JP2002228661A - 表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法 - Google Patents
表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法Info
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- JP2002228661A JP2002228661A JP2001023010A JP2001023010A JP2002228661A JP 2002228661 A JP2002228661 A JP 2002228661A JP 2001023010 A JP2001023010 A JP 2001023010A JP 2001023010 A JP2001023010 A JP 2001023010A JP 2002228661 A JP2002228661 A JP 2002228661A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 微生物、ウイルス又は環境ホルモンを煩雑な
操作や標識物質を使用することなくリアルタイムで、高
感度で検出し測定できるバイオセンサー用測定チップを
提供する。 【解決手段】 光学的に透明な基板と、該基板上に形成
された金属薄膜と、該金属薄膜上に形成されたアミノシ
ラン膜と、該アミノシラン膜上に固定化された生理活性
物質とからなる表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップにおいて、生理活性物質としてコンカナバリン
Ａ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲンレセプタ
ー、テストステロンレセプター及びシクロデキストリン
からなる群の中から選択される少なくとも１種の物質を
使用することを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセ
ンサー用測定チップ及びその製造方法。
操作や標識物質を使用することなくリアルタイムで、高
感度で検出し測定できるバイオセンサー用測定チップを
提供する。 【解決手段】 光学的に透明な基板と、該基板上に形成
された金属薄膜と、該金属薄膜上に形成されたアミノシ
ラン膜と、該アミノシラン膜上に固定化された生理活性
物質とからなる表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップにおいて、生理活性物質としてコンカナバリン
Ａ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲンレセプタ
ー、テストステロンレセプター及びシクロデキストリン
からなる群の中から選択される少なくとも１種の物質を
使用することを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセ
ンサー用測定チップ及びその製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、大腸菌、黄色ブド
ウ球菌、肺炎桿菌などの微生物、インフルエンザウイル
スなどのウイルス又は近年問題となっている外因性分泌
撹乱化学物質すなわち環境ホルモンを簡便に検出できる
表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ及びそ
の製造方法に関する。
ウ球菌、肺炎桿菌などの微生物、インフルエンザウイル
スなどのウイルス又は近年問題となっている外因性分泌
撹乱化学物質すなわち環境ホルモンを簡便に検出できる
表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ及びそ
の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、臨床検査等において試料中の測定
対象物質を検出し測定する方法として抗原−抗体反応な
どの免疫反応を利用した方法、例えばELISA法などが使
用されている。しかしながら、ELISA法などの従来の方
法は、煩雑な操作や標識物質を必要とする。従って、煩
雑な操作や標識物質を必要とすることなく試料中の測定
対象物質を検出し測定することができる方法として、金
属／液体の界面で表面プラズモンが励起した場合に起こ
るいわゆる表面プラズモン共鳴を利用した方法が開発さ
れ、この方法に使用する表面プラズモン共鳴測定装置
（以下、「表面プラズモン共鳴バイオセンサー」とい
う）用の測定チップとして透明基板と、該透明基板上に
配置された金属膜と、該金属膜上に配置された有機ケイ
素膜と、該有機ケイ素膜上に配置された生理活性物質と
を備えた測定チップが提案され、ヒト血清アルブミンや
除草剤アトラジンの検出及び測定に使用されている(特
開平10-267930号公報)。また、プラズモン共鳴バイオセ
ンサー用測定チップとして、透明基板と、該透明基板上
に形成された金属膜と、該金属膜上に形成された蒸着重
合膜と、該蒸着重合膜の表面に固定化された生理活性物
質とからなる層が光学部分に設けられている測定チップ
が提案され、プローブDNAと相補的な塩基配列の検出に
使用されている(特開平11-281569号公報)。
対象物質を検出し測定する方法として抗原−抗体反応な
どの免疫反応を利用した方法、例えばELISA法などが使
用されている。しかしながら、ELISA法などの従来の方
法は、煩雑な操作や標識物質を必要とする。従って、煩
雑な操作や標識物質を必要とすることなく試料中の測定
対象物質を検出し測定することができる方法として、金
属／液体の界面で表面プラズモンが励起した場合に起こ
るいわゆる表面プラズモン共鳴を利用した方法が開発さ
れ、この方法に使用する表面プラズモン共鳴測定装置
（以下、「表面プラズモン共鳴バイオセンサー」とい
う）用の測定チップとして透明基板と、該透明基板上に
配置された金属膜と、該金属膜上に配置された有機ケイ
素膜と、該有機ケイ素膜上に配置された生理活性物質と
を備えた測定チップが提案され、ヒト血清アルブミンや
除草剤アトラジンの検出及び測定に使用されている(特
開平10-267930号公報)。また、プラズモン共鳴バイオセ
ンサー用測定チップとして、透明基板と、該透明基板上
に形成された金属膜と、該金属膜上に形成された蒸着重
合膜と、該蒸着重合膜の表面に固定化された生理活性物
質とからなる層が光学部分に設けられている測定チップ
が提案され、プローブDNAと相補的な塩基配列の検出に
使用されている(特開平11-281569号公報)。
【０００３】また、従来、大腸菌や黄色ブドウ球菌など
の微生物や、インフルエンザウイルスなどのウイルスの
検出は、これらを適当な培地上で長時間培養して増殖さ
せることによって行われている。さらにまた、近年、外
界に広く存在して生物の生活活動と共に体内に取り込ま
れてその生殖、発生、行動などを含む生理的な内分泌の
諸現象に影響を及ぼす外因性内分泌撹乱化学物質（以
下、「環境ホルモン」という）、例えば17β-エストラ
ジオール、ビスフェノールＡ、ノニルフェノール、DD
T、ダイオキシン類、ビンフロゾリン、DDE、TCDD、PCB
などが 問題となっており、これらの物質の検出及び測
定は高精度のガスクロマトグラフィー質量分析計(GC-M
S)を使用して行われている。従って、微生物やウイルス
や環境ホルモンを、煩雑な操作や標識物質を必要とせず
に、短時間で簡便に検出し測定できる技術の開発が望ま
れている。
の微生物や、インフルエンザウイルスなどのウイルスの
検出は、これらを適当な培地上で長時間培養して増殖さ
せることによって行われている。さらにまた、近年、外
界に広く存在して生物の生活活動と共に体内に取り込ま
れてその生殖、発生、行動などを含む生理的な内分泌の
諸現象に影響を及ぼす外因性内分泌撹乱化学物質（以
下、「環境ホルモン」という）、例えば17β-エストラ
ジオール、ビスフェノールＡ、ノニルフェノール、DD
T、ダイオキシン類、ビンフロゾリン、DDE、TCDD、PCB
などが 問題となっており、これらの物質の検出及び測
定は高精度のガスクロマトグラフィー質量分析計(GC-M
S)を使用して行われている。従って、微生物やウイルス
や環境ホルモンを、煩雑な操作や標識物質を必要とせず
に、短時間で簡便に検出し測定できる技術の開発が望ま
れている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、微生物、ウ
イルス又は環境ホルモンを煩雑な操作や標識物質を必要
とすることなく検出し測定できる表面プラズモン共鳴バ
イオセンサー用測定チップを提供することを目的とす
る。
イルス又は環境ホルモンを煩雑な操作や標識物質を必要
とすることなく検出し測定できる表面プラズモン共鳴バ
イオセンサー用測定チップを提供することを目的とす
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的に鑑み、微生物やウイルスの細胞表面にあるマンノー
ス糖鎖に着目して鋭意研究を重ねた結果、マンノース糖
鎖末端を認識できる物質としてコンカナバリンＡ又はシ
アル酸含有糖鎖を選択し、該コンカナバリンＡ又はシア
ル酸含有糖鎖を、光学的に透明な基板上の金属薄膜の表
面に形成したアミノシラン膜の表面に固定化することに
よって調製した表面プラズモン共鳴測定用チップを使用
すると意外にも大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌又は
インフルエンザウイルスＡをリアルタイムで高感度で検
出できることを見出し、また上記のアミノシラン膜の表
面にエストロゲンレセプター、テストステロンレセプタ
ー又はシクロデキストリンを固定化することによって調
製した表面プラズモン共鳴測定用チップを使用すると意
外にも環境ホルモンを検出できることを見出し、これら
の知見に基づいて本発明を完成するに至った。
的に鑑み、微生物やウイルスの細胞表面にあるマンノー
ス糖鎖に着目して鋭意研究を重ねた結果、マンノース糖
鎖末端を認識できる物質としてコンカナバリンＡ又はシ
アル酸含有糖鎖を選択し、該コンカナバリンＡ又はシア
ル酸含有糖鎖を、光学的に透明な基板上の金属薄膜の表
面に形成したアミノシラン膜の表面に固定化することに
よって調製した表面プラズモン共鳴測定用チップを使用
すると意外にも大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌又は
インフルエンザウイルスＡをリアルタイムで高感度で検
出できることを見出し、また上記のアミノシラン膜の表
面にエストロゲンレセプター、テストステロンレセプタ
ー又はシクロデキストリンを固定化することによって調
製した表面プラズモン共鳴測定用チップを使用すると意
外にも環境ホルモンを検出できることを見出し、これら
の知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明の第一の要旨によれば、
光学的に透明な基板と、該基板上に形成された金属薄膜
と、該金属薄膜上に形成されたアミノシラン膜と、該ア
ミノシラン膜上に固定化された生理活性物質とからなる
表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップにおい
て、生理活性物質としてコンカナバリンＡ、シアル酸含
有シアロ糖鎖、エストロゲンレセプター、テストステロ
ンレセプター 及び シクロデキストリンからなる群の中
