JP2010002393A - Detection method of target material - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、臨床検査、獣医検査、食品検査、環境検査などの様々な分野で利用される、検体液中の標的物質を検出する方法に関するものである。 The present invention relates to a method for detecting a target substance in a sample liquid, which is used in various fields such as clinical tests, veterinary tests, food tests, and environmental tests.
検体液中に含まれる抗原、抗体、ＤＮＡなどの生体成分の検出は、感染症や癌などの疾病の診断や治療に広く用いられており、臨床上、非常に重要である。 Detection of biological components such as antigens, antibodies and DNA contained in a sample liquid is widely used for diagnosis and treatment of diseases such as infectious diseases and cancers, and is very important clinically.
標的物質を検出するための方法としては、標的物質と特異的に結合する物質を有する不溶性の担体（固相。基板や粒子などを含む）を用いて標的物質を捕捉して測定する方法、いわゆる固相測定法が広く用いられている。固相測定法は、競合法と非競合法（サンドイッチ法）に大別されるが、測定感度の点においてはサンドイッチ法が優っている。固相として基板を用いたサンドイッチ法では、まず標的物質の一方の領域（標的物質が抗原の場合はエピトープと呼ばれる）を特異的に認識し捕捉する第一の特異結合物質（標的抗原を抗体を用いて捕捉する場合には一次抗体と呼ばれる）を基板上に固定する。次に、この基板表面に、標的物質を含む検体液を接触させる。これにより、標的物質が第一の特異結合物質に捕捉される。次に、第一の特異結合物質により捕捉された標的物質の他方の領域を特異的に認識し、捕捉することができる第二の特異結合物質（標的抗原を抗体を用いて捕捉する場合には二次抗体と呼ばれる）を有する標識物質（例えば粒子）を添加する。これにより、第二の特異結合物質を有する標識物質が、基板表面に固定化された第一の特異結合物質に捕捉された標的物質に捕捉され、標的物質を介して標識物質が基板表面に固定化される。 As a method for detecting a target substance, a method for capturing and measuring a target substance using an insoluble carrier (solid phase, including substrates and particles) having a substance that specifically binds to the target substance, so-called Solid phase measurement methods are widely used. The solid-phase measurement method is roughly classified into a competitive method and a non-competitive method (sandwich method), but the sandwich method is superior in terms of measurement sensitivity. In the sandwich method using a substrate as a solid phase, first a first specific binding substance (target antigen as an antibody) that specifically recognizes and captures one region of the target substance (called an epitope when the target substance is an antigen). When used for capturing, it is called a primary antibody). Next, the specimen liquid containing the target substance is brought into contact with the substrate surface. Thereby, the target substance is captured by the first specific binding substance. Next, a second specific binding substance that can specifically recognize and capture the other region of the target substance captured by the first specific binding substance (when the target antigen is captured using an antibody) A labeling substance (called particles) having a secondary antibody) is added. As a result, the labeling substance having the second specific binding substance is captured by the target substance captured by the first specific binding substance immobilized on the substrate surface, and the labeling substance is immobilized on the substrate surface via the target substance. It becomes.
また、あらかじめ標的物質を含む検体液中に、第二の特異結合物質を有する粒子（標識物質）を加えて、“標的物質−第二の特異結合物質−粒子”複合体を形成させる。この複合体を基板上に固定化された第一の特異結合物質と接触させることによっても、標的物質を介して、標識物質を基板表面に固定化できる。 In addition, particles having a second specific binding substance (labeling substance) are added in advance to a sample solution containing the target substance to form a “target substance-second specific binding substance-particle” complex. The labeling substance can also be immobilized on the substrate surface via the target substance by bringing this complex into contact with the first specific binding substance immobilized on the substrate.
あるいは、標的物質を含む検体液中に、第一の特異結合物質を固定した固相と第二の特異結合物質を有する粒子（標識物質）を加え、所定時間反応させることによっても、標的物質を介して、標識物質を基板表面に固定化できる。 Alternatively, the target substance can also be obtained by adding a solid phase on which the first specific binding substance is immobilized and a particle (labeling substance) having the second specific binding substance to the sample liquid containing the target substance and reacting for a predetermined time. Thus, the labeling substance can be immobilized on the substrate surface.
近年、磁性粒子を固相としてではなく、標識物質として用いて標的物質濃度を測定する磁気バイオセンサが注目されている。磁気測定においては、バックグラウンドノイズの発生源が磁性体のみであるため、光学測定や電気化学測定と比較して、外部からのバックグラウンドノイズが低く、高感度検出に有用な手法である。 In recent years, magnetic biosensors that measure the concentration of a target substance using magnetic particles not as a solid phase but as a labeling substance have attracted attention. In the magnetic measurement, since the background noise is generated only from the magnetic material, the background noise from the outside is low as compared with the optical measurement and the electrochemical measurement, which is a useful technique for high-sensitivity detection.
磁気測定の手法を用いた標的物質の検出方法として、例えば特許文献１に記載の方法が挙げられる。特許文献１には、センサ素子上にある第一の特異結合物質を標的物質を介した第二の特異結合物質に標識された磁性粒子の磁気信号を、巨大磁気抵抗効果素子を用いて検出する方法が開示されている。 As a method for detecting a target substance using a magnetic measurement technique, for example, the method described in Patent Document 1 can be mentioned. In Patent Document 1, a magnetic signal of a magnetic particle labeled with a second specific binding substance via a target substance is detected using a giant magnetoresistive effect element. A method is disclosed.
また、特許文献２には、センサ素子上の第一の特異結合物質を標的物質を介した第二の特異結合物質に標識された磁性粒子の磁気信号を、半導体磁気抵抗効果素子を用いて検出する方法が開示されている。 In Patent Document 2, a magnetic signal of a magnetic particle labeled with a second specific binding substance via a target substance is detected using a semiconductor magnetoresistive effect element. A method is disclosed.
しかし、検体液中における標的物質は微量しか含まれていない、あるいは疾病の早期発見や再発防止のために微量での検出が必要とされる場合が多く、さらなる高感度および高精度での検出が望まれている。 However, there are many cases where the target substance in the sample solution contains only a trace amount, or detection in a trace amount is necessary for early detection of disease or prevention of recurrence, and detection with even higher sensitivity and accuracy is required. It is desired.
標的物質の検出における高感度化を目的として、特許文献３では、標的物質と標識物質との複合体をフィルターで濃縮して検出する方法が開示されている。より具体的には、特異結合物質を固定した表面積の大きな粒子状等の固相と、標的物質と、特異結合物質を結合させた標識物質と、を溶液中で接触させ、得られた複合体をフィルターでろ過し、フィルター上に濃縮された複合体を共焦点測定により検出している。 For the purpose of increasing sensitivity in detection of a target substance, Patent Document 3 discloses a method of detecting a complex of a target substance and a labeling substance by concentrating them with a filter. More specifically, a complex obtained by bringing a solid phase having a large surface area, on which a specific binding substance is immobilized, into contact with a target substance and a labeling substance bound with a specific binding substance in a solution. Is filtered through a filter, and the complex concentrated on the filter is detected by confocal measurement.
また、特許文献４では、通常のサンドイッチ法により、固相上に標的物質を介して標識物質を固定し、標識物質である酵素の反応により生成したチオール化合物を金基板上に選択的に結合させ、表面プラズモン共鳴法による測定を行うことで高感度化を目指している。
上述のように、標的物質の検出の高感度化を目的として、種々の試みがなされている。しかしながら、特許文献３に記載の方法では、複合体と未反応の固相とを分離するためには、フィルターのポアサイズを厳密に規定しなければならない。また、複合体のフィルター膜内への進入や流出を抑制するためには、フィルターのポアサイズの厳密な規定に加え、素材の選定も必要となる、といった問題があり、汎用性の高い手法とは言い難い。 As described above, various attempts have been made for the purpose of increasing the sensitivity of target substance detection. However, in the method described in Patent Document 3, in order to separate the complex from the unreacted solid phase, the pore size of the filter must be strictly defined. In addition, in order to suppress the entry and outflow of the complex into the filter membrane, there is a problem that it is necessary to select the material in addition to the strict regulation of the filter pore size. It's hard to say.
また、特許文献４に記載の表面プラズモン共鳴法による検出では、基板から数百ｎｍの範囲に存在する試料の影響を受けるため、検出基板表面に低分子を濃縮しても、感度向上の効果は得られ難い。 In addition, since the detection by the surface plasmon resonance method described in Patent Document 4 is affected by a sample existing within a range of several hundreds of nanometers from the substrate, even if low molecules are concentrated on the detection substrate surface, the effect of improving the sensitivity is It is difficult to obtain.
また、前述の磁気バイオセンサにおいても、さらなる高感度化のためには固相面積を増大させて第一の特異結合物質の固定量を増加させる必要があるが、固相がセンサ素子であるため、コストの上昇に直結してしまう。 Also in the above-described magnetic biosensor, it is necessary to increase the solid phase area and the amount of the first specific binding substance to be immobilized in order to further increase the sensitivity, but the solid phase is a sensor element. , Which leads directly to increased costs.
そこで、本発明は、上記課題点を克服することを目的になされたものであり、検出感度および検出精度に優れた、検体液中の標的物質の検出方法を提供するものである。 Therefore, the present invention has been made to overcome the above-described problems, and provides a method for detecting a target substance in a sample liquid that is excellent in detection sensitivity and detection accuracy.
本発明に係る標的物質の検出方法は、
（１）粒子を用いて標的物質の有無又は量を検出する方法において、
（ａ）特異結合物質を有する粒子と、標的物質と、２重特異性を有する捕捉体と、を含んで成る複合体を溶液中で形成する工程と、
（ｂ）前記複合体中の２重特異性を有する捕捉体と基板との間に結合を形成させ、前記複合体を前記基板上に固定する工程と、
（ｃ）前記基板上に固定された複合体中の粒子を検出することにより、前記標的物質の有無又は量を検出する工程と、
を有することを特徴とする標的物質の検出方法。
The method for detecting a target substance according to the present invention comprises:
(1) In a method for detecting the presence or amount of a target substance using particles,
(A) forming a complex comprising a particle having a specific binding substance, a target substance, and a capture body having a dual specificity in a solution;
(B) forming a bond between the capture body having dual specificity in the complex and the substrate, and immobilizing the complex on the substrate;
(C) detecting the presence or amount of the target substance by detecting particles in the complex immobilized on the substrate;
A method for detecting a target substance, comprising:
（２）前記２重特異性を有する捕捉体は、標的物質認識部位及び基板表面認識部位を有することを特徴とする（１）に記載の標的物質の検出方法。 (2) The target substance detection method according to (1), wherein the capturing body having the dual specificity has a target substance recognition site and a substrate surface recognition site.
（３）前記基板表面認識部位は、金に結合することを特徴とする（２）に記載の標的物質の検出方法。 (3) The method for detecting a target substance according to (2), wherein the substrate surface recognition site binds to gold.
