JP2002369689A - Knockout animal - Google Patents
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子トラップ法
によるランダム変異ESクローン技術により得られた胚幹
細胞及びノックアウト動物に関する。[0001] The present invention relates to embryonic stem cells and knockout animals obtained by a random mutation ES clone technique by a gene trap method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ヒトゲノムプロジェクトの進展で、ヒト
ゲノムの構造解析は2003年又はそれ以前に終了すると言
われている。したがって、個々に遺伝子を単離し、構造
解析を行なう時代ではなく、ゲノムの「機能解析」の時
代に入ったといえる。2. Description of the Related Art With the progress of the human genome project, it is said that structural analysis of the human genome will be completed in 2003 or earlier. Therefore, it can be said that the era of "functional analysis" of the genome has entered, rather than the era of isolating genes individually and conducting structural analysis.
【０００３】しかし、ゲノムの塩基配列のみでは、機能
に関する情報は十分でないため、機能解析のための新し
い解析系が必要である。さらに、ヒトゲノム解析の一つ
の大きな目標はヒト疾患の原因遺伝子の解明であるが、
原因遺伝子の構造だけでは病気を説明することはできな
い。また、ヒト患者を用いて実験することはできず、発
症機構を解析することはできない。したがって、原因遺
伝子の同定後の発症過程の解析と新たな治療法の開発の
ためには、モデル個体の作製が必須課題となっている。[0003] However, since information on functions is not sufficient with only the base sequence of the genome, a new analysis system for analyzing functions is required. Furthermore, one of the major goals of human genome analysis is to elucidate the genes responsible for human diseases,
The structure of the causative gene alone cannot explain the disease. In addition, experiments cannot be performed using human patients, and the onset mechanism cannot be analyzed. Therefore, in order to analyze the onset process after identification of the causative gene and to develop a new therapeutic method, it is essential to prepare a model individual.
【０００４】一方、ゲノムを、その構造から遺伝子部分
とそれ以外の部分に分けるとすれば、それぞれ別個の機
能を有すると考えられ、両者の機能を解析することが必
要である(図1)。ゲノム全体から見れば、個々の遺伝子
は一部の機能しか果たしておらず、ゲノムは単に遺伝子
の集合体ではなく、まだ知られていない機能を有してい
るとも考えられる。事実、position effect mutationと
いう新しい概念が成立したことから、ゲノムには機能が
未知の領域を有するものと推察される。[0004] On the other hand, if the genome is divided into a gene part and other parts based on its structure, it is considered that each part has a separate function, and it is necessary to analyze both functions (Fig. 1). From the viewpoint of the whole genome, each gene performs only a part of the function, and it is considered that the genome is not merely a collection of genes but has a function that is not yet known. In fact, the new concept of position effect mutation was established, suggesting that the genome has a region whose function is unknown.
【０００５】遺伝子部分については、調節領域とコード
領域があるが、現在ゲノム機能解析の標的となっている
のは、コード領域である。ヒトとマウスを比べてみて
も、遺伝子の種類はほぼ同じであるため、調節領域の機
能解析は重要である。但し、ヒトの遺伝子とマウスの遺
伝子との間には、種の相違がある。この違いは、タンパ
ク質の違いではなく、遺伝子発現の調節の違いによるも
のと思われる。[0005] The gene part has a regulatory region and a coding region, but the coding region is currently the target of genomic function analysis. Even when humans and mice are compared, the types of genes are almost the same, so that functional analysis of regulatory regions is important. However, there are species differences between human and mouse genes. This difference may be due to differences in regulation of gene expression, not differences in proteins.
【０００６】発現調節にあずかる転写因子等の機能は、
遺伝子のコード領域の配列から解明することができる。
その転写因子が結合するエレメントの解析は、一つの遺
伝子の調節領域内に多数存在するので、機能の解明は現
在のところ極めて困難である。但し、機能解析の一手法
として、細菌人工染色体を用いる方法等が考え得る。[0006] The functions of transcription factors involved in the regulation of expression are as follows:
It can be elucidated from the sequence of the coding region of the gene.
Since the analysis of the element to which the transcription factor binds exists in a large number within the regulatory region of one gene, it is extremely difficult to elucidate the function at present. However, a method using a bacterial artificial chromosome or the like can be considered as one method of functional analysis.
【０００７】コード領域の機能解析のレベル（対象）
は、mRNAレベル、蛋白レベル、細胞レベル、組織・臓器
レベル、個体レベルが考えられる。mRNAレベルは、DNA
チップで対応できると考えられる。他方、mRNA以外のレ
ベルの解析を考えるとき、胚幹細胞（ES細胞）を利用す
るのが最も良い方法と思われる。なぜなら、ES細胞から
直接in vitroで、各種細胞や組織の誘導糸が開発されて
いるものもあるし、今後開発され得る可能性のあるもの
も多いからである。また、個体レベルの解析系が樹立で
きる利点もあるためである。[0007] Level of functional analysis of code area (target)
Can be considered at the mRNA level, protein level, cell level, tissue / organ level, and individual level. mRNA level is DNA
It is thought that it can be dealt with by chips. On the other hand, when considering analysis at a level other than mRNA, the use of embryonic stem cells (ES cells) seems to be the best method. This is because there are those in which inducing fibers of various cells and tissues have been developed directly from ES cells in vitro, and there are many possibilities that can be developed in the future. Another advantage is that an analysis system at the individual level can be established.
【０００８】上記から、ゲノムの機能解析を考える上で
も、ES細胞レベルでの遺伝子破壊とそのマウスの作製は
極めて重要であることがわかる。これまでは、ES細胞を
用いた相同遺伝子組換え法が、遺伝子破壊マウス作製に
おいて主役を演じていたが、これを個々の遺伝子破壊マ
ウスを作製するという戦術としてではなく、網羅的に作
製するという戦略的な立場からみたとき、大きな問題点
がある。[0008] From the above, it is understood that gene disruption at the ES cell level and production of mice are extremely important even in consideration of functional analysis of the genome. Until now, homologous gene recombination using ES cells has played a leading role in the production of gene-disrupted mice, but this is not a tactic to create individual gene-disrupted mice, but rather a comprehensive strategy. From a strategic standpoint, there is a major problem.
【０００９】第1は、時間がかかりすぎることである。
遺伝子破壊マウス作製において、ES細胞を用いた相同組
換えによるノックアウトESクローンを単離することが律
速段階となっている。1人の熟練した研究者でも、ノッ
クアウトESクローンを単離するには最低3ヵ月かかるの
で、年間4遺伝子を破壊できるにすぎない。従って、10
万個の遺伝子にそれぞれ一つの変異を導入する場合は、
1年あたり25,000人が必要とされる。現在世界中で、1年
間に約1000系統の遺伝子破壊マウスが作製されていると
見積もられている。そうすると、ノックアウトESクロー
ンを10万種類作製するのに100年かかることになる。こ
れでは、2003年に終了するといわれているヒトゲノムの
構造解析の進展と比較しても、現実的ではない。First, it takes too much time.
Isolation of a knockout ES clone by homologous recombination using ES cells has become the rate-limiting step in producing a gene-disrupted mouse. Even a single skilled researcher would need at least three months to isolate a knockout ES clone, so he could only destroy four genes per year. Therefore, 10
To introduce one mutation into every 10,000 genes,
25,000 people are needed per year. Currently, it is estimated that about 1000 strains of gene-disrupted mice are produced worldwide every year. Then, it would take 100 years to produce 100,000 knockout ES clones. This is not realistic compared to the progress of structural analysis of the human genome, which is said to be completed in 2003.
【００１０】第2は、コストがかかりすぎることであ
る。1系統の遺伝子破壊マウス作製のため、人件費及び
減価償却費を除いても、最低200〜400万円必要である。
したがって、10万個の単純な遺伝子破壊マウス作製だけ
で2,000〜4,000億円必要となる。以上のように、従来の
ES細胞を用いた相同遺伝子組換えには問題点があり、ま
た、ゲノムは巨大ではあるが、数は決まっている。従っ
て、この中から重要な機能を持つ遺伝子を単離すること
が必要となる。遺伝子の機能については、遺伝子破壊マ
ウスを作製して初めて明らかになることが多いことか
ら、遺伝子破壊マウスは将来画期的な薬剤の開発等にも
直結し、極めて付加価値が高い。従って、「ランダム」
かつ「大規模」にマウスの変異体作製を行なうのが世界
の「戦略」となっており、現在のところ、以下に述べる
3つの方法が、ランダム変異マウス作製において、もっ
とも妥当であると考えられている。Second, it is too costly. A minimum of 2-4 million yen is required for the production of one line of gene-disrupted mice, excluding labor costs and depreciation costs.
Therefore, the production of 100,000 simple gene-disrupted mice requires 200 to 400 billion yen. As described above,
There is a problem with homologous gene recombination using ES cells, and the genome is huge, but the number is fixed. Therefore, it is necessary to isolate genes having important functions from these. Since the function of a gene is often clarified only when a gene-disrupted mouse is prepared, the gene-disrupted mouse is directly linked to the development of a revolutionary drug in the future, and has an extremely high added value. Therefore, "random"
In addition, the production of mouse mutants on a "large scale" has become the "strategy" of the world, and is currently described below.
Three methods are believed to be the most relevant in generating random mutant mice.
【００１１】第１は、変異原物質であるエチルニトロソ
ウレア(ethylnitrosourea:ENU)を用いる方法である。EN
Uを用いた方法による大規模な突然変異体作製のプロジ
ェクトがヨーロッパで開始されている。ドイツではヒト
ゲノムプロジェクトの一貫として哺乳類遺伝学研究所の
パリング博士を中心として1997年度に開始した。英国に
おいてもスミスクライン社が資金を提供し、Harwe11に
あるMRCのマウスゲノムセンターにおいてブラウン博士
を中心として主に脳・神経系の突然変異マウスを樹立す
ることを目的として開始している。現在までに、両者併
せて、優性遺伝を示す変異マウスが約200系統樹立さ
れ、予想よりもよい効率でプロジェクトが進行してい
る。米国においてもケースウエスタンリザーブ大学やオ
ークリッジ国立研究所を中心として、膨大な予算(年間6
0億円)でマウスゲノムの構造解析やENU法による変異体
作製が始まることとなった。The first is a method using ethyl nitrosourea (ENU) which is a mutagen. EN
A large-scale mutant project using the U method has been started in Europe. In Germany, the project was started in 1997 as a part of the Human Genome Project, led by Dr. Paring of the Institute of Mammalian Genetics. In the UK, SmithKline has also provided funding and has begun at the MRC Mouse Genome Center in Harwe11 with the aim of establishing mutant mice, mainly brain and nervous systems, led by Dr. Brown. To date, approximately 200 mutant mice exhibiting dominant inheritance have been established, and the project is proceeding with better than expected efficiency. In the United States, Case Western Reserve University and Oak Ridge National Laboratory have led to huge budgets (6
(Billion yen), the structural analysis of the mouse genome and the creation of mutants by the ENU method have begun.
【００１２】ENUを成熟雄マウスに投与すると、減数分
裂前の精原細胞に作用し、1細胞当たり約50-100カ所に
点突然変異をランダムに引き起こす。そして、1つの遺
伝子座につきおよそ1/1,000/配偶子の頻度で突然変異が
起こる。したがって、1匹の処理マウスを雌マウスと交
配することにより、F1世代で多種類の変異マウスを作製
できる。また、ENUを用いる方法は、特定の遺伝子座に
ついて1,000匹をスクリーニングすれば、1匹はその遺伝
子に変異が生じている確率となるため、極めて効率がよ
いと考えられている。When ENU is administered to adult male mice, it acts on premeiotic spermatogonia and randomly induces point mutations at about 50-100 sites per cell. Mutations occur at a frequency of about 1/1000 / gamete per locus. Therefore, by breeding one treated mouse with a female mouse, various types of mutant mice can be produced in the F1 generation. In addition, the method using ENU is considered to be extremely efficient because if one screens 1,000 animals at a specific locus, one animal has the probability of having a mutation in that gene.
【００１３】第2は、やはり変異原物質であるクロラム
ブシルを用いる方法である。この方法によれば、ENU法
と同じ頻度で精原細胞に突然変異を引き起こす。ただ
し、この場合は時に1メガベースに及ぶ欠失変異が生じ
る。第3は遺伝子トラップ法によるものである。遺伝子
トラップ法とは、マーカー遺伝子を含むトラップベクタ
ーをES細胞に導入し、マーカー遺伝子の発現を指標とし
て未知遺伝子の探索を行なうことを目的として開発され
た方法である。トラップベクターの組み込みはランダム
であり、その組込みにより、殆どの場合内在性遺伝子
（本来、その細胞や組織に存在する遺伝子）は破壊され
る。したがって、そのES細胞を用いてキメラマウスを作
製することにより、種々の遺伝子破壊マウスを作製でき
る。しかしながら、これら変異原物質を用いる方法及び
遺伝子トラップ法は、それぞれ利点と欠点を有する(表
１)。The second is a method using chlorambucil, which is also a mutagen. According to this method, spermatogonia are mutated with the same frequency as the ENU method. However, in this case, deletion mutations sometimes occur up to 1 megabase. The third is by the gene trap method. The gene trap method is a method developed for the purpose of introducing a trap vector containing a marker gene into ES cells, and searching for an unknown gene using the expression of the marker gene as an index. The integration of the trap vector is random and the integration destroys the endogenous gene in most cases (the gene originally present in the cell or tissue). Therefore, various gene-disrupted mice can be produced by producing chimeric mice using the ES cells. However, the methods using these mutagens and the gene trap method have advantages and disadvantages, respectively (Table 1).
【００１４】[0014]
【表１】 [Table 1]
【００１５】ENU法は、変異マウスの作製は容易である
が、個々の変異系統の樹立は、交配により分離を行わな
ければならない。また、変異した遺伝子の同定には、ま
ず多型DNAマーカーを用いた連関解析により遺伝子座を
同定し、その後にポジショナルクローニング法により遺
伝子を単離しなければならない。従って、ENU法は操作
が煩雑である。Although the ENU method makes it easy to produce mutant mice, the establishment of individual mutant lines must be separated by crossing. In addition, in order to identify a mutated gene, the gene locus must first be identified by linkage analysis using a polymorphic DNA marker, and then the gene must be isolated by positional cloning. Therefore, the operation of the ENU method is complicated.
【００１６】クロラムブシル法は、変異マウスの作製は
容易であるが、欠失部位を同定しなければならず、その
ためには多数の多型DNAマーカーを用いて解析する必要
がある。また、一般的に、クロラムブシル法などの変異
原物質法では、大規模の飼育室を必要とするため、費用
及び労力がかかる。Although the chlorambucil method is easy to produce a mutant mouse, it is necessary to identify a deletion site, and it is necessary to analyze using a large number of polymorphic DNA markers. In addition, in general, the mutagen method such as the chlorambucil method requires a large-scale breeding room, and thus is expensive and labor-intensive.
【００１７】遺伝子トラップ法は、変異マウスの作製に
手間と技術を要するが、変異遺伝子の同定は容易であ
り、飼育室の規模に応じて実験可能である。遺伝子トラ
ップESクローンはそれ自体ゲノム機能解析のための貴重
なリソースとなり、この点も他の方法と際立って異なる
点である。[0017] The gene trap method requires time and skill in producing a mutant mouse, but the identification of the mutant gene is easy, and an experiment can be performed according to the scale of the breeding room. The gene trap ES clone itself is a valuable resource for genomic function analysis, which is also a significant difference from other methods.
【００１８】遺伝子トラップ法についても、世界のいく
つかの研究室で変異体作製が始まっている。米国では、
民間のレキシコンジェネティクス社がレトロウイルスベ
クターを用いた遺伝子トラップによるランダム破壊を行
なっている。しかし、遺伝子をトラップできていても、
内在性遺伝子を破壊できているかどうかが定かでないこ
と、生殖キメラマウスが作製できるかどうかが不明であ
ること、キメラマウス作製は別料金を要求されること、
利用するに当たって相当な金額を要求していることなど
から、一般の研究者にとっては殆ど利用できない状況で
ある。また、ドイツではENUプロジェクトの一貫として
も12,000クローンを目標として遺伝子トラップが行なわ
れている。いずれにしても、マウス系統の樹立よりも、
トラップした遺伝子の解析を先行させる方法で進められ
ている。Regarding the gene trap method, mutants have been produced in several laboratories around the world. In the United States,
Lexicon Genetics, a private company, is performing random disruptions by gene traps using retroviral vectors. However, even if the gene could be trapped,
It is unclear whether the endogenous gene can be disrupted, it is unknown whether a reproductive chimeric mouse can be produced, it is required to pay a separate fee for chimeric mouse production,
Since it requires a considerable amount of money to use it, it is hardly available to ordinary researchers. In Germany, gene trapping is being conducted with the goal of 12,000 clones as part of the ENU project. In any case, rather than establishing a mouse strain,
The analysis of trapped genes is being advanced in advance.
