JP2002191396A - ルシフェラーゼ発光反応の増強法 - Google Patents
ルシフェラーゼ発光反応の増強法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、ルシフェリン再生酵素を用いるルシ
フェラーゼ発光反応系において、その発光を増強させる
方法、およびそのための試薬キットを提供することを目
的とする。 【解決手段】ATP、ホタルルシフェリン、ルシフェラー
ゼ、D-システイン、2価金属イオンおよびルシフェリン
再生酵素が関与する発光反応系に、CoA,ピロリン酸また
はピリドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体から選
ばれる一種以上を添加することを特徴とする、発光反応
の増強方法。以下の（１）〜（３）記載の成分を含む試
薬キット。（１）CoA,ピロリン酸またはピリドキサール
リン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、
（２）D-システイン、（３）ルシフェリン再生酵素を含
む試薬キット
フェラーゼ発光反応系において、その発光を増強させる
方法、およびそのための試薬キットを提供することを目
的とする。 【解決手段】ATP、ホタルルシフェリン、ルシフェラー
ゼ、D-システイン、2価金属イオンおよびルシフェリン
再生酵素が関与する発光反応系に、CoA,ピロリン酸また
はピリドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体から選
ばれる一種以上を添加することを特徴とする、発光反応
の増強方法。以下の（１）〜（３）記載の成分を含む試
薬キット。（１）CoA,ピロリン酸またはピリドキサール
リン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、
（２）D-システイン、（３）ルシフェリン再生酵素を含
む試薬キット
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、主として甲虫類由
来のルシフェラーゼおよびルシフェリンが関与する生物
発光の増強法およびそのための試薬キットに関する。
来のルシフェラーゼおよびルシフェリンが関与する生物
発光の増強法およびそのための試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】ホタル由来のルシフェラーゼが触媒する
発光反応については、長年に渡って仔細な研究がなされ
ており、その反応機構は以下の通りである。ホタルルシ
フェリン＋ATP＋O2＋H2O→ オキシルシフェリン＋AMP＋
PPi＋CO2＋光この反応には、2価金属イオン、例えばMg
2+、Mn2+が必要である。以下、本発明では、2価金属イ
オンの存在下でATPおよびホタルルシフェリンに作用し
て発光反応を生じさせる活性のことを、「ルシフェラー
ゼ活性」という。
発光反応については、長年に渡って仔細な研究がなされ
ており、その反応機構は以下の通りである。ホタルルシ
フェリン＋ATP＋O2＋H2O→ オキシルシフェリン＋AMP＋
PPi＋CO2＋光この反応には、2価金属イオン、例えばMg
2+、Mn2+が必要である。以下、本発明では、2価金属イ
オンの存在下でATPおよびホタルルシフェリンに作用し
て発光反応を生じさせる活性のことを、「ルシフェラー
ゼ活性」という。
【０００３】上記発光（以下、「ルシフェラーゼ発光」
という）反応における発光量はATP量に比例することか
ら、ルシフェラーゼは試料中のATP量測定に利用されて
いる。現在、ルシフェラーゼを用いたATP検出法は、微
生物や食品残さ由来のATP量を測定する清浄度検査や、
微生物由来のATP量を測定する菌数検査等の衛生検査分
野で利用されている。また、修飾ルシフェラーゼ、例え
ば、化学修飾法（特開昭60-138463）や組換法（特開平8
-308578）によりビオチン化されたビオチン化ルシフェ
ラーゼも種々の測定系にて使用されている。ビオチン化
ルシフェラーゼは、そのビオチンを介してルシフェラー
ゼとアビジンまたはストレプトアビジンとの複合体を作
製することにより、例えば、現在多用されている酵素免
疫測定法、DNAプローブ法、免疫染色法、in situハイブ
リダイゼーション法等のビオチン・アビシンを利用した
検出系に応用されている。（北川常廣編、酵素免疫測定
法（蛋白質核酸酵素別冊NO.31）（1997）、共立出版、
P. Tijssen著、石川栄治監訳、エンザイムイムノアッセ
イ（1989）、東京化学同人、高橋豊三著、DNAプローブ
（1988）、シーエムシー）。
という）反応における発光量はATP量に比例することか
ら、ルシフェラーゼは試料中のATP量測定に利用されて
いる。現在、ルシフェラーゼを用いたATP検出法は、微
生物や食品残さ由来のATP量を測定する清浄度検査や、
微生物由来のATP量を測定する菌数検査等の衛生検査分
野で利用されている。また、修飾ルシフェラーゼ、例え
ば、化学修飾法（特開昭60-138463）や組換法（特開平8
-308578）によりビオチン化されたビオチン化ルシフェ
ラーゼも種々の測定系にて使用されている。ビオチン化
ルシフェラーゼは、そのビオチンを介してルシフェラー
ゼとアビジンまたはストレプトアビジンとの複合体を作
製することにより、例えば、現在多用されている酵素免
疫測定法、DNAプローブ法、免疫染色法、in situハイブ
リダイゼーション法等のビオチン・アビシンを利用した
検出系に応用されている。（北川常廣編、酵素免疫測定
法（蛋白質核酸酵素別冊NO.31）（1997）、共立出版、
P. Tijssen著、石川栄治監訳、エンザイムイムノアッセ
イ（1989）、東京化学同人、高橋豊三著、DNAプローブ
（1988）、シーエムシー）。
【０００４】このように、ルシフェラーゼ発光を用いた
測定法は、臨床検査、衛生検査等に広く利用されてい
る。また、近年では、ルシフェラーゼ発光は、玩具、遊
具、照明、演出装置あるいは結婚式等のイベントにも利
用されている。一方、ルシフェラーゼ発光のパターン
が、研究試薬や産業上の利用に際し問題になっていた。
すなわち、ルシフェラーゼ発光は、短時間に急激にピー
クに達し、以後急激に減衰し、定常状態となりさらにゆ
っくりと減衰していく。このため、ルシフェラーゼ発光
の減衰を抑制すること、および／または発光量を増加さ
せること、すなわち発光を増強させることが、ルシフェ
ラーゼ発光を利用する産業分野において求められてい
る。すなわち、ルシフェラーゼ発光の増強により、発光
測定系の高感度化が可能となり、また玩具、遊具、照明
や結婚式等のイベントの分野においては、利用者が発光
を長時間楽しむことができるようになる。ルシフェラー
ゼ発光を増強させる方法として、発光反応系に、CoAやD
TT等のチオール試薬を添加する方法（特表平6-500921、
US5283179、US5650189、US5641641）、ピロリン酸を添
加する方法（US4246340、Arch. Biochem. Biophys.46、
399〜416、1953）、ルシフェラーゼ阻害剤を添加する方
法（US5814471）、チオール試薬とBSAを共存させる方法
（特表平6-500921）が開発されている。
測定法は、臨床検査、衛生検査等に広く利用されてい
る。また、近年では、ルシフェラーゼ発光は、玩具、遊
具、照明、演出装置あるいは結婚式等のイベントにも利
用されている。一方、ルシフェラーゼ発光のパターン
が、研究試薬や産業上の利用に際し問題になっていた。
すなわち、ルシフェラーゼ発光は、短時間に急激にピー
クに達し、以後急激に減衰し、定常状態となりさらにゆ
っくりと減衰していく。このため、ルシフェラーゼ発光
の減衰を抑制すること、および／または発光量を増加さ
せること、すなわち発光を増強させることが、ルシフェ
ラーゼ発光を利用する産業分野において求められてい
る。すなわち、ルシフェラーゼ発光の増強により、発光
測定系の高感度化が可能となり、また玩具、遊具、照明
や結婚式等のイベントの分野においては、利用者が発光
を長時間楽しむことができるようになる。ルシフェラー
ゼ発光を増強させる方法として、発光反応系に、CoAやD
TT等のチオール試薬を添加する方法（特表平6-500921、
US5283179、US5650189、US5641641）、ピロリン酸を添
加する方法（US4246340、Arch. Biochem. Biophys.46、
399〜416、1953）、ルシフェラーゼ阻害剤を添加する方
法（US5814471）、チオール試薬とBSAを共存させる方法
（特表平6-500921）が開発されている。
【０００５】ルシフェラーゼ発光の減衰の原因のひとつ
に、反応産物であるオキシルシフェリンによるルシフェ
ラーゼ活性阻害があげられる（Arch. Biochem. Biophy
s.169、616〜621、1975）。ホタル体内において、オキ
シルシフェリンはニトリル体を経てホタルルシフェリン
に再生されうることが以前より知られていた（Tetrahed
ron Letters 32、2771〜2774、1974）。また、オキシル
シフェリンからホタルルシフェリンを再生する反応に関