から選択される少なくとも１種の物質を使用することを
特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チ
ップが提供される。
光学的に透明な基板と、該基板上に形成された金属薄膜
と、該金属薄膜上に形成されたアミノシラン膜と、該ア
ミノシラン膜上に固定化された生理活性物質とからなる
表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップにおい
て、生理活性物質としてコンカナバリンＡ、シアル酸含
有シアロ糖鎖、エストロゲンレセプター、テストステロ
ンレセプター 及び シクロデキストリンからなる群の中
から選択される少なくとも１種の物質を使用することを
特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チ
ップが提供される。
【０００７】また、本発明の第二の要旨によれば、光学
的に透明な基板と、該基板上に形成された金属薄膜と、
該金属薄膜上に形成されたアミノシラン膜からなり、該
アミノシラン膜上にコンカナバリンＡ、シアル酸含有シ
アロ糖鎖、エストロゲンレセプター又はテストステロン
レセプターがグルタルアルデヒド重合膜を介して固定化
されていることを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオ
センサー用測定チップが提供される。
的に透明な基板と、該基板上に形成された金属薄膜と、
該金属薄膜上に形成されたアミノシラン膜からなり、該
アミノシラン膜上にコンカナバリンＡ、シアル酸含有シ
アロ糖鎖、エストロゲンレセプター又はテストステロン
レセプターがグルタルアルデヒド重合膜を介して固定化
されていることを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオ
センサー用測定チップが提供される。
【０００８】さらにまた、本発明の第三の要旨によれ
ば、光学的に透明な基板上に金属薄膜を形成し、該金属
薄膜の上にアミノシラン膜を形成し、次いで該アミノシ
ラン膜の表面にコンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ
糖鎖、エストロゲンレセプター、テストステロンレセプ
ター及びシクロデキストリンからなる群の中から選択さ
れる少なくとも１種の物質を固定化することを特徴とす
る表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製
造方法が提供される。
ば、光学的に透明な基板上に金属薄膜を形成し、該金属
薄膜の上にアミノシラン膜を形成し、次いで該アミノシ
ラン膜の表面にコンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ
糖鎖、エストロゲンレセプター、テストステロンレセプ
ター及びシクロデキストリンからなる群の中から選択さ
れる少なくとも１種の物質を固定化することを特徴とす
る表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製
造方法が提供される。
【０００９】さらにまた、本発明の第四の要旨によれ
ば、光学的に透明な基板上に金属薄膜を形成し、該金属
薄膜の上にアミノシラン膜を形成し、次いで該アミノシ
ラン膜の表面にグルタルアルデヒド重合膜を形成し、次
いで該グルタルアルデヒド重合膜の表面にコンカナバリ
ンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲンレセプタ
ー及びテストステロンレセプターからなる群の中から選
択される少なくとも１種の物質を固定化することを特徴
とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ
の製造方法が提供される。
ば、光学的に透明な基板上に金属薄膜を形成し、該金属
薄膜の上にアミノシラン膜を形成し、次いで該アミノシ
ラン膜の表面にグルタルアルデヒド重合膜を形成し、次
いで該グルタルアルデヒド重合膜の表面にコンカナバリ
ンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲンレセプタ
ー及びテストステロンレセプターからなる群の中から選
択される少なくとも１種の物質を固定化することを特徴
とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ
の製造方法が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の表面プラズモン共鳴バイ
オセンサー用測定チップ(以下、単に「測定チップ」と
いう)は、光学的に透明な基板と、該基板上に形成され
た金属薄膜と、該金属薄膜上に形成されたアミノシラン
膜と、該アミノシラン膜上に固定化されたコンカナバリ
ンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲンレセプタ
ー(生理活性があれば天然品でも合成品でもよい)、テス
トステロンレセプター及びシクロデキストリン（α-、
β-又はγ-シクロデキストリン等）からなる群の中から
選択される少なくとも１種の物質とを有してなる。
オセンサー用測定チップ(以下、単に「測定チップ」と
いう)は、光学的に透明な基板と、該基板上に形成され
た金属薄膜と、該金属薄膜上に形成されたアミノシラン
膜と、該アミノシラン膜上に固定化されたコンカナバリ
ンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲンレセプタ
ー(生理活性があれば天然品でも合成品でもよい)、テス
トステロンレセプター及びシクロデキストリン（α-、
β-又はγ-シクロデキストリン等）からなる群の中から
選択される少なくとも１種の物質とを有してなる。
【００１１】本発明の測定チップを構成する光学的に透
明な基板は、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定
チップに使用されているものであればどのようなもので
よいが、一般的にはガラス、ポリエチレンテレフタレー
ト、ポリカーボネートなどのレーザー光に対して透明な
材料からなるものであり、その厚みは0.1〜20mm程度で
ある。
明な基板は、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定
チップに使用されているものであればどのようなもので
よいが、一般的にはガラス、ポリエチレンテレフタレー
ト、ポリカーボネートなどのレーザー光に対して透明な
材料からなるものであり、その厚みは0.1〜20mm程度で
ある。
【００１２】また、本発明の測定チップを構成する金属
薄膜は表面プラズモン共鳴を生じるものであれば特に限
定されないが、この金属薄膜に使用することができる金
属としては、例えば金、銀、銅、アルミニウム、白金等
が挙げられ、これらは単独で使用してもよいし又は組み
合わせて使用してもよい。また、前記の透明基板に対す
る付着性を考慮して、該透明基板と前記の金属薄膜との
間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属薄膜
の厚みは100〜2000Åであるのが好ましく、200〜600Å
であるのがさらに好ましい。金属薄膜の厚みが3000Åを
超えると媒質の表面プラズモン現象を十分に検出するこ
とができないので好ましくない。また、クロム等からな
る介在層を設ける場合には、その介在層の厚さは30〜50
Åであることが好ましい。
薄膜は表面プラズモン共鳴を生じるものであれば特に限
定されないが、この金属薄膜に使用することができる金
属としては、例えば金、銀、銅、アルミニウム、白金等
が挙げられ、これらは単独で使用してもよいし又は組み
合わせて使用してもよい。また、前記の透明基板に対す
る付着性を考慮して、該透明基板と前記の金属薄膜との
間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属薄膜
の厚みは100〜2000Åであるのが好ましく、200〜600Å
であるのがさらに好ましい。金属薄膜の厚みが3000Åを
超えると媒質の表面プラズモン現象を十分に検出するこ
とができないので好ましくない。また、クロム等からな
る介在層を設ける場合には、その介在層の厚さは30〜50
Åであることが好ましい。
【００１３】前記の金属薄膜は、前記の光学的に透明な
基板上に常法に従って形成することができ、例えばスパ
ッタリング法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気
メッキ法、無電解メッキ法等によって形成することがで
きる。
基板上に常法に従って形成することができ、例えばスパ
ッタリング法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気
メッキ法、無電解メッキ法等によって形成することがで
きる。
【００１４】また、本発明の測定チップを構成するアミ
ノシラン膜は、Si-Ｏ及びSi−Ｃ結合並びにNH2基を分子
内に含む高分子からなる膜であり、例えばシランカップ
リング剤を用いて形成することができる。シランカップ
リング剤は、分子中に有機材料と親和性のある有機官能
基、例えばアミノ基と、無機材料と親和性のある加水分
解性基、例えばメトキシ基又はエトキシ基とを有する有
機ケイ素化合物であり、その加水分解性基は前記の金属
薄膜中の金属原子と結合し、またその有機官能基はコン
カナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲン
レセプター、テストステロンレセプター又はシクロデキ
ストリンと結合する。これにより前記の金属薄膜、アミ
ノシラン膜並びにコンカナバリンＡ、シアル酸含有シア
ロ糖鎖、エストロゲンレセプター、テストステロンレセ
プター又はシクロデキストリンの三者が強固に固定化さ
れる。本発明に使用できるシランカップリング剤として
は、例えば3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-ア
ミノプロピルトリメトキシシラン、3-アミノプロピルジ
エトキシメチルシラン、3-(2-アミノエチルアミノプロ
ピル)トリメトキシシラン、3-(2-アミノエチルアミノプ
ロピル)ジメトキシメチルシラン、3-メルカプトプロピ
ルトリメトキシシラン、ジメトキシ-3-メルカプトプロ
ピルメチルシランなどが挙げられ、これらは単独で使用
してもよいし又は組み合わせて使用してもよい。
ノシラン膜は、Si-Ｏ及びSi−Ｃ結合並びにNH2基を分子
内に含む高分子からなる膜であり、例えばシランカップ
リング剤を用いて形成することができる。シランカップ
リング剤は、分子中に有機材料と親和性のある有機官能
基、例えばアミノ基と、無機材料と親和性のある加水分
解性基、例えばメトキシ基又はエトキシ基とを有する有
機ケイ素化合物であり、その加水分解性基は前記の金属
薄膜中の金属原子と結合し、またその有機官能基はコン
カナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲン
レセプター、テストステロンレセプター又はシクロデキ
ストリンと結合する。これにより前記の金属薄膜、アミ
ノシラン膜並びにコンカナバリンＡ、シアル酸含有シア
ロ糖鎖、エストロゲンレセプター、テストステロンレセ
プター又はシクロデキストリンの三者が強固に固定化さ