【００１９】[0019]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、トラップベ
クターを用いた遺伝子トラップ法によりトラップされた
遺伝子が導入されたノックアウト動物を提供することを
目的とする。An object of the present invention is to provide a knockout animal into which a gene trapped by a gene trap method using a trap vector has been introduced.
【００２０】[0020]
【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題を解
決するために鋭意研究の結果、遺伝子トラップ法にバク
テリオファージ由来の組換えシステムである、Cre-loxP
を利用することを思いつき、本発明を完成するに至った
ものである。ここでCreは組換え酵素であり、1oxP配列
を認識して、この部位で組換えを起こすものである。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, the gene trap method has been applied to a recombinant system derived from bacteriophage, Cre-loxP.
The present inventors have come up with an idea to use the present invention, and have completed the present invention. Here, Cre is a recombination enzyme that recognizes the 1oxP sequence and causes recombination at this site.
【００２１】すなわち、本発明は、以下の通りである。
(1) 逆反復配列１、スペーサー配列及び逆反復配列２の
順で構成される1oxP配列、又は該loxP配列のうち逆反復
配列１及び逆反復配列2の双方若しくはいずれか一方の
一部の配列に変異が導入された変異型1oxP配列を含むト
ラップベクターを導入してなる胚幹細胞又はノックアウ
ト動物であって、配列番号７に示す遺伝子が破壊された
胚幹細胞又はノックアウト動物。That is, the present invention is as follows.
(1) a 1oxP sequence composed of an inverted repeat sequence 1, a spacer sequence and an inverted repeat sequence 2, or a sequence of both or one of the inverted repeat sequence 1 and the inverted repeat sequence 2 of the loxP sequence An embryonic stem cell or a knockout animal obtained by introducing a trap vector containing a mutant type 1oxP sequence into which a mutation has been introduced, wherein the gene shown in SEQ ID NO: 7 has been disrupted.
【００２２】loxP配列としては配列番号３に示されるも
のが挙げられ、変異型1oxP配列としてはlox71（例えば
配列番号１に示されるもの）又はlox66（例えば配列番
号２に示されるもの）が挙げられる。また、トラップベ
クターとしては、以下の(a)〜(j)に示すものから選ばれ
るいずれかのものが挙げられる。The loxP sequence includes the sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the mutant type 1oxP sequence includes lox71 (for example, the sequence shown in SEQ ID NO: 1) or lox66 (for example, the sequence shown in SEQ ID NO: 2) . Examples of the trap vector include any one selected from the following (a) to (j).
【００２３】(a) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (b) lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (c) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro-pA-lox511-PV (d) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (e) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (f) (lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-l
ox511 (g) (lox71が組み込まれたSA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272
-PV-lox511 (h) (lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-lox2272-プロ
モーター-M-lox511-SD (i) loxP-SA-IRES-M-pA-loxP-PV (j) loxP-SA-loxP-IRES-M-pA-loxP-PV (SAはスプライスアクセプターを、SDはスプライスドナ
ーを、IRESは分子内リボゾームエントリー部位を、Mは
マーカー遺伝子を、puroはピューロマイシン耐性遺伝子
を、pAはポリA配列を、PVはプラスミドベクターを表
す。) 上記ノックアウト動物としては、ノックアウトマウスが
挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。(A) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (b) lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (c) SA-lox71-IRES-M-pA- loxP-puro-pA-lox511-PV (d) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (e) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (f) (lox71 is incorporated SA) -M-loxP-pA-lox2272-PV-l
ox511 (g) (SA incorporating lox71) -IRES-M-loxP-pA-lox2272
-PV-lox511 (h) (SA with lox71 incorporated) -M-loxP-pA-lox2272-promoter-M-lox511-SD (i) loxP-SA-IRES-M-pA-loxP-PV (j) loxP-SA-loxP-IRES-M-pA-loxP-PV (SA is a splice acceptor, SD is a splice donor, IRES is an intramolecular ribosome entry site, M is a marker gene, and puro is a puromycin resistance gene. , PA represents a poly A sequence, and PV represents a plasmid vector.) Examples of the knockout animal include a knockout mouse. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
【００２４】[0024]
【発明の実施の形態】１．概要 本発明は、遺伝子トラップ法によりトラップされた遺伝
子が導入された胚幹細胞及びノックアウト動物に関する
ものである。遺伝子トラップ法の概要を図2に示す。ま
ず、本発明の目的を達成するためトラップベクターを構
築し、これを胚幹細胞（ES細胞）に導入してトラップク
ローンを単離及び選択する（図２A〜C）。図２ではpU-8
(pU-Hachiともいう)トラップベクターを例示する。そ
の後、キメラ動物（例えばキメラマウス）を作製してト
ラップクローン由来のマウスを作製する（図２F〜G）。
一方、単離及び選択されたトラップクローンを用いて、
トラップされた遺伝子の単離及び配列決定、並びにプラ
スミドレスキューによるゲノムの回収を行う（図２C〜
E）。さらに、クローンを電気穿光法及びピューロマイ
シン等の薬剤選択を行い、トラップされた遺伝子を発現
させ、ESクローンのマウス系列の作製を行う（図２H〜
I）。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION 1. Outline The present invention relates to embryonic stem cells and knockout animals into which a gene trapped by a gene trap method has been introduced. Fig. 2 shows the outline of the gene trap method. First, to achieve the object of the present invention, a trap vector is constructed, introduced into embryonic stem cells (ES cells), and a trap clone is isolated and selected (FIGS. 2A to 2C). In Figure 2, pU-8
A trap vector (also referred to as pU-Hachi) is exemplified. Thereafter, a chimeric animal (eg, a chimeric mouse) is produced to produce a mouse derived from the trap clone (FIGS. 2F to 2G).
On the other hand, using the isolated and selected trap clones,
Isolate and sequence the trapped genes and recover the genome by plasmid rescue (Figure 2C-
E). Further, the clone is subjected to electroporation and drug selection such as puromycin to express the trapped gene, and a mouse strain of ES clone is prepared (FIG. 2H to FIG. 2H).
I).
【００２５】本発明においてトラップされた遺伝子（Ay
u6003遺伝子という）は、胚様体形成によるスクリーニ
ング法により、発生や細胞増殖に関連する遺伝子を効率
よくトラップしているかどうかを、遺伝子の種類を調べ
ることにより得られたものである。そして、Ayu6003遺
伝子は、配列番号７に示す配列を有することが分かっ
た。このことは、胚様体形成によるスクリーニング系
が、よく機能していることを示している。配列番号７に
示す遺伝子は、大腸菌Ftsj遺伝子のマウスホモログであ
ると考えられ、ゲノムDNAの解析により、この遺伝子は
マウスMTH1遺伝子の上流にMTH1の転写の方向とは逆向き
に存在することが判明した。The gene trapped in the present invention (Ay
The u6003 gene) has been obtained by examining gene types to determine whether or not genes related to development and cell proliferation are efficiently trapped by a screening method based on embryoid body formation. The Ayu6003 gene was found to have the sequence shown in SEQ ID NO: 7. This indicates that the screening system based on embryoid body formation is functioning well. The gene shown in SEQ ID NO: 7 is considered to be a mouse homolog of the Escherichia coli Ftsj gene, and genomic DNA analysis revealed that this gene was present upstream of the mouse MTH1 gene in a direction opposite to the direction of MTH1 transcription. did.
【００２６】本発明において、遺伝子トラップにより実
際に内在性遺伝子が破壊されるかどうかを調べることが
重要なポイントの一つであるので、上記遺伝子につい
て、トラップ部位の構造を解析した。すなわち、プラス
ミドレスキューにより得られた3' フランキングゲノム
断片の配列とAyu6003 cDNA 全長の配列とを比較した結
果、ベクター挿入位置から約1kb下流に、5' RACE 産物
に続く配列が現れた。従って、トラップベクターは Ayu
6003 遺伝子のイントロン内に挿入され、挿入時のゲノ
ムDNAの欠失も大きくないことが確認された。以下、本
発明をさらに詳しく説明する。In the present invention, since it is one of the important points to check whether or not the endogenous gene is actually destroyed by the gene trap, the structure of the trap site was analyzed for the above gene. That is, as a result of comparing the sequence of the 3 ′ flanking genomic fragment obtained by plasmid rescue with the full-length sequence of Ayu6003 cDNA, a sequence following the 5 ′ RACE product appeared about 1 kb downstream from the vector insertion position. Therefore, the trap vector is Ayu
It was inserted into the intron of the 6003 gene, and it was confirmed that the deletion of the genomic DNA at the time of insertion was not large. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
【００２７】２．トラップベクターの構築 遺伝子トラップ法とは、トラップベクターをES細胞に導
入すると、偶然及びランダムにマウス内在性遺伝子に組
込まれることを利用して、未知遺伝子をゲノム上でトラ
ップするというものである。「遺伝子トラップ」とは、
トラップベクターがゲノム上の特定の遺伝子に入り込ん
で、当該特定の遺伝子を捕まえることを意味し、遺伝子
を捕らえるためのベクターを「トラップベクター」とい
う。遺伝子にはエンハンサー、プロモーター、エクソ
ン、ポリAなどが存在し、それぞれを捕獲することがで
きるが、そのためには、目的に応じた構造を持つトラッ
プベクターを使用することができる。2. Construction of trap vector The gene trap method is to trap an unknown gene on the genome by utilizing the fact that when a trap vector is introduced into ES cells, it is accidentally and randomly incorporated into a mouse endogenous gene. "Gene trap"
It means that the trap vector enters a specific gene on the genome and captures the specific gene, and a vector for capturing the gene is called a “trap vector”. Genes include enhancers, promoters, exons, poly-A, etc., which can be captured. For this purpose, a trap vector having a structure suitable for the purpose can be used.
【００２８】一般に、エクソントラップベクターは、ス
プライスアクセプターのみを有するレポーター遺伝子、
薬剤選択マーカー遺伝子、及びプラスミド部分から構成
されており、マウス内在性遺伝子の下流に組み込まれた
ときにのみ、レポーター遺伝子が発現する。換言すれ
ば、トラップベクター中のレポーター遺伝子の発現をモ
ニターすることで、内在性遺伝子への組込みを知ること
ができる。また、pUC19などのプラスミドをトラップベ
クターに連結しておくと、いわゆるプラスミドレスキュ
ー法と呼ばれる手法により、トラップした内在性遺伝子
を単離することができる。「プラスミドレスキュー法」
とは、エレクトロポレーション法等により形質転換され
た細胞をアンピシリン選別等にかけて目的の遺伝子を回
収する方法である（図2E）。しかも、トラップ時にその
遺伝子を破壊するので直ちに遺伝子破壊マウスを作製す
ることができる。さらに、レポーター遺伝子はマウス内
在性遺伝子の発現調節領域に支配されて発現するので、
内在性遺伝子の発現の組織特異性、時期特異性を簡単に
解析することができる。Generally, an exon trap vector is a reporter gene having only a splice acceptor,
It is composed of a drug selection marker gene and a plasmid part, and the reporter gene is expressed only when integrated downstream of the mouse endogenous gene. In other words, by monitoring the expression of the reporter gene in the trap vector, integration into the endogenous gene can be known. When a plasmid such as pUC19 is linked to a trap vector, the trapped endogenous gene can be isolated by a so-called plasmid rescue method. "Plasmid rescue method"
Is a method for recovering a target gene by subjecting cells transformed by electroporation or the like to ampicillin selection or the like (FIG. 2E). Moreover, since the gene is destroyed at the time of trapping, a gene-disrupted mouse can be produced immediately. Furthermore, since the reporter gene is expressed under the control of the expression regulatory region of the mouse endogenous gene,
Tissue specificity and temporal specificity of endogenous gene expression can be easily analyzed.
【００２９】従来の遺伝子トラップ法では、遺伝子を完
全に破壊できても、ヒト遺伝病で見られるような小さな
変異、例えば1アミノ酸置換といった変異を導入するこ
とができず、またヒト遺伝子と置換することもできない
という問題点があった。そこで、本発明は、これらの問
題点を解消するため、バクテリオファージ由来の組換え
システムである、Cre-loxPを改変し、それを遺伝子トラ
ップ法に利用することにより、一旦遺伝子トラップベク
ターを組み込ませてマウス遺伝子を破壊した後、トラッ
プベクター内の変異lox部位に、任意の遺伝子を挿入で
きることとしたものである。これによって、ヒト遺伝病
で見られるような小さな変異、例えば1アミノ酸置換と
いった変異を導入することが可能となり、またヒト遺伝
子と置換することも可能となる。本発明のトラップベク
ターは、種々の遺伝子をトラップするために使用するこ
とができるが、エクソントラップ又はプロモータートラ
ップ用として好ましく使用することができる。In the conventional gene trap method, even if the gene can be completely destroyed, small mutations such as those found in human genetic diseases, for example, mutations such as one amino acid substitution cannot be introduced, and the gene is replaced with a human gene. There was a problem that it could not be done. In order to solve these problems, the present invention modifies Cre-loxP, a bacteriophage-derived recombination system, and uses it in a gene trapping method to temporarily incorporate a gene trap vector. After the mouse gene has been disrupted, an arbitrary gene can be inserted into the mutant lox site in the trap vector. This makes it possible to introduce small mutations such as those found in human genetic diseases, for example, mutations such as single amino acid substitutions, and to replace human genes. The trap vector of the present invention can be used for trapping various genes, but is preferably used for exon trap or promoter trap.
【００３０】1oxP（locus of crossing (X-ring) over,
P1）は34塩基(5'-ataacttcgtata gcatacat tatacgaagt
tat-3')からなる配列であり（配列番号３）、5'末端か
ら13塩基(逆反復配列１という)、及び3'末端から13塩基
の配列(逆反復配列２という)が、それぞれ逆反復配列を
構成し、「gcatacat」により示される8塩基のスペーサ
ーと呼ばれる配列が上記逆反復配列１及び２に挟まれて
いる（図３）。「逆反復配列」とは、スペーサーを境界
として一方の側の配列が、他方の側の配列と、互いに向
き合う方向に相補的であるような配列を意味する。換言
すれば、一方の側の配列のうちセンス鎖の配列が、他方
の側の配列のアンチセンス鎖と、互いに向き合う方向に
相同であることを意味する。方向が互いに向き合ってお
り、二本鎖を形成したときの配列自体は同一で繰り返さ
れているため、逆反復配列と呼ばれる。図３に示す通
り、二本鎖のうち一方の鎖（例えばセンス鎖）におい
て、紙面左側の逆反復配列１（5'-ataacttcgtata-3'：
配列番号４）の5'→3'方向の配列が、紙面右側の逆反復
配列２（5'-tatacgaagttat-3'：配列番号５）の5'←3'
方向の配列に対し、相補的という関係になっている。1oxP (locus of crossing (X-ring) over,
P1) is 34 bases (5'-ataacttcgtata gcatacat tatacgaagt
tat-3 ′) (SEQ ID NO: 3), a sequence consisting of 13 bases from the 5 ′ end (referred to as inverted repeat sequence 1) and 13 bases from the 3 ′ end (referred to as inverted repeat sequence 2), respectively. A sequence called a spacer consisting of 8 bases, which constitutes a repetitive sequence and is indicated by "gcatacat", is sandwiched between the above-mentioned inverted repeat sequences 1 and 2 (FIG. 3). The term “inverted repeat sequence” means a sequence in which a sequence on one side is complementary to a sequence on the other side in a direction facing each other with a spacer as a boundary. In other words, it means that the sequence of the sense strand of the sequence on one side is homologous to the antisense strand of the sequence on the other side in the direction facing each other. Since the directions are opposite to each other and the sequence itself when forming a double strand is identical and repeated, it is called an inverted repeat sequence. As shown in FIG. 3, in one of the two strands (for example, the sense strand), the inverted repeat sequence 1 (5'-ataacttcgtata-3 ':
The sequence in the 5 ′ → 3 ′ direction of SEQ ID NO: 4) is the 5 ′ ← 3 ′ of the inverted repeat sequence 2 (5′-tatacgaagttat-3 ′: SEQ ID NO: 5) on the right side of the page.
It is complementary to the sequence in the direction.