与するタンパク質（ルシフェリン再生酵素）がホタル発
光器から発見され（特開平10-114794）、さらに該タン
パク質の遺伝子がクローニングされた（特願平11-28525
8、特願2000-228226、特願2000-228227）。
に、反応産物であるオキシルシフェリンによるルシフェ
ラーゼ活性阻害があげられる（Arch. Biochem. Biophy
s.169、616〜621、1975）。ホタル体内において、オキ
シルシフェリンはニトリル体を経てホタルルシフェリン
に再生されうることが以前より知られていた（Tetrahed
ron Letters 32、2771〜2774、1974）。また、オキシル
シフェリンからホタルルシフェリンを再生する反応に関
与するタンパク質（ルシフェリン再生酵素）がホタル発
光器から発見され（特開平10-114794）、さらに該タン
パク質の遺伝子がクローニングされた（特願平11-28525
8、特願2000-228226、特願2000-228227）。
【０００６】ATP,ホタルルシフェリン、ルシフェラー
ゼ、2価金属イオンを反応させる従来の生物発光反応系
に、D-システインおよびルシフェリン再生酵素を添加す
ると発光量が増大することは知られている（特開平10-1
14794）。図１に示す通り、従来の生物発光反応系にD-
システインおよびルシフェリン再生酵素を共存させる
と、発光の結果生成するオキシルシフェリンがD-システ
イン存在下でホタルルシフェリンに再生され、再び発光
反応に関与するので、発光量が増大すると考えられる。
そしてルシフェリン再生酵素を用いる発光反応系におい
ても、さらに発光を増強する方法が求められている。
ゼ、2価金属イオンを反応させる従来の生物発光反応系
に、D-システインおよびルシフェリン再生酵素を添加す
ると発光量が増大することは知られている（特開平10-1
14794）。図１に示す通り、従来の生物発光反応系にD-
システインおよびルシフェリン再生酵素を共存させる
と、発光の結果生成するオキシルシフェリンがD-システ
イン存在下でホタルルシフェリンに再生され、再び発光
反応に関与するので、発光量が増大すると考えられる。
そしてルシフェリン再生酵素を用いる発光反応系におい
ても、さらに発光を増強する方法が求められている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ルシフェリ
ン再生酵素を用いるルシフェラーゼ発光反応系におい
て、その発光を増強させる方法、ルシフェラーゼ活性ま
たはホタルルシフェリンの検出法、およびそのための試
薬を提供することを目的とする。
ン再生酵素を用いるルシフェラーゼ発光反応系におい
て、その発光を増強させる方法、ルシフェラーゼ活性ま
たはホタルルシフェリンの検出法、およびそのための試
薬を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
について種々検討した結果、ATP,ホタルルシフェリン、
D-システイン、2価金属イオンおよびルシフェリン再生
酵素が関与する発光反応系に、CoA,ピロリン酸またはピ
リドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれ
る一種以上を添加することにより発光の増強が可能とな
ることを見出し、本発明を完成した。
について種々検討した結果、ATP,ホタルルシフェリン、
D-システイン、2価金属イオンおよびルシフェリン再生
酵素が関与する発光反応系に、CoA,ピロリン酸またはピ
リドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれ
る一種以上を添加することにより発光の増強が可能とな
ることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】即ち、本発明は、下記の方法および試薬キ
ットを提供するものである。 １．ATP、ホタルルシフェリン、ルシフェラーゼ、D-シ
ステイン、2価金属イオンおよびルシフェリン再生酵素
が関与する発光反応系に、CoA,ピロリン酸またはピリド
キサールリン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一
種以上を添加することを特徴とする、発光反応の増強方
法。
ットを提供するものである。 １．ATP、ホタルルシフェリン、ルシフェラーゼ、D-シ
ステイン、2価金属イオンおよびルシフェリン再生酵素
が関与する発光反応系に、CoA,ピロリン酸またはピリド
キサールリン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一
種以上を添加することを特徴とする、発光反応の増強方
法。
【００１０】２．ATP,ホタルルシフェリン、D-システイ
ン、2価金属イオンおよびルシフェリン再生酵素が関与
する発光反応に基づく発光測定法において、発光反応系
に、CoA,ピロリン酸またはピリドキサールリン酸もしく
はこれらの誘導体から選ばれる一種以上を添加すること
を特徴とする、発光測定法。
ン、2価金属イオンおよびルシフェリン再生酵素が関与
する発光反応に基づく発光測定法において、発光反応系
に、CoA,ピロリン酸またはピリドキサールリン酸もしく
はこれらの誘導体から選ばれる一種以上を添加すること
を特徴とする、発光測定法。
【００１１】３．CoA,ピロリン酸またはピリドキサール
リン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、
ATP,ホタルルシフェリン、D-システイン、2価金属イオ
ンおよびルシフェリン再生酵素を試料に添加し、生じる
発光を測定することを特徴とする、試料中のルシフェラ
ーゼ活性の検出法。
リン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、
ATP,ホタルルシフェリン、D-システイン、2価金属イオ
ンおよびルシフェリン再生酵素を試料に添加し、生じる
発光を測定することを特徴とする、試料中のルシフェラ
ーゼ活性の検出法。
【００１２】４．ルシフェラーゼとして、試料中の被検
物質と結合可能である修飾ルシフェラーゼを使用するこ
とを特徴とする、上記３記載の方法。
物質と結合可能である修飾ルシフェラーゼを使用するこ
とを特徴とする、上記３記載の方法。
【００１３】５．修飾ルシフェラーゼが、ビオチン、抗
体、ハプテン、酵素、核酸または補酵素とルシフェラー
ゼが結合したものである、上記４記載の方法。
体、ハプテン、酵素、核酸または補酵素とルシフェラー
ゼが結合したものである、上記４記載の方法。
【００１４】６．CoA,ピロリン酸またはピリドキサール
リン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、
ルシフェラーゼ、ATP、D-システイン、2価金属イオンお
よびルシフェリン再生酵素を試料に添加し、生じる発光
を測定することを特徴とする、試料中のホタルルシフェ
リンの検出法。
リン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、
ルシフェラーゼ、ATP、D-システイン、2価金属イオンお
よびルシフェリン再生酵素を試料に添加し、生じる発光
を測定することを特徴とする、試料中のホタルルシフェ
リンの検出法。
【００１５】７．ホタルルシフェリンがルシフェリン誘
導体から遊離したルシフェリンである、上記６記載の方
法。 ８．ルシフェリン誘導体がルシフェリンガラクトシドま
たはオキシルシフェリンである上記７記載の方法 ９．以下の（１）〜（３）記載の成分を含む試薬キット （１）CoA,ピロリン酸またはピリドキサールリン酸もし
くはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、（２）D-シ
ステイン、（３）ルシフェリン再生酵素
導体から遊離したルシフェリンである、上記６記載の方
法。 ８．ルシフェリン誘導体がルシフェリンガラクトシドま
たはオキシルシフェリンである上記７記載の方法 ９．以下の（１）〜（３）記載の成分を含む試薬キット （１）CoA,ピロリン酸またはピリドキサールリン酸もし
くはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、（２）D-シ
ステイン、（３）ルシフェリン再生酵素
【００１６】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。 〔発光反応の増強方法〕本発明における発光反応の増強
方法は、ATP、ホタルルシフェリン（以下、単に「ルシ
フェリン」と記載することもある）、ルシフェラーゼ、
D-システイン、2価金属イオンおよびルシフェリン再生
酵素が関与する発光反応系に、CoA,ピロリン酸またはピ
リドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれ
る一種以上を添加することを特徴とする。ホタルルシフ
ェリンは、下記一般式に示す化合物である。
する。 〔発光反応の増強方法〕本発明における発光反応の増強
方法は、ATP、ホタルルシフェリン（以下、単に「ルシ
フェリン」と記載することもある）、ルシフェラーゼ、
D-システイン、2価金属イオンおよびルシフェリン再生
