JP2002247980A - エンベロープウイルスと非エンベロープウイルスの選択的分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、エンベロープウィルスと非エン
ベロープウィルスを試料から選択的に分離する方法を得
る。 【解決手段】 １．カチオン性基を少なくともその表
面に持つウイルス結合性担体Iをウイルス含有試料に添
加した後、ウイルス結合性担体Iを試料から分離するこ
とによりエンベロープウイルスを分離する工程および ２．アニオン性基を少なくともその表面に持つウイルス
結合性担体IIを添加した後、ウイルス結合性担体IIを試
料から分離する工程を含むことを特徴とするエンベロー
プウィルスと非エンベロープウイルスの選択的分離方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エンベロープウィ
ルスと非エンベロープウィルスを試料から選択的に分離
する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ウイルスは、中心部に核酸あるいはコア
と呼ばれる核タンパク質複合体を持ち、その回りにキャ
プシドと呼ばれるタンパク質構造がある。さらに一部の
ウイルスでは、キャプシドが感染細胞から放出される際
に、キャプシドが細胞膜由来の脂質二重層に覆われる。
前者は非エンベロープウイルス（Naked Virus）、後者
はエンベロープウイルス（Enveloped Virus）と呼ばれ
ている。従来、エンベロープウイルスと非エンベロープ
ウイルスを分離するためには、密度勾配超遠心法などの
比重を利用した方法が用いられていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし密度勾配超遠心
法は、高価な機器や多大な処理時間、熟練した技術が必
要であり、一度に処理できるウイルス量も限られる。ま
た、両ウイルスタイプで比較的比重差の少ないウイルス
種があり、完全な方法とは言い難い。そこで、エンベロ
ープウイルスと非エンベロープウイルスを簡便な方法で
選択的に分離できる方法が望まれている。本発明は、上
記の密度勾配超遠心法の欠点を改善し、エンベロープウ
イルスと非エンベロープウイルスの簡便な分離と、短時
間での大量処理が可能な方法を提供することを目的とす
る。

【０００４】

【発明を解決するための手段】本発明は、 １．カチオ
ン性基を少なくともその表面に持つウイルス結合性担体
Iをウイルス含有試料に添加した後、ウイルス結合性担
体Iを試料から分離することによりエンベロープウイル
スを分離する工程および ２．アニオン性基を少なくともその表面に持つウイルス
結合性担体IIを添加した後、ウイルス結合性担体IIを試
料から分離することにより非エンベロープウィルスを分
離する工程を含むことを特徴とするエンベロープウィル
スと非エンベロープウイルスの選択的分離方法を提供す
るものである。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的により詳し
く説明する。 [ウイルス含有試料]本発明を適用できるウイルス含有試
料とは、ウイルスを含有している可能性のある血清、
尿、唾液、組織の溶解液、培養細胞破砕液、培養液など
である。ウイルスは上記試料中に含まれている自然状態
であっても良いし、または、超遠心分離等の前処理によ
り、共存する蛋白、脂質、糖等の夾雑物を除去した状態
であっても良い。本発明において、エンベロープウイル
スとしては、ポックスウイルス（以降「ウイルス」は省
略）、ヘルペス、トガ、コロナ、パラミクソ、オルトミ
クソ、ラブド、ブニヤ、アレナ、レトロ、バキュロなど
を、非エンベロープウイルスとしては、イリド、アデ
ノ、パポーバ、パルボ、レオ、ピコルナ、カリシ、ノダ
などを挙げることができる。

【０００６】[ウイルス結合性担体] （１）担体I カチオン性基を少なくともその表面に持つ担体Iとして
は、その表面に、アミノ基、アンモニウム基、イミノ
基、イミジノ基、ヒドラジノ基、さらにピリジル基等の
窒素原子を含む環状基等を持つ担体を挙げることができ
る。これら担体Iのカチオン性基は、アミノ基等のプロ
トンと結合してカチオンを形成し得る基および該基が酸
と反応して塩を生成し、塩のカチオン部を形成している
基を包含する。担体Iとして表面がカチオン性を有する
ものとしては、例えば、担体Iがカチオン性基を有す
るモノマーを共重合した重合体からなるもの、カチオ
ン性基を有する重合開始剤を用いてラジカル重合させて
得た重合体からなるもの、カチオン性基を有する化合
物を重合体担体に結合してなるもの、陰イオン交換樹
脂からなるもの、カチオン性基含有水溶性高分子を水
不溶性ポリマー担体に担持させたもの、無機ポリマー
または無機粒子の表面に、カチオン性基を有する重合体
またはカチオン性基含有水溶性高分子を有するものなど
である。