【００３１】1oxPは、通常の配列と異なり方向性を有す
る。従って、本発明において、上記5'→3'の向きで1oxP
の配列を表示するときは、その表示中に紙面左向きの矢
印（例えば図３の矢印１）を含めることとする。Cre（c
auses recombination）とは、遺伝子組換えを起こさせ
る組換え酵素（リコンビナーゼともいう）を意味し、上
記反復配列を認識し、スペーサー部の「cataca」を粘着
末端とする切断様式で切断する(図3)。1oxP has a directionality different from a normal sequence. Therefore, in the present invention, 1oxP in the 5 ′ → 3 ′ orientation
Is displayed, an arrow pointing left (for example, arrow 1 in FIG. 3) is included in the display. Cre (c
“Auses recombination” refers to a recombinase (also referred to as a recombinase) that causes gene recombination, recognizes the above-mentioned repetitive sequence, and cleaves it in a cleavage mode with “cataca” in the spacer portion as a sticky end (FIG. 3). ).
【００３２】ところで、バクテリアの中では、2カ所の1
oxP間で組換えが起こり、挿入または削除反応が起こ
る。哺乳類細胞で挿入反応を起こすことができれば、後
に任意の遺伝子を挿入できるので、応用性は格段に広が
る。哺乳類細胞では核が大きいため、一旦削除されたlo
xPを持つ環状DNAは拡散してしまい、挿入反応は殆ど観
察されない。By the way, among bacteria, one of two places
Recombination occurs between oxPs, causing insertion or deletion reactions. If the insertion reaction can be induced in mammalian cells, any gene can be inserted later, and the applicability is greatly expanded. Since mammalian cells have large nuclei, lo
The circular DNA having xP is diffused, and almost no insertion reaction is observed.
【００３３】そこで、本発明者は、挿入反応を起こすた
めに1oxP配列に変異を導入し、一旦遺伝子がゲノムに挿
入されると挿入された遺伝子は削除できない（ゲノムか
ら脱離しない）ようにすることを考え、このため2種類
の変異型1oxPを準備した（図４）。Therefore, the present inventor introduces a mutation into the 1oxP sequence to cause an insertion reaction so that once the gene is inserted into the genome, the inserted gene cannot be deleted (is not removed from the genome). For this reason, two types of mutant 1oxP were prepared for this purpose (FIG. 4).
【００３４】１つは、loxPの反復配列（センス鎖側）の
うち紙面左側の反復配列（ATAACTTCGTATA）の左から5塩
基までを、「TACCGTTCGTATA」となるように置換変異(下
線部が変異させた部分。)を導入したものであり、これ
を「lox71」と名付けた（配列番号１；図4b）。もう１
つは、loxPの紙面右側の反復配列（TATACGAAGTTAT）
を、右から5塩基まで「TATACGAACGGTA」(下線部が変異
させた部分。)となるように置換変異を導入したもの
で、これを「1ox66」と名付けた（配列番号２；図4
b）。One is a substitution mutation (the underlined portion is mutated in the underlined portion) of the loxP repetitive sequence (sense strand side) up to 5 bases from the left of the repetitive sequence (ATAACTTCGTATA) on the left side of the paper to become " TACCG TTCGTATA". This was named "lox71" (SEQ ID NO: 1; FIG. 4b). Another one
One is the repetitive sequence on the right side of the loxP paper (TATACGAAGTTAT)
Was replaced with a substitution mutation so as to be "TATACGAA CGGTA " (the underlined portion was mutated) from the right to 5 bases, and was named "1ox66" (SEQ ID NO: 2; FIG. 4).
b).
【００３５】ゲノム上の1ox71とプラスミド上のlox66と
の間で組換えが起こると、挿入されたDNAの5'側（紙面
左側）にはloxPの両側の反復配列が変異したもの（「1o
x71/66」という：TACCGTTCGTATA GCATACAT TATACGAACGG
TA：配列番号６）が、右側には野生型の1oxP(ATAACTTCG
TATA GCATACAT TATACGAAGTTAT：配列番号３)が配置され
る（図4a）。その結果、Creはもはや1ox71/66を見分け
ることができず、loxPとの間で組換えを起こせず、ゲノ
ムに遺伝子は挿入されたままとなる。すなわち、loxP同
士の相同組換えの場合は、切り出されたloxPを含む環状
DNAが物理的に離れるので、挿入よりも削除に反応は傾
く。一方、染色体側にlox71を、及び環状DNA側にlox66
を用いると、組み込まれたときに生ずるlox71/66をCre
リコンビナーゼは認識できにくくなり、削除反応より挿
入反応に傾くため、挿入状態が維持される（図５）。こ
こで、本発明においては、染色体側にlox66を、環状DNA
側にlox71を用いることもできる。When recombination occurs between 1ox71 on the genome and lox66 on the plasmid, the inserted DNA is mutated on the 5 'side (left side of the paper) of the repetitive sequence on both sides of loxP ("1o
x71 / 66 ": TACCG TTCGTATA GCATACAT TATACGAA CGG
TA : SEQ ID NO: 6), and on the right, wild-type 1oxP ( ATAAC TTCG
TATA GCATACAT TATACGAA GTTAT : SEQ ID NO: 3) is located (FIG. 4a). As a result, Cre can no longer distinguish 1ox71 / 66, does not recombine with loxP, and the gene remains inserted into the genome. That is, in the case of homologous recombination between loxPs, the circular
Since the DNA is physically separated, the reaction is more inclined to deletion than insertion. On the other hand, lox71 on the chromosome side and lox66 on the circular DNA side
If you use lox71 / 66, the
The recombinase becomes difficult to recognize and tends to insert rather than delete, so that the inserted state is maintained (FIG. 5). Here, in the present invention, lox66 on the chromosome side, circular DNA
Lox71 can also be used on the side.
【００３６】実際に、ES細胞にあらかじめ1ox71などの
変異型loxP（以下「変異型lox」ともいう）を組込んで
おき、そこに他の変異型loxP （例えばlox66）を含むプ
ラスミドを導入すると、プラスミドがゲノムに組込まれ
る。したがって、例えばこのlox71をあらかじめ遺伝子
トラップベクターに組込んでおけば、あとでいかなる遺
伝子でも1ox66を用いて挿入することが可能となる。つ
まり、小さな変異を導入した遺伝子やヒトの遺伝子で置
換することも可能となった。Actually, a mutant loxP such as 1ox71 (hereinafter also referred to as “mutant lox”) is previously incorporated into ES cells, and a plasmid containing another mutant loxP (eg, lox66) is introduced therein. The plasmid is integrated into the genome. Therefore, for example, if this lox71 is previously incorporated into a gene trap vector, any gene can be inserted later using 1ox66. That is, it has become possible to substitute a gene into which a small mutation has been introduced or a human gene.
【００３７】この変異型lox(1ox71又はlpx66)を利用し
た遺伝子トラップベクターは、以下の通り構築すること
ができる(図６A)。但し、以下のトラップベクターは例
示であって、限定されるものではない。従って、以下の
ベクターにおいて、変異型loxとしてlox71を例示する
が、これに限定されるものではなく、lox71の代わりにl
ox66を用いたものも、本発明のトラップベクターに含ま
れる。また、変異型loxPとはせずに、通常のloxPを用い
たトラップベクターを構築することもできる(図６B)。A gene trap vector using this mutant lox (1ox71 or lpx66) can be constructed as follows (FIG. 6A). However, the following trap vectors are illustrative and not limited. Accordingly, in the following vectors, lox71 is exemplified as a mutant lox, but is not limited thereto.
Those using ox66 are also included in the trap vector of the present invention. In addition, a trap vector using ordinary loxP can be constructed without using the mutant loxP (FIG. 6B).
【００３８】(a) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (b) lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (c) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro-pA-lox511-PV (d) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (e) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (f) (lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-l
ox511 (g) (lox71が組み込まれたSA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272
-PV-lox511 (h) (lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-lox2272-プロ
モーター-M-lox511-SD (i) loxP-SA-IRES-M-pA-loxP-PV (j) loxP-SA-loxP-IRES-M-pA-loxP-PV(A) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (b) lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (c) SA-lox71-IRES-M-pA- loxP-puro-pA-lox511-PV (d) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (e) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (f) (lox71 is incorporated SA) -M-loxP-pA-lox2272-PV-l
ox511 (g) (SA incorporating lox71) -IRES-M-loxP-pA-lox2272
-PV-lox511 (h) (SA with lox71 incorporated) -M-loxP-pA-lox2272-promoter-M-lox511-SD (i) loxP-SA-IRES-M-pA-loxP-PV (j) loxP-SA-loxP-IRES-M-pA-loxP-PV
【００３９】上記ベクターの構成要素において、SAはス
プライスアクセプターを、SDはスプライスドナーを、IR
ESは分子内リボゾームエントリー部位を、Mはマーカー
遺伝子を、puroはピューロマイシン(puromycin)耐性遺
伝子を、pAはポリA配列を、PVはプラスミドベクターを
表す。In the above vector components, SA is a splice acceptor, SD is a splice donor, and IR is a splice donor.
ES indicates an intramolecular ribosome entry site, M indicates a marker gene, puro indicates a puromycin resistance gene, pA indicates a poly A sequence, and PV indicates a plasmid vector.
【００４０】ところで、トラップベクターがゲノムDNA
に組み込まれる際に、ほとんどのケースでベクターの一
部が欠失し、その結果、ベクターの重要な部分が欠失す
る場合がある。本発明では、そのような欠失を防ぐため
のダミーとして任意配列を付加することが好ましい。こ
のような任意配列をSP配列という。SP配列は、上記ベク
ターの先頭部、最後尾部又はそれらの両方に付加するこ
とができる。図６Aにおいて、pU-8及びpU-12にはSP配列
（「Sp」と表示）を最後尾に付加した態様を示し、図６
Bにおいて、pU-San及びpU-Rokには先頭部及び最後尾の
両方に付加した態様を示した。また、SP配列自体は自由
に決定することができる。SP配列の長さは100〜1000塩
基、好ましくは300〜400塩基である。また、公知の任意
配列をSPに使用することができる。公知配列としては、
例えばウサギβ-グロビン遺伝子の一部等が挙げられ
る。Incidentally, the trap vector is genomic DNA
In most cases, a portion of the vector will be deleted when it is integrated into the DNA, resulting in the deletion of a significant portion of the vector. In the present invention, it is preferable to add an arbitrary sequence as a dummy for preventing such deletion. Such an arbitrary array is called an SP array. The SP sequence can be added to the head, the tail, or both of the vector. FIG. 6A shows an embodiment in which an SP sequence (indicated as “Sp”) is added to the end of pU-8 and pU-12.
In B, pU-San and pU-Rok show an embodiment in which they are added to both the head and the tail. In addition, the SP sequence itself can be freely determined. The length of the SP sequence is 100 to 1000 bases, preferably 300 to 400 bases. In addition, any known sequence can be used for SP. As a known sequence,
For example, a part of the rabbit β-globin gene and the like can be mentioned.
【００４１】スプライスアクセプターは、スプライシン
グの際にエキソンの3'末端側に連結することができる配
列を意味する。スプライスドナーは、スプライシングの
際にエキソンの5'末端側に連結することができる配列を
意味する。A splice acceptor refers to a sequence that can be ligated to the 3 'end of an exon during splicing. A splice donor refers to a sequence that can be ligated to the 5 'end of an exon during splicing.
【００４２】IRESは、分子内リボゾームエントリー部位
（internal ribosomal entry site）と呼ばれ、タンパ
ク質合成の際にアミノアシルt-RNAが結合するリボゾー
ム上の部位（A部位）であり、CAP非依存的に翻訳を開始
できるようにするための配列である。IRES is a site on the ribosome (A site) to which aminoacyl-t-RNA binds during protein synthesis, which is called an internal ribosome entry site (internal ribosomal entry site). Is an array that allows you to start
【００４３】マーカー遺伝子は、本発明のベクターが標
的遺伝子をトラップできたか否かを示すマーカーとなる
遺伝子であり、大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝
子（lacZ遺伝子）、又はlacZ遺伝子とネオマイシン（G4
18）耐性遺伝子との融合遺伝子（β-geo遺伝子）、CAT
遺伝子、GFP遺伝子、SV40ラージT遺伝子、ネオマイシン
耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマ
イシン耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子等が
挙げられる。The marker gene is a marker gene indicating whether or not the vector of the present invention can trap the target gene, and is a β-galactosidase gene (lacZ gene) derived from Escherichia coli, or a lacZ gene and neomycin (G4
18) Fusion gene with resistance gene (β-geo gene), CAT
Gene, GFP gene, SV40 large T gene, neomycin resistance gene, puromycin resistance gene, hygromycin resistance gene, blasticidin S resistance gene and the like.
【００４４】プラスミドベクターは、遺伝子トラップ後
に内在性遺伝子をプラスミドレスキュー法により単離す
るために使用されるものである。従って、トラップベク
ター内のプラスミド（大腸菌で増やせるもの）の一部を
利用して当該プラスミド部分の近接領域を回収すること
ができる。例えば、プラスミドにゲノムDNAが連結され
た場合において、制限酵素処理によりプラスミドとゲノ
ムDNAとが連結した断片を切り出し、切り出した断片を
環状にした後、大腸菌に導入して増殖させると、プラス
ミドに近接したゲノムDNAを回収することができる。プ
ラスミドベクターとしては、例えばpBR322、pUC(pUC1
8、pUC19、pUC118、pUC119等)、pSP(pSP64, pSP65等)、
pGEM（pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z等）等が挙げられる。
なお、プラスミドベクターには、supF、アンピシリン耐
性遺伝子、複製開始点、及びクローニングのための制限
酵素部位（例えばマルチクローニング部位）を単独で又
は適宜組み合わせて連結しておくことができる。The plasmid vector is used for isolating an endogenous gene by a plasmid rescue method after gene trapping. Therefore, a part of the plasmid (which can be expanded in Escherichia coli) in the trap vector can be used to recover a region adjacent to the plasmid. For example, when a genomic DNA is ligated to a plasmid, a fragment in which the plasmid and the genomic DNA are ligated is cut out by restriction enzyme treatment, the cut out fragment is circularized, and then introduced into Escherichia coli to proliferate. The recovered genomic DNA can be recovered. As plasmid vectors, for example, pBR322, pUC (pUC1
8, pUC19, pUC118, pUC119, etc.), pSP (pSP64, pSP65, etc.),
pGEM (pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, etc.) and the like.
In addition, the supF, the ampicillin resistance gene, the replication origin, and a restriction enzyme site for cloning (for example, a multiple cloning site) can be linked to the plasmid vector alone or in an appropriate combination.
【００４５】上記(a)に示すベクターをpU-8という。pU-
8の基本部分（SA-IRES-β-geo-pA：図7)は、pGT1.8IRES
betageoに由来している。このpGT1.8IRESbetageoは、マ
ウスEn-2遺伝子由来のスプライスアクセプター、脳心筋
炎ウイルス由来のIRES、β-geoを含んでいる。このpGT
1.8IRESbetageoのBglII部位に1ox71を組み込んだ後、Sa
lIで処理し、SalI断片を用意しておく。一方、pUC19な
どのベクターに180塩基対のSP配列、1oxP、及びマウス
ホスホグリセレートキナーゼ-1（PGK）由来のpoly A付
加シグナルを、ベクターのLacZ配列が除去された改変型
ベクターに挿入することによりプラスミドpEBN-SE7tiを
作製する。このプラスミドの制限酵素SalI部位にSA-IRE
S-lox71-β-geoのSalI断片を挿入することにより、pU-8
を作製する。したがって、この構造は、5'側から順に任
意配列、スプライスアクセプター、1ox71、IRES、β-ge
o、pA、loxP、pA、pUC19、任意配列である（図７）。The vector shown in the above (a) is called pU-8. pU-
The basic part of 8 (SA-IRES-β-geo-pA: Fig. 7) is pGT1.8IRES
Derived from betageo. This pGT1.8IRESbetageo contains a splice acceptor derived from the mouse En-2 gene, an IRES derived from encephalomyocarditis virus, and β-geo. This pGT
1.8 After incorporating 1ox71 into the BglII site of IRESbetageo,
Treat with lI and prepare a SalI fragment. On the other hand, a 180 base pair SP sequence, 1oxP, and a polyA addition signal derived from mouse phosphoglycerate kinase-1 (PGK) are inserted into a vector such as pUC19 into a modified vector from which the LacZ sequence of the vector has been removed. To produce plasmid pEBN-SE7ti. SA-IRE is inserted into the SalI site of this plasmid.
By inserting the SalI fragment of S-lox71-β-geo, pU-8
Is prepared. Therefore, this structure has an arbitrary sequence, a splice acceptor, 1ox71, IRES, β-ge
o, pA, loxP, pA, pUC19, any sequence (FIG. 7).