（４）前記基板表面認識部位は、硫黄含有官能基を含むことを特徴とする（３）に記載の標的物質の検出方法。 (4) The method for detecting a target substance according to (3), wherein the substrate surface recognition site contains a sulfur-containing functional group.
（５）前記基板は、少なくともその表面に金を有することを特徴とする（３）又は（４）に記載の標的物質の検出方法。 (5) The method for detecting a target substance according to (3) or (4), wherein the substrate has gold on at least its surface.
（６）前記基板表面認識部位と前記基板との間の結合がチオレート結合であることを特徴とする（５）に記載の標的物質の検出方法。 (6) The method for detecting a target substance according to (5), wherein the bond between the substrate surface recognition site and the substrate is a thiolate bond.
（７）前記粒子が磁性粒子であることを特徴とする（１）乃至（６）のいずれかに記載の標的物質の検出方法。 (7) The method for detecting a target substance according to any one of (1) to (6), wherein the particles are magnetic particles.
（８）前記工程（ａ）の後であって前記工程（ｂ）の前に、磁場の印加によりＢ／Ｆ分離を行い、前記複合体を濃縮することを特徴とする（７）に記載の標的物質の検出方法。 (8) After the step (a) and before the step (b), B / F separation is performed by applying a magnetic field to concentrate the complex. A method for detecting a target substance.
（９）前記基板上に固定された複合体中の粒子を磁気信号により検出することを特徴とする（７）又は（８）に記載の標的物質の検出方法。 (9) The method for detecting a target substance according to (7) or (8), wherein particles in the complex fixed on the substrate are detected by a magnetic signal.
（１０）（１）に記載の検出方法を用いて標的物質を検出した後に、電位の印加による還元反応を利用して前記複合体を前記基板から外すことを特徴とする基板の再生方法。 (10) A method for regenerating a substrate, comprising: detecting a target substance using the detection method according to (1); and then removing the complex from the substrate using a reduction reaction by applying a potential.
（１１）前記２重特異性を有する捕捉体が前記とチオレート結合を形成することを特徴とする（１０）に記載の基板の再生方法。 (11) The method for regenerating a substrate according to (10), wherein the capturing body having the dual specificity forms a thiolate bond with the capturing body.
本発明により、検出感度および精度に優れた検出方法を提供することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide a detection method excellent in detection sensitivity and accuracy.
本発明に係る標的物質の検出方法は、粒子を用いて標的物質の有無又は量を検出する方法において、
（ａ）特異結合物質を有する粒子と、標的物質と、２重特異性を有する捕捉体と、を含んで成る複合体を溶液中で形成する工程と、
（ｂ）前記複合体中の２重特異性を有する捕捉体と基板との間に結合を形成させ、前記複合体を前記基板上に固定する工程と、
（ｃ）前記基板上に固定された複合体中の粒子を検出することにより、前記標的物質の有無又は量を検出する工程と、
を有することを特徴とする。
The method for detecting a target substance according to the present invention uses a particle to detect the presence or amount of a target substance,
(A) forming a complex comprising a particle having a specific binding substance, a target substance, and a capture body having a dual specificity in a solution;
(B) forming a bond between the capture body having dual specificity in the complex and the substrate, and immobilizing the complex on the substrate;
(C) detecting the presence or amount of the target substance by detecting particles in the complex immobilized on the substrate;
It is characterized by having.
本発明は、検出部位上の標識物質の数を検知することにより検体液中の標的物質の濃度を測定する方法である。本発明について図１を用いて簡単に説明する。本発明では、まず、特異結合物質を有する粒子と、標的物質と、基体表面認識部位と標的物質認識部位を有する捕捉体（２重特異性を有する捕捉体）と、を溶液中でサンドイッチ複合体を形成させる（図１（ａ））。次に、複合体中の２重特異性を有する捕捉体の基体表面認識部位と基板とを結合させ、複合体を基板表面に固定する（図１（ｂ））。そして、基板上の粒子を検出することにより、標的物質の存在又は量を検出する（図１（ｃ））。 The present invention is a method for measuring the concentration of a target substance in a sample liquid by detecting the number of labeling substances on a detection site. The present invention will be briefly described with reference to FIG. In the present invention, first, a sandwich complex in which a particle having a specific binding substance, a target substance, and a capturing body having a substrate surface recognition site and a target substance recognition site (capturing body having dual specificity) are contained in a solution. Is formed (FIG. 1A). Next, the substrate surface recognition site of the capturing body having double specificity in the complex is bound to the substrate, and the complex is fixed to the substrate surface (FIG. 1B). Then, the presence or amount of the target substance is detected by detecting particles on the substrate (FIG. 1 (c)).
従来技術ではまず基体上に第一の特異結合物質を結合させた後に標的物質を結合させ、さらに標識物質を有する第二の特異結合物質を結合させることで、基体上に複合体を形成する。従来技術の場合、第一の特異結合物質の量は基体の面積によって制限され、かつ基体上に結合させることによる活性の低下も生じるために、微量しか含まれていない標的物質を捕捉する効率が低下し、結果として感度が低下してしまう。これに対し、本発明においては、複合体を溶液中で形成させた後に基体上へ結合させる。これにより、第一の特異結合物質の量は制限されることなく、かつ溶液中で活性の高い状態で標的物質を捕捉することが可能である。従って、本発明により、従来技術に比べ標的物質を高感度に検出又は定量を行うことができる。また、本発明では捕捉体や粒子の充分量の添加により感度を向上させることができ、磁気バイオセンサのようにセンサ素子自体を固相として用いる検出系で問題となる、感度向上のためのセンサ素子面積の増大に伴うコストの上昇を回避することができる。 In the prior art, first, a first specific binding substance is bound on a substrate, a target substance is bound, and a second specific binding substance having a labeling substance is further bound to form a complex on the base. In the case of the prior art, since the amount of the first specific binding substance is limited by the area of the substrate, and the activity is decreased by binding on the substrate, the efficiency of capturing the target substance containing only a trace amount is increased. As a result, the sensitivity is lowered. In contrast, in the present invention, the complex is formed in a solution and then bonded to the substrate. Thereby, the amount of the first specific binding substance is not limited, and the target substance can be captured in a highly active state in the solution. Therefore, according to the present invention, the target substance can be detected or quantified with higher sensitivity than in the prior art. In addition, in the present invention, the sensitivity can be improved by adding a sufficient amount of a capturing body or particles, and a sensor for improving sensitivity, which is a problem in a detection system using the sensor element itself as a solid phase, such as a magnetic biosensor. An increase in cost associated with an increase in element area can be avoided.
以下、本発明について、詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
（標的物質）
本発明における標的物質は、存在あるいは量を検出する対象となる物質を言い、特に限定されるものではない。例えば、特異結合物質が存在する全ての物質である。したがって、標的物質は、生体物質に限られるものではなく、またその大きさも限定されるものではない。例えば、生体物質の標的物質としては、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体から選択される物質等が含まれる。生体物質として、具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原（擬似抗原も含む）、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプタ、酵素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖、ビタミン、スフィンゴ糖、又はスフィンゴ脂質等が挙げられる。また、これらの物質を産生する細菌や細胞そのものも生体物質に含まれる。これらのうち、抗原や擬似抗原、抗体、ホルモン、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖、ビタミン、遺伝子若しくは薬剤などの生物に含有される生体物質、又はその関連物質や人工的に合成された擬似生体物質であることが望ましい。
(Target substance)
The target substance in the present invention refers to a substance whose presence or amount is to be detected, and is not particularly limited. For example, all substances where specific binding substances exist. Therefore, the target substance is not limited to the biological substance, and the size thereof is not limited. For example, the target substance of the biological substance includes a substance selected from nucleic acids, proteins, sugar chains, lipids, and complexes thereof. Specific biological materials include DNA, RNA, aptamers, genes, chromosomes, cell membranes, viruses, antigens (including pseudoantigens), antibodies, lectins, haptens, hormones, receptors, enzymes, proteins, peptides, amino acids, sugars , Vitamins, sphingosaccharides, or sphingolipids. In addition, bacteria and cells themselves that produce these substances are also included in biological substances. Of these, biological substances contained in organisms such as antigens, pseudoantigens, antibodies, hormones, proteins, peptides, amino acids, sugars, vitamins, genes or drugs, or related substances or artificially synthesized pseudobiological substances It is desirable that
例えば、標的物質がある特定の核酸（標的核酸）である場合、標的核酸の由来元としては、例えば、人工合成産物、ヒトやマウスなどの動物、植物、細菌、真菌、古細菌、ウイルスなどの微生物等を挙げることができる。 For example, when the target substance is a specific nucleic acid (target nucleic acid), examples of the source of the target nucleic acid include artificial synthetic products, animals such as humans and mice, plants, bacteria, fungi, archaea, viruses, etc. Examples include microorganisms.
これらの標的物質は全血、血清、血漿、髄液、唾液、尿、涙液、汗若しくは間質液などの体液、糞便又は組織抽出液などに含まれる場合が多い。これらの標的物質を含む試料をそのまま検体液として使用しても良い。また、試料に対して、標的物質の抽出処理、分離処理、希釈処理又は精製処理等の各種処理を経て調製されたものを使用しても良い。 These target substances are often contained in body blood such as whole blood, serum, plasma, spinal fluid, saliva, urine, tears, sweat or interstitial fluid, feces, or tissue extract. A sample containing these target substances may be used as a sample liquid as it is. Moreover, you may use what was prepared through various processes, such as a target substance extraction process, a separation process, a dilution process, or a refinement | purification process, with respect to a sample.
（特異結合物質）
本発明における特異結合物質は、標的物質と特異的に結合する物質をいい、修飾あるいは標識されたものも含む。抗体、抗原、レセプター、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、レクチン、遺伝子などが挙げられるがこれに限るものではない。また、特異結合物質は、特異結合能を有するそれらのフラグメントあるいはサブユニットも含む。また、特異結合物質は、本発明に用いられる標識粒子の表面に固定される。
(Specific binding substance)
The specific binding substance in the present invention refers to a substance that specifically binds to a target substance, and includes those that are modified or labeled. Examples include, but are not limited to, antibodies, antigens, receptors, proteins, peptides, amino acids, lectins, and genes. The specific binding substance also includes those fragments or subunits having specific binding ability. Further, the specific binding substance is immobilized on the surface of the labeled particle used in the present invention.
なお、特異結合物質は標的物質の種類に応じて選択できる。例えば、特異的な結合対の組み合わせの一方が標的物質である場合に、特異結合物質として利用することができる。このような組み合わせとしては、抗原／抗体、相補的ＤＮＡ対、リセプター／リガンド、酵素／基質があげられる。例えば、標的物質が抗原である場合、それに特異的に結合する抗体を特異結合物質として用いることができる。 The specific binding substance can be selected according to the type of target substance. For example, when one of the specific binding pair combinations is a target substance, it can be used as a specific binding substance. Such combinations include antigen / antibody, complementary DNA pair, receptor / ligand, enzyme / substrate. For example, when the target substance is an antigen, an antibody that specifically binds to the antigen can be used as the specific binding substance.
