CN117964713A - 一种t4gp32蛋白突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种T4GP32蛋白突变体及其应用，涉及生物技术领域。所述T4GP32蛋白突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亲本逆转录酶相比，含有选自下组的至少一个位点上的氨基酸取代：第64位、第79位、第84位、第90位和第106位本；申请的T4GP32蛋白突变体具有增加的热稳定性，可以用于在逆转录反应和qPCR反应中提高扩增效率。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种T4GP32蛋白突变体及其应用。
背景技术
逆转录是指在逆转录酶的作用下，发生以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。此过程中，核酸合成与转录（DNA到RNA）过程和遗传信息的流动方向相反，故称为逆转录。逆转录的发现，是对遗传中心法则的一个重要补充。逆转录的现象说明在蛋白质的合成过程中，不单DNA能决定RNA，RNA同样也可以决定DNA，然后通过mRNA翻译成蛋白质。逆转录现象多见于致癌病毒和免疫缺陷病毒。逆转录过程在真核细胞中也同样存在，例如逆转座子和端粒DNA的延长均存在逆转录过程，需逆转录酶的催化，端粒酶即为真核细胞中的逆转录酶。
逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Real-Time QuantitativePolymerase Chain Reaction，RT-qPCR）是一种用于快速、准确、灵敏地检测和定量目的RNA或DNA分子的分子生物学技术。它结合了逆转录和实时荧光定量PCR两个关键步骤，首先使用逆转录酶和特定引物将RNA样品反转录成cDNA，然后使用特定引物对cDNA进行PCR扩增，该方法利用荧光染料或探针，当与扩增的DNA或RNA 分子结合时会发出信号，从而可以对目标序列进行量化。RT-qPCR 通常用于基因表达分析、病毒载量定量、表观遗传学、生物进化和基因突变检测等应用。但是，现有RT-qPCR试剂依然存在一些潜在的不足之处，例如形成的引物二聚体降低试剂性能、整体cDNA产量相对较少、对于复杂样品可能会导致非特异性扩增以及长片段cDNA扩增性能较差等。面对这些挑战，未来的改进方向可以包括引物设计的优化、试剂保存条件的改进以及试剂所涉及蛋白本身性质改造，以进一步提高逆转录试剂的性能和应用范围。
T4噬菌体基因32编码蛋白（T4 Gene 32 Protein），也称T4GP32蛋白，是一种由噬菌体T4基因组的基因32编码的单链DNA结合蛋白（ssDNA结合蛋白）。T4GP32蛋白被证明能够增加逆转录反应的cDNA产量和长片段cDNA扩增，其原因主要包括以下几个方面：T4GP32蛋白能够与RNA模板结合，使其不易形成阻止RTase发挥功能的发夹结构；T4GP32蛋白与新合成的cDNA结合，可能会阻止其形成稳定的 RNA：cDNA 双链，从而导致合成速率增加；T4GP32蛋白与ssDNA形式的引物结合，可以提高引物退火的速度和特异性，从而提高逆转录反应的周转率。
目前的现有技术中所添加T4GP32蛋白大多来自野生型，其稳定性相对较差，无法在逆转录试剂反应过程以及长期储存中发挥最佳效果。因此，设计具有热稳定性的T4GP32蛋白对提高逆转录性能具有重要意义。
发明内容
本申请旨在针对现有技术的不足，提供一种T4GP32蛋白突变体，该突变体相对于野生型具有更优的耐热性和储存稳定性。运用所述T4GP32蛋白突变体配制的逆转录反应试剂，不仅具备增加的逆转录性能，而且还具有更长的储存周期。所述T4GP32蛋白突变体也可以运用到PCR反应中，增强PCR过程中高温阶段的扩增性能。
本申请的第一方面提供一种T4GP32蛋白突变体，所述T4GP32蛋白突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亲本野生型T4GP32蛋白相比，含有选自下组的至少一个位点上的氨基酸取代：第64位、第79位、第84位、第90位和第106位。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体由选自下组的至少一个位点取代组成（例如一个、两个、三个、四个或五个）：H64C、S79Y、Y84E、C90H、Y106E。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体包含选自下组的至少一个位点取代（例如一个、两个、三个、四个或五个）：H64C、S79Y、Y84E、C90H、Y106E。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体与SEQ ID NO.1具有至少70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列一致性。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体包含取代H64C或由其组成。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体包含取代S79Y或由其组成。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体包含取代Y84E或由其组成。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体包含取代C90H或由其组成。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体包含取代Y106E或由其组成。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体包含取代H64C、C90H或由其组成。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体包含取代Y84E、Y106E或由其组成。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体包含取代H64C、S79Y、Y84E、C90H、Y106E或由其组成。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体包含选自下列位点取代中的任意一个：