れる。本発明に使用できるシランカップリング剤として
は、例えば3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-ア
ミノプロピルトリメトキシシラン、3-アミノプロピルジ
エトキシメチルシラン、3-(2-アミノエチルアミノプロ
ピル)トリメトキシシラン、3-(2-アミノエチルアミノプ
ロピル)ジメトキシメチルシラン、3-メルカプトプロピ
ルトリメトキシシラン、ジメトキシ-3-メルカプトプロ
ピルメチルシランなどが挙げられ、これらは単独で使用
してもよいし又は組み合わせて使用してもよい。
【００１５】前記のアミノシラン膜は、前記のようにし
て光学的に透明な基板上に形成された金属薄膜を、例え
ばシランカップリング剤の飽和蒸気中に一定時間暴露す
る方法（飽和蒸気法）、シランカップリング剤を含む溶
液中に一定時間浸漬する方法（浸漬法）、スピンコータ
を用いる方法（スピンコーティング法）、グラビア印刷
機を用いる方法（グラビア法）などにより成膜して形成
することができる。
て光学的に透明な基板上に形成された金属薄膜を、例え
ばシランカップリング剤の飽和蒸気中に一定時間暴露す
る方法（飽和蒸気法）、シランカップリング剤を含む溶
液中に一定時間浸漬する方法（浸漬法）、スピンコータ
を用いる方法（スピンコーティング法）、グラビア印刷
機を用いる方法（グラビア法）などにより成膜して形成
することができる。
【００１６】このようにして光学的に透明な基板上に形
成された金属薄膜上に形成されたアミノシラン膜を有す
る表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ又は
キュベットは、Biacore社やAffinity Sensors社から市
販されているので、これらを使用してもよい。
成された金属薄膜上に形成されたアミノシラン膜を有す
る表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ又は
キュベットは、Biacore社やAffinity Sensors社から市
販されているので、これらを使用してもよい。
【００１７】前記のようにして形成されたアミノシラン
膜表面に対するコンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ
糖鎖、エストロゲンレセプター、テストステロンレセプ
ター又はシクロデキストリンの固定化は、常法に従って
行うことができ、例えば該アミノシラン膜に所定量のコ
ンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲ
ンレセプター、テストステロンレセプター又はシクロデ
キストリンを所定時間接触させることによって行うこと
ができる。この固定化は、例えば前記のようにして金属
薄膜及びアミノシラン膜を形成してある透明基板を、フ
ローセル型又はバッチ型の表面プラズモン共鳴バイオセ
ンサーのカートリッジブロック上に設置して、これにコ
ンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲ
ンレセプター、テストステロンレセプター又はシクロデ
キストリンを所定時間接触させることによって行うこと
もできる。
膜表面に対するコンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ
糖鎖、エストロゲンレセプター、テストステロンレセプ
ター又はシクロデキストリンの固定化は、常法に従って
行うことができ、例えば該アミノシラン膜に所定量のコ
ンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲ
ンレセプター、テストステロンレセプター又はシクロデ
キストリンを所定時間接触させることによって行うこと
ができる。この固定化は、例えば前記のようにして金属
薄膜及びアミノシラン膜を形成してある透明基板を、フ
ローセル型又はバッチ型の表面プラズモン共鳴バイオセ
ンサーのカートリッジブロック上に設置して、これにコ
ンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲ
ンレセプター、テストステロンレセプター又はシクロデ
キストリンを所定時間接触させることによって行うこと
もできる。
【００１８】前記のようにしてアミノシラン膜上に固定
化されたコンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、
エストロゲンレセプター、テストステロンレセプター又
はシクロデキストリンの層の厚みは、使用する物質の大
きさにもよるが100〜3000Åであるのが好ましく、特に1
00〜1000Åであるのが好ましい。
化されたコンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、
エストロゲンレセプター、テストステロンレセプター又
はシクロデキストリンの層の厚みは、使用する物質の大
きさにもよるが100〜3000Åであるのが好ましく、特に1
00〜1000Åであるのが好ましい。
【００１９】また、本発明の別の態様の測定チップは、
コンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロ
ゲンレセプター又はテストステロンレセプターがグルタ
ルアルデヒド重合膜を介してアミノシラン膜上に固定化
されているものであり、光学的に透明な基板と、該基板
上に形成された金属薄膜と、該金属薄膜上に形成された
アミノシラン膜と、該アミノシラン膜の上にさらにグル
タルアルデヒド重合膜を有し、この重合膜を介してコン
カナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲン
レセプター又はテストステロンレセプターが固定化され
ている。
コンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロ
ゲンレセプター又はテストステロンレセプターがグルタ
ルアルデヒド重合膜を介してアミノシラン膜上に固定化
されているものであり、光学的に透明な基板と、該基板
上に形成された金属薄膜と、該金属薄膜上に形成された
アミノシラン膜と、該アミノシラン膜の上にさらにグル
タルアルデヒド重合膜を有し、この重合膜を介してコン
カナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲン
レセプター又はテストステロンレセプターが固定化され
ている。
【００２０】このように、グルタルアルデヒド重合膜を
設け、それにコンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖
鎖、エストロゲンレセプター又はテストステロンレセプ
ターを共有結合により強固に固定化すると、測定チップ
を洗浄しても前記物質の固定化を維持でき、繰り返し測
定に使用することができるという利点を有する。この場
合のグルタルアルデヒド重合膜の厚みは10〜100Åであ
るのが好ましく、特に10〜20Åであるのが好ましい。
設け、それにコンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖
鎖、エストロゲンレセプター又はテストステロンレセプ
ターを共有結合により強固に固定化すると、測定チップ
を洗浄しても前記物質の固定化を維持でき、繰り返し測
定に使用することができるという利点を有する。この場
合のグルタルアルデヒド重合膜の厚みは10〜100Åであ
るのが好ましく、特に10〜20Åであるのが好ましい。
【００２１】前記のグルタルアルデヒド重合膜の形成
は、常法に従って行うことができ、例えば前記のように
予め金属薄膜及びアミノシラン膜を形成しておいた透明
基板のアミノシラン膜上でグルタルアルデヒドを重合さ
せることにより行うことができる。グルタルアルデヒド
重合膜に対するコンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ
糖鎖、エストロゲンレセプター又はテストステロンレセ
プターの固定化は、これらの物質をアミノシラン膜に固
定化する場合と同様にして行うことができる。
は、常法に従って行うことができ、例えば前記のように
予め金属薄膜及びアミノシラン膜を形成しておいた透明
基板のアミノシラン膜上でグルタルアルデヒドを重合さ
せることにより行うことができる。グルタルアルデヒド
重合膜に対するコンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ
糖鎖、エストロゲンレセプター又はテストステロンレセ
プターの固定化は、これらの物質をアミノシラン膜に固
定化する場合と同様にして行うことができる。
【００２２】このようにして作製される本発明の測定チ
ップは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーにおいて微
生物、ウイルス又は環境ホルモンをリアルタイムで高感
度で検出し測定するのに使用できる。例えば、生理活性
物質としてコンカナバリンＡを固定化した測定チップを
使用した場合にはインフルエンザウイルスＡなどのウイ
ルスを高感度で検出でき、生理活性物質としてシアル酸
含有シアロ糖鎖を固定化した測定チップを使用した場合
には大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌などの微生物を
高感度で検出でき、また生理活性物質としてエストロゲ
ンレセプター、テストステロンレセプター又はシクロデ
キストリンを固定化した測定チップを使用した場合には
17β-エストラジオール、ビスフェノールＡ、DDT、ダイ
オキシン、PCB、フタル酸エステルなどの環境ホルモン
をリアルタイムで検出することができる。また、多くの
環境ホルモンは疎水性であるので、これらを検出し測定
する場合には、測定対象溶液にβ-シクロデキストリン
を加えて測定することによりさらに高感度で検出し測定
することができる。
ップは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーにおいて微
生物、ウイルス又は環境ホルモンをリアルタイムで高感
度で検出し測定するのに使用できる。例えば、生理活性
物質としてコンカナバリンＡを固定化した測定チップを
使用した場合にはインフルエンザウイルスＡなどのウイ
ルスを高感度で検出でき、生理活性物質としてシアル酸
含有シアロ糖鎖を固定化した測定チップを使用した場合
には大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌などの微生物を
高感度で検出でき、また生理活性物質としてエストロゲ
ンレセプター、テストステロンレセプター又はシクロデ
キストリンを固定化した測定チップを使用した場合には
17β-エストラジオール、ビスフェノールＡ、DDT、ダイ
オキシン、PCB、フタル酸エステルなどの環境ホルモン
をリアルタイムで検出することができる。また、多くの
環境ホルモンは疎水性であるので、これらを検出し測定
する場合には、測定対象溶液にβ-シクロデキストリン
を加えて測定することによりさらに高感度で検出し測定
することができる。
【００２３】
【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説
明する。
明する。
【００２４】実施例１： シアル酸含有シアロ糖鎖を固
定化した測定チップの作製 1.1 金属薄膜の調製 光学的に透明な基板として幅18mm、長さ18mm及び厚さ0.