酵素が関与する発光反応系に、CoA,ピロリン酸またはピ
リドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれ
る一種以上を添加することを特徴とする。ホタルルシフ
ェリンは、下記一般式に示す化合物である。
【００１７】
【化１】
【００１８】また、ホタルルシフェリンは発光反応に関
与できるものであれば、上記一般式に示す化合物の誘導
体、例えばホタルルシフェリンの塩、エステル、配糖体
であってもよい。なお、ホタルルシフェリンは、反応に
直接関与しない誘導体、例えばルシフェリンガラクトシ
ド、オキシルシフェリンなどから、酵素的あるいは非酵
素的反応により生成したものであってもよい。ルシフェ
ラーゼは、ルシフェラーゼ活性を有するものであればよ
く、好適なものとしては、甲虫、例えばゲンジボタル、
ヘイケボタル、アメリカボタル等を由来とするルシフェ
ラーゼが挙げられる。ルシフェラーゼとしては、上記の
昆虫の発光器から精製されたもの、クローニングされた
ルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換え体微生物により
生産されたものが挙げられる。また、ルシフェラーゼ
は、天然型ルシフェラーゼに限定されず、変異型ルシフ
ェラーゼや修飾ルシフェラーゼであってもよい。修飾ル
シフェラーゼとは、例えば生理活性物質、具体的には、
ビオチン、ホルモン、レセプター、抗体、ハプテン、酵
素、核酸、補酵素等と結合したルシフェラーゼである。
また、ATPはATP産生酵素によって試料中の他の化合物か
ら生成されたものでもよい。ATP産生酵素としてはアセ
テートカイネース、ピルベートオルソフォスフェートジ
キナーゼ(PPDK)などがあげられるが、これらに限定され
るものではない。2価金属イオンは、好ましくは、M
g2+、Mn2+等であるが、特にこれらに限定されない。
与できるものであれば、上記一般式に示す化合物の誘導
体、例えばホタルルシフェリンの塩、エステル、配糖体
であってもよい。なお、ホタルルシフェリンは、反応に
直接関与しない誘導体、例えばルシフェリンガラクトシ
ド、オキシルシフェリンなどから、酵素的あるいは非酵
素的反応により生成したものであってもよい。ルシフェ
ラーゼは、ルシフェラーゼ活性を有するものであればよ
く、好適なものとしては、甲虫、例えばゲンジボタル、
ヘイケボタル、アメリカボタル等を由来とするルシフェ
ラーゼが挙げられる。ルシフェラーゼとしては、上記の
昆虫の発光器から精製されたもの、クローニングされた
ルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換え体微生物により
生産されたものが挙げられる。また、ルシフェラーゼ
は、天然型ルシフェラーゼに限定されず、変異型ルシフ
ェラーゼや修飾ルシフェラーゼであってもよい。修飾ル
シフェラーゼとは、例えば生理活性物質、具体的には、
ビオチン、ホルモン、レセプター、抗体、ハプテン、酵
素、核酸、補酵素等と結合したルシフェラーゼである。
また、ATPはATP産生酵素によって試料中の他の化合物か
ら生成されたものでもよい。ATP産生酵素としてはアセ
テートカイネース、ピルベートオルソフォスフェートジ
キナーゼ(PPDK)などがあげられるが、これらに限定され
るものではない。2価金属イオンは、好ましくは、M
g2+、Mn2+等であるが、特にこれらに限定されない。
【００１９】本発明でいうルシフェリン再生酵素とは、
オキシルシフェリンをD-システイン存在下でホタルルシ
フェリンに変換させる能力をもつ酵素のことであり、そ
の由来は限定されない。ルシフェリン再生酵素をコード
する遺伝子はすでに得られているので、該遺伝子を含有
する組換体微生物を培養することにより、培養物からル
シフェリン再生酵素を精製することができる。例えば、
アメリカホタル由来のルシフェリン再生酵素は、組換え
体大腸菌であるE.coliJM109(ｐLRE)（FERM BP-6908）よ
り精製可能である。この場合、まず、該組換え体をTY培
地で37℃一昼夜培養し、集菌後、リゾチームにより溶菌
させる。溶菌液の遠心上清を30%〜65％飽和硫安分画
し、得られた硫安沈殿物を少量のバッファーに溶解さ
せ、ゲル濾過カラムで分画する。活性画分をセントリプ
レップ10（アミコン社製）で濃縮し、QセファロースFF
カラムにかける。吸着画分の溶出は１〜200ｍM NaCl直
線濃度勾配で行う。活性画分をSDS-PAGEで解析し、シグ
ルバンドであることを確認した後、セントリプレップ10
で濃縮し、ルシフェリン再生酵素標品とする。
オキシルシフェリンをD-システイン存在下でホタルルシ
フェリンに変換させる能力をもつ酵素のことであり、そ
の由来は限定されない。ルシフェリン再生酵素をコード
する遺伝子はすでに得られているので、該遺伝子を含有
する組換体微生物を培養することにより、培養物からル
シフェリン再生酵素を精製することができる。例えば、
アメリカホタル由来のルシフェリン再生酵素は、組換え
体大腸菌であるE.coliJM109(ｐLRE)（FERM BP-6908）よ
り精製可能である。この場合、まず、該組換え体をTY培
地で37℃一昼夜培養し、集菌後、リゾチームにより溶菌
させる。溶菌液の遠心上清を30%〜65％飽和硫安分画
し、得られた硫安沈殿物を少量のバッファーに溶解さ
せ、ゲル濾過カラムで分画する。活性画分をセントリプ
レップ10（アミコン社製）で濃縮し、QセファロースFF
カラムにかける。吸着画分の溶出は１〜200ｍM NaCl直
線濃度勾配で行う。活性画分をSDS-PAGEで解析し、シグ
ルバンドであることを確認した後、セントリプレップ10
で濃縮し、ルシフェリン再生酵素標品とする。
【００２０】ルシフェリン再生酵素を含むと思われる画
分の活性測定は、以下の方法により行なう。まず、活性
測定用緩衝液（25mMグリシルグリシン＋5.4mM硫酸マグ
ネシウム、（pH7.8））8.5ml に0.01ｍM D-システイン1
mlおよび1ｍMオキシルシフェリン0.5mlを添加し、基質
混合液を作製する。この混合液100μlに、測定サンプル
10μlを加え、37℃で一定時間反応させる。この反応液1
0μlを活性測定用緩衝液100μlに添加した後、ATP、ル
シフェラーゼ混合液（10mMATP溶液に、ルシフェラーゼ
を0.5mg/mlとなるよう添加した溶液）を100μl注入し、
発光量を5秒間積算する。ルシフェリン再生酵素を含む
画分は、他の画分よりも発光量が多い。本発明の発光の
増強法において反応系に添加されるのは、CoA,ピロリン
酸またはピリドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体
から選ばれる一種である。CoAや、ピロリン酸はルシフ
ェラーゼに結合したオキシルシフェリンを放出すると考
えられている（Biochim. Biophys. Acta 27、519〜53
2、1958、Arch. Biochem.Biophys.46、399〜416、195
3）。CoAやピロリン酸によりルシフェラーゼから引き離
されたオキシルシフェリンは、ルシフェリン再生酵素の
作用を受けやすくなり、D-システイン存在下で効率よく
ホタルルシフェリンに再生される。再生されたホタルル
シフェリンは、ルシフェラーゼの基質として再度使われ
る。また、オキシルシフェリンがホタルルシフェリンに
再生されるため、ルシフェラーゼへの再結合が防止さ
れ、オキシルシフェリンによるルシフェラーゼの阻害も
緩和される。
分の活性測定は、以下の方法により行なう。まず、活性
測定用緩衝液（25mMグリシルグリシン＋5.4mM硫酸マグ
ネシウム、（pH7.8））8.5ml に0.01ｍM D-システイン1
mlおよび1ｍMオキシルシフェリン0.5mlを添加し、基質
混合液を作製する。この混合液100μlに、測定サンプル
10μlを加え、37℃で一定時間反応させる。この反応液1
0μlを活性測定用緩衝液100μlに添加した後、ATP、ル
シフェラーゼ混合液（10mMATP溶液に、ルシフェラーゼ
を0.5mg/mlとなるよう添加した溶液）を100μl注入し、
発光量を5秒間積算する。ルシフェリン再生酵素を含む
画分は、他の画分よりも発光量が多い。本発明の発光の
増強法において反応系に添加されるのは、CoA,ピロリン
酸またはピリドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体
から選ばれる一種である。CoAや、ピロリン酸はルシフ
ェラーゼに結合したオキシルシフェリンを放出すると考
えられている（Biochim. Biophys. Acta 27、519〜53
2、1958、Arch. Biochem.Biophys.46、399〜416、195
3）。CoAやピロリン酸によりルシフェラーゼから引き離
されたオキシルシフェリンは、ルシフェリン再生酵素の
作用を受けやすくなり、D-システイン存在下で効率よく
ホタルルシフェリンに再生される。再生されたホタルル
シフェリンは、ルシフェラーゼの基質として再度使われ
る。また、オキシルシフェリンがホタルルシフェリンに
再生されるため、ルシフェラーゼへの再結合が防止さ
れ、オキシルシフェリンによるルシフェラーゼの阻害も
