JP2002340902A - 微生物ないし微生物成分の測定方法およびこれに用いる測定キット - Google Patents
微生物ないし微生物成分の測定方法およびこれに用いる測定キットInfo
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- JP2002340902A JP2002340902A JP2001148641A JP2001148641A JP2002340902A JP 2002340902 A JP2002340902 A JP 2002340902A JP 2001148641 A JP2001148641 A JP 2001148641A JP 2001148641 A JP2001148641 A JP 2001148641A JP 2002340902 A JP2002340902 A JP 2002340902A
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料中の夾雑物の影響を受けることなく、ま
た、測定対象物の変異・多様性に関係なく微生物ないし
微生物成分を簡単に、しかも的確に測定する方法を提供
すること。 【解決手段】 検体と、微生物の外膜または細胞壁を構
成する多糖類に特異的に結合するタンパク質とを反応さ
せ、当該タンパク質に結合した上記多糖類を検出するこ
とを特徴とする検体中の微生物ないし微生物成分の測定
方法。
た、測定対象物の変異・多様性に関係なく微生物ないし
微生物成分を簡単に、しかも的確に測定する方法を提供
すること。 【解決手段】 検体と、微生物の外膜または細胞壁を構
成する多糖類に特異的に結合するタンパク質とを反応さ
せ、当該タンパク質に結合した上記多糖類を検出するこ
とを特徴とする検体中の微生物ないし微生物成分の測定
方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の外膜また
は細胞壁を構成する多糖類と特異的に結合するタンパク
質を利用した微生物または微生物成分の測定方法および
これに用いる測定キットに関するものである。
は細胞壁を構成する多糖類と特異的に結合するタンパク
質を利用した微生物または微生物成分の測定方法および
これに用いる測定キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】医療や食品等の分野では、ヒト等に対す
る安全性を確保するため、微生物の存在の有無を確認
し、汚染を避けることが必要不可欠であり、そのために
適切な検査を行うことが要求されている。それ故に微生
物検査は、医療現場での診断、医薬品等の安全性試験、
製造現場での水や食品等の検査等、幅広い分野で行われ
ている。
る安全性を確保するため、微生物の存在の有無を確認
し、汚染を避けることが必要不可欠であり、そのために
適切な検査を行うことが要求されている。それ故に微生
物検査は、医療現場での診断、医薬品等の安全性試験、
製造現場での水や食品等の検査等、幅広い分野で行われ
ている。
【０００３】また一方、生きている微生物だけでなく、
微生物を構成するいくつかの多糖類もそれ自身種々の生
物活性を有することが知られており、疾患との関係につ
いても議論されている（Lisa, Vol.6,No.9,pp854-858,1
999）。従って、このような物質に対する汚染をさける
ことも重要である。
微生物を構成するいくつかの多糖類もそれ自身種々の生
物活性を有することが知られており、疾患との関係につ
いても議論されている（Lisa, Vol.6,No.9,pp854-858,1
999）。従って、このような物質に対する汚染をさける
ことも重要である。
【０００４】例えば、グラム陰性菌表層に存在する外膜
を構成する多糖類の１つであるリポ多糖（以下、「ＬＰ
Ｓ」という）は、リピドＡと呼ばれる脂質とこれに共有
結合した多糖により構成されるものであるが、内毒素と
して凝固繊溶系の反応促進、アジュバンド作用・マイト
ジェン活性など免疫系への影響、血小板・白血球減少、
ショック等循環系への影響、シュワルツマン（Shwartzm
an）反応、発熱等様々な生物活性を示すことが知られて
いる。
を構成する多糖類の１つであるリポ多糖（以下、「ＬＰ
Ｓ」という）は、リピドＡと呼ばれる脂質とこれに共有
結合した多糖により構成されるものであるが、内毒素と
して凝固繊溶系の反応促進、アジュバンド作用・マイト
ジェン活性など免疫系への影響、血小板・白血球減少、
ショック等循環系への影響、シュワルツマン（Shwartzm
an）反応、発熱等様々な生物活性を示すことが知られて
いる。
【０００５】また、酵母・カビ・キノコ等の真菌類の細
胞壁を構成する多糖類の１つであるβ−１,３−グルカ
ン（以下、「βＧ」という）は多様な構造を持ち、マク
ロファージからの各種サイトカインの産生誘導、補体の
活性化、抗腫瘍活性、アレルゲンとしての作用、ＬＰＳ
の生理作用の増強等、種々の生物活性を示すことが知ら
れている。
胞壁を構成する多糖類の１つであるβ−１,３−グルカ
ン（以下、「βＧ」という）は多様な構造を持ち、マク
ロファージからの各種サイトカインの産生誘導、補体の
活性化、抗腫瘍活性、アレルゲンとしての作用、ＬＰＳ
の生理作用の増強等、種々の生物活性を示すことが知ら
れている。
【０００６】更に、大部分の原核生物の細胞壁を構成す
る多糖類の一つであるペプチドグリカン（以下、「Ｐ
Ｇ」という）はＮ−アセチルムラミン酸またはＮ−グル
コリルムラミン酸とＤ−アミノ酸を含む糖ペプチドのポ
リマーであるが、このものもβＧやＬＰＳと同様にマク
ロファージ、Ｔリンパ球およびＢリンパ球等の免疫応答
細胞に対する種々の作用を有する。具体的には血小板の
破壊、繊維芽細胞の増殖促進、骨吸収の促進、補体の活
性化、体液性免疫反応の増進または抑制、細胞性免疫の
増強、細胞内皮系の刺激、一過性の白血球減少およびそ
の後の増加、インターフェロン誘導因子の作用増強、自
然抵抗力の強化、発熱誘導、ＬＰＳに対する感受性向上
等の作用を有することが知られている。
る多糖類の一つであるペプチドグリカン（以下、「Ｐ
Ｇ」という）はＮ−アセチルムラミン酸またはＮ−グル
コリルムラミン酸とＤ−アミノ酸を含む糖ペプチドのポ
リマーであるが、このものもβＧやＬＰＳと同様にマク
ロファージ、Ｔリンパ球およびＢリンパ球等の免疫応答
細胞に対する種々の作用を有する。具体的には血小板の
破壊、繊維芽細胞の増殖促進、骨吸収の促進、補体の活
性化、体液性免疫反応の増進または抑制、細胞性免疫の
増強、細胞内皮系の刺激、一過性の白血球減少およびそ
の後の増加、インターフェロン誘導因子の作用増強、自
然抵抗力の強化、発熱誘導、ＬＰＳに対する感受性向上
等の作用を有することが知られている。
【０００７】従って製造・医療現場においてはこのよう
な微生物や、これら微生物の成分の存在を的確に検出
し、それらの混入を防ぐことが強く要求され、一部義務
付けられている。
な微生物や、これら微生物の成分の存在を的確に検出
し、それらの混入を防ぐことが強く要求され、一部義務
付けられている。
【０００８】ところで、現在、微生物あるいは微生物由
来の物質を測定する方法として、これらに対する抗体を
用いて測定する方法が知られている。しかしこの方法
は、免疫源として使用した微生物や微生物成分に対して
は、感度の高い測定が可能であるが、その反面、抗体が
厳密に抗原を識別するために、免疫源とした微生物以外
の微生物や免疫源とした微生物であっても抗原の変異が
あった場合、これを検出することができない可能性は高
い。
来の物質を測定する方法として、これらに対する抗体を
用いて測定する方法が知られている。しかしこの方法
は、免疫源として使用した微生物や微生物成分に対して
は、感度の高い測定が可能であるが、その反面、抗体が
厳密に抗原を識別するために、免疫源とした微生物以外
の微生物や免疫源とした微生物であっても抗原の変異が
あった場合、これを検出することができない可能性は高
い。
【０００９】また、微生物の検出には培養法やＰＣＲ法
等も利用されている。このうち、培養法では微生物の検
出に時間がかかり、さらに培地の選択や条件によっては
目的微生物の増殖が起きず、検出できないことがある。
また、ＰＣＲ法では特定の遺伝子配列しか増幅できない
ため、公知の特定の微生物しか測定できないといった問
題点がある。更に、それらの方法の大半は、生きた微生
物そのものを測定する方法であり、微生物成分を検出す
る場合には使用できない。
等も利用されている。このうち、培養法では微生物の検
出に時間がかかり、さらに培地の選択や条件によっては
目的微生物の増殖が起きず、検出できないことがある。
また、ＰＣＲ法では特定の遺伝子配列しか増幅できない
ため、公知の特定の微生物しか測定できないといった問
題点がある。更に、それらの方法の大半は、生きた微生
物そのものを測定する方法であり、微生物成分を検出す
る場合には使用できない。
【００１０】このようなことから、現在、微生物の外膜
や細胞壁を構成する多糖類であるＬＰＳや、βＧあるい
はＰＧを測定することにより、微生物の存在等を検出す
ることが行われている。
や細胞壁を構成する多糖類であるＬＰＳや、βＧあるい
はＰＧを測定することにより、微生物の存在等を検出す
ることが行われている。
【００１１】このうち、ＬＰＳおよびβＧの測定に関し
ては、カブトガニ血球抽出物を利用したリムルス試薬が
利用されている。このリムルス試薬を用いた測定法は、
簡便で高感度な測定法であるが、カブトガニ血球抽出液
中の生体防御反応の１つである血液凝固カスケード機構
を利用しているため、プロテアーゼやプロテアーゼ阻害
剤、タンパク変性剤、キレート剤、金属イオン、強酸・
