JP2002228586A - Fluorescence measuring instrument and fluorescence measuring method - Google Patents
Fluorescence measuring instrument and fluorescence measuring methodInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、試料の蛍光強度又
は試料に結合した蛍光物質の蛍光強度を測定する蛍光測
定装置及び蛍光測定方法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a fluorescence measurement device and a fluorescence measurement method for measuring the fluorescence intensity of a sample or the fluorescence intensity of a fluorescent substance bound to the sample.
【０００２】[0002]
【従来の技術】キャピラリー電気泳動装置（ＣＥ）は、
溶液中に存在する試料の分離分析を行う装置で、分離に
は細いキャピラリーカラムを使用するので微量試料の分
析に有効である。試料の検出には、紫外線の吸光度測定
や蛍光強度測定を用いる。特に、蛍光検出法は高感度な
ので、ＤＮＡ等の低濃度の微量試料分析に有効である。
キャピラリー電気泳動法については、”キャピラリー電
気泳動法、基礎と実際”第５頁〜第１３頁、本田進、寺
部茂編、講談社サイエンティフィック、１９９５年発行
に詳細に述べられている。2. Description of the Related Art Capillary electrophoresis apparatus (CE)
This is a device for separating and analyzing a sample present in a solution. Since a thin capillary column is used for the separation, it is effective for analyzing a very small amount of sample. The sample is detected by measuring the absorbance of ultraviolet light or measuring the fluorescence intensity. In particular, since the fluorescence detection method has high sensitivity, it is effective for analyzing low-concentration trace samples such as DNA.
The capillary electrophoresis method is described in detail in "Capillary Electrophoresis Method, Basics and Practice", pp. 5-13, edited by Susumu Honda and Shigeru Terabe, published by Kodansha Scientific, 1995.
【０００３】キャピラリー電気泳動装置で使用するキャ
ピラリーカラムは通常溶融シリカでできており、機械的
強度を保つために樹脂製皮膜に覆われている。樹脂製皮
膜は光透過性が非常に低いので、通常皮膜を剥し、その
部分に光を照射して測定を行う。しかし、その部分の機
械的強度が著しく低下し、破損しやすいという問題があ
った。これを解決するため、透明な皮膜に覆われたキャ
ピラリーカラムを使用する方法が、特開平５−１５７７
３３号公報、特開平５−１９６６０２号公報、特開平１
０−２５３５９０号公報、特開平１１―２０１８９６号
公報に記載されている。これらは紫外線や可視光及び赤
外線に対して透過性が高く、吸光度を測定する場合には
有効である。[0003] A capillary column used in a capillary electrophoresis apparatus is usually made of fused silica, and is covered with a resin film to maintain mechanical strength. Since the resin film has a very low light transmittance, the film is usually peeled off and the portion is irradiated with light for measurement. However, there is a problem that the mechanical strength of the portion is significantly reduced and the portion is easily broken. In order to solve this, a method using a capillary column covered with a transparent film is disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 5-1577.
No. 33, JP-A-5-196602 and JP-A-1
0-253590 and JP-A-11-201896. These have high transparency to ultraviolet light, visible light and infrared light, and are effective when measuring absorbance.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】上記従来技術は、いず
れも試料の蛍光を測定することについては配慮されてい
なかった。すなわち、上記樹脂製透明皮膜付きキャピラ
リーカラムの樹脂製透明皮膜が蛍光を発してしまうた
め、実際に蛍光測定に使用されることがなかった。ま
た、殆ど蛍光を発しない樹脂製皮膜を作ることは困難で
ある。また、キャピラリーカラムでない試料容器も、安
価な樹脂製容器を用いて蛍光を測定することは困難であ
った。In any of the above prior arts, no consideration has been given to measuring the fluorescence of a sample. That is, since the resin transparent film of the capillary column with the resin transparent film emits fluorescence, it was not actually used for fluorescence measurement. Also, it is difficult to form a resin film that emits little fluorescence. Also, it was difficult to measure the fluorescence of a sample container other than a capillary column using an inexpensive resin container.
