JP2002138047A - 皮膚賦活用組成物 - Google Patents
皮膚賦活用組成物Info
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- JP2002138047A JP2002138047A JP2000331318A JP2000331318A JP2002138047A JP 2002138047 A JP2002138047 A JP 2002138047A JP 2000331318 A JP2000331318 A JP 2000331318A JP 2000331318 A JP2000331318 A JP 2000331318A JP 2002138047 A JP2002138047 A JP 2002138047A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】皮膚賦活効果を有する組成物を提供すること。
【解決手段】リュウガン、タイセイ、ホソバタイセイお
よびリュウキュウアイから選ばれる１種又は２種以上の
植物又は植物抽出物を有効成分として含む皮膚賦活用組
成物。
よびリュウキュウアイから選ばれる１種又は２種以上の
植物又は植物抽出物を有効成分として含む皮膚賦活用組
成物。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、皮膚基底膜に存在
する細胞外マトリックスタンパク質の一種であるラミニ
ン５の産生を亢進させる活性を有するある特定の植物を
有効成分として配合する皮膚賦活用組成物に関する。
する細胞外マトリックスタンパク質の一種であるラミニ
ン５の産生を亢進させる活性を有するある特定の植物を
有効成分として配合する皮膚賦活用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】ラミニン５（別名カリニン、エピリグリ
ン、ナイセイン）は皮膚の基底膜に存在するラミニン分
子種の一種として同定され、α３鎖、β３鎖、γ２鎖の
３本のサブユニットで構成される分子量３８０〜４９０
ｋDaの糖タンパク質である（Carter, W. G., et al., C
ell., 65, 599-610, 1991., Rousselle, P., et al.,
J. Cell Biol., 114, 567-576, 1991., Verrando, P.,
et al., Biochem. Biophys. Acta, 942, 45-56, 198
8.）。ラミニン５遺伝子は表皮・真皮間の剥離と水泡形
成を特徴とする重篤な遺伝的疾患である結合型表皮水泡
症（Herlitz's junctional epidermolysis bullosa）の
原因遺伝子であることから、ラミニン５は正常な皮膚構
造の維持に必要不可欠なタンパク質であることが明らか
になった（Aberdam, D., et al., Nat. Genet., 6, 299
-304, 1994., Pulkkinen, L., et al.,Genomics, 24, 3
57-360, 1994, Kivirikko, S., et al., Hum. Mol. Gen
et., 4,959-962, 1995.）。また、老化した皮膚では基
底膜が偏平化していることから、基底膜の構造変化が皮
膚老化を引き起こす可能性が示唆されていた（Lavker
R., et al., Dermatol. Clin., 4, 379-389, 1986.）。
ン、ナイセイン）は皮膚の基底膜に存在するラミニン分
子種の一種として同定され、α３鎖、β３鎖、γ２鎖の
３本のサブユニットで構成される分子量３８０〜４９０
ｋDaの糖タンパク質である（Carter, W. G., et al., C
ell., 65, 599-610, 1991., Rousselle, P., et al.,
J. Cell Biol., 114, 567-576, 1991., Verrando, P.,
et al., Biochem. Biophys. Acta, 942, 45-56, 198
8.）。ラミニン５遺伝子は表皮・真皮間の剥離と水泡形
成を特徴とする重篤な遺伝的疾患である結合型表皮水泡
症（Herlitz's junctional epidermolysis bullosa）の
原因遺伝子であることから、ラミニン５は正常な皮膚構
造の維持に必要不可欠なタンパク質であることが明らか
になった（Aberdam, D., et al., Nat. Genet., 6, 299
-304, 1994., Pulkkinen, L., et al.,Genomics, 24, 3
57-360, 1994, Kivirikko, S., et al., Hum. Mol. Gen
et., 4,959-962, 1995.）。また、老化した皮膚では基
底膜が偏平化していることから、基底膜の構造変化が皮
膚老化を引き起こす可能性が示唆されていた（Lavker
R., et al., Dermatol. Clin., 4, 379-389, 1986.）。
【０００３】上記のような事から、ラミニン５自体やラ
ミニン５の産生亢進活性を持つ大豆由来の調製物を有効
成分として配合する事により、皮膚賦活効果などを有す
る皮膚外用剤や皮膚賦活用組成物が開発されている（特
開平10-147515、特開平11-343226）。
ミニン５の産生亢進活性を持つ大豆由来の調製物を有効
成分として配合する事により、皮膚賦活効果などを有す
る皮膚外用剤や皮膚賦活用組成物が開発されている（特
開平10-147515、特開平11-343226）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ラミニ
ン５は非常に高分子の糖タンパク質であることから、安
定性、皮膚浸透性などに問題があり、それ自体を有効成
分として配合する皮膚外用剤は、必ずしも十分な皮膚賦
活用効果を期待できない。一方、従来使用されているラ
ミニン５の産生を亢進させる組成物も活性がそれほど高
いとは言い難く、必ずしも十分な皮膚賦活効果を期待で
きない。
ン５は非常に高分子の糖タンパク質であることから、安
定性、皮膚浸透性などに問題があり、それ自体を有効成
分として配合する皮膚外用剤は、必ずしも十分な皮膚賦
活用効果を期待できない。一方、従来使用されているラ
ミニン５の産生を亢進させる組成物も活性がそれほど高
いとは言い難く、必ずしも十分な皮膚賦活効果を期待で
