JP2002189027A - Immunity detection method - Google Patents

Immunity detection method

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JP2002189027A
JP2002189027A JP2000389401A JP2000389401A JP2002189027A JP 2002189027 A JP2002189027 A JP 2002189027A JP 2000389401 A JP2000389401 A JP 2000389401A JP 2000389401 A JP2000389401 A JP 2000389401A JP 2002189027 A JP2002189027 A JP 2002189027A
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antigen
antibody
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JP2000389401A
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Japanese (ja)
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Naoya Omura
直也 大村
Lucky Steve
ラッキー スティーヴ
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SAPIDYNE INSTR Inc
SAPIDYNE INSTRUMENT Inc
Central Research Institute of Electric Power Industry
Original Assignee
SAPIDYNE INSTR Inc
SAPIDYNE INSTRUMENT Inc
Central Research Institute of Electric Power Industry
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Publication date
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  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To expand the kind of a substance to be detected in an immunity detection system, using an antigen-antibody reaction and to expand its measuring range (sensitivity). SOLUTION: In the method, the existence of an antigen in a sample is detected; two or more kinds of antibodies whose affinity with reference to the antigen is different are used, under the condition that also the concentration of the antibodies be sufficiently low, as compared with an equilibrium dissociation constant to the antigen and that the kind of the antibody be controlled by its own antigen-bonding affinity; the plurality of kinds of antibodies in known amounts are introduced simultaneously to the sample, so as to be used for the antigen-antibody reaction with an antigen whose existence is known; a reaction mixed solution of the plurality of kinds of antibodies and the sample is brought into contact with an immobilized antigen in known amount; the amount of an antigen bonded to the immobilized antigen is detected by measuring the fluorescence intensity of labeling fluorescence bonded to the plurality of kinds of antibodies; and the existence of the antigen in the sample is detected based on the result.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は改良された免疫検出
法に関するものであり、特に、女性ホルモン、あるいは
PCBやダイオキシンなどの外因性内分泌撹乱物質を高感
度で、かつ簡便に検出する方法に関するものである。The present invention relates to an improved immunodetection method, and particularly to a female hormone or
The present invention relates to a method for easily and easily detecting exogenous endocrine disrupting substances such as PCB and dioxin.

【０００２】[0002]

【従来の技術】近年、環境中に極低濃度に存在する化学
物質や人畜由来の天然女性ホルモンが野生生物のメス化
を引き起こす可能性が指摘されている(Weise. T.E. & K
elce,W.R. An introduction to environmental oestrog
ens. Chemistry and Industry24, 648-653 (1997))。こ
のうち、近年社会的な問題となっている外因性内分泌撹
乱物質、いわゆる環境ホルモンは、体内の天然ホルモン
の作用を撹乱することで生体に悪影響を及ぼすと考えら
れている。その撹乱作用は現在未だ十分には解明されて
いないが、以下に示すような、ある種の女性ホルモン作
用の撹乱メカニズムが提案されている。女性ホルモン作
用は通常生体内で女性ホルモンが対応するホルモン受容
体に結合することにより誘発される。ホルモンとその受
容体の結合体は二量体化し、さらにＤＮＡの特定の配列
に結合する。これによりホルモン作用に必要な遺伝子の
転写が始まり、結果として生理作用が起こる。ここで外
因性内分泌撹乱物質は、天然の女性ホルモンの代わりに
受容体に結合することによって、上記のホルモン作用を
撹乱する。2. Description of the Related Art In recent years, it has been pointed out that chemical substances present in extremely low concentrations in the environment and natural female hormones derived from humans and animals can cause the feminization of wildlife (Weise. TE & K).
elce, WR An introduction to environmental oestrog
ens. Chemistry and Industry 24, 648-653 (1997)). Of these, exogenous endocrine disruptors, so-called environmental hormones, which have recently become a social problem, are considered to adversely affect living organisms by disrupting the action of natural hormones in the body. Although its perturbing effect has not yet been fully elucidated, the following perturbation mechanism of female hormone action has been proposed. Estrogen action is usually triggered in vivo by the binding of female hormones to corresponding hormone receptors. The conjugate of the hormone and its receptor dimerizes and binds to specific sequences of DNA. This initiates the transcription of genes required for hormonal action, resulting in physiological effects. Here, the exogenous endocrine disrupting substance disrupts the above hormonal action by binding to a receptor instead of a natural female hormone.

【０００３】このような外因性内分泌撹乱物質ないしは
人畜由来の天然女性ホルモンの環境中への拡散を防止
し、かつ環境中から除去する必要があるが、そのために
はまずこのような物質を簡易かつ高感度に検出しなけれ
ばならない。しかしながら、ナノモルないしピコモル単
位という極めて希薄な濃度で環境中に存在するだけで、
生体への悪影響が危惧されている上記撹乱物質を検出す
る必要があるため、検出にはできるだけ感度の高い特殊
な方法を採用する必要があった。[0003] It is necessary to prevent such endogenous endocrine disrupting substances or natural female hormones derived from human and animal from diffusing into the environment and to remove them from the environment. Must be detected with high sensitivity. However, it only exists in the environment at extremely dilute concentrations of nanomolar or picomolar units,
Since it is necessary to detect the above-mentioned disturbing substance, which is feared to have an adverse effect on the living body, it is necessary to employ a special method having as high a sensitivity as possible for the detection.

【０００４】外因性内分泌撹乱物質を検出するための従
来の方法には、放射受容体検定法(ラジオレセプターア
ッセイ)〔Endocrine, 138(3);863-870(1997)〕、免疫検
定法(イムノアッセイ)〔"Reproductive Toxicology", d
el Mazo eds., Plenum Press, New York(1998)〕、蛍光
偏向解消法〔Environmental Health Respectives., 106
(9);551-557(1998)〕の他、組換え酵母を使用する方法
や受容体との複合体と遺伝子との結合を指標として放射
活性を用いて使用する方法等が知られている。Conventional methods for detecting exogenous endocrine disruptors include a radioreceptor assay (radio receptor assay) (Endocrine, 138 (3); 863-870 (1997)) and an immunoassay (immunoassay). ) ["Reproductive Toxicology", d
el Mazo eds., Plenum Press, New York (1998)), fluorescence depolarization method (Environmental Health Respectives., 106).
(9); 551-557 (1998)], a method using a recombinant yeast, a method using radioactivity with the binding between a complex with a receptor and a gene as an index, and the like are known. .

【０００５】しかしながら、これら従来の方法は、放射
性物質や組換え酵母を利用するため操作が煩雑であった
り、しかもいずれの方法も環境中の外因性内分泌撹乱物
質の検出のためには感度が十分ではなかった。[0005] However, these conventional methods use radioactive substances or recombinant yeasts, so that the operation is complicated, and both methods are not sufficiently sensitive for detecting exogenous endocrine disrupting substances in the environment. Was not.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】このような従来技術の
下に、本発明者は、先に、環境ホルモンの疑いのある化
学物質の多くが女性ホルモンに類似の作用を有すること
に着眼し、試験すべき試料中に上記抗ホルモン抗体を導
入して環境ホルモンと抗ホルモン抗体との抗原抗体反応
を生じさせ、その後この反応混合物を固定化女性ホルモ
ンに接触させて反応混合物中に存在する未反応の抗ホル
モン抗体を固定化女性ホルモンに結合させ、その結果を
当該抗ホルモン抗体に結合させた標識蛍光の蛍光強度の
差で検出することにより、被試試料中の環境ホルモンの
存在の有無が高感度で、かつ簡便に検出し得ることを鋭
意研究の結果見出した。SUMMARY OF THE INVENTION Under such prior art, the present inventor has first focused on the fact that many chemicals suspected of being environmental hormones have an effect similar to that of female hormones. The anti-hormone antibody is introduced into the sample to be tested to cause an antigen-antibody reaction between the environmental hormone and the anti-hormone antibody. The presence or absence of environmental hormones in the test sample is high by binding the anti-hormone antibody to the immobilized female hormone and detecting the result by the difference in the fluorescence intensity of the labeled fluorescence bound to the anti-hormone antibody. As a result of earnest study, they have found that they can be easily detected with high sensitivity.

【０００７】この方法は従来技術と比べるとその簡便性
および感度の点において十分に優れるものであったが、
被測定物質の種類とその測定範囲（感度）の面からは、
更なる改良が望まれるものであった。Although this method was sufficiently superior in its simplicity and sensitivity as compared with the prior art,
In terms of the type of substance to be measured and its measurement range (sensitivity),
Further improvement was desired.

【０００８】ところで、抗原抗体反応を利用したイムノ
アッセイは、臨床検査などの医薬分野で広く応用されて
いる。このアッセイの最大の利点は抗体の抗原結合性を
利用して抗原となる物質の測定が簡易に行える点にあ
る。一般に抗原である被測定物質の種類とその測定範囲
（感度）は抗体の持つ抗原結合親和性に規定され、抗体
制限イムノアッセイではこの結合親和性を十分に活用す
ることが重要である。[0008] Immunoassays utilizing antigen-antibody reactions are widely applied in the pharmaceutical field such as clinical examination. The greatest advantage of this assay is that a substance serving as an antigen can be easily measured by utilizing the antigen binding property of an antibody. In general, the type of a substance to be measured, which is an antigen, and its measurement range (sensitivity) are determined by the antigen-binding affinity of an antibody, and it is important to make full use of this binding affinity in an antibody-restricted immunoassay.

【０００９】多くのイムノアッセイでは単一の抗体を用
いて単一の物質を測定する系で検討されているが、幾つ
かの多重検出系が報告されている。例として、異なる２
種の抗原に対する抗体をマイクロキャピラリー内壁に固
相固定し、これに結合しうる抗原を測定する方法(Naran
g. U., Gauger. P. R., Kusterbeck. A. W. & Ligler.
F. S. Multianalyte detection using a capillary-bas
ed flow immunosensor. Anal Biochem, 255(1), 13-19
(1998))やビーズ固相に複数の抗体を固定した凝集法(O
h. S. et al. Use of a dual monoclonal solid phase
and a polyclonal detector to create an immunoassay
for the detection of human cardiactroponin I. Cli
n Biochem, 33(4), 255-262(2000)、Schray. K. J. & N
iedbala. R. S. Separation-free dual solid phase en
zyme immunoassay for macromolecules. Anal Chem, 60
(4), 353-356(1988))などが挙げられる。また、最近で
はチップにマルチスポットを行い、多数の検出を一挙に
行う方法などが検討されている(Ekins. R. P. & Chu,
F. Developing multianalyte assays. Trends Biotechn
ol, 12(3), 89-94(1994))。[0009] Although many immunoassays have been studied with systems that measure a single substance using a single antibody, several multiplex detection systems have been reported. For example, two different
A method for immobilizing an antibody against a species antigen on the inner wall of a microcapillary and measuring the amount of antigen that can bind thereto (Naran
g. U., Gauger. PR, Kusterbeck. AW & Ligler.
FS Multianalyte detection using a capillary-bas
ed flow immunosensor.Anal Biochem, 255 (1), 13-19
(1998)) and the agglutination method (O
h.S. et al. Use of a dual monoclonal solid phase
and a polyclonal detector to create an immunoassay
for the detection of human cardiactroponin I. Cli
n Biochem, 33 (4), 255-262 (2000), Schray. KJ & N
iedbala. RS Separation-free dual solid phase en
zyme immunoassay for macromolecules.Analy Chem, 60
(4), 353-356 (1988)). Recently, a method of performing multiple spots on a chip and performing a large number of detections at once has been studied (Ekins. RP & Chu,
F. Developing multianalyte assays. Trends Biotechn
ol, 12 (3), 89-94 (1994)).

【００１０】なお、これらは、いずれも、多重検出に用
いられる複数の抗体はお互い異なる抗原と結合するもの
である。[0010] In any of these, a plurality of antibodies used for multiplex detection bind to different antigens.

【００１１】したがって、本発明は、抗原抗体反応を利
用した免疫検定系において、検出される被測定物質の種
類とその測定範囲（感度）を拡大可能な方法を提供する
ことを課題とする。本発明はさらに、環境中に存在する
女性ホルモン、あるいはPCBやダイオキシンなどの外因
性内分泌撹乱物質を高感度で、かつ簡便に検出する方法
を提供することを課題とする。Accordingly, an object of the present invention is to provide a method capable of expanding the type of a substance to be detected and its measurement range (sensitivity) in an immunoassay system utilizing an antigen-antibody reaction. Another object of the present invention is to provide a method for easily and easily detecting a female hormone existing in the environment or an exogenous endocrine disrupting substance such as PCB or dioxin.

【００１２】[0012]