【０００７】上記の例としては、次のものを挙げること
ができる。 カチオン性基を有するモノマーを共重合した重合の
例：カチオン性基を有するモノマーとしては、２−ジメ
チルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ジエチル
アミノエチル（メタ）アクリレート、２−ジメチルアミ
ノプロピル（メタ）アクリレート、３−ジメチルアミノ
プロピル（メタ）アクリレート等のアミノアルキル基含
有（メタ）アクリル酸エステル類及びこれらの塩化メチ
レン、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等による４級塩；２
−（ジメチルアミノエトキシ）エチル（メタ）アクリレ
ート、２−（ジエチルアミノエトキシ）エチル（メタ）
アクリレート、３−（ジメチルアミノエトキシ）プロピ
ル（メタ）アクリレート等のアミノアルコキシアルキル
基含有（メタ）アクリル酸エステル類及びこれらの塩化
メチレン、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等による４級
塩；Ｎ−（２−ジメチルアミノエチル）（メタ）アクリ
ルアミド、Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）（メタ）
アクリルアミド、Ｎ−（２−ジメチルアミノプロピル）
（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）（メタ）アクリルアミド等のＮ−アミノアルキ
ル基含有（メタ）アクリルアミド類及びこれらの塩化メ
チレン、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等による４級塩等
が挙げられる。なかでも、２−ジメチルアミノエチル
（メタ）アクリレート、Ｎ−（２−ジメチルアミノエチ
ル）（メタ）アクリルアミド、及びこれらの塩化メチレ
ンによる４級塩が好ましい。これらは、他の重合性モノ
マーと共重合させてもよい。カチオン性モノマーと共重
合するモノマーとしては、下記に示すような架橋性モノ
マーならびに非架橋かつ非イオン性モノマーを挙げるこ
とができる。架橋性モノマーとしては、ジビニルベンゼ
ン、ジビニルビフェニル、エチレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）ア
クリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリ
レート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレ
ート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレー
ト、、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレー
ト、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレー
ト、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレー
ト、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、
１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ネ
オペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、２，
２’−ビス〔４−（メタ）アクリロイルオキシプロピオ
キシフェニル〕プロパン、２，２’−ビス〔４−（メ
タ）アクリロイルオキシジエトキジフェニル〕プロパ
ン、グリセリントリ（メタ）アクリレート、トリメチロ
ールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリス
リトールテトラ（メタ）アクリレート等のジビニル系モ
ノマー、トリビニル系モノマー及びテトラビニル系モノ
マーが挙げられる。なかでも、ジビニルベンゼン、エチ
レングリコールジメタクリレートおよびトリメチロール
プロパントリメタクリレートが好ましい。

【０００８】共重合可能な非架橋性かつ非イオン性モノ
マーは、カチオン性モノマーあるいは架橋性モノマーの
いずれかと共重合可能であって、非架橋性かつ非イオン
性のモノマーである。このようなモノマーとして、スチ
レン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ハロ
ゲン化スチレン等の芳香族ビニル単量体；アクリロニト
リル等の不飽和ニトリル；メチルアクリレート、メチル
メタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリ
レート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、
シクロヘキシルメタクリレート、２−エチルヘキシルア
クリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウ
リルアクリレート、ラウリルメタクリレート、グリシジ
ルアクリレート、グリシジルメタクリレート、２−ヒド
ロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタ
クリレート等のアクリル酸エステルおよびメタクリル酸
エステル；ブタジエン、イソプレン等のジオレフィン；
酢酸ビニル等のカルボン酸ビニルエステル；塩化ビニ
ル、塩化ビニリデン等のハロゲン化ビニリデン等を挙げ
ることができる。なかでも、スチレン、α−メチルスチ
レン、アクリロニトリル、メチルメタクリレート、ブチ
ルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレー
ト、シクロヘキシルメタクリレートが好ましい。