きない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、種々の植物
について、ラミニン５の産生を亢進させる活性を検討し
た。その結果、リュウガン（Euphoria longan （Lou
r.）Steud.）、タイセイ（I. Indigotica Fort.）、ホ
ソバタイセイ（Isatis tinctoria L.）、リュウキュウ
アイ（Storobilanthes flaccidifolius Nees）、ナルコ
ユリ（Polygonatumfolcatum A. Gray）、カギクルマバ
ナルコユリ（Polygonatum sibiricum Redoute ex Redou
te）がラミニン５の産生を亢進させることを見出し、本
発明を完成した。
について、ラミニン５の産生を亢進させる活性を検討し
た。その結果、リュウガン（Euphoria longan （Lou
r.）Steud.）、タイセイ（I. Indigotica Fort.）、ホ
ソバタイセイ（Isatis tinctoria L.）、リュウキュウ
アイ（Storobilanthes flaccidifolius Nees）、ナルコ
ユリ（Polygonatumfolcatum A. Gray）、カギクルマバ
ナルコユリ（Polygonatum sibiricum Redoute ex Redou
te）がラミニン５の産生を亢進させることを見出し、本
発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、リュウガン、タイセ
イ、ホソバタイセイおよびリュウキュウアイから選ばれ
る１種または２種以上の植物又は植物抽出物を有効成分
として含む皮膚外用組成物、皮膚賦活用組成物、リュウ
ガン、タイセイ、ホソバタイセイ、リュウキュウアイ、
ナルコユリおよびカギクルマバナルコユリから選ばれる
１種または２種以上の植物又は植物抽出物を含むラミニ
ン５産生亢進組成物、リュウガン、タイセイ、ホソバタ
イセイ、リュウキュウアイ、ナルコユリおよびカギクル
マバナルコユリから選ばれる１種または２種以上の植物
又は植物抽出物を含む光老化防止用組成物に関する。
イ、ホソバタイセイおよびリュウキュウアイから選ばれ
る１種または２種以上の植物又は植物抽出物を有効成分
として含む皮膚外用組成物、皮膚賦活用組成物、リュウ
ガン、タイセイ、ホソバタイセイ、リュウキュウアイ、
ナルコユリおよびカギクルマバナルコユリから選ばれる
１種または２種以上の植物又は植物抽出物を含むラミニ
ン５産生亢進組成物、リュウガン、タイセイ、ホソバタ
イセイ、リュウキュウアイ、ナルコユリおよびカギクル
マバナルコユリから選ばれる１種または２種以上の植物
又は植物抽出物を含む光老化防止用組成物に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明における植物は、リュウガ
ン（Euphoria longan （Lour.）Steud.）、タイセイ
（I. Indigotica Fort.）、ホソバタイセイ（Isatis ti
nctoria L.）、リュウキュウアイ（Storobilanthes fla
ccidifolius Nees）、ナルコユリ（Polygonatum folcat
um A. Gray）、カギクルマバナルコユリ（Polygonatum
sibiricum Redoute ex Redoute）が使用可能である。
ン（Euphoria longan （Lour.）Steud.）、タイセイ
（I. Indigotica Fort.）、ホソバタイセイ（Isatis ti
nctoria L.）、リュウキュウアイ（Storobilanthes fla
ccidifolius Nees）、ナルコユリ（Polygonatum folcat
um A. Gray）、カギクルマバナルコユリ（Polygonatum
sibiricum Redoute ex Redoute）が使用可能である。
【０００８】本発明におけるリュウガン（Euphoria lon
gan （Lour.）Steud.）とは、むくろじ科ユーフォリア
属の植物である。仮種皮の部分は竜眼肉（リュウガンニ
ク）と呼ばれ、鎮静、滋養強壮に処方され、物忘れや不
眠症にも効果的で、神経の興奮を静める効力があるとい
われている。
gan （Lour.）Steud.）とは、むくろじ科ユーフォリア
属の植物である。仮種皮の部分は竜眼肉（リュウガンニ
ク）と呼ばれ、鎮静、滋養強壮に処方され、物忘れや不
眠症にも効果的で、神経の興奮を静める効力があるとい
われている。
【０００９】本発明におけるタイセイ（I. Indigotica
Fort.）、ホソバタイセイ（Isatistinctoria L.）と
は、いずれもあぶらな科タイセイ属の植物である。根の
部分は板藍根（バンランコン）と呼ばれ、種々の病原菌
に対する抑制作用を有し、消炎、解熱、解毒、止血薬と
して用いられている。
Fort.）、ホソバタイセイ（Isatistinctoria L.）と
は、いずれもあぶらな科タイセイ属の植物である。根の
部分は板藍根（バンランコン）と呼ばれ、種々の病原菌
に対する抑制作用を有し、消炎、解熱、解毒、止血薬と
して用いられている。
【００１０】本発明におけるリュウキュウアイ（Storob
ilanthes flaccidifolius Nees）は、きつねのまご科イ
セハナビ属の植物である。この植物の根、根茎も板藍根
（バンランコン）と呼ばれ、タイセイ（I. Indigotica
Fort.）、ホソバタイセイ（Isatis tinctoria L.）の根
と同様の薬効を有する。また、葉の部分にも抗菌、解
毒、解熱、消炎、止血作用があることが知られている。
ilanthes flaccidifolius Nees）は、きつねのまご科イ
セハナビ属の植物である。この植物の根、根茎も板藍根
（バンランコン）と呼ばれ、タイセイ（I. Indigotica
Fort.）、ホソバタイセイ（Isatis tinctoria L.）の根
と同様の薬効を有する。また、葉の部分にも抗菌、解
毒、解熱、消炎、止血作用があることが知られている。
【００１１】本発明におけるナルコユリ（Polygonatum
folcatum A. Gray）、カギクルマバナルコユリ（Polygo
natum sibiricum Redoute ex Redoute）はいずれもゆり
科アマドコロ属の植物である。根茎の部分は黄精（オウ
セイ）と呼ばれ、種々の菌に対する抑制作用、アドレナ
リンによる高血糖に対する抑制作用、血圧降下作用があ