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意検討の結果、複数の異なる結合親和性
を持つ抗体を同時にアッセイに用いることができれば、
被測定物質の種類とその測定範囲は抗体の組み合わせに
より任意に設定できるのではないかとの点に着目した。
具体的には、同一の抗原に対して異なる結合親和性を持
つ抗体を併用してイムノアッセイの欠点である測定範囲
を拡大すること、異なる抗原に対する抗体を併用して多
数の抗原を同時に検出すること、あるいは両者を同時に
実現できると考えられる。さらに、本発明者は、鋭意検
討を進めた結果、このように複数の抗体の結合親和性を
組み合わせるには、抗原抗体反応が起こる反応系におい
て、いずれの抗体濃度も抗原への平衡解離定数に比べて
十分に低く、抗体の結合が自身の抗原結合親和性により
支配される条件でなければならないとの結論を得た。な
ぜなら、抗体が過剰に存在すると結合平衡状態は抗体濃
度に支配され、抗体の結合親和性が十分にアッセイに反
映されなくなるからである。また、このような結合親和
性支配の条件下であれば、検出下限を理論的に到達可能
な抗体の平衡解離定数に近づけられる利点もある。以上
のような知見の下に完成された本発明は、以下のような
特徴を有するものである。 （１） 試料中における抗原の存在を検出する方法であ
って、当該抗原に対し親和性の異なる２種ないしそれ以
上の種類の抗体を用い、いずれの抗体濃度も抗原への平
衡解離定数に比べて十分に低く、抗体の結合がそれら自
身の抗原結合親和性により支配される条件下で、既知量
のこれら複数種の抗体を、同時に前記試料に導入して存
在未知なる抗原と抗原抗体反応に供し、その後、これら
複数種の抗体と試料との反応混合液を、固定化された既
知量の抗原と接触させ、固定化抗原に結合した抗体量
を、これら複数種の抗体に結合させた標識蛍光の蛍光強
度を測定することで検出し、その結果より試料中の抗原
の存在を検知することを特徴とする抗原の検出方法。 （２） 前記抗原が、女性ホルモンであり、前記複数種
の抗体が当該女性ホルモンに対する抗ホルモン抗体であ
ることを特徴とする上記（１）に記載の検出方法。 （３） 前記抗原が、外因性内分泌撹乱物質であり、前
記複数種の抗体が女性ホルモンに対する抗ホルモン抗体
であることを特徴とする上記（１）に記載の検出方法。 （４） 前記複数種の抗体が蛍光標識抗体であり、固定
化抗原に結合した抗体量を、当該複数種の蛍光標識抗体
の標識蛍光の蛍光強度を測定することで検出することを
特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の検出
方法。 （５） 前記複数種の抗体を無標識一次抗体とし、固定
化抗原に結合した抗体量は、二次抗体として当該複数種
の一次抗体に特異的に結合する蛍光標識抗一次抗体抗体
を用い、固定化抗原に結合した一次抗体に特異的に結合
した該二次抗体の標識蛍光の蛍光強度を測定することで
検出することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれ
かに記載の検出方法。 （６） 前記抗原が、抗原自体とその抗原の誘導体とを
含むものであり、前記複数種の抗体として、抗原自体お
よびその抗原の誘導体に対してほぼ同様の親和性を示す
抗体と、異なる親和性を示す抗体とを組み合わせて用い
ることにより、抗原自体と抗原の誘導体とを区別して同
時に検出するものである上記（１）〜（５）のいずれか
に記載の検出方法。 （７） 試料中における複数の抗原の存在を検出する方
法であって、各抗原に対する抗体を組み合わせて用い、
いずれの抗体濃度もそれぞれの抗原への平衡解離定数に
比べて十分に低く、抗体の結合がそれら自身の抗原結合
親和性により支配される条件下で、既知量のこれら複数
の抗体を、同時に前記試料に導入して存在未知なる各抗
原と抗原抗体反応に供し、その後、これら複数種の抗体
と試料との反応混合液を、固定化された既知量の各抗原
と接触させ、固定化抗原に結合した抗体量を、これら複
数種の抗体に結合させた標識蛍光の蛍光強度を測定する
ことにより検出し、その結果より試料中の当該複数の抗
原の存在を検知することを特徴とする抗原の検出方法。 （８） 前記複数の抗原が、いずれも女性ホルモンであ
り、前記複数種の抗体が当該各女性ホルモンに対する抗
ホルモン抗体であることを特徴とする上記（７）に記載
の検出方法。 （９） 前記複数の抗原が、いずれも外因性内分泌撹乱
物質であり、前記複数種の抗体が各女性ホルモンに対す
る抗ホルモン抗体であることを特徴とする上記（７）に
記載の検出方法。 （１０） 前記複数種の抗体が蛍光標識抗体であり、固
定化抗原に結合した抗体量を、当該複数種の蛍光標識抗
体の標識蛍光の蛍光強度を測定することで検出すること
を特徴とする上記（７）〜（９）のいずれかに記載の検
出方法。 （１１） 前記複数種の抗体を無標識一次抗体とし、固
定化抗原に結合した抗体量は、二次抗体として当該複数
種の一次抗体に特異的に結合する蛍光標識抗一次抗体抗
体を用い、固定化抗原に結合した一次抗体に特異的に結
合した該二次抗体の標識蛍光の蛍光強度を測定すること
で検出することを特徴とする上記（７）〜（９）のいず
れかに記載の検出方法。 （１２） 試料中における複数の抗原の存在を検出する
方法であって、各抗原に対する抗体を組み合わせて用
い、いずれの抗体濃度もそれぞれの抗原への平衡解離定
数に比べて十分に低く、抗体の結合がそれら自身の抗原
結合親和性により支配される条件下で、既知量のこれら
抗体を、前記試料の各アリコートにそれぞれ単独で導入
して、存在未知なる各抗原と抗原抗体反応に供し、その
後、これらの各抗体を含む複数のアリコートを、固定化
された既知量の双方の抗原を有するカラム内に順次流
し、各アリコートの流下毎に固定化抗原に結合した抗体
量を、これら抗体に結合させた標識蛍光の蛍光強度の測
定によって検出し、各抗体に由来する蛍光強度によっ
て、試料中の各抗原の存在を検知することを特徴とする
抗原の検出方法を特徴とする抗原の検出方法。 （１３） 前記複数の抗原が、いずれも女性ホルモンで
あり、前記複数種の抗体が当該各女性ホルモンに対する
抗ホルモン抗体であることを特徴とする上記（１２）に
記載の検出方法。 （１４） 前記複数の抗原が、いずれも外因性内分泌撹
乱物質であり、前記複数種の抗体が各女性ホルモンに対
する抗ホルモン抗体であることを特徴とする上記（１
２）に記載の検出方法。 （１５） 前記複数種の抗体が蛍光標識抗体であり、固
定化抗原に結合した抗体量を、当該複数種の蛍光標識抗
体の標識蛍光の蛍光強度を測定することで検出すること
を特徴とす上記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の
検出方法。 （１６） 前記複数種の抗体を無標識一次抗体とし、固
定化抗原に結合した抗体量は、二次抗体として当該複数
種の一次抗体に特異的に結合する蛍光標識抗一次抗体抗
体を用い、固定化抗原に結合した一次抗体に特異的に結
合した該二次抗体の標識蛍光の蛍光強度を測定すること
で検出することを特徴とする上記（１２）〜（１５）の
いずれかに記載の検出方法。Means for Solving the Problems The present inventors have made intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, if a plurality of antibodies having different binding affinities can be used simultaneously in an assay,
We paid attention to the possibility that the type of the substance to be measured and the measurement range could be arbitrarily set depending on the combination of the antibodies.
Specifically, using antibodies with different binding affinities for the same antigen in combination to expand the measurement range, which is a drawback of immunoassay, and simultaneously detecting many antigens using antibodies to different antigens Or both can be realized at the same time. Furthermore, as a result of intensive studies, the present inventor has found that in order to combine the binding affinities of a plurality of antibodies in this manner, in a reaction system in which an antigen-antibody reaction occurs, the concentration of any antibody is reduced by the equilibrium dissociation constant to the antigen. In comparison, it was concluded that antibody binding had to be a condition governed by its own antigen binding affinity. This is because, if the antibody is present in excess, the binding equilibrium is governed by the antibody concentration, and the binding affinity of the antibody is not sufficiently reflected in the assay. In addition, under such conditions of binding affinity, there is an advantage that the lower limit of detection can be made closer to the equilibrium dissociation constant of an antibody that can theoretically be reached. The present invention completed based on the above knowledge has the following features. (1) A method for detecting the presence of an antigen in a sample, wherein two or more types of antibodies having different affinities for the antigen are used, and the concentration of each antibody is lower than the equilibrium dissociation constant for the antigen. Under conditions where antibody binding is dominated by their own antigen-binding affinities, known amounts of these multiple antibodies are simultaneously introduced into the sample to allow antigen-antibody reactions with unknown antigens. After that, the reaction mixture of the plural kinds of antibodies and the sample is brought into contact with a known amount of immobilized antigen, and the amount of antibody bound to the immobilized antigen is labeled with the plural kinds of antibodies. A method for detecting an antigen, comprising detecting by measuring the fluorescence intensity of the fluorescence, and detecting the presence of the antigen in the sample from the result. (2) The detection method according to (1), wherein the antigen is a female hormone, and the plurality of antibodies are anti-hormone antibodies against the female hormone. (3) The detection method according to (1), wherein the antigen is an exogenous endocrine disrupting substance, and the plurality of antibodies are anti-hormone antibodies against female hormones. (4) The plurality of antibodies are fluorescently labeled antibodies, and the amount of the antibodies bound to the immobilized antigen is detected by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescence of the plurality of fluorescently labeled antibodies. The detection method according to any one of the above (1) to (3). (5) The plurality of types of antibodies are used as unlabeled primary antibodies, and the amount of the antibodies bound to the immobilized antigen is determined using a fluorescent-labeled anti-primary antibody that specifically binds to the plurality of types of primary antibodies as a secondary antibody; The method according to any one of (1) to (3) above, wherein the detection is performed by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescence of the secondary antibody specifically bound to the primary antibody bound to the immobilized antigen. Detection method. (6) the antigen includes the antigen itself and a derivative of the antigen, and the plurality of types of antibodies have different affinity from an antibody having substantially the same affinity for the antigen itself and the derivative of the antigen. The detection method according to any one of the above (1) to (5), wherein the antigen itself and a derivative of the antigen are detected simultaneously by using the antibody in combination with an antibody showing the property. (7) A method for detecting the presence of a plurality of antigens in a sample, wherein a combination of antibodies against each antigen is used,
Both antibody concentrations are sufficiently low compared to the equilibrium dissociation constants for the respective antigens, and under conditions where antibody binding is governed by their own antigen-binding affinities, a known amount of these antibodies is simultaneously added to the antibody. After being introduced into the sample and subjected to an antigen-antibody reaction with each of the unknown antigens, the reaction mixture of these multiple antibodies and the sample is contacted with a known amount of each immobilized antigen, and The amount of the bound antibody is detected by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescence bound to the plurality of types of antibodies, and the presence of the plurality of antigens in the sample is detected from the result. Detection method. (8) The detection method according to (7), wherein the plurality of antigens are all female hormones, and the plurality of antibodies are anti-hormone antibodies against the respective female hormones. (9) The detection method according to (7), wherein the plurality of antigens are all exogenous endocrine disrupting substances, and the plurality of antibodies are anti-hormone antibodies against each female hormone. (10) The plurality of kinds of antibodies are fluorescently labeled antibodies, and the amount of the antibodies bound to the immobilized antigen is detected by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescence of the plurality of kinds of fluorescently labeled antibodies. The detection method according to any one of the above (7) to (9). (11) The plurality of types of antibodies are used as unlabeled primary antibodies, and the amount of the antibodies bound to the immobilized antigen is determined by using a fluorescent-labeled anti-primary antibody that specifically binds to the plurality of types of primary antibodies as a secondary antibody; (7) The method according to any of (7) to (9) above, wherein the detection is performed by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescence of the secondary antibody specifically bound to the primary antibody bound to the immobilized antigen. Detection method. (12) A method for detecting the presence of a plurality of antigens in a sample, wherein a combination of antibodies to each antigen is used, and the concentration of each antibody is sufficiently lower than the equilibrium dissociation constant for each antigen. Under conditions in which binding is governed by their own antigen-binding affinities, known amounts of these antibodies are independently introduced into each aliquot of the sample and subjected to an antigen-antibody reaction with each of the unknown antigens, A plurality of aliquots containing each of these antibodies are sequentially flowed into a column having a known amount of both antigens immobilized thereon, and the amount of antibody bound to the immobilized antigen is bound to these antibodies for each aliquot flowing down. An antigen detection method characterized by detecting the fluorescence intensity of the labeled fluorescence thus detected, and detecting the presence of each antigen in the sample by the fluorescence intensity derived from each antibody. Method for detecting an antigen. (13) The detection method according to (12), wherein the plurality of antigens are all female hormones, and the plurality of antibodies are anti-hormone antibodies against each of the female hormones. (14) The method according to (1), wherein the plurality of antigens are all exogenous endocrine disrupting substances, and the plurality of antibodies are anti-hormone antibodies against each female hormone.
The detection method according to 2). (15) The plurality of antibodies are fluorescently labeled antibodies, and the amount of the antibodies bound to the immobilized antigen is detected by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescence of the plurality of fluorescently labeled antibodies. The detection method according to any one of the above (12) to (14). (16) The plurality of types of antibodies are used as unlabeled primary antibodies, and the amount of the antibodies bound to the immobilized antigen is determined using a fluorescent-labeled anti-primary antibody that specifically binds to the plurality of types of primary antibodies as a secondary antibody; The detection according to any one of the above (12) to (15), wherein the detection is performed by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescence of the secondary antibody specifically bound to the primary antibody bound to the immobilized antigen. Detection method.

【００１３】[0013]

【発明の実施の形態】以下、本発明を実施態様に基づき
より詳細に説明する。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on embodiments.

【００１４】本発明に係る検定法において、検出可能な
抗原および固定化抗原として使用される抗原の種類とし
ては、特に限定されるものではないが、以下、抗原とし
て女性ホルモンの場合を例にとり、本発明を説明する。In the assay method according to the present invention, the types of the antigen used as the detectable antigen and the immobilized antigen are not particularly limited. The present invention will be described.

【００１５】本発明に係る検定法は、抗体抗原反応を利
用するものであって、その手順としては、概して、極微
量の抗原を含有する試料に、所定量の抗体を接触させ
て、抗原抗体反応を起こさせた後、この反応に供しなか
った余剰の未反応抗体を、固定化抗原において捕捉し、
捕捉された抗体量を蛍光標識によって測定し、ブランク
における値との蛍光強度差から、試料中の抗原の存在を
検出するものである。そして本発明においては、この検
出に用いる抗体として、複数の異なる結合親和性を持つ
抗体を用いる。The assay method according to the present invention utilizes an antibody-antigen reaction. As a general procedure, a predetermined amount of an antibody is brought into contact with a sample containing a very small amount of an antigen to prepare an antigen-antibody reaction. After initiating the reaction, excess unreacted antibody not subjected to this reaction is captured on the immobilized antigen,
The amount of the captured antibody is measured by fluorescent labeling, and the presence of the antigen in the sample is detected from the difference in fluorescence intensity from the value in the blank. In the present invention, antibodies having a plurality of different binding affinities are used as the antibodies used for this detection.

【００１６】本発明において、担体に固定化される抗原
として使用され得る女性ホルモンとしては、発情作用を
有するものであれば、あらゆるものが使用でき、エスト
ラジオール、エストロン、エストリオール、エキリン、
エレキニン等のステロイドホルモンまたはその代謝物、
これらの化学誘導体、例えばホモエストロン、エチニル
エストラジオール、ドワシノール酸、または合成エスト
ロゲン等を挙げることができる。In the present invention, any female hormone which can be used as an antigen immobilized on a carrier can be used as long as it has an estrus effect, and estradiol, estrone, estriol, equilin,
Steroid hormones such as elekinin or metabolites thereof,
These chemical derivatives include, for example, homoestrone, ethinylestradiol, dowashinoleic acid, and synthetic estrogens.

【００１７】本発明において固定化抗原とは、不溶性担
体に抗原を固定化したものを意味し、抗原が女性ホルモ
ンである態様においては、固定化女性ホルモンとは不溶
性担体に女性ホルモンを固定化したものを意味する。In the present invention, the term "immobilized antigen" means an antigen immobilized on an insoluble carrier. In the embodiment in which the antigen is a female hormone, the immobilized female hormone is a female hormone immobilized on an insoluble carrier. Means things.

【００１８】このように固定化される抗原は、測定され
る試料中に含まれると推定される抗原と一般に同種のも
のである。しかしながら、本発明の検出方法において、
測定対象となる抗原は、検出系において担体に固定化さ
れる抗原と必ずしも同一である必要はなく、使用される
抗体に特異的な結合性を有する物質であれば良い。例え
ば、担体に固定化される抗原の誘導体、具体的には、固
定化抗原が上記したようなエストラジオール、エストリ
オールといった女性ホルモンである場合、これらエスト
ラジオールやエストリオールの包合体や、女性ホルモン
に対する抗ホルモン抗体に結合性を示す外因性内分泌撹
乱物質の検出が可能である。その検出可能な外因性内分
泌撹乱物質としては特に限定されるわけではなく多種多
様な物質が含まれ得る。例えば、タモキシフェン、ノニ
ルフェノール、ビスフェノールＡ、ジエチルスチルベス
トロール、エストラジオール−３−スルフェート、エス
トラジオール−１７−グルクロニド、エストラジオール
−３−グルクロニド、エストリオール−３−スルフェー
ト、エストリオール−１７−グルクロニド、エストリオ
ール−３−グルクロニドなど化学物質が例示できるが、
もちろん、これら数種の化学物質に限定されるものでは
ない。The antigen thus immobilized is generally the same as the antigen presumed to be contained in the sample to be measured. However, in the detection method of the present invention,
The antigen to be measured does not necessarily have to be the same as the antigen immobilized on the carrier in the detection system, and may be any substance having specific binding properties to the antibody used. For example, when the derivative of the antigen immobilized on the carrier, specifically, the immobilized antigen is a female hormone such as estradiol or estriol as described above, an conjugate of these estradiol or estriol, or an antibody against female hormone, It is possible to detect an exogenous endocrine disrupting substance that has a binding property to a hormone antibody. The detectable exogenous endocrine disrupting substance is not particularly limited, and may include a wide variety of substances. For example, tamoxifen, nonylphenol, bisphenol A, diethylstilbestrol, estradiol-3-sulfate, estradiol-17-glucuronide, estradiol-3-glucuronide, estriol-3-sulfate, estriol-17-glucuronide, estriol-3 -Chemical substances such as glucuronide can be exemplified,
Of course, it is not limited to these several chemicals.