【００４６】上記(b)に示すベクターをpU8deltaとい
う。pU8deltaは、pU-8のスプライスアクセプターを削除
したベクターである。このベクターは、lox71がレポー
ターであるβ-geoの前に、1oxPがβ-geoの後ろに接続さ
れた構成となっている。このような構成としたのは、ベ
クターが組込まれたのちに、Creを一過性に発現させる
ことで、中間のIRESとβ-geo部分を完全に除去できるか
らである。その結果、プラスミドpUC19が上流に存在す
るマウス内在性遺伝子の近傍に位置することになり、マ
ウス内在性遺伝子を容易に単離することができる。The vector shown in the above (b) is called pU8delta. pU8delta is a vector from which the splice acceptor of pU-8 has been deleted. In this vector, lox71 is connected before reporter β-geo, and 1oxP is connected after β-geo. The reason for such a configuration is that the intermediate IRES and β-geo can be completely removed by transiently expressing Cre after the vector has been integrated. As a result, the plasmid pUC19 is located near the mouse endogenous gene located upstream, and the mouse endogenous gene can be easily isolated.
【００４７】上記(c) に示すベクターを「pU-12」とい
う。このベクターは、SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro-p
A-lox511-PVで構成されている。pU12トラップベクター
を構築するために、まずpE3NSE7のPGK poly(A)シグナル
をピューロマイシン耐性遺伝子＋PGK poly(A)シグナル
に置き換え、さらにその下流のBglII部位にlox511を挿
入する。得られるプラスミドの制限酵素部位にpU-Hachi
からのSA-IRES-lox71-β-geoのSalI断片を挿入すること
により、pU-12を得ることができる。The vector shown in (c) above is called "pU-12". This vector is SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro-p
It consists of A-lox511-PV. In order to construct a pU12 trap vector, first, the PGK poly (A) signal of pE3NSE7 is replaced with a puromycin resistance gene + PGK poly (A) signal, and lox511 is inserted into a BglII site downstream thereof. PU-Hachi at the restriction site of the resulting plasmid
PU-12 can be obtained by inserting the SalI fragment of SA-IRES-lox71-β-geo from E. coli.
【００４８】上記(d) に示すベクターを「pU-15」とい
う。このベクターは、lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox
511で構成されている。ここで、「lox2272」は、loxPの
スペーサー領域（gcatacat）のうち、第２番目のcをg
に、第７番目のaをtに置換した配列（ggatactt）を有す
るものをいう。また、「lox511」は、loxPのスペーサー
領域（gcatacat）のうち、第２番目のcをtに置換した配
列（gtatacat）を有するものをいう。lox511及びlox227
2は、loxP配列のスペーサー部分に変異があるため、そ
れ自身（lox511同士、lox2272同士）とは組換えを起こ
すが、loxPやlox71とは組換えを起こさない変異lox配列
である。なお、lox2272及びlox511の配列順序はどちら
を前方又は後方にしてもよく、任意に選択することがで
きる（以下同様）。The vector shown in (d) above is called "pU-15". This vector is lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox
511. Here, “lox2272” is the second c in the spacer region (gcatacat) of loxP.
And a sequence (ggatactt) in which the 7th a is replaced with t. “Lox511” refers to a spacer region (gcatacat) having a sequence (gtatacat) in which the second c is replaced with t in the spacer region (gcatacat). lox511 and lox227
2 is a mutated lox sequence that causes recombination with itself (between lox511 and lox2272) but has no recombination with loxP or lox71 because the spacer portion of the loxP sequence has a mutation. The order of arrangement of lox2272 and lox511 may be either forward or backward, and can be arbitrarily selected (the same applies hereinafter).
【００４９】上記(e) に示すベクターを「pU-16」とい
う。このベクターは、lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-P
V-lox511で構成されており、pU-15のlox71とマーカー
（β-geo）との間にIRESを挿入することにより作製する
ことができる。上記(f) に示すベクターを「pU-17」と
いう。このベクターにおいて、1ox71はSAの一部の領域
に挿入されている。例えば、pSPプラスミドに、lox51
1、loxP、PGK poly(A)シグナル、lox2272を挿入してプ
ラスミドを構築し、次に、pU-8のSA内にlox71配列を挿
入し、続いてβ-geoをこの順に挿入する。このプラスミ
ドを、先に構築しておいたプラスミドと連結することに
より、pU-17を得ることができる。The vector shown in the above (e) is called "pU-16". This vector contains lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-P
It is composed of V-lox511 and can be produced by inserting an IRES between lox71 of pU-15 and a marker (β-geo). The vector shown in (f) above is called "pU-17". In this vector, 1ox71 is inserted into a partial region of SA. For example, in the pSP plasmid, lox51
1. A plasmid is constructed by inserting loxP, PGK poly (A) signal, and lox2272, and then the lox71 sequence is inserted into SA of pU-8, followed by β-geo in this order. By ligating this plasmid with the previously constructed plasmid, pU-17 can be obtained.
【００５０】上記(g)に示すベクターを「pU-18」とい
う。このベクターも、pU-17と同様、SAの中にlox71が挿
入されている。pU-18は、pU-17のSAとβ-geoとの間にIR
ESを挿入することにより得ることができる。上記(h)に
示すベクターは、(lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-
lox2272-プロモーター-M-lox511-SDで構成される。この
ベクターは、pU-17内のPVの代わりに プロモーター及び
Mをこの順で挿入し、lox511の後方にSDを連結すること
により得ることができる。このベクターには、プロモー
ターが付加されている。プロモーターとしては、特に限
定されるものではなく、任意のものを使用することがで
きる。例えば、後述の形質転換体作製の項に記載の細菌
由来プロモーター、酵母由来プロモーターなどのほか、
SP6 RNAポリメラーゼプロモーター、T7RNAポリメラーゼ
プロモーター、T3RNAポリメラーゼプロモーターなどのR
NAポリメラーゼプロモーター、あるいは、EF1（伸長因
子１）プロモーター、PGK(グリセロリン酸キナーゼ)プ
ロモーター、MC1(ポリオーマエンハンサー/単純ヘルペ
スウイルスチミジンキナーゼ)プロモーターなどの哺乳
動物由来プロモーターを例示することができる。The vector shown in the above (g) is referred to as "pU-18". This vector also has lox71 inserted in SA, as in pU-17. pU-18 has an IR between pU-17 SA and β-geo
It can be obtained by inserting ES. The vector shown in the above (h) is (SA incorporating lox71) -M-loxP-pA-
It consists of lox2272-promoter-M-lox511-SD. This vector contains a promoter and a promoter instead of PV in pU-17.
M can be obtained by inserting M in this order and connecting SD behind lox511. A promoter is added to this vector. The promoter is not particularly limited, and any promoter can be used. For example, in addition to the bacterial-derived promoter and yeast-derived promoter described in the section on preparing a transformant described below,
R such as SP6 RNA polymerase promoter, T7 RNA polymerase promoter, T3 RNA polymerase promoter
Examples of the promoter include an NA polymerase promoter, and a mammalian-derived promoter such as an EF1 (elongation factor 1) promoter, a PGK (glycerophosphate kinase) promoter, and an MC1 (polyoma enhancer / herpes simplex virus thymidine kinase) promoter.
【００５１】上記(i)に示すベクターを「pU-San」とい
い、上記(j)に示すベクターを「pU-Rok」という。pU-Sa
nは、pU-8に使用されているlox71がloxPとなっているこ
とを除き、その構成はpU-8と同じである。換言すれば、
pU-SanのloxPをlox71で置換すると、pU-8となる。pU-Ro
kは、pU-SanのSAとIRESとの間にloxPを挿入することに
より得ることができる。The vector shown in (i) above is called “pU-San”, and the vector shown in (j) is called “pU-Rok”. pU-Sa
n has the same configuration as pU-8, except that lox71 used in pU-8 is loxP. In other words,
Substituting lox71 for loxP in pU-San yields pU-8. pU-Ro
k can be obtained by inserting loxP between SA and IRES of pU-San.
【００５２】３．遺伝子トラップ 前記の通り作製されたベクターを用い、2段階の遺伝子
トラップを行う。3. Gene trap Using the vector prepared as described above, a two-step gene trap is performed.
【００５３】第1段階は通常の遺伝子トラップ法であ
る。「通常の遺伝子トラップ」とは、ES細胞に前記トラ
ップベクターを導入し、ES細胞内に本来的に存在する内
在性遺伝子をトラップすることを意味する。これによ
り、ES細胞中の内在性遺伝子は破壊される。なお、この
ES細胞を用いて、後述の遺伝子破壊動物（例えばノック
アウトマウス）を作製することができる。そして、トラ
ップされた内在性遺伝子（図８、遺伝子X）を単離した
後に、大腸菌の中で部位特異的変異導入法等の方法でこ
の遺伝子に微細な変異を導入し（図８、遺伝子X'）、こ
れをプラスミド上で1ox66の下流につなぎ、第２段階の
遺伝子トラップを行う（図８）。なお、遺伝子Xに変異
を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知
の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。
例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用
キット（例えばMutan-K又はMutan-G(宝酒造）)などを用
いて、あるいは、LA PCR in vitro Mutagenesis シリー
ズキット（宝酒造）を用いて変異の導入が行われる。The first step is a general gene trap method. The “ordinary gene trap” means that the trap vector is introduced into an ES cell to trap an endogenous gene originally present in the ES cell. Thereby, the endogenous gene in the ES cell is destroyed. Note that this
Using ES cells, a gene-disrupted animal (for example, a knockout mouse) described below can be prepared. After isolating the trapped endogenous gene (FIG. 8, gene X), a minute mutation was introduced into this gene by a method such as site-directed mutagenesis in E. coli (FIG. 8, gene X). '), This is connected to the downstream of 1ox66 on the plasmid, and the second-stage gene trap is performed (FIG. 8). In order to introduce a mutation into the gene X, a known method such as the Kunkel method and the Gapped duplex method or a method similar thereto can be adopted.
For example, using a mutagenesis kit using site-directed mutagenesis (for example, Mutan-K or Mutan-G (Takara Shuzo)), or using the LA PCR in vitro Mutagenesis series kit (Takara Shuzo), An introduction is made.
【００５４】第２段階の遺伝子トラップは、1ox66の下
流に連結された内在性遺伝子の変異型（遺伝子X'）をES
細胞に導入することを意味する。これにより、第１段階
で導入されたトラップベクターの1ox71部位が、第２段
階で導入したベクターのlox66との間で組換えを起こ
し、「（lox71/66)-(遺伝子X')-(loxP)」で構成される
カセットを含む改変した遺伝子を導入できる(図８)。こ
の方法によれば、改変した内在性遺伝子のみならず、ヒ
ト遺伝子で置換することも可能であり、あらゆる遺伝子
を導入することができる。これを本発明において可変型
遺伝子トラップ法と名付ける。The second step of the gene trap is to convert the mutant form of the endogenous gene (gene X ′) linked downstream of 1ox66 into ES.
It means to be introduced into cells. As a result, the lox71 site of the trap vector introduced in the first step recombines with lox66 of the vector introduced in the second step, and “(lox71 / 66)-(gene X ′)-(loxP )) Can be introduced (FIG. 8). According to this method, not only a modified endogenous gene but also a human gene can be substituted, and any gene can be introduced. This is referred to as a variable gene trap method in the present invention.
【００５５】４．トラップベクターが組み込まれたクロ
ーン（ES細胞）のスクリーニング 遺伝子トラップベクターをES細胞に導入しネオ耐性クロ
ーンを選別すれば、これらはマウス内在性遺伝子の下流
にトラップベクターが組み込まれているクローンである
とみなされる。これらのクローンからDNAを抽出し、サ
ザンブロット法等により解析し、トラップベクターが1
コピーのみ組み込まれているクローンを選択する。この
選択方法を用いることにより、効率良くマウス遺伝子を
トラップしているクローンを選択できることがわかった
ので、これをスクリーニング系として用いる。4. Screening of clones (ES cells) incorporating trap vectors If a gene trap vector is introduced into ES cells and neo-resistant clones are selected, these are clones with trap vectors integrated downstream of the mouse endogenous gene. It is regarded. DNA was extracted from these clones and analyzed by Southern blotting or the like.
Select a clone that contains only the copy. By using this selection method, it was found that a clone trapping a mouse gene could be selected efficiently, and this was used as a screening system.
【００５６】(1)ネオ耐性クローンの単離 本発明において、トラップベクターをES細胞に導入する
には、エレクトロポレーション法、マイクロインジェク
ション法等が採用される。例えば、トラップベクター10
0μgを電気穿孔法(バイオラッドGenePulserを用い、800
V, 3μFの条件下)にて0.8m1のリン酸緩衝液中に浮遊さ
せた3000万個のTT2 ES細胞に導入し、200μg/m1の濃度
のG418存在下で培養する。1週間後に、ネオ耐性クロー
ンを単離する。(1) Isolation of Neo-Resistant Clones In the present invention, in order to introduce a trap vector into ES cells, an electroporation method, a microinjection method, or the like is employed. For example, trap vector 10
0 μg was electroporated (using Bio-Rad GenePulser, 800
V, 3 μF) into 30 million TT2 ES cells suspended in 0.8 ml phosphate buffer, and cultured in the presence of G418 at a concentration of 200 μg / m1. One week later, the neo-resistant clone is isolated.
【００５７】遺伝子トラップベクターはES細胞のゲノム
上にランダムに組み込まれる。したがって、単にトラッ
プベクターをES細胞に導入しただけでは、必ずしも遺伝
子の中に組み込まれるわけではなく、遺伝子とは関係の
ない場所にも組み込まれる。しかし、トラップベクター
内には薬剤耐性遺伝子であるネオ耐性遺伝子がまれてい
るので、それが発現している細胞は、ネオマイシン(G41
8ともいう)耐性となる。逆に言えば、ネオマイシン存在
下で生存する細胞は、ネオ耐性遺伝子を発現しているこ
とになる。トラップベクター内のネオ耐性遺伝子は、ES
細胞で発現しているマウスの遺伝子の下流に組み込まれ
ないと発現しない。したがって、発現するということ
は、ある遺伝子の下流に組み込まれたことを意味する。The gene trap vector is randomly integrated into the ES cell genome. Therefore, simply introducing a trap vector into an ES cell does not necessarily mean that the trap vector will be incorporated into the gene, but will also be incorporated into a location unrelated to the gene. However, since the neo-resistance gene, which is a drug-resistance gene, is contained in the trap vector, cells expressing it are neomycin (G41
8). Conversely, cells that survive in the presence of neomycin will express the neo resistance gene. The neo-resistance gene in the trap vector is ES
It is not expressed unless it is integrated downstream of the mouse gene expressed in cells. Thus, expression means that it has been integrated downstream of a gene.
【００５８】(2)組込みパターンによるESクローンの選
別 ESクローンから常法にしたがってDNAを抽出し、サザン
ブロット法等により組込みパターンを解析する。サザン
ブロットのパターンが単一バンドとして現れた場合は、
1コピーのみが組込まれていると判断できるため、その
パターンを表したDNAを選別する。これは、プラスミド
によるマウス内在性遺伝子の単離を容易に行なえるクロ
ーンを選別するためであり、また、1コピーでネオ耐性
となるクローンでは、実際にマウス遺伝子をトラップし
ている確率が極めて高いからである。(2) Selection of ES clones by integration pattern DNA is extracted from ES clones according to a conventional method, and the integration pattern is analyzed by Southern blotting or the like. If the Southern blot pattern appeared as a single band,
Since it can be determined that only one copy has been incorporated, DNAs expressing that pattern are selected. This is to select clones that can easily isolate the mouse endogenous gene using a plasmid.In addition, clones that become neo-resistant with one copy have a very high probability of actually trapping the mouse gene. Because.
【００５９】５．キメラ動物作製によるトラップ系統
（トランスジェニック動物）の樹立 キメラ動物の作製は標準的な方法で行う（図9）。本発
明において作製されるキメラ動物の種類は特に限定され
るものではない。例えば、マウス、ラット、モルモッ
ト、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ等が挙げられ
る。本発明においては、取り扱いが容易で繁殖もしやす
いマウスが好ましい。5. Establishment of trap line (transgenic animal) by chimeric animal production Chimeric animals are produced by a standard method (FIG. 9). The type of chimeric animal produced in the present invention is not particularly limited. For example, mouse, rat, guinea pig, rabbit, goat, sheep, pig, dog and the like can be mentioned. In the present invention, mice that are easy to handle and easily breed are preferred.