緩和される。
【００２１】ピリドキサールリン酸とはビタミンB6リン
酸化合物である。ピリドキサールリン酸がルシフェラー
ゼ発光に関与するという報告は今までになく、本発明で
初めて明らかになったものである。添加されたCoA,ピロ
リン酸またはピリドキサールリン酸は、図２に示すよう
な状態でルシフェラーゼ発光反応に関与していると考え
られる。CoA、ピロリン酸またはピリドキサールリン酸
の誘導体とは、これらの化合物の基本的な構造を有しか
つルシフェラーゼ発光を増強できる物質であれば限定さ
れない。誘導体とは例えば、CoA等の塩、エステル化
物、アセチル化物、脱リン酸物などである。具体的に
は、CoA誘導体とは、例えばデホスホCoA、アセチルCoA
等である。また、ピロリン酸誘導体とは、例えば、ピロ
リン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム等である。また
ピリドキサールリン酸誘導体とは、例えば その塩であ
る。本発明の発光の増強法において、CoA,ピロリン酸ま
たはピリドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体を反
応系に添加する場合、その添加量は特に限定されない。
これらの試薬は、例えば、終濃度０．１〜２ｍＭとなる
ように反応系に添加することができる。
酸化合物である。ピリドキサールリン酸がルシフェラー
ゼ発光に関与するという報告は今までになく、本発明で
初めて明らかになったものである。添加されたCoA,ピロ
リン酸またはピリドキサールリン酸は、図２に示すよう
な状態でルシフェラーゼ発光反応に関与していると考え
られる。CoA、ピロリン酸またはピリドキサールリン酸
の誘導体とは、これらの化合物の基本的な構造を有しか
つルシフェラーゼ発光を増強できる物質であれば限定さ
れない。誘導体とは例えば、CoA等の塩、エステル化
物、アセチル化物、脱リン酸物などである。具体的に
は、CoA誘導体とは、例えばデホスホCoA、アセチルCoA
等である。また、ピロリン酸誘導体とは、例えば、ピロ
リン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム等である。また
ピリドキサールリン酸誘導体とは、例えば その塩であ
る。本発明の発光の増強法において、CoA,ピロリン酸ま
たはピリドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体を反
応系に添加する場合、その添加量は特に限定されない。
これらの試薬は、例えば、終濃度０．１〜２ｍＭとなる
ように反応系に添加することができる。
【００２２】本発明において、ATP、ホタルルシフェリ
ン、ルシフェラーゼ、D-システイン、2価金属イオンお
よびルシフェリン再生酵素が関与する発光反応系とは、
どのような産業分野に利用されるものであってもよい。
該産業分野としては、例えば、医療分野、学術研究分野
が挙げられる。また玩具、遊具、照明、演出装置あるい
は結婚式等のイベントに関する分野も挙げられる。上記
発光反応系としては、ルシフェリンおよびルシフェラー
ゼが関与する発光測定法が例示される。発光測定法とは
例えば、以下の測定法である。 （１）試料にルシフェリン、ルシフェラーゼおよびMg2+
を添加して生じる発光を測定する、試料中のＡＴＰ量の
測定法 （２）試料中のAMPをホスホエノールピルビン酸存在下
でPPDKによりATPに変換させ、さらにルシフェリン、ル
シフェラーゼおよびMg2+を添加して生じる発光を測定す
る、試料中のAMP量の測定法
ン、ルシフェラーゼ、D-システイン、2価金属イオンお
よびルシフェリン再生酵素が関与する発光反応系とは、
どのような産業分野に利用されるものであってもよい。
該産業分野としては、例えば、医療分野、学術研究分野
が挙げられる。また玩具、遊具、照明、演出装置あるい
は結婚式等のイベントに関する分野も挙げられる。上記
発光反応系としては、ルシフェリンおよびルシフェラー
ゼが関与する発光測定法が例示される。発光測定法とは
例えば、以下の測定法である。 （１）試料にルシフェリン、ルシフェラーゼおよびMg2+
を添加して生じる発光を測定する、試料中のＡＴＰ量の
測定法 （２）試料中のAMPをホスホエノールピルビン酸存在下
でPPDKによりATPに変換させ、さらにルシフェリン、ル
シフェラーゼおよびMg2+を添加して生じる発光を測定す
る、試料中のAMP量の測定法
【００２３】〔試料中のルシフェラーゼ活性の検出法〕
別の態様では、本発明は試料中のルシフェラーゼ活性の
検出法であって、CoA,ピロリン酸またはピリドキサール
リン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、
ATP,ホタルルシフェリン、D-システイン、2価金属イオ
ンおよびルシフェリン再生酵素を試料に添加し、生じる
発光を測定することを特徴とする。試料中にルシフェラ
ーゼが存在する場合、上記の試薬を試料に添加すること
によりルシフェラーゼ発光が生じ、さらにCoA,ピロリン
酸またはピリドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体
から選ばれる一種以上とルシフェリン再生酵素、D-シス
テインの作用により発光が増強される。このため、試料
中のルシフェラーゼが高感度に検出される。本発明にお
いてルシフェラーゼ発光は、市販のルミノメーター、シ
ンチレーションカウンター、光度計、フォトエマルジョ
ンフィルム等を利用して測定することができる。ルシフ
ェラーゼが修飾ルシフェラーゼ、特に試料中の被検物質
と結合可能なものである場合は、上記方法により生じた
ルシフェラーゼ発光を測定することにより試料中の被検
物質を高感度に測定することができる。そのような修飾
ルシフェラーゼとしては、ビオチン、抗体、ハプテン、
酵素、核酸または補酵素等とルシフェラーゼが結合した
ものが挙げられる。ビオチン等とルシフェラーゼの結合
は、直接的であってもよく、また適当な化合物を介して
間接的に結合していてもよい。ルシフェラーゼと他のタ
ンパク質を結合する場合は遺伝子工学的手法により融合
タンパク質とすることもできる。
別の態様では、本発明は試料中のルシフェラーゼ活性の
検出法であって、CoA,ピロリン酸またはピリドキサール
リン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、
ATP,ホタルルシフェリン、D-システイン、2価金属イオ
ンおよびルシフェリン再生酵素を試料に添加し、生じる
発光を測定することを特徴とする。試料中にルシフェラ
ーゼが存在する場合、上記の試薬を試料に添加すること
によりルシフェラーゼ発光が生じ、さらにCoA,ピロリン
酸またはピリドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体
から選ばれる一種以上とルシフェリン再生酵素、D-シス
テインの作用により発光が増強される。このため、試料
中のルシフェラーゼが高感度に検出される。本発明にお
いてルシフェラーゼ発光は、市販のルミノメーター、シ
ンチレーションカウンター、光度計、フォトエマルジョ
ンフィルム等を利用して測定することができる。ルシフ
ェラーゼが修飾ルシフェラーゼ、特に試料中の被検物質
と結合可能なものである場合は、上記方法により生じた
ルシフェラーゼ発光を測定することにより試料中の被検
物質を高感度に測定することができる。そのような修飾
ルシフェラーゼとしては、ビオチン、抗体、ハプテン、
酵素、核酸または補酵素等とルシフェラーゼが結合した
ものが挙げられる。ビオチン等とルシフェラーゼの結合
は、直接的であってもよく、また適当な化合物を介して
間接的に結合していてもよい。ルシフェラーゼと他のタ
ンパク質を結合する場合は遺伝子工学的手法により融合
タンパク質とすることもできる。
【００２４】ルシフェラーゼがビオチン化ルシフェラー
ゼである場合、本発明の検出法は以下のように実施でき
る。まず、抗原等の被検物質をイムノプレート等に固定
化した抗体に結合させる。さらに抗原に対するビオチン
化抗体を結合させる。これにビオチン化ルシフェラーゼ
をアビジンまたはストレプトビジンを介して結合させ
る。ビオチン化ルシフェラーゼはアビジンまたはストレ
プトアビジンを介してビオチン化抗体と複合体を形成す
ることができる。ビオチン化ルシフェラーゼを発光によ
り検出すると、ビオチン化ルシフェラーゼと複合体を形
成している測定する被検物質を検出できる。この方法に
より、試料中の被検物質、例えば、黄色ブドウ球菌の産
生するプロテインAが高感度に測定できる。ルシフェラ
ーゼと結合している物質が、抗体である場合は抗原が、
ハプテンである場合は抗体が高感度に測定できる。ま
た、ルシフェラーゼと結合している物質が、核酸である
場合はそれにハイブリダイズ可能な核酸が、補酵素であ
る場合はそれに結合可能な酵素が高感度に測定できる。
ゼである場合、本発明の検出法は以下のように実施でき
る。まず、抗原等の被検物質をイムノプレート等に固定
化した抗体に結合させる。さらに抗原に対するビオチン
化抗体を結合させる。これにビオチン化ルシフェラーゼ
をアビジンまたはストレプトビジンを介して結合させ