15mmのガラス板を使用した。この透明基板上にスパッタ
リングによりクロムからなる薄膜を形成し、次いでその
表面に金からなる薄膜を形成した。スパッタリングの条
件はクロムについては100Ｗで30秒間、金については100
Ｗで150秒間で行った。得られたクロムの薄膜の厚さは3
0Åであり、金の薄膜の厚さは470Åであった。
定化した測定チップの作製 1.1 金属薄膜の調製 光学的に透明な基板として幅18mm、長さ18mm及び厚さ0.
15mmのガラス板を使用した。この透明基板上にスパッタ
リングによりクロムからなる薄膜を形成し、次いでその
表面に金からなる薄膜を形成した。スパッタリングの条
件はクロムについては100Ｗで30秒間、金については100
Ｗで150秒間で行った。得られたクロムの薄膜の厚さは3
0Åであり、金の薄膜の厚さは470Åであった。
【００２５】1.2 アミノシラン膜の調製 上記のようして調製した金属薄膜を有するガラス板を、
シランカップリング剤の飽和蒸気中に暴露させて、金属
薄膜上にアミノシラン膜を形成させた。すなわち、容量
10mlのサンプルびんに500μlのγ-アミノプロピルエト
キシシラン〔（H2N-(CH2)3Si(OEt)3 、東芝シリコーン
株式会社製のTSL 8331）を入れ、室温で24時間放置し、
サンプルびん内部をγ-アミノプロピルエトキシシラン
の飽和蒸気で満たした。次に、上記の1.1に記載のよう
にして調製した金属薄膜を有するガラス板をその金属薄
膜部分が露出するようにPET製のマスク（支持具）の中
央部に固定し、このマスクをサンプルびんの開口部に載
せて15分又は90分間放置してガラス板の金属薄膜上にア
ミノシラン膜を形成させた。
シランカップリング剤の飽和蒸気中に暴露させて、金属
薄膜上にアミノシラン膜を形成させた。すなわち、容量
10mlのサンプルびんに500μlのγ-アミノプロピルエト
キシシラン〔（H2N-(CH2)3Si(OEt)3 、東芝シリコーン
株式会社製のTSL 8331）を入れ、室温で24時間放置し、
サンプルびん内部をγ-アミノプロピルエトキシシラン
の飽和蒸気で満たした。次に、上記の1.1に記載のよう
にして調製した金属薄膜を有するガラス板をその金属薄
膜部分が露出するようにPET製のマスク（支持具）の中
央部に固定し、このマスクをサンプルびんの開口部に載
せて15分又は90分間放置してガラス板の金属薄膜上にア
ミノシラン膜を形成させた。
【００２６】1.3 アミノシラン膜へのシアル酸含有シ
アロ糖鎖の固定化 透明基板の金属薄膜上にアミノシラン膜を有する表面プ
ラズモン共鳴センサー用測定キュベットであって、表面
プラズモン共鳴センサー用にAffinity Sensors社から市
販されている200μl容量アミノシランキュベットを使用
して行った。前記の200μl容量のアミノシランキュベッ
トを、Affinity Sensors社製の表面プラズモン共鳴セン
サー IAsysのカートリッジブロック上に設置した。次い
で、このアミノシランキュベットに蒸留水を注入して洗
浄し、Iasys に接続したパソコンディスプレー上に表示
されるセンサーグラムのベースラインの安定化を待っ
た。ベースラインが安定化した後に、シアロ糖鎖含有シ
アル酸(Sialo-OHと略記する）１mＭ、1-エチル-3-(3-ジ
メチルアミノプロピル)カルボジイミド１mＭ及びN-ヒド
ロキシコハク酸イミド１mＭを蒸留水に溶解して調製し
たシアル酸複合糖溶液100μlを、前記キュベットに注入
してアミノシラン膜と十分に接触させ、次いでキュベッ
トに蒸留水を注入して洗浄した。上記のシアル酸複合糖
溶液の注入及び蒸留水の洗浄を再度繰り返した。次い
で、前記キュベットに１Ｍ無水酢酸／酢酸混合溶液100
μlを注入して、キュベット表面上の未反応のアミノシ
ラン膜のアミノ基をブロッキングし、その後に蒸留水を
通して洗浄した。このようにして、前記のアミノシラン
キュベットのアミノシラン膜にシアル酸複合糖鎖（すな
わち、シアル酸含有シアロ糖鎖）を固定化した表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップを作製した。
アロ糖鎖の固定化 透明基板の金属薄膜上にアミノシラン膜を有する表面プ
ラズモン共鳴センサー用測定キュベットであって、表面
プラズモン共鳴センサー用にAffinity Sensors社から市
販されている200μl容量アミノシランキュベットを使用
して行った。前記の200μl容量のアミノシランキュベッ
トを、Affinity Sensors社製の表面プラズモン共鳴セン
サー IAsysのカートリッジブロック上に設置した。次い
で、このアミノシランキュベットに蒸留水を注入して洗
浄し、Iasys に接続したパソコンディスプレー上に表示
されるセンサーグラムのベースラインの安定化を待っ
た。ベースラインが安定化した後に、シアロ糖鎖含有シ
アル酸(Sialo-OHと略記する）１mＭ、1-エチル-3-(3-ジ
メチルアミノプロピル)カルボジイミド１mＭ及びN-ヒド
ロキシコハク酸イミド１mＭを蒸留水に溶解して調製し
たシアル酸複合糖溶液100μlを、前記キュベットに注入
してアミノシラン膜と十分に接触させ、次いでキュベッ
トに蒸留水を注入して洗浄した。上記のシアル酸複合糖
溶液の注入及び蒸留水の洗浄を再度繰り返した。次い
で、前記キュベットに１Ｍ無水酢酸／酢酸混合溶液100
μlを注入して、キュベット表面上の未反応のアミノシ
ラン膜のアミノ基をブロッキングし、その後に蒸留水を
通して洗浄した。このようにして、前記のアミノシラン
キュベットのアミノシラン膜にシアル酸複合糖鎖（すな
わち、シアル酸含有シアロ糖鎖）を固定化した表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップを作製した。
【００２７】実施例２： グルタルアルデヒド重合膜を
介してアミノシラン膜にコンカナバリンＡを固定化した
測定チップの作製 2.1 金属薄膜及びアミノシラン膜の調製 光学的に透明な基板として幅18mm、長さ18mm及び厚さ0.
15mmのガラス板を使用し、実施例１の1.1 に記載のよう
にしてこのガラス板上に金属薄膜を形成し、次いで実施
例１の1.1 に記載のようにして金属薄膜の上にアミノシ
ラン膜を形成した。
介してアミノシラン膜にコンカナバリンＡを固定化した
測定チップの作製 2.1 金属薄膜及びアミノシラン膜の調製 光学的に透明な基板として幅18mm、長さ18mm及び厚さ0.