【００１９】女性ホルモンなどのような抗原を固定化す
るための不溶性担体としては、例えばポリメチルメタク
リル酸、ガラス等からなる固定化用ビーズ、アルギン酸
カルシウム粒子等の微細粒子などを用いることができる
が、特にこれらに限定されるものではなく、種々の形
状、材質のものを使用することができる。このうち、ビ
ーズないし微粒子形状、特に平均粒径５０〜１００μｍ
程度のビーズないし微粒子形状のものであることが好ま
れる。As an insoluble carrier for immobilizing an antigen such as a female hormone, for example, immobilizing beads made of polymethyl methacrylic acid, glass or the like, fine particles such as calcium alginate particles and the like can be used. However, the present invention is not particularly limited thereto, and various shapes and materials can be used. Among them, the shape of beads or fine particles, particularly the average particle diameter is 50 to 100 μm
It is preferred that it is in the form of beads or fine particles.

【００２０】このような不溶性担体に対する女性ホルモ
ンの固定化方法としては、また担体への女性ホルモンの
固定化方法としては、ホルモンを失活化させない方法で
あれば特に限定されるものではない。例えば、ホルモン
を直接自然吸着法、イオン結合法、共有結合法などを用
いて担体に結合させることができ、また直接結合させる
方法のみならず、適当な化学物質あるいはタンパク質な
どのスペーサーを介して間接的に結合させることも可能
である。例えば、ホルモンの活性に影響のない部位に官
能基を導入し共有結合を介して結合させること、長鎖の
スペーサーを配するといった態様を取ることが望まし
い。具体的には例えば、芳香族アミノ基を持つ担体をジ
アゾ化し、ホルモンなどの抗原となる化学物質をジアゾ
カップリングする方法、あるいは、セファロースなどの
多糖類をBrCNで活性化してアミノ基を持つホルモンなど
の化学物質のアミノ基と共有結合させる方法などを例示
できる。また、ホルモンをタンパク質に化学結合により
結合させ、この結合体をさらに担体に固定化することも
できる。この固定化法についても、ホルモンとタンパク
質の結合体を直接自然吸着法、イオン結合法、共有結合
法などを用いて担体に結合させることができ、また直接
固定させる方法のみならず、適当な化学物質、例えばグ
ルタルアルデヒド架橋などのスペーサーを介して固定さ
せることも可能である。その他の種類の抗原の場合であ
っても、同様な手法、あるいは公知のその他の手法を適
宜採択することができる。The method for immobilizing the female hormone on such an insoluble carrier and the method for immobilizing the female hormone on the carrier are not particularly limited as long as the method does not inactivate the hormone. For example, a hormone can be directly bound to a carrier using a natural adsorption method, an ionic bonding method, a covalent bonding method, or the like.In addition to a method of directly bonding a hormone, indirectly via a spacer such as an appropriate chemical substance or protein. It is also possible to combine them. For example, it is desirable to adopt a mode in which a functional group is introduced into a site that does not affect the activity of the hormone and bonded via a covalent bond, or a long-chain spacer is provided. Specifically, for example, a method of diazotizing a carrier having an aromatic amino group and diazo coupling a chemical substance serving as an antigen such as a hormone, or a method of activating a polysaccharide such as sepharose with BrCN and a hormone having an amino group And the like, for example, a method of covalently bonding to an amino group of a chemical substance. Alternatively, the hormone can be bound to the protein by a chemical bond, and the conjugate can be further immobilized on a carrier. In this immobilization method, the conjugate of the hormone and the protein can be directly bonded to the carrier using a natural adsorption method, an ionic bonding method, a covalent bonding method, or the like. It is also possible to fix via a spacer such as a substance, for example glutaraldehyde crosslinks. Even in the case of other types of antigens, a similar technique or other known techniques can be appropriately adopted.

【００２１】一方、固定化される抗原に対する抗体、こ
の態様においては、女性ホルモンに対する抗ホルモン抗
体に蛍光標識したものを別途調製する。抗体としては、
各種動物を起源とする免疫グロブリンのどのクラスに属
するものであってもよく、一般に市販されるものを用い
ることも、あるいは適当な免疫系を該女性ホルモンで刺
激し産生される該女性ホルモンに対する特異性の高い抗
体を別途調製したものを用いてもよい。またモノクロー
ナル抗体を用いることも可能である。例えば、抗エスト
ラジオール抗体は、バイオデザイン (Biodesign) 社、
バイオスペシフィック(BiospeciＦic)社、フィツァーア
ルド(Ｆitzgerald）社、コーテックスバイオケミストリ
ー(Cortex Biochemistry)社（いずれも米国）などか
ら、また抗エストリオール抗体はバイオストライド(Bio
stride)社などから入手可能である。このような抗体の
蛍光標識化は、慣用の手段により行い得、また使用され
る蛍光色素としても上記したものと同様のものが例示で
きる。On the other hand, an antibody against an antigen to be immobilized, in this embodiment, an anti-hormone antibody against a female hormone, which is fluorescently labeled, is separately prepared. As an antibody,
It may belong to any class of immunoglobulin derived from various animals, and it may be a commercially available one, or a specific immune system produced by stimulating an appropriate immune system with the female hormone. A high-potency antibody separately prepared may be used. It is also possible to use a monoclonal antibody. For example, anti-estradiol antibodies are available from Biodesign,
BiospeciFic, Fitzgerald, Cortex Biochemistry (all in the United States), etc., and anti-estriol antibody is biostride (Bio
stride). Fluorescent labeling of such an antibody can be performed by conventional means, and examples of the fluorescent dye to be used are the same as those described above.

【００２２】あるいはまた、抗原に対する抗体、この態
様の場合、女性ホルモンに対する抗ホルモン抗体には、
蛍光標識付けせず、これを一次抗体として使用するとと
もに、別途この一次抗体に対して特異的に結合する抗体
（抗一次抗体抗体）を用意し、これを蛍光標識したもの
を二次抗体として用いることも可能である。この場合、
固定化女性ホルモンに結合した抗ホルモン抗体（一次抗
体）に蛍光標識された二次抗体が特異的に結合するた
め、蛍光標識した抗ホルモン抗体を用いる上記態様と同
様に、固定化女性ホルモンに結合した抗ホルモン抗体を
蛍光標識により識別化できるものである。Alternatively, an antibody against an antigen, in this embodiment, an anti-hormone antibody against a female hormone,
This is used as a primary antibody without fluorescent labeling, and an antibody (anti-primary antibody) that specifically binds to the primary antibody is separately prepared and used as a secondary antibody. It is also possible. in this case,
Since the fluorescently labeled secondary antibody specifically binds to the antihormone antibody (primary antibody) bound to the immobilized female hormone, it binds to the immobilized female hormone in the same manner as in the above embodiment using the fluorescently labeled antihormone antibody. The anti-hormone antibody thus identified can be identified by a fluorescent label.

【００２３】しかして、第１の発明においては、試料中
に存在すると思われる抗原に対し、親和性の異なる２種
ないしそれ以上の種類の抗体を用い、既知量のこれら複
数種の抗体を、同時に前記試料に導入して存在未知なる
抗原と抗原抗体反応を起こさせる。Thus, in the first invention, two or more kinds of antibodies having different affinities with respect to an antigen considered to be present in a sample are used, and a known amount of these plural kinds of antibodies is used. At the same time, the antigen is introduced into the sample to cause an antigen-antibody reaction with an antigen whose existence is unknown.

【００２４】例えば、ある女性ホルモンに対し、高い親
和性を有する抗ホルモン抗体と親和性の低い抗ホルモン
抗体という、親和性が大きく異なる2種の抗体を組み合
わせる。このような組合せを用いた場合、試料中に存在
する抗原（女性ホルモン）の濃度が低い場合において
は、親和性の高い抗体のみが抗原に結合し、抗原濃度が
高くなるにつれて親和性が低い抗体の結合も同時に起こ
る。結果的に、本発明においては、検出可能な抗原濃度
範囲（感度）が拡大できる。For example, two types of antibodies having greatly different affinities, ie, an anti-hormone antibody having a high affinity and an anti-hormone antibody having a low affinity for a certain female hormone are combined. When such a combination is used, when the concentration of the antigen (female hormone) present in the sample is low, only the antibody with high affinity binds to the antigen, and the antibody with lower affinity decreases as the antigen concentration increases. Also occurs at the same time. As a result, in the present invention, the detectable antigen concentration range (sensitivity) can be expanded.

【００２５】なお、複数の抗体を用いる本発明の検定方
法において、いずれの抗体濃度も抗原への平衡解離定数
に比べて十分に低く、抗体の結合がそれら自身の抗原結
合親和性により支配される条件下で、行う必要がある。
前記したように、抗体が過剰に存在すると結合平衡状態
は抗体濃度に支配され、抗体の結合親和性が十分にアッ
セイに反映されなくなるからである。また、このような
結合親和性支配の条件下であれば、検出下限を理論的に
到達可能な抗体の平衡解離定数に近づけられる利点もあ
る。In the assay method of the present invention using a plurality of antibodies, the concentration of each antibody is sufficiently lower than the equilibrium dissociation constant for the antigen, and the binding of the antibodies is governed by their own antigen-binding affinities. Under conditions, need to do.
As described above, when the antibody is present in excess, the binding equilibrium state is governed by the antibody concentration, and the binding affinity of the antibody is not sufficiently reflected in the assay. In addition, under such conditions of binding affinity, there is an advantage that the lower limit of detection can be made closer to the equilibrium dissociation constant of an antibody that can theoretically be reached.

【００２６】このためには、使用する個々の抗体の当該
抗原に対する平衡解離定数を決定し、検定に使用する抗
体濃度を、決定された平衡解離定数より十分小さな値、
例えば、平衡解離定数の1/2以下（下限値として０は含
まない）とすることが望ましい。For this purpose, the equilibrium dissociation constant of each antibody to be used for the antigen is determined, and the antibody concentration used in the assay is set to a value sufficiently smaller than the determined equilibrium dissociation constant,
For example, it is desirable to set the equilibrium dissociation constant to 1/2 or less (excluding 0 as the lower limit).

【００２７】後述する実施例に示すように、親和性支配
の結合条件で10pM〜1nMと1nM〜1μMの測定範囲を示す2
種類の抗エストリオール抗体を組み合わせた場合、エス
トリオールの測定可能な濃度範囲は10pM〜1μMに拡大し
た。As shown in the examples described later, the measurement ranges of 10 pM to 1 nM and 1 nM to 1 μM are shown under the binding conditions controlled by affinity.
When various anti-estriol antibodies were combined, the measurable concentration range of estriol was expanded to 10 pM to 1 μM.

【００２８】さらに、第１の発明において、検出しよう
とする試料中にある抗原とその抗原の誘導体が存在する
と想定される場合、例えば、エストリオールと、その抱
合体であるエストリオール-3-硫酸およびエストリオー
ル-3-グルクロン酸などが存在する、あるいはエストラ
ジオールと、その抱合体であるエストラジオール-3-硫
酸、エストラジオール-3-グルクロン酸などが存在する
と想定される場合、使用する抗体として、抗原自体およ
びその抗原の誘導体に対してほぼ同様の親和性を示す抗
体と、異なる親和性を示す抗体とを組み合わせて用いれ
ば、抗原自体と抗原の誘導体とを区別して同時に検出す
ることが可能となる。上記した態様で言えば、例えば、
エストリオール系では、エストリオール、エストリオー
ル-3-硫酸、およびエストリオール-3-グルクロン酸のい
ずれにも高い親和性を示す抗エストリオール抗体と、エ
ストリオールに対しては高い親和性を示すが、エストリ
オール-3-硫酸およびエストリオール-3-グルクロン酸に
対する親和性は低い抗エストリオール抗体との組合せ、
同様にエストラジオール系でも、エストラジオール、エ
ストラジオール-3-硫酸、およびエストラジオール-3-グ
ルクロン酸のいずれにも高い親和性を示す抗エストリオ
ール抗体と、エストラジオールに対しては高い親和性を
示すが、エストラジオール-3-硫酸およびエストラジオ
ール-3-グルクロン酸に対する親和性は低い抗エストラ
ジオール抗体との組合せなどが例示できる。Further, in the first invention, when it is assumed that an antigen and a derivative of the antigen are present in a sample to be detected, for example, estriol and conjugate thereof, estriol-3-sulfate, may be used. And estriol-3-glucuronic acid, etc., or estradiol and its conjugates estradiol-3-sulfate, estradiol-3-glucuronic acid, etc., are assumed to be present. If an antibody having substantially the same affinity for the derivative of the antigen and an antibody having a different affinity are used in combination, the antigen itself and the derivative of the antigen can be simultaneously detected separately. In the above-described embodiment, for example,
In the estriol system, an anti-estriol antibody showing a high affinity for any of estriol, estriol-3-sulfate, and estriol-3-glucuronic acid, and a high affinity for estriol, A combination with an anti-estriol antibody having low affinity for estriol-3-sulfate and estriol-3-glucuronic acid,
Similarly, in the estradiol system, an anti-estriol antibody showing high affinity to any of estradiol, estradiol-3-sulfate, and estradiol-3-glucuronic acid, and a high affinity for estradiol, but estradiol- Examples thereof include a combination with an anti-estradiol antibody having a low affinity for 3-sulfuric acid and estradiol-3-glucuronic acid.

【００２９】この場合、両抗体ともに高い結合親和性を
示すエストリオール（またはエストラジオール）に関し
ては両抗体の結合が低濃度のエストリオール（またはエ
ストラジオール）に対して同時に起こり、濃度の増加に
対して検出される蛍光強度が急激に減少するが、エスト
リオール-3-硫酸やエストリオール-3-グルクロン酸（エ
ストラジオール-3-硫酸やエストラジオール-3-グルクロ
ン酸）では前者の抗体が高い結合親和性を示すのに対し
て後者の抗体は低い親和性を示すため、低い抗原濃度で
は前者の抗体の結合のみが起こり、高い濃度では両抗体
の結合が同時に起こることとなる。このように、異なる
親和性を持つ2種の抗体を組み合わせることで、試料に
含まれるホルモンの形態やそれらの測定能範囲を拡大で
きる。In this case, with respect to estriol (or estradiol), which exhibits a high binding affinity for both antibodies, the binding of both antibodies occurs simultaneously with a low concentration of estriol (or estradiol), and the detection of an increase in the concentration occurs. Estriol-3-sulfate and estriol-3-glucuronic acid (estradiol-3-sulfate and estradiol-3-glucuronic acid) show higher binding affinity. On the other hand, since the latter antibody shows low affinity, only the binding of the former antibody occurs at a low antigen concentration, and the binding of both antibodies occurs simultaneously at a high concentration. Thus, by combining two kinds of antibodies having different affinities, it is possible to expand the form of the hormone contained in the sample and the measurement capability range thereof.