強アルカリ等の、測定に干渉する因子が多く、これらを
除去、または試料の希釈による調製をおこなわなくては
ならないという問題があった。
ては、カブトガニ血球抽出物を利用したリムルス試薬が
利用されている。このリムルス試薬を用いた測定法は、
簡便で高感度な測定法であるが、カブトガニ血球抽出液
中の生体防御反応の１つである血液凝固カスケード機構
を利用しているため、プロテアーゼやプロテアーゼ阻害
剤、タンパク変性剤、キレート剤、金属イオン、強酸・
強アルカリ等の、測定に干渉する因子が多く、これらを
除去、または試料の希釈による調製をおこなわなくては
ならないという問題があった。
【００１２】更に、ＰＧやβＧの測定に関しては、蚕体
液を用いる方法が報告されている（FEMS Immunology an
d Medical Microbiology, 15, 129-134, 1996.）。この
方法は、蚕体液中に存在するプロテアーゼカスケード
が、ＰＧやβＧによって活性化することを利用した方法
であり、活性化したカスケードにより最終的に生じるメ
ラニンを測ることにより、ＰＧやβＧを定量するもので
ある。そして、この原理を利用した製品がすでに市販さ
れているが、この試薬は、試料中の塩濃度の影響を受け
やすく、また、多くの場合試料中にＰＧとβＧが共に存
在するが、このような場合、どちらの検体に対しても同
様に反応するため、両者を合わせた測定値しか得られな
い、すなわちＰＧのみを測定することができないという
問題があった。
液を用いる方法が報告されている（FEMS Immunology an
d Medical Microbiology, 15, 129-134, 1996.）。この
方法は、蚕体液中に存在するプロテアーゼカスケード
が、ＰＧやβＧによって活性化することを利用した方法
であり、活性化したカスケードにより最終的に生じるメ
ラニンを測ることにより、ＰＧやβＧを定量するもので
ある。そして、この原理を利用した製品がすでに市販さ
れているが、この試薬は、試料中の塩濃度の影響を受け
やすく、また、多くの場合試料中にＰＧとβＧが共に存
在するが、このような場合、どちらの検体に対しても同
様に反応するため、両者を合わせた測定値しか得られな
い、すなわちＰＧのみを測定することができないという
問題があった。
【００１３】上記方法については、ＰＧを特異的に測定
するために、蚕体液中よりβＧに反応する成分を除去
し、ＰＧと特異的に反応する成分のみを用いる方法が報
告されている（特公平７−１１４７０７号公報）。しか
しこの方法では、作業中に外部環境からのＰＧやβＧの
混入がおきやすいこと、蚕体液中の反応系を構成する酵
素の活性の低下がおきやすいこと、アフィニティクロマ
トグラフィ中にβＧに反応する系が活性化してしまう可
能性が高いこと等の欠点がある。またこれ以外の方法と
して、βＧ認識タンパク質抗体等を用いてβＧに反応す
る系を除去する方法やβＧを試料から除去する方法（特
開平１１−１９６８９５号公報）、特定構造を有するポ
リ(１→３)グルコシド等、βＧに対する反応系を阻害す
る糖化合物を利用する方法（特開平１１−２５５８０５
号公報）等が報告されているが、いずれも調製作業中
に、外部環境からのＰＧやβＧの混入を完全に防ぐこと
は困難である。すなわち、試薬調製におけるＰＧやβＧ
のわずかな混入であっても、反応系の活性化が起こるた
め、その結果、ＰＧに対する反応性が低下し、しかもそ
の程度が一定でないため測定値の再現性を得ることが難
しい可能性が高い。
するために、蚕体液中よりβＧに反応する成分を除去
し、ＰＧと特異的に反応する成分のみを用いる方法が報
告されている（特公平７−１１４７０７号公報）。しか
しこの方法では、作業中に外部環境からのＰＧやβＧの
混入がおきやすいこと、蚕体液中の反応系を構成する酵
素の活性の低下がおきやすいこと、アフィニティクロマ
トグラフィ中にβＧに反応する系が活性化してしまう可
能性が高いこと等の欠点がある。またこれ以外の方法と
して、βＧ認識タンパク質抗体等を用いてβＧに反応す
る系を除去する方法やβＧを試料から除去する方法（特
開平１１−１９６８９５号公報）、特定構造を有するポ
リ(１→３)グルコシド等、βＧに対する反応系を阻害す
る糖化合物を利用する方法（特開平１１−２５５８０５
号公報）等が報告されているが、いずれも調製作業中
に、外部環境からのＰＧやβＧの混入を完全に防ぐこと
は困難である。すなわち、試薬調製におけるＰＧやβＧ
のわずかな混入であっても、反応系の活性化が起こるた
め、その結果、ＰＧに対する反応性が低下し、しかもそ
の程度が一定でないため測定値の再現性を得ることが難
しい可能性が高い。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑みなされたものであり、試料中の夾雑物の影響を受け
ることなく、また、測定対象物の変異・多様性に関係な
く微生物ないし微生物成分を簡単に、しかも的確に測定
する方法を提供することを課題とするものである。
鑑みなされたものであり、試料中の夾雑物の影響を受け
ることなく、また、測定対象物の変異・多様性に関係な
く微生物ないし微生物成分を簡単に、しかも的確に測定
する方法を提供することを課題とするものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、まず微生
物の検出方法について検討を行った結果、微生物の外膜
または細胞壁を構成する多糖類と特異的に結合するタン
パク質を測定系に組み込むことにより、従来の方法に比
べ微生物の存在を的確に検出できることを見出した。ま
た、この方法は、生きている微生物のみならず、微生物
成分の存在をも検出できることを見出し、本発明を完成
するに至った。
物の検出方法について検討を行った結果、微生物の外膜
または細胞壁を構成する多糖類と特異的に結合するタン
パク質を測定系に組み込むことにより、従来の方法に比
べ微生物の存在を的確に検出できることを見出した。ま
た、この方法は、生きている微生物のみならず、微生物
成分の存在をも検出できることを見出し、本発明を完成
するに至った。
【００１６】すなわち本発明は、検体と、微生物の外膜
または細胞壁を構成する多糖類に特異的に結合するタン
パク質とを反応させ、当該タンパク質に結合した上記多
糖類を検出することを特徴とする検体中の微生物ないし
微生物成分の測定方法を提供するものである。
または細胞壁を構成する多糖類に特異的に結合するタン
パク質とを反応させ、当該タンパク質に結合した上記多
糖類を検出することを特徴とする検体中の微生物ないし
微生物成分の測定方法を提供するものである。
【００１７】また本発明は、微生物の外膜または細胞壁
を構成する多糖類に特異的に結合するタンパク質を固定
化した固相と、検体とを反応させ、次いで固相上で上記
タンパク質と結合した微生物の外膜または細胞壁を構成
する多糖類を、標識物質で標識された微生物の外膜また
は細胞壁を構成する多糖類に特異的に結合するタンパク
質で検出することを特徴とする検体中の微生物ないし微
生物成分の測定方法を提供するものである。
を構成する多糖類に特異的に結合するタンパク質を固定
化した固相と、検体とを反応させ、次いで固相上で上記
タンパク質と結合した微生物の外膜または細胞壁を構成
する多糖類を、標識物質で標識された微生物の外膜また
は細胞壁を構成する多糖類に特異的に結合するタンパク
質で検出することを特徴とする検体中の微生物ないし微
生物成分の測定方法を提供するものである。
【００１８】更に本発明は、次の成分（ａ）および
（ｂ）、 （ａ）微生物の外膜または細胞壁を構成する多糖類に特
異的に結合するタンパク質が固定化された固相 （ｂ）標識物質で標識された微生物の外膜または細胞壁
を構成する多糖類に特異的に結合するタンパク質 を含む微生物または微生物成分の測定キットを提供する
ものである。
（ｂ）、 （ａ）微生物の外膜または細胞壁を構成する多糖類に特
異的に結合するタンパク質が固定化された固相 （ｂ）標識物質で標識された微生物の外膜または細胞壁
を構成する多糖類に特異的に結合するタンパク質 を含む微生物または微生物成分の測定キットを提供する
ものである。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明は、微生物ないしは微生物
成分を検出すべき検体に、微生物の外膜または細胞壁を
構成する多糖類（以下、「膜多糖類」という）に特異的
に結合するタンパク質（以下、「特異結合タンパク質」
という）を反応させ、特異結合タンパク質と膜多糖類が
結合してできた複合体を検出することにより実施され
る。
成分を検出すべき検体に、微生物の外膜または細胞壁を
構成する多糖類（以下、「膜多糖類」という）に特異的
に結合するタンパク質（以下、「特異結合タンパク質」
という）を反応させ、特異結合タンパク質と膜多糖類が
結合してできた複合体を検出することにより実施され
る。
【００２０】本発明において用いられる特異結合タンパ
ク質としては、微生物の外膜または細胞壁を構成する多
糖類を認識し、これと安定な結合体を形成できるタンパ
ク質をいう。この特異結合タンパク質としては、大部分
の原核生物の細胞壁を構成するＰＧと特異的に結合する
ペプチドグリカン認識タンパク質（以下、「ＰＧＲＰ」
という）、グラム陰性菌の外膜を構成するＬＰＳと特異
的に結合するＬＰＳ結合タンパク質（Eur.J.Biochem. V
ol.1248, pp.217-224, 1997.）、真菌類の細胞壁を構成
するβＧと特異的に結合するβＧ認識タンパク質（The
Journal of Biological Chemistry Vol.263, No24, pp.