り、滋養強壮、糖尿病、動脈硬化症などの薬として用い
られる。
folcatum A. Gray）、カギクルマバナルコユリ（Polygo
natum sibiricum Redoute ex Redoute）はいずれもゆり
科アマドコロ属の植物である。根茎の部分は黄精（オウ
セイ）と呼ばれ、種々の菌に対する抑制作用、アドレナ
リンによる高血糖に対する抑制作用、血圧降下作用があ
り、滋養強壮、糖尿病、動脈硬化症などの薬として用い
られる。
【００１２】本発明における植物は、葉、茎、芽、花、
木質部、木皮部（樹皮）などの地上部、根、塊茎などの
地下部、種子、樹脂などのすべての部位が使用可能であ
る。
木質部、木皮部（樹皮）などの地上部、根、塊茎などの
地下部、種子、樹脂などのすべての部位が使用可能であ
る。
【００１３】本発明における植物は、それら自体を乾燥
させた乾燥物、その粉砕物、それら自体を圧搾抽出する
ことにより得られる搾汁、水またはアルコール、エーテ
ル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物および粗抽
出物を分配、カラムクロマトグラフィーなどの各種クロ
マトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物
画分などのすべてを含む。これらは単独で用いても良
く、２種以上混合して用いても良い。
させた乾燥物、その粉砕物、それら自体を圧搾抽出する
ことにより得られる搾汁、水またはアルコール、エーテ
ル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物および粗抽
出物を分配、カラムクロマトグラフィーなどの各種クロ
マトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物
画分などのすべてを含む。これらは単独で用いても良
く、２種以上混合して用いても良い。
【００１４】本発明の植物の有効配合量は、植物の調製
法、製剤の形態などにより、適宜選択、決定され、特に
限定されないが、例えば、本発明の植物の乾燥粉砕物か
らアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒によ
り抽出された抽出物を調製物として使用する場合は、そ
の乾燥含量として総組成物重量当たり０．００１〜３０
重量％が適当である。
法、製剤の形態などにより、適宜選択、決定され、特に
限定されないが、例えば、本発明の植物の乾燥粉砕物か
らアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒によ
り抽出された抽出物を調製物として使用する場合は、そ
の乾燥含量として総組成物重量当たり０．００１〜３０
重量％が適当である。
【００１５】本発明の組成物は、ローション剤、乳液
剤、クリーム剤、抽出製剤、散剤、造粒製剤、カプセル
剤、錠剤、軟膏剤、硬軟剤、懸濁剤、シロップ剤、ハッ
プ剤、坐剤、注射剤、エアゾール剤などの製剤として、
製剤上の常套手段を用いて製剤化することができる。投
与方法として、経口投与、注射、吸入、経皮投与、経粘
膜投与などをすることができ、毒性は低い。また、必要
に応じて、賦形剤、安定化剤、乳化剤、結合剤、保存
剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、粘度調製剤、湿潤剤、着色
剤、等張化剤、香料などの添加剤を適宜配合できる。
剤、クリーム剤、抽出製剤、散剤、造粒製剤、カプセル
剤、錠剤、軟膏剤、硬軟剤、懸濁剤、シロップ剤、ハッ
プ剤、坐剤、注射剤、エアゾール剤などの製剤として、
製剤上の常套手段を用いて製剤化することができる。投
与方法として、経口投与、注射、吸入、経皮投与、経粘
膜投与などをすることができ、毒性は低い。また、必要
に応じて、賦形剤、安定化剤、乳化剤、結合剤、保存
剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、粘度調製剤、湿潤剤、着色
剤、等張化剤、香料などの添加剤を適宜配合できる。
【００１６】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１７】調製 植物の抽出；リュウガン（Euphoria
longan （Lour.）Steud.）の仮種皮の部分（リュウガン
ニク）、ホソバタイセイ（Isatis tinctoria L.）の根
の部分（バンランコン）、ナルコユリ（Polygonatum fo
lcatum A. Gray）の根茎の部分（オウセイ）を細切し、
その各１ｋｇに９９．５％エタノール３Ｌを加え、室温
で一晩浸漬した。これを濾過し、各抽出液を得た。各抽
出液を濃縮したところ、その蒸発残分はそれぞれ７５
ｇ、１１０ｇ、１３５ｇであった。
longan （Lour.）Steud.）の仮種皮の部分（リュウガン
ニク）、ホソバタイセイ（Isatis tinctoria L.）の根
の部分（バンランコン）、ナルコユリ（Polygonatum fo
lcatum A. Gray）の根茎の部分（オウセイ）を細切し、
その各１ｋｇに９９．５％エタノール３Ｌを加え、室温
で一晩浸漬した。これを濾過し、各抽出液を得た。各抽
出液を濃縮したところ、その蒸発残分はそれぞれ７５
ｇ、１１０ｇ、１３５ｇであった。
【００１８】試験結果１ 表皮角化細胞によるラミニン
５産生能の測定試験；ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉ
ｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）に
よるラミニン５産生能の測定 表皮角化細胞および培地は、旭テクノグラス株式会社か
ら販売されている胎児由来正常ヒト表皮角化細胞および
Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ
ＢｕｌｌｅｔＫｉｔを用いた。この培地（ＫＧＭ）
は、表皮角化細胞基礎培地にヒト上皮細胞増殖因子
（０．１ｎｇ／ｍｌ）、インシュリン（５．０μｇ／ｍ
ｌ）、ハイドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、ゲン
タマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、アンフォテリシンＢ
（５０μｇ／ｍｌ）、牛脳下垂体抽出液（２ｍｌ）を添
加したものである。細胞はＫＧＭで３７℃−５％ＣＯ２