る。ビオチン化ルシフェラーゼはアビジンまたはストレ
プトアビジンを介してビオチン化抗体と複合体を形成す
ることができる。ビオチン化ルシフェラーゼを発光によ
り検出すると、ビオチン化ルシフェラーゼと複合体を形
成している測定する被検物質を検出できる。この方法に
より、試料中の被検物質、例えば、黄色ブドウ球菌の産
生するプロテインAが高感度に測定できる。ルシフェラ
ーゼと結合している物質が、抗体である場合は抗原が、
ハプテンである場合は抗体が高感度に測定できる。ま
た、ルシフェラーゼと結合している物質が、核酸である
場合はそれにハイブリダイズ可能な核酸が、補酵素であ
る場合はそれに結合可能な酵素が高感度に測定できる。
【００２５】〔試料中のルシフェリンの検出法〕別の態
様では、本発明は試料中のルシフェリンの検出法であっ
て、CoA,ピロリン酸またはピリドキサールリン酸もしく
はこれらの誘導体から選ばれる一種以上、ルシフェラー
ゼ、ATP、D-システイン、2価金属イオンおよびルシフェ
リン再生酵素を試料に添加し、生じる発光を測定するこ
とを特徴とする。試料中にルシフェリンが存在する場
合、上記の試薬を添加することによりルシフェラーゼ発
光が生じ、さらにCoA,ピロリン酸またはピリドキサール
リン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上と
ルシフェリン再生酵素、D-システインの作用により発光
が増強される。このため、試料中のルシフェリンが高感
度に検出される。ルシフェリンが、ルシフェリン誘導
体、特に試料中の被検物質の作用によりルシフェリンを
遊離するような物質から生成したものである場合は、試
料中の被検物質を高感度に測定することができる。その
ようなルシフェリン誘導体としては、例えばルシフェリ
ン-O-ガラクトシドがあげられる（特開平11-332593）。
ルシフェリン-O-ガラクトシドは、βガラクトシダーゼ
によりルシフェリンに変換される。このため、βガラク
トシダーゼ活性をもつ大腸菌群が試料中に存在すると、
ルシフェリン-O-ガラクトシドから遊離したルシフェリ
ンをルシフェラーゼ発光で検出できる。このため、本発
明の方法は、試料中の大腸菌群の高感度な検出法として
使用できる。また、本発明の方法は、試料中のオキシル
シフェリンの検出方法としても有用である。この場合、
オキシルシフェリンを含む試料に、ルシフェリン再生酵
素、D-システインを作用させホタルルシフェリンに変換
させる。変換されたホタルルシフェリンをルシフェラー
ゼ発光で検出する。すなわち、発光量を測定することで
試料中のオキシルシフェリンを検出することができる。
この発光反応系にCoA,ピロリン酸またはピリドキサール
リン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上を
添加することにより発光が増強される。
様では、本発明は試料中のルシフェリンの検出法であっ
て、CoA,ピロリン酸またはピリドキサールリン酸もしく
はこれらの誘導体から選ばれる一種以上、ルシフェラー
ゼ、ATP、D-システイン、2価金属イオンおよびルシフェ
リン再生酵素を試料に添加し、生じる発光を測定するこ
とを特徴とする。試料中にルシフェリンが存在する場
合、上記の試薬を添加することによりルシフェラーゼ発
光が生じ、さらにCoA,ピロリン酸またはピリドキサール
リン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上と
ルシフェリン再生酵素、D-システインの作用により発光
が増強される。このため、試料中のルシフェリンが高感
度に検出される。ルシフェリンが、ルシフェリン誘導
体、特に試料中の被検物質の作用によりルシフェリンを
遊離するような物質から生成したものである場合は、試
料中の被検物質を高感度に測定することができる。その
ようなルシフェリン誘導体としては、例えばルシフェリ
ン-O-ガラクトシドがあげられる（特開平11-332593）。
ルシフェリン-O-ガラクトシドは、βガラクトシダーゼ
によりルシフェリンに変換される。このため、βガラク
トシダーゼ活性をもつ大腸菌群が試料中に存在すると、
ルシフェリン-O-ガラクトシドから遊離したルシフェリ
ンをルシフェラーゼ発光で検出できる。このため、本発
明の方法は、試料中の大腸菌群の高感度な検出法として
使用できる。また、本発明の方法は、試料中のオキシル
シフェリンの検出方法としても有用である。この場合、
オキシルシフェリンを含む試料に、ルシフェリン再生酵
素、D-システインを作用させホタルルシフェリンに変換
させる。変換されたホタルルシフェリンをルシフェラー
ゼ発光で検出する。すなわち、発光量を測定することで
試料中のオキシルシフェリンを検出することができる。
この発光反応系にCoA,ピロリン酸またはピリドキサール
リン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上を
添加することにより発光が増強される。
【００２６】〔試薬キット〕別の態様では、本発明は以
下の（１）〜（３）記載の成分を含む試薬キットであ
る。 （１）CoA,ピロリン酸またはピリドキサールリン酸もし
くはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、（２）D-シ
ステイン、（３）ルシフェリン再生酵素 本発明の試薬キットは、ルシフェラーゼ発光に関与する
他の成分と組み合わせて、発光を増強するために使用す
ることができる。該試薬キットが試料中のルシフェラー
ゼ活性を検出するために使用される場合、ルシフェラー
ゼ発光に関与する他の成分とは、好ましくはATP、ホタ
ルルシフェリン、２価金属イオンである。また、該試薬
キットが試料中のルシフェリンを検出するために使用さ
れる場合、ルシフェラーゼ発光に関与する他の成分と
は、好ましくはATP、ルシフェラーゼ、２価金属イオン
である。さらに、該試薬キットが玩具、遊具、照明、演
出装置あるいは結婚式等のイベント用品として発光を楽
しむために使用される場合は、ルシフェラーゼ発光に関
与する成分とは、好ましくはATP、ルシフェラーゼ、ホ
タルルシフェリン、２価金属イオンである。
下の（１）〜（３）記載の成分を含む試薬キットであ
る。 （１）CoA,ピロリン酸またはピリドキサールリン酸もし
くはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、（２）D-シ
ステイン、（３）ルシフェリン再生酵素 本発明の試薬キットは、ルシフェラーゼ発光に関与する
他の成分と組み合わせて、発光を増強するために使用す
ることができる。該試薬キットが試料中のルシフェラー
ゼ活性を検出するために使用される場合、ルシフェラー
ゼ発光に関与する他の成分とは、好ましくはATP、ホタ
ルルシフェリン、２価金属イオンである。また、該試薬
キットが試料中のルシフェリンを検出するために使用さ
れる場合、ルシフェラーゼ発光に関与する他の成分と
は、好ましくはATP、ルシフェラーゼ、２価金属イオン
である。さらに、該試薬キットが玩具、遊具、照明、演
出装置あるいは結婚式等のイベント用品として発光を楽
しむために使用される場合は、ルシフェラーゼ発光に関
与する成分とは、好ましくはATP、ルシフェラーゼ、ホ
タルルシフェリン、２価金属イオンである。
【００２７】
【実施例】〔実施例１〕ルシフェリン再生酵素の精製 アメリカホタル由来のルシフェリン再生酵素を組換え体
E.coliJM109(ｐLRE)（FERM BP-6908）より精製した。す
なわち、該組換体を２LのTY培地で37℃一昼夜培養し、
集菌後、リゾチームにより溶菌させた。溶菌液の遠心上
清を30%〜65％飽和硫安分画し、得られた硫安沈殿物は
少量のバッファーA（50 ｍMトリス（pH7）、100mM NaC
l、１mM DTT、１mM EDTA、5% グリセロール）に溶解さ
せ、ゲル濾過カラム（UltrogelAcA34、径2.5cm×65cm、
溶離液は上記バッファーA）で分画した。活性画分はセ
ントリプレップ10（アミコン社製）で濃縮し、Qセファ
ロースFFカラムにかけた。溶出はバッファーB（10 ｍM
トリス（pH8）、１mM DTT、１mM EDTA、5% グリセロー
ル）中１〜200ｍM NaCl直線濃度勾配で行った。活性画
分はSDS-PAGEで解析したところ、シングルバンドであっ
たため、これらをセントリプレップ10で濃縮し、ルシフ
ェリン再生酵素標品（0.93mg/ml）とした。
E.coliJM109(ｐLRE)（FERM BP-6908）より精製した。す
なわち、該組換体を２LのTY培地で37℃一昼夜培養し、
集菌後、リゾチームにより溶菌させた。溶菌液の遠心上
清を30%〜65％飽和硫安分画し、得られた硫安沈殿物は
少量のバッファーA（50 ｍMトリス（pH7）、100mM NaC
l、１mM DTT、１mM EDTA、5% グリセロール）に溶解さ
せ、ゲル濾過カラム（UltrogelAcA34、径2.5cm×65cm、
溶離液は上記バッファーA）で分画した。活性画分はセ
ントリプレップ10（アミコン社製）で濃縮し、Qセファ
ロースFFカラムにかけた。溶出はバッファーB（10 ｍM
トリス（pH8）、１mM DTT、１mM EDTA、5% グリセロー