12056-12062, 1988.）等が挙げられる。
ク質としては、微生物の外膜または細胞壁を構成する多
糖類を認識し、これと安定な結合体を形成できるタンパ
ク質をいう。この特異結合タンパク質としては、大部分
の原核生物の細胞壁を構成するＰＧと特異的に結合する
ペプチドグリカン認識タンパク質（以下、「ＰＧＲＰ」
という）、グラム陰性菌の外膜を構成するＬＰＳと特異
的に結合するＬＰＳ結合タンパク質（Eur.J.Biochem. V
ol.1248, pp.217-224, 1997.）、真菌類の細胞壁を構成
するβＧと特異的に結合するβＧ認識タンパク質（The
Journal of Biological Chemistry Vol.263, No24, pp.
12056-12062, 1988.）等が挙げられる。
【００２１】上記した特異結合タンパク質はいずれも公
知のものであり、例えばＰＧＲＰの製造方法としては、
蚕体液から精製する方法（The Journal of Biological
Chemistry Vol.271, No.23, pp.13854-13860, 199
6.）、組換え体を用い生産する方法（特開平10-179171
号）等が報告されているが、特にこれらに制約されるも
のでなく、結合タンパク質を製造可能な方法であればい
ずれの方法であっても良い。
知のものであり、例えばＰＧＲＰの製造方法としては、
蚕体液から精製する方法（The Journal of Biological
Chemistry Vol.271, No.23, pp.13854-13860, 199
6.）、組換え体を用い生産する方法（特開平10-179171
号）等が報告されているが、特にこれらに制約されるも
のでなく、結合タンパク質を製造可能な方法であればい
ずれの方法であっても良い。
【００２２】上記の特異結合タンパク質の製造方法のう
ち、特に好ましい方法としては、組換えバキュロウイル
スをカイコに感染させることにより組換え特異結合タン
パク質を発現させ、体液を回収、精製する方法である。
この場合比較的少量の材料から必要量の特異結合タンパ
ク質を得ることが可能となる。また、上記のようにして
得られた特異結合タンパク質の精製方法としては、例え
ばアフィニティカラムを用いた方法（The Journal of B
iological Chemistry Vol.271, No.23, pp.13854-1386
0, 1996.）が利用できるが、結合タンパク質を精製可能
な方法であれば特に制限されるものでない。
ち、特に好ましい方法としては、組換えバキュロウイル
スをカイコに感染させることにより組換え特異結合タン
パク質を発現させ、体液を回収、精製する方法である。
この場合比較的少量の材料から必要量の特異結合タンパ
ク質を得ることが可能となる。また、上記のようにして
得られた特異結合タンパク質の精製方法としては、例え
ばアフィニティカラムを用いた方法（The Journal of B
iological Chemistry Vol.271, No.23, pp.13854-1386
0, 1996.）が利用できるが、結合タンパク質を精製可能
な方法であれば特に制限されるものでない。
【００２３】本発明の測定方法において、特に好ましい
方法の例としては、特異結合タンパク質を固相表面に固
定化し、これに検体中の膜多糖類を結合させて得られた
複合体に、さらに検出用の特異結合タンパク質を結合さ
せる測定法（以下、「サンドイッチ測定法」という）が
挙げられる。このサンドイッチ測定法は、抗体を用いる
測定方法において広く使われる方法であるが、その場合
は、通常、固定化する抗体と、検出用の抗体は異なるエ
ピトープを認識するものである必要がある。しかしなが
ら、本発明方法では、測定対象物である膜多糖類がポリ
マー状の繰り返し構造、または多数の特定構造を有する
ものであるから、この特定単位を認識する特異結合タン
パク質を用いることにより、１つの特異結合タンパク質
のみでサンドイッチ測定法が可能となる。
方法の例としては、特異結合タンパク質を固相表面に固
定化し、これに検体中の膜多糖類を結合させて得られた
複合体に、さらに検出用の特異結合タンパク質を結合さ
せる測定法（以下、「サンドイッチ測定法」という）が
挙げられる。このサンドイッチ測定法は、抗体を用いる
測定方法において広く使われる方法であるが、その場合
は、通常、固定化する抗体と、検出用の抗体は異なるエ
ピトープを認識するものである必要がある。しかしなが
ら、本発明方法では、測定対象物である膜多糖類がポリ
マー状の繰り返し構造、または多数の特定構造を有する
ものであるから、この特定単位を認識する特異結合タン
パク質を用いることにより、１つの特異結合タンパク質
のみでサンドイッチ測定法が可能となる。
【００２４】固相化に用いる担体としては、膜多糖類と
結合能をもつ特異結合タンパク質を十分量固定化できる
物であれば特に制限されず、担体として通常用いられる
物質を原料としたプレート、メンブレン、チューブ、ビ
ーズ、ゲル等の形状のものが使用可能である。また、固
相化方法としては、膜多糖類と結合能をもつ特異結合タ
ンパク質を十分量固定化できる方法であれば特に制限さ
れず、直接担体に固相化する方法、スペーサーを用いる
方法、抗体を介して結合させる方法等が何れも使用可能
である。
結合能をもつ特異結合タンパク質を十分量固定化できる
物であれば特に制限されず、担体として通常用いられる
物質を原料としたプレート、メンブレン、チューブ、ビ
ーズ、ゲル等の形状のものが使用可能である。また、固
相化方法としては、膜多糖類と結合能をもつ特異結合タ
ンパク質を十分量固定化できる方法であれば特に制限さ
れず、直接担体に固相化する方法、スペーサーを用いる
方法、抗体を介して結合させる方法等が何れも使用可能
である。
【００２５】しかしながら、特異結合タンパク質の特性
を最大限に引き出しうる固相材料としては、担体表面に
共有結合用の官能基を有するものが好ましく、特に特異
結合タンパク質としてＰＧＲＰを使用する場合、担体表
面にカルボキシル基を有するものが好ましく、例えばＥ
ＬＩＳＡ用プレートカルボ（住友ベークライト製）等の
使用が特に好ましい。また、この固相に対する結合方法
としても、カルボジイミドを縮合剤として用いる方法を
用いることによりより好ましい結果が得られる。
を最大限に引き出しうる固相材料としては、担体表面に
共有結合用の官能基を有するものが好ましく、特に特異
結合タンパク質としてＰＧＲＰを使用する場合、担体表
面にカルボキシル基を有するものが好ましく、例えばＥ
ＬＩＳＡ用プレートカルボ（住友ベークライト製）等の
使用が特に好ましい。また、この固相に対する結合方法
としても、カルボジイミドを縮合剤として用いる方法を
用いることによりより好ましい結果が得られる。
【００２６】上記した固相に固定化した特異結合タンパ
ク質に、膜多糖類を結合させて複合体を形成させるに
は、これに先立ち、夾雑物が非特異的に固相や結合タン
パク質に吸着することを防ぐために、予め固相に対しブ
ロッキング処理をおこなうことが好ましい。この段階で
のブロッキング処理に用いる溶液（以下、「第１ブロッ
ク剤」という）に含まれるブロック体としては、夾雑物
の非特異的吸着を可能な限り防ぎ、かつ結合タンパク質
と微生物成分との結合を阻害しない性質を有するものが
利用される。このような第１ブロック剤中のブロック体
の例としては、血清タンパク質、カゼインやスキムミル
ク等の乳成分タンパク質、ゼラチンが挙げられる。な
お、このブロック剤は測定に使用される結合タンパク質
および測定対象物となる微生物成分の種類によって異な
るものであり、それに応じてブロック体も選択しなけれ
ばならない。具体的に結合タンパク質としてＰＧＲＰを
使用してペプチドグリカンを測定する場合には、第１ブ