インキュベーターにて培養した。本実験には継代数が３
〜５代の細胞を使用した。
５産生能の測定試験；ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉ
ｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）に
よるラミニン５産生能の測定 表皮角化細胞および培地は、旭テクノグラス株式会社か
ら販売されている胎児由来正常ヒト表皮角化細胞および
Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ
ＢｕｌｌｅｔＫｉｔを用いた。この培地（ＫＧＭ）
は、表皮角化細胞基礎培地にヒト上皮細胞増殖因子
（０．１ｎｇ／ｍｌ）、インシュリン（５．０μｇ／ｍ
ｌ）、ハイドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、ゲン
タマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、アンフォテリシンＢ
（５０μｇ／ｍｌ）、牛脳下垂体抽出液（２ｍｌ）を添
加したものである。細胞はＫＧＭで３７℃−５％ＣＯ２
インキュベーターにて培養した。本実験には継代数が３
〜５代の細胞を使用した。
【００１９】細胞をＫＧＭで培養後、トリプシン／ＥＤ
ＴＡ溶液を処理し、接着細胞を培養ディッシュから剥が
した後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンを中和
した。遠心分離により細胞を集めた後、２×１０５／ｍ
ｌとなるようにＫＧＭにて再懸濁した。この細胞懸濁液
を１００μｌ／ウェルで９６穴プレートに播種し、２４
時間培養後、各植物抽出物を１００μｇ／ｍｌで添加し
たＫＧＭで２４時間培養した。培養後、細胞培養上清を
回収し、８００ｒｐｍ、５分間遠心して浮遊細胞を除去
後、１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して細胞片を除去
し、ＥＬＩＳＡ用サンプルとして用いた。
ＴＡ溶液を処理し、接着細胞を培養ディッシュから剥が
した後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンを中和
した。遠心分離により細胞を集めた後、２×１０５／ｍ
ｌとなるようにＫＧＭにて再懸濁した。この細胞懸濁液
を１００μｌ／ウェルで９６穴プレートに播種し、２４
時間培養後、各植物抽出物を１００μｇ／ｍｌで添加し
たＫＧＭで２４時間培養した。培養後、細胞培養上清を
回収し、８００ｒｐｍ、５分間遠心して浮遊細胞を除去
後、１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して細胞片を除去
し、ＥＬＩＳＡ用サンプルとして用いた。
【００２０】９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートにリン酸緩衝
溶液（ＰＢＳ）で１／８に希釈した細胞培養上清液を３
７℃で２時間吸着させた。細胞培養上清液を除去後、ブ
ロッキング溶液｛１％の牛血清アルブミン（BSA）を含
むＰＢＳ｝に浸し、３７℃で１時間ブロッキングした。
洗浄液｛０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソル
ビタンモノラウレート（和光純薬）を含むＰＢＳ｝にて
洗浄後、一次抗体溶液｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製し
たラミニンγ２鎖に対するモノクローナル抗体（クロー
ンＤ4Ｂ５）（Mizushima, H., et al., Horm. Res., 5
0, 7-14, 1998.）｝を５０μｌ／ウェルずつ添加し、３
７℃で２時間反応させた。洗浄後、二次抗体｛洗浄液で
１ｍｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗マウスイムノグロ
ブリンＧ（VECTOR LABORATORIES）｝を５０μｌ／ウェ
ルずつ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酵素
溶液｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したアルカリフォス
ファターゼアビジンＤ（VECTOR LABORATORIES）｝を５
０μｌ／ウェルずつ添加し、室温で１時間反応させた。
洗浄後、基質液｛１ｍｇ／ｍｌのｐ−ｎｉｔ−ｒｏｐｈ
ｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ICN Biomedicals, In
c.）を含む０．７５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．
３）｝を１００μｌ／ウェルずつ添加し、３７℃で３０
分間反応後、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
溶液（ＰＢＳ）で１／８に希釈した細胞培養上清液を３
７℃で２時間吸着させた。細胞培養上清液を除去後、ブ
ロッキング溶液｛１％の牛血清アルブミン（BSA）を含
むＰＢＳ｝に浸し、３７℃で１時間ブロッキングした。
洗浄液｛０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソル
ビタンモノラウレート（和光純薬）を含むＰＢＳ｝にて
洗浄後、一次抗体溶液｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製し
たラミニンγ２鎖に対するモノクローナル抗体（クロー
ンＤ4Ｂ５）（Mizushima, H., et al., Horm. Res., 5
0, 7-14, 1998.）｝を５０μｌ／ウェルずつ添加し、３
７℃で２時間反応させた。洗浄後、二次抗体｛洗浄液で
１ｍｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗マウスイムノグロ
ブリンＧ（VECTOR LABORATORIES）｝を５０μｌ／ウェ
ルずつ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酵素
溶液｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したアルカリフォス
ファターゼアビジンＤ（VECTOR LABORATORIES）｝を５