【００３０】次に、第２の発明においては、試料中に存
在すると思われる複数の抗原に対し、それぞれの抗原に
対する抗体を組み合わせて同時に使用する。例えば、エ
ストリオールとエストラジオールの２つの女性ホルモン
が存在すると思われる試料の測定において、エストリオ
ールに対し高い結合親和性を有する抗エストリオール抗
体とエストラジオールに対し高い結合親和性を有する抗
エストラジオール抗体とを組み合わせて用い、これら２
つの抗体を当該試料に同時に導入して存在未知なる抗原
と抗原抗体反応を起こさせる。Next, in the second invention, for a plurality of antigens which are considered to be present in a sample, antibodies against each antigen are combined and used simultaneously. For example, in the measurement of a sample in which two female hormones of estriol and estradiol are considered to exist, an anti-estriol antibody having a high binding affinity to estriol and an anti-estradiol antibody having a high binding affinity to estradiol are used. Used in combination, these two
The two antibodies are simultaneously introduced into the sample to cause an antigen-antibody reaction with an antigen whose existence is unknown.

【００３１】この第２の発明においても、使用されるい
ずれの抗体濃度もそれぞれの抗原への平衡解離定数に比
べて十分に低く、抗体の結合がそれら自身の抗原結合親
和性により支配される条件下として検出を行う。このよ
うな条件下とすれば、異なる抗原に対する親和性を組み
合わせることができ、高感度に検出可能な抗原種を拡大
できる。Also in the second invention, the conditions are such that the concentration of any antibody used is sufficiently lower than the equilibrium dissociation constant for each antigen, and the binding of antibodies is governed by their own antigen-binding affinities. Detection is performed as below. Under such conditions, the affinity for different antigens can be combined, and the antigen species that can be detected with high sensitivity can be expanded.

【００３２】後述する実施例において示すように、例え
ば、抗エストリオール抗体と抗エストラジオール抗体を
組み合わせた測定では、それぞれの女性ホルモンを同時
に1.6ｐM〜1nMの範囲で定量することができた。As shown in the examples described below, for example, in the measurement using a combination of an anti-estriol antibody and an anti-estradiol antibody, each female hormone could be simultaneously quantified in the range of 1.6 pM to 1 nM.

【００３３】この第２の発明の方法では、複数の抗原、
例えば上記態様では、エストラジオールとエストリオー
ルを同時に検出できる一方、得られた蛍光強度に対して
複数の抗原（エストリオールとエストラジオールの）濃
度の組み合わせが対応するため、その存在の有無を確か
めるモニタリングなどには有効であるが、複数の抗体の
定量にはあまり適していない。In the method of the second invention, a plurality of antigens,
For example, in the above embodiment, while estradiol and estriol can be simultaneously detected, a combination of a plurality of antigen (estriol and estradiol) concentrations corresponds to the obtained fluorescence intensity. Is effective but not well suited for quantification of multiple antibodies.

【００３４】一方、第３の発明においては、第２の発明
と同様に、複数の抗原に対し、それぞれの抗原に対する
抗体を組み合わせ、かついずれの抗体濃度もそれぞれの
抗原への平衡解離定数に比べて十分に低く、抗体の結合
がそれら自身の抗原結合親和性により支配される条件下
として使用されるが、第２の発明とは異なり、試料中に
同時にこれら複数の抗体を導入することはせず、前記試
料の各アリコートに各抗体それぞれ単独で導入して、存
在未知なる各抗原と抗原抗体反応に供し、その後、これ
らの各抗体を含む複数のアリコートを、双方の抗原を固
定化してなる検出系へと順次導入する。そして、各アリ
コートの導入毎に固定化抗原に結合した抗体量を、これ
ら抗体に結合させた標識蛍光の蛍光強度の測定によって
検出する。On the other hand, in the third invention, as in the second invention, a plurality of antigens are combined with an antibody against each antigen, and the concentration of each antibody is lower than the equilibrium dissociation constant for each antigen. Low enough to be used under conditions where antibody binding is governed by their own antigen binding affinity, but unlike the second invention, it is not possible to introduce these multiple antibodies into a sample simultaneously. Instead, each antibody alone was introduced into each aliquot of the sample, and subjected to an antigen-antibody reaction with each of the unknown antigens, and thereafter, a plurality of aliquots containing these antibodies were immobilized on both antigens. Introduce sequentially into the detection system. Each time an aliquot is introduced, the amount of the antibody bound to the immobilized antigen is detected by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescence bound to these antibodies.

【００３５】このような、順次多重測定により、試料中
の各抗原は、他の抗原の濃度に関わりなく相応する抗体
に起因する蛍光強度によって定量される。例えば、エス
トラジオールとエストリオールを含む試料の検出におい
ては、当該試料中のエストリオールはエストラジオール
の濃度に関わりなく蛍光強度の減少率から定量され、同
様に共存するエストラジオール濃度に関わらずエストリ
オールの定量も可能となる。後述する実施例において
は、その定量濃度範囲はエストラジオールとエストリオ
ールともに1.6ｐM〜1nMとすることができた。By such a sequential multiplex measurement, each antigen in the sample is quantified by the fluorescence intensity caused by the corresponding antibody regardless of the concentration of other antigens. For example, in the detection of a sample containing estradiol and estriol, estriol in the sample is quantified from the reduction rate of the fluorescence intensity regardless of the estradiol concentration, and similarly, estriol is quantified regardless of the coexisting estradiol concentration. It becomes possible. In the examples described below, the quantitative concentration range was 1.6 pM to 1 nM for both estradiol and estriol.

【００３６】また、使用する複数の抗体として、いずれ
も特定の抗原とその誘導体の双方に高い結合親和性を示
す抗体を選択し、これらを組み合わせれば、これらの誘
導体を含めて各抗原系を識別して、定量することが可能
となる。例えば、後述する実施例においては、エストラ
ジオールとその抱合体のいずれにも高い結合親和性を有
する抗エストラジオール抗体およびエストリオールとそ
の抱合体のいずれにも高い結合親和性を有する抗エスト
リオール抗体の組み合わせによって、合計６種の物質を
エストリオール系ホルモンとエストラジオール系に識別
して1.6pM〜1nMの濃度範囲で定量が可能であったことが
示されている。As the plurality of antibodies to be used, antibodies exhibiting high binding affinity to both a specific antigen and a derivative thereof are selected, and if these are combined, each antigen system including these derivatives can be used. It can be identified and quantified. For example, in Examples described later, a combination of an anti-estradiol antibody having a high binding affinity to both estradiol and its conjugate and an anti-estriol antibody having a high binding affinity to any of estriol and its conjugate It shows that a total of six substances could be classified into estriol hormones and estradiols and quantification was possible in the concentration range of 1.6 pM to 1 nM.

【００３７】このことは、環境中、特に、下水処理場向
けの女性ホルモンのモニタリング法としての本発明方法
の適用の可能性を示唆している。これは、近年、下水で
の女性ホルモンが問題となりつつあるが、下水処理場で
はかならずしも女性ホルモンはフリーで存在するわけで
なく、抱合体として様々な形態をとっており、上記した
ように本発明方法であれば、フリーのみの濃度と抱合体
を含めた総濃度の両者が同時に定量できる可能性がある
からである。また、アフィニテイーコントロールである
ため、高感度であり、測定時間も短いという利点もある
からである。This suggests the possibility of applying the method of the present invention as a method for monitoring female hormones in the environment, particularly for sewage treatment plants. In recent years, female hormones in sewage have become a problem.However, female hormones do not always exist free in sewage treatment plants, and they take various forms as conjugates. This is because if the method is used, both the free concentration and the total concentration including the conjugate may be simultaneously determined. Also, because of the affinity control, there is an advantage that the sensitivity is high and the measurement time is short.

【００３８】本発明の検出方法はいずれも、抗原抗体反
応を利用し、試料中に対象とする抗原が存在する場合
に、試料に添加した抗体と当該抗原を反応させ、該試料
中での抗原と反応に供しなかった未反応の抗体を、固定
化抗原で捕捉しその抗体を測定することで、間接的に試
料中の抗原を検出するものであるが、迅速な測定を行う
上から、固定化抗原を内部に保持してなる検出容器を用
いることが好ましい。All of the detection methods of the present invention utilize an antigen-antibody reaction, and when an antigen of interest is present in a sample, the antibody added to the sample is reacted with the antigen, and the antigen in the sample is reacted. The unreacted antibody not subjected to the reaction is captured with an immobilized antigen and the antibody is measured to indirectly detect the antigen in the sample. It is preferable to use a detection container in which the immobilized antigen is held.

【００３９】検出容器は固定化抗原を内部に保持し、か
つ該固定化抗原に結合された蛍光標識抗体からの蛍光の
検出を阻害しないことが必要であり、例えば透明ガラス
または透明プラスチック等からなる。検出容器は底部が
閉じられ、導入される試料が流出しないような形状であ
ってもよいが(この場合、蛍光強度の各々の測定はバッ
チ形式で行われる)、解放された底部に、固定化受容体
は通さないが導入される試料は通すスクリーン等の保持
材を設置するといった手法により、解放容器内の所定部
位に固定化受容体を通液可能な状態で保持拘束した形態
(いわゆるフロー式の検出容器）とすると、該試料を検
出容器に連続的に導入することができ、それにより、受
容体に結合する目的物質を極く微量含む試料であって
も、目的物質が検出容器中に蓄積・濃縮され、結果的に
目的物質の検出限界濃度が向上することとなるので好ま
しい。また液相と固相の接触時間が極端に短く、液中の
数パーセントにあたる抗体をフローにより連続的に捕捉
するため、液相中の結合平衡状態を乱すことなく解析が
可能であると同時に、連続捕捉が可能なため、液相中の
結合が抗体の親和性支配になるまで抗体の結合部位濃度
を低下させることができる。It is necessary that the detection container holds the immobilized antigen therein and does not hinder the detection of fluorescence from the fluorescently labeled antibody bound to the immobilized antigen, and is made of, for example, transparent glass or transparent plastic. . The detection vessel may be shaped such that the bottom is closed and the sample to be introduced does not flow out (in this case, each measurement of the fluorescence intensity is performed in a batch format), but is immobilized on the open bottom. A form in which the immobilized receptor is held and constrained so that the immobilized receptor can pass through a predetermined part of the open container by a method such as installing a holding material such as a screen through which the sample to be introduced does not pass through the receptor.
(A so-called flow-type detection container), the sample can be continuously introduced into the detection container, whereby even if the sample contains a very small amount of the target substance bound to the receptor, the target substance can be It is preferable because it is accumulated and concentrated in the detection container, and as a result, the detection limit concentration of the target substance is improved. In addition, the contact time between the liquid phase and the solid phase is extremely short, and several percent of the antibody in the liquid is continuously captured by flow, enabling analysis without disturbing the binding equilibrium state in the liquid phase, Since continuous capture is possible, the concentration of the binding site of the antibody can be reduced until the binding in the liquid phase is governed by the affinity of the antibody.

【００４０】具体的には、ビーズを積層したセル内に、
抗体と抗原の混合液を送液することで、固相担体に試料
中の抗原と結合しなかったフリーの抗体を捕捉し、その
捕捉量から間接的に液中の抗原と未結合の抗体および結
合した抗体の濃度を決定し、抗原と抗体の平衡結合状態
を解析する。前記第１および第２の発明方法では２種な
いしはそれ以上の異なる抗体が同じ溶液中に存在し、同
時に単独あるいは複数の抗原を検出する。一方、第３の
方法では異なる抗体２種ないしそれ以上の種類をそれぞ
れ単独で、試料の別々のアリコートに適用し、これらを
順次セル内に送液することで、１回の測定で両者が個別
に定量できる。Specifically, in a cell in which beads are stacked,
By sending a mixed solution of the antibody and the antigen, the free antibody that did not bind to the antigen in the sample is captured on the solid phase carrier, and the indirectly bound antibody and the antigen in the liquid are captured from the captured amount. The concentration of the bound antibody is determined, and the equilibrium binding state between the antigen and the antibody is analyzed. In the first and second invention methods, two or more different antibodies are present in the same solution, and one or more antigens are simultaneously detected. On the other hand, in the third method, two or more different antibodies are individually applied to separate aliquots of a sample, and these are sequentially fed into a cell, whereby both are separately obtained in one measurement. Can be determined.

【００４１】なお、フロー式の検出容器内における固定
化受容体の保持方法としては、上記したようなスクリー
ンのような保持材を用いる方法に限定されるものではな
く、これ以外にも例えば、受容体を固定化する担体とし
て通液性を有する塊状物を用い、この塊状物で検出容器
の流路断面を塞ぐように配置するといった方法も採択し
得る。The method for holding the immobilized receptor in the flow-type detection container is not limited to the above-mentioned method using a holding material such as a screen. It is also possible to adopt a method of using a liquid-permeable mass as a carrier for immobilizing the body and arranging the mass so as to close the flow path cross section of the detection container.

【００４２】また、検出容器は少量の試料間でも極くわ
ずかの蛍光強度の差を検知しうるように、微小セルの形
状であることが好ましい。微小セルは例えば１００ｍｍ
３以下、特に２０〜７０ｍｍ３の容積を有することが望
ましい。The detection container is preferably in the form of a small cell so that a very small difference in fluorescence intensity can be detected even between a small amount of samples. A micro cell is, for example, 100 mm
It is desirable to have a volume of 3 or less, especially 20-70 mm 3 .

【００４３】蛍光強度は、上記固定化抗原に捕捉された
抗体上の標識蛍光を適当な光源からのレーザ光、水銀灯
等の照射により励起した際に発生する蛍光を検出器によ
り検出される。The fluorescence intensity is detected by a detector which detects the fluorescence generated when the labeled fluorescence on the antibody captured by the immobilized antigen is excited by irradiation with laser light from a suitable light source, irradiation with a mercury lamp or the like.