H64C；
S79Y；
Y84E；
C90H；
Y106E；
H64C、C90H；
Y84E、Y106E；
H64C、S79Y、Y84E、C90H、Y106E。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。
在一些实施方案中，所述T4GP32蛋白突变体与亲本相比具有提高的热稳定性。所述热稳定性是指在一定温度下保存一段时间后的蛋白活性。
本申请的第二方面提供一种分离的多核苷酸，其编码本申请所述的T4GP32蛋白突变体。
本申请的第三方面提供一种核酸载体，其包含编码本申请所述T4GP32蛋白突变体的多核苷酸，例如质粒，粘粒或噬菌体。
本申请的第四方面提供一种宿主细胞，其用于表达本申请所述的T4GP32蛋白突变体、多核苷酸和/或核酸载体，例如大肠杆菌细胞，酵母细胞或小鼠细胞。
本申请的第五方面提供一种制备本申请所述T4GP32蛋白突变体的方法。
在一些实施方案中，所述方法包括在合适的条件下培养本申请第四方面的宿主细胞，提取纯化T4GP32蛋白突变体。
本申请的第六方面提供本申请所述的T4GP32蛋白突变体在逆转录反应中的应用。
本申请第七方面提供本申请所述的T4GP32蛋白突变体在PCR反应或qPCR反应中的应用。
本申请的第八方面提供一种试剂盒，其包含本申请第一方面所述的T4GP32蛋白突变体。
本申请的第九方面提供一种扩增组合物，所述扩增组合物包含缓冲物质、金属盐、dNTPs和本申请第一方面所述的T4GP32蛋白突变体。
在一些实施方案中，所述缓冲物质是例如Tris、Tris-HCl、Tris碱或HEPES中的一种或多种，优选Tris。
在一些实施方案中，所述金属盐包含Mg2+盐，优选MgCl2。
在一些实施方案中，所述金属盐还包括K+盐、Mn2+盐、Cs+盐、Na+盐和Ca2+盐中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述扩增组合物还包含DNA聚合酶，优选耐热的DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶。
在一些实施方案中，所述扩增组合物还包含逆转录酶，例如MMLV逆转录酶。
在一些实施方案中，所述扩增组合物还包含引物。
在一些实施方案中，所述扩增组合物还包含探针和/或荧光染料。
本申请的第十方面提供一种核酸扩增方法，所述方法包括如下步骤：
将RNA样本逆转录合成cDNA，和，扩增所述cDNA；
其中所述将RNA样本逆转录合成cDNA的步骤，和/或，所述扩增所述cDNA的步骤在本申请第一方面所述的T4GP32蛋白突变体存在下进行。
在一些实施方案中，所述扩增所述cDNA是PCR扩增、qPCR扩增或等温扩增中的任意一种。
本申请中取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸。
术语解释：
单链结合蛋白：（Single-stranded DNA-binding protein，SSB或SSBP）是专门负责与DNA单链区域结合的一种蛋白质，为DNA复制、重组和修复所必需的成分。
T4噬菌体基因32编码蛋白：（T4 Gene 32 Protein），又称T4GP32蛋白，是一种由T4噬菌体基因组的基因32编码的单链DNA（ssDNA）结合蛋白，为T4噬菌体DNA复制和修复所必需。 它协调性地结合并稳定瞬时形成的ssDNA区域，在T4噬菌体DNA复制过程中起着重要的结构性作用。
逆转录反应：（Reverse Transcription），是以RNA为模板合成DNA的过程，合成的DNA称为cDNA。 逆转录过程遗传信息的流动方向为RNA到DNA，与转录过程DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录。
附图说明
图1：RT-qPCR测定得到的T4GP32蛋白突变体1-8的ΔCT值。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本申请的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本申请的示例，并不代表或限制本申请的保护范围。本申请的保护范围以权利要求书为准。在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。
实施例1
对亲本野生型T4GP32蛋白（SEQ ID NO.1）进行定点突变得到T4GP32蛋白突变体1-8，具体制备方法参照文献（Andreassen P R, et al. Site-Directed Mutagenesis forIn Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions inEscherichia Coli. J Vis Exp. 2019 Feb 5;(144).）中三步PCR定点突变方法进行，其中野生型T4GP32蛋白的氨基酸序列如下：