15mmのガラス板を使用し、実施例１の1.1 に記載のよう
にしてこのガラス板上に金属薄膜を形成し、次いで実施
例１の1.1 に記載のようにして金属薄膜の上にアミノシ
ラン膜を形成した。
【００２８】2.2 アミノシラン膜へのコンカナバリン
Ａの固定化 透明基板の金属薄膜上にアミノシラン膜を有する表面プ
ラズモン共鳴センサー用測定キュベットであって、表面
プラズモン共鳴センサー用にAffinity Sensors社から市
販されている200μl容量アミノシランキュベットを使用
して行った。前記の200μl容量アミノシランキュベット
を、Affinity Sensors社製の表面プラズモン共鳴センサ
ー IAsysのカートリッジブロック上に設置した。次いで
アミノシランキュベットにリン酸緩衝液(以下、「PBS」
と略記する)(pH 7.2)を通して洗浄し、IAsysに接続した
コンピューターディスプレー上に表示されるセンサーグ
ラムのベースラインの安定化を待った。ベースラインが
安定した後に、予め５％グルタルアルデヒド５mlと0.1
Ｍ Na0H 500μlを混合して30分間放置し、次いで0.1Ｍ
HCl 500μlを加えてグルタルアルデヒドを重合させてお
いた4.2％グルタルアルデヒド重合物をアミノシランキ
ュベットに入れて30分間放置した。次いで、このキュベ
ットをPBS（pH7.2）を注入して５分間洗浄した。次に、
キュベットにコンカナバリンＡ(濃度300μ／ml)を注入
して30分間放置し、次いでPBS（pH7.2）で５分間洗浄し
た。次に、キュベットに再生用緩衝液（１Ｍギ酸）を入
れて２分間放置し、PBS（pH7.2）で５〜10分間洗浄し、
次いでブロッキング剤(１Ｍエタノールアミン)を注入し
て５〜10分間放置し、その後にPBS（pH7.2）を注入して
５分間洗浄した。次いで、キュベットに再生用緩衝液
(１Ｍギ酸)を入れて２分間放置し、次いでPBS（pH7.2）
で５〜10分間洗浄した。このようにして、アミノシラン
キュベットのアミノシラン膜にグルタルアルデヒド重合
膜を介してコンカナバリンＡを固定化した表面プラズモ
ン共鳴バイオセンサー用測定チップを作製した。
Ａの固定化 透明基板の金属薄膜上にアミノシラン膜を有する表面プ
ラズモン共鳴センサー用測定キュベットであって、表面
プラズモン共鳴センサー用にAffinity Sensors社から市
販されている200μl容量アミノシランキュベットを使用
して行った。前記の200μl容量アミノシランキュベット
を、Affinity Sensors社製の表面プラズモン共鳴センサ
ー IAsysのカートリッジブロック上に設置した。次いで
アミノシランキュベットにリン酸緩衝液(以下、「PBS」
と略記する)(pH 7.2)を通して洗浄し、IAsysに接続した
コンピューターディスプレー上に表示されるセンサーグ
ラムのベースラインの安定化を待った。ベースラインが
安定した後に、予め５％グルタルアルデヒド５mlと0.1
Ｍ Na0H 500μlを混合して30分間放置し、次いで0.1Ｍ
HCl 500μlを加えてグルタルアルデヒドを重合させてお
いた4.2％グルタルアルデヒド重合物をアミノシランキ
ュベットに入れて30分間放置した。次いで、このキュベ
ットをPBS（pH7.2）を注入して５分間洗浄した。次に、
キュベットにコンカナバリンＡ(濃度300μ／ml)を注入
して30分間放置し、次いでPBS（pH7.2）で５分間洗浄し
た。次に、キュベットに再生用緩衝液（１Ｍギ酸）を入
れて２分間放置し、PBS（pH7.2）で５〜10分間洗浄し、
次いでブロッキング剤(１Ｍエタノールアミン)を注入し
て５〜10分間放置し、その後にPBS（pH7.2）を注入して
５分間洗浄した。次いで、キュベットに再生用緩衝液
(１Ｍギ酸)を入れて２分間放置し、次いでPBS（pH7.2）
で５〜10分間洗浄した。このようにして、アミノシラン
キュベットのアミノシラン膜にグルタルアルデヒド重合
膜を介してコンカナバリンＡを固定化した表面プラズモ
ン共鳴バイオセンサー用測定チップを作製した。
【００２９】実施例３： インフルエンザウイルスＡの
検出 実施例１で調製したアミノシラン膜にシアル酸含有シア
ロ糖鎖を固定化した測定チップを、Affinity Sensors社
製の表面プラズモン共鳴センサー IAsysのカートリッジ
ブロック上の測定セルに設置した。測定セル内に酢酸緩
衝溶液(pH 5.3)を入れて洗浄し、IAsysに接続したパソ
コンディスプレー上に表示されるセンサーグラムのベー
スラインを安定化させた。測定セル内の酢酸緩衝溶液を
廃液した後に、測定セルに濃度32 HAU／0.025ml（約10
4 TCID50／ml）のインフルエンザウイルスＡを酢酸緩衝
溶液で希釈した溶液を注入して、センサーグラムを測定
した。希釈濃度は原液に対して0.1、0.2、0.4、0.5、0.
7、0.8及び1.0の７段階とした。表面プラズモン共鳴セ
ンサー Iasys に接続したパソコンディスプレー上に、
インフルエンザウイルスＡのコンカナバリンＡへの会合
量の変化がリアルタイムでセンサーグラム（曲線）によ
って表される。これを会合曲線とする。この会合曲線が
平衡状態になったら、測定セル内のインフルエンザウイ
ルスＡの試料溶液を排出して、酢酸緩衝溶液を注入し
た。パソコンディスプレー上のセンサーグラムの曲線が
下降した。これは、インフルエンザウイルスＡがコンカ
ナバリンＡから解離して行く様子を表している。これを
解離曲線とする。解離曲線が平衡状態になった際に測定
セル内の酢酸緩衝溶液を廃液し、20mＭ塩酸水溶液を注
入した。これによってシアル酸含有シアロ糖鎖とインフ
ルエンザウイルスＡの化学的結合を解き、試料注入前の
測定チップの状態に再生することができる。数値処理の
結果、インフルエンザウイルスＡを含有する原液の濃度3
2HAU/0.025mlを１としたときの会合定数(Ka)は10.3
M-1、会合速度定数(ka)は0.18ｓ-1、解離速度定数(kd)
は0.018ｓ-1であった。これらのパラメータとの照合に
よりインフルエンザＡの同定が出来る。
検出 実施例１で調製したアミノシラン膜にシアル酸含有シア
ロ糖鎖を固定化した測定チップを、Affinity Sensors社
製の表面プラズモン共鳴センサー IAsysのカートリッジ
ブロック上の測定セルに設置した。測定セル内に酢酸緩
衝溶液(pH 5.3)を入れて洗浄し、IAsysに接続したパソ
コンディスプレー上に表示されるセンサーグラムのベー
スラインを安定化させた。測定セル内の酢酸緩衝溶液を
廃液した後に、測定セルに濃度32 HAU／0.025ml（約10
4 TCID50／ml）のインフルエンザウイルスＡを酢酸緩衝
溶液で希釈した溶液を注入して、センサーグラムを測定
した。希釈濃度は原液に対して0.1、0.2、0.4、0.5、0.