【０００５】本発明の目的は、キャピラリーカラムや容
器の機械的強度を低下させずに或いは安価な容器を用い
て蛍光を測定することができる蛍光測定装置及び方法を
提供することにある。An object of the present invention is to provide a fluorescence measuring apparatus and method capable of measuring fluorescence without reducing the mechanical strength of a capillary column or a container or using an inexpensive container.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明の蛍光測定装置は、樹脂皮膜に覆われたキャ
ピラリーカラムと、キャピラリーカラムに励起光を照射
する光源と、この励起光によって発生した蛍光を検出す
る蛍光検出部と、光源や蛍光検出部の動作を制御する制
御部を有し、このキャピラリーカラムに励起光を照射し
てキャピラリーカラム自体又は樹脂皮膜から蛍光を発生
させ、この蛍光が所望の値以下に消光した後、キャピラ
リーカラム中の試料の蛍光強度測定を行うようにしたも
のである。In order to achieve the above object, a fluorescence measuring apparatus according to the present invention comprises a capillary column covered with a resin film, a light source for irradiating the capillary column with excitation light, and a light source generated by the excitation light. It has a fluorescence detection unit that detects the fluorescence, and a control unit that controls the operation of the light source and the fluorescence detection unit, and irradiates the capillary column with excitation light to generate fluorescence from the capillary column itself or the resin film, and this fluorescence has a desired fluorescence. After quenching below the value, the fluorescence intensity of the sample in the capillary column is measured.
【０００７】ここで、キャピラリーカラム中の試料の蛍
光強度測定を行うとは、予めキャピラリーカラム中に試
料を導入しておいて、励起光の照射により発生した蛍光
が所望の値以下に消光した後、蛍光強度測定を行うので
もよいし、蛍光が所望の値以下に消光した後、キャピラ
リーカラムに試料を導入し、この試料の蛍光強度測定を
行うのでもよい。Here, the measurement of the fluorescence intensity of the sample in the capillary column means that the sample is introduced into the capillary column in advance, and the fluorescence generated by the irradiation of the excitation light is quenched to a desired value or less. The intensity may be measured, or after the fluorescence has quenched to a desired value or less, a sample may be introduced into the capillary column, and the fluorescence intensity of the sample may be measured.
【０００８】また、本発明の蛍光測定方法は、蛍光測定
用の試料が保持される容器又は流路に励起光を照射し、
容器又は流路から蛍光を発生させ、蛍光の強度が所望の
値以下になるまで時間が経過した後に、容器又は流路中
の測定試料の蛍光を測定するようにしたものである。Further, according to the fluorescence measurement method of the present invention, a container or a flow channel holding a sample for fluorescence measurement is irradiated with excitation light,
Fluorescence is generated from a container or a channel, and after a lapse of time until the intensity of the fluorescence becomes a desired value or less, the fluorescence of the measurement sample in the container or the channel is measured.
【０００９】さらにまた、本発明の蛍光測定方法は、蛍
光測定用の試料が保持される容器又は流路に励起光を照
射する第１のステップと、この照射により容器又は流路
から発生した蛍光強度を測定し、該蛍光強度が所望の値
以下になったことを検出する第２のステップと、容器又
は流路に導入された試料に励起光を照射し、試料が発す
る蛍光を測定する第３のステップを設けるようにしたも
のである。Further, in the fluorescence measuring method of the present invention, a first step of irradiating excitation light to a container or a flow channel holding a sample for fluorescence measurement, and a fluorescent light generated from the container or the flow channel by this irradiation. A second step of measuring the intensity and detecting that the fluorescence intensity has fallen below a desired value; and a second step of irradiating the sample introduced into the container or the channel with excitation light and measuring the fluorescence emitted by the sample. The third step is provided.