０μｌ／ウェルずつ添加し、室温で１時間反応させた。
洗浄後、基質液｛１ｍｇ／ｍｌのｐ−ｎｉｔ−ｒｏｐｈ
ｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ICN Biomedicals, In
c.）を含む０．７５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．
３）｝を１００μｌ／ウェルずつ添加し、３７℃で３０
分間反応後、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【００２１】ＥＬＩＳＡによるラミニン５産生能の測定
結果を表１に示す。各植物抽出物を処理した時のラミニ
ン５産生率について、無処理対照を１００％として表し
た。バンランコン、リュウガンニク、オウセイを処理し
た場合は、無処理対照に比べてラミニン５産生率がそれ
ぞれ１７６、１８９、１６８％に亢進した。尚、ラミニ
ン５の産生を亢進することが知られているＰＨＯＲＢＯ
Ｌ １２−ＭＹＲＩＳＴＡＴＥ １３−ＡＣＥＴＡＴＥ
（ＰＭＡ）(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．)を１
００ｎｇ／ｍｌで処理した場合は、無処理対照に比べて
ラミニン５産生率が１７３％であった。
結果を表１に示す。各植物抽出物を処理した時のラミニ
ン５産生率について、無処理対照を１００％として表し
た。バンランコン、リュウガンニク、オウセイを処理し
た場合は、無処理対照に比べてラミニン５産生率がそれ
ぞれ１７６、１８９、１６８％に亢進した。尚、ラミニ
ン５の産生を亢進することが知られているＰＨＯＲＢＯ
Ｌ １２−ＭＹＲＩＳＴＡＴＥ １３−ＡＣＥＴＡＴＥ
（ＰＭＡ）(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．)を１
００ｎｇ／ｍｌで処理した場合は、無処理対照に比べて
ラミニン５産生率が１７３％であった。
【００２２】
【表１】
【００２３】（２）ウエスタンブロッティングによるラ
ミニン５産生能の測定 細胞をＫＧＭで培養後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を処
理し、接着細胞を培養ディッシュから剥がした後、トリ
プシン中和溶液を用いてトリプシンを中和した。遠心分
離により細胞を集めた後、２×１０５／ｍｌとなるよう
にＫＧＭにて再懸濁した。この細胞懸濁液をφ９０ｍｍ
ディッシュに播種し、８０％飽和状態まで培養後、各植
物抽出物を１００μｇ／ｍｌで添加したＫＧＭで２４時
間培養した。培養後、細胞培養上清を回収し、８００ｒ
ｐｍ、５分間遠心して浮遊細胞を除去後、１５０００ｒ
ｐｍ、３０分間遠心して細胞片を除去した。８０％飽和
になるように硫酸アンモニウムを添加して４℃で一晩攪
拌した。２００００ｒｐｍ、３０分間遠心してタンパク
質を沈降させ、上清を除去後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）に溶解した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で４℃で一晩透析後、２０倍濃縮
になるように２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）を加え、ウエスタンブロッティング用サンプルとし
て用いた。
ミニン５産生能の測定 細胞をＫＧＭで培養後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を処
理し、接着細胞を培養ディッシュから剥がした後、トリ
プシン中和溶液を用いてトリプシンを中和した。遠心分
離により細胞を集めた後、２×１０５／ｍｌとなるよう
にＫＧＭにて再懸濁した。この細胞懸濁液をφ９０ｍｍ
ディッシュに播種し、８０％飽和状態まで培養後、各植
物抽出物を１００μｇ／ｍｌで添加したＫＧＭで２４時
間培養した。培養後、細胞培養上清を回収し、８００ｒ
ｐｍ、５分間遠心して浮遊細胞を除去後、１５０００ｒ
ｐｍ、３０分間遠心して細胞片を除去した。８０％飽和
になるように硫酸アンモニウムを添加して４℃で一晩攪
拌した。２００００ｒｐｍ、３０分間遠心してタンパク
質を沈降させ、上清を除去後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）に溶解した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で４℃で一晩透析後、２０倍濃縮
になるように２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）を加え、ウエスタンブロッティング用サンプルとし
て用いた。
【００２４】サンプル中のタンパク質を非還元条件でＳ
ＤＳ-ＰＡＧＥで分離後、ニトロセルロース膜に転写し
た。転写後のニトロセルロース膜をブロッキング溶液
（５％のスキムミルクを含むＰＢＳ）に浸し、室温で１
時間ブロッキングした。洗浄液｛０．１％のＢＳＡおよ
び０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン
モノラウレートを含むＰＢＳ｝で洗浄後、一次抗体溶液
｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したラミニンγ２鎖に対
するモノクローナル抗体（クローンＤ4Ｂ５）｝に浸
し、室温で一晩反応させた。洗浄後、二次抗体溶液（洗
浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗マウスイム
ノグロブリンＧ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗
浄後、酵素溶液（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したアル
カリフォスファターゼアビジンＤ）に浸し、室温で１時
間反応させた。洗浄後、基質液｛ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｓ
ｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ （VECTOR LABORATORIES）｝
に浸し、室温で１５分間反応させた。
ＤＳ-ＰＡＧＥで分離後、ニトロセルロース膜に転写し
た。転写後のニトロセルロース膜をブロッキング溶液