7、0.8及び1.0の７段階とした。表面プラズモン共鳴セ
ンサー Iasys に接続したパソコンディスプレー上に、
インフルエンザウイルスＡのコンカナバリンＡへの会合
量の変化がリアルタイムでセンサーグラム（曲線）によ
って表される。これを会合曲線とする。この会合曲線が
平衡状態になったら、測定セル内のインフルエンザウイ
ルスＡの試料溶液を排出して、酢酸緩衝溶液を注入し
た。パソコンディスプレー上のセンサーグラムの曲線が
下降した。これは、インフルエンザウイルスＡがコンカ
ナバリンＡから解離して行く様子を表している。これを
解離曲線とする。解離曲線が平衡状態になった際に測定
セル内の酢酸緩衝溶液を廃液し、20mＭ塩酸水溶液を注
入した。これによってシアル酸含有シアロ糖鎖とインフ
ルエンザウイルスＡの化学的結合を解き、試料注入前の
測定チップの状態に再生することができる。数値処理の
結果、インフルエンザウイルスＡを含有する原液の濃度3
2HAU/0.025mlを１としたときの会合定数(Ka)は10.3
M-1、会合速度定数(ka)は0.18ｓ-1、解離速度定数(kd)
は0.018ｓ-1であった。これらのパラメータとの照合に
よりインフルエンザＡの同定が出来る。
【００３０】実施例４： インフルエンザウイルスＡの
検出 実施例２で調製したアミノシラン膜にコンカナバリンＡ
を固定化した測定チップをAffinity Sensors社製の表面
プラズモン共鳴センサー IAsysのカートリッジブロック
上の測定セルに設置した。測定セル内に酢酸緩衝溶液(p
H 5.3)を入れて洗浄し、IAsysに接続したパソコンディ
スプレー上に表示されるセンサーグラムのベースライン
を安定化させた。測定セル内の酢酸緩衝溶液を廃液した
後に、測定セルに、濃度32 HAU／0.025ml（約104 TCID
50／ml）のインフルエンザウイルスＡを酢酸緩衝溶液で
希釈した溶液を注入して、センサーグラムを測定した。
希釈濃度は原液に対して0.1、0.2、0.4、0.5、0.7、0.8
及び1.0の７段階とした。表面プラズモン共鳴センサー
IAsysに接続したパソコンディスプレー上に、インフル
エンザウイルスＡのコンカナバリンＡへの会合量の変化
がリアルタイムでセンサーグラム(曲線)によって表され
る。これを会合曲線とする。この会合曲線が平衡状態に
なったら、測定セル内のインフルエンザウイルスＡの試
料溶液を排出して、酢酸緩衝溶液を注入した。パソコン
ディスプレー上のセンサーグラムの曲線が下降した。こ
れはインフルエンザウイルスＡがコンカナバリンＡから
解離して行く様子を表している。これを解離曲線とす
る。解離曲線が平衡状態になった際に、測定セル内の酢
酸緩衝溶液を廃液し、20mＭ 塩酸水溶液を注入した。こ
れによりコンカナバリンＡとインフルエンザウイルスＡ
の化学的結合を解き、試料注入前の測定チップの状態に
再生することができる。数値処理の結果、インフルエン
ザウイルスＡを含有する原液の濃度32HAU/0.025mlを１
としたときの会合定数は5.3 M-1、会合速度定数は0.017
ｓ-1、解離速度定数は0.0032ｓ-1であった。これらのパ
ラメータとの照合によりインフルエンザＡの同定が出来
る。また、酢酸緩衝溶液の代わりにPBS(pH 8.15)を用い
ても感度良く検出することができた。
検出 実施例２で調製したアミノシラン膜にコンカナバリンＡ
を固定化した測定チップをAffinity Sensors社製の表面
プラズモン共鳴センサー IAsysのカートリッジブロック
上の測定セルに設置した。測定セル内に酢酸緩衝溶液(p
H 5.3)を入れて洗浄し、IAsysに接続したパソコンディ
スプレー上に表示されるセンサーグラムのベースライン
を安定化させた。測定セル内の酢酸緩衝溶液を廃液した
後に、測定セルに、濃度32 HAU／0.025ml（約104 TCID
50／ml）のインフルエンザウイルスＡを酢酸緩衝溶液で
希釈した溶液を注入して、センサーグラムを測定した。
希釈濃度は原液に対して0.1、0.2、0.4、0.5、0.7、0.8
及び1.0の７段階とした。表面プラズモン共鳴センサー
IAsysに接続したパソコンディスプレー上に、インフル
エンザウイルスＡのコンカナバリンＡへの会合量の変化
がリアルタイムでセンサーグラム(曲線)によって表され
る。これを会合曲線とする。この会合曲線が平衡状態に
なったら、測定セル内のインフルエンザウイルスＡの試
料溶液を排出して、酢酸緩衝溶液を注入した。パソコン
ディスプレー上のセンサーグラムの曲線が下降した。こ
れはインフルエンザウイルスＡがコンカナバリンＡから
解離して行く様子を表している。これを解離曲線とす
る。解離曲線が平衡状態になった際に、測定セル内の酢
酸緩衝溶液を廃液し、20mＭ 塩酸水溶液を注入した。こ
れによりコンカナバリンＡとインフルエンザウイルスＡ
の化学的結合を解き、試料注入前の測定チップの状態に
再生することができる。数値処理の結果、インフルエン
ザウイルスＡを含有する原液の濃度32HAU/0.025mlを１
としたときの会合定数は5.3 M-1、会合速度定数は0.017
ｓ-1、解離速度定数は0.0032ｓ-1であった。これらのパ
ラメータとの照合によりインフルエンザＡの同定が出来
る。また、酢酸緩衝溶液の代わりにPBS(pH 8.15)を用い
ても感度良く検出することができた。
【００３１】実施例５： 大腸菌の検出 実施例２で調製したコンカナバリンＡを固定化させた測
定チップをAffinitySensors社製の表面プラズモン共鳴
センサー IAsysのカートリッジブロック上の測定セルに
設置した。測定セル内に酢酸緩衝溶液（pH5.3）を入れ
て洗浄し、IAsysに接続したパソコンディスプレー上に
表示されるセンサーグラムのベースラインを安定化させ
た。測定セル内の酢酸緩衝溶液を廃液した後に、測定セ
ルに濃度70 mg/３mlの大腸菌を酢酸緩衝溶液で希釈した
溶液を注入して、センサーグラムを測定した。希釈濃度
は、原液に対して0.01、0.025、0.04、0.05、0.07、0.0
8及び0.1の７段階とした。表面プラズモン共鳴センサー
IAsysに接続したパソコンディスプレー上に、大腸菌の
コンカナバリンＡへの会合量の変化がリアルタイムでセ
ンサーグラム（曲線）によって表される。これを会合曲
線とする。この会合曲線が平衡状態になったら、測定セ
ル内の大腸菌の試料溶液を排出して、酢酸緩衝溶液を注
入した。パソコンディスプレー上のセンサーグラムの曲
線が下降した。これは大腸菌がコンカナバリンＡから解
離して行く様子を表している。これを解離曲線とする。
解離曲線が平衡状態になった際に、測定セル内の酢酸緩
衝溶液を廃液し、20mＭ塩酸水溶液を注入した。これに
より、コンカナバリンＡと大腸菌の化学的結合を解き、
試料注入前の測定チップの状態に再生することができ
る。実施例３と同様に、大腸菌を含有する原液の濃度を
１としたときの会合定数は12.4 M-1、会合速度定数は0.
90ｓ-1、解離速度定数は 0.0073ｓ-1であった。これら
のパラメータとの照合により大腸菌の同定が出来る。
定チップをAffinitySensors社製の表面プラズモン共鳴
センサー IAsysのカートリッジブロック上の測定セルに
設置した。測定セル内に酢酸緩衝溶液（pH5.3）を入れ
て洗浄し、IAsysに接続したパソコンディスプレー上に
表示されるセンサーグラムのベースラインを安定化させ
た。測定セル内の酢酸緩衝溶液を廃液した後に、測定セ
ルに濃度70 mg/３mlの大腸菌を酢酸緩衝溶液で希釈した
溶液を注入して、センサーグラムを測定した。希釈濃度
は、原液に対して0.01、0.025、0.04、0.05、0.07、0.0
8及び0.1の７段階とした。表面プラズモン共鳴センサー
IAsysに接続したパソコンディスプレー上に、大腸菌の
コンカナバリンＡへの会合量の変化がリアルタイムでセ
ンサーグラム（曲線）によって表される。これを会合曲
線とする。この会合曲線が平衡状態になったら、測定セ
ル内の大腸菌の試料溶液を排出して、酢酸緩衝溶液を注
入した。パソコンディスプレー上のセンサーグラムの曲
線が下降した。これは大腸菌がコンカナバリンＡから解
離して行く様子を表している。これを解離曲線とする。
解離曲線が平衡状態になった際に、測定セル内の酢酸緩
衝溶液を廃液し、20mＭ塩酸水溶液を注入した。これに
より、コンカナバリンＡと大腸菌の化学的結合を解き、
試料注入前の測定チップの状態に再生することができ
る。実施例３と同様に、大腸菌を含有する原液の濃度を
１としたときの会合定数は12.4 M-1、会合速度定数は0.
90ｓ-1、解離速度定数は 0.0073ｓ-1であった。これら
のパラメータとの照合により大腸菌の同定が出来る。
【００３２】実施例６： 肺炎桿菌の検出 実施例２で調製したコンカナバリンＡを固定化させた測
定チップを AffinitySensors社製の表面プラズモン共鳴
センサー IAsysのカートリッジブロック上の測定セルに
設置した。測定セル内に酢酸緩衝溶液(pH 5.3)を入れて
洗浄し、IAsysに接続したパソコンディスプレー上に表
示されるセンサーグラムのベースラインを安定化させ
た。測定セル内の酢酸緩衝溶液を廃液した後に、測定セ
ルに濃度70mg/３mlの肺炎桿菌を酢酸緩衝溶液で希釈し
た溶液を注入して、センサーグラムを測定した。希釈濃
度は、原液に対して0.005、0.01、0.03、0.05、0.07、0.