【００１０】[0010]
【発明の実施の形態】図１は、本発明の一実施例である
キャピラリーカラムを使用し、電気泳動を用いる蛍光測
定装置の構成図である。本体１の内部には、キャピラリ
ーカラム２、リザーバ３、リザーバ４、電源６、蛍光検
出部７が配置されている。蛍光試料は容器に入れられて
おり、この容器はリザーバ３の位置に移動し、蛍光試料
がリザーバ３側のキャピラリーカラム２の端部から内部
へと導入される。容器の蛍光試料が導入された後、泳動
バッファが入った容器がリザーバ３の位置へと移動さ
れ、リザーバ３側のキャピラリーカラム２の端部は泳動
バッファ溶液に浸される。その後、リザーバ３とリザー
バ４の間に電極５を通して電圧が印加され、導入された
蛍光試料は電気泳動され、蛍光検出部で検出される。こ
の蛍光試料の検出が終わった後、別の蛍光試料が入った
別の容器がリザーバ３の位置に移動され、同様に蛍光試
料がリザーバ３側のキャピラリーカラム２の端部から内
部へと導入され、電気泳動される。順次この動作を繰り
返し、複数の試料の分析を行う。これらの動作はコンピ
ュータ８により制御される。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS FIG. 1 is a block diagram of a fluorescence measuring apparatus using a capillary column and electrophoresis according to one embodiment of the present invention. Inside the main body 1, a capillary column 2, a reservoir 3, a reservoir 4, a power supply 6, and a fluorescence detector 7 are arranged. The fluorescent sample is placed in a container, and the container moves to the position of the reservoir 3, and the fluorescent sample is introduced from the end of the capillary column 2 on the reservoir 3 side into the inside. After the fluorescent sample in the container is introduced, the container containing the migration buffer is moved to the position of the reservoir 3, and the end of the capillary column 2 on the reservoir 3 side is immersed in the migration buffer solution. Thereafter, a voltage is applied between the reservoir 3 and the reservoir 4 through the electrode 5, the introduced fluorescent sample is electrophoresed, and detected by the fluorescence detecting unit. After the detection of the fluorescent sample is completed, another container containing another fluorescent sample is moved to the position of the reservoir 3, and the fluorescent sample is similarly introduced from the end of the capillary column 2 on the reservoir 3 side into the inside, Electrophoresed. This operation is sequentially repeated to analyze a plurality of samples. These operations are controlled by the computer 8.
【００１１】図２は、この装置の蛍光検出部の構成図で
ある。光源９から発せられた励起光１０１は、ダイクロ
イックミラー１０を通り、さらにレンズ１１を通ってキ
ャピラリーカラム１２とキャピラリー表面の樹脂製皮膜
１３に照射される。励起光１０１により励起された、蛍
光試料が発する蛍光１０３及び樹脂皮膜が発する蛍光１
０２は、レンズ１１を通り、ダイクロイックミラー１０
に反射され、フィルター１５を通って検出器１６で検出
される。蛍光試料１４をキャピラリーカラム１２に導入
する前に、十分に励起光１０１を照射しておけば、皮膜
の蛍光１０２は消光して弱くなり、蛍光検出部に到達し
た蛍光試料１４が発する蛍光１０３を検出できる。レン
ズ１１は設置しなくともよい。また、フィルター１５は
設置しなくともよい。FIG. 2 is a block diagram of the fluorescence detecting section of the apparatus. The excitation light 101 emitted from the light source 9 passes through the dichroic mirror 10 and further passes through the lens 11 to irradiate the capillary column 12 and the resin coating 13 on the capillary surface. Fluorescence 103 emitted from the fluorescent sample and fluorescence 1 emitted from the resin film, excited by the excitation light 101
02 passes through the lens 11 and passes through the dichroic mirror 10
And is detected by the detector 16 through the filter 15. If the excitation light 101 is sufficiently irradiated before the fluorescent sample 14 is introduced into the capillary column 12, the fluorescent light 102 on the film is quenched and weakened, and the fluorescent light 103 emitted from the fluorescent sample 14 reaching the fluorescent detection unit is detected. it can. The lens 11 need not be provided. Further, the filter 15 need not be provided.
【００１２】図３は、この装置の蛍光検出部の別の構成
図である。キャピラリーカラム１２を挟んで、光源９の
反対側に検出器１６を配置してある。光源９から発せら
れた励起光１０１は、レンズ１１を通ってキャピラリー
カラム１２及び皮膜１３に照射され、皮膜１３から発せ
られた蛍光１０２及び蛍光試料１４から発せられた蛍光
１０３は、フィルタ１５を通って検出器１６に到達す
る。蛍光試料１４をキャピラリーカラム１２に導入する
前に、十分に励起光１０１を照射しておけば、皮膜の蛍
光１０２は消光して弱くなり、蛍光試料１４から発せら
れた蛍光１０３を検出できるようになる。また、フィル
ター１５は設置しなくともよい。FIG. 3 is another block diagram of the fluorescence detecting section of this apparatus. A detector 16 is arranged on the opposite side of the light source 9 across the capillary column 12. The excitation light 101 emitted from the light source 9 is applied to the capillary column 12 and the coating 13 through the lens 11, and the fluorescence 102 emitted from the coating 13 and the fluorescence 103 emitted from the fluorescent sample 14 pass through the filter 15. Reach the detector 16. If the excitation light 101 is sufficiently irradiated before introducing the fluorescent sample 14 into the capillary column 12, the fluorescent light 102 on the film is quenched and weakened, and the fluorescent light 103 emitted from the fluorescent sample 14 can be detected. . Further, the filter 15 need not be provided.