ル）中１〜200ｍM NaCl直線濃度勾配で行った。活性画
分はSDS-PAGEで解析したところ、シングルバンドであっ
たため、これらをセントリプレップ10で濃縮し、ルシフ
ェリン再生酵素標品（0.93mg/ml）とした。
【００２８】〔実施例２〕CoA及びピロリン酸の添加効
果 以下の試薬を調製した。 試薬１；10mM D-システイン、５mM 硫酸マグネシウム、
ホタルルシフェラーゼ（キッコーマン製）1μg/ml、50m
Mグリシルグリシン（pH7.8） 試薬２；0.5mMルシフェリン-10mM ATP-5mM 硫酸マグネ
シウム（pH7.8） 試薬３として 組成Ａ；50mMグリシルグリシン（pH7.8） 組成Ｂ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg 組成Ｃ；5mM CoA 組成Ｄ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mM CoA 組成Ｅ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mMデホスホCo
A 組成Ｆ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mMアセチルCo
A 組成Ｇ；5mMピロリン酸 組成Ｈ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、0.5ｍMピロリ
ン酸 組成Ｉ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mMピロリン酸 組成Ｊ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mMピロリン酸
カリウム 組成Ｋ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mMピロリン酸
ナトリウム 次いで、80μlの試薬1と20μlの試薬３を混合し、100μ
lの試薬２を添加することで発光をスタートさせ、アロ
カ社製ルミノメーターで発光を200秒間モニターした。
試薬3が組成Ａであるときの発光量を1とした場合の結果
を表１に示す。
果 以下の試薬を調製した。 試薬１；10mM D-システイン、５mM 硫酸マグネシウム、
ホタルルシフェラーゼ（キッコーマン製）1μg/ml、50m
Mグリシルグリシン（pH7.8） 試薬２；0.5mMルシフェリン-10mM ATP-5mM 硫酸マグネ
シウム（pH7.8） 試薬３として 組成Ａ；50mMグリシルグリシン（pH7.8） 組成Ｂ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg 組成Ｃ；5mM CoA 組成Ｄ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mM CoA 組成Ｅ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mMデホスホCo
A 組成Ｆ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mMアセチルCo
A 組成Ｇ；5mMピロリン酸 組成Ｈ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、0.5ｍMピロリ
ン酸 組成Ｉ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mMピロリン酸 組成Ｊ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mMピロリン酸
カリウム 組成Ｋ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mMピロリン酸
ナトリウム 次いで、80μlの試薬1と20μlの試薬３を混合し、100μ
lの試薬２を添加することで発光をスタートさせ、アロ
カ社製ルミノメーターで発光を200秒間モニターした。
試薬3が組成Ａであるときの発光量を1とした場合の結果
を表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】ルシフェリン再生酵素と、CoAまたはピロ
リン酸あるいはこれらの誘導体を組み合わせてルシフェ
リン-ルシフェラーゼ反応に添加することでより、発光
量が増加し、より高感度にルシフェラーゼ活性を検出で
きるようになった。
リン酸あるいはこれらの誘導体を組み合わせてルシフェ
リン-ルシフェラーゼ反応に添加することでより、発光
量が増加し、より高感度にルシフェラーゼ活性を検出で
きるようになった。
【００３１】〔実施例３〕ピリドキサールリン酸の添加
効果 以下の試薬を調製した。 試薬１；10μMオキシルシフェリン、50mMグリシルグリ
シン（pH7.8） 試薬２として 組成Ａ；50ｍMグリシルグリシン（pH7.8） 組成Ｂ；ルシフェリン再生酵素9.3μg 組成Ｃ；10ｍMピリドキサールリン酸 組成Ｄ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、10ｍMピリドキ
サールリン酸 試薬３；10mM D-システイン 試薬４；ホタルルシフェラーゼ（キッコーマン社製）
0.5mg/ml、10mM ATP、5mM硫酸マグネシウム（pH7.8）
効果 以下の試薬を調製した。 試薬１；10μMオキシルシフェリン、50mMグリシルグリ
シン（pH7.8） 試薬２として 組成Ａ；50ｍMグリシルグリシン（pH7.8） 組成Ｂ；ルシフェリン再生酵素9.3μg 組成Ｃ；10ｍMピリドキサールリン酸 組成Ｄ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、10ｍMピリドキ
サールリン酸 試薬３；10mM D-システイン 試薬４；ホタルルシフェラーゼ（キッコーマン社製）
0.5mg/ml、10mM ATP、5mM硫酸マグネシウム（pH7.8）
【００３２】次いで、50μlの試薬１と50μlの試薬２を
混合し、37℃、30分インキュベートした。この反応液10
μlに、100μlの試薬３を添加し、さらに５分後100μl
の試薬４を添加し、アロカ社製ルミノメーターで発光量
を5秒間測定し、再生されたルシフェリン量を比較し
た。試薬２の組成Ｃであるときの発光量を１とした場合
の結果を表２に示す。
混合し、37℃、30分インキュベートした。この反応液10
μlに、100μlの試薬３を添加し、さらに５分後100μl
の試薬４を添加し、アロカ社製ルミノメーターで発光量
を5秒間測定し、再生されたルシフェリン量を比較し
た。試薬２の組成Ｃであるときの発光量を１とした場合
の結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】ピリドキサールリン酸が存在するとオキシ
ルシフェリンが効率よくルシフェリンに再生された。ま
た、ピリドキサールリン酸、ルシフェリン再生酵素が共
存すると、さらに効率よくルシフェリンが再生された。
ピリドキサールリン酸とルシフェリン再生酵素によりル
シフェリン再生が促進されることが示された。本発明の
方法により、ルシフェラーゼ発光を増強することが可能
となる。
ルシフェリンが効率よくルシフェリンに再生された。ま
た、ピリドキサールリン酸、ルシフェリン再生酵素が共
存すると、さらに効率よくルシフェリンが再生された。
ピリドキサールリン酸とルシフェリン再生酵素によりル
シフェリン再生が促進されることが示された。本発明の
方法により、ルシフェラーゼ発光を増強することが可能
となる。
【００３５】〔実施例４〕組み合わせて添加した場合の
効果 CoA、ピロリン酸、ピリドキサールリン酸、ルシフェリ
ン再生酵素を組み合わせてルシフェラーゼ発光測定に添
加した。まず、以下の試薬を調製した。 試薬１；10mM D-システイン、５mM 硫酸マグネシウム、
ホタルルシフェラーゼ（キッコーマン製）1μg/ml、50m
Mグリシルグリシン（pH7.8） 試薬２；0.5mMルシフェリン-10mM ATP-5mM 硫酸マグネ
シウム（pH7.8） 試薬３として 組成Ａ；50mMグリシルグリシン（pH7.8） 組成Ｂ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mM CoA、5ｍM
ピリドキサールリン酸 組成Ｃ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、0.5ｍMピロリン
酸、0.5ｍMピリドキサールリン酸 組成Ｄ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、0.5ｍMピロリン
酸、5ｍMピリドキサールリン酸 組成Ｅ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、5ｍMピロリン
酸、0.5ｍMピリドキサールリン酸 組成Ｆ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、5ｍMピロリン
酸、5ｍMピリドキサールリン酸 組成Ｇ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、0.5ｍM CoA、0.