08及び0.1の７段階とした。表面プラズモン共鳴センサ
ー IAsysに接続したパソコンディスプレー上に、肺炎桿
菌のコンカナバリンＡへの会合量の変化がリアルタイム
でセンサーグラム（曲線）によって表される。これを会
合曲線とする。この会合曲線が平衡状態になったら、測
定セル内の肺炎桿菌の試料溶液を排出して、測定セルに
酢酸緩衝溶液を注入した。パソコンディスプレー上のセ
ンサーグラムの曲線が下降した。これは、肺炎桿菌がコ
ンカナバリンＡから解離して行く様子を表している。こ
れを解離曲線とする。解離曲線が平衡状態になった際
に、測定セル内の酢酸緩衝溶液を廃液し、20mＭ塩酸水
溶液を注入した。これにより、コンカナバリンＡと肺炎
桿菌の化学的結合を解き、試料注入前の測定チップの状
態に再生することができる。実施例３と同様に肺炎桿菌
を含有する原液の濃度を１としたときの会合定数は26.6
M-1、会合速度定数は0.15ｓ-1、解離速度定数は0.0058
ｓ-1であった。これらのパラメータとの照合により大腸
菌の同定が出来る。
定チップを AffinitySensors社製の表面プラズモン共鳴
センサー IAsysのカートリッジブロック上の測定セルに
設置した。測定セル内に酢酸緩衝溶液(pH 5.3)を入れて
洗浄し、IAsysに接続したパソコンディスプレー上に表
示されるセンサーグラムのベースラインを安定化させ
た。測定セル内の酢酸緩衝溶液を廃液した後に、測定セ
ルに濃度70mg/３mlの肺炎桿菌を酢酸緩衝溶液で希釈し
た溶液を注入して、センサーグラムを測定した。希釈濃
度は、原液に対して0.005、0.01、0.03、0.05、0.07、0.
08及び0.1の７段階とした。表面プラズモン共鳴センサ
ー IAsysに接続したパソコンディスプレー上に、肺炎桿
菌のコンカナバリンＡへの会合量の変化がリアルタイム
でセンサーグラム（曲線）によって表される。これを会
合曲線とする。この会合曲線が平衡状態になったら、測
定セル内の肺炎桿菌の試料溶液を排出して、測定セルに
酢酸緩衝溶液を注入した。パソコンディスプレー上のセ
ンサーグラムの曲線が下降した。これは、肺炎桿菌がコ
ンカナバリンＡから解離して行く様子を表している。こ
れを解離曲線とする。解離曲線が平衡状態になった際
に、測定セル内の酢酸緩衝溶液を廃液し、20mＭ塩酸水
溶液を注入した。これにより、コンカナバリンＡと肺炎
桿菌の化学的結合を解き、試料注入前の測定チップの状
態に再生することができる。実施例３と同様に肺炎桿菌
を含有する原液の濃度を１としたときの会合定数は26.6
M-1、会合速度定数は0.15ｓ-1、解離速度定数は0.0058
ｓ-1であった。これらのパラメータとの照合により大腸
菌の同定が出来る。
【００３３】実施例７： 黄色ブドウ球菌の検出 実施例２で調製したコンカナバリンＡを固定化させた測
定チップをAffinitySensors社製の表面プラズモン共鳴
センサー IAsysのカートリッジブロック上の測定セルに
設置した。測定セル内に酢酸緩衝溶液（pH5.3）を入れ
て洗浄し、IAsysに接続したパソコンディスプレー上に
表示されるセンサーグラムのベースラインを安定化させ
た。測定セル内の酢酸緩衝溶液を廃液した後に、測定セ
ルに、濃度10mg/３mlの黄色ブドウ球菌を酢酸緩衝溶液
で希釈した溶液を注入して、センサーグラムを測定し
た。希釈濃度は原液に対して0.01、0.02、0.04、0.07、
0.08及び0.1の６段階とした。表面プラズモン共鳴セン
サー IAsysに接続したパソコンディスプレー上に、黄色
ブドウ球菌のコンカナバリンＡへの会合量の変化がリア
ルタイムでセンサーグラム（曲線）によって表される。
これを会合曲線とする。この会合曲線が平衡状態になっ
たら、測定セル内の黄色ブドウ球菌の試料溶液を排出し
て、測定セルに酢酸緩衝溶液を注入した。パソコンディ
スプレー上のセンサーグラムの曲線が下降した。これは
黄色ブドウ球菌がコンカナバリンＡから解離して行く様
子を表している。これを解離曲線とする。解離曲線が平
衡状態になった際に、測定セル内の酢酸緩衝溶液を廃液
し、20mＭ塩酸水溶液を注入した。これにより、コンカ
ナバリンＡと黄色ブドウ球菌の化学的結合を解き、試料
注入前の測定チップの状態に再生することができる。実
施例３と同様に黄色ブドウ球菌を含有する原液の濃度を
１としたときの会合定数は8.6 M-1、会合速度定数は0.0
8ｓ-1、解離速度定数は0.009ｓ-1であった。これらのパ
ラメータとの照合により大腸菌の同定が出来る。
定チップをAffinitySensors社製の表面プラズモン共鳴
センサー IAsysのカートリッジブロック上の測定セルに
設置した。測定セル内に酢酸緩衝溶液（pH5.3）を入れ
て洗浄し、IAsysに接続したパソコンディスプレー上に
表示されるセンサーグラムのベースラインを安定化させ
た。測定セル内の酢酸緩衝溶液を廃液した後に、測定セ
ルに、濃度10mg/３mlの黄色ブドウ球菌を酢酸緩衝溶液
で希釈した溶液を注入して、センサーグラムを測定し
た。希釈濃度は原液に対して0.01、0.02、0.04、0.07、
0.08及び0.1の６段階とした。表面プラズモン共鳴セン
サー IAsysに接続したパソコンディスプレー上に、黄色
ブドウ球菌のコンカナバリンＡへの会合量の変化がリア
ルタイムでセンサーグラム（曲線）によって表される。
これを会合曲線とする。この会合曲線が平衡状態になっ
たら、測定セル内の黄色ブドウ球菌の試料溶液を排出し
て、測定セルに酢酸緩衝溶液を注入した。パソコンディ
スプレー上のセンサーグラムの曲線が下降した。これは
黄色ブドウ球菌がコンカナバリンＡから解離して行く様
子を表している。これを解離曲線とする。解離曲線が平
衡状態になった際に、測定セル内の酢酸緩衝溶液を廃液
し、20mＭ塩酸水溶液を注入した。これにより、コンカ
ナバリンＡと黄色ブドウ球菌の化学的結合を解き、試料
注入前の測定チップの状態に再生することができる。実
施例３と同様に黄色ブドウ球菌を含有する原液の濃度を
１としたときの会合定数は8.6 M-1、会合速度定数は0.0
8ｓ-1、解離速度定数は0.009ｓ-1であった。これらのパ
ラメータとの照合により大腸菌の同定が出来る。
【００３４】実施例８： 17β-エストラジオール及び
ビスフェノールＡの検出 コンカナバリンＡに代えてエストロゲンレセプターを使
用した以外は実施例２の2.2 に記載の方法と同様にし
て、市販のアミノシランキュベットのアミノシラン膜に
エストロゲンレセプターを固定化した測定チップを作製
した。この測定チップを使用し、大腸菌に代えて17β-
エストラジオール4.81×10-5モルとβ-シクロデキスト
リン4.02×10-4モル、又はビスフェノールＡ 4.81×10
-5モルを使用した以外は実施例５に記載の方法と同様に
して、17β-エストラジオール及びビスフェノールＡに
ついて会合定数、会合速度定数及び解離速度定数を求め
た。その結果、17β-エストラジオールについては、会合
定数は4.10×105±0.080 M-1、会合速度定数は74964.50
±6651.82 M-1ｓ-1、解離速度定数は0.18±0.020ｓ-1で
あった。また、ビスフェノールＡについては、会合定数
は1.90×102±1.28 M-1、会合速度定数は142.16±101.98
M-1ｓ-1、解離速度定数は0.71±0.060ｓ-1であった。
ビスフェノールＡの検出 コンカナバリンＡに代えてエストロゲンレセプターを使
用した以外は実施例２の2.2 に記載の方法と同様にし
て、市販のアミノシランキュベットのアミノシラン膜に
エストロゲンレセプターを固定化した測定チップを作製
した。この測定チップを使用し、大腸菌に代えて17β-
エストラジオール4.81×10-5モルとβ-シクロデキスト
リン4.02×10-4モル、又はビスフェノールＡ 4.81×10
-5モルを使用した以外は実施例５に記載の方法と同様に
して、17β-エストラジオール及びビスフェノールＡに
ついて会合定数、会合速度定数及び解離速度定数を求め
た。その結果、17β-エストラジオールについては、会合
定数は4.10×105±0.080 M-1、会合速度定数は74964.50
±6651.82 M-1ｓ-1、解離速度定数は0.18±0.020ｓ-1で
あった。また、ビスフェノールＡについては、会合定数
は1.90×102±1.28 M-1、会合速度定数は142.16±101.98
M-1ｓ-1、解離速度定数は0.71±0.060ｓ-1であった。
【００３５】実施例９： 17β-エストラジオール及び
ビスフェノールＡの検出 シアル酸複合糖溶液に代えてシクロデキストリン溶液を
使用した以外は実施例１の1.3 に記載の方法と同様にし
て、市販のアミノシランキュベットのアミノシラン膜に
シクロデキストリンを固定化した測定チップを作製し
た。この測定チップを使用した以外は、実施例８に記載
の方法と同様にして17β-エストラジオール及びビスフ
ェノールＡについて会合定数、会合速度定数及び解離速
度定数を求めた。その結果、17β-エストラジオールに
ついては、会合定数は 3.83×104±0.026 M-1、会合速
度定数は 21407.50±2164.23 M-1ｓ-1、解離速度定数は
0.56±0.060ｓ-1であった。また、ビスフェノールＡに
ついては、会合定数は 2.59×102±0.76 M-1、会合速度
定数は82.14±26.54 M-1ｓ-1、解離速度定数は 0.31±
0.0097ｓ-1であった。
ビスフェノールＡの検出 シアル酸複合糖溶液に代えてシクロデキストリン溶液を
使用した以外は実施例１の1.3 に記載の方法と同様にし
て、市販のアミノシランキュベットのアミノシラン膜に
シクロデキストリンを固定化した測定チップを作製し
た。この測定チップを使用した以外は、実施例８に記載
の方法と同様にして17β-エストラジオール及びビスフ
ェノールＡについて会合定数、会合速度定数及び解離速
度定数を求めた。その結果、17β-エストラジオールに
ついては、会合定数は 3.83×104±0.026 M-1、会合速
度定数は 21407.50±2164.23 M-1ｓ-1、解離速度定数は
0.56±0.060ｓ-1であった。また、ビスフェノールＡに
ついては、会合定数は 2.59×102±0.76 M-1、会合速度
定数は82.14±26.54 M-1ｓ-1、解離速度定数は 0.31±
0.0097ｓ-1であった。
【００３６】
【発明の効果】本発明の測定チップは調製が容易であ
り、しかも良好な感度でリアルタイムで大腸菌、黄色ブ
ドウ球菌、肺炎桿菌などの微生物、インフルエンザウイ
ルスＡなどのウイルスを検出し測定でき、またエストロ
ジェンやテストステロンなどのホルモンレセプターを固
定化することにより環境ホルモンすなわち外因性内分泌
撹乱化学物質を検出し測定できると同時に生態系のその
他のホルモンまたは酵素に対する影響を調べることが可
能である。