【００１３】上記の蛍光測定装置は、キャピラリーカラ
ムを複数にしてもよい。その例として、キャピラリーカ
ラムを複数設置した場合の励起光の照射方法を図４から
６に示す。図４に示すように、１本又はキャピラリーカ
ラムの本数より少ない数の光源を用い、一本の励起光１
０１で複数のキャピラリーカラムを貫いて蛍光を励起し
てもよい。この場合、励起光１０１と略直角に横方向に
検出器を置き、蛍光試料１４からの蛍光を検出する。ま
た、図５に示すように、キャピラリーカラムと同数の光
源を用い、励起光１本でキャピラリーカラム１本を照射
してもよい。また、光源を移動させ、一つの励起光１０
１をキャピラリーカラムに対して平行にスキャンさせて
もよい。さらに図６に示すように、１本又はキャピラリ
ーカラムの本数より少ない数の光源を用い、励起光を扇
状にスキャンして順次キャピラリーカラムに励起光１０
１を照射してもよい。The above-mentioned fluorescence measuring device may have a plurality of capillary columns. As an example, FIGS. 4 to 6 show a method of irradiating excitation light when a plurality of capillary columns are provided. As shown in FIG. 4, one excitation light 1 was used by using one or a smaller number of light sources than the number of capillary columns.
At 01, the fluorescence may be excited through a plurality of capillary columns. In this case, a detector is placed in a lateral direction substantially perpendicular to the excitation light 101 to detect the fluorescence from the fluorescent sample 14. Alternatively, as shown in FIG. 5, one capillary column may be irradiated with one excitation light using the same number of light sources as the capillary columns. Further, the light source is moved so that one excitation light 10
1 may be scanned parallel to the capillary column. Further, as shown in FIG. 6, using one or a smaller number of light sources than the number of capillary columns, the excitation light is scanned in a fan shape and the excitation light 10 is sequentially applied to the capillary column.
1 may be irradiated.
【００１４】励起光１０１は、レーザーでもよいし、ハ
ロゲンランプ等の光源でもよい。ハロゲンランプ等の光
をカットオフフィルターに通して、比較的波長幅の狭い
光にしたものでもよい。また、複数の波長の光源を用い
れば、異なる波長により励起される複数の試料の蛍光を
測定できる。The excitation light 101 may be a laser or a light source such as a halogen lamp. Light from a halogen lamp or the like may be passed through a cutoff filter to make light having a relatively narrow wavelength width. In addition, if a light source having a plurality of wavelengths is used, the fluorescence of a plurality of samples excited by different wavelengths can be measured.
【００１５】図７は、従来の方法で測定を行う場合の手
順を示している。従来は、皮膜が発する蛍光が測定の妨
害になるため、予め加熱等でキャピラリーカラムの皮膜
を一部除去しておく。次に、装置本体にキャピラリーカ
ラムを設置する。このときの物理的な力により、皮膜を
除去した部分の破損が発生することがある。キャピラリ
ーカラムを装置本体に設置した後、電気泳動を行って測
定を行うが、電気泳動によりキャピラリーカラム内の溶
液に電流が流れるため、ジュール熱が発生し、その熱に
より皮膜を除去した部分が破損する場合もある。FIG. 7 shows a procedure for performing measurement by a conventional method. Conventionally, since the fluorescence emitted from the film interferes with the measurement, a part of the film of the capillary column is previously removed by heating or the like. Next, a capillary column is installed in the apparatus main body. The physical force at this time may cause damage to the portion from which the film has been removed. After the capillary column is installed in the main body of the device, measurement is performed by performing electrophoresis.When current flows through the solution in the capillary column due to electrophoresis, Joule heat is generated, and the heat removes the part from which the film was removed. There is also.