【０００９】カチオン性基を有する重合開始剤を使用
してモノマーを重合して得た重合体の例：カチオン性基
を有するラジカル重合開始剤は、これを用いたラジカル
重合により得られたポリマーがその末端に該ラジカル重
合開始剤に由来するカチオン性基を有するようになるも
のである。好ましいカチオン性基を有するラジカル重合
開始剤としては、アミジノ基、イミジノ基あるいはピリ
ジウム基を有するアゾビス型の開始剤が挙げられる。ま
た、１０時間半減期温度が４０〜９５℃の範囲にあるも
のが温和な条件下で重合を行うことができるので好まし
い。 カチオン性基を有する化合物を重合体担体に結合させ
てなる重合体 粒子表面にカルボキシル基、ハイドロキシル基、エポキ
シ基、アミノ基、アミド基などを共重合やシード重合法
などにより導入し、それらの基を結合部として反応させ
ることにより、カチオン性基を有する化合物を重合体表
面に導入することができる。カチオン性基を有する化合
物としては、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミ
ン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリプロピ
レンアミンなどのポリアミン化合物、ポリリジン、ポリ
アルギニン、ポリヒスチジンなどの遊離アミノ酸類、前
述のカチオン性基を有するモノマーを共重合したポリマ
ーなどを挙げることができる。

【００１０】陰イオン交換樹脂 ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンに第４級アンモニウ
ム基−CH₂N⁺(CH₃)₃（I型）あるいは−CH₂N⁺(CH₃)₃(C₂H₄
OH)（II型）を導入した強塩基性陰イオン交換樹脂、−N
H(CH₃)₂、−NH(CH₂CH₂NH)_nH、−CONH(CH₂)₃N(CH₃)₂を導
入した弱塩基性陰イオンなど。 無機ポリマーまたは無機化合物の表面にカチオン性基
を有する重合体またはカチオン性基含有水溶性高分子を
有するもの。さらにキレート樹脂といわれる供与体原子
（Ｏ，Ｎ，Ｓ）を有する樹脂も挙げることができる。キ
レート樹脂としては、イミノ二酢酸型、イミノプロピオ
ン酸型、エチレンジアミン三酢酸型、キノリン型、アミ
ノカルボン酸型、アミンリン酸型、アミドキシム型、ク
リプタント型、ポリアミン型、ピリジン型、ピコリルア
ミン型、チオール型、リン酸型、多価フェノール型、ジ
チオカルバミン酸型、チオ尿素型、イソチウロニウム型
およびジチゾン型などが挙げられる。

【００１１】（２）担体II アニオン性基としては、カルボキシル基、スルホン基
（スルホン基は硫酸基の一部として存在していてもよ
い）、リン酸基などを挙げることができる。これらのア
ニオン性基は塩を形成した状態で存在してもよい。担体
IIとしてアニオン性を有するものとしては、例えば、担
体IIがアニオン性基を有するモノマーを共重合した重
合体からなるもの、重合体をアニオン化してなるも
の、合成高分子にスルホン酸含有単量体をシード結合
又はグラフト重合してなる重合体、陽イオン交換樹脂
からなるもの、硫酸化した天然高分子を水不溶性ポリ
マー担体に担持させたもの、無機ポリマーまたは無機
粒子の表面に、アニオン性基を有する重合体または硫酸
化した天然高分子を有するもの、などである。上記の例
として次のものを挙げることができる。

【００１２】アニオン性基を有するモノマーを共重合
した重合体の例：カルボン酸含有単量体の（共）重合体
をあげることができる。ここで、カルボン酸含有単量体
（以下「カルボン酸単量体」という。）とは、付加重合
性の不飽和結合およびカルボキシル基を分子中に有する
重合性単量体である。具体例としては、アクリル酸、メ
タクリル酸、クロトン酸、イタコン酸、フマル酸、マレ
イン酸などをあげることができる。 重合体をアニオン化（スルホン化）してなるものの
例：少なくともその表面にスルホン化可能な官能基、例
えば主鎖または側鎖に不飽和二重結合、芳香族基、第一
級または第二級アミノ基、第一級ハロゲン化アルキル
基、脂肪族アルデヒド、脂肪族ケトン、脂肪族カルボン
酸、脂肪族カルボン酸無水物、水酸基等をもつ（共）重
合体からなり、その表面の少なくとも一部がスルホン化
されているもの。表面スルホン化可能な（共）重合体の
例として、スチレン、α−メチルスチレン、ビニルナフ
タレン、ジビニルベンゼン、ブタジエン、イソプレン、
ビニルアルコール等のスルホン化可能な単量体の（共）
重合体、およびこれら単量体と他の重合性単量体との
（共）重合体等の付加重合系高分子化合物；ポリカーボ
ネート、ポリエステル、ポリエステルエーテル、ポリア
リールエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリスルホ
ン、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、ポリイミド、
ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリウレタ
ン、芳香族化合物のアセトアルデヒド縮合物、ポリエー
テル等の縮合重合系高分子化合物等があげられる。