り、しかも良好な感度でリアルタイムで大腸菌、黄色ブ
ドウ球菌、肺炎桿菌などの微生物、インフルエンザウイ
ルスＡなどのウイルスを検出し測定でき、またエストロ
ジェンやテストステロンなどのホルモンレセプターを固
定化することにより環境ホルモンすなわち外因性内分泌
撹乱化学物質を検出し測定できると同時に生態系のその
他のホルモンまたは酵素に対する影響を調べることが可
能である。
フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G059 AA05 EE02 4B029 AA07 BB15 BB20 CC03 FA03 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ10 QQ79 QR43 QR48 QR82 QS39 QX04
Claims (8)
- 【請求項１】 光学的に透明な基板と、該基板上に形成
された金属薄膜と、該金属薄膜上に形成されたアミノシ
ラン膜と、該アミノシラン膜上に固定化された生理活性
物質とからなる表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップにおいて、生理活性物質としてコンカナバリン
Ａ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲンレセプタ
ー、テストステロンレセプター及びシクロデキストリン
からなる群の中から選択される少なくとも１種の物質を
使用することを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセ
ンサー用測定チップ。 - 【請求項２】 生理活性物質がコンカナバリンＡ又はシ
アル酸含有シアロ糖鎖である請求項１記載の測定チッ
プ。 - 【請求項３】 生理活性物質がエストロゲンレセプタ
ー、テストステロンレセプター又はシクロデキストリン
である請求項１記載の測定チップ。 - 【請求項４】 アミノシラン膜上にコンカナバリンＡ、
シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲンレセプター又は
テストステロンレセプターがグルタルアルデヒド重合膜
を介して固定化されている請求項１記載の測定チップ。 - 【請求項５】 光学的に透明な基板上に金属薄膜を形成
し、該金属薄膜の上にアミノシラン膜を形成し、次いで
該アミノシラン膜の表面にコンカナバリンＡ、シアル酸
含有シアロ糖鎖、エストロゲンレセプター、テストステ
ロンレセプター及びシクロデキストリンからなる群の中
から選択される少なくとも１種の物質を固定化すること
を特徴とする、請求項１記載の表面プラズモン共鳴バイ
オセンサー用測定チップの製造方法。 - 【請求項６】 アミノシラン膜の表面にコンカナバリン
Ａ又はシアル酸含有シアロ糖鎖を固定化する請求項５記
載の製造方法。 - 【請求項７】 アミノシラン膜の表面にエストロゲンレ
セプター、テストステロンレセプター又はシクロデキス
トリンを固定化する請求項５記載の製造方法。 - 【請求項８】 光学的に透明な基板上に金属薄膜を形成
し、該金属薄膜の上にアミノシラン膜を形成し、次いで
該アミノシラン膜の表面にグルタルアルデヒド重合膜を
形成し、次いで該グルタルアルデヒド重合膜の表面にコ
ンカナバリンＡ、シアル酸含有シアロ糖鎖、エストロゲ
ンレセプター及びテストステロンレセプターからなる群
の中から選択される少なくとも１種の物質を固定化する
ことを特徴とする請求項４記載の表面プラズモン共鳴バ
イオセンサー用測定チップの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001023010A JP4248154B2 (ja) | 2001-01-31 | 2001-01-31 | 表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップを用いた１７β−エストラジオール又はビスフェノールＡの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001023010A JP4248154B2 (ja) | 2001-01-31 | 2001-01-31 | 表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップを用いた１７β−エストラジオール又はビスフェノールＡの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002228661A true JP2002228661A (ja) | 2002-08-14 |
| JP4248154B2 JP4248154B2 (ja) | 2009-04-02 |
Family
ID=18888342
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001023010A Expired - Fee Related JP4248154B2 (ja) | 2001-01-31 | 2001-01-31 | 表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップを用いた１７β−エストラジオール又はビスフェノールＡの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007026669A1 (ja) * | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Shizuoka Prefectural Universities Corporation | ウイルスレセプター糖鎖認識特異性の判別方法 |
| JP2007064638A (ja) * | 2005-08-29 | 2007-03-15 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 検体反応装置及び標的分子検出装置 |
| JP2010160212A (ja) * | 2009-01-06 | 2010-07-22 | Toshiba Corp | 選択的な光透過特性を有する金属薄膜複合体およびその製造方法 |
| CN101887016A (zh) * | 2010-06-07 | 2010-11-17 | 北京理工大学 | 一种利用表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法 |
| US9239329B2 (en) | 2006-12-18 | 2016-01-19 | Japan Science And Technology Agency | Method of measuring interaction between biomaterial and sugar chain, method of evaluating biomaterial in sugar chain selectivity, method of screening biomaterial, method of patterning biomaterials, and kits for performing these methods |
| WO2016036145A1 (ko) * | 2014-09-02 | 2016-03-10 | 광주과학기술원 | 노로바이러스 검출 센서, 및 이를 이용하는 전기화학적 센싱방법 |
| KR20220060763A (ko) * | 2020-11-05 | 2022-05-12 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 플라즈모닉 큐벳, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 분석 장치 |
-
2001
- 2001-01-31 JP JP2001023010A patent/JP4248154B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007064638A (ja) * | 2005-08-29 | 2007-03-15 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 検体反応装置及び標的分子検出装置 |
| JP4569420B2 (ja) * | 2005-08-29 | 2010-10-27 | パナソニック株式会社 | 検体反応装置及び標的分子検出装置 |
| WO2007026669A1 (ja) * | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Shizuoka Prefectural Universities Corporation | ウイルスレセプター糖鎖認識特異性の判別方法 |
| US9239329B2 (en) | 2006-12-18 | 2016-01-19 | Japan Science And Technology Agency | Method of measuring interaction between biomaterial and sugar chain, method of evaluating biomaterial in sugar chain selectivity, method of screening biomaterial, method of patterning biomaterials, and kits for performing these methods |
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| WO2016036145A1 (ko) * | 2014-09-02 | 2016-03-10 | 광주과학기술원 | 노로바이러스 검출 센서, 및 이를 이용하는 전기화학적 센싱방법 |
| KR20220060763A (ko) * | 2020-11-05 | 2022-05-12 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 플라즈모닉 큐벳, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 분석 장치 |
| KR102582700B1 (ko) | 2020-11-05 | 2023-09-22 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 플라즈모닉 큐벳, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 분석 장치 |
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