【００６０】ネオマイシンで選別したES細胞を動物由来
の桑実胚と凝集させ（ES細胞と桑実胚との集合体を形成
させること）、キメラ動物胚(例えば胚盤胞まで発生し
たもの)を作製する。これらを不妊雄と交尾し偽妊娠状
態となった仮親の子宮に移植する。例えばマウスの場合
は約17日後に子が生まれるので、仮親から生まれた子の
うちキメラ動物を選ぶ。キメラの寄与率が高い動物は、
生殖系列の可能性が高いが、キメラ動物を正常動物と交
配することにより、生殖系列のキメラ動物であることの
確認が可能である。The ES cells selected with neomycin are aggregated with morula of animal origin (to form an aggregate of ES cells and morula), and a chimeric animal embryo (for example, one that has developed to a blastocyst) is obtained. Make it. These are mated with an infertile male and transplanted into the uterus of a foster mother who has become pseudopregnant. For example, in the case of a mouse, a child is born about 17 days later. Therefore, a chimeric animal is selected from the child born from the foster parent. Animals with a high chimeric contribution
Although the possibility of germ line is high, it is possible to confirm that the animal is a germ line chimeric animal by crossing the chimeric animal with a normal animal.
【００６１】その後正常な雌と交配し、F1を得て変異動
物系統を樹立する。系統（トランスジェニック動物）樹
立ができたもののみについて以下の解析を行なう。な
お、F1からの***、及び該***を用いて体外受精を行な
って得られる2細胞期胚は、超急速凍結法にて凍結保存
しておくことができる。Thereafter, the female is crossed with a normal female, F1 is obtained, and a mutant animal strain is established. The following analysis is performed on only those lines (transgenic animals) that have been established. The sperm from F1 and the two-cell embryo obtained by in vitro fertilization using the sperm can be cryopreserved by the ultra-rapid freezing method.
【００６２】(1)発現パターンの解析 F1動物を交配し、胚（例えばマウスの場合9.5日目のも
の）と成体における発現パターンを解析する。 (2)表現型の解析 樹立した動物系統について、ヘテロ及びホモ動物の表現
型を解析する。表現型の解析は、肉眼的観察、解剖によ
る内部の観察、各臓器の組織切片、X線撮影による骨格
系、行動や記憶、血液を用いて行う。(1) Expression Pattern Analysis F1 animals are bred and the expression patterns in embryos (eg, mouse 9.5 days) and adults are analyzed. (2) Analysis of phenotype The phenotype of the established animal strain is analyzed for hetero and homo animals. The phenotypic analysis is performed using macroscopic observation, internal observation by dissection, tissue sections of each organ, skeletal system by X-ray photography, behavior and memory, and blood.
【００６３】(3)トラップした遺伝子の単離と構造解
析、染色体地図の作成 トラップクローンからDNAの単離と塩基配列の決定を行
ない（後述）、ホモロジーサーチを行なう。その結果、
得られた配列情報が既知遺伝子、EST、未知遺伝子及び
リピートのいずれに属するのか、区別しておく。ESTと
未知遺伝子については、染色体地図を作成することもで
きる。染色体地図は、蛍光in situ hybridization(FIS
H)法、またはマイクロサテライトプローブ等を用いた連
関解析若しくは放射線照射による雑種細胞を用いた解析
によって行なう。染色体上の位置が明らかになれば、既
存の変異マウスの位置と対比し、一致するかどうかも調
べておく。(3) Isolation of Trapped Gene, Structural Analysis, and Preparation of Chromosome Map DNA is isolated from the trap clone and its nucleotide sequence is determined (described later), and homology search is performed. as a result,
Whether the obtained sequence information belongs to a known gene, an EST, an unknown gene, or a repeat is distinguished. For ESTs and unknown genes, a chromosome map can also be created. Chromosome maps can be obtained by fluorescence in situ hybridization (FIS
H) method, or an association analysis using a microsatellite probe or an analysis using hybrid cells by irradiation. Once the location on the chromosome is known, it should be compared with the location of the existing mutant mouse to determine whether it matches.
【００６４】(4)データベース構築 樹立した各系統について、マーカー遺伝子の胚（例えば
マウスの場合10日目の胚）と成体における発現パター
ン、F1およびF2動物における表現型、トラップした動物
内在性DNAの塩基配列、ESTと未知遺伝子についてはその
染色体上の位置について、データベースを作成する。(4) Database Construction For each established line, the expression patterns of marker genes in embryos (eg, embryos on day 10 in mice) and adults, phenotypes in F1 and F2 animals, and For nucleotide sequences, ESTs and unknown genes, a database is created for their positions on the chromosome.
【００６５】６．ノックアウト動物 本発明のノックアウト動物は、遺伝子の機能が失われる
ように処理されたものである。その処理方法について説
明する。本発明において使用し得る動物としては、マウ
ス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブ
タ、イヌ等が挙げられる。本発明においては、取り扱い
が容易で繁殖もしやすいマウスが好ましい。6. Knockout animal The knockout animal of the present invention has been processed so that the function of the gene is lost. The processing method will be described. Animals that can be used in the present invention include mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, sheep, pigs, dogs, and the like. In the present invention, mice that are easy to handle and easily breed are preferred.
【００６６】未知遺伝子を含むゲノム DNAを、動物ES細
胞から調製したゲノムDNAから PCRにより、又はゲノム
ライブラリーから得、これに本発明のトラップベクター
に組み込む。この操作により、このエクソンの機能は破
壊される。これと同時にベクターの中にネガティブ選別
用のチミジンキナーゼ (tk) 遺伝子又はジフテリア (D
T) 毒素遺伝子を繋げておく。エレクトロポレーション
等によりトラップベクターをES細胞に導入し、この細胞
をポジティブ選別用のネオマイシン及びネガティブ選別
用の核酸類似体 FIAU (fluoroiodoadenosyluracil)、又
はジフテリア毒素の存在下で培養する。この選別により
トラップベクターが挿入されたES細胞のみが残る。この
ESクローンでは、破壊されたエクソンを含む遺伝子がノ
ックアウトされる。得られた細胞を仮親の子宮に移植
し、その後生まれるキメラ動物を選ぶ。キメラ動物と正
常動物との交配により、ヘテロ接合体動物が得られ、ヘ
テロ接合体同士の交配によりホモ接合体を得ることがで
きる。A genomic DNA containing an unknown gene is obtained from genomic DNA prepared from animal ES cells by PCR or from a genomic library, and incorporated into the trap vector of the present invention. This operation destroys the function of this exon. At the same time, the thymidine kinase (tk) gene or diphtheria (D
T) Link toxin genes. The trap vector is introduced into ES cells by electroporation or the like, and the cells are cultured in the presence of neomycin for positive selection and FIAU (fluoroiodoadenosyluracil), a nucleic acid analog for negative selection, or diphtheria toxin. This selection leaves only the ES cells into which the trap vector has been inserted. this
In ES clones, the gene containing the disrupted exon is knocked out. The obtained cells are transplanted into the uterus of a foster mother, and a chimeric animal born thereafter is selected. By mating a chimeric animal with a normal animal, a heterozygous animal is obtained, and by mating the heterozygotes, a homozygote can be obtained.
【００６７】なお、ノックアウトマウスが得られたこと
の確認は、外見上の異常の有無及び解剖を行った際の諸
組織-臓器の異常を観察することもできる。さらに、組
織からRNAを抽出し、ノーザンブロット解析により遺伝
子の発現パターンを解析し、必要に応じて血液を採取
し、血液検査や血清生化学検査を実施してもよい。The knockout mouse can be confirmed by observing the appearance of abnormalities and by observing the abnormalities of various tissues and organs at the time of dissection. Furthermore, RNA may be extracted from the tissue, the expression pattern of the gene may be analyzed by Northern blot analysis, blood may be collected as necessary, and a blood test or serum biochemical test may be performed.
【００６８】７．遺伝子の単離、組換えベクターの構築
及び形質転換体の作製 (1) 遺伝子の単離 本発明においては、前記の通りトラップされた遺伝子の
クローニングを行い、構造解析を行うことができる。7. Isolation of Gene, Construction of Recombinant Vector, and Preparation of Transformant (1) Isolation of Gene In the present invention, the gene trapped as described above can be cloned to perform structural analysis.
【００６９】トラップクローンからDNAの単離は、通常
行われる手法により行うことができる。例えば、トラッ
プクローンのmRNAからクローニングする場合は、まず、
トラップクローンをグアニジン試薬、フェノール試薬等
で処理して全RNAを得た後、オリゴdT-セルロース又はセ
ファロース2Bを担体とするポリU-セファロース等を用い
たアフィニティーカラム法、あるいはバッチ法によりポ
リ(A+)RNA(mRNA)を得る。得られたmRNAを鋳型として、
オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNA
を合成した後、該一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成す
る。このようにして得られた二本鎖cDNAを適当な発現ベ
クター(例えばλgt11等)に組み込むことによって、cDNA
ライブラリーを得る。[0069] Isolation of DNA from the trap clone can be performed by a commonly used technique. For example, when cloning from mRNA of a trap clone, first,
The trap clone is treated with a guanidine reagent, a phenol reagent, etc. to obtain total RNA, and then subjected to an affinity column method using oligo dT-cellulose or poly-U-sepharose using Sepharose 2B as a carrier, or a poly (A + ) Obtain RNA (mRNA). Using the obtained mRNA as a template,
Single-stranded cDNA using oligo dT primer and reverse transcriptase
Is synthesized, a double-stranded cDNA is synthesized from the single-stranded cDNA. By incorporating the double-stranded cDNA thus obtained into an appropriate expression vector (e.g., λgt11 or the like), the cDNA
Get the library.
【００７０】上記の通り得られた遺伝子について塩基配
列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム-ギルバー
トの化学修飾法、又はDNAポリメラーゼを用いるジデオ
キシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うこと
ができる。通常は、自動塩基配列決定装置等により塩基
配列を決定することができる。また、cDNAの5'領域又は
3'領域の塩基配列が未決定の場合は、5'-RACE法、3'-RA
CE等を用いて全塩基配列の決定を行う。RACE (Raped Am
plification of cDNA Ends)法は、当該技術分野におい
て周知であり（Frohman,M.A. et al., Methods Enzymo
l. Vol. 218, pp340-358 (1993)）、RACEを行うための
キットも市販されている（例えば、Marathon TM cDNA Am
plification Kit; CLONETECH社、その他）。The nucleotide sequence of the gene obtained as described above
Make column decisions. Maxam-Gilber for nucleotide sequencing
Modification of DNA or DNA using DNA polymerase
Performing by a known method such as a xynucleotide chain termination method
Can be. Usually, the base is determined by an automatic base sequencer or the like.
The sequence can be determined. In addition, the 5 'region of the cDNA or
If the nucleotide sequence of the 3 'region has not been determined, the 5'-RACE method, 3'-RA
The entire nucleotide sequence is determined using CE or the like. RACE (Raped Am
plification of cDNA Ends) method is
(Frohman, M.A. et al., Methods Enzymo
l. Vol. 218, pp340-358 (1993))
Kits are also commercially available (eg, Marathon TM cDNA Am
plification Kit; CLONETECH, others).
【００７１】本発明において解析されたクローンAyu600
3のcDNAの塩基配列を配列番号７に、該塩基配列により
コードされるアミノ酸配列を配列番号８に示す。Ayu600
3のcDNAは、配列番号９に示す塩基配列のうち、エクソ
ン１（2580〜2608番目の29bpの配列）、エクソン２（31
93〜3482番目の290bpの配列）及びエクソン３（5689〜6
774番目の1086bpの配列）から構成され、コード領域は7
38bpであることが分かった。一旦本発明の遺伝子の塩基
配列が決定されると、その後は、化学合成によって、又
は決定された当該塩基配列から合成したプライマーを用
いたPCRによって、本発明の遺伝子を得ることができ
る。The clone Ayu600 analyzed in the present invention
The nucleotide sequence of the cDNA of No. 3 is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 8. Ayu600
The cDNA of exon 1 (2580-2608 bp 29 bp sequence) and exon 2 (31
290 bp sequence at positions 93-3482) and exon 3 (5689-6
774th 1086 bp sequence), and the coding region is 7
It was found to be 38 bp. Once the nucleotide sequence of the gene of the present invention has been determined, the gene of the present invention can be obtained by chemical synthesis or by PCR using primers synthesized from the determined nucleotide sequence.
【００７２】(2) 組換えベクターの構築 目的とする遺伝子断片を精製し、ベクターDNAと連結す
る。ベクターとしては、ファージベクター、プラスミド
ベクター等の任意のものを用いることができる。DNAと
ベクターとの連結手法は、当該分野で周知である(J. Sa
mbrook, et al.,Molecular cloning, A Laboratory Man
ual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989)。さらに、これより組換えベクターを作
製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組
換えベクターを調製する。(2) Construction of Recombinant Vector The gene fragment of interest is purified and ligated to vector DNA. Any vector such as a phage vector and a plasmid vector can be used as the vector. Techniques for linking a DNA and a vector are well known in the art (J. Sa.
mbrook, et al., Molecular cloning, A Laboratory Man
ual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989). Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
【００７３】(3) 形質転換体 本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目
的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ
り得ることができる。ここで、宿主は、本発明のDNAを
発現できるものであれば特に限定されるものではない。
例えば、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等が挙げられ
る。(3) Transformant The transformant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host so that the target gene can be expressed. Here, the host is not particularly limited as long as it can express the DNA of the present invention.
For example, bacteria, yeast, animal cells, insect cells and the like can be mentioned.
【００７４】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ま
しい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれて
いてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・
コリ(Escherichia coli)K12、DH1などが挙げられ、枯草
菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus su
btilis)などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等
の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよ
い。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロ
モーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに
由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーター
などのように、人為的に設計改変されたプロモーターを
用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、
細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるもの
ではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohe
n, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2
110-2114 (1972))、エレクトロポレーション法(Becker,
D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182-187 (19
90))等が挙げられる。When a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, the recombinant vector of the present invention is capable of autonomous replication in the bacterium, and comprises a promoter, a ribosome binding sequence, a gene of the present invention, and a transcription termination sequence. Is preferred. Further, a gene controlling a promoter may be included. As Escherichia coli, for example, Escherichia
E. coli (Escherichia coli) K12, DH1, etc., and examples of Bacillus subtilis include Bacillus subtilis (Bacillus su
btilis). Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli. For example, promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter, lac promoter, PL promoter and PR promoter are used. An artificially designed and modified promoter such as a tac promoter may be used. The method of introducing a recombinant vector into bacteria is as follows:
The method is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. For example, a method using calcium ions (Cohe
n, SN et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2.
110-2114 (1972)), electroporation method (Becker,
DM et al .: Methods. Enzymol., 194: 182-187 (19
90)).
【００７５】酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾ
サッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)
などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵
母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば
gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショッ
クタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5
プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、AD
Hプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。酵
母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入
する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポ
レーション法、スフェロプラスト法(Hinnen, A. et a
l.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929-1933 (1
978))、酢酸リチウム法(Itoh, H.：J. Bacteriol., 15
3：163-168 (1983))等が挙げられる。When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe
Are used. In this case, the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast, for example,
gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, PHO5
Promoter, PGK promoter, GAP promoter, AD
H promoter, AOX1 promoter and the like. The method for introducing the recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast. For example, electroporation, spheroplast method (Hinnen, A. et a
l .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 1929-1933 (1
978)), lithium acetate method (Itoh, H .: J. Bacteriol., 15
3: 163-168 (1983)).
【００７６】動物細胞を宿主とする場合は、COS細胞、V
ero細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウス骨髄腫細胞などが用いられる。プロモータ
ーとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプ
ロモーター、EF1プロモーター、PGKプロモーター、MC1
プロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウ
イルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動
物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えば
エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポ
フェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする
場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが挙げられる。昆虫細
胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン
酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレ
ーション法などが用いられる。When animal cells are used as hosts, COS cells, V
Ero cells, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), mouse myeloma cells and the like are used. Promoters: SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, EF1 promoter, PGK promoter, MC1
A promoter or the like may be used, and an early gene promoter of human cytomegalovirus may be used. Examples of a method for introducing a recombinant vector into animal cells include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a lipofection method. When an insect cell is used as a host, Sf9 cells, Sf21 cells and the like can be mentioned. As a method for introducing a recombinant vector into insect cells, for example, a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method, and the like are used.