【００１３】合成高分子粒子にスルホン酸含有単量体
（以下、「スルホン酸単量体」という）および／または
カルボン酸単量体をシード重合あるいはグラフト重合し
た粒子としては、合成高分子からなるシード粒子にスル
ホン酸含有単量体および／またはカルボン酸単量体、さ
らに必要に応じてそれら以外の他の共重合可能な単量体
とともにシード（共）重合あるいはグラフト（共）重合
した粒子をあげることができる。このような粒子は、界
面活性剤を含む水あるいは水／極性溶媒に分散したシー
ド粒子に、モノマーおよびラジカル発生剤を加え、５０
〜１００℃で反応することにより合成できる。ここで、
合成高分子からなるシード粒子としては、スチレン、α
−メチルスチレン、ビニルトルエン、ビニルナフタレン
などの重合性二重結合含有芳香族化合物；アクリロニト
リル、メタクリロニトリル、シアン化ビニリデン等の重
合性二重結合含有シアン化合物；ジビニルベンゼン、エ
チレングリコールジメタクリレート等の重合性架橋性化
合物；塩化ビニル、塩化ビニリデン、ビニルメチルエチ
ルケトン、ビニルメチルエーテル、酢酸ビニル、ギ酸ビ
ニル、酢酸アリル、酢酸メタアリル、アクリルアミド、
メタクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、
Ｎ―イソプロピルアクリルアミド、アクリル酸グリリジ
ル、メタクリル酸グリシジル、アクロレイン、メタクロ
レイン、アリルアルコール、２―ヒドロキシエチルアク
リレート、２―ヒドロキシエチルメタクリレート、２―
メトキシエチルアクリレート、ｎ−ブチルアクリレー
ト、ｓｅｃ−ブチルアクリレート、イソブチルアクリレ
ート、ｔ−ブチルアクリレート、、ｎ−ブチルメタクリ
レート、ｓｅｃ−ブチルメタクリレート、イソブチルメ
タクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、メチルアク
リレート、エチルアクリレート、ｎ−プロピルアクリレ
ート、イソプロピルアクリレート、メチルメタクリレー
ト、エチルメタクリレート、ｎ−プロピルメタクリレー
ト、イソプロピルメタクリレート等の重合性二重結合含
有化合物；エチレンオキシド、プロピレンオキシド、２
−メチルテトラヒドロキシフラン、スチレンオキシド、
ブチレンオキシド、グリシジルエーテル等の重合性環状
化合物等の（共）重合体粒子等をあげることができる。

【００１４】スルホン酸単量体としては、イソプレンス
ルホン酸、エチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、ス
チレンスルホン酸、α−メチルスチレンスルホン酸、2-
アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸、スルホ
エチルアクリレート、スルホン化ジシクロペンタジエン
等をあげることができる。

【００１５】他の共重合可能な単量体としては、1,3-ブ
タジエン、イソプレン等の脂肪族ジエン系化合物；スチ
レン、α−メチルスチレン、ビニルトルエンなどの重合
性二重結合含有芳香族化合物；メチルアクリレート、エ
チルアクリレート、2-エチルヘキシルアクリレート、メ
チルメタクリレート、エチルメタクリレート、２―ヒド
ロキシエチルアクリレート、２―ヒドロキシエチルメタ
クリレート、等の（メタ）アクリル酸アルキルエステ
ル；アクリロニトリル、メタクリロニトリル等の重合性
シアン化合物；塩化ビニル、塩化ビニリデン、ビニルメ
チルエチルケトン、ビニルメチルエーテル、酢酸ビニ
ル、ギ酸ビニル、酢酸アリル、酢酸メタアリル、アクリ
ルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリ
ルアミド、Ｎ―イソプロピルアクリルアミド、アクリル
酸グリリジル、メタクリル酸グリシジル、アクロレイ
ン、メタクロレイン、アリルアルコール等の重合性二重
結合含有化合物、エチレンオキシド、プロピレンオキシ
ド、２−メチルテトラヒドロキシフラン、スチレンオキ
シド、ブチレンオキシド、グリシジルエーテル等の重合
性環状化合物等をあげることができる。