（粒子）
本発明に用いる粒子は、その表面に前記特異結合物質を担持する。また、基板上に固定された粒子を適当な検出装置を用いて検出することにより、標的物質の量が測定される。また、溶液中に分散することが好ましい。従来の固相測定法で使用されてきたものでも、あるいは新しいものでもよく、材質、形状、大きさなどによって限定されるものではない。粒子の表面積は基板表面積の２倍以上であることが好ましい。
(particle)
The particles used in the present invention carry the specific binding substance on the surface thereof. Further, the amount of the target substance is measured by detecting the particles fixed on the substrate using an appropriate detection device. Moreover, it is preferable to disperse | distribute in a solution. The material used in the conventional solid-phase measurement method or a new one may be used, and it is not limited by the material, shape, size, or the like. The surface area of the particles is preferably at least twice the surface area of the substrate.
粒子としては、例えば、顕微鏡により検出可能であることが望ましい。また、粒子の表面及び／又は内部に標識物質を有し、その標識物質により粒子が検出可能であることも望ましい。また、粒子は、検体液や分散液等の液媒体（例えば緩衝液）に対して不溶性であることが望ましい。また、本発明で用いられる粒子は、その表面に前記特異結合物質を担持できる構成を有することが望ましい。 The particles are desirably detectable by a microscope, for example. It is also desirable that the particle has a labeling substance on the surface and / or inside thereof, and the particle can be detected by the labeling substance. The particles are preferably insoluble in a liquid medium (for example, a buffer solution) such as a sample liquid or a dispersion liquid. Moreover, it is desirable that the particles used in the present invention have a configuration capable of supporting the specific binding substance on the surface thereof.
ここで、前記顕微鏡としては、光学顕微鏡、電子顕微鏡又は原子間力顕微鏡などが挙げられる。顕微鏡で検出される場合、粒子は少なくとも５ｎｍ以上の直径を有する粒子であることが好ましい。 Here, examples of the microscope include an optical microscope, an electron microscope, and an atomic force microscope. When detected with a microscope, the particles are preferably particles having a diameter of at least 5 nm.
粒子の材料としては、特に限定されるものではないが、例えば、ポリスチレン、ナイロン、ガラス、ラテックス、金属、多孔質体又はデキストランなどの糖誘導体等が挙げられる。他の例としては、ポリ乳酸、アガロース、キトサン、アルブミン又はデンプン等も挙げることができる。また、これらの粒子を金属で被覆したものを用いることもできる。また、多孔質体であってもよい。また、磁性物質を含む粒子（磁性粒子）、蛍光物質を含む粒子（蛍光粒子）を用いることもできる。特に、磁性粒子を用いることにより、磁場の印加によるＢ／Ｆ分離が可能であり、測定精度をさらに向上させることができるため好ましい。 Although it does not specifically limit as a material of particle | grains, For example, sugar derivatives, such as a polystyrene, nylon, glass, latex, a metal, a porous body, or a dextran, etc. are mentioned. Other examples include polylactic acid, agarose, chitosan, albumin or starch. Moreover, what coat | covered these particles with the metal can also be used. Moreover, a porous body may be sufficient. In addition, particles containing a magnetic substance (magnetic particles) and particles containing a fluorescent substance (fluorescent particles) can also be used. In particular, it is preferable to use magnetic particles because B / F separation by applying a magnetic field is possible and the measurement accuracy can be further improved.
磁性粒子としては、粒子の表面及び／又は内部に磁性物質を有する構成でもよく、磁性物質のみからなる構成でもよい。例えば、磁性物質を、ポリスチレンやシリカ、ラテックス等の前記材料で覆った構成としてもよいし、磁性物質を混合した材料を粒子状に形成した構成としてもよい。磁性物質としては、磁場の印加により磁気信号を検出できるものであれば良く、常磁性、超常磁性を示す磁性粒子などを用いることができる。磁性粒子としては、例えばフェライトやマグネタイトといった鉄酸化物や金属酸化物の粒子を利用できる。また、これらの粒子や高分子材料中にこれらの粒子を封入あるいは分散させたものをコアとして、高分子層を被覆した被覆物も用いることができる。磁性粒子の大きさは、検出素子の形状、大きさ、あるいは用途によって様々に選択することが可能であるが、一般的に数十ナノメートルから数百マイクロメートルの直径を有するものが用いられる。ただし、特異結合物質の固定量を増加させるために粒径が小さく、かつ磁力による濃縮や洗浄および磁気信号の検出を行うために飽和磁化の高いものが望ましい。 As a magnetic particle, the structure which has a magnetic substance on the surface and / or inside of a particle | grain may be sufficient, and the structure which consists only of a magnetic substance may be sufficient. For example, the magnetic material may be covered with the material such as polystyrene, silica, and latex, or the material mixed with the magnetic material may be formed into particles. Any magnetic substance may be used as long as it can detect a magnetic signal by applying a magnetic field, and magnetic particles exhibiting paramagnetism or superparamagnetism can be used. As the magnetic particles, for example, iron oxide or metal oxide particles such as ferrite and magnetite can be used. Moreover, the coating | coated which coat | covered the polymer layer can also be used for these particles and what made these particle | grains encapsulate or disperse | distribute in a polymer material as a core. The size of the magnetic particles can be variously selected depending on the shape, size, or application of the detection element, but those having a diameter of several tens of nanometers to several hundreds of micrometers are generally used. However, it is desirable that the particle size is small in order to increase the fixed amount of the specific binding substance and that the saturation magnetization is high in order to perform concentration and washing by magnetic force and detection of magnetic signals.
本発明に用いられる粒子は、標識物質により標識されることができる。粒子が標識物質を有する構成としておくことにより、その標識物質を検出することで、基板に固定された粒子を測定することができる。例えば、前記蛍光粒子のように、標識物質として蛍光材料を選択することができる。蛍光材料としては、例えば、フルオロセイン誘導体、シアニン系色素、ローダミン系色素、クマリン系色素、ダンシル型色素、アントラセン誘導体、ピレン誘導体又は希土類金属錯体などが挙げられる。また、標識物質として発光材料を用い、粒子表面あるいは内部に発光材料を結合させておくこともできる。発光材料としては、例えば、アクリジウム系化合物、ルミノール系化合物、ルシゲニン系化合物、ロフィン系化合物、ルテニウム系化合物などがあげられる。さらに、標識物質として酵素を用い、粒子表面に酵素を結合させておくこともできる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどがあげられる。この場合、酵素活性を色原性基質を用いた場合には生成物を光学的な、また生成物が電気化学的に活性な物質である場合には電気化学的な方法で測定することにより、粒子を検出することができる。 The particles used in the present invention can be labeled with a labeling substance. By setting the particles to have a labeling substance, the particles fixed to the substrate can be measured by detecting the labeling substance. For example, a fluorescent material can be selected as a labeling substance like the fluorescent particles. Examples of the fluorescent material include fluorescein derivatives, cyanine dyes, rhodamine dyes, coumarin dyes, dansyl dyes, anthracene derivatives, pyrene derivatives, rare earth metal complexes, and the like. Further, a luminescent material can be used as a labeling substance, and the luminescent material can be bonded to the particle surface or inside. Examples of the light emitting material include an acridium compound, a luminol compound, a lucigenin compound, a lophine compound, and a ruthenium compound. Furthermore, an enzyme can be bound to the particle surface using an enzyme as a labeling substance. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase, peroxidase, acetylcholinesterase, β-D-galactosidase, glucose oxidase and the like. In this case, the enzyme activity is measured optically when a chromogenic substrate is used, or electrochemically when the product is an electrochemically active substance. Particles can be detected.
また、粒子の表面には、上述のように、前記特異結合物質が固定化される。特異結合物質を粒子表面に固定化させる方法としては、既に多くの方法が提案されており、特に制限されるものではなく、特異結合物質や粒子の表面状態によって適宜選択することができる。例えば、粒子への特異結合物質の固定化方法は、化学結合もしくはアフィニティー結合を利用して行うことができる。ここで、化学結合とは、原子間やイオン間で電子の授受を伴って形成された結合であり、例えば、共有結合、配位結合、金属結合などが挙げられる。化学結合を利用する方法としては、例えば、縮合剤を用いて固定する方法、シラン剤を用いて固定する方法、アルデヒドを介して固定する方法、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによりアミド結合を介して固定する方法、マレイミドによりチオール結合で固定する方法、ニッケル錯体とリガンド分子内のヒスチジン部位の錯体形成によって固定する方法などが挙げられる。また、アフィニティー結合を利用する方法としては、ビオチン−アビジン結合で固定する方法、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを介して固定する方法、抗原−抗体反応で固定する方法、これらを組み合わせたサンドイッチ結合を利用して固定する方法、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリダイズにより固定する方法、アプタマーを介してリガンド分子を固定する方法などを用いることができる。また、スペーサー分子をはさんで結合させる方法も知られている。なお、特異結合物質を固定する際は、特異結合物質が標的物質の検出や分離の用途において求められる活性を損なわないように変性が起こらない程度の緩和な温度および化学的条件下で行われることが望ましい。 Further, as described above, the specific binding substance is immobilized on the surface of the particle. Many methods have already been proposed as a method for immobilizing the specific binding substance on the particle surface, and is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the specific binding substance and the surface state of the particle. For example, the method for immobilizing a specific binding substance on particles can be performed using chemical binding or affinity binding. Here, the chemical bond is a bond formed with transfer of electrons between atoms or ions, and examples thereof include a covalent bond, a coordinate bond, and a metal bond. Examples of the method using a chemical bond include a method of fixing using a condensing agent, a method of fixing using a silane agent, a method of fixing via an aldehyde, and fixing via an amide bond with N-hydroxysuccinimide ester. Examples thereof include a method, a method of fixing by maleimide with a thiol bond, and a method of fixing by forming a complex between a nickel complex and a histidine site in a ligand molecule. In addition, as a method of using affinity binding, a method of fixing by biotin-avidin binding, a method of fixing via Protein A or Protein G, a method of fixing by antigen-antibody reaction, or a sandwich binding that combines these methods is used. And the like, a method of fixing by DNA-DNA, DNA-PNA hybridization, a method of fixing a ligand molecule via an aptamer, and the like can be used. Also known is a method of binding spacer molecules between them. In addition, the specific binding substance should be immobilized under a mild temperature and chemical conditions that do not cause denaturation so that the specific binding substance does not impair the activity required for the detection and separation of the target substance. Is desirable.