【００４４】このような蛍光強度測定おいては、まず実
際の試料測定に先立ち、ある濃度の抗ホルモン抗体を上
記固定化女性ホルモンに結合させた場合の蛍光強度（ブ
ランク）を測定する(この値を検出値Ｆ０とする)。次に
試験すべき試料を上記と同濃度の抗ホルモン抗体と接触
させ、その後、この接触混合物を上記固定化女性ホルモ
ンに接触させ、固定化女性ホルモンに結合した抗ホルモ
ン抗体の蛍光強度を測定する(この値を検出値Ｆ１とす
る)。ここで、上記試料中に抗原が存在するならば、上
記抗ホルモン抗体の一部は上記試料との最初の接触にお
いて、試料中の抗原と結合し、この試料中の抗原と結合
した抗体は、続く固定化抗原との接触において、固定化
抗原と結合できず、反応混合物中に遊離状態で残ること
となるため、その結果が検出値Ｆ１における蛍光強度の
低下となって示される。従って、検出値Ｆ１が検出値Ｆ
０に比べ小さい場合(Ｆ１＜Ｆ０)、上記試験すべき試料
中に対象とする抗原が存在すると判断できる。In such fluorescence intensity measurement, first, prior to the actual sample measurement, the fluorescence intensity (blank) when a certain concentration of anti-hormone antibody is bound to the immobilized female hormone is measured (this value). Is the detected value F0). Next, the sample to be tested is contacted with the same concentration of the anti-hormone antibody as above, and then this contact mixture is contacted with the immobilized female hormone, and the fluorescence intensity of the anti-hormone antibody bound to the immobilized female hormone is measured. (This value is referred to as a detection value F1). Here, if an antigen is present in the sample, a part of the anti-hormonal antibody binds to the antigen in the sample at the first contact with the sample, and the antibody bound to the antigen in the sample is: In the subsequent contact with the immobilized antigen, the antibody cannot bind to the immobilized antigen and remains in the reaction mixture in a free state, and the result is indicated by a decrease in the fluorescence intensity at the detection value F1. Therefore, the detection value F1 is equal to the detection value F
When it is smaller than 0 (F1 <F0), it can be determined that the target antigen is present in the sample to be tested.

【００４５】しかし、Ｆ１のＦ０に比べた低下の割合
が、試料中に含まれる抗原の量にある程度比例すること
から、既知の濃度の抗原を用いて予め検量線等を作成す
ることにより、Ｆ１の低下の割合に応じて被試試料中に
含まれる抗原の定量を行うこともできる。However, since the rate of decrease of F1 compared to F0 is somewhat proportional to the amount of antigen contained in the sample, F1 can be determined by preparing a calibration curve or the like in advance using a known concentration of antigen. The antigen contained in the test sample can be quantified according to the rate of decrease in the amount of the antigen.

【００４６】なお、本発明に係る免疫検定法において、
蛍光標識の測定による検出段階としては、上記に例示し
たような手法に特に限定されるわけではなく、種々の態
様を取ることが可能であり、例えば、蛍光標識の追加と
検出セルの連結よりさらに高度化可能となる。In the immunoassay according to the present invention,
The detection step by measurement of the fluorescent label is not particularly limited to the method exemplified above, and can take various modes.For example, it is more preferable to add a fluorescent label and connect the detection cells. It can be advanced.

【００４７】また、上記においては、複数の抗体を組み
合わせて試料中の抗原を検出するにおいて、抗原を固相
に固定し、試料と接触させた抗体のうち試料中の抗原と
未反応の抗体を、この固定化抗原で捕捉し、間接的に試
料中の抗原を測定する態様を示したが、複数の抗体を固
相に固定し、これを試料と接触させて試料中の抗原を直
接捕捉固定化する態様も、同様に考慮し得るものであ
る。Further, in the above, when detecting an antigen in a sample by combining a plurality of antibodies, the antigen is immobilized on a solid phase, and an antibody which has not reacted with the antigen in the sample among the antibodies that have been brought into contact with the sample. Although the mode of capturing with the immobilized antigen and indirectly measuring the antigen in the sample has been described, a plurality of antibodies are immobilized on a solid phase, and this is brought into contact with the sample to directly capture and fix the antigen in the sample. The aspect of conversion can be similarly considered.

【００４８】[0048]

【実施例】次に、図面を参照して本発明の実施例につい
て説明するが、これらは本発明をより詳細に説明するた
めのものであり、限定するためのものではない。なお、
以下の実施例において、用いられた材料と方法は以下の
通りである。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Embodiments of the present invention will now be described with reference to the drawings, but these are for illustrating the present invention in more detail and not for limiting the present invention. In addition,
In the following examples, the materials and methods used are as follows.

【００４９】（１）抗体およびホルモン 固相担体のポリメタクリル酸メチルのビーズはガンツ化
成から購入した。17‐βエストラジオールおよびエスト
リオールは和光純薬から購入した。また両者の抱合体は
全てシグマ(St. Louis, MO)から購入した。また、担体
に固定したエストリオールと牛血清アルブミンの複合体
（estriol-6-(o-carboxymethyl)oxime:BSA）およびエス
トラジオールと牛血清アルブミンの複合体（estradiol-
6-(o-carboxymethyl)oxime:BSA）はシグマ(St. Louis,
MO)から購入した。また、実験に１次抗体として使用し
たモノクローナル マウス抗エストリオール抗体および
マウス抗エストラジオール抗体を表１にまとめた。な
お、2次抗体として使用したCY-5標識モノクローナル
ヤギ抗マウス抗体はJackson ImmunoResearch (West Gro
ve, PA)から購入した。(1) Antibodies and hormones Polymethyl methacrylate beads on a solid support were purchased from Ganz Kasei. 17-β estradiol and estriol were purchased from Wako Pure Chemical Industries. All conjugates were purchased from Sigma (St. Louis, MO). In addition, a complex of estriol and bovine serum albumin (estriol-6- (o-carboxymethyl) oxime: BSA) and a complex of estradiol and bovine serum albumin (estradiol-
6- (o-carboxymethyl) oxime: BSA) is Sigma (St. Louis,
MO). Table 1 summarizes the monoclonal mouse anti-estriol antibody and mouse anti-estradiol antibody used as the primary antibody in the experiment. CY-5 labeled monoclonal used as secondary antibody
Goat anti-mouse antibody is available from Jackson ImmunoResearch (West Gro
ve, PA).

【００５０】（２）固定化抗原の調製 抗原の固相固定は自然吸着により行った。担体には平均
直径100μmのポリメタクリル酸メチルのビーズを用い
た。具体的には200mgのビーズをエストリオールと牛血
清アルブミンの複合体あるいはエストラジオールの複合
体100μgを含む1mlの生理食塩水に投入し、37℃で２時
間振とうして行った。この後、100mgの牛血清アルブミ
ンを1mlのPBSに溶解した液を調製し、この液0.1mlを先
のビーズ懸濁液に加え、2時間同じ温度で振とうした。
振とう後、ビーズを生理食塩水で洗浄して同溶液30mlに
懸濁した。 （３）試料液および１次抗体溶液の調製 1次抗体溶液は表１に示した抗体を単独あるいは２種の
抗体を組み合わせ、1.0mg/mlの牛血清アルブミンを含む
生理食塩水にて希釈して使用した。また、全てのホルモ
ン溶液はジメチルスルオキシドに1 mM の濃度で溶解
し、さらに希釈する場合には牛血清アルブミンを1.0mg/
mlの濃度で含む生理食塩水を用いて調製した。抱合体を
含む混合女性ホルモンはエストリオール系ではエストリ
オール、エストリオール-3-硫酸、エストリオール-3-グ
ルクロン酸をそれぞれ等モルで溶解し、同様にエストラ
ジオール系ではエストラジオール、エストラジオール-3
-硫酸、エストラジオール-3-グルクロン酸を溶解した。
これらの混合液を単独あるいは混合して測定に用いた。
混合ホルモンのモル数は溶液中に存在するホルモンの総
モル濃度として示した。以上の手順で調製したホルモン
溶液と１次抗体溶液の等量を種々の組み合わせで混合し
て測定に供した。この際、ホルモンと１次抗体濃度は終
濃度として表示した。一方、２次抗体として使用したCY
-5標識モノクローナル ヤギ抗マウス抗体は血清アルブ
ミンを1.0 mg/ml の濃度で含む生理食塩水で表記した濃
度に希釈して用いた。(2) Preparation of immobilized antigen The solid-phase immobilization of the antigen was performed by natural adsorption. As the carrier, beads of polymethyl methacrylate having an average diameter of 100 μm were used. Specifically, 200 mg of beads were put into 1 ml of physiological saline containing 100 μg of a complex of estriol and bovine serum albumin or a complex of estradiol, and shaken at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, a solution prepared by dissolving 100 mg of bovine serum albumin in 1 ml of PBS was prepared, and 0.1 ml of this solution was added to the above bead suspension and shaken at the same temperature for 2 hours.
After shaking, the beads were washed with physiological saline and suspended in 30 ml of the same solution. (3) Preparation of sample solution and primary antibody solution The primary antibody solution was prepared by diluting the antibodies shown in Table 1 alone or in combination of two antibodies with a physiological saline solution containing 1.0 mg / ml bovine serum albumin. Used. All hormone solutions are dissolved in dimethylsulfoxide at a concentration of 1 mM.
It was prepared using physiological saline containing a concentration of ml. The mixed female hormone containing the conjugate is estriol, in which estriol, estriol-3-sulfuric acid, and estriol-3-glucuronic acid are dissolved in equimolar amounts, respectively. Similarly, in the estradiol system, estradiol and estradiol-3 are dissolved.
-Sulfuric acid and estradiol-3-glucuronic acid were dissolved.
These liquid mixtures were used alone or in combination for measurement.
The number of moles of the mixed hormone was shown as the total molar concentration of the hormone present in the solution. Equal amounts of the hormone solution and the primary antibody solution prepared by the above procedure were mixed in various combinations and used for measurement. At this time, the concentrations of the hormone and the primary antibody were indicated as final concentrations. On the other hand, CY used as a secondary antibody
The -5-labeled monoclonal goat anti-mouse antibody was used after diluting it to the concentration indicated with physiological saline containing serum albumin at a concentration of 1.0 mg / ml.

【００５１】（４）蛍光検出装置および検出方法 測定にはフロー式蛍光光度計(KinExATM 3000, Sapidyne
Instruments, Inc.,Boise, ID)を用いた。この光度計
は直径1.5mm、長さ30mmの円筒形ガラスセル、励起光源
および蛍光検出器を備えており、測定に先だってセル内
に導入される抗原固定ビーズを測定の固相担体として利
用する。詳しくは、ビーズを積層したセル内に、抗体と
抗原の混合液を送液することで、固相担体に抗原と未結
合の抗体を捕捉し、その捕捉量から間接的に液中の抗原
と未結合の抗体および結合した抗体の濃度を決定し、抗
原と抗体の平衡結合状態を解析する。液相と固相の接触
時間が極端に短く、液中の数パーセントにあたる抗体を
フローにより連続的に捕捉するため、液相中の結合平衡
状態を乱すことなく解析が可能である。同時に、連続捕
捉が可能なため、液相中の結合が抗体の親和性支配にな
るまで抗体の結合部位濃度を低下させることができる。
免疫検定は、この抗体親和性支配の条件で同時多重法と
順次多重法の両法で行った。同時多重法では２種の異な
る1次抗体が同じ溶液中に存在し、同時に単独あるいは
複数のホルモンを検出する。一方、順次多重法では異な
る1次抗体2種をそれぞれ単独の抗体液2種を調製し、こ
れらを順次用いることで、１回の測定で両者が個別に定
量できる。(4) Fluorescence Detector and Detection Method For measurement, a flow-type fluorometer (KinExA ™ 3000, Sapidyne
Instruments, Inc., Boise, ID). This photometer is provided with a cylindrical glass cell having a diameter of 1.5 mm and a length of 30 mm, an excitation light source and a fluorescence detector, and uses antigen-immobilized beads introduced into the cell as a solid-phase carrier for measurement prior to measurement. Specifically, by sending a mixed solution of the antibody and the antigen into the cell in which the beads are stacked, the antibody unbound to the antigen is captured on the solid phase carrier, and the amount of the antigen in the liquid is indirectly determined from the captured amount. The concentration of the unbound antibody and the bound antibody is determined, and the equilibrium binding state between the antigen and the antibody is analyzed. Since the contact time between the liquid phase and the solid phase is extremely short, and several percent of the antibody in the liquid is continuously captured by flow, analysis can be performed without disturbing the binding equilibrium state in the liquid phase. At the same time, since continuous capture is possible, the concentration of the binding site of the antibody can be reduced until the binding in the liquid phase is controlled by the affinity of the antibody.
The immunoassay was performed by the simultaneous multiplex method and the sequential multiplex method under the condition of the antibody affinity control. In the simultaneous multiplex method, two different primary antibodies are present in the same solution, and a single or multiple hormones are simultaneously detected. On the other hand, in the sequential multiplex method, two different primary antibodies are respectively prepared as two single antibody solutions, and these are sequentially used, whereby both can be individually quantified in one measurement.

【００５２】４−１）同時多重免疫検定 先の要領で調製したエストリオールあるいはエストラジ
オール固定化ビーズの懸濁液（6.7 mg of dry beads/m
l）のうち700 ml を流速1.5 ml/min でセルに流し込
み、1.5 ml の生理食塩水で洗浄することによってセル
内に均一に積層した。この後、２種類の1次抗体と単独
あるいは複数種のホルモンを含む混合液をセルに導入し
た。この際、混合液中の２種の１次抗体とホルモンの濃
度は実験により変えた。また、混合液の送液量も実験に
より変えたが、流速は0.25ｍｌ/minに固定した。さらに
200 mlの生理食塩水を流速0.25 ml/minで送液してセル
内を洗浄した。この後、2.0nMのCY-5標識モノクローナ
ル ヤギ抗マウス抗体溶液を送液した。続いて、未結合
の2次抗体を1.5mlの生理食塩水を流速1.5 ml/minで送液
することによって洗浄・除去した。実験中の蛍光信号
（励起波長；620nm、測定波長；670nm）は1秒ごとに測
定され、測定値はコンピューターに記録した。最終的に
得られた残存蛍光信号値とベースライン値との差を測定
値としてボルト単位で示した。4-1) Simultaneous Multiplexed Immunoassay A suspension of estriol or estradiol-immobilized beads prepared as described above (6.7 mg of dry beads / m
700 ml of l) was poured into the cell at a flow rate of 1.5 ml / min, and washed uniformly with 1.5 ml of physiological saline to uniformly stack the cells. Thereafter, a mixed solution containing two types of primary antibodies and one or more types of hormones was introduced into the cell. At this time, the concentrations of the two primary antibodies and the hormone in the mixture were changed by experiments. Further, the flow rate of the mixed solution was also changed by experiments, but the flow rate was fixed at 0.25 ml / min. further
200 ml of physiological saline was fed at a flow rate of 0.25 ml / min to wash the inside of the cell. Thereafter, a 2.0 nM CY-5-labeled monoclonal goat anti-mouse antibody solution was sent. Subsequently, the unbound secondary antibody was washed and removed by sending 1.5 ml of physiological saline at a flow rate of 1.5 ml / min. The fluorescence signal during the experiment (excitation wavelength; 620 nm, measurement wavelength; 670 nm) was measured every second, and the measured value was recorded on a computer. The difference between the finally obtained residual fluorescence signal value and the baseline value was shown as a measured value in volts.