（５％のスキムミルクを含むＰＢＳ）に浸し、室温で１
時間ブロッキングした。洗浄液｛０．１％のＢＳＡおよ
び０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン
モノラウレートを含むＰＢＳ｝で洗浄後、一次抗体溶液
｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したラミニンγ２鎖に対
するモノクローナル抗体（クローンＤ4Ｂ５）｝に浸
し、室温で一晩反応させた。洗浄後、二次抗体溶液（洗
浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗マウスイム
ノグロブリンＧ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗
浄後、酵素溶液（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したアル
カリフォスファターゼアビジンＤ）に浸し、室温で１時
間反応させた。洗浄後、基質液｛ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｓ
ｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ （VECTOR LABORATORIES）｝
に浸し、室温で１５分間反応させた。
【００２５】ウエスタンブロッティングによる各植物抽
出物のラミニン５産生能の測定結果を図１に示す。バン
ランコン、リュウガンニク、オウセイを処理した場合
は、無処理対照に比べてラミニン５産生率が有意に亢進
した。尚、ポジティブコントロールとしてＰＭＡを１０
０ｎｇ／ｍｌで処理した場合の結果も同時に示した。
出物のラミニン５産生能の測定結果を図１に示す。バン
ランコン、リュウガンニク、オウセイを処理した場合
は、無処理対照に比べてラミニン５産生率が有意に亢進
した。尚、ポジティブコントロールとしてＰＭＡを１０
０ｎｇ／ｍｌで処理した場合の結果も同時に示した。
【００２６】実験結果２ 光老化に対する効果の測定試
験； （１）ヒト表皮角化細胞の光老化に対する効果の測定試
験；ヒト表皮角化細胞をＫＧＭで培養後、トリプシン／
ＥＤＴＡ溶液を処理し、接着細胞を培養ディッシュから
剥がした後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンを
中和した。遠心分離により細胞を集めた後、２×１０５
／ｍｌとなるようにＫＧＭにて再懸濁した。この細胞懸
濁液に１００μｇ／ｍｌのリュウガンニク抽出物および
５μｇ／ｍｌのラミニン５中和抗体（ＣＨＥＭＩＣＯ
Ｎ，ｃｌｏｎｅＰ３Ｈ９−２）をそれぞれ単独または組
み合せて処理した。本実験では、リュウガンニク抽出物
の光老化に対する抑制効果が、ラミニン５の産生亢進に
起因するかについて調べるために、ラミニン５中和抗体
を用いた。この細胞懸濁液を１ｍｌ／ウェルで２４穴プ
レートに播種し、２４時間培養後、プレートに蓋をしな
い状態でＵＶＢを０または７０ｍＪ／ｃｍ２で照射し
た。２４時間培養後、ＰＢＳ（−）で洗浄し浮遊細胞を
除去した後、５％グルタルアルデヒド水溶液にて室温、
１５分間処理し、細胞を固定した。水道水にて洗浄後、
蛍光染色液｛５μｇ／ｍｌのＨｏｃｈｓｔ３３３４２
(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．)および０．００
１％のポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエ
ーテル（和光純薬）を含む水溶液｝にて室温、暗所にて
１．５時間処理した。水道水にて洗浄後、蛍光プレート
リーダーにて蛍光強度を測定した。
験； （１）ヒト表皮角化細胞の光老化に対する効果の測定試
験；ヒト表皮角化細胞をＫＧＭで培養後、トリプシン／
ＥＤＴＡ溶液を処理し、接着細胞を培養ディッシュから
剥がした後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンを
中和した。遠心分離により細胞を集めた後、２×１０５
／ｍｌとなるようにＫＧＭにて再懸濁した。この細胞懸
濁液に１００μｇ／ｍｌのリュウガンニク抽出物および
５μｇ／ｍｌのラミニン５中和抗体（ＣＨＥＭＩＣＯ
Ｎ，ｃｌｏｎｅＰ３Ｈ９−２）をそれぞれ単独または組
み合せて処理した。本実験では、リュウガンニク抽出物
の光老化に対する抑制効果が、ラミニン５の産生亢進に
起因するかについて調べるために、ラミニン５中和抗体
を用いた。この細胞懸濁液を１ｍｌ／ウェルで２４穴プ
レートに播種し、２４時間培養後、プレートに蓋をしな
い状態でＵＶＢを０または７０ｍＪ／ｃｍ２で照射し
た。２４時間培養後、ＰＢＳ（−）で洗浄し浮遊細胞を
除去した後、５％グルタルアルデヒド水溶液にて室温、
１５分間処理し、細胞を固定した。水道水にて洗浄後、
蛍光染色液｛５μｇ／ｍｌのＨｏｃｈｓｔ３３３４２
(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．)および０．００
１％のポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエ
ーテル（和光純薬）を含む水溶液｝にて室温、暗所にて
１．５時間処理した。水道水にて洗浄後、蛍光プレート
リーダーにて蛍光強度を測定した。
【００２７】結果を図２に示す。本実験での細胞生存率
は、リュウガンニク抽出物およびラミニン５中和抗体を
無処理で、ＵＶＢを非照射の場合を１００％として表し
た。ＵＶＢ非照射の場合は、リュウガンニク抽出物およ
びラミニン５中和抗体を単独または組み合わせて処理し
たいずれの場合でも、無処理の場合と同程度の細胞生存
率であった。一方、ＵＶＢを７０ｍＪ／ｃｍ２で照射し
た場合は、無処理の時の細胞生存率が約５０%まで低下
したのに対して、リュウガンニク抽出物を処理した場合
は約７０％であった。リュウガンニク抽出物およびラミ
ニン５中和抗体を組み合せて処理した場合の細胞生存率
は、約５０％で無処理と同程度であった。従って、リュ
ウガンニク抽出物の光老化に対する抑制効果はラミニン
５の産生亢進に起因するものであると考えられる。ま
た、ラミニン５中和抗体を単独で処理した場合の細胞生
存率は約５０％で無処理と同程度であり、抗体による細
胞生存率の低下は見られなかった。 （２）ヒト皮膚三次元モデルの光老化に対する効果の測
定試験；ヒト皮膚三次元モデルは、東洋紡績（株）のＴ
ＥＳＴＳＫＩＮ（ＬＳＥ−ｈｉｇｈ）を用いプロトコー