【００１６】スルホン酸単量体と水溶性架橋性単量体か
らなるハイドロゲル粒子としては、例えば上記スルホン
酸単量体と、N,N'-メチレンビスアクリルアミド等の水
溶性架橋性単量体の重合体からなるハイドロゲル粒子を
用いることができる。このような粒子は、スルホン酸単
量体、水溶性架橋性単量体、ラジカル反応開始剤の水溶
液と、界面活性剤を添加した非極性溶媒を激しく混合
し、油中水型の逆ミセルを形成させた後、５０〜１００
℃で反応することにより得られる。

【００１７】陽イオン交換樹脂の例としては、ジビニ
ルベンゼン架橋スルホン化ポリスチレンがあげられ、粒
径は、中心粒径が０．１ｍｍから１ｍｍ程度のもので良
い。 硫酸化した天然高分子を水不溶性ポリマー担体に担持
させたものの例：硫酸化多糖類としては、ヘパリン、デ
キストラン硫酸、セルロース硫酸、ガードラン硫酸、コ
ンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、
キチン硫酸、キトサン硫酸、デルマタン硫酸、アミロペ
クチン硫酸、ケタラン硫酸、キシラン硫酸、カロニン硫
酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギン酸硫酸、グ
リコーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カラゲニン硫
酸、デンプン硫酸、ポリグルコース硫酸、ラミナリン硫
酸、ガラクタン硫酸、レバン硫酸、メペサルフェート、
フコイダン、硫酸化グリチルリチンなどの抗ウイルス性
を有する多糖類を挙げることができる。硫酸化多糖類
は、エポキシ基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシ
ル基、水酸基、酸クロライド基などの官能基を持つ重合
体に直接もしくはカップリング剤やスペーサーを介して
担持させることができる。

【００１８】（３）担体Iおよび担体IIに共通する項目 本発明において、ウイルス結合性担体には、分離操作の
自動化のために有効な、強磁性体、常磁性体などの磁性
体を含有させることができる。ウイルス結合性担体の形
状としては特に限定されず種々あり得る。例えば、フィ
ルター状、繊維状（中空繊維も含む）、粒子状、プレー
ト状、チューブ状などである。ウイルス結合性担体の形
態が粒子状の場合、粒径はウイルス含有試料中に分散し
て使用する場合には、０．１〜２００μｍ程度、カラム
に充填して使用する場合には０．１〜１ｍｍ程度の粒径
を有することが好ましい。フィルターの場合には、好ま
しくは、平均孔径が０．１〜５０μｍの範囲にあるフィ
ルターであり、平膜、中空糸膜、不織布、織布などを例
示できる。血漿や培養液などを対象とした場合は、平均
孔径が０．１μｍ〜１０μｍ が好ましい。平均孔径が
０．１μ以下だと、孔径が小さくなるため十分な濾過量
が得られなくなる。平均孔径は、ＡＳＴＭ−Ｆ３１６に
記載されたパームポロメーター（ポーラスマテリアル社
製）を用いて求めた値であり、実際の透過孔を反映する
値である。また、フィルターの通水量は、０．７ｋｇ／
ｃｍ²の圧力下で、２５℃±２℃で測定した値で、１０
ｍL／ｍIｎ／ｍ²／ｍｍＨｇ以上、好ましくは１００ｍL
／ｍIｎ／ｍ²／ｍｍＨｇ以上であることが、濾過圧を低
くできるため好ましい。また、不織布状の基材の場合、
フィルター材を形成するフィラメントは、モノフィラメ
ントであってもマルチフィラメントであってもよいが、
平均直径（走査型電子顕微鏡で観察したフィラメントの
長径と短径の平均値）が１００μｍ以下、好ましくは、
５０μｍ以下であると、膜の表面積が大きくなり吸着部
位が増加することとなるため好ましい。さらに、異形フ
ィラメントであっても多孔質フィラメントであっても良
い。さらに、フィルターの空孔部の割合（空孔率）は、
２０％以上、好ましくは５０％以上である。