5ｍM ピロリン酸 組成Ｈ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5ｍMピリドキ
サールリン酸 次いで、80μlの試薬1と20μlの試薬３を混合し、100μ
lの試薬２を添加することで発光をスタートさせ、アロ
カ社製ルミノメーターで発光を100秒間モニターした。
試薬3が組成Ａであるときの発光量を1とした場合の結果
を表３に示す。
効果 CoA、ピロリン酸、ピリドキサールリン酸、ルシフェリ
ン再生酵素を組み合わせてルシフェラーゼ発光測定に添
加した。まず、以下の試薬を調製した。 試薬１；10mM D-システイン、５mM 硫酸マグネシウム、
ホタルルシフェラーゼ（キッコーマン製）1μg/ml、50m
Mグリシルグリシン（pH7.8） 試薬２；0.5mMルシフェリン-10mM ATP-5mM 硫酸マグネ
シウム（pH7.8） 試薬３として 組成Ａ；50mMグリシルグリシン（pH7.8） 組成Ｂ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mM CoA、5ｍM
ピリドキサールリン酸 組成Ｃ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、0.5ｍMピロリン
酸、0.5ｍMピリドキサールリン酸 組成Ｄ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、0.5ｍMピロリン
酸、5ｍMピリドキサールリン酸 組成Ｅ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、5ｍMピロリン
酸、0.5ｍMピリドキサールリン酸 組成Ｆ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、5ｍMピロリン
酸、5ｍMピリドキサールリン酸 組成Ｇ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、0.5ｍM CoA、0.
5ｍM ピロリン酸 組成Ｈ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5ｍMピリドキ
サールリン酸 次いで、80μlの試薬1と20μlの試薬３を混合し、100μ
lの試薬２を添加することで発光をスタートさせ、アロ
カ社製ルミノメーターで発光を100秒間モニターした。
試薬3が組成Ａであるときの発光量を1とした場合の結果
を表３に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】CoA、ピロリン酸、ピリドキサールリン
酸、ルシフェリン再生酵素が同一液体内で共に働きうる
ことが示された。
酸、ルシフェリン再生酵素が同一液体内で共に働きうる
ことが示された。
【００３８】〔実施例５〕ルシフェラーゼがビオチン化
ルシフェラーゼである場合 以下の試薬を調製した。 試薬１；0.5mM ルシフェリン、0.8mM ATP、10mM 酢酸マ
グネシウム、50mM トリシン、6mM D-システイン、4mM
チオグリセロール、1mM EDTA、0.1mM ピロリン酸カリウ
ム、0.2% BSA、0.5mM CoA、pH 7.8 試薬２として 組成Ａ；50ｍＭグリシルグリシン（pH7.8） 組成Ｂ；ルシフェリン再生酵素（0.93mg/ml） 試薬３；23 ng/mlビオチン化ルシフェラーゼ（キッコー
マン製） 次いで、110μlの試薬１に３μlの試薬２を添加し、試
薬３を５μl添加後、ルミテスターK210（キッコーマン
製）で発光量を測定した。添加直後の発光量はほぼ同じ
であるが、15分後の発光量を比較すると、組成Ｂは組成
Ａの1.3倍であり、発光持続効果が認められた。ビオチ
ン化ルシフェラーゼは、酵素免疫測定法、DNAプローブ
法、免疫染色法、in situハイブリダイゼーション法等
で利用されていることから、本発明がこれらの測定系に
応用可能であることが示された。
ルシフェラーゼである場合 以下の試薬を調製した。 試薬１；0.5mM ルシフェリン、0.8mM ATP、10mM 酢酸マ
グネシウム、50mM トリシン、6mM D-システイン、4mM
チオグリセロール、1mM EDTA、0.1mM ピロリン酸カリウ
ム、0.2% BSA、0.5mM CoA、pH 7.8 試薬２として 組成Ａ；50ｍＭグリシルグリシン（pH7.8） 組成Ｂ；ルシフェリン再生酵素（0.93mg/ml） 試薬３；23 ng/mlビオチン化ルシフェラーゼ（キッコー
マン製） 次いで、110μlの試薬１に３μlの試薬２を添加し、試
薬３を５μl添加後、ルミテスターK210（キッコーマン
製）で発光量を測定した。添加直後の発光量はほぼ同じ
であるが、15分後の発光量を比較すると、組成Ｂは組成
Ａの1.3倍であり、発光持続効果が認められた。ビオチ
ン化ルシフェラーゼは、酵素免疫測定法、DNAプローブ
法、免疫染色法、in situハイブリダイゼーション法等
で利用されていることから、本発明がこれらの測定系に
応用可能であることが示された。
【００３９】〔実施例６〕ルシフェリン誘導体がルシフ
ェリンガラクトシドである場合 まず、以下の試薬を調製した。 試薬１； 5μMルシフェリン-O-ガラクトシド（キッコー
マン製）、10ｍMトリスバッファー（pH7.3）を含む溶液
に、βガラクトシダーゼ（シグマ製）１ユニットを添加
し、ルシフェリンを遊離させ、ルシフェリン溶液とし
た。 試薬２；10mM D-システイン、５mM 硫酸マグネシウム、
ルシフェラーゼ（キッコーマン製）1×10-1 mg/ml、50m
Mグリシルグリシン（pH7.8） 試薬３；10mM ATP-5mM 硫酸マグネシウム（pH7.8） 試薬４として 組成Ａ；50mMグリシルグリシン（pH7.8） 組成Ｂ；ルシフェリン再生酵素9.3μg 組成Ｃ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mM CoA 組成Ｄ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、5ｍMピロリン酸 組成Ｅ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、5ｍM CoA、5ｍM
ピリドキサールリン酸 組成Ｆ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、5ｍMピロリン
酸、5ｍMピリドキサールリン酸 次いで、10μlの試薬１、80μlの試薬２および20μlの
試薬４を混合し、100μlの試薬３を添加することで発光
をスタートさせ、アロカ社製ルミノメーターで発光を15
0秒間モニターした。試薬3が組成Ａであるときの発光量
を1とした場合の結果を表４に示す。
ェリンガラクトシドである場合 まず、以下の試薬を調製した。 試薬１； 5μMルシフェリン-O-ガラクトシド（キッコー
マン製）、10ｍMトリスバッファー（pH7.3）を含む溶液
に、βガラクトシダーゼ（シグマ製）１ユニットを添加
し、ルシフェリンを遊離させ、ルシフェリン溶液とし
た。 試薬２；10mM D-システイン、５mM 硫酸マグネシウム、
ルシフェラーゼ（キッコーマン製）1×10-1 mg/ml、50m
Mグリシルグリシン（pH7.8） 試薬３；10mM ATP-5mM 硫酸マグネシウム（pH7.8） 試薬４として 組成Ａ；50mMグリシルグリシン（pH7.8） 組成Ｂ；ルシフェリン再生酵素9.3μg 組成Ｃ；ルシフェリン再生酵素9.3 μg、5mM CoA 組成Ｄ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、5ｍMピロリン酸 組成Ｅ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、5ｍM CoA、5ｍM
ピリドキサールリン酸 組成Ｆ；ルシフェリン再生酵素9.3μg、5ｍMピロリン
酸、5ｍMピリドキサールリン酸 次いで、10μlの試薬１、80μlの試薬２および20μlの
試薬４を混合し、100μlの試薬３を添加することで発光
をスタートさせ、アロカ社製ルミノメーターで発光を15
0秒間モニターした。試薬3が組成Ａであるときの発光量
を1とした場合の結果を表４に示す。
【００４０】
【表４】
【００４１】ルシフェリンガラクトシドは、βガラクト
シダーゼ活性をもつ大腸菌群の検出法に利用されている
ことから、本発明がその測定系に応用可能であることが
示された。
シダーゼ活性をもつ大腸菌群の検出法に利用されている
ことから、本発明がその測定系に応用可能であることが
示された。