【００５３】４−２）順次多重免疫検定法 まず、1次抗体と単独あるいは複数種のホルモンを含む
混合液を1次抗体別に2種類調製した。なお、混合液中の
１次抗体とホルモンの濃度は実験により変えた。この
後、それぞれの混合液に４.0nMのCY-5標識モノクローナ
ル ヤギ抗マウス抗体溶液を等量加えた。エストリオー
ルあるいはエストラジオール固定化ビーズをそれぞれ単
独あるいは等量混合した懸濁液（6.7 mg of dry beads/
ml）のうち700 ml を前述と同様な条件でセル内に積層
した。ビーズ積層後、まず2種類の混合液のうち一方を
セルに導入した。混合液の送液量は実験により変えた
が、流速は0.25ｍｌ/minに固定した。次ぎに生理食塩水
を蛍光信号が一定になるまで送液し、得られた残存蛍光
信号値とベースライン値との差を測定値とした。さらに
引き続き、もう一方の混合液と生理食塩水を同じ要領で
送液した。測定値は最終的に残った蛍光信号値から最初
の混合液に由来する蛍光信号値を差し引いて求めた。4-2) Sequential Multiplexed Immunoassay First, two kinds of mixed solutions containing the primary antibody and a single or plural kinds of hormones were prepared for each primary antibody. The concentrations of the primary antibody and the hormone in the mixed solution were changed by experiments. Thereafter, an equal volume of a 4.0 nM CY-5-labeled monoclonal goat anti-mouse antibody solution was added to each mixture. Suspension of estriol or estradiol-immobilized beads alone or in equal amounts (6.7 mg of dry beads /
700 ml) was laminated in the cell under the same conditions as described above. After lamination of the beads, one of the two mixed solutions was first introduced into the cell. The flow rate of the mixed solution was changed depending on the experiment, but the flow rate was fixed at 0.25 ml / min. Next, physiological saline was fed until the fluorescence signal became constant, and the difference between the obtained residual fluorescence signal value and the baseline value was used as the measured value. Subsequently, the other mixture and physiological saline were sent in the same manner. The measured value was obtained by subtracting the fluorescence signal value derived from the first mixed solution from the finally remaining fluorescence signal value.

【００５４】（５）結合解析 検定系に1種類の抗体のみが存在する場合は以下の式に
従い解析した。また、２種類の抗体による反応を解析す
る場合は、それぞれの反応が同時に起こるので、抗体ご
とに以下の数式１により蛍光強度を求め、その積算を蛍
光強度とした。(5) Binding analysis When only one type of antibody was present in the assay system, analysis was performed according to the following formula. In the case of analyzing reactions by two kinds of antibodies, since each reaction occurs simultaneously, the fluorescence intensity was obtained by the following formula 1 for each antibody, and the integrated value was defined as the fluorescence intensity.

【００５５】[0055]

【数１】 但し、式中、 [Ag0]は抗原総濃度、 [Ab0]は抗体総濃
度、kは結合親和性（kon/k off）、Sig0は[Ab0]における
蛍光強度、NSBは抗体の非特異的吸着による蛍光強度で
ある。 参考例１ 1次抗体のキャラクタリゼーション(Equation 1)Where [Ag0] is the total antigen concentration and [Ab0] is the total antibody concentration.
Degree, k is the binding affinity (kon/ k off), Sig0 in [Ab0]
Fluorescence intensity, NSB is the fluorescence intensity due to nonspecific adsorption of antibody
is there. Reference Example 1 Characterization of primary antibody

【００５６】いくつかのマウス 抗女性ホルモン モノ
クローナル抗体についてエストリオール、エストラジオ
ールおよび、これらの抱合体に対する平衡解離定数を決
定し、表１にまとめた。抗エストリオール抗体であるBS
31M抗体はエストリオール、エストリオール-3-硫酸、エ
ストリオール-3-グルクロン酸に対してそれぞれ22×10
-12mol/L、11×10-12mol/L、16×10-12mol/Lの平衡解離
定数を示し、検討した女性ホルモンの形態にかかわらず
良く結合した。また、抗エストリオール抗体であるBS33
M抗体とBD45021M抗体はBS31M抗体に比し、エストリオー
ルに対して、それぞれ同等の平衡解離定数（89×10-12m
ol/L）と２桁以上高い平衡解離定数を示した。The equilibrium dissociation constants for estriol, estradiol and their conjugates for several mouse anti-female hormone monoclonal antibodies were determined and are summarized in Table 1. BS, an anti-estriol antibody
The 31M antibody was 22 × 10 against estriol, estriol-3-sulfate, and estriol-3-glucuronic acid, respectively.
It showed equilibrium dissociation constants of −12 mol / L, 11 × 10 −12 mol / L, and 16 × 10 −12 mol / L, and showed good binding irrespective of the form of the female hormone studied. In addition, BS33 which is an anti-estriol antibody
The M antibody and the BD45021M antibody have the same equilibrium dissociation constant (89 × 10 −12 m) for estriol compared to the BS31M antibody.
ol / L) and an equilibrium dissociation constant higher by two orders of magnitude or more.

【００５７】抗エストラジオール抗体であるBD2F9抗体
はエストラジオール、エストラジオール-3-硫酸、エス
トラジオール-3-グルクロン酸に対して約10×10-12mol/
Lの平衡解離定数を示し、検討した女性ホルモンの形態
にかかわらず良く結合した。BSP抗体はエストラジオー
ルに34×10-12mol/Lの平衡解離定数を示したが、その抱
合体には３桁以上高い値を示した。The anti-estradiol antibody BD2F9 has an estradiol, estradiol-3-sulfate, and estradiol-3-glucuronic acid concentration of about 10 × 10 −12 mol / mol.
It showed an equilibrium dissociation constant of L and bound well regardless of the form of the female hormone studied. The BSP antibody showed an equilibrium dissociation constant of 34 × 10 −12 mol / L for estradiol, but its conjugate showed a value higher by three orders of magnitude or more.

【００５８】[0058]

【表１】 [Table 1]

【００５９】実施例１ 単一抗原に対する複数の抗体の
親和性を組み合わせた免疫検定 表１に示した抗体を2種類組み合わせたイムノアッセイ
（以下、デュアルアッセイと称する。）を実施した。そ
れぞれの抗体濃度は決定された平衡解離定数の1/2以下
とし、結合が親和性支配になる条件で実験を行った。ま
ず、単一の抗体を用いるイムノアッセイ（以下、シング
ルアッセイと称する。）にて2種の抗エストリオール抗
体の蛍光強度とエストリオール濃度との関係をそれぞれ
調べたところ、図１（Ａ）に示すように、BS3１M抗体で
はエストリオール濃度55.1pM、BS33M抗体では140pMで最
大蛍光強度の50%が得られた。そこで、得られた値をも
とに2種の抗体とエストリオールの結合が親和性にもと
づいて同時に起こると仮定し、デュアルアッセイの蛍光
強度とエストリオール濃度との関係を計算するとともに
実測も行った。その結果、破線で示した計算値と実測値
は良く一致し、エストリオール濃度115pMで最大蛍光強
度の50%を示す曲線が得られた。この結果から、デュア
ルアッセイによって2種の抗体の親和性を組み合わせて
用いることができると予想された。そこで、さらに親和
性が大きく異なる2種の抗体を組み合わせることによっ
て、低い抗原濃度では親和性の高い抗体のみが抗原に結
合し、抗原濃度が高くなるにつれて親和性が低い抗体の
結合も同時に起こると予想された。よって、測定可能な
抗原の濃度範囲が拡大できると考えた。そこで、測定濃
度範囲が10pM〜1nM であったBS31M抗体に加え、新たにB
D45021M抗体のモノアッセイを行ったところ、測定濃度
範囲は1nM〜1μMであった。これらの値をもとに両抗体
を組み合わせたデュアルアッセイの蛍光強度とエストリ
オール濃度との関係を実測した。その結果、図１（Ｂ）
に示すように、破線で示した計算値と実測値は良く一致
し、かつ測定濃度範囲は両抗体を合わせた10pM〜1μMに
拡大した。よって、デュアルアッセイにより、異なる親
和性を持つ2種の抗体を組み合わせて測定濃度範囲を拡
大できることが確かめられた。Example 1 Immunoassay Combining the Affinities of a Plurality of Antibodies to a Single Antigen An immunoassay combining the two types of antibodies shown in Table 1 (hereinafter referred to as dual assay) was performed. The concentration of each antibody was less than or equal to 1/2 of the determined equilibrium dissociation constant, and the experiment was performed under the condition that the binding was dominated by affinity. First, the relationship between the fluorescence intensity and the estriol concentration of two kinds of anti-estriol antibodies was examined by an immunoassay using a single antibody (hereinafter, referred to as a single assay), and is shown in FIG. 1 (A). Thus, 50% of the maximum fluorescence intensity was obtained at an estriol concentration of 55.1 pM with the BS31M antibody and at 140 pM with the BS33M antibody. Therefore, based on the obtained values, it is assumed that the binding between the two antibodies and estriol occurs simultaneously based on the affinity, and the relationship between the fluorescence intensity of the dual assay and the estriol concentration is calculated and measured. Was. As a result, the calculated value indicated by the broken line was in good agreement with the measured value, and a curve showing 50% of the maximum fluorescence intensity at an estriol concentration of 115 pM was obtained. From this result, it was expected that the affinity of the two antibodies could be used in combination by the dual assay. Therefore, by combining two types of antibodies having significantly different affinities, only a high-affinity antibody binds to an antigen at a low antigen concentration, and as the antigen concentration increases, the binding of a low-affinity antibody occurs simultaneously. As expected. Therefore, it was considered that the measurable antigen concentration range could be expanded. Therefore, in addition to the BS31M antibody whose measurement concentration range was 10 pM to 1 nM,
When a monoassay for the D45021M antibody was performed, the measured concentration range was 1 nM to 1 μM. Based on these values, the relationship between the fluorescence intensity and the estriol concentration in a dual assay combining both antibodies was measured. As a result, FIG.
As shown in the figure, the calculated value indicated by the broken line and the measured value were in good agreement, and the measured concentration range was expanded to 10 pM to 1 μM for both antibodies. Therefore, the dual assay confirmed that the measurement concentration range could be expanded by combining two types of antibodies having different affinities.

【００６０】実施例２ 単一抗原に対する複数の抗体の
親和性を組み合わせた免疫検定 次に、エストラジオールとその抱合体に対して異なる結
合親和性を示す2種の抗体の組み合わせによるデュアル
アッセイについて検討した。この場合も前述した実施例
１におけると同様に抗体の結合が親和性支配になる条件
で実験を行った。具体的には、表１に示すように、エス
トラジオール、エストラジオール-3-硫酸、エストラジ
オール-3-グルクロン酸に対して約10×10-12mol/Lの平
衡解離定数を示すBD2F9抗体とエストラジオールに34×1
0-12mol/Lの平衡解離定数を示すが、その抱合体には３
桁以上高い値を示すBSP抗体を組み合わせた。まずモノ
アッセイにて2種の抗エストラジオール抗体についてエ
ストラジオールの形態別にホルモン濃度と蛍光強度との
関係を調べた。図２（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、BD2F
9抗体ではエストラジオールの形態に関わらず29.3pM〜4
4.1pMの範囲で最大蛍光強度の50%を示す曲線が得られ、
測定濃度範囲は10pM〜250pMであった。一方、図２
（Ａ）〜（Ｃ）に示すようにBSP抗体はエストラジオー
ル、エストラジオール-3-硫酸、エストラジオール-3-グ
ルクロン酸に対して、それぞれ83.4pM、19.3nM、649nM
で最大蛍光強度の50%を示す曲線が得られ、同順で測定
濃度範囲は15.6pM〜500pM、1.96nM〜500nM 、3.21nM〜
4.0μM であった。2種の抗体の結合がそれぞれの親和性
にもとづいて同時に起こるならば、デュアルアッセイに
おける蛍光強度の減少は測定系内に共存するエストラジ
オールの形態によって大きく異なるはずである。そこ
で、モノアッセイから得られた値をもとにデュアルアッ
セイの蛍光強度をエストラジオールの形態別に計算し、
同時に実測も行った。その結果、図２（Ａ）〜（Ｃ）検
討した3種類のエストラジオールの形態について破線で
示す計算値と実測値は良く一致していた。デュアルアッ
セイではエストラジオール、エストラジオール-3-硫
酸、エストラジオール-3-グルクロン酸に対して、それ
ぞれ69.4pM、1.23nM、8.96nMで最大蛍光強度の50%を示
す曲線が得られ、同順で測定濃度範囲は10.0pM〜250p
M、10pM〜500nM、10.0pM〜4.0μM であった。これらの
濃度範囲の下限は各抗原に対するBD2F9抗体の高い同等
な親和性を、上限はBSP抗体の各抗原に対する親和性の
違いを反映していた。これらの結果から、デュアルアッ
セイでは両抗体ともに高い結合親和性を示すエストラジ
オールに関しては両抗体の結合が低濃度のエストラジオ
ールに対して同時に起こり、濃度の増加に対して蛍光強
度が急激に減少することがわかった。一方、エストラジ
オール-3-硫酸やエストラジオール-3-グルクロン酸では
BD2F9抗体が高い結合親和性を示すのに対してBSP抗体は
約4〜5桁低い親和性を示すため、低い抗原濃度ではBD2F
9抗体の結合のみが起こり、高い濃度では両抗体の結合
が同時に起こることが確かめられた。以上、デュアルア
ッセイにより、異なる親和性を持つ2種の抗体を組み合
わせて試料に含まれるホルモンの形態やそれらの測定能
範囲を拡大できることが確かめられた。Example 2 Immunoassay Combining the Affinities of Multiple Antibodies to a Single Antigen Next, a dual assay using a combination of two antibodies having different binding affinities for estradiol and its conjugate was examined. . In this case, an experiment was performed under the same conditions as in Example 1 described above, in which the binding of the antibody was dominated by affinity. Specifically, as shown in Table 1, the BD2F9 antibody and estradiol exhibit an equilibrium dissociation constant of about 10 × 10 −12 mol / L with respect to estradiol, estradiol-3-sulfate, and estradiol-3-glucuronic acid. × 1
It shows an equilibrium dissociation constant of 0-12 mol / L, but its conjugate has 3
BSP antibodies exhibiting orders of magnitude or more higher values were combined. First, the relationship between the hormone concentration and the fluorescence intensity was examined for each of the two types of anti-estradiol antibodies by monoassay in each estradiol form. As shown in FIGS. 2A to 2C, the BD2F
For 9 antibodies, 29.3 pM to 4 regardless of estradiol form
A curve showing 50% of the maximum fluorescence intensity in the range of 4.1 pM was obtained,
The measured concentration range was from 10 pM to 250 pM. On the other hand, FIG.
As shown in (A) to (C), the BSP antibody responded to estradiol, estradiol-3-sulfate, and estradiol-3-glucuronic acid at 83.4 pM, 19.3 nM, and 649 nM, respectively.
A curve showing 50% of the maximum fluorescence intensity is obtained in the same order, and the measurement concentration range is 15.6 pM to 500 pM, 1.96 nM to 500 nM, 3.21 nM to
4.0 μM. If the binding of the two antibodies occurs simultaneously based on their respective affinities, the decrease in fluorescence intensity in the dual assay should be greatly dependent on the form of estradiol coexisting in the assay. Therefore, the fluorescence intensity of the dual assay was calculated for each estradiol form based on the value obtained from the mono assay,
At the same time, actual measurements were made. As a result, regarding the three types of estradiol forms studied in FIGS. 2 (A) to 2 (C), the calculated values indicated by broken lines and the measured values were in good agreement. In the dual assay, curves showing 50% of the maximum fluorescence intensity were obtained at 69.4 pM, 1.23 nM, and 8.96 nM for estradiol, estradiol-3-sulfate, and estradiol-3-glucuronic acid, respectively. Is 10.0pM to 250p
M, 10 pM-500 nM, 10.0 pM-4.0 μM. The lower end of these concentration ranges reflected the high and equivalent affinity of the BD2F9 antibody for each antigen, and the upper end reflected differences in the affinity of the BSP antibody for each antigen. From these results, in the dual assay, for estradiol, which has high binding affinity for both antibodies, the binding of both antibodies occurs simultaneously to low concentrations of estradiol, and the fluorescence intensity decreases sharply with increasing concentration. all right. On the other hand, estradiol-3-sulfuric acid and estradiol-3-glucuronic acid
The BD2F9 antibody shows a high binding affinity while the BSP antibody shows about 4 to 5 orders of magnitude lower affinity, so BD2F
It was confirmed that only the binding of 9 antibodies occurred, and that the binding of both antibodies occurred simultaneously at a high concentration. As described above, the dual assay confirmed that the combination of two kinds of antibodies having different affinities can expand the form of the hormone contained in the sample and the range of their measurement ability.