【００１９】ウイルス結合性担体がシート状、チューブ
状または板状である例としては、採血管、真空採血管、
試験管、ウェルプレート、マイクロプレート、マイクロ
テストチューブ、エッペンドルフチューブ（商品名）な
どを挙げることができる。これらの形状のウイルス結合
性担体を得るには、上記に例示された有機ポリマーのう
ちポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ
エチレンテレフタレート、ノルボルネン系樹脂などの熱
可塑性樹脂はそのまま所望の形状に成形することができ
る。また、ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリ
レートなどからなる汎用の採血管などの表面をイオン化
することにより、本発明に適したウイルス結合性担体と
することもできる。また、ガラス、ポリスチレン、ポリ
メチルメタクリレートなどからなる汎用の採血管などの
表面をイオン化することにより、本発明に適したウイル
ス結合性担体とすることもできる。

【００２０】[二価イオン]非エンベロープウイルスと担
体IIとの結合を促進するため、多価金属イオンを添加す
ることが望ましい。ここで多価金属としては、例えば、
Be, Mg, Sr, Ba,TI, Zr, Cr, Mo, W, Mn, Fe, Ru, Os,
Co, Rh, NI, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Zn, Cd, Hg, Al, G
a, SI, Ge, Sn, Pb, P, As, Sb, BIなどを挙げることが
でき、多価金属化合物とはこれら多価金属の塩化物、水
酸化物、炭酸化合物、硫酸化合物、硝酸化合物、酢酸化
合物、塩素酸化合物などのうち、水中で解離して２価以
上のカチオンを生成する化合物である。多価金属イオン
の使用量は、生体試料中での該イオン濃度が０．０１〜
５０ｍＭとなるよう添加する。

【００２１】[分離] （１）エンベロープウイルスの分離 エンベロープウイルスと非エンベロープウイルスの分離
のためには、第一段としてウイルス含有試料を、担体I
と接触させることにより、エンベロープウイルスを分離
する。本発明では、ウイルス含有試料と担体Iとの接触
方法は種々あり得、特に限定されない。担体Iの形状、
大きさなどに応じて適切な方法をとればよい。例えば、
担体Iが粒径２００μｍ未満の粒子の場合には、担体Iを
試料中に分散させ、場合により振とうすることにより試
料と担体Iを接触させる。担体Iが粒径２００μｍを超え
る粒子の場合には、カラムに充填し、その中に試料を通
過させる。また、担体Iが直径５〜６ｍｍのプラスチッ
クビーズなど大きなものの場合は、１〜数個を試験管に
入れ、試料と接触させる。担体Iがフィルター状または
繊維状の場合には、フィルターまたは繊維表面と試料が
充分接触するように、フィルターまたは繊維で試料を濾
過する。担体Iが試験管やウェルプレートなどの試験器
具である場合には、該試験器具の中に試料を入れ振とう
する。担体Iにウイルス含有試料を接触させる際のウイ
ルス含有試料の温度は通常０〜４０℃、接触時間は通常
３０秒〜１時間であるが、ウイルス含有試料の性状によ
り適宜変更することが好ましい。担体Iとウイルス含有
試料の接触後、担体Iをウイルス含有試料から取り除く
ことによりエンベロープウイルスが分離される。この
際、担体Iが粒径２００μｍ未満の粒子の場合には、例
えば遠心により分離する。また、担体Iに磁性体を含有
させておくことにより、ウイルス含有試料から磁気によ
り容易に分離することができる。

【００２２】（２）非エンベロープウイルスの分離 エンベロープウイルスを分離した後のウイルス含有試料
は必要に応じて、第二段として非エンベロープウイルス
分離工程に移行する。第二段としての非エンベロープウ
イルス分離工程では、ウイルス含有試料を、担体IIと接
触させることにより、非エンベロープウイルスを分離す
る。この際、非エンベロープウイルスと担体IIとの結合
を促進するため、多価金属イオンを添加することが望ま
しい。本発明では、ウイルス含有試料と担体IIとの接触
方法は種々あり得、特に限定されない。担体IIの形状、
大きさなどに応じて適切な方法をとればよい。多価金属
イオンを添加する以外は、担体IIは上記担体Iと同様な
方法で操作することができる。また、エンベロープウイ
ルスの分離や、エンベロープウイルスを除去したウイル
ス含有試料の取得が目的であれば、必ずしもこの第二段
のウイルス分離操作を行う必要はない。また、エンベロ
ープウイルスおよび非エンベロープウイルスを同時に分
離したい場合には、ウイルス含有試料を担体IIで直接処
理することにより実現できる。