ルに従って培養した。６０μｌのリュウガンニク抽出物
（１００μｇ／ｍｌ）を含む培地をアッセイリング内の
組織上に添加し、２４時間培養した。培養後、プレート
に蓋をしない状態でＵＶＢを０、２４０、３６０および
４６０ｍＪ／ｃｍ２で照射し、２４時間培養した。培養
後、組織培養液を回収し、１５０００ｒｐｍ、３０分間
遠心して組織片を除去した。
は、リュウガンニク抽出物およびラミニン５中和抗体を
無処理で、ＵＶＢを非照射の場合を１００％として表し
た。ＵＶＢ非照射の場合は、リュウガンニク抽出物およ
びラミニン５中和抗体を単独または組み合わせて処理し
たいずれの場合でも、無処理の場合と同程度の細胞生存
率であった。一方、ＵＶＢを７０ｍＪ／ｃｍ２で照射し
た場合は、無処理の時の細胞生存率が約５０%まで低下
したのに対して、リュウガンニク抽出物を処理した場合
は約７０％であった。リュウガンニク抽出物およびラミ
ニン５中和抗体を組み合せて処理した場合の細胞生存率
は、約５０％で無処理と同程度であった。従って、リュ
ウガンニク抽出物の光老化に対する抑制効果はラミニン
５の産生亢進に起因するものであると考えられる。ま
た、ラミニン５中和抗体を単独で処理した場合の細胞生
存率は約５０％で無処理と同程度であり、抗体による細
胞生存率の低下は見られなかった。 （２）ヒト皮膚三次元モデルの光老化に対する効果の測
定試験；ヒト皮膚三次元モデルは、東洋紡績（株）のＴ
ＥＳＴＳＫＩＮ（ＬＳＥ−ｈｉｇｈ）を用いプロトコー
ルに従って培養した。６０μｌのリュウガンニク抽出物
（１００μｇ／ｍｌ）を含む培地をアッセイリング内の
組織上に添加し、２４時間培養した。培養後、プレート
に蓋をしない状態でＵＶＢを０、２４０、３６０および
４６０ｍＪ／ｃｍ２で照射し、２４時間培養した。培養
後、組織培養液を回収し、１５０００ｒｐｍ、３０分間
遠心して組織片を除去した。
【００２８】この組織培養液を用いて、細胞膜に傷害を
受けた細胞から遊離される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活
性を測定することにより、細胞毒性を測定した。ＬＤＨ
活性の測定は、ＬＤＨ−細胞毒性テスト（和光純薬）を
用いて行った。１／８に希釈した組織培養液を５０μｌ
ずつ９６穴の反応プレートに分注後、発色液を５０μｌ
ずつ分注し、室温で２０分間反応させた。反応後、反応
停止液を１００μｌずつ分注し、反応を停止させた後、
マイクロプレートリーダーにより５６０ｎｍの吸光度を
測定した。
受けた細胞から遊離される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活
性を測定することにより、細胞毒性を測定した。ＬＤＨ
活性の測定は、ＬＤＨ−細胞毒性テスト（和光純薬）を
用いて行った。１／８に希釈した組織培養液を５０μｌ
ずつ９６穴の反応プレートに分注後、発色液を５０μｌ
ずつ分注し、室温で２０分間反応させた。反応後、反応
停止液を１００μｌずつ分注し、反応を停止させた後、
マイクロプレートリーダーにより５６０ｎｍの吸光度を
測定した。
【００２９】結果を図３に示す。本実験での細胞毒性率
は、リュウガンニク抽出物を無処理で、ＵＶＢを非照射
の場合を１００％として表した。ＵＶＢを非照射の場合
は、リュウガンニク抽出物の処理の有無に関わらず、ほ
ぼ同程度の細胞毒性率であった。一方、ＵＶＢを照射し
た場合は、リュウガンニク抽出物を無処理の場合でも処
理した場合でも、ＵＶＢ照射量の増加に伴い細胞毒性率
は増加するが、無処理に比べてリュウガンニク抽出物を
処理した場合は、細胞毒性率が有意に低下した。
は、リュウガンニク抽出物を無処理で、ＵＶＢを非照射
の場合を１００％として表した。ＵＶＢを非照射の場合
は、リュウガンニク抽出物の処理の有無に関わらず、ほ
ぼ同程度の細胞毒性率であった。一方、ＵＶＢを照射し
た場合は、リュウガンニク抽出物を無処理の場合でも処
理した場合でも、ＵＶＢ照射量の増加に伴い細胞毒性率
は増加するが、無処理に比べてリュウガンニク抽出物を
処理した場合は、細胞毒性率が有意に低下した。
【００３０】 処方例１ クリームの製造； （組成） （配合量） （Ａ） ステアリルアルコール ６．０％ ステアリン酸 ２．０％ 水添ラノリン ４．０％ スクワラン ９．０％ オクチルドデカノール １０．０％ ＰＯＥ（２５）セチルアルコールエーテル ３．０％ モノステアリン酸グリセリン ２．０％ リュウガン抽出液 ０．１％ 防腐剤 適量 香料 適量 （Ｂ） １，３ブチレングリコール ６．０％ ＰＥＧ １５００ ４．０％ 精製水 残余 （製法）Ａ、Ｂをそれぞれ７０℃に加熱調節する。Ａを
Ｂに加えて、ホモミキサーにて乳化粒子を均一にして、
脱気、濾過、冷却する。
Ｂに加えて、ホモミキサーにて乳化粒子を均一にして、
脱気、濾過、冷却する。
【００３１】 処方例２ 錠剤の製造； （組成） （配合量） リュウガン抽出液 ２０．０％ 乳糖 ６５．０％ コーンスターチ １４．０％ グァーガム １．０％ （製法）常法に従い、上記組成の錠剤を製造した。
【００３２】
【発明の効果】本発明によると、皮膚基底膜の構造維持
を促し、正常な皮膚の構造維持や機能向上に有用な組成
物が提供される。また、UVなどにより障害を受けた皮膚
に対して、正常な皮膚の構造維持や機能向上を促し、障
害を予防、防止および緩和することができる組成物が提
供される。
を促し、正常な皮膚の構造維持や機能向上に有用な組成
物が提供される。また、UVなどにより障害を受けた皮膚
に対して、正常な皮膚の構造維持や機能向上を促し、障
害を予防、防止および緩和することができる組成物が提
供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】各植物抽出物を処理した場合のヒト表皮角化細
胞によるラミニン５産生能をウエスタンブロッティング
により測定した結果を示す。
胞によるラミニン５産生能をウエスタンブロッティング
により測定した結果を示す。
【図２】UVB照射時のヒト表皮角化細胞の細胞生存率に
対するリュウガンニク抽出物の効果を測定した結果を示
す。
対するリュウガンニク抽出物の効果を測定した結果を示
す。
【図３】UVB照射時のヒト皮膚三次元モデルの細胞毒性
率に対するリュウガンニク抽出物の効果を測定した結果
を示す。
率に対するリュウガンニク抽出物の効果を測定した結果