【００７７】[0077]
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。 〔実施例1〕 遺伝子トラップベクターの作製 (1) pU-8トラップベクターの構築 pU-8ベクターはpGT1.8IRESβ-geoに由来し、マウスEn-2
遺伝子からのSA配列と、脳心筋炎ウイルス由来のIRES配
列に連結したβ-geo配列とを含有する。まず、lox71のB
amHI断片をpGT1.8IRESβ-geoのBglII部位に挿入した。
次いで、ウサギβ-グロビン遺伝子の一部である180bpの
配列、loxP配列、及びマウスホスホグリセレートキナー
ゼ-1（PGK）由来のpoly A付加シグナルを、ベクターpUC
19のLacZ配列が除去された改変型ベクターに挿入するこ
とにより、プラスミドpEBN-SE7tiを構築した。SP配列
は、トラップベクターの3'側を保護するために使用し
た。プラスミドpEBN-SE7tiのSalI部位にSA-IRES-lox71-
β-geoのSalI断片を挿入することにより、pU-8を得た。The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples. [Example 1] Preparation of gene trap vector (1) Construction of pU-8 trap vector The pU-8 vector was derived from pGT1.8IRESβ-geo,
It contains an SA sequence from the gene and a β-geo sequence linked to an IRES sequence from encephalomyocarditis virus. First, lox71 B
The amHI fragment was inserted into the BglII site of pGT1.8IRESβ-geo.
Next, a 180 bp sequence that is a part of the rabbit β-globin gene, a loxP sequence, and a polyA addition signal derived from mouse phosphoglycerate kinase-1 (PGK) were added to the vector pUC.
Plasmid pEBN-SE7ti was constructed by insertion into a modified vector from which 19 LacZ sequences had been removed. The SP sequence was used to protect the 3 'side of the trap vector. SA-IRES-lox71- is inserted into the SalI site of plasmid pEBN-SE7ti.
pU-8 was obtained by inserting the SalI fragment of β-geo.
【００７８】(2) pU-12トラップベクターの構築 pU-12トラップベクターを構築するために、まずpE3NSE7
のPGK poly(A)シグナルをピューロマイシン耐性遺伝子
＋PGK poly(A)シグナルに置き換え、さらにその下流のB
glII部位にlox511を挿入したプラスミドを作製した。そ
のプラスミドのSalI部位にpU-HachiからのSA-IRES-lox7
1-β-geoのSalI断片を挿入することにより、pU-12を得
た。(2) Construction of pU-12 trap vector To construct a pU-12 trap vector, first, pE3NSE7
PGK poly (A) signal was replaced with puromycin resistance gene + PGK poly (A) signal, and further downstream B
A plasmid having lox511 inserted at the glII site was prepared. SA-IRES-lox7 from pU-Hachi at the SalI site of the plasmid
PU-12 was obtained by inserting the SalI fragment of 1-β-geo.
【００７９】(3) pU-17トラップベクターの構築 まず、pSP73（Promega）に、lox511、loxP、PGK poly
(A)シグナル、lox2272をこの順で挿入し、プラスミドpS
P5PP2を構築した。次に、pU-HachiのSA内に2箇所あるBa
mHIのうち上流のBamHI部位で切断し、pBluescriptII KS
+ プラスミドに、SA前半のBamHIまでのDNA断片、lox71
配列、SA後半BamHIからKpnIまでのDNA断片、β-geoのNc
oIからSalI部位までをこの順に挿入し、プラスミドpKS+
S71Aβgeoを構築した。このpKS+S71Aβgeoからlox71を
含むSA-βgeoのXbaI断片を切り出し、これをpSP5PP2のS
peI部位に挿入することによりpU-17を得た。(3) Construction of pU-17 trap vector First, lox511, loxP, PGK poly was added to pSP73 (Promega).
(A) Insert signal, lox2272 in this order, and add plasmid pS
P5PP2 was constructed. Next, two Ba in pU-Hachi SA
Cleavage at the upstream BamHI site of mHI, pBluescriptII KS
+ Plasmid contains DNA fragment up to BamHI in the first half of SA, lox71
Sequence, DNA fragment from BamHI to KpnI in the second half of SA, Nc of β-geo
Insert from oI to SalI site in this order, plasmid pKS +
S71Aβgeo was constructed. An XbaI fragment of SA-βgeo containing lox71 was cut out from this pKS + S71Aβgeo, and
pU-17 was obtained by insertion at the peI site.
【００８０】(4) pU-San及びpU-Rokトラップベクターの
構築 pU-Sanベクターは、pU-8を作製する際に使用したlox71
の代わりにloxPを使用した点以外は、pU-8と同様にして
構築した。pU-Rokベクターは、pU-SanのSA(En2)とIRES
との間にloxPを挿入することにより構築した。(4) Construction of pU-San and pU-Rok Trap Vectors The pU-San vector was prepared using lox71 used in the production of pU-8.
Was constructed in the same manner as pU-8, except that loxP was used instead of pU-Rok vector is composed of pU-San SA (En2) and IRES
And constructed by inserting loxP.
【００８１】〔実施例2〕 ES細胞クローンの選別 ネオマイシン耐性初代マウス線維芽細胞をPEF培地でコ
ンフルエントに培養した後、100μg/mlマイトマイシンC
で3時間処理し、0.25％トリプシンで処理した。トリプ
シン処理した細胞を、0.01％ゼラチンコート培養ディッ
シュに播種し、ES細胞用フィーダー細胞とした。pU-Rok
トラップベクターを用いたエレクトロポレーションにお
いては、100μgのSpeIで消化したDNA及び3×107個のES
細胞を用いた。ES細胞を0.8mlのPBSに懸濁し、Bio-Rad
Gene Pulserを用いて、以下のいずれかの条件でエレク
トロポレーションを行った。Example 2 Selection of ES Cell Clones Neomycin-resistant primary mouse fibroblasts were cultured to confluence in PEF medium, and then 100 μg / ml mitomycin C
For 3 hours and treated with 0.25% trypsin. The cells treated with trypsin were seeded on a 0.01% gelatin-coated culture dish, and used as feeder cells for ES cells. pU-Rok
In electroporation using a trap vector, DNA digested with 100 μg SpeI and 3 × 10 7 ES
Cells were used. Suspend the ES cells in 0.8 ml of PBS, and use Bio-Rad
Electroporation was performed using a Gene Pulser under any of the following conditions.
【００８２】（i）電極間距離： 0.4 cm、電圧：0.2 k
V、キャパシタンス： 960μF、抵抗：無し (ii)電極間距離： 0.4 cm、電圧： 0.8 kV、キャパシタ
ンス： 3μF、抵抗：無し 48時間後、200μg/mlのG418の存在下で培養した。選別
を7日間維持し、コロニーを24ウェルプレートにまいて
増殖させ、凍結保存した。トラップクローンをサザンブ
ロッティングにより解析し、単一コピーの組み込みパタ
ーンを示す細胞株を選別した。(I) Distance between electrodes: 0.4 cm, voltage: 0.2 k
V, capacitance: 960 μF, resistance: none (ii) distance between electrodes: 0.4 cm, voltage: 0.8 kV, capacitance: 3 μF, resistance: none After 48 hours, the cells were cultured in the presence of 200 μg / ml G418. Sorting was maintained for 7 days, and colonies were spread on 24-well plates and cryopreserved. Trap clones were analyzed by Southern blotting to select cell lines that showed a single copy integration pattern.
【００８３】トラップクローンからβ-geo配列を除去す
るため、pCAGGS-Cre（Araki, K. etal., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 92:160-164,1995; Araki, K. et al.,
Nucl. Acids Res.,25:868-872,1997; Araki, K. et a
l., J. Biochem. Tokyo, 122:977-982, 1997）を環状の
形態でエレクトロポレーションにより導入した。細胞数
が1.5×107個、PBS容量が0.4mlであることを除き上記と
同一の条件でエレクトロポレーションを行った。In order to remove the β-geo sequence from the trap clone, pCAGGS-Cre (Araki, K. et al., Proc. Natl. A
cad.Sci. USA, 92: 160-164,1995; Araki, K. et al.,
Nucl. Acids Res., 25: 868-872, 1997; Araki, K. et a
l., J. Biochem. Tokyo, 122: 977-982, 1997) was introduced by electroporation in the form of a ring. Electroporation was performed under the same conditions as above except that the number of cells was 1.5 × 10 7 and the PBS volume was 0.4 ml.
【００８４】処理された細胞の半分を1枚の100mmプレー
トにまき、48時間増殖させた。次に、1×103個/プレー
トの濃度で100mmのプレートに再度まき、コロニーを形
成させた。1週間後、コロニーを取り上げ、DNA調製のた
めに増殖させた。PBS中、1×107個/0.8mlの細胞をエレ
クトロポレーションにかけた（200V, 950μF）。48時間
後、2μg/mlのピューロマイシンを用いて3日間選別にか
け、その後通常の培地に細胞を移した。エレクトロポレ
ーション後9日目にコロニーを取り上げ、増殖させた。One half of the treated cells were plated on one 100 mm plate and grown for 48 hours. Next, a 100 mm plate was replated at a density of 1 × 10 3 cells / plate to form a colony. One week later, colonies were picked and expanded for DNA preparation. 1 × 10 7 cells / 0.8 ml of cells in PBS were subjected to electroporation (200 V, 950 μF). After 48 hours, the cells were selected with 2 μg / ml puromycin for 3 days, and then the cells were transferred to a normal medium. Nine days after electroporation, colonies were picked and grown.
【００８５】公知方法（Abe, K.,Niwa,H. et al., Exp.
Ce11 Res. 229: 27-34, 1996）に従って胚様体（EB）
の生産を行った。ES細胞中のβ-ガラクトシダーゼ活性
及びEBは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル β-D-ガラ
クトピラノシド(X-gal)で染色することにより測定した
(Gossler, A. and Zachgo, J., Gene Targeting: A Pra
ctical Approach, Joyner, A. (ed.), Oxford Universi
ty Press, Oxford, 1993, pp.181-227)。Known methods (Abe, K., Niwa, H. et al., Exp.
Embryoid body (EB) according to Ce11 Res. 229: 27-34, 1996)
Production. Β-galactosidase activity and EB in ES cells were measured by staining with 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal)
(Gossler, A. and Zachgo, J., Gene Targeting: A Pra
ctical Approach, Joyner, A. (ed.), Oxford Universi
ty Press, Oxford, 1993, pp. 181-227).
【００８６】トラップベクターpU-Rokを直鎖状にしてTT
2 ES細胞に導入し、クローン（Ayu-6003クローン）を単
離した。Ayu-6003クローンは、独立行政法人産業技術総
合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁
目１番地１）に、平成13年（2001年）５月23日付で寄託
されている（受託番号：FERM P-18340）。The trap vector pU-Rok was made linear to form TT
2 The cells were introduced into ES cells, and a clone (Ayu-6003 clone) was isolated. The Ayu-6003 clone has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary (1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) on May 23, 2001 (accession number). : FERM P-18340).
【００８７】〔実施例3〕 キメラマウスの作製及び遺伝
子解析 (1) マウスへのクローン導入 トラップしたESクローン（Ayu-6003）をICRマウス由来
の８細胞期胚と凝集させ、１晩培養した。翌日、ES細胞
と８細胞期胚とが凝集しあい、1つの胚盤胞へと発生し
たものを選択した。これらのキメラ胚約20個を不妊雄と
交尾した雌（仮親）の子宮の中へ移植した。約17日後に
出生し、性成熟する生後８週以降にキメラマウスを雌の
マウスと交配し、ESクローン由来のF1マウス(ヘテロ接
合体)個体を得た。F1個体同士を交配したが、ホモ接合
体は8.5日胚より前に致死であるが、ヘテロ接合体は正
常に生まれ、外観上特に目立った表現型は見られなかっ
た。なお、ヘテロ接合体は9.5日胚より成体まで心臓に
β-geoの発現を認めた。[Example 3] Preparation of chimeric mouse and gene analysis (1) Introduction of clone into mouse The trapped ES clone (Ayu-6003) was aggregated with an 8-cell stage embryo derived from an ICR mouse and cultured overnight. The next day, the ES cells and the 8-cell stage embryos aggregated each other, and those that developed into one blastocyst were selected. Approximately 20 of these chimeric embryos were implanted into the uterus of a female (foster parent) mated with an infertile male. Chimera mice were mated with female mice about 8 weeks after birth about 17 days after birth and sexual maturity, and F1 mice (heterozygotes) derived from ES clones were obtained. When F1 individuals were crossed, homozygotes were killed before the 8.5-day embryo, but heterozygotes were born normally and no apparent phenotype was observed. In the heterozygote, β-geo expression was observed in the heart from the 9.5 day embryo to the adult.
【００８８】(2) トラップした遺伝子の解析 (i) RNAの抽出 5' RACEを行うため、材料として正常B6マウスの心臓か
らRNAを抽出した。 (ii)トラップされた遺伝子のcDNAの解析 上記RNAサンプルを元に、cDNA合成用プライマー（5'-TG
CTCTGTCAGGTACCTGTTG-3'（配列番号10））を合成し、 1
st strand 合成を行った。PCRは、キットに付属のプラ
イマーと以下のプライマー： 5'-CTTTGTTAGGGTTCTTCTTC
-3' （配列番号11）を用い、PCRを行った。(2) Analysis of Trapped Gene (i) Extraction of RNA RNA was extracted from a normal B6 mouse heart as a material for 5 ′ RACE. (ii) Analysis of cDNA of Trapped Gene Based on the above RNA sample, cDNA synthesis primers (5'-TG
CTCTGTCAGGTACCTGTTG-3 '(SEQ ID NO: 10)), 1
St strand synthesis was performed. For PCR, use the primers provided with the kit and the following primers: 5'-CTTTGTTAGGGTTCTTCTTC
PCR was performed using -3 ′ (SEQ ID NO: 11).
【００８９】その結果、340 bp の産物を得た。この 5'
RACE 産物の塩基配列を決定し、データベースホモロジ
ー検索を行ったところ、AA277699 EST クローンに該当
した（図10）。次にこのAA277699の配列を用いてデータ
ベースホモロジー検索を行った結果、W48287 EST クロ
ーンが当り（図10）、この３個の配列をつなぎあわせた
ところ、AK00956の配列に当たった。As a result, a 340 bp product was obtained. This 5 '
When the base sequence of the RACE product was determined and a database homology search was performed, it corresponded to the AA277699 EST clone (FIG. 10). Next, a database homology search was performed using the sequence of AA277699, and as a result, a W48287 EST clone was hit (FIG. 10). When these three sequences were joined, the result was the sequence of AK00956.
【００９０】Ayu6003のcDNAは、配列番号９に示す塩基
配列のうち、エクソン１（2580〜2608番目の29bpの配
列）、エクソン２（3193〜3482番目の290bpの配列）及
びエクソン３（5689〜6774番目の1086bpの配列）から構
成され、コード領域は738bpであることが分かった。ま
た、レスキューされた3'フランキングゲノム断片の配列
とAyu6003 cDNA 全長の配列(配列番号7)とを比較した結
果、ベクター挿入位置から約1kb下流に、5' RACE 産物
に続く配列が現れた。従って、トラップベクターはAyu6
003 遺伝子のイントロン内に挿入され、挿入時のゲノム
DNAの欠失も大きくないことが確認された。また、本発
明のノックアウトマウスは、配列番号７に示す遺伝子が
破壊されたものであることが判明した。The cDNA of Ayu6003 comprises exon 1 (a 29bp sequence at positions 2580 to 2608), exon 2 (a 290 bp sequence at positions 3193 to 3482) and exon 3 (5689 to 6774) of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9. And the coding region was found to be 738 bp. Also, as a result of comparing the sequence of the rescued 3 'flanking genomic fragment with the full-length sequence of Ayu6003 cDNA (SEQ ID NO: 7), a sequence following the 5' RACE product appeared about 1 kb downstream from the vector insertion position. Therefore, the trap vector is Ayu6
Inserted into the 003 gene intron, the genome at the time of insertion
It was confirmed that DNA deletion was not large. It was also found that the knockout mouse of the present invention had the gene shown in SEQ ID NO: 7 disrupted.
【００９１】[0091]
【発明の効果】本発明により、ノックアウトマウスが提
供される。本発明のノックアウトマウスは、血管形成や
血球の発達のプロセス、あるいはこれらをターゲットと
した新薬の開発のためのモデル動物として利用できる。According to the present invention, a knockout mouse is provided. The knockout mouse of the present invention can be used as a model animal for angiogenesis and blood cell development processes, or for the development of new drugs targeting these.