（２重特異性を有する捕捉体）
本発明に用いる２重特異性を有する捕捉体は、標的物質を特異的に捕捉する部位と、基体に結合する部位の両方を有するものであれば良い。ここでは、標的物質として抗原、および抗原を特異的に認識する部位として抗体を用いた場合を例として説明する。
(Capturing body having dual specificity)
The capturing body having dual specificity used in the present invention may be any one that has both a site that specifically captures the target substance and a site that binds to the substrate. Here, a case where an antigen is used as a target substance and an antibody is used as a site that specifically recognizes the antigen will be described as an example.
Ｘ１−Ｒ−Ｘ２の二官能性構造を有する化合物で修飾した抗体を用いることで、抗体が抗原を特異的に認識し、前記二官能性化合物のＸ１の官能基が金などの基板表面に選択的に結合する。例えばＸ１は、チオール基、スルフィド基、ジスルフィド基、ポリスルフィド基などの硫黄含有官能基であり、金、銀、銅、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウムなどの金属や、酸化インジウムのような酸化物や、ＧａＡｓやＩｎＰのような半導体の基板に結合する官能基である。また、Ｘ２はアミノ基、カルボキシル基、活性エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基などの、標的物質を特異的に補足する抗体などを修飾するための官能基である。ＲはＸ１とＸ２をつなぐリンカーであり、その構造や長さなどによって限定されるものではない。一般的には、Ｒには炭素数が１〜２０程度のアルキル鎖やエチレンオキシドユニット数が１〜５０程度のポリエチレングリコール鎖あるいはこれらの誘導体が用いられる。前記二官能性化合物の、標的物質を特異的に捕捉する抗体などへの修飾は、公知の方法により行うことができる。例えば抗体へＸ２がアミノ基の二官能性の化合物を修飾する場合には、グルタルアルデヒドによる架橋法を用いることで、抗体のアミノ基へ修飾することができる。あるいは抗体のカルボキシル基を水溶性のカルボジイミドあるいはさらにＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような活性エステル化合物を用いて活性化することでも、二官能性化合物のアミノ基とアミド結合を形成させることができる。Ｘ２がカルボキシル基の場合には抗体のアミノ基と同様の方法により、アミド結合を形成させることができる。あるいは、Ｘ２としてあらかじめ活性エステル基を持つ二官能性化合物を用いることで、より簡便に抗体のアミノ基とのアミド結合を形成させることができる。さらに、Ｘ２としてマレイミド基を有する場合には、抗体のチオール基とチオエーテル結合を形成させることができる。 By using an antibody modified with a compound having a bifunctional structure of X1-R-X2, the antibody specifically recognizes the antigen, and the functional group of X1 of the bifunctional compound is selected on the substrate surface such as gold Join. For example, X1 is a sulfur-containing functional group such as a thiol group, a sulfide group, a disulfide group, or a polysulfide group. A metal such as gold, silver, copper, platinum, palladium, rhodium, or ruthenium, an oxide such as indium oxide, , A functional group that binds to a semiconductor substrate such as GaAs or InP. X2 is a functional group for modifying an antibody that specifically supplements a target substance, such as an amino group, a carboxyl group, an active ester group, a maleimide group, an isocyanate group, or an isothiocyanate group. R is a linker that connects X1 and X2, and is not limited by the structure or length thereof. In general, R is an alkyl chain having about 1 to 20 carbon atoms, a polyethylene glycol chain having about 1 to 50 ethylene oxide units, or a derivative thereof. Modification of the bifunctional compound to an antibody that specifically captures a target substance can be performed by a known method. For example, when a bifunctional compound in which X2 is an amino group is modified to an antibody, it can be modified to the amino group of the antibody by using a crosslinking method with glutaraldehyde. Alternatively, the amide bond can be formed with the amino group of the bifunctional compound by activating the carboxyl group of the antibody with an active ester compound such as water-soluble carbodiimide or N-hydroxysuccinimide. When X2 is a carboxyl group, an amide bond can be formed by the same method as the amino group of the antibody. Alternatively, by using a bifunctional compound having an active ester group in advance as X2, an amide bond with the amino group of the antibody can be formed more simply. Furthermore, when it has a maleimide group as X2, it can form a thioether bond with the thiol group of the antibody.
また、２種以上の抗原を認識する能力を持った人工抗体分子を用いることもできる。代表例としては、特開２００５−３１２４４６号公報に記載の２価抗体であるＤｉａｂｏｄｙ分子があげられる。この２種以上の抗原結合能のうち１つ以上を標的物質に対する結合能を持つ様に構成し、かつ、他の１つ以上の抗原結合能を金基板に対する結合能をもつ様に構成する。このような多価抗体分子は、抗原結合能とセンシング部位表面結合能を同時に発揮することができる。 Artificial antibody molecules having the ability to recognize two or more types of antigens can also be used. A typical example is a diabody molecule that is a divalent antibody described in JP-A-2005-31446. One or more of these two or more antigen binding capacities are configured to have a binding capability to a target substance, and the other one or more antigen binding capacities are configured to have a binding capability to a gold substrate. Such a multivalent antibody molecule can simultaneously exhibit antigen binding ability and sensing site surface binding ability.
さらに、ＭＨＧＫＴＱＡＴＳＧＴＩＱＳの配列に代表される金結合ペプチドを利用することもできる。例えば、大腸菌に発現させた、あるいは依頼合成により購入した、アビジンのＣ末端に（ＭＨＧＫＴＱＡＴＳＧＴＩＱＳ）ｎ（ｎ＝１〜１０）の配列を融合させたものを用い、これにビオチンが修飾された任意の抗体を結合させることでも、標的物質を特異的に補足する部位と、金基板に結合する部位の両方を有する捕捉体を得ることができる。同様の方法で、非特許文献１中に記載されているような配列を有するペプチドを用いることで、金以外の金属、酸化物、半導体などの基板に結合する部位を有する捕捉体を得ることができる。 Furthermore, gold-binding peptides represented by the sequence of MHGKTQATSGTIQS can also be used. For example, using an Avidin C-terminus fused with the sequence of (MHGKTQATSGTIQS) n (n = 1 to 10), expressed in E. coli, or purchased by requested synthesis, and any biotin modified By binding the antibody, a capturing body having both a site that specifically captures the target substance and a site that binds to the gold substrate can be obtained. By using a peptide having a sequence as described in Non-Patent Document 1 in the same manner, a capturing body having a site that binds to a substrate such as a metal other than gold, an oxide, or a semiconductor can be obtained. it can.
前記捕捉体はいずれも基板材料を認識する部位を有するものであるが、基板表面を任意の物質で被覆し、この物質を特異的に認識する捕捉体を用いても良い。例えば、基板表面をグルコースあるいはマルトースで被覆し、グルコース結合タンパク質あるいはマルトース結合タンパク質に抗体を結合させたものも組み合わせて用いることができる。同様に、一般的にダグと呼ばれる物質を利用することもできる。基板表面をアビジンで被覆することにより、ビオチンタグを結合させた抗体を用いることができる。基板表面をグルタチオンで被覆した場合では、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグ融合タンパク質に抗体を結合させたものと組み合わせて用いれば良い。ヒスチジンタグ融合タンパク質に抗体を結合させたものを用いることで、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+などの二価の金属イオンの錯体で被覆した基体に結合させることができる。前述の二官能性化合物への抗体の結合と同様の方法を用いることで、前記グルコース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、ビオチンタグ、ＧＳＴタグ融合タンパク質、ヒスチジンタグ融合タンパク質に抗体を結合させることができる。
本発明に用いる２重特異性を有する捕捉体は、標的物質認識部位及び基板表面認識部位を有する。標的物質認識部位とは、標的物質と特異的に結合を形成する部位のことである。また、基板表面認識部位とは、基板表面と特異的に結合を形成する部位のことである。本発明においては、まず、液相中で「粒子−標的物質−２重特異性を有する捕捉体」を含むサンドイッチ複合体を形成する。その後、２重特異性を有する捕捉体の基板表面認識部位と基板との間に結合を形成し、複合体を基板に固定化する。 The capturing body having dual specificity used in the present invention has a target substance recognition site and a substrate surface recognition site. The target substance recognition site is a site that specifically forms a bond with the target substance. The substrate surface recognition site is a site that specifically forms a bond with the substrate surface. In the present invention, first, a sandwich complex including “particle—target substance—capturing body having dual specificity” is formed in the liquid phase. Thereafter, a bond is formed between the substrate surface recognition site of the capturing body having double specificity and the substrate, and the complex is immobilized on the substrate.
基板表面認識部位を利用することで、溶液中で形成されかつ他の夾雑物質と共に分散している複合体を選択的に基板表面に結合させて測定することができ、高感度に標的物質の定量を行うことができる。 By using the substrate surface recognition site, the complex formed in the solution and dispersed together with other contaminants can be selectively bound to the substrate surface and measured, and the target substance can be quantified with high sensitivity. It can be performed.
例えば、標的物質が抗原である場合には、２重特異性を有する捕捉体としては、その抗原と特異的に結合を形成し、かつチオール基を有する抗体を用いることができる。この場合、抗原と特異的に結合を形成する部分が標的物質認識部位であり、チオール基が基板表面認識部位となる。この２重特異性を有する捕捉体を用いることにより、抗体部分が抗原を特異的に認識して結合を形成でき、チオール基が金などの基板表面に結合する。このような標的物質認識部位を有する分子への、基板表面認識部位の導入は、生体分子の固相表面への固定等で汎用されている手法により可能であり、標的物質に応じた２重特異性を有する捕捉体の調製は容易に実現できる。 For example, when the target substance is an antigen, an antibody that specifically forms a bond with the antigen and has a thiol group can be used as the capture body having dual specificity. In this case, the part that specifically forms a bond with the antigen is the target substance recognition site, and the thiol group is the substrate surface recognition site. By using the capturing body having the dual specificity, the antibody portion can specifically recognize the antigen to form a bond, and the thiol group binds to the substrate surface such as gold. Introduction of a substrate surface recognition site to a molecule having such a target substance recognition site can be performed by a technique commonly used for immobilizing biomolecules on a solid phase surface, etc. Preparation of a capturing body having properties can be easily realized.
また、２種以上の抗原を認識する能力を持った人工抗体分子を用いることができる。代表例としては、２価抗体であるＤｉａｂｏｄｙ分子があげられる。この２種以上の抗原結合能のうち１つ以上を標的物質に対する結合能を持つ様に構成し、かつ、他の１つ以上の抗原結合能をセンシング部位表面の構成材料に対する結合能をもつ様に構成する。このような多価抗体分子は、抗原結合能とセンシング部位表面結合能を同時に発揮することができる。 Artificial antibody molecules having the ability to recognize two or more types of antigens can be used. A typical example is a diabody molecule that is a divalent antibody. One or more of these two or more antigen binding capacities are configured to have a binding ability to a target substance, and the other one or more antigen binding capacities have a binding capacity to a constituent material of the sensing site surface. Configure. Such a multivalent antibody molecule can simultaneously exhibit antigen binding ability and sensing site surface binding ability.