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石田 隆男 神奈川県横浜市戸塚区上品濃12番13号 株 式会社ファンケル中央研究所内 Ｆターム(参考） 4C088 AB12 AB15 AB85 AC03 AC04 AC05 AC06 AC10 AC11 AC13 BA09 BA10 CA03 MA63 ZA89
Claims (5)
- 【請求項１】リュウガン、タイセイ、ホソバタイセイお
よびリュウキュウアイから選ばれる１種または２種以上
の植物又は植物抽出物を有効成分として含む皮膚外用組
成物。 - 【請求項２】リュウガン、タイセイ、ホソバタイセイお
よびリュウキュウアイから選ばれる１種または２種以上
の植物又は植物抽出物を有効成分として含む皮膚賦活用
組成物。 - 【請求項３】リュウガン、タイセイ、ホソバタイセイ、
リュウキュウアイ、ナルコユリおよびカギクルマバナル
コユリから選ばれる１種または２種以上の植物又は植物
抽出物を含むラミニン５産生亢進組成物。 - 【請求項４】リュウガン、タイセイ、ホソバタイセイ、
リュウキュウアイ、ナルコユリおよびカギクルマバナル
コユリから選ばれる１種または２種以上の植物又は植物
抽出物を含む光老化防止用組成物。 - 【請求項５】皮膚外用である請求項２，３又は４記載の
組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000331318A JP5452827B2 (ja) | 2000-10-30 | 2000-10-30 | 皮膚賦活用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000331318A JP5452827B2 (ja) | 2000-10-30 | 2000-10-30 | 皮膚賦活用組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002138047A true JP2002138047A (ja) | 2002-05-14 |
| JP5452827B2 JP5452827B2 (ja) | 2014-03-26 |
Family
ID=18807681
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000331318A Expired - Lifetime JP5452827B2 (ja) | 2000-10-30 | 2000-10-30 | 皮膚賦活用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5452827B2 (ja) |
Cited By (6)
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|---|---|---|---|---|
| JP2005089454A (ja) * | 2003-08-14 | 2005-04-07 | Fancl Corp | ヒアルロン酸蓄積促進用組成物 |
| JP2011116759A (ja) * | 2003-08-14 | 2011-06-16 | Fancl Corp | ヒアルロン酸蓄積促進用組成物 |
| US10251926B2 (en) | 2015-04-09 | 2019-04-09 | Galderma S.A. | Extract from indigo naturalis and a process for preparing the same |
| US20190160128A1 (en) * | 2015-04-09 | 2019-05-30 | Galderma S.A. | Pharmaceutical composition comprising refined indigo naturalis extracts and the use thereof |
| JP2020502172A (ja) * | 2016-12-15 | 2020-01-23 | エルジー ハウスホールド アンド ヘルスケア リミテッド | 漢方薬抽出物を有効成分として含む化粧料組成物 |
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| JPH08283172A (ja) | 1995-04-14 | 1996-10-29 | Kose Corp | 活性酸素消去剤及びこれを含有する皮膚外用剤 |
| JPH11335233A (ja) * | 1998-05-22 | 1999-12-07 | Ichimaru Pharcos Co Ltd | メラニン生成抑制剤及び化粧料組成物 |
| JP2000103718A (ja) * | 1998-09-28 | 2000-04-11 | Pola Chem Ind Inc | 生体活動改善用の組成物 |
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-
2000
- 2000-10-30 JP JP2000331318A patent/JP5452827B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| JPN6010062322; Ｏｌｅａｇｉｎｅｕｘ， Ｃｏｒｐｓ Ｇｒａｓ， Ｌｉｐｉｄｅｓ Ｖｏｌ．２ Ｎｏ．３, 1995, ｐｐ．２２９-２３５ * |
| JPN6010062323; 中葯通報 第１３巻第２期, 1988, ｐｐ．３１-３２ * |
| JPN6011017248; Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｖｏｌ．１７５ Ｎｏ．３, 1998, ｐｐ．３１４-３２２ * |
| JPN6013041100; '第３章 老化のメカニズムと老化防止化粧品への最新応用技' 機能性化粧品ＩＩ 株式会社シーエムシー, 19960830, ５３-６２ |
| JPN6013041101; 世界有用植物事典 , 19890825, ４４２-４４３頁, 株式会社平凡社 |
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| US10555985B2 (en) * | 2015-04-09 | 2020-02-11 | Galderma S.A. | Pharmaceutical composition comprising refined Indigo naturalis extracts and the use thereof |
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