【００４２】
【発明の効果】本発明により、ルシフェラーゼ発光の増
強法およびそのための試薬キットが提供された。本発明
は、臨床検査、衛生検査等における発光測定法、玩具、
遊具、照明、演出装置あるいは結婚式等のイベント等に
利用できることから、産業上有用である。
強法およびそのための試薬キットが提供された。本発明
は、臨床検査、衛生検査等における発光測定法、玩具、
遊具、照明、演出装置あるいは結婚式等のイベント等に
利用できることから、産業上有用である。
【図１】ATP、ホタルルシフェリン、ルシフェラーゼ、D
-システイン、2価金属イオンおよびルシフェリン再生酵
素が関与する発光反応を示す模式図。
-システイン、2価金属イオンおよびルシフェリン再生酵
素が関与する発光反応を示す模式図。
【図２】ATP、ホタルルシフェリン、ルシフェラーゼ、D
-システイン、2価金属イオンおよびルシフェリン再生酵
素が関与する発光反応系に、CoA,ピロリン酸またはピリ
ドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる
一種以上が添加された場合を示す模式図。
-システイン、2価金属イオンおよびルシフェリン再生酵
素が関与する発光反応系に、CoA,ピロリン酸またはピリ
ドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる
一種以上が添加された場合を示す模式図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA28 BA11 BB60 DA20 FB01 FB07 FB13 GC15 2G054 AB03 BA04 CE02 EA02 FB07 GA03 GB04 4B063 QA01 QQ22 QR02 QR41 QR51 QS02 QS36 QX02
Claims (9)
- 【請求項１】ATP、ホタルルシフェリン、ルシフェラー
ゼ、D-システイン、2価金属イオンおよびルシフェリン
再生酵素が関与する発光反応系に、CoA,ピロリン酸また
はピリドキサールリン酸もしくはこれらの誘導体から選
ばれる一種以上を添加することを特徴とする、発光反応
の増強方法。 - 【請求項２】ATP,ホタルルシフェリン、D-システイン、
2価金属イオンおよびルシフェリン再生酵素が関与する
発光反応に基づく発光測定法において、発光反応系に、
CoA,ピロリン酸またはピリドキサールリン酸もしくはこ
れらの誘導体から選ばれる一種以上を添加することを特
徴とする、発光測定法。 - 【請求項３】CoA,ピロリン酸またはピリドキサールリン
酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、ATP,
ホタルルシフェリン、D-システイン、2価金属イオンお
よびルシフェリン再生酵素を試料に添加し、生じる発光
を測定することを特徴とする、試料中のルシフェラーゼ
活性の検出法。 - 【請求項４】ルシフェラーゼとして、試料中の被検物質
と結合可能である修飾ルシフェラーゼを使用することを
特徴とする、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】修飾ルシフェラーゼが、ビオチン、抗体、
ハプテン、酵素、核酸または補酵素とルシフェラーゼが
結合したものである、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】CoA,ピロリン酸またはピリドキサールリン
酸もしくはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、ルシ
フェラーゼ、ATP、D-システイン、2価金属イオンおよび
ルシフェリン再生酵素を試料に添加し、生じる発光を測
定することを特徴とする、試料中のホタルルシフェリン
の検出法。 - 【請求項７】ホタルルシフェリンがルシフェリン誘導体
から遊離したルシフェリンである、請求項６記載の方
法。 - 【請求項８】ルシフェリン誘導体がルシフェリンガラク
トシドまたはオキシルシフェリンである請求項７記載の
方法 - 【請求項９】以下の（１）〜（３）記載の成分を含む試
薬キット （１）CoA,ピロリン酸またはピリドキサールリン酸もし
くはこれらの誘導体から選ばれる一種以上、（２）D-シ
ステイン、（３）ルシフェリン再生酵素
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001315397A JP3983023B2 (ja) | 2000-10-20 | 2001-10-12 | ルシフェラーゼ発光反応の増強法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000-320921 | 2000-10-20 | ||
| JP2000320921 | 2000-10-20 | ||
| JP2001315397A JP3983023B2 (ja) | 2000-10-20 | 2001-10-12 | ルシフェラーゼ発光反応の増強法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002191396A true JP2002191396A (ja) | 2002-07-09 |
| JP3983023B2 JP3983023B2 (ja) | 2007-09-26 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007116687A1 (ja) * | 2006-03-27 | 2007-10-18 | The University Of Electro-Communications | 複素環化合物及び発光方法 |
| JP2008113620A (ja) * | 2006-11-07 | 2008-05-22 | Toyobo Co Ltd | ルシフェラーゼの発光方法 |
| JP2010509924A (ja) * | 2006-11-20 | 2010-04-02 | バイエル・シェーリング・ファルマ・アクチェンゲゼルシャフト | 生物発光検出によるピロリン酸塩の検出方法 |
| JP2010075132A (ja) * | 2008-09-29 | 2010-04-08 | Chisso Corp | システインが導入された新規ガウシアルシフェラーゼ変異体 |
| WO2017002892A1 (ja) * | 2015-06-30 | 2017-01-05 | キッコーマンバイオケミファ株式会社 | Ａｔｐ測定におけるａｔｐ分解活性の低減方法 |
-
2001
- 2001-10-12 JP JP2001315397A patent/JP3983023B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007116687A1 (ja) * | 2006-03-27 | 2007-10-18 | The University Of Electro-Communications | 複素環化合物及び発光方法 |
| JP5194258B2 (ja) * | 2006-03-27 | 2013-05-08 | 国立大学法人電気通信大学 | 複素環化合物及び発光方法 |
| JP2008113620A (ja) * | 2006-11-07 | 2008-05-22 | Toyobo Co Ltd | ルシフェラーゼの発光方法 |
| JP2010509924A (ja) * | 2006-11-20 | 2010-04-02 | バイエル・シェーリング・ファルマ・アクチェンゲゼルシャフト | 生物発光検出によるピロリン酸塩の検出方法 |
| JP2014054252A (ja) * | 2006-11-20 | 2014-03-27 | Bayer Intellectual Property Gmbh | 生物発光検出によるピロリン酸塩の検出方法 |
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| WO2017002892A1 (ja) * | 2015-06-30 | 2017-01-05 | キッコーマンバイオケミファ株式会社 | Ａｔｐ測定におけるａｔｐ分解活性の低減方法 |
| JPWO2017002892A1 (ja) * | 2015-06-30 | 2018-04-19 | キッコーマンバイオケミファ株式会社 | Ａｔｐ測定におけるａｔｐ分解活性の低減方法 |
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