本発明においては、基板の材料として金を用い、２重特異性を有する捕捉体における基板表面認識部位が硫黄含有官能基であることが好ましい。この構成とすることにより、硫黄含有官能基は金基板に特異的に結合するため、溶液中で形成された複合体を基板上に選択的に結合させることが可能である。また、チオレート結合により金基板上に結合した硫黄含有官能基は、電位の印加による還元反応により容易に解離させることが可能である。このため、基板をセンサ素子として用いた場合にはセンサ素子を再生させて繰り返し使用できる。これにより、同一のセンサ素子を用いた標的物質の検出が可能となり、異なるセンサ素子を用いた場合に問題となる、センサ素子自体の特性のばらつきによる測定精度の低下を回避することができ、高精度の測定を行うことが可能となる。さらに、高価なセンサ素子を用いる場合には、コストを低下することもできるという利点がある。 In the present invention, it is preferable that gold is used as the material of the substrate, and the substrate surface recognition site in the capturing body having double specificity is a sulfur-containing functional group. With this configuration, since the sulfur-containing functional group specifically binds to the gold substrate, it is possible to selectively bind the complex formed in the solution onto the substrate. Further, the sulfur-containing functional group bonded on the gold substrate by a thiolate bond can be easily dissociated by a reduction reaction by applying a potential. Therefore, when the substrate is used as a sensor element, the sensor element can be regenerated and used repeatedly. This makes it possible to detect a target substance using the same sensor element, avoiding a decrease in measurement accuracy due to variations in characteristics of the sensor element itself, which is a problem when using different sensor elements, It becomes possible to measure the accuracy. Further, when an expensive sensor element is used, there is an advantage that the cost can be reduced.
（基板）
基板としては、その材料、構成は特に限定されないが、各種の測定方法に応じて、光透過性を有するものや、電極として利用が可能な金属等の導電性基板や表面に金属等の導電性薄膜が形成された基板、光学的特性の変化を検出するための誘電体基板や表面に誘電体薄膜が形成された基板等が用いられる。硫黄含有官能基が特異的かつ強固な結合を形成できるため、基板を金で形成する、又は基板を金膜で覆うことが好ましい。標識物質として酵素を用いる場合には、酵素反応による生成物をまた、磁性粒子を特異結合物質を担持させる粒子かつ標識物質として用いる場合にも、基板自体をセンサ素子として用いる構成とすることができる。センサ素子としては、磁性粒子がセンサ表面に集まることによって起きる磁界の変化を出力信号（電圧の変換や電流の変化）として取り出せるものであればよい。このようなセンサ素子としては、磁気インピーダンス効果素子、ホール効果素子、磁気抵抗効果素子、コイル、超伝導量子干渉素子などを挙げることができる。
(substrate)
The material and configuration of the substrate are not particularly limited. However, depending on various measurement methods, the substrate is light transmissive, and can be used as an electrode. A substrate on which a thin film is formed, a dielectric substrate for detecting a change in optical characteristics, a substrate on which a dielectric thin film is formed, or the like is used. Since the sulfur-containing functional group can form a specific and strong bond, it is preferable to form the substrate with gold or cover the substrate with a gold film. When an enzyme is used as the labeling substance, the substrate itself can be used as a sensor element even when the product of the enzyme reaction is used as the labeling substance and the particle carrying the specific binding substance. . Any sensor element may be used as long as it can take out a change in magnetic field caused by magnetic particles gathering on the sensor surface as an output signal (voltage conversion or current change). Examples of such a sensor element include a magneto-impedance effect element, a Hall effect element, a magneto-resistance effect element, a coil, and a superconducting quantum interference element.
（濃縮効果）
本発明において濃縮とは、特異結合物質を有する粒子−標的物質−２重特異性を有する捕捉体を含むサンドイッチ複合体を、２重特異性を有する捕捉体のセンサ表面認識能を利用して、複合体を形成していない特異結合物質を有する標識粒子や標的物質および検体液中に含まれる標的物質以外の夾雑物質から選別し、前記複合体を検出部位に選択的に結合させることを示す。特に、複合体を形成していない標識粒子が検出部位に存在すると、検出時にバックグラウンドノイズとなり測定感度および精度の低下を引き起こすため、選別することにより測定感度および精度の向上を実現できる。
(Concentration effect)
In the present invention, the term “concentration” refers to a sandwich complex including a particle-target substance having a specific binding substance-capture having bispecificity, and using a sensor surface recognition ability of the capture body having bispecificity, The labeling particles having a specific binding substance that does not form a complex, the target substance, and contaminants other than the target substance contained in the sample liquid are selected, and the complex is selectively bound to the detection site. In particular, if labeled particles that do not form a complex are present at the detection site, background noise occurs during detection, causing a reduction in measurement sensitivity and accuracy. Therefore, it is possible to improve measurement sensitivity and accuracy by sorting.
標識粒子として磁性粒子を用いる場合には、磁場の印加によるＢＦ分離を行うことにより、複合体を形成していない標的物質や検体液中に含まれる他の夾雑物質に加え、複合体を形成していない２重特異性を有する捕捉体を洗浄により除去することができる。さらに、２重特異性を有する捕捉体のセンサ表面認識能を利用することで、複合体を形成していない標識粒子から選別して、サンドイッチ複合体のみを検出部位に濃縮して結合させることができる。標識粒子として磁性粒子を用いた方が、磁性粒子以外を用いた場合に比べ、より効果的な濃縮が可能であり、検出部位上において単位面積当たりに存在する複合体の数を増大できるため、さらなる測定感度および精度の向上を実現できる。 When magnetic particles are used as the labeling particles, BF separation is performed by applying a magnetic field to form a complex in addition to the target substance not forming the complex and other contaminants contained in the sample liquid. Uncaptured traps with dual specificity can be removed by washing. Furthermore, by utilizing the sensor surface recognition ability of the capture body having a dual specificity, only the sandwich complex can be concentrated and bound to the detection site by selecting from the labeled particles not forming the complex. it can. Compared to the case of using magnetic particles other than the magnetic particles, it is possible to concentrate more effectively, and the number of complexes existing per unit area on the detection site can be increased. Further improvement in measurement sensitivity and accuracy can be realized.
また本発明における濃縮は、２重特異性を有する捕捉体のセンサ素子表面に対する特異的な認識能を利用しており、特異結合物質を有する標識粒子−標的物質−２重特異性を有する捕捉体から成るサンドイッチ複合体を含有する溶液をセンサ素子と接触させるだけで達成されるため、フィルター等を用いた従来の濃縮法のように厳密な濃縮条件の選定を必要としない汎用性の高い手法である。 Further, the concentration in the present invention utilizes the specific recognition ability of the capturing body having a dual specificity to the sensor element surface, and the capturing body having a labeled particle having a specific binding substance, a target substance and a bispecificity. This is achieved by simply contacting the solution containing the sandwich complex consisting of the sensor element with the sensor element, so that it is a highly versatile technique that does not require selection of strict concentration conditions as in the conventional concentration method using a filter or the like. is there.
（検出方式）
本発明の検出方法において用いる検出方式は、基板に固定された粒子の数量を検知することにより、検体液中の標的物質の濃度を測定できる方法であればよい。例えば、粒子の結合に伴う基板表面の屈折率あるいは誘電率の変化を光学的な手法により検出することができる。また、粒子が金属粒子、金属で被覆された各種粒子の場合では、これらの粒子による吸収スペクトル変化を光学的な手法により検出することもできる。粒子が蛍光粒子の場合には、蛍光物質から生じる蛍光強度を検出すれば良い。粒子が磁性粒子の場合は、バックグラウンドノイズが低い磁気信号を検出する方式が好ましく、センサ素子としては、磁気抵抗効果素子、ホール効果素子、磁気インピーダンス素子、コイル、超伝導量子干渉素子が望ましい。
(Detection method)
The detection method used in the detection method of the present invention may be any method that can measure the concentration of the target substance in the sample liquid by detecting the number of particles fixed on the substrate. For example, a change in the refractive index or dielectric constant of the substrate surface due to particle bonding can be detected by an optical technique. Further, in the case where the particles are metal particles or various particles coated with metal, the change in absorption spectrum due to these particles can be detected by an optical technique. When the particles are fluorescent particles, the fluorescence intensity generated from the fluorescent material may be detected. When the particles are magnetic particles, a method of detecting a magnetic signal with low background noise is preferable, and the sensor element is preferably a magnetoresistive element, a Hall effect element, a magnetic impedance element, a coil, or a superconducting quantum interference element.
（センサ素子の再生方法）
標的物質の検出において使用される基板は繰り返し使用できることが望ましい。特に基板がセンサ素子として機能する場合は繰り返し使用可能であることが望まれる。また、基板がセンサ素子として機能する場合、電気化学的、光学的、磁気的な手法により、標的物質の検出を行う際に、センサ素子自体の電気化学的、光学的、磁気的な特性の変化は測定精度の低下につながる。したがって、同一のセンサ素子を用いて標的物質の検出を行うことが、高精度の測定のために望ましい。また、高価なセンサ素子を使用する場合には、コストの面からも繰り返し使用できることが望ましい。
(Sensor element regeneration method)
It is desirable that the substrate used in the detection of the target substance can be used repeatedly. In particular, when the substrate functions as a sensor element, it is desirable that it can be used repeatedly. In addition, when the substrate functions as a sensor element, the electrochemical, optical, and magnetic characteristics of the sensor element change when the target substance is detected by an electrochemical, optical, or magnetic method. Leads to a decrease in measurement accuracy. Therefore, it is desirable for highly accurate measurement to detect a target substance using the same sensor element. Moreover, when using an expensive sensor element, it is desirable that it can be used repeatedly from the viewpoint of cost.
測定精度の向上およびコストの削減のための、基板の再生方法として、例えば、市販の表面プラズモン共鳴測定装置では塩酸の添加により標的物質−特異結合物質間の結合を解離させる手法が一般的に用いられている。しかしながら、酸やアルカリ溶液の添加により完全に解離させることは難しい。また、解離のために長時間を必要とする。さらには、基板上の特異結合物質の変性を誘発し、測定感度および精度の低下を招いてしまう。 As a substrate regeneration method for improving measurement accuracy and reducing costs, for example, a commercially available surface plasmon resonance measurement apparatus generally uses a method of dissociating the binding between a target substance and a specific binding substance by adding hydrochloric acid. It has been. However, it is difficult to completely dissociate by adding an acid or alkali solution. Moreover, a long time is required for dissociation. Furthermore, denaturation of the specific binding substance on the substrate is induced, leading to a decrease in measurement sensitivity and accuracy.