ロック剤に含まれるブロック体としては牛血清アルブミ
ン等の血清アルブミンが好ましい。
ク質に、膜多糖類を結合させて複合体を形成させるに
は、これに先立ち、夾雑物が非特異的に固相や結合タン
パク質に吸着することを防ぐために、予め固相に対しブ
ロッキング処理をおこなうことが好ましい。この段階で
のブロッキング処理に用いる溶液（以下、「第１ブロッ
ク剤」という）に含まれるブロック体としては、夾雑物
の非特異的吸着を可能な限り防ぎ、かつ結合タンパク質
と微生物成分との結合を阻害しない性質を有するものが
利用される。このような第１ブロック剤中のブロック体
の例としては、血清タンパク質、カゼインやスキムミル
ク等の乳成分タンパク質、ゼラチンが挙げられる。な
お、このブロック剤は測定に使用される結合タンパク質
および測定対象物となる微生物成分の種類によって異な
るものであり、それに応じてブロック体も選択しなけれ
ばならない。具体的に結合タンパク質としてＰＧＲＰを
使用してペプチドグリカンを測定する場合には、第１ブ
ロック剤に含まれるブロック体としては牛血清アルブミ
ン等の血清アルブミンが好ましい。
【００２７】このようにして得られた、特異結合タンパ
ク質を固定化した固相に、膜多糖類を結合させて複合体
を形成させる方法は特に制約はなく、例えば、いくつか
のウエルを有するプレート状固相の各ウエルに検体液を
加えたり、逆に粒状の固相を検体液中に加える方法等が
挙げられる。また、測定すべき場所を拭った綿棒等を検
体とし、これを固相上に写し取ったり、検体を適当な溶
液に懸濁して用いてもよい。なお、その後非結合の夾雑
物を適当な洗浄液を使用し、洗浄することにより除去す
ることが好ましい。この過程により、測定の対象である
微生物成分のみを特異的に固相に結合させることが可能
となる。
ク質を固定化した固相に、膜多糖類を結合させて複合体
を形成させる方法は特に制約はなく、例えば、いくつか
のウエルを有するプレート状固相の各ウエルに検体液を
加えたり、逆に粒状の固相を検体液中に加える方法等が
挙げられる。また、測定すべき場所を拭った綿棒等を検
体とし、これを固相上に写し取ったり、検体を適当な溶
液に懸濁して用いてもよい。なお、その後非結合の夾雑
物を適当な洗浄液を使用し、洗浄することにより除去す
ることが好ましい。この過程により、測定の対象である
微生物成分のみを特異的に固相に結合させることが可能
となる。
【００２８】次に、固相に固定化された特異結合タンパ
ク質と結合した膜多糖類を検出するために、標識物質で
標識された結合タンパク質（以下、「標識結合タンパク
質」という）を加え、反応させる。この標識結合タンパ
ク質に用いられる標識物質としては、結合タンパク質の
結合機能を阻害することなく、膜多糖類を検出するため
に使用可能なものであれば特に制限されず種々のものが
使用されるが、微量でも感度よく検出が可能な標識物質
を選択することにより、高感度な測定が可能となる。こ
のような標識物質の例としては、酵素免疫測定法に用い
られるアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、
β-ガラクトシダーゼ等の酵素、放射性同位元素、ＧＦ
Ｐ、フルオレセイン等の蛍光物質、ルシフェラーゼ等の
発光剤等が挙げられる。上記標識物質は複数組み合わせ
てもよい。なお、標識物質の結合タンパク質への結合方
法は既知のタンパク質への結合方法を用いればよい。無
論、標識物質を直接結合させる方法ではなく、例えばビ
オチン等を特異結合タンパク質に結合させ、アビジン等
と結合した標識物質をそれに結合させるような間接的な
結合方法を用いても構わない。
ク質と結合した膜多糖類を検出するために、標識物質で
標識された結合タンパク質（以下、「標識結合タンパク
質」という）を加え、反応させる。この標識結合タンパ
ク質に用いられる標識物質としては、結合タンパク質の
結合機能を阻害することなく、膜多糖類を検出するため
に使用可能なものであれば特に制限されず種々のものが
使用されるが、微量でも感度よく検出が可能な標識物質
を選択することにより、高感度な測定が可能となる。こ
のような標識物質の例としては、酵素免疫測定法に用い
られるアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、
β-ガラクトシダーゼ等の酵素、放射性同位元素、ＧＦ
Ｐ、フルオレセイン等の蛍光物質、ルシフェラーゼ等の
発光剤等が挙げられる。上記標識物質は複数組み合わせ
てもよい。なお、標識物質の結合タンパク質への結合方
法は既知のタンパク質への結合方法を用いればよい。無
論、標識物質を直接結合させる方法ではなく、例えばビ
オチン等を特異結合タンパク質に結合させ、アビジン等
と結合した標識物質をそれに結合させるような間接的な
結合方法を用いても構わない。
【００２９】この標識結合タンパク質を固相に添加する
に当たり、標識結合タンパク質が固相や固定化された結
合タンパク質に吸着するのを防ぐため、これと同時に非
特異吸着を阻害するブロック剤（以下、「第２ブロック
剤」という）を添加することが好ましく、これにより、
高感度の測定が可能となる。このような第２ブロック剤
に含まれるブロック体の例としては、血清タンパク質、
カゼイン、スキムミルク等の乳成分タンパク質、ゼラチ
ンが挙げられる。なお、この第２ブロック剤は、測定対
象物となる膜多糖類および測定に使用される結合タンパ
ク質の種類によって異なるものであり、それに応じてブ
ロック体も選択しなければならない。具体的に、結合タ
ンパク質としてＰＧＲＰを使用してＰＧを測定する場合
には、第２ブロック剤に含まれるブロック体としてカゼ
インやスキムミルク等の乳成分タンパク質を使用するこ
とが好ましい。
に当たり、標識結合タンパク質が固相や固定化された結
合タンパク質に吸着するのを防ぐため、これと同時に非
特異吸着を阻害するブロック剤（以下、「第２ブロック
剤」という）を添加することが好ましく、これにより、
高感度の測定が可能となる。このような第２ブロック剤
に含まれるブロック体の例としては、血清タンパク質、
カゼイン、スキムミルク等の乳成分タンパク質、ゼラチ
ンが挙げられる。なお、この第２ブロック剤は、測定対
象物となる膜多糖類および測定に使用される結合タンパ
ク質の種類によって異なるものであり、それに応じてブ
ロック体も選択しなければならない。具体的に、結合タ
ンパク質としてＰＧＲＰを使用してＰＧを測定する場合
には、第２ブロック剤に含まれるブロック体としてカゼ
インやスキムミルク等の乳成分タンパク質を使用するこ
とが好ましい。
【００３０】更に、各過程間においては夾雑物等を排除
するためにＴｗｅｅｎ−２０（和光純薬工業製）等の界
面活性剤を含むリン酸緩衝溶液で洗浄を行うのが好まし
い。
するためにＴｗｅｅｎ−２０（和光純薬工業製）等の界
面活性剤を含むリン酸緩衝溶液で洗浄を行うのが好まし
い。
【００３１】最後に、標識結合タンパク質の量を測定す
ることにより、固相に結合した膜多糖類の量を測定し、
微生物ないしは微生物成分の存在を検出する。本発明の
測定方法において、膜多糖類の量の測定は、標識結合タ
ンパク質の標識物質の測定により行われ、これに用いら
れる測定装置は、分光光度計、マイクロプレートリーダ
ー、液体シンチレーションカウンター、蛍光分光光度計
およびルミノメーター等、標識物質にあわせて適宜選
択、使用可能である。また、標識物質として蛍光物質や
発光物質を使用した場合、顕微鏡下での微生物ないしは
微生物成分の性状の確認も可能となる。
ることにより、固相に結合した膜多糖類の量を測定し、
微生物ないしは微生物成分の存在を検出する。本発明の
測定方法において、膜多糖類の量の測定は、標識結合タ
ンパク質の標識物質の測定により行われ、これに用いら
れる測定装置は、分光光度計、マイクロプレートリーダ