【００２３】[ウイルスの回収]担体Iおよび担体IIに結
合して分離されたエンベロープウイルスは、塩溶液を加
えて回収し種々の用途に用いることもできるし、そのま
ま核酸を抽出を行い核酸増幅法等の方法で検出すること
も可能である。但し、回収や検出に供する前に必要に応
じて担体Iおよび担体IIを低濃度の緩衝液で洗浄しても
よい。エンベロープウイルスを担体Iから分離する方法
としては、塩溶液および界面活性剤あるいは両者の混合
物を作用させて標的物質を標的物質吸着体から解離させ
る方法がある。塩溶液としては高濃度の、例えば２〜８
Ｍの臭化カリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウ
ム、グアニジンイソチオシアネート、グアニジンチオシ
アネート、塩酸グアニジン、硫酸グアニジン、チオシア
ン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウムおよびその塩の
水溶液、1.5〜6M塩化ナトリウム水溶液、0.5〜5mMリン
タングステン酸水溶液等を用いることができる。界面活
性剤としては、ＳＤＳ、トライトンＸ−１００、Ｔｗｅ
ｅｎ２０，８０、ＮＰ−４０などがある。エンベロープ
ウイルスに対するダメージが少ない方法としては、1.5
〜２Ｍ程度の塩化ナトリウム溶液による解離が好まし
い。非エンベロープウイルスを担体IIから分離する方法
としては、上記担体Iで用いた試薬類の他に、エチレン
ジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレングリコール（２
−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）などのキ
レート剤も用いることができる。

【００２４】

【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
以下の記載においては、特記しない限り「部」は「重量
部」を意味する。 参考例１（担体Iの合成） （１）油性磁性流体フェリコロイドHC50［商品名、タイ
ホー工業（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿
させた後、これを乾燥することにより、親油化処理され
た表面を有するフェライト系の超常磁性体（粒子径：
０．０１μｍ）を得た。ついで、上で得た超常磁性体４
０部にシクロヘキシルメタクリレート９０部、トリメチ
ルアミノエチルメタクリレートの塩化物１０部およびベ
ンゾイルペルオキシド（重合開始剤）３部を添加し、こ
の系を混合攪拌することにより超常磁性体を均一に分散
させてモノマー組成物を調製した。一方、ポリビニルア
ルコール１０部、ラウリル硫酸ナトリウム０．０５部お
よびポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル０．
１部を水１０００部に溶解して水性モノマー組成物を調
製した。こうして調製した水性モノマー組成物中に上記
のモノマー組成物を添加し、ホモジナイザーで予備攪拌
した後、超音波分散機で分散処理することにより平均粒
子径が１μｍの油滴（油相）が水性媒体に分散した懸濁
液（油滴分散体）を調製した。次に、得られた懸濁液を
容量２リットルの攪拌機付き三つ口フラスコに仕込み、
この系を７５℃に昇温し、窒素雰囲気下において攪拌し
ながら５時間にわたり油滴中のモノマーを重合（懸濁重
合）させることにより、磁性ポリマー粒子を作製した。
得られた粒子を光学顕微鏡で写真撮影し、粒子200個の
直径を計測してその平均を求めた結果1.2μｍであっ
た。 （２）上記（１）で得られた磁性ポリマー粒子を５ｍＭ
水酸化ナトリウム水溶液に分散し、８０℃で１２時間処
理してカルボキシ変性磁性ポリマー粒子とした。 （３）得られたカルボキシ変性磁性ポリマー粒子１ｇを
２０ｍLの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ６．０）に懸
濁し、ポリエチレンイミン（和光純薬工業株式会社、数
平均分子量７万）３０％水溶液、３３μLおよび水溶性
カルボジイミド試薬ＥＤＣ・塩酸塩（１−エチル−３
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロ
クロライド）０．０５ｇを添加し、２時間室温で反応さ
せた後、純水手で洗浄してポリエチレンイミン結合磁性
粒子を得た。