特許文献５においては、標的物質を固相測定により検出するために、金等の貴金属表面に固定した特異結合物質を、検出工程後に、還元剤又は酸化剤あるいは特定の試薬の添加により除去することにより、基板を再生している。再生工程後は新たな特異結合物質を固定して使用するため、特異結合物質の失活に依る測定感度および精度の低下を防ぐことが可能である。しかしながら、還元剤や酸化剤や特定の試薬の添加により基板上の特異結合物質を完全に解離させるためには、特異結合物質の固定方法を最適化する必要がある。また、試薬の添加により特異結合物質、あるいは標的物質の変性や構造変化が生じ、基板表面に不可逆的に強く吸着して以降の測定制度を低下させることも予想される。
そこで、本発明は、標的物質の濃度測定に使用したセンサ素子を再生させる方法も提供する。電位印加による還元反応を利用して、固定化された複合体を基板から外すことにより、基板（例えばセンサ素子）を繰り返し使用できる。 Therefore, the present invention also provides a method for regenerating the sensor element used for measuring the concentration of the target substance. A substrate (for example, a sensor element) can be repeatedly used by removing the immobilized complex from the substrate using a reduction reaction by applying a potential.
本発明において、基板上に選択的に結合した、特異結合物質を有する粒子−標的物質−２重特異性を有する捕捉体を含むサンドイッチ複合体を、標的物質の濃度検出の工程終了後に基板上から外すことにより、基板を再生させることが出来る。 In the present invention, a sandwich complex including a specific binding substance-containing particle-target substance-capacitor having bispecificity selectively bonded on a substrate is removed from the substrate after the target substance concentration detection step is completed. By removing, the substrate can be regenerated.
基板の再生方法としては、例えば、基板表面と２重特異性を有する捕捉体間にチオレート結合が形成されている場合には、基板に対して、銀／塩化銀などの電極を基準として一定の負電位を印加あるいは一定範囲の電位を挿引する。そうすると、還元脱離反応が起こり、チオレート結合を選択的に解離させることができる。例えばチオール基を持つ化合物（Ｒ−ＳＨ）を金の固相上に結合させた場合では、 As a method for regenerating the substrate, for example, when a thiolate bond is formed between the substrate surface and a capture body having a dual specificity, the substrate is fixed with respect to the electrode such as silver / silver chloride. Apply a negative potential or subtract a certain range of potential. Then, a reductive elimination reaction occurs and the thiolate bond can be selectively dissociated. For example, when a compound having a thiol group (R-SH) is bound on a gold solid phase,
という反応が起こる。チオレート結合を解離させるためには、一定の電位を所定時間印加しても良いし、所定範囲の電位を所定の速度で掃引しても良い。電極還元だけでなく、プロトンの付加によっても、チオレート結合は解離するため、溶液のｐＨは低い方がより狭い電位範囲での掃引で脱離させることが可能になる。したがって、印加する電位の値、あるいは挿引する電位の範囲は、例えば、ｐＨ３からｐＨ１０の溶液中で、銀／塩化銀電極に対して−０．２Ｖから−１．０Ｖの電位範囲で、数十ｍＶ／ｓから数百ｍＶ／ｓの速度で掃引を行う。これにより、チオレート結合を解離させ、清浄なセンサ素子表面を得ることが可能である。なお、最適値は用いる化合物や溶液のｐＨにより異なり、適宜選択することができる。 This happens. In order to dissociate the thiolate bond, a constant potential may be applied for a predetermined time, or a predetermined range of potential may be swept at a predetermined speed. Since the thiolate bond is dissociated not only by electrode reduction but also by addition of protons, the solution having a lower pH can be desorbed by sweeping in a narrower potential range. Accordingly, the value of the potential to be applied or the range of the potential to be subtracted is, for example, in the potential range of −0.2 V to −1.0 V with respect to the silver / silver chloride electrode in a solution of pH 3 to pH 10, Sweeping is performed at a speed of 10 mV / s to several hundred mV / s. Thereby, it is possible to dissociate the thiolate bond and obtain a clean sensor element surface. The optimum value varies depending on the compound used and the pH of the solution, and can be appropriately selected.
以下、実施例を用いてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail using an Example, this invention is not limited to these Examples.
（実施例１）
本実施例では、図１に示すように、標識物質として蛍光物質を有する粒子として蛍光粒子１０１、２重特異性を有する捕捉体としてチオール化合物を修飾した抗体１０４を用いる。まず、蛍光粒子−標的物質（標的抗原）−２重特性を有する捕捉体を含んで成るサンドイッチ複合体を液相中で形成する（図１（ａ））。次に、チオール基と金基板との間にチオレート結合を形成し、複合体を基板に固定する（図１（ｂ））。次に、蛍光粒子１０１を蛍光強度検出器により検出し、標的抗原の有無又は量の検出を行う。なお、金基板はセンサ素子としての機能を有する構成とすることもできる。なお、金基板は少なくとも基板表面に金を有する構成であればよい。
Example 1
In this embodiment, as shown in FIG. 1,
（１）蛍光粒子への特異結合物質の固定化
標的抗原（ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ（ｈＣＧ） 、Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ社製）を特異的に捕捉する抗体（第１の抗体、ａｎｔｉ−ｈＣＧ、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を有する蛍光粒子を作製する。蛍光粒子としては、ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標、ポリスチレンマイクロスフィア，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、平均粒径２００ｎｍ）を用いる。該蛍光粒子の表面のカルボキシル基を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化する。そして、抗体に存在するアミノ基とアミド結合を形成させることにより、蛍光粒子の表面に抗体（特異結合物質）を固定できる。
(1) Immobilization of specific binding substance to fluorescent particles Antibody (first antibody, anti-hCG, manufactured by Medix Biochemica) that specifically captures a target antigen (human chorigonal gonadotropin (hCG), manufactured by Acris Antibodies GmbH) ) Are produced. As the fluorescent particles, FluoSpheres (registered trademark, polystyrene microsphere, manufactured by Invitrogen, average particle diameter of 200 nm) is used. The carboxyl group on the surface of the fluorescent particles is activated with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide. The antibody (specific binding substance) can be immobilized on the surface of the fluorescent particle by forming an amide bond with an amino group present in the antibody.
（２）２重特性を有する捕捉体の作製
粒子に固定した抗体とは異なるｈＣＧのエピトープを認識する抗体（第２の抗体、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ、 Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を用いる。１０−カルボキシ−１−デカンチオール（同仁化学社製品）のカルボキシル基末端を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化する。そして、第２の抗体に存在するアミノ基とアミド結合を形成させることにより、第２の抗体とチオール基という標的抗原と基板表面（例えば金基板）への２重特異性を有する捕捉体を作製できる。
(2) Production of capture body having double characteristics An antibody that recognizes an epitope of hCG different from the antibody immobilized on the particles (second antibody, anti-human alpha subunit, manufactured by Medix Biochemica) is used. The carboxyl group terminal of 10-carboxy-1-decanethiol (product of Dojindo) is activated with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide. Then, by forming an amide bond with an amino group present in the second antibody, a capture body having a dual specificity to the target antigen and the substrate surface (for example, a gold substrate) of the second antibody and a thiol group is produced. it can.
（３）ｈＣＧの捕捉
図１（ａ）のように、標的抗原（ｈＣＧ）１０３を含む検体と、特異結合物質１０２を有する蛍光粒子１０１と、２重特異性を有する捕捉体１０４を溶液中で接触させ、蛍光粒子−ｈＣＧ−２重特異性を有する捕捉体を含んで成るサンドイッチ複合体を形成させる。
(3) Capture of hCG As shown in FIG. 1 (a), a specimen containing a target antigen (hCG) 103, a
（４）基板上へのサンドイッチ複合体の固定
図１（ｂ）のように、２重特異性を有する捕捉体のチオール基（基板表面認識部位）と基板である金基板１０５との間にチオレート結合を形成させることにより、（３）の操作により形成させたサンドイッチ複合体を金基板上に固定する。サンドイッチ複合体の形成に関与しなかった特異結合物質を有する蛍光粒子や標的抗原等の溶液中に含まれる物質は洗浄操作により除去される。
(4) Immobilization of sandwich complex on substrate As shown in FIG. 1 (b), a thiolate is formed between a thiol group (substrate surface recognition site) of a capturing body having double specificity and a
（５）ｈＣＧの検出
図１（ｃ）のように、（４）の操作により金基板表面に固定したサンドイッチ複合体の蛍光粒子からの蛍光強度を検出することによって、検体液中に含まれるｈＣＧを定量する。
(5) Detection of hCG As shown in FIG. 1 (c), hCG contained in the sample liquid is detected by detecting the fluorescence intensity from the fluorescent particles of the sandwich complex fixed on the gold substrate surface by the operation of (4). Quantify.
＜測定時操作の説明＞
以下に図２の本発明の測定システムのブロック図を用いて、測定操作について説明する。２０７のサンプリングプローブにより、２０１の標的抗原を含む検体液を２１０の反応容器へ分注する。２０４の希釈液も同様にして２１０の反応容器へ分注する。さらに、２０２の特異結合物質を有する蛍光粒子を含む試薬および２０３の２重特異性を有する捕捉体を含む試薬も同様にして２１０の反応容器へ分注する。次に、特異結合物質を有する蛍光粒子−標的抗原−２重特異性を有する捕捉体から成るサンドイッチ複合体を含む溶液を、２０７のサンプリングプローブを用いて２１０の反応容器から２１１の検出容器へ移す。２１２の基板（例えばセンサ素子）と２重特異性を有する捕捉体間にチオレート結合が形成されることにより、２１２の基板上にサンドイッチ複合体が固定される。サンドイッチ複合体の形成に関与しなかった標的抗原や蛍光粒子等を含む溶液は、２０７のサンプリングプローブにより、２１１の検出容器内より２０６の廃液容器へ移送される。さらに、２０７のサンプリングプローブにより、２０５の洗浄液を２１１の検出容器内へ満たし、洗浄を行う。２０７のサンプリングプローブにより、２１１の検出容器内より２０６の廃液容器へ、使用された洗浄溶液は移送される。２０７のサンプリングプローブにより、２０３の希釈液を２１０の反応容器へ分注する。蛍光粒子からの蛍光強度を、２１３の検出プローブにより検出し、２１４の検出器により測定する。既知濃度の標的抗原を用いてあらかじめ作成した検量線を基に、検出した蛍光強度の変化量から、検体中の標的抗原濃度を算出する。ここに記載はしないが、あらかじめバックグラウンドを測定しておき、蛍光強度の差分を求め、標的抗原の濃度を算出しても良い。
<Description of measurement operation>
The measurement operation will be described below with reference to the block diagram of the measurement system of the present invention shown in FIG. A sample solution containing 201 target antigens is dispensed into 210 reaction containers by means of 207 sampling probes. In the same manner, the diluted solution of 204 is dispensed into the reaction vessel of 210. Furthermore, a reagent containing fluorescent particles having 202 specific binding substances and a reagent containing 203 double specificity capture agents are similarly dispensed into 210 reaction vessels. Next, a solution containing a sandwich complex consisting of a fluorescent particle having a specific binding substance-a target antigen-a bispecific capture body is transferred from 210 reaction vessels to 211 detection vessels using 207 sampling probes. . A sandwich complex is immobilized on the 212 substrate by forming a thiolate bond between the 212 substrate (e.g., sensor element) and a capture body having dual specificity. A solution containing target antigens, fluorescent particles and the like that have not been involved in the formation of the sandwich complex is transferred from the
（実施例２）
本実施例では、図３に示すように、粒子として磁性粒子３０１、２重特異性を有する捕捉体としてチオール化合物を修飾した抗体３０４を用いる。磁性粒子−標的抗原−２重特性を有する捕捉体を含んで成るサンドイッチ複合体を基板（センサ素子）表面にチオレート結合により固定する。そして、センサ素子表面に固定した複合体中の磁性粒子を磁気センサにより検出し、標的抗原であるｈＣＧ３０３の有無又は量を検出する。
(Example 2)
In this example, as shown in FIG. 3,
（１）磁性粒子への特異結合物質の固定化
ｈＣＧを捕捉する抗体を有する蛍光粒子を作製する。磁性粒子は、ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ（登録商標，ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２５０ｎｍ）を用いる。磁性粒子の表面のカルボキシル基を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化する。そして、抗体（第１の交代）に存在するアミノ基とアミド結合を形成させることにより、磁性粒子の表面に抗体を固定できる。
(1) Immobilization of specific binding substance to magnetic particles Fluorescent particles having an antibody that captures hCG are prepared. As the magnetic particles, nanomag-D (registered trademark, manufactured by micromod, average particle size of 250 nm) is used. The carboxyl group on the surface of the magnetic particle is activated with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide. The antibody can be immobilized on the surface of the magnetic particle by forming an amide bond with an amino group present in the antibody (first alternation).