【００９２】[0092]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION IDE, HIROYUKI <120> KNOCKOUT ANIMAL <130> P01-0415 <140> <141> <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 1 taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 2 ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 3 ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 4 ataacttcgt ata 13 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 5 tatacgaagt tat 13 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 6 taccgttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34 <210> 7 <211> 1405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (22)..(759) <400> 7 ggaaaccacc agcaagcagc a atg gcc ggg cat ctg aag ctg gta ggc gtt 51 Met Ala Gly His Leu Lys Leu Val Gly Val 1 5 10 ccc ctt aag gtt cgg agg tta cac aca gca gtg tgt cac tac agg ggc 99 Pro Leu Lys Val Arg Arg Leu His Thr Ala Val Cys His Tyr Arg Gly 15 20 25 cgg gcc gtc gct gag cac ctg tgg ctc acg cgg cat cta aag gat ccg 147 Arg Ala Val Ala Glu His Leu Trp Leu Thr Arg His Leu Lys Asp Pro 30 35 40 ttt gtg aag gcc gca aag gtg gag agt tac cgc tgc cgc agt gcc tac 195 Phe Val Lys Ala Ala Lys Val Glu Ser Tyr Arg Cys Arg Ser Ala Tyr 45 50 55 aaa ctc ctg gag atg aat gag aag cat cag atc ctg agg ccc ggt ctc 243 Lys Leu Leu Glu Met Asn Glu Lys His Gln Ile Leu Arg Pro Gly Leu 60 65 70 cgg gtg ctg gac tgc ggc gca gct ccg gga gcc tgg agt cag gtg gca 291 Arg Val Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Gly Ala Trp Ser Gln Val Ala 75 80 85 90 gtg cag cgc gtc aat gcc aca ggc gca gat tcc agc tct cct gtg ggc 339 Val Gln Arg Val Asn Ala Thr Gly Ala Asp Ser Ser Ser Pro Val Gly 95 100 105 ttt gtg ctt ggc gtc gat ctt ctt cac ata ttc cct ttg gcg gga gca 387 Phe Val Leu Gly Val Asp Leu Leu His Ile Phe Pro Leu Ala Gly Ala 110 115 120 act ttt cta tgc cct gct gat gtg act gac ccc aga act ttc cag aag 435 Thr Phe Leu Cys Pro Ala Asp Val Thr Asp Pro Arg Thr Phe Gln Lys 125 130 135 att cta gaa ctg ctt ccc agc agg aga gca gat gtg att ctg agt gac 483 Ile Leu Glu Leu Leu Pro Ser Arg Arg Ala Asp Val Ile Leu Ser Asp 140 145 150 atg gca ccg aat gcc act ggg atc aga gac ctc gat cac gat aag ctc 531 Met Ala Pro Asn Ala Thr Gly Ile Arg Asp Leu Asp His Asp Lys Leu 155 160 165 170 atc agc ttg tgc ctt acc ctt gtg gac atg gct gtg gac atc ctg cat 579 Ile Ser Leu Cys Leu Thr Leu Val Asp Met Ala Val Asp Ile Leu His 175 180 185 ccc gga ggg aca ctg ctg tgt aaa acc tgg gcc gga agt aaa agc cac 627 Pro Gly Gly Thr Leu Leu Cys Lys Thr Trp Ala Gly Ser Lys Ser His 190 195 200 ctg ctg cag aag aga ctg acc cag gaa ttc cag agc aca agg gtg gtg 675 Leu Leu Gln Lys Arg Leu Thr Gln Glu Phe Gln Ser Thr Arg Val Val 205 210 215 aaa ccg gag gcc agc agg aaa gag tct tcg gag gtg tac ctg tta gcc 723 Lys Pro Glu Ala Ser Arg Lys Glu Ser Ser Glu Val Tyr Leu Leu Ala 220 225 230 acc cag tac cgt ggg ggg aag ggc acc agg agg ccg tgagtctgcc 769 Thr Gln Tyr Arg Gly Gly Lys Gly Thr Arg Arg Pro 235 240 245 ctgccattct gggggtgctt ccggaggagc gtggattcaa gctgccttgt ggatatgacc 829 agcaccccaa ggcacctctg cttttaaaga gataagcaaa tattttcaag ggccgtgaaa 889 aagtgctaag aatgggcagc gccatggcgc agtgaggaaa gggggattgc tgctaagcct 949 gacagtctga gtgcagcatc cgggacccca gagcagcgag agcgcgtgca cgcacacgca 1009 ggctgcacac aatatgaaca gatatattgg tactgttagt ttttggcaat ttgtctggga 1069 agaaagaatc tgactgtgga attcctccat cggctcacag gctgagccag ggagacattg 1129 atgagtgact gacgtggcag ggcccagccc tgtgcgggtg ctgccatccc ttggcaggta 1189 gcctgagttg tatgagaaag cggggtgagc aggactgagg aacaagccag tcatccatac 1249 cccactcccc gtctccagtt gctgctgcct ccaggttccc accccgagaa cccactttga 1309 tttccttcag tgatggactg tggttgggat gagtgaggca aagaaaccct ttccttccaa 1369 ggcttttaaa tgctgaaaac aaagcagtct tctcta 1405 <210> 8 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Met Ala Gly His Leu Lys Leu Val Gly Val Pro Leu Lys Val Arg Arg 1 5 10 15 Leu His Thr Ala Val Cys His Tyr Arg Gly Arg Ala Val Ala Glu His 20 25 30 Leu Trp Leu Thr Arg His Leu Lys Asp Pro Phe Val Lys Ala Ala Lys 35 40 45 Val Glu Ser Tyr Arg Cys Arg Ser Ala Tyr Lys Leu Leu Glu Met Asn 50 55 60 Glu Lys His Gln Ile Leu Arg Pro Gly Leu Arg Val Leu Asp Cys Gly 65 70 75 80 Ala Ala Pro Gly Ala Trp Ser Gln Val Ala Val Gln Arg Val Asn Ala 85 90 95 Thr Gly Ala Asp Ser Ser Ser Pro Val Gly Phe Val Leu Gly Val Asp 100 105 110 Leu Leu His Ile Phe Pro Leu Ala Gly Ala Thr Phe Leu Cys Pro Ala 115 120 125 Asp Val Thr Asp Pro Arg Thr Phe Gln Lys Ile Leu Glu Leu Leu Pro 130 135 140 Ser Arg Arg Ala Asp Val Ile Leu Ser Asp Met Ala Pro Asn Ala Thr 145 150 155 160 Gly Ile Arg Asp Leu Asp His Asp Lys Leu Ile Ser Leu Cys Leu Thr 165 170 175 Leu Val Asp Met Ala Val Asp Ile Leu His Pro Gly Gly Thr Leu Leu 180 185 190 Cys Lys Thr Trp Ala Gly Ser Lys Ser His Leu Leu Gln Lys Arg Leu 195 200 205 Thr Gln Glu Phe Gln Ser Thr Arg Val Val Lys Pro Glu Ala Ser Arg 210 215 220 Lys Glu Ser Ser Glu Val Tyr Leu Leu Ala Thr Gln Tyr Arg Gly Gly 225 230 235 240 Lys Gly Thr Arg Arg Pro 245 <210> 9 <211> 6863 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 9 gccagcacca aagcccctct tcttcatgcc caggagaact cgctgaggct gtagcactag 60 cacaagggta taaagcctgg aggagctcat gctctcctgg gtcctgttaa gaggatggga 120 aaatgtggtt tgattgggtc ttgtagtctg tttagagtat gcatcatatg agttctgttg 180 tggccaggtg ggagggagat acatctggag aggaaataag aatgtatgta tgtatgtaat 240 nacaagtgct ggggaaagaa ctccaaagcc ttgagcatga taggctaatg ttctcccatt 300 gagccatacc ccagcccctc actgggggat tctaggcagg ggctctacta ctgagccata 360 ctcccagtac tgagttatct ctccagcccc cagacaaagc gtcttatttt attgtttcct 420 aggcctcaac tggctaaggc agtatacaga aactgggacc ctcctaagag gctgcagtgt 480 ataagaaaag gaacttgaac aagggctgga gagatggcag tggttaggag gactagctgc 540 tcttgcagag gactgtggtt ccatttctag catccacatg gtggctcacg actgtctaac 600 tctgttctga tgccctcttc tggcgtcttt gggtaccagg cacacatata gtataatagt 660 taacaaaact cctgtattcc agctggagag atggctgctc agtggttaag agcactggct 720 gctcctccag gggcaccaag ttcaattccc agcaaccaca tggtggcttg caattgtctg 780 taattctagc tcctggggat atggccccct acacaaacat acatggaggc aaagcatcaa 840 tgaacataaa aaataaatat ttttttaaag ctatacacca cctctggatg gttttttaaa 900 atatttattt gtttgtttgt ttgtttatta tatacactgt agctgtcttc agacactcca 960 gaagagggca tcagatctca ttacggatgg ttgtgagcca ccatgtggtt gctgggattt 1020 gaactcagga cctttggaag agcagtcagc gctcctaacc gctgagccaa ttcaccagcc 1080 ccccaaaata aatattttta aaaccctata cgttctcgaa taaaaaaatc caacaaccct 1140 atatgtgcac aatataagtt aaaatttaaa aacagaataa gaagaaaggg aaagaaaagg 1200 gacccggaag cttaggcctg gtgctgaggt aagtcaggag aagaagtggg cttagcattg 1260 gcctgtgttc tgacttgcct gtgcctgagc ctctggcttc ctgactcagc aaagtcagcc 1320 atctcttatt aagcaccggc tgtatacagc tgtctttcat agccacagga tatccacagg 1380 atatctttca tatccacaga taccaggata ccttaccctt ccatggatac tgggattaaa 1440 gtatgatgaa atcacttctt tgaaatggcg tatttgcctg taacttacag acatcctccg 1500 gcccacttta catgcaaact atgtaaattg ttttcatgta gggagtgatg acaaatgtcc 1560 tcacattcca tacagatgag tgatttgttt tgcaaggatt ttaaacgaga cagagttggt 1620 gccatgttct ccattctgga cttaaactca caatcttccc gcctccaacc acctgagtgt 1680 agaatgacag gcgtgcacca gcgtgctcag ctccttgtct cagtgaaatg agcagtgagg 1740 acatagattg gaatcaggta gaatgggtgt ggctatggct ctgttgattg gcattgcttc 1800 aaacacagag tccccatact gtttcccttt gcaatggaaa tgggagtggg tgggtagggg 1860 agtggggggg agggtatgag ggacttttgg gatagcattg gaaatgtaaa tgaggaaaat 1920 acctaataaa aaaagtaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agactaagaa cagagtttaa 1980 gacttacttt cttcgtttct gaggcgaaaa ctagtgctcc gaggtcaaat 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acaaaatact 2880 ggacatgtgt gctgaccaaa tgtaacccca gtgctgggga ggcagagaaa aggggtccct 2940 ggagaaagct ggcgagatag actggcaggt tggcgacctt acatcaatac ataaggtaga 3000 gagcaagcga aggggacgtc ccttctctac tttggccccc catacacagg cagacacatg 3060 tgcacataca tgctaataca catgcgtgca tgcatatcgc acatacatat gcagaaacaa 3120 aaaggttgga accaagactt ctttggctct ctgtgtaatg cccacccgct aactcttttt 3180 tcgtcgtttc aggcatctga agctggtagg cgttcccctt aaggttcgga ggttacacac 3240 agcagtgtgt cactacaggg gccgggccgt cgctgagcac ctgtggctca cgcggcatct 3300 aaaggatccg tttgtgaagg ccgcaaaggt ggagagttac cgctgccgca gtgcctacaa 3360 actcctggag atgaatgaga agcatcagat cctgaggccc ggtctccggg tgctggactg 3420 cggcgcagct ccgggagcct ggagtcaggt ggcagtgcag cgcgtcaatg ccacaggcgc 3480 aggtgggacc tgctggactc ccagctcctc tgactactgc tagtgagcag ctctttacct 3540 agagacattg tttgaggctc tttctaagta ggtttagaga tgagagttac agaaatacga 3600 cacaggctgg gtacaggaca cagctgctaa gtaaagtcag gctcccgcag gcctacgagg 3660 tggaggcagg attagaagtt cagggtcatc ccagctacat ggtatgtctg tactagagaa 3720 aaaaaaaagg gcagaggtag ggggttggga agggagcaca gggtggtggt gatgctatga 3780 agatgggtta gtcagcagtg gttctcactc tgggctgtga cccactggct tggtggttga 3840 atggtgcatg ccggtaaggc tgacaagctt gagttctcgc cccaggattt acactgtgga 3900 cggggagaat tgacaccaga aagttgctgt gtggactcca caaatgtgcc ctggcgtgtg 3960 ctcacttgct tatataccct ctcacataca tgattaaata agcaaaatgt ttaaaaaaga 4020 acaaagaaga aaaccacagg agttggcgga cagcctgggt ttgcactatg tccctttctc 4080 taaacaaaac aaaaagcccc agaaaactaa acaataatgg cttcctttgc tttctgttgc 4140 tgtcataagc accataacca gacagtgtga gtaggaaaag gtttccacct gggctggggg 4200 tctgggccct gtaagaaagc aggctcttcg agccaggggg aacaggcagg ctgtgcgagc 4260 cgggggagcg ggccagtcag cagcaccctc catggcctgt gcatcagcag ctcctgcctc 4320 caggctccag ccttgattga gttcctgttc tggcttcttt cagtgacagt gatatggata 4380 tgtaagtcac gtaaccccct tcttctccaa cttgattttt ggttatggtg tttcatcaca 4440 gcagtagaaa cgccaagaca gcagggtttg gggacaggac tactaatgtg tccctgaagc 4500 ctaggagctc ttggaggtcc cactggggcc actggattcc ttactctggg 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ctt ctt cac ata ttc cct ttg gcg gga gca 387 Phe Val Leu Gly Val Asp Leu Leu His Ile Phe Pro Leu Ala Gly Ala 110 115 120 act ttt cta tgc cct gct gat gtg act gac ccc aga act ttc cag aag 435 Thr Phe Leu Cys Pro Ala Asp Val Thr Asp Pro Arg Thr Phe Gln Lys 125 130 135 att cta gaa ctg ctt ccc agc agg aga gca gat gtg att ctg agt gac 483 Ileu Glu Leu Leu Pro Ser Arg Arg Ala Asp Val Ile Leu Ser Asp 140 145 150 atg gca ccg aat gcc act ggg atc aga gac ctc gat cac gat aag ctc 531 Met Aag Pro Asn Ala Thr Gly Ile Arg Asp Leu Asp His Asp Lys Leu 155 160 165 170 atc agc ttg tgc ctt acc ctt gtg gac atg gct gtg gac atc ctg cat 579 Ile Ser Leu Cys Leu Thr Leu Val Asp Met Ala Val Asp Ile Leu His 175 180 185 ccc gga ggg aca ctg ctg tgt aaa acct gcc g ga agt aaa agc cac 627 Pro Gly Gly Thr Leu Leu Cys Lys Thr Trp Ala Gly Ser Lys Ser His 190 195 200 ctg ctg cag aag aga ctg acc cag gaa ttc cag agc aca agg gtg gtg 675 Leu Leu Gln Lys Arg Leu Thr Glu Phe Gln Ser Thr Arg Val Val 205 210 215 aaa ccg gag gcc agc 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atgcatcagc 2280 ttaccgccca ggtcccctct ccctctcatt tctgctccct actctctgta gtttccctgg 2340 tcttcccgac ctcaggcctg cccagtaccc cagttttcct ggtgggtttg aagctgctct 2400 ctagtccttc taccccttct ctccccagat tttccctggc accccactcc cgacctccag 2460 cgtctctccc gcacccagat ctcattcgcc cgggaccatc cataccttcg cgccccagcc 2520 aaagtttccc ggggcggagc ctcgcgttgg aagcgagggc gggacttccg gcggcgggag 2580 gaaaccacca gcaagcagca atggccgggt gagtgagtta cggcgtctgc ctgcgctaaa 2640 aggacgtctt tgcatacagg aacggagtgg atgacagtag tagggagctc agtgaattgt 2700 gttgcagagg ggtgctggcg acctccgtcc cggggagcgg gacacgggtg tacgatgttt 2760 attcatgtac agacgtgagt gagtgaggct tgcaacatag aaataggtgt atgggctccg 2820 tggataaagc tgtgcattcg ggaggattgg ggttcggatc cccagagcct acaaaatact 2880 ggacatgtgt gctgaccaaa tgtaacccca gtgctgggga ggcagagaaa aggggtccct 2940 ggagaaagct ggcgagatag actggcaggt tggcgacctt acatcaatac ataaggtaga 3000 gagcaagcga aggggacgtc ccttctctac tttggccccc catacacagg cagacacatg 3060 tgcacataca tgctaataca catgcgtgca tgcatatcgc acatacatat gcagaaacaa 3120 aaaggttgga accaagactt ctttggctct ctgtgtaatg cccacccgct aactcttttt 3180 tcgtcgtttc aggcatctga agctggtagg cgttcccctt aaggttcgga ggttacacac 3240 agcagtgtgt cactacaggg gccgggccgt cgctgagcac ctgtggctca cgcggcatct 3300 aaaggatccg tttgtgaagg ccgcaaaggt ggagagttac cgctgccgca gtgcctacaa 3360 actcctggag atgaatgaga agcatcagat cctgaggccc ggtctccggg tgctggactg 3420 cggcgcagct ccgggagcct ggagtcaggt ggcagtgcag cgcgtcaatg ccacaggcgc 3480 aggtgggacc tgctggactc ccagctcctc tgactactgc tagtgagcag ctctttacct 3540 agagacattg tttgaggctc tttctaagta ggtttagaga tgagagttac agaaatacga 3600 cacaggctgg gtacaggaca cagctgctaa gtaaagtcag gctcccgcag gcctacgagg 3660 tggaggcagg attagaagtt cagggtcatc ccagctacat ggtatgtctg tactagagaa 3720 aaaaa aaagg gcagaggtag ggggttggga agggagcaca gggtggtggt gatgctatga 3780 agatgggtta gtcagcagtg gttctcactc tgggctgtga cccactggct tggtggttga 3840 atggtgcatg ccggtaaggc tgacaagctt gagttctcgc cccaggattt acactgtgga 3900 cggggagaat tgacaccaga aagttgctgt gtggactcca