MFKRKSTAELAAQMAKLNGNKGFSSEDKGEWKLKLDNAGNGQAVIRFLPSKNDEQAPFAILVNHGFKKNGKWYIETCSSTHGDYDSCPVCQYISKNDLYNTDNKEYSLVKRKTSYWANILVVKDPAAPENEGKVFKYRFGKKIWDKINAMIAVDVEMGETPVDVTCPWEGANFVLKVKQVSGFSNYDESKFLNQSAIPNIDDESFQKELFEQMVDLSEMTSKDKFKSFEELNTKFGQVMGTAVMGGAAATAAKKADKVADDLDAFNVDDFNTKTEDDFMSSSSGSSSSADDTDLDDLLNDL
其中T4GP32蛋白突变体及对应的突变位点和氨基酸序列见表1。
表1
实施例2
准备野生型T4GP32蛋白和T4GP32蛋白突变体1-8各1U，在50℃下保温5h进行处理以及不进行温度处理的情况下，然后参考文献中的色氨酸检测法（Hillier BJ,et al.Coupling protein stability and protein function in Escherichia coli CspA.Fold Des. 1998;3(2):87-93.；Casas-Finet J R, et al. A maximum of twotryptophan residues in gene-32 protein from phage T4 undergo stackinginteractions with single-stranded polynucleotides. Eur J Biochem. 1988 Mar15;172(3):641-6.）测试其单链核酸结合性能，比较它们的活性残留，评价T4GP32蛋白突变体1-8的热稳定性，结果如表2所示。
其中色氨酸检测法原理为T4GP32蛋白与单链DNA结合后，其结合位点中的色氨酸被单链DNA掩盖，导致其光学性质发生变化，这种变化可以通过酶标仪检测色氨酸荧光值变化（激发波长：280nm；发射波长：349nm）。
具体方法：以野生型T4GP32蛋白构建标准曲线，进行活性定量。取100μl含有不同浓度野生型T4GP32蛋白的溶液，在加入1nmol单链DNA（序列： 5′-CTTGAGGTTAATCCA-3′ ）前后进行酶标仪测量，分别得到两个荧光值。使用这两个荧光值的差值作为纵坐标，将蛋白浓度（μg/μl）换算成活性单位（U/μl:将10μg野生型T4GP32定义为1U）作为横坐标，绘制野生型T4GP32蛋白活性标准曲线。T4GP32蛋白突变体1-8通过相同的酶标仪测量方法，计算出荧光值的差值，按照野生型T4GP32蛋白活性标准曲线进行活性定量。此方法能够保证在相同的单链DNA结合能力下，进行T4GP32蛋白热稳定性性能评估。
活性残留的计算方法为50℃ 5h处理后的蛋白活性/未处理的蛋白活性。
表2
如表2所示，在50℃下保温5h处理后，T4GP32蛋白突变体1-8的活性残留均明显高于野生型的T4GP32，说明T4GP32蛋白突变体1-8具有显著增强的热稳定性，并且多位点突变体的热稳定性能整体上优于单位点突变体。
实施例3
使用标准两步法RT-qPCR实验步骤检测T4GP32蛋白突变体1-8对逆转录反应性能的影响。
1、样本制备
使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的RNA提取试剂盒FastPure® Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit（Vazyme#RC101）提取HEK293T细胞总RNA，获得浓度为2211ng/μl的total RNA作为模板，经过不含逆转录酶的qPCR试剂检测，没有DNA污染，可进行后续测试。
2、引物设计
根据人源(PHACTR2，NM_001100165.2)基因序列、人源(B2M，NM_004048.4)基因序列，设计qPCR引物探针，具体序列见表3。
表3
3、两步法RT-qPCR反应
按照表4配制第一轮逆转录反应体系。
表4
其中4×RT反应buffer组分浓度为：Tris（100mmol/L）、KCl（100mmol/L）、dNTPs（2mmol/L）、MgCl2（20mmol/L）；
表5
按照表5程序进行逆转录反应，获得cDNA产物作为下一轮qPCR的模板。
按照表6配制qPCR反应体系。
表6
其中5×扩增体系组分为：Tris（250mmol/L）、KAc（250mmol/L）、KCl（100mmol/L）、dNTPs（1.5mmol/L）、MgCl2（20mmol/L）；
表7
按照表7程序进行qPCR反应，测定CT值并计算 ΔCT =CT（突变体）-CT（野生型），结果如图1所示。
如图1所示，相较于野生型T4GP32蛋白，在逆转录和qPCR反应体系中分别添加T4GP32蛋白突变体1-8后，测定的CT值降低，说明RT-qPCR试剂的扩增性能均有明显提升。
Claims (10)
1.一种T4GP32蛋白突变体，其特征在于，所述T4GP32蛋白突变体与氨基酸序列如SEQID NO.1所示的亲本逆转录酶相比，含有选自下组的至少一个位点上的氨基酸取代：第64位、第79位、第84位、第90位和第106位。
2.权利要求1所述的T4GP32蛋白突变体，其特征在于，所述T4GP32蛋白突变体包含选自下组的至少一个位点取代：H64C、S79Y、Y84E、C90H、Y106E。
3.权利要求1所述的T4GP32蛋白突变体，其特征在于，所述T4GP32蛋白突变体与SEQ IDNO.1具有至少70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列一致性。
4.权利要求1所述的T4GP32蛋白突变体，其特征在于，所述突变体包含选自下列位点取代中的任意一个：
H64C；
S79Y；
Y84E；
C90H；
Y106E；
H64C、C90H；
Y84E、Y106E；
H64C、S79Y、Y84E、C90H、Y106E。