【００１６】図８から１０は、本発明の実施例における
手順の例を示す図である。図８に示す手順では、まずキ
ャピラリーカラムを装置本体に設置する。皮膜は除去し
ていないので、物理的力に対して強く、キャピラリーカ
ラムが破損することは少ない。次に、試料を注入する前
に励起光を予備照射する。ここで十分に皮膜の蛍光を消
光させておく。その後、蛍光試料を注入し、測定を開始
する。皮膜が残っているので、ジュール熱による破損も
防ぐことができる。FIGS. 8 to 10 are diagrams showing an example of a procedure in the embodiment of the present invention. In the procedure shown in FIG. 8, first, the capillary column is set in the apparatus main body. Since the film has not been removed, it is resistant to physical forces and the capillary column is rarely damaged. Next, pre-irradiation with excitation light is performed before the sample is injected. Here, the fluorescence of the film is sufficiently extinguished. Thereafter, a fluorescent sample is injected, and measurement is started. Since the film remains, damage due to Joule heat can also be prevented.
【００１７】図９の手順では、キャピラリーカラムを装
置本体に設置する前に、キャピラリーカラムの一部又は
全体に励起光を照射する。その後キャピラリーカラムを
装置本体に設置する。それから蛍光試料を注入し、測定
を開始する。皮膜が残っているので、設置時の物理的な
力や測定中のジュール熱による破損を防ぐことができ
る。In the procedure shown in FIG. 9, a part or the whole of the capillary column is irradiated with excitation light before the capillary column is set in the apparatus main body. After that, the capillary column is set in the apparatus main body. Then, a fluorescent sample is injected and measurement is started. Since the film remains, it can be prevented from being damaged by physical force during installation or Joule heat during measurement.
【００１８】図１０はまた別の手順を示している。キャ
ピラリーカラムを装置本体に設置した後、予備照射を行
い、一定時間励起光を照射したところで皮膜の蛍光を測
定し、一定の蛍光強度まで下がっていなかったら再び励
起光を照射する。このようなフィードバックを行い、皮
膜の蛍光強度に下がった後、蛍光試料を注入し測定を開
始する。FIG. 10 shows another procedure. After the capillary column is set in the main body of the apparatus, preliminary irradiation is performed. When the excitation light is irradiated for a certain period of time, the fluorescence of the film is measured. If the fluorescence intensity has not decreased to a certain level, the excitation light is irradiated again. After such feedback is performed and the fluorescence intensity of the film is reduced, a fluorescent sample is injected and measurement is started.
【００１９】このような手順は、測定者がマニュアルで
行ってもよいし、計測制御プログラムでソフト的に制御
してもよい。プログラムは装置本体のハードディスクに
書きこまれていてもよいし、装置に接続されているコン
ピュータにインストールされていてもよい。Such a procedure may be performed manually by a measurer or controlled by software using a measurement control program. The program may be written on a hard disk of the apparatus main body, or may be installed on a computer connected to the apparatus.
【００２０】本実施例では、励起光源であるアルゴンイ
オンレーザーの出力は１０ｍＷで、さらに検出器である
ＣＣＤの光蓄積時間が０．５秒の場合に、濃度約８ｎＭ
（0.008ｎｍｏｌ／ｍ３）のＦＡＮ蛍光体を測定したと
き、検出器がフルスケールになるよう電荷増幅器のゲイ
ンを調整してある。ＣＣＤの出力は、ＡＤコンバーター
でデジタル信号に変換される。この条件でキャピラリー
カラムの透明皮膜に励起光を照射した場合、皮膜の蛍光
は約２５分後に検出器のフルスケール（飽和する強度）
の９０％以下になり、約６０分でフルスケールの１０％
以下になる。これを図１１で説明する。In this embodiment, when the output of the argon ion laser as the excitation light source is 10 mW and the light accumulation time of the CCD as the detector is 0.5 second, the concentration is about 8 nM.
When measuring (0.008 nmol / m 3 ) of the FAN phosphor, the gain of the charge amplifier was adjusted so that the detector became full scale. The output of the CCD is converted to a digital signal by an AD converter. When the transparent film of the capillary column is irradiated with excitation light under these conditions, the fluorescence of the film becomes full scale (saturated intensity) of the detector after about 25 minutes.
90% or less, and 10% of full scale in about 60 minutes
It becomes below. This will be described with reference to FIG.
【００２１】図１１のＡ、Ｂ、Ｃは、本発明の一実施例
の蛍光測定装置の効果を示すＤＮＡの電気泳動図であ
る。図１１のＤは、従来法の、皮膜を除去する方法によ
り得られた電気泳動図である。試料のＤＮＡには蛍光物
質がラベルされている。図１１Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄでは同じ
試料を測定している。FIGS. 11A, 11B and 11C are electrophoretograms of DNA showing the effects of the fluorescence measuring device according to one embodiment of the present invention. FIG. 11D is an electrophoretogram obtained by a conventional method for removing a film. A fluorescent substance is labeled on the DNA of the sample. 11A, 11B, 11C, and 11D, the same sample is measured.