（２）２重特性を有する捕捉体の作製
磁性粒子上へ固定した第１の抗体とは異なるｈＣＧのエピトープを認識する抗体（第２の抗体）を用いる。１０−カルボキシ−１−デカンチオール（同仁化学社製品）のカルボキシル基末端を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化する。そして、第２の抗体に存在するアミノ基とアミド結合を形成させることにより、標的抗原とセンサ素子表面への２重特異性を有する捕捉体を作製できる。
(2) Production of capture body having dual properties An antibody (second antibody) that recognizes an epitope of hCG different from the first antibody immobilized on the magnetic particles is used. The carboxyl group terminal of 10-carboxy-1-decanethiol (product of Dojindo) is activated with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide. Then, by forming an amide bond with an amino group present in the second antibody, a capture body having a dual specificity to the target antigen and the sensor element surface can be produced.
（３）ｈＣＧの捕捉
図３（ａ）のように、標的抗原であるｈＣＧ３０３を含む検体と、特異結合物質３０２を有する蛍光粒子３０１と、２重特異性を有する捕捉体３０４を溶液中で混合し、磁性粒子−ｈＣＧ−２重特異性を有する捕捉体を含んで成るサンドイッチ複合体を形成させる。
(3) Capture of hCG As shown in FIG. 3 (a), a sample containing hCG303 as a target antigen,
（４）センサ素子上へのサンドイッチ複合体の固定
図３（ｂ）のように、２重特異性を有する捕捉体のチオール基とセンサ素子である金基板３０５との間にチオレート結合を形成させることにより、（３）の操作により形成させたサンドイッチ複合体をセンサ素子上に固定する。この際、磁場の印加により複合体をセンサ素子付近に集磁することにより、複合体の固定効率を向上させることができる。また、磁場の印加を利用したＢ／Ｆ分離を行うことにより、複合体の濃縮が可能である。サンドイッチ複合体の形成に関与しなかった特異結合物質を有する磁性粒子、標的抗原、検体中に含まれる物質は洗浄操作により除去される。
(4) Immobilization of sandwich complex on sensor element As shown in FIG. 3B, a thiolate bond is formed between the thiol group of the capturing body having double specificity and the
（５）ｈＣＧの検出
図３（ｃ）のように、（４）の操作によりセンサ素子表面に固定したサンドイッチ複合体の磁性粒子からの磁気信号を検出することによって、検体液中に含まれるｈＣＧを定量する。
(5) Detection of hCG As shown in FIG. 3C, the hCG contained in the sample liquid is detected by detecting the magnetic signal from the magnetic particles of the sandwich complex fixed on the sensor element surface by the operation of (4). Quantify.
＜測定時操作の説明＞
測定時の操作については、実施例１と同様であるため説明は省略する。
<Description of measurement operation>
Since the operation at the time of measurement is the same as that of Example 1, the description thereof is omitted.
（実施例３）
本実施例では、図４に示すように、粒子として磁性粒子４０１、２重特異性を有する捕捉体としてチオール化合物を修飾した抗体４０４を用いる磁性粒子−標的抗原−２重特性を有する捕捉体を含んで成るサンドイッチ複合体を基板にチオレート結合により固定化し、標的物質（標的抗原）であるｈＣＧ４０３の磁気センサによる検出を行う。
(Example 3)
In this example, as shown in FIG. 4, a
（１）磁性粒子への特異結合物質の固定化
ｈＣＧを捕捉する抗体を有する磁性粒子を作製する。磁性粒子ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ（登録商標，ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２５０ｎｍ）表面のカルボキシル基を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化する。そして、抗体に存在するアミノ基とアミド結合を形成させることにより、磁性粒子表面に抗体を固定できる。
(1) Immobilization of specific binding substance on magnetic particles Magnetic particles having an antibody that captures hCG are prepared. The carboxyl group on the surface of magnetic particles nanomag-D (registered trademark, manufactured by micromod, average particle size 250 nm) is activated with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide. The antibody can be immobilized on the surface of the magnetic particle by forming an amide bond with an amino group present in the antibody.
（２）２重特性を有する捕捉体の作製
固相上へ固定した抗体とは異なるｈＣＧのエピトープを認識する抗体を用いる。１０−カルボキシ−１−デカンチオール（同仁化学社製品）のカルボキシル基末端を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化する。そして、抗体に存在するアミノ基とアミド結合を形成させることにより、抗体とチオール基という標的抗原とセンサ素子表面への２重特異性を有する捕捉体を作製できる。
(2) Preparation of capture body having double characteristics An antibody that recognizes an epitope of hCG different from the antibody immobilized on the solid phase is used. The carboxyl group terminal of 10-carboxy-1-decanethiol (product of Dojindo) is activated with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide. Then, by forming an amide bond with an amino group present in the antibody, a capture body having dual specificity to the target antigen and the sensor element surface of the antibody and thiol group can be produced.
（３）ｈＣＧの捕捉
図４（ａ）のように、標的抗原であるｈＣＧ４０３を含む検体と、特異結合物質４０２を有する磁性粒子４０１と、２重特異性を有する捕捉体４０４とを溶液中で混合させ、磁性粒子−ｈＣＧ−２重特異性を有する捕捉体を含んで成る複合体を形成させる。
(3) Capture of hCG As shown in FIG. 4 (a), a specimen containing hCG403, which is a target antigen, a
（４）センサ素子上へのサンドイッチ複合体の固定
図４（ｂ）のように、反応容器壁面４０５に磁場の印加により磁性粒子を集磁し、Ｂ／Ｆ分離を行う。図４（ｃ）のように、磁場の印加を解除し、磁性粒子を再分散させる。図４（ｄ）のように、２重特異性を有する捕捉体のチオール基とセンサ素子である金基板４０６との間にチオレート結合を形成させることにより、（３）の操作により形成させたサンドイッチ複合体のみをセンサ素子上に選択的に濃縮する。図４（ｄ）のように、サンドイッチ複合体の形成に関与しなかった特異結合物質を有する磁性粒子は洗浄操作により除去される。
(4) Fixing of sandwich composite on sensor element As shown in FIG. 4B, magnetic particles are collected on the reaction
（５）ｈＣＧの検出
（４）の操作によりセンサ素子表面に濃縮したサンドイッチ複合体の磁性標識からの磁気信号を検出することによって、検体液中に含まれるｈＣＧを定量する。
(5) Detection of hCG The hCG contained in the sample liquid is quantified by detecting a magnetic signal from the magnetic label of the sandwich complex concentrated on the surface of the sensor element by the operation of (4).