5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1-4任一项所述的T4GP32蛋白突变体。
6.一种核酸载体，其特征在于，其包含编码权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，其用于表达权利要求1-4任一项所述的T4GP32蛋白突变体、权利要求5所述的多核苷酸和/或权利要求6所述的核酸载体。
8.一种试剂盒，其包含权利要求1-4任一项所述的T4GP32蛋白突变体。
9.权利要求1-4任一项所述的T4GP32蛋白突变体在核酸反应中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
将RNA样本逆转录合成cDNA，和，扩增所述cDNA；
其中所述将RNA样本逆转录合成cDNA的步骤，和/或，所述扩增所述cDNA的步骤权利要求1-4任一项所述的T4GP32蛋白突变体存在下进行。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030228616A1 (en) * | 1999-10-29 | 2003-12-11 | Stratagene | DNA polymerase mutants with reverse transcriptase activity |
| US20160326502A1 (en) * | 2006-05-04 | 2016-11-10 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase Polymerase Amplification |
| CN107109380A (zh) * | 2014-10-07 | 2017-08-29 | 牛津纳米孔技术公司 | 经修饰的酶 |
| CN108699138A (zh) * | 2016-03-02 | 2018-10-23 | 牛津纳米孔技术公司 | 突变孔 |
| CN114230644A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-25 | 南京巨匠生物科技有限公司 | 一种gp32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用 |
-
2024
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030228616A1 (en) * | 1999-10-29 | 2003-12-11 | Stratagene | DNA polymerase mutants with reverse transcriptase activity |
| US20160326502A1 (en) * | 2006-05-04 | 2016-11-10 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase Polymerase Amplification |
| CN107109380A (zh) * | 2014-10-07 | 2017-08-29 | 牛津纳米孔技术公司 | 经修饰的酶 |
| CN108699138A (zh) * | 2016-03-02 | 2018-10-23 | 牛津纳米孔技术公司 | 突变孔 |
| CN114230644A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-25 | 南京巨匠生物科技有限公司 | 一种gp32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JUQIAN GUO AND DAVID P. GIEDROC: "Zinc Site Redesign in T4 Gene 32 Protein: Structure and Stability of Cobalt(II) Complexes Formed by Wild-Type and Metal Ligand Substitution Mutants", BIOCHEMISTRY, vol. 36, no. 4, 28 January 1997 (1997-01-28), pages 730 - 742 * |
| JUQIAN GUO ET AL: "X-ray and Visible Absorption Spectroscopy of Wild-Type and Mutant T4 Gene 32 Proteins：His64, not His81, Is the Non-Thiolate Zinc Ligand", J. AM. CHEM. SOC., vol. 117, 20 September 1995 (1995-09-20), pages 9437 - 9440 * |
| Y. SHAMOO ET AL: "Site-specific mutagenesis of T4 gene 32: the role of tyrosine residues in protein.cntdot.nucleic acid interactions", BIOCHEMISTRY, vol. 28, no. 18, 1 September 1989 (1989-09-01), pages 7409 - 7417 * |
| 佚名: "single strand DNA binding protein [Escherichia phage T4]", NCBI ACCESSION NO: NP_049854.1, 11 January 2023 (2023-01-11), pages 1 * |
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