【００２２】図１１Ａは、予備照射を行わずに測定した
結果である。横軸が時間、縦軸が蛍光強度を示している
が、皮膜の蛍光が強いバックグラウンドとなるため、試
料の蛍光は照射した最初の方、つまり図の左の方では全
く分からない。FIG. 11A shows the result of measurement without performing preliminary irradiation. The horizontal axis represents time, and the vertical axis represents fluorescence intensity. However, since the fluorescence of the film is a strong background, the fluorescence of the sample cannot be seen at all at the beginning of irradiation, that is, at the left side of the figure.
【００２３】図１１Ｂは、図１１Ａの測定終了後に、キ
ャピラリーカラムに全く同じ試料を導入して行った蛍光
測定の結果である。図１１Ａの測定には２５分かかって
いるため、図１１Ｂの測定結果は予備照射を２５分行っ
て測定した結果ということになる。図１１Ｂの測定結果
においては、バックグラウンドの傾きが分かるため、ベ
ースライン補正により、試料の蛍光ピークの測定が可能
である。図１１Ｂのように、バックグラウンドの傾きが
分かり得るような状態で測定を行うためには、試料の測
定開始時点において、キャピラリーカラム又は流路のバ
ックグラウンドが検出器の飽和強度よりも小さくなって
いることが必要である。バックグラウンドの強度は経時
的に減少するため、測定開始時点でのバックグラウンド
強度が飽和強度よりも小さければ、試料の蛍光測定の途
中からバックグラウンド強度が減少し始めるような、つ
まり図１１Ａのような測定結果にはならない。FIG. 11B shows the result of a fluorescence measurement performed by introducing exactly the same sample into the capillary column after the measurement in FIG. 11A is completed. Since the measurement in FIG. 11A takes 25 minutes, the measurement result in FIG. 11B is a result of performing the preliminary irradiation for 25 minutes. In the measurement results of FIG. 11B, the background slope can be determined, and therefore, the fluorescence peak of the sample can be measured by the baseline correction. As shown in FIG. 11B, in order to perform the measurement in a state where the inclination of the background can be recognized, the background of the capillary column or the channel is smaller than the saturation intensity of the detector at the time of starting the measurement of the sample. It is necessary. Since the background intensity decreases over time, if the background intensity at the start of the measurement is smaller than the saturation intensity, the background intensity starts to decrease in the middle of the fluorescence measurement of the sample, as shown in FIG. 11A. Measurement results are not obtained.
【００２４】図１１Ｃは、図１１Ｂの測定終了後、つま
り図１１Ａの測定での最初の照射から約６０分後に行っ
た測定の結果である。図１１Ａ及び図１１Ｂの測定に要
した時間が経過しているので十分な予備照射がなされて
いることになり、図１１Ｄの皮膜除去の場合と略同じバ
ックグラウンドの低い結果が得られている。この場合、
図１１Ｂとは異なり、ベースライン補正の必要がないた
め、より精度よい測定が可能である。この結果により、
本発明の効果が確認できた。図１１Ｃの図の左端でのバ
ックグラウンド強度は、大体検出器の飽和する強度の約
１０％である。検出器の飽和する強度の約１０％以下に
バックグラウンドを消光させれば、好ましい結果が得ら
れる。FIG. 11C shows the result of the measurement performed after the end of the measurement of FIG. 11B, that is, about 60 minutes after the first irradiation in the measurement of FIG. 11A. Since the time required for the measurement in FIGS. 11A and 11B has elapsed, sufficient preliminary irradiation has been performed, and the same low-background result as in the case of film removal in FIG. 11D has been obtained. in this case,
Unlike FIG. 11B, since there is no need for baseline correction, more accurate measurement is possible. With this result,
The effect of the present invention was confirmed. The background intensity at the left end of the diagram in FIG. 11C is approximately 10% of the detector's saturation intensity. Favorable results are obtained by quenching the background to less than about 10% of the detector's saturation intensity.