ー、液体シンチレーションカウンター、蛍光分光光度計
およびルミノメーター等、標識物質にあわせて適宜選
択、使用可能である。また、標識物質として蛍光物質や
発光物質を使用した場合、顕微鏡下での微生物ないしは
微生物成分の性状の確認も可能となる。
【００３２】以上説明した本発明の測定方法を容易に実
施するために、微生物成分の測定キットを利用すること
ができる。この検出キットの一例としては、次の組み合
わせよりなるものを挙げることができる。
施するために、微生物成分の測定キットを利用すること
ができる。この検出キットの一例としては、次の組み合
わせよりなるものを挙げることができる。
【００３３】成分（ａ）および（ｂ）、 （ａ）微生物の外膜または細胞壁を構成する多糖類に特
異的に結合するタンパク質が固定化された固相 （ｂ）標識物質で標識された微生物の外膜または細胞壁
を構成する多糖類に特異的に結合するタンパク質 を含む微生物または微生物成分の測定キット。
異的に結合するタンパク質が固定化された固相 （ｂ）標識物質で標識された微生物の外膜または細胞壁
を構成する多糖類に特異的に結合するタンパク質 を含む微生物または微生物成分の測定キット。
【００３４】このキットには、更に上記第１および第２
のブロック剤や、適当な界面活性剤を含むリン酸緩衝溶
液等を追加することもできる。
のブロック剤や、適当な界面活性剤を含むリン酸緩衝溶
液等を追加することもできる。
【００３５】本発明方法を実施するために特に好ましい
測定キットの具体的例としては、次のものが挙げられ
る。
測定キットの具体的例としては、次のものが挙げられ
る。
【００３６】（i）担体表面のカルボキシル基にカルボ
ジイミドを用いて特異結合タンパク質を結合した固相 （ii）蛍光物質もしくは発光物質で標識した特異結合タ
ンパク質 （iii）血清アルブミンを含有する第１のブロック剤 （iv）乳成分タンパク質を含有する第２のブロック剤 （v）界面活性剤を含有するリン酸緩衝液
ジイミドを用いて特異結合タンパク質を結合した固相 （ii）蛍光物質もしくは発光物質で標識した特異結合タ
ンパク質 （iii）血清アルブミンを含有する第１のブロック剤 （iv）乳成分タンパク質を含有する第２のブロック剤 （v）界面活性剤を含有するリン酸緩衝液
【００３７】
【作用】本発明の測定方法は、微生物の外膜あるいは細
胞壁を構成する膜多糖類を検出し、これから微生物ある
いは微生物成分の存在を検出するものである。つまり、
微生物の外膜あるいは細胞壁には、共通してＬＰＳ、β
Ｇ、ＰＧやテイコ酸などのような、その構造中にポリマ
ー状の繰り返しまたは多数の特定構造を有する多糖類が
存在するとの知見に基づいてなされたものである。
胞壁を構成する膜多糖類を検出し、これから微生物ある
いは微生物成分の存在を検出するものである。つまり、
微生物の外膜あるいは細胞壁には、共通してＬＰＳ、β
Ｇ、ＰＧやテイコ酸などのような、その構造中にポリマ
ー状の繰り返しまたは多数の特定構造を有する多糖類が
存在するとの知見に基づいてなされたものである。
【００３８】すなわち、種々のタンパク質を特異的に検
出する方法としては、抗体を用いる方法が知られてお
り、広く使用されているが、この方法は、抗体の製造に
先立ち抗原の存在が必要であるから、未知の微生物の検
出については問題がある。また、抗体を用い、サンドイ
ッチ法で検出を行う場合には、一つの検出物（例えば微
生物）について、２つの異なるエピトープを認識する抗
体が必要になるという問題がある。
出する方法としては、抗体を用いる方法が知られてお
り、広く使用されているが、この方法は、抗体の製造に
先立ち抗原の存在が必要であるから、未知の微生物の検
出については問題がある。また、抗体を用い、サンドイ
ッチ法で検出を行う場合には、一つの検出物（例えば微
生物）について、２つの異なるエピトープを認識する抗
体が必要になるという問題がある。
【００３９】これに対し本発明方法では、微生物が有す
る膜構成成分に着目し、これを多糖類の大まかな構造を
認識し特異的に結合するタンパク質を用いて検出するこ
とにより微生物等の存在を検出しようとするものである
ため抗体では対応できない広い種類の微生物が検出可能
である。また、膜構成成分の構造は上記したようなポリ
マー状の繰り返し構造を有するものであるから、１種類
の特異結合タンパク質が固定化用と標識用として使用可
能である。
る膜構成成分に着目し、これを多糖類の大まかな構造を
認識し特異的に結合するタンパク質を用いて検出するこ
とにより微生物等の存在を検出しようとするものである
ため抗体では対応できない広い種類の微生物が検出可能
である。また、膜構成成分の構造は上記したようなポリ
マー状の繰り返し構造を有するものであるから、１種類
の特異結合タンパク質が固定化用と標識用として使用可
能である。
【００４０】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明する
が、本発明はこれらに何ら制限されるものではない。
が、本発明はこれらに何ら制限されるものではない。
【００４１】実 施 例 1 ＰＧの測定： （１）ＰＧＲＰプレートの作製 精製ＰＧＲＰ（The Journal of Biological Chemistry,
Vol.271, No.23, pp13854-13860, 1996.）を、５ｍｇ
／ｍｌの水溶性カルボジイミド（同仁化学研究所製）を
含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ５.８）で、その濃度が５０
μｇ／ｍｌになるように希釈した。この希釈液をＥＬＩ
ＳＡ用プレートカルボ（住友ベークライト製）の各ウェ
ルに１００μｌずつ分注し、ゆっくり振盪しながら４℃
で１晩インキュベートすることでＰＧＲＰをプレートに
結合させた。翌日反応液を捨て、０.０５％のＴｗｅｅ
ｎ−２０（和光純薬工業製）を含むリン酸緩衝溶液３０
０μｌ（以下、「洗浄液」という）でプレートの洗浄を
３回行った。次いで１％の牛血清アルブミン（ＳＩＧＭ
Ａ製）を含むリン酸緩衝溶液を３００μｌずつ分注し、
プレートのブロッキングを行った。３０℃で１０分間イ
ンキュベート後、上清を捨て、ＰＧＲＰプレートを作製
した。本プレートを以下の測定に用いた。
Vol.271, No.23, pp13854-13860, 1996.）を、５ｍｇ
／ｍｌの水溶性カルボジイミド（同仁化学研究所製）を
含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ５.８）で、その濃度が５０
μｇ／ｍｌになるように希釈した。この希釈液をＥＬＩ
ＳＡ用プレートカルボ（住友ベークライト製）の各ウェ
ルに１００μｌずつ分注し、ゆっくり振盪しながら４℃
で１晩インキュベートすることでＰＧＲＰをプレートに
結合させた。翌日反応液を捨て、０.０５％のＴｗｅｅ
ｎ−２０（和光純薬工業製）を含むリン酸緩衝溶液３０
０μｌ（以下、「洗浄液」という）でプレートの洗浄を
３回行った。次いで１％の牛血清アルブミン（ＳＩＧＭ
Ａ製）を含むリン酸緩衝溶液を３００μｌずつ分注し、
プレートのブロッキングを行った。３０℃で１０分間イ
ンキュベート後、上清を捨て、ＰＧＲＰプレートを作製
した。本プレートを以下の測定に用いた。
【００４２】（２）ＰＧの測定 ＰＧ（和光純薬工業製）を１％の牛血清アルブミンを含
むリン酸緩衝溶液で希釈し、５０ｎｇ／ｍｌを最大濃度
とする２倍希釈系列を作成した（５０、２５、１２.
５、６.２５、３.１２５ｎｇ／ｍｌ)。ＰＧＲＰプレー
トの各ウェルにＰＧ希釈液を１００μｌずつ入れ、３０
℃で３時間ゆっくり振盪することによりＰＧＲＰとＰＧ
を結合させた。
むリン酸緩衝溶液で希釈し、５０ｎｇ／ｍｌを最大濃度
とする２倍希釈系列を作成した（５０、２５、１２.