【００６１】実施例３ 同時多重免疫検定 2種類の異なる抗原に対してそれぞれ高い結合親和性を
示す抗体を組み合わせ、親和性支配の結合条件下でデュ
アルアッセイにより高感度に2種類の抗原を検出するこ
とを試みた。実験には、エストリオールに対してBS31M
抗体とエストラジオールに対してBSP抗体を用いた。エ
ストラジオールをそれぞれ0pM、6ｐM、37pM、111pM、33
3pM、1000pM含む試料に、種々の濃度でエストリオール
をさらに添加し、BS31M抗体とBSP抗体の存在下で蛍光強
度を測定した。その結果、図３（Ａ）に示すように、一
定濃度のエストリオールを含む試料において、エストラ
ジオールの濃度の増加に従い、蛍光強度の減少がみられ
た。同様に一定濃度のエストラジオールを含む試料にお
いて、エストリオールの濃度の増加に従い、蛍光強度が
減少した。Example 3 Simultaneous Multiplexed Immunoassay Antibodies showing high binding affinities for two different antigens are combined, and two types of antigens are detected with high sensitivity by dual assay under affinity-controlled binding conditions. Tried that. In the experiment, BS31M was used against estriol.
BSP antibodies were used against the antibody and estradiol. Estradiol was added at 0pM, 6pM, 37pM, 111pM, 33
Estriol was further added at various concentrations to the samples containing 3 pM and 1000 pM, and the fluorescence intensity was measured in the presence of the BS31M antibody and the BSP antibody. As a result, as shown in FIG. 3 (A), in the sample containing a certain concentration of estriol, the fluorescence intensity decreased as the estradiol concentration increased. Similarly, in the sample containing a constant concentration of estradiol, the fluorescence intensity decreased as the concentration of estriol increased.

【００６２】これらの結果をもとに蛍光強度とエストラ
ジオールおよびエストリオール濃度の関係を図３（Ｂ）
に示した。その結果、デュアルアッセイではエストリオ
ールとエストラジオールをともに6ｐM〜1nMの範囲で同
時に検出が可能であった。このように、デュアルアッセ
イにより異なる抗原に対する親和性を組み合わせること
ができ、高感度に検出可能な抗原種を拡大できると考え
られた。 実施例４ 順次多重免疫検定Based on these results, the relationship between the fluorescence intensity and the concentrations of estradiol and estriol is shown in FIG.
It was shown to. As a result, in the dual assay, it was possible to simultaneously detect both estriol and estradiol in the range of 6 pM to 1 nM. As described above, it was considered that the affinity for different antigens can be combined by the dual assay, and the types of antigens that can be detected with high sensitivity can be expanded. Example 4 Sequential multiplex immunoassay

【００６３】試料中に含まれる複数の抗原の定量が可能
な順次多重免疫検定について実験を行った。An experiment was conducted on a sequential multiplex immunoassay in which a plurality of antigens contained in a sample can be quantified.

【００６４】エストラジオールとエストリオールをそれ
ぞれ0pM、1.6pM、8pM、40pM、200pM、1000pMの濃度で含
む組み合わせの合計30種類の試料に対し、BS31M抗体とB
SP抗体をCy-5標識した2次抗体とともにそれぞれ添加し
て調製した混合液を以下の要領で送液した。すなわち、
緩衝液、BS31M抗体＋CY-5標識2次抗体＋エストラジオー
ル＋エストリオール、緩衝液、BD2F9抗体＋CY-5標識2次
抗体＋エストラジオール＋エストリオール、緩衝液の順
に送液した。For a total of 30 kinds of samples containing estradiol and estriol at concentrations of 0 pM, 1.6 pM, 8 pM, 40 pM, 200 pM and 1000 pM, respectively, the BS31M antibody and B
The mixed solution prepared by adding the SP antibody together with the Cy-5-labeled secondary antibody was sent in the following manner. That is,
Buffer solution, BS31M antibody + CY-5 labeled secondary antibody + estradiol + estriol, buffer solution, BD2F9 antibody + CY-5 labeled secondary antibody + estradiol + estriol, and buffer solution were sent in this order.

【００６５】送液時の蛍光強度の時間変化を図４（Ａ）
に示した。ホルモン混合液中のエストリオール濃度はBS
31M抗体に由来する残存蛍光強度、同様にエストラジオ
ール濃度はBD2F9抗体に由来する強度から定量された。
この順次多重測定により、ホルモン混合液中のエストリ
オールはエストラジオールの濃度に関わりなく蛍光強度
の減少率から定量され、同様に共存するエストラジオー
ル濃度に関わらずエストリオールの定量も可能であった
（図４（Ｂ）、（Ｃ））。その定量濃度範囲はエストラ
ジオールとエストリオールともに1.6ｐM〜1nMである。
以上、２種の抗体を組み合わせて測定を連続的に行うこ
とで、2種の抗原を定量できた。FIG. 4 (A) shows the time change of the fluorescence intensity at the time of liquid sending.
It was shown to. Estriol concentration in the hormone mixture is BS
The residual fluorescence intensity derived from the 31M antibody, as well as the estradiol concentration, were quantified from the intensity derived from the BD2F9 antibody.
By this sequential multiplex measurement, estriol in the hormone mixture was quantified from the reduction rate of the fluorescence intensity regardless of the estradiol concentration, and estriol was similarly quantified regardless of the coexisting estradiol concentration (FIG. 4). (B), (C)). The quantitative concentration range is 1.6 pM to 1 nM for both estradiol and estriol.
As described above, by continuously performing measurement by combining two kinds of antibodies, two kinds of antigens could be quantified.

【００６６】この順次多重免疫検定において、連続した
定量は用いた抗体の親和性が結合を支配する抗体濃度で
行った。従って、エストラジオールとエストリオールの
抱合体に親和性を持つ抗体の組み合わせによっては抱合
体を含めた混合女性ホルモン中からエストラジオール系
ホルモンとエストリオール系ホルモンにわけて定量する
ことも可能であると予想された。そこで、前述と同様な
順次多重測定でエストリオール系ホルモン（エストリオ
ール、エストリオール-3-硫酸、エストリオール-3-グル
クロン酸を等モルで混合）とエストラジオール系ホルモ
ン（エストラジオール、エストラジオール-3-硫酸、エ
ストラジオール-3-グルクロン酸を等モルで混合）を含
む試料から両者をそれぞれ定量した。この時、エストリ
オール系ホルモンの検出には混合したエストリオールと
その抱合体に対してほぼ同じ平衡解離定数を示すBS31M
抗体、同様な理由でエストラジオール系ホルモンにはBD
2F9抗体を用いた。その結果、図５（Ａ）および（Ｂ）
に示すように、混合液中の３種のエストリオール系ホル
モンは共存するエストラジオール系ホルモンの濃度に関
わりなく蛍光強度の減少率から定量され、同様に3種の
エストラジオール系ホルモンについても定量可能であっ
た。その定量濃度範囲はエストラジオール系とエストリ
オール系ホルモンともに総濃度として1.6ｐM〜1nMであ
った。以上、2種類の抗女性ホルモン抗体を組み合わせ
て連続的に検出するデュアルアッセイにより、1回約10
分間の測定で2種の女性ホルモンとその抱合体合計6物質
を1.6ｐM〜1nMの範囲で定量できた。In this sequential multiplex immunoassay, continuous quantification was performed at an antibody concentration at which the affinity of the antibody used governs binding. Therefore, it is expected that, depending on the combination of antibodies having an affinity for the conjugate of estradiol and estriol, it is possible to quantify the estradiol hormone and estriol hormone in the mixed female hormone including the conjugate. Was. Therefore, estriol-based hormones (estriol, estriol-3-sulfuric acid, estriol-3-glucuronic acid mixed in equimolar amounts) and estradiol-based hormones (estradiol, estradiol-3-sulfate) were determined by sequential multiple measurements as described above. , And estradiol-3-glucuronic acid were mixed in equimolar amounts). At this time, for the detection of estriol hormones, BS31M showing almost the same equilibrium dissociation constant for mixed estriol and its conjugate was used.
Antibodies, for similar reasons, estradiol hormones include BD
The 2F9 antibody was used. As a result, FIGS. 5A and 5B
As shown in the figure, the three estriol hormones in the mixed solution were quantified from the reduction rate of the fluorescence intensity irrespective of the concentration of the coexisting estradiol hormones. Similarly, the three estriol hormones could be quantified. Was. The quantitative concentration range was 1.6 pM to 1 nM in total for both estradiol and estriol hormones. As described above, the dual assay in which two types of anti-female hormone antibodies are continuously detected in combination is used,
In a minute measurement, a total of six female hormones and their conjugates were quantified in the range of 1.6 pM to 1 nM.

【００６７】[0067]

【発明の効果】以上述べたように本発明によれば、複数
の異なる結合親和性を持つ抗体を１つの免疫検定に併用
して用いることができ、被測定物質の種類とその測定範
囲（感度）を向上させることができる。As described above, according to the present invention, a plurality of antibodies having different binding affinities can be used in combination in one immunoassay, and the type of the substance to be measured and its measurement range (sensitivity) ) Can be improved.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】２種類の抗エストリオール抗体を組み合わせた
免疫検定による測定範囲を示す図であり、図１（Ａ）に
おいて、:（○）はBS31抗体単独、（△）はBS33抗体単
独、（□）はBS31抗体＋BS33抗体の場合のデータであ
り、また、図１（Ｂ）において、（○）はBS31抗体単
独、（△）はBD2F9抗体単独、（□）はBS31抗体＋BD2F9
抗体の場合のデータであり、また図中の破線は、いずれ
も２種の抗体を組み合わせた場合を単独の場合のデータ
に基づき計算により算出した値である。BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing a measurement range by an immunoassay combining two kinds of anti-estriol antibodies. In FIG. 1 (A), (（): BS31 antibody alone, (△): BS33 antibody alone, (△) □) are data for BS31 antibody + BS33 antibody, and in FIG. 1 (B), (○) is BS31 antibody alone, (、) is BD2F9 antibody alone, (□) is BS31 antibody + BD2F9
The data are for the case of an antibody, and the broken lines in the figure are values calculated by calculation based on the data for a single case combining two types of antibodies.

【図２】２種類の抗エストラジオール抗体を組み合わせ
た免疫検定によるホルモンおよびホルモン抱合体測定範
囲を示す図であり、図２（Ａ）は エストラジオール、
図２（Ｂ）はエストラジオール-3-硫酸、図２（Ｃ）は
エストラジオール-3-グルクロン酸に関する検出値であ
り、各図において、（○）はBD2F9抗体単独、（△）はB
SP抗体単独、（□）はBD2F9抗体＋BSP抗体の場合のデー
タであり、また図中の破線は、いずれも２種の抗体を組
み合わせた場合を単独の場合のデータに基づき計算によ
り算出した値である。FIG. 2 is a diagram showing a measurement range of hormones and hormone conjugates by an immunoassay using two kinds of anti-estradiol antibodies. FIG. 2 (A) shows estradiol,
FIG. 2 (B) shows the detection values for estradiol-3-sulfuric acid, and FIG. 2 (C) shows the detection values for estradiol-3-glucuronic acid. In each figure, (は) shows BD2F9 antibody alone, and (△) shows B values.
SP antibody alone, (□) is data for BD2F9 antibody + BSP antibody, and the dashed line in the figure is a value calculated by calculation based on data for the case of combining two types of antibodies alone. is there.

【図３】デュアルアッセイによるエストラジオールとエ
ストリオールの同時多重免疫検定の結果を示す図であ
り、図３（Ａ）は、種々の濃度でエストリオールを含む
試料に一定濃度でエストラジオールを添加した場合の蛍
光信号を、また、図３（Ｂ）は図３（Ａ）における蛍光
信号に関してのエストリオールとエストラジオール濃度
との関係を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing the results of simultaneous multiplex immunoassay of estradiol and estriol by a dual assay. FIG. 3 (A) shows the results when estradiol was added at a constant concentration to samples containing estriol at various concentrations. FIG. 3B is a diagram showing the relationship between the concentration of estriol and estradiol with respect to the fluorescence signal in FIG. 3A.

【図４】デュアルアッセイによるエストラジオールとエ
ストリオールの順次多重免疫検定の結果を示す図であ
る。図４（Ａ）は、〜の液体を順次送液した場合の
蛍光強度の時間変化を示す図であり、ここにおいて、
は緩衝液、はBS31M抗体＋CY-5標識2次抗体＋エストラ
ジオール＋エストリオール、は緩衝液、はBD2F9抗
体＋CY-5標識2次抗体＋エストラジオール＋エストリオ
ール、は緩衝液である。なお、とについては曲線
の上から、エストラジオールとエストリオールをともに
0pM、1.6pM、40pM、200pM、1000pMで含む場合を示して
いる。図４（Ｂ）および図４（Ｃ）は、図４（Ａ）に示
す結果から得られた、エストラジオールとエストリオー
ルを種々の濃度で含む試料を測定した場合の蛍光強度変
化とホルモン濃度との関係を示す図であり。図４（Ｂ）
においては、エストラジオールを、また図４（C）につ
いてはエストリオール濃度を（○）;1000pM,（△）;200
pM,（□）;40pM,（◇）;8pM, （▽）;1.6pM, （●）;0p
Mでそれぞれ示した。FIG. 4 is a diagram showing the results of a sequential multiplex immunoassay for estradiol and estriol by a dual assay. FIG. 4A is a diagram showing a time change of the fluorescence intensity when the liquids (1) to (4) are sequentially sent.
Represents a buffer, represents a BS31M antibody + CY-5 labeled secondary antibody + estradiol + estriol, represents a buffer, represents a BD2F9 antibody + CY-5 labeled secondary antibody + estradiol + estriol, and represents a buffer. For estradiol and estriol, both from the top of the curve
The case is shown at 0 pM, 1.6 pM, 40 pM, 200 pM, and 1000 pM. FIGS. 4 (B) and 4 (C) show the relationship between the change in the fluorescence intensity and the hormone concentration when the samples containing estradiol and estriol at various concentrations obtained from the results shown in FIG. 4 (A) are measured. It is a figure showing a relation. FIG. 4 (B)
In FIG. 4, estradiol was used, and in FIG. 4 (C), estriol concentration was used (）); 1000 pM, (△);
pM, (□); 40pM, (◇); 8pM, (▽); 1.6pM, (●); 0p
Indicated by M.