【００２５】予備照射の時間は、試料の濃度、皮膜の厚
み、使用条件等で変更させてもよい。また、本実施例で
は、バックグラウンド強度を測定しながら、バックグラ
ウンドが所望の値以下になった後に試料の蛍光測定を行
っていることになるが、バックグラウンドの時間変化を
予め測定しておき、バックグラウンドが所望の値以下に
なると予想される所定の時間が予備照射から経過した後
に、試料の蛍光測定を行うことにしてもよい。The pre-irradiation time may be changed depending on the concentration of the sample, the thickness of the film, the conditions of use, and the like. In the present embodiment, while measuring the background intensity, the fluorescence measurement of the sample is performed after the background has fallen below the desired value.However, the time change of the background is measured in advance. Alternatively, the fluorescence measurement of the sample may be performed after a predetermined period of time in which the background is expected to be lower than the desired value has elapsed from the preliminary irradiation.
【００２６】なお、上記実施例はキャピラリーカラムに
ついて説明したが、電気泳動でない通常の蛍光測定分析
に用いるプラスチックセルに適用しても同様の効果があ
る。Although the above embodiment has been described with reference to a capillary column, the same effects can be obtained by applying the present invention to a plastic cell used for ordinary fluorescence measurement analysis other than electrophoresis.
【００２７】[0027]
【発明の効果】本発明により、キャピラリーカラムの機
械的強度を低下させずに、キャピラリーカラムの樹脂製
皮膜が発する蛍光が試料の蛍光強度測定を妨害するのを
防ぐことができる。また、安価な樹脂製容器を蛍光強度
測定に用いることができる。According to the present invention, it is possible to prevent the fluorescence emitted from the resin coating of the capillary column from interfering with the measurement of the fluorescence intensity of the sample without reducing the mechanical strength of the capillary column. Further, an inexpensive resin container can be used for the fluorescence intensity measurement.
【図１】本発明の一実施例の蛍光測定装置の構成図。FIG. 1 is a configuration diagram of a fluorescence measurement device according to one embodiment of the present invention.
【図２】本発明の一実施例の蛍光検出部の構成図。FIG. 2 is a configuration diagram of a fluorescence detection unit according to one embodiment of the present invention.
【図３】本発明の別の実施例の蛍光検出部の構成図。FIG. 3 is a configuration diagram of a fluorescence detection unit according to another embodiment of the present invention.
【図４】本発明のさらに別の実施例の蛍光検出部の構成
図。FIG. 4 is a configuration diagram of a fluorescence detection unit according to still another embodiment of the present invention.
【図５】本発明のさらに別の実施例の蛍光検出部の構成
図。FIG. 5 is a configuration diagram of a fluorescence detection unit according to still another embodiment of the present invention.
【図６】本発明のさらに別の実施例の蛍光検出部の構成
図。FIG. 6 is a configuration diagram of a fluorescence detection unit according to still another embodiment of the present invention.
【図７】従来法の測定までの手順を示した流れ図。FIG. 7 is a flowchart showing a procedure up to measurement in a conventional method.
【図８】本発明の一実施例の測定までの手順を示した流
れ図。FIG. 8 is a flowchart showing a procedure up to measurement in one embodiment of the present invention.
【図９】本発明の別の実施例の測定までの手順を示した
流れ図。FIG. 9 is a flowchart showing a procedure up to measurement according to another embodiment of the present invention.
【図１０】本発明のさらに別の実施例の測定までの手順
を示した流れ図。FIG. 10 is a flowchart showing a procedure up to measurement according to still another embodiment of the present invention.
【図１１】本発明及び従来方法により得られた電気泳動
図。FIG. 11 is an electrophoretogram obtained by the present invention and the conventional method.
１…本体、２…キャピラリーカラム、３…リザーバ、４
…リザーバ、５…電極、６…電源、７…蛍光検出部、８
…コンピュータ、９…光源、１０…ダイクロイックミラ
ー、１１…レンズ、１２…キャピラリーカラム、１３…
皮膜、１４…蛍光試料、１５…フィルター、１６…検出
器、１０１…励起光、１０２…（樹脂皮膜が発する）蛍
光、１０３…（蛍光試料が発する）蛍光。1 ... body, 2 ... capillary column, 3 ... reservoir, 4
... reservoir, 5 ... electrode, 6 ... power supply, 7 ... fluorescence detector, 8
... Computer, 9 ... Light source, 10 ... Dichroic mirror, 11 ... Lens, 12 ... Capillary column, 13 ...