５、６.２５、３.１２５ｎｇ／ｍｌ)。ＰＧＲＰプレー
トの各ウェルにＰＧ希釈液を１００μｌずつ入れ、３０
℃で３時間ゆっくり振盪することによりＰＧＲＰとＰＧ
を結合させた。
【００４３】洗浄液で洗浄を３回行った後、ＥＣＬ タ
ンパク質ビオチン化システム（アマシャム ファルマシ
ア バイオテク製）を用いてビオチンでラベルしたＰＧ
ＲＰを、１０μｇ／ｍｌとなるように０.５％のカゼイ
ン（メルク製）を含むリン酸緩衝溶液により希釈し、各
ウェルに１００μｌずつ分注した。次いでゆっくり振盪
しながら３０℃で１時間インキュベートした後、洗浄液
で洗浄を３回行った。その後、０.５％のカゼインを含
むリン酸緩衝溶液で１０００倍に希釈したペルオキシダ
ーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャム ファルマシ
ア バイオテク製）を１００μｌ加え、２５℃で１時間
インキュベートしてビオチンにストレプトアビジンを結
合させた。
ンパク質ビオチン化システム（アマシャム ファルマシ
ア バイオテク製）を用いてビオチンでラベルしたＰＧ
ＲＰを、１０μｇ／ｍｌとなるように０.５％のカゼイ
ン（メルク製）を含むリン酸緩衝溶液により希釈し、各
ウェルに１００μｌずつ分注した。次いでゆっくり振盪
しながら３０℃で１時間インキュベートした後、洗浄液
で洗浄を３回行った。その後、０.５％のカゼインを含
むリン酸緩衝溶液で１０００倍に希釈したペルオキシダ
ーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャム ファルマシ
ア バイオテク製）を１００μｌ加え、２５℃で１時間
インキュベートしてビオチンにストレプトアビジンを結
合させた。
【００４４】ウエルの液を捨て、洗浄液で洗浄を４回行
い、ＴＭＢ試薬（ＫＰＬ製）を１００μｌ加え、３０℃
でインキュベートすることで発色させた。１時間後に１
Ｍのリン酸を１００μｌ加えることにより反応を停止さ
せ、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでの
吸光度を測定した。
い、ＴＭＢ試薬（ＫＰＬ製）を１００μｌ加え、３０℃
でインキュベートすることで発色させた。１時間後に１
Ｍのリン酸を１００μｌ加えることにより反応を停止さ
せ、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでの
吸光度を測定した。
【００４５】（３）結果 ＰＧ濃度を横軸、吸光度を縦軸にしてグラフを作成した
ところ、図１に示すようにＰＧ濃度と吸光度は明らかな
相関性を示した。
ところ、図１に示すようにＰＧ濃度と吸光度は明らかな
相関性を示した。
【００４６】実 施 例 ２ ＰＧＲＰ固相化後のブロック体の選択： （１）ＰＧＲＰプレートの作製 精製ＰＧＲＰ（The Journal of Biological Chemistry,
Vol.271, No.23, pp13854-13860, 1996.）を、１０ｍ
ｇ／ｍｌの水溶性カルボジイミド（同仁化学研究所製）
を含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ５.８）で、その濃度が１
００μｇ／ｍｌになるように希釈した。この希釈液をＥ
ＬＩＳＡ用プレートカルボ（住友ベークライト製）の各
ウェルに１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間インキ
ュベートすることによってＰＧＲＰをプレートに結合さ
せた。反応液を捨て、０.０５％のＴｗｅｅｎ−２０
（和光純薬工業製）を含むリン酸緩衝溶液３００μｌ
（以下、「洗浄液」という）でプレートの洗浄を３回行
った。ついで第１ブロック剤に含むブロック体として１
％の牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ製）または５％のス
キムミルク（雪印乳業製）を含むリン酸緩衝溶液を３０
０μｌずつ分注し、プレートのブロッキングを行った。
３７℃で５分間インキュベート後、上清を捨てＰＧＲＰ
プレートを作製した。本プレートを以下の測定に用い
た。
Vol.271, No.23, pp13854-13860, 1996.）を、１０ｍ
ｇ／ｍｌの水溶性カルボジイミド（同仁化学研究所製）
を含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ５.８）で、その濃度が１
００μｇ／ｍｌになるように希釈した。この希釈液をＥ
ＬＩＳＡ用プレートカルボ（住友ベークライト製）の各
ウェルに１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間インキ
ュベートすることによってＰＧＲＰをプレートに結合さ
せた。反応液を捨て、０.０５％のＴｗｅｅｎ−２０
（和光純薬工業製）を含むリン酸緩衝溶液３００μｌ
（以下、「洗浄液」という）でプレートの洗浄を３回行
った。ついで第１ブロック剤に含むブロック体として１
％の牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ製）または５％のス
キムミルク（雪印乳業製）を含むリン酸緩衝溶液を３０
０μｌずつ分注し、プレートのブロッキングを行った。
３７℃で５分間インキュベート後、上清を捨てＰＧＲＰ
プレートを作製した。本プレートを以下の測定に用い
た。
【００４７】（２）ＰＧの測定 ＰＧ（和光純薬工業製）を１％の牛血清アルブミンまた
は５％のスキムミルクを含むリン酸緩衝溶液で希釈し、
２０μｇ／ｍｌを最大濃度とする２倍希釈系列を各々作
成した（２０、１０、５、２.５、１.２５μｇ／ｍ
ｌ)。上記で作成したブロッキング済みのＰＧＲＰプレ
ートの各ウェルに各々対応するＰＧ希釈液を１００μｌ
ずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートしてＰＧＲＰ
とＰＧを結合させた。
は５％のスキムミルクを含むリン酸緩衝溶液で希釈し、
２０μｇ／ｍｌを最大濃度とする２倍希釈系列を各々作
成した（２０、１０、５、２.５、１.２５μｇ／ｍ
ｌ)。上記で作成したブロッキング済みのＰＧＲＰプレ
ートの各ウェルに各々対応するＰＧ希釈液を１００μｌ
ずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートしてＰＧＲＰ
とＰＧを結合させた。
【００４８】洗浄液で洗浄を３回行った後、ＥＣＬ タ
ンパク質ビオチン化システム（アマシャム ファルマシ
ア バイオテク製）を用いてビオチンでラベルしたＰＧ
ＲＰを作成し、それを１０μｇ／ｍｌの濃度となるよう
に５％のスキムミルクを含むリン酸緩衝液で希釈して、
各ウェルに１００μｌずつ分注した。次いで３７℃で１
時間インキュベートした後、洗浄液で洗浄を３回行っ
た。その後０.５％のカゼインを含むリン酸緩衝溶液で
１６０倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトア
ビジン（アマシャム ファルマシア製）を１００μｌ加
え、３７℃で１時間インキュベートし、ビオチンにスト
レプトアビジンを結合させた。
ンパク質ビオチン化システム（アマシャム ファルマシ
ア バイオテク製）を用いてビオチンでラベルしたＰＧ
ＲＰを作成し、それを１０μｇ／ｍｌの濃度となるよう
に５％のスキムミルクを含むリン酸緩衝液で希釈して、
各ウェルに１００μｌずつ分注した。次いで３７℃で１
時間インキュベートした後、洗浄液で洗浄を３回行っ
た。その後０.５％のカゼインを含むリン酸緩衝溶液で
１６０倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトア
ビジン（アマシャム ファルマシア製）を１００μｌ加
え、３７℃で１時間インキュベートし、ビオチンにスト
レプトアビジンを結合させた。
【００４９】ウエルから液を捨て、洗浄液で洗浄を４回
行い、ＡＢＴＳ試薬（ＫＰＬ製）を１００μｌ加え、２
５℃でインキュベートすることで発色させた。３０分後
に停止液を１００μｌ加えることにより反応を停止さ
せ、マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍでの吸
光度を測定した。
行い、ＡＢＴＳ試薬（ＫＰＬ製）を１００μｌ加え、２
５℃でインキュベートすることで発色させた。３０分後
に停止液を１００μｌ加えることにより反応を停止さ
せ、マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍでの吸
光度を測定した。
【００５０】（３）結 果 ＰＧ濃度を横軸、吸光度を縦軸にしてグラフを作成した
ところ、図２に示すようにブロック体として牛血清アル
ブミンを用いたものはＰＧの測定曲線が描けたのに対
し、ブロック体としてスキムミルクを用いたものはＰＧ
が検出されなかったため測定曲線が描けなかった。
ところ、図２に示すようにブロック体として牛血清アル
ブミンを用いたものはＰＧの測定曲線が描けたのに対
し、ブロック体としてスキムミルクを用いたものはＰＧ
が検出されなかったため測定曲線が描けなかった。
【００５１】実 施 例 ３ 標識したＰＧＲＰ結合時のブロック体の選択： （１）ＰＧＲＰプレートの作製 精製ＰＧＲＰ（The Journal of Biological Chemistry,
Vol.271, No.23, pp13854-13860, 1996.）を、５ｍｇ
／ｍｌの水溶性カルボジイミド（同仁化学研究所製）を
含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ５.８）で、その濃度が５０
μｇ／ｍｌになるように希釈した。この希釈液をＥＬＩ
ＳＡ用プレートカルボ（住友ベークライト製）の各ウェ
ルに１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間インキュベ
ートすることでＰＧＲＰをプレートに結合させた。反応
液を捨て、０.０５％のＴｗｅｅｎ−２０（和光純薬工
業製）を含むリン酸緩衝溶液３００μｌ（以下、「洗浄
液」という）で洗浄を３回行った。次いで、１％の牛血
清アルブミン（ＳＩＧＭＡ製）を含むリン酸緩衝溶液を
３００μｌずつ分注し、プレートのブロッキングを行っ
た。３７℃で１０分インキュベート後、上清を捨てＰＧ
ＲＰプレートを作製した。本プレートを以下の測定に用
いた。
Vol.271, No.23, pp13854-13860, 1996.）を、５ｍｇ
／ｍｌの水溶性カルボジイミド（同仁化学研究所製）を
含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ５.８）で、その濃度が５０
μｇ／ｍｌになるように希釈した。この希釈液をＥＬＩ
ＳＡ用プレートカルボ（住友ベークライト製）の各ウェ
ルに１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間インキュベ
ートすることでＰＧＲＰをプレートに結合させた。反応
液を捨て、０.０５％のＴｗｅｅｎ−２０（和光純薬工
業製）を含むリン酸緩衝溶液３００μｌ（以下、「洗浄
液」という）で洗浄を３回行った。次いで、１％の牛血
清アルブミン（ＳＩＧＭＡ製）を含むリン酸緩衝溶液を
３００μｌずつ分注し、プレートのブロッキングを行っ
た。３７℃で１０分インキュベート後、上清を捨てＰＧ
ＲＰプレートを作製した。本プレートを以下の測定に用
いた。
【００５２】（２）ＰＧの測定 ＰＧ（和光純薬工業製）を１％の牛血清アルブミンを含
むリン酸緩衝溶液で希釈し、１０μｇ／ｍｌを最大濃度
とする２倍希釈系列を２つ作成した（１０、５、２.
