
ことによって提供されることを特徴とする請求項13に記載の方法。 - 【請求項15】 アポリポタンパク質(a)を発現できるウサギは、ヒトア
ポリポタンパク質(a)遺伝子を有する酵母人工染色体を、ウサギ胚に注入する
ことによって提供されることを特徴とする請求項13に記載の方法。 - 【請求項16】 アポリポタンパク質(a)を発現できるウサギは、ウサギ
胚性幹細胞に、アポリポタンパク質(a)タンパク質をコードする少なくとも一
つのヒトDNA断片を導入し、上記幹細胞とウサギ胚盤胞を一緒にし、胚をレシ
ピエントメスウサギに移すことによって提供されることを特徴とする請求項13
に記載の方法。 - 【請求項17】 アポリポタンパク質Bを発現できるウサギは、ウサギ胚性
幹細胞に、アポリポタンパク質Bタンパク質をコードする少なくとも一つのヒト
DNA断片を導入し、上記幹細胞とウサギ胚盤胞を一緒にし、胚をレシピエント
メスウサギに移すことによって提供されることを特徴とする請求項13に記載の
方法。 - 【請求項18】 アポリポタンパク質(a)を発現するウサギは、ウサギ卵
割球に、アポリポタンパク質(a)タンパク質をコードする少なくとも一つのヒ
トDNA断片を有するレトロウイルスを感染させ、上記卵割球をレシピエントメ
スウサギに移すことによって提供されることを特徴とする請求項13に記載の方
法。 - 【請求項19】 アポリポタンパク質Bを発現するウサギは、ウサギ卵割球
に、アポリポタンパク質Bタンパク質をコードする少なくとも一つのヒトDNA
断片を有するレトロウイルスを感染させ、上記卵割球をレシピエントメスウサギ
に移すことによって提供されることを特徴とする請求項13に記載の方法。 - 【請求項20】 化合物が、リポタンパク質(a)発現又は代謝に関連する
疾患を阻害できるかどうかを決定する方法であって、 ヒトリポタンパク質(a)を産生でき、ヒトリポタンパク質(a)と関連する疾
患を発症し、上記化合物で治療された第1のトランスジェニックウサギを、ヒト
リポタンパク質(a)を産生でき、ヒトリポタンパク質(a)と関連する疾患を
発症し、上記化合物で治療されなかった第2のトランスジェニックウサギと比較
することを特徴とする上記方法。 - 【請求項21】 上記疾患は、アテローム性動脈硬化、心臓血管疾患、虚血
、脳卒中、再発狭窄症、冠動脈疾患、末梢閉塞性動脈疾患、心筋梗塞、血栓、及
び望ましくない脂質プロフィールからなる群から選択されることを特徴とする請
求項20に記載の方法。 - 【請求項22】 化合物が、リポタンパク質(a)粒子のアッセンブリィを
阻害できるかどうかを決定する方法であって、 上記化合物で治療され、ヒトリポタンパク質(a)を産生できる第1のトランス
ジェニックウサギにおけるリポタンパク質(a)産生のレベルを、上記化合物で
治療されず、ヒトリポタンパク質(a)を産生できる第2のトランスジェニック
ウサギにおけるリポタンパク質(a)産生のレベルと比較することを特徴とする
上記方法。 - 【請求項23】 上記化合物は、アンチセンス核酸及び細胞内結合タンパク
質からなる群から選択されることを特徴とする請求項22に記載の方法。
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