Coating, 14: Fluorescent sample, 15: Filter, 16: Detector, 101: Excitation light, 102: Fluorescence (emitted by the resin film), 103: Fluorescence (emitted by the fluorescent sample).
Claims (7)
と、該キャピラリーカラムに励起光を照射する光源と、
該励起光によって発生した蛍光を検出する蛍光検出部
と、上記光源及び上記蛍光検出部の動作を制御する制御
部を有し、上記キャピラリーカラムに励起光を照射し、
上記キャピラリーカラム自体又は上記樹脂皮膜から蛍光
を発生させ、該蛍光が所望の値以下に消光した後、上記
キャピラリーカラム中の試料の蛍光強度測定を行うこと
を特徴とする蛍光測定装置。1. A capillary column covered with a resin film, a light source for irradiating the capillary column with excitation light,
A fluorescence detection unit that detects fluorescence generated by the excitation light, and a control unit that controls the operation of the light source and the fluorescence detection unit, and irradiates the capillary column with excitation light,
A fluorescence measuring device, wherein fluorescence is generated from the capillary column itself or the resin film, and after the fluorescence is quenched to a desired value or less, the fluorescence intensity of the sample in the capillary column is measured.
と、該キャピラリーカラムに励起光を照射する光源と、
該励起光によって発生した蛍光を検出する蛍光検出部
と、上記光源及び上記蛍光検出部の動作を制御する制御
部を有し、上記キャピラリーカラムに励起光を照射し、
上記キャピラリーカラム自体又は上記樹脂皮膜から蛍光
を発生させ、上記励起光の照射時から所定の時間が経過
した後、上記キャピラリーカラム中の試料の蛍光強度測
定を行うことを特徴とする蛍光測定装置。2. A capillary column covered with a resin film, a light source for irradiating the capillary column with excitation light,
A fluorescence detection unit that detects fluorescence generated by the excitation light, and a control unit that controls the operation of the light source and the fluorescence detection unit, and irradiates the capillary column with excitation light,
A fluorescence measurement apparatus, wherein fluorescence is generated from the capillary column itself or the resin film, and after a predetermined time has elapsed from the irradiation of the excitation light, the fluorescence intensity of the sample in the capillary column is measured.
記キャピラリーカラム自体又は上記樹脂皮膜から発生す
る蛍光を上記検出部の飽和強度よりも小さくして、上記
キャピラリーカラム中の試料の蛍光強度測定を行うこと
を特徴とする蛍光測定装置。3. The fluorescence measurement apparatus according to claim 1, wherein the fluorescence intensity of the sample in the capillary column is measured by making the fluorescence generated from the capillary column itself or the resin film smaller than the saturation intensity of the detection section. A fluorescence measuring device characterized by the above-mentioned.
たことを特徴とする請求項１から３のいずれか一に記載
の蛍光測定装置。4. The fluorescence measuring apparatus according to claim 1, wherein a plurality of said capillary columns are provided.
特徴とする請求項１から３のいずれか一に記載の蛍光測
定装置。5. The fluorescence measuring apparatus according to claim 1, wherein said excitation light has a plurality of wavelengths.
路に励起光を照射し、該容器又は該流路から蛍光を発生
させ、該蛍光の強度が所望の値以下になるまで時間が経
過した後に、上記容器又は上記流路中の測定試料の蛍光
を測定することを特徴とする蛍光測定方法。6. A container or a channel in which a sample for fluorescence measurement is held is irradiated with excitation light to generate fluorescence from the container or the channel, and a time period until the intensity of the fluorescence becomes a desired value or less. Measuring the fluorescence of the measurement sample in the container or the flow channel after elapse of.
路に励起光を照射する第１のステップ、上記照射により
上記容器又は上記流路から発生した蛍光強度を測定し、
該蛍光強度が所望の値以下になったことを検出する第２
のステップ、上記容器又は上記流路に導入された試料に
励起光を照射し、該試料が発する蛍光を測定する第３の
ステップを有することを特徴とする蛍光測定方法。7. A first step of irradiating a vessel or a channel holding a sample for fluorescence measurement with excitation light, measuring a fluorescence intensity generated from the container or the channel by the irradiation,
A second method for detecting that the fluorescence intensity has fallen below a desired value.
And a third step of irradiating the sample introduced into the container or the flow path with excitation light and measuring fluorescence emitted by the sample.
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- 2001-01-31 JP JP2001022935A patent/JP2002228586A/en active Pending
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