５、１.２５μｇ／ｍｌ)。ＰＧＲＰプレートの各ウェル
にＰＧ希釈液を１００μｌずつ入れ、３７℃で２時間３
０分インキュベートしてＰＧＲＰとＰＧを結合させた。
むリン酸緩衝溶液で希釈し、１０μｇ／ｍｌを最大濃度
とする２倍希釈系列を２つ作成した（１０、５、２.
５、１.２５μｇ／ｍｌ)。ＰＧＲＰプレートの各ウェル
にＰＧ希釈液を１００μｌずつ入れ、３７℃で２時間３
０分インキュベートしてＰＧＲＰとＰＧを結合させた。
【００５３】洗浄液で洗浄を３回行った後、ＥＣＬ タ
ンパク質ビオチン化システム（アマシャム ファルマシ
ア バイオテク製）を用いてビオチンでラベルしたＰＧ
ＲＰを、１０μｇ／ｍｌとなるように１％の牛血清アル
ブミン又は２％のスキムミルク（雪印乳業製）を含むリ
ン酸緩衝溶液で希釈して、各々の希釈系列の各ウェルに
１００μｌずつ分注した。３７℃で１時間インキュベー
トした後、洗浄液で洗浄を３回行った。その後０.５％
のカゼインを含むリン酸緩衝溶液で５００倍に希釈した
ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャム
ファルマシア バイオテク製）を１００μｌ加え、３７
℃で１時間インキュベートしてビオチンにストレプトア
ビジンを結合させた。
ンパク質ビオチン化システム（アマシャム ファルマシ
ア バイオテク製）を用いてビオチンでラベルしたＰＧ
ＲＰを、１０μｇ／ｍｌとなるように１％の牛血清アル
ブミン又は２％のスキムミルク（雪印乳業製）を含むリ
ン酸緩衝溶液で希釈して、各々の希釈系列の各ウェルに
１００μｌずつ分注した。３７℃で１時間インキュベー
トした後、洗浄液で洗浄を３回行った。その後０.５％
のカゼインを含むリン酸緩衝溶液で５００倍に希釈した
ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャム
ファルマシア バイオテク製）を１００μｌ加え、３７
℃で１時間インキュベートしてビオチンにストレプトア
ビジンを結合させた。
【００５４】ウエルの液を捨て、洗浄液で洗浄を４回行
い、ＡＢＴＳ試薬（ＫＰＬ製）を１００μｌ加え、２５
℃でインキュベートすることで発色させた。３０分後に
停止液を１００μl加えることにより反応を停止させ、
マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍでの吸光
度を測定した。
い、ＡＢＴＳ試薬（ＫＰＬ製）を１００μｌ加え、２５
℃でインキュベートすることで発色させた。３０分後に
停止液を１００μl加えることにより反応を停止させ、
マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍでの吸光
度を測定した。
【００５５】（３）結果 ＰＧ濃度を横軸、吸光度を縦軸にしてグラフを作成した
ところ、図３に示すようにブロック体としてスキムミル
クを用いたものはペプチドグリカンの測定曲線が描けた
のに対し、ブロック体として牛血清アルブミンを用いた
ものは、ＰＧ量が０を含めて全て吸光度が２.０以上と
なったため測定曲線が描けなかった。
ところ、図３に示すようにブロック体としてスキムミル
クを用いたものはペプチドグリカンの測定曲線が描けた
のに対し、ブロック体として牛血清アルブミンを用いた
ものは、ＰＧ量が０を含めて全て吸光度が２.０以上と
なったため測定曲線が描けなかった。
【００５６】実 施 例 ４ βＧの測定： （１）ＰＧＲＰプレートの作製 精製ＰＧＲＰ（The Journal of Biological Chemistry,
Vol.271, No.23, pp13854-13860, 1996.）を、５ｍｇ
／ｍｌの水溶性カルボジイミド（同仁化学研究所製）を
含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ５．８）で濃度が５０μｇ／
ｍｌになるように希釈した。この希釈液をＥＬＩＳＡ用
プレートカルボ（住友ベークライト製）の各ウェルに１
００μｌずつ分注し、ゆっくり振盪しながら４℃で１晩
インキュベートすせることでＰＧＲＰをプレートに結合
させた。翌日反応液を捨て、０.０５％のＴｗｅｅｎ−
２０（和光純薬工業製）を含むリン酸緩衝溶液３００μ
ｌ（以下、「洗浄液」という）で３回洗浄した。次い
で、１％の牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ製）を含むリ
ン酸緩衝溶液を３００μｌずつ分注し、プレートのブロ
ッキングを行った。３０℃で１０分インキュベート後、
上清を捨てＰＧＲＰプレートを作製した。本プレートを
以下の測定に用いた。
Vol.271, No.23, pp13854-13860, 1996.）を、５ｍｇ
／ｍｌの水溶性カルボジイミド（同仁化学研究所製）を
含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ５．８）で濃度が５０μｇ／
ｍｌになるように希釈した。この希釈液をＥＬＩＳＡ用
プレートカルボ（住友ベークライト製）の各ウェルに１
００μｌずつ分注し、ゆっくり振盪しながら４℃で１晩
インキュベートすせることでＰＧＲＰをプレートに結合
させた。翌日反応液を捨て、０.０５％のＴｗｅｅｎ−
２０（和光純薬工業製）を含むリン酸緩衝溶液３００μ
ｌ（以下、「洗浄液」という）で３回洗浄した。次い
で、１％の牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ製）を含むリ
ン酸緩衝溶液を３００μｌずつ分注し、プレートのブロ
ッキングを行った。３０℃で１０分インキュベート後、
上清を捨てＰＧＲＰプレートを作製した。本プレートを
以下の測定に用いた。
【００５７】（２）βＧの測定 βＧとしてカルボキシメチルカードラン（和光純薬工業
製）を１％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液で
希釈し、５０μｇ／ｍｌを最大濃度とする２倍希釈系列
を作成した（５０、２５、１２.５、６.２５、３.１２
５μｇ／ｍｌ）。対照として、ＰＧ（和光純薬工業製）
も同様に希釈し、５０ｎｇ／ｍｌを最大濃度とする２倍
希釈系列を作成した（５０、２５、１２.５、６.２５、
３.１２５ｎｇ／ｍｌ）。ＰＧＲＰプレートの各ウェル
にβＧまたはＰＧ希釈液を１００μｌずつ入れ、３０℃
で３時間ゆっくり振盪することによりＰＧＲＰとβＧま
たはＰＧを結合させた。
製）を１％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液で
希釈し、５０μｇ／ｍｌを最大濃度とする２倍希釈系列
を作成した（５０、２５、１２.５、６.２５、３.１２
５μｇ／ｍｌ）。対照として、ＰＧ（和光純薬工業製）
も同様に希釈し、５０ｎｇ／ｍｌを最大濃度とする２倍
希釈系列を作成した（５０、２５、１２.５、６.２５、
３.１２５ｎｇ／ｍｌ）。ＰＧＲＰプレートの各ウェル
にβＧまたはＰＧ希釈液を１００μｌずつ入れ、３０℃
で３時間ゆっくり振盪することによりＰＧＲＰとβＧま
たはＰＧを結合させた。
【００５８】洗浄液で洗浄を３回行った後、ＥＣＬ タ
ンパク質ビオチン化システム（アマシャム ファルマシ
ア バイオテク製）を用いてビオチンでラベルしたＰＧ
ＲＰを、１０μｇ／ｍｌとなるように０.５％のカゼイ
ン（メルク製）を含むリン酸緩衝溶液で希釈して、各ウ
ェルに１００μｌずつ分注した。次いでゆっくり振盪し
ながら３０℃で１時間インキュベートした後、洗浄液で
洗浄を３回行った。その後０.５％のカゼインを含むリ
ン酸緩衝溶液で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ
標識ストレプトアビジン（アマシャム ファルマシア
バイオテク製）を１００μｌ加え、２５℃で１時間イン
キュベートしてビオチンにストレプトアビジンを結合さ
せた。
ンパク質ビオチン化システム（アマシャム ファルマシ
ア バイオテク製）を用いてビオチンでラベルしたＰＧ
ＲＰを、１０μｇ／ｍｌとなるように０.５％のカゼイ
ン（メルク製）を含むリン酸緩衝溶液で希釈して、各ウ
ェルに１００μｌずつ分注した。次いでゆっくり振盪し
ながら３０℃で１時間インキュベートした後、洗浄液で
洗浄を３回行った。その後０.５％のカゼインを含むリ
ン酸緩衝溶液で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ
標識ストレプトアビジン（アマシャム ファルマシア
バイオテク製）を１００μｌ加え、２５℃で１時間イン
キュベートしてビオチンにストレプトアビジンを結合さ
せた。
【００５９】ウエルから液を捨て、洗浄液で洗浄を４回
行い、ＴＭＢ試薬（ＫＰＬ製）を１００μｌ加え、３０
℃でインキュベートすることで発色させた。１時間後に
１Ｍのリン酸を１００μｌ加えることにより反応を停止
させ、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで
の吸光度を測定した。
行い、ＴＭＢ試薬（ＫＰＬ製）を１００μｌ加え、３０