【００２５】参考例２（担体IIの合成） （１）耐圧反応容器にスチレン３５ｇ、ｎ−ブチルリチ
ウム０．４４ｇおよびシクロヘキサン２００ｇを仕込
み、６０〜９０℃を保ちながら４時間重合した後、反応
容器内に二酸化炭素を吹き込むことにより反応を終了し
た。次いで減圧下で溶剤および未反応単量体を留去した
のち、エーテル１００ｇを加えて希釈し、ポリマー溶液
を得た。このポリマー溶液に濃硫酸４１ｇを少しずつ添
加し、５０℃で５時間撹拌を続けた後、減圧下で溶剤を
留去し、得られた生成物を水酸化ナトリウムにより中和
後、透析によって精製し、末端カルボン酸変性ポリスチ
レンスルホン酸ナトリウム（分子量２６０００）を得
た。 （２）次に、参考例１の（２）で得られたの粒子１０ｇ
を水５０ｇに分散し、１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）０．１ｇを
加え、4℃で１時間反応後、冷水で洗浄し、次いで０．
５ｇのヘキサメチレンジアミンを加え、室温で２時間反
応後、純水で洗浄しヘキサメチレンジアミン固定化粒子
を得た。これに、ＷＳＣ ０．１ｇ、末端カルボン酸変
性ポリスチレンスルホン酸０．５ｇを加え、室温で２時
間反応した後、純水にて粒子を洗浄しポリスチレンスル
ホン酸結合磁性粒子を得た。

【００２６】ウイルス液 ポリオウイルス（非エンベロープウイルス）と水泡性口
内炎ウイルス（エンベロープウイルス）の二種類を用い
た。それぞれのウイルスを感染させたＶｅｒｏ細胞の培
養上清をウイルス液として用いた。量子的感染性測定法 本発明のウイルス選択分離方法により目的のウイルスが
分離できているかの確認法として、培養細胞による量子
的感染性測定法を用いた。９６ウエルマイクロプレート
上に培養したＶｅｒｏ細胞に、３倍希釈系列のウイルス
液、担体I処理液、担体II処理液を１０μｌ添加して、
３７℃で９６時間培養後、細胞の破壊を観察した。培養
細胞全体が破壊されているものを＋、一部が破壊されて
いるものを＋／−、破壊の見られないものを−と表記し
た。

【００２７】実施例１ ＳIｍIａｎ ｖIｒｕｓ ４０（ＳＶ４０、エンベロー
プウイルス）液２ｍｌに参考例１（担体I）の粒子を２
０ｍｇ加え、１５分間穏やかに撹拌後、磁気分離により
参考例Iの粒子を除去した。続いてこの担体I処理液のう
ち１ｍｌに、参考例２（担体II）の粒子１０ｍｇおよび
１Ｍ硫酸亜鉛２５μｌを加え、１５分間穏やかに撹拌
後、磁気分離により参考例２の粒子を除去した。この担
体III処理液および先の担体I処理液、ウイルス混合原液
をそれぞれ、Ｖｅｒｏ細胞に添加して、量子的感染性測
定法によるウイルス除去の評価を行った。結果を表１に
示す。実施例２ ポリオウイルス（非エンベロープウイルス）液２ｍｌに
参考例１（担体I）の粒子を２０ｍｇ加え、１５分間穏
やかに撹拌後、磁気分離により参考例Iの粒子を除去し
た。続いてこの担体I処理液のうち１ｍｌに、参考例２
（担体II）の粒子１０ｍｇおよび１Ｍ硫酸亜鉛２５μｌ
を加え、１５分間穏やかに撹拌後、磁気分離により参考
例２の粒子を除去した。この担体III処理液および先の
担体I処理液、ウイルス混合原液をそれぞれ、Ｖｅｒｏ
細胞に添加して、量子的感染性測定法によるウイルス除
去の評価を行った。結果を表２に示す。

【００２８】

【表１】 I：担体I処理液 II：担体II処理液

【００２９】

【表２】 I：担体I処理液 II：担体II処理液

【００３０】

【発明の効果】本発明のエンベロープウイルスと非エン
ベロープウイルスの選択的分離方法では、簡便な操作で
それぞれのウイルスを分離可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 日方 幹雄 東京都中央区築地二丁目11番24号ジェイエ スアール株式会社内 (72)発明者 佐藤 功栄 茨城県猿島群総和町大字下大野字高谷2965 −37 (72)発明者 山口 照英 東京都練馬区大泉学園町５−10−15 Ｆターム(参考） 4B065 AA95X BD14 BD40 CA60

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １．カチオン性基を少なくともその表面
   に持つウイルス結合性担体Iをウイルス含有試料に添加
   した後、ウイルス結合性担体Iを試料から分離すること
   によりエンベロープウイルスを分離する工程および ２．アニオン性基を少なくともその表面に持つウイルス
   結合性担体IIを添加した後、ウイルス結合性担体IIを試
   料から分離することにより非エンベロープウィルスを分
   離する工程を含むことを特徴とするエンベロープウィル
   スと非エンベロープウイルスの選択的分離方法。