caaatgtgcc ctggcgtgtg 3960 ctcacttgct tatataccct ctcacataca tgattaaata agcaaaatgt ttaaaaaaga 4020 acaaagaaga aaaccacagg agttggcgga cagcctgggt ttgcactatg tccctttctc 4080 taaacaaaac aaaaagcccc agaaaactaa acaataatgg cttcctttgc tttctgttgc 4140 tgtcataagc accataacca gacagtgtga gtaggaaaag gtttccacct gggctggggg 4200 tctgggccct gtaagaaagc aggctcttcg agccaggggg aacaggcagg ctgtgcgagc 4260 cgggggagcg ggccagtcag cagcaccctc catggcctgt gcatcagcag ctcctgcctc 4320 caggctccag ccttgattga gttcctgttc tggcttcttt cagtgacagt gatatggata 4380 tgtaagtcac gtaaccccct tcttctccaa cttgattttt ggttatggtg tttcatcaca 4440 gcagtagaaa cgccaagaca gcagggtttg gggacaggac tactaatgtg tccctgaagc 4500 ctaggagctc ttggaggtcc cactggggcc actggattcc ttactctggg aatgtgatag 4560 gctgtgtact gtgtgtgtat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgaaa 4620 tggtgcccaa ataggaaaga gaaaaatcga aaaaacagct gcatctgtga cattgcccag 4680 ctgtggtggc tatacctgtg accctagccc tctggaggta gagacaggag aaccaggaat 4740 cccaggcctg agtcacacag ttctcaaaga accaagagcc aaaaatgaag ggcttggctc 4800 tcagagagga ctcaagttca gttcccagca cccacatcag gcagccccta gcctccgtga 4860 tttcacatcc aggccttgaa ctgggcaggt acctgcactt gagtgcacat tcacacgata 4920 tgtaaataaa taatacatct ggaagacaaa acagtagagc atggtctcac atgcccttta 4980 gaggcagagg catcagttct ctgaatttga ggctagcctg ggctatatag tgagattgtc 5040 tcaaggaata aaaagcaaac aaacattaaa aaccaaaaag gattgttggg agctgggtat 5100 ggtggtgccc acctgtaacc tcgggtactc actgggttaa gtcaggaact tattatgttt 5160 tgggctagcc tgggctacct actaagattc ccattttaga accaacgcat actaaataaa 5220 ataaaaaatc atttggaaga agagtccttc ctgtgggagg ggagcctggg gtagtgaact 5280 gacagtgaag tgggattcag caccttggct gcggttcacc tcggcttgtc actctccacg 5340 atggcaaggc catttccttt ctaggtctca acttccccag ctatgccagg gggagtagag 5400 gacaccctac actcta ctac gtgtctttat ttatttactt atttttcaac tttgagagac 5460 gagatctcac ttggtagctc aaactagcct tgaacttgtg acagtcctcc cgcctcaggc 5520 tcccaaagtg ctgaggttat agcctgtgcc attattacat ctaactcatg tgccttcata 5580 ccaaaggtct tttgcgcaca tacatgcatg ggtgcctgac tgccttttgt gacttgtttt 5640 ttggtaggga gattcatggt ttaataacac attgtgttac ttccttagat tccagctctc 5700 ctgtgggctt tgtgcttggc gtcgatcttc ttcacatatt ccctttggcg ggagcaactt 5760 ttctatgccc tgctgatgtg actgacccca gaactttcca gaagattcta gaactgcttc 5820 ccagcaggag agcagatgtg attctgagtg acatggcacc gaatgccact gggatcagag 5880 acctcgatca cgataagctc atcagcttgt gccttaccct tgtggacatg gctgtggaca 5940 tcctgcatcc cggagggaca ctgctgtgta aaacctgggc cggaagtaaa agccacctgc 6000 tgcagaagag actgacccag gaattccaga gcacaagggt ggtgaaaccg gaggccagca 6060 ggaaagagtc ttcggaggtg tacctgttag ccacccagta ccgtgggggg aagggcacca 6120 ggaggccgtg agtctgccct gccattctgg gggtgcttcc ggaggagcgt ggattcaagc 6180 tgccttgtgg atatgaccag caccccaagg cacctctgct tttaaagaga taagcaaata 6240 ttttcaaggg ccgtgaaaaa g tgctaagaa tgggcagcgc catggcgcag tgaggaaagg 6300 gggattgctg ctaagcctga cagtctgagt gcagcatccg ggaccccaga gcagcgagag 6360 cgcgtgcacg cacacgcagg ctgcacacaa tatgaacaga tatattggta ctgttagttt 6420 ttggcaattt gtctgggaag aaagaatctg actgtggaat tcctccatcg gctcacaggc 6480 tgagccaggg agacattgat gagtgactga cgtggcaggg cccagccctg tgcgggtgct 6540 gccatccctt ggcaggtagc ctgagttgta tgagaaagcg gggtgagcag gactgaggaa 6600 caagccagtc atccataccc cactccccgt ctccagttgc tgctgcctcc aggttcccac 6660 cccgagaacc cactttgatt tccttcagtg atggactgtg gttgggatga gtgaggcaaa 6720 gaaacccttt ccttccaagg cttttaaatg ctgaaaacaa agcagtcttc tctatcatga 6780 ttttattttt ctggcttttg tttacttgtc tgtttgtgag gttgagtgtc actataaccc 6840 aggcaccta 6210 agcctcac tcgtcgtcacgtcctcgtcctacgtcaccacgtacct6210agtcctcaccgtacc synthetic DNA <400> 10 tgctctgtca ggtacctgtt g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 11 ctttgtt agg gttcttcttc 20
【００９３】[0093]
配列番号１：合成DNA 配列番号２：合成DNA 配列番号３：合成DNA 配列番号４：合成DNA 配列番号５：合成DNA 配列番号６：合成DNA 配列番号10：合成DNA 配列番号11：合成DNA SEQ ID NO: 1: Synthetic DNA SEQ ID NO: 2: Synthetic DNA SEQ ID NO: 3: Synthetic DNA SEQ ID NO: 4: Synthetic DNA SEQ ID NO: 5: Synthetic DNA SEQ ID NO: 10: Synthetic DNA SEQ ID NO: 11: Synthetic DNA
【図１】遺伝子部分とそれ以外の部分における両者の機
能解析の概念を示す図である。BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing the concept of functional analysis of both a gene part and other parts.
【図２】本発明のトラップベクターの構築法及び遺伝子
のトラップ法の概要を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing an outline of a method for constructing a trap vector and a method for trapping a gene of the present invention.
【図３】1oxPの構造を示す図である。FIG. 3 shows the structure of 1oxP.
【図４】lox71とlox66との組換えを示す図である。FIG. 4 shows the recombination of lox71 and lox66.
【図５】変異型loxPによるDNA断片の挿入を示す図であ
る。FIG. 5 is a diagram showing insertion of a DNA fragment by mutant loxP.
【図６Ａ】本発明のトラップベクターを示す図である。FIG. 6A shows a trap vector of the present invention.
【図６Ｂ】本発明のトラップベクターを示す図である。FIG. 6B is a diagram showing a trap vector of the present invention.
【図７】トラップベクターpU-8の構築図である。FIG. 7 is a construction diagram of a trap vector pU-8.
【図８】2段階の可変型遺伝子トラップ法を示す図であ
る。FIG. 8 is a diagram showing a two-stage variable gene trap method.
【図９】キメラ動物作製によるトラップ系統の樹立の概
要を示す図である。FIG. 9 is a diagram showing an outline of establishment of a trap line by producing a chimeric animal.
【図１０】5' RACE 産物のデータベースホモロジー検索
結果を示す模式図である。FIG. 10 is a schematic diagram showing a database homology search result of a 5 ′ RACE product.
１：矢印 1: Arrow
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 501267243 荒木 喜美 熊本県熊本市世安町55−２−1103 (72)発明者 井出 博之 福岡県福岡市中央区平尾４−10−11 (72)発明者 山村 研一 熊本県熊本市九品寺４−24−１ 熊本大学 発生医学研究センター内 (72)発明者 荒木 喜美 熊本県熊本市九品寺４−24−１ 熊本大学 発生医学研究センター内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA20 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA01 CA60 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (71) Applicant 501267243 Yoshimi Araki 55-2-1103, Seyacho, Kumamoto City, Kumamoto Prefecture (72) Inventor Hiroyuki Ide 4-10-11, Hirao, Chuo-ku, Fukuoka City, Fukuoka Prefecture (72) Inventor Kenichi Yamamura 4-24-1 Kuphinji Temple, Kumamoto City, Kumamoto Prefecture (72) Inventor Yoshimi Araki 4-24-1 Kupujiji Temple, Kumamoto City, Kumamoto Prefecture F-term (Reference) 4B024 AA20 BA80 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA20 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA01 CA60
Claims (13)
復配列２の順で構成される1oxP配列、又は該loxP配列の
うち逆反復配列１及び逆反復配列2の双方若しくはいず
れか一方の一部の配列に変異が導入された変異型1oxP配
列を含むトラップベクターを導入してなる胚幹細胞であ
って、配列番号７に示す遺伝子が破壊された胚幹細胞。1. A loxP sequence composed of an inverted repeat sequence 1, a spacer sequence and an inverted repeat sequence 2, or a part of both or one of the inverted repeat sequence 1 and the inverted repeat sequence 2 of the loxP sequence. An embryonic stem cell obtained by introducing a trap vector containing a mutant type 1oxP sequence in which a mutation has been introduced into the above sequence, wherein the gene shown in SEQ ID NO: 7 has been disrupted.
ある請求項１記載の胚幹細胞。2. The embryonic stem cell according to claim 1, wherein the loxP sequence is represented by SEQ ID NO: 3.
請求項1記載の胚幹細胞。3. The embryonic stem cell according to claim 1, wherein the mutant type 1oxP sequence is lox71 or lox66.
る請求項３記載の胚幹細胞。4. The embryonic stem cell according to claim 3, wherein 1ox71 is represented by SEQ ID NO: 1.
る請求項３記載の胚幹細胞。5. The embryonic stem cell according to claim 3, wherein 1ox66 is represented by SEQ ID NO: 2.
すものから選ばれるいずれかのものである請求項１〜５
のいずれかに記載の胚幹細胞。 (a) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (b) lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (c) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro-pA-lox511-PV (d) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (e) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (f) (lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-l
ox511 (g) (lox71が組み込まれたSA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272
-PV-lox511 (h) (lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-lox2272-プロ
モーター-M-lox511-SD (i) loxP-SA-IRES-M-pA-loxP-PV (j) loxP-SA-loxP-IRES-M-pA-loxP-PV (SAはスプライスアクセプターを、SDはスプライスドナ
ーを、IRESは分子内リボゾームエントリー部位を、Mは
マーカー遺伝子を、puroはピューロマイシン耐性遺伝子
を、pAはポリA配列を、PVはプラスミドベクターを表
す。)6. The trap vector according to claim 1, wherein the trap vector is any one selected from the following (a) to (j):
An embryonic stem cell according to any one of the above. (a) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (b) lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (c) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro -pA-lox511-PV (d) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (e) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (f) (SA incorporating lox71 ) -M-loxP-pA-lox2272-PV-l
ox511 (g) (SA incorporating lox71) -IRES-M-loxP-pA-lox2272
-PV-lox511 (h) (SA with lox71 incorporated) -M-loxP-pA-lox2272-promoter-M-lox511-SD (i) loxP-SA-IRES-M-pA-loxP-PV (j) loxP-SA-loxP-IRES-M-pA-loxP-PV (SA is a splice acceptor, SD is a splice donor, IRES is an intramolecular ribosome entry site, M is a marker gene, and puro is a puromycin resistance gene. , PA represents the poly A sequence, and PV represents the plasmid vector.)
復配列２の順で構成される1oxP配列、又は該loxP配列の
うち逆反復配列１及び逆反復配列2の双方若しくはいず
れか一方の一部の配列に変異が導入された変異型1oxP配
列を含むトラップベクターを導入してなるノックアウト
動物であって、配列番号７に示す遺伝子が破壊されたノ
ックアウト動物。7. A 1oxP sequence composed of an inverted repeat sequence 1, a spacer sequence and an inverted repeat sequence 2, or a part of both or one of the inverted repeat sequence 1 and the inverted repeat sequence 2 of the loxP sequence. A knockout animal obtained by introducing a trap vector containing a mutant type 1oxP sequence in which a mutation has been introduced into the sequence of SEQ ID NO: 7, wherein the gene shown in SEQ ID NO: 7 has been disrupted.
ある請求項７記載のノックアウト動物。8. The knockout animal according to claim 7, wherein the loxP sequence is represented by SEQ ID NO: 3.
請求項７記載のノックアウト動物。9. The knockout animal according to claim 7, wherein the mutant 1oxP sequence is lox71 or lox66.
ある請求項９記載のノックアウト動物。10. The knockout animal according to claim 9, wherein 1ox71 is represented by SEQ ID NO: 1.
ある請求項９記載のノックアウト動物。11. The knockout animal according to claim 9, wherein 1ox66 is represented by SEQ ID NO: 2.
示すものから選ばれるいずれかのものである請求項７〜
11のいずれかに記載のノックアウト動物。 (a) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (b) lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (c) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro-pA-lox511-PV (d) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (e) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (f) (lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-l
ox511 (g) (lox71が組み込まれたSA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272
-PV-lox511 (h) (lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-lox2272-プロ
モーター-M-lox511-SD (i) loxP-SA-IRES-M-pA-loxP-PV (j) loxP-SA-loxP-IRES-M-pA-loxP-PV (SAはスプライスアクセプターを、SDはスプライスドナ
ーを、IRESは分子内リボゾームエントリー部位を、Mは
マーカー遺伝子を、puroはピューロマイシン耐性遺伝子
を、pAはポリA配列を、PVはプラスミドベクターを表
す。)12. The trap vector according to claim 7, wherein the trap vector is any one selected from the following (a) to (j):
12. The knockout animal according to any one of 11 above. (a) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (b) lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV (c) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro -pA-lox511-PV (d) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (e) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511 (f) (SA incorporating lox71 ) -M-loxP-pA-lox2272-PV-l
ox511 (g) (SA incorporating lox71) -IRES-M-loxP-pA-lox2272
-PV-lox511 (h) (SA with lox71 incorporated) -M-loxP-pA-lox2272-promoter-M-lox511-SD (i) loxP-SA-IRES-M-pA-loxP-PV (j) loxP-SA-loxP-IRES-M-pA-loxP-PV (SA is a splice acceptor, SD is a splice donor, IRES is an intramolecular ribosome entry site, M is a marker gene, and puro is a puromycin resistance gene. , PA represents the poly A sequence, and PV represents the plasmid vector.)
ずれかに記載のノックアウト動物。13. The knockout animal according to claim 7, wherein the animal is a mouse.
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN110689923A (en) * | 2018-07-04 | 2020-01-14 | 赛业（广州）生物科技有限公司 | Automatic parallelization knockout strategy sequence repeatability analysis method and system thereof |
-
2001
- 2001-05-25 JP JP2001157568A patent/JP3713513B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN110689923A (en) * | 2018-07-04 | 2020-01-14 | 赛业（广州）生物科技有限公司 | Automatic parallelization knockout strategy sequence repeatability analysis method and system thereof |
| CN110689923B (en) * | 2018-07-04 | 2022-05-17 | 广州赛业百沐生物科技有限公司 | Automatic parallelization knockout strategy sequence repeatability analysis method and system thereof |
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