℃でインキュベートすることで発色させた。１時間後に
１Ｍのリン酸を１００μｌ加えることにより反応を停止
させ、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで
の吸光度を測定した。
【００６０】（３）結果 ＰＧ及びβＧ濃度を横軸、吸光度を縦軸にしてグラフを
作成したところ、図４に示すようにＰＧは測定曲線が描
けたのに対し、βＧは検出されなかったため測定曲線が
描けなかった。
作成したところ、図４に示すようにＰＧは測定曲線が描
けたのに対し、βＧは検出されなかったため測定曲線が
描けなかった。
【００６１】
【発明の効果】本発明は、特異結合タンパク質を利用し
て膜多糖類を測定することにより、微生物あるいは微生
物成分を検出する方法であり、微生物が未知のものであ
るか、変異をしたものであるかに関係なく、広く微生物
やその成分の存在を検出できるものである。また、測定
対象となる膜多糖類を代えて本発明方法を実施すること
により、単に微生物の存在を検出するだけでなく、どの
ような分類の微生物が存在するかまでも検出可能なもの
である。
て膜多糖類を測定することにより、微生物あるいは微生
物成分を検出する方法であり、微生物が未知のものであ
るか、変異をしたものであるかに関係なく、広く微生物
やその成分の存在を検出できるものである。また、測定
対象となる膜多糖類を代えて本発明方法を実施すること
により、単に微生物の存在を検出するだけでなく、どの
ような分類の微生物が存在するかまでも検出可能なもの
である。
【００６２】従って、本発明は医療現場での診断、医薬
品等の安全性試験、製造現場での水や食品等の検査等の
用途に有用なものである。
品等の安全性試験、製造現場での水や食品等の検査等の
用途に有用なものである。
【図１】 ＰＧ濃度と吸光度（λ＝４５０ｎｍ）との関
係を示す図面。
係を示す図面。
【図２】 ＰＧ濃度と吸光度（λ＝４０５ｎｍ）との関
係を示す図面。
係を示す図面。
【図３】 ＰＧ濃度と吸光度（λ＝４０５ｎｍ）との関
係を示す図面。
係を示す図面。
【図４】 ＰＧ濃度およびβＧ濃度と吸光度（λ＝４５
０ｎｍ）との関係を示す図面。 以 上
０ｎｍ）との関係を示す図面。 以 上
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４１ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４１Ｂ ５４１Ｚ 33/547 33/547
Claims (16)
- 【請求項１】 検体と、微生物の外膜または細胞壁を構
成する多糖類に特異的に結合するタンパク質とを反応さ
せ、当該タンパク質に結合した上記多糖類を検出するこ
とを特徴とする検体中の微生物ないし微生物成分の測定
方法。 - 【請求項２】 微生物の外膜または細胞壁を構成する多
糖類に特異的に結合するタンパク質を固定化した固相と
検体とを反応させ、次いで固相上で上記タンパク質と結
合した微生物の外膜または細胞壁を構成する多糖類を、
標識物質で標識された微生物の外膜または細胞壁を構成
する多糖類に特異的に結合するタンパク質で検出するこ
とを特徴とする検体中の微生物ないし微生物成分の測定
方法。 - 【請求項３】 固相に固定化された微生物の外膜または
細胞壁を構成する多糖類に特異的に結合するタンパク質
と、標識物質で標識された微生物の外膜または細胞壁を
構成する多糖類に特異的に結合するタンパク質とが同一
のタンパク質である請求項第１項および請求項第２項記
載の微生物ないし微生物成分の測定方法。 - 【請求項４】 微生物の外膜または細胞壁を構成する多
糖類が、グラム陰性菌表層に存在する外膜を構成するリ
ポ多糖、酵母・カビ・キノコ等の真菌類の細胞壁を構成
するβ−１,３−グルカンまたは大部分の原核生物の細
胞壁を構成するペプチドグリカンである請求項第１項な
いし第３項の何れかの項記載の微生物ないし微生物成分
の測定方法。 - 【請求項５】 微生物の外膜または細胞壁を構成する多
糖類が、ペプチドグリカンであり、微生物の外膜または
細胞壁を構成する多糖類に特異的に結合するタンパク質
が、ペプチドグリカン認識タンパク質であり、検出物が
原核微生物またはその成分である請求項第１項ないし請
求項第４項の何れかの項記載の微生物ないし微生物成分
の測定方法。 - 【請求項６】 検体と、微生物の外膜または細胞壁を構
成する多糖類に特異的に結合するタンパク質との反応に
おいて、血清タンパク質、乳成分タンパク質、ゼラチン
から選ばれる化合物の少なくとも１種をブロック体とし
て添加することを特徴とする請求項第１項ないし請求項
第５項の何れかの項記載の微生物ないし微生物成分の測
定方法。 - 【請求項７】 ブロック体が、血清アルブミンである請
求項第６項記載の微生物ないし微生物成分の測定方法。 - 【請求項８】 微生物の外膜または細胞壁を構成する多
糖類と、この多糖類に特異的に結合するタンパク質との
結合物を、標識物質で標識された微生物成分に特異的に
結合するタンパク質で標識する反応において、血清タン
パク質、乳成分タンパク質、ゼラチンから選ばれる少な
くとも１種をブロック体として添加することを特徴とす
る請求項第２項ないし請求項第７項の何れかの項記載の
微生物ないし微生物成分の測定方法。 - 【請求項９】 ブロック体が、乳成分タンパク質である
請求項第８項記載の微生物ないし微生物成分の測定方
法。 - 【請求項１０】 固相に用いる担体が、その表面にカル
ボキシル基を有するものである請求項第２項または第３
項記載の微生物ないし微生物成分の測定方法。 - 【請求項１１】 固定化をカルボジイミドを用いて行う
請求項第２項または第３項記載の微生物ないし微生物成
分の測定方法。 - 【請求項１２】 次の成分（ａ）および（ｂ）、 （ａ）微生物の外膜または細胞壁を構成する多糖類に特
異的に結合するタンパク質が固定化された固相 （ｂ）標識物質で標識された微生物の外膜または細胞壁
を構成する多糖類に特異的に結合するタンパク質 を含む微生物または微生物成分の測定キット。 - 【請求項１３】 成分（ｂ）の標識物質が酵素、放射性
物質、蛍光物質もしくは発光物質である請求項第１２項
記載の微生物ないし微生物成分の測定キット。 - 【請求項１４】 更に、第１のブロック剤として血清ア
ルブミンを、第２のブロック剤として乳成分タンパクを
含む請求項１２記載の微生物ないし微生物成分の測定キ
ット。 - 【請求項１５】 固相に用いる担体が、その表面にカル
ボキシル基を有するものである請求項第１２項記載の微
生物ないし微生物成分の測定キット。 - 【請求項１６】 固定化をカルボジイミドを用いて行う
請求項第１２項記載の微生物ないし微生物成分の測定キ
ット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001148641A JP2002340902A (ja) | 2001-05-18 | 2001-05-18 | 微生物ないし微生物成分の測定方法およびこれに用いる測定キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001148641A JP2002340902A (ja) | 2001-05-18 | 2001-05-18 | 微生物ないし微生物成分の測定方法およびこれに用いる測定キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002340902A true JP2002340902A (ja) | 2002-11-27 |
Family
ID=18993915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001148641A Pending JP2002340902A (ja) | 2001-05-18 | 2001-05-18 | 微生物ないし微生物成分の測定方法およびこれに用いる測定キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002340902A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011515656A (ja) * | 2008-02-14 | 2011-05-19 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 微生物を検出する方法及び組成物 |
-
2001
- 2001-05-18 JP JP2001148641A patent/JP2002340902A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011515656A (ja) * | 2008-02-14 | 2011-05-19 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 微生物を検出する方法及び組成物 |
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