【図５】デュアルアッセイによる6種混合女性ホルモン
中のエストラジオール系とエストリオール系ホルモンの
順次多重免疫検定の結果を示す図であり、図５（Ａ）は
種々の濃度でエストリオール系ホルモン（エストリオー
ル:エストリオール-3-硫酸:エストリオール-3-グルクロ
ン酸=1:1:1)とエストラジオール系ホルモン（エストラ
ジオール:エストラジオール-3-硫酸:エストラジオール-
3-グルクロン酸=1:1:1)を含む試料を測定した場合のエ
ストリオール系ホルモンに関する濃度と蛍光信号の関
係、図５（Ｂ）は同測定でのエストラジオール系ホルモ
ンに関する濃度と蛍光信号の関係を示す図であり、図５
（Ａ）および図５（Ｂ）中で、共存する他方のホルモ
ン、すなわち、図５（Ａ）でのエストラジオール系ホル
モン濃度と、図５（Ｂ）でのエストリオール系ホルモン
濃度は、それぞれ（○）;1000pM,（△）;200pM,（□）;
40pM,（◇）;8pM, （▽）;1.6pM,（●）;0pMとし、濃度
は各ホルモン系の総濃度として表示した。FIG. 5 is a diagram showing the results of a sequential multiplex immunoassay for estradiol and estriol hormones in six mixed female hormones by a dual assay, and FIG. 5 (A) shows estriol hormones (ESG) at various concentrations. Triol: estriol-3-sulfate: estriol-3-glucuronic acid = 1: 1: 1) and estradiol hormones (estradiol: estradiol-3-sulfate: estradiol-
Relationship between the concentration of estriol hormone and the fluorescence signal when a sample containing 3-glucuronic acid = 1: 1: 1) was measured. FIG. 5 (B) shows the concentration and fluorescence signal of estradiol hormone in the same measurement. It is a figure which shows a relationship, FIG.
In (A) and FIG. 5 (B), the other coexisting hormones, ie, the estradiol hormone concentration in FIG. 5 (A) and the estriol hormone concentration in FIG. ); 1000pM, (△); 200pM, (□);
40 pM, (◇); 8 pM, (▽); 1.6 pM, (●); 0 pM, and the concentration was expressed as the total concentration of each hormone system.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 599145122 967 Ｅ．Ｐａｒｋ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｌ ｖｄ． ＃445，Ｂｏｉｓｅ ＩＤ 83706 −6700，ＵＳＡ (72)発明者 大村 直也 千葉県我孫子市我孫子1646番地 財団法人 電力中央研究所 我孫子研究所内 (72)発明者 スティーヴ ラッキー アメリカ合衆国 アイダホ州 83706− 6700 ボイシ， イー．パーク センター ブールバード ＃445 967 サピダイン インストルメント インコーポレイテッ ド内 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (71) Applicant 599 145 122 967 Park Center Bl vd. # 445, Boise ID 83706-6700, USA (72) Inventor Naoya Omura 1646 Abiko, Abiko-shi, Chiba Japan Electric Power Research Institute Abiko Research Institute (72) Inventor Steve Lucky 83706-6700 Boise, Idaho United States of America Boise, E. Park Center Boulevard # 445 967 Inside Sapidine Instrument Inc.

Claims (16)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 試料中における抗原の存在を検出する方
法であって、当該抗原に対し親和性の異なる２種ないし
それ以上の種類の抗体を用い、いずれの抗体濃度も抗原
への平衡解離定数に比べて十分に低く、抗体の結合がそ
れら自身の抗原結合親和性により支配される条件下で、
既知量のこれら複数種の抗体を、同時に前記試料に導入
して存在未知なる抗原と抗原抗体反応に供し、その後、
これら複数種の抗体と試料との反応混合液を、固定化さ
れた既知量の抗原と接触させ、固定化抗原に結合した抗
体量を、これら複数種の抗体に結合させた標識蛍光の蛍
光強度を測定することで検出し、その結果より試料中の
抗原の存在を検知することを特徴とする抗原の検出方
法。1. A method for detecting the presence of an antigen in a sample, wherein two or more kinds of antibodies having different affinities for the antigen are used, and the concentration of each antibody is determined by the equilibrium dissociation constant for the antigen. Under conditions where antibody binding is governed by their own antigen-binding affinities,
A known amount of these multiple antibodies is simultaneously introduced into the sample and subjected to an antigen-antibody reaction with an unknown antigen, and thereafter,
The reaction mixture of these plural kinds of antibodies and the sample is contacted with a known amount of immobilized antigen, and the amount of antibody bound to the immobilized antigen is determined by the fluorescence intensity of the labeled fluorescence bound to these plural kinds of antibodies. A method for detecting an antigen, comprising: detecting the presence of an antigen in a sample; 【請求項２】 前記抗原が、女性ホルモンであり、前記
複数種の抗体が当該女性ホルモンに対する抗ホルモン抗
体であることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。2. The detection method according to claim 1, wherein the antigen is a female hormone, and the plurality of antibodies are anti-hormonal antibodies against the female hormone. 【請求項３】 前記抗原が、外因性内分泌撹乱物質であ
り、前記複数種の抗体が女性ホルモンに対する抗ホルモ
ン抗体であることを特徴とする請求項１に記載の検出方
法。3. The detection method according to claim 1, wherein the antigen is an exogenous endocrine disrupting substance, and the plurality of antibodies are anti-hormone antibodies against a female hormone. 【請求項４】 前記複数種の抗体が蛍光標識抗体であ
り、固定化抗原に結合した抗体量を、当該複数種の蛍光
標識抗体の標識蛍光の蛍光強度を測定することで検出す
ることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の検
出方法。4. The method according to claim 1, wherein the plurality of kinds of antibodies are fluorescently labeled antibodies, and the amount of the antibodies bound to the immobilized antigen is detected by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescence of the plurality of kinds of fluorescently labeled antibodies. The detection method according to any one of claims 1 to 3. 【請求項５】 前記複数種の抗体を無標識一次抗体と
し、固定化抗原に結合した抗体量は、二次抗体として当
該複数種の一次抗体に特異的に結合する蛍光標識抗一次
抗体抗体を用い、固定化抗原に結合した一次抗体に特異
的に結合した該二次抗体の標識蛍光の蛍光強度を測定す
ることで検出することを特徴とする請求項１〜３のいず
れかに記載の検出方法。5. The method according to claim 5, wherein the plurality of kinds of antibodies are unlabeled primary antibodies, and the amount of the antibodies bound to the immobilized antigen is a fluorescently labeled anti-primary antibody which specifically binds to the plurality of kinds of primary antibodies as a secondary antibody. The detection according to any one of claims 1 to 3, wherein the detection is performed by measuring the fluorescence intensity of labeled fluorescence of the secondary antibody specifically bound to the primary antibody bound to the immobilized antigen. Method. 【請求項６】 前記抗原が、抗原自体とその抗原の誘導
体とを含むものであり、前記複数種の抗体として、抗原
自体およびその抗原の誘導体に対してほぼ同様の親和性
を示す抗体と、異なる親和性を示す抗体とを組み合わせ
て用いることにより、抗原自体と抗原の誘導体とを区別
して同時に検出するものである請求項１〜５のいずれか
に記載の検出方法。6. The method according to claim 1, wherein the antigen comprises the antigen itself and a derivative of the antigen, and the plurality of kinds of antibodies exhibit substantially the same affinity for the antigen itself and the derivative of the antigen. The detection method according to any one of claims 1 to 5, wherein an antigen itself and a derivative of the antigen are separately detected simultaneously by using a combination of antibodies having different affinities. 【請求項７】 試料中における複数の抗原の存在を検出
する方法であって、各抗原に対する抗体を組み合わせて
用い、いずれの抗体濃度もそれぞれの抗原への平衡解離
定数に比べて十分に低く、抗体の結合がそれら自身の抗
原結合親和性により支配される条件下で、既知量のこれ
ら複数の抗体を、同時に前記試料に導入して存在未知な
る各抗原と抗原抗体反応に供し、その後、これら複数種
の抗体と試料との反応混合液を、固定化された既知量の
各抗原と接触させ、固定化抗原に結合した抗体量を、こ
れら複数種の抗体に結合させた標識蛍光の蛍光強度を測
定することにより検出し、その結果より試料中の当該複
数の抗原の存在を検知することを特徴とする抗原の検出
方法。7. A method for detecting the presence of a plurality of antigens in a sample, comprising using a combination of antibodies against each antigen, wherein each antibody concentration is sufficiently lower than the equilibrium dissociation constant for each antigen. Under conditions where antibody binding is governed by their own antigen-binding affinities, known amounts of these multiple antibodies are simultaneously introduced into the sample and subjected to antigen-antibody reactions with each of the unknown antigens, A reaction mixture of a plurality of types of antibodies and a sample is brought into contact with a known amount of each immobilized antigen, and the amount of antibody bound to the immobilized antigen is determined by the fluorescence intensity of the labeled fluorescence bound to the plurality of types of antibodies. And detecting the presence of the plurality of antigens in the sample based on the results. 【請求項８】 前記複数の抗原が、いずれも女性ホルモ
ンであり、前記複数種の抗体が当該各女性ホルモンに対
する抗ホルモン抗体であることを特徴とする請求項７に
記載の検出方法。8. The detection method according to claim 7, wherein the plurality of antigens are all female hormones, and the plurality of antibodies are anti-hormone antibodies against the respective female hormones. 【請求項９】 前記複数の抗原が、いずれも外因性内分
泌撹乱物質であり、前記複数種の抗体が各女性ホルモン
に対する抗ホルモン抗体であることを特徴とする請求項
７に記載の検出方法。9. The detection method according to claim 7, wherein each of the plurality of antigens is an exogenous endocrine disrupting substance, and the plurality of antibodies are anti-hormone antibodies against each female hormone. 【請求項１０】 前記複数種の抗体が蛍光標識抗体であ
り、固定化抗原に結合した抗体量を、当該複数種の蛍光
標識抗体の標識蛍光の蛍光強度を測定することで検出す
ることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の検
出方法。10. The plural kinds of antibodies are fluorescently labeled antibodies, and the amount of the antibodies bound to the immobilized antigen is detected by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescence of the plural kinds of fluorescently labeled antibodies. The detection method according to any one of claims 7 to 9, wherein 【請求項１１】 前記複数種の抗体を無標識一次抗体と
し、固定化抗原に結合した抗体量は、二次抗体として当
該複数種の一次抗体に特異的に結合する蛍光標識抗一次
抗体抗体を用い、固定化抗原に結合した一次抗体に特異
的に結合した該二次抗体の標識蛍光の蛍光強度を測定す
ることで検出することを特徴とする請求項７〜９のいず
れかに記載の検出方法。11. The method according to claim 11, wherein the plurality of types of antibodies are unlabeled primary antibodies, and the amount of the antibodies bound to the immobilized antigen is a fluorescent-labeled anti-primary antibody which specifically binds to the plurality of types of primary antibodies as a secondary antibody. The detection according to any one of claims 7 to 9, wherein the detection is performed by measuring the fluorescence intensity of labeled fluorescence of the secondary antibody specifically bound to the primary antibody bound to the immobilized antigen. Method. 【請求項１２】 試料中における複数の抗原の存在を検
出する方法であって、各抗原に対する抗体を組み合わせ
て用い、いずれの抗体濃度もそれぞれの抗原への平衡解
離定数に比べて十分に低く、抗体の結合がそれら自身の
抗原結合親和性により支配される条件下で、既知量のこ
れら抗体を、前記試料の各アリコートにそれぞれ単独で
導入して、存在未知なる各抗原と抗原抗体反応に供し、
その後、これらの各抗体を含む複数のアリコートを、固
定化された既知量の双方の抗原を有するカラム内に順次
流し、各アリコートの流下毎に固定化抗原に結合した抗
体量を、これら抗体に結合させた標識蛍光の蛍光強度の
測定によって検出し、各抗体に由来する蛍光強度によっ
て、試料中の各抗原の存在を検知することを特徴とする
抗原の検出方法を特徴とする抗原の検出方法。12. A method for detecting the presence of a plurality of antigens in a sample, wherein a combination of antibodies to each antigen is used, and the concentration of each antibody is sufficiently lower than the equilibrium dissociation constant for each antigen. Under conditions in which antibody binding is governed by their own antigen binding affinity, known amounts of these antibodies are independently introduced into each aliquot of the sample and subjected to an antigen-antibody reaction with each of the unknown antigens. ,
Thereafter, a plurality of aliquots containing each of these antibodies were sequentially passed through a column having a known amount of both antigens immobilized thereon, and the amount of antibody bound to the immobilized antigen was determined for each antibody flowing down each aliquot. An antigen detection method characterized by detecting the presence of each antigen in a sample by detecting the fluorescence intensity of the bound labeled fluorescence and detecting the presence of each antigen in the sample by the fluorescence intensity derived from each antibody . 【請求項１３】 前記複数の抗原が、いずれも女性ホル
モンであり、前記複数種の抗体が当該各女性ホルモンに
対する抗ホルモン抗体であることを特徴とする請求項１
２に記載の検出方法。13. The method according to claim 1, wherein the plurality of antigens are all female hormones, and the plurality of antibodies are anti-hormone antibodies against the respective female hormones.
3. The detection method according to 2. 【請求項１４】 前記複数の抗原が、いずれも外因性内
分泌撹乱物質であり、前記複数種の抗体が各女性ホルモ
ンに対する抗ホルモン抗体であることを特徴とする請求
項１２に記載の検出方法。14. The detection method according to claim 12, wherein all of the plurality of antigens are exogenous endocrine disruptors, and the plurality of antibodies are anti-hormone antibodies against each female hormone. 【請求項１５】 前記複数種の抗体が蛍光標識抗体であ
り、固定化抗原に結合した抗体量を、当該複数種の蛍光
標識抗体の標識蛍光の蛍光強度を測定することで検出す
ることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれかに記載
の検出方法。15. The plurality of antibodies are fluorescently labeled antibodies, and the amount of the antibodies bound to the immobilized antigen is detected by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescence of the plurality of fluorescently labeled antibodies. The detection method according to any one of claims 12 to 14, wherein 【請求項１６】 前記複数種の抗体を無標識一次抗体と
し、固定化抗原に結合した抗体量は、二次抗体として当
該複数種の一次抗体に特異的に結合する蛍光標識抗一次
抗体抗体を用い、固定化抗原に結合した一次抗体に特異
的に結合した該二次抗体の標識蛍光の蛍光強度を測定す
ることで検出することを特徴とする請求項１２〜１４の
いずれかに記載の検出方法。16. The plural kinds of antibodies are used as unlabeled primary antibodies, and the amount of antibodies bound to the immobilized antigen is determined by using a fluorescent-labeled anti-primary antibody that specifically binds to the plural kinds of primary antibodies as a secondary antibody. The detection according to any one of claims 12 to 14, wherein the detection is performed by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescence of the secondary antibody specifically bound to the primary antibody bound to the immobilized antigen. Method.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US7038021B2 (en) 2004-01-08 2006-05-02 Kyoto Electronics Manufacturing Co., Ltd. Anti-dioxins monoclonal antibody suitable for assaying dioxins in environment and hybridoma producing the same
JP2008523358A (en) * 2004-12-07 2008-07-03 プレシセンス・エー／エス Carbohydrate detection sensor
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