＜測定時操作の説明＞
以下に図５の本発明の測定システムのブロック図を用いて、測定操作について説明する。５０７のサンプリングプローブにより、５０１の標的抗原を含む検体液を５１０の反応容器へ分注する。５０４の希釈液も同様にして５１０の反応容器へ分注する。さらに、５０２の特異結合物質を有する磁性粒子を含む試薬および５０３の２重特異性を有する捕捉体を含む試薬も同様にして５１０の反応容器へ分注する。特異結合物質を有する磁性粒子−標的抗原−２重特異性を有する捕捉体を含んで成るサンドイッチ複合体を形成させる。その後、５１０の反応容器内に設置した５１１のＢ／Ｆ分離用基板に、５１２の磁場発生装置により磁場を印加し、磁性粒子を含む複合体を基板上に集磁する。サンドイッチ複合体および未反応の磁性粒子以外の物質および試薬は、５０７のサンプリングプローブにより５１０の反応容器より５０６の廃液容器へ移送される。さらに、５０７のサンプリングプローブにより、５０５の洗浄液を５１０の検出容器内へ満たし、洗浄を行う。５０７のサンプリングプローブにより、５１０の検出容器内より５０６の廃液容器へ、使用された洗浄溶液は移送される。５０７のサンプリングプローブにより、５０３の希釈液を５１０の反応容器へ分注する。５０７のサンプリングプローブにより、５０３の希釈液を５１５の検出容器へ分注する。５１２の磁場発生装置により、５１４の磁気センサ素子に対して垂直に磁場を発生させる。５１３の磁気信号検出器により、初期値の測定を行う。５１２の磁場発生装置により５１１のＢ／Ｆ分離用基板に印加した磁場を解除し、サンドイッチ複合体および未反応の磁性粒子を溶液中に再分散させる。５０７のサンプリングプローブにより、磁性粒子を含む溶液を５１０の反応容器から５１５の検出容器へ移送する。５１４のセンサ素子と２重特異性を有する捕捉体間にチオレート結合が形成されることにより、５１４のセンサ素子上にサンドイッチ複合体のみが選択的に固定される。サンドイッチ複合体の形成に関与しなかった磁性粒子は、５０７のサンプリングプローブにより、５１５の検出容器内より５０６の廃液容器へ移送される。さらに、５０７のサンプリングプローブにより、５０５の洗浄液を５１５の検出容器内へ満たし、洗浄を行う。５０７のサンプリングプローブにより、５１５の検出容器内より５０６の廃液容器へ、使用された洗浄溶液は移送される。５０７のサンプリングプローブにより、５０３の希釈液を５１５の反応容器へ分注する。５１２の磁場発生装置により、特異結合物質を有する磁性標識−標的抗原−２重特異性を有する捕捉体から成るサンドイッチ複合体が固定された５１４の磁気センサ素子に対して垂直に磁場を発生させる。磁性標識より発生した磁気信号を、５１３の磁気信号検出器により測定する。既知濃度の標的抗原を用いてあらかじめ作成した検量線を基に、初期値と比較した磁気信号の変化量から、検体中の標的抗原濃度を算出する。
<Description of measurement operation>
The measurement operation will be described below using the block diagram of the measurement system of the present invention shown in FIG. A sample liquid containing 501 target antigens is dispensed into 510 reaction containers using 507 sampling probes. In the same manner, the diluted solution of 504 is dispensed into the reaction vessel of 510. Further, a reagent containing magnetic particles having 502 specific binding substances and a reagent containing a capturing body having a dual specificity of 503 are also dispensed into 510 reaction containers in the same manner. A sandwich complex comprising a magnetic particle having a specific binding substance-target antigen-bispecific capture body is formed. Thereafter, a magnetic field is applied to the 511 B / F separation substrate installed in the
（実施例４）
本実施例では図６に示すように、粒子として磁性粒子６０１、２重特異性を有する捕捉体として２価抗体であるＤｉａｂｏｄｙ６０４を用いる。磁性粒子−標的抗原−Ｄｉａｂｏｄｙを含んで成るサンドイッチ複合体を基板（センサ素子の機能も兼ねる）表面にＤｉａｂｏｄｙの結合能を利用して固定化する。そして、標的抗原であるＨＥＬ（Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）６０３を磁気センサにより検出する。
Example 4
In this embodiment, as shown in FIG. 6,
（１）磁性粒子への特異結合物質の固定化
ＨＥＬに特異的に結合する抗体を有する磁性粒子を作製する。ここで用いる抗体は、後述する２重特異性を有するＤｉａｂｏｄｙが認識するのと異なるＨＥＬ分子上の位置を認識する抗体を用いる。まず、磁性粒子ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ（登録商標、ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２５０ｎｍ）の表面のカルボキシル基を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化する。そして、抗体に存在するアミノ基とアミド結合を形成させることにより、磁性粒子表面に抗体を固定できる。
(1) Immobilization of specific binding substance on magnetic particles Magnetic particles having an antibody that specifically binds to HEL are prepared. As the antibody used here, an antibody that recognizes a position on the HEL molecule different from that recognized by Diabody having dual specificity described later is used. First, the carboxyl group on the surface of magnetic particles nanomag-D (registered trademark, manufactured by micromod, average particle size 250 nm) is activated with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide. . The antibody can be immobilized on the surface of the magnetic particle by forming an amide bond with an amino group present in the antibody.
（２）２価抗体の作製
磁性粒子に固定した抗体とは異なるＨＥＬのエピトープを認識し、かつ、センサ基板材料を認識する２価抗体を作製する。ここでは、センサ基板材料として金を用いる。この抗体作製方法は、特開２００５−３１２４４６の実施例１８〜２０記載の要領で作製することができる。
(2) Preparation of bivalent antibody A bivalent antibody that recognizes an epitope of HEL different from the antibody immobilized on the magnetic particle and recognizes the sensor substrate material is prepared. Here, gold is used as the sensor substrate material. This antibody production method can be produced as described in Examples 18 to 20 of JP-A-2005-31446.
（３）ＨＥＬの捕捉
図６（ａ）のように、標的抗原であるＨＥＬ６０３を含む検体と、特異結合物質６０２を有する磁性粒子６０１と、Ｄｉａｂｏｄｙ６０４を溶液中で接触させ、磁性粒子−ＨＥＬ−Ｄｉａｂｏｄｙを含んで成るサンドイッチ複合体を形成させる。
(3) Capturing HEL As shown in FIG. 6A, a
（４）センサ素子上へのサンドイッチ複合体の固定
図６（ｂ）のように、反応容器壁面６０５に磁場の印加により磁性粒子を集磁し、Ｂ／Ｆ分離を行う。図６（ｃ）のように、磁場の印加を解除し、磁性粒子を再分散させる。図６（ｄ）のように、Ｄｉａｂｏｄｙのセンサ素子基板結合部位とセンサ素子である金基板６０６との間に特異結合を形成させることにより、（３）の操作により形成させたサンドイッチ複合体のみをセンサ素子上に選択的に固定する。図６（ｄ）のように、サンドイッチ複合体の形成に関与しなかった特異結合物質を有する磁性粒子は洗浄操作により除去される。
(4) Fixing of sandwich composite onto sensor element As shown in FIG. 6B, magnetic particles are collected by applying a magnetic field to the reaction
（５）ＨＥＬの検出
（４）の操作によりセンサ素子表面に固定したサンドイッチ複合体の磁性粒子からの磁気信号を検出することによって、検体液中に含まれるＨＥＬを定量する。
(5) Detection of HEL HEL contained in the sample liquid is quantified by detecting a magnetic signal from the magnetic particles of the sandwich complex fixed on the sensor element surface by the operation of (4).
＜測定時操作の説明＞
測定時の操作については、実施例３と同様であるため説明は省略する。
<Description of measurement operation>
Since the operation at the time of measurement is the same as that of Example 3, the description thereof is omitted.
（実施例５）
本実施例では、基板上に形成した特異結合物質を有する標識粒子−標的抗原−２重特異性を有する捕捉体を含んで成るサンドイッチ複合体を基板から外し、基板を再生する方法を示す。とくに基板がセンサ素子として用いられる場合について例を示す。
(Example 5)
In this example, a method of regenerating a substrate by removing a sandwich complex comprising a labeled particle-target antigen having a specific binding substance formed on a substrate-a capture body having bispecificity from the substrate is shown. In particular, an example will be described in the case where the substrate is used as a sensor element.
センサ素子である金基板上へのサンドイッチ複合体の固定および標的物質の濃度の検出方法については、実施例１乃至３において示した通りである。基板の再生方法は、図１（ｃ）あるいは図４（ｅ）のようにチオレート結合を介してサンドイッチ複合体を固定した金基板を作用極とし、参照極として銀／塩化銀電極、対極に白金線を用い、電位を印加し、複合体を金基板から外す。例えば、リン酸緩衝液中において、−０．２Ｖから−０．８Ｖの電位範囲でリニアースイープボルタンメトリーを行う（電位挿引速度：１００ｍＶ／ｓ）。この操作により還元脱離反応が起こり、チオレート結合が選択的に解離する。洗浄工程後、清浄なセンサ素子（金基板）表面を得ることができ、繰り返し標的物質の測定に用いることが可能となる。また、標的物質に応じて用いる特異結合物質を選択することで、同一の素子を異なる標的物質の検出に使用することも可能である。 The method for immobilizing the sandwich complex on the gold substrate as the sensor element and detecting the concentration of the target substance is as described in Examples 1 to 3. As shown in FIG. 1 (c) or FIG. 4 (e), the substrate regeneration method uses a gold substrate on which a sandwich composite is fixed via a thiolate bond as a working electrode, a silver / silver chloride electrode as a reference electrode, and platinum as a counter electrode. Using a wire, a potential is applied and the composite is removed from the gold substrate. For example, linear sweep voltammetry is performed in a phosphate buffer solution in a potential range of −0.2 V to −0.8 V (potential insertion speed: 100 mV / s). By this operation, a reductive elimination reaction occurs, and the thiolate bond is selectively dissociated. After the cleaning step, a clean sensor element (gold substrate) surface can be obtained and can be used repeatedly for measurement of the target substance. Further, by selecting a specific binding substance to be used according to the target substance, the same element can be used for detection of different target substances.
１０１． 粒子
１０２． 特異結合物質
１０３． 標的物質
１０４． ２重特異性を有する捕捉体
１０５． 基板
２０１． 検体液
２０２． 特異結合物質を有する蛍光粒子を含む試薬
２０３． ２重特性を有する捕捉体を含む試薬
２０４． 希釈液
２０５． 洗浄液
２０６． 廃液容器
２０７． サンプリングプローブ
２０８． チューブ
２０９． ポンプ
２１０． 反応容器
２１１． 検出容器
２１２． 基板（センサ素子）
２１３． 検出用プローブ
２１４． 検出器
３０１． 磁性粒子
３０２． 特異結合物質
３０３． 標的抗原
３０４． ２重特異性を有する捕捉体
３０５． 基板（金基板）
４０１． 磁性粒子
４０２． 特異結合物質
４０３． 標的物質（標的抗原）
４０４． ２重特異性を有する捕捉体
４０５． Ｂ／Ｆ分離用基板
４０６． 基板（金基板）
５０１． 検体液
５０２． 特異結合物質を有する磁性粒子を含む試薬
５０３． ２重特性を有する捕捉体を含む試薬
５０４． 希釈液
５０５． 洗浄液
５０６． 廃液容器
５０７． サンプリングプローブ
５０８． チューブ
５０９． ポンプ
５１０． 反応容器
５１１． Ｂ／Ｆ分離用基板
５１２． 磁場発生装置
５１３． 磁気信号検出器
５１４． センサ素子
５１５． 検出容器
６０１． 磁性粒子
６０２． 特異結合物質
６０３． 標的物質（標的抗原）
６０４． ２重特異性を有する捕捉体（２重特異性抗体）
６０５． ＢＦ分離用基板
６０６． 基板（センサ素子）
101.
213.
401.
404.
501.
604. Bispecific capturer (bispecific antibody)
605.
Claims (11)
（ａ）特異結合物質を有する粒子と、標的物質と、２重特異性を有する捕捉体と、を含んで成る複合体を溶液中で形成する工程と、
（ｂ）前記複合体中の２重特異性を有する捕捉体と基板との間に結合を形成させ、前記複合体を前記基板上に固定する工程と、
（ｃ）前記基板上に固定された複合体中の粒子を検出することにより、前記標的物質の有無又は量を検出する工程と、
を有することを特徴とする標的物質の検出方法。 In a method for detecting the presence or amount of a target substance using particles,
(A) forming a complex comprising a particle having a specific binding substance, a target substance, and a capture body having a dual specificity in a solution;
(B) forming a bond between the capture body having dual specificity in the complex and the substrate, and immobilizing the complex on the substrate;
(C) detecting the presence or amount of the target substance by detecting particles in the complex immobilized on the substrate;
A method for detecting a target substance, comprising:
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2008163523A JP2010002393A (en) | 2008-06-23 | 2008-06-23 | Detection method of target material |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015055568A (en) * | 2013-09-12 | 2015-03-23 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | Biomolecule analysis method and biomolecule analyzer |
| CN110832323A (en) * | 2017-06-13 | 2020-02-21 | 于利奇研究中心有限公司 | Method for detecting aggregates of biotherapeutic substances in a sample |
-
2008
- 2008-06-23 JP JP2008163523A patent/JP2010002393A/en active Pending
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